WO2023277502A1 - 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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WO2023277502A1
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cancer
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gls
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정재호
김재우
황성순
윤보경
김현희
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Cancer is one of the incurable diseases that civilization must solve, and a huge amount of capital is being invested in development to cure it worldwide. is diagnosed, and more than 60,000 people die.
  • Carcinogens that cause cancer include smoking, ultraviolet rays, chemicals, food, and other environmental factors, but the causes are diverse, making it difficult to develop therapeutic agents, and the effects of the therapeutic agents are also different depending on the site where they occur. Substances currently used as therapeutic agents have considerable toxicity and cannot selectively remove only cancer cells. Therefore, it is urgently needed to develop effective anticancer agents with low toxicity to prevent the occurrence of cancer as well as to treat cancer after it has occurred. . Although there have been significant advances in cancer diagnosis and treatment over the past decade, the mortality rate due to cancer is still high.
  • gastric cancer is one of the most common malignancies and is the third leading cause of cancer mortality worldwide.
  • great progress has been made in the treatment of gastric cancer patients, gastric cancer patients frequently recur and metastasize, or drug resistance exists, so there are still limitations to the treatment.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information on a treatment method for epithelial mesenchymal transition (EMT) subtype cancer patients.
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • One embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • the pharmaceutical composition comprises an agent capable of inhibiting the expression of a GLS (Glutaminase) gene, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And PHGDH (Phosphoglycerate Dehydrogenase) gene, SHMT (Serine hydroxymethyltransferase) gene and MTHFD2 gene (Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP + Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)
  • GLS Glutaminase
  • PHGDH Phosphoglycerate Dehydrogenase
  • SHMT Serine hydroxymethyltransferase
  • MTHFD2 gene Methyltetrahydrofolate Cyclohydrolase
  • the pharmaceutical composition comprises an agent capable of inhibiting the function of a protein encoded by the GLS gene, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and an agent capable of inhibiting the function of a protein encoded by any one gene selected from the group consisting of PHGDH gene, SHMT gene and MTHFD2 gene, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the "GLS gene” of the present invention is a gene encoding k-type mitochondrial glutaminase, and catalyzes the hydrolysis of glutamine into glutamate and ammonia.
  • cancer cells degrade glutamine by overexpressing the GLS gene in order to obtain a large amount of energy and a source necessary for fatty acid synthesis.
  • cancer patients have overexpression of the GLS gene, and may have characteristics such as suppression of proliferation or death by an agent capable of inhibiting GLS gene expression or the function of a protein encoded thereby. , but is not limited thereto.
  • the GLS gene of the present invention may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the agent capable of inhibiting the function of the protein encoded by the GLS gene of the present invention is a compound represented by Formula 1 (CAS No. 1439399-58-2) or Formula 2 (CAS no. 314045-39-1) It can be, but is not limited to:
  • the "PHGDH gene” of the present invention is a gene encoding an enzyme involved in the initial stage of L-serine synthesis in animal cells.
  • the PHGDH gene of the present invention may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the "SHMT gene” of the present invention is a gene encoding an enzyme that catalyzes the reversible conversion of serine and tetrahydrofolate into glycine and 5,10-methylenetetrahydrofolate.
  • the SHMT gene of the present invention may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the "MTHFD2 gene” of the present invention is a gene encoding an enzyme having methylenetetrahydrofolate dehydrogenase and methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase activities.
  • the MTHFD2 gene of the present invention may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
  • An agent capable of inhibiting the function of the protein encoded by the PHGDH gene of the present invention may be a compound represented by Formula 3 (CAS No. 1916571-90-8), but is not limited thereto:
  • An agent capable of inhibiting the function of the protein encoded by the MTHFD2 gene of the present invention may be a compound represented by Formula 4 (CAS No. 2227149-22-4), but is not limited thereto:
  • An agent capable of inhibiting the function of the protein encoded by the SHMT gene of the present invention may be a compound represented by Formula 5 (CAS No. 2146095-85-2), but is not limited thereto:
  • the expression of the PHGDH, SHMT and MTHFD2 genes and the proteins encoded thereby are increased together with the GLS gene and the proteins encoded thereby in cancer patients, thereby inhibiting GLS gene expression or the function of the proteins encoded thereby.
  • an agent capable of inhibiting cancer a remarkable synergistic effect can be exerted in suppressing and killing cancer cells in cancer patients.
  • the "pharmaceutically acceptable salts" of the present invention are salts generally regarded by those skilled in the art as being suitable for medical applications (eg, because such salts are not harmful to subjects that can be treated with the salts); or salts that cause acceptable side effects within the respective treatment.
  • the pharmaceutically acceptable salt is a salt that is considered acceptable by regulatory authorities such as the US Food and Drug Administration (FDA), the European Medicines Agency (EMA), or the Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA) of the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention determines whether a specific compound according to the present invention or a physiologically functional derivative thereof can form a salt, that is, a substance corresponding to the inhibitor according to the present invention or It can be easily determined whether a physiologically functional derivative thereof has a group capable of taking on a charge, such as, for example, an amino group, a carboxylic acid group, and the like.
  • exemplary salts of the compound are acid addition salts or salts with bases, especially pharmaceutically acceptable inorganic and organic acid addition salts and salts with bases commonly used in pharmacology. salts, which are water insoluble or especially water soluble acid addition salts. Depending on the substituents of the compounds, salts with bases may also be suitable. Acid addition salts are formed, for example, by combining a solution of a compound of the present invention with a solution of a pharmaceutically acceptable acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, acetic acid, benzoic acid, citric acid, tartaric acid, carbonic acid, or phosphoric acid.
  • a pharmaceutically acceptable acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, acetic acid, benzoic acid, citric acid, tartaric acid, carbonic acid, or phosphoric acid.
  • pharmaceutically acceptable base addition salts include alkali metal salts (eg sodium or potassium salts); alkaline earth metal salts (eg, calcium or magnesium salts); and salts formed with suitable organic ligands (e.g., ammonium, quaternary ammonium and amines formed using counter anions such as halides, hydroxides, carboxylates, sulfates, phosphates, nitrates, alkyl sulfonates and aryl sulfonates). cations) may be included.
  • alkali metal salts eg sodium or potassium salts
  • alkaline earth metal salts eg, calcium or magnesium salts
  • suitable organic ligands e.g., ammonium, quaternary ammonium and amines formed using counter anions such as halides, hydroxides, carboxylates, sulfates, phosphates, nitrates, alkyl sulfonates and aryl sulf
  • Illustrative examples of pharmaceutically acceptable salts include acetates, adipates, alginates, arginates, ascorbates, aspartates, benzenesulfonates, benzoates, bicarbonates, bisulfates, bitartrates, borates, bromide, butyrate, calcium edetate, camphorate, camphorsulfonate, camsylate, carbonate, chloride, citrate, digluconate, dihydrochloride, dodecylsulfate, edetate, edisylate, ethanesulfonate, Formate, fumarate, galactate, galacturonate, gluconate, glutamate, glycerophosphate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hexylresorcinate, hydrobromide, hydrochloride, hydroiodide , 2-hydroxy-ethanesulfonate, hydroxyna
  • Agents capable of inhibiting the expression of the gene of the present invention include compounds; It may be any one selected from the group consisting of miRNA, siRNA, shRNA, and antisense oligonucleotides that specifically bind to the mRNA of the genes, but is not limited thereto.
  • the agent capable of inhibiting the function of the protein of the present invention is any one selected from the group consisting of a compound, an inverse agonist, an antagonist, and an antibody or aptamer capable of specifically binding to the proteins It may be, but is not limited thereto.
  • the "inverse agonist” or “antagonist” of the present invention means a molecule capable of directly or indirectly reducing the biological activity of a receptor, and when used together with a ligand of a receptor, the ligand molecules capable of reducing action, but are not limited thereto.
  • the "antibody” of the present invention refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule, and such an antibody is obtained by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain the marker A protein encoded by a gene is obtained, and it can be produced from the obtained protein by a conventional method.
  • the "aptamer” of the present invention refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule.
  • the aptamer may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may be linear or cyclic.
  • the shorter the nucleotide sequence constituting the aptamer the more chemical synthesis and mass production. It is known that it is easy, has excellent advantages in terms of cost, is easy to chemically modify, has excellent in vivo stability, and has low toxicity.
  • the cancers of the present invention include gastric cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, ovarian cancer, colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, and Hodgkin's lymphoma.
  • the cancer of the present invention may be intractable cancer, which is a cancer with metastasis, recurrence and drug resistance, but is not limited thereto.
  • the cancer of the present invention may be of the epithelial mesenchymal transition (EMT) subtype, but is not limited thereto.
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • the "EMT molecular subtype" of the present invention is a subtype in which there is a process in which epithelial cells change into mesenchymal cells, and it is a mutation process in which epithelial cells lose their appearance and have mesenchymal cell characteristics, which is an important process for object formation and development. It refers to a molecular subtype that is known and can cause cancer cell growth, drug resistance, invasion and metastasis.
  • composition of the present invention may further contain an anticancer agent.
  • the anticancer agent of the present invention is nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, bosutinib, axitinib, cedi ranib, lestaurtinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, sorafenib, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, viscum album, asparaginase, tretinoin, hydroxyl Carbamide, dasatinib, estramustine, gemtuzumab ozogamicin, ibritumomabtucetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, ale
  • prevention of the present invention means any action that suppresses or delays the onset of a disease or condition.
  • the composition is meant to delay the onset of, or inhibit the onset of, cancer, in particular EMT molecular subtype cancer.
  • treatment of the present invention refers to any action that delays, stops, or reverses the progression of a disease or condition, and for the purpose of the present invention, the composition is used to stop, alleviate, or alleviate the progression of cancer, particularly EMT molecular subtype cancer. or to eliminate or reverse.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be intended for humans.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are not limited thereto, but are formulated in the form of oral formulations such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a colorant, a flavoring agent, etc.
  • a buffer, a preservative, A pain reliever, solubilizer, isotonic agent, stabilizer, etc. may be mixed and used, and in the case of topical administration, a base, excipient, lubricant, preservative, etc. may be used.
  • Formulations of the pharmaceutical composition of the present invention may be variously prepared by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutically acceptable carrier for example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
  • it may be formulated into solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained-release preparations, and the like.
  • Examples of carriers, excipients and diluents suitable for the formulation of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, and the like may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but is not limited to oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, This includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • the "parenteral" includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intracapsular, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition may be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on various factors including the activity of the specific compound used, age, body weight, general health, sex, diet, administration time, route of administration, excretion rate, drug combination and severity of the specific disease to be prevented or treated.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be variously varied, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, body weight, disease severity, drug type, administration route and period, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and is 0.0001 to 50 mg/day. kg or 0.001 to 50 mg/kg.
  • Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • an agent capable of inhibiting the expression of a glutaminase (GLS) gene to a subject in need of administration, or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprising administering a pharmaceutically effective amount of a composition containing a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
  • the GLS, PHGDH, SHMT or MTHFD2 gene, the agent capable of inhibiting the expression of the gene, the pharmaceutically acceptable salt, and the information about the cancer prevent, ameliorate, or prevent the cancer As described in the therapeutic composition, it is omitted to avoid excessive complexity in the present specification.
  • the "administration" means providing a predetermined composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • the "subject" in need of the administration may include both mammals and non-mammals.
  • the mammal include humans, non-human primates such as chimpanzees, other apes or monkey species; livestock animals such as cattle, horses, sheep, goats, pigs; domesticated animals such as rabbits, dogs or cats; Laboratory animals, such as rodents, such as rats, mice, or guinea pigs may be included, but are not limited thereto.
  • examples of the non-mammals in the present invention may include birds or fish, but are not limited thereto.
  • the formulation to be administered as described above is not particularly limited, and may be administered as a solid formulation, a liquid formulation, or an aerosol formulation for inhalation, and is converted to a liquid formulation for oral or parenteral administration immediately before use. It can be administered in solid form preparations intended to be, for example, oral formulations such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories and sterile injection solutions. It is not limited thereto.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be additionally administered together with the formulation of the present invention during the administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a colorant, a flavoring agent, etc. for oral administration, and in the case of an injection, a buffer, Preservatives, analgesics, solubilizers, tonicity agents, stabilizers, etc. may be mixed and used, and in the case of topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives, etc. may be used.
  • Formulations of the compound of the present invention can be variously prepared by mixing with the pharmaceutically acceptable carriers described above.
  • it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
  • it may be formulated into solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained-release preparations, and the like.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil, and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, and the like may be further included.
  • the route of administration of the formulation according to the present invention is not limited thereto, but is not limited to oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or work included. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intracapsular, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • “pharmaceutically effective amount” refers to a sufficient amount of an agent to provide a desired biological result. The result may be reduction and/or alleviation of the signs, symptoms or causes of a disease, or any other desirable change in a biological system.
  • an “effective amount” for therapeutic use is the amount of an agent disclosed herein required to provide a clinically significant reduction in disease.
  • An “effective” amount suitable in any individual case can be determined by one skilled in the art using routine experimentation.
  • the expression “effective amount” generally refers to an amount of an active substance that has a therapeutic effect.
  • the active substance is a growth inhibitor of cancer cells, and a preventive, ameliorative or therapeutic agent for cancer.
  • the formulation of the present invention can vary widely depending on various factors including activity, age, body weight, general health, gender, dosage, administration time, route of administration, excretion rate, drug combination and severity of a specific disease to be prevented or treated, and the above
  • the dosage of the preparation varies depending on the patient's condition, weight, disease severity, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by those skilled in the art, and is administered at 0.0001 to 100 mg/kg or 0.001 to 100 mg/kg per day. can do. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the compounds according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries and suspensions.
  • the agent of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
  • the formulation of the present invention may be used in combination with other anticancer agents, wherein the anticancer agents include nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, panitumumab, erlotinib, neratinib, lapatinib, Fitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, bosutinib, axitinib, cediranib, lestaurtinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, 5-fluo louracil (5-FU), bevacizumab, cisplatin, cetuximab, aflibercept, regorafenib, viscum album, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatinib, estramustine, gemtu Zumabozogamicin, ibri
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information on a treatment method for patients with EMT molecular subtype cancer.
  • the method of the present invention comprises the steps of measuring the expression level of a GLS gene or a protein encoded thereby in a biological sample isolated from a subject of interest; and an agent capable of suppressing the expression of the following genes when the measured expression level of the gene or protein is increased; Or determining that administration of an agent capable of inhibiting the function of a protein encoded by the following gene is administered in combination; includes:
  • SHMT Serine hydroxymethyltransferase
  • MTHFD2 gene Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase
  • the "subject of interest” means an agent capable of inhibiting GLS gene expression; Alternatively, it refers to an individual whose treatment responsiveness is uncertain by an agent capable of inhibiting the function of a protein encoded thereby, and which has cancer or is highly likely to develop cancer.
  • the "biological sample” of the present invention means any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear Blood (including peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma and serum), sputum, tears, mucus, nasal washes ), nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspiration It may include bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract, or cerebrospinal fluid, It is not limited thereto.
  • the method for measuring the expression level of the protein of the present invention includes protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) assay, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoretic assay, liquid chromatography-mass It may be at least one selected from the group consisting of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS), western blotting, and enzyme linked immunosorbentassay (ELISA).
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • the expression level of the protein of the present invention can be measured using an agent capable of measuring the expression level of the protein.
  • the agent capable of measuring the expression level of the protein may be at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligopeptide, a ligand, a peptide nucleic acid (PNA), and an aptamer that binds specifically to the protein. there is.
  • antibody of the present invention refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • antibody means an antibody that specifically binds to said protein.
  • Antibodies of the present invention include both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Such antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art. For example, polyclonal antibodies can be produced by a method well known in the art, including a process of injecting an antigen of the protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • monoclonal antibodies can be prepared by the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), or the phage antibody library technique (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991).
  • Antibodies prepared by the above methods may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention include functional fragments of antibodies as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • the functional fragment of the antibody of the present invention means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases the binding force and stability to DNA or RNA, and is thus used in molecular biology. , diagnostic assays and antisense therapies.
  • the "aptamer” of the present invention means an oligonucleic acid or peptide molecule.
  • An agent capable of measuring the expression level of the protein of the present invention is an antibody, PNA, aptamer, etc.
  • the formulation can be easily manufactured.
  • the method for measuring the expression level of the gene of the present invention is reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase It may be at least one selected from the group consisting of RNase protection assay (RPA), Northern blotting, and DNA chip.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RNase It may be at least one selected from the group consisting of RNase protection assay (RPA), Northern blotting, and DNA chip.
  • the expression level of the gene of the present invention can be measured using an agent capable of measuring the expression level of the gene.
  • An agent capable of measuring the expression level of the gene may be at least one selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that complementarily bind to the gene.
  • the "primer” of the present invention is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes a forward and reverse primer pair, preferably a primer pair that provides analysis results having specificity and sensitivity. High specificity can be imparted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that the primer amplifies only the target gene sequence containing a complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification. .
  • the "probe” of the present invention means a substance capable of complementarily binding to a target substance to be detected in a sample, and means a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding.
  • the type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably may be peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably Most likely it is PNA.
  • the probe is a biomaterial, including one derived from or similar to a living organism or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, nerve cells, DNA, and It may be RNA, where DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, and RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides.
  • LNA Locked nucleic acids
  • the "LNA (Locked nucleic acids)" of the present invention means a nucleic acid analog containing a 2'-O, 4'-C methylene bridge [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502 ].
  • LNA nucleosides contain the common nucleic acid bases of DNA and RNA, and can base pair according to the Watson-Crick base pairing rules. However, due to molecular 'locking' due to the methylene bridge, the LNA does not form an ideal shape in the Watson-Crick bond.
  • LNAs When LNAs are included in DNA or RNA oligonucleotides, they can more rapidly pair with complementary nucleotide chains to increase the stability of the double helix.
  • the "antisense nucleotide” of the present invention is a nucleotide sequence in which an antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, allowing the formation of typically mRNA and RNA: oligomer heteroduplexes in the target sequence and an oligomer having an inter-subunit backbone. Oligomers may have exact sequence complementarity or near complementarity to the target sequence.
  • An agent capable of measuring the expression level of the gene of the present invention is easily prepared by a person skilled in the art based on the nucleotide sequence of the gene of the present invention, corresponding to primers, probes, etc. that complementarily bind to the gene. It can be.
  • the present invention relates to a method for preventing, improving or treating a cancer patient, particularly an EMT (Epithelial mesenchymal transition) subtype cancer patient, and in a cancer patient in which the expression level of a glutaminase (GLS) gene or a protein encoded thereby is increased, PHGDH ,
  • EMT epihelial mesenchymal transition
  • PHGDH glutaminase
  • FIG. 1 shows the results of performing stomach transcriptome analysis in a Yonsei cohort of gastric cancer patients according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the expression levels of proteins encoded by GLS (Glutaminase) genes in intestinal subtype cell lines (NCIN87 and SNU601) and stem-like subtype cell lines (MKN1 and HS746T) according to an embodiment of the present invention. It shows the results confirmed through Western blot analysis.
  • GLS Glutaminase
  • FIG. 3 shows the results of genome analysis on intestinal subtype organoids (GA326) and stem-like subtype organoids (GA077) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 to 7 show the results of confirming the proliferation level of the cell line according to the presence or absence of glutamine (FIG. 4) and the concentration of DON, a glutamine analog, according to an embodiment of the present invention (FIG. 5), and the GLS inhibitor CB839 (FIG. 6) and the results of confirming the proliferation level of the cell line according to the concentration of BPTES (FIG. 7).
  • FIG. 8 shows the result of confirming the size change of stem-like subtype organoids by single treatment with CB839, a GLS inhibitor, according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 to 11 confirm the proliferation level of stem-like subtype cell lines according to the presence or absence of glutamine and combined treatment with PHGD (FIG. 9), SHMT (FIG. 10) or MTFHD2 (FIG. 11) inhibitors according to an embodiment of the present invention. that showed the result.
  • FIG. 12 shows the result of confirming the size change of stem-like subtype organoids by the combined treatment of a GLS inhibitor (CB839) and NCT504 according to an embodiment of the present invention.
  • GLS Glutaminase
  • PHGDH Phosphoglycerate Dehydrogenase
  • SHMT Serine hydroxymethyltransferase
  • MTHFD2 gene Methyltetrahydrofolate Cyclohydrolase
  • GLS Glutaminase
  • PHGDH Phosphoglycerate Dehydrogenase
  • SHMT Serine hydroxymethyltransferase
  • MTHFD2 gene Methyltetrahydrofolate Cyclohydrolase
  • the present invention relates to a method for providing information on a method for treating a patient with EMT molecular subtype cancer, comprising:
  • NCIN87, SNU601, MKN1, and HS746T cell lines were purchased from the Korean Cell Line Bank to examine the expression levels of the GLS gene and protein.
  • the NCIN87 and SNU601 cell lines represent the intestinal subtype
  • the MKN1 and HS746T cell lines correspond to the stem-like subtype.
  • RPMI1640 with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin
  • DMEM fetal bovine serum
  • DMEM fetal bovine serum
  • EBC200 200mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5% NP-40
  • a protease inhibitor mixture genedepot
  • the expression level of the protein encoded by the GLS gene is increased particularly in the stem-like subtype.
  • the obtained genome analysis data was normalized with TPM, and the GLS gene and genes related to one-carbon metabolism, MTR, SHMT1, SHMT2, MTHFD1 and MTHFD2 were analyzed.
  • the transcript expression values were confirmed and shown in FIG. 3 .
  • the expression level of the GLS gene is particularly increased in the stem-like subtype compared to other gastric cancer subtypes not only in the cell line but also in the organoid having a high similarity to the patient.
  • NCIN87 an intestinal subtype cell line, and HS746T cell line, a stem-like subtype cell line, were seeded in 96-well plates (black) at 5000 cells each, and replaced with glutamine-deficient culture medium (Gibco) the next day. Then, DON (1 ⁇ M, 50 ⁇ M, 150 ⁇ M; selleckchem, cat no. S8620), CB839 (1 ⁇ M, 5 ⁇ M, 25 ⁇ M; cayman, cat no. S7655) or BPTES (5 ⁇ M, 10 ⁇ M; ⁇ M, 25 ⁇ M; MCE, cat no.
  • the treatment time was 0 hours, and the culture medium of the cells was discarded at 24 hours, 28 hours, and 72 hours, and then placed in an ultra-low temperature freezer at -80 ° C. kept.
  • 200 ⁇ l of the cell lysate containing GR dye included in the cell viability assay kit was added to each well of the cultured cells. and incubated at room temperature for 5 minutes.
  • the fluorescence intensity was measured at a wavelength of 480 nm for excitation and 520 nm for emission using a fluorescence photometer (thermo, varioskan flash 3001), and the measured value was normalized to the number of cells at 0 hour and digitized as % to help the value. 4 to 7 are shown.
  • Each of the GA077 organoids prepared in Example 3 was treated with 5 ⁇ M of CB839 (cayman, cat no. S7655), and the time point of the treatment was D0, day 1 (D1), day 2 (D2), and day 3 (D3) and 4 days (D4) were photographed through an optical microscope (Olympus), using Image J to measure the longest and shortest diameters passing through the center, and averaging the two values to measure the diameter of organoids did
  • the control group vehicle; DMSO treatment group
  • the experiment was repeated 5 times
  • the case of the CB839 treatment group the experiment was repeated 6 times.
  • the organoid diameter measured in this way was converted to ⁇ m through a microscope size bar, averaged based on the diameter of day 0, and the value was expressed in %, and the value is shown in FIG. 8 .
  • Example 4 after seeding and culturing the stem-like subtype cell line HS746T, the culture medium was replaced with glutamine-deficient culture medium, and PHGDH inhibitor (25 ⁇ M), SHMT inhibitor (1 ⁇ M) or MTHFD2 inhibitor (0.5 ⁇ M) were used. ) was administered, and the viability measured using a cell viability assay kit is shown in FIGS. 9 to 11.
  • organoid diameter when GA077, a stem-like subtype organoid was treated with a GLS inhibitor (CB839) or a PHGDH inhibitor (NCT503) alone, compared to when they were administered in combination (combi). The average value of was significantly decreased.
  • composition according to the present invention can not only inhibit the proliferation of cancer cells, but also have a synergistic effect on inhibiting the proliferation of cancer cells in patients with intractable cancer, which are difficult to treat due to recurrence, metastasis, and resistance to anticancer drugs, so that they can treat cancer very effectively.
  • SEQ ID NO: 2 GLS
  • SEQ ID NO: 4 SHMT2

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Abstract

본 발명은 암 환자, 특히 EMT(Epithelial mesenchymal transition)아형 암 환자의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것으로서, GLS(Glutaminase) 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준이 증가되어 있는 암 환자에서, PHGDH, SHMT 및 MTHFD2 억제제를 병용하여 투여하는 경우 1C 메타볼리즘이 더욱 효과적으로 억제되어 재발, 전이 및 항암제 저항성이 존재하여 치료가 어려운 난치성암 환자에서 암 세포의 증식 억제에 시너지 효과가 존재하여 매우 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 나아가, GLS 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 환자 개개인에 초기 단계부터 맞춤형 치료 방법에 관한 정보를 제공하여 치료 성공도를 높일 수 있다.

Description

암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리 나라의 경우, 질병 사망 원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다.
이러한 암의 유발 인자인 발암 물질로는 흡연, 자외선, 화학 물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다. 지난 10년간 암 진단과 치료에 있어 비약적으로 발전하고 있지만, 암 발병으로 인한 치사율은 여전히 높다.
특히, 위암은 흔한 악성 종양 중 하나이며, 전 세계적으로 암 사망률의 세번째 주요 원인에 해당한다. 위암 환자의 치료에 큰 진전이 있었음에도 불구하고, 위암 환자의 경우, 빈번하게 재발 및 전이되거나, 약물 내성이 존재하여 아직까지도 그 치료에 한계가 존재한다.
암의 재발, 전이 및 약물 내성과 관련성이 있는 메커니즘에 대해 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중 암 줄기세포 가설이 주목받고 있다. 연구에 따르면, 줄기-유사(stem-like) 세포가 존재하여 이와 같은 세포가 종양 공격성, 전이, 재발 및 화학 요법에 대한 저항성에 기여하는 것으로 보고되고 있다.
본 발명의 일 목적은 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 EMT(Epithelial mesenchymal transition) 아형 암 환자의 치료 방법에 대한 정보를 제공 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 약학 조성물은 GLS(Glutaminase)유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 PHGDH(Phosphoglycerate Dehydrogenase) 유전자, SHMT(Serine hydroxymethyltransferase) 유전자 및 MTHFD2 유전자(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 상기 약학 조성물은 GLS유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 PHGDH 유전자, SHMT 유전자 및 MTHFD2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 "GLS 유전자"는 k형 미토콘드리아 글루타미나제(Glutaminase)를 암호화하는 유전자로서, 글루타민이 글루타민산염과 암모니아로 가수분해되는 것을 촉매한다. 특히, 암 세포의 경우 다량의 에너지원과 지방산 합성에 필요한 소스를 얻기 위하여 GLS 유전자를 과발현 시킴으로써, 글루타민을 분해시키는 것으로 보고되어 있다. 본 발명의 목적상 암 환자는 GLS 유전자가 과발현되어 있어, GLS 유전자 발현 또는 그에 의해 암호화된 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제에 의해 증식이 억제되거나, 사멸되지 않는 등의 특징을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 GLS 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 GLS 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제는 하기 화학식 1(CAS No. 1439399-58-2) 또는 화학식 2(CAS no. 314045-39-1)로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022009183-appb-img-000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2022009183-appb-img-000002
본 발명의 상기 "PHGDH 유전자"는 동물 세포에서 L 세린 합성의 초기 단계에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 상기 PHGDH 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "SHMT 유전자"는 세린과 테트라하이드로 폴레이트를 글리신과 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트로 가역적 전환시키는 것을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 상기 SHMT 유전자는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "MTHFD2 유전자"는 메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제 및 메테닐테트라하이드로폴레이트사이클로하이드로라제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 상기 MTHFD2 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 PHGDH 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제는 하기 화학식 3(CAS No. 1916571-90-8)로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2022009183-appb-img-000003
본 발명의 상기 MTHFD2 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제는 하기 화학식 4(CAS No. 2227149-22-4)로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 4]
Figure PCTKR2022009183-appb-img-000004
본 발명의 상기 SHMT 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제는 하기 화학식 5(CAS No. 2146095-85-2)로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 5]
Figure PCTKR2022009183-appb-img-000005
본 발명의 목적상 상기 PHGDH, SHMT 및 MTHFD2 유전자 및 그에 의해 암호화되는 단백질은 암 환자에서 GLS 유전자 및 그에 의해 암호화되는 단백질과 함께 발현이 증가되어 있어, GLS 유전자 발현 또는 그에 의해 암호화된 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제와 함께 병용하여 투여하는 경우에는 암 환자에서 암세포 증식 억제 및 사멸에 현저한 시너지 효과가 발휘되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 의학적 적용에 적합한 것으로 당업자에 의해 일반적으로 간주되는 염(예를 들어, 이러한 염이 상기 염으로 치료될 수 있는 대상체에게 유해하지 않기 때문임), 또는 각각의 치료 내에서 허용가능한 부작용을 야기하는 염이다. 일반적으로, 상기 약제학적으로 허용되는 염은 미국 식품 의약국(FDA), 유럽 의약청(EMA), 또는 일본 후생성의 의약품 의료기기 종합기구(PMDA)와 같은 규제 당국에 의해 허용되는 것으로 간주되는 염이다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 각각의 경우에, 당업자는 본 발명에 따른 특정 화합물 또는 그의 생리학적으로 작용성인 유도체가 염을 형성할 수 있는지 여부, 즉, 상기 본 발명에 따른 억제제에 해당하는 물질 또는 그의 생리학적으로 작용성인 유도체가, 예를 들어 아미노기, 카르복실산기 등과 같은 전하를 띨 수 있는 기를 가지는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 상기 억제할 수 있는 제제가 화합물인 경우, 화합물의 예시적인 염은 산 부가 염 또는 염기와의 염, 특히 약학적으로 허용되는 무기산 및 유기산 부가 염 및 약학에서 통상적으로 사용되는 염기와의 염이며, 이는 수불용성 또는 특히 수용성 산 부가염이다. 상기 화합물의 치환기에 따라 염기와의 염이 또한 적합할 수 있다. 산 부가 염은, 예를 들어, 본 발명의 화합물의 용액을 염산, 황산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 아세트산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 탄산 또는 인산과 같은 약학적으로 허용되는 산의 용액과 혼합함으로써 형성될 수 있다. 마찬가지로, 약학적으로 허용되는 염기 부가 염은 알칼리 금속염(예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 염); 알칼리 토금속 염(예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘 염); 및 적합한 유기 리간드로 형성된 염(예를 들어, 할라이드, 하이드록사이드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대 음이온을 사용하여 형성된 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염의 예시적인 예로는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아르기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카르보네이트, 바이설페이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 부티레이트, 칼슘 에데테이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 캄실레이트, 카르보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 디글루코네이트, 디하이드로클로라이드, 도데실설페이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 갈락테이트, 갈락투로네이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥실레소르시네이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 하이드록시나프토에이트, 요오다이드, 이소부티레이트, 이소티오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트), 메틸설페이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 판토테네이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트/디포스페이트, 프탈레이트, 피크레이트, 피발레이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 설페이트, 수베레이트, 석시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 운데카노에이트, 발레레이트 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제는 화합물; 상기 유전자들의 mRNA에 특이적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제는 화합물, 역작용제(Inverse agonist), 길항제(antagonist) 및 상기 단백질들에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "역작용제(Inverse agonist)" 또는 "길항제(antagonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는 것으로서, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학 수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.
본 발명의 상기 암은 위암, 갑상선암, 부갑상선암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 예를 들면, 위암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암은 전이, 재발 및 약물 내성이 있는 암인 난치성 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암은 EMT(Epithelial mesenchymal transition) 아형인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "EMT 분자 아형"은 상피세포가 중간엽 세포로 변하는 과정이 존재하는 아형으로서, 상피세포의 모습을 잃어버리고 중간엽 세포의 특징을 가지게 되는 변이과정으로 개체 형성 발달에 중요한 과정으로 알려져 있으며, 암 세포의 생장, 약물 저항성, 침윤 및 전이가 일어날 수 있는 분자 아형을 의미한다.
본 발명의 상기 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 케페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟, 펜포민, 메트포민, 탈라조파립 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "예방"은 질병 또는 병증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 조성물은 암, 특히 EMT 분자 아형 암의 발병 시기를 지연시키거나, 발병을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 "치료"는 질병 또는 병증의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 모든 행위를 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 조성물은 암, 특히 EMT 분자 아형 암의 진행을 중단, 경감, 완화 또는 없애거나 역전시키는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(Elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
본 발명의 상기 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 상기 약학 조성물은 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에서는 투여가 필요한 대상체에게 GLS(Glutaminase) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 PHGDH(Phosphoglycerate Dehydrogenase) 유전자, SHMT(Serine hydroxymethyltransferase) 유전자 및 MTHFD2 유전자(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 암의 예방 또는 치료 방법에서, GLS, PHGDH, SHMT 또는 MTHFD2 유전자, 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 약제학적으로 허용 가능한 염 및 암에 관한 내용은 상기 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 기재된 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서 상기 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 투여가 필요한 "대상체"는 포유동물 및 비-포유동물을 모두 포함할 수 있다. 여기서, 상기 포유동물의 예로는 인간, 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지, 다른 유인원 또는 원숭이 종; 축산 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 사육 동물, 예컨대 토끼, 개 또는 고양이; 실험 동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 래트, 마우스 또는 기니아 피그 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 비-포유동물의 예로는 조류 또는 어류 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기와 같이 투여되는 제제는 특별히 제한하지 않으며, 고체 형태의 제제, 액체 형태의 제제 또는 흡인용 에어로졸 제제로 투여될 수 있으며, 사용하기 바로 전에 경구 또는 비경구 투여용 액체 형태 제제로 전환되도록 의도되는 고체 형태 제제로 투여될 수 있고, 예를 들면, 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 투여 시 본 발명의 제제와 함께 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 투여할 수 있다. 여기서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제제의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에서, "약학적으로 유효한 양"은 바람직한 생물학적 결과를 제공하기 위한 작용제의 충분한 양을 지칭한다. 상기 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물계의 임의의 다른 바람직한 변화일 수 있다. 예를 들어, 치료 용도를 위한 "유효량"은 질환에서 임상적으로 유의한 감소를 제공하는데 요구되는, 본 발명에 개시된 제제의 양이다. 임의의 개별적인 경우에서 적절한 "효과적인" 양은 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 표현 "유효량"은 일반적으로 활성 물질이 치료 효과를 갖는 양을 지칭한다. 본 발명의 경우에, 활성 물질은 암 세포의 성장 억제제이자, 암의 예방, 개선 또는 치료제이다.
본 발명의 제제는 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 제제의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 100mg/kg 또는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 화합물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 제제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제제는 다른 항암제와도 추가로 병용하여 사용될 수 있으며, 이때 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 파니투무맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실 (5-FU), 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 아플리베르셉트, 레고라페닙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 류코보린, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 인터페론알파-2a, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 5-플루오로우라실, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 EMT 분자 아형 암 환자의 치료 방법에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GLS 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가된 경우, 하기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제; 또는 하기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제를 병용하여 투여하는 것으로 판단하는 단계;를 포함한다:
PHGDH(Phosphoglycerate Dehydrogenase) 유전자,
SHMT(Serine hydroxymethyltransferase) 유전자, 및
MTHFD2 유전자(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 GLS 유전자 발현을 억제할 수 있는 제제; 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제에 의한 치료 반응성이 불확실한 개체로, 암이 발병되었거나, 또는 암의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준은 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 이용하여 측정될 수 있다. 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체의 기능적인 단편을 포함한다.
본 발명의 상기 항체의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 발명의 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자를 의미한다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 본 발명의 상기 단백질들을 이루는 아미노산 서열을 토대로, 통상의 기술자에 의해 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, PNA 및 앱타머 등에 해당하는 상기 제제가 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 이용하여 측정될 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 상보적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 왓슨-크릭 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명의 상기 "안티센스 뉴클레오티드"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로 이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 본 발명의 상기 유전자들의 염기서열을 토대로, 통상의 기술자에 의해 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 프라이머, 프로브 등에 해당하는 상기 제제가 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명은 암 환자, 특히 EMT(Epithelial mesenchymal transition)아형 암 환자의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것으로서, GLS(Glutaminase) 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준이 증가되어 있는 암 환자에서, PHGDH, SHMT 및 MTHFD2 억제제를 병용하여 투여하는 경우 1C 메타볼리즘이 더욱 효과적으로 억제되어 재발, 전이 및 항암제 저항성이 존재하여 치료가 어려운 난치성암 환자에서 암 세포의 증식 억제에 시너지 효과가 존재하여 매우 효과적으로 암을 치료할 수 있다.
나아가, GLS 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 환자 개개인에 초기 단계부터 맞춤형 치료 방법에 관한 정보를 제공하여 치료 성공도를 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 연세 코호트 위암 환자에서 위 전사체 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 장 아형 세포주(NCIN87 및 SNU601) 및 줄기-유사(stem-like) 아형 세포주(MKN1 및 HS746T)에서 GLS(Glutaminase) 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 장 아형 오가노이드(GA326) 및 줄기-유사 아형 오가노이드(GA077)에서 유전체 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 글루타민 유무(도 4), 글루타민 아날로그인 DON의 농도에 따른 세포주의 증식 수준을 확인한 결과(도 5)를 나타낸 것이며, GLS 억제제인 CB839(도 6) 및 BPTES(도 7)의 농도에 따른 세포주의 증식 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 GLS 억제제인 CB839 단독 처리에 의한 줄기-유사 아형 오가노이드의 사이즈 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 글루타민 유무 및 PHGD(도 9), SHMT(도 10) 또는 MTFHD2(도 11) 억제제의 병용 처리에 따른 줄기-유사 아형 세포주의 증식 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLS 억제제(CB839) 및 NCT504의 병용 처리에 의한 줄기-유사 아형 오가노이드의 사이즈 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는 GLS(Glutaminase)유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 PHGDH(Phosphoglycerate Dehydrogenase) 유전자, SHMT(Serine hydroxymethyltransferase) 유전자 및 MTHFD2 유전자(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에서는 투여가 필요한 대상체에게 GLS(Glutaminase)유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 PHGDH(Phosphoglycerate Dehydrogenase) 유전자, SHMT(Serine hydroxymethyltransferase) 유전자 및 MTHFD2 유전자(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GLS 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가된 경우, 하기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제; 또는 하기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제를 병용하여 투여하는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 EMT 분자 아형 암 환자의 치료 방법에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] 위 전사체 분석
연세 암 센터에서 치료 목적으로 위 절제술(curative intent gastrectomy)을 받은 위암 환자로부터 신선한 냉동 종양 조직을 확보한 뒤, 임상 데이터를 일치시키는 과정을 통해 위의 전사체 분석 데이터를 확보하였다. 본 연구는 연세대학교 의과대학 평가위원회 (Institutional Review Board; IRB)의 승인을 얻어 모든 실험을 수행하였으며, 상기 샘플의 경우 환자로부터 서면 동의 후 수집하였다. 위암 환자는 임상적으로 검증된 분류 체계에 따라 5가지 하위 아형(위(gastric), 염증(inflammatory), 장(intestinal), 혼합(mixed), 줄기 유사(난치성, stem-like, EMT 분자 아형)으로 나누었으며 해당과정(glycolysis)과 글루타민 분해과정(glutaminolysis)에 관련된 유전자들을 통상의 방법에 따라 히트맵(heatmap)으로 분석하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 연세 코호트 위암 환자(Yonsei cohort gastric patients)에서 전사체 분석을 진행한 결과, 히트맵에서 보는 것과 같이 위암의 아형들 중에서 특히 줄기 유사(stem-like) 아형(EMT 분자 아형)으로 분류된 환자에서 GLS(Glutaminase) 유전자의 발현 수준이 증가된 것을 확인하였다.
[실시예 2] 위암 세포주에서 GLS 유전자 및 단백질 발현 수준 확인
GLS 유전자 및 단백질 발현 수준을 확인하기 위해 NCIN87, SNU601, MKN1, 및 HS746T 세포주를 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 여기서, 상기 NCIN87 및 SNU601 세포주의 경우 장 아형을 대표하는 세포주이며, MKN1 및 HS746T 세포주의 경우 줄기 유사 아형을 대표하는 세포주에 해당한다. 이렇게 구입된 세포주의 경우, RPMI1640(10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2mM L- 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토 마이신 포함) 또는 DMEM(10 % FBS, 2mM L- 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토 마이신 포함)을 이용하여 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 상기 세포주들의 경우 모두 마이크플라즈마 오염 테스트 후, 마이코플라즈마가 오염되지 않은 것을 확인한 뒤에 실험에 사용하였다. 프로테아제 저해제 혼합액(genedepot)을 포함하는 EBC200(200mM NaCl, 50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.5% NP-40)를 배양된 각각의 세포주들에 넣고, 세포를 용해시키는 과정을 수행하였다. 그런 다음, 용해된 세포로부터 단백질을 분리한 뒤에 BCA 분석 방법(Pierce)을 통해 단백질의 양을 정량하고, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 로딩한 뒤에 전기영동을 수행하고, 상기 SDS-PAGE를 PVDF 막(Biorad)에 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼가 완료된 막에 5% 스킴 밀크(BD difco)를 넣고 상온에서 한시간 동안 차단(blocking)하는 과정을 수행하고, 그 뒤에 1:2000으로 희석한 GLS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(abcam) 및 1:5000으로 희석한 β액틴을 넣고, 4 ℃에서 하루동안 배양하였다. 이후, 5% 스킴 밀크에 희석한 2차 항체를 넣고 1시간 동안 배양한 뒤, LAS 4000 미니(Fujifilm)를 이용하여 단백질의 발현 수준을 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 장 아형에 해당하는 세포주인 NCIN87 및 SNU601 세포주와 비교하여 줄기 유사 아형에 해당하는 세포주인 MKN1 및 HS746T 세포주에서 GLS 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 위암의 다른 아형과 비교하여 특히 줄기 유사 아형에서 GLS 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준이 증가되어 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] 환자 유래 오가노이드의 유전체 분석 결과
연세대학교 의과대학 평가위원회 (Institutional Review Board; IRB)의 승인을 얻어 환자 유래 조직물을 수득하였다. 그런 다음, 상기 환자 유래 조직물을 이용하여 장 아형에 해당하는 GA326 오가노이드 및 줄기 유사 아형에 해당하는 GA077 오가노이드를 제작하였다.
구체적으로, 임상적으로 검증된 분류체계에 따라 장 아형 또는 줄기-유사 아형으로 분류된 환자 조직을 수득한 뒤에 40% advanced DMEM/F12 (gibco), 50% Wnt3A 세포배양액(conditioned media), 10% R-spond1 세포배양액(conditioned media), 1% HEPES(gibco), 1% GlutaMax(gibco). 0.2% primocin(invivogen), 2% B-27(Invitrogen), 10 mM Nicotinamide(sigma), 1 mM N-Acetylcysteine(sigma), 2 μM A8301, 50 ng/ml mEGF(invitrogen), 100 ng/ml mNoggin(peprotech), 1 nM Gastrin(sigma), 200 ng/ml hFGF10(peprotech) 및 12.5 μM Y-27632(Enzo)을 포함하는 배지를 이용하여 마트리겔(corning)을 사용하여 3D 구조를 형성하는 과정을 통해 오가노이드를 제작하였다.
상기 각각의 오가노이드에서 전사체 분석을 진행하기 위해, 얻어진 유전체 분석 데이터를 TPM으로 정규화를 진행하고, GLS 유전자와 일 탄소 대사와 관련되어 있는 유전자인 MTR, SHMT1, SHMT2, MTHFD1 및 MTHFD2에 대해 전사체 발현 값을 확인하여 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 장 아형에 해당하는 GA326 오가노이드에 비하여, 줄기 유사 아형에 해당하는 GA077 오가노이드에서 GLS 유전자의 발현 수준이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 세포주 뿐만 아니라, 환자와 유사도가 높은 오가노이드에서 역시 다른 위암의 아형과 비교하여 줄기 유사 아형에서 GLS 유전자의 발현 수준이 특히 증가되어 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] GLS 억제제에 의한 줄기-유사 아형 세포주의 세포 증식 확인
장 아형 세포주인 NCIN87 및 줄기-유사 아형 세포주인 HS746T 세포주를 각각 5000개의 세포만큼 96웰 플레이트(검정색)에 분주하고, 다음날 글루타민이 결핍된 배양 배지(Gibco)로 교체하였다. 그런 다음, 상기 세포주들에 DON(1μM, 50 μM, 150 μM; selleckchem, cat no. S8620), CB839(1 μM, 5 μM, 25 μM; cayman, cat no. S7655) 또는 BPTES(5 μM, 10 μM, 25 μM; MCE, cat no. HY-12683)를 처리하고, 처리한 시간을 0시간으로 하여, 24시간, 28시간 및 72시간에 세포의 배양 배지를 버린 뒤에 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 이렇게 보관된 세포를 상온에서 충분히 배양한 뒤, 세포 생존율 분석 키트(CyQUANT cell proliferation assay, Invitrogen)에 포함되어 있는 GR 염색약(dye)이 포함된 세포 용해액 200 ㎕를 상기 배양된 세포의 각각의 웰에 넣고 5분 동안 상온에서 배양하였다. 이후, 형광 광도계 (thermo, varioskan flash 3001)를 이용하여 excitation 480 nm, emission 520 nm의 파장에서 형광의 세기를 측정하고, 측정된 값을 0시간의 세포 수로 표준화하여 %로 수치화하여 그 값을 도 4 내지 7에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 장 아형 세포주인 NCIN87의 경우 글루타민이 포함된 배양 배지(Gln+)와 비교하여 글루타민이 포함되지 않는 배양 배지(Gln-)에서 세포 증식이 크게 감소된 반면, 줄기-유사 아형 세포주인 HS746T의 경우 세포 증식이 글루타민 포함 여부에 따라 감소되지 않았다.
도 5 내지 7에서 보는 바와 같이, 장 아형 세포주인 NCIN87의 경우 글루타민 유사체(DON), GLS 활성 억제제(CB839 및 BPTES)에 의해 세포 증식이 억제되는 반면, 줄기-유사 세포주인 HS746T의 경우 상기 약물에도 세포 증식이 감소되지 않았다.
상기 결과를 통해 줄기-유사 아형, 즉 난치성 암의 경우에는 글루타민 결핍이나 GLS 활성 억제제에 의해 세포 증식이 억제되지 않는 것을 알 수 있다.
[실시예 5] GLS 억제제에 의한 오가노이드에서 증식 감소 여부 확인
상기 실시예 3에서 제작된 GA077 오가노이드 각각에 5 μM의 CB839(cayman, cat no. S7655)을 처리하고, 처리한 시점을 D0으로 하여, 1일(D1), 2일(D2), 3일(D3) 및 4일(D4)에 광학 현미경(Olympus)를 통해 촬영하였으며, Image J를 이용하여 중앙을 지나는 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 측정하고, 두 값을 평균화하여 오가노이드의 지름을 측정하였다. 대조군(veh; DMSO 처리군)의 경우 5번 실험을 반복하였고, CB839 처리군의 경우 6번 실험을 반복하였다. 이렇게 측정된 오가노이드 지름은 현미경 사이즈바를 통해 μm로 변환하고, 0일차의 지름을 기준으로 평균화하여 %로 값을 나타내어 그 값을 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 줄기-유사 아형인 GA077 오가노이드의 경우 GLS 활성 억제제에 해당하는 CB839에 의해서 사이즈가 감소되지 않았다.
상기 결과를 통해 줄기-유사 아형, 즉 난치성 암의 경우에는 GLS 활성 억제제에 의해 세포 증식이 억제되지 않는 것을 알 수 있다.
[실시예 6] 병용 요법 의한 줄기-유사 아형 세포주에서 증식 감소 여부 확인
상기 실시예 4에 기재된 바와 같이, 줄기-유사 아형 세포주인 HS746T를 분주 및 배양한 뒤에 글루타민 결핍된 배양 배지로 교체하고, PHGDH 억제제(25 μM), SHMT 억제제(1 μM) 또는 MTHFD2 억제제(0.5 μM)를 투여하고, 세포 생존율 분석 키트를 이용하여 측정된 생존율을 도 9 내지 11에 나타내었다.
도 9 내지 11에서 보는 바와 같이, 글루타민 결핍 단독(Gln(-)/Veh) 및 각각의 억제제를 단독으로 처리한 경우(Gln(+)/PHGDHi, Gln(+)/SHMTi, Gln(+)/MTHFD2i)와 비교하여, 글루타민 결핍과 PHGDH, SHMT 또는 MTHFD2 억제제를 병용하여 처리한 경우(Gln(-)/PHGDHi, Gln(-)/SHMTi, Gln(-)/MTHFD2i), 줄기-유사 아형 세포주인 HS746T의 생존율 억제에 현저한 시너지 효과가 존재하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 글루타민 결핍 및 GLS 억제제에 저항성이 존재하는 줄기-유사 아형, 즉 난치성 암의 경우에 PHGDH, SHMT 및 MTHFD2 억제제를 각각 병용해서 투여하는 경우 세포의 생존율을 효과적으로 억제할 수 있다.
[실시예 7] 병용 요법 의한 줄기-유사 아형 오가노이드에서 증식 감소 여부 확인
상기 실시예 5에 기재된 바와 같이, 줄기-유사 아형 오가노이드인 GA077에 GLS 억제제(CB839, 5 μM), PHGDH 억제제(NCT503, 50 μM) 또는 이들의 조합(combi)을 각각 처리하고, 오가노이드 지름의 평균 값을 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, 줄기-유사 아형 오가노이드인 GA077에 GLS 억제제(CB839) 또는 PHGDH 억제제(NCT503)을 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여 이를 병용하여 투여한 경우(combi)에 오가노이드 지름의 평균 값이 현저하게 감소하였다.
상기 결과를 통해 글루타민 결핍 및 GLS 억제제에 저항성이 존재하는 줄기-유사 아형, 즉 난치성 암의 경우에 PHGDH, SHMT 및 MTHFD2 억제제를 각각 병용해서 투여하는 경우 종양의 크기를 매우 효과적으로 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 암 세포의 증식을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 재발, 전이 및 항암제 저항성이 존재하여 치료가 어려운 난치성암 환자에서 암 세포의 증식 억제에 시너지 효과가 존재하여 매우 효과적으로 암을 치료할 수 있다.
서열번호 1: GLS
atgatgcggc tgcgaggctc ggggatgctg cgggacctgc tcctgcggtc gcccgccggc gtgagcgcga ctctgcggcg ggcacagccc ttggtcaccc tgtgccggcg tccccgaggc gggggacggc cggccgcggg cccggctgcc gccgcgcgac tccacccgtg gtggggcggg ggcggctggc cggcggagcc cctcgcgcgg ggcctgtcca gctctccttc ggagatcttg caggagctgg gcaaggggag cacgcatccg cagcccgggg tgtcgccacc cgctgccccg gcggcgcccg gccccaagga cggccccggg gagacggacg cgtttggcaa cagcgagggc aaagagctgg tggcctcagg tgaaaataaa ataaaacagg gtctgttacc tagcttggaa gatttgctgt tctatacaat tgctgaagga caagagaaaa tacctgttca taaatttatt acagcactca aatctacagg attgcgaacg tctgatccca ggttgaaaga gtgtatggat atgttaagat taactcttca aacaacatca gatggtgtca tgctagacaa agatcttttt aaaaaatgtg ttcagagcaa cattgttttg ttgacacaag catttagaag aaagtttgtg attcctgact ttatgtcttt tacctcacac attgatgagt tatatgaaag tgctaaaaag cagtctggag gaaaggttgc agattatatt cctcaactgg ccaaattcag tcccgatttg tggggtgtgt ctgtttgtac agtagatgga cagaggcatt ctactggaga taccaaagtt cccttctgtc ttcagtcctg tgtaaaacct ttgaaatatg ccattgctgt taatgatctt ggaactgaat atgtgcatcg atatgttgga aaagagccga gtggactaag attcaacaaa ctatttttga atgaagatga taaaccacat aatcctatgg taaatgctgg agcaattgtt gtgacttcac taataaagca aggagtaaat aatgctgaaa aatttgacta tgtcatgcag tttttgaata agatggctgg taatgaatat gttggattca gtaatgcaac gtttcagtct gaaagagaaa gtggagatcg aaattttgca ataggatatt acttaaaaga aaagaagtgt tttccagaag gcacagacat ggttggtata ttagacttct acttccagct gtgctccatt gaagtgactt gtgaatcagc cagtgtgatg gctgcgacac tggctaatgg tggtttctgc ccaattactg gtgaaagagt actgagccct gaagcagttc gaaatacatt gagtttgatg cattcctgtg gcatgtatga cttctcaggg cagtttgctt tccatgttgg tcttcctgca aaatctggag ttgctggggg cattctttta gttgtcccca atgttatggg tatgatgtgc tggtctcctc ctctggataa gatgggcaac agtgttaagg gaattcactt ttgtcacgat cttgtttctc tgtgtaattt ccataactat gataatttga gacactttgc aaaaaaactt gatcctcgaa gagaaggtgg tgatcaaagg gtaaagtcag tgataaatct tttgtttgct gcatatactg gagatgtgtc tgcacttcga agatttgctt tgtcagctat ggacatggaa cagcgggact atgattctag aacagcactc catgtagctg ctgcagaggg tcatgttgaa gttgttaaat ttttgctgga agcctgcaaa gtaaaccctt tccccaagga caggtggaat aacactccca tggatgaagc actgcacttt ggacaccatg atgtatttaa aattctccaa gaataccaag tccagtacac acctcaagga gattctgaca acgggaagga aaatcaaacc gtccataaga atcttgatgg attgttgtaa
서열번호 2: GLS
atgatgcggc tgcgaggctc ggggatgctg cgggacctgc tcctgcggtc gcccgccggc gtgagcgcga ctctgcggcg ggcacagccc ttggtcaccc tgtgccggcg tccccgaggc gggggacggc cggccgcggg cccggctgcc gccgcgcgac tccacccgtg gtggggcggg ggcggctggc cggcggagcc cctcgcgcgg ggcctgtcca gctctccttc ggagatcttg caggagctgg gcaaggggag cacgcatccg cagcccgggg tgtcgccacc cgctgccccg gcggcgcccg gccccaagga cggccccggg gagacggacg cgtttggcaa cagcgagggc aaagagctgg tggcctcagg tgaaaataaa ataaaacagg gtctgttacc tagcttggaa gatttgctgt tctatacaat tgctgaagga caagagaaaa tacctgttca taaatttatt acagcactca aatctacagg attgcgaacg tctgatccca ggttgaaaga gtgtatggat atgttaagat taactcttca aacaacatca gatggtgtca tgctagacaa agatcttttt aaaaaatgtg ttcagagcaa cattgttttg ttgacacaag catttagaag aaagtttgtg attcctgact ttatgtcttt tacctcacac attgatgagt tatatgaaag tgctaaaaag cagtctggag gaaaggttgc agattatatt cctcaactgg ccaaattcag tcccgatttg tggggtgtgt ctgtttgtac agtagatgga cagaggcatt ctactggaga taccaaagtt cccttctgtc ttcagtcctg tgtaaaacct ttgaaatatg ccattgctgt taatgatctt ggaactgaat atgtgcatcg atatgttgga aaagagccga gtggactaag attcaacaaa ctatttttga atgaagatga taaaccacat aatcctatgg taaatgctgg agcaattgtt gtgacttcac taataaagca aggagtaaat aatgctgaaa aatttgacta tgtcatgcag tttttgaata agatggctgg taatgaatat gttggattca gtaatgcaac gtttcagtct gaaagagaaa gtggagatcg aaattttgca ataggatatt acttaaaaga aaagaagtgt tttccagaag gcacagacat ggttggtata ttagacttct acttccagct gtgctccatt gaagtgactt gtgaatcagc cagtgtgatg gctgcgacac tggctaatgg tggtttctgc ccaattactg gtgaaagagt actgagccct gaagcagttc gaaatacatt gagtttgatg cattcctgtg gcatgtatga cttctcaggg cagtttgctt tccatgttgg tcttcctgca aaatctggag ttgctggggg cattctttta gttgtcccca atgttatggg tatgatgtgc tggtctcctc ctctggataa gatgggcaac agtgttaagg gaattcactt ttgtcacgat cttgtttctc tgtgtaattt ccataactat gataatttga gacactttgc aaaaaaactt gatcctcgaa gagaaggtgg tgatcaaagg cattcctttg gaccattgga ctatgaaagt ctccaacaag aacttgcttt aaaagagaca gtatggaaaa aagtgtcacc tgagtcaaat gaggacatct ctacaactgt agtatataga atggaaagtc tgggagagaa aagctaa
서열번호 3: PHGDH
atgg cttttgcaaa tctgcggaaa gtgctcatca gtgacagcct ggacccttgc tgccggaaga tcttgcaaga tggagggctg caggtggtgg aaaagcagaa ccttagcaaa gaggagctga tagcggagct gcaggactgt gaaggcctta ttgttcgctc tgccaccaag gtgaccgctg atgtcatcaa cgcagctgag aaactccagg tggtgggcag ggctggcaca ggtgtggaca atgtggatct ggaggccgca acaaggaagg gcatcttggt tatgaacacc cccaatggga acagcctcag tgccgcagaa ctcacttgtg gaatgatcat gtgcctggcc aggcagattc cccaggcgac ggcttcgatg aaggacggca aatgggagcg gaagaagttc atgggaacag agctgaatgg aaagaccctg ggaattcttg gcctgggcag gattgggaga gaggtagcta cccggatgca gtcctttggg atgaagacta tagggtatga ccccatcatt tccccagagg tctcggcctc ctttggtgtt cagcagctgc ccctggagga gatctggcct ctctgtgatt tcatcactgt gcacactcct ctcctgccct ccacgacagg cttgctgaat gacaacacct ttgcccagtg caagaagggg gtgcgtgtgg tgaactgtgc ccgtggaggg atcgtggacg aaggcgccct gctccgggcc ctgcagtctg gccagtgtgc cggggctgca ctggacgtgt ttacggaaga gccgccacgg gaccgggcct tggtggacca tgagaatgtc atcagctgtc cccacctggg tgccagcacc aaggaggctc agagccgctg tggggaggaa attgctgttc agttcgtgga catggtgaag gggaaatctc tcacgggggt tgtgaatgcc caggccctta ccagtgcctt ctctccacac accaagcctt ggattggtct ggcagaagct ctggggacac tgatgcgagc ctgggctggg tcccccaaag ggaccatcca ggtgataaca cagggaacat ccctgaagaa tgctgggaac tgcctaagcc ccgcagtcat tgtcggcctc ctgaaagagg cttccaagca ggcggatgtg aacttggtga acgctaagct gctggtgaaa gaggctggcc tcaatgtcac cacctcccac agccctgctg caccagggga gcaaggcttc ggggaatgcc tcctggccgt ggccctggca ggcgcccctt accaggctgt gggcttggtc caaggcacta cacctgtact gcaggggctc aatggagctg tcttcaggcc agaagtgcct ctccgcaggg acctgcccct gctcctattc cggactcaga cctctgaccc tgcaatgctg cctaccatga ttggcctcct ggcagaggca ggcgtgcggc tgctgtccta ccagacttca ctggtgtcag atggggagac ctggcacgtc atgggcatct cctccttgct gcccagcctg gaagcgtgga agcagcatgt gactgaagcc ttccagttcc acttctaa
서열번호 4: SHMT2
atgctgtactt ctctttgttt tgggcggctc ggcctctgca gagatgtggg cagctggtca ggatggccat tcgggctcag cacagcaacg cagcccagac tcagactggg gaagcaaaca ggggctggac aggccaggag agcctgtcgg acagtgatcc tgagatgtgg gagttgctgc agagggagaa ggacaggcag tgtcgtggcc tggagctcat tgcctcagag aacttctgca gccgagctgc gctggaggcc ctggggtcct gtctgaacaa caagtactcg gagggttatc ctggcaagag atactatggg ggagcagagg tggtggatga aattgagctg ctgtgccagc gccgggcctt ggaagccttt gacctggatc ctgcacagtg gggagtcaat gtccagccct actccgggtc cccagccaac ctggccgtct acacagccct tctgcaacct cacgaccgga tcatggggct ggacctgccc gatgggggcc atctcaccca cggctacatg tctgacgtca agcggatatc agccacgtcc atcttcttcg agtctatgcc ctataagctc aacctggcac tgactgctcg acttttccgg ccacggctca tcatagctgg caccagcgcc tatgctcgcc tcattgacta cgcccgcatg agagaggtgt gtgatgaagt caaagcacac ctgctggcag acatggccca catcagtggc ctggtggctg ccaaggtgat tccctcgcct ttcaagcacg cggacatcgt caccaccact actcacaaga ctcttcgagg ggccaggtca gggctcatct tctaccggaa aggggtgaag gctgtggacc ccaagactgg ccgggagatc ccttacacat ttgaggaccg aatcaacttt gccgtgttcc catccctgca ggggggcccc cacaatcatg ccattgctgc agtagctgtg gccctaaagc aggcctgcac ccccatgttc cgggagtact ccctgcaggt tctgaagaat gctcgggcca tggcagatgc cctgctagag cgaggctact cactggtatc aggtggtact gacaaccacc tggtgctggt ggacctgcgg cccaagggcc tggatggagc tcgggctgag cgggtgctag agcttgtatc catcactgcc aacaagaaca cctgtcctgg agaccgaagt gccatcacac cgggcggcct gcggcttggg gccccagcct taacttctcg acagttccgt gaggatgact tccggagagt tgtggacttt atagatgaag gggtcaacat tggcttagag gtgaagagca agactgccaa gctccaggat ttcaaatcct tcctgcttaa ggactcagaa acaagtcagc gtctggccaa cctcaggcaa cgggtggagc agtttgccag ggccttcccc atgcctggtt ttgatgagca ttga
서열번호 5: MTHFD2
atggctgcga cttctctaat gtctgctttg gctgcccggc tgctgcagcc cgcgcacagc tgctcccttc gccttcgccc tttccacctc gcggcagttc gaaatgaagc tgttgtcatt tctggaagga aactggccca gcagatcaag caggaagtgc ggcaggaggt agaagagtgg gtggcctcag gcaacaaacg gccacacctg agtgtgatcc tggttggcga gaatcctgca agtcactcct atgtcctcaa caaaaccagg gcagctgcag ttgtgggaat caacagtgag acaattatga aaccagcttc aatttcagag gaagaattgt tgaatttaat caataaactg aataatgatg ataatgtaga tggcctcctt gttcagttgc ctcttccaga gcatattgat gagagaagga tctgcaatgc tgtttctcca gacaaggatg ttgatggctt tcatgtaatt aatgtaggac gaatgtgttt ggatcagtat tccatgttac cggctactcc atggggtgtg tgggaaataa tcaagcgaac tggcattcca accctaggga agaatgtggt tgtggctgga aggtcaaaaa acgttggaat gcccattgca atgttactgc acacagatgg ggcgcatgaa cgtcccggag gtgatgccac tgttacaata tctcatcgat atactcccaa agagcagttg aagaaacata caattcttgc agatattgta atatctgctg caggtattcc aaatctgatc acagcagata tgatcaagga aggagcagca gtcattgatg tgggaataaa tagagttcac gatcctgtaa ctgccaaacc caagttggtt ggagatgtgg attttgaagg agtcagacaa aaagctgggt atatcactcc agttcctgga ggtgttggcc ccatgacagt ggcaatgcta atgaagaata ccattattgc tgcaaaaaag gtgctgaggc ttgaagagcg agaagtgctg aagtctaaag agcttggggt agccactaat taa

Claims (11)

  1. GLS(Glutaminase)유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
    PHGDH(Phosphoglycerate Dehydrogenase) 유전자, SHMT(Serine hydroxymethyltransferase) 유전자 및 MTHFD2 유전자(Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase (NADP+ Dependent) 2, Methenyltetrahydrofolate Cyclohydrolase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제는 화합물, 상기 유전자들의 mRNA에 특이적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제를 더 포함하는, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암은 EMT(Epithelial mesenchymal transition) 아형인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암은 위암, 갑상선암, 부갑상선암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  6. GLS유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
    PHGDH 유전자, SHMT 유전자 및 MTHFD2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제는 화합물, 역작용제(Inverse agonist), 길항제(antagonist) 및 상기 단백질들에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제를 더 포함하는, 약학 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 암은 EMT 분자 아형인, 약학 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 암은 위암, 갑상선암, 부갑상선암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  11. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GLS 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 증가된 경우, 하기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제; 또는 하기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 기능을 억제할 수 있는 제제를 병용하여 투여하는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 EMT 분자 아형 암 환자의 치료 방법에 대한 정보를 제공하는 방법.
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