JP2010148507A - 選択系 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)ウイルスの外被タンパク質ポリペプチドの配列に挿入された異種ポリペプチドからなる融合ポリペプチドをコードしかつ展示するウイルスを提供すること、ただし、該ウイルスは展示されるポリペプチドの内部に配置された切断部位を含むものであること、(b)該ウイルスを切断剤にさらすこと、(c)無傷の融合タンパク質を含むウイルスを増殖させること、を含んでなるウイルスの選択方法。
【選択図】なし
Description
(a) ウイルスの外被タンパク質ポリペプチドの配列中に挿入された異種ポリペプチドからなる融合ポリペプチドをコードしかつ展示するウイルスを提供すること、ただしそのウイルスは展示されるポリペプチドの内部に配置された切断部位を含むものであること、
(b) そのウイルスを切断剤にさらすこと、
(c) 無傷の融合タンパク質を含むウイルスを増殖させること、
を含んでなる方法を提供する。
本発明は、基本的な方法論を応用することが望まれている、意図された手法に従って、いくつかの方法で構成され得る。ファージ展示技術におけるバックグラウンドを減少させるために、ビリオンの選択的切断を用いる。異種ポリペプチドを含まないか、または正確な折りたたみが可能でない異種ポリペプチドを発現するファージを切断して除去することにより、ファージ展示法の感度を実質的に増加させ得る。下記の実験の部で示されるように、本発明の方法論を用いると、ファージ展示は、従来法による展示技術では選択しにくいポリペプチドを選択するために使用される。
糸状ファージのタンパク質加水分解に対する抵抗性
実施例1〜6についての「材料および方法」を、実施例6の最後に添付する。
プロテアーゼ切断部位を有するファージの構築
いくつかのタンパク質加水分解部位を含む配列(PAGLSEGSTIEGRGAHE)を、ファージp3のD2とD3ドメイン間のグリシンに富んだフレキシブルな領域に挿入する。ファージ(fd-K108)を非変性条件下において、トリプシン、サーモリシンまたはズブチリシンとともにインキュベートすると、今回は感染力がほぼ完全に喪失し(107 TU/mlから10 TU/ml未満になる)、Glu-Cおよびキモトリプシンとともにインキュベートすると、感染力の重大な低下がもたらされる(107 TU/mlから104 TU/mlになる)。このことは、これらのプロテアーゼが新たなリンカーを切断することを示す。しかし、第Xa因子、Arg-Cまたはトロンビンとともにインキュベートしても、これらの酵素に対する切断部位となりうる部位が存在するにもかかわらず、感染力の低下にはつながらなかった。おそらく、本発明のポリペプチドの場合、D2およびD3ドメインの存在がこれらの酵素の接近または切断をブロックするのだろう。
プロテアーゼで切断可能なヘルパーファージおよびファージミドの構築
タンパク質のp3への融合は、該タンパク質のファージ上への多価性の展示をもたらすはずである。しかし、タンパク質をファージミド(pHEN1など[25])によってコードされるp3に融合し、ファージミドを担う細菌をヘルパーファージ(VCSM13など)でレスキューする場合、該融合タンパク質はファージへの取り込みについてヘルパーp3と競合しなければならない。このことにより、各ファージ粒子に結合した融合タンパク質のコピー数が通常1つ未満である、いわゆる「単量体性(monomeric)」ファージがもたらされる[26]。
「単量体性」ファージの使用は、高親和性相互作用の選択に対して有利であると期待できるかもしれない。さらに、「単量体性」ファージ内の融合タンパク質は、融合タンパク質の多量体間の相互作用が避けられるので、タンパク質加水分解を受けやすいはずである。しかし、不利な点は、感染性ファージの大部分がタンパク質を展示しないことである。固相に非特異的に結合するこのようなファージは、各ラウンドごとのファージ増殖の間に増幅される。
プロテアーゼで切断可能なヘルパーファージを用いたファージ抗体ライブラリーの構築
細菌を、p3のN末端に融合したscFVフラグメントのレパートリーをコードするファージミドDNAとともにエレクトロポレーションにかけ、液体培地(2xTY、ファージミドを含有する細菌を選択するための抗生物質、および遺伝子3の発現を抑制するためのグルコースを含む)中で増殖させる。細菌増殖の中間対数増殖期(OD600 = 0.5)で、ヘルパーファージKM13を、ヘルパーファージと細菌の比が20:1になるように細菌に添加した。細菌を振とうさせることなく45分間、37℃にてインキュベートし、次の45分間は振とうさせてインキュベートした。細菌を遠心によって回収し、ファージミドDNAの存在について選択するために、50μg/mlのカナマイシンおよび抗生物質を含有するがグルコースは含有しない新鮮な培地に再懸濁する。この培養物を振とうしながら30℃で一夜増殖させる。
モデルとしてバルナーゼ(barnase)を用いた折りたたみの選択
バルナーゼは110個のアミノ酸残基からなる小さなRNaseであり、その折りたたみについて詳細に研究されている(検討のためには[2])。バルナーぜは複数のトリプシン切断部位を有するが、その折りたたまれたタンパク質は切断に抵抗する(データ示さず)。従って、D2とD3の間にバルナーゼをクローン化したファージは、プロテアーゼ切断に抵抗し、選択可能である。
モデルとしてビリン(villin)を用いた折りたたみの選択
f-アクチン-束形成タンパク質であるビリン[32]のヘッドピース(headpiece)ドメインの35アミノ酸からなるサブドメインは、バルナーゼよりもずっと小さい。それにもかかわらず、該サブドメインは室温で安定な折りたたみを形成し、タンパク質加水分解に抵抗する。さらに、その安定性はジスルフィド結合または結合リガンドに起因するものではない[33]。該ビリンサブドメイン(潜在的トリプシン切断部位をいくつか含む)をファージのD2とD3ドメインの間にクローン化し、種々の温度でトリプシンとともにインキュベートする。感染力低下の様相はバルナーゼの場合ほどシャープではなく、主な移行(トランジション)は35℃以下であり、ビリンの熱によるほぐれ(70℃)よりもかなり低い[32,33]。ビリンを展示するファージを、ファージミドpK1およびヘルパーファージKM13を用いて作製したファージと混合し、トリプシンとともにインキュベートする。1ラウンドのタンパク質加水分解選択の後、ビリン融合タンパク質は8.7 x 103倍に濃縮される(表 3)。
1:1〜1:108の比のバルナーゼ突然変異体(A+B)の混合物を37℃でのタンパク質加水分解によって選択した。24個(または2ラウンドでは36個)のファージクローンを分析し、各突然変異体の数を上に記した。a突然変異体の双方が安定であると思われる20℃での選択、b選択前。
ビリンファージとKM13でレスキューしたpK1を1:1〜1:106の比で混合したものを10℃でのタンパク質加水分解によって選択した。24個のファージクローンを分析し、それぞれの数を上に記した。a選択前。
材料
全ての制限酵素、T4リガーゼは、New England Biolabsから取得したものである。Taq DNAポリメラーゼは、HT Biotechnologyから取得したものである。Pfu DNAポリメラーゼは、Stratageneから取得したものである。Ultrapure dNTPは、Pharmaciaから取得したものである。プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤Pefablocは、Boehringer Mannheimから取得したものである(ただし、TPCK処理したトリプシンおよびキモトリプシンはSigmaから入手した)。他の全ての化学薬品は、同様にSigmaから取得したものである。
ファージのクローニングおよび増殖には、大腸菌TG1[42]を用いる。fd-DOG[43]またはその誘導体を有するTG1を、15μg/mlのテトラサイクリンを含有する2xTY中で一晩増殖させる。[27]に記載の如く、KM13またはVCSM13を用いてファージミドをレスキューする。2回のPEG沈降[44]により、ファージ粒子を調製する。
ファージベクターfd-DOG[43]を、プロテアーゼ切断可能なfd-K108の構築のための親ベクターとして用いる。ユニークな制限部位(SfiI、KpnI)を、Sculptor in vitro 突然変異誘発システム(Amersham)およびオリゴヌクレオチドpkリンカーを用いて、D2とD3との間のグリシンに富むスペーサー領域中に導入する(表4)。さらに、制限部位(ApaI、SalI)およびプロテアーゼ切断部位をコードする配列を、オリゴヌクレオチドpolyXaforおよびpolyXabackを用いてSfiIとKpnI部位との間にクローニングし、ベクターfd-K108を作製する。
プライマーBarnaseforおよびBarnaseH102AbackならびにPfuポリメラーゼを用いるPCR増幅のための鋳型として、単一バルナーゼ変異体、His102→AlaおよびLeu14→Ala[29, 46]をコードするベクターを用いる。得られるPCR産物(単一変異体、His102→Alaをコードするものと2重変異体、His102→Ala、Leu14→Alaをコードするもの)を、制限酵素SfiIおよびKpnIを用いて消化し、ベクターpK2に連結し、それぞれファージミドpK2BAおよびpK2BBを得る。得られるバルナーゼ遺伝子の配列を、PCRサイクル配列決定法により決定する。
変性剤に対する抵抗性については、PBS(25 mM NaH2PO4、125 mM NaCl pH 7.0)中の10 M尿素、または8 M GndHCl(塩酸グアニジン)および50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM CaCl2(バッファーA)を、10μlのファージ保存液(108〜1010TU)に加え、容量を1 mlとする。その条件は表1に明記してある。ファージを1〜2時間インキュベートし、次いで100μlのアリコートを1 mlのTG1(OD600 約0.5)に加え、連続希釈物を、15μg/mlのテトラサイクリンを含有するTYEプレートで培養する。極端なpH(2〜12)に対するファージの抵抗性については、TrisグリシンまたはTris HClバッファー(それぞれ0.1 M グリシンまたは0.1 M Tris)を、10μlのファージ保存液に加える。各100μlのアリコートを中和するために、感染前に50μlの1 M Tris-HCl pH 7.4を加えた。温度に対する抵抗性については、バッファーAを10μlのファージ保存液に加え、容量を1 mlとし、所与の温度(20〜60℃)で1時間インキュベートする。100μlのアリコートをTG1に加え、上記の如く培養する。プロテアーゼに対する抵抗性については、100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、1 mM CaCl2 pH 7.4 (100 ng/mlのXa因子もしくはトリプシン、キモトリプシン、トロンビン、サーモリシンおよびズブチリシン、全て100μg/ml)または50 mM Tris-HCl、1 mM EDTA pH 7.4 (IgAプロテアーゼ 10 ng/ml)または50 mM NH4CO3 pH 8.0 (Arg-C 100μg/ml、Glu-C 100μg/ml)または25 mM NaH2PO4、125 mM NaCl pH 7.0 (AspN 40 ng/ml)を、10μlのファージ保存液(fd-DOGおよびfd-K108)に加え、容量を100μlとし、プロテアーゼの最終濃度を示したとおりにする。消化物を室温にて15分間インキュベートし、次いでサンプル(100μl)を上記の如くTG1に感染させる。
ファージ(KM13を用いてレスキューしたpHEN1およびVCSM13を用いてレスキューしたpK1)を、トリプシン(50 ng/ml)による切断の前後にSDS-PAGE[47]にかける。PVDFメンブランに半乾燥移行した後のフィルターは、本質的に[27]に記載の如く処理する。1次抗体、モノクローナル抗gIII(MoBiTec)を、1:5000の希釈率で加え、次いで抗マウスHRP結合抗体(Sigma)を1:50000の希釈率で加える。最後に、ルミノールに基づくChemiluminescence Western Blottingキット(Boehringer Mannheim)を用いて、フィルターを現像する。
RNase阻害剤バースター(barstar)への結合について、[44]に記載の如くファージ展示バルナーゼ変異体を分析する。10 pmolのビオチン化バースターを、バルナーゼ変異体Aもしくはバルナーゼ変異体Bまたはビリンを展示する約1010個のファージあるいはバッファーAと混合する。バースターに結合するファージを、ストレプトアビジン被覆プレート(Boehringer Mannheim)上に捕捉し、HRP結合抗M13抗体(Pharmacia)および2,2'-アジノ‐ビス(3‐エチルベンズチアゾリン‐6‐スルホン酸)(Sigma)を用いて発色させる。吸光度の読み取りは405 nmで行う。
各温度で、バルナーゼ変異体またはビリンを展示する約1010個のファージ(アンピシリン抵抗性)を、切断可能な対照fd-K108(テトラサイクリン抵抗性)および切断不可能な対照ファージミドであるKM13によりレスキューしたpHEN1のクロラムフェニコール抵抗性誘導体と、総容量90μlのバッファーA中で混合した。示した温度にて20〜30分間平衡化させた後、10μlのトリプシン(5μg/ml)を加え、インキュベーションをさらに2分間続ける。4μlの100 mM Pefablocを加えてトリプシンを中和する。TG-1において、上記の如く感染および連続希釈を実施し、アリコートを、100μg/mlのアンピシリン+1%グルコース、30μg/mlのクロラムフェニコール+1%グルコース、または15μg/mlのテトラサイクリンを含有するTYEプレートで培養する。
バルナーゼ変異ファージAの10μlの連続希釈液を、70μlのバッファーA中で10μlの非希釈バルナーゼ変異ファージBと混合する。20℃または30℃で30分間インキュベートした後、10μlのトリプシン(5μg/ml)を加える。2分の消化後、4μlのPefabloc(100 mM)を加える。上記の如く、ファージをTG1に感染させる。3 mlの2xTY中で細菌を擦り取って選択の第2ラウンドを実施し、その50μlを50 mlの2xTY/Amp/Glu中に接種して、上記の如くファージミドをレスキューし、ファージを調製する。プライマーLSPAforおよびLSPAbackを用いるPCRによりクローンを分析し、次いでDdeIを用いて制限消化する。
シグナル配列の選択のためのプロテアーゼ切断可能ヘルパーファージの使用
タンパク質の転位は、シグナルペプチドにより指令される[48]。これらは、正に荷電したアミノ末端領域、疎水性配列、およびシグナルペプチダーゼ切断部位を含むカルボキシ末端領域などの共通の特徴を有することが知られている。シグナルペプチドは、「タンパク質間相互作用およびタンパク質‐脂質相互作用のアレイ」に関与する[49]。さらに、シグナルペプチドは、タンパク質の折りたたみ経路を妨げる可能性がある。また、それらは、主として下流のボックスを介して翻訳の調節に関与している。
感染性ファージ粒子数としてファージ力価を測定し、トリプシンで処理した後の感染性ファージ粒子数としてファージポリメラーゼ力価を測定する。ファージ粒子当たりのファージポリメラーゼ数は力価の比である。ヘルパーファージを用いてファージ粒子をレスキューしたので、ファージは、p3‐ポリメラーゼ融合タンパク質およびトリプシン切断部位を含有するp3の数コピーか、またはこれらのp3コピーのみのどちらかを展示する。
0 mM IPTG 1.7x10-3 9.1x10-4 1.2x10-3
0.1 mM IPTG 9.1x10-3* 8.3x10-3 2.4x10-3*
1 mM IPTG 1.5x10-2* 5.5x10-3* 1.2x10-3*
*これらの条件では、ファージ力価が1010/ml(培地)以下に低下する。
リーダー 力価 ファージ粒子当たりの
x1011 ファージポリメラーゼ数
pelB 1.2 9.1x10-4
17 2.0 2.5x10-2
19 0.5 8.3x10-3
110 0.7 4.3x10-2
112 1.6 1.4x10-2
ランダム化DNA配列を5'から3'方向に示す。その上下に、シグナル配列pelB、17、19、110および112中で所与の配列と異なる塩基を示す。シャイン-ダルガルノ配列、開始コドンおよびシグナル配列の最後のコドンGCCには下線を付してある。HindIII制限部位およびNcoI制限部位を斜体で示す。対応するアミノ酸配列を下に示す。まずpelBリーダーからライブラリーIを、g3リーダーからライブラリーIIを設計する。
プロテアーゼ切断可能なヘルパーファージを用いた触媒活性の選択
ファージ展示による触媒の選択のための戦略は、触媒反応の反応生成物の選択および触媒を選択するための近接効果の使用に基づいている。この戦略では、タグを付した基質が、展示された酵素の近くでファージに架橋されると、該ファージは固相に結合し、展示された酵素[53]によって触媒された分子内切断反応により遊離する。
φiおよびφfは、選択の前[a]および後[b]の形質転換ユニット数(tu)を意味する。収率=φf/φi
[c]:+プライマー1b、+ビオチン化 dUTP 2、+鋳型 3、および+トリプシン。
ジスルフィド含有ポリペプチドの選択
DNA断片をコードする(ポリ)−ペプチドのクローニング、および選択のためバルナーゼとp3との間にそれらを展示するために、ファージ fd-3を構築する(図5)。ファージ fd-3には、ファージ fd-TETのp3遺伝子にN末端が融合したバルナーゼのH102A突然変異体が含まれる。バルナーゼの最後の残基のコドンと、p3の最初の残基のコドンの間には、ヌクレオチド配列 CTG CAG GCG GTG CGG CCG CAがある。この配列には、PstI 制限部位により挟まれるDNA断片を挿入するためのPstI DNA制限部位(下線付き)が含まれる。更に該配列にはバルナーゼとp3との間にフレームシフトが導入され、これはfd-3における正確なp3リーディングフレームの発現を妨げる。従ってファージ fd-3のファージ粒子は、感染タンパク質p3を展示せず、非感染性である。
20mM DTT洗浄を行なわない、トリプシンおよびサーモリシン(それぞれ2ng/μl)によるファージのタンパク質加水分解後のバルスター結合(−DTT)は、プロテアーゼ処理を行なわない場合のファージのバルスター結合のシグナルの少なくとも60%であるシグナルの測定により決定する。20mMDTT洗浄後のバルスター結合(+DTT)は、20mM DTT洗浄を行なわない場合のバルスター結合(−DTT)のシグナルの少なくとも60%であるシグナルの測定により決定する。ファージを、トリプシン(Tr)またはサーモリシン(Th)によるタンパク質加水分解を1ラウンド(1×)または2ラウンド(2×)行なった後にランダムに取り上げる。ファージをプロテアーゼで処理し、マイクロタイターウエルプレート中のビオチン化バルスターで捕捉して、そして適用可能な場合には20mM DTTで洗浄する。結合したファージは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗M13ファージ抗体(Pharmacia Biotech)で検出する。
ジスルフィド関連バックグラウンドを取り除くための還元剤の使用
実施例9に記載のポリペプチドのレパートリーを、上述のようにトリプシンおよびサーモリシンの両方で消化する(実施例9)が、本実施例では、タンパク質分解的に処理したファージの、ストレプトアビジン−ビオチン化バルスターで被覆したマイクロタイターウエルプレートへの結合の後で50mM DTTによる追加の洗浄ステップを行なう。この洗浄ステップは、N末端バルナーゼタグを展示するファージを洗い流すために行ない、該タグはもはや無傷のポリペプチド主鎖を介してp3に結合しているのではなく、バルナーゼタグとp3の間のポリペプチドインサート中のシステイン側鎖間のジスルフィド結合を介して結合しているにすぎない。
トリプシンおよびサーモリシン(それぞれ2ng/μl)によるファージのタンパク質加水分解とそれに続く50mMDTT洗浄の後のバルスター結合(+DTT)を、バルスター結合(+DTT)のシグナル(それはプロテアーゼ処理を行なわない場合のファージのバルスター結合のシグナルの少なくとも60%である)を測定することによって決定する。ファージは、トリプシン(Tr)および/またはサーモリシン(Th)によるタンパク質加水分解性の2ラウンド(2×)の後にランダムに取り上げる。ファージを、プロテアーゼで処理し、マイクロタイターウエルプレート中のビオチン化バルスターで捕捉し、そして適用可能な場合には50mM DTTで洗浄する。結合したファージを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗M13ファージ抗体を用いて検出する。
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Claims (2)
- ファージミドのヘルパーファージレスキューによって作製される、ファージミド由来のウイルス外被タンパク質を提示する子孫ファージを選別する方法であって、該ヘルパーファージはプロテアーゼ感受性切断部位を含むウイルス外被タンパク質をコードしており、該方法は、
a) 子孫ファージを、プロテアーゼ感受性切断部位を切断できるプロテアーゼにさらして、ファージミド由来のウイルス外被タンパク質を提示する子孫ファージを選別すること、ここで、ファージミド由来のウイルス外被タンパク質は切断に耐性であるが、ヘルパーファージ由来のウイルス外被タンパク質は切断に感受性であり、その結果、ヘルパーファージ由来のウイルス外被タンパク質を提示する子孫ファージは切断により非感染性となる、および
d) 感染によってファージミド由来のウイルス外被タンパク質を提示する子孫ファージを増殖させること、
を含んでなる方法。 - プロテアーゼ感受性切断部位が糸状バクテリオファージM13、fdまたは関連種のp3内に含まれる、請求項1記載の方法。
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