ES2632216T3

ES2632216T3 - Fragmentos truncados de la alfa-sinucleína en la enfermedad de cuerpos de Lewy

Info

Publication number: ES2632216T3
Application number: ES10189868.2T
Authority: ES
Inventors: Tamie J. Chilcote; Jason Goldstein; Wei Ping Gai; John P. Anderson
Original assignee: Flinders University of South Australia; Prothena Biosciences Ltd
Current assignee: Flinders University of South Australia; Prothena Biosciences Ltd
Priority date: 2003-05-19
Filing date: 2004-05-19
Publication date: 2017-09-11
Anticipated expiration: 2024-05-19
Also published as: EP1633189A4; PT2361928T; CY1119133T1; EP1633189B1; CA2526900C; HUE034320T2; DK1633189T3; EP2361928B1; PL2361928T3; JP2011033633A; CA2526900A1; HUE035044T2; EP2361928A1; CY1119556T1; ES2640669T3; US20050198694A1; WO2005013889A2; JP2007525464A; PL1633189T3; JP5766923B2

Abstract

Un anticuerpo que se une especificamente a un fragmento 1-122 o 1-119 de la alfa-sinucleina, sin unirse especificamente a alfa-sinucleina de longitud completa como se define en SEQ ID no 1, o un fragmento que induce este anticuerpo en el que el fragmento que induce el anticuerpo tiene menos de 20 aminoacidos de la alfa-sinucleina e incluye el C-terminal del fragmento 1-122 o 1-119 de la alfa-sinucleina.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Fragmentos truncados de la alfa-sinuclema en la enfermedad de cuerpos de Lewy

Descripcion

FONDO

[0001] Enfermedades con cuerpos de Lewy (LBD) se caracterizan por la degeneracion del sistema dopaminergico, alteraciones motoras, deterioro cognitivo, y la formacion de cuerpos de Lewy (LBS). (McKeith et al, Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Deport of the CDLB International Workshop, Neurology (1996) 47:1113-24). Los LBD incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad corporal de Lewy difusa (EDCL), la variante del cuerpo de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBV) y la enfermedad de Alzheimer (AD) combinada. Demencia con cuerpos de Lewy (DLB) es un termino para conciliar diferencias en la terminologfa de LBDs. Los trastornos con LBs continuan siendo una causa comun de trastornos del movimiento y deterioro cognitivo en la poblacion envejecida (Galasko et al., Clinical-neuropathological correlations in Alzheimer's disease and related dementias. Arch. Neurol. (1994) 51:888-95). Aunque su incidencia sigue aumentando la creacion de un grave problema de salud publica, estos trastornos siguen careciendo de tratamientos aprobados (Tanner et al., Epidemiology of Parkinson's disease and akinetic syndromes, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30). La causa de LBD es polemica y multiples factores se han propuesto para desempenar un papel, incluyendo diversas neurotoxinas y factores de susceptibilidad genetica.

[0002] AD, PD, y EDCL son los trastornos neurodegenerativos mas comunes en los ancianos. Recientes estudios epidemiologicos han demostrado una estrecha relacion clmica entre la EA y la EP, ya que aproximadamente el 30% de los pacientes con Alzheimer tambien tienen EP. En comparacion con el resto de la poblacion envejecida, los pacientes con AD son, por tanto, mas propensos a desarrollar PD concomitante. Ademas, los pacientes con DP que se convierten en demenciales generalmente han desarrollado AD clasica. Aunque cada enfermedad neurodegenerativa parece tener una predileccion por las regiones espedficas del cerebro y las poblaciones celulares, resultando en caractensticas patologicas distintas, PD, AD y EDCL tambien comparten caractensticas patologicas comunes. Los pacientes con AD familiar, smdrome de Down, o AD esporadica desarrollan LBs en la amfgdala, que son los signos neuropatologicos clasicos de la EP. Ademas, cada enfermedad se asocia con la degeneracion de neuronas, conexiones neuronales interuronales y, finalmente, muerte celular, agotamiento de neurotransmisores y acumulacion anormal de protemas mal plegadas, cuyos precursores participan en la funcion normal del sistema nervioso central. Estudios bioqmmicos han confirmado un vinculo entre AD, PD y DLB.

[0003] En los ultimos anos, ha surgido una nueva esperanza para la comprension de la patogenesis de la LBD. Espedficamente, varios estudios han demostrado que la protema sinaptica alfa-sinuclema desempena un papel central en la patogenesis de PD, ya que: (1) esta protema se acumula en LBs (Spillantini et al, Nature (1997)- 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol (1998) 152: 367-72; Wakabayashi et al, Neurosci Lett (1997) 239: 45-8), (2) las mutaciones en el gen de la alfa-sinuclema co-segregan con las formas familiares raras del parkinsonismo (Kruger y otros, Nature Gen. (1998) 18: 106-8; Polymeropoulos, et al, Science (1997) 276: 2045-7) y, (3) su sobreexpresion en ratones transgenicos (Masliah et al., Science (2000) 287: (Feany et al, Nature (2000) 1265-9) y Drosophila 404: 3948) imita varios aspectos patologicos de la PD. Por lo tanto, el hecho de que la acumulacion de alfa-sinuclema en el cerebro se asocia con similares alteraciones morfologicas y neurologicas en especies tan diversas como humanos, ratones y moscas sugiere que esta molecula contribuye al desarrollo de la DP.

[0004] Las placas neunticas que son el sello patologico clasico de AD consisten esencialmente de peptido de beta amiloide (Ap), un producto proteolttico de aminoacidos de la protema precursora amiloide (APP), y NAC, un fragmento proteolftico de 35 aminoacidos de Alfa-sinuclema. Tanto Ap como NAC se identificaron por primera vez en las placas amiloides como fragmentos proteolfticos de sus respectivas protemas de longitud completa, para los cuales se identificaron y clonaron los ADNc de longitud completa. (Iwai A., Biochim Biophys Acta (2000) 1502: 95109); Masliah et al., AM. J. Pathol (1996) 148: 201-10; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1993) 90: 112826).

[0005] Alfa-sinuclema es parte de una gran familia de protemas que incluyen beta- y gamma-sinuclema y sinoretina. La alfa-sinuclema se expresa en el estado normal asociado con las sinapsis y se cree que desempena un papel en la plasticidad neural, el aprendizaje y la memoria. Se han identificado mutaciones en la alfa-sinuclema humana (h) que mejoran la agregacion de alfa-sinuclema (Ala30Pro y Ala53Thr) y se asocian con formas raras de formas autosomicas dominantes de la DP. El mecanismo por el cual estas mutaciones aumentan la propension de la alfa- sinuclema al agregado es desconocido.

RESUMEN DE LA INVENCION REIVINDICADA

[0006] La invencion proporciona un anticuerpo que se une espedficamente a un fragmento 1-122 o 1-119 de la alfa- sinuclema, sin unirse espedficamente a de longitud completa alfa-sinuclema como se define en SEQ ID n° 1, o un fragmento que induce este anticuerpo en el que el fragmento que induce el anticuerpo tiene menos de 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aminoacidos de alfa-sinuclema e incluye el extremo C del fragmento 1-122 o 1-119 de alfa-sinuclema.

[0007] La invencion tambien proporciona un fragmento de longitud completa alfa-sinuclema como se define en SEQ ID n° 1, que es alfa sinuclema 1-122 o 1-119. El fragmento de alfa-sinuclema puede tener una mutacion asociada con una Enfermedad de Cuerpo de Lewy hereditaria (LBD), opcionalmente una mutacion A53T.

[0008] La invencion proporciona ademas metodos in vitro de cribado de un agente que tiene una actividad farmacologica util para tratar una enfermedad del cuerpo de Lewy (LBD), que comprende poner en contacto el agente con un fragmento de alfa-sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion; y determinar la velocidad o extension de agregacion del fragmento de alfa-sinuclema, en el que una reduccion en la velocidad o extension de la agregacion con relacion a un control que carece del agente indica que el agente tiene la actividad farmacologica.

[0009] La invencion proporciona ademas metodos in vitro de cribado de un agente para una actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD (por ejemplo, enfermedad de Parkinson o EDCL), comprende poner en contacto una celula que expresa la alfa-sinuclema y procesamiento de la alfa-sinuclema en una alfa-sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion con un agente. A continuacion, se determina un nivel del fragmento en la celula con respecto a un nivel basal en el mismo tipo de celula en ausencia del agente, una reduccion en el nivel del fragmento con respecto a la lmea base indicando que el agente tiene la actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD. La celula puede ser una celula humana, una celula neuronal o una celula dopaminergica. Opcionalmente, la celula es una celula PC 12 o Sy5Y.

[0010] La invencion proporciona ademas procedimientos de cribado de un agente que tiene una actividad farmacologica util para el tratamiento de un LBD (por ejemplo, enfermedad de Parkinson o EDCL), que comprende poner en contacto un animal transgenico no humano que expresa una alfa-sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion con el agente; y determinar un nivel de formas agregadas del fragmento en el cerebro del animal transgenico con respecto a un nivel basal de formas agregadas del fragmento en un animal transgenico comparable en ausencia del agente, una reduccion en el nivel del fragmento de formas agregadas con respecto a la lmea de base indicando que el agente tiene una actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD. Opcionalmente, el animal transgenico es un roedor. El animal transgenico tambien puede ser una Drosophila.

[0011] La invencion proporciona ademas procedimientos de cribado de un agente para una actividad farmacologica util para el tratamiento de un LBD (por ejemplo, enfermedad de Parkinson o EDCL), comprende poner en contacto un animal transgenico no humano que tiene un transgen que expresa alfa-sinuclema y el procesamiento de la alfa- sinuclema en un fragmento alfa-sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion con un agente; y la determinacion de un nivel del fragmento en una celula neuronal con respecto a un nivel basal en ausencia del agente, una reduccion en el nivel de los fragmentos con respecto a la lmea base que indica el agente tiene la actividad farmacologica util para tratar la LBD. Opcionalmente, el animal transgenico es un roedor, raton o Drosophila.

[0012] La invencion proporciona ademas un animal no humano transgenico que tiene un genoma que comprende un transgen que comprende un promotor unido operativamente a un segmento de acido nucleico que codifica un fragmento alfa-sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion; donde la expresion del fragmento en el animal transgenico dispone al animal para desarrollar al menos una caractenstica de un LBD. Opcionalmente, el promotor es un promotor de PDGF. Opcionalmente, al menos una caractenstica es un deterioro de la funcion motora. Opcionalmente, al menos una caractenstica del animal transgenico es un deterioro de la funcion cognitiva. Opcionalmente, el animal transgenico es un roedor, raton o Drosophila.

[0013] La invencion proporciona ademas metodos in vitro para detectar la presencia o la susceptibilidad a un LBD en un paciente, que comprende detectar un nivel de fragmento de alfa-sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion en una muestra de lfquido cefalorraqrndeo, un nivel mas alto que un nivel basal en individuos no inducidos que indican presencia o susceptibilidad a LBD.

[0014] Como se ha descrito anteriormente, la invencion proporciona un anticuerpo que se une espedficamente a un fragmento de la alfa-sinuclema. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, quimerico. Opcionalmente, el anticuerpo es monoclonal. Opcionalmente, el anticuerpo tiene isotipo humano IgG1.

[0015] El anticuerpo puede ser para uso en el diagnostico de la presencia o la susceptibilidad a una LBD, en el que el anticuerpo es para ser administrado a un paciente y el nivel de union del anticuerpo en los pacientes se va a determinar, en el que un nivel mas alto de union relativo a un nivel de lmea de base en individuos no inducidos indica la presencia o susceptibilidad al LBD.

[0016] El fragmento de alfa sinuclema 1-122 o 1-119 de la invencion puede ser para uso en un metodo de efectuar el tratamiento o profilaxis de una LBD, que comprende administrar a un paciente que padece o esta en riesgo de un LBD, un regimen eficaz del fragmento de alfa-sinuclema. Opcionalmente, el metodo comprende ademas administrar un adyuvante que aumenta una respuesta inmune que comprende anticuerpos para el fragmento. Opcionalmente, el fragmento esta unido a un portador que forma una protema de fusion, en el que el soporte aumenta una respuesta inmune que comprende anticuerpos del fragmento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0017] El anticuerpo de la invencion puede ser para uso en un metodo de efectuar el tratamiento o profilaxis de una LBD. El metodo implica la administracion a un paciente que sufre o esta en riesgo de un LBD de un regimen eficaz del anticuerpo, por lo que el anticuerpo efectua la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad.

[0018] La invencion proporciona ademas un metodo de cribado para una proteasa que escinde alfa-sinuclema intacta para formar un fragmento de la alfa-sinuclema 1-122 o 1-119, que comprende la identificacion de un inhibidor de la proteasa; poniendo en contacto el inhibidor con un extracto celular o tejido que contiene la proteasa, con lo que la proteasa se une al inhibidor; y liberar la proteasa del inhibidor. Opcionalmente, el inhibidor es un peptido de alfa- sinuclema que comprende un segmento contiguo de al menos 5 residuos de alfa-sinuclema intacta entre las posiciones 115 y 130. Opcionalmente, el peptido comprende un segmento contiguo de al menos 5 residuos entre las posiciones 118 y 122. Opcionalmente, al menos uno de los residuos es un analogo del estado de transicion.

[0019] La presente divulgacion proporciona ademas un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un epitope dentro de los residuos 109-120 de alfa-sinuclema. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal es quimerico, humanizado o humano.

[0020] La presente divulgacion proporciona ademas un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un epitope dentro de los residuos 115-123 de alfa-sinuclema.

[0021] La presente divulgacion proporciona ademas un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un epftopo discontinuo dentro de los residuos 43-51 y 58 - 65 de alfa-sinuclema. Opcionalmente, el anticuerpo es quimerico, humanizado o humano.

[0022] La presente divulgacion proporciona ademas un anticuerpo monoclonal espedfico de extremo que se une espedficamente a alfa-sinuclema de longitud completa aislada que tiene un C-terminal libre sin unirse espedficamente a una protema de fusion que comprende alfa-sinuclema que tiene un extremo C-terminal unido a un segundo polipeptido. Opcionalmente, el anticuerpo es quimerico, humanizado o humano.

[0023] La descripcion proporciona ademas metodos de deteccion de presencia o la susceptibilidad a una enfermedad de cuerpos de Lewy en un paciente. Los metodos implican la determinacion de un nivel de alfa- sinuclema fosforilada o nitrada en la posicion 125 de alfa-sinuclema en una muestra de un cerebro del paciente, un nivel elevado relativo al nivel medio en una poblacion de individuos no inducidos indicando que el paciente tiene o es susceptible a una enfermedad del cuerpo de Lewy.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0024]

Figs. 1A y B muestran una transferencia Western de diversos extractos de la corteza y el hipocampo de un raton transgenico (B) y un control emparejado (A) con un anticuerpo policlonal que se une a un epftopo dentro de SN115-122.

Fig. 2 muestra una transferencia de Western con el mismo anticuerpo que las Figs. 1A y B para comparar el nivel de la forma truncada de alfa-sinuclema en extracciones de Triton-X100 de la corteza y ratones hipocampo de 3 meses y 12 meses de edad.

Figs. 3A y B muestran una transferencia de Western con un anticuerpo diferente denominado 12C1 (una union monoclonal al epftopo en los aminoacidos 43-51 y 58-65) de un extractos de Triton del cerebro de un raton transgenico de tres meses de edad (B) en comparacion con un (A).

Fig. 4 muestra una transferencia Western adicional usando el mismo anticuerpo que la Fig. 3 sobre un extracto de Triton del cerebro de ratones transgenicos de tres y doce meses de edad.

Figs. 5A, B, C, D, E muestran transferencias de Western con cuatro anticuerpos diferentes (B, C, D, E) y un mapa de epftopos (A) de los sitios de union de los anticuerpos a diversos extractos de los cerebros de ratones transgenicos.

Figs. 6A, B, C muestran extractos de Tris del cerebro de un paciente con enfermedad corporal de Lewy sondado con tres anticuerpos diferentes (A, B, C), sometidos a electroforesis en gel 2-D y sometido a transferencia Western.

Figs. 7A, B, C, D muestran transferencias adicionales de extractos de Tris del cerebro de un paciente con enfermedad de cuerpos de Lewy con cuatro anticuerpos (A, B, C, D) de especificidades adicionales.

Fig. 8 resume los sitios de escision en relacion con los epitopes unidos por los anticuerpos utilizados en transferencia Western.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Figs. 9A, B comparan las protemas solubles de Tris (A) con protemas extrafdas de cuerpos de Lewy (B) por

electroforesis 2D y transferencia Western.

Figs. 10A, B, C, D muestran las inmunotransferencias de protemas procedentes de cuerpos de Lewy reprobados

con diversos anticuerpos C-terminales.

Fig. 11 muestra transferencias de Western de diversos extractos de un paciente de Contursi no curado y

sondado con un anticuerpo que reconoce alfa sinuclema total o espedfico para alfa-sinuclema fosfo-129.

DEFINICIONES

[0025] El termino "agente" se utiliza para describir un compuesto que tiene o puede tener una actividad farmacologica. Los agentes incluyen compuestos que son farmacos conocidos, compuestos para los que se ha identificado actividad farmacologica pero que estan experimentando una evaluacion terapeutica adicional, y compuestos que son miembros de colecciones y bibliotecas que han de ser seleccionados para una actividad farmacologica.

[0026] Una actividad "farmacologica" significa que un agente exhibe una actividad en un sistema de cribado que indica que el agente es o puede ser util en la profilaxis o tratamiento de una enfermedad. El sistema de cribado puede ser in vitro, celular, animal o humano. Los agentes se pueden describir por tener actividad farmacologica a pesar de que pueden requerirse pruebas adicionales para establecer la utilidad profilactica o terapeutica real en el tratamiento de una enfermedad.

[0027] En el contexto de determinaciones del peso molecular basado en electroforesis en gel, el termino "aproximadamente" indica la desviacion estandar de peso molecular esperado debido a un error experimental en repeticiones del metodo en las mismas condiciones. La determinacion del peso molecular de 12 kDa para ciertos fragmentos de alfa-sinuclema se aplica a determinaciones que utilizan un tampon de trycine.

[0028] La frase "se une espedficamente" se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia de la protema en la presencia de una poblacion heterogenea de protemas y otros biologicos. Asf, bajo condiciones designadas, un ligando especificado se une preferentemente a una protema particular y no se une en una cantidad significativa a otras protemas presentes en la muestra. Una molecula tal como un anticuerpo que se une espedficamente a una protema a menudo tiene una constante de asociacion de al menos 106 M-1 o 107 M-1, preferiblemente 108 M'1 a 109 M-1, y mas preferiblemente, aproximadamente 1010 M'1 a 1011 M'1 o superior. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos espedficamente inmunorreactivos con una protema particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase solida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales espedficamente inmunorreactivos con una protema. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripcion de formatos y condiciones de inmunoensayo que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad espedfica.

[0029] Para la comparacion de secuencias, tfpicamente una secuencia actua como secuencia de referencia, a la que las secuencias de prueba se comparan. Cuando se utiliza un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parametros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parametros de programa designados.

[0030] La alineacion optima de secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, Mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Mates. 2: 482-(1981), por el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444-(1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Genetico de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI), o mediante inspeccion visual (vease generalmente Ausubel et al., supra).

[0031] Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). El software para realizar analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa (http: //
www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuacion (HSPs) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuacion T de umbral de valor positivo T cuando estan alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina como el umbral de puntuacion de palabra vecina (Altschul et al., Supra.). Estas palabra iniciales actuan como semillas para comenzar las busquedas para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

encontrar HSPs mas largos que las contienen. Los golpes de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, en la medida en que la puntuacion de alineacion acumulativa puede aumentarse. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos coincidentes, siempre> 0) y N (puntuacion de penalizacion para los residuos que no coinciden, siempre <0). Para secuencias de aminoacidos, se utiliza una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulada. La extension de los golpes de palabra en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulada disminuye por la cantidad X de su valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulada va a cero o por debajo, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuo de puntuacion negativa; o se alcanza el final de cada secuencia. Para identificar si un acido nucleico o polipeptido esta dentro del alcance de la invencion, los parametros por defecto de los programas BLAST son adecuados. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP utiliza como defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62. El programa TBLATN (utilizando la secuencia de protemas para la secuencia de nucleotidos) utiliza como defectos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y una matriz de puntuacion BLOSUM 62. (Vease Henikoff y Henikoff, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989).

[0032] Ademas de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc Nat’l Acad Sci EE.UU. 90: 5.873-5.787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P (N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad de que una coincidencia entre dos nucleotidos o secuencias de aminoacidos se producina por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y lo mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.

[0033] Para los propositos de clasificacion de sustituciones de aminoacidos como acidos conservativos o no conservativos, aminoacidos son agrupados del siguiente modo: Grupo I (cadenas laterales hidrofobas): norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofflicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales addicas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales basicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientacion de las cadenas): gly, pro; y el Grupo VI (cadenas laterales aromaticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoacidos de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otro.

[0034] Los agentes terapeuticos de la invencion son tfpicamente sustancialmente puros a partir de contaminante no deseado. Esto significa que un agente tiene tfpicamente al menos aproximadamente 50% p/p (peso/peso) de pureza, asf como esta sustancialmente exento de protemas y contaminantes que interfieren. A veces los agentes son al menos aproximadamente 80% p/p y, mas preferiblemente al menos 90 o aproximadamente 95% p/p de pureza. Sin embargo, usando tecnicas convencionales de purificacion de protemas, pueden obtenerse peptidos homogeneos de al menos 99% p/p.

[0035] El termino "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usa para incluir anticuerpos intactos y fragmentos de union de los mismos. Tfpicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que derivan para la union espedfica a un fragmento de antfgeno que incluye cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab' F(ab')2, Fabc y Fv. Los fragmentos se producen por tecnicas de ADN recombinante, o por separacion enzimatica o qmmica de inmunoglobulinas intactas. El termino anticuerpo tambien incluye una o mas cadenas de inmunoglobulina que estan qmmicamente conjugadas o expresadas como protemas de fusion con otras protemas. El termino anticuerpo tambien incluye anticuerpo biespedfico. Un anticuerpo biespedfico o bifuncional es un anticuerpo hfbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadena pesada/ligera y dos sitios de union diferentes. Los anticuerpos biespedficos pueden producirse mediante una diversidad de metodos que incluyen la fusion de hibridomas o la union de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315 - 321-(1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547 - 1553 (1992).

[0036] El termino "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antfgeno aumenta la respuesta inmune al antfgeno, pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmune al antfgeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmune mediante varios mecanismos, incluyendo reclutamiento de linfocitos, estimulacion de celulas B y/o T y estimulacion de macrofagos.

[0037] El termino "paciente" incluye sujetos humanos y otros mairnferos que reciben tratamiento ya sea profilactico o terapeutico.

[0038] La competencia entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo ensayo inhibe la union espedfica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun, tal como la alfa-sinuclema. Se conocen numerosos tipos de ensayos de union competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase solida (RIA), inmunoensayo de enzima directo o indirecto en fase solida (EIA), ensayo de competicion de sandwich (vease Stahli et al, Methods in Enzymology 9: 242- 253 (1983)); biotina-avidina directa en fase solida EIA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(vease Kirkland et al, J. Immunol 137: 3614 a 3619 (1986)); ensayo de marcado directo en fase solida, ensayo sandwich marcado directo en fase solida (vease Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); marcador directo RIA en fase solida usando etiqueta de 1-125 (vease Morel et al, Molec Immunol 25 (1): 7-15 (1988)); EIA de biotina - avidina directa en fase solida (Cheung et al., Virology 176: 546 - 552- (1990)); y RIA marcado directamente (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol., 32: 77 - 82 (1990)). Tfpicamente, dicho ensayo implica el uso de antfgeno purificado unido a una superficie solida o celulas que portan cualquiera de estas, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibicion competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie o celulas solidas en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba esta presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante ensayo de competicion (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epftopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epftopo adyacente suficientemente proximal al epftopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento esterico. Normalmente, cuando un anticuerpo competidor esta presente en exceso, inhibira la union espedfica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun en al menos 50 o 75%.

[0039] Coordenadas de epftopo son (+ 2 aminoacidos) aproximados. No todos los aminoacidos dentro de un epftopo se requieren necesariamente para la union.

[0040] Las composiciones o metodos "que comprenden" uno o mas elementos recitados pueden incluir otros elementos no espedficamente indicados. Por ejemplo, una composicion que comprende peptido de alfa-sinuclema abarca tanto un peptido de alfa-sinuclema aislado como un peptido de alfa-sinuclema como un componente de una secuencia de polipeptido mas grande.

[0041] A menos que de otro modo evidente por el contexto, cada forma de realizacion, elemento, etapa o caractenstica de la invencion se puede utilizar en combinacion con cualquier otro.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

I. General

[0042] La invencion se basa en parte en la identificacion de nuevos fragmentos de alfa-sinuclema en pacientes con Enfermedad de Cuerpos de Lewy (LBD) y modelos de animales transgenicos de la misma. Estas enfermedades se caracterizan por agregaciones de alfa-sinuclema. Los fragmentos tienen un terminal C truncado en relacion con la alfa-sinuclema de longitud completa. Algunos fragmentos se caracterizan por un peso molecular de aproximadamente 12 kDa determinado por electroforesis en gel de SDS en tampon de tricina y un truncamiento de al menos diez aminoacidos contiguos a partir del extremo C de la alfa-sinuclema natural. El sitio de escision se produce preferiblemente despues del residuo 117 y antes del residuo 126 de alfa-sinuclema natural. La identificacion de estos nuevos fragmentos de alfa-sinuclema tiene una serie de aplicaciones en, por ejemplo, descubrimiento de farmacos, diagnostico, terapeutica y animales transgenicos.

[0043] La invencion proporciona varios metodos para los agentes de deteccion de la actividad util en el tratamiento de LBD. Algunos metodos identifican agentes que inhiben la reaccion de escision que genera los nuevos fragmentos de la invencion. Otros metodos identifican agentes que inhiben la agregacion de los productos de la reaccion de escision. Tales inhibidores son utiles para el tratamiento de LBD. Los inhibidores de la reaccion de escision son tambien utiles para la purificacion por afinidad de la proteasa responsable de la reaccion de escision.

[0044] Tambien descritos aqrn son modelos de animales transgenicos y celulas que expresan fragmentos de alfa- sinuclema como se describe anteriormente. Los modelos y celulas animales transgenicas estan dispuestas para desarrollar caractensticas de enfermedad de cuerpos de Lewy, incluyendo cuerpos de Lewy que contienen agregaciones de los fragmentos. Los modelos animales y las celulas se pueden utilizar en los metodos de cribado descritos anteriormente.

[0045] Se proporcionan ademas anticuerpos espedficos de gama que se unen espedficamente a fragmentos de alfa-sinuclema sin unirse espedficamente a alfa-sinuclema intacta per se. Estos anticuerpos son utiles para la formacion de imagenes in vivo de agregaciones de alfa-sinuclema y tambien en metodos de tratamiento. Los nuevos fragmentos de alfa-sinuclema tambien pueden usarse en procedimientos de tratamiento, opcionalmente, en combinacion con un adyuvante.

II. Fragmentos de alfa-sinuclema

[0046] Alfa-sinuclema humana es un peptido de 140 aminoacidos que tienen la siguiente secuencia de aminoacidos:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID NO:l)

(Ueda et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90: 11282 - 6); Numero de acceso GenBank: P37840). La protema tiene tres dominios reconocidos, un dominio de repeticion KTKE que cubre los aminoacidos 1-61, un dominio NAC (componente no amiloide) que se extiende desde aproximadamente los aminoacidos 60-95 y un dominio acido C- terminal que se extiende desde aproximadamente el aminoacido 98 a 140.

[0047] Algunos fragmentos novedosos descritos en este documento tienen truncamientos C-terminales de al menos diez aminoacidos contiguos, preferiblemente al menos 15 aminoacidos contiguos y, opcionalmente, de hasta 20, 22, 23 o 25 aminoacidos. Los fragmentos incluyen todos o sustancialmente todos (es decir, al menos 100 residuos contiguos de alfa-sinuclema distintos de la delecion). Algunos fragmentos tambien tienen truncamientos relativamente cortos en el extremo N de hasta 20 aminoacidos, tales como deleciones de los restos 1-4, 1-6, 1-10 y 1-12. Algunos fragmentos tienen deleciones N-terminales de los restos 1-23, 1-38 o 1-45. Los fragmentos preferidos de la descripcion son SN1-118, SN1-119, SN1-120, SN1-121, SN1-122, SN1-123, SN1-124, SN1-125, SN1-126, SN1-127, sN1-128, SN1-129 y SN1-130. Los fragmentos particularmente preferidos de la descripcion son SN1-119, SN1-120, SN1-121, SN1-122, SN1-123, SN1-124 y SN1-125. Un fragmento especialmente preferido es SN1-119. La reaccion de escision se produce preferiblemente en un enlace peptfdico entre los residuos de aminoacidos 118 y 126, por ejemplo, entre el residuo 119 y 120. Otros fragmentos de la descripcion incluyen fragmentos N-terminales de alfa-sinuclema de aproximadamente 6 a 7 kDa (como se determina por sDs Electroforesis) o 50-80 aminoacidos. Otros fragmentos de la descripcion incluyen fragmentos N-terminales de alfa-sinuclema que estan libres de 1-10 aminoacidos del extremo C de la alfa-sinuclema intacta, es decir, SN1-X, en la que X es 130-139. Algunos fragmentos se caracterizan por la union espedfica a anticuerpos ELADW43 (N-terminal libre) y 5C12 (109-120) y la falta de union espedfica a 8A5 (C-terminal libre), LB509 (115-123) y ELAD47 (118-123). Algunos fragmentos se caracterizan por la union espedfica a ELADW43 (N-terminal libre) y 5C12 (109-120), LB509 (115-123) y ELAD47 (118-123) y falta de union espedfica a 8A5 (C-terminal libre). Algunos fragmentos se caracterizan por la union espedfica a ELADW43-(N-terminal libre) y 5C12 (109-120), LB509 (115-123) y ELAD47 (118-123) y 8A5 (C-terminal libre) y la falta de union espedfica a ELADW43 (N-terminal libre).

[0048] Algunos fragmentos o alfa-sinuclema de longitud completa son fosforilados o nitrados en la posicion ocupante de residuo de tirosina 125 de alfa-sinuclema. Fragmentos de retencion de serina de aminoacido 125 o alfa sinuclema de longitud completa tambien pueden fosforilarse en esta posicion. La deteccion de la fosforilacion o nitracion mejorada en la posicion 125 o fosforilacion en la posicion 129 en un paciente respecto a la media en una poblacion de individuos no enfermos es una indicacion de una enfermedad de cuerpos de Lewy. La deteccion puede llevarse a cabo utilizando un anticuerpo espedfico para la alfa-sinuclema fosforilada o nitrada en la posicion 125. Un nivel se considera mejorado si es mayor que la media mas una desviacion estandar en una poblacion de individuos no enfermos.

[0049] Los fragmentos de la invencion son distintos del componente no Ap de amiloide de la enfermedad de Alzheimer (NAC) objeto de informe anteriormente. Este fragmento consiste en al menos 28 residuos de aminoacidos (residuos 60-87) y opcionalmente 35 residuos de aminoacidos (residuos 61-95). Vease Iwai, et al, BioChemistry, 34: 10139-10145); Jensen et al., Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94-(1995); Numero de acceso GenBank S56746.

[0050] A menos que se indique lo contrario, la referencia a la alfa-sinuclema o sus fragmentos incluye la secuencia natural humana de aminoacidos indicada anteriormente, o fragmentos de los mismos, asf como analogos incluyendo alelico, especies y variantes inducidas. A los aminoacidos de los analogos se les asignan los mismos numeros que los aminoacidos correspondientes en la secuencia humana natural cuando el analogo y la secuencia humana son maximamente alineados. Los analogos tfpicamente difieren de los peptidos de origen natural en una, dos o unas pocas posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservadoras. Algunas variantes alelicas naturales estan asociadas geneticamente con LBD hereditaria. Estas variantes incluyen A30P y A53T. La variacion A53T se asocia con mayores niveles de fosforilacion en la posicion 129 de alfa-sinuclema en un individuo que tiene la mutacion con respecto a la norma de la fosforilacion en individuos no enfermos que carecen de la mutacion. Los analogos exhiben al menos 80 o 90% de identidad de secuencia con los peptidos naturales. Algunos analogos tambien incluyen aminoacidos no naturales o modificaciones de N o C terminal de los acidos aminados en una, dos o unas pocas posiciones. Por ejemplo, el residuo de acido glutamico natural puede ser reemplazado con acido iso-aspartico. Ejemplos de aminoacidos no naturales son aminoacidos D, alfa, alfa-disustituidos, aminoacidos N-alquilo, acido lactico, acido 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, epsilon-N,N,N-trimetil-lisina, epsilon-N-acetil-lisina, O- fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina, p-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, acido gamma-amino butirico, homoserina, citrulina, y acido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

isoaspartico. Los analogos tfpicamente se unen espedficamente a una poblacion de anticuerpo policlonal generado contra la alfa-sinuclema humana natural. La invencion tambien proporciona los D-peptidos, en los que D- aminoacidos pueden ser sustituidos por L-aminoacidos naturales de la alfa-sinuclema correspondiente en la mayona o todas las posiciones.

[0051] Alfa-sinuclema, sus fragmentos, y los analogos pueden ser sintetizados por smtesis de peptidos en fase solida o expresion recombinante, o pueden obtenerse de fuentes naturales. Sintetizadores de peptidos automaticos estan disponibles comercialmente de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California. La expresion recombinante puede ser en bacterias, tales como E. coli, levaduras, celulas de insecto o celulas de mairnfero. Los procedimientos para la expresion recombinante se describen por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (CSHP Press, NY 2a ed., 1989).

III. Enfermedades de Cuerpos de Lewy

[0052] La Enfermedad de Cuerpos de Lewy (LBD) se caracteriza por la degeneracion del sistema dopaminergico, alteraciones motoras, deterioro cognitivo, y la formacion de cuerpos de Lewy (LBS). (McKeith et al, Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Inf Report of the CDLB International Workshop, Neurology (1996) 47:1113-24). Cuerpos de Lewy son depositos de protemas esfericas se encuentran en las celulas nerviosas. Su presencia en el cerebro altera el funcionamiento normal del cerebro interrumpiendo la accion de los mensajeros qmmicos que incluyen la acetilcolina y dopamina. Enfermedades con cuerpos de Lewy incluyen la enfermedad de Parkinson (incluyendo la enfermedad idiopatica de Parkinson (PD)), enfermedad difusa de cuerpos de Lewy (EDCL) tambien conocida como demencia con cuerpos de Lewy (DLB), Alzheimer combinado y enfermedad de Parkinson y la atrofia multisistemica (MSA). EDCl comparte smtomas tanto de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. EDCL se diferencia de la enfermedad de Parkinson principalmente en la localizacion de cuerpos de Lewy. En los cuerpos de Lewy EDCL, se forman principalmente en la corteza. En la enfermedad de Parkinson, forman principalmente en la sustancia negra. Otras enfermedades con cuerpos de Lewy incluyen insuficiencia pura autonomica, disfagia de cuerpos de Lewy, LBD incidental, LBD heredado (por ejemplo, mutaciones del gen de alfa-sinuclema, PARK3 y PARK4) y atrofia de multiples sistemas (por ejemplo, Atrofia Olivopontocerebelosa, Degeneracion Nigroestriatal y Smdrome Shy-Drager).

IV. Animales transgenicos y celulas

[0053] La invencion proporciona animales transgenicos no humanos que tienen un genoma que comprende un transgen que comprende un segmento de acido nucleico que codifica una forma truncada C-terminal de la alfa- sinuclema como se describe anteriormente. El transgen esta presente preferiblemente en la totalidad o sustancialmente la totalidad de las celulas somaticas y la lmea germinal del animal transgenico. El segmento de acido nucleico que codifica la forma truncada C-terminal de la alfa-sinuclema esta unido operativamente a uno o mas segmentos reguladores que permiten que la forma truncada de la alfa-sinuclema se exprese en las celulas neuronales del animal. Promotores tales como el promotor de enolasa de neuronas espedficas de rata, promotor del gen de beta-actina humana, promotor del gen de cadena de factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas B (PDGF B), rata promotora del gen del canal de sodio, la mielina del raton promotor del gen de la protema basica, promotor del gen de dismutasa de superoxido de zinc-cobre humano, y el promotor de gen regulador de mam^era POU-dominio se puede utilizar. El promotor PDGF es particularmente adecuado. Opcionalmente, se utiliza un promotor inducible. El promotor de metalotionina de raton, que puede ser regulado mediante la adicion de metales pesados como el zinc al agua del raton o de la dieta, es adecuado. Tales animales transgenicos pueden ser producidos por los mismos enfoques generales descritos por (Masliah et al, Am J. Pathol (1996) 148: 201-10 y Feany et al, Nature (2000) 404: 394-8)) para los animales transgenicos con alfa-sinuclema de longitud completa o US 5.811.633 (para animales transgenicos con una forma mutante de APP). Opcionalmente, los animales transgenicos que llevan un transgen que expresa una protema alfa-sinuclema truncada pueden cruzarse con otros modelos transgenicos de la enfermedad neurogenica, como los modelos de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, los animales transgenicos que llevan un transgen que expresa una protema alfa-sinuclema truncada pueden cruzarse con los animales transgenicos que llevan un transgen expresado APP con una mutacion FAD como se describe, por ejemplo, por Games er al., Nature 373, 523 (1995) McConlogue et al., US 5.612.486, Hsiao et al, Science 274, 99 (1996).; Staufenbiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 13287 - 13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 13287 - 13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). El procedimiento para realizar una cruz de este tipo se describe, por ejemplo, por Masliah et al, PNAS EE.UU. 98: 12.245-12.250 (2001), que informa de un cruce entre ratones transgenicos que expresan una alfa-sinuclema de longitud completa con los ratones PDAPP como se ha descrito por Games et al. Animales transgenicos de la invencion son preferiblemente roedores, tales como ratones o ratas, o los insectos, tales como Drosophila.

[0054] La expresion de formas truncadas de alfa-sinuclema en modelos animales da lugar a animales propensos al desarrollo de al menos una caractenstica de una enfermedad de Cuerpos de Lewy. Tales caractensticas incluyen los niveles de los depositos intracelulares de alfa-sinuclema, aumento de la formacion de cuerpos de Lewy, y deterioro

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de las funciones cognitivas y motoras en relacion con los animales no transgenicos normales de la misma especie. Tales animales transgenicos son utiles para los agentes para la actividad farmacologica de cribado en el tratamiento de la enfermedad de Cuerpos de Lewy.

[0055] La divulgacion tambien proporciona celulas transformadas con alfa sinuclema truncada que forman cuerpos de inclusion que contienen alfa-sinuclema agregada truncada. Las celulas transformadas son preferiblemente celulas neuronales, tales como celulas neuronales GT1-7 (Hsue et al Am J. Pathol 157: 401-410 (2000)), las celulas de neuroblastoma PC12 o celulas SY5Y. Celulas PEAK tambien se pueden utilizar. Las celulas son preferiblemente celulas humanas. Un vector que comprende un segmento que codifica una forma truncada de la alfa-sinuclema unida operativamente a una o mas secuencias reguladoras que aseguran que la expresion de la expresion truncada se transfecte en las celulas. Las celulas transfectadas se pueden utilizar para cribar agentes para la actividad en la limpieza de inclusiones de alfa-sinuclema.

V. Metodos de deteccion

[0056] La invencion proporciona varios metodos de deteccion para identificar agentes que tienen una actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD. Los metodos incluyen examenes que se pueden realizar in vitro, en celulas o animales transgenicos, y que ponen a prueba una variedad de parametros como una indicacion de la actividad. Agentes que se determina que tienen una actividad en estas pruebas pueden ser analizados de nuevo en pruebas secundarias de modelos animales de LBD o en ensayos clmicos para determinar la actividad contra los smtomas de comportamiento u otras de estas enfermedades.

1. In vitro

[0057] Los ensayos in vitro se llevan a cabo para poner a prueba la capacidad de un agente para inhibir la agregacion de las formas truncadas de alfa sinuclema. El formato de base para el analisis de la agregacion in vitro de alfa-sinuclema, aunque en el contexto de alfa sinuclema de longitud completa, se describe por (Wood, J. Biol. Chem. 274, 19509 a 19512 (1999)). En los presentes procedimientos, el ensayo se realiza en presencia de un agente de prueba. La tasa o el grado de agregacion de alfa-sinuclema en presencia de un agente se determina y se compara con la tasa o grado de agregacion de alfa-sinuclema en un control contemporaneo o historico en el que se omitio el agente. Una reduccion en la tasa o grado de agregacion en presencia del agente con respecto al control indica que el agente tiene actividad en la inhibicion de la agregacion de las formas truncadas de alfa sinuclema. Esta actividad es potencialmente util en el tratamiento o prevencion de enfermedades con cuerpos de Lewy.

2. Ensayos celulares

[0058] Algunos ensayos celulares se realizan en las celulas transfectadas con acidos nucleicos que codifican formas truncadas de alfa-sinuclema como se ha descrito anteriormente, opcionalmente con una variacion hereditaria, tal como Ala30Pro o Ala53Th. Tales celulas se ponen en contacto con un agente bajo prueba, y se mide la tasa de extension de la agregacion de alfa-sinuclema truncada. La tasa de extension de la agregacion de alfa-sinuclema se compara entonces con la de celulas de control transfectadas de manera similar en ausencia del agente. La agregacion se puede monitorizar mediante analisis inmunohistoqmmica, microscopfa de luz o por analisis en gel. Analisis en gel puede detectar la formacion de los atenuadores, tnmeros u oligomeros superiores, asf como la incapacidad de sinuclema para entrar en geles debido a un alto nivel de oligomerizacion. Una reduccion en la tasa o grado de agregacion en presencia del agente de ensayo con relacion al control indica que el agente tiene una actividad farmacologica en la inhibicion de la agregacion de las formas truncadas de alfa-sinuclema. Esta actividad es potencialmente util en el tratamiento o prevencion de enfermedades con cuerpos de Lewy.

[0059] Otros ensayos celulares se realizan en las celulas transfectadas con acidos nucleicos que codifican alfa- sinuclema de longitud completa, opcionalmente con una variacion hereditaria, tal como Ala30Pro o Ala53Thr. Tales celulas se ponen en contacto con un agente bajo prueba y la tasa o grado de formacion de formas truncadas de la alfa-sinuclema y/o formas fosforiladas o nitradas de sinuclema se miden. La presencia de estas formas se puede detectar mediante transferencia de Western usando uno o mas anticuerpos a la alfa-sinuclema. Anticuerpos espedficos finales (es decir, anticuerpos que se unen a una forma truncada sin unirse a alfa-sinuclema de longitud completa) son particularmente utiles para este analisis. Las colecciones de anticuerpos que tienen diferentes especificidades de epftopo tambien se pueden utilizar. Por ejemplo, la presencia de formas truncadas de alfa- sinuclema puede demostrarse por la presencia de bandas cuando se realizo la inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen un epftopo N-terminal de un segmento de aminoacidos definido aproximadamente por los aminoacidos 118-125 de alfa-sinuclema intacta, y falta de bandas cuando se borro con un anticuerpo que reconoce un epftopo C-terminal de esta region. La tasa o el grado de formacion de formas truncadas de alfa-sinuclema y/o formas fosforiladas o nitradas en presencia de agente se compara con la de celulas de control comparables en ausencia de agente. Una reduccion en la tasa o grado de formacion de formas truncadas de la alfa-sinuclema en presencia del agente de ensayo con relacion al control indica que el agente tiene una actividad farmacologica que inhibe el procesamiento de alfa-sinuclema a sus formas truncadas. Esta actividad es util para tratar o prevenir LBD.

3. Ensayos en animales transgenicos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0060] Los animales transgenicos tienen un transgen que expresa una forma truncada de la alfa-sinuclema como se ha descrito anteriormente, opcionalmente con una variacion hereditaria, tal como Ala30Pro o Ala53Th. Tal animal se pone en contacto con un agente bajo prueba, y se mide la tasa de extension de la agregacion de la forma truncada de la alfa-sinuclema en comparacion con la de un control contemporaneo o historico. El control es por lo general un animal transgenico similar de la misma especie que no ha sido expuesta al agente. La agregacion de alfa-sinuclema en un animal transgenico se puede controlar mediante transferencia de Western o inmunohistoqmmica como se describe en los ejemplos. De manera alternativa o adicional, la actividad del agente en tales animales transgenicos se puede determinar a partir de caractensticas de comportamiento, tales como caractensticas motoras o cognitivas, como se describe en los Ejemplos. En tales ensayos, la actividad farmacologica del agente se muestra mediante la mejora de caractensticas motoras o cognitivoas (es decir, deterioro disminuido de tales caractensticas) respecto a un animal transgenico de control comparable no expuesto al agente.

[0061] Otros ensayos se realizan en animales transgenicos que tienen un transgen que expresa una forma de longitud completa de alfa-sinuclema, opcionalmente con una variacion hereditaria, tal como Ala30Pro o Ala53Th. Tales animales se ponen en contacto con un agente bajo prueba, y se detecta la tasa o el grado de aparicion de formas truncadas de la alfa-sinuclema, opcionalmente con una variacion hereditaria, tal como Ala30Pro o Ala53Th. Tales formas se pueden detectar usando transferencia Western o analisis inmunohistoqmmica usando anticuerpos anti-alfa-sinuclema apropiados (como se describe para los ensayos celulares). La tasa de extension de la aparicion de formas truncadas de alfa-sinuclema y/o formas fosforiladas o nitradas se compara con la velocidad y el grado de aparicion de tales formas en un control contemporaneo o historico que constituye un animal transgenico comparable que no ha sido expuesto al agente. Una reduccion en la tasa o el grado de aparicion de las formas truncadas de la alfa-sinuclema en el animal expuesto al agente de ensayo con relacion al control indica que el agente tiene actividad en la inhibicion de procesamiento de larga duracion de alfa-sinuclema a formas truncadas.

4. Agentes objeto de examen

[0062] Agentes que se proyectaran incluyen anticuerpos a la alfa-sinuclema, peptidos de alfa-sinuclema, farmacos conocidos o sospechosos de tener actividad en el tratamiento de un LBD, productos naturales y bibliotecas combinatorias. Los peptidos preferidos de alfa sinuclema son peptidos relativamente cortos de 30, 25, 20 10 o menos aminoacidos que incluyen los aminoacidos 118-125 de alfa sinuclema. Opcionalmente, un aminoacido inmediatamente en el lado N-terminal del sitio de escision que genera formas truncadas C-terminal de la alfa- sinuclema se sustituye con un aminoacido analogo de estado de transicion que forma un enlace nonhidrolizable entre los dos aminoacidos que flanquean el sitio de escision, por ejemplo, el aminoacido 119 de alfa-sinuclema. Ejemplos de analogos son analogos del estado de transicion son estatina, hidroxieteleno, hidroxietelamina, AHPPA, ACHPA, y derivados de los mismos. Uno o mas aminoacidos de una secuencia de alfa-sinuclema natural tambien pueden estar sustituidos con otros aminoacidos naturales.

[0063] Los productos naturales objeto de examen tambien pueden obtenerse a partir del Instituto Nacional del Cancer Repositorio de Productos Naturales, Bethesda, MD. Bibliotecas aleatorias de peptidos u otros compuestos tambien pueden ser examinadas para determinar su idoneidad. Las bibliotecas combinatorias se pueden producir para muchos tipos de compuestos que se pueden sintetizar de una manera etapa a etapa. Tales compuestos incluyen polipeptidos, mimeticos de giro beta, polisacaridos, fosfolfpidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromaticos, compuestos heterodclicos, benzodiazepinas, glicinas N-sustituidas oligomericas y oligocarbamatos. Las grandes bibliotecas combinatorias de los compuestos pueden ser construidos por las bibliotecas codificadas sinteticas (ESL) procedimiento descrito en Affymax, documento WO 95/12608, Affymax, documento WO 93/06121, Universidad de Columbia, documento WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 y Scripps, documento WO 95/30642. Las bibliotecas de peptidos tambien pueden generarse mediante metodos de presentacion de fagos. Vease, por ejemplo, Devlin, documento WO 91/18980. Las bibliotecas combinatorias y otros compuestos inicialmente pueden ser examinados para determinar su idoneidad determinando su capacidad para unirse a la alfa-sinuclema.

VI. Ensayos de toxicidad

[0064] Estrategias analogas a las descritas en los ensayos de seleccion se pueden utilizar para determinar si los farmacos existentes, alimentos, toxinas ambientales, y otros compuestos ejercen efectos toxicos a traves de la promocion del procesamiento de alfa-sinuclema, la fosforilacion o agregacion. Dichos ensayos se llevan a cabo en la misma manera que los ensayos de seleccion. La actividad toxica se indica por el resultado opuesto a la actividad farmacologica en los ensayos de seleccion.

VII. Aislamiento de la proteasa

[0065] El procesamiento de longitud completa alfa-sinuclema a las formas truncadas de la invencion se efectua por una proteasa. La proteasa se puede purificar usando un inhibidor identificado por los metodos de deteccion descritos anteriormente. Un inhibidor preferido es un peptido de alfa-sinuclema incluyendo residuos 117-126 en los que un residuo N-terminal al sitio de escision se ha sustituido por un analogo de estado de transicion. Un inhibidor de este

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tipo se utiliza como un reactivo de purificacion por afinidad para purificar la proteasa a partir de extractos de celulas cerebrales. Tales celulas se pueden obtener del cadaver de un individuo normal o uno que ha sufrido de una enfermedad LBD. Los niveles de proteasa pueden ser elevados en el segundo. La proteasa se puede ensayar mediante la presentacion con un sustrato de alfa-sinuclema y el seguimiento de la formacion de productos de escision. El sustrato puede ser, por ejemplo, la forma humana natural de alfa-sinuclema descrita anteriormente, un fragmento de la misma que contiene los residuos que flanquean ambos lados del sitio de escision, o una forma mutante de la misma en la que la mutacion esta asociada con una forma hereditaria de LBD. Opcionalmente, el extremo C-terminal del sustrato se puede inmovilizar a la fase solida, y el N-terminal a una etiqueta. La escision del sustrato libera la etiqueta a la fase ftquida. La fase ftquida puede ser facilmente separada de la fase solida, y la cantidad de marcador cuantificada como una medida de la actividad proteolftica.

VIII. Anticuerpos especificos finales

[0066] La descripcion proporciona anticuerpos especificos de gama. Tales anticuerpos se unen espedficamente a una forma truncada de alfa sinuclema (en el extremo C-terminal), preferiblemente una forma seleccionada del grupo que consiste en SN1-118, SN1-119, 1-120, 1-121, 1-122, 1 -123, 1-124, 1-125 o 1-126 sin unirse espedficamente a alfa-sinuclema de longitud completa. Tales anticuerpos son utiles para formacion de imagenes in vivo de depositos de alfa-sinuclema, como agentes terapeuticos (vease mas adelante), y para la deteccion de productos de escision resultantes de la escision proteolftica de la alfa-sinuclema en los metodos de seleccion descritos anteriormente. Anticuerpos especificos finales tambien se proporcionan a los correspondientes fragmentos C-terminal, por ejemplo, 118-140, 119-140, 120-140, 121-140, 122-140, 123-140, 124-140, 125-140 y 126-140. Los anticuerpos espedficos de gama reconocen el N-terminal de estos fragmentos de tal manera que se unen espedficamente al fragmento sin unirse espedficamente a alfa-sinuclema de longitud completa.

[0067] Dichos anticuerpos se pueden generar mediante la inmunizacion de un animal de laboratorio con alfa- sinuclema o un fragmento de la misma para inducir anticuerpos, y deteccion de los anticuerpos resultantes para identificar los que tienen la especificidad de union deseada. Opcionalmente, la inmunizacion puede llevarse a cabo con peptidos relativamente cortos de acidos de menos de 20 aminoacidos que incluyen el extremo C-terminal de los fragmentos truncados descritos en el presente documento (por ejemplo, SN 99 a 118, o SN 110-119). Opcionalmente, dichos peptidos cortos estan ligados a un portador que ayuda a provocar una respuesta inmunitaria.

[0068] Opcionalmente, la union espedfica a un fragmento truncado marcado o inmovilizado se puede realizar en competencia con alfa-sinuclema no marcada de longitud completa. Opcionalmente, grandes bibliotecas de anticuerpos se pueden examinar simultaneamente usando la tecnica de presentacion en fagos.

[0069] La produccion de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murino, conejillo de indias, primate, conejo o rata, se puede realizar como se describe por Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Adyuvante completo de Freund seguido de adyuvante incompleto se prefiere para la inmunizacion de animales de laboratorio. Conejos o cobayas se utilizan tfpicamente para preparar anticuerpos policlonales. Los ratones se usan tfpicamente para preparar anticuerpos monoclonales. La union puede evaluarse, por ejemplo, mediante transferencia Western o ELISA. El fragmento mas pequeno que muestra union espedfica al anticuerpo define el epftopo del anticuerpo. Alternativamente, la especificidad de epftopo se puede determinar por un ensayo de competicion es que un anticuerpo de ensayo y de referencia compiten para la union a alfa-sinuclema. Si los anticuerpos de ensayo y de referencia compiten, a continuacion, se unen al mismo epftopo o epftopos suficientemente proximales tal que la union de un anticuerpo interfiere con la union del otro.

[0070] Los anticuerpos quimericos y humanizados tienen la misma o similar especificidad de union y afinidad como un raton u otro anticuerpo no humano que proporciona el material de partida para la construccion de un anticuerpo quimerico o humanizado. Los anticuerpos quimericos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, tfpicamente por ingeniena genetica, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de raton pueden unirse a segmentos constantes humanos (C), tales como IgG1 e IgG4. Se prefiere el isotipo IgG1 humano. En algunos metodos, el isotipo del anticuerpo es IgG1 humano. Los anticuerpos IgM se pueden usar tambien en algunos metodos. Un anticuerpo quimerico tfpico es por lo tanto una protema hnbrida que consiste en el dominio de union de V o antfgeno de un anticuerpo de raton y el dominio C o efector de un anticuerpo humano.

[0071] Los anticuerpos humanizados tienen residuos de marco de region variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado un anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de un raton de anticuerpo, (referido como la inmunoglobulina donante). Vease, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 10029-10033 (1989), WO 90/07861, US 5.693.762, US 5.693.761, US 5.585.089, US 5.530.101, y Winter, US 5.225.539. La region constante, si esta presentes, tambien es sustancial o completamente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos suelen ser elegidos a partir de anticuerpos humanos cuyas secuencias de marco presentan un alto grado de identidad de secuencia con los dominios de region variable murina a partir de los cuales se derivaron las CDR. Los residuos de marco de region variable de cadena pesada y ligera pueden derivar de las mismas o diferentes secuencias de anticuerpo humano. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos naturales o pueden ser secuencias de consenso de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

varios anticuerpos humanos. Vease Carter et al., WO 92/22653. Ciertos aminoacidos de los restos de marco de region variable humana se seleccionan para la sustitucion basandose en su posible influencia sobre la conformacion de CDR y/o la union a antfgeno. La investigacion de tales influencias posibles es por modelado, examen de las caractensticas de los aminoacidos en localizaciones particulares, o la observacion empftica de los efectos de la sustitucion o mutagenesis de aminoacidos particulares.

[0072] Los anticuerpos humanos contra la alfa-sinuclema son proporcionados por una variedad de tecnicas descritas a continuacion. Algunos anticuerpos humanos son seleccionados por experimentos de union competitiva, o de otra manera, para tener la misma especificidad de epftopo que un anticuerpo de raton particular. Las tecnicas para producir anticuerpos humanos incluyen la metodologfa del trioma de Oestberg et al, Hybridoma 2: 361-367 (1983); Patente Oestberg, US n° 4.634.664; y Engleman et al., Patente de Estados Unidos 4.634.666, el uso de mairnferos transgenicos no humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana como se describe por, por ejemplo, Lonberg et al., WO93/1222, US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 y metodos de presentacion de fagos vease, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871,907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 y US 5.565.332.

[0073] Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quimericos, humanizados, o humanos pueden estar enlazados para al menos una porcion de una region constante humana. La eleccion de region constante depende, en parte, de si se desea complemento dependiente de anticuerpo y/o toxicidad mediada por celulas. Por ejemplo, los isotopos IgG1 e IgG3 tienen actividad del complemento e isotipos IgG2 e IgG4 no lo hacen. La eleccion de isotipo tambien puede afectar la etapa del anticuerpo en el cerebro. Se prefiere el isotipo IgG1 humano. Regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrameros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab' F(ab')2, y Fv, o como anticuerpos de cadena sencilla en que los dominios variables de cadena pesada y ligera estan vinculados a traves de un espaciador.

[0074] Los anticuerpos monoclonales se unen espedficamente a un epftopo dentro de los residuos 109-120, o 115123, de alfa-sinuclema, o un epftopo discontinuo dentro de los residuos 43-51 y 68-65, o de fin espedfico para el extremo C-terminal de la alfa sinuclema tambien se proporcionan, incluyendo formas humanizadas, quimericas y humanas de los mismos. Un anticuerpo espedfico de extremo a C-terminal de la alfa-sinuclema puede ser reconocido por la capacidad para unirse espedficamente a la alfa-sinuclema como una protema libre sin unirse espedficamente a alfa-sinuclema como un componente de una protema de fusion cuando el extremo C-terminal de la alfa sinuclema esta vinculado a un segundo peptido. Estos anticuerpos pueden ser examinados para la actividad terapeutica, y si se obtienen resultados positivos, se pueden utilizar en metodos terapeuticos. Los anticuerpos tambien se pueden utilizar en la deteccion de fragmentos de alfa-sinuclema como se describe anteriormente.

IX. Diagnostico

[0075] La descripcion proporciona metodos de LBs in vivo de imagen en un paciente. Tales metodos son utiles para diagnosticar o confirmar el diagnostico de una enfermedad de Cuerpos de Lewy de la EP o susceptibilidad a la misma. Por ejemplo, los metodos se pueden utilizar en un paciente que presenta smtomas de demencia. Si el paciente tiene LBs, entonces el paciente es probable que sufre de una enfermedad por cuerpos de Lewy. Los metodos tambien se pueden utilizar en pacientes asintomaticos. La presencia de depositos anormales de amiloide indica la susceptibilidad a la enfermedad sintomatica futura. Los metodos tambien son utiles para controlar la progresion y/o respuesta de la enfermedad al tratamiento en pacientes que han sido diagnosticados previamente con una enfermedad de cuerpos de Lewy.

[0076] El metodo de trabajo mediante la administracion de un anticuerpo espedfico de extremo como se describio anteriormente que se une a la alfa-sinuclema en el paciente y despues detectando el anticuerpo despues de que se ha unido. Si se desea, una respuesta de eliminacion puede evitarse usando fragmentos de anticuerpo que carecen de una region constante de longitud completa, tales como Fab. En algunos procedimientos, el mismo anticuerpo puede servir como un tratamiento y reactivo de diagnostico.

[0077] Reactivos de diagnostico pueden administrarse por inyeccion intravenosa en el cuerpo del paciente, o directamente en el cerebro por inyeccion intracraneal o taladrando un agujero a traves del craneo. La dosificacion de reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos que para los metodos de tratamiento. Tfpicamente, el reactivo esta marcado, aunque en algunos metodos, el reactivo primario con afinidad por la alfa-sinuclema es no marcado y un agente de marcaje secundario se usa para unirse al reactivo primario. La eleccion del marcador depende de los medios de deteccion. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la deteccion optica. El uso de marcadores paramagneticos es adecuado para la deteccion tomografica sin intervencion quirurgica. Los marcadores radiactivos tambien pueden detectarse usando PET o SPECT.

[0078] El diagnostico se lleva a cabo comparando el numero, tamano y/o la intensidad de loci marcado a valores de la lmea base correspondiente. Los valores de la lmea base pueden representar los niveles medios en una poblacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de individuos no enfermos. Valores de la lmea base tambien pueden representar niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores de lmea de base pueden ser determinados en un paciente antes de comenzar el tratamiento, y los valores medidos a partir de entonces en comparacion con los valores de la lmea base. Una disminucion en los valores relativos a la lmea de base de las senales de una respuesta positiva al tratamiento.

[0079] Los anticuerpos espedficos finales tambien son utiles para determinar si las formas truncadas de la alfa- sinuclema estan presentes en el lfquido cefalorraqmdeo o en otros tejidos o fluidos corporales. La presencia de tales formas en niveles significativamente mayores (es dedr, mayor que la media mas una desviacion estandar) en un paciente en relacion con el nivel normal en una poblacion de individuos no enfermos es indicativa de la presencia o la susceptibilidad a una LBD.

X. Metodos de tratamiento

[0080] La descripcion tambien proporciona varios metodos para prevenir o tratar la enfermedad de Cuerpos de Lewy en los pacientes que sufren de o estan en riesgo de dicha enfermedad. Los agentes terapeuticos incluyen las formas truncadas de la alfa-sinuclema descritos anteriormente, y fragmentos de la misma eficaces para inducir anticuerpos, anticuerpos espedficos de gama como se describio anteriormente, e inhibidores de la agregacion de fragmentos truncados de la alfa-sinuclema o procesamiento proteolttico de la alfa-sinuclema como se describe anteriormente. Los metodos generales para los agentes de la administracion a los pacientes que sufren o estan en riesgo de LBD se describen en la solicitud pendiente USSN 60/423.012 presentada el 1 de noviembre de 2002, y US00 PCT/15239 presentada el 1 de junio de 2000, y PCT/US03/34527, presentada el 31 de octubre de 2003.

[0081] Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos en riesgo de la enfermedad de un LBD pero no muestran smtomas, asf como pacientes que muestran actualmente smtomas. Por lo tanto, los presentes procedimientos pueden administrarse profilacticamente a individuos que tienen un riesgo genetico conocido de un LBD. Tales individuos incluyen los que tienen parientes que han experimentado esta enfermedad, y aquellos cuyo riesgo se determina por analisis de marcadores geneticos o bioqmmicos. Los marcadores geneticos de riesgo hacia PD incluyen mutaciones en alfa-sinuclema o genes Parkin, UCHLI, y CYP2D6; particularmente mutaciones en las posiciones 30 y 53 del gen de la alfa-sinuclema. Las personas actualmente padecen la enfermedad de Parkinson se pueden reconocer de sus manifestaciones clmicas, incluyendo temblor en reposo, rigidez muscular, bradicinesia e inestabilidad postural.

[0082] En algunos metodos, el paciente esta libre de smtomas clfnicos o factores de riesgo de cualquier enfermedad amiloidogenica que no sea uno caracterizada por cuerpos de Lewy. En algunos metodos, el paciente esta libre de smtomas clmicos o factores de riesgo de cualquier enfermedad caracterizada por depositos amiloides extracelulares. En algunos metodos, el paciente es libre de enfermedades caracterizadas por depositos amiloides de peptido Ap. En algunos metodos, el paciente esta libre de smtomas clmicos y factores de riesgo de la enfermedad de Alzheimer. En algunos metodos, el paciente tiene la enfermedad de Alzheimer concurrente y una enfermedad caracterizada por cuerpos de Lewy. En algunos metodos, el paciente tiene enfermedad concurrente de Alzheimer y Parkinson.

[0083] En los pacientes asintomaticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Por lo general, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que un paciente alcanza 40, 50, 60 o 70. El tratamiento tfpicamente implica multiples dosificaciones durante un penodo de tiempo. El tratamiento puede monitorizarse mediante el ensayo de anticuerpo, o activa las respuestas de celulas B de celulas T o a un agente terapeutico (por ejemplo, una forma truncada de peptido alfa-sinuclema) en el tiempo. Si la respuesta cae, una dosis de refuerzo se indica.

[0084] En las aplicaciones profilacticas, las composiciones farmaceuticas o medicamentos se administran a un paciente sus-ceptible a, o de otra manera en riesgo de un LBD en regimen que comprende una cantidad y frecuencia de administracion de la composicion o el medicamento suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparicion de la enfermedad, incluyendo smtomas fisiologicos, bioqmmicos, histologicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones se administran a un paciente que se sospecha de, o que ya sufre de una enfermedad como en un regimen que comprende una cantidad y frecuencia de administracion de la composicion suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los smtomas de la enfermedad (fisiologicos, bioqmmicos, histologicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad adecuada para conseguir el tratamiento terapeutico o profilactico se define como una dosis terapeuticamente o profilacticamente efectiva. Una combinacion de cantidad y la frecuencia de dosis adecuada para conseguir el tratamiento terapeutico o profilactico se define como un regimen eficaz terapeuticamente o profilacticamente. En ambos regfmenes profilacticos y terapeuticos, los agentes normalmente se administran en varias dosificaciones hasta que se ha conseguido una respuesta inmune suficiente. Tfpicamente, la respuesta inmune se controla y dosis repetidas se dan si la respuesta inmune empieza a disminuir.

[0085] En algunos metodos, la administracion de un agente resulta en la reduccion de los niveles intracelulares de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

alfa-sinuclema agregada. En algunos metodos, la administracion del agente da como resultado una reduccion en los niveles de las formas truncadas C-terminal de la alfa-sinuclema. En algunos metodos, la administracion de un agente resulta en la mejora de un smtoma clmico de un LBD, tales como el motor o la funcion cognitiva en el caso de la enfermedad de Parkinson. En algunos metodos, la reduccion en los niveles intracelulares de alfa-sinuclema agregada o mejora en un smtoma clmico de la enfermedad se controla a intervalos despues de la administracion de un agente.

[0086] Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invencion, para el tratamiento de las condiciones descritas anteriormente vanan dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administracion, sitio diana, estado fisiologico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profilactico o terapeutico. Por lo general, el paciente es un mairnfero humano pero tambien pueden ser tratados no humanos incluyendo mamfferos transgenicos. Las dosificaciones de tratamiento necesitan titularse para optimizar la seguridad y la eficacia.

[0087] En algunos metodos, el agente es un fragmento truncado de alfa-sinuclema o un fragmento de la misma capaz de inducir anticuerpos a la alfa-sinuclema. La cantidad de un fragmento tal depende de si el adyuvante tambien se administra, con dosis mas altas que se requieren en la ausencia de adyuvante. La cantidad de un fragmento para la administracion a veces vana de 1-500 pg por paciente y mas habitualmente de 5-500 pg por inyeccion para la administracion humana. En ocasiones, se utiliza una dosis mayor de 1-2 mg por inyeccion. Tfpicamente aproximadamente 10, 20, 50 o 100 pg se utiliza para cada inyeccion humana. La masa de fragmento tambien depende de la relacion de masa del epftopo inmunogenico dentro del fragmento a la masa del fragmento como un todo. Tfpicamente, 10'3 a 10'5 micro moles de epftopo inmunogenico se utilizan para microgramo de fragmento. El horario de las inyecciones puede variar significativamente de una vez al dfa, a una vez al ano, a una vez cada decada. En cualquier dfa dado que se da una dosificacion de inmunogeno, la dosificacion es mayor que 1 pg/paciente y habitualmente mayor que 10 pg/paciente si tambien se administra adyuvante, y mayor que 10 pg/paciente y habitualmente mayor que 100 pg/paciente en ausencia de adyuvante. Un regimen tfpico consta de una inmunizacion seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tal como intervalos de 6 semanas. Otro regimen consta de una inmunizacion seguida por inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses mas tarde. Otro regimen supone una inyeccion cada dos meses durante toda la vida. Alternativamente, las inyecciones de refuerzo pueden ser de forma irregular tal como se indica mediante la monitorizacion de la respuesta inmune.

[0088] fragmentos truncados de alfa-sinuclema se pueden administrar tambien en forma de acidos nucleicos que codifican los fragmentos unidos operativamente a uno o mas elementos reguladores para asegurar la expresion del fragmento truncado de alfa sinuclema. Las dosis para acidos nucleicos que codifican inmunogenos vanan de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, o 30-300 pg de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos vanan 10-100, o mas, viriones por dosis.

[0089] Algunos metodos implican la inmunizacion pasiva con un anticuerpo espedfico de extremo. En tales metodos, los intervalos de dosificacion de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del huesped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mg o 700 mg o en el intervalo de 70-700 mg, respectivamente, para un paciente de 70 kg. Un regimen de tratamiento ejemplar implica la administracion una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos procedimientos, dos o mas anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de union se administran simultaneamente, en cuyo caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado esta dentro de los rangos indicados. El anticuerpo se administra habitualmente en multiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos tambien pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sangumeos de anticuerpo a la alfa-sinuclema en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificacion se ajusta para lograr una concentracion de anticuerpo en plasma de 1-1000 pg/ml y en algunos metodos de 25-300 pg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulacion de liberacion sostenida, en cuyo caso se requiere administracion menos frecuente. La dosificacion y frecuencia vanan dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran una vida media mas larga, seguido por anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, y anticuerpos no humanos. La dosificacion y frecuencia de administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, una dosificacion relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo penodo de tiempo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos a veces se requiere hasta que la progresion de la enfermedad se reducza o termine, y preferiblemente hasta que el paciente muestre mejora parcial o completa de los smtomas de la enfermedad. Despues de ello, se puede administrar un regimen profilactico al paciente.

[0090] Los agentes terapeuticos se pueden administrar por via parenteral, topica, intravenosa, oral, subcutanea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal o medios intramusculares para el tratamiento profilactico y/o terapeutico. La ruta mas tfpica de administracion de un agente inmunogenico es subcutanea aunque otras vfas pueden ser igualmente eficaces. La siguiente via mas comun es la inyeccion intramuscular. Este tipo de inyeccion se realiza mas tfpicamente en los musculos de la pierna o el brazo. En algunos procedimientos, los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado depositos, por ejemplo inyeccion intracraneal. La inyeccion intramuscular o infusion intravenosa se prefiere para la administracion de anticuerpos. En algunos procedimientos, en particular anticuerpos terapeuticos se inyectan directamente en el craneo. En algunos procedimientos, los anticuerpos se administran como una composicion de liberacion sostenida o dispositivo, tal como un dispositivo Medipad™. Las moleculas pequenas que actuan mediante la inhibicion de procesamiento de la proteasa de la alfa-sinuclema se pueden administrar por via intravenosa si las pequenas moleculas pasan a traves de la barrera hematoencefalica suficiente para la eficacia terapeutica o profilactica o directamente en el craneo de otra manera.

[0091] Los agentes de la invencion opcionalmente pueden administrarse en combinacion con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de LBD. Agentes de la invencion tambien se pueden administrar en combinacion con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la invencion a traves de la barrera sangre- cerebro.

[0092] Los agentes inmunogenicos se administran a veces en combinacion con un adyuvante. Una variedad de adyuvantes se puede utilizar en combinacion con un peptido, tal como alfa-sinuclema, para provocar una respuesta inmune. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrmseca a un inmunogeno sin provocar cambios conformacionales en el inmunogeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen hidroxido de aluminio y fosfato de aluminio, 3-De-O-acilado monofosforilo lfpido A (MPLTM) (vease GB 2220211 (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, ahora parte de Corixa). Stimulon™ QS-21 es un glicosido triterpeno o saponina aislados de la corteza del arbol Quillaja saponaria Molina se encuentra en America del Sur (vease Kensil et al, en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995); la patente estadounidense n° 5.057.540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinacion con estimulantes inmunes, tales como monofosforilo lfpido A (vease Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), polfmeros pluronicos, y micobacterias muertas. Otro adyuvante es CpG (documento WO 98/40100). Como alternativa, la alfa-sinuclema puede acoplarse a un adyuvante. Sin embargo, tal acoplamiento no debe cambiar sustancialmente la conformacion de alfa-sinuclema de manera que afecte a la naturaleza de la respuesta inmune al mismo. Los adyuvantes pueden administrarse como un componente de una composicion terapeutica con un agente activo o pueden administrarse por separado, antes de, simultaneamente con, o despues de la administracion del agente terapeutico.

[0093] Una clase preferida de adyuvantes es sales de aluminio (alumbre), tales como hidroxido de alumbre, fosfato de alumbre, sulfato de alumbre. Tales adyuvantes pueden usarse con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como MPL o 3-DMP, QS-21, polimerico o aminoacidos monomericos tales como acido poliglutamico o polilisina. Otra clase de adyuvantes es formulaciones de emulsion de aceite-en-agua. Tales adyuvantes pueden usarse con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como peptidos de muramilo (por ejemplo, N-acetilmuramilo-L-treonilo-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilo-normuramilo-L-alanilo-D- isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramilo-L-alanilo-D-isoglutaminilo-L-alanina-2-(1’-fosforiloxi-2’dipalmitoil-sn- glicero-3-hidroxi) etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramilo-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) theramidaTM), u otros componentes de la pared celular bacteriana. Las emulsiones de aceite-en-agua incluyen (a) MF59 (documento WO 90/14837), que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0,5% de Span 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE) formulado en partmulas submicrometricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polfmero bloqueado con pluronico L121 y thr- MDP, microfluidizado en una emulsion submicrometrica o vortex para generar una emulsion de mayor tamano de partmula, y (c) sistema adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80, y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilfpido a (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (DetoxTM).

[0094] Otra clase de adyuvantes preferidos es adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA) o partmulas generadas de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes) y ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen RC-529, GM-CSF y Adyuvante Completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, iL-6, IL-12, IL13 e IL-15), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor estimulante de colonias granulocitos-macrofagos (GM-CSF), y factor de necrosis tumoral (TNF). Otra clase de adyuvantes es analogos de glicolfpidos incluyendo N-glicosilamidas, N-glicosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales esta sustituido en el residuo de azucar por un aminoacido, como inmunomoduladores o adyuvantes (vease la Patente de EE.UU. Num. 4.855.283). Protemas de choque termico, por ejemplo, HSP70 y HSP90, tambien se pueden usar como adyuvantes.

[0095] Un adyuvante puede administrarse con un fragmento de la alfa-sinuclema como una sola composicion, o se puede administrar antes de, simultaneamente con o despues de la administracion del fragmento de la alfa- sinuclema. El fragmento de la alfa-sinuclema y el adyuvante pueden envasarse y suministrarse en el mismo vial o pueden envasarse en viales separados y mezclarse antes de su uso. El fragmento de alfa-sinuclema y el adyuvante

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

se envasan tfpicamente con una etiqueta que indica la aplicacion terapeutica prevista. Si el fragmento de alfa- sinuclema y el adyuvante se envasan por separado, el embalaje incluye tipicamente instrucciones para la mezcla antes de su uso. La eleccion de un adyuvante y/o vehfculo depende de la estabilidad de la formulacion inmunogenica que contiene el adyuvante, la via de administracion, el programa de dosificacion, la eficacia del adyuvante para la especie a la que se vacuna, y, en seres humanos, un adyuvante farmaceuticamente aceptable es uno que se ha aprobado o puede aprobarse para la administracion humana por los organismos reguladores pertinentes. Por ejemplo, adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administracion humana. Se prefieren Alum, MPL y QS-21. Opcionalmente, dos o mas adyuvantes diferentes se pueden utilizar simultaneamente. Las combinaciones preferidas incluyen alumbre con MPL, alumbre con QS-21, MPL con QS-21, MPL o RC-529 con GM-CSF, y el alumbre, QS-21 y mPl juntos. Ademas, el adyuvante incompleto de Freund se puede utilizar (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinacion con cualquiera de alumbre, QS-21, y MPL y todas las combinaciones de los mismos.

[0096] Los agentes de la invencion se administran a menudo como composiciones farmaceuticas que comprenden un agente terapeutico activo, es decir, y una variedad de otros componentes farmaceuticamente aceptables. Vease Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). La forma preferida depende del modo pretendido de administracion y aplicacion terapeutica. Las composiciones tambien pueden incluir, dependiendo de la formulacion deseada, vehfculos farmaceuticamente aceptables, no toxicos, o diluyentes, que se definen como vehfculos comunmente utilizados para formular composiciones farmaceuticas para la administracion animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biologica de la combinacion. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solucion salina fisiologica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa y solucion de Hank. Ademas, la composicion farmaceutica o formulacion tambien puede incluir otros vehfculos, adyuvantes, o, estabilizadores no terapeuticos, no inmunogenicos no toxicos y similares.

[0097] Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como protemas, polisacaridos tales como quitosano, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos y copolfmeros (tales como sefarosa funcionalizada con latex (TM), agarosa, celulosa, y similares), aminoacidos polimericos acidos, copolfmeros de aminoacidos y agregados de lfpidos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos vehfculos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).

[0098] Para la administracion parenteral, los agentes de la invencion se pueden administrar como dosis inyectables de una solucion o suspension de la sustancia en un diluyente fisiologicamente aceptable con un vehfculo farmaceutico que puede ser un lfquido esteril tal como aceites en agua, solucion salina, glicerol, o dimetilol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de las composiciones farmaceuticas son los de petroleo, animal, vegetal o sintetico, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehfculos lfquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos se pueden administrar en la forma de una inyeccion de deposito o preparacion de implante que puede formularse de una manera tal que permita una liberacion sostenida del ingrediente activo. Una composicion ejemplar comprende anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml, formulado en tampon acuoso que consiste en 50 mM de L-histidina, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl. Las composiciones para administracion parenteral son tipicamente sustancialmente esteril, sustancialmente isotonica y fabricado bajo condiciones GMP de la FDA o cuerpo similar.

[0099] Tfpicamente, las composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o suspensiones lfquidas; formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, vehfculos lfquidos antes de la inyeccion tambien se pueden preparar. La preparacion tambien se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartfculas tales como polilactida, poliglicolida, o copolfmero para efecto de adyuvante mejorado, como se discutio anteriormente (vease Langer, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97119 (1997). Los agentes de esta invencion se pueden administrar en forma de una preparacion de inyeccion de deposito o implante que se puede formular de una manera tal que permita una liberacion sostenida o pulsatil del ingrediente activo.

[0100] las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administracion incluyen la via oral, intranasal, y formulaciones pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdermicas para supositorios, los aglutinantes y vehfculos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, formulaciones de liberacion sostenida o polvos y contienen 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25%-70%.

[0101] La aplicacion topica puede resultar en la liberacion transdermica o intradermica. La administracion topica puede facilitarse mediante coadministracion del agente con toxina del colera o derivados o subunidades desintoxicadas de los mismos u otras toxinas bacterianas similares (Vease Glenn et al., Nature 391, 851-(1998)). La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

co-administracion se puede lograr mediante el uso de los componentes como una mezcla o como moleculas unidas obtenidas por reticulacion qmmica o expresion como una protema de fusion. Alternativamente, administracion transdermica se puede lograr mediante una ruta de la piel o usando transferosomas (Paul et al, Eur J. Immunol 25, 3521-24-(1995); Cevc et al, Biochem Biophys Acta 1368, 201-15 (1998)).

Ejemplos

1. La deteccion de formas truncadas de la alfa-sinuclema en un animal transgenico

[0102] Los ratones transgenicos que tienen un acido nucleico que codifica alfa-sinuclema intacta unido operativamente a un promotor PDFG se analizaron a las 6 semanas, 3 meses y 12 meses de edad. Los animales fueron sacrificados y la corteza y el hipocampo de tejidos a partir de cuatro ratones (2 machos/2 hembra) se agruparon. El tejido se homogeneizo en TBS (NaCl 250 mM), y se centrifugo a 150,000 xg durante 15 minutos. Despues, el sedimento se extrajo con 1% de Triton-X 100 durante 30 min a 4 grados y se centrifugo como antes. Despues, el sedimento resultante se extrajo con 1% de SDS durante 30 min a 25 grados y se centrifugo como antes. Finalmente, el granulado se extrajo con urea 8 M/1% de SDS. Este procedimiento dio lugar a cuatro extractos a los que se hace referencia como Tris, Triton, SDS, y extractos de urea en la descripcion siguiente.

[0103] Figs. 1A y B muestran una transferencia Western de extractos a partir de un raton transgenico y un control emparejado con el anticuerpo ELADW-47. Este anticuerpo es un anticuerpo policlonal que se une a un epitope dentro de Sun115-122 (pero no necesariamente requiere de cada aminoacido para que ocurra la union). El anticuerpo se une preferentemente la forma humana de la alfa-sinuclema pero tambien se une la forma del raton en menor medida. Las Figs. 1A y B muestran una banda de alfa-sinuclema en 14 kDa, tanto para el control del raton como del raton transgenico. La banda es mas fuerte para el raton transgenico que el control. Para los diferentes extractos, la banda es mas intensa en el extracto de Triton. Este extracto solubiliza alfa-sinuclema unida a la membrana y, posiblemente, inclusiones de cuerpo como de Lewy. El Tris y en particular las extracciones Triton del raton transgenico (pero no el control) muestran una banda a aproximadamente 12 kDa en un tampon de tricina. Esta es una forma truncada de la alfa-sinuclema. El peso molecular de la banda corresponde a una longitud de aproximadamente 115-120 aminoacidos.

[0104] Fig 2 muestra una transferencia de Western con el mismo anticuerpo como Fig. 1 para comparar el nivel de la forma truncada de la alfa-sinuclema en ratones de 3 meses y 12 meses de edad. La figura muestra que la forma truncada aparece mas fuertemente en los ratones de 3 meses. Una vez mas, la banda truncada no aparece en los ratones de control. Una aparicion mas intensa de la forma truncada de la alfa-sinuclema temprano en el desarrollo de los ratones transgenicos indica que la forma truncada de la alfa-sinuclema tiene un papel temprano en la patogenesis de la enfermedad de Cuerpos de Lewy.

[0105] Figs. 3A y B muestran una transferencia de Western con un anticuerpo diferente denominado 12C1 (se une epftopo en los aminoacidos 43-51 y 58-65, monoclonales, IgG1 k). Este anticuerpo se une igualmente a formas de raton y humanas de la alfa-sinuclema en un epftopo que incluye los aminoacidos 43-51 y 58-65. Fig. 3 muestra la banda truncada de 12 kDa en el extracto de Triton de los ratones transgenicos. La misma banda aparece mucho mas debilmente en el extracto de Triton de los ratones de control. Por lo tanto, el procesamiento de alfa-sinuclema a una forma truncada se produce tanto en ratones normales y ratones transgenicos, pero mas fuertemente en los ultimos. La mayor extension de procesamiento en los ratones transgenicos puede ser debido al procesamiento de la alfa-sinuclema humana directamente, o puede ser debido a la presencia de la alfa-sinuclema humana que conduce alfa sinuclema de raton por una trayectoria que se utiliza en menor medida en ratones no transgenicos.

[0106] Fig. 4 muestra una transferencia Western adicionalmente usando el mismo anticuerpo como Fig. 3. Este gel muestra dos bandas adicionales de pesos moleculares aproximadamente 6 o 7 kDa. La banda 7 kDa aparece mas fuertemente en los ratones transgenicos que los ratones de control. La banda 6 kDa aparece solo en el raton transgenico, y entonces solamente en la muestra 3 mo. Las bandas 6 o 7 kDa son indicativas de fragmentos N- terminales mas cortos de la alfa-sinuclema de una longitud de aproximadamente 50-80 aminoacidos.

[0107] Figs. 5A, B, C, D, E muestran transferencias de Western con cuatro anticuerpos diferentes y mapas de epftopos de los sitios de union de los anticuerpos. ELADW-44 es un anticuerpo policlonal que se une solo a la forma humana de la alfa-sinuclema (es decir, no a la forma de raton) Se une al epftopo en los aminoacidos 98-019. ELADW-47 es un anticuerpo policlonal que se une preferentemente a la forma humana, pero tambien se une a la forma del raton. Se une a un epftopo en los aminoacidos 115-122. ELADW-48 es un anticuerpo policlonal que se une las formas humanas y de raton por igual. Se une a un epftopo entre los aminoacidos 131 y 140. 8A5 es un anticuerpo monoclonal que se une a las formas humanas y de raton por igual. Se une a la C-terminal de la alfa- sinuclema. Las Figs. 5A-E muestran que de estos cuatro anticuerpos, solamente ELADW-47 genera una banda de 12 kDa indicativo de una forma truncada de la alfa-sinuclema. El resultado de que ELADW48 no dio lugar a esta banda es util para la cartograffa del sitio de escision. Debido a que ELAD-47 se urna y ELAD-48 no se urna, el sitio de escision esta bordeado por el extremo N-terminal del epftopo ELADW-47 y el aminoacido C-terminal del epftopo ELADW48. Ademas, debido a que algunos aminoacidos del epftopo ELADW-47 deben estar presentes para permitir la union y algunos de los epftopos ELADW-48 deben estar ausentes para evitar la union, el sitio de escision se limita

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ademas a una region aproximadamente dentro de los aminoacidos 118-135. Cuando estos datos se consideran con el tamano del fragmento truncado (aproximadamente 115-120 aminoacidos) entonces el sitio probable de escision es de alrededor de los aminoacidos 118-121. La ausencia de union por el anticuerpo C-terminal 8A5 es consistente con este sitio de escision. La ausencia de union por el anticuerpo ELADW-44, sin embargo, requiere mas comentarios. La falta de escision puede explicarse si una forma truncada de la alfa-sinuclema humana que resulta de la escision se adapta a una conformacion diferente a alfa-sinuclema intacta, evitando la union de ELDAW-44. Alternativamente, la forma truncada de la alfa-sinuclema presente en ratones transgenicos en un grado mayor que en los ratones normales representa una forma de raton alfa-sinuclema. En este caso, la mayor cantidad de la forma truncada en el raton transgenico sena debido a la presencia de la alfa-sinuclema humana que conduce mas de la alfa sinuclema de raton por un camino de procesamiento que lleva a alfa-sinuclema truncada en relacion con la situacion en un raton control.

2. Deteccion de formas truncadas de la alfa-sinuclema en el cerebro de un paciente con EDCL

[0108] Este ejemplo compara las especies de alfa-sinuclema en LBs a las de las restantes fracciones de protemas solubles y partfculas de un cerebro EDCL. LBs y protema soluble se prepararon a partir de la corteza de un solo paciente EDCL (vease Jensen et al., J. Biol. Chem. 275 21500-21.507 (2000)). El tejido se homogeneizo en Tris/sacarosa (0,32 mM)/EDTA (5 mM) e inhibidores de tampon de proteasa. El homogeneizado se centrifugo a 1000 g. El sobrenadante se sometio a un giro adicional a 150 kg. El sobrenadante de este giro se utilizo para preparar una fraccion soluble Tris de las protemas. El granulado de 1000g se resuspendio y se uso para preparar una fraccion de cuerpos de Lewy. Cuerpos de Lewy se purificaron por inmunoprecipitacion en perlas magneticas que llevan anticuerpos anti-sinuclema. El precipitado se extrajo con 7 M Urea 2 M Tiourea/4% CHAPS. La forma unida se extrajo de nuevo con Urea/Tiourea/CHAPS. Los extractos de este etapa y la extraccion anterior se reunieron despues y se analizaron mediante 2D PAGE e inmunotransferencia. La forma unida estaba sujeto a una extraccion adicional con acido formico al 90%. El extracto se almaceno diluido a acido formico al 9%. Despues, el extracto se analizo por SDS PAGE y RP-HPLC.

[0109] Especies de sinuclema se resolvieron en geles 2-D y se detectaron en transferencias de Western. Especies de alfa-sinuclema multiples, incluyendo especies fosforiladas y truncadas, estaban presentes tanto en LBs como en fraccion de cerebro soluble. Los truncamientos predominantes eran en la region C-terminal de la alfa-sinuclema en aproximadamente los aminoacidos 120-125. Tambien se observo un fragmento mas grande adicional escindido cerca del extremo C-terminal. No se detecto beta o gamma-sinuclema en el SIP a pesar de haberse encontrado en la fraccion de protema soluble. La alfa-sinuclema en la preparacion LB difena de la de la fraccion soluble en que tema divisiones adicionales C-terminal, y que, en general las especies de alfa-sinuclema truncadas fueron enriquecidas en el LBS en relacion con la fraccion de protema soluble. Ademas, multiples especies de alfa- sinuclema de mayor masa molecular, aproximadamente 25-35 kDa, se detectaron solo en la preparacion LB. Los fragmentos C-terminal truncados son del mismo tamano que los observados en el modelo de raton transgenico del Ejemplo 1 que indica un papel en la patogenesis de la enfermedad.

[0110] Figs. 6A, B, C muestra extractos Tris sondeadas con diferentes anticuerpos, sujetos a electroforesis en gel 2D y se sometieron a transferencia de Western. Las manchas oscuras presentes hacia la izquierda de las tablas representan alfa-sinuclema de longitud completa. La caractenstica mas notable es de cuatro puntos en el grafico Syn-1 que estan ausentes en el grafico 8A5. Estos cuatro puntos representan formas truncadas de la alfa-sinuclema que son incapaces de unir el anticuerpo 8A5 debido a la falta de un aminoacido C-terminal. Estos truncamientos corresponden aproximadamente a las formas de SN entre 1-120 y 1-125. Varios puntos adicionales son vistos por debajo y adyacente a los lugares de la alfa-sinuclema de longitud completa. Las manchas debajo de los puntos de longitud completa probablemente representan truncamientos de menor importancia de C-terminal (es decir, sinuclema 1-X, donde X es 130-139). El punto adyacente a los puntos de longitud completa pero a la derecha representan una delecion de menor importancia de N-terminal (debido a la falta de este punto en la transferencia con ELADW43).

[0111] Figs. 7A, B, C, D muestran transferencias con anticuerpos adicionales. Los cuatro puntos estan presentes con 5C12 (109-120). Dos de los puntos estan presentes con ELADW47 (118-123) y los puntos estan ausentes con LB509 (115-123). Las manchas pueden diferir entre sf tanto en peso molecular como en la presencia o ausencia de la modificacion postraduccional, tal como la nitracion o fosforilacion. Estos resultados fijan los sitios de escision dentro de aproximadamente los aminoacidos 120-125 de la alfa-sinuclema. Tambien son notables varios puntos ligeramente por debajo (peso molecular inferior) o a la derecha (pH mas alto) que los puntos de sinuclema no modificados. Estos probablemente representan formas de sinuclema que se han sometido a un pequeno grado de truncamiento y/o diferente modificacion postraduccional en relacion con los puntos principales.

[0112] Fig. 8 resume los sitios de escision con relacion a los epftopos ligados por anticuerpos utilizados en la transferencia de Western.

[0113] Las Figs. 9A, B comparan las protemas Tris solubles con protemas extrafdas de cuerpos de Lewy por electroforesis 2D y transferencias Western. La mancha de transferencia Tris de la izquierda muestra cuatro puntos en peso molecular mas bajo que representan formas truncadas de la alfa-sinuclema (probablemente en el rango de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aminoacidos 1-120 5o 1-125). Estos son de intensidad relativamente baja en comparacion con los puntos representatives de alfa-sinuclema de longitud completa. La transferencia de protemas a partir de cuerpos de Lewy muestra mas manchas representativas de formas truncadas de alfa-sinuclema en el intervalo de 1-120 a 1-125. Sin embargo, estos son de mayor intensidad en relacion con los puntos representativos de alfa-sinuclema de longitud completa. Tambien, son evidentes dos manchas que migran mas rapidamente que alfa-sinuclema de longitud completa pero mas lentamente que la coleccion de puntos en la parte inferior de la mancha de transferencia. Estos puntos representan probablemente truncamientos en el rango de 1-X en la que X es 130-139 aminoacidos.

[0114] Figs. 10A, B, C, D muestran las inmunotransferencias de protemas a partir de cuerpos de Lewy a las que se volvio a sondear con diferentes anticuerpos de C-terminal. Todos los puntos aparecen con Syn-1 (91-96) y 5C12 (109-120). Con ELADW47, el punto funcionando a la velocidad mas rapida y la posicion mas basica de las manchas Syn-1 y 5C12 no se encuentra. En la transferencia LB509, todas las manchas de movimiento mas rapido/mas basicas en las otras manchas faltan o son debiles. La ausencia o reduccion de la intensidad de ciertos puntos en las transferencias ELADW47 y LB509 indica que estos puntos representan formas truncadas de la alfa-sinuclema y son consistentes con la escision que se produce aproximadamente entre los aminoacidos 120 y 125.

3. Deteccion de alfa-sinuclema agregada en un animal transgenico

[0115] Los animales transgenicos son sacrificados y los cerebros se retiran para el analisis neuroqmmico y neuropatologico Brevemente, el hemi-cerebro derecho se congela y se homogeneiza para las determinaciones de la inmunorreactividad de la alfa-sinuclema humana agregada y no agregada por transferencia Western (Masliah et al., Science (2000) 287:1265). El hemi-cerebro izquierdo se fija en 4% de paraformaldetndo, en serie seccionada en el vibratome para inmunocitoqmmica y analisis ultraestructural.

[0116] Las secciones de cerebro se inmunotineron con un anticuerpo policlonal de conejo contra la alfa-sinuclema humana (1: 500). Despues de una incubacion durante la noche a 4°C, las secciones se incuban con anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado seguido de Avidina D-peroxidasa de rabano (HRP) complejo (1: 200, ABC Elite, Vector). La reaccion se visualizo con 0,1% 3,3 -tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (DAB) en 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) con 0,001% de H2O2 y secciones se montaron en portaobjetos bajo Entellan. Los niveles de inmunorreactividad se evaluaron semi-cuantitativamente por densitometna optica usando el Quantimet 570C. Estas secciones tambien se estudian por analisis de imagen para determinar los numeros de inclusiones inmunorreactivas de alfa-sinuclema y esta medida fiable de la agregacion de alfa-sinuclema actua como un mdice valioso de los efectos de anti- agregacion (Masliah et al Science (2000) 287:1265).

[0117] El analisis de los patrones de neurodegeneracion se logra mediante el analisis de densidades sinapticas y dendnticas en el hipocampo, la corteza frontal, corteza temporal y los ganglios basales utilizando secciones de vibratoma doble inmunomarcadas para sinaptofisina y asociadas a microtubulos de protema 2 (mAP2) y se visualizaron con LSCM. El analisis adicional de la neurodegeneracion se consigue mediante la determinacion de la inmunoreactividad de tirosina hidroxilasa (TH) en el caudoputamen y la sustancia negra (SN) como se describe previamente (Masliah, et al. (2000)). Se obtuvieron imagenes de las secciones con el LSCM y cada imagen individual se procesa interactivamente de tal modo que se incluyen los terminales TH-inmunorreactivos que muestran la intensidad de los pfxeles dentro de un intervalo lineal. Una escala se ajusta para determinar la relacion de pixel a pm. A continuacion, esta informacion se utiliza para calcular el area de % de la neuropila cubierta por terminales TH-inmunoreactivos. Estas mismas secciones tambien se utilizan para evaluar el numero de neuronas TH en el SN.

4. Analisis de la alfa-sinuclema en pacientes LBD

[0118] Para determinar que especies de a-sinuclema se enriquecen en tejido de la enfermedad o son unicas a el, hemos examinado muestras de cerebro de pacientes con atrofia multisistemica (MSA) y mutacion de la enfermedad de Parkinson familiar (A53T; Contursi). Fracciones de partmulas de MSA y cerebro de Contursi se prepararon por homogeneizacion de tejido cerebral en Tris 50 mM, NaCl 140 mM y, o bien 1% de Triton (MSA) o 0,1% de NP40 (Contursi) respectivamente emparejadas por edad, pacientes de control ("normales") se prepararon identicamente al cerebro con la enfermedad. Las muestras se analizaron en transferencias de Western de geles de 1-D y mediante ELISA tal como se describe a continuacion, y tambien en los geles 2-D. Se analizo la parte de la fraccion de partmulas. El resto se hizo girar. Tambien se analizo el sobrenadante. El sedimento se extrajo en urea de 7 M. Se analizo el sobrenadante de esta extraccion. El granulado se extrajo adicionalmente en urea de 7 M /1% de SDS. Se analizo el sobrenadante. Transferencias de Western utilizando un anticuerpo para detectar alfa-sinuclema total o a espedficamente alfa-sinuclema fosforilada en la posicion 129 se muestran en la Fig. 11.

[0119] La sinuclema se fracciono de manera diferente en Contursi frente al cerebro control. La mayor parte de la sinuclema en el cerebro normal era soluble despues de la homogeneizacion en Tris tamponada sacarosa, pero casi toda la sinuclema en el cerebro Contursi requirio urea plus SDS para la solubilizacion sugiriendo una enorme cantidad de cuerpos de Lewy en este paciente. La sinuclema en el paciente Contursi era notablemente diferente de la del paciente de control en la cantidad de la fosforilacion Ser 129. Solo una pequena cantidad de a-sinuclema fosforilada se detecto en el paciente de control, mientras que el paciente Contursi tema una cantidad

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

extremadamente grande de fosfo-sinuclema por comparacion en las transferencias Western. Por lo tanto, la insolubilidad de sinuclema en el cerebro Contursi se asocio con un gran aumento en la fosforilacion de sinuclema en ser 129. La a-sinuclema en el paciente Contursi tambien difirio de la del cerebro normal en la distribucion de los truncamientos de C-terminal. a-Sinuclema truncada por C-terminal se observo tanto en fraccion de control como partmulas de cerebro Contursi. Sin embargo, todos los truncamientos detectables eran muy insolubles (urea/extracto de SDS) en el paciente Contursi, mientras que en el cerebro de control eran solubles (extracto de sucrosa tamponado tris). El enriquecimiento de la sinuclema truncado por C-terminal en una fraccion enriquecida por LB de un paciente Contursi esta de acuerdo con nuestro descubrimiento de enriquecimiento de sinuclema truncada por C- terminal en EDCL LBs. El cerebro MSA tambien se enriquecio en fosfo (ser 129)-a-sinuclema revelo truncamiento C- terminal y una abundancia de fosforilacion y otras modificaciones acidas tambien observadas en LBs. Los altos niveles de fosfo (ser 129) tambien se observaron en el cerebro de un paciente con relacion EDCL a un control sin enfermedad. En un experimento separado, mayores niveles de fosfo (ser 129) (aproximadamente 30% mayor) tambien se observaron en celulas PEAK transfectadas con alfa-sinuclema que lleva una mutacion A53T relativa con las celulas PEAK transfectadas con alfa-sinuclema humana de tipo salvaje.

5. Analisis de comportamiento en un animal transgenico

[0120] Para la actividad locomotora, los ratones se analizan durante 2 dfas en el rotarod (San Diego) Instruments, San Diego, CA), como se ha descrito previamente (Masliah, et al. (2000)). En el primer dfa los ratones estan capacitados para 5 pruebas: la primera a 10 rpm, la segunda a 20 rpm y la tercera a la quinta a 40 rpm. En el segundo dfa, los ratones se ensayan para 7 ensayos a 40 rpm cada uno. Los ratones se colocan individualmente en el cilindro y la velocidad de rotacion se aumenta de 0 a 40 rpm durante un penodo de 240 seg. El penodo de tiempo que los ratones permanecen en la varilla (Latencia de cafda) se registra y se utiliza como una medida de la funcion motora.

[0121] Los ratones se ensayaron para la capacidad cognitiva en el laberinto de agua de Morris (Morris, Learn Motivat 12;. 239-260 (1981)). En este procedimiento, el animal se coloca en una piscina circular llena de agua, con una plataforma de escape sumergida justo debajo de la superficie del agua. Un marcador visible se coloca en la plataforma para que el animal pueda encontrarlo navegando hacia una senal visual proximal. Como alternativa, se dara una forma mas compleja de la prueba en la que no hay senales formales para marcar la ubicacion de la plataforma para los animales. De esta forma, el animal debe aprender la ubicacion de la plataforma con respecto a las senales visuales distales. La longitud de tiempo que el animal permanece en el agua esta inversamente relacionado con su capacidad cognitiva.

6. Analisis de los agregados de fragmentos de alfa-sinuclema en una linea celular

[0122] Celulas neuronales GT1-7 (Hsue et al Am. J. Pathol. 157: 401-410 (2000)) se transfectan con un vector de expresion pCR3.1-T (Invitrogen, Carlsbad, CA) que expresa un fragmento truncado de alfa-sinuclema como se describio anteriormente murino alfa-sinuclema y en comparacion con las celulas transfectadas con el vector de expresion solo. Celulas transfectadas con el vector solo tienen una apariencia fibroblastica mientras que las celulas transfectadas con alfa-sinuclema se redondean, con cuerpos de inclusion en la superficie celular visible a traves tanto de microscopfa de barrido confocal como de la luz. Celulas GT1-7 transfectadas se pueden utilizar para agentes de barrido para la actividad en la limpieza de inclusiones de sinuclema.

[0123] Los ejemplos anteriores son solo ilustrativos y no definen la invencion; otras variantes seran facilmente evidentes para personas de experiencia ordinaria en la tecnica. El alcance de la invencion esta abarcado por las reivindicaciones de cualquier patente que emane de este documento.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reivindicaciones

1. Un anticuerpo que se une espedficamente a un fragmento 1-122 o 1-119 de la alfa-sinuclema, sin unirse espedficamente a alfa-sinuclema de longitud completa como se define en SEQ ID n° 1, o un fragmento que induce este anticuerpo en el que el fragmento que induce el anticuerpo tiene menos de 20 aminoacidos de la alfa-sinuclema e incluye el C-terminal del fragmento 1-122 o 1-119 de la alfa-sinuclema.
2. El anticuerpo de la reivindicacion 1 que es un anticuerpo humano o humanizado, preferiblemente de isotipo IgG1 humano.
3. El anticuerpo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, o el fragmento que induce el anticuerpo de la reivindicacion 1, para uso en el tratamiento o la profilaxis de la enfermedad de cuerpos de Lewy.
4. El anticuerpo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 para su uso en el diagnostico de la presencia o la susceptibilidad a una LBD en el que el anticuerpo es para ser administrado a un paciente y el nivel de union del anticuerpo en el paciente se va a determinar, en el que un mayor nivel de union relativa a un nivel de lmea de base en los individuos no enfermos indica la presencia o la susceptibilidad a la LBD.
5. Un fragmento de longitud completa alfa-sinuclema como se define en SEQ ID n° 1, que es la alfa-sinuclema 1-122 o 1-119.
6. El fragmento de la reivindicacion 5, en donde el fragmento de alfa-sinuclema lleva una mutacion asociada con una enfermedad hereditaria de Cuerpos de Lewy (LBD), opcionalmente una mutacion A53T.
7. Un fragmento de la alfa-sinuclema tal como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6

ya sea en combinacion con un adyuvante que aumenta una respuesta inmune que comprende anticuerpos al fragmento, o unido a un portador que forma una protema de fusion, donde el vehfculo aumenta una respuesta inmune que comprende anticuerpos al fragmento.
8. Un metodo de deteccion in vitro para un agente que tiene una actividad farmacologica util para tratar una LBD que comprende:

la puesta en contacto del agente con un fragmento de la alfa-sinuclema como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6; y

la determinacion de la tasa o extension de la agregacion del fragmento de la alfa-sinuclema,

en el que una reduccion en la tasa o grado de agregacion respecto a un control que carece del agente indica que

el agente tiene la actividad farmacologica.
9. Un metodo in vitro de deteccion de un agente para una actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD, que comprende:

la puesta en contacto de una celula que expresa la alfa-sinuclema y el procesamiento de la alfa-sinuclema en un fragmento tal como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 con dicho agente; y determinar un nivel del fragmento en la celula con relacion a un nivel de lmea de base en el mismo tipo de celula en ausencia del agente,

una reduccion en el nivel del fragmento en relacion con la lmea de base que indica que el agente tiene la actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD;

donde la celula es preferiblemente una celula humana, mas preferiblemente una celula neuronal o una celula dopaminergica.
10. Un metodo de deteccion de un agente que tiene una actividad farmacologica util para el tratamiento de un LBD, que comprende la puesta en contacto de un animal transgenico no humano que expresa un fragmento de la alfa- sinuclema como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 con el agente; y

determinar un nivel de formas agregadas del fragmento en el cerebro del animal transgenico en relacion con un nivel de lmea de base de formas agregadas del fragmento en un animal transgenico comparable en ausencia del agente, una reduccion en el nivel del fragmento de formas agregadas relativo a la lmea de base que indica que el agente tiene una actividad farmacologica util en el tratamiento de un LBD, en el que el animal transgenico es preferiblemente un raton o un Drosophila.
11. Un procedimiento de deteccion de un agente para una actividad farmacologica util para el tratamiento de un LBD, que comprende

la puesta en contacto de un animal transgenico no humano que tiene un transgen que expresa alfa-sinuclema y el procesamiento de la alfa-sinuclema en un fragmento tal como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 con el agente; y

determinar un nivel del fragmento en una celula neuronal con relacion a un nivel de lmea de base en ausencia del agente,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

una reduccion en el nivel de los fragmentos con respecto a la lmea de base que indica que el agente tiene la actividad farmacologica util para tratar el LBD.
12. Un animal transgenico no humano, preferiblemente un raton o Drosophila, que tiene un genoma que comprende un transgen que comprende:

un promotor unido operativamente a un segmento de acido nucleico que codifica un fragmento de la alfa-sinuclema como se define en una cualquiera de la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6,

en donde la expresion del fragmento en el animal transgenico dispone el animal para desarrollar al menos una caracteristica de un LBD,

en el que el promotor es preferiblemente un promotor PDGF, o

en el que al menos una caractenstica es preferiblemente un deterioro de la funcion motora o un deterioro de la funcion cognitiva.
13. Un metodo in vitro de deteccion de presencia o la susceptibilidad a un LBD en un paciente, que comprende:

la deteccion de un nivel de un fragmento de la alfa-sinuclema como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 en una muestra de lfquido cefalorraqrndeo,

un nivel mayor que un nivel de lmea de base en los individuos no enfermos que indican la presencia o la susceptibilidad a LBD.
14. Un metodo de deteccion para una proteasa que escinde alfa-sinuclema intacta para formar un fragmento como se define en la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 que comprende:

la identificacion de un inhibidor de la proteasa;

la puesta en contacto del inhibidor con un extracto celular o tejido que contiene la proteasa, en el que la proteasa

se une al inhibidor; y

la liberacion de la proteasa del inhibidor,

opcionalmente en el que el inhibidor es un peptido de alfa-sinuclema que comprende un segmento contiguo de al menos 5 residuos de alfa-sinuclema intacta entre las posiciones 115 y 130, preferiblemente en el que el peptido comprende un segmento contiguo de al menos 5 residuos entre las posiciones 118 y 122, mas preferiblemente en donde al menos uno de los residuos es un analogo de estado de transicion.