CN104271599A - 使用抗m-csf抗体治疗炎性疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体及其抗原结合部分，其特异性结合M-CSF，优选地人M-CSF，并抑制M-CSF。本发明还涉及人抗M-CSF抗体及其抗原结合部分。本发明的抗体是嵌合抗体、双特异性抗体、衍生化抗体、单链抗体或是融合蛋白的一部分。本发明还涉及衍生自人抗M-CSF抗体的分离的重链和轻链免疫球蛋白和编码此类免疫球蛋白的核酸分子。本发明还涉及制备人抗M-CSF抗体、包含这些抗体的组合物的方法，以及使用所述抗体和组合物进行诊断和治疗的方法。本发明还提供使用编码包含人抗M-CSF抗体的重链和/或轻链免疫球蛋白分子的核酸分子的基因治疗方法。本发明还涉及包含本发明的核酸分子的转基因动物和转基因植物。

Description

使用抗M-CSF抗体治疗炎性疾病的方法

相关申请

本申请要求2011年11月8日提交的美国临时申请No.61/557,175的权益，其全部内容通过引用并入本申请。

发明背景

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是称为集落刺激因子(CSF)的蛋白质家族的成员。M-CSF是分泌型的或细胞表面的糖蛋白，其由通过二硫键连接的两个亚基组成，总分子量为40-90kD(Stanley E.R.,et al.,Mol.Reprod.Dev.,46:4-10(1997))。类似于其他CSF，M-CSF由巨噬细胞、单核细胞和人关节组织细胞例如软骨细胞和滑膜成纤维细胞等应答于例如白介素-1或肿瘤坏死因子α等蛋白质而产生。M-CSF刺激多能造血前体干细胞形成巨噬细胞集落(Stanley E.R.,et al.,Mol.Reprod.Dev.,46:4-10(1997))。

M-CSF典型地结合其受体c-fms而发挥其生物学效应。c-fms含有五个细胞外Ig结构域，一个跨膜结构域和具有两个激酶结构域的细胞内结构域。M-CSF结合c-fms之后，受体发生同二聚化并启动一连串信号转导途径，包括JAK/STAT、PI3K和ERK途径。

M-CSF是单核细胞/巨噬细胞功能、活化和存活的重要调节物。多种动物模型已经证实了M-CSF参与多种疾病，包括类风湿性关节炎(RA)和癌症。巨噬细胞是RA中的关键效应细胞。已经发现RA中滑膜的巨噬细胞浸润程度与潜在的关节破坏程度密切相关。由单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞在类风湿关节中内源性产生的M-CSF作用于单核细胞/巨噬细胞系列的细胞，促进它们的存活并分化为具有骨破坏性的破骨细胞，并增强促炎性细胞功能，例如细胞毒性、过氧化物产生、吞噬作用、趋化作用和产生次级细胞因子。例如，以M-CSF处理无乳链球菌超声处理物诱导的实验性关节炎大鼠模型导致加重的病理学表现(Abd,A.H.,et al.,LymphokineCytokine Res.10:43-50(1991))。类似地，给胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型(其是一种RA模型)皮下注射M-CSF，导致RA疾病症状明显加重(Campbell I.K.,et al.,J.Leuk.Biol.68:144-150(2000))。不仅如此，对RA和其他自身免疫性疾病高度易感的MRL/lpr小鼠具有升高的基线M-CSF血清浓度(Yui M.A.,et al.,Am.J.Pathol.139:255-261(1991))。通过使用M-CSF中和性小鼠单克隆抗体显著降低了已建立的疾病的严重程度，证实了内源性M-CSF对于维持CIA是必需的这一事实(Campbell I.K.,et al.,J.Leuk.Biol.68:144-150(2000))。

对于癌症，在小鼠中用反义寡核苷酸抑制集落刺激因子，通过减慢巨噬细胞介导的ECM破坏抑制了胚胎和结肠肿瘤异种移植物的肿瘤生长(Seyedhossein,A.,et al.,Cancer Research,62:5317-5324(2002))。

M-CSF结合于c-fms并随后活化单核细胞/巨噬细胞，这在多种疾病状态中具有重要性。除了RA和癌症，M-CSF相关疾病状态的其他实例包括骨质疏松、破坏性关节炎、动脉粥样化形成、肾小球肾炎、川崎病、HIV-1感染，在这些疾病中，单核细胞/巨噬细胞和有关细胞类型发挥了作用。例如，破骨细胞类似于巨噬细胞，并在一定程度上受到M-CSF的调控。在破骨细胞成熟的初始阶段，M-CSF所诱导的生长和分化信号对于其随后在骨骼中发挥破骨活性是必需的。

破骨细胞介导的骨丢失，既可以是局灶性骨侵蚀，也可以是更加弥漫性的近关节处骨质疏松的形式，其是RA的难以解决的主要问题。这种骨丢失的后果包括关节变形、功能丧失、骨折风险增加和死亡率升高。M-CSF对于破骨细胞形成具有独特的必要性，在关节炎动物模型中实验性阻断该细胞因子成功地消除了关节破坏。已知类似的破坏途径也在其他形式的破坏性关节炎例如牛皮癣关节炎中发挥作用，并可能代表了类似的干预措施的靶点。

绝经后骨丢失继发于因雌激素缺乏所导致的破骨细胞介导的过度骨再吸收且骨形成不足的缺陷型骨重塑。在小鼠中已经发现，使用阻断性抗体体内中和M-CSF可完全防止卵巢切除术所诱导的破骨细胞数量升高、骨吸收升高和随后的骨丢失。

一些线索表明，M-CSF在动脉粥样化形成以及动脉壁机械创伤后的增殖性内膜增生中发挥核心作用。已经发现，粥样硬化病变中的所有主要细胞类型均表达M-CSF，并且暴露于氧化的脂蛋白可使之进一步上调。使用中和性c-fms抗体阻断M-CSF信号途径，降低了巨噬细胞衍生的泡沫细胞在以高脂饮食饲养的载脂蛋白E缺陷小鼠的主动脉根部的聚集。

在实验性肾小球肾炎和人肾小球肾炎中均发现，肾小球M-CSF表达与局部巨噬细胞聚集、活化和增殖共定位，并与肾小球损伤和蛋白尿的程度相关。通过使用针对其受体c-fms的抗体阻断M-CSF信号途径，显著下调了小鼠中实验性单侧输尿管结扎所诱导的肾脏炎症反应过程中的局部巨噬细胞聚集。

川崎病(KD)是一种原因不明的急性发热性小儿血管炎。其最常见和严重的并发症累及冠状血管，表现为动脉瘤扩张。川崎病的急性期，血清M-CSF水平显著升高，在静脉输注免疫球蛋白治疗后正常。巨细胞动脉炎(GCA)是一种炎性血管病变，主要出现在老年患者，其中T细胞和巨噬细胞浸润中等和大动脉壁，引起包括继发于动脉阻塞的失明和中风等临床后果。在血管病变处存在升高水平的来自巨噬细胞的炎性介质是巨噬细胞活跃参与GCA的证据。

已经报道了M-CSF导致人单核细胞来源的巨噬细胞在体外更加易感于HIV-1感染。近期研究发现，M-CSF增加了单核细胞来源的巨噬细胞被感染的频率、每个感染细胞所表达的HIV mRNA的量以及每个感染培养物所表达的原病毒DNA水平。

鉴于M-CSF在各种疾病中的作用，亟需抑制M-CSF活性的方法。

迫切需要治疗性抗M-CSF抗体。

发明内容

本发明提供分离的特异性结合人M-CSF并作为M-CSF拮抗剂的人抗体或其抗原结合部分以及包含所述抗体或部分的组合物。

本发明还提供组合物，其包含有效用于此种治疗的抗M-CSF抗体的重链和/或轻链、其可变区、或其抗原结合部分，或编码本发明的抗体、抗体链或其可变区的核酸分子，以及药用可接受载体。在某些实施方式中，所述组合物可进一步包含其他组分，例如治疗剂或诊断剂。本发明还提供诊断和治疗方法。在某些实施方式中，所述组合物以治疗或预防特定疾病或病症所需的治疗有效量使用。

本发明还提供以有效量的本发明的抗M-CSF抗体或其抗原结合部分、编码所述抗体或其重链和/或轻链、可变区或抗原结合部分的核酸治疗或预防多种疾病和病症的方法，例如但不限于，狼疮、炎症、癌症、动脉粥样化形成、神经系统疾病和心脏病。

本发明提供产生抗M-CSF抗体或其抗原结合部分的分离的细胞系，例如杂交瘤。

本发明还提供编码抗M-CSF抗体的重链和/或轻链、其可变区、或其抗原结合部分的核酸分子。

本发明提供包含所述核酸分子的载体和宿主细胞、以及重组产生由所述核酸分子编码的多肽的方法。

本发明还提供表达所述抗M-CSF抗体的重链和/或轻链或其抗原结合部分的非人转基因动物或植物。

本申请以及公开号为WO2005/030124的PCT申请PCT/US2004/029390详细描述了所述抗M-CSF抗体或其抗原结合部分、组合物、细胞系、核酸分子、载体、宿主细胞和是用所述抗M-CSF抗体治疗或预防疾病的方法，通过引用将该PCT申请的全部内容并入本申请。

附图说明

图1A和1B显示了抗M-CSF抗体随时间以剂量相关的方式降低雄猴和雌猴的总单核细胞计数。使用Abbott Diagnostics Inc.Cell Dyn system通过光散射方法确定单核细胞计数。以3.79mL/kg的剂量体积在大约5分钟时间内施用空载体或抗体8.10.3(0、0.1、1或5mg/kg)，监测施用后24小时至3周的单核细胞计数。

图1A雄猴。

图1B雌猴。

图2A和2B显示了抗M-CSF抗体处理降低雄猴和雌猴的CD14+CD16+单核细胞百分比。以3.79mL/kg的剂量体积在大约5分钟时间内施用空载体或抗体8.10.3(0、0.1、1或5mg/kg)，施用后0-21天。对每只测试的猴子，在注射8.10.3后的1、3、7、14和21天测定CD14+CD16+亚群内的单核细胞百分比。

图2A雄猴。

图2B雌猴。

图3A和3B显示了与单核细胞的测试前水平相比，使用抗体8.10.3F和抗体9.14.4I的抗M-CSF处理在所有剂量上均降低了总单核细胞的百分比改变。

图3A显示了使用抗体8.10.3F得到的实验数据。

图3B显示了使用抗体9.14.4I得到的实验数据。

图4是来自26种抗M-CSF抗体的轻链和重链可变区的推定的氨基酸序列与相应的可变区基因的种系氨基酸序列相比的序列比对。抗体序列与种系基因序列之间的差异以粗体字显示。破折号表示与种系相比无改变。每一比对中以下划线标出的序列从左到右代表FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的序列。

图4A显示了抗体252的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的残基21-127)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4B显示了抗体88的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:8的残基21-127)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4C显示了抗体100的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:12的残基21-127)与种系V_κL2,J_κ3序列(SEQ ID NO:107)之间的比对。

图4D显示了抗体3.8.3的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:16的残基23-130)与种系V_κL5,J_κ3序列(SEQ ID NO:109)之间的比对。

图4E显示了抗体2.7.3的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:20的残基23-130)与种系V_κL5,J_κ4序列(SEQ ID NO:117)之间的比对。

图4F显示了抗体1.120.1的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:24的残基21-134)与种系V_κB3,J_κ1序列(SEQ ID NO:112)之间的比对。

图4G显示了抗体252的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的残基20-136)与种系V_H3-11,D_H7-27J_H6序列(SEQ ID NO:106)之间的比对。

图4H显示了抗体88的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:6的残基20-138)与种系V_H3-7,D_H6-13,J_H4序列(SEQ ID NO:105)之间的比对。

图4I显示了抗体100的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:10的残基20-141)与种系V_H3-23,D_H1-26,J_H4序列(SEQ ID NO:104)之间的比对。

图4J显示了抗体3.8.3的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:14的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4序列(SEQ ID NO:108)之间的比对。

图4K显示了抗体2.7.3的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:18的残基20-137)与种系V_H3-33,D_H1-26,J_H4序列(SEQ ID NO:110)之间的比对。

图4L显示了抗体1.120.1的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:22的残基20-139)与种系V_H1-18,D_H4-23,J_H4序列(SEQ ID NO:111)之间的比对。

图4M显示了抗体8.10.3的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:44的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4N显示了抗体8.10.3的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:30的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ ID NO:113)之间的比对。

图4O显示了抗体9.14.4的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:28的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4P显示了抗体9.14.4的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:38的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4Q显示了抗体9.7.2的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:48的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4R显示了抗体9.7.2的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:46的残基20-136)与种系V_H3-11,D_H6-13,J_H6b序列(SEQ ID NO:115)之间的比对。

图4S显示了抗体9.14.4I的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:28的残基23-130)与种系V_κO12J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4T显示了抗体9.14.4I的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:26的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4U显示了抗体8.10.3F的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:32的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4V显示了抗体8.10.3F的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:30的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ ID NO:113)之间的比对。

图4W显示了抗体9.7.2IF的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:36的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4X显示了抗体9.7.2IF的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ IDNO:34的残基20-136)与种系V_H3-11,D_H6-13,J_H6b序列(SEQ ID NO:115)之间的比对。

图4Y显示了抗体9.7.2C-Ser的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:52的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4Z显示了抗体9.7.2C-Ser的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:50的残基20-136)与种系V_H3-11,D_H6-13,J_H6b序列(SEQ ID NO:115)之间的比对。

图4AA显示了抗体9.14.4C-Ser的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:56的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)。

图4BB显示了抗体9.14.4C-Ser的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:54的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4CC显示了抗体8.10.3C-Ser的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:60的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4DD显示了抗体8.10.3C-Ser的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:58的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ IDNO:113)之间的比对。

图4EE显示了抗体8.10.3-CG2的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:60的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4FF显示了抗体8.10.3-CG2的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:62的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ ID NO:113)之间的比对。

图4GG显示了抗体9.7.2-CG2的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:52的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4HH显示了抗体9.7.2-CG2的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:66的残基20-136)与种系V_H3-11,D_H6-13,J_H6b序列(SEQ ID NO:115)之间的比对。

图4II显示了抗体9.7.2-CG4的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:52的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4JJ显示了抗体9.7.2-CG4的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:70的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H6-13,J_H6b序列(SEQ ID NO:115)之间的比对。

图4KK显示了抗体9.14.4-CG2的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:56的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4LL显示了抗体9.14.4-CG2的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:74的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4MM显示了抗体9.14.4-CG4的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:56的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4NN显示了抗体9.14.4-CG4的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:78的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4OO显示了抗体9.14.4-Ser的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:28的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4PP显示了抗体9.14.4-Ser的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:82的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4QQ显示了抗体9.7.2-Ser的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:48的残基23-130)与种系V_κO12,J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4RR显示了抗体9.7.2-Ser的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:86的残基20-136)与种系V_H3-11,D_H6-13,J_H6b序列(SEQ ID NO:115)之间的比对。

图4SS显示了抗体8.10.3-Ser的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:44的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4TT显示了抗体8.10.3-Ser的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:90的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ ID NO:113)之间的比对。

图4UU显示了抗体8.10.3-CG4的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:60的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4VV显示了抗体8.10.3-CG4的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:94的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ ID NO:113)之间的比对。

图4WW显示了抗体9.14.4G1的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:28的残基23-130)与种系V_κO12J_κ3序列(SEQ ID NO:103)之间的比对。

图4XX显示了抗体9.14.4G1的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:102的残基20-135)与种系V_H3-11,D_H7-27,J_H4b序列(SEQ ID NO:116)之间的比对。

图4YY显示了抗体8.10.3FG1的轻链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:32的残基21-129)与种系V_κA27,J_κ4序列(SEQ ID NO:114)之间的比对。

图4ZZ显示了抗体8.10.3FG1的重链可变区的推定的氨基酸序列(SEQID NO:98的残基20-141)与种系V_H3-48,D_H1-26,J_H4b序列(SEQ ID NO:113)之间的比对。

图5显示了抗M-CSF抗体对小鼠MRL-lpr狼疮模型淋巴结病发展的影响。按照实施例所述，给小鼠(n＝10/组)施用盐水(菱形)、抗M-CSF Ab5A1(方形)、CHOCK IgG1(三角)或CTLA-4Ig(X)，3x/周，共12周，并对淋巴结病评分。^*抗M-CSF处理组显著不同于盐水(p<0.05)。^**抗M-CSF处理组显著不同于盐水和CTLA-4Ig(p<0.05)。抗M-CSF组与CHOCK IgG1处理组无显著差异(p＝0.065，6周至12周)。

图6显示了抗M-CSF抗体对小鼠MRL-lpr狼疮模型皮肤病变发展的影响。按照实施例所述，给小鼠(n＝10/组)施用盐水(菱形)、抗M-CSF Ab5A1(方形)、CHOCK IgG1(三角)或CTLA-4Ig(X)，3x/周，共12周，并对皮肤病变评分。^*抗M-CSF处理组显著不同于盐水(p<0.05)。^**抗M-CSF处理组显著不同于盐水和CTLA-4Ig(p<0.05)。抗M-CSF组与CHOCK IgG1处理组无显著差异(p＝0.065，6周至12周)。

图7显示了抗M-CSF抗体对小鼠MRL-lpr狼疮模型抗dsDNA自身抗体发展的影响。以盐水(菱形)、CTLA-4Ig(方形)、抗M-CSF Ab5A1(三角)或CHOCK IgG1同种型对照(X)处理小鼠，在4个时间点测定抗dsDNA抗体滴度。^*CTLA-4Ig显著不同于盐水和抗M-CSF(p<0.05)。^**抗M-CSF处理组显著不同于CHOCK IgG1(p<0.05)。

图8显示了抗M-CSF抗体对小鼠MRL-lpr狼疮模型肾小球核面积和C3沉积的影响。在研究结束时收集以盐水、CTLA-4Ig、抗M-CSF Ab5A1或CHOCK IgG1同种型对照处理的小鼠的肾脏，显微镜下检查肾小球核面积(左)和C3沉积免疫组织化学染色(右)。数据条形代表平均积分，短线是标准误。

图9显示了抗M-CSF抗体对小鼠NZBWF1/J狼疮模型蛋白尿发展的影响。以盐水(方形)、CHOCK IgG1同种型对照(三角)或抗M-CSF抗体(圆形)处理小鼠，使用以下量表对蛋白尿进行评分：0＝阴性；1＝微量；2＝>30mg/dL；3＝>100mg/dL；4＝>300mg/dL；5＝>2000mg/dL。图9A显示了各组的蛋白尿平均积分，每两周测定一次。图9B显示了个体小鼠第10周时的蛋白尿积分。

图10显示了抗M-CSF抗体对小鼠NZBWF1/J狼疮模型抗dsDNA抗体滴度的影响。如实施例所述，以盐水(圆形)、CHOCK IgG1同种型对照(三角)或抗M-CSF抗体(菱形)处理小鼠，通过ELISA测定抗dsDNA抗体水平。图10A显示了第6周时的抗体滴度。图10B显示了第10周时的抗体滴度。

图11显示了抗M-CSF抗体对小鼠NZBWF1/J狼疮模型血清M-CSF水平的影响。以盐水(圆形)、同种型对照(方形)或抗M-CSF(三角)处理小鼠，在研究结束时收集血清，通过特异性ELISA测定M-CSF的血清水平。

图12显示了抗M-CSF抗体对NZBWF1/J小鼠肾脏中免疫复合物沉积和巨噬细胞浸润的影响。以盐水、CHOCK IgG1对照或抗M-CSF抗体处理小鼠，条形代表每组评价肾脏免疫组织化学染色积分，短线表示标准误。

图13显示了给健康对象施用单剂量静脉注射液后平均血清抗体8.10.3F浓度随时间的变化。上图和下图分别是线性和半对数刻度。图例是以mg表示的抗体剂量。700小时后的浓度为0(低于定量低限)或代表<3subjects。

图14显示了给健康对象施用单剂量静脉注射液后抗体8.10.3F Cmax(上图)和AUC(0-∞)(下图)的数值。左侧显示了观测值；右侧显示了剂量-标准化值。圆形是个体对象，菱形是算数平均值。

图15显示了给健康对象施用单剂量100-mg静脉注射液后抗体8.10.3F(空白方形)和M-CSF(X)的平均浓度。

图16显示了给健康对象施用单剂量静脉注射液后，在研究的第28天时CD14⁺16⁺单核细胞的剂量应答。

图17显示了给健康对象施用单剂量100-mg静脉注射液后CD14⁺16⁺的时间应答。

图18显示了给健康对象施用单剂量100-mg静脉注射液后的平均抗体8.10.3F(空白方形)浓度和CD14⁺16⁺单核细胞计数(X)。

图19显示了给健康对象施用单剂量100-mg静脉注射液后的平均抗体8.10.3F浓度(空白方形)和uNTX-1(X)。

发明详述

定义和通用技术

除非特别指明，否则本发明中使用的科技术语应具有本领域人员通常理解的含义。此外，除非上下文有要求，否则单数术语应包括多个，且复数术语应包括单个。通常，涉及本申请所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的命名法和技术均是本领域熟知和常用的。

除非另有说明，本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法实施，这些常规方法描述于本说明书中所引用和讨论的各种通用的以及更加具体的参考文献中。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow and Lane Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，通过引用将这些文献并入本文。酶反应和纯化技术依照生产商的说明书，以本领域通常采用或本申请所描述的那样进行。涉及本申请所描述的分析化学、有机合成化学以及医学和药物化学的命名法和实验室流程和技术均是本领域所熟知和常用的。采用标准技术进行化合物合成、化合物分析、药物制备、制剂和递送、以及患者治疗。

除非另有说明，否则以下术语应理解为具有如下含义：

术语“多肽”涵盖天然的或人工合成的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或多聚体。

术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指其来源或者衍生来源具有如下1-4种特点的蛋白质、多肽或抗体：(1)与在其天然状态中伴随的天然关联成分不相关，(2)没有来自相同物种的其它蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，或者(4)不是天然产生的。因此，化学合成的多肽或者是在与其从中天然产生的细胞不同的细胞系统中合成的多肽是与其天然关联的成分相“分离的”。也可以通过本领域熟知的分离和蛋白质纯化技术使得蛋白质与其天然关联的成分基本上分开。

分离的抗体的实例包括使用M-CSF经亲和纯化的抗M-CSF抗体、由杂交瘤或其他细胞系体外合成的抗M-CSF抗体以及来自转基因小鼠的人抗M-CSF抗体。

当样品的至少大约60-75％呈现出单一多肽时，该蛋白质或多肽是“基本上纯的”、“基本上均质的”或者“基本上纯化的”。蛋白质或多肽可以是单体或者是多聚体。基本上纯的蛋白质或多肽可典型包含大约50％、60％、70％、80％或者90％w/w的蛋白质样品，更通常为大约95％，优选是99％以上纯的。蛋白质纯度或者均质性可以通过本领域已知的许多手段检测，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，继以本领域熟知的染料对凝胶进行染色观察到单一多肽条带。对于特定的目的，使用HPLC或其他本领域熟知的纯化技术可提供更高的分辨率。

术语“多肽片段”在本文中指的是这样的多肽，其具有氨基端和/或羧基端的缺失，但剩下的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置相同。在一些实施方式中，片段的长度为至少5、6、8或10个氨基酸。在其他一些实施方式中，片段的长度为至少14、至少20、至少50、或至少70、80、90、100、150或200个氨基酸。

术语“多肽类似物”在本文中指的是这样的多肽，其包含与氨基酸序列的一部分基本上相同的节段并具有至少一种以下特性：(1)在合适的结合条件下特异性结合M-CSF，(2)能够抑制M-CSF。

典型地，相对于正常存在的序列，多肽类似物包含保守性氨基酸取代(或插入或缺失)。类似物的长度典型地为至少20或25个氨基酸，优选地至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸或更长，且通常可与全长多肽一样长。

在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分的氨基酸取代是这样的取代：(1)其降低对蛋白水解作用的易感性，(2)其降低对氧化作用的易感性，(3)其改变形成蛋白复合物的结合亲和力，或者(4)其赋予或改变此类类似物的其他生理化学或功能特性。类似物可包括各种突变蛋白质，其序列不同于正常存在的肽序列。例如，可在正常存在的序列中造成单个或多个氨基酸取代(优选地保守性氨基酸取代)，优选地在多肽的形成分子间接触的结构域之外的部分。

保守性氨基酸取代不应明显改变亲本序列的结构特征。例如，置换的氨基酸不应改变形成亲本序列中存在的免疫球蛋白结合结构域的反向平行β折叠，或破坏亲本序列特征性的其他类型的二级结构。通常，甘氨酸和脯氨酸类似物不会被用于反向平行β折叠中。本领域已知的多肽二级结构和三级结构的实例可参见Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introductionto Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,NewYork,N.Y.(1991))；和Thornton et al.,Nature354:105(1991)，通过引用将上述各文献并入本申请。

制药业中经常将非肽类似物用作具有与模板肽相类似的特性的药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“模拟肽”。Fauchere,J.Adv.DrugRes.15:29(1986)；Veber and Freidinger,TINS p.392(1985)；和Evans et al.,J.Med.Chem.30:1229(1987)，通过引用将上述各文献并入本申请。通常借助于计算机化的分子建模而开发此类化合物。可使用结构上类似于具有治疗用途的肽的肽模拟物来产生等同的治疗或预防效果。通常，模拟肽在结构上类似范例多肽(paradigm polypeptide)(即具有所需的生物化学特性或药理学活性的多肽)，例如人抗体，但其一个或多个肽键任选地通过本领域熟知的方法由选自以下一组的键替代：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-。也可用相同类型的D-氨基酸系统地取代共有序列的一个或多个氨基酸(如D-赖氨酸代替L赖氨酸)来生产更稳定的肽。此外，可通过本领域已知的方法产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的限制性肽(constrainedpeptide)(Rizo and Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387(1992)，通过引用并入本申请)；例如通过加入能形成分子内二硫键使肽环化的内部半胱氨酸残基。

“抗体”指完整的抗体或抗原结合部分，该抗原结合部分与完整的抗体竞争特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nded.Raven Press,N.Y.(1989))(为所有目的，通过引用将其全部内容并入本申请)。可通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶或化学裂解产生抗原结合部分。在一些实施方式中，抗原结合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、dAb和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双特异抗体和包含抗体的至少一部分的多肽，该部分足以使多肽特异性结合抗原。

从N-端至C-端，成熟的轻链和重链可变结构域都包含FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区。依照Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991)),Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia et al.,Nature342:878-883(1989)的定义给各结构域分配氨基酸。

在本文中，以编号命名的抗体是与从具有相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同的抗体。例如，单克隆抗体3.8.3是与从杂交瘤3.8.3获得的抗体相同的抗体。

在本文中，Fd片段指的是由V_H和C_H1结构域组成的抗体片段；F_v片段由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成；而dAb片段(Ward et al.,Nature341:544-546(1989))由V_H结构域组成。

在一些实施方式中，抗体是单链抗体(scFv)，其中通过合成的连接序列使V_L和V_H结构域成对以形成单价分子的抗体，所述连接序列能使V_L和V_H区作为单条蛋白质链而制备(Bird et al.,Science242:423-426(1988)和Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988))。在一些实施方式中，抗体是双特异抗体，即二价抗体，其中V_H和V_L结构域在单一的多肽链上表达，但使用太短而使得同一链上的两个结构域之间不能形成配对的连接序列，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域成对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)和Poljak R.J.et al.,Structure2:1121-1123(1994))。在一些实施方式中，来自本发明的抗体的一个或多个CDR可共价或非共价地整合至分子中以使其成为特异性结合至M-CSF的免疫粘合素。在此类实施方式中，CDR可作为更大的多肽链的部分而整合，可共价地连接至另一个多肽链，或可非共价地整合。

在具有一个或多个结合位点的实施方式中，结合位点可彼此相同或不同。

在本文中，术语“人抗体”指的是其中可变区和恒定区序列是人序列的任何抗体。该术语涵盖具有源于人基因但经改变(如用以降低可能的免疫原性、增强亲和力、消除可能引起不希望的折叠的半胱氨酸等)的序列的抗体。该术语涵盖在非人细胞中重组产生的这种抗体，这可以造成抗体发生人细胞中不常见的糖基化。这些抗体可通过下文所述的多种方法制备。

术语“嵌合抗体”在本文中指的是包含来自两种或更多种不同抗体的结构域的抗体。在一个实施方式中，一个或多个CDR源自人抗M-CSF抗体。在另一实施方式中，所有的CDR源自人抗M-CSF抗体。在另一实施方式中，嵌合抗体中组合的CDR源自多于一种的人抗M-CSF抗体。例如，嵌合抗体可包含来自第一人抗M-CSF抗体的轻链的CDR1、来自第二人抗M-CSF抗体的轻链的CDR2和来自第三人抗M-CSF抗体的轻链的CDR3，而来自重链的CDR可源自一或多种其他抗M-CSF抗体。此外，框架区可以源自从中获得一或多个CDR的抗M-CSF抗体之一或源自一或多种不同人抗体。

依照本说明书的教导，本领域人员可容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选的氨基端和羧基端位于功能结构域的边界附近。通过将核苷酸序列和/或氨基酸序列数据与公共或私有序列数据库相比较，可鉴定到结构和功能结构域。优选地，使用计算机化的比较法来鉴定存在于已知结构和/或功能的其它蛋白质中的基序或推定的蛋白质构象结构域。用于鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的，见Bowie et al.,Science253:164(1991)。

术语“表面等离子共振”在本文中指的是一种光学现象，其使得能通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIACORE^TM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Swedenand Piscataway,N.J.)。进一步的描述可参见Jonsson U.et al.,Ann.Biol.Clin.51:19-26(1993)；Jonsson U.et al.,Biotechniques11:620-627(1991)；Jonsson B.et al.,J.Mol.Recognit.8:125-131(1995)；和Johnsson B.et al.,Anal.Biochem.198:268-277(1991)。

术语“K_D”指特定的抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

术语“表位”包括能特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体或以其它方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面簇例如氨基酸或糖侧链组成，并通常具有特定的三维结构特征及特定电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(如抗体)之间相互作用的所有点均线性地沿着该蛋白质的一级氨基酸序列存在。在构象表位中，相互作用点跨越蛋白质上彼此分开的氨基酸残基。当解离常数≤1mM，优选地≤100nM，且最优选地≤10nM时，称抗体特异性结合抗原。在某些实施方式中，K_D为1pM至500pM。在其他一些实施方式中，K_D在500pM至1μM之间。在其他一些实施方式中，K_D在1μM至100nM之间。在其他一些实施方式中，K_D在100mM至10nM之间。确定抗原上的所需表位之后，便可以产生针对该表位的抗体，例如采用本发明中所描述的技术。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可阐明关于合意表位的信息。根据这些信息，便可以竞争性地筛选结合同一表位的抗体。实现这一目的的方法是进行交叉竞争研究，以便找到彼此竞争结合的抗体，例如竞争结合该抗体的抗体。国际申请WO03/48731描述了基于抗体的交叉竞争而将抗体“装箱(binning)”的高通量方法。

在本文中，20个常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。见Immunology-ASynthesis(2^nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，通过引用将其并入本申请。

术语“多核苷酸”在本文中是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式。

术语“分离的多核苷酸”在本文中指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或它们的一些组合，由于其来源，该“分离的多核苷酸”具有以下1-3的特征：(1)与其中该“分离的多核苷酸”在自然界中得以发现处的全部或部分多核苷酸不关联，(2)可操纵地连接至在自然界中不与其连接的多核苷酸，或(3)在自然中不作为更大序列的一部分存在。

术语“寡核苷酸”在本文中包括通过天然存在和非天然存在的寡核苷酸键连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200碱基或更少碱基长度的多核苷酸子集。优选地，寡核苷酸的长度是10-60个碱基，最优选地，其长度是12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。虽然寡核苷酸可以是双链，如用于基因突变体的构建，但寡核苷酸通常为单链，如用于引物和探针。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。

术语“天然存在的核苷酸”在本文中包括脱氧核糖核苷酸和核糖核甘酸。术语“经修饰的核苷酸”在本文中包括具有经修饰或取代的糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”在本文中包括寡核苷酸连键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)、phosphoroamidate等。见例如，LaPlanche etal.,Nucl.Acids Res.14:9081(1986)；Stec et al.,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)；Stein et al.,Nucl.Acids Res.16:3209(1988)；Zon et al.,Anti-CancerDrug Design6:539(1991)；Zon et al.,Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,Oxford University Press,Oxford England(1991))；美国专利No.5,151,510；Uhlmann and Peyman,Chemical Reviews90:543(1990)，通过引用将这些公开内容并入本申请。如果需要，寡核苷酸可包括用于检测的标记物。

“可操纵地连接的”序列包括邻接目的基因的表达调控序列和通过反式作用控制目的基因或相隔一段距离控制目的基因的表达调控序列。术语“表达调控序列”在本文中指实现其连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。表达调控序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，包括增强蛋白分泌的序列。在不同的宿主生物体，这种调控序列的性质不同；在原核生物中，这种调控序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，这种调控序列包括启动子和转录终止序列。术语“调控序列”意在包括(最少)其存在对表达和加工处理是必需的所有成分，并还可包括其存在是有利的额外成分，例如引导序列和融合伴侣序列。

术语“载体”在本文中意指能运输已与之连接的另外的核酸的核酸分子。在一些实施方式中，载体是“质粒”，即可将额外的DNA片段连接至其中的环状双链DNA环。在一些实施方式中，载体是病毒载体，其中额外的DNA节段可连接至该病毒基因组中。在一些实施方式中，载体能在其被导入的宿主细胞中自主复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在其他一些实施方式中，载体(如非附加型哺乳动物载体)在将其导入宿主细胞后可整合至宿主细胞的基因组中，并因而可随宿主基因组一起复制。而且，某些载体能指导与它们可操纵地连接的基因的表达。此类载体在此称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。

术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)在本文中意指已经导入重组表达载体的细胞。应该理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定的对象细胞而且指这种细胞的后代。因为某些修饰由于突变或环境的影响可能发生在随后的子代，实际上，这种子代可能与亲本细胞不完全相同，但仍然包括在本文中术语“宿主细胞”的范围内。

在此涉及的术语“选择性杂交”指的是以可检测且特异性的方式结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在杂交和洗涤条件下可选择性地杂交至核酸链，所述的杂交和洗涤条件使可检测的与非特异性核酸的结合的可感知量最小化。正如本领域已知的并在此讨论的那样，可采用“高严格性”或“高度严格的”条件获得选择性杂交条件。“高严格性”或“高度严格的”条件的实例是于42℃杂交温度、在6X SSPE或SSC，50％甲酰胺，5X Denhardt试剂，0.5％SDS，100μg/ml变性的片段化鲑精DNA的杂交缓冲液中将多核苷酸与另一种多核苷酸温育12-16小时,其中可将一种多核苷酸固定至固体表面如膜上，随后，于55℃用1X SSC，0.5％SDS的洗涤缓冲液洗涤两次。也见Sambrook et al.，见上,pp.9.50-9.55.

在提及核苷酸序列的上下文中，术语“百分比序列相同性”指当第一连续序列与第二连续序列相比较达到最大对应的比对时的残基百分比。序列相同性比较的长度可超过至少约9个核苷酸、通常至少约18个核苷酸、更通常为至少约24个核苷酸、典型地为至少约28个核苷酸、更典型的为至少约32个核苷酸，并且优选地为至少约36、48或更多核苷酸的一段序列。本领域已知的可用于测量核苷酸序列相同性的不同算法有许多。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(均为Wisconsin Package Version10.0的程序,Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin)比较多核苷酸序列。FASTA，其包括如FASTA2和FASTA3程序，提供了查询序列和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列相同性(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.266:227-258(1996)；Pearson,J.Mol.Biol.276:71-84(1998)，通过引用并入本申请)。除非另外指定，使用特定程序或算法的默认参数。例如，核苷酸序列之间的百分比序列相同性可使用采用默认参数(字段大小为6和NOPAM因子用于评分矩阵)的FASTA或使用采用GCGVersion6.1所提供的默认参数的Gap来测定，在此通过引用将其并入本申请。

除非另外说明，对核苷酸序列的指代涵盖其互补链。因此，对具有特定序列的核酸分子的指代应该理解为涵盖具有其互补序列的其互补链。

术语“百分比序列相同性”指的是一个比例，以相同残基的数量占所比较的残基数量的百分数表示。

当涉及核酸或其片段时，术语“显著相似性”或“显著序列相似性”表示当以合适的核苷酸插入或删除达到与另外的核苷酸(或其互补链)最优地比对时，在至少约85％，优选地至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，如通过任何熟知的序列相同性算法测量，如上面讨论的FASTA、BLAST或Gap。

当应用于多肽时，术语“显著相同性”表示两个肽序列，当例如通过采用默认缺口权重(gap weight)的程序GAP或BESTFIT最优比对时，具有至少70％、75％、80％或85％的序列相同性，优选地至少90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。在某些实施方式中，不一致的残基位置的区别在于保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是指其中氨基酸残基由带有具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的侧链R基团的另外的氨基酸残基取代。一般而言，保守性氨基酸取代基本不会改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列由于保守取代而彼此不同的情况下，可上调百分比序列相同性以校正取代的保守性质。进行这种调节的方法是本领域人员熟知的。参见例如Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。带有具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)包含硫的侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

或者，保守性取代是在PAM250log-可能性矩阵(Gonnet et al.,Science256:1443-45(1992)，这里将其通过引用并入本申请)中具有正值的任何改变。“适度保守性”取代是在PAM250log-可能性矩阵中具有非负值的任何改变。

多肽的序列相同性通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件通过赋予不同取代、缺失和其它修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性度量而匹配序列。例如，GCG包括程序如“Gap”和“Bestfit”，可采用其程序所述的默认参数测定紧密相关的多肽如来自不同生物体物种的同源性多肽之间或野生型蛋白质和其突变型蛋白之间的序列同源性或序列相同性。见，例如GCGVersion6.1。也可以使用FASTA，采用默认或推荐的参数来比较多肽序列，见GCG Version6.1.(University of Wisconsin WI)。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列相同性(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000))。当将本发明的序列和含有大量来自不同生物体的序列的数据库相比较时，另外优选的算法是计算机程序BLAST，特别是blastp或tblastn，采用程序随带的默认参数。参见，例如，Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。

比较同源性的多肽序列的长度一般为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常为至少约24个残基，典型的为至少约28个残基，并且优选多于约35个残基。当搜索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。

在本文中，术语“标记”或“经标记的”指将另一种分子掺入抗体中。在一个实施方式中，该标记是可检测的标记，如掺入放射性标记的氨基酸或给多肽附着可通过标记的抗生物素蛋白(如，含有可通过光学或比色法检测的荧光标记或酶活性的抗生物素蛋白链菌素)检测的生物素基部分。在另一实施方式中，标记物或标记可以是治疗性的，如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的并可使用。多肽标记的实例包括但不限于：放射性同位素或放射性核素(例如，³H,¹⁴C,¹⁵N,³⁵S,⁹⁰Y,⁹⁹Tc,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I)、荧光标记(如FITC、若丹明、稀土元素荧光体)、酶标记(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由第二报道分子识别的预定的多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性试剂如钆螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔以及嘌呤霉素和其类似物或同系物。在一些实施方式中，标记由不同长度的间隔臂连接以减少可能的位阻。

在说明书和权利要求书中，“包含”应理解为意味着包括所述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

人抗M-CSF抗体及其表征

在一个实施方式中，本发明提供人源化抗M-CSF抗体。在另一实施方式中，本发明提供人抗M-CSF抗体。在一些实施方式中，人抗M-CSF抗体通过免疫非人转基因动物而产生，所述动物例如为啮齿动物，其基因组包含人免疫球蛋白基因以使得所述啮齿动物产生人抗体。

本发明的抗M-CSF抗体可包含人κ或人λ轻链或源自它们的氨基酸序列。在包含κ轻链的一些实施方式中，轻链可变区(VL)部分地由人V_κO12、V_κL2、V_κL5、V_κA27或V_κB3基因和J_κ1、J_κ2、J_κ3或J_κ4基因编码。在本发明的特定实施方式中，轻链可变区由V_κO12/Jκ3、V_κL2/Jκ3、V_κL5/Jκ3、V_κL5/Jκ4、V_κA27/Jκ4或V_κB3/Jκ1基因编码。

在一些实施方式中，M-CSF抗体的VL相对于种系氨基酸序列包含一或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，抗M-CSF抗体的V_L相对于种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一些实施方式中，对种系的这些取代中的一或多个位于轻链的CDR区。在一些实施方式中，所述相对于种系的氨基酸取代与抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的任何一或多个V_L中相对于种系的那些取代位于一或多个相同的位置。例如，抗M-CSF抗体的V_L具有一或多个与种系相比在抗体88的V_L中出现的氨基酸取代以及与种系相比在抗体252的V_L中出现的其他氨基酸取代，抗体252与抗体88使用相同的V_K基因。在一些实施方式中，所述氨基酸改变位于一或多个相同的位置，但涉及与参照抗体不同的突变。

在一些实施方式中，相对于种系的氨基酸改变出现于一或多个与抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的任一V_L的氨基酸改变相同的位置，但这些改变可代表在这些位置上相对于参照抗体中的氨基酸的保守性氨基酸取代。例如，如果这些抗体之一在特定位置相对于种系发生改变且该位置是谷氨酸，那么可以在该位置以天冬氨酸取代。类似地，如果相对于种系的氨基酸取代是丝氨酸，可以用苏氨酸取代该位置的丝氨酸。保守性氨基酸取代已在上文中讨论。

在一些实施方式中，人抗M-CSF抗体的轻链包含与抗体252(SEQ IDNO:4)、88(SEQ ID NO:8)、100(SEQ ID NO:12)、3.8.3(SEQ ID NO:16)、2.7.3(SEQ ID NO:20)、1.120.1(SEQ ID NO:24)、9.14.4I(SEQ ID NO:28)、8.10.3F(SEQ ID NO:32)、9.7.2IF(SEQ ID NO:36)、9.14.4(SEQ ID NO:28)、8.10.3(SEQ ID NO:44)、9.7.2(SEQ ID NO:48)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO:52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO:56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO:60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO:60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO:52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO:52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO:56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO:56)、9.14.4-Ser(SEQID NO:28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO:48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO:44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO:60)8.10.3FG1(SEQ ID NO:32)或9.14.4G1(SEQID NO:28)的V_L的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸取代和/或总共多达3个非保守性氨基酸取代的所述氨基酸序列。在一些实施方式中，轻链包含任一前述抗体的从CDR1起始处至CDR3结束处的氨基酸序列。

在一些实施方式中，抗M-CSF抗体的轻链至少包含种系或在此所述的抗体序列的轻链CDR1、CDR2或CDR3。在另一实施方式中，轻链可包含独立地选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的CDR1、CDR2或CDR3区，或者各自具有少于4个或少于3个保守性氨基酸取代和/或总共3个或更少的非保守性氨基酸取代的所述CDR区。在其他一些实施方式中，抗M-CSF抗体的轻链包含轻链CDR1、CDR2或CDR3，其中每一CDR独立地选自如下抗体的CDR1、CDR2和CDR3区，所述抗体具有的轻链可变区包含选自SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的V_L区氨基酸序列，或由选自SEQ ID NO:3、7、11、27、31、35、43或47的编码V_L区的核酸分子所编码的氨基酸序列。抗M-CSF抗体的轻链可包含抗体的CDR1、CDR2和CDR3区，所述抗体包含选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的V_L区的氨基酸序列或SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的V_L区氨基酸序列。

在一些实施方式中，轻链包含抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的CDR1、CDR2和CDR3区，或者各自具有少于4个或少于3个保守性氨基酸取代和/或总共3个或更少的非保守性氨基酸取代的所述CDR区。

对于重链，在一些实施方式中，重链氨基酸序列的可变区部分地由人V_H3-11、V_H3-23、V_H3-7、V_H1-18、V_H3-33、V_H3-48基因和J_H4、J_H6、J_H4b或J_H6b基因编码。在本发明的特定实施方式中，重链可变区由V_H3-11/D_H7-27/J_H6、V_H3-7/D_H6-13/J_H4、V_H3-23/D_H1-26/J_H4、V_H3-11/D_H7-27/J_H4、V_H3-33/D_H1-26/J_H4、V_H1-18/D_H4-23/J_H4、V_H3-11/D_H7-27/J_H4b、V_H3-48/D_H1-26/J_H4b、V_H3-11/D_H6-13/J_H6b、V_H3-11/D_H7-27/J_H4b、V_H3-48/D_H1-6/J_H4b或V_H3-11/D_H6-13/J_H6b基因编码。在一些实施方式中，抗M-CSF抗体的V_H相对于种系氨基酸序列含有一或多个氨基酸取代、缺失或插入(添加)。在一些实施方式中，重链可变区与种系氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个突变。在一些实施方式中，与种系氨基酸序列相比所述突变是非保守性取代。在一些实施方式中，所述突变位于重链的CDR区。在一些实施方式中，所述氨基酸改变与抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的任何一或多个V_H中与种系相比的那些突变位于一或多个相同的位置。在其他一些实施方式中，所述氨基酸改变位于一或多个相同的位置，但涉及与参照抗体不同的突变。

在一些实施方式中，重链包含抗体252(SEQ ID NO:2)、88(SEQ IDNO:6)、100(SEQ ID NO:10)、3.8.3(SEQ ID NO:14)、2.7.3(SEQ.ID NO:18)、1.120.1(SEQ.ID NO:22)、9.14.4I(SEQ ID NO:26)、8.10.3F(SEQ IDNO:30)、9.7.2IF(SEQ ID NO:34)、9.14.4(SEQ ID NO:38)、8.10.3(SEQID NO:30)、9.7.2(SEQ ID NO:46)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO:50)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO:54)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO:58)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO:62)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO:66)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO:70)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO:74)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO:78)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO:82)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO:86)、8.10.3-Ser(SEQID NO:90)8.10.3-CG4(SEQ ID NO:94)、8.10.3FG1(SEQ ID NO:98)或9.14.4G1(SEQ ID NO:102)的可变结构域(V_H)的氨基酸序列，或者具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性氨基酸取代和/或总共多达3个的非保守性氨基酸取代的所述氨基酸序列。在一些实施方式中，重链包含任一前述抗体的从CDR1起始处至CDR3结束处的氨基酸序列。

在一些实施方式中，重链包含抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的重链CDR1、CDR2和CDR3区，或者各自具有少于8个、少于6个、少于4个或少于3个的保守性氨基酸取代和/或总共3个或更少的非保守性氨基酸取代的所述CDR区。

在一些实施方式中，重链包含种系或如上所述的具有在此所述的抗体序列的抗体CDR3，并还可包含种系序列的CDR1和CDR2区，或者可包含抗体序列的CDR1和CDR2，它们各自独立地选自包含选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的重链的抗体。在另一实施方式中，重链包含在此所述的抗体序列的CDR3，并还可包含CDR1和CDR2区，它们各自独立地选自如下所述的重链可变区的CDR1和CDR2区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的V_H区氨基酸序列，或由选自SEQ ID NO:1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的编码V_H区的核酸序列所编码的氨基酸序列。在另一实施方式中，所述抗体包含如上所述的轻链和如上所述的重链。

可以进行的一种类型的氨基酸取代是改变抗体中的一或多个半胱氨酸，半胱氨酸可与另一残基具有化学反应性，例如但不限于，丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方式中，其是非规范半胱氨酸(non-canonical cysteine)的取代。取代可以出现在抗体可变结构域的框架区或恒定结构域。在另一实施方式中，半胱氨酸位于抗体的非规范区域(non-canonical region)。

可以进行的另一类型的氨基酸取代是去除抗体中的任何潜在的蛋白水解位点，特别是那些位于抗体可变结构域的CDR或框架区或者恒定结构域内的潜在的蛋白水解位点。取代半胱氨酸残基和去除蛋白水解位点可降低抗体产物的异质性并增加其均质性。另一类型的氨基酸取代是消除天冬酰胺-甘氨酸对，它们形成潜在的脱酰胺位点，这可通过改变这两个残基之一或两者而实现。

在一些实施方式中，本发明的抗M-CSF抗体的重链没有C端赖氨酸(Lewis D.A.,et al.,Anal.Chem,66(5):585-95(1994))。在本发明的各种实施方式中，抗M-CSF抗体的重链和轻链看任选地包括单一序列。

在一个方面，本发明涉及人抗M-CSF单克隆抗体和经工程化以产生所述抗体的细胞系。表1A列出了以下单克隆抗体的编码重链和轻链可变区的核酸的序列号(SEQ ID NO)以及相应的推定的氨基酸序列：单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3和9.7.2。可通过本领域人员已知的方法制备额外的变体抗体9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG48.10.3FG1或9.14.4G1。表1B列出了抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.7.2、9.14.4、8.10.3、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4和8.10.3FG1的重链、轻链以及重链和轻链分别与抗体8.10.3F的重链、轻链以及重链和轻链相比的氨基酸百分比相同性。

在另一方面，本发明涉及与单克隆抗体8,10.3F基本上类似的抗M-CSF单克隆抗体，其中所述抗体的重链或轻链或者重链和轻链的氨基酸序列与抗体8.10.3F的重链或轻链或者重链和轻链分别享有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。

表1A

表1B

抗M-CSF抗体的类别和亚类

可通过本领域已知的任何方法确定抗M-CSF抗体的类别和亚类。通常，抗体的类别和亚类可使用对特定类别和亚类的抗体具有特异性的抗体来测定。这些抗体是可从商业获得的。通过ELISA、蛋白质印迹法及其它技术能测定类别和亚类。或者，可通过测序抗体重链和/或轻链的全部或部分恒定区，将它们的氨基酸序列与各种不同类别和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列相比较，而确定抗体的类别和亚类。

在一些实施方式中，抗M-CSF抗体是单克隆抗体。抗M-CSF抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在优选的实施方式中，抗M-CSF抗体是IgG，且是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在其他优选的实施方式中，抗体是IgG2或IgG4亚类。在另一优选的实施方式中，抗体是IgG1亚类。

物种和分子选择性

在本发明的另一方面，该抗M-CSF抗体显示出物种和分子选择性。在一些实施方式中，抗M-CSF抗体结合人、食蟹猴和鼠的M-CSF。遵循本说明书的教导，可以使用本领域熟知的方法确定抗M-CSF抗体的物种选择性。例如，可使用蛋白质印迹法、FACS、ELISA、RIA、细胞增殖测定法或M-CSF受体结合测定法来确定物种选择性。在优选的实施方式中，可使用细胞增殖测定法或ELISA确定物种选择性。

在另一实施方式中，抗M-CSF抗体对M-CSF的选择性是其对GM-/G-CSF的选择性的至少100倍。在一些实施方式中，抗M-CSF抗体对M-CSF以外的其他蛋白质不显示任何可检测到的特异性结合。根据本说明书的教导，采用本领域熟知的方法，本领域人员可确定抗M-CSF抗体对M-CSF的选择性。例如可采用蛋白质印迹法、FACS、ELISA或RIA来确定所述选择性。

鉴定由抗M-CSF抗体识别的M-CSF表位

本发明提供结合M-CSF的人抗M-CSF单克隆抗体，其与以下抗体竞争结合M-CSF、交叉竞争结合M-CSF和/或结合M-CSF的相同表位和/或以相同的K_D结合M-CSF：(a)抗体，其选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1；(b)抗体，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链可变区；(c)抗体，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链可变区；(d)抗体，其包含(b)中所定义的重链可变区和(c)中所定义的轻链可变区。

可使用本领域已知的方法确定一种抗体是否与抗M-CSF抗体结合相同的表位、竞争结合、交叉竞争结合或以相同的K_D结合M-CSF。在一个实施方式中，可在饱和条件下将本发明的抗M-CSF抗体结合至M-CSF，并随后测量测试抗体结合至M-CSF的能力。如果测试抗体能与抗M-CSF抗体同时结合至M-CSF，那么该测试抗体与抗M-CSF抗体结合至不同的表位。然而，如果该测试抗体不能同时结合至M-CSF，那么该测试抗体结合的表位与该人抗M-CSF抗体结合的表位是相同的表位、重叠的表位或是非常接近的表位。可采用ELISA、RIA或FACS来进行这一实验。在优选的实施方式中，采用BIACORE^TM进行该实验。

抗M-CSF抗体对M-CSF的结合亲和力

在本发明的一些实施方式中，抗M-CSF抗体以高亲和力结合M-CSF。在一些实施方式中，抗M-CSF抗体以1x10^-7M或更低的K_D结合M-CSF。在其他优选的实施方式中，该抗体以1x10^-8M、1x10^-9M、1x10^-10M、1x10^-11M、1x10^-12M或更低的K_D结合M-CSF。在某些实施方式中，K_D为1pM至500pM。在其他一些实施方式中，K_D在500pM至1μM之间。在其他一些实施方式中，K_D在1μM至100nM之间。在其他一些实施方式中，K_D在100mM至10nM之间。在更加优选的实施方式中，抗体以与选自如下一组的抗体基本上相同的K_D结合M-CSF：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。在另一优选的实施方式中，抗体以与包含来自选自如下一组的抗体的轻链CDR2和/或重链CDR3的抗体基本上相同的K_D结合M-CSF：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。在另一优选的实施方式中，抗体以与包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链可变区或包含氨基酸序列SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链可变区的抗体基本上相同的K_D结合M-CSF。在另一优选的实施方式中，抗体以与包含具有V_L区氨基酸序列SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链可变区的CDR2且可任选地包含其CDR1和/或CDR3的抗体、或与包含具有V_H区氨基酸序列SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链可变区CDR3且可任选地包含其CDR1和/或CDR2的抗体基本上相同的K_D结合M-CSF。

在一些实施方式中，抗M-CSF抗体具有低解离速率。在一些实施方式中，抗M-CSF抗体的k_off为2.0x10^-4s^-1或更低。在其他优选的实施方式中，抗体结合M-CSF的k_off为2.0x10^-5或k_off2.0x10^-6s^-1或更低。在一些实施方式中，K_off与在此所述的抗体基本上相同，这样的抗体选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1。在一些实施方式中，抗体以与如下所述的抗体基本上相同的k_off结合M-CSF：(a)抗体，其包含选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的重链的CDR3且可任选地包含其CDR1和/或CDR2；或(b)抗体，其包含选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的轻链的CDR2且可任选地包含其CDR1和/或CDR3。在一些实施方式中，抗体以与包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链可变区的抗体、或包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链可变区抗体基本上相同的k_off结合M-CSF。在另一优选的实施方式中，抗体以与包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链可变区的CDR2且可任选地包含其CDR1和/或CDR3的抗体、或包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链可变区的CDR3且可任选地包含其CDR1和/或CDR2的抗体基本上相同的k_off结合M-CSF。

可通过本领域已知的方法确定抗M-CSF抗体与M-CSF的解离速率。可通过竞争性ELISA、RIA或表面等离子共振(例如，通过采用BIACORE^TM技术)来测定结合亲和力。可通过表面等离子共振测定解离速率。优选地，通过表面等离子共振测定结合亲和力和解离速率。更优选地，采用BIACORE^TM技术测定结合亲和力和解离速率。实施例VI举例阐述了通过BIACORE^TM技术确定抗M-CSF单克隆抗体的亲和力常数的方法。

抗M-CSF抗体抑制M-CSF的活性

抑制M-CSF与c-fms结合

在另一实施方式中，本发明提供抗M-CSF抗体，其抑制M-CSF与c-fms受体的结合并阻断或预防c-fms的活化。在优选的实施方式中，M-CSF是人的M-CSF。在另一优选的实施方式中，抗M-CSF抗体人抗体。可通过如下方法测定IC₅₀：ELISA、RIA和基于细胞的测定法例如细胞增殖测定法、全血单核细胞形态改变测定法或受体结合抑制测定法。在一个实施方式中，通过细胞增殖测定法测定，抗体或其部分抑制细胞增殖的IC₅₀为不超过8.0x10^-7M、优选地不超过3x10^-7M或更优选地不超过8x10^-8M。在另一实施方式中，通过单核细胞形态改变测定法测定的IC₅₀为不超过2x10^-6M、优选地不超过9.0x10^-7M或更优选地不超过9x10^-8M。在另一优选的实施方式中，通过受体结合测定法测定的IC₅₀为不超过2x10^-6M、优选地不超过8.0x10^-7M或更优选地不超过7.0x10^-8M。实施例III、IV和V例证了各种类型的测定法。

在另一方面，本发明的抗M-CSF抗体抑制单核细胞/巨噬细胞应答于M-CSF的细胞增殖，与不存在抗体时的细胞增殖相比，抑制至少20％、更优选地40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。

抗体和抗体产生细胞系的产生方法

免疫

在一些实施方式中，用M-CSF抗原免疫其基因组中包含部分或全部人免疫球蛋白重链和轻链基因座的非人动物而产生人抗体。在优选的实施方式中，非人动物是XENOMOUSE^TM动物(Abgenix Inc.,Fremont,CA)。可使用的另一种非人动物是由Medarex(Medarex,Inc.,Princeton,NJ)产生的转基因动物。

XENOMOUSE^TM小鼠是遗传工程化的小鼠品系，其包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大片段，且在产生小鼠抗体方面具有缺陷。参见，例如，Green et al.,Nature Genetics7:13-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。另见WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560和WO00/037504。

在另一方面，本发明提供用M-CSF抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物而从非人、非小鼠动物制备抗M-CSF抗体的方法。可使用上述文献描述的方法产生这些动物。可如美国专利5,994,619中所述对这些文献中公开的方法进行改良。美国专利5,994,619描述了用于产生新的培养的内细胞团(CICM)细胞和细胞系(其源于猪和奶牛)，以及异源DNA已经插入其中的转基因CICM细胞的方法。CICM转基因细胞可用于产生克隆的转基因胚胎、胎儿和后代。该‘619专利也描述了用于产生能将异源DNA传递至其后代的转基因动物的方法。在优选的实施方式中，非人动物是大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。

该XENOMOUSE^TM小鼠产生成人样完全人抗体库(repertoire)并产生抗原特异性人抗体。在一些实施方式中，XENOMOUSE^TM小鼠通过引入兆碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型酵母人工染色体(YAC)片段而含有约80％人抗体V基因库(repertoire)。在其他一些实施方式中，XENOMOUSE^TM小鼠进一步含有大约全部的λ轻链基因座。见Mendez et al.,Nature Genetics15:146-156(1997),Green and Jakobovits,J.Exp.Med.188:483-495(1998)和WO98/24893，将其公开内容在此通过引用并入本申请。

在一些实施方式中，含有人免疫球蛋白基因的非人动物是具有人免疫球蛋白的“小基因座(minilocus)”的动物。在小基因座方法中，通过引入来自Ig基因座的单个基因来模拟外源Ig基因座。从而，将一个或多个V_H基因、一个或多个D_H基因、一个或多个J_H基因、μ恒定区和第二恒定区(优选地γ恒定区)构成一种构建体用于插入至动物中。该方法描述于，例如，美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763，在此通过引用将其并入本申请。

在另一方面，本发明提供制备人源化抗M-CSF抗体的方法。在一些实施方式中，如下所述在允许抗体产生的条件下用M-CSF抗原免疫非人动物。从动物分离抗体产生细胞，与骨髓瘤融合以产生杂交瘤，并分离编码所需抗M-CSF抗体的重链和轻链的核酸。随后采用本领域已知的技术并如下文所述对这些核酸进行工程化处理，以降低非人序列的量，即，对抗体进行人源化以降低在人体中的免疫应答。

在一些实施方式中，M-CSF抗原是分离的和/或纯化的M-CSF。在优选的实施方式中，M-CSF抗原是人M-CSF。在一些实施方式中，M-CSF抗原是M-CSF的片段。在一些实施方式中，M-CSF片段是M-CSF的细胞外结构域。在一些实施方式中，M-CSF片段包含M-CSF的至少一种表位。在其他一些实施方式中，M-CSF抗原是细胞，所述细胞在其表面表达或过表达M-CSF或其免疫原性片段。在一些实施方式中，M-CSF抗原是M-CSF融合蛋白。M-CSF可通过已知的技术纯化自天然来源。重组M-CSF已经商品化。

可通过本领域已知的任何方法免疫动物。参见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1990。用于免疫非人动物如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域熟知的。参见，例如，Harlow and Lane，见上,和美国专利5,994,619。在优选的实施方式中，M-CSF抗原与一种佐剂一起施用以刺激免疫应答。这种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这种佐剂可通过将多肽隔离于局部沉积物中而保护多肽免于迅速分散，或它们可含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其它成分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，该免疫接种程序表将包含两次或更多次施用多肽，在数周内展开。实施例I例证了在XENOMOUSE^TM小鼠中产生抗M-CSF单克隆抗体的方法。

抗体和抗体产生细胞系的产生

用M-CSF抗原免疫动物后，可从该动物中获得抗体和/或产生抗体的细胞。在一些实施方式中，含有抗M-CSF抗体的血清可通过放血或处死动物从该动物中获得。血清可如其从动物中获得那样使用，可从该血清获得免疫球蛋白部分，或可从血清中纯化抗M-CSF抗体。

在一些实施方式中，可从分离自经免疫的动物的细胞制备产生抗体的永生化细胞系。免疫后，处死动物并使淋巴结和/或脾脏的B细胞永生化。使细胞永生化的方法包括但不限于用癌基因转染它们、用致癌病毒感染它们、将其在选择永生化细胞的条件下培养、使其接受致癌或突变化合物影响、将其与永生化细胞如骨髓瘤细胞融合、以及使肿瘤抑制基因失活。参见，例如，Harlow and Lane，见上。如果采用与骨髓瘤细胞融合的方式，骨髓瘤细胞优选地不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。使用M-CSF、它的一部分或表达M-CSF的细胞筛选永生化细胞。在优选的实施方式中，初次筛选使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定法进行。WO00/37504给出了ELISA筛选的实例，在此通过引用将其并入本申请。

如下文中进一步讨论的那样，对产生抗M-CSF抗体的细胞如杂交瘤进行选择、克隆并进一步筛选所需的特征，包括健康的细胞生长、高抗体产量及所需的抗体特征。杂交瘤可在体内在同系动物、在缺乏免疫系统的动物如裸鼠中，或在体外细胞培养物中扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域人员熟知的。

在优选的实施方式中，免疫的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，将脾脏的B细胞融合至源于与该非人动物相同物种的骨髓瘤。在更加优选的实施方式中，免疫的动物是XENOMOUSE^TM动物并且骨髓瘤细胞系是非分泌型小鼠骨髓瘤。在更加优选的实施方式中，骨髓瘤细胞系是P3-X63-AG8-653。参见，例如，实施例I。

因此，在一个实施方式中，本发明提供用于产生能产生针对M-CSF的人单克隆抗体或其片段的细胞系的方法，所述方法包括(a)用M-CSF、M-CSF的一部分或表达M-CSF的细胞或组织免疫在此描述的非人转基因动物；(b)让该转基因动物产生对M-CSF的免疫应答；(c)从转基因动物中分离B淋巴细胞；(d)使B淋巴细胞永生化；(e)建立永生化的B淋巴细胞的独立单克隆群；并(f)筛选该永生化的B淋巴细胞以鉴定针对M-CSF的抗体。

在另一方面，本发明提供产生人抗M-CSF抗体的杂交瘤。在优选的实施方式中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上描述的。在其他一些实施方式中，杂交瘤在非人、非小鼠物种如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一实施方式中，杂交瘤是人杂交瘤。

在另一优选的实施方式中，用M-CSF免疫转基因动物，从经免疫的转基因动物分离原代细胞，例如脾脏细胞或者外周血细胞，并鉴定产生对所需抗原具有特异性的抗体的独立细胞。分离来自各独立细胞的多腺苷酸化mRNA并进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，其中使用退火至至可变区序列的有义引物，例如识别大部分或全部人重链和轻链可变区基因FR1区的简并引物，以及退火至恒定区或链接区序列的反义引物。然后克隆重链和轻链可变区的cDNA，并在任何合适的宿主细胞例如骨髓瘤细胞中，作为与免疫球蛋白恒定区例如重链和κ或λ恒定区的嵌合抗体的形式表达。见Babcook,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-48,1996，通过引用将其并入本申请。然后可如在此所述的方式鉴定并分离抗M-CSF抗体。

在另一实施方式中，可使用噬菌体展示技术来提供含有对M-CSF具有不同亲和力的抗体库(repertoire)的文库。产生此类库(repertoire)不需要使得来自被免疫动物的B细胞永生化。反之，原代B细胞可直接作为DNA的来源。使用获得自例如源自脾脏的B细胞的cDNA混合物制备表达文库，例如，转染至大肠杆菌的噬菌体展示文库。测试所得细胞对M-CSF的免疫反应性。从此类文库中鉴定高亲和力人抗体的技术可参见Griffiths et al.,EMBO J.,13:3245-3260(1994)；Nissim et al.,ibid,pp.692-698和Griffiths etal.,ibid,12:725-734。最终从文库中鉴定到产生对抗原具有所需结合亲和力水平的克隆，回收编码负责此结合的产物的DNA并用于标准重组表达操作。也可使用以前操作的核苷酸序列构建噬菌体展示文库并以类似的方式筛选。通常，编码重链和轻链的cDNA独立地提供或链接形成Fv类似物用于产生噬菌体文库。

随后筛选噬菌体文库找到对M-CSF具有最高亲和力的抗体并从合适的克隆回收遗传物质。多轮次的筛选可提高所分离的初始抗体的亲和力。

在另一方面，本发明提供产生人抗M-CSF抗体的杂交瘤。在优选的实施方式中，杂交瘤是如上所述的小鼠杂交瘤。在其他一些实施方式中，杂交瘤在非人、非小鼠物种如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一实施方式中，杂交瘤是人杂交瘤。

制备抗体的核酸、载体、宿主细胞和重组方法

核酸

本发明还涵盖编码抗M-CSF抗体的核酸分子。在一些实施方式中，不同的核酸分子编码抗M-CSF免疫球蛋白的重链和轻链。在其他一些实施方式中，同一核酸分子编码抗M-CSF免疫球蛋白的重链和轻链。在一个实施方式中，核酸编码本发明的M-CSF抗体。

在一些实施方式中，所述编码轻链可变结构域的核酸分子包含人的V_κL5、O12、L2、B3、A27基因和Jκ1、Jκ2、Jκ3或Jκ4基因。

在一些实施方式中，所述编码轻链的核酸分子编码与种系氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸分子包含编码与种系序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非保守性氨基酸取代和/或1、2或3个非保守性取代的V_L氨基酸序列的核苷酸序列。取代可以在CDR区、框架区或在恒定区内。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码与种系序列相比包含一或多个变异的V_L氨基酸序列，所述一或多个变异与抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1中任一抗体的V_L中的那些变异相同。

在一些实施方式中，与种系序列相比，所述核酸分子编码抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4、8.10.3或9.7.2中任一抗体的V_L中的至少3个氨基酸突变。

在一些实施方式中，所述核酸分子包含编码单克隆抗体252(SEQ IDNO:4)、88(SEQ ID NO:8)、100(SEQ ID NO:12)、3.8.3(SEQ ID NO:16)、2.7.3(SEQ ID NO:20)、1.120.1(SEQ ID NO:24)、9.14.4I(SEQ ID NO:28)、8.10.3F(SEQ ID NO:32)、9.7.2IF(SEQ ID NO:36)、9.14.4(SEQ IDNO:28)、8.10.3(SEQ ID NO:44)、9.7.2(SEQ ID NO:48)、9.7.2C-Ser(SEQID NO:52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO:56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO:60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO:60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO:52)、9.7.2-CG4(SEQID NO:52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO:56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO:56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO:28)、9.7.2-Ser(SEQ ID NO:48)、8.10.3-Ser(SEQID NO:44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO:60)8.10.3FG1(SEQ ID NO:32)或9.14.4G1(SEQ ID NO:28)的V_L氨基酸序列或其部分的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述部分至少包含CDR2区。在一些实施方式中，核酸编码所述抗体的轻链CDR的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述部分是包含CDR1-CDR3的连续部分。

在一些实施方式中，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60之一的轻链氨基酸序列的核苷酸序列。在一些优选的实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO:3、7、11、27、31、35、43或47的轻链核苷酸序列或其部分。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码与图1所示的VL氨基酸序列或者与抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1中任一抗体的VL氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60中任一氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的V_L氨基酸序列。本发明的核酸分子包括在高严格性条件(例如如上所述的条件)下与编码SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链氨基酸序列的核酸序列、或与具有SEQ ID NO:3、7、11、27、31、35、43或47的轻链核酸序列的核酸序列杂交的核酸。

在另一实施方式中，核酸编码选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的全长轻链、或包含SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的氨基酸序列和轻链恒定区的轻链、或包含突变的轻链。此外，上所述核酸可包含SEQ ID NO:3、7、11、27、31、35、43或47的轻链核苷酸序列和编码轻链恒定区的核苷酸序列、或编码包含突变的轻链的核酸分子。

在另一优选的实施方式中，所述核酸分子编码重链可变区(V_H)，其包含人VH1-18、3-33、3-11、3-23、3-48或3-7基因序列或从其衍生的序列。在各种实施方式中，核酸分子包含人V_H1-18基因、D_H4-23基因和人J_H4基因；人V_H3-33基因、人D_H1-26基因和人J_H4基因；人V_H3-11基因、人D_H7-27基因和人J_H4基因；人V_H3-11基因、人D_H7-27基因和人J_H6基因；人V_H3-23基因、人D_H1-26基因和人J_H4基因；人V_H3-7基因、人D_H6-13基因和人J_H4基因；人V_H3-11基因、人D_H7-27基因和人J_H4b基因；人V_H3-48基因、人D_H1-26基因和人J_H4b基因；人V_H3-11基因、人D_H6-13基因和人J_H6b基因、或衍生自所述人基因的序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码与人V、D或J基因的种系氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个突变的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述突变位于V_H区。在一些实施方式中，所述突变位于CDR区。

在一些实施方式中，与种系序列相比，所述核酸分子编码与单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的V_H中的那些氨基酸突变相同的一或多个氨基酸突变。在一些实施方式中，与种系序列相比，所述核酸编码与上述单克隆抗体之一中的至少3个氨基酸突变相同的至少3个氨基酸突变。

在一些实施方式中，所述核酸分子包含核苷酸序列，其编码抗体252(SEQ ID NO:4)、88(SEQ ID NO:8)、100(SEQ ID NO:12)、3.8.3(SEQ IDNO:16)、2.7.3(SEQ ID NO:20)、1.120.1(SEQ ID NO:24)、9.14.4I(SEQID NO:28)、8.10.3F(SEQ ID NO:32)、9.7.2IF(SEQ ID NO:36)、9.14.4(SEQ ID NO:28)、8.10.3(SEQ ID NO:44)、9.7.2(SEQ ID NO:48)、9.7.2C-Ser(SEQ ID NO:52)、9.14.4C-Ser(SEQ ID NO:56)、8.10.3C-Ser(SEQ ID NO:60)、8.10.3-CG2(SEQ ID NO:60)、9.7.2-CG2(SEQ ID NO:52)、9.7.2-CG4(SEQ ID NO:52)、9.14.4-CG2(SEQ ID NO:56)、9.14.4-CG4(SEQ ID NO:56)、9.14.4-Ser(SEQ ID NO:28)、9.7.2-Ser(SEQID NO:48)、8.10.3-Ser(SEQ ID NO:44)、8.10.3-CG4(SEQ ID NO:60)8.10.3FG1(SEQ ID NO:32)或9.14.4G1(SEQ ID NO:28)的V_H氨基酸序列的至少一部分、或具有保守性氨基酸突变和/或总共3个或更少的非保守性氨基酸取代的所述序列的至少一部分。在各种实施方式中，所述序列编码一或多个CDR区、优选地CDR3区、所有3个CDR区、包括CDR1-CDR3的连续部分或完整V_H区。

在一些实施方式中，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102之一的氨基酸序列的重链核苷酸序列。在一些优选的实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO:1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重链核苷酸序列的至少一部分。在一些实施方式中，所述部分编码V_H区、CDR3区、所有3个CDR区、或包括CDR1-CDR3的连续区域。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码VH氨基酸序列，其与图4所示的V_H氨基酸序列或与SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102中任一V_H氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％,95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的核酸分子包括在高严格性条件(例如如上所述的条件)下与编码SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链氨基酸序列的核酸序列、或与具有SEQ ID NO:1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的核苷酸序列的核酸序列杂交的核酸。

在另一实施方式中，还是编码选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的抗体的全长重链、或具有SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的氨基酸序列和重链恒定区的重链、或包含突变的重链。此外，上所述核酸可包含SEQ ID NO:1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重链核苷酸序列和编码轻链恒定区的核苷酸序列、或编码包含突变的重链的核酸分子。

编码抗M-CSF抗体的完整重链或轻链或其部分的核酸分子可分离自产生该抗体的任何来源。在各种实施方式中，核酸分子可分离自来自以M-CSF免疫的动物的B细胞，或分离自源自这样的B细胞且表达抗M-CSF抗体的永生化细胞。分离编码抗体的mRNA的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook et al。mRNA可用于产生cDNA以便用于聚合酶链反应(PCR)或cDNA克隆抗体基因。在优选的实施方式中，所述核酸分子分离自杂交瘤，杂交瘤具有作为其融合伴侣之一的来自非人转基因动物的产生人免疫球蛋白的细胞。在更加优选的实施方式中，产生人免疫球蛋白的细胞分离自XENOMOUSE^TM动物。在另一实施方式中，产生人免疫球蛋白的细胞来自如上所述的非人、非小鼠转基因动物。在另一实施方式中，核酸分离自非人、非转基因的动物。分离自非人、非转基因的动物的核酸分子可用于，例如，人源化抗体。

在一些实施方式中，编码本发明的抗M-CSF抗体的重链的核酸可包含与编码任意来源的重链恒定结构域的核苷酸序列框内连接的编码本发明的V_H结构域的核苷酸序列。类似地，编码本发明的抗M-CSF抗体的轻链的核酸分子可包含与编码任意来源的轻链恒定结构域的核苷酸序列框内连接的编码本发明的V_L结构域的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，编码重链(V_H)轻链(V_L)可变结构域的核酸分子被“转换”成全长抗体基因。在一个实施方式中，编码V_H或V_L结构域的核酸分子可通过将其插入至分别已经编码重链恒定区(C_H)或轻链恒定区(C_L)的表达载体，使得V_H节段可操纵地连接至载体内的C_H节段而V_L节段可操纵地连接至载体内的C_L节段，从而转换为全长抗体基因。在另一实施方式中，编码V_H和/或V_L结构域的核酸分子通过使用标准的分子生物学技术通过连接，例如连接编码V_H和/或V_L结构域的核酸分子至编码C_H和/或C_L结构域的核酸分子而使其转换成全长抗体基因。使用编码VL和CL链的核酸分子可达到一样的结果。人重链和轻链免疫球蛋白恒定结构域基因的核酸序列是本领域已知的。参见，例如，Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.,NIH Publ.No.91-3242,1991。编码全长重链和/或轻链的核酸分子可随后由已经导入所述核酸分子的细胞表达，并可随后分离抗M-CSF抗体。

可使用核酸分子来重组表达大量抗M-CSF抗体。核酸分子还可用于产生嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘合素、二价抗体、突变抗体和抗体衍生物，如下文所述。如果核酸分子源自非人、非转基因的动物，核酸分子可用于抗体的人源化，如下文所述。

在另一实施方式中，本发明的核酸分子用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，所述核酸可作为探针用于诊断方法或作为PCR引物用于扩增可能使用的DNA区域，例如，用于分离编码抗M-CSF抗体可变结构域的其他核酸分子。在一些实施方式中，所述核酸分子是寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸来自的目标抗体的重链和轻链的高可变区。在一些实施方式中，寡核苷酸编码抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3或1.120.1的一或多个CDR的全部或部分、或在此所述的它们的变体。

载体

本发明提供包含编码本发明的抗M-CSF抗体或其抗原结合部分的重链的核酸分子的载体。本发明也提供包含编码此类抗体或其抗原结合部分的轻链的核酸分子的载体。本发明还提供包含编码融合蛋白、修饰抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。

在一些实施方式中，通过将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入至表达载体，使得基因可操纵地连接至必需的表达调控序列例如转录和翻译调控序列，从而表达本发明的抗M-CSF抗体或抗原结合部分。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。将抗体基因连接进载体中，使得载体中的转录和翻译调控序列发挥它们预期的调节该抗体基因转录和翻译的功能。选择表达载体和表达调控序列使其与使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链的基因和抗体重链的基因可插入分开的载体中。在优选的实施方式中，两种基因都插入同一表达载体。抗体基因可通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补性限制位点，或如果无限制位点则进行平端连接)插入表达载体。

方便的载体是编码功能完全的人C_H或C_L免疫球蛋白序列的载体，通过工程化造成合适的限制位点使得任何V_H或V_L序列能如上所述容易地插入和表达。在这种载体中，剪接通常发生在插入的J区的剪接供体位点和在人C区之前的剪接受体位点之间，也发生在人C_H外显子中存在的剪接区域。多腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体也能编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆进载体中使得信号肽框内连接至免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还携带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。本领域技术人员将理解表达载体的设计，包括对调节序列的选择可依赖于待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))的启动子和/或增强子，多瘤和强的哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。对于进一步的病毒调控元件和其序列的描述，见例如，美国专利No.5,168,062、美国专利No.4,510,245和美国专利No.4,968,615。用于在植物中表达抗体的方法，包括对启动子和载体的描述以及植物的转化在本领域是已知的。参见，例如，美国专利6,517,529，通过引用将其并入本申请。在细菌细胞或真菌细胞如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域熟知的。

除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，如调节该载体在宿主细胞中的复制的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于对载体已经导入其中的宿主细胞进行选择(参见例如，美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞以药物抗性，例如对G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于以甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)、新霉素耐药基因(用于G418选择)以及谷氨酸合成酶基因。

用于重组产生蛋白质的非杂交瘤宿主细胞和方法

编码抗M-CSF抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可用于转化合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法完成。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺-介导的转染、原生质体融合、电穿孔术、脂质体包囊化的多核苷酸和直接显微注射DNA至胞核。另外，核酸分子可通过病毒载体引入至哺乳动物细胞。转化细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利No.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(通过引用将这些专利并入本申请)。转化植物细胞的方法是本领域熟知的，包括如农杆菌属介导的转化、基因枪转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域熟知的。

可用作表达用宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些例如包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、A549细胞和许多其它的细胞系。通过确定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。其它可使用的细胞系是昆虫细胞系如Sf9细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入至哺乳动物宿主细胞时，可通过培养宿主细胞一段时间来产生抗体，所述的时间足以使该抗体在宿主细胞中表达，或更优选地使该抗体分泌至宿主细胞生长的培养基中。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。植物宿主细胞包括如烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和链霉菌属种类。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母、酿酒酵母和巴斯得毕赤酵母。

此外，可使用许多已知的技术增强本发明的抗体(或其其它部分)从生产细胞系中的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在一定条件下改善表达的普通方法。该GS系统在欧洲专利No.0 216 846、0256 055和0 323 997以及欧洲专利申请No.89303964.4中有完整或部分讨论。

通过不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体可能彼此具有不同的糖基化。然而，由在此提供的核酸分子编码或包含在此提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的一部分，无需考虑该抗体的糖基化状态或形式或修饰情况。

转基因动物和植物

也可通过产生以目标免疫球蛋白重链和轻链序列转基因的哺乳动物或植物而以转基因的方式产生本发明的抗M-CSF抗体，且所产生的抗体是可自其回收的形式。就在哺乳动物中转基因产生而言，抗M-CSF抗体可产生于山羊、牛或其他哺乳动物的乳中，并可从中回收。参见，例如，美国专利No.5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。在一些实施方式中，如上所述，以M-CSF或其免疫原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。在植物、酵母或真菌/藻类中制备抗体的方法描述于，例如，美国专利6,046,037和US5,959,177。

在一些实施方式中，非人转基因动物或转基因植物可通过标准转基因技术将一或多种编码本发明的抗M-CSF抗体的核酸分子导入动物或植物中而产生。参见Hogan和美国专利6,417,429，见上。用于生产转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞。转基因非人生物体可以是嵌合、非嵌合的杂合子及非嵌合的纯合子。参见，例如，Hogan et al.,Manipulatingthe Mouse Embryo:A Laboratory Manual2ed.,Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson et al.,Mouse Genetics and Transgenics:A Practical Approach,Oxford University Press(2000)；和Pinkert,Transgenic Animal Technology:ALaboratory Handbook,Academic Press(1999)。在一些实施方式中，转基因非人动物具有通过编码目标重链和/或轻链的靶向构建体所造成的靶向断裂和替换。在优选的实施方式中，转基因动物包含并表达编码特异性结合至M-CSF，优选地结合至人M-CSF的重链和轻链的核酸分子。在一些实施方式中，转基因动物包含编码修饰的抗体如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体的核酸分子。抗M-CSF抗体可在任何转基因动物中生产。在优选的实施方式中，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人转基因动物将所述编码的多肽表达于血、乳、尿、唾液、泪液、粘液和其它体液中。

噬菌体展示文库

本发明提供制备抗M-CSF抗体或其抗原结合部分的方法，其包括如下步骤：在噬菌体上合成人抗体文库，筛选含有M-CSF或其部分的文库，分离与M-CSF结合的噬菌体，并从该噬菌体获得抗体。例如，制备抗体文库用于噬菌体展示技术的方法包括如下步骤：以M-CSF或其抗原部分免疫包括人免疫球蛋白基因座的非-人动物以便引起免疫应答，由经免疫的动物提取产生抗体的细胞；由该提取的细胞分离RNA，将RNA反转录以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，并将cDNA插入噬菌体展示载体以便抗体在噬菌体上表达。可以此方式获得本发明的重组抗M-CSF抗体。

本发明的重组抗M-CSF人抗体可通过筛选重组的组合抗体文库来分离。优选地，该抗体文库为scFv噬菌体展示文库，其通过使用分离自B细胞的mRNA所制备的人V_L和V_H cDNA产生。制备及筛选此类文库的方法是本领域已知的。已有用于产生噬菌体展示文库的商品化试剂盒(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System,目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^TMphage display kit,目录号240612)。也有其它可用于产生及筛选抗体展示文库的方法及试剂(参见，例如，美国专利No.5,223,409；PCT出版物WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690；Fuchs et al.,Bio/Technology9:1370-1372(1991)；Hay et al.,Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85(1992)；Huse et al.,Science246:1275-1281(1989)；McCafferty et al.,Nature348:552-554(1990)；Griffiths et al.,EMBO J.12:725-734(1993)；Hawkinset al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)；Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)；Gram et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580(1992)；Garradet al.,Bio/Technology9:1373-1377(1991)；Hoogenboom et al.,Nuc.Acid Res.19:4133-4137(1991)；和Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982(1991))。

在一个实施方式中，为分离具有所需特性的人抗M-CSF抗体，首先采用在此所述的人抗M-CSF抗体来选择对M-CSF具有类似结合活性的人重链及轻链序列，其使用PCT出版物WO93/06213中描述的表位印记法(epitope imprinting)。用于此方法的抗体文库优选为scFv文库，其制备及筛选描述于PCT出版物WO92/01047,McCafferty et al.,Nature348:552-554(1990)；和Griffiths et al.,EMBO J.12:725-734(1993)。scFv抗体文库优选使用人M-CSF作为抗原来筛选。

一旦选定最初的人V_L和V_H结构域，即可进行"混合及匹配"试验，其中筛选不同对的最初选择的V_L和V_H节段的M-CSF结合情况，以选出优选的V_L/V_H配对组合。此外，为进一步改善抗体品质，可对优选的V_L/V_H对的V_L和V_H节段进行随机突变，优选在V_H和/或V_L的CDR3区内，其方法类似于体内导致天然免疫应答过程中抗体的亲和力成熟的体细胞突变过程。这种体外亲和力成熟可通过使用分别互补于V_H CDR3或V_L CDR3的PCR引物扩增V_H和V_L结构域而实现，其中该引物的某些位置已经掺入四种核苷酸碱基的随机混合物，以使得所得PCR产物所编码的V_H和V_L节段中的V_H和/或V_L CDR3区中导入了随机突变。可再次就其M-CSF结合性对这些随机突变的V_H和V_L节段进行筛选。

从重组免疫球蛋白展示文库筛选并分离本发明的抗M-CSF抗体之后，可回收来自展示包装(如来自噬菌体基因组)的编码选定抗体的核酸，并通过标准重组DNA技术亚克隆入其它表达载体。若需要时，该核酸可进一步如下所述加以操作以产生其它本发明的抗体形式。为表达通过筛选组合文库所分离的重组人抗体，如上所述将编码抗体的DNA克隆入重组表达载体并导入哺乳动物宿主细胞中。

类别转换

本发明的另一方面提供一种方法，用于将抗M-CSF抗体的类别或亚类转换为另一种类别或亚类。在一些实施方式中，使用本领域所熟知的方法来分离编码V_L或V_H但不包含任何编码C_L或C_H的核酸序列的核酸分子。接着将该核酸分子可操作地连接至编码来自所需免疫球蛋白类别或亚类的C_L或C_H的核酸序列。其可通过使用包括C_L或C_H链的载体或核酸分子而实现，如前所述。例如，原本为IgM的抗M-CSF抗体可转换类别成为IgG。此外，类别转换可用于将IgG亚类转换为另一种，如由IgG1转换为IgG2。另一制备包括所需同种型的本发明的抗体的方法包括以下步骤：分离编码抗M-CSF抗体的重链的核酸及编码抗M-CSF抗体的轻链的核酸，分离编码V_H区的序列，连接V_H序列至编码所需同种型的重链恒定结构域的序列，在细胞中表达轻链基因及重链构建体，并收集具有所需同种型的抗M-CSF抗体。

在一些实施方式中，本发明的抗M-CSF抗体的重链第228位(根据欧洲编号惯例)的丝氨酸变为脯氨酸。因此，IgG4的F_C区中的CPSC亚序列变为IgG1中的亚序列CPPC(Aalberse,R.C.and Schuurman,J.,Immunology,105:9-19(2002))。例如，位于SEQ ID NO:46的残基243(其相当于欧洲编号惯例中的残基228)的丝氨酸可变为脯氨酸。类似地，位于SEQ ID NO:38的残基242(其相当于欧洲编号惯例中的残基228)的丝氨酸可变为脯氨酸。在一些实施方式中，IgG4抗体的框架区可回复突变成为种系构架序列。某些具体实施方式同时包括构架区的回复突变及FC区的丝氨酸变为脯氨酸。参见，例如，表1A中的SEQ ID NO:54(抗体9.14.4C-Ser)和SEQ ID NO:58(抗体8.10.3C-Ser)。

去免疫化的抗体

另一产生具有减低免疫原性的抗体的方法为抗体去免疫化。在本发明的另一方面，抗体可使用描述于如PCT出版物WO98/52976和WO00/34317(其全文以引用的方式并入本申请)的技术来进行去免疫化。

突变的抗体

在另一实施方式中，核酸分子、载体及宿主细胞可用于制备突变的抗M-CSF抗体。该抗体可于重链和/或轻链的可变结构域内产生突变，如改变抗体的结合特性。例如，可于一个或多个CDR区中产生突变以增加或降低抗体对M-CSF的K_D，以增加或降低k_off，或者改变抗体的结合特异性。定点突变技术是本领域中所熟知的。参见，例如，Sambrook et al.和Ausubel etal.，见上。在优选的实施方式中，与种系相比，已知突变发生在抗M-CSF抗体的可变结构域内要改变的氨基酸残基位置。在另一实施方式中，与种系相比，已知一或多个突变发生在单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的可变结构域的CDR区或框架区内或恒定结构域内要改变的氨基酸残基位置。在另一实施方式中，与种系相比，已知一或多个突变发生在选自SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98或102的重链氨基酸序列或其重链核苷酸序列为SEQ ID NO:1、5、9、25、29、33、37、45、97或101的重链氨基酸序列的可变结构域的CDR区或框架区内要改变的氨基酸残基位置。在另一实施方式中，与种系相比，已知一或多个突变发生在选自SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、44、48、52、56或60的轻链氨基酸序列或其轻链核苷酸序列为SEQ ID NO:3、7、11、27、31、35、43或47的轻链氨基酸序列的可变结构域的CDR区或框架区内要改变的氨基酸残基位置。

在一个实施方式中，构架区已经突变以便所产生的构架区具有对应的种系基因的氨基酸序列。突变发生于构架区或恒定区以增加抗M-CSF抗体的半衰期。请见如PCT出版物WO00/09560，通过引用将其并入本申请。也可在构架区或恒定区中产生突变以改变抗体的免疫原性，以提供共价或非共价结合另一分子的位点，或改变如补体结合的特性、FcR结合及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。根据本发明，单一抗体可在可变结构域的一或多个CDR或框架区内或者是恒定结构域内具有突变。

在一些实施方式中，与突变前的抗M-CSF抗体相比，在突变的抗M-CSF抗体的V_H或V_L结构域中有由1至8个(包含其间任何数字)氨基酸突变。上述任一情况中，突变可发生于一个或多个CDR区。而且，任一突变都可为保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，恒定区含有不超过5、4、3、2或1个氨基酸变化。

修饰的抗体

在另一实施方式中，可产生融合抗体或免疫粘附素，其包括连接至另一多肽的本发明的抗M-CSF抗体的全部或部分。在优选的实施方式中，仅抗M-CSF抗体的可变结构域连接至多肽。在另一优选的实施方式中，抗M-CSF抗体的V_H结构域连接第一多肽，而抗M-CSF抗体的V_L结构域连接第二多肽，第二多肽与第一多肽的关联方式使得V_H和V_L结构域能彼此相互作用从而形成抗体结合位点。在另一优选的实施方式中，V_H结构域通过接头与V_L结构域分离，以便V_H和V_L结构域可彼此互相作用(请见下文有关单链抗体的部分)。V_H-接头-V_L抗体再连接至目的多肽。融合抗体可用以将多肽指引向表达M-CSF的细胞或组织。该多肽可为一种治疗剂，如毒素、生长因子或其它调节蛋白质，或者其可为诊断剂，例如易于观察的酶，如辣根过氧化物酶。此外，产生的融合抗体中两个(或多个)单链抗体可互相连接。这对于希望在单一多肽链上产生二价或多价抗体或者希望产生双特异性抗体而言是有用的。

为产生单链抗体(scFv)，将编码V_H和V_L的DNA片段可操作地连接至另一编码柔性接头的片段(如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃)，使得V_H和V_L序列可作为连续的单链蛋白质表达，且该V_L和V_H结构域以柔性接头连结。参见，例如，Bird et al.,Science242:423-426(1988)；Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)；McCafferty et al.,Nature348:552-554(1990)。单链抗体可为单价(若仅使用单一V_H和V_L)、二价(若使用两种V_H和V_L)或多价(若使用多于两种V_H和V_L)。可产生能与M-CSF及另一分子特异性结合的双特异性或多价抗体。

在其他一些实施方式中，可使用编码抗M-CSF抗体的核酸分子制备其它经修饰的抗体。例如，可依照说明书教导采用标准的分子生物技术来制备“κ抗体”(Ill et al.,Protein Eng.10:949-57(1997))、“微型抗体”(Martinet al.,EMBO J.13:5303-9(1994))、“二价抗体”(Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991)和Traunecker et al.,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992))。

可通过多种方法来制备双特异性抗体或抗原结合片段，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接等。参见，例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990),Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。另外，可形成“二价抗体”或“Janusins”形式的双特异性抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体可与两种不同的M-CSF表位结合。在一些实施方式中，双特异性抗体具有来自单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3或9.7.2的第一重链及第一轻链，以及另外的抗体重链及轻链。在一些实施方式中，另外的轻链及重链也来自上述单克隆抗体之一，但不同于所述第一重链及轻链。

在一些实施方式中，可使用来自在此所提供的人抗M-CSF单克隆抗体、该单克隆抗体的氨基酸序列、或由编码该单克隆抗体的核酸序列所编码的重链或轻链的一或多个可变区或CDR区制备上述经修饰抗体。

衍生及标记的抗体

本发明的抗M-CSF抗体或抗原结合部分可经另一分子(如另一肽或蛋白质)衍生化或与之连接。通常，抗体或其部分的衍生方式使得该衍生或标记不会不利影响其与M-CSF结合。因此，本发明的抗体与抗体部分意欲包括在此所述的完整及经修饰形式的人抗M-CSF抗体。例如，本发明的抗体或抗体部分可功能性地连接(通过化学结合、基因融合、非共价键结合等)至一或多个其它分子实体，如另一抗体(如双特异性抗体或二价抗体)、检测剂、细胞毒性剂、药剂和/或可介导所述抗体或抗体部分与另一分子(如链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。

一种衍生的抗体是通过使两个或多个抗体(各为同类或不同类，如产生双特异性抗体)交联而制备的。适当的交联接头是异双官能团，具有两个以适当间隔子(如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分隔的不同反应基团，或是同种双官能团(如琥珀酰亚胺基辛二酸酯)的。此种接头可得自Pierce Chemical Company,Rockford,Ill。

另一种衍生抗体为标记抗体。可用于衍生本发明的抗体或抗原结合部分的检测剂包含荧光化合物，包含荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红素、镧系元素磷光体等。抗体也可标记上用于检测的酶，如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体以可检测的酶标记时，其通过添加额外的试剂来检测，所述的试剂被酶利用产生可识别的反应产物。例如，存在辣根过氧化物酶试剂时，添加过氧化氢及二氨基联苯胺能产生可检测的有色反应产物。抗体亦可以生物素标记，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。抗体还可由能以二级报告子(如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合部位、金属结合区、表位标签)识别的预先测定的多肽表位标记。在一些实施方式中，标记可通过不同长度的间隔臂附着以减少可能的空间障碍。

抗M-CSF抗体也可以放射标记氨基酸标记。放射标记的抗M-CSF抗体可用于诊断及治疗目的。例如放射标记的抗M-CSF抗体可通过x-射线或其它诊断技术来检测能表达M-CSF的肿瘤。另外，放射标记的抗M-CSF抗体可治疗性地用作癌细胞或肿瘤的毒素。标记多肽实例包含(不限于)下列放射性同位素或放射核素-³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I和¹³¹I。

抗M-CSF抗体也可用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团来衍生。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，如增加血清半衰期或增强组织结合。

药物组合物及试剂盒

本发明还涉及包含人抗M-CSF拮抗剂抗体的组合物，其用于有需要治疗的对象来治疗类风湿性关节炎、骨质疏松症或动脉硬化。在一些实施方式中，治疗的对象为人。在其他一些实施方式中，对象为兽医对象。可以本发明拮抗剂抗M-CSF抗体治疗的单核细胞在其中发挥重要作用的过度增殖性病症可涉及任何组织或器官并包含(但不限于)脑癌、肺癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰脏癌、乳腺癌、头癌、颈癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠、食道癌、妇科癌症、鼻咽癌或甲状腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。特别地，本发明的人拮抗剂抗M-CSF抗体可用于治疗或预防乳癌、前列腺癌、结肠癌及肺癌。

本发明还涵盖用于治疗选自下列病症的组合物：哺乳动物(包含人)的包括系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎和皮肤狼疮的狼疮、关节炎、牛皮癣性关节炎、Reiter’s综合征、痛风、创伤性关节炎、风疹关节炎与急性滑膜炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、痛风性关节炎及其它关节炎病症、脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、革兰氏阴性菌脓毒症、中毒性休克综合征、阿尔茨海默氏症、中风、神经创伤、哮喘、成人呼吸道窘迫综合征、脑型疟、慢性肺炎性疾病、硅肺、肺部类肉瘤病、骨质再吸收疾病、骨质疏松症、再狭窄、心脏及肾脏再输注伤害、血栓形成、肾小球肾炎、糖尿病、移植物抗宿主反应、同种异体移植物排斥、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、肌肉变性、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣、晒伤或结膜炎性，该组合物包含治疗有效量的本发明人抗M-CSF单克隆抗体及药用可接受载体。

治疗可包含施用一或多种本发明的拮抗剂抗M-CSF单克隆抗体或其抗原结合片段，其可单独或与药用可接受载体共同给药。在本文中，"药用可接受载体"意指任何及所有生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等等。药用可接受载体的一些实例为水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及其混合物。在许多情况下，优选为组合物中包含等渗剂，如糖类、多元醇类如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。额外的药用可接受物质实例为可增加抗体的保存期或效力的湿润剂或少量助剂，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。

本发明的抗M-CSF抗体及包括这些抗体的组合物可与一种或多种其它治疗剂、诊断剂或预防剂组合给药。额外的治疗剂包含其它抗新生物、抗肿瘤、抗血管形成或化学治疗剂。此种额外的药剂可包含于相同组合物中或分别给药。在一些实施方式中，一种或多种的本发明抑制性抗M-CSF抗体可做为疫苗或疫苗的佐剂。

本发明的组合物可为多种形式，例如液体、半固体及固体剂型，如液体溶液(如可注射及输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体及栓剂。优选形式取决于预期的给药方式及治疗用途。典型的优选组合物为可注射或输注溶液形式，如类似运用于人被动免疫的组合物。优选给药方式为胃肠外给药(如静脉、皮下、腹腔、肌肉)。在优选的实施方式中，抗体是以静脉输注或注射给药。在另一优选的实施方式中，该抗体可肌肉注射或皮下注射给药。在另一实施方式中，本发明包括以可特异性结合M-CSF的抗体或其抗原结合部分治疗需治疗的对象的方法，其步骤包括：(a)施用有效量的编码重链或其抗原结合部分的分离核酸分子、编码轻链或其抗原结合部分的分离核酸分子，或同时施用编码轻链及重链或其抗原结合部分的核酸分子；及(b)表达该核酸分子。

治疗性组合物典型地必须是无菌且于制造及贮存条件下稳定。组合物可调配为溶液、微乳化溶液、分散液、脂质体或其它适于高药物浓度的规定结构。无菌可注射溶液的制备可通过将含需要量抗M-CSF抗体的合适溶剂与视需要的一种上列成分或上列成分的组合相混合，然后无菌过滤。通常，分散剂的制备是通过将活性化合物掺入包含基础分散介质及必需的上列其它成分的无菌载体中。至于可供制备无菌可注射溶液的无菌粉剂，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥处理预先无菌过滤的溶液以产生包括活性成分及任何附加所需成分的粉末。可通过如使用包衣(如卵磷脂)、于分散液中维持所需颗粒大小及使用表面活性剂维持溶液的适当流动性。可通过在组合物中纳入可延缓吸收的药剂(如单硬脂酸盐类及明胶)延长可注射组合物的吸收。

本发明的抗体可通过多种本领域中已知的方法给药，不过对许多治疗用途而言，优选给药途径/方法为皮下注射、肌肉注射或静脉输注。本领域人员应了解给药途径和/或方式取决于所需的结果。

在某些实施方式中，可用能防止抗体快速释放的载体处理该抗体组合物的活性化合物，制备成例如控制释放制剂，包含植入物、经皮贴片及微胶囊递送系统。可使用生物可分解、生物兼容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。许多可制备此种制剂的方法都已申请专利或普遍为本领域人员所熟知。参见，例如，Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,New York,1978)。

在某些实施方式中，本发明的抗M-CSF抗体可口服给药，例如与惰性稀释剂或可吸收的食用载体合用。该化合物(及视需要的其它成分)亦可封入硬胶囊或软明胶胶囊中，压缩为片剂或直接掺入对象饮食中。对治疗性的口服给药，抗M-CSF抗体可与赋形剂并用，并以可食片剂、口腔片、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片等形式运用。除了胃肠外施用本发明化合物外，该化合物可能需要以能预防其失活的物质包衣或与可预防其失活的物质共同施用。

额外的活性化合物亦可掺入所述组合物中。在某些实施方式中，本发明的抗M-CSF抗体可与一种或多种额外的治疗剂共同调配和/或共同给药。这些药剂包含可与其它靶结合的抗体、抗癌剂、抗肿瘤剂、化学治疗剂、抑制M-CSF的肽类似物、能与M-CSF结合的可溶性c-fms、一种或多种抑制M-CSF的化学剂、抗炎剂、抗凝血剂、降血压药剂(即血管紧张素-转化酶(ACE)抑制剂)。此种组合疗法可需要较低剂量的抗M-CSF抗体以及共同施用的药剂，从而避免与各种单一药物疗法相关的可能毒性或并发症。

本发明的抑制性抗M-CSF抗体及包括该抗体的组合物亦可与其它治疗方案组合施用，特别是与放射疗法并用治疗癌症。本发明化合物亦可与抗癌剂(如血管内皮抑制素及血管抑制素(angiostatin))或细胞毒性药物(如阿霉素)、柔红霉素、顺铂、鬼臼噻吩甙、紫杉醇、泰素帝及生物碱(如长春花新碱、法呢基转移酶抑制剂、VEGF抑制剂)及抗代谢剂(如氨甲喋呤)并用。

本发明的化合物亦可与抗病毒剂(如Viracept、AZT、阿昔洛韦及泛昔洛韦、以及抗脓毒症化合物(如Valant)并用。

本发明的组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合部分。“治疗有效量"意指，以剂量及所需时间而言，可有效达到所需的治疗效果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可依各种因素而不同，如个体的疾病状态、年龄、性别及体重，以及抗体或抗体部分诱发个体所需反应的能力。治疗有效量也是指该剂量时抗体或抗体部分的有益治疗作用胜过其任何毒性或有害作用。“预防有效量"意指，以剂量及所需时间而言，可有效达到所需的预防作用的量。典型地，由于预防性剂量是用于染病前或患病早期的对象，预防有效量将小于治疗有效量。

可调整剂量方案以提供最佳所需反应(如治疗或预防反应)。例如可施用单一冲击剂量、可于一段时间内施用数次分割剂量或该剂量可视治疗状态的迫切需要而成比例地减少或增加。将胃肠外组合物调配成为单位剂型特别有利，其可易于给药且剂量统一。在本文中，单位剂型意指物理上离散的单位，其适合用作欲治疗的哺乳动物对象的单位剂型；各单位包含预先定量的活性化合物，其加上所需的药用载体、经计算可产生所需疗效。本发明的剂量形式的规格直接取决于(a)抗M-CSF抗体或部分的独特特性以及欲实现的特定治疗或预防作用，及(b)配制此抗体用于治疗敏感个体的技术中的内在限制因素。

本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示范性非限制性范围为0.025至50mg/kg，更优选地为0.1至50mg/kg，更优选地为0.1至25、0.1至10或0.1至3mg/kg。应注意的是剂量值可随所需减轻的病症类型及严重性而变化。应进一步了解对任何特定对象而言，特定的剂量方案应于一段时间后依个体需要及给药者或监督施用组合物者的专业判断来加以调整，且在此所示的剂量范围仅为示范性的且并非意欲限制本发明的组合物的范围或运用。

本发明的另一方面提供试剂盒，其包括本发明的抗M-CSF抗体或抗原结合部分或包括此种抗体或部分的组合物。除抗体或组合物外，试剂盒可包含诊断剂或治疗剂。试剂盒亦可包含用于诊断或治疗法的说明。在优选的实施方式中，该试剂盒包含了抗体或包括该抗体的组合物及可用于下述方法中的诊断剂。在另一优选的实施方式中，该试剂盒包含抗体或包含其的组合物及一种或多种可用于下述方法中的治疗剂。本发明的一个实施方式为试剂盒，其包括容器、对患有炎性疾病的人施用抗M-CSF抗体的说明、或测量生物学样品中的CD14+CD16+单核细胞数量的说明、以及抗M-CSF抗体。

本发明还涉及抑制哺乳动物中异常细胞生长的组合物，其包括一定量的本发明的抗体以及一定量的化学治疗剂，其中的化合物、盐类、溶剂化物或前药及化学治疗剂的量可一起有效抑制异常细胞的生长。许多化学治疗剂为本领域中已知。在一些实施方式中，该化学治疗剂选自：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、如抗雄激素及抗血管形成剂。

抗血管形成剂，如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶-9)抑制剂及COX-II(环氧化酶II)抑制剂，可与本发明的抗M-CSF抗体组合。可用的COX-II抑制剂实例包含CELEBREX^TM(塞来考昔(celecoxib))、伐地考昔(valdecoxib)及罗非考昔(rofecoxib)。可用的基质金属蛋白酶抑制剂实例描述于WO96/33172(1996年10月24日公开)、WO96/27583(1996年3月7日公开)、欧洲专利申请号97304971.1(1997年7月8日申请)、欧洲专利申请号99308617.2(1999年10月29申请)、WO98/07697(1998年2月26日公开)、WO98/03516(1998年1月29日公开)、WO98/34918(1998年8月13日公开)、WO98/34915(1998年8月13日公开)、W98/33768(1998年8月6日公开)、WO98/30566(1998年7月16日公开)、欧洲专利申请606,046(1994年7月13日公开)、欧洲专利公开931,788(1999年7月28日公开)、WO90/05719(1990年5月31日公开)、WO99/52910(1999年10月21日公开)、WO99/52889(1999年10月21日公开)、WO99/29667(1999年6月17日公开)、PCT国际申请PCT/IB98/01113(1998年7月21日申请)、欧洲专利申请99302232.1(1999年3月25日申请)、英国专利申请9912961.1(1999年6月3日申请)、美国临时申请60/148,464(1999年8月12日申请)、美国专利5,863,949(1999年1月26日颁予)、美国专利5,861,510(1999年1月19日颁予)及欧洲专利公开780,386(1997年6月25日公开)，其全部内容皆以引用的方式并入本申请。优选的MMP抑制剂为不会导致关节疼痛。更优选的为相对于其它基质金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)可选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的MMP抑制剂。用于本发明中的MMP抑制剂的一些具体实例为AG-3340、RO32-3555、RS13-0830、以及下列化合物：3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(1-羟基氨甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；(2R,3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]四氧-喃-4-羧酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(1-羟基氨甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺；(2R,3R)l-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基)-苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(1-羟基氨甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(4-羟基氨甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰胺基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；和(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺；及上述化合物药学上可接受盐类及溶剂化物。

包括本发明的人抗M-CSF单克隆抗体的化合物可与信号转导抑制剂一起使用，如可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)反应的药剂，如EGF-R抗体、EGF抗体及EGF-R抑制剂分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如可抑制VEGF的VEGF受体及分子；及erbB2受体抑制剂，如有机分子或可与erbB2受体结合的抗体，如HERCEPTIN^TM(Genentech,Inc.)。EGF-R抑制剂描述于如WO95/19970中(1995年7月27日公开)、WO98/14451(1998年4月9日公开)、WO98/02434(1998年1月22日公开)及美国专利5,747,498(1998年5月5日颁予)，且此种物质可如在此所述运用于本发明。EGFR-抑制剂包含(但不限于)单克隆抗体C225及抗EGFR22Mab(ImClone systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.and Merck KgaA)和化合物ZD-1834,ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK787(Novartis)、CP701(Cephalon)、leflunomide(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD183,805(Warner Lambert ParkeDavis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer MannheimGmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck&Co.)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(ParkerHughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)和EGF-R疫苗(York Medical/Centro de Immunologia Molecular(CIM))。这些和其他EGF-R抑制剂和用于本发明。

VEGF抑制剂，例如SU-5416及SU-6668(Sugen Inc.)、AVASTIN^TM(Genentech)、SH-268(Schering)及NX-1838(NeXstar)亦可与本发明化合物组合。VEGF抑制剂描述于，例如，WO99/24440(1999年5月20日公开)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(1999年5月3日申请)、WO95/21613(1995年8月17日公开)、WO99/61422(1999年12月2日公开)、美国专利5,834,504(1998年11月10日颁予)、WO98/50356(1998年11月12日公开)、美国专利5,883,113(1999年3月16日颁予)、美国专利5,886,020(1999年3月23日颁予)、美国专利5,792,783(1998年8月11日颁予)、WO99/10349(1999年3月4日公开)、W97/32856(1997年9月12日公开)、W97/22596(1997年6月26日公开)、WO98/54093(1998年12月3日公开)、WO98/02438(1998年1月22日公开)、WO99/16755(1999年4月8日公开)及WO98/02437(1998年1月22日公开)，其全文以引用的方式并入本文中。其它一些可用于本发明的特异性VEGF抑制剂的实例为IM862(Cytran Inc.)；Genentech,Inc.的抗VEGF单克隆抗体；以及angiozyme，一种来自Ribozyme and Chiron公司的合成核酶。这些及其它VEGF抑制剂可如在此所述运用于本发明。ErbB2受体抑制剂，如GW-282974(GlaxoWellcome plc)及单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.)及2B-1(Chiron)，可进一步与本发明化合物并用，如那些描述于WO98/02434(1998年1月22日公开)、WO99/35146(1999年7月15日公开)、WO99/35132(1999年7月15日公开)、WO98/02437(1998年1月22日公开)、WO97/13760(1997年4月17日公开)、WO95/19970(1995年7月27日公开)、美国专利5,587,458(1996年12月M日颁予)及美国专利号5,877,305(1999年3月2日颁予)，其全部内容以引用的方式并入本文中。可用于本发明的ErbB2受体抑制剂也描述于美国专利6,465,449(2002年10月15日颁予)及美国专利6,284,764(2001年9月4日颁予)中，两者全文内容皆以引用的方式并入本文中。ErbB2受体抑制剂化合物及物质(描述于上述PCT申请案、美国专利与美国临时申请案中)，以及其它可抑制erbB2受体的化合物与物质，可依本发明所述与本发明化合物并用。

抗生存(anti-survival)剂包含抗IGF-IR抗体及抗整合素剂，如抗整合素抗体。

抗炎剂可与本发明的抗M-CSF抗体并用。对治疗类风湿性关节炎而言，本发明的人抗M-CSF抗体可与下列药剂并用：如TNF-α抑制剂，如TNF药物(如REMICADE^TM、CDP-870及HUMIRA^TM)及TNF受体免疫球蛋白分子(如ENBREL^TM)、IL-1抑制剂、受体拮抗剂或可溶性IL-1ra(如Kineret或ICE抑制剂)、COX-2抑制剂(如塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔及依托考昔)、金属蛋白酶抑制剂(优选为MMP-13选择性抑制剂)、p2X7抑制剂、α2δ配体(如NEUR0TIN^TM及PREGABALIN^TM)、低剂量氨甲蝶呤、Ieflunomide、hydroxychloroquine、d-青霄胺、auranofin或胃肠外或口服金制剂。本发明的化合物亦可与现存可治疗骨关节炎的治疗剂组合使用。可组合使用的适当药剂包含标准非类固醇抗炎剂(以下称为NSAID)，如炎痛喜康、双氯酚酸钠、丙酸类如萘普生、氟比洛芬(flurbiprofen)、fenoprofen、ketoprofen和布洛芬、芬那美特(fenamates)(如甲灭酸)、吲哚美辛、苏林大(sulindac)、apazone、pyrazolones(如苯基保泰松)、水杨酸类(如阿司匹林)、COX-2抑制剂如塞来考昔、伐地考昔、罗非考昔及依托考昔，止痛剂及关节内治疗剂，如类固醇及透明质酸如hyalgan及欣维可(synvisc)。

抗凝剂可与本发明的抗M-CSF抗体并用。抗凝剂实例包含(但不限于)华法令(COUMADIN^TM)、肝素及enoxaparin(LOVENOX^TM)。

本发明的人抗M-CSF抗体亦可与心血管药剂，如钙通道阻断剂、降血脂制剂，如抑制素(statins)、fibrates、β-阻断剂、Ace抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂及血小板聚集抑制剂组合使用。本发明的化合物亦可与CNS药物并用，如抗抑郁剂(如舍曲林)、抗帕金森氏症药(如司立吉林(deprenyl)、L-多巴、REQUIP^TM、MIRAPEX^TM、MAOB抑制剂，如司来吉兰(selegine)及雷沙吉兰(rasagiline)、comP抑制剂(如答是美(Tasmar))、A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、尼古丁激动剂、多巴胺激动剂及神经元氧化氮合酶抑制剂)及抗阿尔茨海默症药物如donepezil、tacrine、α2δ配体(如NEUR0TIN^TM和PREGABALIN^TM)抑制剂、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或metryfonate。

本发明的人抗M-CSF抗体亦可与骨质疏松症药物并用，如roloxifene、屈洛昔芬(droloxifene)、拉索昔芬(Iasofoxifene)或fosomax及免疫抑制剂，如FK-506和雷帕霉素。

诊断用途的方法

另一方面，本发明提供诊断方法。抗M-CSF抗体可用于检测体外或体内生物学样品的M-CSF。在一个实施方式中，本发明提供一种可诊断有需要的对象体内表达M-CSF的肿瘤的存在或其位置的方法，其步骤包括将抗体注射至对象，通过定位抗体结合处而确定对象中的M-CSF表达，比较对象与正常参考对象或标准的表达并诊断肿瘤的存在或位置。

抗M-CSF抗体可用于常规的免疫分析法，包含(但不限于)ELISA、RIA、FACS、组织免疫组化、蛋白质印迹法或免疫沉淀法。本发明的抗M-CSF抗体可用于检测来自人的M-CSF。在另一实施方式中，抗M-CSF抗体可用于检测源自灵长类(如食蟹猴、恒河猴、黑猩猩或猿)的M-CSF。本发明提供可检测生物学样品中M-CSF的方法，其包括将生物学样品与本发明的抗M-CSF抗体接触并检测已结合的抗体。在一个实施方式中，抗M-CSF抗体可直接以可检测的标记来标记。在另一实施方式中，抗M-CSF抗体(第一抗体)并未标记而第二抗体或可与抗M-CSF抗体结合的其它分子是标记的。例如，为本领域人员所熟知，所选的第二抗体可与第一抗体的特定物种及类别特异性结合。例如，若抗M-CSF抗体为人IgG，那么二抗可为抗人IgG。其它可结合抗体的分子包含(但不限于)蛋白质A及蛋白质G，二者皆已商品化，如源自Pierce Chemical Co。

前文已公开了抗体或二抗的适当标记，包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质及放射性物质。适当的酶的实例包含辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当辅基复合物实例包含链霉抗生物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素；适当荧光物质实例包含伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物实例包含鲁米诺；适当放射性物实例包含¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在其他一些实施方式中，M-CSF可于生物学样品中通过竞争性免疫分析法、利用以可检测物质标记的M-CSF标准及未标记的抗M-CSF抗体进行分析。在此测定法析中，将生物学样品、已标记的M-CSF标准与抗M-CSF抗体组合，并确定标记的M-CSF标准与未标记抗体结合的量。生物学样品中的M-CSF的量为标记的M-CSF标准与抗M-CSF抗体结合的量成反比。

上述免疫分析法可用于多种目的。如抗M-CSF抗体可用于检测细胞培养物中的细胞内或细胞表面上或分泌至组织培养基的M-CSF。抗M-CSF抗体可用于测定细胞表面上或分泌至组织培养基中的M-CSF含量，其中该培养基已使用不同化合物处理。本方法可用以鉴别可用来抑制或活化M-CSF表达或分泌的化合物。依照该方法，将一种细胞样本以测试化合物处理一段时间而另一样本则未经处理。若欲测定总M-CSF水平，将细胞裂解并使用上述一种免疫测定法来测量M-CSF总水平。比较经处理与未处理细胞中M-CSF总水平以确定受试化合物的效果。

一种可测量M-CSF总水平的免疫分析法是ELISA或Wfestern印迹法。若欲测量细胞表面的M-CSF水平，细胞不裂解，并可使用上述免疫分析法之一来测量细胞表面的M-CSF水平。可测定细胞表面M-CSF水平的免疫分析法包含步骤：以可检测标记(如生物素或¹²⁵I)来标记细胞表面蛋白质，以抗M-CSF抗体免疫沉淀M-CSF，随后再检测标记的M-CSF。另一种测定M-CSF定位的免疫分析法(如细胞表面水平)可为免疫组织化学法。如ELISA、RIA、蛋白质印迹法、免疫组织化学、整合膜蛋白质的细胞表面标记及免疫沉淀等方法为本领域中所熟知。请见如Harlow和Lane，见上。此外，免疫分析法可将规模放大以用于高通量筛选，以便测试大量抑制或活化M-CSF的化合物。

另一可测量分泌的M-CSF水平的免疫分析法实例为抗原捕捉分析、ELISA、免疫组织染色分析、蛋白质印迹法及使用本发明的抗体的类似方法。若欲测量所分泌的M-CSF，可分析细胞培养基或体液(如血清、尿液或滑液)中分泌的M-CSF和/或将细胞裂解以释出已产生但尚未分泌的M-CSF。可测定分泌的M-CSF水平的免疫分析法包含步骤：以可检测的标记(如生物素或¹²⁵I)将所分泌的蛋白质加以标记，以抗M-CSF抗体免疫沉淀M-CSF并接着检测标记的M-CSF。另一可测定分泌的M-CSF水平的免疫分析法包含步骤：(a)预先将抗M-CSF抗体与微量滴定板表面结合；(b)添加包含分泌M-CSF的组织培养细胞培养基或体液至微量滴定板的孔中与抗M-CSF抗体结合；(c)添加可检测抗M-CSF抗体的抗体，如以地高辛配基标记的抗M-CSF，其可与M-CSF的表位结合，但此表位与步骤(a)的抗M-CSF抗体所结合的不同；(d)添加过氧化物酶缀合的地高辛配基抗体；及(e)添加过氧化物酶底物，其可产生一种有色反应产物，其可被定量以确定组织培养细胞培养基或体液样本中分泌的M-CSF水平。如ELISA、RIA、蛋白质印迹法、免疫组织化学及抗原捕捉分析等方法是于本领域中所熟知。参见，例如，Harlow和Lane，见上。此外，为了测试大量抑制或活化M-CSF的化合物，免疫分析法可扩大规模以供高通量筛选。

本发明的抗M-CSF抗体亦可用于测定组织或起源于组织的细胞中的细胞表面M-CSF水平。在一些实施方式中，组织是源自患病组织。在一些实施方式中，该组织可为肿瘤或其活检物。在本方法的一些实施方式中，可自患者切除组织或活检物。然后该组织或活检物可用于免疫分析法，以通过上述方法测定如总M-CSF总水平、细胞表面M-CSF水平或M-CSF的定位。

该方法可包括步骤：对需进行该诊断试验的病患施用可检测的标记的抗M-CSF抗体或包括该抗体的组合物并对病患进行成像分析以测定M-CSF表达组织的位置。成像分析是医学领域中所熟知的方法，且包含(但不限于)x-射线分析、核磁共振成像(MRI)或计算机断层(CE)。抗体可以任何适用于体内成像的物质标记，如造影剂，如钡(其可用于x-射线分析)或磁性造影剂，如钆螯合物，其可用于MRI或CE。其它标记物质包含(但不限于)放射性同位素，如⁹⁹Tc。在另一实施方式中，抗M-CSF抗体将不标记，其通过施用第二抗体或其它可与抗M-CSF抗体结合的可检测分子来成像。在一个实施方式中，活检物自患者获得以测定目的组织是否表达M-CSF。

本发明的抗M-CSF抗体亦可用于测定体液(如血清、尿液或源自组织的滑液)中M-CSF所分泌的水平。在一些实施方式中，体液源自患病组织。在一些实施方式中，体液源自肿瘤或其活检物。在本方法的一些实施方式中，体液取自病患，随后将体液运用于免疫分析法中以通过前述方法测定分泌的M-CSF水平。本发明的一个实施方式为一种分析M-CSF拮抗剂活性的方法，其包括：对灵长类或人对象施用M-CSF拮抗剂并测量生物学样品中CD14+CD16+单核细胞数量。

治疗用途的方法

在另一实施方式中，本发明提供一种方法，其可通过对需要的患者施用抗M-CSF抗体而抑制M-CSF活性。在此所述的任何类型抗体皆可做治疗用。在优选的实施方式中，抗M-CSF抗体为人嵌合抗体或人源化抗体。在另一优选的实施方式中，M-CSF属于人且患者为人患者。或者，该患者可为表达可与抗M-CSF抗体交叉反应的M-CSF的哺乳动物。该抗体可对表达与抗体交叉反应的M-CSF的非人哺乳动物(即灵长类)给药作为兽医用途或一种人疾病的动物模型。此种动物模型可用于评估本发明的抗体的疗效。

在本文中，术语"M-CSF活性在其中有害的病症"意欲包含疾病及其它病症，其中罹患该病症的对象中高水平M-CSF的存在被发现或怀疑似为该病症的病理生理学的原因或为导致病症恶化的因素。此类病症可通过如分泌的和/或于细胞表面的M-CSF水平增加或患有该疾病的对象受影响细胞或组织中c-fms的酪氨酸自身磷酸化反应增加而证实。可使用如上述的抗M-CSF抗体检测M-CSF的水平增加。

在一个实施方式中，抗M-CSF抗体可给药患有表达c-fms的肿瘤或分泌M-CSF和/或于细胞表面表达M-CSF的肿瘤的患者。优选地，该肿瘤所表达的c-fms或M-CSF的水平高于正常组织。肿瘤可为实体肿瘤或可为非实体肿瘤，如淋巴瘤。在更加优选的实施方式中，可对患有表达c-fms的肿瘤、表达M-CSF的肿瘤或分泌M-CSF的癌性肿瘤的病患施用抗M-CSF抗体。另外，肿瘤可为癌性。在更加优选的实施方式中，肿瘤为肺癌、乳腺癌、前列腺癌或结肠癌。在另一优选的实施方式中，对患者施用的抗M-CSF抗体造成M-CSF不再与c-fms受体结合。在一非常优选具体实施方式中，该方法导致肿瘤重量或体积不增加或减少。在另一实施方式中，该方法可导致肿瘤细胞上的c-fms不被M-CSF结合。在另一实施方式中，该方法可导致肿瘤细胞上的M-CSF不被c-fms结合。在另一具体实施方式中，该方法可导致肿瘤细胞分泌的M-CSF不被c-fms结合。在优选的实施方式中，选自252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1，或抗体包含其重链、轻链或抗原结合区。在另一实施方式中，抗体是具有与抗体8.10.3F的重链、轻链、或者重链和轻链分别具有90％、91％、92,％、93％、94％、95％、96％、96％、97％、98％或99％的相同性的重链、轻链、或者重链和轻链的抗M-CSF抗体。

在另一优选的实施方式中，给M-CSF表达水平不当升高的患者施用抗M-CSF抗体。本领域中已知高水平M-CSF表达可导致多种常见癌症。在一个实施方式中，该方法涉及治疗癌症，如脑癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头部癌症、颈部癌症、食道癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、肾脏癌、卵巢癌、妇科癌或甲状腺癌。可以用本发明的化合物按照本发明的方法进行治疗的患者包括，例如，已诊断为患有肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头及颈部癌症、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症(如甲状腺癌、甲状旁腺癌或肾上腺癌)、软组织的肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、实体瘤(除血液、骨髓或淋巴系统外的身体组织癌症，如肉瘤、癌或淋巴瘤)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌(如肾细胞癌、肾盂癌)或中枢神经系统肿瘤(如原发性CNS淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤或脑垂体腺瘤)的患者。在更加优选的实施方式中，给患有乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌的患者施用抗M-CSF抗体。在更加优选的实施方式中，该方法可导致癌症停止异常地增殖，或者不增加或减少其重量或体积。

在另一优选的实施方式中，给M-CSF表达水平不当升高可导致各种炎症或免疫疾病的患者施用抗M-CSF抗体。此类疾病包括但不限于，狼疮包括系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎和皮肤狼疮、关节炎、牛皮癣性关节炎、Reiter’s综合征、痛风、创伤性关节炎、风疹关节炎与急性滑膜炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、痛风性关节炎及其它关节炎病症、脓毒症、脓毒性休克、内毒素休克、革兰氏阴性菌脓毒症、中毒性休克综合征、阿尔茨海默氏症、中风、神经创伤、哮喘、成人呼吸道窘迫综合征、脑型疟、慢性肺炎性疾病、硅肺、肺部类肉瘤病、骨质再吸收疾病、骨质疏松症、再狭窄、心脏及肾脏再输注伤害、血栓形成、肾小球肾炎、糖尿病、移植物抗宿主反应、同种异体移植物排斥、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、肌肉变性、湿疹、接触性皮炎、牛皮癣、晒伤或结膜炎性。

抗体可给药一次，但更优选为多次给药。如该抗体可自每日给药三次至每六个月或更久给药一次。给药时间表可为如每日三次、每日二次、每日一次、每二日一次、每三日一次、每周一次、每二周一次、每月一次、每二月一次、每三月一次及每六个月一次。抗体亦可经由微型泵持续给药。该抗体可口服、粘膜、颊内、鼻内、吸入、静脉、皮下、肌内、肠胃外、肿瘤内或局部给药途径进行给药。抗体可于肿瘤的部位或发炎的身体部分给药，投入至肿瘤或发炎的身体部分内或于远离肿瘤的位置或发炎的身体部分处给药。该抗体可给药一次、至少二次或至少施用一段时间直到病症经治疗、减轻或治愈。只要肿瘤存在，该抗体通常可持续施用，前提为该抗体导致肿瘤或癌症停止生长或减少重量或体积或直到发炎的身体部分治愈。抗体通常可以前述药物组合物的一部分来施用。抗体剂量范围通常为0.1-100mg/kg，更优选地0.5-50mg/kg，更优选地l-20mg/kg，且更优选为1-10mg/kg。抗体的血清浓度可通过任何本领域中已知的方法测量。

在另一方面，可通过检查患者与各种疾病有关的症状、各种生物学标记物、组织学和生理条件的改变来确定抗M-CSF抗体治疗或预防各种疾病的功效。本领域人员已知如何确定此类症状、生物学标记物、组织学和条件。例如，确定抗M-CSF抗体在治疗或预防患者的狼疮中的功效可包括分析或观察狼疮相关症状的改变，例如皮肤损害、蛋白尿、淋巴结病、血清M-CSF水平、抗dsDNA抗体水平和肾脏病理学改变，例如检查巨噬细胞浸润、炎性浸润、蛋白管型、肾小球簇大小、肾小球IgG沉积和C3沉积。也可检查单核细胞群例如CD14+CD16+单核细胞的改变，以及破骨细胞标记物例如uNTX-1的改变。系统性红斑狼疮、皮肤狼疮、和狼疮性肾炎的生物学标记物可包括红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、补体(C3/C4)、Ig水平(IgA、IgM、IgG)、抗核抗体(ANA)、可提取性核抗原(ENA)和抗dsDNA抗体。

除了药代动力学生物学标记物数据，原理验证(proof of principle)生物学标记物可包括临床研究过程中所取得的M-CSF途径标记物、促炎性细胞因子/趋化因子、免疫细胞亚组(B细胞、T细胞和DC)以及来自全血、血清、尿液和组织样品的其他疾病相关性标记物。

例如，可使用探究性血清标记物组来检查与M-CSF、单核细胞、巨噬细胞和狼疮(系统性、肾炎和皮肤)活动有关的细胞因子、趋化因子和其他血清的蛋白质的血清水平改变。可通过本领域人员熟知的标准免疫测定技术检查血清生物学标记物。细胞因子/趋化因子血清生物学标记物组可包括，例如：IFN-γ、IFN-α、IL-12、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-15、IL-6、IL-10、TGF-β、IL-1-α、IL-1-β、IL-21、IL-22、IL-23、IL-17A、IL-17F、CXCL10、CXCL9、CCL2、CCL19、RANTES、CXCL11、CCL7、CCL3、CXCL13、CCL8、CXCL8、CD40L、可溶性TNFR和可溶性IL-1受体拮抗剂。与M-CSF、单核细胞、和巨噬细胞活性相关的组包括：M-CSF、GM-CSF、RANKL、可溶性CD14和新蝶呤。与皮肤狼疮、系统性狼疮相关的血清生物学标记物亚组可包括：E-选择素、BAFF、可溶性CD27、可溶性CD154和CCL17。

可检查来自经治疗的患者的尿液中尿液生物学标记物组的改变，其可包括例如：M-CSF、MCP-1、IL-6、IL-10、CCL3和RANTES。

为了评价循环免疫细胞库(repertoire)暴露于抗M-CSF抗体后的改变，也可对来自经治疗的人类对象的全血进行荧光激活细胞分选(FACS)检查。可通过已经建立的细胞表面标记物表达模式来确定免疫细胞亚群。例如，B细胞亚群组可包括评价总B细胞、原初B细胞、记忆B细胞(未转换的和已类别转换的)、浆细胞、双阴性B细胞和IgD原初B细胞。过渡B细胞(transitional B cell)组可包括过渡B细胞、未成熟B细胞和种系中心B细胞。T细胞亚群组可分为总T细胞、NK T细胞、NK细胞、原初T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、和效应记忆T细胞。树突状细胞组可检查髓样树突细胞以及浆细胞样树突细胞。本领域人员知晓如何确定和检测此类细胞亚群。

此外，可检查暴露于抗M-CSF抗体之后RNA表达的改变。RNA可分离自来自经治疗的患者的全血和组织活检样品。可由分离的RNA定量基因表达，例如，通过标准的Taqman RT-qPCR TLDA组测定技术。例如，表1C列出了一组与M-CSF途径参与、细胞因子/趋化因子、和疾病相关基因表达有关的靶基因。可检查表1C中所列基因中一或多种RNA的表达以确定治疗的功效。

例如，可通过免疫组化(IHC)和RNA表达谱评价来自皮肤狼疮患者的病损和非病损处皮肤活检样品的M-CSF依赖性改变。可通过IHC检查的细胞群包括巨噬细胞、树突状细胞(pDC和mDC)和T细胞群。可考虑针对血清生物学标记物组中所列的生物学标记物进行额外的IHC染色。对分离自皮肤活检样品的RNA表达分析可检查表1C中所列的一或多种基因。

表1C

另一方面，可给有治疗需要的患者共同施用抗M-CSF抗体与其它治疗剂(如抗炎剂、抗凝血剂、可降低血压的药物、抗癌剂或分子)。在一个方面，本发明涉及一种治疗哺乳动物过度增殖性病症的方法，其包括对该哺乳动物施用治疗有效量的本发明化合物并结合选自(但不限于)下列抗肿瘤剂：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、嵌入剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、基因治疗剂及抗雄激素物质。在更加优选的实施方式中，抗体可与抗癌药共同给药，如阿霉素或紫杉醇。在另一优选的实施方式中，抗体或组合治疗是与放射疗法，化学疗法、光动力疗法、手术或其它免疫疗法一起施用。在另一优选的实施方式中，抗体可与另一抗体共同给药。例如，抗M-CSF抗体可与已知可抑制肿瘤或癌细胞增殖的抗体或其它药剂共同给药，如可抑制erbB2受体、EGF-R、CD20或VEGF的抗体或药剂。

共同施用抗体以及额外的治疗剂(组合疗法)包含施用一种包括抗M-CSF抗体及额外的治疗剂的药物组合物，以及施用两种或多种分开的药物组合物，一种包括抗M-CSF抗体而另一种包括额外的治疗剂。此外，虽然共同给药或组合疗法通常指抗体及额外的治疗剂于同一时间共同给药，但亦包含抗体及额外的治疗剂于不同时间给药的实例。例如，抗体可每三天给药一次，而额外的治疗剂则每日给药一次。或者，该抗体可于以额外的治疗剂治疗该病症前或治疗后施用。类似地，抗M-CSF抗体的可于进行其它疗法(如放射疗法、化学疗法、光动力疗法、手术或其它免疫疗法)之前或之后施用。

抗体与一种或多种额外的治疗剂(组合疗法)可施用一次、二次或至少一段时间，直到病症已经治疗、减轻或治愈。优选地，组合疗法可多次施用。组合疗法可由每日给药三次至每六个月给药一次。给药时间表可为如每日三次、每日二次、每日一次、每二日一次、每三日一次、每周一次、每二周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次及每六个月一次或者其可由微型泵持续给药。组合疗法可借口服、粘膜、颊内、鼻内、吸入、静脉、皮下、肌内、肠胃外、肿瘤内或局部途径施用。组合疗法可于距肿瘤部位较远的部位施用。只要该肿瘤存在，组合疗法通常可持续施用，前提为该抗体可导致肿瘤或癌症停止生长或重量或体积减少。

在另一实施方式中，抗M-CSF抗体是以放射标记、免疫毒素或毒素标记的，或为一种包括毒性肽的融合蛋白。抗M-CSF抗体或抗M-CSF抗体融合蛋白将放射标记、免疫毒素、毒素或毒性肽导入可表达M-CSF的细胞中。在优选的实施方式中，放射标记、免疫毒素、毒素或毒性肽于抗M-CSF抗体与M-CSF在靶细胞表面结合后方才内在化。

在另一方面，抗M-CSF抗体可用于治疗非癌性状态，其中的高水平M-CSF和/或M-CSF是与非癌性状态或疾病有关。在一个实施方式中，该方法包括步骤：给病患施用抗M-CSF抗体，该病患患有由高水平M-CSF和/或M-CSF水平或活性所引起或恶化的非癌性病理状态。在更加优选的实施方式中，抗M-CSF抗体可减缓非癌性病理状态的发展。在更加优选的实施方式中，抗M-CSF抗体可停止或逆转(至少部分)非癌性的病理状态。

基因治疗

本发明核酸分子可通过基因疗法给需要的患者施用。该疗法可用于体内或体外。在优选的实施方式中，给患者施用编码重链及轻链的核酸分子。在更加优选的实施方式中，可施用核酸分子以便其能稳定地整合至B细胞染色体中，因为这些细胞是专供产生抗体的。在优选的实施方式中，前体B细胞可经体外转染或感染并再移植至需要的患者。在另一实施方式中，使用已知可感染目的细胞类型的病毒体内感染前体B细胞或其它细胞。用于基因疗法的典型载体包含脂质体、质体及病毒性载体。示范性病毒载体为反转录病毒、腺病毒及腺相关病毒。在体内或体外感染后，抗体的表达水平可由接受治疗患者取得样本、使用任何本领域中已知或在此所述的免疫分析法监测。

在优选的实施方式中，基因疗法包括步骤：施用经分离的编码抗M-CSF抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子，以及表达该核酸分子。在另一实施方式中，基因疗法包括步骤：施用经分离的编码抗M-CSF抗体轻链或其抗原结合部分的核酸分子，以及表达该核酸分子。在更优选方法中，基因疗法包括步骤：施用经分离的编码本发明的抗M-CSF抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子及分离的编码轻链或其抗原结合部分的核酸分子，以及表达该核酸分子。基因疗法亦可包括步骤：施用额外的抗癌剂，如紫杉醇或阿毒素。

为使本发明被更好了解，提供下列实施例。这些实施例仅供说明的目的，不可理解为欲以任何方式限制本发明范围。

实施例I：制备产生抗M-CSF抗体的细胞系

本发明的抗体如下制备，选择并分析：

免疫和产生杂交瘤

8-10周龄XENOMOUSE^TM小鼠经腹腔或在后足垫内用人M-CSF(10μg/剂/小鼠)。3-8周内重复该剂量5-7次。输注前四天，最后对小鼠注射人M-CSF的PBS溶液。经免疫小鼠的脾和淋巴结淋巴细胞与非分泌性骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细胞系融合，然后如前所述对融合细胞进行HAT选择(Galfre and Milstein,Methods Enzymol.73:3-46,1981)。收获了一组杂交瘤全部分泌M-CSF特异性人IgG2和IgG4抗体。还如Babcook,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-48,1996所述，利用XENOMAX^TM技术产生抗体。改造9个细胞系产生的本发明抗体经选择进行进一步研究，命名为252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4、8.10.3和9.7.2。杂交瘤根据布达佩斯条约的规定于2003年8月8日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Blvd.,Manassas,VA20110-2209。所述杂交瘤的保藏号如下：

实施例II：基因利用分析

分别从相应的杂交瘤细胞系克隆编码单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1,120.1、9.14.4、8.10.3和9.7.2的重链和轻链的DNA，并通过本领域已知的方法进行测定DNA序列。此外来自杂交瘤细胞系9.14.4、8.10.3和9.7.2的DNA在可变区特定读框区域突变和/或同种型转化以分别获得，例如，9.14.4I、8.10.3F、和9.7.2IF。根据抗体的核酸序列以及推定的氨基酸序列，可测定各抗体链所使用基因的身份(″VBASE″)。表2给出了如本发明选定抗体的基因使用情况：

表2：重链和轻链基因使用情况

通过设计引物并利用购自Stratagene的QuickChange位点特定诱变试剂盒根据厂商说明来进行重链和轻链的特定残基诱变。通过自动测序确定突变，并将诱变亚克隆到表达载体中。所述表达载体转染到HEK293细胞中产生足够的抗体用于定性。

实施例III：M-CSF小鼠单核细胞增殖测定

进行体外测定来测定在抗M-CSF抗体存在下M-CSF-依赖性小鼠单核细胞细胞增殖被抗M-CSF抗体抑制的程度。

获得小鼠单核细胞，M-NFS-60细胞(来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA))并保存在含有以下成分的RPMI-1640培养基中：2mM L-谷氨酸盐(ATCC),10％热灭火的胚胎牛血清(FBS)(Invitrogen,Carlsbad,CA),0.05mM2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis MO)(测定介质),其中含有15ng/ml人M-CSF。M-NSF-60细胞分成5x10⁴第二天使用或分成2.5x10⁴两天内使用。在用于测定之前，所述细胞用RPMI-1640洗涤三次,计数并用测定培养基调整体积为2x10⁵细胞/ml。所有条件一式三份重复用于96-孔处理的组织培养物板(Corning,Corning,NY)上。每个孔中加入50μl经洗涤的细胞，25μl100pM或1000pM M-CSF或25μl各个浓度的对照抗体的醋酸缓冲液(140mM氯化钠,20mM醋酸钠,以及0.2mg/ml聚山梨醇酯80,pH5.5)，使得终体积100μl。本发明抗体单独测定并与人M-CFS共同测定。培养板在37℃5％CO₂下培养24小时。

24小时后,加入10μl/孔的0.5μCi3H-胸苷(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)并脉冲细胞3小时。为了检测掺入胸苷的量，将细胞收获置于预先湿化的单滤GF/C滤板(Packard,Meriden,CT)并用水洗涤10次。允许该板干燥过夜。将封底剂加入滤板。然后,加入45μl Microscint20(Packard,Meriden,CT)每孔。加入封顶剂之后，在Trilux microbeta计数器(Wallac,Norton,OH)中计数该板。

这些实验显示本发明抗M-CSF抗体抑制小鼠单核细胞对M-CSF的响应性增殖。此外，通过利用各种浓度的抗体，测定抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3和9.7.2对小鼠单核细胞增殖抑制的IC₅₀(细胞增殖测定，表3a和表3b)。

表3a

表3b

实施例IV：人全血单核细胞活化测定

体外测定M-CSF依赖性单核细胞在抗M-CSF抗体存在下的形状改变以确定所述抗M-CSF抗体能否抑制全血单核细胞活化以及其对单核细胞形状改变的抑制程度。

在96孔组织培养板的各个孔中，混合6μl的1.7nM抗M-CSF和94μl人全血获得102pM终浓度的抗M-CSF抗体。将板在37℃ CO₂组织培养保温箱中保温。然后，将板从保温箱中取出。在每个孔中，加入100μl固定液(0.5％福尔马林磷酸缓冲盐水，其中不含MgCl₂或CaCl₂)并将板在室温保温10分钟。对于每个样品，每孔取出180μl与1ml红细胞裂解缓冲液混合。涡旋试管2秒钟。然后，将样品在震摇水浴中在37℃保温5分钟以裂解红细胞但保留单核细胞完整。该次保温之后，立即将样品置于荧光即获得细胞淘选(FACS)仪(BD Beckman FACS)中读数，利用FACS StationSoftware Version3.4分析数据。

这些试验证明，与对照样品相比本发明的抗M-CSF抗体与抑制单核细胞形状改变。利用单核细胞形状改变测定，测定抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3和9.7.2的IC₅₀(人全血单核细胞活化,表3a和表3b)。

实施例V：c-fms受体结合抑制实验

进行体外实验以测定M-CSF与c-fms受体在抗M-CSF抗体存在下的结合从而确定抗M-CSF抗体是否抑制M-CSF与c-fms受体的结合以及其抑制程度。

洗涤转染的人NIH-3T3细胞，所述细胞由保存在不含镁或钙的Dulbecco’s磷酸缓冲盐水中的人c-fms或M-NSF-60细胞转染。用5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH7.4，从组织培养板除去NIH-3T3细胞。将NIH-3T3细胞返回组织培养箱中1-2分钟并轻敲培养瓶以使细胞松散。NIH-3T3细胞和M-NSF-60细胞被转移到50ml试管中并用反应缓冲液洗涤两次(1xRPMI，不含碳酸氢钠的50mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES),pH7.4)。然后，将NIH-3T3细胞重悬于反应缓冲液中使得终浓度为1.5x10⁵细胞/ml。M-NSF-60细胞重悬于反应缓冲液中使得终浓度为2.5x10⁶细胞/ml。

为了进行测定，将9μl无菌0.4M蔗糖溶液，100μl终浓度为200pM的¹²⁵I-M-CSF(Amersham,IMQ7228v)在含有以下成分的RPMI-1640在结合试管中混合：50mM HEPES(pH7.4),0.2％牛血清白蛋白,100μl终浓度为200nM的未标记M-CSF。然后，加入50μl/管的浓度递增的测定抗体。为了测定抗体的非特异性结合,我们纳入了其中还加入200nM M-CSF的样品。在对照试管中，我们没有加入抗体。然后，每个试管中加入15,000NIH-3T3细胞或250,000M-NSF-60细胞。所有试管在室温保温3小时然后在10,000rpm离心2min。含有细胞碎片的试管尖端被切下并利用PackardCobra II Gamma计数器测定结合于细胞的M-CSF的量。特异性结合通过从总结合中减去非特异性结合来确定。所有测定一式两份进行。结合数据利用计算机程序Graph Pad Prism2.01分析。

这些试验显示与对照样品相比本发明的抗M-CSF抑制M-CSF与c-fms受体的结合。此外，通过利用各种浓度的抗体，测定抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3和9.7.2的受体结合抑制IC₅₀(受体结合抑制实验，表3a和表3b)。

实施例VI：通过BIACORETM测定抗M-CSF单克隆抗体的亲和力常数(KD)

纯化抗体的亲和力测定通过利用BIACORE^TM3000仪根据厂商说明利用表面等离子共振进行。

对于抗体3.8.3、2.7.3和1.120.1，在BIACORE^TM3000仪中在25℃含有0.0005％Tween-20的Dulbecco’s磷酸缓冲盐水中进行实验。蛋白浓度从沉淀速度试验获得或通过利用来自氨基酸序列的理论消光系数测定样品在280nm的波长。为了进行试验测定抗体与固定化抗原的结合，通过标准直接胺偶联法将M-CSF固定在B1芯片上。对于3.8.3,2.7.3和1.120.1，制备0.69μM抗体样品。这些样品连续稀释3倍到8.5nM或2.8nM，浓度范围大概100倍。对于每个浓度，所述样品一式两份以5μl/min的流速注射4分钟。监测解离2000秒。数据利用BIACORE^TM Biaevaluation软件全面适应于简化1:1结合模型。在所有情况中，该方法用于获得k_off并发现该数据组与得自结合与解离的全面适应的数据相当。

对于抗体252、88和100，在BIACORE^TM3000仪在25℃ HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES,pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％SurfactantP20)中进行试验。对于测定抗体与固定抗原的结合的试验，通过标准直接胺偶联法将M-CSF固定在CM5研究级感应芯片上。制备抗体样品：12.5nM的抗体252和100以及25.0nM的抗体88。这些样品被两倍连续稀释到0.78nM，大致浓度范围为15-30倍。对于每个浓度，所述样品一式两份随机顺序以30μl/min注射3min。监测解离300sec。数据利用BIACORE^TMBiaevaluation软件全面适应于简化1:1结合模型。在所有情况中，该方法用于获得k_off并发现该数据组与得自结合与解离的全面适应的数据相当。

表4显示抗体252,88,100,3.8.3,2.7.3和1.120.1的结果。

表4

252

88

100

3.8.3

2.7.3

1.120.1

KD(M)

1.33x10-11

1.33x10-9

2.0x10-11

4.0x10-10

4.7x10-9

5.4x10-9

koff(1/s)

1.03x10-6

7.3x10-5

1.7x10-5

实施例VII：从8.10.3杂交瘤细胞制备8.10.3抗体

于3L射流旋转器(sparged spinners)制备制备抗体8.10.3。3L射流旋转烧瓶为一种玻璃器皿，其使用以磁性平台所控制的推动器来混合培养物。将旋转器连接至气体管线以供给5％CO2及空气。首先将8.10.3杂交瘤细胞融解在T-25细胞培养瓶中。细胞逐渐扩增直到有足量细胞可供植入射流旋转器中。

以8.10.3杂交瘤细胞接种于二个3L的射流旋转烧瓶内，培养基为无血清杂交瘤用培养基，添加物细节见表5。所显示UltraLow IgG血清(Gibco cat#16250-078)、L-谷氨酰胺(JRH Biosciences cat#59202-500M)、非-必须氨基酸(Gibco cat#11140-050)、蛋白胨(Difco cat#211693)、葡萄糖(由JT Baker自制储备物cat#1920-07)及消泡剂C(Sigma cat.#A-8011)的浓度为其于培养基的最终浓度。平衡各反应器体积使用无血清杂交瘤用培养基。

表5：杂交瘤8.10.3在两个3L射流旋转烧瓶中生长的条件

条件	旋转烧瓶1	旋转烧瓶2
			接种密度(1x106细胞/ml)	0.16ml	0.16ml
无血清杂交瘤用培养基(Gibco cat#12045-076)	平衡	平衡
			超低IgG血清(Gibco cat#16250-078)	5％	5％
L-谷氨酸盐(JRH Biosciences cat#59202-500M)	8mmol/L	8mmol/L
			非必需氨基酸(Gibco cat#11140-050)	1％	1％
肽酮(Difco cat#211693)	1g/L	1g/L
			2M葡萄糖(制备自JT Baker cat#1920-07的内部批号)	8g/L	8g/L
消泡剂C(Sigma cat.#A-8011)	1ml/L	1ml/L

让培养物生长15天，当生存力低于20％时进行收集。生存力可通过台盼蓝排除法以自动化细胞计数器(Cedex，Innovatis)测定。采集可由离心及随后的过滤完成。于7000rpm离心15分钟后可获得澄清的上清液并随后以无菌0.22μm4”OpticapMillipore滤膜(cat#KVSCO4HB3)过滤至10L无菌TC-iTech袋(cat#P/N12420Bag Style CC-10-112420)。滤液随后于下列实施例中进行纯化。

实施例VIII：纯化抗M-CSF抗体

首先如下预备蛋白质A柱(Amersham Pharmacia)，以3柱体积的8M尿素洗涤，再以20mM Tris(pH8)平衡洗涤。来自实施例VII的最终滤出液与2％v/v的1M Tris pH8.3及0.02％的NaN₃混合，然后通过重力滴落方式装入蛋白质A柱。装填完成后，以5柱体积的20mM Tris(pH8)洗树脂，接着以5柱体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸pH3.0)冲洗。注意任何沉淀物，接着掺入10％v/v的1M Tris pH8.3以洗脱抗体。被洗脱的蛋白质接着以100倍的洗脱物体积量的透析缓冲液(140mM NaCl/20mM醋酸钠pH5.5)进行透析洗脱物。于透析后，该抗体以0.22μm滤膜进行无菌过滤并贮存直到进一步应用。

实施例IX：猴子处理和单核细胞计数

每剂量组采用一只雄性与一只雌性食蟹猴，于约5分钟的时间以静脉注射给予空载体或抗体8.10.3(如实施例VII及VIII中所述制备)，剂量分别为0、0.1、1或5mg/kg,体积为3.79mL/kg。于给药后24及72小时及每周(共3周)采集供临床实验分析的血液样本。单核细胞计数是使用AbbottDiagnostics Inc.Cell Dyn系统(Abbott Park,Illinois)通过光散射测定。

观察到所有剂量中单核细胞总数(图1A及1B)的剂量相关性减少(～25％至85％)。于第2周时0.1及l mg/kg的单核细胞计数似乎回升至接近对照组，而5mg/kg的单核细胞计数于第3周时仍减少。

CD14+CD16+单核细胞亚群分析

将灵长类全血抽入含有肝素钠的Vacutainer管中。将0.2ml的各血液样本加入含10ml红细胞裂解缓冲液(Sigma)的15ml圆椎形聚丙烯离心试管中，并于37℃水浴中温育15分钟。接着将该管于Sorvall RT7离心机以1,200rpm离心5分钟。吸出上清液，将沉淀再悬浮于10ml的4℃ FACS缓冲溶液中(Hanks’平衡盐溶液/2％FBS/0.02％叠氮化钠)，并将管再次以1,200rpm离心5分钟。吸出上清液并将沉淀再悬浮于由下列各物所组成的抗体混合物中：80μl4℃ FACS缓冲液、10μl FITC缀合的抗人类CD14单克隆抗体(BD Biosciences，San Diego，CA)、0.5μl Cy5-PE-缀合的抗人类CD16单克隆抗体(BD Biosciences，San Diego，CA)及10μl PE缀合的抗人类CD89单克隆抗体(BD Biosciences，San Diego，CA)。细胞悬浮液于冰上温育20分钟，之后加入4℃的10ml FACS缓冲液并将细胞如前述方式离心。吸出上清液，并将细胞沉淀再悬浮于400μl FACS缓冲溶液中并于FACSCaliber流式细胞分析仪(BD Biosciences，SanJose，CA)分析细胞。每样本收集30,000个细胞的数据。

通过前角(forward angle)光散射及直角(orthogonal)光散射组合来鉴别单核细胞群。进一步分析单核细胞门控的细胞的CD14及CD16表达。可观察到二种明显不同的单核细胞群，一种可表达高水平的CD14及很少或无CD16表达(CD14++CD16-)，而另一种可表达较低水平的CD14及高水平的CD16(CD14+CD16+)，类似前述的人类外围血中的二种单核细胞亚群(Ziegler-Heitbrock H.W.，Immunology Today17：424-428(1996))。对受测的各灵长类而言，于以8.10.3注射后第1、3、7、14及21天各次抽血后进行测定CD14+CD16+亚群中的单核细胞百分比。

一般来说，以8.10.3处理可导致CD14+CD16+单核细胞百分比下降(请见图2A及2B)。未接受8.10.3抗体的猴子显示相对稳定的CD14+CD16+单核细胞水平。CD14+CD16+单核细胞被称为“促炎性”，因其可产生较高水平的TNF-α及其它炎症性细胞因子(Frankenberger.,et al.,Blood87：373-377(1996))。亦有报导显示单核细胞由常见的CD14++CD16-表型分化为促炎性表型是取决于M-CSF(Saleh M.N.et al.,Blood85：2910-2917(1995))。实施例X：猴子处理和单核细胞计数

每剂量组三只雄食蟹猴于约5分钟的时间内以静脉内给予载体(20mM醋酸钠，pH5.5，140mM NaCl)、纯化抗体8.10.3F或纯化抗体9.14.4I，其剂量为0、1或5mg/kg，体积为3.79mL/kg。猴子年龄为4至9岁而体重为6至10kg。于2、4、8、15、23及29日采集供临床实验分析的血液样本。单核细胞计数使用Abbott Diagnostics Inc.Cell Dyn系统(Abbott Park，Illinois)通过光散射测定。

观察到与测试前的单核细胞水平(图3A及3B)相比，在抗体8.10.3F及抗体9.14.4I所有剂量(请见如图3A及3B中的第4、8、15及23日)的总单核细胞百分比改变皆减少。

实施例XI：抗M-CSF抗体在鼠狼疮模型中的效果

在该实施例中，在两个独立的鼠模型MRL-Fas^lpr和NZBWF1/J中检测M-CSF被大鼠抗小鼠M-CSF抗体中和对狼疮样疾病的产生的效果。抗M-CSF抗体的效果也与鼠CTLA-4Ig进行比较，之前已经证明后者可降低MRL-Fas^lpr小鼠中的疾病。

在显示与人疾病有多个相同特征的鼠SLE模型(Perry et al,J BiomedBiotechnol。2011:271694。Epub2011Feb14)中对用于治疗人疾病的多个候选物进行了评估。

MRL-Fas^lpr小鼠自发症状模拟人狼疮的症状，包括高循环抗双链DNA(dsDNA)血清自身抗体、肾小球IgG沉积以及严重疾病中的蛋白尿、淋巴结病和皮肤损伤。淋巴结病的发生是由于聚集了双阴性(CD4-CD8-)和B220+T-细胞(Watson et al,Journal of Experimental Medicine.176(6):1645-56(1992))。细胞毒T细胞淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)参与调节T淋巴细胞活化，并且血清CTLA-4Ig的存在与自身反应性B淋巴细胞扩增减少,CD4+T淋巴细胞数量减少，以及小鼠SLE模型中的有利反应相关(Mihara et al,J Clin Invest.106(1):91-101(2002))。M-CSF缺陷型MRL-Fas^lpr小鼠不发生肾炎(Lenda et al.J Immunol.173(7):4644-4754(2004))。

通过NZB和NZW株之间的F1杂交产生的NZBWF1/J模型是狼疮的最早经典模型，其与狼疮患者发生类似的严重狼疮样表型，包括淋巴结病、脾肿大、血清抗核自身抗体升高，其中包括抗dsDNA IgG。免疫复合物介导的肾小球肾炎在5-6月龄明显出现，导致肾衰并且在10-12月龄死亡(Mihara et al.)。在人SLE中，NZBWF1中的疾病在两性中明显不同并偏向于女性发病(Theofilopoulos&Dixon,Adv Immunol.37:269-390(1985))。

材料和方法

本实施例中使用的抗体和对照蛋白总结在表6。

表6

蛋白a	活性
		大鼠抗小鼠M-CSF Ab5A1	小鼠M-CSF的中和性抗体
CHOCK IgG1	大鼠同种型对照免疫球蛋白
		CTLA-4Ig	减轻狼疮疾病的阳性对照

CHOCK＝表达CK-1的中国仓鼠卵巢细胞；CTLA＝细胞毒T淋巴细胞结合的抗原；Ig＝免疫球蛋白；M-CSF＝巨噬细胞集落刺激因子。

^a蛋白在Pfizer制备。

雌性MRL-Fas^lpr和NZBWF1/J(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)在Pfizer的无病原体动物饲养室中圈养。小鼠根据Pfizer动物关怀和利用委员会批准的方案使用。

SLE研究

利用MRL-Fas^lpr和NZBWF1/J SLE模型进行M-CSF中和对狼疮样疾病的出现的影响。10周龄雌性MRL-Fas^lpr或26周龄雌性NZBWF1/J小鼠每周经腹腔内(IP)用以下物质处理3次：盐水、10mg/kg的5A1抗M-CSF、CHOCK IgG1同种型对照抗体或CTLA-4Ig(仅MRL模型)。MRL-Fas^lpr小鼠每两周检查蛋白尿，皮肤损伤和淋巴结病，NZBWF1/J小鼠每两周检查蛋白尿。蛋白尿利用Albustix(Bayer,Tarrytown,NY)测定并根据以下标准评分0–5：0＝无；1＝痕量；2＝30mg/dL；3＝100mg/dL；4＝300mg/dL；和5＝≥2000mg/dL。淋巴节可触及并对淋巴结病评分为0–3：0＝无；1＝小；2＝中等，两个不同部位；3＝大，三个或更多不同部位。皮肤损伤利用宏观病理学评估并评分为0–3：0＝无；1＝小(面部，耳朵)；2＝中等(<2cm面部、耳朵和背部)；3＝严重(>2cm面部，耳朵和背部)。两个模型中的血清每两周收集一次用来通过酶联免疫测定(ELISA)检测抗dsDNAIgG血清抗体。在研究结束时，将脑、肺和肾收集在10％非缓冲福尔马林中用于病理分析或冷冻在最佳切片温度(OCT)化合物中用于免疫组化分析。

抗dsDNA血清抗体和M-CSF ELISA

抗dsDNA IgG血清抗体通过ELISA测定。简而言之，Immulon1B板(Thermolab Systems,Billerica,MA)UV照射过夜然后用2μg/mL小牛胸腺DNA(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)在室温包被1小时。板用磷酸缓冲盐水(PBS)加1％牛血清白蛋白(BSA)封闭，加入稀释血清样品(在1:100滴度开始)，结合抗体利用抗小鼠IgG抗体的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗体(Southern Biotech,Birmingham,AL)检测。板用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB；KPL,Gaithersburg,MD)显色并用2N硫磺酸终止。吸光度利用SpectraMax Plus384酶标仪和SoftMax Pro软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在450nm读数。通过利用收集自患病MRL-Fas^lpr或NZBWF1/J小鼠的标准阳性对照血清测定抗体(任意单位)。M-CSF血清水平通过抗鼠M-CSF试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN；Cat.#MC00)如厂商说明测定。

组织学

在MRL-lpr研究中，检查肾脏的病理学和Ig和C3沉积。对福尔马林固定的左右肾脏标本进行苏木精和伊红(H&E)染色和过碘酸-希夫(PAS；以苏木精复染)染色。将左右肾脏冷冻在液氮中，然后针对C3、IgG和IgM进行免疫组化染色。所有组织切片均由具有全面资格的兽医病理学家检查。通过免疫组化检查F4/80染色的巨噬细胞。

结果

在8周龄的MRL-lpr小鼠上设计研究以测试以中和性抗体5A1(参见，例如，Campbell I.K.,et al.,J.Leuk.Biol.68:144-150(2000)和ATCC NumberCRL-2702)阻断M-CSF的效应。每日给小鼠腹腔注射(IP)400μg抗体(10mg/kg)共12周。使用相同剂量的同种型对照抗体CHOCK IgG1(参见，例如，ATCC Number HB-9421)或盐水处理对照小鼠。小鼠还以CTLA-4Ig(融合于含有效应物功能无效突变的小鼠IgG2a的小鼠CTLA4的胞外结构域)处理作为阳性对照。每两周检查小鼠的血清抗dsDNA抗体、蛋白尿、皮肤病变和淋巴结病。研究设计概述于表7。

表7：测试抗M-CSF抗体在MRL^lpr狼疮模型中的功效的研究设计

处理	数量	IP剂量	显微镜检查的动物a
				盐水	10	100μL3x/周	1-10
CTLA-4Ig	10	10mg/kg,3x/周	11-20
				大鼠抗M-CSF Ab5A1	10	400μg3x/周	31-40
大鼠CHOCK IgG1对照Ab	10	400μg3x/周	41-40

a.每只动物检查一份H&E染色、一份PAS染色、一份C3-免疫染色、一份IgG-免疫染色、一份IgM免疫染色和一份对照抗体免疫染色的切片。

如图5所示，阳性对照蛋白质CTLA-4Ig和抗M-CSF抗体处理显著降低了MRL-lpr小鼠淋巴结病的严重程度。图6显示，以抗M-CSF抗体处理还显著降低了该模型出现的皮肤病变的严重程度。有趣的是，抗M-CSF处理预防MRL-lpr小鼠出现皮肤病变，与此不同的是，CTLA-4Ig处理降低了MRL-lpr小鼠皮肤病变的严重程度。

如图7所示，与同种型对照处理的小鼠相比，这些小鼠在12周的时间点产生的抗dsDNA抗体较少；而以CTLA-4Ig处理在4个测试时间点均非常有效的降低了抗dsDNA抗体产生。

在这一研究中，小鼠没有出现显著的蛋白尿；因此也没有评价肾脏功能。显微镜检查发现，仅施用CTLA-4Ig与对炎性浸润和蛋白管型的严重程度、肾小球簇大小、肾小球构成和肾小球IgG沉积严重程度的有益影响相关。如图8所示，与施用盐水或同种型对照相比，施用大鼠抗M-CSF抗体与较低的肾小球构成和轻度降低的C3免疫组织化学染色积分的组平均值相关。然而，这并不与对所测量的任何其他参数的任何其他明显的有益影响相关。

随后的研究评价了抗M-CSF抗体5A1在减轻NZBWF1/J模型的狼疮性肾炎中的功效。以400μg(10mg/kg)的对照Ig或抗M-CSF或盐水处理26周龄的小鼠，每周3次IP共10周。每两周对小鼠的蛋白尿、体重增加/减轻和抗dsDNA滴度进行评分。给药10周后手机肾脏并检查病理学和免疫复合物沉积。表8描述了该研究设计。

表8：测试抗M-CSF抗体在NZBWF1/J狼疮模型中的功效的研究设计

a.每只动物检查一份H&E和一份PAS染色的切片和两份F4/80免疫染色的组织切片

b.每只动物检查4份IgG、IgM和C3的免疫染色组织切片

如图9所示，在NZBWF1/J狼疮模型中，与同种型对照相比，从给药后4周开始直至研究结束，抗M-CSF处理对蛋白尿的产生均具有显著的作用。然而，在这一模型中，以M-CSF抗体处理没有影响造成免疫复合物沉积和肾脏损害的抗dsDNA自身抗体的产生。如图10所示，在给药后的第6和10周时间点，抗dsDNA抗体水平与盐水、同种型对照和抗M-CSF处理的小鼠相似。图11显示，ELISA测定发现，以M-CSF抗体升高了M-CSF的血清水平，表明该抗体与其靶反应并隔离了血清中的M-CSF。

如图12所示，对研究结束后收集的并对免疫沉积物染色的肾脏进行显微镜检查发现，在所有3个处理组，IgG、IgM和C3染色的水平相似。有趣的是，与以同种型对照处理的小鼠相比，来自以抗M-CSF处理的小鼠的肾脏显示出轻度降低的巨噬细胞(F4/80阳性细胞，由成熟巨噬细胞表达的一种跨膜蛋白)染色。肾脏的巨噬细胞F4/80染色出现于所有小鼠的外部髓质和内部皮质区的间质细胞。与施用CHOCK IgG1同种型对照抗体的小鼠相比，施用盐水或大鼠抗M-CSF的小鼠的这些部位较少的细胞出现染色，提示阻断M-CSF对该模型的肾脏中的巨噬细胞浸润具有影响。抗M-CSF处理似乎还减轻了NZBWF1/J小鼠肾脏内的肾脏蛋白管型以及嗜碱细胞增多和退化。与施用CHOCK IgG1同种型对照的小鼠相比，施用盐水或抗M-CSF的动物中的这些表现严重程度较低。

实施例XII

研究设计

这是随机双盲(赞助商非盲)安慰剂对照剂量递增6组贯续平行研究，目的在于研究以静脉(IV)剂型施用于健康成年志愿者的6个单剂量水平的人单克隆抗M-CSF抗体8.10.3F的安全性和耐受性。

对象处理

总共48个对象入选本研究。第1至5组的对象接受剂量为3、10、30、100或300mg的抗体8.10.3F或者安慰剂，给药后这些对象在CRU(重症监护室)中留观3天，然后出院，随后按照计划返回CRU。第6组的对象以100mg抗体8.10.3F或安慰剂处理，给药后这些对象在CRU中留观21天，然后出院，随后按照计划返回CRU。在各水平组中，6个对象接受单剂量抗体8.10.3F，2个对象接受单剂量安慰剂。所有入选对象均完成了实验。

药代动力学评估

A)用于分析抗体8.10.3F的血清

在给药前和方案设计的给药后时间点直至第28天以及第28天后每次门诊随诊时收集用于分析抗体8.10.3F的样品。将3mL静脉血收集到适当标记的含有添加物的管中，在收集后40分钟内离心，在收集后60分钟内将血清冻存在大约-70℃。

在PPD Development(2244Dabney Road,Richmond,VA23230,USA)使用有效的分析方法分析血清样品的抗体8.10.3F。使用有效的敏感且特异性的酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定抗体8.10.3F样品。血清标本储存在-70℃直至使用，且样品在建立矩阵稳定性数据的439天之内测定。通过在校准的标准曲线(范围在35.0ng/mL至1600ng/mL)上的插入值确定样品浓度，该曲线已经使用4-参数逻辑方程进行拟合。浓度超出定量上限值(1600ng/mL)的样品经充分稀释后插入至校准范围。抗体8.10.3F的LLOQ(定量下限值)是35.0ng/mL。血清抗体8.10.3F浓度低于LLOQ的临床标本报告为<35.0ng/mL。

日间测定准确度以估计值与理论质控(QC)浓度的比例(％)表示，低、中、高和稀释QC样品的范围在-7.81％至2.22％。低(75.0ng/mL)、中(320ng/mL)、高(1200ng/mL)和稀释(1200ng/mL,16000ng/mL和160000ng/mL)浓度的测定精密度，表示为与QC样品的估计浓度的日间变异系数(CV％)，均低于10.0％。

B)药代动力学参数的计算

对血清浓度-时间数据进行不分区分析以计算经各种处理的各对象的抗体8.10.3F PK参数值。研究设计不包括在IV输注期间的PK采样。鉴于预期抗体8.10.3F具有长末段t1/2，预期输注期间的浓度-时间曲线下面积(AUC)相对于AUC极小，因此未试图估计输注期间或结束时的浓度。

低于LLOQ的样品被归于0。样品的实际收集时间被用于PK分析。使用WinNonlin version4.0.1计算药代动力学参数值。

药效动力学评估

A)用于分析CD14 ⁺ 16 ⁺ 单核细胞的全血

在给药前和给药后第2、4、7、14和28天以及第28天后每次门诊随诊时收集用于分析CD14⁺16⁺单核细胞的样品。将3mL静脉血收集到2个管中，其一含有肝素锂，另一含有EDTA钾。在收集后2小时内分析样品。使用有效的敏感且特异性流式细胞术测定法(Becton-Dickinson FACSCaliburFlow Cytometry)以全血样品分析人外周血的单核细胞亚群(CD14和CD16)百分比，测定在Pfizer Drug Safety Research&Development(DSRD),PGRD,Ann Arbor,Michigan进行。基于细胞散射光和发射荧光信号的能力来区分单核细胞亚群。

对于总体样品分析的测定性能特征，使用BD CaliBRITE珠来调整仪器的设置，在每一次单核细胞亚群-CD14/16测定之前设定荧光补偿并评估仪器的敏感性。

B)用于骨骼特异性碱性磷酸酶(BSAP)的血清

在给药前和给药后第2、4、7、14和28天以及第28天后每次门诊随诊时收集用于分析BSAP的样品。将5mL静脉血收集到不含添加物的管中，在收集后40分钟内离心，在收集后60分钟内将血清分为大约等体积转移至2个管中并冻存在大约-70℃。

在Pacific Biometrics Inc.(PBI)(220West Harrison Street,Seattle,Washington98119,US)使用有效的分析方法分析血清样品的BSAP浓度。使用有效的敏感且特异性的酶免疫测定法(EIA)测定BSAP样品。验证期间记录方法的性能。血清标本储存在-70℃直至使用，且样品在验证期间产生的建立的稳定性数据的365天之内测定。通过在校准的标准曲线上的插入值确定样品浓度，该曲线已经使用4-参数逻辑方程进行拟合。浓度超出ULOQ(140U/L)的样品经充分稀释后插入至校准范围。以观测检测限(LOD)所表示的BSAP的测定敏感性为0.4U/L。血清BSAP浓度低于LOD的临床标本报告为低于检测下限。

通过OC评估测定性能特征。将3个水平的QC置于每次运行。运行接受度标准是：3个QC结果中的2个必须是在2.0标准差指数(SDI)之内，而第3个必须是在2.5SDI之内。对于所有4次样品分析运行，平均运行SDI的范围为QC样品的-1.1至0.8。

C)用于分析NTX-1的尿液

在给药前和给药后第2、4、7、14和28天以及第28天后每次门诊随诊时收集用于分析NTX-1的尿液。将次日空腹晨尿收集到清洁容器中，在每一时间点收集5ml用于NTX-1，收集2个额外的5ml用于计划中的探究性生物学标记物分析。样品冻存在大约-70℃。

在Pacific Biometrics Inc.(PBI)(220West Harrison Street,Seattle,Washington98119,USA)使用有效的分析方法分析用于分析尿液交联的胶原蛋白I(uNTX-1)的N-端肽浓度的尿液样品。使用有效的敏感且特异性的NTX-1ELISA和有效的尿液肌酐动力学Jaffe测定uNTX-1样品。

尿液标本储存在-70℃直至使用，且样品在验证期间产生的建立的稳定性数据的365天之内测定。通过在校准的标准曲线上的插入值确定样品NTX-1浓度，该曲线已经使用4-参数逻辑方程进行拟合。浓度超出ULOQ(3000nM当量/L)的样品经充分稀释后插入至校准范围。NTX-1的以LLOQ所表示的NTX-1测定敏感性是44.0nM当量/L。NTX-1浓度低于LLOQ的临床标本报告为低于检测下限。

NTX-1测定值被标准化为骨骼胶原蛋白的相当量，并以nM骨骼胶原蛋白当量/L(nmol BCE/L)表示。通过分析尿液肌酐针对尿液稀释来校正uNTX-1测定值，并以nM骨骼胶原蛋白当量/L(nM BCE)/毫摩尔肌酐/L(mM肌酐)表示。

通过质控(QC)评估测定性能特征。将3个水平的QC置于每次运行。运行接受度标准是：3个QC结果中的2个必须是在2.0标准差指数(SDI)之内，而第3个必须是在2.5SDI之内。对于所有4次样品分析运行，平均运行SDI的范围为NTX-1QC样品的-0.2至0.8，而对于尿液肌酐QC样品为-0.1至0.2。

D)用于分析总人M-CSF的K ₂ EDTA血浆

使用针对探索性生物标记物收集的K₂EDTA血浆样品分析总M-CSF。在给药前和第2、7和28天，以及第28天后的每次额外门诊患者访问时收集样品。在不含EDTA钾盐(K2EDTA)作为抗凝剂的血液收集管中获得10mL静脉血样品。离心后，血浆冷冻储存于大约-70℃。ELISA测定试剂盒(DMC00)来自R&D Systems,Inc.(614McKinley Place NE,Minneapolis55413)。在该测定中采用定量夹心酶免疫测定技术且测定操作和主要试剂遵循试剂盒说明。K₂EDTA血浆样本储存于大约-70℃直至测定。通过使用4-参数逻辑方程拟合的校准标准曲线(跨越31.2pg/mL至2000pg/mL的范围)的插值确定样品浓度。具有高于定量上限(2000pg/mL)的浓度的样品充分稀释至校准范围。M-CSF的定量下限(LLOQ)为31.2pg/mL。血清M-CSF浓度低于LLOQ的临床样品报道为<31.2pg/mL。

在Pfizer Discovery-Molecular Pharmacology,PGRD,Ann Arbor,Michigan使用商业可得的分析K₂EDTA血浆样品的M-CSF浓度。

结果

A)血清抗体8.10.3F药代动力学

表9和表10含有健康患者中施用单一IV剂量后的血清抗体8.10.3F 药代动力学参数的总结。施用每剂后的平均血清浓度-时间谱示于图13。Cmax和AUC值vs.抗体8.10.3F剂量的图示于图14.

在1小时给健康成人志愿者施用抗体8.10.3F的单一输注后，Cmax以剂量比例方式增加。然而，全身性暴露的程度，AUC(0-∞)，在3-300mg的剂量范围以比剂量比例方式更高的方式增加。因为系统的非线性，并不认为表观终点t1/2(用于计算AUC[0-∞])是暴露持续时间的有意义的量度。相反，全部对象抗体8.10.3F浓度低于LLOQ的研究日通过调查浓度-时间表确定。血清抗体8.10.3F浓度在施用3、10、30、100和300mg剂量后分别在第7、14、28、56和84天低于LLOQ。

表9：给健康对象施用单一静脉内溶液剂量后血清抗体8.10.3F药代动力学参数值的总结

^a对tmax为中位数(范围)；对其它参数为算数平均(％CV)

^b门诊患者和住院患者组合并。

^c所有对象中血清浓度低于定量下限(LLQ＝0.035μg/ml)的研究日

N＝对象数目

表10：给健康对象施用单一静脉内溶液剂量后平均血清抗体8.10.3F浓度(ng/mL)

^a以标称研究日总结数据:针对300mg剂量组的第28天组合6个患者中的5个在第28天收集的数据和另一患者在第29天收集的数据。

类似地，针对300mg剂量组的第56天组合6个患者中的4个在第56天收集的数据和6个患者中另外2个在第58天收集的数据。

^b低于定量限的平均值和/或中位数值反映包括在计算中报道为BLQ(<35ng/mL)为0的样品。

B)总血清M-CSF

总(游离的和结合抗体8.10.3F的)M-CSF浓度相对剂量和研究日示于表11且针对100-mg剂量示于图15。

在安慰剂处理组，基线处的平均M-CSF浓度为0.21ng/mL，并且在给健康成年志愿者施用安慰剂后基本上不改变(范围0.21-0.28ng/mL)直至第84天(表11)。

施用抗体8.10.3F后，最大平均M-CSF浓度随着剂量增加而增加。总M-CSF的峰浓度在第2或第7天获得。

施用针对抗体8.10.3F的平衡解离常数(K_D2.8x10^-10M)以及M-CSF和抗体8.10.3F的浓度确定游离和结合配体的比率，计算出在抗体8.10.3F可检测的时间内，100％的测量的M-CSF配体结合抗体8.10.3F。尽管M-CSF的取样频率不如抗体8.10.3F的取样频繁，M-CSF浓度与抗体8.10.3F平行地下降，提示M-CSF的暂时增加随后作为抗体-抗原复合物被清除。

表11：给健康对象施用单一静脉内溶液剂量后的平均M-CSF浓度(ng/mL)

^a100mg剂量的第56天组合组4在第56天和组6在第52天进行的测量。

原始数据储存于ePharm，人工编号1236578。

C)CD14 ⁺ 16 ⁺ 单核细胞

图16显示研究28天时对CD14⁺16⁺单核细胞计数的计量应答(CD14^brightCD16⁺和CD14^dimCD16⁺的总数)。表12通过剂量和研究天数来显示平均CD14⁺16⁺单核细胞计数，图17和图18对100-mg剂量进行了图示。图17中56天的数据与56天组4和52天组6的测量结果组合。显示CD14⁺16⁺细胞计数数据的全部图不包括被认为是离群值的单个观察结果。研究28天的对象1031(100-mg)具有179.0细胞/mcl的报告值。

对于全部剂量在4天时，用抗体8.10.3F治疗引起外周循环CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值的快速下降，最低值为约60％至80％的抑制率。增加剂量保持更长时期内CD14⁺CD16⁺单核细胞的抑制率。对于3和10mg剂量，CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值在14天内返回至基线；对于30mg剂量，CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值在28天内返回至基线；对于100和300mg剂量，CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值在56天内返回至基线。

表12：对健康对象施用单次静脉内溶液剂量后的CD14⁺16⁺单核细胞计数(细胞/μL)

D)BSAP和uNTX-1

抗体8.10.3F的治疗与uNTX-1(破骨细胞的骨再吸收活性的标志物)中剂量和时间依赖性的降低相关。uNTX-1的降低速率对于CD14⁺CD16⁺单核细胞而言较慢，且抑制率的恢复被更加地延长。在30、100和300mg剂量组中，uNTX-1降低至最低64.4、60.5和39.9％的基线值，其分别出现在7、14和28天。对于相同的各剂量组，在28天，平均uNTX-1为78.0、69.4和39.3％。对于≤100mg的剂量，uNTX-1在约56天返回至基线。

表13通过剂量和研究天数来显示平均uNTX-1，图19对100-mg剂量进行了图示。

BSAP水平不受到剂量增加至100mg(包括100mg)的治疗的影响。在300mg，在7至28天观察到BSAP增加的趋势，随后在56天返回至基线。然而，在接受300mg的对象中观察到的最大绝对值可与包括安慰剂在内的其它治疗组中观察到的值相匹配。

表13：对健康对象施用单次静脉内溶液剂量后的平均uNTX-1(nM BCE/mM肌酸酐)

讨论

在向健康成年志愿者施用3-300mg单次静脉内剂量后抗体8.10.3F通常很好地被耐受。抗体8.10.3F治疗引起药效标志物(其在药物清除后是可逆转的)的快速变化。此机理的主要生物标志物是大量循环CD14⁺CD16⁺单核细胞，其已与临床前的关节炎模型的功效相结合。在4天时，全部剂量的抗体8.10.3F治疗引起CD14⁺CD16⁺单核细胞的快速下降，最低值为约60％至80％的抑制率。增加剂量保持更长时期内CD14⁺CD16⁺单核细胞的抑制率。对于3和10mg剂量，CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值在14天内返回至基线；对于30mg剂量，CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值在28天内返回至基线；对于100和300mg剂量，CD14⁺CD16⁺单核细胞的绝对值在56天内返回至基线。

基于使用替代抗体的临床前模型，预测提供治疗益处的剂量是维持CD14⁺CD16⁺单核细胞抑制率在基线值≤50％水平的剂量。在此研究中，≥30mg的剂量能够持续至少14天抑制循环CD14⁺CD16⁺单核细胞低于基线值的50％。30mg剂量在研究7、14和28天分别具有基线的25％、46％和120％的中位CD14⁺CD16⁺单核细胞值。100mg剂量在研究7、14和28天分别具有基线的19％、26％和61％的中位CD14⁺CD16⁺单核细胞值。CD14⁺CD16⁺单核细胞可随着重复给药进一步降低。

预测M-CSF的抑制会抑制导致骨再吸收的抑制的破骨细胞分化。抗体8.10.3F的治疗与uNTX-1中剂量和时间依赖性的降低相关。uNTX-1的降低速率对于CD14⁺CD16⁺单核细胞而言较慢，且抑制率的恢复被更加地延长。在30、100和300mg剂量组中，uNTX-1降低至最低64.4、60.5和39.9％的基线值，其分别出现在7、14和28天。对于相同的各剂量组，在28天，平均uNTX-1为78.0、69.4和39.3％。对于≤100mg的剂量，uNTX-1在约56天返回至基线。BSAP水平不受到剂量增加至100mg(包括100mg)的治疗的影响。在300mg，在7至28天观察到BSAP增加的趋势，随后在56天返回至基线。然而，在接受300mg的对象中观察到的最大绝对值可与包括安慰剂在内的其它治疗组中观察到的值相匹配。

所有于本说明书所引用的公开及专利公开是以引用的方式并入本文中，其方式犹如各单独公开或专利公开是特别且单独指明以引用的方式并入本文中。为供清楚了解的目的，前述本发明通过说明及实施例的方式进行了一定程度的描述，但对熟谙本领域的一般技术人员而言，很明显的可按照本发明的指导而做出某些改变及修饰而不偏离所附申请权利要求的精神或范围。

序列表

关键词:

信号肽:下划线小写字体

CDR1,2,3:下划线大写字体

可变区:大写字体

恒定区:小写字体

自种系的突变：粗体

SEQ ID NO:1

252重链[γ链]核苷酸序列

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SEQ ID NO:2

252重链[γ链]蛋白质序列

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SEQ ID NO:3

252轻链[K链]核苷酸序列

atgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGC AAGTCAGAGCATTAGCG CT TTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCT CATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGAGTTACAGT CCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgctagcgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:4

252轻链[K链]蛋白质序列

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SEQ ID NO:5

88重链[γ链]核苷酸序列

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SEQ ID NO:6

88重链[γ链]蛋白质序列

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SEQ ID NO:7

88轻链[K链]核苷酸序列

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SEQ ID NO:8

88轻链[K链]蛋白质序列

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SEQ ID NO:9

100重链[γ链]核苷酸序列

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SEQ ID NO:10

100重链[γ链]蛋白质序列

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SEQ ID NO:11

100轻链[K链]核苷酸序列

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SEQ ID NO:12

100轻链[K链]蛋白质序列

meapaqllfllllwlpdttgEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRA GIPRSGSGSGTEFTLIISSLQSEDFAVYYCQQSNNWPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:14

3.8.3重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLLQMNSLRAEDTAVYYCAR LTG DYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:16

3.8.3轻链[K链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwfpgsrcDIQMTQSPSSVSASVGDRVTICRASQ IS WLAWYQQKPGKAPKLLISA SSL SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ NSFPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:18

2.7.3重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvallrgcqcQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA IWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGY YFDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:20

2.7.3轻链[K链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwfpgsrcDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ ISSWLAWYQKPGKAPKLIYAASSL SGVPSRFGSGSGTDFTLISSLQPEDFATYYCQQ NSFPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:22

1.120.1重链[γ链]蛋白质序列

mewtwsflflvaaatgahsQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQ RVTMTTDTSTTAYMELRSLRSDDTAVYYCA YG N FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:24

1.120.1轻链[K链]蛋白质序列

mvlqtqvfislllwisgaygDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQS L SNNKNYLAWYQKPGQPPLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYS PW TFGQGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:25

9.14.4I重链[γ链]核苷酸序列

atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTATATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAG ACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCTAACTGGGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTtccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO:26

9.14.4I重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:27

9.14.4,9.14.4I,9.14.4-Ser和9.14.4-G1轻链[K链]核苷酸序列

atggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGCCAAGTCAGATCATTAGCAGTTTATTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:28

9.14.4,9.14.4I,9.14.4-Ser和9.14.4-G1轻链[K链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR SQ ISS LNWYQQKPGKAPKLLI AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:37

9.14.4重链[γ链]核苷酸序列

atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTATATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAG ACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCTAACTGGGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTtccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO:38

9.14.4重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:54

9.14.4C-Ser重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:56

9.14.4C-Ser,9.14.4-CG2和9.14.4-CG4轻链[K链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR SQ ISS LNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:74

9.14.4-CG2重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:78

9.14.4-CG4重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:82

9.14.4-Ser重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO.101

9.14.4G1重链(γ链)核苷酸序列

atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTATATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCTAACTGGGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTtccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag

SEQ ID NO102

9.14.4G1重链(γ链)蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR LT GDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:29

8.10.3和8.10.3F重链[γ链]核苷酸序列

atggagttggggctgtgctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgtGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTTTAGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGAAGTAGTACCATATCCTACGCAGACT CTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGA TCCTCTTCTAGCGGGAGCTACCTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCtccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO:30

8.10.3和8.10.3F重链[γ链]蛋白质序列

melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SM WVRQAPGKGLEWVSYISS SSTI YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR G FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:31

8.10.3FG1和8.10.3F轻链[K链]核苷酸序列

atggaaaccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggaGAATTTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGTTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:32

8.10.3FG1和8.10.3F轻链[K链]蛋白质序列

metpaqllfllllwlpdttgEVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:43

8.10.3和8.10.3-Ser轻链[K链]核苷酸序列

atggaaaccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggaGAATTTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGTTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGTAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:44

8.10.3和8.10.3-Ser轻链[K链]蛋白质序列

metpaqllfllllwlpdttgEVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:58

8.10.3C-Ser重链[γ链]蛋白质序列

melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SM WVRQAPGKGLEWVSYISS SSTI YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR G FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:60

8.10.3-CG2,8.10.3-CG4和8.10.3C-Ser轻链[k链]蛋白质序列

metpaqllfllllwlpdttgEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:62

8.10.3-CG2重链[γ链]蛋白质序列

melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SM WVRQAPGKGLEWVSYISS SSTI YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR G FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:90

8.10.3-Ser重链[γ链]蛋白质序列

melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SM WVRQAPGKGLEWVSYISS SSTI YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR G FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:94

8.10.3-CG4重链[γ链]蛋白质序列

melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SM WVRQAPGKGLEWVSYISS SSTI YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR G FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:97

8.10.3FG1重链核苷酸序列

atggagttggggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTTTAGTATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGAAGTAGTACCATATCCTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCTCTTCTAGCGGGAGCTACCTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCtccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag

SEQ ID NO:98

8.10.3FG1重链(γ链)蛋白质序列

melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS SM WVRQAPGKGLEWVSYISS SSTI YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR G FDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:33

9.7.2IF重链[γ链]核苷酸序列

atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtcAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACT CTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCG TATAGGAGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTtccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO:34

9.7.2IF重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA I GMDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:35

9.7.2IF轻链[K链]核苷酸序列

atggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCC GGGCAAGTCAGAGCATTAGCGGCTTTTTAATTTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:36

9.7.2IF轻链[k链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS L WYQQPGKAPKLLIYA SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:45

9.7.2重链[γ链]核苷酸序列

atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtcAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACT CTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCG TATAGGAGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTtccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO:46

9.7.2重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA I GMDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:47

9.7.2和9.7.2-Ser轻链[K链]核苷酸序列

atggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCC GGGCAAGTCAGAGCATTAGCGGCTTTTTAATTTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATTAAGGTTCAGTGGCAGTGAATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO:48

9.7.2和9.7.2-Ser轻链[K链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS L WYQQPGKAPKLLIYA SSLQSGVPRFSGSSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:50

9.7.2C-Ser重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAI I G MDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:52

9.7.2C-Ser,9.7.2-CG2和9.7.2-CG4轻链[K链]蛋白质序列

mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS L WYQQKPGKAPKLLIYA SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO:66

9.7.2-CG2重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAI I G MDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:70

9.7.2-CG4重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA I G MDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO:86

9.7.2-Ser重链[γ链]蛋白质序列

mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA I GMDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

Claims (37)

1.一种治疗狼疮的方法，其包括给有需要的个体施用治疗有效量的特异性结合M-CSF的人单克隆抗体或其抗原结合部分。

2.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分具有以下特性中的至少一种：

a)结合人M-CSF的分泌亚型和M-CSF的膜结合亚型；

b)对M-CSF的选择性是其对GM-CSF或G-CSF的选择性的至少100倍；

c)以1.0x10^-7M或更低的K_D结合M-CSF；

d)对M-CSF的解离速率(k_off)为2.0x10^-4s^-1或更小；或

e)在存在人c-fms的情况下结合人M-CSF。

3.权利要求2的方法，其中所述抗体或抗原结合部分阻断与c-fms的结合并以1.0x10^-7M或更低的K_D结合M-CSF。

4.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分具有以下特性中的至少一种：

a)与选自如下一组的抗体交叉竞争结合M-CSF：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

b)与选自如下一组的抗体竞争结合M-CSF：252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

c)与选自如下一组的抗体结合M-CSF的相同的表位：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

d)以与选自如下一组的抗体基本上相同的K_D结合M-CSF：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；和

e)以与选自如下一组的抗体基本上相同的解离速率结合M-CSF：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1。

5.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分选自以下一组：

a)抗体，其包含SEQ ID NO:2所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

b)抗体，其包含SEQ ID NO:6所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:8所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

c)抗体，其包含SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

d)抗体，其包含SEQ ID NO:14所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:16所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

e)抗体，其包含SEQ ID NO:18所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:20所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

f)抗体，其包含SEQ ID NO:22所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:24所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

g)抗体，其包含SEQ ID NO:26所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:28所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

h)抗体，其包含SEQ ID NO:38所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:28所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

i)抗体，其包含SEQ ID NO:54所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

j)抗体，其包含SEQ ID NO:74所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

k)抗体，其包含SEQ ID NO:78所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

l)抗体，其包含SEQ ID NO:82所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:28所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

m)抗体，其包含SEQ ID NO:102所示的重链氨基酸序列和SEQ IDNO:28所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

n)抗体，其包含SEQ ID NO:30所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:32所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

o)抗体，其包含SEQ ID NO:30所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:44所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

p)抗体，其包含SEQ ID NO:58所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:60所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

q)抗体，其包含SEQ ID NO:62所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:60所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

r)抗体，其包含SEQ ID NO:90所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:44所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

s)抗体，其包含SEQ ID NO:94所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:60所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

t)抗体，其包含SEQ ID NO:98所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:32所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

u)抗体，其包含SEQ ID NO:34所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:36所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

v)抗体，其包含SEQ ID NO:46所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:48所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

w)抗体，其包含SEQ ID NO:50所示的重链氨基酸序列和SEQ IDNO:52所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

x)抗体，其包含SEQ ID NO:66所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；

y)抗体，其包含SEQ ID NO:70所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列；和

z)抗体，其包含SEQ ID NO:86所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:48所示的轻链氨基酸序列，但不具有信号序列。

6.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分包含：

a)重链CDR1、CDR2和CDR3，其独立地选自如下一组的抗体的重链：单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；或

b)轻链CDR1、CDR2和CDR3，其独立地选自如下一组的抗体的轻链：单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1。

7.权利要求1的方法，其中：

a)所述抗体或抗原结合部分包含选自如下一组的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

b)所述抗体或抗原结合部分包含选自如下一组的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

c)所述抗体包含(a)的重链和(b)的轻链；或

d)所述抗体或抗原结合部分包含(a)的重链和(b)的轻链，其中所述重链和轻链CDR氨基酸序列选自同一抗体。

8.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分包含：

a)重链，其包含选自如下一组的抗体的重链中从CDR1起始处至CDR3结束处的氨基酸序列：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

b)轻链，其包含选自如下一组的抗体的从CDR1起始处至CDR3结束处的氨基酸序列：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1；

c)(a)的重链和(b)的轻链；或

d)(a)的重链和(b)的轻链，其中所述重链和轻链序列选自同一抗体。

9.权利要求1的方法，其中所述单克隆抗体或抗原结合部分包含：

a)选自如下一组的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1，但不具有信号序列；

b)选自如下一组的抗体的轻链可变区(VL)氨基酸序列：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1，但不具有信号序列；

c)(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或

d)(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，其中所述VH和VL来自同一抗体。

10.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分包含选自如下一组的抗体的一或多个FR1、FR2、FR3或FR4氨基酸序列：抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1和9.14.4G1。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的重链无C末端赖氨酸。

12.权利要求1的方法，其中所述抗体包含：

a)重链氨基酸序列，其与单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的重链氨基酸序列具有至少90％的相同性，但不具有信号序列；

b)轻链氨基酸序列，其与单克隆抗体252、88、100、3.8.3、2.7.3、1.120.1、9.14.4I、8.10.3F、9.7.2IF、9.14.4、8.10.3、9.7.2、9.7.2C-Ser、9.14.4C-Ser、8.10.3C-Ser、8.10.3-CG2、9.7.2-CG2、9.7.2-CG4、9.14.4-CG2、9.14.4-CG4、9.14.4-Ser、9.7.2-Ser、8.10.3-Ser、8.10.3-CG4、8.10.3FG1或9.14.4G1的轻链氨基酸序列具有至少90％的相同性，但不具有信号序列；或

c)(a)的重链氨基酸序列和(b)的轻链氨基酸序列。

13.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分包含：

a)重链氨基酸序列，其与单克隆抗体8.10.3F的重链氨基酸序列具有至少90％的相同性，但不具有信号序列；

b)轻链氨基酸序列，其与单克隆抗体8.10.3F的轻链氨基酸序列具有至少90％的相同性；

c)(a)的重链氨基酸序列和(b)的轻链氨基酸序列；或

d)重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，它们一起与抗体8.10.3F的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列具有至少90％的相同性。

14.权利要求13的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的重链氨基酸序列与单克隆抗体8.10.3F的重链氨基酸序列具有至少95％的相同性，但不具有信号序列。

15.权利要求13的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的轻链氨基酸序列与单克隆抗体8.10.3F的轻链氨基酸序列具有至少95％的相同性，但不具有信号序列。

16.权利要求13的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列两者一起与单克隆抗体8.10.3F的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列具有至少95％的相同性，但不具有信号序列。

17.权利要求13的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的重链氨基酸序列与单克隆抗体8.10.3F的重链氨基酸序列具有至少97％的相同性，但不具有信号序列。

18.权利要求13的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的轻链氨基酸序列与单克隆抗体8.10.3F的轻链氨基酸序列具有至少97％的相同性，但不具有信号序列。

19.权利要求13的方法，其中所述抗体或抗原结合部分的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列两者一起与单克隆抗体8.10.3F的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列具有至少97％的相同性，但不具有信号序列。

20.权利要求1的方法，其中所述抗体是单克隆抗M-CSF抗体8.10.3F。

21.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分包含抗体8.10.3F的重链CDR1、CDR2、CDR3和轻链CDR1、CDR2、CDR3。

22.权利要求1的方法，其中所述抗体或抗原结合部分包含抗体8.10.3F的可变重链和可变轻链部分。

23.权利要求1的方法，其中所述狼疮是系统性红斑狼疮(SLE)。

24.权利要求1的方法，其中所述狼疮是狼疮性肾炎。

25.权利要求1的方法，其中所述狼疮是皮肤狼疮。

26.权利要求1的方法，其中通过检查患者情况的改变来确定抗M-CSF抗体治疗狼疮的功效，所述情况选自症状、生物学标记物、组织学样品和生理条件。

27.权利要求26的方法，其中检查患者选自以下一组的情况改变：皮肤损害、蛋白尿、淋巴结病、血清M-CSF水平、抗dsDNA抗体水平、CD14+CD16+单核细胞群、骨细胞标记物和肾脏病理学。

28.权利要求27的方法，其中通过检查选自以下一组的情况来确定肾脏病理学：巨噬细胞浸润、炎性浸润、蛋白管型、肾小球簇大小、肾小球IgG沉积和C3沉积。

29.权利要求26的方法，其中可检查患者选自以下一组的一或多种生物学标记物的改变：表1C中的基因、红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、补体(C3/C4)、Ig水平(IgA、IgM、IgG)、抗核抗体(ANA)、可提取性核抗原(ENA)和抗dsDNA抗体。

30.权利要求1-23任一项的抗M-CSF抗体在治疗有需要的患者的狼疮中的用途。

31.权利要求30的用途，其中所述狼疮是SLE。

32.权利要求30的用途，其中所述狼疮是狼疮性肾炎。

33.权利要求30的用途，其中所述狼疮是皮肤狼疮。

34.权利要求1-23任一项的抗M-CSF抗体在制备治疗狼疮的药物中的用途。

35.权利要求34的用途，其中所述狼疮是SLE。

36.权利要求34的用途，其中所述狼疮是狼疮性肾炎。

37.权利要求34的用途，其中所述狼疮是皮肤狼疮。