WO2022177269A1 - 넌센스-매개 mrna 분해를 억제하기 위한 화합물 - Google Patents

넌센스-매개 mrna 분해를 억제하기 위한 화합물 Download PDF

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WO2022177269A1
WO2022177269A1 PCT/KR2022/002228 KR2022002228W WO2022177269A1 WO 2022177269 A1 WO2022177269 A1 WO 2022177269A1 KR 2022002228 W KR2022002228 W KR 2022002228W WO 2022177269 A1 WO2022177269 A1 WO 2022177269A1
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nmd
compound
ptc
disease
pharmaceutical composition
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PCT/KR2022/002228
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김윤기
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라이보텍(주)
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof for inhibiting nonsense-mediated mRNA decay (hereinafter referred to as "NMD").
  • NMD nonsense-mediated mRNA decay
  • nonsense mutation a mutation generated in the DNA sequence, such as mistakes during DNA recombination and replication, as well as aberrant transcription, inefficient splicing, and frameshift mutations. ) due to abnormal or inefficient intracellular mechanisms.
  • mRNAs with nonsense mutations may express proteins shorter than their normal length, thereby inhibiting the normal function of cells.
  • the NMD mechanism which is a quality inspection mechanism that exists in the cell, and are removed from the cell at a much faster rate than normal mRNA. That is, cells can selectively recognize/remove erroneous mRNAs that can harm themselves by using the NMD mechanism.
  • NMD-related diseases such as Duchenne muscular dystrophy (DMD)
  • drug development such as PTC 124 (generic name: ataluren)
  • PTC 124 gene: ataluren
  • 1,2,4-oxidiazole compound a 1,2,4-oxidiazole compound
  • One object of the present invention is to provide a compound that effectively inhibits NMD (hereinafter also referred to as "NMD inhibitory compound”), thereby providing a pharmaceutical composition that can be used for the prevention or treatment of NMD-related genetic diseases comprising the same as an active ingredient will do
  • Another object of the present invention is to provide the use of the NMD inhibitory compound for the prevention or treatment of NMD-related genetic diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an NMD-associated genetic disease in a subject in need thereof by administering an effective amount of an NMD inhibitory compound to the subject.
  • the NMD inhibitory compound of the present invention reduces NMD efficiency, it can be effectively used for the prevention or treatment of various diseases caused by NMD caused by PTC, in particular, genetic diseases.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a cell line that always expresses an NMD target mRNA (constitutive expression) for high-throughput screening (HTS) of an NMD inhibitor.
  • Figure 2 shows the results of treating the cell line of Figure 1, which is a non-specific NMD inhibitor, caffeine.
  • FIG. 3 shows the results of treating the cell line of FIG. 1 with wortmannin, a non-specific NMD inhibitor.
  • FIG. 4 shows the results of confirming the luciferase (renilla luciferase; RLuc) expression efficiency at the mRNA and protein levels after treatment of compounds 1 to 3 in the cell line of FIG. 1 .
  • luciferase renilla luciferase
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a method for artificially reducing the amount of reporter mRNA by artificially tethering the proteins (Upf1, Upf2, Upf3X) acting in each step of NMD to the 3' UTR of the reporter mRNA. This method allows one to determine the exact step of a particular compound on NMD.
  • FIG. 8 shows the results of checking the level of ⁇ -6bs mRNA, which is a reporter mRNA, after each cell line was treated with Compound 1 or 3 using the method of FIG. 7 .
  • FIG. 9 shows the results of confirming the level of ⁇ -6bs mRNA, which is a reporter mRNA, after each cell line was treated with Compound 1 or 2 using the method of FIG. 7 .
  • Figure 10 shows the results of confirming the mRNA level of the NMD target gene dystrophin gene after each treatment of compounds 1 to 3 in cells derived from a patient with Duchenne muscular dystrophy.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating nonsense-mediated mRNA degradation (NMD)-related diseases, comprising a compound represented by any one of the following Chemical Formulas 1 to 3 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient; the use of the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the prophylaxis or treatment of an NMD-related disease; Or, it provides a method for preventing or treating NMD-related diseases, comprising administering the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • NMD nonsense-mediated mRNA degradation
  • the NMD-related disease may be related to a mutant gene comprising a nonsense mutation, or may be a genetic disease caused by NMD due to an immature stop codon (PTC) associated with a nonsense mutation or a frameshift mutation.
  • PTC immature stop codon
  • the NMD-related genetic disease is cystic fibrosis, muscular dystrophy (eg, Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy), Ullrich's disease, congenital muscular dystrophy, or large muscle dystrophy, etc.), autosomal dominant polycystic kidney disease (ADOKD), ataxia telangiectasia, beta-thalassemia, factor VII deficiency (factor VII) deficiency), familial atrial fibrillation, hemophilia B, hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency (CPT1A), heritable pulmonary arterial hypertension (HPAH), late infantile neurogenic ceroid lipofu Late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (LNCL), leukocyte adhesion deficiency 1 (LAD1), methylmalonic academia (MMA), Hurler syndrome, nephropatic cystinosis, Obesity, peroxisome biogenesis disorder (PBD), renal tubular
  • the NMD-related diseases of the present invention include, in addition to the above-mentioned NMD-related genetic diseases, various cancers caused by the presence of an immature stop codon (eg, hereditary diffuse gastric cancer (HDGC), P53 gene mutations). cancer associated with APC gene mutation).
  • an immature stop codon eg, hereditary diffuse gastric cancer (HDGC), P53 gene mutations.
  • HDGC hereditary diffuse gastric cancer
  • P53 gene mutations cancer associated with APC gene mutation.
  • the present invention provides a compound for inhibiting NMD, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound for inhibiting NMD of the present invention is represented by the following formula (1).
  • the compound of Formula 1 is also referred to simply as “Compound 1”.
  • the compound of Formula 1 is named by the code number of GSK2126458 or the generic name of Omipalisib, and its compound name is 2,4-Difluoro-N- ⁇ 2- (methyloxy)-5-[4-(4-pyridazinyl) )-6-quinolinyl]-3-pyridinyl ⁇ benzenesulfonamide.
  • the compound of Formula 1 is known to exhibit anticancer effects by binding to PI3K in the PI3K/mTOR signaling pathway and inhibiting PI3K (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Omipalisib).
  • the preparation of compound 1 and its use are disclosed in WO 2008/144463, in particular Example 345, and the like.
  • the compound for inhibiting NMD of the present invention is represented by the following formula (2).
  • the compound of formula (2) is also referred to simply as "compound 2”.
  • the compound of Formula 2 is named as the code number of BEZ235 or the generic name of Dactolisib, and its compound name is 2-Methyl-2- ⁇ 4-[3-methyl-2-oxo-8-(quinolin-3) -yl)-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]phenyl ⁇ propanenitrile.
  • the compound for inhibiting NMD of the present invention is represented by the following formula (3).
  • the compound of formula (3) is also referred to simply as "compound 3".
  • the compound of Formula 3 is named with the code number of CP-466722, and its compound name is 1-(6,7-Dimethoxy-4-quinazolinyl)-3-(2-pyridinyl)-1H-1,2,4-Triazol- 5-amine.
  • each of the compounds of Formulas 1 to 3 may be collectively referred to as “compounds of the present invention”.
  • the compounds of the present invention may exist in the form of pharmaceutically acceptable salts.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” or “salt” is used herein to refer to an acid or base addition salt suitable or compatible with the treatment of a patient.
  • exemplary inorganic acids that form suitable salts include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid, as well as metal salts such as sodium monohydrogen orthophosphate and potassium hydrogen sulfate.
  • Exemplary organic acids that form suitable salts include mono-, di- and tricarboxylic acids such as glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, maleic acid acids, benzoic acid, phenylacetic acid, cinnamic acid and salicylic acid, as well as sulfonic acids such as p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid.
  • Monoacid or diacid salts may be formed, and such salts may exist in hydrated, solvated or substantially anhydrous form.
  • acid addition salts of compounds of the present invention are more soluble in water and various hydrophilic organic solvents and generally exhibit higher melting points compared to their free base form.
  • the selection of an appropriate salt is known to the person skilled in the art.
  • Other non-pharmaceutically acceptable salts, such as oxalates, can be used in the isolation of compounds of the invention, for example, for laboratory use or for subsequent conversion to pharmaceutically acceptable acid addition salts.
  • Exemplary inorganic bases that form suitable salts include lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, or barium hydroxide.
  • Exemplary organic bases that form suitable salts include aliphatic, cycloaliphatic or aromatic organic amines such as methylamine, trimethylamine and picoline or ammonia.
  • contemplated salts of the present invention include alkyl, dialkyl, trialkyl or tetra-alkyl ammonium salts.
  • contemplated salts of the present invention include L-arginine, benentamine, benzathine, betaine, calcium hydroxide, choline, theanol, diethanolamine, diethylamine, 2-(diethylamino)ethanol; Ethanolamine, ethylenediamine, N-methylglucamine, hydrabamine, 1H-imidazole, lithium, L-lysine, magnesium, 4-(2-hydroxyethyl)morpholine, piperazine, potassium, 1-(2- hydroxyethyl)pyrrolidine, sodium, triethanolamine, tromethamine, and zinc salts.
  • the compound of Formula 2 may exist in the form of tosylate.
  • the compounds of the present invention also include, without limitation, all possible optical isomers as well as pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • Stereoisomers of the compounds of the present invention can be prepared using methods known in the art.
  • the compounds of the present invention may be prepared in crystalline or amorphous form.
  • the compound When the compound is prepared in crystalline form, it may optionally be hydrated or solvated.
  • the compounds of the present invention may be formulated as any therapeutic pharmaceutical composition, or in a form suitable for use in any of the methods disclosed herein, such as prophylactic or therapeutic methods.
  • a compound of the present invention as an active ingredient of a therapeutic agent includes any pharmaceutically acceptable salts thereof, all of which are to be considered to be included within the scope of the present invention. For convenience of explanation, it may be simply abbreviated as a compound of the above formula or a compound of the present invention.
  • compounds of the present invention may inhibit nonsense-mediated mRNA degradation (NMD). Accordingly, compounds 1 to 3 of the present invention exhibit an effect of preventing or treating NMD-related diseases.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of NMD-related diseases, comprising as an active ingredient a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be included in an effective amount.
  • the present invention relates to the use of a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the prevention or treatment of a disease associated with NMD.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a disease associated with NMD, comprising administering to a subject in need thereof a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered in a therapeutically effective amount.
  • the terms “effective amount” or “therapeutically effective amount” are used interchangeably herein and refer to an amount of a compound, formulation, substance or composition effective to achieve a particular biological result as described herein.
  • therapeutically effective amount refers to a biological or medical response of a subject, for example, alleviating symptoms, alleviating a condition, slowing or delaying the progression of a disease, preventing a disease, etc. The amount of the compound of the present invention is indicated.
  • the term “subject” or “patient” includes humans and non-human animals.
  • Non-human animals include vertebrates, such as mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, cats, horses, cattle, chickens, dogs, mice, rats, goats, rabbits, and pigs.
  • the subject is a human.
  • the terms "patient” or “subject” are used interchangeably herein.
  • the term “treat”, “treating” or “treatment” of any disease, condition or disorder refers to alleviating or ameliorating the disease, condition or disorder (ie, the condition or clinical symptoms thereof). delaying or arresting the occurrence of at least one of the following); or ameliorating or ameliorating at least one physical parameter or biomarker associated with a disease, condition or disorder, including those not recognized by the patient.
  • the term “prevent”, “preventing” or “prevention” of any disease, condition or disorder includes prophylactic treatment of the disease, condition or disorder; or delaying the onset or progression of a condition or disorder.
  • the NMD-associated disease may be a disease responsive to NMD inhibition.
  • the NMD-associated disease may be associated with a mutant gene comprising a nonsense mutation, for example, a genetic disease caused by a nonsense mutation.
  • the NMD-associated disease may be a genetic disease caused by NMD due to an immature stop codon (PTC) associated with a nonsense mutation or a frameshift mutation.
  • PTC immature stop codon
  • the NMD-related disease of the present invention may be selected based on the nucleotide sequence of a gene having PTC.
  • NMD nonsense-mediated RNA degradation
  • PTC immature stop codon
  • NMD monitoring mechanisms reduce or prevent the formation of these defective proteins and peptides.
  • About one-third of all genetic diseases and some forms of cancer are known to be caused by nonsense or frameshift mutations that introduce PTC, and NMD may modulate the clinical phenotype of these diseases. Accordingly, modulation of NMD (ie, inhibition or increase of NMD) may offer potential therapeutic benefits.
  • premature translation termination refers to the result of a mutation that changes a codon corresponding to an amino acid to a stop codon
  • premature termination codon PTC
  • premature stop codon refers to a change in a codon corresponding to an amino acid to a stop codon
  • nonsense mutation is a point mutation that changes a codon corresponding to an amino acid to a stop codon.
  • frameshift mutation refers to a genetic mutation caused by a deletion or insertion of a DNA sequence that shifts in the direction in which the sequence is read.
  • NMD inhibition refers to reduced activity of NMD and reduced degradation of defective mRNA in a cell by any measurable amount as compared to a cell without NMD inhibition.
  • NMD inhibition blocks the function of a protein component of the NMD pathway, inhibits translation, or allows the translation machine to bypass the immature stop codon ("translational bypass therapy (TBT)" or "read-through”). -through)”), etc. (see, for example, Bashyam, Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2009, 3, 7-15).
  • the compound of the present invention may act on any of the proteins (UPF1, UPF2, UPF3X, eIF4AIII, PNRC2, etc.) acting on each step of NMD or on any step in which they are involved.
  • the compounds of the present invention can inhibit the efficiency of NMD by targeting UPF1, which is an important factor in NMD.
  • the compound of the present invention exhibits an NMD inhibitory effect by inhibiting the binding of UPF1 and UPF2, which are major proteins of NMD.
  • the compound of the present invention exhibits an NMD inhibitory effect by inhibiting UPF1 phosphorylation, a major step in NMD.
  • compound 3 exhibits an NMD inhibitory effect by targeting a step prior to UPF1.
  • NMD-associated disease refers to a disease responsive to NMD inhibition, in which the disease phenotype is reduced by NMD inhibition. Patients with this disease phenotype can be diagnosed by determining whether they possess mutations such as, for example, nonsense mutations or frameshift mutations that generate PTC by conventional methods. Alternatively, the patient can be selected by measuring the PTC-bearing gene level.
  • a patient or subject to which a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is applied may be a patient or subject carrying a nonsense mutation that produces PTC.
  • the NMD-associated disease of the present invention may be a disease caused by NMD due to a mutation such as a nonsense mutation or a frameshift mutation that produces PTC. Examples of several genetic diseases caused by nonsense mutations are shown in Table 1.
  • 3' PTC causes mild muscular dystrophy (BMD) CFTR (Cystic fibrosis transmembrane donductance regulator gene) Differently located PTCs can cause a mild to severe phenotype, but most commonly 5' PTC: severe cystic fibrosis 3' PTC: Mild cystic fibrosis.
  • BMD muscular dystrophy
  • CFTR Cystic fibrosis transmembrane donductance regulator gene
  • the NMD-associated genetic disorder caused by the presence of the PTC is cystic fibrosis, muscular dystrophy, autosomal dominant polycystic kidney disease (ADOKD), telangiectasia Ataxia telangiectasia, beta-thalassemia, factor VII deficiency, familial atrial fibrillation, hemophilia B, hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency (CPT1A) ), heritable pulmonary arterial hypertension (HPAH), late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (LNCL), leukocyte adhesion deficiency 1 (LAD1), methylmalonic acidosis (methylmalonic academia; MMA), Hurler syndrome, nephropatic cystinosis, obesity, peroxisome biogenesis disorder (PBD), renal tubular acidosis (RTA), retinitis pigmentosa; RP), Rett syndrome (RTT), spinal muscular at
  • any disease known in the art to carry a PTC-generating mutant gene is included in the scope of the NMD-related disease of the present invention.
  • all diseases known in the art to have an amelioration or therapeutic effect on diseases through an NMD inhibition mechanism are also included in the scope of the NMD-related diseases of the present invention.
  • the NMD-related disease that can be prevented or treated by the compound of the present invention may be muscular dystrophy, specifically, Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, Ulrich's disease. (Ullrich's disease), congenital muscular dystrophy, or zone-type muscular dystrophy.
  • the NMD-associated disease caused by the presence of the PTC may be cancer, in particular hereditary diffuse gastric cancer (HDGC), a cancer associated with a P53 gene mutation (eg, Li -Fraumeni syndrome, human breast cancer) or cancer associated with mutations in the APC gene (eg, colorectal cancer and familial adenomatous polyposis).
  • HDGC hereditary diffuse gastric cancer
  • a cancer associated with a P53 gene mutation eg, Li -Fraumeni syndrome, human breast cancer
  • cancer associated with mutations in the APC gene eg, colorectal cancer and familial adenomatous polyposis.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • Beta-thalassemia is a blood disease that reduces hemoglobin production.
  • stop codon mutations result in premature translation termination and destabilization of mRNA through nonsense mediated degradation.
  • Salvatori et al. Am. J. Hematol., 84 (11): 720-8 (2009)], etc., it has been suggested that beta-thalassemia can be prevented or treated through NMD inhibition.
  • composition refers to a mixture of a compound of the invention with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition facilitates administration of the compound to a patient or subject.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be appropriately selected by a person skilled in the art as an inactive ingredient, that is, a pharmaceutically acceptable excipient, with reference to the Handbook of Pharmaceutical Excipients and the like.
  • Suitable routes of administration include, but are not limited to oral administration, parenteral administration, eg, intramuscular, intravenous, or subcutaneous administration and the like.
  • mRNA is extracted from cells and the amount of mRNA is checked through RT-PCR, but this method has limitations in performing high-throughput screening (HTS). development is needed
  • Beta-thalassemia (beta-thalassemia) is an NMD-related genetic disease
  • beta-globin (beta-globin) is known to be related to the gene. That is, the beta-globin (beta-globin) gene of a person with thalassemia (beta-thalassemia), compared with a normal person, the PTC (premature termination codon) gene is expressed.
  • a gene including a chemiluminescence gene, Renilla luciferase (RLuc), at the back of a beta-globin normal gene or PTC (premature termination codon) found in genetic diseases was inserted.
  • the mRNA in the form of a normal gene inserted is not a target of NMD, whereas when a gene having PTC is inserted, it becomes a target of NMD.
  • a HeLa cell line that always expresses the NMD target mRNA was prepared.
  • this cell line was designed to always express the firefly luciferase (FLuc) gene, which is not a target of NMD.
  • FLuc firefly luciferase
  • each of the prepared cell lines was treated with caffeine, known as a non-specific NMD inhibitor, to confirm the degree of RLuc activity with respect to FLuc activity.
  • caffeine known as a non-specific NMD inhibitor
  • total proteins were isolated from the cells.
  • the expression levels of RLuc and FLuc proteins were measured through dual luciferase assay.
  • FIG. 2 it was confirmed that the expression level of RLuc in the caffeine-treated group increased by about 1,300 times to about 2000 times, compared to the caffeine-untreated group.
  • HeLa cell line is suitable for performing high-throughput screening (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • Experiments were performed by optimizing conditions such as the number of cells, the amount of reagents and buffers used in a 384-well format to be suitable for HTS (Fig. 3), and NMD efficiency was measured using wortmannin, a non-specific NMD inhibitor, as a control material.
  • Wortmannin is known to inhibit NMD by inhibiting SMG1-mediated UPF1 phosphorylation, a critical step in the NMD pathway (A Yamashita et al., 2001 Sep 1;15(17):2215-28). As a result, as shown in FIG.
  • the wortmannin-treated group increased the expression level of RLuc by about 10-40 times (w/FF luc calibration in FIG. 3 is the RLuc value corrected for the FLuc activity value) .
  • the HeLa cell line thus prepared was verified to be suitable for performing HTS as well as reflecting the efficiency of NMD well.
  • RNA and protein were purified from the cells. Then, the amounts of RNA and protein were quantified through real-time PCR and dual luciferase assay. The results are shown in FIG. 4 .
  • Compound 1 increased protein translation of RLuc, while compounds 2 and 3 significantly increased the amount of mRNA. From this, it was found that all three compounds exhibit an effect of inhibiting NMD, but compound 1 and compounds 2 and 3 inhibited at different stages.
  • NMD is a phenomenon made through several steps of protein binding, and is particularly affected by the binding between UPF1 and UPF2 and phosphorylation of UPF1 among them (refer to Korean Patent No. 1021402, etc.).
  • each compound of the present invention was specifically intended to confirm which stage of NMD acts.
  • UPF1 Phosphorylation of UPF1 is known to be one of the most important factors in NMD.
  • the effect of three types of compounds of the present invention on phosphorylation of UPF1 was investigated. Cells were treated with each compound at 5 ⁇ M for 12 hours, and then the total protein was purified. Thereafter, western blotting was performed using each antibody capable of recognizing Upf1 or Upf1 phosphorylated at a specific position.
  • NMD is a phenomenon that occurs through several steps of protein binding, and the binding between UPF1 and UPF2 is known to be the most important step.
  • the effect of the three compounds of the present invention on the binding between UPF1 and UPF2 was investigated.
  • DNA expressing FLAG-UPF1 was transiently overexpressed in the cell line.
  • Each compound was treated in this cell line at 5 ⁇ M for 1 hour to obtain a cell extract. Immunoprecipitation was performed on the cell extract obtained using the FLAG antibody.
  • Proteins before and after immunoprecipitation were analyzed by western blotting.
  • a plasmid expressing reporter mRNA and MS2 binding proteins capable of binding to the 3' UTR of the reporter mRNA were artificially expressed.
  • MS2 binding proteins MS2-Upf1, MS2-Upf2, MS2-Upf3
  • compounds 1 to 3 are substances that inhibit NMD in common, although there are slight differences in the level of NMD that each compound acts. Accordingly, it was confirmed that all of compounds 1 to 3 can be effectively used for the treatment of genetic diseases caused by NMD.
  • DMD is a typical NMD-related genetic disease that occurs because PTC is generated in the dystrophin gene and is quickly eliminated by NMD.
  • the amount of dystrophin mRNA was quantified through real-time PCR.
  • DMD/GAPDH mRNA dystrophin mRNA

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Abstract

본 발명은 넌센스-매개 mRNA 분해(nonsense-mediated mRNA decay, 이하 "NMD"라 함)를 억제하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 본 발명은 NMD를 억제하는 화합물을 통해 NMD 관련 질병을 예방 또는 치료하고자 한다.

Description

넌센스-매개 MRNA 분해를 억제하기 위한 화합물
본 발명은 넌센스-매개 mRNA 분해(nonsense-mediated mRNA decay, 이하 "NMD"라 함)를 억제하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 본 발명은 NMD를 억제하는 화합물을 통해 NMD 관련 질병을 치료 또는 예방하고자 한다.
인간의 모든 유전자는 적당한 시간과 위치 그리고 적당한 양을 발현함으로써 최종적인 고유의 기능을 수행하게 되며, 만약 유전자의 적당한 발현 조절 과정에서 문제가 생겼을 경우, 비정상적으로 발현된 유전자는 정상적인 세포의 기능을 방해하고 그 결과 수 많은 암 및 유전병을 일으키게 된다.
지금까지 알려진 유전병의 약 30%가 비정상적인 과정에 의해 생성된 잘못된 mRNA, 즉 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)에 기인하는 것으로 알려져 있다. 넌센스 돌연변이 생성의 주요인은, DNA 재조합 및 복제 과정에서의 실수와 같은 DNA 염기서열 상에서 생성되는 돌연변이뿐만 아니라, 잘못된 전사과정 (aberrant transcription), 비효율적인 스플라이싱(splicing), 프레임시프트 돌연변이 (frameshift mutation) 등 비정상 또는 비효율적인 세포 내 기전에 기인한다.
넌센스 돌연변이를 갖는 mRNA는 정상길이보다 짧은 단백질을 발현하고 이로 인해 세포의 정상 기능을 저해할 수 있다. 그러나 운 좋게도 대부분의 잘못된 mRNA는 세포 내에 존재하는 품질검사 기전인 NMD 기전에 의해 인식되고, 정상 mRNA 보다 훨씬 빠른 속도로 세포 내에서 제거된다. 즉, 세포는 NMD 기전을 이용하여 자신에게 해를 줄 수 있는 잘못된 mRNA를 선택적으로 인식/제거할 수 있다.
다양한 이유로 잘못 생성된 mRNA가 NMD에 의해 없어지지 않으면 세포의 기능을 저해할 수 있는 짧은 단백질이 생성되고, 그 결과 세포의 암화 및 다양한 유전병을 초래한다. 이와는 반대로 조금만 잘못되더라도 NMD에 의해 빨리 제거되기 때문에 세포의 정상적인 기능을 저해할 수 있으며, 이 역시 다양한 유전병의 발병과 직접적으로 관련이 있다 (한국특허등록공보 제10-1021402호).
현재 NMD 관련 질환의 치료를 위해 많은 치료법이 개발되고 있다. 예를 들어, 듀센형 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy, 이하 DMD)과 같은 유전 질환의 돌연변이-특이적 치료를 위해 1,2,4-oxidiazole 화합물인 PTC 124(일반명: ataluren) 등의 약물 개발이 진행 중이다.
NMD를 억제하여 NMD 관련 유전 질환을 효과적으로 치료하기 위한 효과적인 치료제의 개발은 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 NMD를 효과적으로 억제하는 화합물(이하, "NMD 억제 화합물"로도 지칭함)을 제공함으로써, 이를 유효성분으로 포함하는 NMD 관련 유전 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 NMD 관련 유전 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 NMD 억제 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 NMD 억제 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 NMD 관련 유전 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 NMD 억제 화합물은 NMD 효율을 저하시키므로, PTC로 인한 NMD에 의해서 유발되는 다양한 질병, 특히 유전 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 NMD 저해제의 대용량 탐색(high-throughput screening, HTS)을 위해 NMD 표적 mRNA를 항상 발현(constitutive expression)하는 세포주를 도시화한 모식도이다.
도 2는 도 1의 세포주에 비특이적 NMD 저해제인 카페인을 처리한 결과를 나타낸다.
도 3은 도 1의 세포주에 비특이적 NMD 억제제인 Wortmannin를 처리한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 1의 세포주에 화합물 1 내지 3을 처리한 후 루시퍼라제(renilla luciferase; RLuc) 발현 효율을 mRNA 및 단백질 수준에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 화합물 1 내지 3의 처리가 UPF1(upstream frameshift 1)의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 화합물 1 내지 3의 처리가 UPF1과 UPF2의 결합에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 NMD의 각 단계에 작용하는 단백질 (Upf1, Upf2, Upf3X)을 리포터 mRNA의 3' UTR에 인위적으로 연결시킴으로써(tethering), 리포터 mRNA 양을 인위적으로 줄이는 방법에 대한 모식도이다. 이 방법을 통해 특정 화합물이 NMD에 미치는 정확한 단계를 결정할 수 있다.
도 8은 도 7의 방법을 이용하여 세포주에 화합물 1 또는 3을 각각 처리한 후, 리포터 mRNA인 β-6bs mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 도 7의 방법을 이용하여 세포주에 화합물 1 또는 2를 각각 처리한 후, 리포터 mRNA인 β-6bs mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 듀센형 근이영양증 환자 유래의 세포에 화합물 1 내지 3을 각각 처리한 후 NMD 표적 유전자인 디스트로핀 유전자의 mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 듀센형 근이영양증 환자 유래의 세포에 화합물 1을 처리한 후 디스트로핀 단백질의 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD) 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물; 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 NMD 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 용도; 또는 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NMD 관련 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2022002228-appb-img-000001
<화학식 2>
Figure PCTKR2022002228-appb-img-000002
<화학식 3>
Figure PCTKR2022002228-appb-img-000003
상기 NMD 관련 질병은 넌센스 돌연변이를 포함하는 돌연변이 유전자와 관련된 것일 수 있으며, 또는 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 연관된 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 NMD에 의해 유발되는 유전 질병일 수 있다.
상기 NMD 관련 유전 질병은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근이영양증(예컨대, 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 백커형 근위측증(Becker muscular dystrophy), 울리히병(Ullrich's disease), 선천성 근위축증 근이영양증, 또는 지대형 근육 근이영양증 등), 상염색체 우성 다낭성 신장질환(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADOKD), 모세혈관확장성운동실조증(ataxia telangiectasia), 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia), 인자 VII 결핍증(factor VII deficiency), 가족성 심방 세동, 혈우병 B, 간의 카르니틴 팔미토일 전달 효소 1A 결핍증(hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency; CPT1A), 유전성 폐 동맥 고혈압(heritable pulmonary arterial hypertension; HPAH), 후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; LNCL), 백혈구 부착 결핍1(leukocyte adhesion deficiency 1; LAD1), 메틸말론산증(methylmalonic academia; MMA), 헐러 증후군(Hurler syndrome), 신세포성 시스틴증(nephropatic cystinosis), 비만, 퍼옥시좀 형성 장애(peroxisome biogenesis disorder; PBD), 신세뇨관 산증 (RTA), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa; RP), 레트 증후군(Rett syndrome; RTT), 척수 근위축증(spinal muscular atrophy; SMA), 스티뷰-와이드만 증후군(Stuve-Wiedemann syndrome; SMS), X-연관 신성요붕증(X-linked nephrogenic diabetes insipidus; XNDI) 또는 어셔 증후군(Usher syndrome; USH1)일 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 NMD 관련 질병은, 위 언급된 NMD 관련 유전 질병 이외에, 미성숙 종결 코돈의 존재에 의해 발병되는 다양한 암(예컨대, 유전적 확산성 위암(hereditary diffuse gastric cancer; HDGC), P53 유전자 돌연변이와 관련된 암, 또는 APC 유전자 돌연변이와 관련된 암)일 수 있다.
본 발명은 NMD를 억제하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
일 실시태양에서, 본 발명의 NMD를 억제하기 위한 상기 화합물은 하기 화학식 1로 표시된다. 본원에서 하기 화학식 1의 화합물은 간단히 "화합물 1"로도 지칭된다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2022002228-appb-img-000004
화학식 1의 화합물은 GSK2126458의 코드 번호 또는 오미팔리십(Omipalisib)의 일반명으로 명명되며, 이의 화합물명은 2,4-Difluoro-N-{2- (methyloxy)-5-[4-(4-pyridazinyl)-6-quinolinyl]-3-pyridinyl}benzenesulfonamide이다. 화학식 1의 화합물은 PI3K/mTOR 신호전달 경로에서 PI3K에 결합하여 PI3K를 억제함으로써 항암 효과를 나타낸다고 알려져 있다 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Omipalisib). 화합물 1의 제조 및 그의 용도 등에 대해서는 WO 2008/144463, 특히 실시예 345 등에 개시되어 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 NMD를 억제하기 위한 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시된다. 본원에서 하기 화학식 2의 화합물은 간단히 "화합물 2"로도 지칭된다.
<화학식 2>
Figure PCTKR2022002228-appb-img-000005
화학식 2의 화합물은 BEZ235의 코드 번호 또는 닥토리십(Dactolisib)의 일반명으로 명명되며, 이의 화합물명은 2-Methyl-2-{4-[3-methyl-2-oxo-8-(quinolin-3-yl)-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]phenyl}propanenitrile 이다.
화학식 2의 화합물은 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로에서 PI3K kinase 및 mTOR kinase에 결합하여 종양세포 사멸과 PI3K/mTOR 과발현 종양 세포 성장 억제 활성을 나타낸다고 알려져 있다 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11977753). 화학식 2의 제조 및 그의 용도 등에 대해서는 WO 2006/122806, 특히 실시예 7 등에 개시되어 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 NMD를 억제하기 위한 상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시된다. 본원에서 하기 화학식 3의 화합물은 간단히 "화합물 3"으로도 지칭된다.
<화학식 3>
Figure PCTKR2022002228-appb-img-000006
화학식 3의 화합물은 CP-466722의 코드 번호로 명명되며, 이의 화합물명은 1-(6,7-Dimethoxy-4-quinazolinyl)-3-(2-pyridinyl)-1H-1,2,4-Triazol-5-amine이다.
본원에서 화학식 1 내지 3의 화합물 각각을 총칭하여 "본 발명의 화합물"로 기재하기도 한다.
본 발명의 화합물은 제약상 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다.
"제약상 허용되는 염" 또는 "염"은 본원에서 환자의 치료에 적합한 또는 상용성이 있는 산부가염 또는 염기부가염을 지칭하는데 사용된다. 적합한 염을 형성하는 예시적 무기산으로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산뿐만 아니라 금속 염, 예컨대 오르토인산 일수소 나트륨 및 황산수소칼륨을 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 유기산으로는 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 예컨대 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 벤조산, 페닐아세트산, 신남산 및 살리실산뿐만 아니라 술폰산, 예컨대 p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산을 들 수 있다. 일산 또는 이산 염이 형성될 수 있으며, 이러한 염은 수화, 용매화 또는 실질적으로 무수 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 산부가염은 이의 유리 염기 형태와 비교하여 물 및 다양한 친수성 유기 용매에 더욱 가용성이고, 일반적으로 더 높은 융점을 나타낸다. 적절한 염의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 다른 비-제약상 허용되는 염, 예를 들어 옥살레이트는 예를 들어, 실험실용으로 또는 제약상 허용되는 산부가염으로의 후속 전환용으로 본 발명의 화합물의 단리에서 사용될 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 무기 염기로는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 또는 바륨 히드록시드를 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 유기 염기로는 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민, 예컨대 메틸아민, 트리메틸아민 및 피콜린 또는 암모니아를 들 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 본 발명의 고려되는 염으로는 알킬, 디알킬, 트리알킬 또는 테트라-알킬 암모늄 염을 들 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 고려되는 염으로는 L-아르기닌, 베넨타민, 벤자틴, 베타인, 수산화칼슘, 콜린, 데아놀, 디에탄올아민, 디에틸아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 히드라바민, 1H-이미다졸, 리튬, L-리신, 마그네슘, 4-(2-히드록시에틸)모르폴린, 피페라진, 칼륨, 1-(2-히드록시에틸)피롤리딘, 나트륨, 트리에탄올아민, 트로메타민, 및 아연 염을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
적절한 염의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 화학식 2의 화합물은 토실산염(tosylate)의 형태로 존재할 수 있다.
또한 본 발명의 화합물은 이의 제약상 허용되는 염뿐만 아니라 모든 가능한 광학 이성질체를 제한 없이 포함한다. 본 발명의 화합물의 입체이성질체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 결정질 형태 또는 비결정질 형태로 제조될 수 있다. 화합물이 결정질 형태로 제조되면, 임의로 수화 또는 용매화 될 수 있다.
본 발명의 화합물은 임의의 치료용 약학 조성물로서 제제화하거나, 또는 본원에 개시된 임의의 방법, 예컨대 예방 또는 치료 방법에서 사용하기에 적합한 형태로 제제화될 수 있다.
본원에서 달리 언급되지 않는 한, 치료제의 유효 성분으로서 본 발명의 화합물은 이의 임의의 제약상 허용되는 염을 포함하고, 이들 모두가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 설명의 편의상, 이는 상기 화학식의 화합물 또는 본 발명의 화합물이라고 간단히 약칭될 수 있다.
본 발명의 화합물; 또는 이의 제약상 허용되는 염은 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD)를 억제할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 화합물 1 내지 3은 NMD 관련 질병을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낸다.
일 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는, NMD 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염은 유효량으로 포함될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 NMD 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NMD 관련 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염은 치료적 유효량으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 본원에 기술된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 유효한 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"이란 용어는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들어 증상을 완화하거나, 병태를 경감시키거나, 질환의 진행을 늦추거나 지연시키거나, 질환을 예방하는 등의 본 발명의 화합물의 양을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물에는 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 고양이, 말, 소, 닭, 개, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 및 돼지가 포함된다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 질병, 병태 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병, 병태 또는 장애를 완화 또는 개선하는 것(즉, 병태 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나의 발생을 지연 또는 저지하는 것); 또는 환자가 인식할 수 없는 것을 포함하여, 질병, 병태 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 신체적 파라미터 또는 바이오마커를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 질병, 병태 또는 장애를 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"이라는 용어는 질병, 병태 또는 장애의 예방적 처치; 또는 병태 또는 장애의 발병 또는 진행을 지연시키는 것을 지칭한다.
구체적 일 실시태양에서, 상기 NMD 관련 질병은 NMD 억제에 반응성인 질병일 수 있다.
또 다른 구체적 실시태양에서, 상기 NMD 관련 질병은 넌센스 돌연변이를 포함하는 돌연변이 유전자와 관련된 것일 수 있으며, 예를 들어, 넌센스 돌연변이에 의해 발병되는 유전 질병일 수 있다.
또 다른 구체적 실시태양에서, 상기 NMD 관련 질병은 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 연관된 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 NMD에 의해 유발되는 유전 질병일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 NMD 관련 질병은 PTC를 보유하는 유전자의 염기서열을 기초로 선별된 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "넌센스-매개 RNA 분해(NMD)"는 미성숙 번역 종결 코돈을 포함하는 mRNA의 분해를 매개하는 메커니즘을 지칭한다. 구체적으로, NMD는 돌연변이, 번역 상 에러(transcriptional error), 및 비정상적 스플라이싱(aberrant splicing)에 의해 mRNA에 도입되곤 하는 미성숙 종결 코돈(PTC)을 포함하는 transcript를 특이적으로 인식하여 분해하는 세포 메커니즘이다. 번역시, 해당 mRNA는 짧은 형태의 암호화된 단백질을 생산하게 된다. NMD 감시 메커니즘은 이러한 결함 단백질 및 펩타이드의 형성을 감소시키거나 예방한다. 모든 유전 질환의 약 1/3과 몇몇 형태의 암은 PTC를 도입하는 넌센스 또는 프레임시프트 돌연변이에 의해 야기되는 것으로 알려져 있으며, NMD는 이러한 질병의 임상적 표현형을 조절할 수 있다. 이에 따라 NMD의 조절 (즉, NMD의 억제 또는 증가)는 잠재적인 치료적 이점을 제공할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "미성숙 번역 종결(premature translation termination)"은 아미노산에 해당하는 코돈을 정지 코돈으로 변화시키는 돌연변이의 결과를 의미하고, 용어 "미성숙 종결 코돈(premature termination codon; PTC)" 또는 "미성숙 정지 코돈(premature stop codon)"은 아미노산에 해당하는 코돈이 정지 코돈으로 변화된 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "넌센스 돌연변이(nonsense mutation)"는 아미노산에 해당하는 코돈을 정지 코돈으로 변경하는 점 돌연변이이다.
본원에 사용된 용어 "프레임시프트 돌연변이(frameshift mutation)"는 서열이 판독되는 방향으로 이동하는 DNA 서열의 결실 또는 삽입에 의해 야기되는 유전적 돌연변이를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "NMD 억제"는, NMD 억제가 없는 세포와 비교하여, 임의의 측정 가능한 양만큼 세포에서 NMD의 활성 감소 및 결함있는 mRNA의 분해가 감소됨을 지칭한다. NMD 억제는 NMD 경로의 단백질 성분의 기능을 차단하거나, 번역을 억제하거나, 또는 번역 machine이 미성숙 종결 코돈을 우회하도록 허용("번역 우회 요법(translational bypass therapy; TBT)" 또는 "리드-쓰루(read-through)")하는 등 다양한 방법으로 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Bashyam, Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2009, 3, 7-15] 참조).
일 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 NMD의 각 단계에 작용하는 단백질(UPF1, UPF2, UPF3X, eIF4AIII, PNRC2 등) 중 임의의 단백질 또는 이들이 관여하는 임의의 단계에 작용하는 것일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화합물은 NMD에 중요한 인자인 UPF1을 표적으로 하여 NMD의 효율을 억제할 수 있다.
구체적 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 특히 화합물 1은 NMD의 주요 단백질인 UPF1과 UPF2의 결합을 저해함으로서 NMD 억제 효과를 나타낸다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 특히 화합물 2는 NMD의 주요 단계인 UPF1 인산화를 저해함으로써 NMD 억제 효과를 나타낸다.
또 다른 실시태양에서, 화합물 3은 UPF1 이전 단계를 타겟함으로써 NMD 억제 효과를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "NMD 관련 질병"은 NMD 억제에 반응성인 질병으로서, NMD 억제에 의해 질병 표현형(disease phenotype)이 감소되는 질병을 나타낸다. 이러한 질병 표현형을 가진 환자는 예를 들어, 통상적인 방법으로 PTC를 생성하는 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 같은 돌연변이 보유 여부를 판단함으로써 진단될 수 있다. 다르게는, 상기 환자는 PTC 보유 유전자 수준을 측정함으로써 선별될 수 있다.
이에 따라 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 적용되는 환자 또는 대상체는 PTC를 생성하는 넌센스 돌연변이를 보유하고 있는 환자 또는 대상체일 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 NMD 관련 질병은 PTC를 생성하는 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 같은 돌연변이로 인한 NMD에 의해 유발되는 질병일 수 있다. 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 여러 유전 질환의 예는 표 1에 나타낸 바와 같다.
유전자 명칭 표현형
HBB (β-Globin) 5' PTC: 열성 유전 중증 지중해성 빈혈(β-thalassaemia major); 이형접합 정상
3' PTC: 우성 유전 중간형 지중해성 빈혈 (β-thalassaemia intermedia)
RHO (Rhodopsin) 5' PTC: 열성 유전 실명(blindness); 이형접합은 망막도(retinogram)에 비정상을 가지나, 임상적 질환은 아님
3' PTC: 우성 유전 실명
SOX 10 (SRY-box 10) 5' PTC: 선천성 신경감각 난청 (neurosensory deafness) 및 결장 신경절증 (colonic agangliosis)을 유발하는 반가불충분성 (haploinsufficiency)
3' PTC: 신경감각 난청, 결장 신경절증, 말초 신경병증 (peripheral neuropathy) 및 중추성 수초이상 백질영양증 (central dysmyelinating leukodystrophy)을 포함하는 우성 유전 신경발달 결함
IFNGR1 (Interferon-γ receptor 1) 5' PTC: 우성 유전 마이코박테리아 감염에 대한 감수성; 이형접합 정상
3' PTC: 우성 유전 마이코박테리아 감염에 대한 감수성
CRX (Cone-rod homeobox containing gene) 5' PTC: 현재까지 동형접합 없음; 이형접합 정상
3' PTC: 우성 유전 Leber 선천성 흑내장 (amaurosis)
ROR2 (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2) 5' PTC: 열성 유전 Robinow 증후군 (orodental abnormalities, hypoplastic genitalia, multiple rib/vertebral anomalies); 이형접합 정상
3' PTC: 우성 유전 B형 단지증 (shortening of digits and metacarpals)
CLCN1 (Chloride channel 1, skeletal muscle) 5' PTC: 열성 유전 Becker 병
3' PTC: 우성 유전 Thomsen 병 (muscular disorder characterized by muscle stiffness and an inability of the muscle to relax)
VWF (von willebrand factor) 5' PTC: 열성 유전 3형 von willebrand 병; 이형접합 정상
3' PTC: 우성 유전 2A 3형 von willebrand 병
F10 (Coagulation factor X) 5' PTC: 열성 유전 출혈성 소인 (bleeding tendency); 이형접합 정상
3' PTC: 우성 유전 출혈성 소인
MPN (Myelin protein zero) 5' PTC: 반가불충분성, Charcol-Marie-Tooth 병 (neuropathy with loss of muscle tissue and touch sensation)
3' PTC: 우성 음성 또는 기능 획득 (gain-of-function), 선천성 저수초성 신경병증 (hypomyelinating neuropathy)
ELN (Elastin) 5' PTC: 반가불충분성, 판막상 대동맥 협착증 (supravalvular aortic stenosis), 판막 심장병 (valvular heart disease)
3' PTC: 우성 음성 또는 기능 획득, 선천성 각막염 (congenital cutis laxa), 결합조직 장애
COL1A1 (Collagen type I, α1) 5' PTC: 우성 유전, 1형 골형성부전증 (osteogenesis imperfecta (OI) type I) (경증형)
3' PTC: 2형-4형 OI (중증형)
ATM (Ataxia-telangiectsia mutated gene) 5' PTC: 경증형 운동실조증 (ataxia)
3' PTC: 생존 시간이 짧은 중증형
SMN1 (Survival motor neuron gene) 5' PTC: 3형 척수 근위축증 (spinal muscular atrophy (SMA) type III) (경증형)
3' PTC: 1형 척수 근위축증 (SMA type I) (중증형)
DMD (Dystrophin) 상이한 위치에 있는 PTC는 경증 내지 중증 표현형을 야기할 수 있으나, 가장 흔하게 5' PTC는 중증의 근이영양증 (muscular dystophy (DMD))을 야기함
3' PTC는 경증의 근이영양증 (muscular dystrophy (BMD))을 야기함
CFTR (Cystic fibrosis transmembrane donductance regulator gene) 상이한 위치에 있는 PTC는 경증 내지 중증 표현형을 야기할 수 있으나, 가장 흔하게는 5' PTC: 중증의 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)
3' PTC: 경증의 낭포성 섬유증. NMD가 비효율적인 환자는 넌센스 억제 치료에 더 잘 반응함
PAX6 (Paired box gene 6) 5' PTC: 무홍채증 (aniridia), 홍채의 선천적 결핍
3' PTC: 검출되지 않았으나, 우성 음성 단백질은 심각한 표현형을 보일 것으로 예측됨
EDAR (Ectodysplasin-A receptor gene) 5' PTC: 상염색체 열성 HED (hypohidrotic ectodermal dysplasia)
3' PTC: 상염색체 우성 HED
SCNN1B (Beta subunit of sodium channel) 5' PTC: 상염색체 열성 PHA1 (pseudohypoaldosteronism I)
3' PTC: 우성 Liddle 증후군
보다 구체적 실시태양에서, 상기 PTC의 존재에 의해 발병하는 NMD 관련 유전 질환은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근이영양증, 상염색체 우성 다낭성 신장질환(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADOKD), 모세혈관확장성운동실조증(ataxia telangiectasia), 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia), 인자 VII 결핍증(factor VII deficiency), 가족성 심방 세동, 혈우병 B, 간의 카르니틴 팔미토일 전달 효소 1A 결핍증(hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency; CPT1A), 유전성 폐 동맥 고혈압(heritable pulmonary arterial hypertension; HPAH), 후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; LNCL), 백혈구 부착 결핍1(leukocyte adhesion deficiency 1; LAD1), 메틸말론산증(methylmalonic academia; MMA), 헐러 증후군(Hurler syndrome), 신세포성 시스틴증(nephropatic cystinosis), 비만, 퍼옥시좀 형성 장애(peroxisome biogenesis disorder; PBD), 신세뇨관 산증 (RTA), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa; RP), 레트 증후군(Rett syndrome; RTT), 척수 근위축증(spinal muscular atrophy; SMA), 스티뷰-와이드만 증후군(Stuve-Wiedemann syndrome; SMS), X-연관 신성요붕증(Xlinked nephrogenic diabetes insipidus; XNDI) 또는 어셔 증후군(Usher syndrome; USH1)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, PTC 생성 돌연변이 유전자를 보유하는 것으로 당업계에 알려진 질병이라면 본 발명의 NMD 관련 질병의 범위에 포함된다. 다르게는, NMD 억제 기전을 통해 질병의 개선 또는 치료 효과가 있는 것으로 당업계에 공지된 질병 역시 모두 본 발명의 NMD 관련 질병의 범위에 포함된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 NMD 관련 질병은 근이영양증일 수 있으며, 구체적으로, 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 백커형 근위측증(Becker muscular dystrophy), 울리히병(Ullrich's disease), 선천성 근위축증 근이영양증, 또는 지대형 근육 근이영양증일 수 있다.
또 다른 특정 실시태양에서, 상기 PTC의 존재에 의해 발병하는 NMD 관련 질병은 암일 수 있으며, 특히 유전적 확산성 위암(hereditary diffuse gastric cancer; HDGC), P53 유전자 돌연변이와 관련된 암(예를 들어, Li-Fraumeni 증후군, 인간 유방암) 또는 APC 유전자의 돌연변이와 관련된 암(예를 들어, 대장암 및 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis))일 수 있다.
듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)은 디스트로핀(dystrophin) 유전자에 PTC가 생성되어 NMD에 의해 빨리 제거됨으로 인해 발병되는 희귀난치성 근육병이다. DMD 돌연변이의 98% 이상이 11kb 길이에 걸쳐 다양한 지점에서 디스트로핀 개방 판독 프레임의 조기 종결을 야기시킨다.
베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia)은 헤모글로빈 생성을 감소시키는 혈액 질환이다. β O39-지중해성 빈혈에서, 정지 코돈 돌연변이는 미성숙 번역 종료를 초래하고 넌센스 매개 분해를 통해 mRNA의 불안정화를 야기시킨다. 문헌[Salvatori et al., Am. J. Hematol., 84 (11) : 720-8 (2009)] 등에서의 연구 등으로부터, NMD 억제를 통해 베타-지중해성 빈혈을 예방 또는 치료할 수 있음이 시사되었다.
그 외 위 언급된 질병들은 모두 NMD 억제를 통해 예방 또는 치료될 수 있음이 당업계에 공지되어 있거나 시사되어 있다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)에 관한 문헌 [Welch et al., Nature 447, 87-91 (2007)], Ulrich's disease에 대해서는 문헌 [Usuki et al., Molecular Therapy 14: 351-360 (2006)], 　HDGC에 대해서는 문헌 [Karam et al., Oncogene 27:4255-4260 (2008))] 등을 참조할 수 있다. 그 외 NMD 관련 유전질환 및 암에 대해서도 많은 문헌에서 이미 보고되어 있는 상황이다(예를 들어, 문헌 [Miller & Pearce, Mutat Res Rev Mutat Res. 762:52-64 (2014)], [Holbrook et al., Nature Genetics 36:801-808 (2004)], [Supek et al., Trends Genet. 37:657-668 (2021)], [Khajavi et al., Eur J Hum Genet. 14:1074-1081 (2006)] 등 참조).
본원에 사용된 용어 "조성물" 또는 "약학 조성물"은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 본 발명의 화합물의 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물은 환자 또는 대상체에게 화합물의 투여를 용이하게 한다.
이에 따라 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효성분으로 포함하며, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제 공한다. 상기 제약상 허용되는 담체는, 비유효 성분, 즉, 제약상 허용되는 부형제로서, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients] 등을 참고하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
적합한 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 예를 들면, 근육내, 정맥내, 또는 피하내 투여 등을 비제한적으로 포함한다.
실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것이 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. NMD 저해제 탐색용 세포주 구축
NMD 효율 측정을 위해서 일반적으로 세포에서 mRNA를 추출하여 mRNA의 양을 RT-PCR을 통해 확인하나, 이러한 방법은 대용량 탐색(Highthroughput screening, HTS)을 수행하기에는 한계가 있기 때문에 정량화를 쉽게 할 수 있는 방법 개발이 필요하다.
이에 본 발명은 도 1과 같은 효율적인 NMD 저해제 탐색 방법을 고안하였다. 베타-지중해성빈혈 (beta-thalassemia)은 NMD 관련 유전병으로서 베타-글로빈(beta-globin) 유전자와 관련된 것으로 알려져 있다. 즉, 지중해성빈혈 (beta-thalassemia)을 가진 사람의 베타-글로빈(beta-globin) 유전자는, 정상인과 비교하여, PTC (premature termination codon) 유전자가 발현되어 있다.
본 실시예에서는 화학발광 유전자(Chemiluminescence gene)인 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase; RLuc)의 뒷부분에, 베타-글로빈(beta-globin) 정상 유전자 또는 유전병에서 발견되는 PTC (premature termination codon)를 포함한 유전자를 삽입시켰다. 정상 유전자를 삽입한 형태의 mRNA는 NMD의 표적이 되지 않는 반면, PTC를 가지는 유전자를 삽입했을 경우 NMD 표적이 되고, 그 결과 mRNA가 빨리 깨지고, RLuc의 발현양이 줄어들게 된다.
이에 따라 NMD 표적 mRNA를 항상 발현하는 HeLa 세포주를 제조하였고, 동시에 이 세포주는 NMD의 표적이 되지 않는 firefly luciferase (FLuc) 유전자를 항상 발현할 수 있게 디자인을 하였으며, 동일한 구성을 갖는 총 3종의 세포주(NMD20, NMD4, NMD5)를 확보하였다. 이렇게 제조된 HeLa 세포주가 NMD 효율 측정에 적합한지를 확인하기 위해 아래와 같은 2가지 실험을 수행하였다.
우선, 제조된 세포주 각각에 비특이적 NMD 저해물질로 알려진 카페인을 처리하여, FLuc activity에 대한 RLuc activity의 정도를 확인하였다. 시약을 12시간 처리한 이후, 세포로부터 전체 단백질을 분리하였다. 그 후, dual luciferase assay를 통해 RLuc과 FLuc 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이, 카페인 미처리 군과 비교하여, 카페인 처리군에서 RLuc의 발현량이 약 1,300배 ~ 약 2000배까지 증가함이 확인되었다. 이러한 결과는 상기 세포주들이 NMD의 효율을 잘 반영하는 것을 의미한다.
추가적으로 제조된 HeLa 세포주가 대용량 탐색(high-throughput screening, HTS)을 수행하기에 적합한지를 확인하고자 하였다. HTS에 적합하도록 384-웰 포맷에서 세포의 수, 사용된 시약 및 버퍼의 양 등의 조건을 최적화하여 실험을 수행하였고(도 3), 대조 물질로서 비특이적 NMD 저해제인 wortmannin을 사용하여 NMD 효율을 측정하였다. Wortmannin은 NMD pathway의 결정적 단계인 SMG1-mediated UPF1 phosphorylation을 억제함으로써 NMD를 억제한다고 알려져 있다(A Yamashita et al., 2001 Sep 1;15(17):2215-28). 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 미처리 군과 비교하여, Wortmannin 처리군에서 RLuc의 발현량이 약 10-40배 증가하였다(도 3에서 w/FF luc calibration은 FLuc 활성값에 대해 보정한 RLuc값임). 이에 따라 제조된 HeLa 세포주는 NMD의 효율을 잘 반영할 뿐만 아니라, HTS를 수행하기에 적합한 것으로 검증되었다.
실시예 2. 화합물 1 내지 3의 NMD 저해 효과 확인
실시예 1에서 제조된 HeLa 세포주를 사용하여 화합물 1 내지 3의 NMD 저해 효과를 확인하고자 하였다. 화합물 1 내지 3을 5 μM, 12시간 동안 세포에 각각 처리한 후, 세포로부터 전체 RNA와 단백질을 각각 정제하였다. 그 후, 실시간 PCR 기법과 dual luciferase assay 방법을 통해 RNA와 단백질 각각의 양을 정량하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
화합물 1은 RLuc의 단백질 번역을 증가시키는 반면, 화합물 2 및 3의 경우 mRNA의 양을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다. 이로부터 상기 3종의 화합물은 모두 NMD를 저해하는 효과를 나타내나, 화합물 1과 화합물 2 및 3은 서로 다른 단계에서 저해함을 알 수 있었다.
결론적으로 화합물 1 내지 3 각각이 작용하는 NMD 단계는 조금씩 차이는 있으나 모두 공통적으로 NMD를 억제하는 물질임을 알 수 있었다.
실시예 3. 화합물 1 내지 3의 NMD 저해 기전 분석
NMD는 여러 단계의 단백질 결합을 통해 이루어지는 현상으로서, 그 중 UPF1 및 UPF2 사이의 결합과, UPF1의 인산화 등에 의해 특히 영향을 받음이 알려져 있다(한국특허 제1021402호 등 참조).
본 실시예에서는 본 발명의 각 화합물이 구체적으로 NMD의 어떤 단계에 작용하는지를 확인하고자 하였다.
3.1 UPF1의 인산화에 미치는 영향 분석
UPF1의 인산화는 NMD에 있어서 가장 중요한 인자 중 하나로 알려져 있다. 본 실시예에서는 본 발명의 3종 화합물이 UPF1의 인산화에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 세포에 각 화합물을 5 μM, 12시간 동안 처리한 후, 전체 단백질을 정제하였다. 그 후 Upf1 또는 특정 위치에 인산화된 Upf1을 인식할 수 있는 각각의 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 1 및 3은 UPF1의 인산화에 큰 영향을 미치지 않지만, 화합물 2는 UPF1의 인산화를 현저히 저해시키는 것을 확인하였다.
3.2 UPF1과 UPF2 간의 결합에 미치는 영향 분석
NMD는 여러 단계의 단백질 결합을 통해 이루어지는 현상으로 그 중 UPF1과 UPF2 간의 결합이 가장 중요한 단계로 알려져 있다. 본 실시예에서는 UPF1과 UPF2 간의 결합에 본 발명의 3종 화합물이 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
세포주에 FLAG-UPF1을 발현하는 DNA를 일시적으로 과발현시켰다.
이 세포주에 각 화합물을 5 μM, 1시간 동안 처리한 후 cell extract를 얻었다. FLAG 항체를 이용하여 확보한 cell extract에 대해 immunoprecipitation을 수행하였다.
Immunoprecipitation 전과 후의 단백질을 western blotting을 통해 분석하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 UPF1-UPF2 결합을 현저히 저해하는 반면, 화합물 2 및 3은 UPF1-UPF2 결합에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
3.3 NMD의 작용 단계 분석
NMD의 각 단계에 작용하는 단백질(Upf1, Upf2, Upf3X)을 리포터 mRNA의 3'UTR에 인위적으로 연결(Tethering)한 후, 리포터 mRNA 양을 인위적으로 줄일 수 있는 NMD 기반 검색시스템을 구축하였다(도 7). 이 방법을 이용하여 3종 화합물이 NMD의 어느 단계에 작동하는지를 검증하고자 하였다.
HeLa 세포주에 도 7과 같이 리포터 mRNA를 발현하는 플라스미드와 인위적으로 리포터 mRNA의 3' UTR에 결합할 수 있는 MS2 결합단백질(MS2-Upf1, MS2-Upf2, MS2-Upf3)을 발현시켰다. 이 세포주에 각 화합물 5 μM, 6시간 또는 12 시간 동안 처리한 후 cell extract를 얻었다. 그 후, 리포터 mRNA의 상대적인 양을 실시간 PCR을 통해 측정하였다.
그 결과, 화합물 1은 UPF1-UPF2 단계를 타겟하는 반면, 화합물 2와 3은 UPF1-UPF2, UPF2-UPF3 단계를 타겟하지 않는 것을 확인하였다(도 8 및 9).
결론적으로 화합물 1 내지 3은 각 화합물이 작용하는 NMD 단계는 조금씩 차이는 있으나 모두 공통적으로 NMD를 억제하는 물질임을 확인하였다. 이에 따라, 화합물 1 내지 3은 모두 NMD에 의해 유발되는 유전병의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음이 확인되었다.
실시예 4. DMD 치료 효과 확인
본 실시예에서는 NMD 억제제로서 확인된 화합물 1 내지 3이 NMD 관련 유전병에 효과적인지를 추가적으로 확인하기 위해서, DMD 환자 유래 세포주를 대상으로 실험을 진행하였다. DMD는 디스트로핀(dystrophin) 유전자에 PTC가 생성되어서 NMD에 의해 빨리 제거되기 때문에 발병하는 대표적인 NMD 관련 유전병이다.
서로 다른 DMD 환자에서 유래된 lymphocyte 2종에 화합물 3종을 5μM, 12시간 동안 각각 처리한 후, dystrophin mRNA 양을 실시간 PCR을 통해 정량하였다.
그 결과, 서로 다른 DMD 환자 유래 세포주에서 3종 화합물 모두 디스트로핀 mRNA (DMD/GAPDH mRNA)의 양을 증가시키는 것을 확인하였다(도 10).
위와 동일한 실험 조건에서 화합물 1을 처리한 세포주에서 단백질을 얻어, 디스트로핀 단백질 양의 변화를 Western blotting으로 조사한 결과, 세포 내에서 발현되는 디스트로핀 단백질의 양이 실제로 증가되는 것을 알 수 있었다(도 11).
따라서 위의 3종 화합물은 NMD를 저해하여, 디스트로핀의 양을 증가시키는 것으로 확인되었다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 2의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD) 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
    <화학식 2>
    Figure PCTKR2022002228-appb-img-000007
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD)를 억제하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 UPF1의 인산화를 저해하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 질병은 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 연관된 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 NMD에 의해 유발되는 유전 질병인 것인, 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 NMD에 의해 유발되는 유전 질병은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근이영양증, 상염색체 우성 다낭성 신장질환(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADOKD), 모세혈관확장성운동실조증(ataxia telangiectasia), 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia), 인자 VII 결핍증(factor VII deficiency), 가족성 심방 세동, 혈우병 B, 간의 카르니틴 팔미토일 전달 효소 1A 결핍증(hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency; CPT1A), 유전성 폐 동맥 고혈압(heritable pulmonary arterial hypertension; HPAH), 후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; LNCL), 백혈구 부착 결핍1(leukocyte adhesion deficiency 1; LAD1), 메틸말론산증(methylmalonic academia; MMA), 헐러 증후군(Hurler syndrome), 신세포성 시스틴증(nephropatic cystinosis), 비만, 퍼옥시좀 형성 장애(peroxisome biogenesis disorder; PBD), 신세뇨관 산증 (RTA), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa; RP), 레트 증후군(Rett syndrome; RTT), 척수 근위축증(spinal muscular atrophy; SMA), 스티뷰-와이드만 증후군(Stuve-Wiedemann syndrome; SMS), X-연관 신성요붕증(X-linked nephrogenic diabetes insipidus; XNDI) 또는 어셔 증후군(Usher syndrome; USH1)인, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 근이영양증은 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 백커형 근위측증(Becker muscular dystrophy), 울리히병(Ullrich's disease), 선천성 근위축증 근이영양증, 또는 지대형 근육 근이영양증인, 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 NMD에 의해 유발되는 유전 질병은 유전적 확산성 위암(hereditary diffuse gastric cancer; HDGC), P53 유전자 돌연변이와 관련된 암, 또는 APC 유전자 돌연변이와 관련된 암인, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
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