KR20180083842A - Ｐａｃ-1 조합 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암세포 사멸의 유도를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 조성물들 및 이들의 사용 방법은 암 치료, 및 암세포에서 세포자멸사의 선택적 유도를 위한 요법에서 이들 조성물의 사용을 포함한다. 본원에 기재된 약물 조합은 상승작용적일 수 있으며, 동일한 양의 다른 화합물 및 화합물들의 조합보다 더 낮은 신경독성 효과를 가질 수 있고, 특정 암이 이전에 투여된 요법들에 대해 내성으로 된 경우에도 효과적일 수 있다.

Description

ＰＡＣ-1 조합 치료
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2015년 6월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 62/171,882 및 20116년 6월 3일에 출원된 62/345,629에 대해 우선권을 주장하며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
세포자멸사 또는 프로그래밍된 세포 사멸은 모든 다세포 유기체의 발달 및 항상성에 중추 역할을 한다. 암의 빈번한 특징은 천연 세포자멸사 신호에 대한 내성이다. 암 유형에 따라, 이러한 내성은 세포자멸사 캐스케이드에서 주요 단백질의 상향조절 또는 하향조절로 인한 것일 수 있다. 이러한 내성은 또한, 이들 단백질을 인코딩하는 유전자에서의 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 이들 변화는, 미토콘드리아 및 카스파제-9을 통해 전달되는 내인성 세포자멸사 경로, 및 사멸 수용체 및 카스파제-8의 작용을 수반하는 외인성 세포자멸사 경로 둘 다에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 예컨대 p53, Bim, Bax, Apaf-1, FLIP 및 많은 다른 단백질들의 건강한 수준의 변경은 암에서 관찰되어 왔다. 이들 변경은 결함성 세포자멸사 캐스케이드를 초래할 수 있으며, 이러한 캐스케이드 중 하나는 실행자 카스파제, 카스파제-3 및 카스파제-7을 활성화시키기 위해 업스트림 전-세포자멸사 신호가 적절하게 전파되지 않는 것이다.
대부분의 세포자멸사 경로들이 궁극적으로는 프로카스파제-3의 활성화를 수반하기 때문에, 업스트림 유전적 기형은 세포자멸사 회로망에서 효과적으로 "절단"되고, 그 결과 이러한 세포는 비정형적으로(atypically) 증식한다. 일단, 암에서 세포자멸사의 중추 역할이 주어지면, 세포자멸사 캐스케이드에서 특정 단백질을 표적화하는 치료제를 개발하려는 노력이 이루어져 왔다. 그러나, 이들 치료제가 세포자멸사 캐스케이드 상의 조기(또는 중간 내지 높은) 위치를 표적으로 하기 때문에, 이들 구성원들의 다운스트림 단백질에 돌연변이를 갖는 암은 여전히, 이들 화합물의 가능한 이득 효과에 내성일 수 있다.
치료 목적을 위해, 세포자멸사 캐스케이드에서 훨씬 다운스트림에 존재하는 전세포자멸사 단백질을 직접 활성화시키는 저분자(small molecule)를 확인하는 것이 유리할 것이다. 이러한 접근법은 캐스케이드에서 상대적으로 낮은 위치를 수반할 수 있으며, 따라서, 심지어 세포의 업스트림 세포자멸사 머시너리에 돌연변이를 가진 세포를 살해할 수 있다. 더욱이, 이러한 치료 전략은, 해당 전세포자멸사 단백질이 암세포에서 상향조절된 경우, 성공 가능성이 더 높을 것이다. 따라서, 세포자멸사의 다운스트림 효과기 단백질인 프로카스파제-3를 표적으로 하는 저분자의 확인은 현재의 암 치료법을 상당히 보조할 것이다.
프로카스파제-3로부터 카스파제-3로의 전환 또는 활성화는 활성 "실행자" 카스파제 형태의 발생을 초래하며, 이 형태는 후속적으로 다수의 단백질 기질들의 가수분해를 촉매한다. 소정의 암에서, 프로카스파제-3의 수준이 정상 조직에 비해 상승되어 있다. 20명의 결장암 환자 유래의 원발성 단리물의 연구는, 프로카스파제-3가 평균적으로, 인접한 비-암성 조직에 비해 이러한 단리물에서 6배 상향조절되었음을 보여주었다. 또한, 프로카스파제-3는 소정의 신경아세포종, 림프종 및 간암에서 상향조절된다. 더욱이, 미국 국립 암 연구소의 치료제 개발 프로그램(National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program)에 의한 암 스크리닝에 사용된 60개의 세포주 패널에서 프로카스파제-3 수준의 전신적인 평가가 수행되었다. 이 평가는, 소정의 폐암, 흑색종, 신장암 및 유방암이 크게 증강된 수준의 프로카스파제-3 발현을 보여준다고 나타내었다. 세포자멸사를 달성하는 데 있어서 활성 카스파제-3의 역할, 소정의 암성 세포 유형에서 프로카스파제-3의 상대적으로 높은 수준, 및 이의 자가활성화의 흥미로운 안전 장치-매개 억제로 인해, 프로카스파제-3를 직접 변형시키는 저분자가, 표적화된 암 치료법에서 큰 적용 가능성을 가질 수 있을 것이다.
더욱이, 암 환자의 치료에 있어서 조합 치료가 점점 더 중요해지고 있다. 조합 치료의 목적은, 화학치료제들 사이에서 상가 효과 또는 상승작용 효과를 달성하여, 단축된 치료 기간, 감소된 독성 및 증가된 환자 생존율을 촉진하는 것이다. 단일 생화학적 경로에 작용하는 약물들은 특히, 이들이 "합성 치사(synthetic lethal)" 유전적 조합을 모방할 수 있기 때문에, 상승작용 또는 강화 작용을 위한 강력한 후보이다. 따라서, 많은 형태의 암의 치료를 위한 보다 효과적인 요법이 긴급하게 요망되고 있으며, 항암 약물들의 새로운 상승작용적 조합이 이러한 목적을 보조할 것이다. 이에, 암세포를 살해하지만, 정상 숙주 조직을 세포독성제의 요망되지 않는 독성으로부터 보호하는 세포독성제들의 새로운 조합을 확인하는 것이 요망되고 있다.
본 발명은 치유적 암 치료를 위한 활성제들의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 암세포 사멸을 유도할 수 있는 저분자 약물을 포함한다. 약물들의 조합은 여러 가지 암 질병 및 암세포 유형, 예컨대 흑색종, 부신, 뇌, 유방, 결장직장, 식도, 방광, 백혈병, 간, 폐, 림프종, 신경아세포종, 난소, 췌장, 신장, 갑상선, 에드헤임-체스터 병(ECD; Erdheim-Chester disease), 랑게르한스 세포 조직구증(LCH; Langerhans'-cell histiocytosis) 및 당업게에 공지된 다른 것들에 적용 가능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 조성물은 프로카스파제-3와 같이 프로그래밍된 세포 사멸 경로 구성원과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용한다. 다양한 실시형태에서, 조성물은 특정 유형의 암세포에 대해 선택적이고, 프로카스파제-3와 같은 프로그래밍된 세포 사멸 경로 구성원과 상호작용하는 다른 화합물들과 비교해 감소된 신경독성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 조합 항암 요법은, "합성 치사" 유전적 조합을 모방하는, 상이한 생화학적 경로들을 표적으로 하는 약물, 또는 동일한 경로 내 상이한 표적들을 때리는 약물을 포함할 수 있다. 프로카스파제-3 활성화제 PAC-1과, V600E 돌연변이를 갖는 BRAF 키나제의 저해제의 조합은, 암세포의 세포자멸사를 상가 효과를 꽤 능가하는 정도까지 유도하는 상당한 상승작용을 보여준다. PAC-1과 이들 BRAF 유전자/효소의 저해제의 조합은, 화합물 단독으로는 최소의 효과를 갖거나 전혀 효과가 없는 종양 모델에서 종양 덩어리를 효과적으로 감소시킬 수 있다. 데이터는, 암 치료에 대한 PAC-1과 이들 BRAF 효소의 저해제의 조합의 상당한 효능을 가리키고, 보다 폭넓게는, 이러한 상승작용적 조합이 상당히 증가된 치유적 이득을 제공할 수 있음을 보여준다.
이에, 본 발명은 (a) 화합물 PAC-1:
Figure pct00001
;
(b) 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인 제2 활성제; 및
(c) 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체
를 포함하는 조성물을 제공한다.
돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제는 예를 들어, 베무라페닙(vemurafenib), 다브라페닙(dabrafenib), BMS-908662(Bristol-Myers Squibb), 엔코라페닙(encorafenib)(LGX818)(Novartis), PLX3603(RO5212054)(Hofmann-LaRoche), RAF265(Novartis), 소라페닙(sorafenib) 또는 상기 언급된 활성제들 중 하나의 유도체 또는 전구약물일 수 있다. BRAF 효소의 특히 효과적인 저해제는 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제이다. 이러한 저해제로는, 베무라페닙 및 다브라페닙이 있다. 다른 실시형태에서, 조성물은 MEK 저해제, 예컨대 트라메티닙(trametinib)을 추가로 포함한다. 대안적으로, 제2 활성제(이러한 제제는 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제임)는 별개의 2-제제 조성물을 제공하기 위해, MEK 저해제, 예컨대 트라메티닙으로 대체될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 이들 활성제는 환자에게 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 조성물용 담체로는, 물 및/또는 활성제를 유리하게 전달하기 위한 선택적인 구성성분, 예컨대 완충제, 당(sugar), 셀룰로스, 사이클로덱스트린 또는 이들의 다양한 조합들이 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 사이클로덱스트린은 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린이다.
본 발명은 또한, 암세포의 성장 또는 증식의 저해 방법을 제공한다. 이러한 방법은 암세포를 본원에 기재된 유효량의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 조성물은 PAC-1(즉, 제1 활성제) 및 하나 이상의 제2 활성제(예를 들어, 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제, 및/또는 MEK 저해제) 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 조성물이 PAC-1 및 제2 활성제 중 오로지 하나만 포함하는 경우, 상기 방법은 후속적으로 암세포를 나머지 다른 것(들)과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 또한, 암세포를, PAC-1 및 제2 활성제와 동시에 또는 순차적으로, 유효량의 MEK 저해제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 암세포를 이들 활성제(예를 들어, PAC-1 및 제2 및/또는 제3 활성제)와 접촉시키는 것은 암세포의 성장 또는 증식을 효과적으로 저해한다.
나아가, 본 발명은 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법을 추가로 제공한다. 본 방법은 암세포를 유효량의 PAC-1 및 유효량의 제2 및/또는 제3 활성제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 방법에 의해 세포자멸사가 암세포에서 유도된다. 접촉은 시험관내에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 접촉은 생체내에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 암세포는 PAC-1 및 제2 활성제와 동시에 접촉될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 암세포는 제2 활성제와 접촉된 후, PAC-1과 접촉될 수 있다. 보다 다른 실시형태에서, 암세포는 PAC-1과 접촉된 후, 제2 활성제와 접촉될 수 있다. 제3 활성제(예를 들어, MEK 저해제)는 PAC-1 이전 또는 이후에, 및 제2 활성제 이전 또는 이후에, 암세포에 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 암 치료가 필요한 환자에서 암의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게, 치료적 유효량의 PAC-1의 화합물, 및 돌연변이, 예를 들어 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인 제2 활성제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 방법에 의해 암이 치료된다. 소정의 구체적인 실시형태에서, 제2 활성제는 베무라페닙 또는 다브라페닙이다:
Figure pct00002
.
상기 고찰된 바와 같이, PAC-1 및 제2 활성제는 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, PAC-1 및 제2 활성제는 순차적으로 투여된다. 순차적으로 투여될 때, 제2 활성제는 PAC-1 이전에 투여될 수 있거나, 제2 활성제는 PAC-1 이후에 투여될 수 있다. 부가적인 실시형태에서, 치료적 유효량의 MEK 저해제는 환자에게 투여될 수 있다. MEK 저해제는 PAC-1 및 제2 활성제에 대하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 다양한 실시형태에서, MEK 저해제는 PAC-1 또는 제2 활성제 이전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다.
접촉되거나 치료되는 암(또는 경우가 그럴 수 있다면 암세포)은 예를 들어, 흑색종, 부신암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 방광암, 간암, 폐암, 림프종, 신경아세포종, 난소암, 췌장암, 신장암, 갑상선암, 에드헤임-체스터 병(ECD), 랑게르한스 세포 조직구증(LCH), 또는 모양세포(hairy-cell) 백혈병을 포함하여 백혈병일 수 있다. 흑색종은 베무라페닙-내성 흑색종을 포함하여 BRAFi-내성 흑색종일 수 있다. 갑상선암은 유두상 갑상선암일 수 있다. 폐암은 비소세포폐암(NSCLC)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 뇌암, 림프종, 또는 뼈 조직 내 암세포일 수 있다. 예를 들어, 암은 교아종 또는 희소돌기아교세포종일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 암세포는 골육종 세포일 수 있고, 치료되는 암은 골암이다. 살해되거나 저해될 수 있는 다른 유형의 암세포, 및 치료될 수 있는 다른 암성 질환은 하기에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 의학적 요법에 사용하기 위한 본원에 기재된 조성물의 용도를 제공한다. 의학적 요법은 암, 예를 들어, 흑색종 및/또는 본원에 언급된 다른 암을 치료할 수 있다. 본 발명은 또한, 포유류에서 질병, 예를 들어, 인간에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 약제는 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
하기 도면은 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 소정의 실시형태 또는 다양한 양태들을 더 나타내기 위해 포함된다. 일부 경우, 본 발명의 실시형태는 본원에 제시된 상세한 설명과 함께 첨부된 도면을 참조로 하여 가장 잘 이해될 수 있다. 상세한 설명 및 첨부된 도면은 본 발명의 소정의 구체적인 실시예 또는 소정의 양태를 강조할 수 있다. 그러나, 당업자는, 실시예 또는 양태의 일부가 본 발명의 다른 실시예 또는 양태와 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1a 내지 1c. V600EBRAF 또는 WTBRAF 세포주에서 베무라페닙 및 PAC-1의 효과. (a) 9개의 세포주의 패널에서 베무라페닙 및 PAC-1의 IC50 값(5일). (b) 및 (c): V600EBRAF를 가진 세포주는 베무라페닙(10 μM) 및 PAC-1(12 μM)(b), 또는 베무라페닙(0.5 μM) 및 PAC-1(12 μM)(c)을 24시간 동안 처리한 후 세포자멸사(아넥신 V-FITC/PI 염색에 의해 평가됨)를 겪는 세포를 상당히 더 높은 퍼센트로 갖는 반면, 이러한 조합은 야생형 BRAF를 가진 세포주 상에서는 무시할 만한 효과를 가진다. 수평 파선은 2개의 제제들의 단순한 상가 효과로부터 예상된 세포 사멸의 수준을 나타낸다. 값은 적어도 3개의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 세포자멸사의 유도를 위한 조합이 개별 제제의 상가 효과(수평 파선)와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 통계학적으로 유의하다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 2a 내지 2e. PAC-1+베무라페닙은 A375 세포에서 세포자멸사 및 카스파제 활성을 유도하기 위해 강력하게 상호작용을 한다. (a) 24시간의 처리 후 유도된 세포자멸적 세포 사멸(아넥신 V/PI 염색 및 유세포 분석에 의해 평가됨) 퍼센트가 도시되어 있다. 표시된 값은, 백색은 저(low) % 세포자멸적 세포 사멸을 나타내고 진회색은 고(high) % 세포자멸적 세포 사멸을 나타내는 것으로 열 지도화(heat mapped)되어 있다. (b) Combosyn 소프트웨어와의 각각의 조합에 대해 계산된 조합 지수(CI; combination index). CI 값은 최저값은 연회색으로 최고값은 검정색으로 열 지도화되어 있다. (c) 상당한 카스파제-3/-7 효소적 활성은 PAC-1과 베무라페닙의 조합으로 처리된 세포에서 관찰된다. PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 거의 효과가 없다(모든 시점에서 p-값 vs. DMSO 대조군 > 0.1). 세포 용해물에서 카스파제-3/-7 활성은 플루오로제닉 Ac-DEVD-AFC 기질을 이용하여 평가되었다. 활성은 양성 대조군으로서 1 μM 스타우로스포린(STS)과 함께 검정법 내에서 관찰된 최소 활성 및 최대 활성으로 정상화된 바와 같이 표현되어 있다. 조합이 상가 효과와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 지시된 시점에서 통계학적으로 유의하다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). (d) PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 A375 세포에서 PARP-1 절단에 거의 효과가 없으나, 조합에서 상당한 PARP-1 절단이 웨스턴 블롯을 통해 관찰된다. (e) 24시간 후, ERK1/2 인산화의 무(no)/낮은(low) 저해는 저농도의 베무라페닙(0.1 μM 및 0.25 μM)에서 관찰되었다. 더 높은 농도의 베무라페닙(0.5 μM 및 1 μM)에서, ERK1/2의 인산화는 PAC-1의 첨가와 함께 또는 없이 효과적으로 저해되었으며, 이는, PAC-1의 효과가 MAPK 경로의 다운스트림임을 가리킨다. 그러나, 절단된 PARP-1은 심지어 베무라페닙의 농도(0.1 μM 및 0.25 μM)에서도 베무라페닙/PAC-1 조합으로 처리된 세포에서만 관찰되었으며, 여기서, ERK1/2 인산화의 불완전한 저해가 관찰되었다. 값은 적어도 3개의 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다.
도 3a 내지 3c. 베무라페닙 + 트라메티닙의 조합에 PAC-1의 첨가는 A375 및 UACC-62 세포에서 강력하게 상승작용하여, 세포자멸사 및 카스파제 활성을 유도한다. (a) 24시간의 처리 후 세포자멸적 세포 사멸 퍼센트가 도시되어 있다. 트라메티닙(100 nM)과 베무라페닙(10 μM)의 조합은 세포자멸사 세포 집단에서 최소의 증가를 초래한다. PAC-1(12 μM)의 첨가는 세포자멸사 세포 집단에서 급격한 증가를 초래하며, 이러한 증가는 3개 제제들의 상가 효과를 능가한다. (b) 조합에서 트라메티닙(100 nM) 및 베무라페닙(10 μM)은 A375 및 UACC-62 세포에서 PARP-1 절단에 거의 효과가 없으나, PAC-1(12 μM)이 첨가된 경우 상당한 PARP-1 절단 및 프로카스파제-3 수준의 감소가 웨스턴 블롯을 통해 관찰된다. (c) 베무라페닙과 트라메티닙의 조합은 카스파제-3/-7 활성의 상가 증가를 초래하지만, PAC-1의 첨가는 24시간 후 A375 및 UACC-62에서 카스파제-3/-7 효소적 활성의 상당한 증가를 초래한다. PAC-1(12 μM), 베무라페닙(10 μM) 및 트라메티닙(100 nM) 단독은 거의 효과가 없다(p-값 vs. DMSO 대조군 > 0.1). 활성은 양성 대조군에 대해 정상화된 바와 같이 표현된다. 수평 파선은 2개 제제들의 단순한 상가 효과로부터 예상된 세포 사멸의 수준을 나타낸다. 값은 적어도 3개의 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 세포자멸사의 유도를 위한 조합이 개별 제제의 상가 효과와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 통계학적으로 유의하다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 4a 내지 4e. PAC-1+베무라페닙 조합은 흑색종의 A375 피하 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장을 지연시킨다. (a) A375 모델에서 PAC-1, 베무라페닙 및 이들의 조합의 효과. 피하 종양을 가진 마우스가 15일 동안 투약을 받았다. 마우스에게 PAC-1을 100 mg/kg(n=6)에서 1일 1회 i.p. 주사를 통해 투약하거나, 베무라페닙을 10 mg/kg(n=8)에서 (p.o.)에 의해 1일 2회 투약하거나 PAC-1+베무라페닙 조합(n=8)을 투약하였다. x-축 아래의 검정색 선은 연구 동안 마우스에 대한 투약 기간을 가리킨다. 종양 부피는 평균 ± SEM으로서 도시되어 있다. (b) 절제된 종양의 질량. (c) 종양 용해물은 프로카스파제-3 수준의 변화에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화되었다. (d) 액틴 로딩 대조군에 대해 정상화된 프로카스파제-3 수준의 플롯. (e) 포르말린 고정된 종양 시료의 면역조직화학 염색 후 Ki-67에 대해 양성인 세포의 퍼센트. 2,000개의 세포는 4개의 처리군 각각에 대한 각각의 시료에서 계수되었다. P-값은 대조군 마우스에 대해 나타나 있다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 5a 내지 5d. 저농도의 PAC-1(1 μM)은 장기간 세포 배양 실험에서 베무라페닙과 조합 시 세포 재성장을 상당히 지연시킨다. (a) 베무라페닙 및 PAC-1로 처리된 A375 세포에서 Emax 값의 비교. (b) PAC-1(4 μM) 또는 베무라페닙(10 μM)으로 30일 동안 처리된 A375 및 SK-MEL-5 세포. (c) A375 세포는 PAC-1(1 μM), 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM) 또는 조합으로 처리되었다. 5일, 10일 또는 20일 후, 웰들은 10% 트리클로로아세트산으로 고정되었으며, 0.5% 설포로다민 B(SRB) 염료로 염색되었고, BioRad GelDoc RX를 이용하여 이미지화되었다. 대조군 및 PAC-1 시료의 제20일 이미지는, 세포가 과밀 현상으로 인해 성장할 수 없었기 때문에 나타내지 않는다. (d) SRB 염료가 pH 10.4에서 10 mM Tris 염기에 용해되는 (c)의 정량화, 및 510 nm에서의 흡광도 판독. 510 nm에서의 교정된 흡광도가, 처리 시작 전 제0일에서의 흡광도에 대해 정상화함으로써 연속 처리 일수에 대해 도시되었다. 값은 적어도 3개의 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. T-테스트는 베무라페닙 단독으로 처리된 웰 대(versus) 베무라페닙 및 PAC-1(1 μM)로 처리된 웰 사이에 수행되었다. 제10일에, 오로지 베무라페닙(10 μM) 및 PAC-1(1 μM)로 처리된 웰만 베무라페닙(10 μM) 단독(p=0.049) 처리와 상당히 상이하다. 제20일에, 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM) 및 PAC-1(1 μM)로 처리된 웰은 나타낸 바와 같이, 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM)과 상당히 상이하다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 6a 내지 6d. PAC-1은 베무라페닙-내성 A375VR 세포에서 활성을 보유한다. (a) 베무라페닙은 부모 A375와 비교하여 A375R에서 활성이 상당히 더 낮다. (b) 0.5 μM 또는 1 μM의 베무라페닙의 처리는 2시간 후 A375VR에서 ERK1/2의 인산화를 저해하지 못한다. 동일한 조건 하에, ERK1/2 인산화의 완전한 저해는 부모 A375 세포주에서 관찰되었다. (c) PAC-1은 A375R 세포주에서 활성을 보유한다. 값은 적어도 3개의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. (d) A375VR 이종이식 모델에서 PAC-1, 베무라페닙 및 이들의 조합의 효과. 피하 종양을 가진 마우스는 15일 동안 투약을 받았다. 마우스에게 PAC-1을 100 mg/kg(n=7)에서 1일 2회 i.p. 주사에 의해 투약하거나, 베무라페닙을 10 mg/kg(n=5)에서 (p.o.)에 의해 1일 2회 투약하거나 PAC-1+베무라페닙 조합(n=5)을 투약하였다. x-축 아래의 검정색 선은 연구 동안 마우스에 대한 투약 기간을 가리킨다. 종양 부피는 평균 ± SEM으로서 도시되어 있다. 표시된 P-값은 대조군 마우스에 대한 것이다(* p<0.05).
도 7a 내지 7e. PAC-1 및 베무라페닙은 SK-MEL-5 세포에서 세포자멸사 및 카스파제 활성을 유도하기 위해 강력하게 상호작용한다. (a) 24시간의 처리 후 유도된 세포자멸적 세포 사멸(아넥신 V/PI 염색 및 유세포 분석에 의해 평가됨) 퍼센트가 도시되어 있다. 표시된 값은, 백색은 저 % 세포자멸적 세포 사멸을 나타내고 진회색은 고% 세포자멸적 세포 사멸을 나타내는 것으로 열 지도화되어 있다. (b) Combosyn 소프트웨어와의 각각의 조합에 대해 계산된 조합 지수(CI). CI 값은 최저값은 연회색으로 최고값은 검정색으로 열 지도화되어 있다. (c) 상당한 카스파제-3/-7 효소적 활성은 PAC-1과 베무라페닙의 조합으로 처리된 세포에서 관찰되며; PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 거의 효과가 없다(모든 시점에서 p-값 vs. DMSO 대조군 > 0.1). 세포 용해물에서 카스파제-3/-7 활성은 플루오로제닉 Ac-DEVD-AFC 기질을 이용하여 평가되었다. 활성은 양성 대조군으로서 1 μM 스타우로스포린(STS)과 함께 검정법 내에서 관찰된 최소 활성 및 최대 활성으로 정상화된 바와 같이 표현되어 있다. (d) PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 SK-MEL-5 세포에서 PARP-1 절단에 거의 효과가 없으나, 조합에서 상당한 PARP-1 절단이 웨스턴 블롯을 통해 관찰된다. (e) 24시간 후, 베무라페닙(0.5 μM 및 1 μM)은 PAC-1의 첨가와 함께 또는 없이 ERK1/2의 인산화를 저해하였으며, 이는, PAC-1의 효과가 MAPK 경로의 다운스트림임을 가리킨다. 그러나, 절단된 PARP-1은 베무라페닙/PAC-1 조합으로 처리된 세포에서만 관찰되었다. 값은 적어도 3개의 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 조합이 상가 효과와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 지시된 시점에서 통계학적으로 유의하다(* p<0.05, *** p<0.001).
도 8a 내지 8e. PAC-1 및 베무라페닙은 UACC-62 세포에서 강력하게 상승작용하여, 세포자멸사 및 카스파제 활성을 유도한다. (a) 24시간의 처리 후 유도된 세포자멸적 세포 사멸(아넥신 V/PI 염색 및 유세포 분석에 의해 평가됨) 퍼센트가 도시되어 있다. 표시된 값은, 백색은 저 % 세포자멸적 세포 사멸을 나타내고 진회색은 고% 세포자멸적 세포 사멸을 나타내는 것으로 열 지도화되어 있다. (b) Combosyn 소프트웨어와의 각각의 조합에 대해 계산된 조합 지수(CI). CI 값은 최저값은 연회색으로 최고값은 검정색으로 열 지도화되어 있다. (c) 상당한 카스파제-3/-7 효소적 활성은 PAC-1과 베무라페닙의 조합으로 처리된 세포에서 관찰되며, PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 거의 효과가 없다(모든 시점에서 p-값 vs. DMSO 대조군 > 0.1). 세포 용해물에서 카스파제-3/-7 활성은 플루오로제닉 Ac-DEVD-AFC 기질을 이용하여 평가되었다. 활성은 양성 대조군으로서 1 μM STS와 함께 검정법 내에서 관찰된 최소 활성 및 최대 활성으로 정상화된 바와 같이 표현되어 있다. (d) PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 UACC-62 세포에서 PARP-1 절단에 거의 효과가 없으나, 조합에서 상당한 PARP-1 절단이 웨스턴 블롯을 통해 관찰된다. (e) 24시간 후, 베무라페닙(0.5 μM 및 1 μM)은 PAC-1의 첨가와 함께 또는 없이 ERK1/2의 인산화를 저해하였으며, 이는, PAC-1의 효과가 MAPK 경로의 다운스트림임을 가리킨다. 최소 절단된 PARP-1은 PAC-1 단독 처리된 세포에서 관찰되었으며, 이러한 최소 절단된 PARP-1은 베무라페닙/PAC-1 조합으로 처리된 세포에서 뚜렷하게 증가되었다. 값은 적어도 3개의 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 조합이 상가 효과와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 지시된 시점에서 통계학적으로 유의하다(*** p<0.001).
도 9a 내지 9d. 아넥신 V-FITC/PI 플롯에 의해 평가된 바와 같이, (a) A375, (b) SK-MEL-5 및 (c) UACC-62 세포주에서 24시간 처리 후, 세포주에서 PAC-1a(12 μM) vs 베무라페닙(30 μM)과 조합된 PAC-1(12 μM)의 효과. 보고된 세포자멸사 퍼센트는 DMSO 대조군 시료에 대해 정상화되어 있다. 수평 파선은 2개 제제들의 단순한 상가 효과로부터 예상된 세포 사멸의 수준을 나타낸다. (d) PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(10 μM) 단독은 A375 세포에서 PARP-1 절단에 최소의 효과를 가지지만, 증가된 PARP-1 절단이 조합에서 관찰된다. 베무라페닙(10 μM)과 조합된 PAC-1a(12 μM)는 PARP-1 절단을 증가시키지 않는다. 값은 적어도 3개의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 세포자멸사의 유도를 위한 조합이 개별 제제의 상가 효과(수평 파선)와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 통계학적으로 유의하다(*** p<0.001).
도 10a 내지 10c. WTBRAF를 가진 MIA PaCa-2(돌연변이체 KRAS 및 WTBRAF) 및 CHL-1(WTKRAS 및 WTBRAF) 세포주에서 PAC-1 및 베무라페닙 조합의 효과. (a) 프로카스파제-3 활성화에 대한 효과는, PAC-1(12 μM) + 베무라페닙(30 μM)으로 처리된 경우, MIA PaCa-2 및 CHL-1 세포주에서 관찰되지 않는다. 세포 용해물에서 카스파제-3/-7 활성은 플루오로제닉 Ac-DEVD-AFC 기질을 이용하여 평가되었다. 활성은 양성 대조군으로서 1 μM STS와 함께 검정법 내에서 관찰된 최소 활성 및 최대 활성으로 정상화된 바와 같이 표현되어 있다. (b) PARP-1 절단에 대한 효과는 24시간 후 MIA PaCa-2 세포에서 관찰되지 않았다. (c) PAC-1(12 μM) 및 베무라페닙(30 μM)은 24시간 처리 후 CHL-1 세포에서 PARP-1 절단에 대해 아무런 효과가 없다. 값은 적어도 3개의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다.
도 11. 15일간의 연속 투약 후, 안락사된 종양-가진 마우스의 이미지. 4개의 처리군은 대조군(n=6, 0 mg/kg PAC-1 및 베무라페닙); 100 mg/kg PAC-1로 1일 1회 처리된 마우스(n=6), 10 mg/kg 베무라페닙으로 1일 2회 처리된 마우스(n=8), 및 100 mg/kg PAC-1(1일 1회)과 10 mg/kg 베무라페닙(1일 2회)의 조합으로 처리된 마우스(n=8)이다.
도 12a 내지 12b. UACC-62 세포에 대한 장기간의 베무라페닙 처리에 PAC-1(1 μM)의 첨가는 세포 재성장을 상당히 지연시킨다. (a) UACC-62 세포는 PAC-1(1 μM), 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM) 또는 조합으로 처리되었다. 배지는 2일 내지 3일마다 세척해 냈고, 새로운 화합물이 각각의 웰에 첨가되었다. 5일, 10일 또는 20일 후, 웰들은 10% 트리클로로아세트산으로 고정되었으며, 0.5% 설포로다민 B(SRB) 염료로 염색되었고, BioRad GelDoc RX를 이용하여 이미지화되었다. 대조군 및 PAC-1 시료의 제20일 이미지는, 세포가 과밀 현상으로 인해 성장할 수 없었기 때문에 나타내지 않는다. (b) SRB 염료가 pH 10.4에서 10 mM Tris 염기에 용해되는 (a)의 정량화, 및 510 nm에서의 흡광도 판독. 510 nm에서의 교정된 흡광도가, 처리 시작 전 제0일에서의 흡광도에 대해 정상화함으로써 연속 처리 일수에 대해 도시되었다. 값은 적어도 3개의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 2-테일드 T-테스트는 베무라페닙 단독으로 처리된 웰 대 베무라페닙 및 PAC-1(1 μM)로 처리된 웰 사이에 수행되었다. 제10일에, 오로지 베무라페닙(10 μM) 및 PAC-1(1 μM)로 처리된 웰만 베무라페닙(10 μM) 단독(p=0.035) 처리와 상당히 상이하다. 제20일에, 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM) 및 PAC-1(1 μM)로 처리된 웰은 그래프에 나타난 바와 같이, 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM)과 상당히 상이하다(* p<0.05, *** p<0.001).
도 13a 내지 13c. A375VR 세포에서 PAC-1과 베무라페닙 조합의 효과. (a) 24시간의 처리 후 유도된 세포자멸적 세포 사멸(아넥신 V/PI 염색 및 유세포 분석에 의해 평가됨) 퍼센트가 도시되어 있다. (b) (a)에서 관찰된 세포자멸적 세포 사멸은 Bliss 독립 모델에 의해 예측된 것보다 더 크다. 과잉의 세포 사멸은 [f(관찰된, 세포자멸사 ) - (f(PAC-1, 세포자멸사 ) + f( 베무라페닙 , 세포자멸사 ) - f(PAC-1, 세포자멸사 )*f( 베무라페닙 , 세포자멸사 ))]*100%로서 계산된다. 이는, 관찰된 효과가 상가 효과라기보다는 상승작용 효과임을 가리킨다. (c) 24시간 후, A375VR에서 세포자멸사를 활성화시키는 데 있어서 PAC-1 및 베무라페닙의 상승작용 효과. 이러한 효과는 비활성 PAC-1a가 사용된 경우, 없어진다. 수평 파선은 2개 제제들의 단순한 상가 효과로부터 예상된 세포 사멸의 수준을 나타낸다. 값은 적어도 3개의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM으로서 보고된다. 세포자멸사의 유도를 위한 조합이 개별 제제의 상가 효과(수평 파선)와 상이한지 확인하기 위해 2-웨이 상호작용에 대해 나타낸 P-값은 통계학적으로 유의하다(*　p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
많은 암들은 표준 화학요법에 내성이거나, 일정 시간 후 특정 화학치료제에 내성을 갖게 된다. 본원에 기재된 조합 치료는 PAC-1에 의한 프로카스파제-1 활성화를 이용하며, 이는 제2 활성제, 예컨대 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제의 화학치료 특성과 상승작용하여, 활성제들 중 하나 단독으로는 효과가 덜 하거나 완전히 비효과적인 조건 하에 효능을 제공할 수 있다. 이들 화합물은 또한, 표적화된 암 치료법에 성공적일 수 있으며, 여기서, 암세포의 살해에 있어서 선택성이라는 이점이 존재할 수 있으며, 더불어 더 낮은 수준의 프로카스파제-3를 가진 비-암성 세포에 대한 유사하게 감소된 부반응이 존재한다. 이들 감소된 부반응은 독성, 특히 신경독성의 감소를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 화합물, 조성물 및 방법의 조합은 암 치료에 효과적이기 위해, 세포자멸사 또는 프로그래밍된 세포 사멸 및 다른 화학치료 메커니즘의 조정을 통해 작용할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포자멸사의 조정은 세포자멸사의 유도 또는 활성화에 의한 것이다. 다양한 실시형태에서, 화합물의 투여는 동시적일 수 있거나, 또는 대안적으로 순차적일 수 있다.
따라서, 본 발명은 예를 들어, 흑색종, 결장직장암, 갑상선암, 폐암 또는 난소암의 치료를 위한, PAC-1에 의한 활성제의 강화 방법을 제공한다. 세포자멸사 동안, 자이모겐 프로카스파제-3는 단백분해를 통해 카스파제-3로 활성화되고, 그런 다음 이러한 활성 카스파제-3는 세포 기질의 스코어를 절단하여, 세포자멸사 프로그램을 실행한다. 프로카스파제-3 단백질 수준이 다양한 종양 조직학에서 상승되어 있기 때문에, 프로카스파제-3의 약물-매개 직접적인 활성화는 선택적인 항암 전략으로서 고도로 효과적일 수 있다.
소정의 화합물은 프로카스파제-3의 활성 및 자가성숙을 증강시키고, 암세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있다. 프로카스파제-활성화 화합물-1(PAC-1)은 저해성 아연 이온의 킬레이트화를 통해 프로카스파제-3의 활성을 증강시키고, 배양중인 암세포에서 세포자멸사를 유도하고, 다수의 뮤린 종양 모델들에서 효능을 가진다. PAC-1과, 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제의 신규 조합은 본원에 기재된 바와 같이 암세포의 치료에 있어서 상승작용적으로 효과적인 것으로 확인되어 왔다. PAC-1이 세포자멸사 캐스케이드에서 후기에 작용하기 때문에, PAC-1은 본원에 기재된 바와 같이 광범위한 화학치료 활성제들과 함께 독특하게 상승작용할 수 있다.
흑색종은 가장 흔한 피부 악성 종양이고, 전이 시 가장 치명적인 형태의 피부암으로 간주된다. 흑색종은 미국에서 5번째로 가장 흔한 암이다. 흑색종에서 하나의 보편적인 돌연변이는 BRAF 단백질의 키나제 도메인에서 글루타메이트로부터 발린으로의 치환(V600E)이다(문헌[Davies et al., Nature 2002, 417, 949]). V600E 돌연변이는 BRAF 및 다운스트림 MEK-ERK 신호전달 경로를 구성적으로(constitutively) 활성화시켜, 종양 형성을 초래한다. 대략 50%의 흑색종이 BRAF 단백질에 V600E 돌연변이를 갖고 있다는 발견은 V600EBRAF 저해제의 개발, 및 2011년에는 베무라페닙의 후속적인 승인을 고취시켰다. 베무라페닙(및 다브라페닙, 2013년에 승인됨)과 같은 V600EBRAF 저해제는 수주 동안의 요법 내에서 종양 덩어리의 뚜렷한 감소를 초래하고, 무진행 생존율을 3개월 내지 4개월만큼 연장시킨다.
V600EBRAF 저해제들의 초기 항-흑색종 활성에도 불구하고, V600EBRAF 저해제에 대한 내성이 급속하게 출현한다. 대부분의 내성 종양들에서, MAPK 신호전달 경로의 재활성화가 관찰되며, 이는 전이성 흑색종에 대한 치료 섭생에 MEK1/2 저해제(예를 들어, 트라메티닙)를 첨가할 것을 자극한다. MEK1/2 및 V600EBRAF 저해제를 이용한 업프론트 조합 치료는 과거에 V600EBRAF 저해 치료를 받지 않은 환자에서 내성까지의 중앙 시간을 3.7개월 내지 4.1개월만큼 지연시키는 데 효과적이지만, 과거에 V600EBRAF 저해제 요법에 이미 실패한 환자에게 MEK1/2 저해제의 첨가는 항암 효능에서 미미한 개선을 초래할 뿐이다. 기존의 치료법들이 가진 현재의 임상적 한계들로 인해, 다른 키나제 저해제를 이용한 신규 및 합리적으로-설계된 조합 연구가 탐구되고 있다. 현재까지의 모든 노력에도 불구하고, 표적화된 V600EBRAF 요법에 대한 내성의 발달은 사실상 치료되는 환자의 100%에서 출현하며; 이러한 부류의 제제에 대한 획득된 약물 내성은 전이성 흑색종 환자에 있어서 크게 증강된 생존율 이득에 대한 상당한 방해물로 남는다.
베무라페닙과, 다양하고 약물-표적화 가능한(druggable) 키나제의 저해제의 조합에 초점을 맞춘 많은 연구들과는 대조적으로, 베무라페닙과, 세포자멸사 경로를 활성화시키는 제제의 조합 치료는 폭넓게 탐구된 적이 없다. 부분적으로, 이러한 탐구의 결여는, 흑색종 세포들이 이들의 세포자멸사 신호전달 경로에 다수의 결함들을 가져서, 이들 세포가 많은 전세포자멸사 자극에 대해 내성이 된다는 사실에 기인할 것이다. 본 발명자들은, 이들 세포자멸사의 세포자멸사 다운스트림을 유도하는 적합한 세포자멸사 제제가 V600EBRAF 저해제와 함께 고도로 상승작용적일 것이라고 가정하였다.
흑색종 세포에서 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 변이(aberration)가 프로카스파제-3의 활성화의 업스트림에 존재한다면, 프로카스파제-3를 직접적으로 활성화시키는 약물이 이러한 조합 치료에 대한 매력적인 후보이다. 또한, 흑색종이 상승된 프로카스파제-3 발현을 갖고 있기 때문에, 프로카스파제-3 활성화제는 이러한 세포에 대해 강력하고 선택적이어야 한다. 더욱이, V600EBRAF 저해제는 카스파제-3에 의해 매개된 세포자멸적 세포 사멸을 유도하며; 따라서, 베무라페닙과 직접적인 프로카스파제-3 활성화제의 조합은 단일 제제의 효과와 비교해 크게 증강된 카스파제-3 활성 및 암세포 사멸을 초래할 수 있을 것으로 공지되어 있다. PAC-1은 불안정한 저해성 아연의 킬레이트화를 통해 세포성 프로카스파제-3를 직접적으로 활성화시키는 저분자이다. 다양한 기원의 암에서 프로카스파제-3의 과발현으로 인해, PAC-1 및 이의 유도체는 비-암성 세포를 보존하면서도 암세포에서 세포자멸사를 선택적으로 유도한다. PAC-1은 흑색종의 이종이식 모델을 포함하여 암의 다수의 뮤린 모델들에서 단일 제제 활성을 발휘한다. 중요하게는, 뮤린 종양 모델에서 선호할만한 예비임상 활성 외에도, 인간 암 환자는 2015년 3월부터 I상 임상 시험의 일부로서 PAC-1을 투약해 왔다(NCT02355535).
최초로 승인된 BRAF 저해제인 베무라페닙은 V600E BRAF 단백질을 가진 흑색종 환자에 대한 표적화된 요법이다(문헌[Bollag et al., Nat. Rev. Drug Discov . 2012, 11, 873]). 베무라페닙을 이용한 치료는 세포자멸사 및 신속한 종양 퇴행을 초래하여, V600E BRAF 단백질을 가진 흑색종 환자의 무진행 생존율을 5.3개월만큼 연장시킨다(문헌[McArthur et al., Lancet Oncol . 2014, 15, 323]). 베무라페닙이 흑색종의 치료에 있어서 상당한 진전을 나타내긴 하지만, 내성의 시작은 클리닉에서 상당한 염려거리가 되어 왔다. 베무라페닙과 MEK 저해제의 조합 치료는 임상적으로 무진행 생존율의 기간을 3.7개월만큼 연장시키는 것으로 시험되었으나, 궁극적으로는 RAF-MEK-ERK 경로의 재활성화로 인해 내성이 발생한다(문헌[Larkin et al., N. Engl . J. Med . 2014, 371, 1867]).
세포자멸사 캐스케이드에서 실행자 카스파제인 프로카스파제-3의 상승된 발현은 흑색종을 포함한 다양한 암들에서 보고되어 왔다(문헌[Fink et al., Melanoma Res. 2001, 11, 385]; [Chen et al., Hum. Pathol . 2009, 40, 950]). 따라서, 프로카스파제-3의 저분자 활성화는, 세포자멸사 캐스케이드에서 프로카스파제-3에 의해 작동되는 주요 역할로 인해 흑색종에 대한 매력적인 치료 전략이다. 프로카스파제-3 활성화 화합물 1(PAC-1)은, 프로카스파제-3를 저해하는 아연 이온의 불안정한 풀을 킬레이트화시켜, 암세포를 세포자멸사에 대해 프라이밍(priming)하는 저분자이다(문헌[Peterson et al., J. Mol . Biol . 2009, 388, 144]). PAC-1은 흑색종의 뮤린 이종이식 모델에서 단일 제제 효능을 나타내었으며, 항암 전략으로서의 프로카스파제-3 활성화의 잠재성을 입증한다(문헌[Wang et al., Mol . Oncol . 2014, 8, 1640]). PAC-1이 세포를 세포자멸사에 대해 프라이밍하고 베무라페닙이 암세포에서 세포자멸사를 유도한다는 점에서, 본 발명자들은, PAC-1과 조합된 베무라페닙이 치료 효능을 크게 증강시킴을 확인한다.
본 발명자들은 최근, PAC-1이, 최근 흑색종 치료에 대해 승인된 약물인 베무라페닙(젤보라프(zelboraf)로서 판매됨)을 비롯하여 V600E 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제와 함께 뛰어난 상승작용을 보여줌을 발견하였다. 본 발명자들의 데이터를 기반으로(도 1 내지 13 참조), PAC-1은 이 부류의 모든 약물들(V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제)과 동등한 상승작용을 보일 것이며, 상기 부류의 약물은 또한 다브라페닙(상표명 타핀라(tafinlar)) 및 다른 것들을 포함한다.
V600E BRAF 단백질을 함유하는 여러 가지 흑색종 세포주들에서 세포자멸적 세포 사멸을 증강시키는 데 있어서, V600E 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제, 예컨대 베무라페닙과 PAC-1의 상승작용적 활성은 본원에 기재되어 있다. 중요하게는, PAC-1은 베무라페닙-내성 A375R 세포주에서 활성을 보유하며, 이는, BRAF-저해제 치료를 벗어나서 진행된 흑색종에서 PAC-1의 유용성을 가리킨다.
정의
하기 정의는 명세서 및 청구항의 명료하고 일관적인 이해를 제공하기 위해 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 언급된 용어는 하기 의미를 가진다. 본 명세서에서 사용된 모든 다른 용어들 및 구어들은 당업자가 이해하는 바와 같이 이들의 통상적인 의미들을 가진다. 이러한 통상적인 의미는 기술적 사전, 예컨대 문헌[Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001]을 참조로 하여 수득될 수 있다.
명세서에서 "하나의 실시형태", "일 실시형태" 등의 지칭은, 기재된 실시형태가 특정한 양태, 특색, 구조, 모이어티 또는 특징을 포함할 수 있으나, 모든 실시형태가 본질적으로 해당 양태, 특색, 구조, 모이어티 또는 특징을 포함하는 것은 아님을 가리킨다. 더욱이, 이러한 구어는 명세서의 다른 부분에서 지칭된 동일한 실시형태를 지칭할 수 있지만, 본질적으로 그런 것은 아니다. 나아가, 특정 양태, 특색, 구조, 모이어티 또는 특징이 실시형태와 함께 기재된 경우, 이러한 양태, 특색, 구조, 모이어티 또는 특징을, 명쾌하게 기재되거나 기재되지 않았든간에 다른 실시형태에 영향을 주거나 다른 실시형태와 연결하는 것은 당업자의 지식 내에 포함된다.
단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다, 따라서, 예를 들어, "일 화합물"의 지칭은 복수의 이러한 화합물들을 포함하며, 따라서, 화합물 X는 복수의 화합물 X들을 포함한다. 나아가, 청구항은 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 초안 작성될 수 있음을 주지한다. 이와 같이, 이러한 진술은, 본원에 기재된 임의의 요소와의 연결 시 배제적인 용어, 예컨대 "단독으로", "오로지" 등의 사용, 및/또는 청구항 요소의 언급 또는 "부정적인" 제한의 사용에 대한 선행 기준으로서 역할을 하고자 한다.
용어 "및/또는"은 이러한 용어가 연관이 있는 항목들 중 임의의 하나, 항목들의 임의의 조합 또는 항목들 모두를 의미한다. 구어 "하나 이상의" 및 "적어도 하나"는, 특히 이것이 사용된 문맥에서 읽혀질 때, 당업자에 의해 쉽게 이해된다. 예를 들어, 이러한 구어는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 100, 또는 임의의 상한, 대략적으로 언급된 하한보다 10배, 100배 또는 1000배 더 높은 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 페닐 고리 상의 하나 이상의 치환기는 예를 들어, 페닐 고리가 이치환되는 경우, 1 내지 5, 또는 1 내지 4를 지칭한다.
용어 "약"은 명시된 값의 ± 5%, ± 10%, ± 20% 또는 ± 25%의 변동을 지칭할 수 있다. 예를 들어, "약 50"%는 일부 실시형태에서, 45% 내지 55%의 변동을 가질 수 있다. 정수 범위에 있어서, 용어 "약"은 해당 범위의 각각의 종점에서 언급된 정수보다 더 크고/거나 더 작은 1개 또는 2개의 정수를 포함할 수 있다. 본원에서 다르게 지시되지 않는 한, 용어 "약"은 개별 성분, 조성물 또는 실시형태의 기능성의 측면에서 동등한 언급된 범위에 근접한 값, 예를 들어 중량%를 포함하고자 한다. 용어 약은 또한, 이러한 단락에서 상기 고찰된 바와 같이 언급된 범위의 종점을 변형시킬 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 것들을 포함하여 모든 수들은 근사치이며, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 선택적으로 변형되는 것으로 이해된다. 이들 값은, 본원의 상세한 설명의 교시를 이용하는 당업자가 수득하고자 하는 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있다. 또한, 이러한 값들은 본래, 이들의 각각의 시험 측정에서 확인된 표준 편차로 인해 본질적으로 변동성을 함유하는 것으로 이해된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해, 특히 기재된 상세한 설명을 제공하는 측면에서, 본원에 언급된 모든 범위들은 또한, 임의의 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위들의 조합, 뿐만 아니라 해당 범위를 구성하는 개별 값, 특히 정수값을 포함한다. 언급된 범위(예를 들어, 중량% 또는 탄소 기)는 해당 범위 내의 각각의 구체적인 값, 정수, 소수 또는 아이덴터티를 포함한다. 임의의 열거된 범위는 충분히 설명적이고, 동일한 범위를 적어도 동일한 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 또는 1/10로 나눌 수 있는 것으로 쉽게 인지될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에서 고찰된 각각의 범위는 하위 1/3, 중위 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 나눠질 수 있다. 또한, 당업자가 이해하는 바와 같이, 모든 언어들, 예컨대 "이하", "적어도", "보다 큰", "보다 작은", "보다 많은", "또는 그보다 많은" 등은 언급된 수를 포함하고, 이러한 용어는 상기 고찰된 바와 같이 후속적으로 하위범위로 나눠질 수 있는 범위를 지칭한다. 동일한 방식으로, 본원에 언급된 모든 비율들은 또한, 더 넓은 비율 내에 속하는 모든 하위비율들을 포함한다. 이에, 라디칼, 치환기 및 범위에 대해 언급된 구체적인 값은 단지 예시적일 뿐; 이들은 라디칼 및 치환기에 대한 다른 정의된 값 또는 정의된 범위 내의 다른 값을 배제하지 않는다.
당업자는 또한, 구성원들이 보편적인 방식으로, 예컨대 마쿠시 그룹(Markush group)으로 함께 그룹핑되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 그룹뿐만 아니라 개별적으로 해당 그룹의 각각의 구성원 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위그룹들을 포함함을 쉽게 인지할 것이다. 부가적으로, 모든 목적에 있어서, 본 발명은 주요 그룹뿐만 아니라, 해당 그룹 구성원들 중 하나 이상이 부재하는 주요 그룹을 포함한다. 따라서, 본 발명은 언급된 그룹 중 임의의 하나 이상의 구성원의 명확한 배제를 고려한다. 이에, 개시된 범주 또는 실시형태 중 임의의 것에 단서가 적용될 수 있으며, 이로써, 언급된 요소, 종 또는 실시형태 중 임의의 하나 이상이 예를 들어 명확한 부정적인 제한에 사용되기 위해 이러한 범주 또는 실시형태로부터 배제될 수 있다.
용어 "접촉시키는"은, 예를 들어 용액, 반응 혼합물, 시험관내 또는 생체내에서, 예를 들어 생리학적 반응, 화학적 반응 또는 물리적 반응을 유발하기 위해, 세포 수준 또는 분자 수준을 포함하여, 건드리거나, 접촉하게 되거나 또는 바로 옆에 또는 밀접하게 가져가는 행위를 지칭한다.
"동시에"는 (1) 시간적으로 동시에, 또는 (2) 공통의 치료 스케쥴 경과 동안 상이한 시점에서를 의미한다.
"순차적으로"는 방법에 사용되는 하나의 활성제의 투여, 및 후속적으로 또 다른 활성제의 투여를 지칭한다. 하나의 활성제의 투여 후, 그 다음 활성제는 제1 활성제 이후 실질적으로 즉시 투여될 수 있거나, 그 다음 활성제는 제1 활성제 이후 유효 기간 후에 투여될 수 있으며; 유효 기간은 제1 활성제의 투여로부터 최대 이득의 실현을 위해 주어진 시간의 양이다.
"유효량"은 질병, 장애, 및/또는 질환을 치료하거나, 언급된 효과, 예컨대 활성화 또는 저해를 유발하는 데 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 유효량은 치료되는 질환 또는 증상의 진행 또는 중증도를 감소시키는 데 효과적인 양일 수 있다. 치료적 유효량의 결정은 당업자의 재량에 달려 있다. 용어 "유효량"은 예를 들어, 숙주에서 질병 또는 장애의 치료에 효과적이거나 질병 또는 장애의 증상을 치료하기에 효과적인 본원에 기재된 화합물의 양, 또는 본원에 기재된 화합물들의 조합의 양을 포함하고자 한다. 따라서, "유효량"은 일반적으로, 요망되는 효과를 제공하는 양을 의미한다.
일 실시형태에서, 유효량은 세포 또는 피험자에게 단독으로 또는 약제학적 담체와 조합하여 단일-용량 또는 다중-용량 투여 시, 과증식성 세포의 성장 또는 증식을 저해하거나, 살해를 유도하거나, 성장을 중단시키는 데 효과적인 본원에 기재된 활성제의 양을 지칭한다. 이러한 성장 저해 또는 살해는, 이러한 치료가 부재인 경우 예상된 생존율을 능가한 피험자, 예를 들어 환자의 생존율의 연장, 또는 이러한 치료가 부재인 경우와 비교하여 피험자의 예후의 임의의 개선으로서 반영될 수 있다.
용어 "치료하는", "치료하다" 및 "치료"는 (i) 질병, 병리학적 질환 또는 의학적 질환의 저해 또는 이의 발병의 저지; (ii) 질병, 병리학적 질환 또는 의학적 질환의 경감; 및/또는 (iii) 질병, 병리학적 질환 또는 의학적 질환과 연관된 증상의 감소를 포함한다. 따라서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 치료를 받는 질환 또는 증상의 진행 또는 중증도의 저하, 중단 또는 역행을 포함할 수 있다. 이와 같이, 용어 "치료"는 적절하다면, 의학적 및/또는 치유적 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료되는"은 (i) 관심 증상 또는 질병의 감소 또는 소멸(치료) 또는 (ii) 종양의 소멸 또는 파괴(치유)를 지칭할 수 있다.
용어 "저해하다", "저해하는" 및 "저해"는 질병, 감염, 질환 또는 세포군의 성장 또는 진행을 늦추거나, 중지시키거나 역행시키는 것을 지칭한다. 저해는, 치료 또는 접촉의 부재 시 발생하는 성장 또는 진행과 비교하여 예를 들어 약 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% 또는 99%보다 클 수 있다. 부가적으로, 용어 "유도하다," "저해하다," "강화하다," "상승시키다," "증가시키다," "감소시키다" 등은 2개의 상태들 사이의 정량적 차이를 나타내고, 2개의 상태들 사이에서 적어도 통계학적으로 유의한 차이를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "과증식성 세포의 성장을 저해하기에 효과적인 양"은, 일부 실시형태에서 세포의 성장 속도가 비처리된 세포와 적어도 통계학적으로 유의하게 상이할 수 있음을 의미한다. 이러한 용어는 본원에서 예를 들어 증식 속도에 적용될 수 있다.
구어 과증식성 세포, 예를 들어 신생 세포의 "성장 또는 증식을 저해하는"은, 이의 성장 및 전이를 늦추거나, 방해하거나, 저지하거나 중단시키는 것을 지칭하고, 본질적으로 신생물 성장의 완전한 소멸을 가리키는 것은 아니다.
용어 "암"은 일반적으로, 비정상적인 세포의 비조절된 성장에 의해 유발되는 100가지가 넘는 질병의 임의의 그룹을 지칭한다. 암은 고형 종양 및 림프종, 및 비고형암, 예컨대 백혈병의 형태를 취할 수 있다. 성숙할 때까지 복제되고 이후에는 상처난 세포를 대체하기 위해 필요에 의해서만 복제되는 정상 세포와는 달리, 암세포는 끊임없이 성장하고 분열하여, 근접한 세포 밖으로 밀려 나가고, 결국 신체의 다른 부분에까지 확산될 수 있다.
본 발명은 암 및 암성 질환, 특히 V600E BRAF 단백질 또는 V600K BRAF 단백질을 운반하는 암의 치료 방법을 제공한다. 용어 "암성 질환"은, 세포가 비정상적인 상태로 존재하는 임의의 질환, 또는 급속한 증식 또는 신조직 형성을 특징으로 하는 질환에 관한 것이다. 암성 질환은 사실상 악성 또는 비악성(예를 들어 전암성 질환)일 수 있다. "암성 질환"을 더 설명하기 위해, 용어 "과증식적", "과형성적", "과형성", "악성", "신생의" 및 "신조직 형성"이 사용될 수 있다. 이들 용어는 상호호환적으로 사용될 수 있고, 조직병리학적 유형, 침윤성의 단계 또는 암성 결정(예를 들어 악성 및 비악성)과는 상관없이, 모든 유형의 과증식적 성장, 과형성적 성장, 암성 성장 또는 또는 종양 발생 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 변형된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것으로 의미된다.
용어 "신조직 형성"은 정상적인 성장 조절에 대한 반응성의 상실을 초래하는 새로운 세포 성장, 예를 들어 신생 세포 성장을 지칭한다. "과형성"은 비정상적으로 높은 성장 속도를 겪고 있는 세포를 지칭한다. 그러나, 이들 용어는, 이들의 문맥이 드러낼 바와 같이, 일반적으로 비정상적인 세포 성장 속도를 경험하는 세포를 지칭하므로 상호호환적으로 사용될 수 있다. "신조직 형성" 및 "과형성"은 종양을 포함하고, 이러한 종양은 양성, 전악성, 인-시추 암종, 악성, 고형 또는 비고형일 수 있다. 치료될 수 있는 일부 암성 질환들의 예로는, 항문암, 전이 세포 방광암, 골암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 카포시 육종, 백혈병, 폐암, 예컨대 기관지폐암, 소세포폐암 및 비소세포폐암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 악성 림프종, 신경아세포종, 골원성 암종(예를 들어 뼈의 암), 안암(ophthalmic cancer)(예를 들어 망막아종 및 눈의 다른 암), 난소암, 전립선암, 신장암, 피부암, 예컨대 흑색종, 연조직 육종, 갑상선암 및 빌름스 종양 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범위에 포함되는 비악성 과증식성 질환(예를 들어 전암성 질환)의 다른 예로는, 본원에 기재된 다른 암들을 포함하여 선종, 연골종, 내연골종, 섬유종, 근종, 점액종, 신경초종, 골아세포종, 골연골종, 골종, 유두종 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "백혈병" 또는 "백혈구 암"은 조혈계 및 면역계(혈액 및 림프계)의 모든 암 또는 신조직 형성을 지칭한다. 이들 용어는 혈액 및 골수에서 백혈구 및 이의 전구체의 왜곡된 증식 및 발생에 의해 두드러지는, 혈액-형성 기관의 진행적인 악성 질병을 지칭한다. 골수종은 혈액 및 골수 세포의 다른 유형의 종양을 지칭한다. 림프종은 림프 조직의 종양을 지칭한다. 백혈병의 예로는, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구 백혈병(ALL) 및 만성 골수성 백혈병(CML)이 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 말단 흑자 흑색종, 광선 각화증, 샘암종, 샘낭암종, 샘종, 샘육종, 샘편평세포암종, 성상세포 종양, 바르톨린샘암종, 기저세포암종, 기관지샘암종, 모세, 암양종, 암종, 암육종, 해면상, 담관암종, 연골 육종, 맥락망막 유두종/암종, 투명세포 암종, 낭선종, 내배엽동 종양, 자궁내막 과형성, 자궁내막 간질 육종, 자궁내막모양 샘암종, 뇌실막, 상피모양, 에윙 육종, 섬유층판, 국소 결절성 과형성, 가스트리노마(gastrinoma), 생식 세포 종양, 교아종, 글루카곤증, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간샘종증, 간세포암종, 인슐린종, 상피내 신조직 형성, 상피내 편평세포 신조직 형성, 침윤성 편평세포 암종, 대세포 암종, 평활근육종, 악성 흑자 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 수막(meningeal), 중피(mesothelial), 전이성 암종, 점막표피모양 암종, 신경아세포종, 신경상피 샘암종, 결절성 흑색종, 귀리세포암종, 희소돌기아교세포(oligodendroglial), 골육종, 췌장 폴리펩타이드, 유두상 장액성 샘암종, 송과세포, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐모세포종, 신장세포 암종, 망막아종, 횡문근육종, 육종, 장액 암종, 소세포 암종, 연조직 암종, 소마토스타틴-분비 종양, 편평세포암종, 편평세포 암종, 중피하(submesothelial), 표재 확산 흑색종, 미분화된 암종, 포도막 흑색종, 사마귀모양 암종, 비포마(vipoma), 고분화(well differentiated) 암종 및 빌름스 종양과 같은 질환을 포함하는 다양한 신조직 형성 장애들의 치료에 사용될 수 있다. 이에, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 피부암, 방광암, 뇌암(두개내 신생물(intracranial neoplasm), 예컨대 신경교종, 수막종, 신경초종 및 샘종을 포함), 유방암, 결장암, 폐암(SCLC 또는 NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암 및/또는 본원에서 언급된 다른 암들의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, PAC-1과 제2 활성제(예를 들어 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제, 예를 들어 활성제 베무라페닙)의 조합은 흑색종의 치료에 특히 효과적일 수 있다. 치료될 수 있는 다른 암으로는, 희소돌기아교세포종 및 다형 교아종(GBM)을 포함한 교아종 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 암성 세포에 의해 영향을 받는 조직은 뇌 자체(예를 들어, 두개골(cranium) 또는 중추 척추관) 또는 림프 조직, 혈관, 뇌신경, 뇌 외피(brain envelop)(뇌막), 머리뼈(skull), 뇌하수체 샘 또는 송과샘일 수 있다. 치료될 수 있는 특정 형태의 뇌암으로는, 성상세포종, 연골종, 연골육종, 척색종, CNS(중추 신경계) 림프종, 두개인두종, 뇌실막종(ependymoma), 신경절신경교종, 신경절신경종(신경절세포종이라고도 함), 성상세포종, 희소돌기아교세포종 및 뇌실막종(ependymoma)을 포함한 신경교종, 혈관모세포종(혈관 종양이라고도 함), 원시 신경외배엽 종양(PNET; primitive neuroectodermal tumor), 예컨대 수모세포종, 수막종 및 청신경초종(vestibular schwannoma)(이전에는 속귀 신경집종/슈반세포종으로 공지되어 있음) 등이 있다.
이러한 조합은 또한, 신체의 다른 기관에서 기원하는 암으로부터 두개내 구(intracranial sphere)를 침범하는 전이성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이들 질환은 전형적으로, 2차 뇌종양으로 지칭된다. PAC-1과 제2 활성제의 조합으로 치료될 수 있는 2차 뇌종양으로는, 폐암, 유방암, 악성 흑색종, 신장암, 결장암 및 다른 암종으로부터 기원하는, 뇌의 전이성 종양이 있다.
본 발명의 범위에 포함되는 암성 질환의 다른 예로는, 신경아세포종 및 골원성 암종(예를 들어 뼈의 암 또는 뼈에서 조직의 신생 성장) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. PAC-1과 제2 활성제의 조합으로 치료될 수 있는 악성 원발성 골 종양의 예로는, 골육종, 연골육종, 에윙 육종, 섬유육종 등, 및 2차 골 종양, 예컨대 유방, 폐 및 전립선의 암종을 포함하여 다른 기관으로부터 확산된 전이성 병변이 있다.
치료제 및 활성
프로카스파제-활성화 화합물-1(PAC-1; (2-(4-벤질피페라진-1-일)-N-[(2-하이드록시-3-프로프-2-에닐-페닐)메틸리덴아미노]아세타미드)는 암성 세포에서 세포자멸사를 선택적으로 유도한다. PAC-1의 제조 방법은 미국 특허 8,778,945(Hergenrother et al.)에 기재되어 있다. PAC-1은 암세포에서 저해성 아연 이온의 킬레이트화를 통해 프로카스파제-3의 활성을 증강시키고, 세포자멸사를 유도한다. PAC-1은 암세포에서 프로카스파제-3의 활성 및 자가성숙을 증강시키고, 세포자멸사를 유도할 수 있다. PAC-1은 또한, 종종 PAC-1 또는 제2 활성제가 단독으로는 덜 효과적이거나 완전히 비활성인 경우에, 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제(제2 활성제)의 화학요법 활성을 증강시킨다.
놀랍게도, PAC-1 및 이의 유도체가 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제의 활성과 상승작용할 수 있는 것으로 발견되었다. 이에, 본 발명은, 본원에 기재된 조성물에서 활성제 PAC-1이 미국 특허 8,592,584(Hergenrother et al.) 또는 미국 특허 8,778,945(Hergenrother et al.)에 기재된 바와 같이 PAC-1 유도체로 교환되어 본 발명의 부가적인 조성물을 제공할 수 있는 추가의 실시형태를 제공하며, 이들 특허는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 PAC-1 유도체의 일례는 SPAC-1(4-((4-(2-(2-(3-알릴-2-하이드록시벤질리덴)하이드라지닐)-2-옥소에틸)피페라진-1-일)메틸)벤젠설폰아미드)이다. PAC-1 및 이의 유도체는 또한, MEK 저해제, 예컨대 트라메티닙의 활성과 상승작용할 수 있다.
이에, PAC-1은 본원에 기재된 바와 같이 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제 및/또는 MEK 저해제, 예컨대 트라메티닙, 코비메티닙(cobimetinib), 비니메티닙(binimetinib)(MEK162), 셀루메티닙(selumetinib), PD-325901, CI-1040, PD035901 또는 TAK-733과 조합될 수 있다. MEK 저해제는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 효소인 MEK1 및/또는 MEK2를 저해하는 약물이다. 이들 MEK 저해제는 소정의 암에서 과다활성인 MAPK/ERK 경로에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다.
치료 조성물에서 PAC-1 또는 PAC-1 유도체의 양 또는 농도는 암세포 성장을 저해하거나, 암세포에서 세포자멸사를 유도하거나, 제2 활성제와 상승작용하기에 효과적인 양 또는 농도일 수 있다. 예를 들어, PAC-1의 농도는 약 0.2 μM 내지 약 5 mM, 또는 약 2 μM 내지 약 50 μM, 전형적으로 약 2.5 μM, 약 5 μM, 약 7.5 μM, 약 10 μM, 약 12.5 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 40 μM, 또는 약 50 μM, 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 값들 사이의 범위일 수 있다. 유사하게는, 제2 활성제의 농도(예를 들어, 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제, 예컨대 베무라페닙 또는 다브라페닙)는 약 1 nM 내지 약 1 mM, 또는 약 25 nM 내지 약 1 mM, 전형적으로 약 1 nM, 약 2 nM, 약 3 nM, 약 5 nM, 약 10 nM, 약 25 nM, 약 50 nM, 약 100 nM, 약 250 nM, 약 500 nM, 약 750 nM, 약 900 nM, 약 1 μM, 약 2.5 μM, 약 5 μM, 약 7.5 μM, 약 10 μM, 약 12.5 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 40 μM, 약 50 μM, 약 75 μM, 약 100 μM, 약 125 μM, 약 150 μM, 약 200 μM, 약 250 μM, 약 300 μM, 약 500 μM, 약 750 μM, 또는 약 1 mM, 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 값들 사이의 범위일 수 있다. 당업자는 특정 농도의 용량의 활성제의 양을 예를 들어 고형 투약 단위로 사용되기 위한 활성제의 양으로 쉽게 전환시킬 수 있다.
다양한 실험 데이터들이 도 1 내지 13에 나타나 있다. PAC-1 및 베무라페닙은 흑색종 세포에서 강력하게 상승작용하여, 세포자멸사 및 카스파제 활성을 유도한다. 상당한 프로카스파제-3 활성화가 PAC-1 + 베무라페닙으로 처리된 세포에서 관찰된다. 부가적으로, 12 μM PAC-1 및 10 μM 베무라페닙 단독은 A375 세포에서 PARP-1 절단에 대해 거의 효과가 없으나, 조합에서는 상당한 PARP 절단이 관찰된다(웨스턴 블롯을 통해). 더욱이, 베무라페닙과 MEK 저해제인 트라메티닙의 조합에 PAC-1을 첨가하는 것은 조합의 카스파제-3 활성 및 전세포자멸사 효과를 상당히 증강시킨다. 더욱이, 저농도의 PAC-1의 첨가는 베무라페닙을 이용한 치료 후 암세포의 재성장을 지연시킨다. PAC-1은 또한, 세포 배양물에서 베무라페닙-내성 A375VR 세포에 대해 강력한 채로 남아 있고, 베무라페닙과 상승작용하여, 생체내에서 A375VR 세포 성장에 대해 항종양 효과를 발휘한다. 본 발명자들의 데이터는, 동시적인 프로카스파제-3 활성화와 조합된 MAPK 신호전달의 저해가 베무라페닙의 항종양 활성을 증강시키고 내성의 발달을 경감시키기 위한 효과적인 전략임을 가리킨다. 이에, 본 발명은 PAC-1을 베무라페닙 요법 및/또는 베무라페닙/MEK 저해제 요법과 조합하여 베무라페닙 내성 암을 가진 환자에게 투여함으로써, 베무라페닙 내성의 극복 방법을 제공한다.
본 발명의 방법
본 발명은 암세포의 프로카스파제-3 분자를 변형시킬 수 있는 화합물들의 조합을 상기 암세포에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에서 세포자멸사를 선택적으로 유도하는 방법을 제공하며; 여기서, 화합물들의 조합은 PAC-1 및 제2 활성제이다. 또한, 본 발명은 암세포의 프로카스파제-3 분자를 변형시킬 수 있는 화합물들의 조합을 상기 암세포에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에서 세포자멸사를 선택적으로 유도하는 방법을 제공하며; 여기서, 화합물들의 조합은 PAC-1 및 제2 활성제이고, 예를 들어 암세포는 치료가 필요한 환자에 존재한다.
본 발명은, 화합물들의 언급된 조합이 PAC-1 및 제2 활성제이며, 예를 들어 암세포의 치료 방법으로서, (a) 프로카스파제 활성화제 화합물을 이용한 암세포의 치료에 대한 잠재적인 취약성을 확인하는 단계; 및 (b) 암세포를 프로카스파제 활성화제 화합물과 제2 활성제의 유효량의 조합에 노출시키는 단계를 포함하는, 부가적인 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, (a) 프로카스파제 활성화제 화합물을 이용한 암세포의 치료에 대한 잠재적인 취약성을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 암세포를 유효량의 PAC-1 및 제2 활성제에 노출시키는 단계를 포함하는, 암세포의 치료 방법을 제공하며, 여기서, PAC-1은 프로카스파제-3 및 프로카스파제-7 중 적어도 하나를 활성화시킬 수 있다. 본 발명은 또한, 활성제, 및 암세포의 프로카스파제-3 분자를 활성화시킬 수 있는 화합물, 예컨대 PAC-1을 암세포에 투여하는 단계를 포함하는, 암세포에서 사멸(예를 들어 암세포의 살해)의 유도 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 유효량의 PAC-1과 제2 활성제의 조합을 포함하는 약제를 제공한다. 약제는 세포에서 세포자멸사의 유도 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화합물들의 조합은 환자에서 주목할 만한 신경독성 효과를 유발할 정도까지 뇌혈관 장벽을 가로지르지 않는다. 본 발명의 방법은 생체내에서 또는 시험관내에서 하나 이상의 세포를 유효량의 본원에 기재된 화합물들의 조합과 접촉시키는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 세포를 유효량의 본원에 기재된 화합물들의 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 처리 방법, 및 암 치료가 필요한 환자를 유효량의 본원에 기재된 화합물들의 조합을 이용하여 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 프로카스파제-3 수준이 상승된 종양 세포를 갖는 환자의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 프로카스파제-3 수준이 상승된 종양 세포를 갖는 환자에게 본원에 기재된 치료적 유효량의 PAC-1과 제2 활성제의 조합 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명은 본원에 기재된 치료적 유효량의 PAC-1과 제2 활성제의 조합을 종양 세포에 노출시키는 단계를 포함하는, 상승된 프로카스파제-3 수준을 가진 종양 세포의 치료 방법을 제공하며, 여기서, 종양 세포는 치료되거나, 살해되거나 성장이 저해된다. 종양 또는 종양 세포는 악성 종양 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 세포는 흑색종, 결장직장암, 갑상선암, 폐암 또는 난소암 세포이다.
PAC-1은 환자에게 투여되기 위해 일원화된 투약 형태에서 제2 활성제와 조합될 수 있다. 조합 치료제는 동시적인 섭생 또는 순차적인 섭생으로서 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합은 2개 이상의 투여로서 투여될 수 있다.
조합 치료제는 "상승작용", 즉, 활성 성분들이 함께 사용되었을 때 달성된 효과가 화합물들을 개별적으로 사용한 경우의 효과들의 합계보다 더 큰 현상을 제공할 수 있다. 상승작용 효과는, PAC-1 및 제2 활성제가 (1) 조합된 제형에서 공동제형화되고 동시에 투여되거나 전달되는 경우; (2) 개별 제형들로서 교대로 또는 동시에 전달되는 경우; 또는 (3) 일부 다른 섭생들에 의해 달성될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우, 상승작용 효과는, 화합물들이 예를 들어 개별 정제, 알약 또는 캡슐 내에서, 또는 개별 주사기에서 상이한 주사들에 의해 순차적으로 투여되거나 전달되는 경우, 달성될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안, 각각의 활성 성분의 유효 투약량은 순차적으로, 즉 연속적으로 투여될 수 있는 반면, 조합 치료에서, 2개 이상의 활성 성분들의 유효 투약량들은 함께 투여된다. 상승작용적 항암 효과는, 조합의 개별 화합물의 예측된 순수한 상가 효과보다 더 큰 항암 효과를 나타낸다. 조합 치료는 미국 특허 6,833,373(McKearn et al.)에 더 기재되어 있으며, 이는 PAC-1과 조합될 수 있는 부가적인 활성제, 및 PAC-1으로 치료될 수 있는 부가적인 유형의 암 및 다른 질환들을 포함한다.
이에, PAC-1은 암 치료용의 제2 활성제와 조합하여 사용될 수 있다. PAC-1은 제2 활성제 투여보다 수분 내지 수주 범위의 간격만큼 선행되거나 후속될 수 있다. 제2 활성제 및 PAC-1이 세포에 개별적으로 적용되는 실시형태에서, 당업자는 일반적으로, 각각의 전달 사이에 상당한 기간이 경과하지 않아, 제제 및 PAC-1이 세포에 대해 유리하게 조합된 효과를 여전히 발휘할 수 있을 것임을 보장할 것이다. 예를 들어, 이러한 경우, 당업자는 세포, 조직 또는 유기체를 2개의 제제(modality)들과 실질적으로 동시에(즉, 약 수분 미만 이내에) 접촉시킬 수 있는 것으로 고려된다. 다른 양태에서, 조합의 제2 활성제는 PAC-1의 투여 이전 및/또는 이후에 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 18시간, 약 21시간, 약 24시간, 약 28시간, 약 31시간, 약 35시간, 약 38시간, 약 42시간, 약 45시간 또는 약 48시간 또는 그 이상 이내에 투여될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 제2 활성제는 PAC-1의 투여 이전 및/또는 이후에 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 8일, 약 9일, 약 12일, 약 15일, 약 16일, 약 18일, 약 20일 또는 약 21일 이내에 투여될 수 있다. 일부 상황에서, 치료 기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있으나, 이때, 각각의 투여 사이에 수주(예를 들어, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주 또는 약 8주 또는 그 이상)가 경과된다.
본 발명의 화학치료 조성물을 환자에게 투여하는 것은 전형적으로, 독성이 있다면 이를 고려하여 일반적인 화학치료제 투여 프로토콜을 따를 것이다. 치료 주기는 필요한 대로 반복될 것으로 예상된다. 또한, 다양한 표준 요법들 또는 부속적인 암 치료법들뿐만 아니라 수술적 개입이, 기재된 조합들과 병용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 요법으로는 화학요법, 면역요법, 유전자요법 및 수술 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
약제학적 제형
본원에 기재된 화합물은 예를 들어, 이러한 화합물을 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 조합함으로써 치료용 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 화합물은 염 또는 용매화물 형태의 담체에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 화합물이 충분히 염기성 또는 산성이어서 안정한 무독성 산 또는 염기 염을 형성하는 경우, 화합물을 염으로서 투여하는 것이 적절할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염으로는, 생리학적으로 허용 가능한 음이온, 예를 들어, 토실레이트, 메탄설포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 β-글리세로포스페이트를 형성하는 산을 이용하여 형성된 유기 산 부가염이 있다. 하이드로클로라이드, 할라이드, 설페이트, 니트레이트, 비카르보네이트 및 카르보네이트 염을 포함한 적합한 무기 염이 또한, 형성될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 공지된 표준 절차를 사용하여, 예를 들어 충분히 염기성인 화합물, 예컨대 아민을 적합한 산과 반응시켜 생리학적으로 허용 가능한 이온성 화합물을 제공함으로써 수득될 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속(예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 염 또는 알칼리 토금속(예를 들어 칼슘) 염이 또한, 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 식의 화합물은 여러 가지 형태들의 약제학적 조성물로서 제형화되고, 포유류 숙주, 예컨대 인간 환자에게 투여될 수 있다. 이들 형태는 선택된 투여 경로, 예를 들어 정맥내, 근육내, 국소 또는 피하 경로에 의한 경구 또는 비경구 투여에 맞게 특정하게 조정될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 비히클, 예컨대 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 조합하여 전신 투여될 수 있다. 경구 투여의 경우, 화합물은 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐 내에 밀봉되거나, 정제로 압축되거나, 환자의 식이요법 음식 내로 직접 혼입될 수 있다. 화합물은 또한, 하나 이상의 부형제와 조합되고, 섭취 가능한 정제, 버컬정, 트로키, 캡슐, 엘릭셔, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 조제물은 전형적으로, 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유한다. 조성물 및 조제물의 퍼센트는 달라질 수 있고, 통상적으로, 주어진 단위 투약 형태의 중량의 약 0.5% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 25%, 또는 약 2% 내지 약 10%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 내 활성 화합물의 양은, 유효 투약 수준이 수득될 수 있을 정도의 양일 수 있다.
정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 또한, 결합제, 예컨대 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 다이칼슘 포스페이트; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 및 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 감미제, 예컨대 수크로스, 프룩토스, 락토스 또는 아스파탐; 또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일(oil of wintergreen) 또는 체리향이 첨가될 수 있다. 단위 투약 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 외에도, 액체 담체, 예컨대 식물유 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서, 또는 그렇지 않다면 고체 단위 투약 형태의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭셔는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스 또는 프룩토스, 방부제로서 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤, 염료 및 풍미제, 예컨대 체리향 또는 오렌지향을 함유할 수 있다. 임의의 단위 투약 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 이용되는 양에서 약제학적으로 허용 가능하고 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지효성 조제물 및 장치 내로 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 이의 염의 용액은 물에서 제조되고, 선택적으로 무독성 계면활성제와 혼합될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 또는 이들의 혼합물에서, 또는 약제학적으로 허용 가능한 오일 내에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에, 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유할 수 있다.
주사 또는 주입에 적합한 약제학적 투약 형태는, 멸균 주사 또는 주입 용액 또는 분산액의 즉석 조제에 적합하며 선택적으로 리포좀 내에 캡슐화된 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액, 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 궁극적인 투약 형태는 제조 및 보관 조건 하에 멸균되며, 유체이고 안정해야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물유, 무독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 리포좀의 형성에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 또는 게면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아 및/또는 항진균 제제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어 당, 완충제 또는 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴에 의해 유발될 수 있다.
멸균 주사액은 필요한 양의 활성 화합물을 적절한 용매 내에서 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 혼합하고, 필요에 따라 선택적으로 필터 멸균함으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함할 수 있으며, 이로써 용액 내에 존재하는 활성 성분 + 임의의 부가적인 요망되는 성분의 분말이 수득된다.
유용한 고체 담체로는, 미분된 고체, 예컨대 탈크, 클레이, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등이 있다. 유용한 액체 담체로는, 물, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 알코올, 글리콜 또는 물-알코올/글리콜 블렌드가 있으며, 이러한 액체 담체 내에서 화합물이 유효 수준으로, 선택적으로 무독성 계면활성제의 도움을 받아, 용해되거나 분산될 수 있다. 보조제, 예컨대 착향제 및 부가적인 항균제가 첨가되어, 주어진 용도에 대한 특성을 최적화할 수 있다. 생성된 액체 조성물은 흡수제 패드로부터 적용되거나, 붕대 및 다른 드레싱을 함침시키는 데 사용되거나, 펌프-유형 또는 에어로졸 분무기를 사용하여 영향을 받는 영역 상으로 분무될 수 있다. 증점제, 예컨대 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알코올, 변형된 셀룰로스 또는 변형된 미네랄 물질이 또한, 액체 담체와 함께 이용될 수 있다.
본원에 기재된 활성제들의 유용한 투약량은 이들의 시험관내 활성 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 동물에서의 유효 투약량을 인간에 외삽하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어 미국 특허 4,938,949(Borch et al.)를 참조한다. 치료에 사용하는 데 필요한 화합물, 또는 이의 활성 염 또는 유도체의 양은 선택된 특정 화합물 또는 염뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 질환의 성질, 및 환자의 연령 및 상태에 따라 다를 것이고, 궁극적으로는 참여 의사 또는 임상의의 재량에 달려 있을 것이다.
그러나 일반적으로, 활성제의 적합한 용량은 약 0.5 mg/kg 체중/일 내지 약 100 mg/kg 체중/일, 예를 들어 약 10 mg/kg 체중/일 내지 약 75 mg/kg 체중/일, 예컨대 3 내지 약 50 mg/kg 수여자의 체중/일, 바람직하게는 6 mg/kg/일 내지 90 mg/kg/일, 가장 바람직하게는 15 mg/kg/일 내지 60 mg/kg/일의 범위일 것이다. 화합물은 편리하게는 단위 투약 형태로 제형화될 수 있으며; 예를 들어, 1개 단위 투약 형태 당 5 mg 내지 1000 mg, 통상 10 mg 내지 750 mg, 가장 통상적으로 50 mg 내지 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 일부 실시형태에서, PAC-1 투약량은 약 50 mg/kg 내지 250 mg/kg, 약 75 mg/kg 내지 150 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg일 것이다. 다양한 실시형태에서, BRAF 유전자 또는 효소의 저해제의 투약량은 약 0.5 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg일 것이다. MEK 저해제 투약량은 이들 활성제 중 어느 하나와 유사한 양일 수 있거나, 이들 활성제 중 어느 하나의 양의 약 1/2 내지 약 1/10일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 이러한 단위 투약 형태로 제형화된, 본원에 기재된 활성제 또는 활성제들의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다.
요망되는 용량은 통상, 단일 용량으로 제시되거나, 적절한 간격으로 투여되는 분할된 용량, 예를 들어 1일 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 하위용량으로서 제시될 수 있다. 하위용량 그 자체는 예를 들어, 다수의 별개의 느슨하게 간격을 둔 투여; 예컨대 취입기로부터의 다수의 흡입 또는 경구 투여에 의한 투여로 더 분할될 수 있다.
활성제들의 조합은 통상, 예를 들어 1개 단위 투약 형태 당 100 mg/m2 내지 5,000 mg/m2, 300 mg/m2 내지 4,000 mg/m2, 370 mg/m2 내지 3,700 mg/m2, 50 mg/m2 내지 750 mg/m2, 또는 750 mg/m2 내지 4,000 mg/m2의 활성제를 함유하는 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 각각의 활성제는 개별적으로 또는 조합하여, 약 1 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 100 mg/kg, 또는 약 150 mg/kg, 또는 상기 언급된 값들 중 임의의 값 내지 상기 언급된 값들 중 임의의 다른 값 사이의 범위로 투여될 수도 있다. 활성제는 또한, 단독으로 또는 조합하여 약물의 정상-상태 혈장 농도를 약 1 μmol/L 내지 약 25 μmol/L, 또는 약 10 μmol/L, 또는 약 15 μmol/L로 제공하기 위해 피험자에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 활성제를 약 10 nM 내지 약 100 μM의 유효 농도로 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 약 200 nM 내지 약 50 μM, 약 500 nM 내지 약 40 μM, 약 750 nM 내지 약 25 μM, 약 1 μM 내지 약 20 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 또 다른 실시형태에서, 유효 농도는 직접적인 프로카스파제 활성화 검정법, 세포자멸사 유도 검정법, 또는 동물 임상 치료 평가에서 예컨대 50% 활성일 때의 농도 값인 것으로 간주된다. 일 실시형태에서, 이러한 값은 약 200 μM 미만이다. 또 다른 실시형태에서, 이 값은 약 10 μM 미만 내지 약 10 nM 초과이다. 요망되는 용량은 통상, 단일 용량으로 제시되거나, 적절한 간격으로 투여되는 분할된 용량, 예를 들어 1일 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 하위용량으로서 제시될 수 있다. 하위용량 그 자체는 예를 들어, 다수의 별개의 느슨하게 간격을 둔 투여로 더 분할될 수 있다.
본원에 기재된 활성제는 효과적인 항종양제일 수 있고, 임의의 단일 제제의 투여와 비교하여 더 높은 효능 및/또는 감소된 독성을 가질 수 있다. 본 발명은 환자 또는 피험자, 예컨대 포유류에서 암을 치료하는 치료 방법을 제공하며, 본 방법은 암을 가진 포유류에게 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계를 수반한다. 포유류로는, 영장류, 인간, 설치류, 개, 고양이, 소, 양, 말, 돼지, 염소, 소 등이 있다. 암은 임의의 다양한 유형의 악성 신생물, 예를 들어 본원에 기재된 다른 것들 중에서도 결장암, 유방암, 흑색종 또는 백혈병을 지칭하고, 일반적으로 바람직하지 못한 세포 증식, 예를 들어 상향조절된 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침범 및 전이를 특징으로 한다.
조성물의 암 치료 능력은 당업계에 잘 공지된 검정법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 치료 프로토콜의 설계, 독성 평가, 데이터 분석, 종양 세포 살해의 정량화, 및 이식 가능한 종양 스크린의 사용의 생물학적 유의성이 공지되어 있다. 또한, 조성물의 암 치료 능력은 본원에 인용된 인용문헌 및 특허 문헌에서의 검정법을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명은 또한, 전구약물 형태의 화합물을 제공한다. 생체내에서 전환되어 본원에 언급된 PAC-1 또는 또 다른 활성제를 제공할 임의의 화합물이 전구약물이다. 전구 약물의 다수의 형성 방법들이 당업계에 잘 공지되어 있다. 전구약물들 및 이들의 제조 방법의 예들은 특히, 문헌[Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard(Elsevier, 1985), Methods in Enzymology, Vol. 42, at pp. 309-396, edited by K. Widder, et. al.(Academic Press, 1985)]; [A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krosgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5, "Design and Application of Prodrugs," by H. Bundgaard, at pp. 113-191, 1991)]; [H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 8, p. 1-38 (1992)]; [H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 77, p. 285 (1988)]; 및 [Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392)]에서 확인된다.
부가적으로 일부 실시형태에서, PAC-1은 PAC-1 유도체 또는 다른 저해제, 예컨대 미국 특허 7,632,972(Hergenrother et al.), 8,778,945(Hergenrother et al.) 또는 8,916,705(Hergenrother et al.), 미국 특허 공개 2007/0049602(Hergenrother et al.), 미국 출원 12/597,287(Hergenrother et al.) 또는 국제 공개 WO 2014/022858(Hergenrother et al.)에 기재된 화합물들로 대체될 수 있으며, 이들 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원의 개시내용과 조합하여 사용될 수 있는 암 치료법에 유용한 화합물, 방법 및 기술은 상기 언급된 문헌들, 뿐만 아니라 미국 특허 6,303,329(Heinrikson et al.), 6,403,765(Alnemri), 6,878,743(Choong et al.) 및 7,041,784(Wang et al.) 및 미국 특허 공개 2004/0180828(Shi)에 기재되어 있다.
시험을 수행하고 암세포주를 평가하는 방법은 문헌[Putt et al., Nature Chemical Biology 2006, 2(10), 543-550]; [Peterson et al., J. Mol. Biol. 2009, 388, 144-158]; 및 [Peterson et al., Cancer Res. 2010, 70(18), 7232-7241]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
하기 실시예는 상기 발명을 예시하고자 하는 것이고, 이의 범위를 좁히는 것으로 여겨져서는 안 된다. 당업자는, 실시예가, 본 발명이 실시될 수 있을 많은 다른 방식들을 제시함을 쉽게 인지할 것이다. 많은 변동 및 변형들이 본 발명의 범위 내에 있으면서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1. 베무라페닙과 프로카스파제-3 활성화제의 조합은 돌연변이체 BRAF 흑색종에서 상승작용적이다
베무라페닙 내성의 발달은 V600EBRAF 돌연변이를 가진 전이성 흑색종의 치료에 있어서 이러한 약물의 장기간 효능을 제한한다. 베무라페닙을 이용한 다운스트림 MAPK 신호전달의 저해는 카스파제-3에 의해 매개되는 세포자멸적 세포 사멸을 유도하며, 이는, 프로카스파제-3 활성화제의 첨가가 항암 효과를 증강시킬 수 있음을 제시한다. 본원에서, 본 발명자들은, 프로카스파제-활성화 화합물인 PAC-1과 베무라페닙의 조합이 V600EBRAF 돌연변이를 가진 흑색종 세포주에서 카스파제-3 활성 및 세포자멸적 세포 사멸을 증강시키는 데 고도로 상승작용적임을 보여준다. 생체내에서, 이러한 조합은 마우스에서 선호할만한 안전성 프로파일을 보여주고, 상당한 항종양 효과를 발휘한다. 본 발명자들은 추가로, 베무라페닙과 MEK 저해제인 트라메티닙의 임상적으로 유용한 조합에 PAC-1을 첨가하는 것이 상기 조합의 카스파제-3 활성 및 전세포자멸사 효과를 완전히 증강시킨다고 언급하고 있다. 더욱이, 저농도 PAC-1의 첨가는 또한, 베무라페닙을 이용한 치료 후, 세포의 재성장을 지연시킨다. 마지막으로, PAC-1은 세포 배양물에서 베무라페닙-내성 A375VR 세포에 대해 강력한 채로 남아 있고, 생체내에서 베무라페닙과 상승작용하여 A375VR 세포 성장에 대해 항종양 효과를 발휘한다. 종합하면, 본 발명자들의 데이터는, 동시적인 프로카스파제-3 활성화와 조합된 MAPK 신호전달의 저해가 베무라페닙의 항종양 활성을 증강시키고 내성 발달을 경감시키기 위한 효과적인 전략임을 가리킨다.
본원에서, 본 발명자들은, V600EBRAF 흑색종에서 카스파제-3 활성 및 세포자멸적 세포 사멸의 증강에 있어서 PAC-1+베무라페닙 및 PAC-1+베무라페닙+트라메티닙의 상승작용적 활성을 보고하고 있다. 증가된 세포자멸적 세포 사멸의 결과, PAC-1+베무라페닙 조합은 V600EBRAF 흑색종의 뮤린 이종이식 모델에서 개별 제제의 항종양 효과를 꽤 능가하는 종양 부피의 상당한 감소를 유도한다. 또한, 베무라페닙-민감성 흑색종에서 PAC-1의 첨가에 의한 이러한 세포자멸사 증강은 베무라페닙에의 노출 후 세포의 재성장을 상당히 지연시킨다. 마지막으로, PAC-1은 배양물에서 베무라페닙-내성 A375VR 세포에 효과적인 채로 남아 있고, 생체내에서 베무라페닙과 상승작용하여 이들 세포의 종양 성장을 지연시키며, 이는, BRAF-저해제 치료를 벗어나서 진행되어 현재로서 이용 가능한 이에 대한 치료 옵션이 몇 개 없는 흑색종에서 이러한 조합의 유용성을 나타낸다.
PAC-1과 베무라페닙의 조합은 V600E BRAF 돌연변이를 가진 세포에서 세포자멸사를 증강시킨다 . 다양한 기원들 및 BRAF 돌연변이 상태를 가진 9개의 세포주의 패널에서, 베무라페닙은 V600EBRAF 돌연변이를 가진 세포주에서만 강력하고(IC50 값은 200 nM 내지 550 nM임), 이는 이전에 보고된 값과 일치한다(도 1a). 동일한 패널의 세포주에서 PAC-1의 평가는, PAC-1이 BRAF 돌연변이 상태와 상관없이 모든 세포주들에서 유사한 활성(IC50 값이 1 μM 내지 4 μM임)을 보유함을 보여준다(도 1a). 그런 다음, 세포자멸적 세포 사멸을 유도하는 PAC-1+베무라페닙 조합의 능력을 이들 세포주에서 평가하였다. 베무라페닙 또는 PAC-1 중 어느 것도 단일 제제로서 유의한 세포자멸사(≤10%)를 유도하지 않은 조건(화합물과 함께 24시간 인큐베이션) 하에, PAC-1+베무라페닙 조합은 V600EBRAF 돌연변이를 가진 세포주에서 상당한 세포자멸사(20% 내지 45%)를 유도한다(도 1b). 유사한 경향은 또한, V600EBRAF 세포주에서 더 낮은 농도의 베무라페닙(0.5 μM)을 PAC-1과 조합하여 평가했을 때에도 관찰되었다(도 1c). 그러나, PAC-1+베무라페닙 조합은 야생형 BRAF를 가진 세포주에서는 상승작용적 세포자멸사를 유도하지 않는다(도 1b).
PAC-1 및 베무라페닙은 A375, SK-MEL-5 및 UACC-62 세포에서 상승작용하여 카스파제-3 활성 및 세포자멸사를 증강시킨다 . 관찰된 상승작용을 보다 폭넓게 알아보기 위해, 세포자멸사를, 단일 제제로서 최소의 세포자멸사를 유도하는 농도의 PAC-1 및 베무라페닙의 매트릭스로 처리된 3개의 인간 V600EBRAF 흑색종 세포주에서 평가하였다. 이들 실험에서, 세포자멸사 세포 집단에서 (단일 제제 단독의 상가 효과를 능가하는) 큰 증가가 A375(도 2a), SK-MEL-5(도 7a) 및 UACC-62(도 8a)에서 관찰되었다. 이러한 약물 조합의 상승작용을 정량화하기 위해, 조합 지수(CI)를 계산하였다. 상승작용적인 약물 조합은 1보다 낮은 CI 값을 가질 것이며, 한편 1의 값은 상가 효과를 반영한다(문헌[Chou, Pharmacol Rev 2006;58:621-81]). 계산된 CI 값의 93%는 1보다 작으며(도 2b에서 A375, 도 7b에서 SK-MEL-5 및 도 8b에서 UACC-62), 이는, 시험된 모든 3개의 세포주들에 걸친 조합에 대한 상승작용을 가리킨다.
세포자멸사의 증가가 실행자 프로카스파제의 증가된 활성화의 결과인지 평가하기 위해, 카스파제-3/-7 효소적 활성을 A375 세포(용해 후)에서 플루오로제닉 기질을 사용하여 평가하였다. 베무라페닙 또는 PAC-1 단독(도 1b에 사용된 것과 동일한 농도에서)으로 처리된 A375 세포에서, 카스파제-3 활성의 무시할 만한 증가가 이들 시점 및 농도에서 관찰되었다(도 2c). 그러나, A375 세포를 PAC-1 및 베무라페닙으로 처리했을 때, 카스파제-3 활성의 상당한 증가가 치료 후 7시간만큼 일찍이 관찰되었다(도 2c). 웨스턴 블롯 분석에서, 단일 제제 중 어느 것도 이들 시점 및 농도에서 PARP-1 절단에 대해 아무런 효과가 없었으나; 조합은 상당한 PARP-1 절단(도 2d)을 초래하였으며, 이는 PAC-1+베무라페닙 조합으로 처리된 세포에서 증가된 카스파제-3/-7 활성의 결과이다. 조합으로 24시간 동안 처리한 후, PARP-1의 거의 완전한 절단을 A375 세포에서 관찰하였다(도 2d). 카스파제-3/-7 활성 검정법 및 PARP-1 절단에 대한 유사한 결과는 또한, SK-MEL-5(도 7c 및 7d) 및 UACC-62 세포(도 8c 및 8d)에서도 관찰되었다.
PAC-1 유도체인 PAC-1a은 아연 킬레이트화 모티프를 갖고 있지 않으며, 따라서, 프로카스파제-3를 활성화하거나 세포자멸사를 유도하지 않는다.
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베무라페닙과의 조합에서 PAC-1a의 사용은 A375, SK-MEL-5 또는 UACC-62 세포에서 세포자멸사를 겪는 세포의 비율을 상당히 증가시키지 않았다(도 9a 내지 9c). 이러한 결과는 또한, PAC-1a와 베무라페닙 조합으로 처리된 세포에서 PARP-1 절단의 증가의 부재와 일치하며(도 9d), 이는 세포가 세포자멸사를 겪지 않았음을 가리킨다.
ERK1/2 인산화의 저해 및 프로카스파제-3의 활성화는 세포자멸적 세포 사멸의 증강에 필요하다. 도 1b의 데이터와 일치하여, 카스파제-3 활성 또는 PARP-1 절단의 증강은, PAC-1+베무라페닙의 조합으로 처리되었을 때 2개의 WTBRAF 세포주에서 관찰되지 않았다(도 1a 내지 1c). WTBRAF를 갖는 세포주에서 PAC-1+베무라페닙 상승작용의 결여는, 세포자멸적 세포 사멸의 상당한 증가를 유도하기 위해서는 ERK1/2의 저해 및 프로카스파제-3의 활성화가 둘 다 필요함을 제시한다. 사실상, 베무라페닙으로 처리한 지 24시간 후, ERK1/2 인산화의 저해가 WTBRAF 세포주에서는 심지어 고농도(30 μM)의 베무라페닙에서조차 관찰되지 않았다(도 1b 및 1c). 이러한 관찰은, 베무라페닙이 WTBRAF 세포에서 ERK1/2 인산화를 저해하지 않으나 역설적이게도 ERK1/2 인산화를 활성화시킨다는 이전의 보고들과 일치한다.
이를 더 조사하기 위해, A375(V600EBRAF를 가짐) 세포를 PAC-1, 베무라페닙 또는 조합으로 처리하고, 절단된 PARP-1의 존재 및 ERK1/2 인산화에 대해 탐침하였다. 24시간 후, 포스포-ERK1/2 밴드가 베무라페닙(0.5 μM 및 1.0 μM) 및 조합으로 처리된 세포에서 관찰되지 않았다(도 2e). 그러나, 절단된 PARP-1 양의 상당한 증가는 오로지, PAC-1과 베무라페닙 둘 다로 처리된 세포에서만 관찰되었다(도 2e). 유사한 결과는 또한, SK-MEL-5(도 7e) 및 UACC-62 세포(도 8e)에서도 관찰되었다. ERK1/2 인산화의 불완전한 저해가 관찰된 저농도의 베무라페닙(0.1 μM 및 0.25 μM)에서는, 단일 제제 효과를 능가하는 PARP-1 절단의 약간의 증가가 또한 관찰되었다(도 2e). 이러한 결과는, ERK1/2 인산화의 불완전한 저해에도 불구하고, 베무라페닙 치료에 PAC-1을 첨가하면 ERK1/2 신호전달의 다운스트림인 프로카스파제-3 활성화가 증강될 수 있음을 제시한다. 종합하면, 이러한 데이터는, PAC-1을 통한 프로카스파제-3 활성화가 V600EBRAF 돌연변이를 갖는 세포주에서 베무라페닙의 전세포자멸사 효과를 상당히 증강시킴을 보여준다.
베무라페닙 및 트라메티닙에 PAC-1의 첨가는 카스파제-3 활성 및 세포자멸사를 증강시킨다. MEK1/2 저해제, 예컨대 트라메티닙의 첨가는 V600EBRAF 흑색종에서 베무라페닙의 효능을 증강시키기 위해 병원에서 널리 사용되고 있다. 이러한 조합과 함께 PAC-1의 효과를 알아보기 위해, 세포를 PAC-1의 존재 또는 부재 하에 베무라페닙+트라메티닙으로 처리하고, 세포자멸사를 평가하였다. A375 및 UACC-62 세포주 둘 다에서, 베무라페닙+트라메티닙 공동치료는 세포자멸사 세포 집단에서 단순히 상가적인 증가를 초래하였다(도 3a). 이와는 대조적으로, PAC-1의 첨가는 세포자멸사 세포 집단의 큰 증가를, 단일 제제 단독의 상가 효과를 능가하여 초래하였다(도 3a). 베무라페닙+트라메티닙 공동치료는 PARP-1 절단을 초래하지 않았으며, 한편, PAC-1의 첨가가 PARP-1의 거의 정량적인 절단을 초래하였다(도 3b). PAC-1의 존재 하에 증가된 세포자멸적 세포 사멸이 실행자 카스파제의 증강된 효소적 활성의 결과인지 알아보기 위해, 베무라페닙+트라메티닙, +/- PAC-1으로 처리한 A375 및 UACC-62 세포의 카스파제-3/-7 활성을 평가하였다. 다시, PAC-1이 포함되었을 때 카스파제-3/-7 활성의 상당한 증가가 관찰되었으며, 이러한 효과는 PAC-1이 첨가되지 않았을 때에는 부재하였다(도 3c).
베무라페닙과 PAC-1의 조합은 A375 이종이식 모델에서 종양 덩어리를 상당히 감소시킨다. 생체내에서 PAC-1+베무라페닙 조합의 항종양 효과를 확인하기 위해, A375 이종이식 모델(문헌[Yadav et al., Mol Cancer Ther 2014;13:2253-63])을 사용하였다. 이 모델에서, 누드 마우스에게 A375 세포를 피하 접종하고, 종양이 성장하도록 놔둔 후, 마우스를 종양 부피를 기반으로 4개의 그룹으로 무작위로 나누고[F=0.03 < F임계(3.01)], PAC-1, 베무라페닙 또는 조합을 15일 동안 투약하였다. PAC-1 단독으로 치료한 경우, 비처리된 대조군 마우스와 비교하여 종양 질량 및 부피가 미미하게 감소되었다(도 4a 및 4b). 베무라페닙 단독을 투약한 마우스는 대조군과 비교하여 종양 부피 및 질량에 있어서 중간 정도의 감소(53%; p=0.04)를 경험하였으며(도 4a 및 4b), 8마리 중 3마리는 대조군 마우스와 유사한 종양 질량을 가졌다(도 4b). 이와는 대조적으로, PAC-1과 베무라페닙의 조합으로 처리된 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 상당히 더 작은 종양 덩어리를 가졌다(도 4a, 4b 및 도 11). 이들 마우스에서, 종양 부피의 78% 감소가 관찰되었으며(도 4a, p=0.0008 vs. 대조군), 8마리 중 6마리는 질량이 0.2 g 미만인 종양을 가졌고(도 4b), 이는, PAC-1의 첨가가 생체내에서 베무라페닙의 항종양 효과를 증강시키고 치료에 대한 반응의 변동성을 감소시킴을 가리킨다.
웨스턴 블롯에 의한 종양 시료 내 프로카스파제-3 수준의 검사는, 다른 투약 그룹들에 대한 가변적인 반응과 비교하여(versus), 조합 치료를 받은 마우스로부터 유래된 종양 시료에서만 프로카스파제-3의 양의 주목할 만하고 일관된 감소를 보여주었다(도 4c 및 4d). 면역조직화학 염색을 사용한 경우, PAC-1+베무라페닙으로 처리된 종양에서 Ki-67 발현 세포의 퍼센트의 상당한 감소가 관찰되었으며(도 4e), 이는, PAC-1+베무라페닙 조합이 프로카스파제-3 활성화를 증폭시킬 뿐만 아니라 세포 증식을 약화시킬 수도 있었음을 가리킨다. 마지막으로, PAC-1+베무라페닙으로 처리된 마우스에서, 혈액학적 독성은 관찰되지 않았으며(표 1), 이는 조합에 대한 선호할만한 안전성 프로파일을 가리킨다. 종합하면, 생체내 데이터는, PAC-1+베무라페닙의 상승작용이 카스파제-3 활성의 증가 및 세포자멸적 세포 사멸의 유도, 뿐만 아니라 세포 증식의 감소를 초래함을 보여주는 세포 배양물 결과와 일치한다.
표 1. PAC-1 및 베무라페닙의 혈액학적 독성 및 생화학적 독성. 100 mg/kg PAC-1 1일 1회 및 10 mg/kg 베무라페닙 1일 2회로 15일 동안 처리된 4마리의 마우스로부터의 평균 데이터. 골수억제, 신장 외상 또는 간 독성에 대한 임상적으로 유의한 증가가 확인되지 않았다. *혈소판 무리(clump)가 관찰되었기 때문에 혈소판 세포 계수는 낮았다. 1정상 범위 값은 Charles River사의 8주령 내지 10주령의 암컷 NU/NU 마우스로부터 수득되었다.
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PAC-1을 이용한 장기간 치료는 세포 재성장을 방지하고, 베무라페닙에의 PAC-1의 첨가는 세포 재성장의 개시를 지연시킨다. A375 세포에서 베무라페닙의 Emax(고농도의 화합물에 의해 유도된 세포 사멸 %)는 5일 후 96.8±0.3%이며(도 5a), 이는 약 3%의 A375 세포가 베무라페닙에 둔감함을 가리킨다. 동일한 조건 하에, PAC-1은 99.4±0.7%의 Emax를 가지며(도 5a), 이는 PAC-1이 A375 세포를 정량적으로 살해하고, 둔감한 세포는 매우 소수임을 가리킨다. 따라서, 본 발명자들은, 베무라페닙을 이용한 장기간 치료가 암세포의 재성장을 초래할 것이지만, PAC-1을 이용한 치료는 재성장을 방지해야 한다고 가정하였다. 이러한 가정을 조사하기 위해, A375 및 SK-MEL-5 세포를 저밀도로 평판배양하고, PAC-1(4 μM) 또는 베무라페닙(10 μM)으로 30일 이하 동안 연속해서 처리하였다. 베무라페닙으로 처리한 A375 및 SK-MEL-5 세포에서, 세포의 재성장은 20일만큼 일찍이 관찰되었다(도 5b). 그러나, PAC-1을 처리한 웰에서는, 심지어 30일 이후에도 재성장이 관찰되지 않았다(도 5b). 따라서, 더 높은 Emax 값과 일치하여, PAC-1은 세포를 정량적으로 살해함으로써 재성장을 방지할 수 있다.
저농도의 PAC-1의 첨가가 베무라페닙과 조합하여, 암세포 재성장을 방지할 수 있는지 조사하기 위해, A375 및 UACC-62 세포를 96웰 플레이트에 저밀도로 평판배양하고, PAC-1(1 μM), 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM) 또는 조합을 20일 이하 동안 연속적으로 처리하였다. 5일 후, PAC-1, 베무라페닙 또는 조합을 이용한 처리는 각각, 대조군과 비교하여 세포 수의 상당한 감소를 초래하였다(A375: 도 5c 및 5d; UACC-62: 도 12a 및 12b). 제10일에, PAC-1 처리 웰과 대조군 사이에 관찰 가능한 차이가 존재하지 않는다. 5 μM 또는 10 μM 베무라페닙으로 처리한 웰에서, 세포 사멸은 각각 89.4±1.4% 및 93.2±1.1%이었다. 그러나, A375 세포를 1 μM PAC-1 및 5 μM 또는 10 μM 베무라페닙으로 처리한 웰에서는, 증가된 세포 사멸이 관찰되었으며, 각각 96.1±1.0% 및 97.9±0.7%이었다. 보다 완전한 세포 사멸을 달성한 결과, PAC-1과 베무라페닙 둘 다로 처리한 웰에서 더 작은 비율의 세포가 남아 있다. 20일 동안 처리한 후, 콜로니의 상당한 재성장이 베무라페닙-단독 처리 웰에서 관찰되었으나, 공동처리한 웰에서는 관찰되지 않았다(A375: 도 5c 및 5d; UACC-62: 도 12a 및 12b). 이러한 결과는, 세포를 PAC-1 및 베무라페닙으로 공동처리함으로써 유도된 보다 완전한 세포 사멸이 A375 및 UACC-62의 재성장을 지연시키는 데 효과적임을 가리킨다.
PAC-1은 생체내에서 베무라페닙-내성 흑색종에서 베무라페닙과 상승작용한다 . PAC-1이, 베무라페닙에 대해 내성을 획득한 세포주에서 활성을 유지하는지 평가하기 위해, A375 부모 세포주를 순차적으로 더 높은 농도의 베무라페닙(0.5 μM 내지 1.0 μM) 내에서 2개월 동안 성장시킴으로써 베무라페닙-내성 A375VR 세포주를 발생시켰다. A375VR의 내성 메커니즘을 확인하기 위해, MEK1/2, NRAS 및 AKT에 대한 유전자들을 시퀀싱하였으나, 내성을 부여할 것으로 보편적으로 보고된 돌연변이는 확인되지 않았다(문헌[Rizos et al., Clinical Cancer Research 2014;20:1965-77]). 유사하게는, V600EBRAF mRNA의 스플라이스 변이체 또한, 관찰되지 않았다. qPCR을 통해, A375VR 세포는 A375와 비교하여 대략 3배 더 높은 수준의 MDR1 mRNA를 가진다. 그러나, 독소루비신 또는 시스플라틴에 내성인 난소 세포에서 최대 1,000배 더 높은 수준의 MDR1 mRNA와 비교하여, MDR1 mRNA 과발현의 수준은 낮은 것으로 간주되며, 이는, 내성이 MDR 표현형의 상당한 상향조절로 인한 것이 아닐 것임을 가리킨다.
베무라페닙은 1.5 μM의 제5일 IC50 값으로 A375VR 세포주를 살해하며, 이 IC50 값은 부모 A375의 민감성과 비교하여 12배 덜 강력하다(도 6a). 더욱이, A375VR에 대한 베무라페닙 Emax는 79±6.3%이며, 이 Emax는 부모 A375 세포주보다 14% 더 낮다. 부모 A375 세포를 베무라페닙(0.5 μM 또는 1 μM)로 2시간 동안 처리하면, 완전한 ERK1/2 인산화의 저해가 초래되긴 하더라도, 이러한 효과는 A375VR에서는 관찰되지 않으며, 이는 베무라페닙에 대한 A375VR의 내성 및 계속된 MAPK 신호전달과 일치한다(도 6b). 이와는 대조적으로, PAC-1은 2.4 μM(vs 부모 세포주의 경우 1.2 μM, 도 6c)의 IC50 값 및 유사한 Emax를 가지고 있으며 A375VR에 대해 활성을 보유한다. 본 발명자들은, 내성 A375VR 세포주에서 ERK1/2 인산화 및 MAPK 신호전달을 저해하는 데 있어서 베무라페닙의 무능력에도 불구하고, 조합은 PAC-1+베무라페닙 치료에 대해 관찰된 PARP-1 절단을 기반으로, 심지어 ERK1/2 인산화의 불완전한 저해의 조건 하에서도 부분적인 능력을 보유하여 상승작용적 효과를 발휘할 것으로 가정하였다(도 2e). PAC-1이 베무라페닙-유도 세포자멸사에 대해 A375VR 세포를 재민감화시킬 수 있는지 알아보기 위해, A375VR 세포를 저농도의 베무라페닙과 조합된 PAC-1으로 처리하였다. 이러한 조합은 세포자멸사를 겪는 세포의 비율을 증가시켰으며(도 13a, 13c), 이는, PAC-1의 첨가가, 베무라페닙에 대한 A375VR의 내성 메커니즘을 우회할 수 있음을 가리킨다. 이러한 효과는, 비활성 변이체 PAC-1a이 사용되었을 때 소멸되었다(도 13c). PAC-1+베무라페닙 조합은 상승작용적이어서, 블리스(Bliss) 독립 모델에 의해 예측된 것보다 평균 7.5% 더 높은 세포자멸사 세포 집단을 유도하였다(문헌[Bliss, Ann Appl Biol 1939;26:585-615])(도 13a 및 13b). 마지막으로, PAC-1이 생체내에서 베무라페닙과 상승작용할 수 있는지 확인하기 위해, A375VR 세포를 누드 마우스에게 피하 이식하고, 마우스에게 베무라페닙(10 mg/kg), PAC-1(100 mg/kg) 또는 조합을 15일 동안 매일 투약하였다. 베무라페닙 또는 PAC-1 단독을 이용한 치료는 이러한 생체내 모델에서 임의의 항종양 효과를 발휘하지 않으며, 한편, 조합을 이용한 치료는 비처리된 대조군과 비교하여 종양 부피를 상당히 감소시켰다(도 6d).
고찰. 흑색종 세포에서 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 변이가 프로카스파제-3의 활성화의 업스트림에 존재하는 것을 고려하면, 프로카스파제-3를 직접적으로 활성화시키는 저분자는 결함성 세포자멸사 회로를 우회함으로써 세포자멸사를 유도할 수 있다. PAC-1을 이용한 프로카스파제-3의 활성화는 이전에, 배양중인 흑색종 세포에 대해 단일 제제 효능을 가지고 있는 것으로 나타나 있고(문헌[Wang et al., Mol Oncol 2014;8:1640-52]; [Peterson et al., Cancer Res 2010;70:7232-41]; [Putt et al., Nat Chem Biol 2006;2:543-50]), 현재 본 발명자들은, PAC-1+베무라페닙 또는 PAC-1+베무라페닙+트라메티닙이 V600EBRAF 돌연변이를 가진 흑색종에서 카스파제-3 활성 및 세포자멸적 세포 사멸의 유도에 있어서 강력하게 상승작용적임을 보여준다. 흑색종 외에도, V600EBRAF 돌연변이는 에드헤임-체스터 병(ECD)(54%), 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)(57%), 비소세포폐암(NSCLC)(1.5%) 및 모양세포 백혈병(100%)을 포함한 몇몇 다른 암들에서 보고되어 있다. 최근의 2개의 II상 시험에서, V600EBRAF 돌연변이를 갖는 몇몇 비흑색종 암들에서 베무라페닙의 효능이 보고되었으며, 유망한 결과는 NSCLC, ECD, LCH 및 불응성 모양세포 백혈병을 앓고 있는 환자들에서 관찰된다. V600EBRAF 흑색종에서 PAC-1, 베무라페닙 및 트라메티닙 사이의 강력한 상승작용을 보여주는 이러한 임상 데이터 및 본 발명자들의 현재의 연구를 고려하면, 이들 PAC-1/약물 조합은 V600EBRAF 돌연변이를 갖는 다른 악성 종양들에서 효능을 가질 수 있다.
Emax 파라미터는 배양중인 암세포를 정량적으로 살해하는 화합물의 능력을 평가하는 데 유용한 미터법(metric)이다(문헌[Fallahi-Sichani et al., Nat Chem Biol 2013;9:708-14]). 100%보다 작은 Emax 값은 암세포 집단을 살해하는 약물의 능력에 있어서 불균질성을 시사한다. 본원에서, 본 발명자들은, 베무라페닙이 V600EBRAF 돌연변이체 A375 세포에서 약 97%의 Emax를 가지지만, PAC-1에 대한 Emax 값은 100%에 달함을 보여준다. 이로 인해, A375 또는 SK-MEL-5 세포의 재성장은 PAC-1을 이용한 장기간 실험에서는 관찰되지 않는다. 그러나, 베무라페닙 단독으로 20일 동안 처리한 A375, UACC-62 및 SK-MEL-5 세포에서는 대규모 재성장이 관찰되었다. 저농도의 PAC-1(1 μM)을 베무라페닙에 첨가하면, 세포에서 재성장이 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않았다. 이들 결과는, 저농도의 PAC-1(1 μM, 생체내에서 쉽게 달성되는 PAC-1 농도(문헌[Lucas et al., Invest New Drugs 2011;29:901-11]))의 첨가가 내성을 지연시키는 데 있어서 임상적으로 효과적일 수 있음을 가리킨다. 조합 처리 동안 초기에 카스파제-3 활성의 상당한 증가 및 후속해서 세포자멸사의 대량 유도는, 초기에 베무라페닙에 둔감했던 세포의 대부분을 살해하는 경향이 있다. 결과적으로, 치료에 의해 영향을 받지 않는 세포 집단이 상당히 더 작게 남으며, 이는 세포의 재성장을 지연시키는 데 중요하다.
현재, 베무라페닙-내성 흑색종이 발병된 환자에 대해 몇몇 옵션이 존재할 뿐이다. MEK1/2 저해제인 트라메티닙은 V600EBRAF 돌연변이를 가진 흑색종에 대해 승인되긴 했지만, 이전의 치료법에서 실패한 환자에서 BRAF 저해제와 조합되어 제한된 활성을 발휘한다(문헌[Kim et al., J Clin Oncol 2013;31:482-89]). 본 발명자들의 결과는, PAC-1이 베무라페닙과 여전히 상승작용하여, 베무라페닙-내성 종양에서 항종양 효과를 발휘함을 보여준다. 따라서, PAC-1의 첨가는, 베무라페닙 치료 후 진행된 흑색종 환자에 대해 실행 가능하고 대안적인 치료 옵션이 될 것이다. PAC-1+베무라페닙 조합은 관용성이 양호하고, 양호한 안전성 프로파일을 가지며, 생체내에서 상당한 항종양 효과를 나타낸다. PAC-1은 현재, I상 임상 시험중이며(NCT02355535), 베무라페닙과 트라메티닙 둘 다 V600EBRAF 흑색종에 대한 승인된 제1선(first-line) 치료이다. 따라서, 이러한 연구에 기재된 상승작용의 예비임상 내용을, 이러한 신규 조합이 V600EBRAF 돌연변이를 갖는 인간 암 환자에서 평가될 수 있는 임상 시험으로 번역하기 위한 명백한 방향이 존재한다.
재료 및 방법
세포 배양 및 시약. A375(CRL-1619) 및 CHL-1(CRL-9446)을 각각 ATCC사로부터 2014년 11월 5일 및 2014년 11월 18일에 구매하였다. A375SM은 2014년 10월 30일에 Isiah Fidler(MD Anderson, 미국 텍사스주) 교수로부터 제공받았다. B16-F10, H460 및 HCT 116을 제외한 모든 세포주들을 10% FBS(Gemini)가 보충된 DMEM에서 배양하였다. B16-F10, H460 및 HCT 116은 10% FBS가 보충된 RPMI에서 배양하였다. 베무라페닙, 트라메티닙 및 아넥신 V-FITC(10040-02)를 각각 LC Laboratories, MedChemExpress 및 SouthernBiotech사로부터 구매하였다. 하기 항체들: 항-PARP-1(9542), 항-카스파제-3(9662), 항-β-액틴(4967), 항-포스포-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(4370), 항-ERK1/2(4695) 및 항-토끼 IgG HRP 링크드(linked)(7074)를 Cell Signalling Technology사로부터 구매하였다. 항-절단된-PARP-1(ab32561) 항체를 Epitomics사로부터 구매하였다. PAC-1 및 PAC-1a은 이전에 보고된 바와 같이 합성하였다(문헌[Putt et al., Nat Chem Biol 2006;2:543-50]).
세포주 인증. 모든 인간 세포주들(A375, A375SM, CHL-1, H460, HCT 116, MIA PaCa-2, SK-MEL-5 및 UACC-62)을 PowerPlex16HS 검정법(Promega)을 사용하여 인증받았다: 아리조나 대학교 유전학 코어에서 15개의 상염색체 유전자좌, X/Y. 시험 및 페로그램(pherogram)의 결과를 기록하였다. 마이코플라즈마 시험을, 일리노이 대학교 수의학 진단 실험실에서 마이코플라즈마 검출 PCR을 사용하여 A375 세포주에 대해 수행하였다.
세포 증식 검정법. 96웰 플레이트에서 1개 웰 당 1,000개 내지 2,000개의 세포를 접종하고, 부착되도록 놔둔 후, PAC-1 또는 베무라페닙의 DMSO 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 증식을 설포로다민 B(SRB) 검정법에 의해 평가하였다.
아넥신 V/PI 유세포 분석 분석. 70,000개의 세포를 12웰 플레이트에 접종하고, 부착되도록 놔둔 후, 화합물을 첨가하였다. 세포에 화합물을 37℃에서 24시간 동안 처리한 다음, 세포를 수합하고, 아넥신 V-FITC 및 PI(0.55 ㎍/mL) 염료와 예비혼합된 450 ㎕의 냉각 완충제(10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2 pH 7.4)에 재현탁하였다. 시료를 BD Biosciences LSR II 유세포 분석기 상에서 분석하고, 데이터 분석을 FCS Express V3-2를 사용하여 수행하였다.
카스파제 -3/7 활성 검정법. 5,000개 내지 8,000개의 세포를 96웰 플레이트에 평판배양하고, 부착되도록 놔두었다. 세포를 1 μM의 스타우로스포린으로 24시간 동안 처리하거나 양성 대조군으로서 13 μM의 랍티날(raptinal)(문헌[Palchaudhuri et al., Cell Rep 2015;13:2027-36])로 3시간 동안 처리하거나, 음성 대조군으로서 DMSO로 처리한 다음, 지시된 농도의 PAC-1 및 베무라페닙으로 0시간, 2시간, 4시간, 7시간, 10시간, 12시간, 16시간, 20시간 또는 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 플레이트를, 플루오로제닉 기질(λex=400 nm, λem=505 nm)로서 20 μM의 Ac-DEVD-AFC(Cayman Chemicals)와 함께 이작용성 용해 및 활성 완충제(200 mM HEPES, 400 mM NaCl, 40 mM DTT, 0.4 mM EDTA, 1% Triton-X, pH 7.4)의 첨가를 통해 카스파제-3/7 활성에 대해 평가하였다. 플레이트를 시너지 멀티모드 판독기(BioTek)에서 37℃에서 30분 동안 예비인큐베이션한 다음, 3분 간격으로 30분 동안 판독하였다. 각각의 웰에 대한 경사도(slope)를 계산하였다. 활성은 검정법 내에서 관찰된 최소 활성 및 최대 활성으로 정상화된 바와 같이 표현된다.
시험관내 내성 검정법. 800개의 A375 또는 UACC-62 세포를 96웰 플레이트에 평판배양하고, 밤새 부착되도록 놔두었다. 이튿날, 베무라페닙(5 μM 또는 10 μM) 또는 PAC-1(1 μM)을 6개의 기술적 복제물에서 5일, 10일 및 20일 동안 처리하였다. 신선한 배지 및 화합물을 연구 기간 동안 2일 내지 3일마다 첨가하였다. 5일, 10일 및 20일의 종료 시, 웰을 10% 냉각 트리클로로아세트산을 이용하여 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 그런 다음, 웰을 세척하고, 건조되도록 놔둔 다음, 0.5% SRB 염료를 이용하여 실온에서 30분 동안 염색하였다. 그런 다음, 웰을 0.1% 아세트산으로 세척하고, 건조되도록 놔두었다. 이때, 플레이트의 이미지를 GelDoc XR(BioRad)를 이용하여 촬영하였다. 마지막으로, 200 ㎕의 10 mM Tris 염기(pH > 10.4)를 웰에 첨가하고, 510 nm에서의 흡광도를 SpectraMax Plus(Molecular Devices)를 사용하여 판독하였다. 510 nm에서의 흡광도를, 실험 기간에 걸친 세포 증식의 지표로서 치료 후 일수(day)에 대하여 도시한다.
면역블로팅. 세포 및 종양 조직을 포스파타제 및 프로테아제 저해제 칵테일(Calbiochem)을 함유하는 RIPA 완충제를 사용하여 용해시켰다. 각각의 시료의 단백질 농도를 BCA 검정법(Pierce)에 의해 확인하였다. 20 ㎍의 단백질을 함유하는 세포 용해물을 SDS-PAGE용 4% 내지 20% 구배 겔(BioRad)의 각각의 레인 내로 로딩하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 PDVF 막 상으로 옮겼다.
PCR 및 시퀀싱. A375 및 A375VR 세포를 용해시키고, RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 900 ng의 RNA를 iScript cDNA 합성 키트(BioRad)를 사용하는 역전사 반응에 사용하였다. qPCR 반응을 7900HT 패스트 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems) 상에서 진행시켰다. 정기적인 PCR 반응을 MyFi Mix PCR 키트(Bioline)를 사용하여 35 사이클 동안 진행시켰고, 1% 아가로스 겔 상에서 진행시켰다. 표적 앰플리콘을 겔 추출하였고, UIUC 코어 시퀀싱 시설에서 시퀀싱하였다. 사용된 프라이머는 하기 표에서 확인할 수 있다.
베무라페닙-내성 A375VR을 특징화하는 데 사용된 프라이머 서열.
Figure pct00005
A375 및 A375VR 이종이식 모델. 모든 동물 연구를 UIUC IACUC 가이드라인(프로토콜 번호 14292)에 따라 수행하였다. 1:1 DMEM : 마트리겔(Corning) 중 0.1 mL의 A375 또는 A375VR을 6주령 내지 7주령(A375) 또는 5주령(A375VR)의 암컷 무흉선 누드 마우스(Charles River)의 우측 옆구리에 주사하였다. 두 모델 모두에서, 마우스를 4개의 그룹: 대조군, 100 mg/kg PAC-1, 10 mg/kg 베무라페닙, 및 100 mg/kg PAC-1과 10 mg/kg 베무라페닙의 조합(n=8)으로 무작위로 나누었다. 초기 종양 부피 측정을 수행하고, 투약을 15일 동안 개시하였다. 베무라페닙을 1% 메틸 셀룰로스 중 5% DMSO로서 제형화하고, 경구 복용(oral gavage)(p.o.)에 의해 매일 2회 제공하였다. PAC-1을 pH 5.5에서 200 mg/mL 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에서 제형화하고, 복강내(i.p.) 주사에 의해 제공하였다. 종양 길이 및 폭 측정을 1주에 3회 수행하였으며, 부피를 0.52*L*W2로서 계산하였다. 연구 종료 시, 마우스를 안락사시키고, 종양을 절제하였다. 종양의 중량을 측정하고, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학에 사용하였다.
A375 종양의 면역조직화학 및 Ki-67 지수의 정량화
H&E 염색에 의해 적절한 조직 온전성(integrity)과 함께 신생 세포 집단의 존재를 확인한 후, 4 ㎛-두께의 포르말린-고정된 파라핀-포매된 A375 종양 상에서 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. Ki-67에 대한 항체(Biocare Medical #CRM325)를 IHC에 사용하였으며, IntelliPATH FLX DAB 색원체 키트(Biocare Medical #IPK 5010 G80)를 사용하여 염색을 시각화하였다. 인간 편도선을 양성 대조군 조직으로서 사용하였다. 1차 항체를 음성 대조군으로서 중합체 음성 대조군 혈청(마우스 및 토끼)(Biocare Medical #NC499)으로 대체하였다. Ki-67 지수의 정량화를 위해, 2,000개의 신생 세포를 계수하고, 양성 세포의 퍼센트를 계산하였다. 2,000개의 세포를 정량화하기에 너무 작은 종양에서는, 신생 세포의 최대 수를 계수하였다. 모든 슬라이드를 단일 수의과 병리학자가 검수하였다.
실시예 2. 약제학적 투약 형태
하기 제형은 본원에 기재된 조합 화합물(예를 들어, PAC-1 및 제2 활성제), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물(이하, '화합물 X'로도 지칭되며, 1개의 활성제 또는 2개의 활성제들의 조합일 수 있음)의 치료적 또는 예방적 투여에 사용될 수 있는 대표적인 약제학적 투약 형태를 예시한 것이다:
(i) 정제 1 mg/정제
'화합물 X' 200.0
락토스 77.5
포비돈 15.0
크로스카멜로스 소듐 12.0
미세결정질 셀룰로스 92.5
마그네슘 스테아레이트 3.0
400.0
(ii) 정제 2 mg/정제
'화합물 X' 120.0
미세결정질 셀룰로스 410.0
전분 50.0
소듐 스타치 글리콜레이트 15.0
마그네슘 스테아레이트 5.0
600.0
(iii) 캡슐 mg/캡슐
'화합물 X' 110.0
콜로이드 실리콘 다이옥사이드 1.5
락토스 465.5
예비젤라틴화된 전분 120.0
마그네슘 스테아레이트 3.0
700.0
(iv) 주사액 1(1 mg/mL) mg/mL
'화합물 X' 1.0
다이베이직 소듐 포스페이트 12.0
모노베이직 소듐 포스페이트 0.7
소듐 클로라이드 4.5
1.0 N 소듐 하이드록사이드 용액 q.s.
(pH 7.0 내지 7.5로 조정)
주사용수 q.s. ad 1 mL
(v) 주사액 2(10 mg/mL) mg/mL
'화합물 X' 10.0
모노베이직 소듐 포스페이트 0.3
다이베이직 소듐 포스페이트 1.1
폴리에틸렌 글리콜 400 200.0
0.1 N 소듐 하이드록사이드 용액 q.s.
(pH 7.0 내지 7.5로 조정)
주사용수 q.s. ad 1 mL
(vi) 에어로졸 mg/캔
'화합물 X' 20
올레산 10
트리클로로모노플루오로메탄 5,000
다이클로로다이플루오로메탄 10,000
다이클로로테트라플루오로에탄 5,000
이들 제형은 약제학적 분야에 잘 공지된 종래의 절차에 의해 제조될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 활성제(들) '화합물 X'의 상이한 양 및 유형들을 수용하기 위해 잘 공지된 약제학적 기술에 따라 변할 수 있음을 이해할 것이다. 에어로졸 제형 (vi)은 표준 계량된 용량 에어로졸 디스펜서와 함께 사용될 수 있다. 부가적으로, 특정 성분 및 비율은 예시를 위한 것이다. 성분은 적합한 등가물(예를 들어, 상기 기재된 구성성분)로 교환될 수 있고, 비율은 관심 투약 형태의 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있다.
실시예 3. 정제 형태
하기 제형은 본원에 기재된 조합 화합물(예를 들어, PAC-1 및 제2 활성제), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물의 치료적 또는 예방적 투여에 사용될 수 있는 대표적인 약제학적 투약 형태를 예시한 것이다:
(i) 정제 A mg/정제
PAC-1 250.0
미세결정질 셀룰로스 127.5
만니톨 50.0
소듐 스타치 글리콜레이트 50.0
흄드 실리카 2.5
하이드록시프로필 셀룰로스 15.0
소듐 스테아릴 푸마레이트 5.0
500.0
(ii) 정제 B mg/정제
제2 제제 250.0
미세결정질 셀룰로스 127.5
만니톨 50.0
소듐 스타치 글리콜레이트 50.0
흄드 실리카 2.5
하이드록시프로필 셀룰로스 15.0
소듐 스테아릴 푸마레이트 5.0
500.0
제2 제제는 예를 들어, 베무라페닙, 다브라페닙, BMS-908662(XL281로도 알려져 있음), 엔코라페닙(LGX818), PLX3603(RO5212054) 또는 RAF265(1-메틸-5-[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]피리딘-4-일]옥시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈이미다졸-2-아민)일 수 있다. 제2 제제는 또한, MEK 저해제, 또는 MEK 저해제와 상기 언급된 활성제들 중 하나의 조합일 수 있다. 더욱이, 정제 B와 유사한 제3 약제학적 투약 형태가 MEK 저해제를 (예를 들어, 활성제의 제3의 개별적이고 순차적인 투여로서) 투여하는 데 사용될 수 있다. 이들 제형은 약제학적 분야에 잘 공지된 종래의 절차에 의해 제조될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 활성제의 상이한 양 및 유형들을 수용하기 위해 잘 공지된 약제학적 기술에 따라 변할 수 있음을 이해할 것이다. 부가적으로, 특정 성분 및 비율은 예시를 위한 것이다. 성분은 적합한 등가물(예를 들어, 상기 기재된 구성성분)로 교환될 수 있고, 비율은 관심 투약 형태의 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있다.
구체적인 실시형태가 개시된 실시형태 및 실시예를 참조로 하여 상기 기재되긴 했어도, 이러한 실시형태는 단지 예시일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 변화 및 변형은 하기 청구항에 정의된 바와 같은 이의 더 넓은 양태에서 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 따라 이루어질 수 있다.
모든 공개, 특허 및 특허 문헌은 개별적으로 원용에 의해 포함되더라도, 본원에 원용에 의해 포함된다. 이러한 개시내용과 일치하지 않는 어떠한 제한도 이로부터 이해되지 않아야 한다. 본 발명은 다양한 구체적이고 바람직한 실시형태 및 기술을 참조로 하여 기재되어 있다. 그러나, 많은 변화 및 변형들이 본 발명의 사상 및 범위 내에 있으면서 이루어질 수 있는 것으로 이해해야 한다.

Claims (31)

  1. (a) 화합물 PAC-1:
    Figure pct00006
    ;
    (b) 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인 제2 활성제; 및
    (c) 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체
    를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인 제2 활성제가 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 제2 활성제가 베무라페닙(vemurafenib), 다브라페닙(dabrafenib), 엔코라페닙(encorafenib), BMS-908662, PLX3603 또는 RAF265인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 제2 활성제가 베무라페닙 또는 다브라페닙인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 MEK 저해제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 담체가 물, 완충제, 당(sugar), 셀룰로스, 사이클로덱스트린 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, PAC-1의 농도가 약 1 μM 내지 약 50 μM인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 제2 활성제의 농도가 약 25 nM 내지 약 1 mM인 조성물.
  9. 제1항 또는 제4항에 있어서, 제2 활성제가 베무라페닙이고, 베무라페닙의 농도가 약 0.5 μM 내지 약 50 μM인 조성물.
  10. 제1항 또는 제4항에 있어서, 제2 활성제가 다브라페닙이고, 다브라페닙의 농도가 약 0.5 μM 내지 약 50 μM인 조성물.
  11. 암세포를 유효량의 제1항의 조성물과 접촉시킴으로써 암세포의 성장 또는 증식을 저해하는 단계를 포함하는, 암세포의 성장 또는 증식의 저해 방법.
  12. 제11항에 있어서, 암세포가 흑색종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 골육종 세포, 유방암 세포, 또는 난소 암종 세포인, 암세포의 성장 또는 증식의 저해 방법.
  13. 암세포를 유효량의 화합물 PAC-1:
    Figure pct00007
    ; 및
    유효량의 제2 활성제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포에서 세포자멸사를 유도하는 방법으로서, 여기서, 제2 활성제는 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제이고, 상기 방법에 의해 세포자멸사가 암세포에서 유도되는, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제2 활성제가 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제2 활성제가 베무라페닙, 다브라페닙, BMS-908662, 엔코라페닙, PLX3603 또는 RAF265인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포를 유효량의 MEK 저해제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  17. 제13항에 있어서, 접촉이 생체내에서 수행되는 것인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포가 PAC-1 및 제2 활성제와 동시에 접촉되는 것인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포를 제2 활성제와 접촉시키기 전에, 암세포가 PAC-1과 접촉되는 것인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  20. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암세포를 제2 활성제와 접촉시킨 후에, 암세포가 PAC-1과 접촉되는 것인, 암세포에서 세포자멸사의 유도 방법.
  21. 환자에게 치료적 유효량의 화합물 PAC-1:
    Figure pct00008
    ;
    및 유효량의 제2 활성제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서, 제2 활성제는 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제이고, 상기 방법에 의해 암이 치료되는, 암 치료 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제2 활성제가 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 갖는 BRAF 효소의 저해제인, 암 치료 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 제2 활성제가 베무라페닙, 다브라페닙, BMS-908662, 엔코라페닙, PLX3603 또는 RAF265인, 암 치료 방법.
  24. 제21항에 있어서, 화합물 PAC-1 및 제2 활성제가 동시에 투여되는 것인, 암 치료 방법.
  25. 제21항에 있어서, 화합물 PAC-1 및 제2 활성제가 순차적으로 투여되는 것인, 암 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제2 활성제가 투여되기 전에, 화합물 PAC-1이 투여되는 것인, 암 치료 방법.
  27. 제25항에 있어서, 제2 활성제가 투여된 후에, 화합물 PAC-1이 투여되는 것인, 암 치료 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 백혈병, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 에드헤임-체스터 병(ECD) 또는 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)인, 암 치료 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 치료적 유효량의 MEK 저해제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 암 치료 방법.
  30. 암 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 암이 흑색종, 백혈병, 결장직장암, 갑상선암, 폐암, 난소암, 에드헤임-체스터 병(ECD) 또는 랑게르한스 세포 조직구증(LCH)인 용도.
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