JP2021500851A - モジュラー結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、１つ又は複数の標的分子に結合することが可能なモジュラータンパク質に関する。モジュラー結合タンパク質は、２つ又はそれ以上の反復ドメイン（例えば、テトラトリコペプチド反復ドメイン）；反復ドメインを連結する反復間ループ；及び１つ又は複数の結合ドメインを含む。各々の結合ドメインは、反復間ループ中に又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する。結合ドメインは、異種ペプチジル結合モチーフ（例えば、短い線形モチーフ（ＳＬｉＭ））を含みうる。種々の配置を有するモジュラー結合タンパク質並びにそれらの製造及び使用のための方法を提供する。

Description

分野
本発明はモジュラー結合タンパク質並びにそれらの製造及び使用に関する。

背景
医学、特に癌研究における優先分野は、「新薬の開発につながるような」プロテオームの拡大であり、これは現在は狭いクラスの分子標的に限定されている。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は全ての生物学的プロセスの基礎であり、潜在的な薬物標的の大部分を代表するが、それらは従来の小分子阻害には容易には従わない。縦列反復タンパク質の構造は、合理的な設計のための膨大な範囲を有する（非特許文献１〜３）。縦列反復タンパク質の重要な特徴は、ジスルフィド結合を必要としない比較的小さなサイズ、モジュール性、及び極めて高い安定性（従って組換え体産生）である。個々のコンセンサス設計された反復配列は自己適合性であり、任意の順序で組み立てることができる。従って、機能もモジュラーであり、これは、複数の機能が独立して設計され、単一の分子内に組み合わせ様式で組み入れることができることを意味する（特許文献１）。

新規反復タンパク質機能、例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ（非特許文献４）は、これらのタンパク質の天然型のＰＰＩ界面（即ち、標的についての伸長された高親和性結合界面を作製するための多くの反復単位に及ぶ）に基づいて開発されてきた。変異が、細胞質受容体ペルオキシン５のテトラトリコペプチド（ＴＰＲ）反復配列中の表面残基中に導入されている（非特許文献５）。ペルオキシン５へのペプチドリガンドの結合は、いくつかの異なるＴＰＲ反復中に位置する残基により媒介されることが示されている。ＴＰＲ含有タンパク質キネシン１と異なる積荷タンパク質との相互作用も報告されている（非特許文献６）。アンキリン反復タンパク質の特異性及び安定性は、アンキリン反復配列中への変異の導入を通じて改変されてきた（非特許文献７）。

国際公開第２０１７／１０６７２８号

Kobe & Kajava 2000 Longo & Blaber, 2014 Rowling et al., 2015 Tamaskovic et al., 2012 Sampathkumar et al. (2008) J. Mol. Biol., 381, 867-880 Zhu et al PLoS One 2012 7 3 e33943 Li et al (2006) Biochemistry 45 15168-15178

概要
本発明者らは、モジュラー骨格上にペプチジル結合モチーフ（例えば、短い線形モチーフ（ＳＬｉＭ））を呈示することにより、１つ又は複数の標的分子に結合することが可能なモジュラータンパク質を製造できることを見出した。これらのモジュラー結合タンパク質は、例えば、単又は多機能タンパク質治療薬として有用でありうる。

本発明の一局面は、
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメイン（各々の上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）
を含む、モジュラー結合タンパク質を提供する。

いくつかの好ましい実施形態では、モジュラー結合タンパク質は、第１の標的分子に結合する第１の結合ドメイン及び第２の標的分子に結合する第２の結合ドメインを含みうる。第１又は第２の標的分子の１つはＥ３ユビキチンリガーゼでありうる。

本発明の別の局面は、
結合ドメインをコードする第１の核酸を、反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメインをコードする第２の核酸中に挿入して、本明細書に記載するようなモジュラー結合タンパク質をコードするキメラ核酸を産生すること；及び
上記キメラ核酸を発現させて、モジュラー結合タンパク質を産生すること
を含む、モジュラー結合タンパク質を製造する方法を提供する。

本発明の別の局面は、
反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメインをコードする核酸を提供すること；及び
上記核酸中に、第１の標的分子に結合する第１の結合ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２の標的分子に結合する第２の結合ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を組み入れて、上記第１及び第２の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質をコードする核酸を生成すること（ここで、上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）；及び
核酸を発現させてタンパク質を産生すること
を含む、第１の標的分子及び第２の標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質を製造する方法を提供する。

いくつかの好ましい実施形態では、第１又は第２の標的分子の１つはＥ３ユビキチンリガーゼである。

本発明の別の局面は、モジュラー結合タンパク質を含むライブラリーであって、
当該ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質が、
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）前記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメイン（各々の上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）
を含み、
上記ライブラリー中の結合ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸残基が多様である、
ライブラリーを提供する。

本発明の別の局面は、モジュラー結合タンパク質の第１及び第２のサブライブラリーを含むライブラリーであって、第１及び第２のサブライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質が、
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの多様なアミノ酸残基を含む結合ドメイン
を含み、
第１のサブライブラリー中のモジュラー結合タンパク質中の結合ドメインが、第１の標的分子に結合し、かつ、（ｉ）反復間ループ、（ｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＮ末端、又は（ｉｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＣ末端のうちの１つに位置し、
第２のサブライブラリー中のモジュラー結合タンパク質中の結合ドメインが、第２の標的分子に結合し、（ｉ）反復間ループ、（ｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＮ末端、又は（ｉｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＣ末端のうちの別の所に位置する、
ライブラリーを提供する。

本発明の別の局面は、
（ａ） （ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメイン（各々の上記結合ドメインは、反復間ループ中に又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）
を含むモジュラー結合タンパク質の多様な集団をコードする核酸の集団を提供することであって、ここで、上記集団中の結合ドメインは多様である、及び
（ｂ）核酸の上記集団を発現させて多様な集団を産生し、それにより、モジュラー結合タンパク質のライブラリーを産生すること
を含む、モジュラー結合タンパク質のライブラリーを製造する方法を提供する。

本発明の別の局面は、
（ａ）モジュラー結合タンパク質のライブラリーを提供することであって、ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質は、
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）反復間ループ中に、タンパク質のＮ末端に、又はタンパク質のＣ末端に位置する結合ドメイン
を含み、ここで、上記ライブラリー中の結合ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸残基は多様である、
（ｂ）結合活性を呈示するモジュラー結合タンパク質についてライブラリーをスクリーニングすること、及び
（ｃ）結合活性を呈示する、ライブラリー中の１つ又は複数のモジュラー結合タンパク質を同定すること
を含む、ライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。

本発明の他の局面及び実施形態を、以下に、より詳細に記載する。

図１は、ループ又はヘリックス移植結合モチーフを含むコンセンサス設計されたテトラトリコペプチド（ＣＴＰＲ）タンパク質の熱安定性を示す：円二色性によりモニターした、２反復ＲＴＰＲ（リジン残基をアルギニン残基に置き換えたＣＴＰＲ）タンパク質の熱変性：ＲＴＰＲ２（ひし形）、ループ結合モジュールを含むＲＴＰＲ２（円）及びヘリックス結合モジュールを含むＲＴＰＲ２（四角）。全てのサンプルが、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ中で２０μMである。 図２は、増加数の結合モジュール（ブランクモジュールでの代替）を含む、増加長のＣＴＰＲタンパク質の熱安定性を示す：円二色性によりモニターした、タンキラーゼ結合配列を含む１、２、３、及び４つのループを含むＴＰＲタンパク質：１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４、３ＴＢＰ−ＣＴＰＲ６、４ＴＢＰ−ＣＴＰＲ８の熱変性曲線。全てのサンプルが、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ中で２０μMである。 図３にヘリックス移植の例を示す。図３Ａ（ｉ）は、ＫＲＡＳ（Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫）に結合したＳＯＳ１（ｓｏｎ−ｏｆ−ｓｅｖｅｎｌｅｓｓホモログ１）の結晶構造を示し（ＰＤＢ １ＮＶＵ、Margarit et al. Cell (2003)112(5):685-95）、（ｉｉ）は、ＣＴＰＲ２タンパク質のＮ末端でヘリックス上に移植されたＳＯＳ１ヘリックスを示す。ＳＯＳ−ＲＴＰＲ２のモデル化構造を示し、ヘリックスの配列は、重要なＫＲＡＳ結合残基（灰色）及びＣＴＰＲヘリックスとの界面を形成する残基（黒色）とともに与えている。（ｉｉｉ）は、ＫＲＡＳとの複合体中にあるＳＯＳ−ＴＰＲ２のモデル化構造を示す。 図３Ｂは、競合蛍光偏光（ＦＰ）により測定したＫＲＡＳへのＳＯＳ−ＴＰＲ２の結合を示す。ｍａｎｔ−ＧＴＰとＫＲＡＳの間の複合体を予め形成させ、次いで、０．１〜３００μMのＳＯＳ−ＲＴＰＲ２を複合体に滴定し、ＫＲＡＳからｍａｎｔ−ＧＴＰを置換してＦＰの減少をもたらした。ＥＣ５０は３μMである。 図４にヘリックス移植の別の例を示す。図４Ａは、ＣＴＰＲ２タンパク質のＣ末端でヘリックス上に移植されたｐ５３のＭｄｍ２結合ヘリックスを含むｐ５３−ＴＰＲ２との複合体中にあるＭｄｍ２（ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ２ホモログ）Ｎ末端ドメインのモデル化構造を示す。 図４Ｂは、ｐ５３−ＴＰＲ２とＭｄｍ２ Ｎ末端ドメインの間の相互作用のＩＴＣ分析を示す。Ｍｄｍ２のＮ末端ドメインを１０μMのｐ５３−ＴＰＲ２を含む細胞に滴定した。 図５は、単及び多価のループ移植ＣＴＰＲの例を示す。図５Ａは、一連のタンキラーゼ結合ループ移植ＣＴＰＲ２タンパク質（ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２）とタンキラーゼの基質結合ＡＲＣ４（アンキリン反復クラスター）ドメインの間の相互作用のＩＴＣ分析を示す。増加数の結合モジュール数に伴い結合親和性及び解離定数の両方の増強がある。 図５Ｂは、ｆｏｌｄｏｎ三量化ドメイン（Boudko et al 2002;Meier et al. 2004）との融合構築物として発現される多価ＴＢＰ−ＣＴＰＲタンパク質の未変性ゲル分析（トリス−グリシン緩衝液ｐＨ ８．０中の未変性ゲル、４０μMのタンパク質濃度を使用）を示す。１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４、及び４ＴＢＰ−ＣＴＰＲ８（全てがｆｏｌｄｏｎドメインを欠く）を精製し、単量体対照として泳動した。ｆｏｌｄｏｎドメインを有する構築物は、それらの単量体の対応物よりもずっと高い分子量で泳動する。 図６は、ＣＴＰＲタンパク質のループ中に移植されたｐ２７から由来する１０残基のＳｋｐ２結合配列を含むループ移植ＣＴＰＲの例を示す（ＣＴＰＲ−ｐ２７）。図６Ａは、ＨＡ−ＣＴＰＲ２−ｐ２７が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＦＬＡＧ−Ｓｋｐ２を同時に免疫沈降することができることを示す。 図６Ｂは、大腸菌で発現され、精製されたＴＰＲ５−ｐ２７によって、ｐ２７ユビキチン化がインビトロで阻害されることを示す。 図７は、ループ移植ＣＴＰＲの別の例を示す。図７Ａは、Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク質１）ＫＥＬＣＨドメインと、タンパク質Ｎｒｆ２（核内因子（赤血球由来２）様２）（（Ｎｒｆ−ＣＴＰＲ２）から由来するループ移植Ｋｅａｐ１結合配列を含むＣＴＰＲ２タンパク質の間での相互作用のＩＴＣ分析を示す（左）。結合は、ブランクＣＰＴＲ２タンパク質については観察されない（右）。 図７Ｂは、Ｎｒｆ−ＣＴＰＲ２の３つの変異体（Ｎｒｆ−ＣＴＰＲ２（ｉ）、Ｎｒｆ−ＣＴＰＲ２（ｉｉ）、Ｎｒｆ−ＣＴＰＲ２（ｉｉｉ））がＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＫｅａｐ１を同時に免疫沈降することができることを示す。 図８は、再表面化（アルギニン残基を表面部位に導入することによる）により達成されるＲＴＰＲの細胞内送達の生細胞画像化を示す。ＰＣ３（左）細胞及びＵ２ＯＳ（右）細胞を、１０μMのＦＩＴＣ標識再表面化ＴＢＰ−ＲＴＰＲ２と３７℃、５% ＣＯ_２で３時間にわたりインキュベートした。ＤＩＣ（微分干渉コントラスト）及び共焦点画像の重ね合わせ。細胞内蛍光も低濃度のタンパク質で観察された。 図９は、設計したヘテロ二機能性ＲＴＰＲによる標的タンパク質ベータ−カテニンの誘導性分解を示す。図９Ａは、ＨＡタグ付きベータ−カテニンプラスミド単独で、又はＨＡタグ付きベータ−カテニンプラスミドと２つの異なるヘテロ二機能性ＲＴＰＲプラスミド（ベータ−カテニン及びＥ３リガーゼＳＣＦ^Ｓｋｐ２に同時に結合するように設計したＬＲＨ１−ＴＰＲ−ｐ２７及びアキシン−ＴＰＲ−ｐ２７）の１つと一緒にトランスフェクトされた細胞におけるベータ−カテニンレベルを示す。 図９Ｂは、ベータ−カテニンに、及びＥ３リガーゼＳＣＦ^Ｓｋｐ２又はＥ３リガーゼＭｄｍ２のいずれかに同時に結合するように設計した異なるヘテロ二機能性ＲＴＰＲの存在におけるベータ−カテニンレベルの定量分析を示す。分析は、ImageJを使用してアクチンバンドに対して標準化されたＨＡタグ付きベータ−カテニンに対応する、ウェスタンブロットにより検出されたバンドのデンシトメトリーを使用して実施した。使用した陰性対照は、単機能ＴＰＲ又はブランク（非機能性）ＴＰＲであった。 図１０は、異なるモジュラー結合タンパク質フォーマットの例を示す。モジュラー結合タンパク質は以下を含みうる。Ｎ末端及びＣ末端にヘリックス標的結合ペプチド及びヘリックスＥ３結合ペプチドを伴う２つの反復ドメイン（図１０Ａ）。 Ｃ末端にヘリックスＥ３結合ペプチド及びＮ末端からの第１の反復間ループ中に標的結合ドメインを伴う３つの反復ドメイン（図１０Ｂ）。 Ｎ末端にヘリックス標的結合ペプチド及びＮ末端からの第２の反復間ループ中にＥ３結合ドメインを伴う３つの反復ドメイン（図１０Ｃ）。 Ｎ末端からの第１及び第３の反復間ループ中に標的結合ドメイン及びＥ３結合ドメインを伴う４つの反復ドメイン（図１０Ｄ）。 図１１は、交互の反復間ループ中に位置する４つの結合ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質の模式図を示す。結合部位は互いに９０°に整列されている。 図１２は、交互の反復間ループ中の結合ドメインが標的上の隣接エピトープに結合するように操作されたモジュラー結合タンパク質の模式図を示す。 図１３は、ＴＰＲ反復ドメイン、標的ベータ−カテニンに結合するように設計したＬＲＨ１由来結合ドメイン、及びＥ３ユビキチンリガーゼｍｄｍ２に結合するように設計したｐ５３由来Ｎ末端結合ドメインを含むヘテロ二機能性モジュラー結合タンパク質のモデル化構造を示す。 図１４は、モジュラー結合タンパク質を生成するための、反復ドメイン及び末端ヘリックス結合ドメインを含むモジュール並びに反復ドメイン及び反復間ループ結合ドメインを含むモジュールの組み合せ的な組み立ての模式図を示す。 図１５は、異なるモジュラー結合タンパク質フォーマットの例を示す。（ｉ）はブランクタンパク質を示す；（ｉｉ）は、１つ又は複数の反復間ループ中に挿入された結合ペプチドを示す。（ｉｉｉ）は、一方又は両方の末端でのヘリックス結合ペプチドを示す。（ｉｖ）は、ループ及びヘリックス結合ペプチドの組合せである。（ｖ）及び（ｖｉ）は、どのようにして多価性を達成することができるのかについての例を示す。 図１６は、以前のスクリーニングのラウンドで既に同定されたモジュールに加えて、多様な結合ドメインを伴うモジュールを含むモジュラー結合タンパク質の漸進的スクリーニングによるモジュラー結合タンパク質の組み立ての模式図を示す。 図１７は、Ｗｎｔシグナル伝達に対する、設計した多価タンキラーゼ結合ＴＰＲタンパク質の効果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Lipofectamine 2000を使用し、ＴＰＲをコードするプラスミドでトランスフェクトした。ＴＰＲタンパク質は、反復間ループ上に移植された１〜４コピーのタンキラーゼ結合ペプチド（ＴＢＰ）を含んでいた。例えば、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４は、第１のＴＰＲと第２のＴＰＲの間のループ上に移植された１つのＴＢＰ及び第３のＴＰＲと第４のＴＰＲの間の１つのＴＢＰを伴う４つのＴＰＲモジュールを含むタンパク質である。「ｆｏｌｄｏｎ」は、三量体ＴＰＲ−ｆｏｌｄｏｎ融合タンパク質を示す。 図１８は、リポソームカプセル化ＴＰＲタンパク質のサイズ及び電荷の特徴付けを示す。 図１９は、リポソームカプセル化による細胞中へのＴＰＲタンパク質の送達を示す。ＦＩＴＣ色素標識リポソームによって膜融合時に細胞膜が染色され（赤色パネル）、ＲＩＴＣ標識ＴＰＲタンパク質カーゴが次に細胞質中に送達される。緑色パネル及び赤緑の混合は、タンパク質が細胞に入り、細胞質中で拡散的に広がっていることを示す。 図２０は、リポソームカプセル化ＴＰＲタンパク質が、使用した濃度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して毒性がないことを示す。 図２１は、Ｗｎｔシグナル伝達に対する、設計したヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質（リポソームカプセル化により送達される）の効果を示す。ＴＰＲタンパク質は、ユビキチン化及びその後の分解のためにタンキラーゼを誘導するタンキラーゼ結合ペプチド及びＳＣＦ^Ｓｋｐ２結合ペプチドを含んだ。細胞をリポソームで２時間にわたり処理した。 図２２は、Ｗｎｔシグナル伝達に対する、設計したヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質（リポソームカプセル化により送達される）の効果を示す。ＴＰＲタンパク質は、ユビキチン化及びその後の分解のためのベータ−カテニンを誘導するために、ベータ−カテニン結合ペプチド及びＳＣＦ^Ｓｋｐ２結合ペプチドを含んだ。細胞を、３２μgのタンパク質をカプセル化したリポソームで、図に示す様々な時間（２〜８時間）にわたり処理した。 図２３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのＫＲＡＳレベルに対する、設計したヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質の効果を示す。ＴＰＲタンパク質は、ＫＲＡＳ（ＲＴＰＲの反復間ループ上に移植されたＫＢＬと呼ばれる非ヘリックスペプチド配列）及び別の反復間ループ上に移植されたｐ２７から由来するデグロンについての結合配列を含んだ。細胞を、示すように、５０ng又は５００ngのＴＰＲをコードするプラスミドで、及びＫＲＡＳプラスミド又は対照として空ベクターで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を溶解し、ＫＲＡＳレベルをウェスタンブロットにより評価した。濃い灰色は、単機能ＴＰＲプラスミド（デグロンだけを含む）でトランスフェクトした細胞である。 図２４は、ＣＭＡ（シャペロン媒介性オートファジー）経路に対して内因性ＫＲＡＳを標的化するヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質の効果を示す。ＴＰＲタンパク質は、ＫＲＡＳ（ｓｏｎ−ｏｆ−ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ−ｈｏｍｏｌｏｇ１（ＳＯＳ）から由来する移植ヘリックス、又はＲＴＰＲのループ中に呈示される非ヘリックスペプチド配列（「ＫＢＬ」と呼ぶ））についての結合配列を含み、構築物のＮ末端又はＣ末端で２つの異なるシャペロン媒介性オートファジーペプチド（「ＣＭＡ＿Ｑ」又は「ＣＭＡ＿Ｋ」と呼ぶ）を使用して分解のために標的化した。構築物又は空ベクター（薄い灰色）をＨＥＫ２９３Ｔ又はＤＬＤ１（結腸直腸癌細胞株）のいずれかに一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を溶解し、ＫＲＡＳレベルをウェスタンブロットにより評価した。空ベクター対照と比較してＫＲＡＳにおいて有意な低下をもたらした構築物を白色で示す。 図２５は、標的について結合親和性を最適化するために結合ドメインを反復間ループに接続するリンカー配列中の変動の例を示す。示した例はＮｒｆ−ＴＰＲ（Ｋｅａｐ１に結合するように設計したＴＰＲタンパク質）である（原特許出願の図７を参照のこと）。グリジン残基をリンカー中に導入して柔軟性を提供し、空間サンプリングを増加させた。このより柔軟なリンカー配列の導入によって、コンセンサス様リンカー配列と比較した場合、Ｎｒｆ−ＴＰＲタンパク質の結合親和性が増加することが見出された（「柔軟」と標識）。リンカー配列の電荷量を変えること（「荷電」と標識）、及びリンカー配列のアミノ酸組成を変化させることによりループの立体構造特性（プログラムＣＩＤＥＲ（Holehouse et al. Biophys. J. 112, 16-21 (2017)）の予測に基づく）を変えることによっても、Ｋｅａｐ１結合親和力に影響が及ぼされた。

詳細な説明
本発明は、複数の反復ドメインを含むモジュラー結合タンパク質に関する。これらの反復ドメインは、反復間ループによりポリペプチド鎖中で互いに連結されている。１つ又は複数の結合ドメインは、１つ又は複数の反復間ループ中に及び／又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端ヘリックス中に位置する。結合ドメインは同一の又は異なる標的分子に対するものでありうるが、モジュラー結合タンパク質は多機能及び／又は多価でありうる。移植された結合部位の幾何学的な呈示は、結合部位の位置並びに反復ドメインの数及び形状を調節することにより、正確かつ予測可能に調整されうる。本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、治療的及び診断的な適用の範囲において有用でありうる。

反復ドメインは、定義された二次構造を形成する３０から１００アミノ酸の反復構造エレメントである。複数の反復ドメインは、モジュラー様式で連続的に積み重なって安定なタンパク質を形成し、それは、例えば、ソレノイド構造又はトロイド構造を有しうる。反復ドメインは合成的でありうる、又は縦列反復タンパク質からの天然の反復、若しくはその変異体でありうる。

反復ドメインは、ソレノイド反復の構造を有しうる。ソレノイド反復の構造は当技術分野で周知である（Kobe & Kajava Trends in Biochemical Sciences 2000; 25(10):509-15）。例えば、反復ドメインは、α／α又はα／３１０（ヘリックス・ターン・ヘリックス又はｈｔｈ）構造、例えば、テトラトリコペプチド反復構造；α／α／α（ヘリックス・ターン・ヘリックス・ターン・ヘリックス又はｈｔｔｈ）構造、例えば、アルマジロ反復構造；β／β／α／α構造；α／β又は３１０／β構造、例えば、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）構造；β／β／β構造、例えば、ＩＧＦ１ＲＬ、ＨＰＲ又はＰｅｌＣ反復構造；或いはβ／β構造、例えば、セラリシン又はＥＧＦ反復構造を有しうる。

適切な反復ドメインは、アンキリン族（Ｐｆａｍ：ＣＬ０４６５）、例えばアンキリン（ＰＦ０００２３）などのドメイン（２つのベータ鎖及び２つのアルファヘリックスで構成される３０〜３４アミノ酸反復を含みうる）；ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）族（Ｐｆａｍ；ＣＬ００２２）、例えばＬＲＲ１（ＰＦ００５６０）などのドメイン（α／βホースシューホールドで構成される２０〜３０アミノ酸反復を含みうる）；Ｐｅｃリアーゼ様（ＣＬ０２６８）族、例えばｐｅｃリアーゼＣ（ＰＦ００５４４）などのドメイン（右巻きベータヘリックスを含みうる）；ベータ−Ｒｏｌｌ（ＣＬ０５９２）族、例えばヘモリシン型カルシウム結合反復（ＰＦ０００３５３）などのドメイン（Ｃａ^２＋イオンにより安定化された、各々が２つの短い鎖のベータ鎖ターンの超ヘリックスで作られたベータ−ロールを形成する短い反復単位（例、９−ｍｅｒ）を含みうる）； ＰＳＩ族（ＣＬ０６３０）、例えばトレフォイル（ＰＦ０００８８）などのドメイン；及びテトラトリコペプチド族（ＣＬ００２０）、例えばＴＰＲ−１（ＰＲ００５１５）などのドメイン（ヘリックス・ターン・ヘリックスで構成される２４から９０アミノ酸反復を含みうる）を含みうる。

適切な反復ドメインは、ＰＦＡＭデータベース（例えば、Finn et al Nucleic Acids Research (2016)Database Issue 44: D279-D285を参照のこと）を使用して同定されうる。

いくつかの好ましい実施形態では、反復ドメインは、α／αソレノイド反復ドメイン（例えばヘリックス・ターン・ヘリックスなど）の構造を有しうる。ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは１２〜４５アミノ酸の２つの逆平行αヘリックスを含む。

適切なヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは、テトラトリコペプチド様反復ドメインを含む。テトラトリコペプチド様反復は、ＴＰＲ族（ＣＬ００２０）のドメイン、例えば、及びＡｒｍドメイン（例えば、Ａｒｍａｄｉｌｌｏ；ＰＦ００５１４；Huber et al Cell 1997; 90: 871-882を参照のこと）、ＨＥＡＴドメイン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ、ＥＦ３、ＰＰ２Ａ、ＴＯＲ１；ＰＦ０２９８５；例えば、Groves et al . Cell. 96 (1): 99-110を参照のこと）、ＰＰＲドメイン（ペンタトリコペプチド反復ＰＦ０１５３５；例えば、Small (2000)Trends Biochem. Sci. 25 (2): 46-7を参照のこと）、ＴＡＬＥドメイン（ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター；ＰＦ０３３７７；例えば、Zhang et al Nature Biotechnology. 29 (2): 149-53を参照のこと）及びＴＰＲ１ドメイン（テトラトリコペプチド反復１；ＰＦ００５１５；例えば、Blatch et al BioEssays. 21 (11): 932-9を参照のこと）を含みうる。

他の適切なヘリックス・ターン・ヘリックスドメインは合成的、例えば、Brunette et al., Nature 2015 528 580-584に開示されているように、ＤＨＲ１からＤＨＲ８３でありうる。

いくつかの好ましい実施形態では、ヘリックス・ターン・ヘリックス骨格は、テトラトリコペプチド反復ドメイン（ＴＰＲ）（D’Andrea & Regan, 2003）又はその変異体でありうる。ＴＰＲ反復ドメインは天然又は合成ＴＰＲドメインを含みうる。適切なＴＰＲ反復ドメインは当技術分野で周知であり（例えば、Parmeggiani et al., J. Mol. Biol. 427 563-575を参照のこと）、以下のアミノ酸配列を有しうる：
ＡＥＡＷＹＮＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＱＫＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４
ここで、Ｘ_１−４は独立して任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ_１及びＸ_２はそれぞれＤ及びＰであり、又はこの配列の変異体でありうる。他のＴＰＲ反復ドメイン配列を以下の表４〜６に示す。

好ましいＴＰＲドメインは、ＣＴＰＲ、ＲＴＰＲａ、ＲＴＰＲｂ、及びＫＴＰＲｂドメイン、例えば、表４若しくは表６に示す配列を有するドメイン、又は表４若しくは表６に示す配列の変異体を含みうる。

いくつかの実施形態では、ＴＰＲ反復ドメインは、ヒトＴＰＲ反復ドメイン、好ましくは、血液中のヒトタンパク質からのＴＰＲ反復ドメインでありうる。ヒト血液からのＴＰＲ反復ドメインはインビボで低下した免疫原性を有しうる。適切なヒト血液中ＴＰＲ反復ドメインは、ＩＦＴ１、ＩＦＴ２、又はＩＦＴ３からの反復ドメインを含みうる。血漿中プロテオームデータベースにおいて同定されたヒト血液中反復ドメインの他の例を表５に示す。

適切なヒト血液中反復ドメインは、例えば、標準的な配列分析ツール（例、Altschul et al Nucleic Acids Res. 25:3389-3402l；Altschul et al FEBS J. 272:5101-5109）を使用し、ＴＰＲ反復ドメインと高い配列同一性を伴う配列を探索することにより、血漿中プロテオームデータベース（Nanjappa et al Nucl Acids Res 2014 Jan;42(Database issue):D959-65）から同定されうる。

本明細書中に示す参照反復ドメイン又は結合部位配列の変異体は、参照配列と少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、又は少なくとも９８%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。特定のアミノ酸配列の変異体は、１つのアミノ酸、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０又はそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、置換、又は欠失により、上に示す反復ドメインとは異なりうる。ＴＰＲ反復ドメインの好ましい変異体は、１つ又は複数の保存残基、例えば、７位のＬｅｕ、８位のＧｌｙ又はＡｌａ、１１位のＴｙｒ、２０位のＡｌａ、２７位のＡｌａ、２８位及び３２位のＬｅｕ又はＩｌｅ、並びに３０位のＰｒｏの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はより好ましくは全てを含みうる。

配列類似性及び同一性は、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin Package、Accelerys、米国サンディエゴ）を参照して一般に定義する。ＧＡＰでは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用し、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する２つの完全な配列を整列させる。一般的に、デフォルトパラメータをギャップ作成ペナルティ＝１２及びギャップＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1990)J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988)PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用）、若しくはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith and Waterman (1981)J. Mol Biol. 147: 195-197）、又はAltschul et al. (1990)（上記）のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用してもよく、一般的にはデフォルトパラメータを用いる。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Nucl. Acids Res. (1997)25 3389-3402）を使用してもよい。

配列比較は、本明細書中に記載する関連配列の全長にわたって行いうる。

例えば、反復ドメインは、疎水性結合ドメインの移植を促進させるために、１つ又は複数の点変異を含みうる。例えば、反復ドメイン中の芳香族残基を極性残基又は荷電残基で置換してもよい。適切な置換は、合理的な様式で、例えば、天然において共通の芳香族位置において見出される非芳香族残基を同定するために、反復ドメイン配列の隠れマルコフプロットを使用して同定してもよい。疎水性結合ドメインを移植するための適切なＴＰＲ反復ドメインは、以下のアミノ酸配列を有しうる：
ＡＥＡＷＹＮＧＮＡＹＲＱＧＤＹＱＲＡＩＥＹＹＱＲＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４
ここで、Ｘ_１−４は独立して任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ_１及びＸ_２はそれぞれＤ及びＰである。

いくつかの実施形態では、反復ドメイン中のリジン残基は、ユビキチン化及びその後の分解を防止するためにアルギニン残基により置換されうる。これは、モジュラー結合タンパク質が、例えば、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）においてＥ３ユビキチンリガーゼ結合ドメインを含む場合に特に有用でありうる。例えば、適切なＴＰＲ反復ドメインは、以下のアミノ酸配列を有しうる：
ＡＥＡＬＮＮＬＧＮＶＹＲＥＱＧＤＹＱＲＡＩＥＹＹＱＲＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４
ここで、Ｘ_１−４は独立して任意のアミノ酸であり、好ましくはＸ_１及びＸ_２はそれぞれＤ及びＰである。

好ましい実施形態では、モジュラー結合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を上回る反復ドメインを含みうる。好ましくは、モジュラー結合タンパク質は２から５の反復ドメインを含む。少ない反復ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質は、細胞透過性の増加を呈示しうる。例えば、２〜３反復ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質は、細胞内標的分子に結合する際に有用でありうる。より多くの反復ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質は、安定性及び機能性の増加を呈示しうる。例えば、４つ又はそれ以上の反復ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質は、細胞外標的分子に結合する際に有用でありうる。６又はそれ以上の反復ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質は、二価又は多価フォーマットで細胞外複合体を標的化する又は組み立てるための長い線形分子を産生する際に有用でありうる。

他の実施形態では、十分な安定性及び機能性が、Ｎ末端及びＣ末端結合ドメインを伴う単一反復ドメインにより与えられうる。例えば、モジュラー結合タンパク質は、以下を含みうる：
（ｉ）反復ドメイン、及び
（ｉｉ）反復ドメインのＮ末端及びＣ末端での結合ドメイン。

モジュラー結合タンパク質の反復ドメインは、結合活性を欠くことがある、即ち、モジュラー結合タンパク質の結合活性は、結合ドメインにより（反復ドメイン内の残基によってではない）媒介される。

結合ドメインは、標的分子に特異的に結合する連続したアミノ酸配列である。末端へリックス又は反復間ループ上に移植することが可能である適切な結合ドメインが当技術分野で周知であり、ライブラリー、抗原エピトープ、天然タンパク質−タンパク質相互作用（ヘリックス、伸長又はターン様）、及び短い線形モチーフ（ＳＬｉＭ）より選択されるペプチド配列を含む。ウイルスＳＬｉＭ（宿主機構を乗っ取る）は特に有用でありうる。なぜなら、それらは、高い結合親和性を呈示しうるからである（Davey et al (2011)Trends Biochem. Sci. 36,159-169）。

標的分子についての適切な結合ドメインは、例えば、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイを使用してライブラリーから選択してもよく、或いは、例えば、複合体の結晶構造又は相互作用を使用し、合理的なアプローチ又はコンピューター設計を使用して同定又は設計してもよい。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、標準配列分析ツール（例、Davey et al Nucleic Acids Res. 2011 Jul 1; 39(Web Server issue): W56-W60）を使用してアミノ酸配列中で同定されうる。

結合ドメインは、長さが５から２５アミノ酸、好ましくは８から１５アミノ酸でありうるが、いくつかの実施形態では、より長い結合ドメインを用いてもよい。

モジュラー結合タンパク質の結合ドメイン及び反復ドメインは異種性であり、即ち、結合ドメインは、天然タンパク質中の反復ドメインと会合せず、結合ドメイン及び反復ドメインは、組換え手段によりモジュラー結合タンパク質中で人工的に会合される。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、１からｎ＋１の結合ドメインを含みうるが、ここで、ｎはモジュラー結合タンパク質中の反復ドメインの数である。結合ドメインの数は、モジュラー結合タンパク質の要求される機能性及び結合価により決定される。例えば、１つの結合ドメインは、単機能性モジュラー結合タンパク質について適切でありうるが、２つ又はそれ以上の結合ドメインは、二機能性又は多機能性モジュラー結合タンパク質について適切でありうる。

モジュラー結合タンパク質は一価でありうる。標的分子は、一価モジュラー結合タンパク質中の単一結合ドメインにより結合されうる。モジュラー結合タンパク質は多価でありうる。標的分子は、多価モジュラー結合タンパク質中の同一の又は異なる結合ドメインの２つ又はそれ以上により結合されうる。

モジュラー結合タンパク質は単一特異性でありうる。単一特異性モジュラー結合タンパク質中の結合ドメインは全て、同じ標的分子、より好ましくは標的分子の同じ部位又はエピトープに結合しうる。

モジュラー結合タンパク質は多特異性でありうる。多特異性モジュラー結合タンパク質中の結合ドメインは、異なる標的分子に結合しうる。例えば、二特異性モジュラー結合タンパク質は、第１の標的分子に結合する１つ又は複数の結合ドメイン及び第２の標的分子に結合する１つ又は複数の結合ドメインを含みうるが、三特異性モジュラー結合タンパク質は、第１の標的分子に結合する１つ又は複数の結合ドメイン、第２の標的分子に結合する１つ又は複数の結合ドメイン、及び第３の標的分子に結合する１つ又は複数の結合ドメインを含みうる。

二特異性モジュラー結合タンパク質は、２つの異なる標的分子に同時に結合しうる。これは、第１及び第２の標的分子を近接させる際に有用でありうる。標的分子が異なる細胞上に位置する場合、モジュラー結合タンパク質への標的分子の同時結合によって細胞が近接し、例えば、細胞の相互作用が促される又は増強されうる。例えば、腫瘍特異性抗原及びＴ細胞抗原（例えばＣＤ３など）に結合するモジュラー結合タンパク質は、Ｔ細胞を腫瘍細胞に近接させる際に有用でありうる。標的分子が異なる生物学的経路からである場合、これは相乗効果を達成する際に、また耐性を最小化するために有用でありうる。

三特異性モジュラー結合タンパク質は、３つの異なる標的分子に同時に結合しうる。いくつかの実施形態では、標的分子の１つはＥ３ユビキチンリガーゼでありうる。例えば、三特異性モジュラー結合タンパク質は、第１の生物学的経路からの第１の標的分子及び第２の生物学的経路からの第２の標的分子、並びにＥ３ユビキチンリガーゼに結合しうる。これは相乗効果を達成する際に、また耐性を最小化するために有用である。

結合ドメインは、モジュラー結合タンパク質の反復間ループ中に位置しうる。

反復間結合ドメインは、５から２５のアミノ酸残基、好ましくは８から１５のアミノ酸を含みうる。しかし、ループ間結合ドメインのサイズに対する固有の制限はないため、２５アミノ酸残基を上回るより長い配列をいくつかの実施形態では使用しうる。

いくつかの実施形態では、非構造化結合ドメインは反復間ループ中に挿入されうる。

モジュラー結合タンパク質中の１つ又は複数、２つ又はそれ以上、３つ又はそれ以上、４つ又はそれ以上、或いは５つ又はそれ以上の反復間ループは、結合ドメインを含みうる。結合ドメインは、連続した反復間ループ上に位置してもよく、又はモジュラー結合タンパク質の反復間ループ中で異なる分布を有してもよい。例えば、結合ドメインを含む反復間ループは、結合ドメインを欠く１つ又は複数、２つ又はそれ以上、３つ又はそれ以上、或いは４つ又はそれ以上の反復間ループによりモジュラータンパク質中で分離されうる。

結合ドメインは、直接的に、或いは１つ又は複数の更なる残基又はリンカーを介して反復間ループに接続されうる。更なる残基又はリンカーは、例えば、標的分子に結合するために結合ドメインが立体構造の柔軟性を要求する場合、又は最小結合ドメインに隣接するアミノ酸残基が結合界面の微小環境に有利に影響する場合に有用でありうる。

更なる残基又はリンカーは、結合ドメインのＮ末端、結合ドメインのＣ末端、又は両方に位置付けられうる。例えば、結合ドメインを含む反復間ループの配列は、［Ｘ_１−ｉ］−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｚ］でありうるが、ここで、Ｘにより表示される各々の残基は、独立して任意のアミノ酸でありうる、及び、またＸにより表示される任意の他の残基と同じアミノ酸又は異なるアミノ酸でありうる、［Ｘ_１−ｎ］は結合ドメインであり、ｎは１から１００であり、［Ｘ_１−ｉ］はリンカーであり、及びｉは独立して１から１０の間の任意の数である。いくつかの実施形態では、Ｄは、リンカー［Ｘ_１−ｉ］の第１の位置で好まれうる、Ｐは、リンカー［Ｘ_１−ｉ］の第２の位置で好まれうる、Ｄは、リンカー［Ｘ_１−ｚ］の最後の位置で好まれうる、及び／又はＰは、リンカー［Ｘ_１−ｚ］の最後から２番目の位置で好まれうる。好ましい反復間ループ配列の例は、ＤＰ−［Ｘ_１−ｎ］−ＰＸ；ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｎ］−ＸＸＰＸ；ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｎ］−ＸＰＸＸ；ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｎ］−ＰＸＸＸ；ＰＸＸ−［Ｘ_１−ｉ］−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｉ］−ＸＸＰＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｉ］−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｉ］−ＸＰＸＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｉ］−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｉ］−ＰＸＸＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｉ］− ［Ｘ_１−ｎ］−ＸＰＸＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｉ］−［Ｘ_１−ｎ］−ＸＰＸＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｉ］−［Ｘ_１−ｎ］−ＸＰＸＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｉ］−ＸＸＰＸ、ＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｉ］−ＸＰＸＸ、及びＤＰＸＸ−［Ｘ_１−ｎ］−［Ｘ_１−ｉ］−ＰＸＸＸを含みうる。

結合ドメインを反復間ループに接続するために使用される残基又はリンカーの正確な配列は、結合ドメインに依存し、標準的な技術を使用して目的の任意の結合ドメインについて容易に決定されうる。例えば、小さな非疎水性アミノ酸（例えばグリシンなど）を使用し、例えば、結合ドメインが特定の立体構造を採用する必要がある、又はプロリン残基を使用して強剛性を増加させうる場合（例えば、結合ドメインが短い場合）、柔軟性及び増加した空間サンプリングを提供しうる。

いくつかの好ましい実施形態では、反復間結合ドメインは非疎水性でありうる。例えば、結合ドメイン中のアミノ酸の少なくとも４０%は荷電していてもよく（例、Ｄ、Ｅ、Ｒ、又はＫ）、又は極性であってもよい（例、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、又はＷ）。或いは、反復ドメインを改変して、疎水性結合ドメインを順応させてもよい（例えば、芳香族残基を荷電残基又は極性残基で置換することによる）。

結合ドメインは、モジュラー結合タンパク質の一方又は両方の末端に位置しうる。

いくつかの実施形態では、Ｎ末端又はＣ末端に位置する結合ドメインは、αヘリックス構造を含みうる、及び隣接反復ドメインに対して積み重なる半反復の全部又は一部（即ち、単一のαヘリックスの全部又は一部）を含みうる。末端結合ドメインのαヘリックスは隣接反復ドメインと安定化相互作用を作り、安定であり、折り畳まれている。αヘリックスを構造的に定義する位置のごく少数だけが、隣接反復ドメインとの正しい界面相互作用のために要求される。これらの位置の一部における残基が定義されているが（Ｎ末端αヘリックスについてはＴｙｒ（ｉ）−Ｉｌｅ（ｉ＋４）−Ｔｙｒ（ｉ＋７）−Ｌｅｕ（ｉ＋１１）及びＣ末端ヘリックスについてはＡｌａ（ｉ）−Ｌｅｕ（ｉ＋４）−Ａｌａ／Ｖａｌ（ｉ＋７））、しかし、αヘリックスの残りの位置は改変されてヘリックス結合ドメインを形成しうる。

ヘリックス結合ドメインはタンパク質のＮ末端に位置しうる。Ｎ末端結合ドメインはヘリックスであってもよく、配列Ｘｎ−（Ｘ）１５−Ｘ_１Ｘ_２ＸＸの全部又は一部、好ましくは配列Ｘｎ−ＸＹＸＸＸＩＸＸＹＸＸＸＬＸＸ−Ｘ_１Ｘ_２ＸＸの全部又は一部を含んでもよく、ここで、Ｘにより表示される各々の残基は独立して任意のアミノ酸であり、またＸにより表示される配列中の任意の他の残基と同じアミノ酸又は異なるアミノ酸であってもよく、Ｘ_１は独立して任意のアミノ酸、好ましくはＤであり、Ｘ_２は独立して任意のアミノ酸、好ましくはＰであり、ｎは０又は任意の数である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端結合ドメイン中のＹ、Ｉ、及び／又はＬ残基は、類似の特性を伴うアミノ酸残基で置換されうる（即ち、保存的置換）。

ヘリックス結合ドメインはタンパク質のＣ末端に位置しうる。Ｃ末端結合ドメインはヘリックスであってもよく、配列Ｘｎ−（Ｘ）１５−Ｘ_１Ｘ_２ＸＸの全部又は一部、好ましくは配列Ｘ_１Ｘ_２ＸＸ−ＸＸＡＸＸＸＬＸＸ［Ａ又はＶ］ＸＸＸＸＸ−Ｘ_ｎの全部又は一部を含んでもよく、ここで、Ｘは独立して任意のアミノ酸であり、またＸにより表示される配列中の任意の他の残基と同じアミノ酸又は異なるアミノ酸であってもよく、Ｘ_１は独立して任意のアミノ酸、好ましくはＤであり、Ｘ_２は独立して任意のアミノ酸、好ましくはＰであり、ｎは０又は任意の数である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端結合ドメイン中のＡ、Ｌ、及び／又はＶ残基は、類似の特性を伴うアミノ酸残基で置換されうる（即ち、保存的置換）。

末端結合ドメインの最小長は、標的分子に結合するヘリックスを形成するために要求される残基の数により決定される。末端結合ドメインの固有の最大長はなく、ｎは任意の数でもよい。

他の実施形態では、Ｎ末端又はＣ末端に位置する結合ドメインは、非ヘリックス構造を含みうる。例えば、絶対Ｎ末端又はＣ末端ドメインである結合ドメイン（例えば、末端のアミノ基又はカルボン酸基が結合相互作用を媒介するため）は、１つ又は複数の反復ドメインの開始又は終了に位置しうる。

いくつかの実施形態では、結合ドメイン中の１つ又は複数の位置は、多様でありうる、又はランダム化されうる。１つ又は複数の多様な又はランダム化された残基を含むモジュラー結合タンパク質は、以下に記載するようにライブラリーを形成しうる。

いくつかの実施形態では、Ｎ末端及びＣ末端結合ドメインは非疎水性でありうる。例えば、結合ドメイン中のアミノ酸の少なくとも２０%は荷電していてもよく（例、Ｄ、Ｅ、Ｒ、又はＫ）、又は極性であってもよい（例、Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、又はＷ）。或いは、反復ドメインのヘリックス・ターン・ヘリックス骨格は、例えば、疎水性結合ドメインを順応させるために、芳香族残基を荷電残基又は極性残基で置換することにより改変してもよい。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、任意の配置又は組合せにおいて結合ドメインを含みうる。例えば、結合ドメインは、Ｎ末端及びＣ末端の両方、並びに場合によりモジュラー結合タンパク質の１つ又は複数の反復間ループに；Ｎ末端、及び場合によりモジュラー結合タンパク質の１つ又は複数のループに；Ｃ末端、及び場合によりモジュラー結合タンパク質の１つ又は複数のループに；或いはモジュラー結合タンパク質の１つ又は複数の反復間ループ中に位置してもよい。

モジュラー結合タンパク質内の結合ドメインの位置は、例えば、２つの標的分子を互いに提示するための（例、Ｅ３ユビキチンリガーゼへの基質提示のための）最適な配置を同定するためのモデル化を使用した合理的な設計により；及び／又は、例えば、標的分子の最適な相互作用を与える配置を同定するための、結合ドメインの異なる配置を伴うモジュラー結合タンパク質の集団を使用したスクリーニングにより決定されうる。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質のための適切な標的分子は、生体高分子（例えばタンパク質など）を含む。標的分子は、受容体、酵素、抗原、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、内在性膜タンパク質、転写因子、転写調節因子、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、又は任意の他の目的の標的でありうる。小分子（例えばＰＰＩなど）で標的化するのが困難なタンパク質、神経変性疾患において蓄積するタンパク質、及び疾患状態（例えば癌など）において過剰発現するタンパク質は、特に適切な標的分子でありうる。標的分子は、αシヌクレイン；βアミロイド；タウ；スーパーオキシドジスムターゼ；ハンチンチン；βカテニン；ＫＲＡＳ；スーパーエンハンサー及び他の種類の転写因子の成分、例えばＮ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｎｏｔｃｈ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＥＷＳ−ＦＬＩ１（ユーイング肉腫フレンド白血病組込み１）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ性白血病タンパク質１）、及びＳｏｘ２（（性決定領域Ｙ）−ボックス２）など；タンキラーゼ；ホスファターゼ、例えばＰＰ２Ａなど；エピジェネティックなライター、リーダー、及びイレーザー、例えばヒストンデアセチラーゼ及びヒストンメチルトランスフェラーゼなど；ＢＲＤ４及び他のブロモドメインタンパク質；並びにキナーゼ、例えばＰＬＫ１（ｐｏｌｏ様キナーゼ１）、ｃ−ＡＢＬ（Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、及びＢＣＲ（ブレークポイントクラスタ領域）−ＡＢＬなどを含みうる。

いくつかの実施形態では、モジュラー結合タンパク質は、例えば、その活性を阻害若しくはそれに拮抗する、又は別の分子に結合することにより、或いはユビキチン化及びプロテアソーム分解のために又はオートファジーを介した分解のためにそれにタグ付けすることにより、標的分子の生物学的活性を中和しうる。他の実施形態では、モジュラー結合タンパク質は、標的分子の生物学的活性を活性化しうる。

いくつかの実施形態では、標的分子はβカテニンでありうる。βカテニンに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、アキシン（例、ＧＡＹＰＥＹＩＬＤＩＨＶＹＲＶＱＬＥＬ及びその変異体）、Ｂｃｌ−９（例、ＳＱＥＱＬＥＨＲＹＲＳＬＩＴＬＹＤＩＱＬＭＬ及びその変異体）、ＴＣＦ７Ｌ２（例、ＱＥＬＧＤＮＤＥＬＭＨＦＳＹＥＳＴＱＤ及びその変異体）、ＩＣＡＴ（例、ＹＡＹＱＲＡＩＶＥＹＭＬＲＬＭＳ及びその変異体）、ＬＲＨ−１（例、ＹＥＱＡＩＡＡＹＬＤＡＬＭＣ及びその変異体）、又はＡＰＣ（例、ＳＣＳＥＥＬＥＡＬＥＡＬＥＬＤＥ及びその変異体）から由来するβカテニン結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＫＲＡＳでありうる。ＫＲＡＳに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＳＯＳ−１からのＫＲＡＳ結合ドメイン（例、ＦＥＧＩＡＬＴＮＹＬＫＡＬＥＧ及びその変異体）及びファージディスプレイにより同定されるＫＲＡＳ結合ドメイン（例えば、Sakamoto et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. (2017)484 605-611を参照のこと）を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はタンキラーゼでありうる。タンキラーゼに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、Ａｘｉｎからのタンキラーゼ結合ドメイン（例、ＲＥＡＧＤＧＥＥ及びＨＬＱＲＥＡＧＤＧＥＥＦＲＳ又はその変異体）を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＥＷＳ−ＦＬＩ１でありうる。ＥＷＳ−ＦＬＩ１に特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＥＳＡＰ１ペプチドＴＭＲＧＫＫＫＲＴＲＡＮ及びその変異体を含む。他の適切な配列はファージディスプレイにより同定されうる（例えば、Erkizan et al. Cell Cycle (2011)10, 3397-408を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、標的分子はＡｕｒｏｒａ−Ａでありうる。Ａｕｒｏｒａ−Ａに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＴＰＸ２からのＡｕｒｏｒａ−Ａ結合配列、例えばＳＹＳＹＤＡＰＳＤＦＩＮＦＳＳ（Bayliss et al. Mol. Cell (2003)12, 851-62）など、及びＮ−ｍｙｃからのＡｕｒｏｒａ−Ａ結合配列、例えばＮ−ｍｙｃの残基１９−４７又は６１−８９（例えば、Richards et al. PNAS (2016)113, 13726-31を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＮ−Ｍｙｃ又はＣ−Ｍｙｃでありうる。Ｎ−ｍｙｃ又はＣ−ｍｙｃに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、Ａｕｒｏｒａ−Ａからのヘリックス結合配列（例えば、Richards et al. PNAS (2016)113, 13726-31を参照のこと）を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＷＤＲ５（ＷＤ反復含有タンパク質５）でありうる。
ＷＤＲ５に特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＭＬＬ１（混合系統白血病タンパク質１）のＷＤＲ５相互作用モチーフ（ＷＩＮ）（例えば、Song & Kingston J. Biol. Chem. (2008)283, 35258-64；Patel et al. J. Biol. Chem. (2008)283, 32158-61を参照のこと）、例えばＥＰＰＬＮＰＨＧＳＡＲＡＥＶＨＬＲＫＳ及びその変異体を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＢＲＤ４又はブロモドメインタンパク質でありうる。
ＢＲＤ４に特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ヒストンタンパク質リガンドから由来する配列を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）でありうる。ＨＤＡＣに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＳＭＲＴ及び、ＨＤＡＣを特異的な転写調節複合体に動員する他のタンパク質から由来する結合配列、又はヒストンタンパク質から由来する結合配列（例えば、Watson et al. Nat. Comm. (2016)7, 11262；Dowling et al. Biochem. (2008)47, 13554-63を参照のこと）を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＮｏｔｃｈでありうる。Ｎｏｔｃｈに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＭＡＭＬ１（マスターマインド様タンパク質１）のＮ末端からの結合配列、例えば、ＳＡＶＭＥＲＬＲＲＲＩＥＬＣＲＲＨＨＳＴ及びその変異体（例えば、Moellering et al. Nature (2009)462, 182-8を参照のこと）を含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＣｄｋ（サイクリン依存性キナーゼ）でありうる。Ｃｄｋに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、基質ベースのペプチド、例えば、サイクリンＡから由来するＣｄｋ２配列、例えばＴＹＴＫＫＱＶＬＲＭＥＨＬＶＬＫＶＬＴＦＤＬ及びその変異体（例えば、Gondeau et al. J. Biol. Chem. (2005)280, 13793-800；Mendoza et al. Cancer Res. (2003)63, 1020-4を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＰＬＫ１（ｐｏｌｏ様キナーゼ１）でありうる。ＰＬＫ１に特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、基質結合ＰＢＤ（ｐｏｌｏボックスドメイン）に結合する最適化された基質由来配列、例えばＭＡＧＰＭＱＳＥＰＬＭＧＡＫＫ及びその変異体などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はタウでありうる。タウに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、アルファ−及びベータ−チューブリンから由来するタウ結合配列、例えばＫＤＹＥＥＶＧＶＤＳＶＥ及びＹＱＱＹＱＤＡＴＡＤＥＱＧ並びにそれらの変異体（例えば、Maccioni et al. EMBO J. (1988)7, 1957-63；Rivas et al. PNAS (1988)85, 6092-6）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＢＣＲ−ＡＢＬでありうる。ＢＣＲ−ＡＢＬに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、最適化された基質由来配列、例えばＥＡＩＹＡＡＰＦＡＫＫＫ及びその変異体などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＰＰ２Ａ（プロテインホスファターゼ２Ａ）でありうる。ＰＰ２Ａに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、Ｂ５６調節サブユニットに結合する配列、例えばＬＱＴＩＱＥＥＥ及びその変異体（例えばHetz et al. Mol. Cell (2016), 63 686-95を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＥＥＤ（胚性外胚葉発生）でありうる。ＥＥＤに特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、補因子ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー）からのヘリックス結合配列、例えばＦＳＳＮＲＱＫＩＬＥＲＴＥＩＬＮＱＥＷＫＱＲＲＩＱＰＶ及びその変異体（例えばKim et al. Nat. Chem. Biol. (2013)9, 643-50を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＭＣＬ−１（骨髄性白血病細胞分化誘導タンパク質）でありうる。ＭＣＬ−１に特異的に結合する適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、ＢＣＬ２からの配列、例えばＫＡＬＥＴＬＲＲＶＧＤＧＶＱＲＮＨＥＴＡＦ及びその変異体（例えば、Stewart et al. Nat. Chem. Biol. (2010)6, 595-601を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＲＡＳでありうる。適切なＲＡＳ結合ドメインは当技術分野で周知であり、ファージディスプレイにより同定されるＲＡＳ結合ペプチド、例えばＲＲＲＲＣＰＬＹＩＳＹＤＰＶＣＲＲＲＲ及びその変異体（例えば、Sakamoto et al. BBRC (2017)484, 605-11を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）でありうる。適切なＧＳＫ３結合ドメインは当技術分野で周知であり、基質競合結合配列、例えばＫＥＡＰＰＡＰＰＱＤＰ、ＬＳＲＲＰＤＹＲ、ＲＲＥＧＧＭＳＲＰＡＤＶＤＧ、及びＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＳＱＤＥＤＥＥＥ並びにそれらの変異体（例えば、Ilouz et al. J. Biol. Chem. 281 (2006), 30621-30630. Plotkin et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. (2003)305, 974-980を参照のこと）などを含む。

いくつかの実施形態では、標的分子はＣｔＢＰ（Ｃ末端結合タンパク質）でありうる。適切なＣｔＢＰ結合ドメインは当技術分野で周知であり、環状ペプチドライブラリーのスクリーニングから同定された配列、例えばＳＧＷＴＶＶＲＭＹ及びその変異体（例えば、Birts et al. Chem. Sci. (2013)4, 3046-57を参照のこと）などを含む。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質において使用されうる標的分子のための適切な結合ドメインの例を表２及び７に示す。

いくつかの好ましい実施形態では、本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼのための結合ドメインを含みうる。適切なＥ３ユビキチンリガーゼの例は、ＭＤＭ２、ＳＣＦ^Ｓｋｐ２、ＢＴＢ−ＣＵＬ３−ＲＢＸ１、ＡＰＣ／Ｃ、ＳＩＡＨ、ＣＨＩＰ、Ｃｕｌ４−ＤＤＢ１、ＳＣＦファミリー、ベータ−ＴｒＣＰ、Ｆｂｗ７、及びＦｂｘ４を含む。

Ｅ３ユビキチンリガーゼ（デグロン）のための適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり、５から２０のアミノ酸でありうる。例えば、ＭＤＭ２のための適切な結合ドメインは、ｐ５３からの結合ドメイン（例、ＦＡＡＹＷＮＬＬＳＡＹＧ）及びその変異体を含みうる。ＳＣＦ^Ｓｋｐ２のための適切な結合ドメインは、ｐ２７からの結合ドメイン（例、ＡＧＳＮＥＱＥＰＫＫＲＳ）及びその変異体を含みうる。Ｋｅａｐ１−Ｃｕｌ３のための適切な結合ドメインは、Ｎｒｆ２からの結合ドメイン（例、ＤＰＥＴＧＥＬ）又はその変異体を含みうる。ＳＰＯＰ−Ｃｕｌ３のための適切な結合ドメインは、Ｐｕｃからの結合ドメイン（例、ＬＡＣＤＥＶＴＳＴＴＳＳＳＴＡ）又はその変異体を含みうる。ＡＰＣ／Ｃのための適切な結合ドメインは、ＡＢＢＡ（例、ＳＬＳＳＡＦＨＶＦＥＤＧＮＫＥＮ）、ＫＥＮ（例、ＳＥＤＫＥＮＶＰＰ）、若しくはＤＢＯＸ（例、ＰＲＬＰＬＧＤＶＳＮＮ）と呼ばれるデグロン又はその変異体を含みうる。いくつかの例では、これらのデグロンの組み合わせを使用してもよい（いくつかの天然基質において見出される二部分又は三部分デグロンを模倣する）。ＳＩＡＨのための適切な結合ドメインは、ＰＨＹＬからの結合ドメイン（例、ＬＲＰＶＡＭＶＲＰＴＶ）又はその変異体を含みうる。ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）のための適切な結合ドメインは、ペプチド配列、例えばＡＳＲＭＥＥＶＤ（Ｈｓｐ９０のＣ末端から）及びＧＰＴＩＥＥＶＤ（Ｈｓｐ７０のＣ末端から）又はその変異体などを含みうる。ベータ−ＴｒＣＰのための適切な結合ドメインは、デグロン配列モチーフ（ホスホミメティックアミノ酸を含む）、例えばＤＤＧＹＦＤ又はその変異体などを含みうる。Ｆｂｘ４のための適切な結合ドメインは、ＴＲＦ１から由来する配列、例えばＭＰＩＦＷＫＡＨＲＭＳＫＭＧＴＧ又はその変異体（例えば、Lee et al. Chembiochem (2013)14, 445-451を参照のこと）などを含みうる。ＦＢｗ７のための適切な結合ドメインは、デグロン配列モチーフ（ホスホミメティックアミノ酸を含む）、例えばＬＰＳＧＬＬＥＰＰＱＤなどを含みうる。ＤＤＢ１−Ｃｕｌ４のための適切な結合ドメインは、ＨＢｘ（Ｂ型肝炎ウイルスＸタンパク質）及び他のウイルスからの同様のタンパク質から、並びにヘリカルモチーフ、例えばＩＬＰＫＶＬＨＫＲＴＬＧＬ、ＮＦＶＳＷＨＡＮＲＱＬＧＭ、ＮＴＶＥＹＦＴＳＱＱＶＴＧ、及びＮＩＴＲＤＬＩＲＲＱＩＫＥ（例えば、Li et al. Nat. Struct. Mol. Biol. (2010)17, 105-111を参照のこと）などを含むＤＣＡＦ（ＤＤＢ１−ＣＵＬ４関連因子）から由来する配列を含みうる。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質において使用されうるＥ３ユビキチンリガーゼのための適切な結合ドメインの例を表３に示す。

Ｅ３ユビキチンリガーゼのための結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質はまた、標的分子のための結合ドメインを含みうる。標的分子及びＥ３ユビキチンリガーゼの両方へのモジュラー結合タンパク質の結合によって、標的分子はＥ３ユビキチンリガーゼによりユビキチン化されうる。ユビキチン化された標的分子は次に、プロテアソームにより分解される。これによって、モジュラー結合タンパク質によるタンパク質分解のために分子の特異的標的化が可能になる。標的タンパク質のユビキチン化及びそれに続く分解は、標的タンパク質及びユビキチンリガーゼに同時に結合するヘテロ二機能性小分子（ＰＲＯＴＡＣ；キメラを標的化するタンパク質分解）について示されている（例えば、Bondeson et al. Nat. Chem. Biol. 2015；Deshaies 2015; Lu et al. 2015を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、モジュラー結合タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼによるユビキチン化を回避するように、リジン残基を欠きうる。Ｅ３ユビキチンリガーゼ及び標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質の例を表１及び８に示す。

適切なモジュラー結合タンパク質は、標的タンパク質（例えばβカテニンなど）に結合するＮ末端結合ドメイン、及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＣ末端結合ドメインを含みうる。例えば、Ｎ末端結合ドメインは、Ｂｃｌ９から由来するβカテニン結合配列でありうる、及びＣ末端結合ドメインは、ｐ５３から由来するＭｄｍ２結合配列でありうる。或いは、モジュラー結合タンパク質は、標的タンパク質（例えばβカテニンなど）に結合するＣ末端結合ドメイン、及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＮ末端結合ドメインを含みうる（図１０Ａを参照のこと）。

別の適切なモジュラー結合タンパク質は、３つの反復ドメイン、標的タンパク質（例えばβカテニンなど）に結合する反復間ループ中に位置する結合ドメイン、及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＣ末端結合ドメインを含みうる。例えば、反復間ループ結合ドメインは、ＡＰＣ（大腸腺腫症）のリン酸化領域から由来しうるが、Ｃ末端結合ドメインは、ｐ５３から由来するＭｄｍ２結合配列でありうる。或いは、モジュラー結合タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する反復間ループ中に位置する結合ドメイン、及び標的タンパク質（例えばβカテニンなど）に結合するＣ末端結合ドメインを含みうる（図１０Ｂを参照のこと）。

別の適切なモジュラー結合タンパク質は、３つの反復ドメイン、標的タンパク質（例えばβカテニンなど）に結合するＮ末端結合ドメイン、及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するモジュール間ループ中に位置する結合ドメインを含みうる。例えば、Ｎ末端結合ドメインは、ＬＲＨ１（肝受容体ホモログ１）から由来するβカテニン結合配列でありうる、及びモジュール間ループ結合ドメインは、ｐ２７のＳｋｐ２標的化領域から由来する配列でありうる。或いは、モジュラー結合タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合するＮ末端結合ドメイン及び標的タンパク質（例えばβカテニンなど）に結合するモジュール間ループ中に位置する結合ドメインを含みうる（図１０Ｃを参照のこと）。

別の適切なモジュラー結合タンパク質は、４つの反復ドメイン、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する反復間ループ中に位置する第１の結合ドメイン、及び標的分子に結合する反復間ループ中に位置する第２の結合ドメインを含みうる。第１及び第２の反復間ループは、結合ドメインを欠く反復間ループにより分離されうる。例えば、第１の結合ドメインは、Ｎ末端からの第１の反復間ループの反復間ループ中に位置しうる、及び第２の結合ドメインは、Ｎ末端からの第３の反復間ループ中に位置しうる、又はその逆でもよい。

いくつかの好ましい実施形態では、本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、表８に示すアミノ酸又はその変異体を含みうる。

他の好ましい実施形態では、本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、標的選択的オートファジー経路、例えばシャペロン媒介性オートファジー（ＣＭＡ）などの成分に結合する結合ドメインを含みうる。モジュラー結合タンパク質及びそれに結合した標的分子は、このように、オートファジー経路により認識され、標的分子はその後に分解される。ＣＭＡ経路の適切な成分は、７０kDaの熱ショック同族タンパク質（ｈｓｃ７０、ＨＳＰＡ８、遺伝子ＩＤ：３３１２）を含む。適切な結合ドメインは当技術分野で周知であり（Dice J.F. (1990). Trends Biochem. Sci. 15, 305-309）、本明細書中に記載するように、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（ＫＦＥＲＱ）及びその変異体、例えばＣＭＡ＿Ｑ及びＣＭＡ＿Ｋなどを含む。これらのドメインは、異種タンパク質をオートファジー経路に標的化することが可能であることが実証されている（Fan, X.et al; (2014)Nature Neuroscience 17, 471-480）。

反復ドメイン及び結合ドメインに加えて、モジュラー結合タンパク質は、追加の機能性を付与する１つ又は複数の追加のドメイン、例えば標的化ドメイン、細胞内輸送ドメイン、安定化ドメイン、又はオリゴマー化ドメインなどを更に含みうる。追加のドメインは、例えば、モジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に又は反復の間のループ中に位置しうる。

標的化ドメインは、インビボで特定の目標にモジュラー結合タンパク質を標的化する際に有用でありうる（例えば標的組織、細胞、膜、又は細胞内オルガネラなど）。適切な標的化ドメインはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

細胞内輸送ドメインによって、例えば、細胞内標的分子に結合するために、細胞膜を通じた細胞中へのモジュラー結合タンパク質の通過が促進されうる。適切な細胞内移行ドメインは当技術分野で周知であり（例えば、Bechara et al FEBS Letters 587 1 (2013)1693-1702を参照のこと）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えばアンテナペディア（４３−５８）、Ｔａｔ（４８−６０）、カドヘリン（６１５−６３２）、及びポリ−Ａｒｇなどを含む

安定化ドメインは、インビボでモジュラー結合タンパク質の半減期を増加させうる。適切な安定化ドメインは当技術分野で周知であり、Ｆｃドメイン、血清アルブミン、非構造化ペプチド（例えばＸＴＥＮ^９８又はＰＡＳ^９９など）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

オリゴマー化ドメインによって、例えば、多価標的に対する結合活性を増加させるために、多タンパク質複合体の形成が促進されうる。適切なオリゴマー化ドメインは「ｆｏｌｄｏｎドメイン」（Ｔ４フィブリチンの天然三量体化ドメイン）（Meier et al., J. Mol. Biol. (2004)344(4):1051-69）を含む。

反復ドメイン、結合ドメイン、及び場合により１つ又は複数の追加のドメインに加えて、モジュラー結合タンパク質は、細胞傷害剤若しくは治療剤及び／又は検出可能な標識を更に含みうる。

適切な細胞傷害剤は、例えば、化学療法薬剤（例えばメトトレキセート、アウリスタチンアドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、オゾガマイシン、クロラムブシル、メイタンシン、エムタンシン、ダウノルビシン、又は他の挿入薬剤など）、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素（例えばジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αアマニチン、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ツブリシン、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びトリコテセン並びにこれらのいずれかの断片を含む。適切な細胞傷害剤はまた、放射性同位元素を含みうる。種々の放射性核種が、放射性複合体モジュラー結合タンパク質の産生のために利用可能である（限定しないが、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１３１Ｉｎ、^１０５Ｒｈ、^１５３Ｓｍ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、及び^２１２Ｂｉを含む）。モジュラー結合タンパク質及び１つ又は複数の小さな抗癌分子、例えば、毒素（例えばカリケアミシン、メイタンシノイド、トリコテン、及びＣＣ１０６５など）の複合体、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体を使用してもよい。

適切な治療剤は、サイトカイン（例、ＩＬ２、ＩＬ１２、及びＴＮＦ）、ケモカイン、凝固促進因子（例、組織因子）、酵素、リポソーム、及び免疫応答因子を含みうる。

検出可能な標識は、シグナルを産生する又はシグナルを産生するように誘導することができる任意の分子（蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤、又は光増感剤を含むがこれらに限定しない）でありうる。このように、結合は、蛍光又は発光、放射能、酵素活性、又は光吸収を検出することにより検出及び／又は測定されうる。検出可能な標識は、当技術分野で公知の従来の化学を使用し、モジュラー結合タンパク質に付着させてもよい。

標識が、外部手段、例えば目視検査、電磁放射、熱、及び化学試薬により検出可能なシグナルを産生することができる多数の方法がある。標識はまた、モジュラー結合タンパク質に結合する別の特異的結合メンバーに、又は支持体に結合することができる。

いくつかの実施形態では、モジュラー結合タンパク質は、例えばスクリーニング及び選択のために、粒子又は分子複合体（例えば細胞、リボソーム、又はファージなど）上での呈示のために形成されうる。適切なモジュラー結合タンパク質は、粒子又は分子複合体上での呈示を促進するために、呈示部分（例えばファージコートタンパク質など）を更に含みうる。ファージコートタンパク質はモジュラー結合タンパク質に融合又は共有結合させてもよい。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、組換え手段により産生されうる。例えば、本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質を産生する方法は、モジュラー結合タンパク質をコードする核酸を発現することを含みうる。核酸を宿主細胞中で発現させてもよく、発現されたモジュラー結合タンパク質を次に細胞培養物から単離及び／又は精製してもよい。

いくつかの実施形態では、方法は以下を含みうる；
結合ドメインをコードする第１の核酸を、２つ又はそれ以上の反復ドメインをコードする第２の核酸中に挿入し、反復間ループ中に又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質をコードするキメラ核酸を産生すること；及び
上記キメラ核酸を発現させてモジュラー結合タンパク質を産生すること。

本明細書中に記載する方法は、第１の標的分子及び第２の標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質を産生する際に有用でありうる。例えば、方法は以下を含みうる；
反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメイン（各反復ドメイン）をコードする核酸を提供すること；及び
上記核酸中に、第１の標的分子に結合する第１の結合ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列、及び第２の標的分子に結合する第２の結合ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を組み入れて、上記第１及び第２の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質をコードする核酸を生成すること、ここで、上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置し；及び
核酸を発現させて上記タンパク質を産生すること。

第１及び第２の標的分子の１つは、Ｅ３ユビキチンリガーゼでありうる。例えば、方法は以下を含みうる；
反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメイン（各反復ドメイン）をコードする核酸を提供すること；及び
上記核酸中に、標的分子に結合する第１の結合ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合する第２の結合ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を組み入れて、上記第１及び第２の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質をコードする核酸を生成すること、ここで、上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置し；及び
核酸を発現させて上記タンパク質を産生すること。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質をコードする単離核酸を、本発明の一局面として提供する。核酸は、発現ベクター内に含まれうる。適切なベクターは、適当な調節配列（プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び他の配列を含む）を適宜含むように選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞における核酸の発現を駆動するための適当な調節配列を含む。発現系において異種核酸コード配列の発現を駆動するための適切な調節配列は、当技術分野で周知であり、構成プロモーター、例えば、ウイルスプロモーター（例えばＣＭＶ又はＳＶ４０など）、及び誘導プロモーター（例えばＴｅｔ−ｏｎ制御プロモーターなど）を含む。ベクターはまた、細菌宿主（例えば大腸菌など）及び／又は真核細胞においてその選択並びに複製及び発現を可能にする配列（例えば複製起点及び選択マーカーなど）を含みうる。

細胞培養中での組換えモジュラー結合タンパク質の発現並びにその後のそれらの単離及び精製のために適切である多くの技術及びプロトコールが、当技術分野で公知である（例えば、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992；Recombinant Gene Expression Protocols Ed RS Tuan (Mar 1997)Humana Press Inc.を参照のこと）。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質をコードする核酸又はそのような核酸を含むベクターを含む宿主細胞も、本発明の一局面として提供する。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母、及びバキュロウイルス系、並びにトランスジェニック植物及び動物を含む。原核細胞におけるタンパク質の発現は当技術分野において十分に確立されている。一般的な細菌宿主は大腸菌である。モジュラー結合タンパク質はまた、培養中での真核細胞中での発現により産生されうる。モジュラー結合タンパク質の発現のために当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞、ＹＢ ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎細胞（例、ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト胚性網膜細胞（例、ＰｅｒＣ６細胞）、及び多くの他を含む。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質を使用し、ライブラリーを産生してもよい。適切なライブラリーを、特異的結合活性を伴うモジュラー結合タンパク質を同定及び単離するためにスクリーニングしてもよい。ライブラリーはモジュラー結合タンパク質を含みうるが、各々のモジュラー結合タンパク質は、
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメイン（各々の上記結合ドメインは反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）、
を含み、
ここで、上記ライブラリー中の結合ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸残基は多様である。

ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質の結合ドメインにおける１つ又は複数の位置の残基は、多様でありうる又はランダム化されうる、即ち、１つ又は複数の位置に位置する残基は、集団中の異なる分子において異なりうる。

例えば、ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端でのヘリックス結合ドメイン内の１から１２の位置は、多様でありうる又はランダム化されうる。また、結合ドメインの非制約Ｘ_ｎ配列は追加の多様性を含みうる。或いは、又は加えて、ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質の反復間結合ドメイン内の１〜ｎの位置は、多様でありうる又はランダム化されうる（ここで、ｎは結合ドメイン中のアミノ酸の数である）。

いくつかの実施形態では、結合ドメインは個々にスクリーニングされうる、及びモジュラー結合タンパク質は、異なるラウンドのスクリーニングにおいて同定された結合ドメインを含む反復ドメインから連続的に組み立てられうる。例えば、ライブラリーはモジュラー結合タンパク質を含みうるが、ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質は、
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質において同じアミノ酸配列を有する１つ又は複数の定常結合ドメイン、及びライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質において異なるアミノ酸配列を有する１つ又は複数の多様な結合ドメイン、好ましくは１つの多様な結合ドメイン
を含み、
上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する。

上記ライブラリー中の多様な結合ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸残基は多様でありうる。

ライブラリーは、以下を含む方法により産生されうる：
（ａ）以下を含むモジュラー結合タンパク質の多様な集団をコードする核酸の集団を提供すること
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメイン（各々の前記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）、
ここで、各々のモジュラー結合タンパク質中の結合ドメインの１つ又は複数の残基は、前記ライブラリーにおいて多様であり、
（ｂ）前記核酸集団を発現させて多様な集団を産生し、それにより、モジュラー結合タンパク質のライブラリーを産生すること。

核酸集団は、多様な結合ドメインをコードする核酸の第１の集団を、反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメインをコードする核酸の第２の集団中に挿入することを含む方法により提供してもよく、場合により、ここで、第１及び第２の核酸は、１０までのアミノ酸のリンカーをコードする核酸の第３の集団と連結させる。

核酸は、ベクター、例えば、発現ベクター中に含まれうる。適切なベクターは、ファージベースの又はファージミドベースのファージディスプレイベクターを含む。

核酸は、無細胞インビトロ翻訳系（例えばリボソームなど）を使用し、細胞中又は溶液中で組換え的に発現されてライブラリーを生成しうる。いくつかの好ましい実施形態では、ライブラリーは、モジュラー結合タンパク質の機能によってそのコード核酸の単離が可能になる系において発現される。例えば、モジュラー結合タンパク質は、粒子又は分子複合体上で呈示され、選択及び／又はスクリーニングが可能になりうる。いくつかの実施形態では、モジュラー結合タンパク質のライブラリーは、ビーズ、無細胞リボソーム、バクテリオファージ、原核細胞、又は真核細胞上に呈示されうる。或いは、コードされるモジュラー結合タンパク質は乳剤内で提示されうるが、ここで、モジュラー結合タンパク質の活性によって同定可能な変化が起こる。或いは、コードされるモジュラー結合タンパク質は細胞内又はその近傍で発現されうるが、ここで、モジュラー結合タンパク質の活性によって表現型変化又はレポーター遺伝子の発現における変化が起こる。

好ましくは、核酸は原核細胞（例えば大腸菌など）において発現される。例えば、核酸を原核細胞において発現させ、バクテリオファージの表面上に呈示される組換え結合タンパク質のライブラリーを生成しうる。適切な原核生物ファージディスプレイ系は当技術分野で周知であり、例えば、Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC;2001、ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５、国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５９６９１０８号明細書、米国特許第５５６５３３２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８７２２１５号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６２９１６５０号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書、米国特許第６５２１４０４号明細書において記載されている。ファージディスプレイシステムによって、大きなライブラリー、例えば、１０^８又はそれ以上、１０^９又はそれ以上、或いは１０^１０又はそれ以上のメンバーを伴うライブラリーの産生が可能になる。

他の実施形態では、細胞は真核細胞（例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞など）でありうる。

本明細書中に記載する多様な配列は、集団のメンバー間で変動する配列であり、即ち、配列は集団の異なるメンバーにおいて異なる。多様な配列はランダムでありうる、即ち、多様な配列中の各々の位置でのアミノ酸又はヌクレオチドの同一性は、天然アミノ酸又はヌクレオチドの完全なセット又はそのサブセットからランダムに選択されうる。多様性は、当業者に公知のアプローチ、例えばオリゴヌクレオチド特異的変異誘発２２（Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Russell et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press、及びその中の参考文献）などを使用して結合ドメイン中に導入しうる。

多様な配列は近接していてもよく、又は結合ドメイン内に分布していてもよい。多様な配列を結合ドメイン中に導入するための適切な方法は、当技術分野において十分に記載されており、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Russell et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press及びその中の参考文献を参照のこと）を含む。例えば、多様化は、ヌクレオチドの部分的若しくは完全なランダム化を使用して作製された、又はコドン混合物を使用して、例えば、トリヌクレオチドを使用して作製されたオリゴヌクレオチド混合物を使用して生成されうる。或いは、多様なオリゴヌクレオチドの集団を、ハイスループット遺伝子合成方法を使用して合成し、組み合わせて、正確に定義され、制御された結合ドメインの集団を作製してもよい。或いは、本来のヌクレオチドが優勢であり、代わりのヌクレオチドがより低い頻度で存在する「ドーピング」技術を使用してもよい。

好ましくは、ライブラリーはディスプレイライブラリーである。ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質は、粒子、又は分子複合体、例えばビーズなど（例えば、プラスチックビーズ又は樹脂ビーズ）、リボソーム、細胞又はウイルス（複製可能な遺伝子パッケージ、例えば酵母、細菌、又はバクテリオファージ（例、Ｆｄ、Ｍ１３、又はＴ７）粒子、ウイルス、細胞（哺乳動物細胞を含む）、又は共有結合、リボソーム、若しくは他のインビトロディスプレイ系を含む）などの表面上に呈示してもよい。ディスプレイライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリーなど）の産生のための技術は当技術分野で周知である。各々の粒子又は分子複合体は、粒子により呈示されるモジュラー結合タンパク質をコードする核酸を含みうる。

いくつかの好ましい実施形態では、ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質は、ウイルス粒子（例えばバクテリオファージなど）の表面上に呈示される。ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質は、呈示を促進させるためにファージコートタンパク質を更に含んでもよい。各々のウイルス粒子は、粒子上に呈示されたモジュラー結合タンパク質をコードする核酸を含みうる。適切なウイルス粒子は、バクテリオファージ、例えば、繊維状バクテリオファージ（例えばＭ１３及びＦｄなど）を含む。

ファージディスプレイライブラリーの生成及びスクリーニングのための適切な方法は、当技術分野で周知である。ファージディスプレイは、例えば、国際公開第９２／０１０４７号並びに米国特許第５９６９１０８号明細書、米国特許第５５６５３３２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８７２２１５号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第５９６２２５５号明細書、米国特許第６１４０４７１号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第６２２５４４７号明細書、米国特許第６２９１６５０号明細書、米国特許第６４９２１６０号明細書、及び米国特許第６５２１４０４号明細書に記載されている。

本明細書中に記載するライブラリーは、結合活性、例えば、標的分子への結合を呈示するモジュラー結合タンパク質についてスクリーニングされうる。結合は、直接的に測定してもよく、又は結合からもたらされるアゴニスト作用若しくはアンタゴニスト効果を通じて間接的に測定してもよい。スクリーニングの方法は以下を含みうる；
（ａ）モジュラー結合タンパク質のライブラリーを提供することであって、ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質は以下を含む；
（ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
（ｉｉ）上記反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
（ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメイン（各々の上記結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する）、
ここで、１つ又は複数の結合ドメインの１つ又は複数の残基は、上記ライブラリーにおいて多様である、
（ｂ）結合活性を呈示するモジュラー結合タンパク質についてライブラリーをスクリーニングすること、及び
（ｃ）結合活性を呈示するライブラリー中の１つ又は複数のモジュラー結合タンパク質を同定すること。

いくつかの実施形態では、ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質は、少なくとも１つの多様なアミノ酸残基を伴う１つの結合ドメインを含みうる。好都合なことに、ライブラリー中のモジュラー結合タンパク質は２つの反復ドメインを含む。ライブラリーは、標的分子に結合する結合ドメインについてスクリーニングされうる。この様式で同定された結合ドメインをモジュラー様式で組み立て、多特異性である、本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質を生成することができる。

例えば、第１のライブラリーは、第１の標的分子に結合する第１の結合ドメインについてスクリーニングされうるが、第２のライブラリーは、第２の標的分子に結合する第２の結合ドメインについてスクリーニングされうる。第１及び第２の結合ドメインは、モジュラー結合タンパク質中の異なる位置にある、即ち、それらは両方がＮ末端結合ドメイン、Ｃ末端結合ドメイン、又は反復間結合ドメインであるわけではない。第１及び第２の標的分子にそれぞれ結合する第１及び第２の結合ドメインは、第１及び第２のライブラリーから同定される。同定された第１及び第２の結合ドメインを次に、第１及び第２の標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質中に組み入れてもよい。

第１のライブラリーは、少なくとも１つの多様なアミノ酸残基を有する第１の多様な結合ドメインを伴うライブラリー中にモジュラー結合タンパク質を含みうる。標的分子に結合する第１の結合ドメインは、第１のライブラリーから同定されうる。第１の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質を使用し、少なくとも１つの多様なアミノ酸残基を有する第２の多様な結合ドメインを含む第２のライブラリーを生成しうる。例えば、第１のライブラリーからのモジュラー結合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端での第２の多様な結合ドメインの付加により、或いは反復間ループにおける第２の多様な結合ドメインを含む追加の反復ドメインの付加により改変されうる。同一の又は異なる標的分子に結合する第２の結合ドメインは、第２のライブラリーから同定されうる。第１及び第２の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質を使用し、少なくとも１つの多様なアミノ酸残基を有する第３の多様な結合ドメインを含む第３のライブラリーを生成しうる。例えば、第２のライブラリーからのモジュラー結合タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端での第３の多様な結合ドメインの付加により、或いは反復間ループにおける第３の多様な結合ドメインを含む追加の反復ドメインの付加により改変されうる。第１及び／又は第２の結合ドメインと同じ標的分子又は異なる標的分子に結合する第３の結合ドメインが、第３のライブラリーから同定されうる。この方法において、複数の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質を連続的に組み立てうる（図１６を参照のこと）。

各々の結合ドメインについての別々のライブラリーの使用によって、各々の結合ドメインの多数の異なる変異体を独立してスクリーニングし、次に組み合わせることが可能になる。例えば、１０^８〜１０^１２の第１の結合ドメイン変異体のファージライブラリーを、１０^８〜１０^１２の第２の結合ドメイン変異体のファージライブラリー及び１０^８〜１０^１２の第３の結合ドメイン変異体のファージライブラリーと組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、１０^８〜１０^１２のＮ末端結合ドメイン変異体のファージライブラリーを、１０^８〜１０^１２のＣ末端結合ドメイン変異体のファージライブラリーと組み合わせて、Ｎ末端及びＣ末端結合ドメインを伴うモジュラー結合タンパク質を生成してもよい。

結合活性についてライブラリーをスクリーニングすることは、標的分子を提供すること、及び標的に結合するライブラリーのメンバーを同定又は選択すること、或いは細胞の集団においてライブラリーを発現すること、及び細胞表現型を誘発するライブラリーのメンバーを同定又は選択することを含みうる。１つ又は複数の同定又は選択されたモジュラー結合タンパク質を回収し、さらなる選択及び／又はスクリーニングに供してもよい。

結合は、任意の適切な技術により決定されうる。例えば、ライブラリーは、標的分子がライブラリーと相互作用し、その少なくとも１つのメンバーと結合反応複合体を形成するために十分な時間にわたり結合条件下で標的分子と接触されうる。結合条件は、標的分子の公知の天然結合機能に適合する条件である。それらの適合条件は、標的分子の生物学的活性を維持し、それにより、その事前に選択された結合相互作用に関与する分子の能力を維持する緩衝液、ｐＨ、及び温度条件である。典型的には、それらの条件は、目的の標的分子に通常関連付けられるｐＨ及びイオン強度の水性生理溶液を含む。

ライブラリーは、不均一又は均一の混合物の形態で標的分子と接触されうる。このように、ライブラリーのメンバーは固相中にあり、標的分子は液相中に存在しうる。或いは、標的分子は固相中にあり、ライブラリーのメンバーは液相中に存在しうる。更に、ライブラリーメンバー及び標的分子の両方が液相中にありうる。

標的分子へのモジュラー結合タンパク質の結合を決定するための適切な方法は、当技術分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ビーズベースの結合アッセイ（例、ビオチン化標的分子と併用したストレプトアビジンコーティングビーズ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、及び親和性クロマトグラフィーを使用する）を含む。或いは、生化学的又は細胞ベースのアッセイ、例えば蛍光ベース又は発光ベースのレポーターアッセイなどを用いてもよい。

複数ラウンドのパンニングを、結合活性を呈示するモジュラー結合タンパク質を同定するために実施してもよい。例えば、結合活性について濃縮されたモジュラー結合タンパク質の集団を、ライブラリーから回収又は単離し、結合活性について１つ又は複数のさらなるラウンドのスクリーニングに供し、１つ又はさらなる濃縮集団を産生しうる。結合活性を呈示するモジュラー結合タンパク質は、１つ又は複数のさらなる濃縮集団から同定され、回収され、単離され、及び／又は更に研究されうる。

いくつかの実施形態では、結合は、標的分子（例えばリガンド、受容体、又は酵素など）へのモジュラー結合タンパク質の結合からもたらされるアゴニズム又はアンタゴニズムを検出することにより決定されうる。例えば、ライブラリーは、レポーター細胞においてライブラリーを発現させ、変化した遺伝子発現又は表現型を伴う１つ又は複数のレポーター細胞を同定することによりスクリーニングされうる。モジュラー結合タンパク質の組換え集団をスクリーニングするための適切な機能的スクリーニング技術は、当技術分野で周知である。

結合活性を呈示するモジュラー結合タンパク質を更に操作し、活性若しくは特性を改善する、又は新たな活性若しくは特性、例えば、結合特性（例えば親和性及び／又は特異性など）、インビボ特性（例えば溶解性、血漿中安定性、又は細胞浸透性など）、又は活性（例えば標的分子の中和の増加及び／又は標的分子の特異的活性若しくは分析特性の調節など）を導入してもよい。モジュラー結合タンパク質はまた、安定性、溶解性、又は発現レベルを改善するように操作してもよい。

さらなるラウンドのスクリーニングを用いて、改善された特性又は活性を呈示するモジュラー結合タンパク質を同定しうる。例えば、標的分子に結合するために濃縮されたモジュラー結合タンパク質の集団をライブラリーから回収又は単離し、改善された又は新たな特性又は活性について１つ又は複数のさらなるラウンドのスクリーニングに供し、１つ又はさらなる濃縮集団を産生してもよい。場合により、これを１つ又は複数の回数繰り返してもよい。改善された特性又は活性を呈示するモジュラー結合タンパク質は、１つ又は複数のさらなる濃縮集団から同定、回収、単離、及び／又は更に研究されうる。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、例えば細胞中への送達のために、リポソーム中にカプセル化してもよい。好ましいリポソームは融合性リポソームを含む。適切な融合性リポソームは、カチオン性脂質、例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）など、及び中性脂質、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などを、例えば、１：１（ｗ／ｗ）の比率で含みうる。場合により、リポソームは、芳香族脂質、例えば、ＤｉＯ（３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩）、ＤｉＲ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−シンダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トリエチルアンモニウム塩）（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−ＤＨＰＥ）、及び２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２ＨＰＣ）などを、例えば、中性脂質及びカチオン性脂質に対して０．１：１：１（ｗ／ｗ）の比率で更に含みうる。リポソーム中でのタンパク質のカプセル化及び細胞中へのそれらの送達のための適切な技術は、当技術分野において確立されている（例えば、Kube et al Langmuir (2017)33 1051-1059；Kolasinac et al (2018)Int. J. Mol. Sci. 19 346を参照のこと）。

本明細書中に記載する方法は、本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質又はコード核酸を、脂質の溶液、例えば、有機溶媒（例えばクロロホルムなど）中で混合し、溶媒を蒸発させ、モジュラー結合タンパク質をカプセル化するリポソームを産生することを含みうる。本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質を含むリポソームカプセル化を、本発明の一局面として提供する。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質又はコード核酸は、医薬的に許容可能な賦形剤と混合してもよい。本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質又は核酸及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を、本発明の一局面として提供する。

本明細書中で使用する用語「医薬的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比と釣り合った、被験体（例、ヒト）の組織と接触した使用のために適切な化合物、材料、組成物、及び／又は投与形態に関する。各々の担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な医薬テキスト、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990において見出すことができる。

医薬組成物は、単位投与形態において便利に提示してもよく、薬学の分野で周知の任意の方法により調製してもよい。そのような方法は、モジュラー結合タンパク質を、１つ又は複数の補助成分を構成しうる担体と会合させる工程を含む。一般的に、医薬組成物は、活性化合物を液体担体若しくは微粉固体担体又はその両方と均一に及び密に会合させ、次に必要な場合には産物を成形することにより調製される。

医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、乳剤、エリキシル、シロップ、錠剤、トローチ剤、顆粒、散剤、カプセル、カシェ剤、丸剤、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、スプレー、ミスト、泡、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、又はエアロゾルの形態でありうる。

モジュラー結合タンパク質、コード核酸、又はモジュラー結合タンパク質若しくはコード核酸を含む医薬組成物は、全身的／末梢的に、又は所望の作用部位（経口（例、摂取による）；局所（例、経皮、鼻腔内、眼、頬、舌下などを含む）；肺（例、例えば、エアロゾルを使用し、例えば、口又は鼻を通じた吸入又は通気治療による）；直腸；膣；例えば、注射（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、及び胸骨内を含む）による非経口；例えば、皮下又は筋肉内でのデポの移植による、を含むが、これらに限定しない）を問わず、任意の便利な投与経路により被験体に投与されうる。

経口投与（例、摂取による）のための適切な医薬組成物は、別々の単位、例えばカプセル、カシェ剤、又は錠剤（各々が所定量の活性化合物を含む）として；粉剤又は顆粒として；水溶液又は非水溶液中の溶液又は懸濁液として；又は水中油型液体乳剤若しくは油中水型液体乳剤として；ボーラスとして；舐剤として；ペーストとして提示されうる。

非経口投与（例、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む、注射により）のための適切な医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、静菌剤、及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含みうる、水性及び非水性の等張の、発熱物質を含まない滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性無菌懸濁液、並びに化合物を細胞、組織、又は器官に標的化するように設計したリポソーム又は他の微小粒子系を含む。そのような製剤中での使用のための適切な等張性溶剤の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸リンゲル注射液を含む。典型的には、溶液中での活性化合物の濃度は、約１ng/ml〜約１０μg/ml、例えば、約１０ng/ml〜約１μg/mlである。製剤は、単位用量又は複数用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアル中で提示してもよく、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加だけを要求するフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。

モジュラー結合タンパク質の適当な投与量は、患者ごとに変動しうることが理解されよう。最適な投与量を決定することには、一般的に、投与の任意のリスク又は有害な副作用に対して診断上の利益のレベルの釣り合いをとることが含まれる。選択される投与量レベルは、種々の因子（投与経路、投与時間、造影剤の排泄速度、要求される造影剤の量、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、並びに患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、及び既往歴を含むが、これらに限定しない）に依存する。造影剤の量及び投与経路は、最終的には医師の判断によるが、一般的に、投与量は、部位、例えば腫瘍、目的の組織、又は全身などで造影剤の濃度を達成することであり、それによって、実質的に害になる又は有害な副作用を起こすことなく画像化することが可能となる。

インビボでの投与は、連続的又は断続的に（例、適当な間隔において分割用量で）、一回用量でもたらすことができる。投与の最も効果的な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療のために使用される製剤、治療の目的、治療されている標的細胞、及び治療されている被験体で変動しうる。単回又は複数回の投与は、医師により選択された用量レベル及びパターンで行うことができる。

本明細書中に記載するモジュラー結合タンパク質は、ヒト又は動物の被験体（例、ヒト）における診断又は処置の方法において使用されうる。標的分子のためのモジュラー結合タンパク質は、標的分子に関連付けられる障害を処置するために使用されうる。

本発明の他の局面及び実施形態は、用語「含む」を用語「からなる」により置き換えた、上に記載する局面及び実施形態、並びに用語「含む」を用語「から本質的になる」に置き換えた、上に記載する局面及び実施形態を提供する。

本願は、文脈によって他の意味が求められない限り、上に記載する局面及び実施形態のいずれかの互いの全ての組み合わせを開示することを理解すべきである。同様に、本願は、文脈によって他の意味が求められない限り、単独で又は他の局面のいずれかと一緒に、好ましい及び／又は任意の特徴の全ての組み合わせを開示する。

上の実施形態の改変、さらなる実施形態及びそれらの改変は、本開示を読めば当業者に明らかであり、そのようなものとして、これらは本発明の範囲内にある。

本明細書中に言及する全ての文書及び配列データベース項目は、全ての目的のために、それらの全体を参照により本明細書中に援用する。

「及び／又は」は、本明細書中で使用する場合、他の特徴又は構成要素を伴う又は伴わない２つの特定の特徴又は構成要素の各々の特定の開示と見なすべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の特定の開示として、ちょうど各々が本明細書中で個別に示されているかのように見なすべきである。

本発明の特定の局面及び実施形態を、これから、例として、及び上に記載する図面を参照して説明する。

実験
１．方法
１．１ 大腸菌からの大規模タンパク質精製（Ｈｉｓタグ付き）。
ｐＲＳＥＴ Ｂ（Ｈｉｓタグ）構築物を熱ショックにより化学的にコンピテントな大腸菌Ｃ４１細胞中に形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐプレート上に蒔いた。コロニーを、アンピシリン（５０μg/mL）を含む２ＴＹ培地中で３７℃、２２０rpmで、６００nmの光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．６に達するまで増殖させた。細胞を次に、２０℃で１６〜２０時間又は３７℃で４時間にわたりＩＰＴＧ（０．５mM）を用いて誘導した。細胞を、３０００g（４℃、１０分）での遠心分離によってペレット化し、溶解緩衝液（１０mMリン酸ナトリウムｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ、SIGMAFASTプロテアーゼ阻害剤カクテルの１錠（ＥＤＴＡ不含、溶液１００mL当たり））中に再懸濁し、次に１５０００psiのEmulsiflex C5ホモジナイザーで溶解した。細胞破片を４℃で、１５，０００ｇで４５分間にわたる遠心分離によりペレット化した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズ５０%総容量（GE Healthcare）（５mL）を、細胞溶解物の上清をバッチにおいて４℃で１時間にわたりそれらに結合させる前に、リン酸緩衝液（１０mMリン酸ナトリウムｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ）で一回洗浄した。充填したビーズを、３０mMのイミダゾールを含むリン酸緩衝液（４０mL）で三回洗浄し、溶解タンパク質とビーズとの非特異的相互作用を防止した。サンプルを、３００mMイミダゾールを伴うリン酸緩衝液を使用して溶出し、リン酸緩衝液（１０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ）中で予め平衡化されたHiLoad 16/60 SuperdexG75カラム（GE Life-Science）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、タンパク質を均一濃度条件において分離した。純度をＮｕＰａｇｅタンパク質ゲル（Invitrogen）上でチェックし、９５%を上回る純粋であることが見出された画分をプールした。精製したタンパク質を急速凍結し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。濃度は、２８０nmでの吸光度を測定すること、及び各々の変異体についてExPASy ProtParam（Gasteiger et al. 2005）からの算出された吸光係数を使用することにより決定した。分子量及び純度を、質量分析（ＭＡＬＤＩ）を使用して確認した。

１．２ 大腸菌からの大規模タンパク質精製（熱処理）。
本明細書中に記載する全てのモジュラー結合タンパク質は、熱的に非常に安定であり、８０℃を上回る融解温度を伴う。これは、モジュラー結合タンパク質が、細胞溶解物を６５℃で２０分間にわたりインキュベートすることにより、大腸菌タンパク質から分離されうることを意味する。大腸菌タンパク質の非常に少数がそのような温度で残存し、従って、それらは変性して凝集する。凝集したタンパク質を遠心分離により除去し、所望のタンパク質の８０〜９０%純粋なサンプルを残した。全ての構築物は可逆的に折り畳まれ、従って、アセトン又は塩沈殿などの方法により更に精製し、ＤＮＡ及び他の混入物を除去することができた。

このアプローチによって、高価な親和性精製方法（例えば抗体又はＨｉｓタグなど）を伴わずに、大量の機能タンパク質の産生が可能になり、工業的産生及びバイオリアクターに拡張可能である。

１．３ ハイスループットテストのためのＨｉｓタグ付きタンパク質の小規模精製。
プラスミドを大腸菌Ｃ４１細胞中に形質転換し、一晩蒔いた。５０マイクログラム/mlアンピシリンを含む１５mlの２ＴＹ培地（Roche）を複数の５０mlチューブ中に入れた。いくつかのコロニーを採取し、各々１５ml培養物中に再懸濁した。十分な通気のために、５０mlチューブのふたをゆるく締めることだけが重要である。細胞をＯＤ６００＝０．６まで３７℃で増殖させ、次に０．５mMのＩＰＴＧで一晩誘導した。細胞を３０００g（Eppendorf Centrifuge 5804）でペレット化し、次に１mlのBugBuster（登録商標）細胞溶解試薬中に再懸濁した。或いは、リゾチーム及びＤＮＡｓｅ Ｉ処理と組み合わせた超音波処理を使用した。溶解物を１２０００gで１分間にわたりスピンさせ、不溶性タンパク質及び細胞破片をペレット化した。

上清を、総容量１００μｌの予洗Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズに加えた。その後の親和性精製は、ビーズを毎回１mlの緩衝液で４回洗浄することにより（或いは、Qiagen Ni-NTA Spin Columnを使用することができる）バッチで実施した。最初の洗浄には、選んだ緩衝液中に１０% BugBuster（登録商標）溶液及び３０mMイミダゾールが含まれた。ここは、本発明者らは５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．８）、１５０mM ＮａＣｌを使用した。３つの連続洗浄は、選んだ緩衝液中に３０mMのイミダゾールを有した。ビーズを徹底的に洗浄し、BugBuster（登録商標）溶液中に存在する界面活性剤を除去した。タンパク質を、３００mMイミダゾールを含む１mlの選んだ緩衝液を使用し、一工程でビーズから溶出した。Bugbuster（登録商標）及びイミダゾールの組み合せ並びに小ビーズ容量中での反復洗浄によって、＞９５%の純粋なタンパク質がもたらされた。イミダゾールを、ＮＡＰ−５使い捨てゲルろ過カラム（GE Healthcare）を使用して除去した。

１．４ 競合蛍光偏光（ＦＰ）
ＫＲＡＳへの、設計したＳＯＳ−ＴＰＲタンパク質の結合をアッセイするために、競合ＦＰを、精製されたＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ変異体及び（２’−（又は３’）−Ｏ−（Ｎ−メチルアントラニロイル）グアノシン５’−三リン酸、ＧＴＰの蛍光バージョン（ｍａｎｔ−ＧＴＰとしても公知）を使用して実施した。ＳＯＳ−ＴＰＲを、黒色９６ウェルプレート（ＣＬＳ３９９３ SIGMA）中のＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ及びｍａｎｔ−ＧＴＰ（１μM）の１：１複合体に対する２倍連続希釈を使用して滴定した。プレートを還元光条件下で調製し、室温でインキュベートした。読み取りは、３６０nmの励起フィルター及び４４０nmの発光フィルターを使用し、CLARIOstarマイクロプレートリーダーで行った。

１．５ 等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）
ＩＴＣを、ＶＰ−ＩＴＣ（Microcal）を使用して２５℃で実施した。１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４、３ＴＢＰ−ＣＴＰＲ６、及びＴＮＫＳ２ＡＲＣ４を１０mMリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ、０．５mM ＴＣＥＰ中に透析した。透析したＴＮＫＳ２ＡＲＣ４（２００μM）を、１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２を含むサンプル細胞中に２０μMで滴定した。同様の実験を２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４及び３ＴＢＰ−ＣＴＰＲ６について実施した。細胞中へのＴＮＫＳ２ＡＲＣ４の注入を５μL注入で開始し、２９回の注入（１０μL）が続いた。参照出力を１５μCal/秒に設定し、初期遅延は１０００秒、撹拌速度は４８５rpmであった。データを、装置ソフトウェアである一部位結合モデルを使用して適合させた。

１．６ 細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０%ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（LifeTech）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma Aldrich）中で、３７℃で５% ＣＯ_２空気供給を伴い培養した。

１．７ 細胞トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔを６ウェル組織培養プレート（５０万細胞／ウェル）中に播種し、製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（Invitrogen）を使用して翌日トランスフェクトした。

１．８ βカテニンレベルのウェスタンブロットアッセイ
ＨＡ−β−カテニン（１μg）単独、及び種々のＰＲＯＴＡＣ（１μg）を伴い、Lipofectamine 2000を使用し、６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２００μLのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解した。サンプルを９５℃で２０分間にわたり煮沸した後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、イムノブロットを、抗ＨＡ抗体（Ｃ２９Ｆ４、Cell Signaling Technologies）及び抗アクチン抗体（Ａ２０６６、Sigma-Aldrich）を使用して実施した。βカテニンレベルにおける変化を、ImageJを使用し、アクチンレベルに対して標準化したＨＡ−β−カテニンに対応するバンドのデンシトメトリーにより評価した。

１．９ リポソーム製剤及び細胞傷害性アッセイ
タンパク質（ＬＦＰ）のリポソーム製剤を作製するために、脂質（ＤＯＴＡＰ（カチオン性）：ＤＯＰＥ（中性）：ＤｉＲ（芳香族）＝１：１：０．１（幅））をクロロホルム中に溶解し、溶媒を真空下で一晩蒸発させた。結果として得られた混合脂質ケーキを、２７μMタンパク質を含む１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４で水和し、全脂質濃度を４mg/mlにした。この混合物を２分間にわたりボルテックスし、次に室温で２０分間にわたり超音波処理した。タンパク質をカプセル化するリポソームは、さらなる使用まで４℃で保存した。空リポソーム（ＥＬ、タンパク質を伴わない空リポソーム）を作製するために、脂質ケーキを、タンパク質を伴わない１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４で水和した。

ＡＴＰアッセイを使用し、ＥＬ及びＬＦＰに関連付けられる細胞傷害性があるか否かを研究した。典型的な手順において、１０%ウシ胎児血清を添加した５００μLのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の２×１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞／ウェルを、２４ウェル細胞培養プレート中で２４時間にわたり増殖させた。細胞を、異なる容量（０〜６０μL）のＥＬ及びＬＦＰを有するリポソーム（ＥＬ／ＬＦＰ）−培地（ＦＢＳを伴わないＤＭＥＭ）混合物とともに、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。１×ＰＢＳで二回洗浄した後、５００μLのCellTiter-Glo（登録商標）試薬（Promega）を加え、発光を、製造者のプロトコールに従ってマイクロプレートリーダーを使用して測定した。未処理細胞を対照として使用した。データを３通りのサンプルから得て、標準偏差を２つの独立した実験から算出した。

１．１０ ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ
Ｗｎｔ経路は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｗｎｔ３Ａを発現するＬ細胞から得られたＷｎｔ馴化培地を用いて８日間にわたり処理することにより活性化させた。このアッセイを実施するために、１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞／ウェルを２４ウェルプレートNunclon Delta表面プレート（ＮＵＮＣ）上に播種し、３７℃、５% ＣＯ_２で一晩インキュベートした。次の日、細胞を１００ngのＴＯＰｆｌａｓｈ ＴＣＦ７Ｌ２−ホタルルシフェラーゼプラスミド、１０ngのＣＭＶ− Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド（内部対照として）、及び１００ngの対応するＴＰＲ構築物を用いてトランスフェクトした。プラスミドを、製造業者のプロトコール（invitrogen）に従って０．５μＬのLipofectamine 2000トランスフェクション試薬と混合した。トランスフェクトした細胞を８時間にわたり回復させ、次に、それらをＷｎｔ−馴化培地（１：２最終濃度）を用いて更に１６時間にわたり処理した。ＴＯＰｆｌａｓｈアッセイは、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）（Korinek et al., 1997 Science 275(5307):1784-7）を使用し、製造業者の指示に従って実施した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性を、CLARIOstarプレートリーダーを使用し、単一サンプルから連続的に測定した。相対ルシフェラーゼ値を、ホタル発光活性をＣＭＶ誘導Ｒｅｎｉｌｌａ活性により割った３通りのサンプルから得て、標準偏差を算出した。

１．１１ 設計したＴＰＲタンパク質を細胞中に送達するためのリポソームカプセル化を使用したＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ
１０%ウシ胎児血清を添加した５００μLのダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の１０^５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェル細胞培養プレートの各々のウェル中で一晩増殖させた。ＴＯＰＦＬＡＳＨレポーターアッセイのために、１００ng/ウェルのＴＯＰＦＬＡＳＨプラスミド及び１０ng/ウェルのＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド（内部対照として）を使用し、２４ウェルプレート中で細胞をトランスフェクトした。細胞を、製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従って、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションした細胞を８時間にわたり回復させ、Ｗｎｔシグナル伝達を、Ｌ細胞から得たＷｎｔ３Ａ馴化培地の添加により活性化した。Ｗｎｔ経路活性化の１６時間後、タンパク質をリポソーム処理により細胞中に送達した。細胞を、リポソーム（ＬＦＰ）−培地（ＦＢＳを伴わないＤＭＥＭ）混合物と３７℃で１５分間にわたりインキュベートし、１回のＰＢＳ洗浄が続いた。Ｗｎｔ３Ａ馴化培地を交換し、細胞を様々な時間（２〜８時間）にわたりインキュベートした。インキュベーションに続いて、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイを、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）（Korinek et al., 1997）を製造業者の指示に従って使用して実施した。相対ルシフェラーゼ値を、ホタルルシフェラーゼ値（ＴＯＰＦＬＡＳＨから）をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ値（ＣＭＶレニラから）で割ることにより、３通りのサンプル（２つの独立した実験から）から得て、標準偏差を算出した。

１．１２ Ｋｅａｐ１への、設計したＮｒｆ−ＴＰＲタンパク質の結合を測定するための競合蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ
Ｋｅａｐ１への、設計したＮｒｆ−ＴＰＲタンパク質の結合を測定するために、競合ＦＰを、３８４ウェルの黒色不透明オプチプレートマイクロプレート及びＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダーを使用して実施した。Ｎｒｆ−ＴＰＲタンパク質を、ＦＩＴＣ標識Ｎｒｆ２ペプチド及びＫｅａｐ１タンパク質の混合物を含む溶液中で滴定した。調製したプレートを、読み取りを行う前に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。

２．結果
テトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）は、縦列に反復してモジュールタンパク質を生成することができる３４残基のモチーフである。ＴＰＲを、ここでは、ヘリックス・ターン・ヘリックス縦列反復アレイの例として使用するが、しかし、任意の縦列反復アレイを使用してもよい。

ＴＰＲを含むＲＴＰＲタンパク質はコンセンサスＴＰＲ配列（ＣＴＰＲ）から由来した。２つの反復が、６８アミノ酸（ＲＴＰＲ２）の高度に安定なミニタンパク質を生成するのに十分であることが見出された。２つの型の工学的戦略の生物物理学的特性；ループ挿入及び末端へリックス移植を評価した。３つの異なるＲＴＰＲモジュールの２２２nmでのモル楕円率（ヘリックス二次構造含量の測定値）を増加温度の関数としてモニターした。増加温度に伴う絶対モル楕円率における減少は、構造の喪失及びタンパク質の変性を示す。記録された最高温度（８５℃）でさえ、挿入を伴わないＲＴＰＲ２タンパク質は完全には変性しなかった（図１）。２つの反復の間に２０残基の非構造化ループを伴うＲＴＰＲ２は、より低い融解温度への小さなシフトを示したが（図１）、しかし、タンパク質は５５℃まで完全に折り畳まれたままである。これは生理学的に関連する温度を十分に上回る。追加のＮ末端ヘリックスを伴うＲＴＰＲ２は、絶対モル楕円率における増加を示したが、追加のヘリックスドメインが折り畳まれていることを示す。更に、ループ挿入とは異なり、ヘリックスドメインはＲＴＰＲ２モジュールを安定化することが可能であり、遷移中間点を９０℃超にシフトさせた（図１）。これらの結果は、２つの工学的戦略によって、高温に耐えることが可能である折り畳まれた安定なモジュラーミニタンパク質が生成されることを示した。

ＴＰＲ骨格の重要な特徴はそのモジュラー特性であった。このモジュラー性によって、任意の数の結合モジュールを縦列で呈示し、１、２、又はそれ以上の標的に対する二価及び多価並びに多機能性分子を得ることが可能になった。これらのタンパク質の安定性はモジュラーであることが示された。縦列で反復されたＴＢＰ−ＣＴＰＲ２（タンパク質タンキラーゼ（Guettler et al. 2011）に結合するループ挿入を伴う二反復ＣＴＰＲ）を含むタンパク質の安定性を測定した。ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２含有タンパク質は２、４、６、及び８反復を有し、それらはそれぞれ１、２、３、及び４結合ループを呈示した。タンパク質のヘリックス含量は、２２２nmのモル楕円率によりモニターし、安定性と同様に反復の数に比例して増加することが見出され、それらが古典的ヘリック反復タンパク質のように挙動することを示した（図２）。これらの結果によって、二機能性又は多機能性モジュラー結合タンパク質が高い熱安定性を有することが実証される。

２．１．アルファ−ヘリックス上に移植した単一結合機能を伴うタンパク質の実証
２．１．１ ＳＯＳ１−ＴＰＲ（腫瘍性タンパク質ＫＲＡＳに結合するように設計したヘリックス移植結合モジュール）
最初に、本発明者らは、ＫＲＡＳ（Margarit et al. 2003 Cell 112 5 685-695）と相互作用するＳＯＳ１のヘリックスを７アミノ酸分布上にマッピングした。本発明者らは、７アミノ酸位置を、Leshchiner et al. (PNAS 2015 112 (6)1761-1766）により産生されたステープル化ＳＯＳ１ヘリックスペプチドと一致させ、ペプチドのステープル化側を、ＴＰＲタンパク質の残り部分と疎水性界面を形成するように設定した（図３Ａ）。ヘリックスの長さは重要である。Ｎ末端に溶媒和したＣＴＰＲへリックスはＤＰＮＮ配列中で終わり、それは、次の反復中に導く短いループを形成する。結合へリックス（制約）のＣＴＰＲ媒介性「ステープル化」は、従って、残基Ｔｙｒ（ｉ）−Ｉｌｅ（ｉ＋４）−Ｔｙｒ（ｉ＋７）−Ｌｅｕ（ｉ＋１１）を通じて生じ、１５残基のへリックスは完全にステープル化される。

本発明者らは、グラフト化ヘリックスと隣接反復の間に疎水性界面を作製し、グラフト化ヘリックスのＣ末端でのＤＰＮＮループの形成を可能にした。本発明者らは次に、相互作用のさらなる検証のため、ＣＴＰＲ Ｂヘリックスの結晶構造上に最終配列を移植した。本発明者らの設計したＫＲＡＳ結合タンパク質ＳＯＳ１−ＴＰＲを、Haddockソフトウェア（de Vries & Bonvin 2011；de Vries et al. 2010）を使用してＫＲＡＳに対してドッキングした。Ｈａｄｄｏｃｋは、その算出のために相互作用に関する公知の情報を使用するデータ駆動ドッキングアルゴリズムである。ＳＯＳ１−ＫＲＡＳ（ＰＤＢ：１ＮＶＵ）の結晶構造（Margarit et al. 2003）は本来、ステープル化ペプチドを設計するために使用された。活性残基（一次相互作用残基）及び不活性残基（活性残基に５Å近接）を抽出し、算出中に入力した。

最初の研究以降、本発明者らは、新たなヘリックスモジュールを検証するためにドッキングは必要ではないことを見出した。設計戦略はαへリックスの幾何学に基づいた確かな理論を有し、設計は、重要な結合残基が移植されている限り成功するであろう。これらのＴＰＲ反復はこのように、それらがヘリックスの反対方向に直線的に成長し、それにより標的タンパク質との立体衝突を避けるため、結合ヘリックスを呈示する例外的な骨格であることが見出された。

次に、本発明者らは、ｍａｎｔ−ＧＴＰ（２’−／３’−Ｏ−（Ｎ’−メチルアントラニロイル）グアノシン−５’−Ｏ−三リン酸）（ＧＴＰの蛍光類似体）の蛍光偏光における変化を使用してＫＲＡＳ結合をモニターした（図３Ｂ）。ｍａｎｔ−ＧＴＰの蛍光は、その環境の疎水性に依存する（３６０nmの励起、４４０nmの発光）。蛍光強度及び蛍光偏光における増加が、ＫＲＡＳへの結合時に以前に観察された（Leshchiner et al. 2015）。ＳＯＳ−ＴＰＲ２を次に、予め形成されたｍａｎｔ−ＧＴＰ−ＫＲＡＳ複合体中に滴定した。ＳＯＳ−ＴＰＲ２の増加濃度に伴い極性化における明らかな減少があったが、ＫＲＡＳへのＳＯＳ−ＴＲＰ２の結合時でのｍａｎｔ−ＧＴＰの置換を示す（図３Ｂ）。データを適合することによって、３．４μMのＥＣ５０が与えられた。対照的に、ブランクタンパク質ＣＴＰＲ３は蛍光偏光に対する効果を有さなかった。

２．１．２ ｐ５３−ＴＰＲ（Ｍｄｍ２に結合するように設計したヘリックス移植結合モジュール
多くのデグロン（Ｅ３ユビキチンリガーゼにより認識される基質内の領域）は構造化されていない。しかし、ｐ５３はαへリックスを通じてＭｄｍ２Ｅ３に結合する（図４Ａ）。ｐ５３へリックスのステープル化バージョン、並びに環状ペプチド及び移植コイルドコイルが、多くのグループにより開発されており、配列が、いくつかの場合においてナノモル親和性を与えるように最適化されている（例えば、Ji et al. 2013；Lee et al. 2014；Kritzer et al. 2006を参照のこと）。ｐ５３ヘリックスは、ＣＴＰＲ骨格のＣ末端溶媒和ヘリックス上に移植するのに好ましい幾何学を有し、更に２つのヘリックスは３０%の配列同一性を有する。

Ｍｄｍ２（Ｎ末端ドメイン）へのｐ５３−ＣＴＰＲ２の結合の証拠を、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用して得た。Ｍｄｍ２を、１０μMのｐ５３−ＴＰＲ２を含む溶液中に滴定した。ＩＴＣによって結合時に放出される熱が測定される。高親和性相互作用が、約５０nMの解離定数を伴って観察された（図４Ｂ）。

２．２．反復間ループ上に移植した単一結合機能を伴うタンパク質の実証。
２．２．１ ＴＰＢ２−ＴＰＲ（腫瘍性タンパク質タンキラーゼに結合するように設計したループモジュール）。
最初に、本発明者らは、ＳＬｉＭ「３ＢＰ２」、即ち、タンパク質タンキラーゼ（多くの癌においてＣＴＰＲ骨格上で上方調節されるマルチドメインポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（Guettler et al. 2011））の基質結合アンキリン反復クラスター（ＡＲＣ）に結合する配列を導入した。折り畳まれたドメイン中でのＳＬｉＭの移植によって、タンパク質分解耐性の増加に導かれ；さらなる合理的な操作、インシリコの方法、及び／又は有向進化を通じて相互作用面を拡大する可能性；制御された幾何学的配置；及び二価又は多価の相互作用が示される。

本発明者らは、ＩＴＣを使用し、タンキラーゼのＡＲＣ４ドメインへの１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４、及び３ＴＢＰ−ＣＴＰＲ６の結合をテストした（図５Ａ）。この技術は、それによって相互作用の化学量論（ｎ）を測定できるため、これらの相互作用のために特に有用である。本発明者らは、ｎが結合ループの数とともに増加し、タンパク質中のループと同じ数のタンキラーゼ分子が１つのＴＢＰ−ＣＴＰＲに結合していることを示した。このように、全てのループが結合パートナーに到達できる。更に、結合親和性は増加し、オフ率は結合力効果を示す反復の数とともに減少した。この型の多価分子は、それが３ＢＰ２ペプチドに結合することが可能な４つのＡＲＣドメインを有するため、全長タンキラーゼのために特に有用であろう。

この系における多価性は、Ｔ４フィブリチンのｆｏｌｄｏｎドメインへのその融合による結合モジュールのオリゴマー化を介して更に増加した（図５Ｂ）。この三量体化ドメインは、Ｃ末端へリックス（例えばｐ５３−ＣＴＰＲのＣ末端へリックスなど）で構成され、ｆｏｌｄｏｎドメイン（ホモ三量体化が可能な短いβシートペプチド）で終わる。ｆｏｌｄｏｎドメインは非常に安定で、独立して折り畳まれることが示されている（Boudko et al 2002；Meier et al. 2004）。この方法において、複数の結合モジュールを、高い結合力を伴う他の多価ネットワークと相互作用するそれらの自然な傾向に起因して、一価相互作用では標的化することができない複雑な多価分子を阻害するように、特定の幾何学で配列することができる。

２．２．２ 単一結合機能ＴＰＲ中に多価性を導入する効果
本発明者らは、タンパク質タンキラーゼに結合する種々の数の「３ＢＰ２」モチーフ（１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４、及び３ＴＢＰ−ＣＴＰＲ６など）を含む多価ＣＴＰＲタンパク質の機能をテストした。多価性を、Ｔ４フィブリチンのｆｏｌｄｏｎドメイン（１ＴＢＰ−ＣＴＰＲ２−ｆｏｌｄｏｎ、２ＴＢＰ−ＣＴＰＲ４−ｆｏｌｄｏｎなど）にそれを融合することによるＴＰＲのオリゴマー化を介して更に増加させた。タンキラーゼは多くの癌において上方調節され、ベータ−カテニンを下方調節することによりその効果を発揮する。従って、ＴＢＰ移植ＴＰＲの阻害効果を、ベータ−カテニンレポーター遺伝子アッセイ（ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイ）を使用してアッセイした。機能単位数を増加させることによって、Ｗｎｔシグナリングアッセイを使用して、言及したように、タンパク質の阻害効果が増加した（図１７）。

２．２．３ Ｓｋｐ２−ＲＴＰＲ（Ｅ３ユビキチンリガーゼＳＣＦ ^Ｓｋｐ２ に結合するように設計したループモジュール）
Ｓｋｐ２はＳＣＦ^Ｓｋｐ２ユビキチンリガーゼの基質認識サブユニットである。ＲＴＰＲループ中に挿入したＳｋｐ２結合配列は、Ｃｋｓ１（アクセサリータンパク質）との複合体中でＳｋｐ２に結合する基質ｐ２７から由来する、以前に発表されたデグロンペプチド配列に基づいた（Hao et al. 2005）。本発明者らは、このペプチドの１０残基だけを使用した。理想的にはＳｋｐ２結合配列はホスホ−スレオニンを含むが（この残基がＳｋｐ２及びＣｋｓ１と重要な接触を作るため）、本発明者らは、代わりに、本発明者らが、結合親和性に影響を及ぼすことなくホスホ−スレオニンをホスホミメティック（グルタミン酸）で置換できるか否かを探索した。本発明者らは、共免疫沈降を使用し、結果として得られたｐ２７−ＴＰＲタンパク質がＳｋｐ２に結合できること（図６Ａ）、及びそれが３０nMオーダーの解離定数を示す高い効率を伴いｐ２７のユビキチン化をインビボで阻害できること（図６Ｂ）を見出した。ペプチドはそのＳｋｐ２／Ｃｋｓ１結合状態においてターン様立体構造を採用するため、ＲＴＰＲ骨格内にそれを制約することによって、ホスホスレオニンをホスホミメティックで置換することから生じる親和性における任意の喪失を上回る結合親和性における大きな増強に導かれる。

２．２．４ Ｎｒｆ−ＴＰＲ（Ｅ３ユビキチンリガーゼＫｅａｐ１−Ｃｕｌ３に結合するように設計したループモジュール）
Ｋｅａｐ１は、Ｋｅａｐ１−Ｃｕｌ３ユビキチンリガーゼの基質認識サブユニットである。本発明者らがＣＴＰＲループ中に挿入したＫｅａｐ１結合配列は、Ｋｅａｐ１基質Ｎｒｆ２から由来する以前に発表されたデグロンペプチド配列に基づいた。本発明者らは、共免疫沈降法を使用し、結果として得られたＮｒｆ−ＴＰＲタンパク質がＫｅａｐ１に結合することができること（図７Ａ）、及びその相互作用が、ＩＴＣ分析により測定したように、低いナノモル範囲において高い親和性を有すること（図７Ｂ）を見出した。

２．３．細胞中への送達のためのＲＴＰＲ骨格の操作
本発明者らのＲＴＰＲ配列を代わりのコンセンサスＴＰＲ配列（Parmeggiani et al. 2015）と組み合わせ、本発明者らは追加の溶媒曝露されたアルギニン残基を含め、そのような「再表面化」又は「超電荷」は、細胞中へのタンパク質の流入を促進させることが以前に示されている（Chapman & McNaughton 2016；Thompson et al. 2012）。図８は、このアプローチが、蛍光標識再表面化ＴＢＰ−ＲＴＰＲ２タンパク質を２つの異なる細胞株中に送達する際に成功したことを示す。

２．４．ユビキチン化及びその後の分解のためにタンパク質を方向付けるためのヘテロ二機能性ＴＰＲの設計
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、多くの癌において及び神経変性疾患において脱調節されており、従って、βカテニンは重要な薬物標的である。ＴＰＲ骨格上への移植のために適切であると思われる、βカテニンについての多数の公知の結合配列（ヘリックス及び非ヘリックスの両方）が存在し、従って、本発明者らは、タンパク質分解を誘導するための本発明者らのヘテロ二機能性ＴＰＲの設計のための最初の標的としてそれを選んだ。本発明者らは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとしてテストするためにＭｄｍ２及びＳＣＦ^Ｓｋｐ２を選択した。なぜなら、本発明者らは、それらに結合する単機能ＴＰＲを成功裏に生成していたからである（図４及び６）。本発明者らは、ヘテロ二機能性分子のいくつかの構造モデルを生成し、結果として得られる、Ｅ３へのβカテニンの呈示が適当であるか否かの大まかな評価としてこれらを使用した。本発明者らは次に、βカテニン結合モジュール及び２つのＥ３リガーゼ結合モジュールの異なる組み合わせを用いて機能化された３つ又は４つのＴＰＲを含むタンパク質をコードするプラスミドの小さなライブラリーを生成した。

本発明者らは、Lipofectamine 2000を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付きβカテニンプラスミド単独で、又はＨＡタグ付きβカテニンプラスミドを種々のヘテロ二機能性ＴＰＲプラスミドの１つと一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解し、サンプルを煮沸し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イムノブロットを、抗ＨＡ抗体及び抗アクチン抗体を使用して実施した。βカテニンレベルにおける変化を、アクチンレベルに対して標準化したＨＡ−β−カテニンに対応するバンドのデンシトメトリーにより評価した（図９）。結果は、多数のヘテロ二機能性分子によってβカテニンレベルを最高７０%だけ低下させることが可能であることを示す。対照的に、ブランクＴＰＲ又は単一機能性ＴＰＲは、βカテニンレベルに対する効果を有さない。

広範な異なる因子が、これらのヘテロ二機能性分子による効率的なユビキチン化及び標的分解に、ひいては単一機能モジュールの異なる組合せ及び、潜在的にはまた、介在するブランクモジュールの異なる長さをスクリーニングする能力に寄与する。

２．５ モジュラーＴＰＲタンパク質を細胞中に導入するための送達媒体の使用
本発明者らは、設計したＴＰＲタンパク質を、カチオン性、中性、及び芳香族脂質から作製した融合性リポソーム内にカプセル化し、本発明者らは、それらがそれにより細胞中に送達されることを示した（図１８及び１９）。空リポソーム及びＴＰＲタンパク質をカプセル化したリポソームは、細胞に対して傷害性はなかった（図２０）。

２．６ ユビキチン化及びその後の分解のためにタンパク質を方向付けるためのヘテロ二機能性ＴＰＲのさらなる例
ヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質を、ユビキチン化及び分解のためにタンキラーゼ（図２１）、ベータ−カテニン（図２２）、又はＫＲＡＳ（図２３）のいずれかを標的化するように設計した。タンキラーゼ又はベータ−カテニンを標的化するＴＰＲタンパク質を、リポソームカプセル化を使用して細胞中に送達し、Ｗｎｔシグナル伝達に対する効果を、ＴＯＰＦＬＡＳＨアッセイを使用して分析した。結果は、設計したヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質がＷｎｔシグナル伝達を阻害できることを示す。ＫＲＡＳについては、本発明者らは、Lipofectamine 2000を使用し、ＫＲＡＳプラスミド単独又はＴＰＲプラスミドの１つと一緒にＫＲＡＳプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ＫＲＡＳレベルをウェスタンブロットにより評価した。結果は、設計したヘテロ二機能性ＴＰＲがＫＲＡＳレベルを低下させることが可能であることを示す。

２．７ シャペロン媒介性オートファジー（ＣＭＡ）を介した分解のためにＫＲＡＳを方向付けるためのヘテロ二機能性ＴＰＲ
ヘテロ二機能性ＴＰＲタンパク質を、ＣＭＡを介した分解のために内因性ＫＲＡＳを標的化するように設計した（図２４）。ＴＰＲ構築物又は空ベクター（薄い灰色）を、Lipofectamine 2000を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＤＬＤ１（結腸直腸癌細胞株）のいずれかに一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、ＫＲＡＳレベルをウェスタンブロットにより評価した。空ベクターの対照と比較してＫＲＡＳレベルの低下をもたらした、設計したヘテロ二機能性ＴＰＲを白色で示す。

２．８ 結合ドメインを反復間ループに連結するリンカー配列中での変異
Ｎｒｆ−ＴＰＲ（タンパク質Ｋｅａｐ１に結合するように設計したＴＰＲタンパク質）のための標的についての結合親和性を最適化するために、結合ドメインを反復間ループに接続させるリンカー配列を変動させた（図７を参照のこと）。グリジン残基をリンカー中に導入して柔軟性を提供し、空間サンプリングを増加させた。このより柔軟なリンカー配列の導入によって、コンセンサス様リンカー配列と比較した場合、Ｎｒｆ−ＴＰＲタンパク質（「柔軟」と標識）の結合親和性が増加することが見出された。リンカー配列の荷電量を変えること（「荷電」と標識）、及びリンカー配列のアミノ酸組成を変化させることによりループの立体構造特性を変えること（プログラムＣＩＤＥＲ（Holehouse et al. Biophys. J. 112, 16-21 (2017)）の予測に基づく）（「ＣＩＤＥＲ−最適化」と標識）によっても、Ｋｅａｐ１結合親和性に影響が及ぼされた（図２５）。

参考文献

Claims (75)

1. （ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
   （ｉｉ）該反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
   （ｉｉｉ）標的分子に結合する１つ又は複数の異種結合ドメインであって、各々の該結合ドメインが、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する、異種結合ドメイン
   を含む、モジュラー結合タンパク質。
2. 反復ドメインが、ヘリックス・ターン・ヘリックス反復ドメインである、請求項１記載のモジュラー結合タンパク質。
3. 反復ドメインが、テトラトリコペプチド（ＴＰＲ）反復ドメインである、請求項２記載のモジュラー結合タンパク質。
4. 反復ドメインが、アミノ酸配列Ｙ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４
   （式中、Ｙは表４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列又はその変異体であり、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４は独立して任意のアミノ酸である）
   を有する、請求項３記載のモジュラー結合タンパク質。
5. 反復ドメインが、アミノ酸配列
   ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＱＫＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４；又は
   ＡＥＡＬＮＮＬＧＮＶＹＲＥＱＧＤＹＱＫＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４；又は
   ＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＲＱＧＤＹＱＲＡＩＥＹＹＱＲＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４；又は
   ＡＥＡＬＮＮＬＧＮＶＹＲＥＱＧＤＹＱＲＡＩＥＹＹＱＲＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４；又は
   ＡＥＡＬＲＮＬＧＲＶＹＲＲＱＧＲＹＱＲＡＩＥＹＹＲＲＡＬＥＬ−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４
   （これらの式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４は独立して任意のアミノ酸、又はその変異体である）
   を有する、請求項３又は請求項４記載のモジュラー結合タンパク質。
6. Ｘ_１がＤである、請求項４又は請求項５記載のモジュラー結合タンパク質。
7. Ｘ_２がＰである、請求項４〜６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
8. ２〜５つの反復ドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
9. 結合ドメインが１つ又は複数の反復間ループ中に位置する、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
10. 結合ドメインが、１つ又は複数の更なる残基により反復間ループに接続されている、請求項９記載のモジュラー結合タンパク質。
11. 結合ドメインがリンカーにより反復間ループに接続されている、請求項１０記載のモジュラー結合タンパク質。
12. 結合ドメインが非疎水性である、請求項９〜１１のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
13. 結合ドメインがＮ末端に位置する、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
14. Ｎ末端結合ドメインがαヘリックスを含む、請求項１３記載のモジュラー結合タンパク質。
15. Ｎ末端結合ドメインが配列Ｘ_ｎ−ＸＹＸＸＸＩＸＸＹＸＸＸＬＸＸ−Ｘ_１Ｘ_２ＸＸ（式中、Ｘにより表示される残基は独立して任意のアミノ酸であり、Ｘ_１及びＸ_２は独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０又は任意の数である）を含む、請求項１３又は１４記載のモジュラー結合タンパク質。
16. Ｘ_１がＤである、請求項１５記載のモジュラー結合タンパク質。
17. Ｘ_２がＰである、請求項１５又は請求項１６記載のモジュラー結合タンパク質。
18. 結合ドメインがＣ末端に位置する、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
19. Ｃ末端結合ドメインがαヘリックスを含む、請求項１８記載のモジュラー結合タンパク質。
20. Ｃ末端結合ドメインが配列Ｘ_１Ｘ_２ＸＸ−ＸＸＡＸＸＸＬＸＸ［ＡＶ］ＸＸＸＸＸ−Ｘ_ｎ（式中、Ｘにより表示される残基は独立して任意のアミノ酸であり、Ｘ_１及びＸ_２は独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０又は任意の数である）を含む、請求項１９記載のモジュラー結合タンパク質。
21. Ｘ_１がＤである、請求項２０記載のモジュラー結合タンパク質。
22. Ｘ_２がＰである、請求項２０又は請求項２１記載のモジュラー結合タンパク質。
23. 標的分子が、受容体、酵素、抗原、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、内在性膜タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、転写因子、転写調節因子、又はブロモドメインタンパク質である、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
24. 標的分子が、β−カテニン、ＫＲＡＳ、タンキラーゼ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ｒａｓ、ｎｏｔｃｈ及びａｕｒｏｒａ Ａ、α−シヌクレイン、β−アミロイド、タウ、スーパーオキシドジスムターゼ、ハンチンチン、発癌性ヒストンデアセチラーゼ、又は発癌性ヒストンメチルトランスフェラーゼである、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
25. １つ又は複数の結合ドメインが同じ標的分子に結合する、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
26. 表２又は表７中に示すアミノ酸配列を有する結合ドメインを含む、請求項１〜２５のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
27. Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合ドメイン、場合により表３中に示すアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼ結合ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
28. 標的選択的オートファジー結合ドメイン、場合により７０kDa（Ｈｓｃ７０）結合ドメインの熱ショック同族体を含む、請求項１〜２６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
29. 配列ＫＦＥＲＱ又はその変異体を有するｈｓｃ７０結合ドメインを含む、請求項２８記載のモジュラー結合タンパク質。
30. 第１の標的分子に結合する第１の結合ドメイン及び第２の標的分子に結合する第２の結合ドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
31. 第１又は第２の標的分子の１つがＥ３ユビキチンリガーゼである、請求項３０記載のモジュラー結合タンパク質。
32. 標的タンパク質に結合するＮ末端結合ドメイン及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＣ末端結合ドメインを含む、請求項３１記載のモジュラー結合タンパク質。
33. 標的タンパク質に結合する反復間結合ドメイン及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＣ末端結合ドメインを含む、請求項３１記載のモジュラー結合タンパク質。
34. 標的タンパク質に結合する反復間結合ドメイン及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＮ末端結合ドメインを含む、請求項３１記載のモジュラー結合タンパク質。
35. 標的タンパク質に結合するＣ末端ドメイン及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合するＮ末端結合ドメインを含む、請求項３１記載のモジュラー結合タンパク質。
36. Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する反復間結合ドメイン及び標的タンパク質に結合するＮ末端結合ドメインを含む、請求項３１記載のモジュラー結合タンパク質。
37. Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する反復間結合ドメイン及び標的タンパク質に結合するＣ末端結合ドメインを含む、請求項３１記載のモジュラー結合タンパク質。
38. 第１又は第２の標的分子の１つが標的選択的オートファジー経路の成分であり、場合により７０kDaの熱ショック同族体（Ｈｓｃ７０）である、請求項３０記載のモジュラー結合タンパク質。
39. 標的タンパク質に結合するＮ末端結合ドメイン及び標的選択的オートファジー経路の成分に結合するＣ末端結合ドメインを含む、請求項３８記載のモジュラー結合タンパク質。
40. 標的タンパク質に結合する反復間結合ドメイン及び標的選択的オートファジー経路の成分に結合するＣ末端結合ドメインを含む、請求項３８記載のモジュラー結合タンパク質。
41. 標的タンパク質に結合する反復間結合ドメイン及び標的選択的オートファジー経路の成分に結合するＮ末端結合ドメインを含む、請求項３８記載のモジュラー結合タンパク質。
42. 標的タンパク質に結合するＣ末端ドメイン及び標的選択的オートファジー経路の成分に結合するＮ末端結合ドメインを含む、請求項３８記載のモジュラー結合タンパク質。
43. 標的選択的オートファジー経路の成分に結合する反復間結合ドメイン及び標的タンパク質に結合するＮ末端結合ドメインを含む、請求項３８記載のモジュラー結合タンパク質。
44. 標的選択的オートファジー経路の成分に結合する反復間結合ドメイン及び標的タンパク質に結合するＣ末端結合ドメインを含む、請求項３８記載のモジュラー結合タンパク質。
45. 標的化ドメイン、細胞内移行ドメイン、安定化ドメイン、オリゴマー化ドメイン、細胞傷害剤、治療剤、及び／又は検出可能な標識を更に含む、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
46. 表８中に示すアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質。
47. 請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質をコードする、核酸。
48. 請求項４７記載の核酸を含む、発現ベクター。
49. 請求項４８記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
50. 請求項４７記載の核酸を発現させてモジュラー結合タンパク質を産生することを含む、モジュラー結合タンパク質を製造する方法。
51. 結合ドメインをコードする第１の核酸を、反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメインをコードする第２の核酸中に挿入して、請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質をコードするキメラ核酸を産生すること；及び
    該キメラ核酸を発現させて、モジュラー結合タンパク質を産生すること
    を含む、モジュラー結合タンパク質を製造する方法。
52. 反復間ループにより連結された２つ又はそれ以上の反復ドメインをコードする核酸を提供すること；及び
    該核酸中に、第１の標的分子に結合する第１の結合ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列及び第２の標的分子に結合する第２の結合ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を組み入れて、該第１及び第２の結合ドメインを含むモジュラー結合タンパク質をコードする核酸を生成すること、ここで、該結合ドメインは、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置し；及び
    該核酸を発現させてタンパク質を産生すること
    を含む、第１の標的分子及び第２の標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質を製造する方法。
53. 第１又は第２の標的分子の１つがＥ３ユビキチンリガーゼである、請求項５２記載の方法。
54. モジュラー結合タンパク質を含むライブラリーであって、
    該ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質が、
    （ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
    （ｉｉ）該反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
    （ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメインであって、各々の該結合ドメインが、反復間ループ中に位置するか又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する、結合ドメイン
    を含み、
    該ライブラリー中の結合ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸残基が多様である、
    ライブラリー。
55. ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質が１つの結合ドメインを含む、請求項５４記載のライブラリー。
56. モジュラー結合タンパク質の第１及び第２のサブライブラリーを含むライブラリーであって、第１及び第２のサブライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質が、
    （ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
    （ｉｉ）該反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの多様なアミノ酸残基を含む結合ドメイン
    を含み、
    第１のサブライブラリー中のモジュラー結合タンパク質中の結合ドメインが、第１の標的分子に結合し、かつ、（ｉ）反復間ループ、（ｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＮ末端、又は（ｉｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＣ末端のうちの１つに位置し、
    第２のサブライブラリー中のモジュラー結合タンパク質中の結合ドメインが、第２の標的分子に結合し、（ｉ）反復間ループ、（ｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＮ末端、又は（ｉｉｉ）モジュラー結合タンパク質のＣ末端のうちの別の所に位置する、
    ライブラリー。
57. モジュラー結合タンパク質が請求項１〜４６のいずれか一項記載のものである、請求項５４〜５６のいずれか一項記載のライブラリー。
58. ライブラリーが粒子の表面に呈示される、請求項５４〜５７のいずれか一項記載のライブラリー。
59. （ａ）モジュラー結合タンパク質のライブラリーを提供することであって、該ライブラリー中の各々のモジュラー結合タンパク質は、
    （ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
    （ｉｉ）該反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
    （ｉｉｉ）反復間ループ中に、タンパク質のＮ末端に、又はタンパク質のＣ末端に位置する結合ドメイン
    を含み、ここで、該ライブラリー中の結合ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸残基は多様である、
    （ｂ）結合活性を呈示するモジュラー結合タンパク質について該ライブラリーをスクリーニングすること、及び
    （ｃ）結合活性を呈示する、該ライブラリー中の１つ又は複数のモジュラー結合タンパク質を同定すること
    を含む、ライブラリーをスクリーニングする方法。
60. 請求項５４〜５８のいずれか一項記載のライブラリーをコードする核酸の集団。
61. 請求項６０記載の核酸の集団を発現させることを含むライブラリーを製造する方法。
62. （ａ） （ｉ）２つ又はそれ以上の反復ドメイン、
    （ｉｉ）該反復ドメインを連結する反復間ループ；及び
    （ｉｉｉ）１つ又は複数の結合ドメインであって、各々の該結合ドメインが、反復間ループ中に又はモジュラー結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に位置する、結合ドメイン
    を含むモジュラー結合タンパク質の多様な集団をコードする核酸の集団を提供することであって、ここで、該集団中の結合ドメインは多様である、及び
    （ｂ）核酸の該集団を発現させて多様な集団を産生し、それにより、モジュラー結合タンパク質のライブラリーを産生すること
    を含む、モジュラー結合タンパク質のライブラリーを製造する方法。
63. 請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクター、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
64. 請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクターを医薬的に許容可能な賦形剤とともに製剤化することを含む、医薬組成物を製造する方法。
65. 請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクターを含むリポソームの集団。
66. 請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクターを脂質溶液と混合すること、及び、該溶液をエバポレートして、該モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクターをカプセル化したリポソームを製造することを含む、リポソームの集団を製造する方法。
67. ヒト又は動物の対象における診断又は処置の方法における使用のための、請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクター。
68. 標的分子に関連する障害の処置における使用のための、標的分子に結合する請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質をコードする請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクター。
69. 標的分子に関連する障害の処置における使用のための医薬の製造における、標的分子に結合する請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質をコードする請求項４７記載の核酸、又は請求項４８記載のベクターの使用。
70. 標的分子に結合する請求項１〜４６のいずれか一項記載のモジュラー結合タンパク質、標的分子に結合するモジュラー結合タンパク質をコードする請求項４７記載の核酸、又は該核酸を含む請求項４８記載のベクターを、それを必要とする個体に投与することを含む、標的分子に関連する障害の処置の方法。
71. 障害が、炎症性障害、神経変性疾患、血管新生障害、骨量減少障害、又は癌である、請求項６８記載の使用、請求項６９記載の使用、又は請求項７０記載の方法のための、モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクター。
72. 癌が、乳房、卵巣、結腸直腸、胃腸、膵臓、前立腺、甲状腺、肺、肝細胞癌、食道、多発性骨髄腫、白血病、Ｔ細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、多形性膠芽腫、胸膜中皮腫、骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項７１記載の使用、使用、又は方法のための、モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクター。
73. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症である、請求項７１記載の使用、使用、又は方法のための、モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクター。
74. 炎症性障害が、自己免疫疾患である、請求項７１記載の使用、使用、又は方法のための、モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクター。
75. モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクターがリポソーム中にカプセル化されている、請求項６８〜７４のいずれか一項記載の使用、使用、又は方法のための、モジュラー結合タンパク質、核酸、又はベクター。

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