ES2299244T3 - Sistema de exposicion de fagos para la seleccion de proteinas correctamente plegadas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la selección de un polipéptido de fusión correctamente plegado, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una pluralidad de viriones que codifican y exponen un repertorio de polipéptidos de fusión, comprendiendo dichos polipéptidos de fusión un polipétido heterólogo insertado en la secuencia de un polipéptido de proteína de revestimiento viral, en el que un sitio de proteasa está situado dentro del polipéptido de fusión, de tal forma que el sitio está protegido de la escisión por parte de la proteasa en los polipéptidos de fusión correctamente plegados y no está protegido de la escisión en polipéptidos de fusión que no están correctamente plegados, y dicho repertorio comprende al menos elementos parcialmente no plegados y plegados; (b) exponer los viriones a una proteasa a través de la cual los viriones que exponen polipéptidos de fusión correctamente plegados son resistentes a la escisión por parte de dicha proteasa; y aquellos que no exponen polipéptidos de fusión correctamente plegados no son resistentes a la escisión por parte de dicha proteasa; (c) propagar aquellos viriones que comprenden proteínas de fusión intactas.
Description
Sistema de exposición de fagos para la selección
de proteínas correctamente plegadas.
La invención se refiere a un sistema de
selección que permite la selección de polipéptidos expuestos en un
sistema de exposición en la cápsida de fagos.
Los virus se han usado para la exposición de
péptidos y proteínas [21, 26, 44]. En particular, se han usado
bacteriófagos filamentosos para la exposición de proteínas y
péptidos mediante la fusión de los genes que codifican las
proteínas o péptidos al gen que codifica una proteína de
revestimiento en la cápsida de fagos. A medida que el gen de fusión
se encapsida en el fago que está exponiendo la proteína de fusión,
se proporciona un enlace del fenotipo y genotipo. Repertorios de
proteínas se pueden codificar por medio de una población de fagos,
y comprendiendo el fago raro proteínas con actividades de unión
predefinidas aisladas por la unión a la fase sólida. De esta forma,
se han seleccionado los anticuerpos humanos sintéticos de
especificidad de unión al antígeno predefinida a partir de
repertorios de fragmentos de anticuerpos ensamblados a partir de
elementos estructurales diferentes [10]. Ya que el anticuerpo
necesita plegarse para unirse al antígeno, la selección para la
unión también selecciona el plegamiento. Este principio también se
ha usado para la selección de péptidos plegados en los que la unión
se media a través de un epitope discontinuo [8, 11 - 13].
Un problema presente en los sistemas de
exposición en la cápsida de fagos es la presencia de niveles
elevados de fondo provocados por la presencia de fagos que no
exponen los polipéptidos deseados. Por ejemplo, los repertorios de
anticuerpos se codifican comúnmente como proteínas de fusión con la
proteína p3 en los vectores fagémidos y se encapsidan mediante el
uso de un fago auxiliar. La proteína de revestimiento del fago
auxiliar compite con la fusión del anticuerpo y la proteína de
revestimiento (codificada en el fagémido), lo que lleva a la
exposición "monovalente" en lugar de multivalente en la cápsida
de fagos de fragmentos de anticuerpos plegados. Esto puede ser útil
en la discriminación entre la afinidad y la avidez (con exposición
multivalente) de los anticuerpos expuestos en el fago. Sin embargo,
la gran mayoría de fagos sólo exponen la proteína de revestimiento
del fago auxiliar que contribuye a una unión "de fondo" al
antígeno. En este caso, es conveniente seleccionar fagos que
expongan anticuerpos plegados, y eliminar aquellos que no lo
hagan.
Además, todos los sistemas actualmente en uso
dependen de una actividad de unión en el polipéptido que se va a
seleccionar con el fin de realizar el aislamiento de los cuerpos de
exposición deseados de aquellos que no codifican polipéptidos que
tienen una característica deseada. Esto limita los sistemas de
exposición disponibles a la selección de polipéptidos plegados que
poseen una actividad de unión conocida. Sería conveniente tener un
medio para la selección de las proteínas o polipéptidos expuestos
que sea independiente de la actividad de unión de los mismos.
Por ejemplo, existe un interés considerable en
la construcción de proteínas plegadas de novo. Se ha
intentado diseñar proteínas de novo por medio del ensamblaje
de elementos predefinidos de estructura secundaria y también a
partir de secuencias aleatorias (para revisión [5]). En algunos
casos, las proteínas diseñadas han mostrado retener elementos de
estructura secundaria, pero carecen de las interacciones terciarias
estables características del plegamiento de las proteínas nativas,
sugiriendo la presencia de glóbulos fundidos (véase [6] y
referencias en éste). Más exitosa ha sido la creación de proteínas
similares a las nativas basadas en una estructura central
pre-existente [7, 8]. En estos casos las actividades
de unión de una proteína diseñada de novo serán
desconocidas. En este caso, es conveniente seleccionar proteínas
plegadas para la exposición en la cápsida de fagos, y eliminar
aquellas que no lo hagan.
Aunque se han realizado intentos para rastrear
la presencia de proteínas plegadas por su capacidad de sobrevivir a
enzimas degradantes en bacterias [16 - 18], tales procedimientos no
permiten la selección si la supervivencia o crecimiento bacteriano
no depende de la función de la proteína plegada. Así pues, estos
sistemas solamente son aplicables a una pequeña minoría de
polipéptidos que se desearían seleccionar de acuerdo con su
capacidad para plegarse.
Anteriormente se ha demostrado que la inserción
de una secuencia peptídica entre una marca proteolíticamente
estable fusionada a la proteína p3 de revestimiento en la cápsida de
fagos menor y la propia proteína p3, seguido de proteólisis,
proporciona un medio para seleccionar fagos que soportan secuencias
peptídicas que son susceptibles a la proteólisis [19, Patente de
Estados Unidos 5.780.279]. En estos experimentos, los fagos se unen
a una resina de afinidad que se une a una marca proteolíticamente
estable, N-terminal, en el fago. Si los fagos
unidos se someten a proteólisis y elución, sólo los fagos con
secuencias escindibles se eluirán. Este procedimiento se usa para
identificar, entre un repertorio expuesto en la cápsida de fagos,
secuencias de aminoácidos adecuadas como sustratos para proteasas.
Las secuencias introducidas son cortas y no serían capaces de
plegarse de forma independiente. Además, el sistema selecciona
específicamente fágos eluidos en lugar de unidos; en otras
palabras, está configurado específicamente para aislar fagos
escindidos en lugar de no escindidos.
El documento WO 92/156479 (Protein engineering
corporation) se refiere a un procedimiento de exposición en la
cápsida de fagos en el que los enlaces escindibles específicos del
sitio se pueden incorporar en los fagos, por ejemplo, como una
parte de una proteína quimérica de revestimiento tal como el gen III
con el fin de ser capaz de superar el problema de unión
irreversible al material diana. La modificación anhidro - tripsina
con el fin de retener la unión específica de la tripsina pero no la
actividad de la proteasa se usó para reconocer las proteínas
funcionales correctamente plegadas sobre la superficie del fago
MK-BPTI.
La presente invención explota la aplicación de
la escisión del péptido para eliminar virus no deseados.
De acuerdo con un primer aspecto, por lo tanto,
la invención proporciona un procedimiento según la reivindicación
1, para la selección de un polipéptido de fusión correctamente
plegado, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar una pluralidad de viriones que
codifican y exponen un repertorio de polipéptidos de fusión,
comprendiendo dichos polipéptidos de fusión un polipéptido
heterólogo insertado en la secuencia de una proteína viral de
revestimiento, en el que un sitio de proteasa está situado dentro
del polipéptido de fusión de tal forma que el sitio está protegido
de la escisión por proteasa en polipéptidos de fusión correctamente
plegados y no está protegido de la escisión en polipéptidos de
fusión que no están correctamente plegados, y dicho repertorio
comprende al menos elementos plegados y no plegados;
(b) exponer los viriones a una proteasa, a
través de la cual los viriones que exponen polipéptidos de fusión
correctamente plegados son resistentes a la escisión por parte de
dicha proteasa; y aquellos que no exponen polipéptidos de fusión
correctamente plegados no son resistentes a la escisión por parte de
dicha proteasa;
(c) propagar aquellos viriones que comprenden
proteínas de fusión intactas.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, los virus
se pueden seleccionar por escisión de viriones no resistentes
usando una proteasa. Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"virus" se refiere a un inóculo infectivo de viriones, que
puede incorporar sitios de escisión, opcionalmente como parte de
polipéptidos heterólogos codificados por el genoma viral. Así pues,
"virus" se puede referir a una pluralidad de viriones, de tal
forma que puede codificar un repertorio de polipéptidos; de manera
alternativa, según lo requiera el contexto, se puede usar para
denotar un virión individual. El término "virus" incluye
cualquier virus adecuado que puede incorporar un sitio de escisión,
de manera natural o por manipulación. Un virus preferido para usar
en la presente invención es el bacteriófago, preferiblemente
bacteriófago filamentoso.
El término "polipéptido" se usa por lo
general para denotar moléculas construidas por una pluralidad de
aminoácidos, estando los aminoácidos unidos entre sí de forma
covalente tal como a través de enlaces peptídicos. Los polipéptidos
de "fusión" son esencialmente polipéptidos que se incorporan en
proteínas virales de revestimiento, de tal forma que se crea una
fusión entre la proteína viral de revestimiento y el polipéptido en
cuestión. La fusión puede incorporar el polipéptido en la proteína
viral de revestimiento, de manera ventajosa entre dominios de la
misma, o colocarlo en un extremo de la misma, para realizar una
fusión terminal. El polipéptido se denomina un polipéptido
"heterólogo" para denotar que es heterólogo a la proteína viral
de revestimiento en la que se inserta. Es posible, sin embargo, que
se derive de otro polipéptido de dicho virus.
En un sentido, polipéptido se usa de forma
intercambiable con "proteína" en la presente memoria
descriptiva, en la que no se implica ninguna diferencia de
estructura o tamaño. Sustancialmente, cualquier polipéptido se
puede seleccionar mediante el procedimiento de la presente
invención, incluyendo los polipéptidos estructurales, teniendo los
polipéptidos actividad enzimática y teniendo los polipéptidos
actividad de unión, incluyendo anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos. Los sitios de escisión pueden estar presentes en los
polipéptidos, y pueden ser de origen natural o pueden estar
modificados por ingeniería genética en el polipéptido o en un
péptido de unión unido a éste. "Polipéptido" también se puede
referir a polipéptidos insertados que son esencialmente
polipéptidos que no se pliegan y sirven para codificar un sitio de
escisión e insertar este sitio en la proteína de revestimiento de
un virus. Los polipéptidos insertados pueden adoptar la forma de
fusiones N- o C-terminales, o pueden formar parte
de la propia proteína de revestimiento.
Un "sitio de escisión" es un sitio capaz de
escisión cuando está expuesto a un agente de escisión. En la
presente invención, se explota el uso de sitios de escisión por
proteasas, capaces de escindirse con proteasas. Los sitios de
escisión por proteasas pueden ser parte de, o incorporarse en,
polipéptidos de acuerdo con la invención; de manera alternativa, se
puede modificar por ingeniería genética independientemente en la
proteína de revestimiento del virus. Una característica del sitio
de escisión es que no debería de estar presente en el virus distinto
al de en el sitio de su inserción específica de acuerdo con la
presente invención, o por el contrario inaccesible a la escisión, o
presente solamente en proteínas virales que no son necesarias
después del ensamblaje para mediar la infección.
De acuerdo con la invención, el sitio de
escisión se puede insertar o estar presente en cualquier posición
adecuada en el virus. De forma ventajosa, sin embargo, se inserta o
está presente en la propia proteína de revestimiento o en el
polipéptido heterólogo que forma parte del polipéptido de
fusión.
Un enlace puede estar presente formado a través
de cadenas laterales en uno o más aminoácidos, tal como un enlace
disulfuro. Los enlaces disulfuros se escinden con agentes de
reducción, tales como DTT o
\beta-mercaptoetanol.
Si un virus contiene un enlace disulfuro, la
escisión de un sitio de escisión por proteasas situado entre los
dos residuos de cisteína que forman el enlace a través de sus
cadenas laterales no supondrá la pérdida de infectividad viral ya
que el enlace disulfuro es capaz de retener el enlace covalente de
los polipéptidos virales.
En caso de que no se desee la selección de
polipéptidos que contienen disulfuro, los virus se tratan de manera
ventajosa con un agente de reducción antes o después de la
proteólisis, con el fin de eliminar el fondo debido a los virus que
se han escindido con la proteasa pero que se han mantenido juntos
por los sisulfuros.
El polipéptido de fusión puede comprender uno o
más polipéptidos heterólogos. En el caso de una fusión terminal, un
polipéptido heterólogo como tal puede funcionar como una marca de la
proteína, permitiendo la identificación del fago que expresa el
polipéptido de fusión. En un caso como tal, el sitio de escisión
puede posicionarse en o cerca de la marca, de tal forma que la
escisión del sitio de escisión libere la marca.
Una marca es cualquier entidad capaz de unirse a
un ligando que se puede usar para aislar un virus por medio del
procedimiento de la presente invención. Por consiguiente, la marca
es resistente a la proteasa usada en el procedimiento de la
invención. Ejemplos de parejas marca / ligando incluyen barnasa /
barstar, avidina / biotina, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
y ligandos, grupos de quelación y quelados, por ejemplo metales y
similares.
En todas las realizaciones de la presente
invención, que se describen en mayor detalle a continuación, se
seleccionan los polipéptidos no escindidos; el material escindido se
descarta en la etapa de selección.
Preferiblemente, el virus de acuerdo con la
invención codifica un repertorio de polipéptidos heterólogos. Un
repertorio es una colección de elementos, preferiblemente
polipéptidos, que se distinguen ligeramente unos de otros de una
forma aleatoria o parcialmente aleatoria. Preferiblemente un
repertorio de polipéptidos es una colección de polipéptidos
variantes que preferiblemente incorporan mutaciones aleatorias o
parcialmente aleatorias. Como se usa en la presente memoria
descriptiva, un repertorio preferiblemente está constituido por
10^{4} elementos o más. Un repertorio de manera ventajosa
comprende una cantidad muy grande de elementos, típicamente entre
10^{8} y 10^{11}, y potencialmente 10^{14} o superior.
El polipéptido heterólogo, o repertorio de tales
polipéptidos, se expone de manera ventajosa sobre la superficie del
virus que lo codifica, en virtud de incorporarse en una proteína de
revestimiento, o sobre la superficie de células infectadas por el
virus. Cuando el virus es un bacteriófago, la proteína también se
puede exponer sobre la superficie de las bacterias infectadas con
el bacteriófago.
De manera ventajosa, el sitio de escisión está
situado en o adyacente al polipéptido heterólogo, de tal forma que
se puede proteger plegando el polipéptido heterólogo y permite así
la selección de los polipéptidos heterólogos que son capaces de
plegarse correctamente. De manera alternativa, sin embargo, el sitio
de escisión se puede colocar distal al polipéptido heterólogo; en
dichas realizaciones, el sitio de escisión puede servir para
permitir la reducción de fondo en las técnicas de exposición de
proteínas y péptidos en la cápsida de fagos. Por ejemplo, la
introducción del sitio de escisión en el fago auxiliar usado con
fagémidos que codifican un repertorio de polipéptidos permite
eliminar el fago auxiliar mediante escisión antes de la infección de
células hospedadoras, reduciendo así espectacularmente el fondo
debido al fago "vacío". De manera ventajosa, por lo tanto, el
sitio de escisión se incorpora en la proteína de revestimiento del
virus.
Como se refiere en la presente memoria
descriptiva, un fagémido es un vector de clonación de plásmidos que
comprende secuencias de replicación viral pero que carece de al
menos una función viral. Esto significa que aunque los fagémidos se
pueden insertar en células hospedadoras por medio de procedimientos
de transferencia de ácidos nucleicos convencionales, y existirán en
las células hospedadoras en un estado episomal, son incapaces de
ensamblar en viriones y completan así un ciclo viral de infección.
Los fagos auxiliares se usan para proporcionar las funciones
virales deficientes y permiten que los fagémidos se empaqueten en
viriones. De acuerdo con la invención, los fagémidos pueden
codificar fusiones de proteínas de revestimiento con polipéptidos
heterólogos que incorporan un sitio de escisión.
Los fagos auxiliares proporcionan la función
viral carente en los fagémidos con el fin de permitir el
empaquetamiento de los fagémidos en viriones. Los fagos auxiliares
se pueden modificar con el fin de volverlos escindibles por medio
de una proteasa. En un aspecto, los fagos auxiliares pueden
incorporar una proteína de escisión que tiene un sitio de escisión
que, cuando está escindido en el fago "rescatado" de la
progenie, volverá a la proteína de revestimiento derivada del fago
auxiliar incapaz de mediar la infección.
Como será evidente a partir de lo anterior, en
el procedimiento de acuerdo con la presente invención se seleccionan
los virus que son resistentes a la escisión. De manera ventajosa,
los viriones resistentes se seleccionarán por medio de la infección
de células hospedadores escindibles, tales como células hospedadoras
bacterianas. Los viriones escindidos no son infectivos. De manera
alternativa, la unión de viriones a un ligando, por ejemplo a
través de una marca, depende de la protección de un sitio de
escisión en el virus, de tal forma que los virus que están
escindidos no se aíslan por medio de la unión ligando / marca.
La presente invención se puede configurar de una
serie de formas de acuerdo con el procedimiento diseñado para el
que se desea aplicar la metodología básica. La escisión selectiva de
viriones se usa para reducir el fondo en las técnicas de exposición
de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos. Mediante la escisión
y eliminación de los fagos que no contienen un polipéptido
heterólogo, o expresan un polipéptido heterólogo que no es capaz de
plegarse correctamente, se puede aumentar sustancialmente la
sensibilidad de un procedimiento de exposición en la cápsida de
fagos. Como se demuestra en la sección experimental a continuación,
usando la metodología de la invención, la exposición en la cápsida
de fagos se puede usar para seleccionar polipéptidos que no son
susceptibles de selección mediante las técnicas de exposición de
acuerdo con los procedimientos de la técnica anterior.
En una primera configuración, la escisión de un
sitio de escisión en una proteína de revestimiento del virión se
puede explotar para reducir el fondo atribuible a los fagos que no
exponen polipéptidos heterólogos, o a los fagos que exponen
polipéptidos heterólogos que son incapaces de plegarse
correctamente. La escisión de polipéptidos expuestos, de acuerdo
con la presente invención, da como resultado el deterioro de los
virus para conseguir la infección de células hospedadoras. Así
pues, por medio de la propagación de los virus que se han expuesto
a una proteasa, es posible enriquecer los virus para los viriones
que comprenden polipéptidos expuestos que son resistentes a la
escisión. Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"deteriorar" significa reducir; de este modo incluye la
prevención parcial y completa de la infección de células
hospedadores por parte del virus afectado.
La proteína de revestimiento se selecciona como
el sitio para la escisión en base a que está disponible para los
agentes de escisión en las células hospedadores que contienen el
virus o en la superficie del propio virus. Así pues, en una
realización preferida, las preparaciones de virus se pueden tratar
con una proteasa con el fin de proporcionar viriones que tienen
proteínas de revestimiento escindibles incapaces de mediar la
infección de las células hospedadoras. De manera alternativa, las
células infectadas con el virus se pueden tratar con una proteasa
activa dentro de la célula, que evitará el empaquetamiento de los
virus que comprenden una proteína de revestimiento escindible.
De acuerdo con la presente invención, la
referencia a la selección se puede interpretar como una referencia
al rastreo, ya que se pueden usar los mismos procedimientos para
rastrear fagos, como puede ser evidente para las personas expertas
en la técnica.
Los sitios de proteasas pueden ser parte de la
proteína de revestimiento de forma natural, pero preferiblemente
están modificados por ingeniería genéticamente dentro de ésta.
Los sitios de escisión por proteasas se pueden
encontrar en polipéptidos o modificarse por ingeniería genética
como una parte integral de su secuencia. De forma típica, los sitios
de escisión por proteasas se pueden definir en lo que se refiere a
secuencias de aminoácidos que son susceptibles de escisión por una
proteasa. Por ejemplo, la invención abarca el uso de sitios de
escisión por proteasas escincibles por una o más de las proteasas
tripsina (escinde en Lys, Arg), quimotripsina (Phe, Trp, Tyr, Leu),
termolisina (residuos alifáticos pequeños), subtilisina (residuos
alifáticos pequeños), Glu-C (Glu), Factor Xa (Ile /
Leu - Glu - Gly - Arg), Arg-C (Arg) y trombina.
Los sitios de escisión por proteasas se pueden
incorporar en la proteína de revestimiento de un virus por medio de
la construcción de una fusión entre la proteína de revestimiento y
un polipéptido adicional, conteniendo el polipéptido adicional el
sitio de escisión. El polipéptido adicional debería insertarse en
una posición en la proteína viral de revestimiento de tal forma que
permita el ensamblaje de una cápsida viral funcional y la infección
subsiguiente, pero si se escinde dará como resultado el deterioro de
la infectividad.
Si el sitio de escisión por proteasas
incorporado en la proteína de revestimiento permanece sin escindir,
por lo tanto, el virus es capaz de ensamblar en viriones funcionales
y retiene el potencial para infectar células hospedadoras. Si el
sitio de escisión por proteasas se escinde, sin embargo, la
estructura de la proteína viral de revestimiento se verá
comprometida y el virus perderá al menos parte de su potencial para
infectar células hospedadoras.
En una realización preferida, el virus para usar
en la presente invención es un bacteriófago, preferiblemente un
bacteriófago filamentoso. El bacteriófago filamentoso se usa en gran
medida en las técnicas de exposición de proteínas y péptidos en la
cápsida de fagos para la selección de polipéptidos de bibliotecas de
fagos que codifican un gran repertorio de los mismos. De manera
convencional, el repertorio de polipéptidos se inserta en la
proteína p3 del bacteriófago filamentoso, pero se puede emplear
cualquier otro sitio adecuado dentro del alcance de la presente
invención.
En el caso de la proteína p3 del bacteriófago
filamentoso, la proteína está constituida por tres dominios. El D1
N-terminal está implicado en la unión al receptor
de tolA, el D2 en la unión al F-pilus (y mediación
de la infección) y el D3 en el anclaje de la proteína a la partícula
del fago. Los péptidos y proteínas se pueden insertar en los
límites del dominio sin eliminar la infectividad [21, 22], pero la
presencia de todos los dominios es esencial para la infectividad
del fago [23]. Los bacteriófagos son resistentes a la proteólisis
(permitiendo su uso como fago "sustrato", [19]), pero la
introducción de los polipéptidos que comprenden sitios de escisión
por proteasas en p3, por ejemplo en las uniones entre dominios,
supone la pérdida de la infectividad del fago después de la
proteólisis.
Los sitios de escisión por proteasas se pueden
incorporar en los polipéptidos heterólogos. Como se describe
anteriormente, los polipéptidos heterólogos se pueden codificar en
forma de un repertorio en una biblioteca de fagos. Como los
polipéptidos o proteínas plegadas son con frecuencia resistentes a
la proteólisis y las proteínas no plegadas son sensibles, la
escisión requiere que la cadena polipeptídica se una y se adapte a
la estereoquímica específica del sitio activo de la proteasa, y por
lo tanto que sea flexible, accesible y capaz de desplegamiento
local [14, 15]. La clonación de un polipéptido que comprende sitios
de escisión por proteasas en las uniones del dominio de p3, seguido
de proteólisis, proporciona un medio de selección de fagos que
soportan proteínas que son resistentes a la proteólisis y se
pliegan.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En el caso de los repertorios de exposición en
la cápsida de fagos (en los que el polipéptido que se selecciona
está clonado en el extremo N-terminal de p3)
codificados en vectores de fagémidos, el uso de fagos auxiliares
que comprenden un polipéptido que comprende sitios de escisión por
proteasas en los límites del dominio, seguido de proteólisis,
proporciona un medio de selección de los fagos que exponen la
proteína de fusión por medio de la eliminación del fago auxiliar
después de que se ha proporcionado el "auxilio".
El uso del auxiliar escindible por proteasa
seguido de la escisión por proteasas selecciona los fagos que
soportan la proteína de fusión (y una buena exposición). Como muchos
fagos en un repertorio no exponen proteínas de fusión [26] y éstas
contribuyen a la unión no específica del fago, esto también
mejoraría la eficacia de la selección. Cuando se usan las técnicas
de la técnica anterior, sólo entre el 0,1% y el 1% de todas las
partículas del fago en una biblioteca de fagos puede comprender una
proteína del gen 3 que surge del fagémido. Por lo tanto, la mayor
parte (99% - 99,9%) de las partículas del fago que se han unido de
forma no específica al soporte sólido usado en la selección
comprenderá p3 del fago auxiliar (independientemente del genoma que
lleva la partícula del fago que lo más probable es que sea un ADN
fagémido), estas partículas se vuelven no infectivas con la
escisión proteolítica.
La invención opcionalmente comprende el uso de
condiciones o agentes, durante la escisión del sitio de escisión,
que modulan la labilidad del sitio de escisión en presencia de la
proteasa. Este enfoque se puede usar para aumentar la escisión, por
ejemplo para seleccionar sólo los polipéptidos que se pliegan de tal
forma que protejan estrechamente el sitio de escisión del acceso
por parte de la proteasa, o para disminuir la escisión, por ejemplo
para seleccionar mutantes estables de un repertorio de polipéptidos
que es ordinaria y relativamente lábil en condiciones de
escisión.
Por ejemplo, la modulación de la labilidad del
sitio de escisión se puede conseguir por medio del uso de agentes
que aumentan o disminuyen dicha labilidad. Así pues, se puede
incluir una proteína desnaturalizante, a una concentración
adecuada, para desestabilizar un polipéptido y hacerlo más lábil. De
manera alternativa, se puede incluir un ligando para un
polipéptido. El ligando puede estabilizar la estructura plegada del
polipéptido, hacerlo menos sensible a la escisión. De manera
alternativa, el ligando puede desestabilizar la estructura plegada
del polipéptido, por ejemplo favoreciendo la adopción de una
configuración alternativa. Esto puede hacer al polipéptido más
accesible a la proteasa y de este modo más lábil.
Las condiciones del procedimiento de escisión se
pueden alterar, tal como manipulando el pH o la temperatura a la
que se dirige la escisión, para conseguir efectos similares. De este
modo, la desviación del pH de lo óptimo para el polipéptido que
comprende el sitio de escisión puede provocar que el sitio se
convierta en más accesible a la proteasa. De forma similar, el
aumento (o disminución) de la temperatura de las condiciones en la
que se escinde el polipéptido, puede hacer al polipéptido más o
menos susceptible a la escisión.
En algunos casos, las interacciones no
covalentes pueden ser responsables de que los péptidos retengan su
estructura y que las proteínas de revestimiento permanezcan viables,
incluso después de la escisión satisfactoria del sitio de escisión.
El uso de desnaturalizantes, variación de la temperatura y otras
técnicas potencialmente desestabilizantes también se pueden usar
para disminuir la probabilidad de que un polipéptido escindido
retenga su estructura.
La selección proteolítica para el plegamiento de
las proteínas se puede aplicar en una serie de áreas, ya que
permite que se procesen cantidades de proteínas mucho mayores que
con el rastreo convencional. Por ejemplo, permite el aislamiento de
proteínas mutantes con estabilidad mejorada [1], por ejemplo a
partir de bibliotecas combinatorias de mutantes en las que los
residuos en varios sitios se varían simultáneamente [39, 40] o a
partir de mutantes aleatorios o por recombinación [3, 4]. También
permite el aislamiento de nuevas proteínas y arquitecturas de
grandes repertorios de secuencias [16 - 18, 41]; y la mejora en la
estabilidad del plegamiento tras varias rondas de mutación y
selección rigurosa en aumento, más como la maduración de la afinidad
de los anticuerpos.
Una segunda configuración de la presente
invención concierne el uso de marcas para permitir el aislamiento
de polipéptidos heterólogos correctamente plegados, explotando la
capacidad de los polipéptidos correctamente plegados de proteger un
sitio de escisión cerca de una marca asociada.
La inserción de un polipéptido entre la marca
estable fusionada al extremo N-terminal de la
proteína de revestimiento viral y la propia proteína de
revestimiento, seguido de escisión, proporciona un medio de
selección de virus que soportan proteínas que son resistentes a la
proteólisis y se pliegan. De este modo, sólo los viriones, cuyo
polipéptido insertado no se degrada, mantendrán la fusión de la
marca como parte de su revestimiento, y sólo estos viriones pueden,
por lo tanto, ser capturados por purificación de afinidad usando
esta marca. Después de la elución de estos fagos capturados por
afinidad del ligando, estos fagos se pueden propagar y someter a
rondas adicionales del mismo procedimiento de selección.
De manera alternativa, los viriones se pueden
unir a una matriz de afinidad, que comprende un ligando para la
marca, antes de la escisión. El agente de escisión se puede añadir
subsiguientemente, y sólo los fagos resistentes se retendrán en la
matriz. Estos se pueden eluir después según sea necesario.
Las matrices adecuadas incluyen columnas, perlas
y otras superficies a las que se une un ligando para la marca.
De acuerdo con la presente invención, la
referencia a la selección se puede interpretar como una referencia
al rastreo, ya que se pueden usar los mismos procedimientos para
rastrear fagos, como será evidente para las personas expertas en la
técnica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los sitios de proteasas se describen
sustancialmente para la configuración anterior de la presente
invención y de manera ventajosa son sitios de escisión por
proteasas.
La escisión requiere que la cadena de
polipéptido se una y adapte a la estereoquímica específica del sitio
activo de la proteasa, y por lo tanto que sea flexible, accesible y
capaz de desplegamiento local [14, 15]. Los polipéptidos o
proteínas plegadas son con frecuencia resistentes a la proteólisis,
debido a la inflexibilidad relativa de su estructura, mientras que
las proteínas no plegadas permanecen sensibles.
Como se hace referencia anteriormente, la
selección posible de polipéptidos de un repertorio que, a través de
la variación o de la mutación, no contienen una secuencia de
reconocimiento para cualquier proteasa particular de la invención
usada en este procedimiento, se puede circunvenir de dos formas.
Por ejemplo, el uso de un cóctel de proteasas con secuencias de
reconocimiento muy distintas aseguraría que todos los polipéptidos
fueran escindibles, si no están protegidos por su estado de
plegado. De manera alternativa, un repertorio fágico de
polipéptidos que se va a seleccionar podría desnaturalizarse
parcialmente, de tal forma que el polipéptido insertado se
despliegue pero el fago y la marca N-terminal
permanezcan intactos. La digestión proteolítica seguida de
purificación por afinidad eliminaría todos los fagos del repertorio
que han escapado a la proteólosis debido a la ausencia de
secuencias de reconocimiento de la proteasa en el polipéptido. Los
fagos no unidos por la resina, contienen sólo fagos, que contienen
la secuencia de reconocimiento de la proteasa en el polipéptido
expuesto y que pueden o no pueden escapar a la proteólisis en
condiciones no desnaturalizantes. De este modo, éstos estarían
sometidos a la selección proteolítica basada en la protección del
estado de plegamiento del polipéptido expuesto.
La invención también se describe en los
siguientes ejemplos, solamente a efectos de ilustración.
Los materiales y procedimientos para los
Ejemplos 1 - 6 se anexan al final del Ejemplo 6.
El fago se incuba en un intervalo de condiciones
desnaturalizantes in vitro y después se restaura a las
condiciones nativas inmediatamente antes de la infección de
bacterias. La incubación del fago en urea 10 M, o extremos de pH
(tan bajos como pH 2, y tan altos como pH 12) y temperatura (tan
alta como 60ºC) no suponen una pérdida importante de infectividad
(Tabla 1). Esto indica que el fago es resistente a las condiciones
desnaturalizantes o que si se despliega puede ser capaz de
replegarse rápidamente. Sin embargo, con GndHCl se observa una
pérdida de 5 veces en la infectividad del fago por encima de 5 M y
una pérdida adicional de 5 veces a 8 M (Tabla 1).
Después el fago se incuba en condiciones nativas
con un intervalo de proteasas (tripsina, Factor Xa, IgA proteasa,
Asp-N, quimotripsina, Arg-C,
Glu-C, trombina, termolisina, subtilisina) con
especificidades diferentes. No hay pérdida en infectividad salvo
para la subtilisina, que se ha reseñado que escinde la proteína p3
[24]. Si el fago se incuba en condiciones desnaturalizantes en
presencia de proteasas tales como tripsina en urea 3,5 M (o >
47ºC), la infectividad se pierde. Esto indica que en condiciones
desnaturalizantes el desplegamiento de las proteínas de
revestimiento del fago es suficiente para hacer los sitios
disponibles para la proteólisis.
Una secuencia (PAGLSEGSTIEGRGAHE) que comprende
varios sitios proteolíticos se inserta en la región rica en glicina
flexible entre los dominios D2 y D3 de la p3 del fago. La incubación
del fago (fd-K108) en condiciones nativas con
tripsina, termolisina o subtilisina dio ahora como resultado una
pérdida casi completa de la infectividad (de 10^{7} a < 10
TU/ml) y la incubación con Glu-C y chimotripsina dio
como resultado una pérdida importante (de 10^{7} a 10^{4}
TU/ml). Esto indica que estas proteasas escinden el nuevo enlace.
Sin embargo, la incubación con Factor Xa, Arg-C o
trombina no supuso una pérdida en la infectividad, a pesar de la
presencia de sitios de escisión potenciales para estas enzimas.
Presumiblemente, la presencia de los dominios D2 y D3 pueden
bloquear el acceso o escisión para estas enzimas en el caso del
polipéptido presente.
La fusión de proteínas a p3 debería suponer la
exposición multivalente de la proteína en la cápsida de fagos. Sin
embargo, si la proteína se fusiona a p3 codificado por un fagémido
(tal como pHEN 1 [25]), y la bacteria que contiene el fagémido se
rescata con un fago auxiliar (tal como VCSM13), la proteína de
fusión tiene que competir para la incorporación en el fago con p3
auxiliar. Esto supone el denominado fago "monomérico", en el
que normalmente menos de una copia de la proteína de fusión se une a
cada partícula del fago [26].
Se podría esperar que el uso de fagos
"monoméricos" sea ventajoso para la selección de interacciones
de gran afinidad. Además, las proteínas de fusión en los fagos
"monoméricos" deberían ser más sensibles a la proteólisis, ya
que se evitan las interacciones entre multímeros de las proteínas de
fusión. Sin embargo, una desventaja es que la mayor parte de los
fagos infectivos no exponen una proteína; tales fagos que se unen de
manera no específica a la fase sólida se amplían durante cada ronda
de desarrollo en la cápsida de fagos.
Los fagos auxiliares escindibles por proteasas
se construyen, por lo tanto, introduciendo la secuencia de escisión
por proteasas entre los dominios D2 y D3 para generar el fago
auxiliar KM 13.
Se muestra que KM 13 rescata el fagémido pHEN1.
Además, se muestra que la tripsina escinde una fracción mayor
(aproximadamente el 50%) de p3 del fago rescatado, como se muestra
en la transferencia de Western y se detecta con un
anti-mAb de D3 (Fig. 1). Sin embargo, la
infectividad del fago apenas se altera con la escisión; por lo
tanto, parece que sólo una fracción de p3 necesita ser entera para
mediar la infección bacteriana.
También se muestra que KM 13 rescata un fagémido
pHEN1 que codifica un fragmento de anticuerpo de una sola cadena
[27]. Aquí la escisión por tripsina dio como resultado una pérdida
50 veces de la infectividad en la cápsida de fagos (no se muestran
los datos), que concuerda con las indicaciones de que solamente una
pequeña fracción del fago expresa la proteína de fusión cuando se
rescata con el fago auxiliar [26, 28].
También se construye un fagémido escindible por
proteasas. El fagémido se puede rescatar con KM13 ó VCSM13. Como es
de esperar, la infectividad de este fagémido rescatado con KM 13
(pero no con VCSM 13) se destruye con la tripsina. Este vector del
fagémido es propenso a las deleciones en el enlace D2 - D3; al
cambiar el uso del codón en las regiones del enlace en cualquiera
de los sitios del sitio de escisión por proteasas, y acortando la
longitud de esas regiones del enlace, se crea un vector más estable
(pK1; Fig. 2). En un segundo vector (pK2; Fig. 2), la secuencia del
poliengarce se dispone de manera que sitúa D3 fuera de fase para
hacer no infecciosas las religaciones dentro del poliengarce.
Las bacterias se electroporan con ADN del
fagémido que codifica un repertorio de fragmentos de scFv fusionados
al extremo N-terminal de p3 y se cultivan en
cultivo líquido (2 x TY que contiene antibiótico para seleccionar
las bacterias que contienen fagémidos y glucosa para suprimir la
expresión del gen 3). En la fase de medio logaritmo del cultivo
bacteriano (OD600 = 0,5) el fago auxiliar KM13 se añade a las
bacterias para proporcionar una relación de fago auxiliar a
bacterias de 20:1. Las bacterias se incuban a 37ºC sin agitación
durante 45 minutos, después con agitación durante 45 minutos. Las
bacterias se recolectan por centrifugación y se vuelven a suspender
en medio fresco que contiene 50 \mum/ml de kanamicina y
antibiótico, sin glucosa, para seleccionar la presencia de ADN del
fagémido. El cultivo se cultiva durante toda la noche a 30ºC con
agitación.
Las bacterias se sacan del sobrenadante que
contiene el fago por centrifugación. El fago se precipita del
sobrenadante añadiendo 1/5 del volumen de PEG al 20% / NaCl 2,5 M.
Después de 1 - 2 horas a 4ºC el fago precipitado se recoge por
centrifugación. El fago se vuelve a suspender en PBS (una segunda
precipitación de PEG es opcional) y se puede usar en la
selección.
Se deja que la biblioteca de fagos se una al
antígeno (inmovilizado sobre un soporte sólido tal como un
inmunotubo o en solución al antígeno marcado (esto es, biotinilado)
que se puede inmovilizar después de la unión por afinidad de los
anticuerpos en la cápsida de fagos. El fago no unido se elimina por
medio de lavado extensivo (la rigurosidad del lavado se puede
variar con respecto al tiempo y a los detergentes añadidos).
Las bibliotecas de fagos que comprenden una
marca escindible, tal como la marca c-myc insertada
entre el anticuerpo y el gen 3, se pueden eluir por medio de la
adición de tripsina en solución a una concentración de 0,1 a 1
mg/ml. (Las bibliotecas de fagos sin una secuencia escindible entre
el anticuerpo y el gen 3 se pueden eluir por medio de la adición de
Trietilamina 100 mM. En este caso, la solución se neutraliza por
medio de la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,4 y
después de 10 minutos, se añade tripsina a una concentración final
de 0,1 a 1 mg/ml.) La tripsina también escinde las copias del gen 3
del fago auxiliar, aunque deja el gen 3 del fagémido intacto. De
este modo, solamente el fago que había llevado, o todavía lleva, una
fusión del anticuerpo será infectivo.
El fago se usa para infectar bacterias en fase
de medio logaritmo de cultivo (OD600 = 0,5), y las bacterias se
siembran sobre placas de agar que contienen el antibiótico que
selecciona el ADN del fagémido. Se recogieron los clones
individuales y el pago se preparó como anteriormente. El fago
resultante se usa en ELISA para identificar anticuerpos en la
cápsida de fagos que se unen específicamente al antígeno de
interés.
La barnasa en una RNasa pequeña de 110 residuos
de aminoácidos cuyo plegamiento se ha estudiado extensamente (para
revisión [2]). La barnasa contiene múltiples sitios para la escisión
por tripsina, aunque la proteína plegada es resistente a la
escisión (los datos no se muestran). Los fagos con barnasa clonados
entre D2 y D3 deberían, por lo tanto, ser resistentes a la escisión
por proteasa y capaces de selección.
Como la barnasa es tóxica a Escherichia
coli, un mutante A (His 102 -> Ala) se clona, que es
catalíticamente inactivo pero estable [29, 30], en el fagémido pK2.
Un mutante B (His 102 -> Ala, Leu14 -> Ala) también se clona,
con estabilidad más baja; Leu14 se entierra en el núcleo hidrófobo y
su mutación crea una cavidad grande en el núcleo afectando el
empaquetamiento de diferentes elementos estructurales [31]. Los
fagos (rescatados con KM13) se unen al inhibidor barstar mediante
ELISA (Fig. 3), y por lo tanto exponen la barnasa mutante en forma
plegada.
Después los fagos se incuban con tripsina a un
intervalo de temperaturas (Fig. 4). Después de la incubación a
10ºC, existe una disminución en la infectividad de la cápsida de
fagos de 5 a 10 veces para ambos mutantes, sugiriendo que (como
antes con la exposición del fragmento scFv) sólo una pequeña
fracción de los fagos exponen la proteína de fusión. No existe una
pérdida adicional en la infectividad tras la escisión hasta 30ºC
(para el mutante B) ó 37ºC (para el mutante A). En ambos casos la
transición principal es al menos 10ºC por debajo de la esperada
para el desplegamiento térmico reversible de los mutantes.
Los fagos A y B se mezclan en relaciones
diferentes y se incuban con tripsina a 20ºC, en la que ambos
mutantes están estables para la escisión, o a 37ºC en la que
solamente A está estable. Después de la "selección
proteolítica" los fagos se siembran en placas y se analizan por
PCR, que se sigue por la digestión de restricción para distinguir
los mutantes. Como se muestra en la Tabla 2, el mutante A se
enriquece con un factor de 1,6 x 10^{4} después de una sola ronda
y con 1,3 x 10^{6} después de dos rondas de selección proteolítica
a 37ºC. No se puede detectar ningún enriquecimiento a 20ºC.
El subdominio de 35 aminoácidos del dominio de
pieza de cabeza de la proteína villina con haces de
f-actina [32] es mucho más pequeño que el de la
barnasa. Sin embargo, forma un pliegue estable a temperatura
ambiente y es resistente a la proteólisis; además su estabilidad no
depende de enlaces disulfuros o ligandos de unión [33]. El
subdominio de la villina (que contiene varios sitios de escisión por
tripsina potenciales) está clonado entre los dominios D2 y D3 de la
cápsida de fagos, y se incuba con tripsina a diferentes
temperaturas. El perfil para la pérdida de infectividad no es tan
agudo como con la barnasa, con la transición principal inferior a
35ºC, considerablemente inferior al desplegamiento térmico de la
villina (70ºC) [32, 33]. Los fagos que exponen villina se mezclan
con fagos que se han producido usando el fagémido pK1 y el fagémido
auxiliar KM13, y se incuban con tripsina. Después de una sola ronda
de selección proteoítica, los fagos de fusión de villina se
enriquecen 8,7 x 10^{3} veces (Tabla 3).
En resumen, los resultados de los Ejemplos 1 y 2
muestran que la infectividad de los fagos es relativamente
resistente a la temperatura, pH, urea y GndHCl, y a varias
proteasas, pero si un enlace flexible que comprende un sitio de
escisión por proteasas se inserta entre los dominios D2 y D3 de la
proteína p3 de revestimiento de la cápsida de fagos, el fago se
vuelve sensible a la escisión. Por el contrario, como se muestra en
los Ejemplos 5 y 6, si los sitios de escisión por proteasas
comprenden un dominio de proteínas plegadas tales como barnasa o
villina, el fago es resistente a la escisión. Esto permite la
selección proteolítica del plegamiento de proteínas, con factores
de enriquecimiento de más de 10^{4} veces para una sola ronda de
selección. La selección es evidente tanto para la barnasa, un
dominio de tamaño medio [34] de 110 aminoácidos, como para la
villina, un dominio pequeño de 35 aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de los mutantes de barnasa (A + B)
en relaciones desde 1:1 hasta 1:10^{8} se seleccionaron por
proteólisis a 37ºC, se analizaron 24 (ó 36 en la ronda 2) clones de
fagos y se anotaron arriba los números de cada mutante.
^{a} Selección a 20ºC cuando se espera que ambos mutantes estén estables, ^{b} antes de la selección.
^{a} Selección a 20ºC cuando se espera que ambos mutantes estén estables, ^{b} antes de la selección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de fagos con villina y pK1
restatados con KM13 en relaciones desde 1:1 hasta 1:10^{6} se
seleccionaron por proteólisis a 10ºC, se analizaron 24 clones de
fagos y se anotaron arriba los números de cada uno. ^{a} antes de
la selección.
Todas las enzimas de restricción, T4 ligasa, se
obtienen de New England Biolabs. Taq ADN polimerasa se obtiene de
HT Biotechnology. Pfu ADN polimerasa se obtiene de Stratagene. dNTP
ultrapuro de Pharmacia. Las proteasas y el inhibidor de proteasas
Pefabloc se obtienen de Boehringer Mannenheim, salvo la
quimotropsina y tripsina tratada con TPCK que se obtienen de Sigma.
Todos los otros agentes químicos se obtienen de igual modo de
Sigma.
Escherichia coli TG1 [42] se usa para la
clonación y propagación de los fagos. TG1 que contiene
fd-DOG [43] o derivados se cultiva toda la noche en
2xTY que contiene 15 \mug/ml de tetraciclina. Los fagémidos se
rescatan usando KM13 ó VCSM13 como se ha descrito [27]. Las
partículas de los fagos se preparan por medio de dos
precipitaciones de PEG [44].
El vector del fago fd-DOG [43]
se usa como vector parental para la construcción de
fd-K108 escindible por proteasas. Los sitios de
restricción únicos (SfiI, KpnI) se introducen en la región
espaciadora rica en glicina entre D2 y D3 usando el sistema de
mutagénesis in vitro Sculptor (Amersham) y el oligonucleótido
pklinker (Tabla 4). Otros sitios de restricción (ApaI, SalI) y
secuencias que codifican un sitio de escisión por proteasas están
clonados entre los sitios SfiI y KpnI usando los oligonucleótidos
polyXafor y polyXaback para crear el vector
fd-K108.
El fago auxiliar escindible por proteasas KM13
se prepara a partir de fd-K108 por medio del
transplante en el fago auxiliar VCSM13 de un fragmento
BamH1-ClaI generado por PCR y los cebadores
fdPCRBack y LIBSEQfor.
Un vector del fagémido escindible por proteasas
se deriva de fd-K108 tanto como el anterior excepto
que usa pCANTAB 3 (Pharmacia). Se introduce una marca FLAG en el
extremo N-terminal de D1 por medio de la clonación
de un fragmento NotI-SfiI generado por PCR y los
cebadores Flagprimer y LSPAback. Para circunvenir las deleciones
debidas a la secuencia repetida en el enlace D2 - D3, el uso del
codón de la región del poliengarce se cambia en dos etapas (a)
usando un fragmento Bam-SfiI generado por PCR y los
cebadores RECGLYfor y LIBSEQfor, rastreando recombinantes por PCR y
los cebadores LSPAfor y LSPAback, (b) usando un fragmento
KpnI-ClaI generado por PCR y los cebadores
RECGLYfor y LIBSEQfor, rastreando recombinantes usando LSPAfor y
LSPAback. El vector resultante es pK1. El gen p3 completo se
secuencia usando secuenciación en ciclo por PCR con terminadores
fluorescentes de cadena didesoxi (Applied Biosystems) [45]. El
vector "fuera de fase" pK2 se deriva de pK1 por mutagénesis
directa al sitio usando el oligo delCKpn y el kit Sculptor de
Amersham. Las secuencias precisas de pK1 y pK2 se establecen en
Kristensen y col., (1998) Folding & Design 3: 321 - 328.
Los vectores que codifican los mutantes
individuales de barnasa, His102-> Ala y Leu 14-> Ala [29, 46]
se usan como plantillas para la amplificación por PCR con los
cebadores Barnasefor y BarnaseH102Aback y Pfu polimerasa. Los
productos por PCR (que codifican el mutante individual His102->
Ala, y el mutante doble His102-> Ala, Leu 14-> Ala) se
digieren usando las enzimas de restricción SfiI y KpnI, y se ligan
en el vector pK2 para proporcionar los fagémidos pK2BA y pK2BB
respectivamente y los genes de barnasa secuenciados usando
secuenciación en ciclo por PCR.
El fragmento termoestable de 35 aminoácidos de
la pieza de cabeza de la proteína villina que une
f-actina [33] se amplifica a partir de ADNc de
bolsa de pollo usando los cebadores de PCR villinfor y villinback
con Pfu polimerasa. Los productos por PCR se clonan como
anteriormente para proporcionar el fagémido pK2V.
Para la resistencia a los desnaturalizantes, se
añade urea 10 M en PBS (NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM pH
7,0) ó GndHCl 8 M (clorhidrato de guanidina) y
Tris-HCl 50 mM pH 7,4, CaCl2 1 mM (tampón A) a 10
\mul de reservas de fagos (10^{8} - 10^{10} TU) para
proporcionar un volumen de 1 ml y las condiciones especificadas en
la Tabla 1. Los fagos se incuban durante 1 - 2 horas, después se
añade 100 \mul de alícuota a 1 ml de TG1 (OD600 \sim 0,5) y
diluciones en serie sembradas en placas de TYE con 15 \mug/ml de
tetraciclina. Para la resistencia de los fagos a los extremos de pH
(2 - 12), se añaden tampones de Tris glicina o Tris HCl (glicina
0,1 M ó Tris 0,1 M respectivamente) a 10 \mul de reservas de
fagos, y para neutralizar cada alícuota de 100 \mul se añaden 50
\mul de Tris-HCl 1 M pH 7,4 antes de la infección.
Para la resistencia a la temperatura, se añade el tampón A a 10
\mul de reservas de fagos para proporcionar un volumen de 1 ml y
se incuban a una temperatura dada (20ºC - 60ºC) durante 1 hora. Se
añaden alícuotas de 100 \mul a TG1 y se siembran en placas como
anteriormente. Para la resistencia a las proteasas, se añade NaCl
100 mM, Tris-HCl 50 mM, CaCl_{2} 1 mM pH 7,4 (100
ng/ml Factor Xa o tripsina, quimotripsina, trombina, termolisina y
subtilisina, todos 100 \mug/ml) ó Tris-HCl 50 mM,
EDTA 1 mM pH 7,4 (10 ng/ml IgA Proteasa) ó NH_{4}CO_{3} 50 mM pH
8,0 (100 \mug/ml Arg-C, 100 \mug/ml
Glu-C) ó NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM pH 7,0
(40 ng/ml AspN) a 10 \mul de reservas de fagos
(fd-DOG y fd-K108) para proporcionar
un volumen de 100 \mul y una concentración final de proteasa como
se indica. Las digestiones se incubaron durante 15 minutos a
temperatura ambiente, después las muestras (100 \mul) se
infectaron en TG1 como anteriormente.
Para la resistencia a las proteasas en presencia
de desnaturalizantes se prepararon muestras como anteriormente para
la desnaturalización de temperatura y urea. A alícuotas de 90 \mul
se añade tripsina 10 \mul (1 mg/ml), después de 5 minutos a
temperatura ambiente se añade Pefabloc 4 \mul (100 mM) y las
muestras se infectan en TG1 como anteriormente.
Los fagos (pHEN1 rescatado usando KM 13 y pK1
rescatado usando VCSM13) se someten a SDS-PAGE [47]
antes o después de la escisión por tripsina (50 ng/ml). Después de
la transferencia semiseca a membranas PVDF el filtro se procesa
esencialmente como se ha descrito [27]. El anticuerpo primario,
monoclonal anti-gill (MoBiTec) se añade a una
dilución 1:5000 seguido de un anticuerpo anti-ratón
conjugado por HRP (Sigma) en una dilución de 1:50000. Finalmente el
filtro se desarrolla usando el kit de Transferencia de Western con
Quimioluminiscencia basado en luminol (Boehringer Mannheim).
Los fagos que exponen mutantes de barnasa se
analizan para unirse al inhibidor barstar de RNasa como se ha
descrito [44]. El barstar biotinilado 10 pmol se mezcla con
aproximadamente 10^{10} fagos que exponen el mutante de barnasa A
o mutante de barnasa B o villina o tampón A. El fago que se une a
barstar se captura en placas revestidas de Estreptavidina
(Boehringer Mannheim) y se desarrolla usando el anticuerpo
anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante
(Pharmacia) y 2,2'-Anzino-Bis(ácido
3-Etilbenztiazolina-6-sulfónico)
(Sigma). Las lecturas de absorbancia se toman a 405 nm.
A cada temperatura aproximadamente 10^{10}
fagos que exponen los mutantes de barnasa o villina (resistente a
ampicilina) se mezclan con un fagémido fd-K108 de
control escindible (resistente a tetraciclina), y un fagémido de
control no escindible, un derivado de pHEN1 resistente a
cloranfenicol, rescatado con KM13 en un volumen total de 90 \mul
de tampón A. Después del equilibrado durante 20 - 30 minutos a la
temperatura indicada, se añade tripsina 10 \mul (5 \mug/ml y la
incubación continuó durante 2 minutos. La tripsina se neutraliza
añadiendo 4 \mul de Pefabloc 100 mM. La infección y la dilución en
serie se realiza en TG-1 como anteriormente y las
alícuotas se siembran en placas sobre placas de TYE que contienen
ampicilina 100 \mug/ml + glucosa al 1%, cloranfenicol 30
\mug/ml + glucosa al 1% o tetraciclina 15 \mug/mg.
10 \mul de diluciones en serie del fago A
mutante de barnasa se mezcla con 10 \mul del fago B mutante de
barnasa no diluido en tampón A 70 \mul. Después de 30 minutos de
incubación a 20ºC ó 37ºC se añade tripsina 10 \mul (5 \mug/ml).
Después de 2 minutos de digestión se añade Pefabloc 4 \mul (100
mM). Los fagos se infectan en TG1 como anteriormente. Se lleva a
cabo una segunda ronda de selección legrando las bacterias en 2xTY
3 ml, se inoculan 50 \mul en 2xTY/Amp/Glu 50 ml y se rescata el
fagémido y el fago se prepara como anteriormente. Los clones se
analizan por PCR usando los cebadores LSPAfor y LSPAback seguido de
la digestión de restricción usando Ddel.
Las selecciones entre las partículas de los
fagos pK2V y pK1 se realizan como anteriormente, salvo que la
selección se realiza a 10ºC. Los clones se analizan por PCR usando
los cebadores LSPAfor y LSPAback.
La transposición de proteínas está dirigida por
péptidos señal [48]. Estos son conocidos por compartir
características comunes tales como una región
amino-terminal cargada positivamente, una secuencia
hidrófoba y una región carboxi-terminal que incluye
el sitio de escisión por peptidasa señal. Los péptidos señal están
implicados en "una disposición de interacciones proteína -
proteína y proteína - lípido" [49]. La secuencia señal puede,
además, interferir en la ruta de plegamiento de la proteína.
También están implicados en la regulación de la traducción,
principalmente a través de la caja cadena abajo.
Las enzimas tales como ADN polimerasa se exponen
muy escasamente en las partículas de la cápsida de fagos, haciendo
su selección casi imposible. Con el fin de mejorar las capacidades
de la exposición en la cápsida de fagos para seleccionar
polimerasas, por lo tanto, se diseñan secuencias señal mejoradas y
se seleccionan para usar una técnica de exposición de proteínas y
péptidos en la cápsida de fagos en la que el fondo de la cápsida de
fagos "vacío" se elimina por medio de la digestión del fago
auxiliar.
El diseño de una secuencia señal para la
exposición óptima de polimerasa en la cápsida de fagos no se
consigue fácilmente. Por lo tanto, se idea una estrategia de
selección para aislar secuencias señal de una biblioteca en la que
las mutaciones se introducen en sitios seleccionados. Aunque la
secuencia señal no está presente en la cápsida de fagos, su
secuencia se recupera fácilmente por medio de la secuenciación del
fagémido situado dentro de la partícula de la cápsida de fagos.
Se generan dos bibliotecas a partir de las
secuencias guía pelB y g3, haciendo uso de los siguientes cebadores
oligonucleótidos para amplificación por PCR:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los sitios de restricción HindIII y NcoI se
indican en cursiva.
La biblioteca I que se deriva de la guía pelB y
la biblioteca II que se deriva de la guía g3 se preparan por
amplificación por PCR de 4 (pelB) amplificado con 1 y 2 y de 5 (g3)
amplificado con 3 y 2 respectivamente. Cada producto por PCR se
digiere con HindIII y NcoI y se purifica con un kit de extracción en
gel (Qiaquick, Qiagen). 0,2 \mug de cada inserción resultante se
mezcla para ligación con aproximadamente 2 \mug del vector
pHEN2-Stoffel (Fig. 6) previamente digerido con
HindIII y NcoI y desfosforilado con fosfatasa alcalina (Boehringer
Mannheim). La mezcla de la ligación se purifica por medio de la
extracción fenol - cloroformo y precipitación en etanol antes de la
electroporación en TG1 de E. coli recién preparado.
Se lleva a cabo la distribución aleatoria de 32
y 20 bases para las guías pelB y g3 respectivamente: (i) cerca y
dentro de la secuencia Epsilon inmediatamente cadena arriba de la
secuencia Shine-Delgarno (ii) cadena debajo de la
secuencia Shine-Delgarno cerca y dentro de la caja
Cadena abajo [50] (iii) dentro del péptido guía en la región
N-terminal que contiene los residuos de aminoácidos
cargados positivamente, en la región hidrófoba [51] y en la región
C-terminal próxima al sitio de escisión por
peptidasa altamente conservado [52].
El fago se produce como se ha descrito
previamente [25] salvo que el fago auxiliar KM13 (Ejemplo 3) se usa
en lugar de VCSM13 y que se añade IPTG 0,1 mM cuando se especifica
al cultivo durante toda la noche a 30ºC. Las selecciones de
resistencia a tripsina y de unión [44] se realizan como se describe
anteriormente, salvo que 11 \mug de anticuerpo
anti-Taq (Taqstart, Clontech) se recubre durante
toda una noche en inmunotubos (Nunc). El rastreo por PCR se realiza
con los cebadores 6 y 7 usando colonias individuales de TG1 de E.
coli que contienen el fagémido como plantilla, de acuerdo con
un protocolo anteriormente descrito; después de la electroforesis
en gel sobre un gel de agarosa al 2%. El tamaño del fragmento
amplificado se usa como criterio para establecer si se han
originado las deleciones dentro del gen de polimerasa.
La diversidad calculada de las bibliotecas
computadas a partir del deterioro de los oligonucleótidos
sintetizados es aproximadamente 3,7x10^{13} =
4^{9}x3^{7}x2^{16} y 1,7x10^{7} = 4^{4}x2^{16} para las
guías pelB y g3 respectivamente. Después de la transformación de
E. coli con las bibliotecas de fagémidos, resulta que el
tamaño de la biblioteca medido como el número de colonias
resistentes a ampicilina es 1,3x10^{7} y 9,6x10^{6} para las
guías pelB y g3 respectivamente.
La selección de la exposición de la polimerasa
se realiza por medio de la escisión específicamente de las copias
del fago auxiliar p3 con la proteasa tripsina de tal forma que hace
no infectivas todas las partículas de la cápsida de fagos que no
expresan ninguna proteína de fusión
p3-polimerasa.
Ambas bibliotecas se mezclan y las rondas de
selección se llevan a cabo en dos condiciones, con o sin IPTG 0,1
mM en el medio de cultivo. Con IPTG, las deleciones del gen
polimerasa, o de parte de éste, se observan después de la ronda III
(4 de 28 clones) como se muestra por medio de un rastreo por PCR
(véase arriba); después de la ronda IV, estos clones representan la
mayor parte de la población (28 de 30). Sin IPTG, estos clones
representan una parte significativa de los seleccionados después de
la ronda VI (3 de 12). Por lo tanto, la selección se cambia a
partir de la ronda cinco o al introducir además de la selección para
la resistencia a la proteasa, una selección para unirse a un
anticuerpo anti-Taq. Después de las rondas de
selección VII y VIII, los clones (3 de 13) y (0 de 19)
respectivamente corresponden a las proteínas de fusión
p3-polimerasa eliminadas.
Para la caracterización de las guías, los
fragmentos HindIII-NcoI se subclonan después de la
amplificación por PCR de colonias individuales de E. coli.
Se observa que los fagémidos resultantes pHEN1 - 1x / Stoffel se
subclonan con x = 7,9,10 y 12. Los fragmentos
HindIII-NcoI y NcoI-NotI
correspondientes al fragmento Stoffel se secuencian en ambas
cadenas usando un secuenciador de ADN 373A (Applied Biosystems).
Para ELISA, se usa un anticuerpo
anti-Taq (Taqstart, Clontech) para recubrir la placa
ELISA y se usa una proteína de fusión
anti-M13-peroxidasa de rábano
picante (Pharmacia Biotech) para la detección en un protocolo
convencional [44].
La expresión de polimerasa en el sobrenadante se
realiza mediante la infección de HB2151 de E. coli con
fagémidos seleccionados [25, 27] salvo que la concentración de IPTG
es 0,1 en lugar de 1 mM. Aproximadamente 10 \mul de sobrenadante
se carga sobre un gel de poliacrilamida para electroforesis (Novex);
el gel se seca sobre nitrocelulosa (Protran, Schleicher and
Schuell) y un anticuerpo anti-Taq polimerasa
(Taqstart, Clontec), y un IgG de cabra anti - ratón de peroxidasa
de rábano picante (Sigma) antes de la detección en películas de
autorradiografía por quimioluminiscencia (ECL reagents,
Amersham).
También se caracterizaron cuatro clones
individuales 7, 9, 10 y 12 de la ronda VII, que se rastrearon para
detectar la resistencia a la proteasa entre 12 clones. Para asegurar
que sólo se consideran las mutaciones dentro de la secuencia señal,
y no las mutaciones de cualquier sitio dentro del fagémido que se
pueden haber originado durante la amplificación en la diversas
rondas, las secuencias señal se subclonan en el vector original.
Los resultados mostrados en la Tabla 5 indican que la exposición
óptima de polimerasa para el clon 10 seleccionado es
aproximadamente 50 veces superior a la de la secuencia original.
Este resultado se confirma independientemente dentro de los errores
experimentales mediante un ELISA usando el anticuerpo
anti-Taq y
anti-M13-HRP: 10^{9} partículas
del fago del fagémido pHEN1-Stoffel de la guía pe1B
(relación señal a ruido: 1,46) proporcionan una señal idéntica como
10^{7} partículas del fago del clon 10 (relación señal a ruido:
1,47).
La expresión del fragmento Stoffel en HB2151 de
E. coli también se estudia para las diversas guías (véase
Tabla 6). La concentración de fragmento Stoffel en el sobrenadante
del cultivo se calcula comparando las intensidades de la mancha
para cantidades conocidas de polimerasa y resulta ser
aproximadamente 0,1 mg/l para la guía pelB. Se observa un aumento
de 3 veces en la expresión para las guías 17 y 110, mientras que se
aprecia una disminución de 3 veces para la guía 19.
El título del fago se mide como el número de
partículas infectivas del fago y el título de polimerasa en la
cápsida de fagos como el número de partículas infectivas del fago
después del tratamiento con tripsina. El número de polimerasas en
la cápsida de fagos por partícula del fago es la relación de los
títulos. Como las partículas del fago se rescataron con un fago
auxiliar, el fago expone una proteína de fusión
p3-polimerasa y unas pocas copias de p3 que
contienen un sitio de escisión por tripsina o solamente estas copias
de p3.
La secuencia de ADN distribuida aleatoriamente
se proporciona de 5' a 3'; por encima y por debajo de ésta, se
indican las bases que difieren de la secuencia dada en las
secuencias señal pelB, 17, 19, 110 y 112. Se han subrayado la
secuencia Shine-Delgarno, el codón de partida y el
codón último de la secuencia señal, GCC. Los sitios de restricción
HindIII y NcoI están en cursiva. Las secuencias de aminoácidos
correspondientes se proporcionan abajo. La biblioteca I está
diseñada inicialmente a partir de la guía pelB y la biblioteca II
de la guía g3.
Una estrategia para la selección de
catalizadores por medio de la exposición en la cápsida de fagos se
basa en la selección del producto de reacción de una reacción
catalítica, y el uso de efectos de proximidad para seleccionar el
catalizador. En esta estrategia, un sustrato marcado está reticulado
al fago en la proximidad de la enzima expuesta; el fago se une de
este modo a una fase sólida y se libera por medio de una reacción
de escisión intramolecular catalizada por la enzima expuesta
[53].
Se ha aplicado un enfoque similar a la selección
de variantes de ADN polimerasa activa. El enfoque implica dos
reacciones químicamente independientes, la reacción catalítica que
lleva a un producto (en este caso distinguido por la incorporación
de una marca de biotina) y una reacción de reticulación química por
la que el sustrato (y producto) se unen al fago. La selección del
fago por perlas de estreptavidina selecciona, por lo tanto, los
fagos que están químicamente unidos al producto marcado; es más
probable que estas reacciones se acoplen en el mismo fago ya que
las reacciones en cis están favorecidas sobre las reacciones en
trans por proximidad.
Las maleimidas se usan en una reacción de
reticulación química. Éstas son conocidas por reaccionar con tioles
y en soluciones alcalinas con grupos amino, y son, por lo tanto,
capaces de reaccionar con una amplia variedad de sitios en la
cápsida de fagos y en la enzima expuesta. Un producto covalente
entre la proteína de revestimiento principal (p8) y
N-biotinoil-N'-(6-maleimidohexanoil)
hidracida, se detecta por medio de espectrometría de masas SELDI.
Se piensa que dos grupos amino (el Ala-1
N-terminal y el residuo Lys-8) están
implicados.
La estrategia se analiza usando ADN polimerasas
en vista de su función central en la evolución molecular. Un grupo
maleimidilo se introduce en el extremo 5' de un cebador de ADN; el
producto se marca por la adición de dUT2 biotinilado al extremo 3'
del cebador por medio de la acción catalítica de la polimerasa. Los
fragmentos Klenow y Stoffel de Escherichia coli y Thermus
aquaticus de ADN polimerasa I, respectivamente, se clonan para
la exposición por fusión a la proteína de revestimiento pIII del
bacteriófago filamentoso por medio de técnicas convencionales.
Ambos fragmentos carecen de los dominios de exonucleasa 5' a 3'; el
fragmento Stoffel también carece de una actividad exonucleasa 5' a
3'.
La proteína de fusión está clonada en un
fagémido (pHEN1) [25], y se rescata por medio de un fago auxiliar.
Se muestra que los fragmentos de polimerasa están expuestos en el
fago (después del rescate con el fago auxiliar) por medio de la
unión del fago a pocillos revestidos con anticuerpos
anti-polimerasa como se detectó por ELISA (no se
muestra). Los fagos también se analizan por transferencia de Western
usando anticuerpos anti-p3 o
anti-polimerasa. Esto confirma la presencia de la
proteína de fusión, pero también indica la contaminación por
polimerasa libre. Presumiblemente, esto se origina por la secreción
desde el huésped bacteriano a través de la supresión incompleta del
codón de parada ámbar o por escisión desde la superficie del fago.
Esto se elimina por medio de una etapa adicional de
ultracentrifugado o por cromatografía por exclusión de tamaño. Los
fagos purificados se analizan para detectar la actividad de la ADN
polimerasa en un ensayo de extensión del cebador/plantilla con
a^{32}P-dCTP radioactivamente etiquetado y
resultó ser activa.
Sin embargo, como se indica en las
transferencias de Western, la proteína de fusión
polimerasa-p3 se incorpora escasamente en el fago
en comparación con la proteína p3. Esto parece ser debido a la
incorporación de p3 a partir del fago auxiliar, como se muestra por
medio del uso alternativo de un fago auxiliar (KM 13) en el que la
proteína p3 del fago auxiliar (pero no el de la proteína de fusión)
se puede escindir con tripsina, de tal forma que lo hace incapaz de
mediar la infección (Ejemplos 3 y 4). De este modo, después de la
proteólisis solamente aquellos fagos que habían incorporado la
proteína de fusión son infectivos; a partir de la pérdida en el
título después de la proteólisis, se considera que solamente una
partícula de mil del fago había incorporado la proteína de fusión.
El procedimiento de selección, dependiendo del marcado por
polimerasa en cis, estaría comprometido por un gran exceso como tal
de fagos que carecen de la polimerasa pero que están disponibles
para el marcaje en trans. Los fagos seleccionados se tratan, por lo
tanto, con tripsina para destruir la infectividad de aquellos que
carecen de la polimerasa expuesta.
Los fagos que exponen el fragmento Stoffel se
incuban con el cebador 13 [TTT CGC AAG ATG TGG CGT] que comprende
un grupo maleimidilo 5' y un nucleótido biotinilado 3'. Después de
la incubación los fagos se capturan sobre perlas revestidas de
estreptavidina, con un rendimiento de aproximadamente el 1% - 5% del
fago infeccioso. Esto demuestra que el cebador se puede reticular
químicamente al fago, presumiblemente a través de la proteína p8
como se muestra para
N-biotinoil-N'-(6-maleimidohexanoil)
hidracida. Los fagos se incuban después con el cebador 1b
[GCGAAGATGTGG] que comprende un grupo maleimidilo 5' en presencia de
biotina-dUTP 2 y plantilla 3 [AAA TAC AAC AAT AAA
ACG CCA CAT CTT GCG]. La captura del fago depende de la presencia de
1b, 2 y 3 (Tabla 8), pero también de la inclusión de tripsina, que
escinde el fago auxiliar para reducir el aislamiento del fago no
específico.
\varphi_{i} y \varphi_{f} denotan el
número de unidades de transformación (tu) antes [a] y después [b]
de la selección. Rendimiento = \varphi_{f} /
\varphi_{i}.
[c]: + cebador 1b, + dUTP 2 biotinilado, +
plantilla 3 y + tripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la clonación de
(poli)-péptidos que contienen fragmentos de ADN y su
exposición para la selección entre barnasa y p3, se construye el
fago fd-3 (Fig. 5). El fago fd-3
comprende el mutante H102A de barnasa fusionado
N-terminalmente al gen p3 del fago
fd-TET. Entre el codón para el último residuo de
barnasa y el primer residuo de p3 está la secuencia nucleótida
CTG CAG GCG GTG CGG CCG CA. Esta secuencia contiene un sitio
de restricción de ADN PstI (en cursiva) para la inserción de
fragmentos de ADN flanqueados por sitios de restricción PstI. La
secuencia además introduce un desplazamiento de fase entre barnasa
y p3, que evita la expresión de la fase de lectura correcto de p3
en fd-3. Las partículas fágicas del fago
fd-3, por lo tanto, no exponen la proteína de
infección p3 y son no infecciosas.
Por lo tanto, el fago fd-3 se
adapta bien como vector de clonación ya que los vectores sin
inserciones de ADN en PstI después de la ligación no se propagan
durante la selección. Estadísticamente 1 de cada 3 inserciones de
ADN aleatorias en el sitio de restricción PstI creará (excepto la
presencia de codones de parada dentro de la inserción) una fase de
lectura abierto que desplaza la barnasa, la propia inserción y p3 y
da como resultado partículas fágicas infecciosas que contienen p3
en el revestimiento del fago. En estos clones recombinantes la
barnasa está seguida de la inserción, a la que después siguen los
residuos de aminoácidos AGGAAA antes del comienzo de la proteína
p3. Este péptido AGGAAA debería proporcionar flexibilidad suficiente
en la proteína de fusión para permitir la función de infectividad
de p3 y el acceso de la proteasa a los apéndices
N-terminales de p3.
El ADN genómico de la cepa de E. coli TG1
se amplifica en 30 ciclos de una reacción en cadena con polimerasa
(PCR) con una temperatura de hibridación de 48ºC usando el
oligonucleótido SN6MIX (5'-GAG CCT GCA GAG
CTC AGG NNN NNN-3'), que comprende 6 posiciones
degeneradas en el extremo 3' extensible para asegurar el cebado
aleatorio. En una segunda etapa de 30 ciclos de PCR con una
temperatura de hibridación de 52ºC los productos primarios por PCR
se extienden por re-amplificación con el
oligonucleótido XTND (5'-CGT GCG AGC CTG CAG
AGC TCA GG-3'). Los productos con una longitud de
alrededor de 150 pares de bases de esta reacción se purifican a
partir de un gel de agarosa y se re-amplifican en 30
ciclos de PCR usando una temperatura de hibridación de 52ºC y el
oligonucleótido XTND. Estos fragmentos
re-amplificados de 150 pares de bases se digieren
parcialmente con SacI (sitio indicado en negrita en los
oligonucleótidos) y se ligan para dimerización. Los productos
ligados se re-amplifican en 10 ciclos adicionales
de PCR con una temperatura de hibridación de 44ºC seguido de 30
ciclos de PCR con una temperatura de hibridación de 55ºC usando en
oligonucleótido XTND. Las temperaturas de hibridación se eligen
para discriminar el cebado del oligonucleótido en medio de los
fragmentos dimerizados. El producto de la reacción se purifica por
tamaño dos veces sobre un gel de agarosa para eliminar los monómenos
y oligómeros (no dímeros).
La fracción del dímero final se amplifica por
PCR usando una temperatura de hibridación de 55ºC y el
oligonucleótido XTND a gran escala, se digiere con PstI (sitio
indicado en cursiva en oligonucleótidos) y se liga en el vector
fd-3 también digerido y fosfatado con PstI. Después
de la electroporación en bacterias de E. coli se obtiene un
repertorio de recombinantes 3,6 x 10^{7}. El análisis secuencial
de los clones recogidos aleatoriamente revela la presencia de
inserciones de ADN principalmente diméricas (11 de 14) y algunas
monoméricas (2 de 14).
La reinfección de bacterias de E. coli
con el fago producido a partir de la población inicial de células
transformadas proporciona, de acuerdo con el análisis secuencial de
veinte clones recogidos aleatoriamente, una biblioteca de fagos
infecciosos que contiene casi exclusivamente fusiones de barnasa-(en
fase, inserción de dímero sin parada)-p3. Los fagos
no infecciosos que se originan a partir de vectores sin inserción y
a partir de vectores con inserciones que contienen codones de
parada o fuera de fase no se propagan en la etapa de infección. Por
lo tanto, el vector fd-3 es adecuado para crear un
repertorio de polipéptidos generados aleatoriamente a través de la
dimerización de fragmentos de ADN a partir del genoma de E.
coli.
Este repertorio de polipéptidos expuestos como
una fusión insertada entre barnasa y p3 en el fago fd se somete a
digestión proteolítica con tripsina y termolisina solos o una mezcla
de ambos (1 ng/\mul de cada) en tampón TBS-Ca
(Tris 25 mM, NaCl 137 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 7,4). Después de la
proteólisis el fago se captura con barstar biotinilado unido a una
placa de pocillos con microtítulos revestidos de Estreptavidina y
se eluye a pH 2,0. El fago se neutraliza a pH 7 y se propaga a
través de la reinfección de células de E. coli y se
selecciona para una segunda ronda como anteriormente. Todas las
etapas se realizan sin la presencia de ningún agente de reducción
como ditiotreitol (DTT) o \beta-mercaptoetanol,
que reduciría y de este modo escindiría cualquier enlace disulfuro
potencial formado entre las cadenas laterales de cisterna dentro de
los polipéptidos seleccionados.
Los fagos recogidos aleatoriamente, que se
eluyen después de la primera y segunda ronda de selección
proteolítica, se analizan para unirse a barstar después de la
incubación con una mezcla de tripsina y termolisina en las
condiciones de la selección (Tabla 9). Su secuencia se determina
(Tabla 9). 17 de 18 clones analizados tratados con una mezcla de
tripsina y termolisina durante la selección resultan unirse al
barstar biotinilado después de la incubación con tripsina y
termolisina. 5 de 8 clones analizados tratados con tripsina durante
la selección se unieron al barstar biotinilado después de la
incubación con tripsina y termolisina, mientras que 9 de 14 clones
analizados tratados con termolisina resultaron unirse. Ningún clon
recogido aleatoriamente no tratado con una proteasa durante la
selección se une al barstar biotinilado después de la incubación con
tripsina y termolisina. La unión al barstar biotinilado muestra que
la inserción del polipéptido entre barnasa y p3 en la cápsida de
fagos retiene su integridad covalente total y por lo tanto mantiene
la marca N-terminal (barnasa) y la proteína de
infección p3 (y por tanto la partícula del fago en su totalidad)
unidas de forma covalente.
Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad
de la digestión proteolítica de la estructura central del péptido,
ya que las inserciones también se pueden mantener unidas de forma
covalente a través de enlaces entre grupos de cadena lateral como
los grupos SH_{2} de cisternas. El análisis secuencial de los
clones seleccionados revela que 19 de 25 (76%) de los clones
resistentes contienen dos o más residuos de cisteína.
Para analizar la función de posibles enlaces
disulfuro en las inserciones de los polipéptidos, se analizan 13 de
los fagos seleccionados para unirse a barstar biotinilado (y de ese
modo para un enlace covalente de barnasa y p3 a través de la
inserción) después del tratamiento con tripsina y termolisina
seguido de un lavado con DTT 20 mM antes de la detección del fago
unido. 2 clones de los fagos, que se unen a barstar después del
tratamiento con proteasa sin lavado de DTT y que no contienen
cisteínas, no se ven afectados por el tratamiento con DTT. También
se observa que otros dos clones de los fagos, que se unen a barstar
después del tratamiento con proteasa sin DTT y que contienen dos o
más cisteínas, se unen a barstar después del tratamiento con
proteasa y DTT. Esto sugiere que sus inserciones están protegidas
de la proteólisis de su estructura central peptídica, a pesar de la
presencia de sitios de sustratos fundamentales para las
proteasas.
Por lo tanto, estas inserciones están protegidas
del ataque proteolítico debido a una limitación conformacional de
su estructura central peptídica. Sin embargo, se observa que 9
clones de los fagos que se unen a barstar después del tratamiento
con proteasa sin lavado de DTT y que contienen dos o más cisteínas
no se unen a barstar después del tratamiento con proteasa y DTT.
Esto sugiere que sus inserciones están proteolíticamente escindidas
en su estructura central peptídica, pero se mantienen juntas por
medio de enlaces disulfuro entre las cadenas laterales de cisteína,
sin la presencia del agente de reducción DTT. Estas inserciones no
están por lo tanto protegidas del ataque proteolítico debido a una
limitación conformacional de su estructura central peptídica.
De este modo, el procedimiento de la presente
invención se puede configurar para seleccionar polipéptidos que
contienen cisteína, incluso cuando los polipéptidos sean
susceptibles al ataque por proteasa, ya que los polipéptidos son
capaces de mantenerse juntos en la etapa de selección por medio de
enlaces disulfuro.
\newpage
La unión a barstar (-DTT) después de la
proteólisis del fago con tripsina y termolisina (2 ng/\mul de
cada) sin un lavado de DTT 20 mN se determina por la medida de una
señal que es al menos el 60% de la señal para la unión a barstar
del fago sin tratamiento con proteasa. La unión a barstar (+DTT)
después de un lavado 20 mM se determina por la medida de una señal
que es al menos el 60% de la señal para la unión a barstar (-DTT)
sin un lavado de DTT 20 mM. Los fagos se recogen aleatoriamente
después de una (1x) o dos (2x) rondas de proteólisis con tripsina
(Tr) o termolisina (Th). Los fagos se tratan con proteasas, se
capturan con barstar biotinilado en placas de pocillos con
microtítulos, y se lavan con DTT 20 mM cuando sea aplicable. Los
fagos unidos se detectan con un anticuerpo del fago
anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante
(Pharmacia Biotech).
La unión a barstar (-DTT) después de la
proteólisis del fago con tripsina y termolisina (2 ng/\mul de
cada) sin un lavado de DTT 20 mN se determina por la medida de una
señal que es al menos el 60% de la señal para la unión a barstar
del fago sin tratamiento con proteasa. La unión a barstar (+DTT)
después de un lavado 20 mM se determina por la medida de una señal
que es al menos el 60% de la señal para la unión a barstar (-DTT)
sin un lavado de DTT 20 mM. Los fagos se recogen aleatoriamente
después de una (1x) o dos (2x) rondas de proteólisis con tripsina
(Tr) o termolisina (Th). Los fagos se tratan con proteasas, se
capturan con barstar biotinilado en placas de pocillos con
microtítulos, y se lavan con DTT 20 mM cuando sea aplicable. Los
fagos unidos se detectan con un anticuerpo del fago
anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante
(Pharmacia Biotech).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El repertorio de polipéptidos descrito en el
Ejemplo 9 se digiere como anteriormente con tripsina y termolisina
(Ejemplo 9) excepto que aquí hay una etapa de lavado adicional con
DTT 50 mM después de la unión del fago tratado proteolíticamente a
las placas de pocillos con microtítulos revestidas con barstar
biotinilado con Estreptavidina. Esta etapa de lavado está diseñada
para lavar fagos que exponen una marca de barnasa
N-terminal, que ya no está unida a p3 a través de
una estructura central polipeptídica intacta, sino solamente a
través de enlaces disulfuro entre cadenas laterales de cisteína en
las inserciones del polipéptido entre la marca de barnasa y p3.
Se analizan 12 fagos recogidos aleatoriamente
eluidos después de la segunda ronda de proteólisis para detectar la
estabilidad frente a una mezcla de tripsina y termolisina en las
condiciones de la selección y se determina su secuencia (Tabla 10).
10 clones tratados con una mezcla de tripsina y termolisina durante
la selección se unen al barstar biotinilado después de la
incubación con tripsina y termolisina seguido de lavado con DTT 50
mM antes de la detección del fago capturado. Solamente uno de estos
clones contiene dos o más cisteínas.
El tratamiento proteolítico de la biblioteca de
fagos seguido de un lavado con DTT permite, por lo tanto, la
selección de las inserciones peptídicas que están protegidas de la
proteólisis y que no se mantienen juntas a través de enlaces
disulfuro.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La unión a barstar (+DTT) después de la
proteólisis del fago con tripsina y termolisina (2 ng/\mul de
cada) seguido de un lavado de DTT 50 mN se determina por la medida
de una señal para la unión a barstar (+DTT), que es al menos el 60%
de la señal para la unión a barstar del fago sin tratamiento con
proteasa. Los fagos se recogen aleatoriamente después de dos (2x)
rondas de proteólisis con tripsina (Tr) y/o termolisina (Th). Los
fagos se tratan con proteasas, se capturan con barstar biotinilado
en placas de pocillos con microtítulos, y se lavan con DTT 50 mM
cuando sea aplicable.
Los fagos unidos se detectan con un anticuerpo del fago anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante.
Los fagos unidos se detectan con un anticuerpo del fago anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante.
Figura 1. Escisión de fagos con sitios de
proteasas. Los fagos se prepararon por rescate con KM13 (pHEN1, A +
B), o con VCSM13 (pK1, C + D). (A + C) no escindido o escindido con
tripsina (B + D). Los fagos de 5 \mul, 2,5 \mul y 1 \mul se
cargaron como se indica. Los marcadores de peso molecular están en
kD.
Figura 2. Los vectores fagémidos pK1 y pK2.
Estos vectores contienen una secuencia escindible por proteasa
entre D2 y D3 de la proteína p3 del fago. En pK1, D2 + D3 están en
fase; en pK2, D3 está fuera de fase.
Figura 3. Unión de fago-barnasa
a barstar. Los fagos que exponen la proteína de fusión diferente se
incuban con barstar biotinilado capturado sobre placas revestidas
de estreptavidina y detectados por ELISA. A) mutante de barnasa A,
b) mutante de barnasa B, c) villina, d) ningún fago.
Figura 4. Desnaturalización de temperatura de
las proteínas de fusión del fago. Los fagémidos se rescataron con
KM13, la infectividad (TU/ml) se mostró después de la incubación y
escisión con tripsina a temperaturas dadas. Fusión con subdominio
de villina (triángulos), mutante de barnasa A (rombos),
pHEN1-cloranfenicol resistente (círculos).
Figura 5. El vector fd-3 de fd.
El gen para el mutante H102A de Barnasa se introduce por medio de
subclonación en fd-DOG [43] después de la
amplificación por PCR con oligonucleótidos adecuados usando los
sitios de restricción ApaLI (en el extremo 5' de Barnasa) y NotI
para crear fd-3.
Figura 6. Mapa del vector fagémido usado para la
exposición del fragmento Stoffel sobre la superficie del fago. El
asterisco muestra las secuencias que se distribuyen aleatoriamente
al menos parcialmente en las bibliotecas I y II.
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<110> MEDICAL RESEARCH COUNCIL
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SISTEMA DE SELECCIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P4693WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
OLIGOPÉPTIDO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Gly Leu Ser Glu Gly Ser Thr Ile Glu
Gly Arg Gly Ala His}
\sac{Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaccctca gaacggtacc ccaccctcag aggccggctg ggccgccacc ctcagag
\hfill57
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 89
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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<211> 89
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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<400> 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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\hfill24
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaattcag agactgcgct ttcc
\hfill24
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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\hskip-.1em\dddseqskipcctcctgagt acggtgatac acc
\hfill23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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\hfill26
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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<213> Secuencia Artificial
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CEBADOR
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\hskip-.1em\dddseqskipcccctcagaa aggccggctg ggccgccgcc agcattgaca ggaggttcag g
\hfill51
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<210> 12
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<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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CEBADOR
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<213> Secuencia Artificial
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CEBADOR
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<213> Secuencia Artificial
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CEBADOR
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CEBADOR
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CEBADOR
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CEBADOR
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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<213> Secuencia Artificial
<220
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CEBADOR
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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CEBADORES
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<213> Secuencia Artificial
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CEBADORES
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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CEBADORES
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\vskip0.400000\baselineskip
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Leu Leu Leu Leu Ala}
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADORES
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADORES
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<211> 22
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttcgcaaga tgtggcgt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaagatgt gg
\hfill12
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
CEBADOR
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\hskip-.1em\dddseqskipaaatacaaca ataaaacgcc acatcttgcg
\hfill30
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<211> 45
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<211> 40
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<212> PRT
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<212> PRT
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<220>
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<220>
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<212> PRT
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<220>
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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\sa{Leu Gln Ser Ser Gly Val Arg Pro Ala}
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<210> 58
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<211> 44
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<213> Secuencia Artificial
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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<211> 9
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
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<211> 36
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
INSERCIONES POLIPEPTÍDICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
Claims (7)
1. Un procedimiento para la selección de un
polipéptido de fusión correctamente plegado, que comprende las
etapas de:
(a) proporcionar una pluralidad de viriones que
codifican y exponen un repertorio de polipéptidos de fusión,
comprendiendo dichos polipéptidos de fusión un polipétido heterólogo
insertado en la secuencia de un polipéptido de proteína de
revestimiento viral, en el que un sitio de proteasa está situado
dentro del polipéptido de fusión, de tal forma que el sitio está
protegido de la escisión por parte de la proteasa en los
polipéptidos de fusión correctamente plegados y no está protegido
de la escisión en polipéptidos de fusión que no están correctamente
plegados, y dicho repertorio comprende al menos elementos
parcialmente no plegados y plegados;
(b) exponer los viriones a una proteasa a través
de la cual los viriones que exponen polipéptidos de fusión
correctamente plegados son resistentes a la escisión por parte de
dicha proteasa; y aquellos que no exponen polipéptidos de fusión
correctamente plegados no son resistentes a la escisión por parte de
dicha proteasa;
(c) propagar aquellos viriones que comprenden
proteínas de fusión intactas.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el sitio de escisión por proteasa está
situado en o adyacente al polipéptido heterólogo.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el sitio de escisión por proteasa está
situado distal al polipéptido heterólogo.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el polipéptido de fusión además comprende
una marca seleccionable, en el que la escisión elimina la marca del
virión; y se seleccionan los viriones que comprenden la marca,
mientras que se descartan los viriones a los que se ha eliminado la
marca por escisión.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que los viriones se separan a través de la
unión a una fase sólida por medio de una marca.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que los viriones se unen a la fase sólida
antes de la exposición a la proteasa.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que los viriones se exponen a la proteasa
antes de unirse a la fase sólida.
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