NO329172B1 - Fremgangsmate for seleksjon av et korrekt foldet fusjonspolypeptid - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for seleksjon av et korrekt foldet fusjonspolypeptid.

Virus har blitt anvendt for presentasjon ("display") av

peptider og proteiner [21, 26, 44]. Spesielt har filamen-

tøse bakteriofager blitt anvendt for å presentere proteiner og peptider ved fusjon av genene som koder for proteiner eller peptider til genene som koder for et fagkappeprotein.

Idet fusjonsgenet er innkapslet i fagen som presenterer fusjonsproteinet, så gir dette en kopling til fenotype og genotype. Repertoarer av proteiner kan kodes for av en populasjonsfag, og en sjelden fag som omfatter proteiner med predefinerte bindingsaktiviteter isolert ved binding til en fastfase. På denne måte har syntetiske humane antistoff av predefinerte antigenbindende spesifisitet,

blitt selektert fra repertoar av antistoff-fragmenter sammenstilt fra forskjellige strukturelementer. Idet antistoffet må foldes for å binde antigen, vil seleksjon for binding også selektere for foldning. Dette prinsipp har også blitt anvendt for seleksjon av foldete peptider hvor binding er mediert av diskontinuerlig epitop [8, 11-13].

Et problem med foreliggende fagpresentasjonssystemer er

nærvær av høye nivåer av bakgrunn forårsaket av nærvær av fag som ikke fremviser de ønskede polypeptider. For eksempel vil antistoffrepertoar vanligvis kodes for av fusjonsproteiner med p3-proteinet for fagomidvektorer og er innkapslet ved anvendelse av hjelperfag. Hjelper-fagkappeprotein konkurrerer med fusjonen av antistoff og kappeprotein (kodet på fagemid), og fører til fag med "monovalent" istedenfor multivalent presentasjon av foldete antistoff-fragmenter. Dette kan anvendes ved å diskriminere mellom affinitet og tilgjengelighet (med multivalent presentasjon) av antistoffene presentert på fagen. Imidler-

tid vil hoveddelen av fagene kun presentere hjelper-fag-kappe-protein som bidrar til en "bakgrunnsbinding" til antigen. I dette tilfellet er det ønskelig å selektere for

fag som presenterer foldete antistoff, og eliminere de som ikke gjør det.

Videre vil alle systemer som finnes i dag anvende bindingsaktivitet i polypeptidet for å selektere for å utføre isoleringen av de fremviste antistoff fra de som ikke koder polypeptider som har en ønsket karakteristikk. Dette gir en begrensning på tilgjengelige presentasjonssysterner for å selektere foldete polypeptider som oppviser en kjent bindingsaktivitet. Det vil være ønskelig å etablere middel for seleksjon av fremviste proteiner eller polypeptider som er uavhengig av dets bindingsaktivitet.

For eksempel er det en betydelig interesse i å konstruere foldete proteiner de novo. Forsøk har blitt utført for å konstruere proteiner de novo ved å sammenstille predefinerte elementer av sekundærstruktur, og også fra vilkårlige sekvenser (for oversikt [5]). I noen tilfeller har de konstruerte proteiner blitt vist å inneholde elementer av sekundærstruktur men mangler den stabile tertiære inter-aksjonskarakteristikk av foldete native proteiner, og det er foreslått nærvær av smeltede globuler (se [6] og referanser deri). Mer suksessfull har dannelse av nativ-lignende proteiner basert på pre-eksisterende backbone [7, 8] vært. I disse tilfeller vil bindingsaktivitetene for de de novo-konstruerte proteiner være ukjent. I dette tilfellet er det ønskelig å selektere for fag som fremviser foldete proteiner, og å eliminere de som ikke gjør det.

Selv om det er blitt gjort forsøk for å screene for foldete proteiner ved deres evne til å overleve degraderende enzymer i bakterier [16-18], så gir slike metoder ikke mulighet for seleksjon dersom bakteriell vekst eller overlevelse ikke avhenger av funksjonen av de foldete proteiner. Disse systemer er således kun anvendbare for en liten del av polypeptidene som man ville ønske å selektere i samsvar med evne til å folde.

Det er tidligere blitt vist at innsetting av en polypeptid-sekvens mellom en proteolytisk stabil markør ("tag") fusjonert til det mindre fagkappeproteinet p3 og p3-proteinet selv, etterfulgt av proteolyse, gir mulighet for å selektere for fag som bærer peptidsekvenser som er utsatt for proteolyse [19, US Patent 5,780,279]. I disse eksperimenter er fag bundet til en affinitetsresin som binder en N-terminal, proteolytisk stabil markør på fagen. Dersom den bundne fag underlegges proteolyse og eluering, vil kun fag med spaltbare sekvenser elueres. Denne metode anvendes for å identifisere, blant et repertoar presentert på fag, aminosyresekvenser som er egnet som substrat for proteaser. Sekvensene som introduseres er korte og vil ikke være i stand til å folde seg uavhengig. Videre selekterer systemet spesielt for eluert istedenfor bundet fag, mao. er det spesielt konfigurert for å isolere spaltete og ikke ikke-spaltede fag.

W092/156479 (Protein engeneering corporation) omtaler en fremgangsmåte for fagpresentasjon hvor setespesifikke spaltbare linkere kan inkorporeres inn i fagene, for eksempel som en del av et kimerisk kappeprotein så som gen III for å overvinne problemet med irreversibel binding ti målmaterialet. Anhydro-trypsin modifisert for å beholde den spesifikke binding av trypsin men ikke proteaseaktiviteten ble anvend for å gjenkjenne korrekt foldete funksjonelle proteiner på overflaten av MK-BPTI-fag.

Den foreliggende oppfinnelse utnytter applikasjon av peptidspalting for å eliminere ikke ønskede virus.

I samsvar med et første aspekt vedrører foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for seleksjon av et korrekt foldet fusjonspolypeptid, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) tilveiebringe et flertall av virioner som koder for og presenterer et repertoar av fusjonspolypeptider, idet nevnte fusjonspolypeptider omfatter et heterologt polypeptid innsatt i sekvensen av et viralt kappeprotein-polypeptid, hvor et proteasesete er lokalisert i fusjonspolypeptidet slik at setet beskyttes fra proteasespalting i korrekt foldete fusjonspolypeptider og ikke beskyttes fra spalting i polypeptider som ikke er korrekt foldet, og hvor nevnte repertoar omfatter minst delvis ikke-foldete og foldete medlemmer;

(b) eksponere virionene til en protease hvorved virioner som presenterer korrekt foldete

fusjonspolypeptider er resistente til spaltning av nevnte protease; og hvor de som ikke oppviser korrekt foldete polypeptider ikke er resistente til spaltning av nevnte protease; (c) formere de virioner som omfatter intakt fusjonsprotein.

Ytterligere utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 2-7.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse kan virus selekteres ved spalting av ikke-resistente virioner ved anvendelse av en protease. Som anvendt heri benevner termen "virus" et infeksiøst inokulum av virioner, som kan inkorporere spaltingsseter, valgfritt som en del av heterologe polypeptider som kodes for av det virale genom. Dermed kan "virus" benevne et flertall virioner, så som de som koder for et repertoar av polypeptider, eller alternativt dersom sammenhengen krever det, kan termen anvendes for å benevne ett enkelt virion. Termen "virus" inkluderer ethvert egnet virus som kan inkorporere et spaltingssete, enten naturlig eller gjennom manipulasjon. Et foretrukket virus for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er bakteriofag, fortrinnsvis filamentøs bakteriofag.

Termen "polypeptid" anvendes generelt for å benevne molekyler konstruert av et flertall aminosyrer, idet aminosyrene er koblet sammen kovalent, så som igjennom peptidbindinger. "Fusjon"-polypeptider er i hovedsak polypeptider som er inkorporert inn i virale kappeproteiner, så som en fusjon dannet mellom det virale kappeprotein og det aktuelle polypeptid. Fusjonen kan inkorporere polypeptidet i det virale kappeprotein, fordelaktig mellom domener derav, eller plassere det på den ene enden derav, for å lage en terminalfusjon. Polypeptidet benevnes som et heterologt polypeptid, for å angi at det er heterologt i forhold til det virale kappeprotein hvortil det er innsatt. Det er imidlertid mulig at det er avledet fra en annen type polypeptid av viruset.

I en betydning angis polypeptid vekselvis med "protein" idet dette ikke medfører en forskjell i struktur eller størrelse. I hovedsak kan ethvert polypeptid selekteres med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderende strukturelle polypeptider, polypeptider som har enzymatisk aktivitet og polypeptider som har bindingsaktivitet, inkluderende antistoff og antistoff-fragmenter. Spaltingsseter kan foreligge i polypeptidene, og kan være naturlig forekommende, eller de kan være konstruert inn i polypeptidet eller i et linkerpeptid tilkoblet dertil. "Polypeptid" kan også angi innsatte polypeptider som i hovedsak er ikke-foldende polypeptider, og fungerer for å kode et spaltingssete og innsette dette sete til kappeproteinet i et virus. Innsatte polypeptider kan ta del i dannelse av N- eller C-terminale fusjoner, eller være en del av selve kappeproteinet.

Et "spaltingssete" er et sete som er i stand til å spaltes idet det eksponeres for et spaltingsmiddel. I følge foreliggende oppfinnelse er anvendelse av proteasespaltingsseter, som er i stand til å bli spaltet av proteaser, benyttet. Proteasespaltingsseter kan være en del av, eller inkorporert i, polypeptider i samsvar med foreliggende oppfinnelse, eller de kan alternativt være uavhengig konstruert inn i kappeproteinet i viruset. En egenskap med spaltingssete er at det enten skal være fraværende fra viruset andre steder enn det stedet for dets spesifikke innsetting i samsvar med foreliggende oppfinnelse, eller ikke tilgjengelig for spalting, eller at det kun foreligger i virale proteiner som ikke er påkrevet etter virionsammen-stilling for å mediere infeksjon.

I samsvar med oppfinnelsen kan det spaltbare sete innsettes eller foreligge i enhver egnet posisjon i viruset. Fordelaktig er det imidlertid innsatt i, eller foreligger i enten selve kappeproteinet eller det heterologe polypeptid som danner del av fusjonspolypeptidet.

I et foretrukket aspekt av foreliggende oppfinnelse kan mer enn ett spaltingssete anvendes. For eksempel kan ett sete innsettes eller på annen måte være kjent å foreligge i viruset, mens nærvær av et annet sete kan være ukjent eller uavhengig av randomisering av den heterologe polypeptid-sekvens.

Dersom et virus inneholder en disulfidbinding vil spalting av et proteasespaltbart sete lokalisert mellom de to cysteinenheter som danner bindingen gjennom deres sidekjeder ikke føre til tap av viral infektivitet siden disulfidbindingen er i stand til å opprettholde den kovalente binding av de virale polypeptider.

I tilfelle hvor seleksjonen av disulfidinneholdende polypeptider ikke er ønskelig, behandles virusene fortrinnsvis med et reduserende middel før eller etter proteolyse, for å eliminere bakgrunnsfarging for viruser som har blitt spaltet av proteasen men som ikke har blitt holdt sammen av disulfidene.

Fusjonspolypeptid kan omfatte én eller flere heterologe polypeptider. I tilfelle en terminalfusjon, kan et slikt heterolog polypeptid fungere som et protein-tagg og mulig-gjøre at man kan identifisere fag som uttrykker fusjonspolypeptidet. Spaltingssetet kan, i et slikt tilfelle, være posjonert i eller nært tagg, slik at spalting av spaltingssetet frigjør taggen.

En markør ("tag") er enhver egnet enhet som er i stand til og bindes til en ligand som kan anvendes for å isolere et virus ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Således, markøren er resistent til proteasen anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Eksempler på markør/- ligand-par inkluderer barnase/barstar, avidin/-biotin, antistoff- eller antistoff-fragmenter og ligander, kelaterende grupper og kelater, f.eks. metaller o.l.

I alle utførelser ifølge foreliggende oppfinnelse, som er beskrevet i større detalj nedenfor, selekteres det for de ikke-spaltede polypeptider, og det avspaltede materiale fjernes i seleksjonstrinnet.

Fortrinnsvis koder viruset i samsvar med foreliggende oppfinnelse for et repertoar av heterologe polypeptider. Et repertoar er en samling medlemmer, fortrinnsvis polypeptider, som avviker noe fra hverandre på en tilfeldig eller delvis tilfeldig måte. Fortrinnsvis er et repertoar av polypeptider en samling variantpolypeptider som fortrinnsvis inkorporerer vilkårlige eller delvis vilkårlige mutasjoner. Som anvendt heri består et repertoar fortrinnsvis av 10^ medlemmer eller mere. Et repertoar omfatter fortrinnsvis et svært høyt antall medlemmer, typisk mellom 10^ og IO<11>, og potensielt IO<14> eller høyere.

Det heterologe polypeptid, eller repertoar av slike polypeptider, presenterer fortrinnsvis på overflaten av viruset som koder for det, ved hjelp av at det inkorporeres inn i kappeproteinet, eller på overflaten av celler infisert av viruset. Dersom viruset er en bakteriofag, kan proteinet også fremvises på overflaten av bakterier infisert med bakteriofagen.

Spaltingssetet er fortrinnsvis lokalisert i eller tilgrensende til det heterologe polypeptid, slik at det kan beskyttes ved foldning av det heterologe polypeptid, og dermed muliggjøre seleksjon for heterologe polypeptider som er i stand til å utføre korrekt foldning. Alternativt kan imidlertid det spaltbare sete være lokalisert i en avstand fra det heterologe polypeptid, og i slike tilfeller kan spaltingssete fungere for å muliggjøre reduksjon av bakgrunn i fagfremvisningsteknikkene. F.eks. muliggjør introduksjon av spaltingssete inn i hjelper-fag anvendt med fagemidkodene et repertoar av polypeptider at hjelper-fag kan fjernes ved spalting før infeksjon av vertsceller, og dermed dramatisk redusere bakgrunnen på grunn av "tomt" fag. Fortrinnsvis er derfor spaltingssete inkorporert inn i virusets kappeprotein.

Som benevnt heri er et fagemid en plasmidkloningsvektor som omfatter virale replikasjonssekvenser men som mangler minst én viral funksjon. Dette betyr at mens fagemid kan innsettes inn i vertsceller ved konvensjonell nukleinsyreover-føringsmetoder, og vil eksistere i vertscellene i en episomal form, så er de ikke i stand til å tilordne seg til virioner og dermed fullføre en viral infeksjonssyklus. Hjelper-fag anvendes for å forsyne de manglende virale funksjoner og bevirke at fagemid kan pakkes inn i virioner. I samsvar med oppfinnelsen kan fagemid kode for kappe-proteinfusjoner med heterologe polypeptider som inkorporerer et spaltingssete.

Hjelper-fag gir den virale fusjon som mangler i fagemid for å muliggjøre pakking av fagemid til virioner. I samsvar med oppfinnelsen kan hjelper-fag modifiseres for å gjøre de spaltbare av en protease. I et aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse kan hjelper-fag inkorporeres i et kappeprotein som har et spaltingssete som, idet det spaltes i "reddet" etterkommerfase, vil gjøre det hjelper-fag-avledete kappeprotein ikke i stand til å mediere infeksjon.

Som det vil fremgå fra det foregående, ifølge fremgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse, selekteres virus som er resistent mot spalting. Med fordel kan de resistente virioner selekteres ved infeksjon av utsatte vertsceller, så som bakterielle vertsceller. Spaltede virioner er ikke infektive. Alternativt er binding av virioner til en ligand, f.eks. via en markør, avhengig av beskyttelse av et spaltingssete i viruset, slik at viruser som er spaltet ikke isoleres ved ligand/markør-binding.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse kan konfigureres på en rekke forskjellige måter i samsvar med den tiltenkte prosedyre hvortil det er ønskelig å anvende hovedmetodologi. Selektiv spalting av virioner anvendes for å redusere bakgrunn i fagfremvisningsteknikker. Ved spalting og fjerning av fag som enten ikke inneholder heterologt polypeptid, eller uttrykker et heterologt polypeptid som ikke er i stand til å danne korrekt foldning, kan sensitiviteten av fagfremvisningsprosessen betydelig økes. Som vist i den eksperimentelle seksjon nedenfor, ved anvendelse av metodologien ifølge oppfinnelsen, kan fagfremvisningen anvendes for å selektere for polypeptider som ikke er utsatt for seleksjon ved fremvisningsteknikker i samsvar med kjente metoder.

I en første konfigurasjon kan spalting av et spaltingssete i et verionkappeprotein utnyttes for å redusere bakgrunn som skyldes fag som fremviser ikke-heterologe polypeptider, eller fag som fremviser heterologe polypeptider som er i stand til å foldes korrekt. Spalting av fremviste polypeptider, i samsvar med foreliggende oppfinnelse, resul-terer i at virusets evne til å oppnå infeksjon i vertsceller svekkes. Dermed, ved å formere viruser som har blitt eksponert for en protease er det mulig å anrike viruset for virioner som omfatter fremviste polypeptider som er resistent til spalting. Som anvendt heri skal termen "svekke" bety å redusere, og den inkluderer dermed delvis og fullstendig hindring av infeksjon av vertsceller ved affektert virus.

Kappeproteinet selekteres ved sete for spalting på bakgrunn av at det er tilgjengelig for spaltingsmiddel i de vertsceller som har virus, eller ved overflaten av selve viruset. Dermed, i en foretrukket utførelse, kan virus-preparater behandles med en protease, for å gjøre virioner som har spaltbare kappeproteiner ikke i stand til å mediere infeksjon i vertsceller. Alternativt kan celler infisert med viruset behandles med en protease som er aktivt i cellen, som vil hindre pakking av virus som omfatter et spaltbart kappeprotein.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse, kan referanse til seleksjon tolkes som en referanse til screening, siden de samme prosesser kan anvendes for å screene fag, noe som vil være innlysende for fagkyndige.

Proteaseseter kan være innsatt i kappeproteinet. Proteasespaltingsseter kan foreligge i polypeptider eller konstrueres som en integrert del av deres sekvens. Typisk kan proteasespaltingsseter defineres i termer av aminosyresekvenser som er utsatt for spalting av en protease. F.eks. omfatter oppfinnelsen anvendelser av proteasespaltingsseter som kan spaltes av én eller flere av proteasene; trypsin (spalter ved Lys, Arg), chymotrypsin (Phe, Trp, Tyr, Leu), termolysin (små ali-fatiske enheter), subtilisin (små alifatiske enheter), Glu-C (Glu), faktor Xa (Ile/Leu-Glu-Gly-Arg), Arg-C (Arg) og trombin.

Proteasespaltingsseter kan inkorporeres inn i kappeproteinet i et virus ved å konstruere en fusjon mellom kappeproteinet og et ytterligere polypeptid, idet det ytterligere polypeptid inneholder spaltingssete. Det ytterligere polypeptid bør innsettes ved en posisjon i det virale kappeprotein slik at det muliggjør tilordning av et funksjonelt viralt kapsid og påfølgende infeksjon, men at det ved spalting burde resultere i en svekkelse av infektivitet.

Dersom proteasespaltingssetet inkorporert i kappeproteinet forblir ikke-spaltet, er derfor viruset i stand til å tilordnes til funksjonelle virioner, og bevarer dermed potensielt for å infisere vertsceller. Dersom proteasespaltingssetet spaltes vil imidlertid strukturen av det virale kappeprotein bli ødelagt og viralet vil tape i det minste en del av dets potensiale til å infisere vertscellene .

I en foretrukket utførelse er viruset som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse en bakteriofag, fortrinnsvis filamentøs bakteriofag. Filamentøs bakteriofag anvendes bredt i fagfremvisningsteknikker for seleksjon av polypeptider fra fagbibliotek som koder for et stort repertoar derav. Således innsette repertoaret av polypeptider i p3-proteinet av filamentøs bakteriofag, men ethvert annet egnet sete kan benyttes innen rammen av foreliggende oppfinnelse.

I tilfelle p3-proteinet av filamentøs bakteriofag omfatter proteinet tre domener. N-terminalen Dl er involvert i binding til tolA-receptor, D2 i binding til F-pilus (og medierer infeksjon) og D3 ved å forankre proteinet til fagpartikkelen. Peptider og proteiner kan innsettes i domenegrensene uten å påvirke infektivitet [21, 22] men nærvær av alle domenene er essensielt for faginfektivitet

[23]. Bakteriofagen er resistent mot proteolyse (som mulig-gjør deres anvendelse som "substrat"-fag, [19]), men introdusering av polypeptider omfattende proteasespaltingsseter inn i p3, f.eks. i koblingen mellom domener fører til tap i infektivitet av fag ved proteolyse.

Proteasespaltingssetene kan inkorporeres i heterologe polypeptider. Som beskrevet ovenfor kan heterologe polypeptider kodes for i form av et repertoar i fagbibliotek. Idet foldete polypeptider eller proteiner ofte er resistente til proteolyse og ikke-foldete proteiner er sensitive, krever spalting at polypeptidkjeden bindes og tilpasses til den spesifikke stereokjemi ved det protease-aktive sete, og derfor til å være fleksibel, aksessbar og i stand til lokal utfolding [14, 15]. Kloning av polypeptider omfattende proteasespaltingsseter ved domenekoblinger i p3, etterfulgt av proteolyse, gir et middel for seleksjon av fag som bærer proteiner som er resistente til proteolyse, og som er foldet.

I tilfelle fagpresentasjonsrepertoarer (hvor polypeptidet som skal selekteres for er klonet ved N-terminus av p3) kodet på fagemidvektorer, gir anvendelse av hjelper-fag omfattende et polypeptid som omfatter proteasespaltingsseter ved domenegrenser, etterfulgt av proteolyse, et middel for seleksjon av fag som fremviser fusjonsproteinet ved eliminering av hjelper-fag etter at "hjelpen" har blitt gitt.

Anvendelse av proteasespaltbar hjelper etterfulgt av proteasespalting selekterer for fag som bærer fusjonsproteinet (og for god fremvisning). Idet mange fag i repertoaret ikke presenterer fusjonsproteiner [26], og disse bidrar til ikke-spesifikk binding til fagen, vil dette også forbedre seleksjonseffektiviteten. Ved anvendelse av tek-nikkene ifølge teknikkens stilling, vil kun mellom 0,1-1% av alle fagpartikler i et fagbibliotek omfatte et gen 3 protein fra fagemidet. Derfor vil hovedandelen (99-99,9%) av fagpartikler som har bundet ikke-spesifikt til det faste støttemedium anvendt i seleksjonen omfatte p3 fra hjelper-fag (uavhengig av genomet båret av fag-partikkelen, som mest sannsynlig vil være et fagemid DNA), idet disse partikler er ikke-infektive ved proteolyttisk spalting.

Oppfinnelsen omfatter valgfritt anvendelse av betingelser eller midler, under spalting av det spaltbare setet, som modulerer labiliteten av spaltingssetet i nærvær av proteasen. Denne løsning kan anvendes for å øke spaltning, for f.eks. for å selektere kun for polypeptider som foldes på en slik måte at de nært beskytter spaltningssete fra aksess av proteasen, eller å redusere spalting, f.eks. for å selektere stabile mutanter fra et repertoar av polypeptider som ordinært er relativt labile under spaltingsbetingel-sene.

For eksempel kan modulering av labiliteten av spaltingssetet oppnås ved anvendelse av midler som øker eller ned-setter slik labilitet. Således kan et proteindenaturerende middel inkluderes, ved en egnet konsentrasjon, for å destabilisere et polypeptid og gjøre det mer labilt. Alternativt kan en ligand for et polypeptid inkluderes. Liganden kan stabilisere den foldete struktur av polypeptidet, og gjøre den mindre sensitiv for spalting. Alternativt kan liganden destabilisere den foldete struktur av polypeptidet, f.eks. ved å favorisere tilpassing av en alternativ konfigurasjon. Dette kan gjøre polypeptidet mer aksessbart for proteasen, og dermed mer labilt.

Betingelsene for spaltingsprosessen forandres, ved å manipulere pH eller temperaturen hvorved spaltingen utføres, for å oppnå tilsvarende effekter. Således kan avvik fra pH fra det optimale for polypeptidet omfattende spaltingssetet forårsake at setet blir mer aksessbart for protease. Tilsvarende kan heving (eller senking) av temperaturen for betingelsene hvorunder polypeptidet spaltes gjøre polypeptidet mer eller mindre utsatt for spalting.

I noen tilfeller kan ikke-kovalente interaksjoner være ansvarlig for at peptider beholder sin struktur og at kappeproteiner forblir levedyktige, selv etter suksessfull spalting av det spaltbare setet. Anvendelse av denaturerende midler, temperaturvariasjon og andre potensielt destabiliserende teknikker, kan også anvendes for å nedsette sannsynligheten for at et spaltet polypeptid beholder sin struktur.

Proteolytisk seleksjon for proteinfolding kan anvendes i et antall tilfeller, idet metoden tillater at et langt større antall proteiner kan behandles enn ved konvensjonell screening. For eksempel muliggjør metoden isolering av mutante proteiner med forbedret stabilitet [1], f.eks. fra kombinatoriske biblioteker av mutanter hvor enheter med flere seter varieres samtidig [39, 40], eller fra vilkårlige mutanter, eller ved rekombinasjon [3, 4]. Den mulig-gjør også isolering av nye proteiner og arkitekturer fra store repertoarer av sekvenser [16-18, 41], og for for-bedring i foldingsstabilitet over flere runder av mutasjoner og økende stringensseleksjon, mye på samme måte som affinitetsmodning av antistoff.

En andre konfigurasjon ifølge foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av tagg (merker) for å muliggjøre isolering av korrekt foldete heterologe polypeptider, idet man benytter evnen til de korrekt foldete polypeptider til å beskytte et spaltbart sete på eller nær en assosiert tagg. Innsetting av et polypeptid mellom den stabile tagg fusjonert til N-terminus av det virale kappeprotein og selve kappeproteinet, etterfulgt av spalting, gir et middel for seleksjon av viruset som bærer proteiner som er resistente til proteolyse og som er foldet. Dermed vil kun virioner, hvis innsatte polypeptid ikke degraderes, beholde markørfunksjonen som en del av deres kappe, og kun disse virioner kan derfor opptas ved affinitetsrensing ved anvendelse av denne tagg. Etter eluering av de affinitets-opptatte faser fra liganden, kan disse fag propageres og underlegges ytterligere runder av den samme seleksjons-prosedyre.

Alternativt kan virioner bindes til en affinitetsmatriks, omfattende en ligand for markøren, før spalting. Spaltingsmiddelet kan deretter tilsettes, og kun resistent fag vil tilbakeholdes på matriksen. Disse kan deretter elueres som nødvendig.

Egnete matriser inkluderer kolonner, kuler og andre over-flater hvortil en ligand for taggen bindes.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse kan referanse til seleksjon tolkes som en referanse til screening, siden de samme prosesser kan anvendes for å screene fag, slik det vil være innlysende for fagkyndige.

Proteaseseter er i hovedsak som beskrevet for tidligere konfigurasjon ifølge foreliggende oppfinnelse, og er fortrinnsvis proteasespaltbare seter.

Spalting krever at polypeptidkjeden bindes og tilpasses til den spesifikke stereokjemi i det proteaseaktive sete, og derfor til å være fleksibel, aksessbar og i stand til lokal utfolding [14, 15]. Foldete polypeptider eller proteiner er ofte resistente til proteolyse, pga. relativt lite fleksibilitet i deres struktur, mens ikke-foldete proteiner forblir sensitive.

Som angitt ovenfor inneholder den mulige seleksjon av polypeptider fra et repertoar, som gjennom variasjon eller mutasjon, ikke inneholder en gjenkjenningssekvens for en bestemt protease anvendt i denne metode, kan omgås på to måter. For eksempel kan anvendelse av en cocktail av proteaser med svært distinktive gjenkjenningssekvenser sikre at alle polypeptider skulle være spaltbare, dersom de ikke er beskyttet av deres foldete status. Alternativt kan et fag-repertoar av polypeptider som skal selekteres være delvis denaturert, slik at det innsatte polypeptid brettes ut, mens fag og N-terminal-markøren blir intakt. Proteolytisk oppkutting etterfulgt av affinitetsrensing vil fjerne alle fag fra repertoaret, som har unnsluppet proteolyse pga. mangel på proteasegjenkjenningssekvens i polypeptidet. Fag som ikke er bundet av resinet, inneholder kun fag, som inneholder proteasegjenkjenningssekvensen i polypeptidet presentert og som kan eller kan ikke unnslippe proteolyse under ikke-denaturerende betingelser. Disse vil således underlegges proteolytisk seleksjon basert på beskyttelse av den foldete status av det fremviste polypeptid.

Seleksjonsprosessen kan også anvendes for identifisering av interagerende proteinelementer. Dersom to slike elementer som er koblet av et polypeptid som omfatter proteasespaltingsseter klones mellom N-terminalen, proteolytisk stabile tagg for fremvisning på fag og kappeproteinet, de eneste fag etter proteolyse, som kan opptas ved affinitetsbinding til tagg, er de hvis tagg og p3-protein holdes sammen av ikke-kovalente interaksjoner mellom interagerende proteinelementer.

Oppfinnelsen er videre beskrevet i de medfølgende eksempler, kun for illustrasjonsformål.

Eksempel 1. Resistens av filamentøs fag for proteolyse.

Materialer og metoder for eksempel 1-6 er tilføyet ved slutten av eksempel 6.

Fag inkuberes under et område med denaturerende betingelser in vitro og gjenvinnes deretter til native tilstander umid-delbart før infeksjon av bakterier. Inkubasjonen av fag i 10 M urea eller ekstreme pH (så lav som pH 2, og så høy som pH 12) og temperatur (så høy som 60°) førte ikke til et hovedtap av infektivitet (tabell 1). Dette indikerer at fagen enten er resistent til denaturerende betingelser eller at dersom det ikke foldes ut så er den i stand til å refoldes hurtig. Imidlertid, med GndHCl observeres et 5 gangers tap i fag-infektivitet på over 5 M, og et ytterligere 5 gangers tap ved 8 M (tabell 1).

Fag inkuberes deretter under native betingelser med en rekke proteaser (trypsin, Factor Xa, IgA protease, Asp-N, chymotrypsin, Arg-C, Glu-C, trombin, termolysin, subtilisin) med forskjellige spesifisiteter. Det er intet tap i infektivitet, med unntak for substilisin som har blitt rapportert å spalte p3 proteinet [24]. Dersom fag inkuberes under denaturerende betingelser i nærvær av proteaser såsom trypsin i 3,5 M urea (eller > 4 7°C) , tapes infektivitet. Dette indikerer at under denaturerende betingelser er utfolding av fagkappeproteinet ikke tilstrekkelig til å gjøre setene tilgjengelig for proteolyse.

Eksempel 2. Konstruksjon av fag med proteasespaltingsseter .

En sekvens (PAGLSEGSTIEGRGAHE) omfattende flere polypeptid-seter innsettes i den fleksible glysinrike region mellom D2- og D3-domener i fag p3. Inkubering av fag (fd-K108) under native betingelser med trypsin, termolysin eller substilisin resulterte nå i et omtrent fullstendig tap i infektivitet (fra 10^ til <10 TU/ml), og inkubering med Glu-C og chymotrypsin resulterte i et vesentlig tap (fra 10^ til 10^ TU/ml). Dette indikerer at disse proteaser spalter den nye linker. Imidlertid førte inkubering med faktor Xa, Arg-C eller trombin ikke til tap i infektivitet, til tross for nærvær av potensielle spaltingsseter for enzymer. Sannsynligvis kan nærvær av D2 og D3-domener blokkere aksess eller spalting for disse enzymer i tilfelle med det foreliggende polypeptid.

Eksempel 3. Konstruksjon av proteasespaltbar hjelper-fag og fagemid.

Fusjon av proteiner til p3 skal føre til multivalent fremvisning av proteinet på fagen. Imidlertid, dersom proteinet er fusjonert til p3, som er kodet for av et fagemid, så som pHENl [25]), og bakterien som bærer fagemidet reddes med en hjelper-fag (så som VCSM13), så må fusjonsproteinet konkurrere for inkorporering inn i fagen med hjelper-p3. Dette fører til såkalt "monomerisk" fag, hvor vanligvis mindre enn en kopi av fusjonsproteinet er koblet til hver fagpartikkel [26].

Anvendelse av "monomerisk" fag kan forventes å være fordelaktig for seleksjon av høyaffinitetsinteraksjoner. Videre forventes av fusjonsproteiner i "monomeriske" fag er mer sensitiv for proteolyse, idet interaksjoner mellom multimerer av fusjonsproteiner unngås. En ulempe er imidlertid at hoveddelen av de infektive fag ikke presenterer et protein, og slike fag som binder ikke-spesifikt til fastfaser mangfoldiggjøres under hver runde av vekst av fag.

Proteaserspaltbar hjelpefag konstrueres derfor, ved å introdusere proteasespaltingssekvens mellom D2- og D3-domener for å generere hjelper-fag KM13. KM13 er vist å redde fagemid pHENl. Videre er trypsin vist å spalte en hovedfraksjon (ca. 50%) av p3 for det reddete fag som vist med Westernblått og detektert med en anti-D3-mAb (fig. 1). Imidlertid påvirkes ikke i nevneverdig grad fag-infektivitet av spaltingen, og det synes derfor som om kun én fraksjon av p3 trenger å være fullstendig for å mediere bakteriell infeksjon.

KM13 er også vist å redde pHENl fagemid som koder for et enkeltkjedet antistoff-fragment [27]. Her resulterte spalting av trypsin i et 50 gangers tap i fag-infektivitet (data ikke vist), noe som er konsistent med indikasjoner av at kun en liten fraksjon av fag-ekspresjonsfusjonsproteinet ble reddet med hjelper-fag [26, 28].

Et protease-spaltbart fagemid konstrueres også. Fagemidet kan reddes med KM13 eller VCSM13. Som forventet vil infektivitet av dette fagemid reddes med KM13 (men ikke VCSM13) ødelegges av trypsin. Denne fagemidvektor er utsatt for deleteringer i D2-D3-kobler, ved å forandre kodonbruken i koblingsregioner på en av sidene av det proteasespaltbare setet, og forkorte lengden av disse koblingsregioner, en mer stabil vektor dannes (pKl, fig. 2). I en andre vektor (pK2, fig. 2) er sekvensen av polykobleren arrangert slik at D3 plasseres utenfor ramme for å gi religeringer innen polylinker ikke-infektiøs.

Eksempel 4. Konstruksjon av et fag-antistoff-biblio-tek ved anvendelse av protease-spaltbar hjelper-fag.

Bakterier elektroporeres med fagemid DNA som koder for et repertoar av scFv-fragmenter fusjonert til N-terminus av p3 og som fikk vokse i en væskekultur (2xTY inneholdende antibiotika for å selektere for bakterier inneholdende fagemid og glukose for å undertrykke ekspresjon av gen 3). I den midterste logg-fase av bakteriell vekst (OD600 = 0,5) tilsettes hjelper-fag KM13 til bakteriene for å gi et forhold mellom hjelper-fag og bakterie på 20:1. Bakteriene inkuberes ved 31°C uten risting i 45 min., og deretter med en risting i 45 min. Bakteriene innhøstes ved sentrifugering og resuspenderes i ferskt medium inneholdende 50 jig/ml kanamycin og antibiotika, uten glukose, for å selektere for nærvær av fagemid-DNA. Kulturen fikk vokse over natten ved 30°C med risting.

Bakterier fjernes fra den fag-inneholdende supernatant ved sentrifugering. Fag presipiteres fra supernatant ved å tilsette 1/5 av volumet av 20% PEG/ 2,5 M NaCl. Etter 1-2 timer ved 4°C innsamles den presipiterte fag ved sentrifugering. Fagen resuspenderes i PBS (en andre PEG-presipitering er valgfri) og kan anvendes ved seleksjon.

Fagbiblioteket tillates å binde til antigen (immobilisert på fast støttemedium så som en immunotub eller i løsning til markør (dvs. biotinylert) antigen som kan immobiliseres etter affinitetsbinding av fag-antistoff). Ikke bundet fag fjernes med den utstrakte vasking (stringentbetingelser for vaskingen kan varieres med hensyn til tid og detergenter tilsatt).

Fag-biblioteker omfattende en spaltbar markør, så som c-myc-markør som innsettes mellom antistoff og gen 3, kan elueres ved tilsetting av trypsin i løsning ved en konsentrasjon på 0,1 til 1 mg/ml. Fagbibliotek uten en spaltingssekvens mellom antistoff og gen 3 kan elueres ved tilsetning av 100 mM trietylamin. I tilfelle løsningen er nøytralisert ved tilsetning av 1 M Tris-HCl pH 7,4 og etter 10 min., tilsettes trypsin til en final konsentrasjon på 0,1 til 1 mg/ml. Trypsin spalter også kopier av gen 3 fra hjelper-fag, mens gen 3 fra fagemid holdes intakt. Dermed vil kun fag som har båret, eller fremdeles bærer, en antistoff-fusjon være infektiv.

Fag anvendes for å infektere bakterier i midterste logg-fase av vekst (OD600 = 0,5), og bakteriene utsås på agarplater inneholdende antibiotika som selekterer for fagemid-DNA. Individuelle kloner ble utvalgt, og fag fremstilt som ovenfor. Den resulterende fag anvendes i ELISA for å identifisere fag-antistoff som spesielt binder til det aktuelle antigen.

Eksempel 5. Seleksjon for folding ved anvendelse av barnaser som en modell.

Barnase er en liten RNase på 110 aminosyreenheter hvis folding har blitt grundig undersøkt (for oversikt [2]). Barnaser inneholder multiple seter for trypsinspalting, selv om det foldete protein er resistent til spalting (data ikke vist). Fag med barnase klonet mellom D2 og D3 skulle derfor være resistent for proteasespalting og i stand til seleksjon.

Idet barnase er toksisk for Escherichia coli, klones en mutant A (Hisl02->Ala) som er katalytisk inaktiv, men stabil, [29, 30] inn i fagemid pK2. En mutant B (Hisl02->Ala, Leul4->Ala) klones også, med lavere stabilitet, Leul4 er begravet i den hydrofobiske kjerne og dets mutering danner et stort hulrom i kjernen som påvirker pakking av forskjellige strukturelle elementer [31]. Fagene (som reddes med KM13) binder til inhibitor-barstar ved ELISA (fig. 3), og fremviser derfor den mutante barnase i en foldet form.

Fagene inkuberes deretter med trypsin i et temperaturområde (fig. 4). Etter inkubering ved 10<*>C er det en nedgang i fag-infektivitet på 5 til 10 ganger for begge mutanter, noe som foreslår at man (se ovenfor med frem-visningen av scFv-fragment) kun en liten fraksjon av fagene fremviser fusjonsproteinet. Det er intet ytterligere tap i infektivitet ved spalting inntil 30°C (fra mutatn B) eller 37<*>C (fra mutant A). I begge tilfeller er hovedtransisjonen ved minst lO^C under det som forventes for den reversible termiske utfolding av mutantene.

Fag A og B blandes i forskjellige forhold og inkuberes med trypsin ved 20<,C, hvor begge mutanter er stabile mot spaltning, eller ved 37<*>C hvor kun A er stabil. Etter "proteolytisk seleksjon" utsåes fagene og analyseres ved PCR, som etterfølges av restreksjonsoppkutting for å skille mutantene. Som vist i tabell 2 er mutant A anriket med en faktor på 1,6 x 10^ etter en enkelt runde, og med 1,3 x 10^ etter to runder proteolytisk seleksjon ved 37°C. Ingen anriking kan detekteres ved 20°C.

Eksempel 6. Seleksjon for folding ved anvendelse av villin som en modell.

Subdomener på 35 aminosyrer i hode-domenet av f-aktin-bundtproteinvillin [32] er mye mindre en barnase. Den danner allikevel en stabil folding ved romtemperatur og er resistent mot proteolyse, og videre er ikke dens stabilitet avhengig av disulfidbindinger eller bindingslegander [33]. Villin-subdomenet (som inneholder flere potensielle trypsinspaltingsseter) klones mellom D2- og D3-domenene i fagen, og inkuberes med trypsin ved forskjellige temperaturer. Profilen for tap av infektivitet er ikke så skarp som med barnase, med hovedtransisjonen under 35°C, betydelig under den termale utfolding av villin (70<,C) [32, 33] . Fagen som fremviser villin blandes med fag, som ble produsert ved anvendelse av fagemid pKl og i hjelper-fag KM13, og inkuberes med trypsin. Etter en enkelt runde av proteolytisk seleksjon anrikes villin-fusjonsfagen 8,7 x IO<3> ganger (tabell 3).

Oppsummert, resultatene fra eksempler 1 og 2 viser at infektiviteten av fagen er relativt resistent til temperatur, pH, urea og GndHCl, og til flere proteaser, men dersom en fleksibel kobler som omfatter et proteasespaltingssete innsettes mellom domener D2 og D3 i fagkappeproteinet p3, blir fagen sensitiv til spalting. I motsetning, som vist i eksempler 5 og 6, dersom proteasespaltingssetet omfatter et foldet proteindomene så som barnase eller villin, er fagen resistent til spalting. Dette muliggjør for proteolytisk seleksjon for proteinfolding, med anrikelsesfaktorer på større enn 10^ ganger for en enkelt runde med seleksjon. Seleksjon er tydelige for både barnase, et gjennomsnittlig domene på størrelse av 110 aminosyrer og for villin, et lite domene på 35 aminosyrer.

Diskriminering mellom strukturer av forskjellige stabili-teter kan utføres ved å øke stringensen i proteolytisk seleksjon. Dermed, med økning i temperatur vil både barnase og villin bli utsatt for spalting, noe som reflekterer proteinutfolding. Hovedinnvirkningen på proteasespalting er ved en temperatur lavere enn utfoldingstransisjonen som målt med sirkulær dikroisme [38]. Dette kan reflektere det faktum at utfoldingstransisjonen er en fullt reversibel prosess, mens spalting med proteaser (av utfoldet struktur) er en kinetisk og irreversibel prosess, som skyver like-vekten over fra foldet til utfoldet (og spaltet) struktur. Dette er i samsvar med CD-utfoldingstransisjonen som sees med villin [33], hvor det ved temperaturer så lavt som 35°C er bevis på utfolding, det samme punkt hvorved villin starter og blir utsatt utsatt for proteaseangrep.

Tabell 2. Seleksjon av barnase-mutanter.

Blandinger av barnasemutanter (A+B) i forholdstall fra 1:1 til 1:10<8> ble selektert ved proteolyse ved 37<*>0, 24 (eller 36 i runde 2) fagkolonier ble analysert og antallet av hver mutant ble notert over. <a>Seleksjon ved 2CC på begge mutanter er forventet å være stabil, -<k>før seleksjon. Blandinger av villin-fag og pKl reddet med KM13 i forhold fra 1:1 til 1:10<6> ble selektert med proteolyse ved 10<*>C, 24 fagkloner ble analysert og antallet av hver ble notert over. <a>før seleksjon.

Materialer og metoder (eksempler 1-6)

Materialer

Alle restriksjonsenzymer, T4 ligase er tilgjengelig fra New England Biolabs. Taq DNA polymerase er tilgjengelig fra HT Biotechnology. Pfu DNA polymerase er tilgjengelig fra Stratagene. Ultraren dNTP fra Pharmacia. Protease og proteaseinhibitor Pefabloc er tilgjengelig fra Boehringer Mannheim, med unntak av chymotrypsin og trypsin TPCK-behandlet som er tilgjengelig fra Sigma. Alle andre kjemi-kalier er også tilgjengelig fra Sigma.

Fremstilling av fag

Escherichia coli TG1 [42] anvendes for kloning og propa-gering av fag. TG1 som lokaliserer fd-DOG [43] eller derivater fikk vokse over natten i 2xTY inneholdende 15 jig/ml tetracyclin. Fagemider reddes ved anvendelse av KM13 eller VCSM13 som beskrevet [27] . Fagpartikler fremstilles av to PEG-presipiteringer [44].

Konstruksjon av vektor

Fagvektor fd-DOG [43] anvendes som morvektor for konstruksjon av den proteasespaltbare fd-K108. Unike restriksjonsseter (Sfil, Kpnl) introduseres inn i den glycinrike spacerregion mellom D2 og D3 ved anvendelse av Sculptor in vitro mutagenissystem (Amersham) og oligonukleotid pklinker (tabell 4). Ytterligere restriksjonsseter (Apal, Sali) og seksvenser som koder for et proteasespaltingssete klones mellom Sfil og Kpnl-seter ved anvendelse av oligonukleotider polyXafor og polyXaback for å danne vektoren fd-K108.

Den proteasespaltbare hjelper-fag KM13 fremstilles fra fd-K108 ved å transportere inn i hjelper-fag VCSM13 et BamHl-Clal-fragment generert ved PCR og primere (fdPCRBack) og (LIBSEQfor).

En proteasespaltbar fagemidvektor avledes fra fd-K108 på samme måte som ovenfor med unntak av anvendelse av pCANTAB 3 (Pharmacia). En FLAG-tagg introduseres ved N-terminus av Dl ved kloning av Notl-Sfil-fragment generert av PCR og primere Flagprimer og LSPAback. For å unngå deleteringer pga. av repeterte sekvenser i D2-D3-linker, forandres kodonbruken av polylinker-regionen i to trinn; (a) ved anvendelse av Bam-Sfil-fragment generert av PCR og primere RECGLYfor og LIBSEQfor, screene rekombinanter med PCR og primerne LSPAfor og LSPAback, (b) anvende et Kpnl-Clal-fragment generert av PCR og primerne RECGLYback og LIBSEQback, screene rekombinanter ved anvendelse av LSPAfor og LSPAback. Den resulterende vektor er pKl. Hele p3-genet sekvenseres ved anvendelse av PCR syklisk sekvensering med fluoriserende dideoksy kjedetermineringer (Applied Biosystems) [45]. "Ut av ramme"-vektoren pK2 er avledet fra pKl med setedirektert mutagenese ved anvendelse av oligo delCKpn og Sculptor Amersham kit. De presise sekvenser av pKl og pK2 er angitt i [Kristensen et al., (1998) Folding & Design 3: 321-328].

Kloning av barnase og villin

Vektorene som koder for den enkle barnasemutant, Hisl02->Ala og Leul4->Ala [29, 46] anvendes som templater for PCR-mangfoldiggjøring med primere Barnasefor og BarnaseH102Aback og Pfu-polymerase. PCR-produktene (koder for enkeltmutant Hisl02->Ala, og dobbeltmutant Hisl02->Ala, Leul4->Ala) oppkuttes ved anvendelse av restriksjons-enzymene Sfil og Kpnl, og ligeres inn i vektor pK2 for å gi fagemidene pK2BA og pK2BB, respektivt, og barnasegenene sekvenseres ved anvendelse av PCR syklisk sekvensering.

Det termostabile fragment på 35 aminosyrer av head-piece av f-actin-bindende protein villin [33] mangfoldiggjøres fra bursa cDNA fra kylling ved anvendelse av PCR-primere villinfor og villinback med Pfu-polymerase. PCR-produktene klones som ovenfor for å gi fagemidet pK2V.

Resistens av fag mot denatureringsmiddel, pH og proteaser

For resistens til denatureringsmiddel, 10 M urea i PBS (25 mM NaH2P04, 125 mM NaCl pH 7,0) eller 8 M GndHCl (Guanidine hydroklorid) og 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, til-settes 1 mM CaC12 (buffer A) til 10(il fag-forrådsløsning (10<8->10<10>TU) for å gi et volum på 1 ml og betingelsene som spesifisert i tabell 1. Fagen inkuberes i 1-2 timer, deretter tilsettes 100 (il aliquot til 1 ml TG1 (OD600 ~ 0,5) og seriefortynninger utsås på TYE-plater med 15 fig/ml tetracyclin. For resistanse av fag til ekstremiteter av pH (2-12), tilsettes Tris-glycin eller Tris-HCl-buffere (0,1 M glycin eller 0,1 M Tris, respektivt) til 10 (il f ag-f orråd-sløsninger, og for å nøytralisere hver 100 (il aliquot ble det tilsatt 50 (il 1 M Tris-HCl, pH 7,4 før infeksjon. For resistanse til temperatur tilsettes buffer A til 10 (il fag-forråds-løsninger for å gi et volum på 1 ml, og det inkuberes ved en gitt temperatur (20 - 60 C°) i 1 time. 100 (il aliquoter tilsettes til TG1, og de sås ut som ovenfor. For resistente proteaser tilsettes 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, ImM CaCl2 pH 7,4 (Faktor Xa 100 ng/ml eller trypsin, chymotrypsin, trombin, termolysin og subtilisin, alle 100 (ig/ml) eller 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4 (IgA Protease 10 ng/ml) eller 50 mM NH4C03 pH 8,0 (Arg-C 100 (ig/ml, Glu-C 100 (ig/ml) eller 25 mM NaH2P04, 125 mM NaCl pH 7,0 (Aspn 40 ng/ml) til 10 (il fag-forrådsløsninger (fd-DOG og fd-K108) for å gi et volum på 100 (il og en finalkonstruksjon av protease som angitt. Oppkuttingsreaksjoner inkuberes i 15 min. ved romtemperatur, og prøver (100 (il) infiseres deretter inn i TG1 som ovenfor.

For resistens til proteaser i nærvær av denaturerende middel fremstilles prøver som ovenfor for urea- og temperatur-denatureringer. Til 90 (il aliquoter tilsettes 10 (il trypsin (1 mg/ml), og etter 5 min. ved romtemperatur tilsettes 4 (il Pefabloc (100 mM) og prøvene infiseres inn i TG1 som ovenfor .

Western blot

Fag (pHENl reddet ved anvendelse av KM13, og pKl reddet ved anvendelse av VCSM13) underlegges SDS-PAGE [47] før eller etter spalting med trypsin (50 ng/ml). Etter semitørr overføring til PVDF-membraner prosesseres filteret i hovedsak som beskrevet [27]. Det primære antistoff, monoklonalt anti-glll (MoBiTec), tilsettes i en 1:5000 fortynning etterfulgt av anti-mus HRP-konjugert antistoff (Sigma) i en fortynning på 1:50000. Til slutt utvikles filteret ved anvendelse av luminol-basert Chemiluminescence Western Blotting kit (Boehringer Mannheim).

ELISA

Fag som fremviser barnasemutanter analyseres for binding til RNase-inhibitoren barstar som beskrevet [44]. 10 pmol biotinylert barstar blandes med ca. 10 i fu ) fag som fremviser barnasemutant A eller barnasemutant B eller villin eller buffer A. Fag som binder barstar opptas på Straptavidin-belagte plater (Boehringer Mannheim) og utvikles ved anvendelse av HRP-konjugert anti-M13-antistoff (Pharmacia) og 2,2'-Azino-Bis(3-etyl-benz-thiazolin-6-sulfonisk syre)

(Sigma). Absorbansavlesninger foregår ved 405 nm.

Temperaturdenaturering

Ved hver temperatur blandes ca. lO-^ fag som fremviser barnasemutanter eller villin (ampicillin-resistente) med en spaltbar kontroll fd-K108 (tetracycline resistent), og et ikke-spaltbart kontroll-fagemid, et kloramfenikol-resistent derivat av pHENl, reddet med KM13 i totalt volum på 90 (il av buffer A. Etter ekvilibrering i 20-30 min. ved den angitte temperatur, tilsettes 10 (il trypsin (5 (ig/ml) og inkuberingen får fortsette i 2 min. Trypsin nøytraliseres ved tilsetning av 4 (il 100 mM Pefabloc. Infeksjon og seriefortynning utføres i TG-1 som ovenfor, og aliquoter utsås på TYE-plater inneholdende 100 (ig/ml ampicillin + 1% glukose, 30 (ig/ml kloramfenikol + 1% glukose eller 15 (ig/ml tetracyclin.

Seleksjonseksperimenter

10 (il av seriefortynninger av barnase-mutantfag A blandes med 10 (il av den ikke-f ortynnede barnase-mutantf ag B i 70 (il buffer A. Etter 30 minutters inkubering ved 20°C eller 37°C, ble 10 (il trypsin (5 (ig/ml) tilsatt. Etter 2 minutters oppkutting ble 4 (il Pefabloc (100 mM) tilsatt. Fagen ble infisert inn i TG-1 som ovenfor. En andre runde seleksjon utføres ved å skrape bakterier i 3 ml 2xTY, 50 (il inokulert inn i 50 ml 2xTY/Amp/Glu og fagemidet ble reddet og fag fremstilt som ovenfor. Kloner analyseres med PCR ved anvendelse av primeren LSPAfor og LSPAback etterfulgt av restriksjonsoppkutting ved anvendelse av Ddel.

Seleksjonen mellom pK2V og pKl-fagpartikler utføres som ovenfor, med unntak av at seleksjonen utføres ved lO^C. Kloner analyseres med PCR ved anvendelse av primerne LSPAfor og LSPAback.

Eksempel 7. Anvendelse av proteasespaltbar hjelper-fag for seleksjon av signalsekvenser.

Translokering av proteiner er dirigert av signalpeptider

[48]. Disse er kjent å dele fellesegenskaper så som positivt ladete aminoterminalregion, en hydrofobisk sekvens og en karboksyterminalregion inkluderende signalpeptidase-spaltingssete. Signalpeptider en involvert i "en rekke protein-protein- og protein-lipid-interaksjoner" [49]. Signalsekvensen kan i tillegg interagere med protein-foldingsreaksjonsvei. De er også involvert i translasjonsregulering, i hovedsak igjennom downstreambox.

Enzymer så som DNA-polymerase er svært dårlig fremvist på fag-partikler, noe som gjør deres seleksjon omtrent umulig. For å forbedre evnen til fag-fremvisning til å selektere polymeraser, konstrueres derfor forbedrete signalsekvenser og selektert for anvendelse av fagfremvisningsteknikker hvor "tomme" fagbakgrunn elimineres ved oppkutting av hjelper-fag.

Konstruksjon av en signalsekvens for optimal polymerasefremvisning på fag er ikke enkelt å oppnå. En selek-sjonsstrategi som benyttes er derfor å isolere signalsekvenser fra et bibliotek hvor mutasjoner introduseres ved selekterte seter. Selv om signalsekvensen ikke foreligger på fagen, er dets sekvens enkelt å gjenvinne ved å sekvensere fagemidet lokalisert inne i fagpartikkelen.

To biblioteker genereres fra pelB og g3-leader-sekvenser, ved anvendelse av de følgende oligonukleotid-primere for PCR-mangfoldiggj øring:

Restrisjonssetene Hindlll og Ncol er angitt i kursiv.

Bibliotek I avledet fra pelB leader og bibliotek II avledet fra g3 leader fremstilles med PCR-mangfoldiggjøring av 4 (pelB) mangfoldiggjort med 1 og 2 og av 5 (g3) mangfoldiggjort med 3 og 2 respektivt. Hvert PCR-produkt oppkuttes med Hindlll og Ncol og renses med et gelekstraheringssett (Qiaquick, Qiagen) . 0,2 jig av hvert resulterende innskudd blandes for legering med ca. 2 jig pHENl-Stoffel-vektor (fig. 6) tidligere oppkuttet med Hindlll og Ncol og defosforyleres med alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim). Ligeringsblandingen renses med fenol-kloroform-ekstrahering og etanolpresipitering før elektro-porering inn i ferskt fremstilt E. coli TG1.

Randomisering av 32 og 20 baser for pelB og g3 leader, respektivt, utføres ved: (i) nær og innen Epsilon-sekvensen like oppstrøms for Shine-Delgarno-sekvensen, (ii) nedstrøms Shine-Delgarno-sekvensen nær og innenfor nedstrømsboksen

[50] (iii) innen leader-peptidet ved N-terminalregionen inneholdende de positivt ladete aminosyreenheter, i den hydrofobe region [51] og i den C-terminale region nær det sterkt konserverte peptidasespaltingssetet [52].

Fag produseres som tidligere beskrevet [25] med unntak av at hjelper-fag KM13 (eksempel 3) anvendes istedet for VCSM13 og at 0,1 mM IPTG tilsettes der de er spesifisert til overnatt-kulturen ved 3Q°C. Seleksjoner for resistens til trypsin og for binding [44] utføres som beskrevet tidligere, med unntak av at 11 |ig anti-Taq-antistoff (Taqstart, Clontech) belegges overnatt på immunorør (Nunc). PCR-screening utføres med primere 6 og 7 ved anvendelse av enkle E. coli TGl-kolonier inneholdende fagemid som templat etterfulgt av en tidligere beskrevet protokoll; etter gelelektroforese på en 2% agarosegel. Størrelsen av det mangfoldiggjorte fragment anvendes som et kriterium for å etablere om deleteringer innen polymerasegenet har forekommet.

Den kalkulerte diversitet av bibliotekene beregnet ut fra degeneranse i de syntetiserte oligonukleotider er ca. 3,7xl013 =4<9>x3<7>x2<16> og l,7xl0<7> = 4<4>x216 for pelB og g3-leadere, respektivt. Etter transformasjon av E. coli med fagemid-bibliotekene måles bibliotekstørrelsen og antallet ampicillin-resistente kolonier finnes til å være l,3xl0<7> og 9,6x10^ for pelB og g3-leadere respektivt.

Seleksjon for fremvisning av polymerasen utføres ved å spalte spesifikt hjelper-fag p3-kopier med proteasen trypsin for å gjøre alle fag-partikler som ikke uttrykkes av p3-polymerase-fusjonsproteinet ikke-infektive.

Begge biblioteker blandes og seleksjonsrunder utføres ved to betingelser, med eller uten 0,1 mM IPTG i dyrkningsmedium. Med IPTG noteres deleteringer av polymerasegenet eller en del av det etter runde III (4 av 28 kloner) som vist med en PCR-screening (se ovenfor); etter runde IV, disse kloner representerer mesteparten av populasjonen (28 av 30). Uten IPTG representerer disse kloner en signifikant del av de selekterte etter runde VI (3 av 12). Seleksjonen forandres derfra fra runde fem ved å introdusere i tillegg til seleksjon fra proteaseresistens, en seleksjon for binding til et anti-Taq-antistoff. Etter seleksjonsrunder VII og VIII, (3 av 13) og (0 av 19) kloner korresponderte respektivt til deletert p3-polymerase-fusjonsproteiner.

For karakterisering av leadere, subklones Hindlll-Ncol-fragmenter etter PCR-mangfoldiggjøring av individuelle E. coli kolonier. De resulterende fagemider noteres for pHENl-lx/Stoffel subkloning med x=7,9,10 og 12. Hindlll-Ncol, og NcoI-Notl-fragmentet korresponderer til Stoffel-fragmentet sekvenseres på begge tråder ved anvendelse av en 373A DNA-sekvenserer (Applied Biosystems).

For ELISA anvendes en anti-Taq-antistoff (Taqstart, Clontech) for belegging av ELISA-platen, og et anti-M13-horse radich peroksidase-fusjonsprotein (Pharmacia Biotech) for deteksjon i en standard protokoll [44].

Ekspresjon av polymerase i supernatanten utføres ved infeksjon av E. coli HB2151 med selekterte fagemider [25, 27] med unntak av at IPTG-konsentrasjonen er 0,1 mM istedet for 1 mM. Ca. 10 (il av supernatanten appliseres på en polyakrylamidgel for elektroforese (Novex), gelen blottes til nitrocellulose (Protran, Schleicher and Schuell) og et anti-Taq-polymerase-antistoff (Taqstart, Clontech), og en anti-mus IgG-pepperrot peroksidase fra geit (Sigma) før deteksjon av autoradiografifilmer ved chemiluminescence (ECL-reagenser, Amersham).

Fire individuelle kloner 7, 9, 10 og 12 fra runde VII, som ble screenet for protease-resistans blant 12 kloner karak-teriseres videre. For å sikre at kun mutasjoner innen signalsekvensen analyseres, og ikke mutasjoner et annet sted innen fagemidet som kan ha forekommet under amplifi-sering ved de forskjellige runder, subklones signalsekvensene inn i den opprinnelige vektor. Resultatene vist i tabell 5 indikerer at optimal polymerasefremvisning for den selekterte klon 10 er ca. 50 ganger høyere enn for originalsekvensen. Dette resultat bekreftes uavhengig innen eksperimentelle feil med en ELISA ved anvendelse av anti-Taq-antistof f og anti-M13-HRP og 10^ fagpartikler av pelB-leader-fagemid pHENl-Stoffel (signal til støyforhold: 1,46) gir et identisk signal på IO<7> fagpartikler av klon 10 (signal til støyforhold: 1,47).

Ekspresjonen av Stoffel-fragment i E. coli HB2151 undersøkes også for de forskjellige leadere (se tabell 6). Konsentrasjonen av Stoffel-fragment i kultursupernatanten estimeres ved å sammenligne spot-intensiteter for kjente mengder polymerase, og finnes til å være ca. 0,1 (ig/1 for pelB-leader. En 3-gangers økning i ekspresjon observeres for leadere 17 og 110, mens en ca. 3-gangers økning noteres for leader 19.

Tabell 5. Antall fag-polymeraser pr. fagpartikkel med leader-pelB, som en funksjon av temperatur og IPT6-konsentrasjoner.

Fag-titer måles som antallet infektive fagpartikler og fagpolymeraser-titer som antallet infektive fagpartikler etter behandling med trypsin. Antallet fag-polymeraser pr. fag-partikkel er forholdet mellom titerene. Idet fag-partiklene ble reddet med en hjelper-fag, fremviser fagen enten en p3-polymerasefusjonsprotein og noen få p3-kopier inneholdende et trypsin-spaltingssete eller kun disse p3-kopier.

Tabell 6. Fag-karakterisering for leader-pelB eller selekterte leadere fra runde VII for optimal polymerasefremvisning (samme figuranvisninger som for tabell 5, dyrkningsmedium i 2xTY ved T=30°C uten IPT6) .

Tabell 7. Randomisering av selekterte sekvenser.

Den randomiserte DNA-sekvens er gitt fra 5' til 3'; over og under den, og basene forskjellige fra den gitte sekvens i signalsekvensene pelB, 17, 19, 110 og 112 er indikert. Shine-Delgarno-sekvensen, startkodon og de siste kodon i signalsekvensen, GCC, er under understreket. Hindlll og Ncol-restriksjonssetene er i kursiv. De korresponderende aminosyresekvenser er gitt nedenfor. Bibliotek I er innledningsvis oppkuttet fra pelB-leader og bibliotek II fra g3-leader.

Eksempel 8. Seleksjon av katalytisk aktivitet ved anvendelse av protease-spaltbar hjelper-fag.

En strategi for seleksjon av katalysering av fag-fremvisning er basert på seleksjon av reaksjonsproduktet av en katalytisk reaksjon, og anvendelse av nærhetseffekter for å selektere katalysatoren. I denne strategi krysskobles et merket substrat til fag i nærheten av det fremviste enzym, og fagen påkobles deretter til en fast fase og frigjøres ved intramolekylær spaltingsreaksjon katalysert av det oppviste enzym [53].

En tilsvarende løsning har blitt benyttet for seleksjon av aktive DNA-polymerase-varianter. Løsningen involverer to kjemisk uavhengige reaksjoner, hvor den katalytiske reaksjon fører til et produkt (som i dette tilfellet skilles ved inkorporering av en biotin-markør), og en kjemisk krysskoblingsreaksjon hvor substratet (og produkt) kobles til fagen. Seleksjon av fagen med streptavidin-kuler selekterer derfor for fag som er kjemisk tilkoblet til det merkede produkt; disse reaksjoner er mer sannsynlig koblet til den samme fag som reaksjoner i cis foretrekkes fremfor reaksjoner i trans ved nærhet.

Maleimider anvendes i en kjemisk kryssbindingsreaksjon. Disse er kjent å reagere med tioler og i alkaliske løs-ninger med aminogrupper, og er derfor i stand til å reagere med et bredt spekter seter på fagen og på det oppviste enzym. Et kovalent produkt mellom hovedkappeproteinet (p8) og N-biotinoyl-N'-(6-maleimido-heksanoyl)hydrazid detekteres ved SELDI-massespektrometri. To aminogrupper (N-terminalen Ala-1 og enheten Lys-8) er tenkt å være involvert .

Strategien testes ved anvendelse av DNA-polymerase i lys av deres sentrale rolle i molekylær evolusjon. En maleimedyl-gruppe introduseres ved 5'-enden av en DNA-primer, produktet merkes ved tilsetning av biotinylert dUTP til 3'-enden av primeren ved den katalytiske virkning av polymerasen. Klenow- og Stoffel-fragmentene av DNA-polymerase I Escherichia coli og Thermus aquaticus, respektivt, klones for oppvisning av fusjon til plll-kappeproteinet av filamentøs bakteriofag ved konvensjonelle teknikker. Begge fragmenter mangler 5'- til 3'-eksonukleasedomener, og Stoffel-fragmentet mangler også en 3' til 5'-eksonuklease-aktivitet.

Fusjonsproteinet klones på et fagemid (pHENl) [25}, og reddes av en hjelper-fag. Polymerase-fragmentene er vist og presenteres på fagen (etter redding med hjelper-fag) ved binding av fagen til brønner med anti-polymerase-antistoff som detektert med ELISA (ikke vist). Fagen analyseres også ved Western-blått ved anvendelse av anti-p3- eller anti-polymerase-antistof f . Dette bekrefter nærvær av fusjons-proteinet, men indikerer også kontaminering av fri polymerase. Dette skyldes sannsynligvis sekresjon av bakterielle verter gjennom ufullstendig undertrykking av amber-stoppkodon eller ved spalting fra fagoverflaten. Dette fjernes i et ytterligere trinn med ultrasentri-fugering eller ved størrelsesgradert kromatografi. De rensete fag analyseres for DNA-polymerase-aktivitet i en primer/- templat-ekstensjonsanalyse med radiomerket a<3>^P-dCTP, og finnes å være aktiv.

Imidlertid, som angitt ved Western-blått, er poly-merase-p3-fusjonsproteinet dårlig inkorporert inn i fag sammen-lignet med p3-proteinet. Dette synes å skyldes inkorporering av p3 fra hjelper-fag, som vist ved alternativ anvendelse av hjelper-fag (KM13), hvor p3-proteinet på hjelper-fagen (men ikke det for fusjonsproteinet) kan spaltes med trypsin slik at det blir ikke i stand til å mediere infeksjon (eksempler 3 og 4). Etter proteolyse vil dermed kun de fag som hadde inkorporert fusjons-proteinet være infektive, fra tap av titre etter proteolyse estimerer vi at kun én fagpartikkel av tusen hadde inkorporert fusjonsproteinet. Seleksjonsprosessen, som er basert på merking med polymerase i cis ville bli ødelagt av et slikt stort overskudd av fag som mangler polymerasen men som er tilgjengelig for merking i trans. Selekterte fag behandles derfor med trypsin for å ødelegge infektiviteten av de som mangler den fremviste polymerase.

Fagfremvisning av Stoffel-fragmentet inkuberes med primer 13 [TTT CGC AAG ATG TGG CGT] omfattende et 5' maleimidyl-gruppe og 3' biotinylert nukleotid. Etter inkubering opptas fagen på streptavidin-belagte kuler, med et utbytte på ca. 1 - 5 % av infektiøs fag. Dette viser at primeren kan kjemisk krysskobles til fagen, sannsynligvis via p8-proteinet som vist for N-biotinoyl-N'-(6-maleimidoheksanoyl)hydrazid. Fagen inkorporeres deretter med primer lb [GCGAAGATGTGG] omfattende en 5' male-imidyl-gruppe i nærvær av biotin-dUTP2 og templat 3 [AAA TAC AAC AAA ACG CCA CAT CTT GCG]. Opptak av fagen er avhengig av nærvær av lb, 2 og 3 (tabell 8), men også av inklusjon av trypsin, som spalter hjelper-fagen for å redusere ikke-spesifikk fagisolering.

(pj_ og (pf angir antallet transformasjonsenheter (tu) før [a] og etter [b] seleksjonen. Utbytte = (pf/(pi.

[c]: + primer lb, + biotinylert dUTP 2, + templat 3 og + trypsin.

Eksempel 9. Seleksjon av disulfid-inneholdende polypeptider .

For kloningen av (poly)-peptid-kodende DNA-fragmenter og deres fremvisning for seleksjon mellom barnase og p3, konstrueres fagen fd-3 (fig. 5). Fag fd-3 omfatter H102A-mutanten av barnase N-terminalt fusjonert til p3-genet av fag fd-TET. Mellom kodon for siste enhet av barnase og første enhet av p3 er nukleotidsekvensen CTG CAG GCG CGG CCG CA. Denne sekvens inneholder et Pstl DNA restriksjons-sete (i kursiv) for innsetting av DNA-fragmenter flankert av Pstl-restriksjonssetet. Sekvensen introduserer videre et rammeskift mellom barnase og p3, som hindrer ekspresjon av den korrekte p3-leseramme i fd-3. Fagpartikler av fag fd-3 oppviser derfor ikke infeksjonsproteinet p3 og er ikke-infektiøs.

Fag fd-3 er derfor en godt egnet kloningsvektor uten Pstl DNA-innskudd etter legering og propageres ikke under seleksjon. Statistisk vil 1 av 3 vilkårlige DNA-innskudd i Pstl-restriks j onssetet etablere (med unntak av nærvær av stopp-kodon i innskuddet) en åpen leseramme som dekker barnase, selve innskuddet og p3 og resultere i infektiøse fagpartikler inneholdende p3 i fagkappen. I disse rekombinante kloner etterfølges barnase av innskuddet, som deretter etterfølges av aminosyreenhetene AGGAAA før starten av p3-proteinet. Dette AGGAAA-peptid skulle tilveiebringe tilstrekkelig fleksibilitet i fusjonsproteinet til å mulig-gjøre den infektive funksjon av p3 og aksess av proteasen til N-terminale vedheng på p3.

Genomisk DNA fra E. coli stamme TG1 mangfoldiggjøres ved 30 sykluser med en polymerase kjedereaksjon (PCR) med en annealingstemperatur på 48°C ved anvendelse av oligo-nukleotidet SN6MIX (5<*->GAG CCT GCA GAG CTC AGG NNN NNN-3'), som omfatter 6 degenererte posisjoner ved den forlengete 3'-ende for å sikre vilkårlig priming. I et andre trinn på 30 PCR-sykluser med en annealingstemperatur på 52<>C for-lenges primære PCR-produkter ved re-mangfoldig-gjøring med oligonukleotide XTND (5'-CGT GCG AGC CTG CAG AGC TCA GG-3'). Produktet med en lengde på ca. 150 bp fra denne reaksjon renses fra en agarosegel og re-mangfoldig-gjøres i 30 PCR-sykluser ved anvendelse av en annealings-temperatur på 52°C og oligonukleotide XTND. Disse re-mangfoldiggjorte 150 bp fragmenter oppkuttes delvis med SacI (setet indikert i uthevet skrift i oligonukleotidene) og ligeres for dimerisering. Ligerte produkter re-mang-foldiggjøres i en ytterligere 10 PCR-syklus med en annealingstemperatur på 44°C etterfulgt av 30 PCR-sykluser med en annealingstemperatur på 55* 0 ved anvendelse av oligonukleotide XTND. Annealings-temperaturene velges for å diskriminere mot priming av oligonukleotide i midten av de dimeriserte fragmenter. Reaksjonsproduktet størrelsesrenses to ganger på en agarosegel for å fjerne monomerer og oligo-merer (ikke-dimerer).

Den finale dimerfraksjon mangfoldiggjøres med PCR ved anvendelse av en annealingstemperatur på 55°C og oligonukleotide XTND i storskala oppkuttes med Pstl (setet indikert i kursiv i oligonukleotider) og ligeres inn også i Pctl-oppkuttet og fosfatiserte vektor fd-3. Etter elektro-porering inn i E. coli bakterier ble et repertoar av 3,6xl0<7> rekombinanter oppnådd. Sekvensanalyse av vilkårlig utplukkete kloner ga nærvær av i hovedsak dimeriske (11 av 14) og noen monomeriske (2 av 14) DNA-innskudd.

Reinfeksjon av E. coli bakterier med fag produsert fra den opprinnelige populasjon av transformerte celler ga, i samsvar med sekvensanalyse av 20 vilkårlig utplukkete kloner, et bibliotek av infeksiøse fag inneholdende omtrent kun barnase (i ramme, ikke-stopp-dimerinnskudd)-p3-fusjoner. Ikke-infektiøse fag som kommer fra vektor uten innskudd og fra vektor med ut-av-ramme eller stopp-kodon-inneholdende innskudd propageres ikke i infeksjonstrinnet. Vektoren fd-3 er derfor egnet for å etablere et repertoar av polypeptider vilkårlig generert igjennom dimerisering av DNA-fragmenter fra E. coli genomet.

Dette repertoar av polypeptider presentert som et innsatt fusjon mellom barnase og p3 på fag-fd underlegges proteolytisk oppkutting med trypsin og termolysin alene eller i en blanding av begge to (1 ng/fil hver) i TBS-Ca-buf f er (25 mM Tris, 137 mM NaCl, ImM CaCl2, pH 7,4). Etter proteolyse opptas fag med biotinylert barstar bundet til en Streptavidin-belagt mikrotiter-brønnplate og elueres ved pH 2,0. Fag nøytraliseres til pH 7 og propageres gjennom reinfeksjon av E. coli celler og selekteres for en andre runde som før. Alle trinn utføres i fravær av reduserende midler så som ditiotreitol (DTT) eller |$-merkaptoetanol, som ville redusere og dermed spalte enhver potensiell disulfidbinding dannet mellom cysteinkjeder med selekterte polypeptider.

Vilkårlig utplukkete fag, som elueres etter den første og andre runde av proteolytisk seleksjon, analyseres for binding til barstar etter inkubering med en blanding trypsin og termolysin under betingelsene for seleksjon (tabell 9). Sekvensene deres bestemmes (tabell 9). 17 av 18 analyserte kloner behandlet med en blanding av trypsin og termolysin under seleksjon finnes til å binde biotynilert barstar etter inkubering med trypsin og termolysin. 5 av 8 analyserte kloner behandlet med trypsin under seleksjonen bandt biotinylert barstar etter inkubering med trypsin og termolysin, mens 9 av 14 analyserte kloner behandlet med termolysin finnes å binde. Ingen vilkårlig utplukkete kloner som ikke behandles med protease under seleksjonen binder biotynilert barstar etter inkubering med trypsin og termolysin. Binding til biotynilert barstar viser at poly-peptidinnskuddet mellom barnase og p3 på fagen opprett-holder dets totale kovalente integritet og derfor holder den N-terminal-markør (barnase) og infeksjonsproteinet p3 (og dermed fagpartikkelen som et hele) kovalent koblet. Imidlertid kan muligheten for proteolytisk oppkutting av peptid-backbone ikke utelukkes, idet innskuddet også kan holdes kovalent koblet igjennom bindinger mellom side-grupper så som Sf^-grupper av cysteiner. Sekvensanalyse av de selekterte kloner ga at 19 av 25 (76%) resistente kloner inneholdt to eller flere cysteinenheter.

For å analysere funksjonen av mulige disulfidbindinger i polypeptidinnskuddene, ble 13 av de selekterte fag analysert for binding til biotinylert barstar (og dermed for en kovalent binding av barnase og p3 gjennom innskuddet) etter behandling med trypsin og termolysin etterfulgt av en vasking med 20 mM DTT før deteksjon av bundet fag. 2 fag-kloner, som binder bastar etter protease-behandling uten DTT-vask og som ikke inneholder cysteiner, blir ikke på-virket av DTT-behandlingen. Ytterligere 2 fag-kloner, som binder bastar etter proteasebehandling uten DTT og som inneholder to eller flere cysteiner, observeres også til å vinne barstar etter protease og DTT-behandling. Dette antyder at deres innskudd er beskyttet fra proteolyse av deres peptid-backbone til tross for nærvær av, i prin-sippet, substratsteder for proteasene.

Disse innskudd er derfor beskyttet fra proteolytisk angrep pga. en konformasjon som er i deres peptid-backbone. Imidlertid, 9 fag-kloner som binder barstar etter protease-behandling uten DTT-vask og som inneholder to eller flere cysteiner er observert til ikke å binde barstar etter protease- og DTT-behandling. Dette antyder at deres innskudd er proteolytisk spaltet i peptid-backbone, og at de holdes sammen av disulfid-bindinger mellom cystein-sidekjede i fravær av det reduserende middel DTT. Disse innskudd er derfor ikke beskyttet fra proteolytisk angrep pga. av en konfirmasjonshindring av deres peptid-backbone.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor konfigureres for å selektere for cystein-inneholdende polypeptider, også hvor polypeptidene ville være utsatte for proteaseangrep siden polypeptidene er i stand til å kunne holde sammen i seleksjonstrinnet med disulfid-bindinger.

Tabell 9. Barstar-binding av fag som fremviser barnase-p3-fusjonsinnskuddene selektert etter proteolytisk behandling under ikke-reduserende betingelser og aminosyresekvenser av deres Pstl-innskudd i vektor fd-3.

Barstar-binding (-DTT) etter proteolyse av fag med trypsin og termolysin (2ng/jil hver) uten en 20 mM DTT-vask bestemmes ved måling av dets signal som er minst 60% av signalet for barstar-binding av fag uten proteasebehandling. Barstar-binding (+DTT) etter en 20 mM-vask bestemmes ved målinger av et signal som er minst 60% av signalet for barstar-binding (-DTT) uten en 20 mM-vask. Fag plukkes vilkårlig etter en (lx) eller to (2x) runder av proteolyse med trypsin (Tr) eller termolysin (Th). Fag behandles med proteaser, opptas med biotinylert barstar i mikrotitre brønnplater, og vaskes med 20 mM DTT der dette er hensiktsmessig. Bundet fag detekteres med en horse radish peroksi-dasekonjugert anti-M13-fag-antistoff (Pharmacia Biotech). Eksempel 10. Anvendelse av reduserende midler for å eliminere bakgrunn relatert til disulfid.

Repertoarer av polypeptider beskrevet i eksempel 9 oppkuttes som før med både trypsin og termolysin (eksempel 9) med unntak for et ytterligere vasketrinn med 50 M DTT etter binding av den proteolytisk behandlete fag til mikrotitre brønnplater belagt med Streptavidin-biotinylert barstar. Dette vasketrinn er konstruert for å vaske av fag som fremviser N-terminale barnase-markører, som ikke lenger er koblet til p3 gjennom en intakt polypeptid-backbone, men kun gjennom disulfidbindinger mellom cysteinsidegrupper i polypeptidinnskuddene mellom barnase-markør og p3. 12 vilkårlig utplukkete fag eluert etter den andre runde av proteolyse analyseres for stabilitet mot en blanding trypsin og termolysin under betingelsene for seleksjonen, og deres sekvens bestemmes (tabell 10). 10 kloner behandlet med en blanding trypsin og termolysin under seleksjon binder biotynilert barstar etter inkubering med trypsin og termolysin etterfulgt av vasking med 50 mM DTT før deteksjon av opptatt fag. Kun én av disse kloner inneholdt to eller flere cysteiner.

Proteolytisk behandling av fag-bibliotek etterfulgt av en vask med DTT muliggjør derfor for seleksjon av peptid-innskudd som er beskyttet fra proteolyse og som holdes sammen gjennom disulfidbindinger.

Tabell 10. Barstar-binding av fag som fremviser barnase-p3-fusjonsinnskudd selektert etter proteolytisk behandling etterfulgt av behandling med 50 mM DTT og aminosyre-sekvensen av deres Pstl-innskudd i fd-3. Barstar-binding. Barstar-binding +DTT etter proteolyse av fag med trypsin og termolysin (2 ng/jil hver) etterfulgt av 50 mM DTT bestemmes ved måling av et signal for barstar-binding +DTT, som er minst 60% av signalet for barstar-binding av fag uten proteasebehandling. Fag utplukkes vilkårlig etter to (2x) runders proteolytisk behandling med trypsin (Tr) og/eller termolysin (Th). Fagene behandles med proteaser, opptas med biotynilert barstar i mikrotitre-brønnplater, og vaskes med 20 mM DTT der hvor dette er hensiktsmessig. Bundet fag detekteres med en horse radish peroksidase-konjugert anti-M13-fag-antistoff.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1. Spalting av fag med proteaseseter. Fag blir fremstilt med redding med KM13 (pHENl, A + B), eller med VCSM13 (pKl, C + D). Ikke spaltet (A + C) eller spaltet med trypsin (B + D) . 5(il, 2,5 (il og 1 (il fag ble applisert som indikert. Molekylære vektmarkører er i kD. Fig. 2. Fagemid-vektorene pKl og pK2. Disse vektorer inneholder en protease-spaltbar sekvens mellom D2 og D3 av fag-p3-protein. I pKl, er D2 + D3 i ramme, i pK2, er D3 ute av ramme. Fig. 3. Binding av fag-barnase til barstar. Fag som oppviser forskjellige fusjonsproteiner inkuberes med biotinylert barstar opptatt på Streptavidin-belagte plater og detekteres med ELISA, a) barnase-mutant A, b) barnase-mutant B, c) villin og d) intet fag. Fig. 4. Temperatur denaturering av fag-fusjonsproteiner. Fagemider ble reddet med KM13, infektivitet (TU/ml) vist etter inkubering og spalting med trypsin ved gitte temperaturer. Fusjon med villin-subdomene (triangler), barnase-mutant A (diamanter), barnase-mutant B (firkanter), pHENl-kloramfenicol-resistens (sirkler). Fig. 5. fd-vektoren fd-3. Genet for H102A-mutanten av barnase introduseres ved subkloning inn i fd-DOG [43] etter PCR-mangfoldiggjøring med egnete oligonukleotider ved anvendelse av restriksjonssetene ApaLI (ved Barnase 5'-ende) og Noti for å etablere fd-3. Fig. 6. Kart over fagemidvektor anvendt for å fremvise Stoffel-fragment på overflaten av fagen. Stjerne viser sekvenser som ikke er randomisert minst delvis i bibliotekene I og II.

Referanser:

1. Rubingh, D.N. (1997) . Protein engineering from a bioindustrial point of view. Current Opinion in Biotechnology. 8, 417-422. 2. Fersht, A.R. (1993). Protein folding and stability: the pathway of folding of barnase. FEBS Letters. 325, 5-16. 3. Zhao, H., et al. (1998). Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination. Nature Biotechnology. 16, 258-261. 4. Patten, P.A., R.J. Howard, andW.P.C. Stemmer. (1997). Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines. Current Opinion in Biotechnology. 8, 724-733. 5. Sauer, R.T. (1996). Protein folding from a combinatorial perspective. Folding & Design. 1, R27-R30. 6. Munson, M., et al. (1996). What makes a protein a protein? Hydrophobic core designs that specify stability and structural properties. Protein Science. 5, 1584-1593. 7. Dahiyat, B.I., CA. Sarisky, and S.L. Mayo. (1997). De Novo Protein Design: Towards Fully Automated Sequence Selection. Journal of Molecular Biology. 273, 789-796. 8. Riddle, D.S., et al. (1997). Functional rapidly folding proteins from simplified amino acid sequences. Nature Structural Biology. 4(10), 805-809. 9. Hoogenboom, H.R. and G. Winter. (1992). By-passing Immunisation. Human Antibodies from Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged in Vitro. Journal of Molecular Biology. 221, 381-388. 10. Winter, G., et al. (1994). Making Antibodies by Phage Display Technology. Annual Review of Immunology. 12, 433-455. 11. Braisted, A.C. and J.A. Wells. (1996). Minimizing a binding domain from protein A. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 93, 5688-5692. 12. 0'Neil, K.T., et al. (1995). Thermodynamic Genetics of the Folding of the Bl Immunoglobulin-Binding Domain From Streptococcal Protein G. Proteins: Structure, Function, and Genetics. 21, 11-21. 13. Gu, H., et al. (1995). A phage display system for studying the sequence determinants of protein folding. Protein Science. 4, 1108-1117. 14. Hubbard, S.J., F. Eisenmenger, and J.M. Thornton.

(1994). Modeling studies of the change in conformation required for cleavage of limited proteolytic sites. Protein Science. 3, 757-768. 15. Fontana, A., et al. (1997). Probing the partly folded states of proteins by limited proteolysis. Folding & Design. 2, R17-R26. 16. Kamtekar, S., et al. (1993) . Protein Design by Binary Patterning of Polar and Nonpolar Amino Acids. Science. 262, 1680-1685. 17. Davidson, A.R. and R.T. Sauer. (1994) . Folded proteins occur frequently in libraries of random amino acid sequences. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 91, 2146-2150. 18. Davidson, A.R., K.J. Lumb, and R.T. Sauer. (1995). Cooperatively folded proteins in random sequence libraries. Nature Structural Biology. 2(10), 856-864. 19. Matthews, D.J. and J.A. Wells. (1993). Substrate Phage: Selection of Protease Substrates by Monovalent Phage Display. Science. 260, 1113-1117. 20. Riechmann, L. and P. Holliger. (1997). The C-Terminal Domain of TolA Is the Coreceptor for Filamentous Phage Infection of E. coli. Cell. 90, 351-360. 21. Smith, G.P. (1985). Filamentous Fusion Phage: Novel Expression Vectors That Display Cloned Antigens on the Virion Surface. Science. 228, 1315-1317. 22. Krebber, C, et al. (1997). Selectively-infective Phage (SIP): A Mechanistic Dissection of a Novel in vivo Selection for Protein-ligand Interactions. Journal of Molecular Biology. 268, 607-618. 23. Stengele, I., et al. (1990). Dissection of Functional Domains in Phage fd Adsorption Protein. Discrimination between Attachment and Penetration. Journal of Molecular Biology. 212, 143-149. 24. Gray, C.W., R.S. Brown, and D.A. Marvin. (1981). Adsorption complex of Filamentous fd virus. Journal of Molecular Biology. 146, 621-627. 25. Hoogenboom, H.R., et al. (1991). Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Research. 19, 4133-4137. 26. Bass, S., R. Greene, and J.A. Wells. (1990). Hormone Phage: An Enrichment Method for Variant Proteins With Altered Binding Properties. Proteins. 8, 309-314. 27. Nissim, A., et al. (1994). Antibody fragments from a "single pot" phage display library as immunochemical reagents. The EMBO Journal. 13, 692-698. 28. Marzari, R., et al. (1997). Extending filamentous phage host range by the grafting of a heterologous receptor binding domain. Gene. 185, 27-33. 29. Mossakowska, D.E., K. Nyberg, and A.R. Fersht. (1989). Kinetic Characterisation of the Recombinant Ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens (Barnase) and Investigation of Key Residues in Catalysis by Site-Directed Mutagenesis. Biochemistry. 28, 3843-3850. 30. Meiering, E.M., L. Serrano, and A.R. Fersht. (1992). Effect of Active Site Residues in Barnase on Activity and Stability. Journal of Molecular Biology. 225, 585-589. 31. Serrano, L., et al. (1992) . The Folding of an Enzyme. II Substructure of Barnase and the Contribution of Different Interactions to Protein Stability. Journal of Molecular Biology. 224, 783-804. 32. McKnight, C.J., P.T. Matsudaira, and P.S. Kim. (1997). NMR structure of the 35-residue villin headpiece subdomain. Nature Structural Biology. 4(3), 180-184. 33. McKnight, C.J., et al. (1996). A Thermostable 35-Residue Subdomain within Villin Headpiece. Journal of Molecular Biology. 260, 126-134. 34. Xu, D. and R. Nussinov. (1997). Favorable domain size in proteins. Folding & Design. 3, 11-17. 35. Kippen, A.D. and A.R. Fersht. (1995). Analysis of the Mechanism of Assembly of Cleaved Barnase from Two Peptide Fragments and Its Relevance to the Folding Pathway of Uncleaved Barnase. Biochemistry. 34, 1464-1468. 36. Gay, G.d.P. and A.R. Fersht. (1994). Generation of a Family of Protein Fragments for Structure-Folding Studies. 1. Folding Complementation of Two Fragments of Chymotrypsin Inhibitor-2 Formed by Cleavage at Its Unique Methionine Residue. Biochemistry. 33, 7957-7963.

37. Wu, L.C., R. Grandori, and J. Carey. (1994).

Autonomous subdomains in protein folding. Protein Science.

3, 369-371.

38. Kwon, W.S., N.A.D. Silva, and J.T. Kellis. (1996). Relationships between thermal stability, degradation rate

and expression yield of barnase variants in the periplasm of Escherichia coli. Protein Engineering. 9(12), 1197-1202.

39. Axe, D.D., N.W. Foster, and A.R. Fersht. (1996).

Active barnase variants with completely random hydrophobic

cores. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 93, 5590-5594.

40. Waldburger, C.D., J.F. Schildbach, and R.T. Sauer.

(1995). Are buried salt bridges important for protein

stability and conformational specificity? Nature Structural Biology. 2(2), 122-128.

41. Roy, S., et al. (1997). A Protein Designed by Binary Patterning of Polar and Nonpolar Amino Acids Displays Native-like Properties. Journal of the American Chemical

Society. 119, 5302-5306. 42. Gibson, T.J., Studies on the Epstein- Barr Virus Genome. 1984, Univ. of Cambridge, Cambridge, UK: 43. Clackson, T., et al. (1991). Making antibody fragments using phage display libraries. Nature. 352, 624-628.

44. McCafferty, J., et al. (1990). Phage antibodies:

filamentous phage displaying antibody variable domains.

Nature. 348, 552-554.

45. Fisch, I., et al. (1996). A strategy of exon shuffling for making large peptide repertoires displayed on

filamentous bacteriophage. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 93, 7761-7766.

46. Matouschek, A., et al. (1989). Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein

engineering. Nature. 340, 122-126.

47. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Nature. 227, 680-685. 48. Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996) Common principles of protein translocation across membranes. Science. 271, 1519-1526. 49. Von Heijne, G. (1998) Life and death of a signal peptide. Nature. 396, 111-113. 50. Sprengart, M.L., Fuchs, E. and Porter, A.G. (1996) The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in E.coli. EMBO J. 15, 665-674. 51. Perlman, D. and Halvorson, H.O. (1983) A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukaryotic and prokaryotic signal peptides. J. Mol. Biol. 167, 391-409. 52. Von Heijne, G. (1983) Patterns of amino acids near signal-sequence cleavage sites. Eur. J. Biochem. 133, 17-21. 53. Pedersen, H., Holder, S., Sutherlin, D.P., Schwitter, U., King, D.S., Schultz, P.G. (1998) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 95, 10523-10528.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for seleksjon av et korrekt foldet fusjonspolypeptid, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) tilveiebringe et flertall av virioner som koder for og presenterer et repertoar av fusjonspolypeptider, idet nevnte fusjonspolypeptider omfatter et heterologt polypeptid innsatt i sekvensen av et viralt kappeprotein-polypeptid, hvor et proteasesete er lokalisert i fusjonspolypeptidet slik at setet beskyttes fra proteasespalting i korrekt foldete fusjonspolypeptider og ikke beskyttes fra spalting i polypeptider som ikke er korrekt foldet, og hvor nevnte repertoar omfatter minst delvis ikke-foldete og foldete medlemmer; (b) eksponere virionene til en protease hvorved virioner som presenterer korrekt foldete fusjonspolypeptider er resistente til spaltning av nevnte protease; og hvor de som ikke oppviser korrekt foldete polypeptider ikke er resistente til spaltning av nevnte protease; (c) formere de virioner som omfatter intakt fusjonsprotein.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakter isert ved at proteasespaltingssetet er lokalisert i eller tilgrensende til det heterologe polypeptid.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakter isert ved at det proteasespaltbare setet er lokalisert distalt i forhold til det heterologe polypeptid.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakter isert ved at fusjonspolypeptidet ytterligere omfatter en selekterbar markør, hvor spalting fjerner markøren fra virionet; og hvor virioner som omfatter markøren velges, mens virioner hvorfra markøren har blitt fjernet med spalting vrakes.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 4, karakter isert ved at virionene separeres ved binding til en fastfase ved hjelp av en markør.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakter isert ved at virionene bindes til fastfasen før eksponering til proteasen.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakter isert ved at virionene eksponeres til proteasen før de bindes til fastfasen.