CN116096758A - 工程化免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了工程化免疫球蛋白或其片段及它们的制备和使用方法。这些工程化免疫球蛋白衍生自人IgG1，并被工程化以赋予Fcα受体结合能力。另外，这些工程化IgG1免疫球蛋白或其片段可以保持与Fcγ受体和/或FcRn结合。

Description

工程化免疫球蛋白
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2021年4月9日，名称为PAT058736-WO-PCT_SL.txt并且大小为975千字节。
技术领域
本发明涉及包含促进中性粒细胞募集的修饰的工程化免疫球蛋白及其片段，以及它们的制备方法。工程化免疫球蛋白及其片段可用于治疗肿瘤，特别是实体瘤。
背景技术
目前，所有临床批准的抗体均包含免疫球蛋白IgG同种型。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是由识别并结合Fcγ受体(FcγR)的IgG抗体介导的肿瘤细胞杀伤的关键机制。然而，在具有高肿瘤负荷的患者中，可能会发生复发，并且IgG抗体治疗剂可能会失去功效。这主要是由于肿瘤和宿主相关因素，但可能涉及与靶的相互作用改变、细胞存活途径之间的串扰，以及抗凋亡蛋白的参与(Reslan等人,(2009)MABS.[单克隆抗体],1(3):222-9)。IgA通过接合由髓样效应细胞(诸如中性粒细胞和肿瘤驻留骨髓源性抑制细胞(MDSC))表达的Fcα受体(FcαR)，代表了抗体疗法的替代性同种型。IgA是人血清中仅次于IgG的第二丰富的免疫球蛋白；两种单体IgA同种异型(IgA1和IgA2)包含高达25％的人血清免疫球蛋白。在过去，中性粒细胞通常不被认为是潜在的效应细胞。然而，中性粒细胞是循环白细胞中最丰富的群体，并且也显示出浸润实体瘤(Gregory和Houghton(2011)Cancer Res.[癌症研究],71:2411-16；Vogt Sionov等人,(2015)Cancer Microenviron.[癌症微环境],8(3):125-58；Uribe-Querol和Rosales(2015)J.Immunol.Res.[免疫学研究杂志],文章ID:983698；Rosales(2018)Front Physiol.[生理学前沿],9:113)。MDSC也衍生自髓样谱系，并且是最具免疫抑制性的细胞类型之一。已经证明IgA抗体通过募集中性粒细胞和MDSC有效地杀死肿瘤细胞，从而增强ADCC。不幸的是，IgA抗体作为治疗剂的使用受到一些缺点和限制的阻碍，诸如低表达产量和昂贵的纯化方案。另外，生产受到异质糖基化的影响。IgA具有多个可能容易受多聚糖异质性影响的糖基化位点。据报道，人IgA1的单体IgA的瞬时表达水平为30-70μg/L(Lombana等人,(2019)MABS[单克隆抗体],11:1122-38；Meyer等人,(2016)MABS[单克隆抗体],8:87-98)。
因此，仍然需要通过募集中性粒细胞来增强ADCC从而杀死肿瘤细胞的有效方法。我们已经工程化了免疫球蛋白IgG Fc区，以开发能够与FcγR和FcαRI(CD89)结合的IgG，从而通过募集中性粒细胞、MDSC和增强的ADCC来实现肿瘤细胞杀伤。
发明内容
本发明涉及工程化IgG1免疫球蛋白，其包含经修饰的Fc区，使得Fc区可以结合FcαRI(CD89)。为了产生具有这种特性的IgG1免疫球蛋白，设计了一种蛋白质工程化策略来鉴定IgA免疫球蛋白中对与FcαRI结合至关重要的特定氨基酸残基和氨基酸残基区段。在实例中列出我们进行的大量蛋白质工程化工作。最初，进行IgG1恒定结构域至IgA抗体的逐步转移，随后进行IgG1/IgA铰链置换。这随后是IgG1和IgA1 Fc区的晶体结构分析，这导致鉴定出在结构上等效于参与IgA Fc/FcαRI相互作用的IgA残基的IgG1残基。IgG1 CH2/CH3弯头的长度也被缩短以对应于IgA的长度。后续合理设计的使用导致对IgG1的CH2和/或CH3结构域中各种氨基酸残基的修饰，从而用来自IgA的对应残基取代IgG1残基。将半合理设计和结构域切割用于进一步改进IgG1 CH2和CH3结构域的工程化。
因此，在第一方面，本发明提供了能够募集FcαRI功能的工程化IgG1免疫球蛋白。在本披露中，术语“工程化IgG1免疫球蛋白”是指IgG1同种型的非天然存在的免疫球蛋白，其中与野生型IgG1免疫球蛋白相比，至少一个氨基酸残基已经被修饰。在一个实施例中，本披露提供了包含Fc区的工程化IgG1免疫球蛋白或其片段，该Fc区包含第一和第二Fc结构域，其中该第一Fc结构域包含至少一个氨基酸修饰，并且其中该第一Fc结构域与来自野生型IgG1的Fc结构域(氨基酸CH2-1.6至CH3-125(C结构域的IMGT编号)，等效于SEQ ID NO:1的氨基酸231至445(EU编号))具有至少约65％的氨基酸序列同一性，并且其中该工程化IgG1免疫球蛋白或其片段结合并激活人FcαRI。例如，第一Fc结构域可以与来自野生型IgG1的Fc结构域具有至少约65％、70％、75％、80％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在一个实施例中，第一Fc结构域与来自野生型IgG1的Fc结构域具有至少约70％的氨基酸序列同一性。在优选的实施例中，第一Fc结构域与来自野生型IgG1的Fc结构域具有至少约75％的氨基酸序列同一性。
工程化IgG1免疫球蛋白与FcαRI的结合可以根据如通过KD所测量的结合亲和力，或工程化IgG1免疫球蛋白对FcαRI相对于其他Fc受体的选择性，或通过与野生型IgG1免疫球蛋白相比时与FcαRI的竞争性结合来定义。
本披露的工程化IgG1免疫球蛋白对Fc受体(例如，FcαRI或FcγR)的激活可以通过在例如使用效应细胞(诸如多形核细胞(PMN)或外周血单核细胞(PBMC))的细胞杀伤测定中测量ADCC的水平来评价。PMN可以用于表征工程化IgG1免疫球蛋白的α效应子功能，而PBMC可以用于表征γ效应子功能。可以使用不同的细胞系(包括SK-BR-3、Calu-3、MDA-MB-453或MDA-MB-175细胞)来进行细胞杀伤测定。
如本文所定义，Fc结构域包含CH2和CH3结构域。经修饰的第一和/或经修饰的第二Fc结构域可以包含CH2结构域或CH3结构域或CH2和CH3结构域两者中的修饰。修饰可以包括添加或插入、缺失或取代。优选地，该修饰是取代，其中第一Fc结构域中的氨基酸修饰是对应于IgA的Fc结构域(例如野生型IgA1的Fc结构域(SEQ ID NO:254)、野生型IgA2的Fc结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸CH2-1.2至CH3-125(C结构域的IMGT编号))、IgA2的m2同种异型的Fc结构域(SEQ ID NO:3的氨基酸CH2-1.2至CH3-125(C结构域的IMGT编号)；Lombana等人,(2019)MABS[单克隆抗体],11:1122-38；本文中称为“亲代IgA2”)或者IgA1或IgA2的亲和力成熟变体Fc结构域)中的氨基酸的取代。两个或更多个序列之间的对应氨基酸可以通过根据本领域已知并在下文详细描述的方法对序列进行比对来确定。
相对于未经修饰的或野生型Fc结构域，一个或多个氨基酸修饰任选地提供一种或多种优化的特性，尽管在一些情况下，变体表现出与未经修饰的或野生型Fc结构域基本上相同的生物学特性。可以优化的特性包括但不限于与Fc受体(例如FcαRI)的结合。与FcαRI的结合可以被增强或减弱，如通过对FcαRI的亲和力增强或减弱所示。在一个实施例中，本发明的工程化IgG1免疫球蛋白被优化以对人FcαRI具有增强的亲和力。FcαRI的激活刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞通过ADCC机制破坏微生物或受感染细胞，因此与野生型IgG1免疫球蛋白相比，工程化IgG1免疫球蛋白可以具有改善的ADCC。预期此类优化的特性将为工程化IgG1免疫球蛋白或其片段提供增强的人类治疗特性，例如增强的效应子功能和更大的抗癌效力。
“IgA1或IgA2的亲和力成熟变体Fc结构域”在本文中定义为在CH2结构域和/或CH3结构域中包括氨基酸修饰的Fc结构域。相对于非亲和力成熟变体Fc结构域，一个或多个氨基酸修饰任选地提供一种或多种优化的特性，尽管在一些情况下，变体表现出与非亲和力成熟变体Fc结构域基本上相同的生物学特性。可以优化的特性包括但不限于与FcαRI的结合。与FcαRI的结合可以被增强或减弱，如通过对FcαRI的亲和力增强或减弱所示。在一个实施例中，本发明的亲和力成熟变体Fc结构域被优化以对人FcαRI具有增强的亲和力。在一个实施例中，Fc变体的Fc结构域已经亲和力成熟，由此在CH2和/或CH3结构域中进行了氨基酸修饰，以增强Fc区与其靶FcαRI的结合。这种类型的修饰可以改善与靶抗原结合的缔合和/或解离动力学。预期这种优化的特性将为工程化IgG1免疫球蛋白或其片段提供增强的人类治疗特性，例如增强的效应子功能和更大的抗癌效力。
在一个实施例中，包含含有经修饰的第一和第二Fc结构域的Fc区的工程化IgG1免疫球蛋白或其片段表达为同二聚体，其中第一和第二Fc结构域是相同的。使用表面等离子体共振测量Fc区同二聚体对FcαRI的结合亲和力，并且发现其与野生型IgA对FcαRI的结合亲和力(KD)相似。如本文所测试的，发现亲代IgA2对FcαRI的结合亲和力(KD)在约2E-07M和约6E-07M之间，并且发现本披露的工程化IgG1免疫球蛋白的结合亲和力在约2E-10M和约3.5E-06M之间(参见表23、24和47)。在实施例中，本披露的工程化IgG1免疫球蛋白以与亲代IgA2相当的亲和力，或以比亲代IgA2提高至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约100倍或约1000倍的亲和力结合FcαRI。
在本披露的实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白或其片段可以包含选自以下序列并包含在以下序列内的Fc结构域：SEQ ID No:99至123、146至149、165至181。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白或其片段包含SEQ ID NO:122内包含的Fc结构域。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白或其片段包含SEQ ID NO:148内包含的Fc结构域。
然而，对本披露的IgG1免疫球蛋白进行工程化以赋予FcαRI结合特性但却导致了与FcRn结合的丧失。因此，进行了研究以确定野生型IgG1 Fc结构域中对FcRn结合重要的氨基酸残基。发现将这些残基转移至IgA2抗体可以恢复FcRn结合。在一个实施例中，本披露提供了结合并激活人FcαRI并且还结合人FcRn的工程化IgG1免疫球蛋白。在优选的实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白以与野生型IgG1相当的亲和力结合人FcRn。
对本披露的IgG1免疫球蛋白进行工程化以赋予FcαRI结合特性还对工程化IgG1免疫球蛋白结合FcγR和募集γ效应子功能的能力有影响。因此，进行了研究以用来自IgG1的对应残基取代IgA残基，以及对CH2结构域进行另外的氨基酸修饰S239D和I332E/S_CH2.3_D和I_CH2.117_E(C结构域的EU/IMGT编号；“SDIE”突变)。在一个实施例中，本披露提供了结合FcαRI、FcγRIa和FcγRIIIa的工程化IgG1免疫球蛋白。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白或其片段包含SEQ ID NO:148内包含的Fc结构域。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白或其片段包含SEQ ID NO:152内包含的Fc结构域。
将前述实施例的工程化IgG1免疫球蛋白构建为同二聚体。因此，将Fcα和Fcγ效应子功能两者维持在与亲代IgA或野生型IgG1相当的水平是具有挑战性的。为了解决这个问题，利用具有不同结合特性的Fc结构域，将工程化IgG1免疫球蛋白构建为异二聚体。因此，在第二方面，本发明提供了以相当于或优于亲代IgA和野生型IgG1的亲和力结合FcαRI、FcRn和Fcγ受体的工程化IgG1免疫球蛋白。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其包含经工程化以结合FcαRI的第一Fc结构域和包含野生型IgG1的氨基酸序列以结合Fcγ受体和FcRn的第二Fc结构域。替代性地，第二Fc结构域包含衍生自IgA的在空间上位于CH2顶部的残基，例如，堆积的顶部环和二硫键；然而，在此实施例中，不再募集FcγR，并且期望另外的突变来恢复FcRn结合，诸如“LS”或“YTE”突变(下文更详细地描述)。
为了确保工程化免疫球蛋白表达时正确的异二聚体配对，将突变引入第一和第二Fc结构域中以产生突起和对应的空腔。此类“杵臼结构”突变在本领域中有所描述(Merchant等人,(1998)Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681)。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其中第一Fc结构域包含氨基酸突变T336W和S354C/T_CH3.22_W和S_CH3.10_C以引入“杵”，并且第二Fc结构域包含氨基酸突变Y349C、T366S、L368A和Y407V/Y_CH3.5_C、T_CH3.22_S、L_CH3.24_A和Y_CH3.86_V以引入“臼”(C结构域的EU/IMGT编号)。在实施例中，第一Fc结构域可以包含SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、154、159、160、161、162、163或164内包含的Fc结构域。在实施例中，第二Fc结构域可以包含SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、155、156、157或158内包含的Fc结构域。为了进一步改善工程化IgG1免疫球蛋白与FcRn的结合，可以对Fc结构域进行另外的突变，例如，“LS”突变M428L和N434S/M_CH3.107_L和N_CH3.114_S(C结构域的EU/IMGT编号)和/或“YTE”突变M252Y、S254T和T256E/M_CH2.15.1_Y、S_CH3.16_T和T_CH2.18_E(C结构域的EU/IMGT编号)。在实施例中，第一Fc结构域包含“LS”突变，并且可以包含SEQ ID NO:154或162内包含的Fc结构域。在另一个实施例中，第二Fc结构域包含“YTE”突变，并且可以包含SEQ ID NO:163内包含的Fc结构域。
为了使本披露的工程化IgG1免疫球蛋白发挥最佳功能，例如，以相当于或优于亲代IgA和野生型IgG1的亲和力结合FcαRI、FcRn和Fcγ受体，在Fc结构域中进行用于引入“臼”的氨基酸修饰，这些氨基酸修饰包含用于结合并激活FcαRI的氨基酸修饰。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其包含结合人Fcγ受体和FcRn并包含氨基酸突变以产生“杵”的第一Fc结构域，和结合人FcαRI并包含氨基酸突变以产生“臼”的第二Fc结构域。在另一个实施例中，第一Fc结构域可以另外包含“LS”突变或“SDIE”突变或两者，以恢复完整的FcγR效应子功能，例如，第一Fc结构域可以包含SEQ ID NO:161、162或164内包含的Fc结构域。
在本披露的实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含选自SEQ ID NO:154、159、160、161或162内包含的Fc结构域的第一Fc结构域，和选自SEQ ID NO:137或157内包含的Fc结构域的第二Fc结构域。在实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含SEQ ID NO:137内包含的第一Fc结构域和SEQ ID NO:154内包含的第二Fc结构域。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含SEQ ID NO:157内包含的第一Fc结构域和SEQ ID NO:159内包含的第二Fc结构域。在实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含SEQ ID NO:157内包含的第一Fc结构域和SEQ IDNO:160内包含的第二Fc结构域。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含SEQ ID NO:157内包含的第一Fc结构域和SEQ ID NO:161内包含的第二Fc结构域。在实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含SEQ ID NO:157内包含的第一Fc结构域和SEQ ID NO:162内包含的第二Fc结构域。
使用表面等离子体共振(SPR)测定本发明的工程化IgG1免疫球蛋白的结合亲和力。产生的所得工程化免疫球蛋白具有以下结合特性(参见表37)：
a.FcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至比亲代IgA2低10倍；
b.FcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至低10倍，以及与Fcγ受体的野生型IgG1样结合；
c.FcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至低10倍，以及与FcRn的野生型IgG1样结合；
d.FcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至低10倍，以及与Fcγ受体和FcRn的野生型IgG1样结合。
本发明的工程化IgG1免疫球蛋白与FcαRI的结合亲和力可以通过包括由亲和力成熟确定的氨基酸来进一步增强，以有助于改善结合。产生并筛选IgA2 Fc文库，以鉴定与亲代IgA2相比，赋予IgA2变体增强的FcαRI结合亲和力的氨基酸突变。当掺入IgA2中时，这些突变将与FcαRI的结合提高了超过约225倍。然后将这些突变掺入通过合理设计产生的工程化IgG1免疫球蛋白中。这些突变将这些工程化IgG1免疫球蛋白与FcαRI的结合提高了超过约1200倍。这是IgA2变体与FcαRI结合的显著改善，并且非常令人惊讶地观察到，当将突变掺入工程化IgG1免疫球蛋白中时，与FcαRI的结合再次提高，比IgA2变体提高了约5倍。
在本披露的实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白包含SEQ ID NO:252内包含的第一Fc结构域，和选自SEQ ID NO:159或161内包含的Fc结构域的第二Fc结构域。如果不期望γ效应子功能(即与FcγR结合)，则优选分别具有来自氨基酸序列SEQ ID NO:252和159的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白。如果期望γ效应子功能(即与FcγR结合)，则优选分别具有来自氨基酸序列SEQ ID NO:252和161的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白。
在一个实施例中，本披露的工程化IgG1免疫球蛋白在选自由以下组成的组的位置处包含氨基酸修饰：CH2.10、CH2.89、CH2.91、CH2.94、CH2.97、CH2.99、CH3.45、CH3.105、CH3.109、CH3.118和CH3.124，其中编号是根据C结构域的IMGT编号。在一个实施例中，工程化IgG1免疫球蛋白在位置CH2.94、CH2.97和CH3.45处包含氨基酸修饰。在优选的实施例中，本披露的工程化IgG1免疫球蛋白包含氨基酸修饰Q_CH2.94_E、L_CH2.97_Y和S_CH3.45_D。当在体外细胞杀伤测定中表征时，与亲代工程化IgG1免疫球蛋白和亲代IgA2相比，这些工程化IgG1免疫球蛋白在PMN测定中被证明具有改善的杀伤特性。
附图说明
图1：此示意图示出了本申请中用于将氨基酸残基从IgA转移至IgG的合理设计的总体策略。所得IgG结构在Fc区的两个或一个Fc结构域中含有来自IgA的残基。
图2a-g：这些示意图描绘了具有尾段(图2a)和没有尾段(图2b)的全长IgA、恒定结构域CH1(图2c)和铰链(图2d)从IgG1至IgA的转移、“CH2/CH3弯头”区的位置(图2e)、IgG/IgA CH2/CH2修饰(图2f)和IgG/IgA CH3/CH3修饰(图2g)。
图3a-g：这些示意图总结了用于鉴定参与IgA2/FcαRI相互作用的氨基酸残基位置的半合理设计，以便随后将这些残基转移至IgG1 Fc中。在β链扫描(图3a、图3b)和结构域切割(顶部/底部、前部/侧面)(图3c-3g)后进行修饰。图3h和图3i描绘了分别对CH2和CH3结构域进行的修饰，以确定参与间接FcαRI结合的残基。
图4：这些示意图示出了工程化IgG1免疫球蛋白上的位置，其中对CH2、CH3和CH2/CH3弯头区进行了修饰以并入IgA残基。图4a还包含来自IgA的铰链区，而图4b包含来自IgG1的铰链区。这些工程化IgG1免疫球蛋白保留了IgA免疫球蛋白的FcαRI结合能力。
图5a-b：这些示意图示出了为恢复FcRn结合(图5a)和FcγR结合(图5b)而进行的修饰的大致位置。在图5a中，用星号示出了IgA免疫球蛋白CH3结构域中被来自IgG1免疫球蛋白的对应残基替换以恢复FcRn结合的氨基酸的位置。在图5b中，用星号示出了为恢复FcγR结合而对IgG1免疫球蛋白CH2结构域进行的SDIE突变的位置。
图6a-e：这些示意图总结了产生的具有hFcαRI、FcRn和FcγR结合的工程化IgG1异二聚物免疫球蛋白。所有构建体均具有“杵臼”修饰，添加了LS突变(图6a、6c和6e)和/或添加了SDIE突变(图6d和6e)。
图7a-d：这些示意图指示了由IgA亲和力成熟产生的突变组的大致位置，以及它们在工程化IgG1异二聚物免疫球蛋白中的应用。图7a示出了全长IgA2免疫球蛋白中突变的位置，并且图7b和7c示出了将相同的突变组并入能够与FcαRI结合的IgG1免疫球蛋白中。图7d示意性示出了应用了来自IgA2的亲和力成熟突变组的工程化IgG1异二聚物免疫球蛋白。
图8：此示意图示出了IgA和IgG的CH2和CH3结构域界面处CH2/CH3弯头区的位置。深灰色＝IgG(PDB 1FC1)/IgA FC(PDB 1OWO)重叠，浅灰色＝IgG1(PDB 1FC1)/IgA FC(PDB1OWO)CH2-CH3铰链重叠。箭头指示弯头区。
图9：IgA2 Fc的此示意图示出了在空间上位于IgA2 Fc顶部的二硫键和堆积环的位置。
图10：此图示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，对同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的细胞杀伤测定中的PMN细胞毒性的影响。经测试的候选物具有以下序列：SEQID NO:119(■)、SEQ ID NO:120(▲)、SEQ ID NO:122(▼)和SEQ ID NO:123(◆)。
图11：此图示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，对具有序列SEQ ID NO:122(■)的同二聚体先导候选物对Calu-3细胞的细胞杀伤测定中的PMN细胞毒性的影响。
图12：此图示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))和野生型IgG1(SEQ ID NO:1(■))相比，具有序列SEQ ID NO:122(▲)的同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的吞噬活性。
图13a-d：此图示出了对具有序列SEQ ID NO:148或152的同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的PMN细胞毒性的影响。在图13a中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:148(▼)的候选物的作用。图13b示出了随着具有序列SEQ ID NO:148(■)的候选物和亲代IgA2浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图13c中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:152(◆)的候选物的作用。图13d示出了随着具有序列SEQ ID NO:152(■)的候选物和亲代IgA2浓度的增加的特异性杀伤百分比。
图14a-b：此图示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，具有序列SEQ ID NO:148(▲)的同二聚体先导候选物对Calu-3细胞的PMN细胞毒性。在图14a中，PMN杀伤测定的效果和图14b示出了随着候选物或亲代IgA2浓度的增加的特异性杀伤百分比。
图15a-d：此图示出了具有序列SEQ ID NO:148或152的同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的PBMC细胞毒性。在图15a中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:148(▼)的候选物的作用。图15b示出了随着具有序列SEQID NO:148(■)的候选物和亲代IgA2浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图15c中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:152(◆)的候选物的作用。图15d示出了随着具有序列SEQ ID NO:152(■)的候选物和亲代IgA2浓度的增加的特异性杀伤百分比。
图16：此图示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))和野生型IgG1(SEQ ID NO:1(■))相比，具有序列SEQ ID NO:122(▲)、SEQ ID NO:148(▼)和SEQ ID NO:152(◆)的同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的吞噬活性。
图17a-j：此图示出了具有序列SEQ ID NO:137-154、157-159、157-160、157-161、157-162的五种异二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的PMN细胞毒性。在图17a中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:137-154(◆)的异二聚体候选物的作用。图17b示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图17c中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:157-159(▼)的异二聚体候选物的作用。图17d示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图17e中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:157-160(▼)的异二聚体候选物的作用。图17f示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图17g中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:157-161(▼)的异二聚体候选物的作用。图17h示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图17i中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQID NO:157-162(▼)的异二聚体候选物的作用。图17j示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。
图18a-j：此图示出了具有序列SEQ ID NO:137-154、157-159、157-160、157-161、157-162的五种同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的PBMC细胞毒性。在图18a中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:137-154(◆)的异二聚体候选物的作用。图18b示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图18c中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:157-159(▼)的异二聚体候选物的作用。图18d示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图18e中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:157-160(▼)的异二聚体候选物的作用。图18f示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图18g中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQ ID NO:157-161(▼)的异二聚体候选物的作用。图18h示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。在图18i中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))相比，在PMN杀伤测定中示出了具有序列SEQID NO:157-162(▼)的异二聚体候选物的作用。图18j示出了随着相同异二聚物候选物(■)和亲代IgA2(●)浓度的增加的特异性杀伤百分比。
图19：此图示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))和野生型IgG1(SEQ ID NO:1(■))相比，具有序列SEQ ID NO:137-154(●)、157-159(■)、157-160(▲)、157-161(▼)和157-162(◆)的五种同二聚体先导候选物对SK-BR-3细胞的吞噬活性。
图20：此图示出了在如实例6所述的ADCC测定中，浓度增加的具有序列SEQ ID NO:122(■)、148(▲)、204(▼)、209(◆)和214
Figure BDA0003909357670000131
的同二聚物候选物和亲代IgA2(SEQ IDNO:3(●))对SK-BR-3细胞的PMN细胞毒性。每种同二聚物候选物的功效(Emax％)如下：SEQID NO:3：25％，SEQ ID NO:122：32％，SEQ ID NO:148：27％，SEQ ID NO:204：28％，SEQ IDNO:209：35％，SEQ ID NO:214：34％。
图21：此图示出了在如实例6所述的ADCC测定中，浓度增加的具有序列SEQ ID NO:122(■)、148(▲)、204(▼)、209(◆)和214
Figure BDA0003909357670000141
的同二聚物候选物和亲代IgA2(SEQ IDNO:3(●))对Calu-3细胞的PMN细胞毒性。每种同二聚物候选物的功效(Emax％)如下：SEQID NO:3：42％，SEQ ID NO:122：44％，SEQ ID NO:148：41％，SEQ ID NO:204：71％，SEQ IDNO:209：76％，SEQ ID NO:214：81％。
图22：此图示出了在如实例6所述的ADCC测定中，浓度增加的具有序列SEQ ID NO:214
Figure BDA0003909357670000142
的同二聚物候选物和亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))对MDA-MB-453细胞的PMN细胞毒性。具有序列SEQ ID NO:3的同二聚物候选物的EC50值是2.45nM，并且具有序列SEQ IDNO:214的同二聚物候选物的EC50值是0.36nM。
图23此图示出了在如实例6所述的ADCC测定中，浓度增加的具有序列SEQ ID NO:214
Figure BDA0003909357670000143
的同二聚物候选物和亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●))对MDA-MB-175细胞的PMN细胞毒性。
图24a-d：此图示出了在如实例6所述的ADCC测定中，浓度增加的异二聚物候选物对SK-BR-3细胞的PMN和PBMC细胞毒性。图24a和24b分别示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●)；图24a)和野生型IgG1(SEQ ID NO:1(●)；图24b)相比，具有序列SEQ ID NO:157-159(■)和252-159(▲)的异二聚物候选物。图24c和24d分别示出了与亲代IgA2(SEQ ID NO:3(●)；图24c)和野生型IgG1(SEQ ID NO:1(●)；图24d)相比，具有序列SEQ ID NO:157-161(▼)和252-161(◆)的异二聚物候选物。
图25：此图示出了与IgA2和IgG1两者相比，工程化免疫球蛋白热稳定性的总体改善。具有序列SEQ ID NO:119、120、122、123的工程化免疫球蛋白及其亲代IgG1和IgA2(分别为SEQ ID NO:1和2)的单个温谱图通过DSC测量获得并重叠。箭头表示与IgG1或IgA2的CH2TM相比，CH2溶解温度(TM)的增加，以摩尔热容(kJ/mol K)测量。
图26：此图示出了与IgA2相比，工程化免疫球蛋白的CH2和CH3结构域的热稳定性改善。具有序列SEQ ID NO:126、127、128、129的工程化免疫球蛋白及其亲代IgA2 Fc(SEQID NO:125)的单个温谱图通过DSC测量获得并重叠，以摩尔热容(kJ/mol K)测量。提取了单个CH2和CH3结构域的溶解温度(TM)，并呈现于表48中。
图27：此图示出了小鼠中IgG、IgA和工程化免疫球蛋白的血清-时间浓度曲线。(◆)来自HEK293T的具有序列SEQ ID NO:1的免疫球蛋白、(▲)来自HEK293T的具有序列SEQID NO:3的免疫球蛋白、(●)来自HEK293T的具有序列SEQ ID NO:157-159的工程化免疫球蛋白、(x)来自HEK293T的具有序列SEQ ID NO:252-159的工程化免疫球蛋白的血清浓度。
图28：小鼠中IgG、IgA和糖工程化免疫球蛋白的血清-时间浓度曲线。(◆)具有来自CHO-S的序列SEQ ID NO:1的免疫球蛋白、(▲)具有来自CHO-S的SEQ ID NO:3的免疫球蛋白、(x)具有来自CHO-S的序列SEQ ID NO:252-159的工程化免疫球蛋白、(■)具有来自CHO-S的序列SEQ ID NO:212的工程化免疫球蛋白、(○)具有来自CHO-S的序列SEQ ID NO:256的工程化免疫球蛋白、(□)具有来自CHO-S的序列SEQ ID NO:257的工程化免疫球蛋白、(●)具有来自CHO-S的序列SEQ ID NO:258的工程化免疫球蛋白的血清浓度。
具体实施方式
本文披露了工程化免疫球蛋白，例如包含突变Fc区的IgG1或其片段，使得经修饰的IgG1结合Fcα受体，从而募集α效应子功能。工程化免疫球蛋白还可以通过与Fcγ受体结合来募集IgG效应子功能。此外，工程化免疫球蛋白还可以结合FcRn，并因此具有延长的半衰期。
定义
为了可以更容易地理解本披露，在整个具体实施方式中具体定义了某些术语。除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
在提及序列(例如，氨基酸序列)时使用术语“包含”等的所有情况下，应理解所述序列也可受术语“由……组成”等限制。如本文所用，短语“基本上由……组成(consistingessentially of)”是指方法或组合物中所包含的活性药剂以及对这些方法或组合物的预期目的而言无活性的任何赋形剂的类属或物种。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包括除本披露的多特异性结合分子以外的一种或多种另外的活性剂。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确排除了包括除本披露的多特异性结合分子和第二共同施用药剂以外的一种或多种另外的活性剂。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽，该多肽能够非共价、可逆并以特异性方式结合对应的抗原。每种抗体的基本功能单位是仅含有一个Ig单位的免疫球蛋白单体，在本文中定义为“Ig单体”。分泌的抗体还可以是具有两个Ig单位的二聚物(例如IgA)、具有四个Ig单位的四聚物或具有五个Ig单位的五聚物(例如哺乳动物IgM)。术语“抗体”包括，例如，单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)。Ig单体是由四条多肽链组成的Y形分子；通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链(Woof和Burton(2004)Nature Reviews Immunology[自然免疫学评论],4(2):89-99)。每条链包含许多含有约70-110个氨基酸的结构域，这些结构域分为两类：根据它们的大小和功能，可变或恒定。重链包含一个可变结构域(可变重链结构域；缩写为VH)和三个恒定结构域(缩写为CH1、CH2和CH3)。每个轻链包含一个可变结构域(缩写为VL)和一个恒定结构域(缩写为CL)。免疫球蛋白结构域具有特征性免疫球蛋白折叠，其中两个β折叠形成“三明治”形状，通过保守的半胱氨酸残基和其他带电氨基酸之间的相互作用保持在一起。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，它们散布有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的抗原结合结构域或抗原结合位点。
术语“抗体”包括但不限于：单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本披露抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所用的术语“单特异性分子”是指与靶标抗原上的一个表位结合的分子。在一些实施例中，本披露的单特异性分子是单特异性抗体样分子。在一些实施例中，本披露的单特异性分子是单特异性抗体。术语“双特异性分子”是指结合两种不同抗原的多特异性结合分子。在一些实施例中，本披露的双特异性分子是双特异性抗体样分子。如本文所用的术语“多特异性结合分子”是指结合两种或更多种不同抗原的分子。每种抗原的识别通常经由“抗原结合结构域”来完成。在一些实施例中，本披露的多特异性结合分子是多特异性抗体样分子，诸如双特异性抗体样分子。
术语“抗原结合位点”是指抗体的一部分，该部分包含形成与抗原或其表位结合的界面的决定簇。术语“抗原结合位点”可以与术语“抗原结合结构域”可互换地使用。关于蛋白质(或蛋白质模拟物)，抗原结合位点典型地包括形成与抗原多肽结合的界面的一个或多个环(具有至少四个氨基酸或氨基酸模拟物)。典型地，抗体分子的抗原结合位点包括至少一个或两个CDR和/或高变环，或更典型地至少三个、四个、五个或六个CDR和/或高变环。
如本文所用的“互补决定区”(“CDR”)是指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，结合位点携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端依序编号)，这些CDR构成可变结构域的总计约15％-20％。CDR可以按其区域和顺序提到。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”均是指重链可变区的第一CDR。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。剩余的VL或VH区段(所谓的框架区)表现出较少的氨基酸序列变异(Kuby(2000)Immunology[免疫学],第4版,第4章,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约市(New York))。CDR和框架区的位置可以使用本领域各种已知的定义来确定，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM和组合定义(参见例如，Johnson等人,(2001)Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206；Chothia和Lesk,(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature[自然],342:877-883；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],(1992)227:799-817；Lefranc,M.P.,(2001)NucleicAcids Res.[核酸研究],29:207-209；Al-Lazikani等人,(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748以及Kabat等人,(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest.[免疫学感兴趣的蛋白质序列]第5版-美国DHHS,NIH出版物编号91-3242,第662、680、689页)。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,(2000)Nucleic AcidsRes.[核酸研究],28:219-221；MacCallum等人,(1996)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745；和Martin等人,(1989)PNAS.USA[美国国家科学院院刊],86:9268-9272；Martin等人,(1991)Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153；以及Rees等人,(1996)在Sternberg M.J.E.(编),Protein Structure Prediction[蛋白质结构预测],牛津大学出版社(Oxford University Press),牛津(Oxford),141-172中。在组合的卡巴特和乔西亚编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为卡巴特CDR、乔西亚CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，CDR对应于VH，例如哺乳动物VH，例如人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；和VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。根据IMGT，将VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并将VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“卡巴特”编号)。根据IMGT，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align测定。IMGT工具可在万维网(www).imgt.org上获得。
在实施例中，抗体包含抗体的“抗原结合片段”。此类片段的实例包括：(i)Fab片段，该片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的双抗体(dAb)片段；(vi)骆驼科(camelid)或骆驼化(camelized)可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)(参见例如Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人,(1988)PNAS USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)；(viii)单个结构域抗体；(ix)双抗体(Dab)(二价和双特异性)，以及(x)嵌合(例如，人源化)抗体，其可以通过修饰完整抗体或使用重组DNA技术重新合成的抗体来产生。这些功能抗体片段保留了与其各自的抗原或受体选择性结合的能力。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
在哺乳动物中，存在两种类型的免疫球蛋白轻链，称为λ和κ。每个抗体包含两条总是相同的轻链；在哺乳动物中，每个抗体仅存在一种类型的轻链，κ或λ。轻链的大致长度为211至217个氨基酸，并且每个轻链具有两个结构域，一个恒定结构域和一个可变结构域。
存在五种类型的哺乳动物Ig重链，表示为α、δ、ε、γ和μ，并且抗体中存在的重链类型限定了抗体的类别或同种型：分别为IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。重链在生理化学、结构和免疫学特性上有所不同，但每条重链均具有两个结构域，一个可变结构域和一个恒定结构域。可变结构域包含单个Ig结构域(大约110个氨基酸长)并决定抗体结合特异性。恒定结构域在相同同种型的所有抗体中都是相同的，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由三个串联Ig结构域构成的恒定区，以及用于增加灵活性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区(Woof和Burton,同上)。术语“免疫球蛋白”(Ig)与术语“抗体”在本文中可互换地使用。在实施例中，免疫球蛋白的“片段”可以是Fc区或者一个或多个Fc结构域。
IgG是血液(血浆)中最丰富的抗体同种型，占人体免疫球蛋白的70％-75％。IgG使有害物质解毒，并且在由白细胞和巨噬细胞识别抗原-抗体复合物方面起重要作用。在人类中，IgG进一步分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM通常在血液中循环，占人体免疫球蛋白的约10％。IgM具有五聚物结构，其中五个基本的Y形分子连接在一起。B细胞响应于微生物感染/抗原入侵，首先产生IgM。尽管IgM对抗原的亲和力低于IgG，但由于其五聚物/六聚物结构，它对抗原的亲合力更高。IgM通过与细胞表面受体结合，还激活细胞信号传导途径。IgA在血清、鼻涕、唾液、母乳和肠液中含量丰富，占人体免疫球蛋白的25％。IgA形成二聚体(即，两个IgA单体结合在一起)。母乳中的IgA保护新生儿的胃肠道免受病原体的侵害。IgA分为2个亚类：IgA1和IgA2。IgD占人类免疫球蛋白的不到1％，并且可能参与B细胞中抗体产生的诱导，但其确切功能仍然未知。IgE以微量存在，占人体免疫球蛋白不超过0.001％。它最初的作用是抵御寄生虫。在寄生虫感染罕见的地区，IgE主要参与过敏反应。
免疫细胞活性由抗体的被称为片段可结晶区或“Fc区”的区域调节。Fc区由两条多肽链或Fc结构域构成，在IgG中分别包含重链的CH2和CH3恒定结构域或“CH2结构域”和“CH3结构域”。IgM和IgE Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。CH2和CH3结构域中的氨基酸残基可以根据EU编号系统(Edelman等人,(1969)PNAS.USA[美国国家科学院院刊],63,78-85)、“Kabat”编号(Kabat等人,同上)或者替代性地使用C结构域的IMGT编号进行编号。IMGT工具可在万维网(www).imgt.org上获得。
Fc区与细胞表面受体、“Fc受体”和补体蛋白结合，从而介导抗体的生理效应。Fc受体存在于免疫系统的许多细胞中，这些细胞包括：B淋巴细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、人血小板和肥大细胞。抗体Fc区与Fc受体的结合刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)机制来破坏微生物或感染细胞。存在几种不同类型的Fc受体(FcR)，基于它们识别的抗体类型进行分类。例如，结合IgG的称为Fcγ受体(FcγR)，结合IgA的称为Fcα受体(FcαR)，并且结合IgE的称为Fcε受体(FcεR)。FcR的类别还通过表达它们的细胞(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T和B细胞)和每种受体的信号传导特性来区分(Owen J等人,(2009)Immunology[免疫学](第7版).纽约：W.H.弗里曼公司第423页)。下表(表1)总结了不同的Fc受体、它们的配体、细胞分布和结合作用。
表1：Fc受体及其特性的概述
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Figure BDA0003909357670000221
在实施例中，抗体包含全长抗体、或全长免疫球蛋白链。在实施例中，抗体包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能性片段。抗体的制剂可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外产生的抗体。
在一个实施例中，可以重组地产生抗体或免疫球蛋白，例如通过噬菌体展示或通过组合方法产生。用于产生抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域已知的(如描述于例如，Ladner等人US 5,223,409；Kang等人,WO 92/18619；Dower等人,WO 91/17271；Winter等人,WO 92/20791；Markland等人,WO 92/15679；Breitling等人,WO 93/01288；McCafferty等人,WO 92/01047；Garrard等人,WO 92/09690；Ladner等人,WO 90/02809；Fuchs等人,(1991)Bio/Technology[生物技术],9:1370-1372；Hay等人,(1992)Hum AntibodyHybridomas[人抗体杂交瘤],3:81-85；Huse等人,(1989)Science[科学]246:1275-1281；Griffths等人,(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学学会会刊],12:725-734；Hawkins等人,(1992)J Mol Biol.[分子生物学杂志],226:889-896；Clackson等人,(1991)Nature[自然],352:624-628；Gram等人,(1992)PNAS[美国国家科学院院刊],89:3576-3580；Garrard等人,(1991)Bio/Technology[生物技术],9:1373-1377；Hoogenboom等人,(1991)Nuc AcidRes.[核酸研究],19:4133-4137；以及Barbas等人,(1991)PNAS[美国国家科学院院刊],88:7978-7982中，所有文献的内容通过引用并入本文)。
在一个实施例中，抗体或免疫球蛋白是全人抗体(例如，在已经基因工程化为从人免疫球蛋白序列产生抗体的小鼠中制备的抗体或从人中分离的抗体)，或非人抗体，例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如，猴)、骆驼抗体。可以使用携带人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠产生人单克隆抗体。将来自用感兴趣的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞用于产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤，这些人单克隆抗体对来自人蛋白质的表位具有特异性亲和力(参见例如，Wood等人,WO 91/00906；Kucherlapati等人,WO91/10741；Lonberg等人,WO 92/03918；Kay等人,WO 92/03917；Lonberg,N.等人,(1994)Nature[自然]368:856-859；Green,L.L.等人,(1994)Nature Genet.[自然遗传学]7:13-21；Morrison,S.L.等人,(1994)PNAS USA[美国国家科学院院刊]81:6851-6855；Bruggeman等人,(1993)Year Immunol[免疫学年评]7:33-40；Tuaillon等人,(1993)PNAS[美国国家科学院院刊]90:3720-3724；Bruggeman等人,(1991)Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]21:1323-1326)。
抗体或免疫球蛋白可以是可变区或其一部分(例如，CDR)在非人生物(例如，大鼠或小鼠)中产生的抗体或免疫球蛋白。嵌合抗体、CDR移植的抗体、和人源化抗体属于本发明。在非人生物(例如，大鼠或小鼠)中产生并且然后在例如可变框架或恒定区中修饰以降低在人中的抗原性的抗体属于本发明。嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生(参见Robinson等人,WO 87/002671；Akira等人,EP 184187 A1；Taniguchi,M.,EP171496A1；Morrison等人,EP 173494A1；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,US 4,816,567；Cabilly等人,EP 125023A1；Better等人,(1988)[科学]240:1041-1043；Liu等人,(1987)PNAS[美国国家科学院院刊]84:3439-3443；Liu等人,(1987),J.Immunol.[免疫学杂志]139:3521-3526；Sun等人,(1987)PNAS[美国国家科学院院刊]84:214-218；Nishimura等人,(1987),Canc.Res.[癌症研究]47:999-1005；Wood等人,(1985)Nature[自然]314:446-449；以及Shaw等人,(1988),J.Natl Cancer Inst.[美国国立癌症研究所杂志]80:1553-1559)。
人源化抗体或CDR移植抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。抗体可以被至少一部分非人CDR替换，或者仅一些CDR可以被非人CDR替换。仅需要替换人源化抗体与靶抗原结合所需的CDR的数量。优选地，供体是啮齿动物抗体(例如大鼠或小鼠抗体)，并且受体将是人框架或人共有框架。典型地，提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施例中，供体免疫球蛋白是非人类(例如啮齿动物)。受体框架是天然存在的(例如人类)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高、优选90％、95％、99％或更高同一性的序列。
如本文所用，术语“共有序列”是指由相关序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker,(1987)From Genes to Clones[从基因到克隆](德国魏因海姆出版社(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany))。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置被在该家族中该位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸同样频繁出现，则任一个均可以包括在共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。
抗体可以通过本领域已知的方法人源化(参见例如Morrison,S.L.,(1985),Science[科学]229:1202-1207；Oi等人,(1986),BioTechniques[生物技术]4:214，以及Queen等人,US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，所有文献的内容通过引用特此并入)。可以通过CDR移植或CDR置换产生人源化抗体或CDR移植抗体，其中免疫球蛋白链的一个、两个或所有CDR可以被替换。参见例如US 5,225,539；Jones等人,(1986)Nature[自然]321:552-525；Verhoeyan等人,(1988)Science[科学]239:1534；Beidler等人,(1988)J.Immunol.[免疫学杂志]141:4053-4060以及Winter US 5,225,539，所有文献的内容明确地通过引用特此并入。人源化抗体也在本发明的范围内，其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加。从供体中选择氨基酸的标准描述于US 5,585,089，例如US 5,585,089的第12-16栏中，其内容通过引用特此并入。用于人源化抗体的其他技术描述于Padlan等人,EP 519596A1中。
用于改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。具有改变功能(例如，改变的对效应配体(诸如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和力)的抗体可以通过用不同的残基替换抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基而产生(参见例如，EP 388151 A1、US 5,624,821和US5,648,260)。
如本文所用的一个或多个氨基酸残基/一个或多个位置的“修饰”或“突变”是指与起始氨基酸序列相比，一级氨基酸序列的变化，其中该变化是由涉及所述一个或多个氨基酸残基/位置的序列变化引起的。例如，典型的修饰包括用一个或多个另一种氨基酸取代一个或多个残基(或在一个或多个所述位置处)(例如，保守或非保守取代)、在所述一个或多个残基/位置附近插入一个或多个氨基酸、以及缺失所述一个或多个残基/位置、倒置所述一个或多个残基/位置，以及复制所述一个或多个残基/位置。
“氨基酸取代”或“取代”是指用一个或多个不同的氨基酸残基置换预定(起始或亲代)氨基酸序列中的一个或多个现有氨基酸残基。例如，取代I332E是指如下变体多肽(在这种情况下是恒定重链变体)，其中位置332处的异亮氨酸被谷氨酸替换(EU编号)。替代性地，可以给出CH2或CH3结构域中取代的位置，例如，CH2.97表示CH2结构域中位置97处的取代，其编号根据C结构域的IMGT编号。确切的取代还可以通过例如L_CH2.97_Y来表示，其表示CH2结构域中位置97处的亮氨酸被酪氨酸替换。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中特定位置处添加氨基酸。如本文所述的插入通过符号“∧”表示，随后是位置，随后是插入的氨基酸。例如，“∧236R”表示在位置236后插入精氨酸；“∧236RR”描绘了在位置236后插入两个精氨酸，等。为便于参考，插入后的原始编号不变；因此，在含有插入的分子中，除非另有说明，否则通常在插入位点后发现的氨基酸仍然如同插入没有发生一样被编号。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中特定位置处去除氨基酸。如本文所述的缺失通过符号“#”表示，前面是待缺失的氨基酸和位置。例如，G237#表示位置237处的甘氨酸的缺失。为便于参考，缺失后的原始编号不变；因此，在含有缺失的分子中，除非另有说明，否则通常在缺失位点后发现的氨基酸仍然如同缺失没有发生一样被编号。
通常且优选地，与包含起始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽相比，修饰使变体多肽的至少一种物理生物化学活性改变。例如，在抗体或多特异性结合分子的情况下，改变的物理生物化学活性可以是对靶标分子的结合亲和力、结合能力和/或结合作用。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H))、酸性侧链(例如，天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))、不带电的极性侧链(例如甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C))、非极性侧链(例如丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W))、β-支链侧链(例如苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I))以及芳族侧链(例如，酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H))。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下，术语“相同百分比”或“同一性百分比”是指两个或更多个相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以寻求使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或当没有规定时则在整个序列上，60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。本披露的“同一性百分比”或“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：(i)在比较窗口内比较两个最佳比对的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定两个序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)的位置的数量，以得到匹配位置的数量，(iii)将匹配位置的数量除以比较窗口内的位置总数，并且然后(iv)将这个商乘以100％，以得到同一性百分比。如果在没有指定特定比较窗口的情况下计算相对于参考序列的“同一性百分比”，则同一性百分比通过将比对区域上匹配位置的数量除以参考序列的总长度来确定。因此，出于本披露的目的，当两个序列(查询序列和主题序列)最佳比对(允许它们比对中的间隙)时，查询序列的“同一性百分比”等于用两个序列之间的相同位置的数量除以查询序列全长度(或比较窗口)的位置的总数量，然后将其乘以100％。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代性参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的术语“比较窗口”包括提及选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组的多个邻接位置中的任一个的区段，其中可以将序列与具有相同数量邻接位置的参考序列在两个序列最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域已知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：例如，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443的同源比对算法；通过搜索Pearson和Lipman(1988)PNAS.USA[美国国家科学院院刊],85:2444的相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575Science Dr.,Madison,WI)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过手动校准和目视检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in MolecularBiology[当代分子生物学实验指南])。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res[核酸研究],.25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。此算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人,(1990)同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)PNAS USA[美国国家科学院院刊],89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。
该BLAST算法还对两个序列之间的相似度进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)PNAS.USA[美国国家科学院院刊],90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，该最小总和概率提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01、最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17(1988))的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com上可获得)中的GAP程序中的Needleman&Wunsch同上算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及缺口权重为16、14、12、10、8、6或4和长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。
除了上述序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或它们的互补序列在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的又另一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”可互换地使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，如下文详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究],19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J Biol Chem.[生物化学杂志],260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol Cell Probes[分子和细胞探针],8:91-98)。如本文所用，术语“优化的核苷酸序列”意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞(在这种情况下为中国仓鼠卵巢细胞(CHO))中优选的密码子编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列工程化以完全保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲代”序列。在特定的实施例中，本文优化的序列已被工程改造以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子。
如本文所用，“C末端”是指具有游离羧基(-COOH)的多肽链的羧基末端氨基酸。如本文所用，“N末端”是指具有游离胺基(-NH2)的多肽链的氨基末端氨基酸。
如本文所用的术语“可操作地连接”或“功能性连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。典型地，它是指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列可操作地连接至编码序列。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调节序列增强其转录的编码序列的位置。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。这些短语还适用于一个或多个氨基酸残基是对应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指示，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体。
如本文所用的术语“体内半衰期”是指在给定哺乳动物的血液中循环的感兴趣的分子或其变体的半衰期。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物如非人类灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非在指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
如本文所用，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的受试者”的短语包括将受益于施用例如用于检测、诊断程序和/或治疗的本披露的分子或药物组合物的受试者，诸如哺乳动物受试者。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treat)”在本文中定义为向受试者或来自受试者的分离的组织或细胞系施加或施用根据本披露内容的多特异性结合分子或包含所述多特异性结合分子的药物组合物，其中受试者患有特定的疾病(例如，关节炎)、具有与该疾病相关的症状或易产生该疾病的倾向(如果适用)，其中目的是治愈疾病(如果适用)，预防疾病(如果适用)、延缓疾病的发作，降低疾病的严重性，减轻、改善疾病的一种或多种症状，改善疾病，减少或改善疾病的任何相关症状或易产生疾病的倾向。术语“治疗(treatment或treat)”包括治疗怀疑患有疾病的患者以及患病或已诊断患有疾病或医学病症的患者，并且包括抑制临床复发。短语“降低可能性”是指延迟疾病、感染或障碍的发作或产生或进展。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所需结果(即，降低疾病活性，降低疾病进展，减少疾病病征和/或症状等)的量。在一些方面，治疗可接受量不诱导或不引起不期望的副作用。可以通过首先施用低剂量并且随后递增地增加剂量直至实现所期望效果来确定治疗上可接受的量。本披露的分子的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别预防疾病症状的发作(如果适用)或使疾病症状的严重性降低。
如本文所用，关于患者的“选择”用于指特定患者由于其具有预定标准而特别地从较大的患者组选出。类似地，“选择性治疗患者”是指向如下患者提供治疗，该患者由于该特定患者具有预定标准而特别地从较大的患者组选出。类似地，“选择性施用”是指向如下患者施用药物，该患者由于该特定患者具有预定标准而特别地从较大的患者组选出。
除非另外特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，关于数值的术语“约”应理解为在本领域的正常公差内，例如，在平均值的两个标准偏差内。因此，“约”可以在所述值的+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％或0.01％内，优选地，所述值的+/-10％内。当在数值范围或数字列表前使用时，术语“约”适用于系列中的每个数字，例如，短语“约1-5”应被解释为“约1-约5”，或例如，短语“约1、2、3、4”应被解释为“约1、约2、约3、约4等”。
单词“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，本披露的定义中可以省略单词“基本上”。
术语“共同施用”是指个体的血液中同时存在两种活性药剂。与所披露的抗体和抗原结合片段共同施用的活性剂(例如，另外的治疗剂)可以同时或依序递送。
本披露的各种方面在以下段落和子段落中进一步详细描述。
工程化免疫球蛋白
除了抗体结合抗原的能力之外，抗体的一个重要特征是它们募集免疫效应子功能的能力。体液免疫应答的参与主要由与C1q的相互作用和补体级联的启动来控制(Meyer等人,(2014)MABS[单克隆抗体],6(5):1133-44)。细胞免疫应答主要是由于抗体和Fcγ受体(FcγR)之间的相互作用而发生的。存在五种激活FcγR：可以结合单价抗体的高亲和力FcγRI(CD64)，以及需要基于亲合力的相互作用的较低亲和力FcγRIIa和IIc(CD32)，以及FcγRIIIa(CD16a)和IIIb(CD16b)。存在一种抑制性受体：FcγRIIb(CD32)。通过激活受体的细胞内信号传导通过免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)的磷酸化来调节，这导致效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和经由诱导细胞因子分泌的炎症。相比之下，通过抑制性FcγRIIb的细胞内信号传导通过免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的磷酸化来调节，这些抑制性基序募集磷酸酶来平衡激活信号传导途径(Nimmerjahn和Ravetch,(2008)Nat Rev Immunol.[自然免疫学评论],8:34-47)。抗体与FcγR和C1q的相互作用依赖于铰链和近端CH2氨基酸序列以及CH2区域的糖基化(Edelman等人,(1969)PNAS USA[美国国家科学院院刊],63:78-85)。
尽管许多基于抗体的疗法已显示出临床和商业上的成功，但这些疗法通常仅在一部分患者中有效。迄今为止，所有商业抗体均是IgG类，主要是IgG1，其经由FcγRIII(CD16)募集免疫效应子功能。典型的反应包括通过触发ADCC的IgG抗体的Fc部分激活在其细胞表面上展示FcγRIII的自然杀伤(NK)细胞。然而，NK细胞只是先天免疫系统的一个组成部分，并且其他形式的白细胞的激活可以用于增强由IgG触发的ADCC应答。IgA类抗体接合在中性粒细胞上广泛表达的FcαRI。中性粒细胞包含在循环中发现的最高百分比的先天效应细胞，并且它们的激活触发ADCC和ADCP两者。另外，已经证明它们浸润许多实体瘤(Gregory和Houghton(2011)同上)。然而，由于IgG抗体不与FcαRI结合，大多数基于抗体的商业疗法不能激活中性粒细胞。由于各种缺点，基于IgA的治疗性抗体尚未在商业上开发出来，并且这些类别的抗体还缺乏IgG抗体的有利治疗特性。例如，IgA的铰链区是高度糖基化的，并且产生具有多个复杂聚糖的蛋白质对于药物开发期间的生物加工和质量控制可能是有问题的(Woof和Kerr(2006)J.Pathol.[病理学杂志],208:270-82)，IgA不与C1q结合，因此它不能通过经典的补体途径介导CDC(van Egmond等人,(2001)Trends Immunol.[免疫学趋势],22:205-11)，IgA还不与Fcγ受体结合，因此不能利用与IgG1治疗剂相关的免疫细胞激活的不同机制，并且由于缺乏与对细胞内再循环很重要的FcRn受体的结合，IgA表现出比IgG更短的循环半衰期。由于监管和成本问题以及潜在的不良治疗作用，IgG与IgA抗体的组合疗法尚未开发出来。
由于人IgG和IgA类的免疫球蛋白样结构域共有高度的结构同源性，许多小组已经检查了一类特性转移至另一类的可能性。例如，将IgA2的单个结构域附加至γ1恒定区的末端，从而产生四结构域恒定区(CH1g-CH2g-CH3g-CH3a)(Chintalacharuvu等人,(2001)ClinImmunol.[临床免疫学],101:21-31)，试图与FcγR和FcαRI接合。为了使恒定区更类似于α恒定区，用γ1的CH1结构域取代α1恒定区结构域(CH1a-CH2g-CH3g-CH3a)。这些四结构域交叉同种型IgG/A嵌合抗体以类似于天然IgA2的方式与J链形成聚合物，但减少了通过聚合Ig受体的运输。四结构域、交叉同种型抗体能够介导绵羊红细胞的补体依赖性裂解，并且似乎比IgG1更耐pH；然而，它们的FcγRI亲和力降低了3倍至5倍，并且具有IgA2的短血清半衰期(Chintalacharuvu等人,同上)。
Borrok等人产生了串联IgG1/IgA2抗体形式，其中曲妥珠单抗结合IgG1抗体的Fc区被IgA2的Fc区替换，或者IgA2 Fc区被附加至全长IgG1抗体的C末端(Borrok等人,(2015)MABS[单克隆抗体],7(4):743-51)。这些构建体表现出增强的ADCC和ADCP能力，其中IgG1/IgA2串联Fc形式保留了IgG1 FcγR结合加上FcRn介导的血清持久性，并经由FcαRI/IgA Fc相互作用具有髓样细胞介导的效应子功能。具有串联IgG1/IgA2 Fc的抗人表皮生长因子受体-2抗体被证明比亲代IgG1或IgA2更好地募集和接合细胞毒性PMN细胞。IgG1/IgA2在BALB/c小鼠中的药代动力学与亲代IgG相似，并远远超过IgA2的较差血清持久性。
将早期的结构生物学工作用于确定lgG1的Fc结构域的哪一部分与Fcγ受体相互作用(Woof等人,(1986)Molecular Immunology[分子免疫学],23(3):319-330)以及lgA的Fc结构域的哪一部分与Fcα受体相互作用(Woof等人,(2011)Mucosal Immunology[粘膜免疫学],4(6):590-7)。基于这一知识，已经产生了结合Fcα受体和Fcγ受体的免疫球蛋白。例如，构建了具有经修饰的重链的抗原结合蛋白，其中经修饰的重链的Fc区的CH3结构域是IgG1同种型，并且另一个经修饰的重链的Fc区的CH3结构域是IgA同种型(WO 12/116926A1，Bossenmaier和Kettenberger)。Kelton等人描述了称为“交叉同种型”抗体的嵌合IgG-IgA抗体，其中抗体的Fc区被工程化以包含嵌合IgG CH2结构域，该嵌合IgG CH2结构域具有来自IgA的α1和/或α2环和来自IgA的CH3结构域。还可以通过向嵌合抗体的C末端添加FcRn结合肽来将FcRn结合活性赋予嵌合分子(Kelton等人,(2014)Chem.Biol.[化学生物学],21(12):1603-9；WO 14/065945A1)。
尽管上述嵌合IgG/IgA免疫球蛋白确实具有与Fcα和Fcγ受体两者结合的特性；但Fc区仍然包含高比例的IgA氨基酸残基，因为它含有完整的IgA Fc结构域(例如CH2和/或CH3结构域)，并且因此Fc结构域具有大于50％的IgA残基(WO 14/065945A1)。因此，这些嵌合蛋白具有如上所讨论的阻碍治疗性IgA抗体产生的相同缺点，即发育特性差。分别与野生型、全长IgG1和IgA2相比，嵌合蛋白还与通过SPR测得的对FcγR和FcαRI的亲和力较低相关(Jung等人,(2010)PNAS USA.[美国国家科学院院刊],107(2):604-9；WO 14/065945A1(第27-28页))。
相比之下，在本发明中，我们已经工程化了IgG1同种型的免疫球蛋白Fc区，其赋予IgA效应子功能，但具有最少数量的氨基酸修饰。这示意性地示于图1中。令人惊讶的是，IgG1的期望表达和制造特性得到了保持，并具有中性粒细胞激活的额外益处。使用合理设计，将人IgA2和人IgG1的CH2和CH3结构域叠置，并调整长度以确定用于修饰的氨基酸残基。使用这种方法，将hIgA2 Fc/FcαRI界面转移至hIgG1 Fc中，从而产生募集Fcα效应子功能的IgG1样分子。另外，将α效应子功能的转移与Fc区的进一步修饰组合，以恢复结合FcRn的能力，从而延长半衰期。另外，为了恢复IgG效应子功能，将Fc区进一步修饰以引入导致FcγR结合的修饰。将包含经修饰的Fc序列的抗HER2结合抗体用于举例说明产生同二聚物和异二聚物IgG1样分子的蛋白质工程化。
1.募集FcαR功能的工程化同二聚物免疫球蛋白
在第一方面，募集FcαR功能的人IgG1同种型的工程化免疫球蛋白的产生是通过使用合理和半合理设计两者将与人FcαRI接合的人IgA2Fc残基转移至IgG1免疫球蛋白的Fc区来实现的。由于IgA天然地以多种不同的形式(单体、二聚物、分泌型)存在，因此对IgA2结构进行了初步修饰以产生单体IgA2，这是用于蛋白质工程化的优选形式。从CH3结构域中除去尾段，并且用精氨酸取代CH1结构域中位置124(C结构域的IMGT编号)处的脯氨酸残基，以降低IgA2异质性。这些修饰随后是用来自IgG1的对应CH1结构域和铰链区替换IgA2构建体的CH1结构域和铰链区。这些置换对FcαRI结合的影响有限(参见实例1)。
然后将计算机分析用于叠置IgG1和IgA1的Fc区，以鉴定在结构上等效于参与IgA1与FcαRI相互作用的IgA1残基的IgG1残基。IgA2 Fc的晶体结构尚不清楚；然而，IgA1和IgA2的Fc区在结构上非常相似，因为它们共有96.2％的同一性/98.6％的相似性(SEQ ID NO:2(氨基酸CH2-1.2至CH3-125(C结构域的IMGT编号))和SEQ ID NO:254中包含的CH2-CH3序列的比对)。然后在IgG1构建体中用等效的IgA2残基替换这些鉴定的残基。虽然IgG1和IgA2共有结构同源性，但序列长度和CH2和CH3结构域之间的角度是不同的。这种CH2-CH3界面包含IgA2的CH2结构域的大约最后三个残基和CH3结构域的前六个残基，并且在本文中被称为“CH2-CH3弯头”，在IgG1中被修饰以缩短此区域中CH2和CH3结构域的长度，从而在IgG1 3D结构中这些结构域之间实现与IgA2中发现的相似角度。然后在与FcαRI结合的背景下检查IgA2构建体的β折叠结构。该折叠的一侧将残基侧链转向FcαRI，并且另一侧将残基侧链转向CH3-CH3核心界面。CH3-CH3核心残基可以影响残基侧链在它们与FcαRI相互作用中的定位，这取决于它们的特性和空间位阻。由于IgA2和IgG1的CH2和CH3结构域的β折叠共有高度的结构同源性，因此有可能将IgG1构建体中CH3-CH3界面处的CH3残基与来自IgA2 CH3的对应残基交换，以正确定向与FcαRI相互作用的残基。
使用如上所述的合理设计，能够鉴定重要的IgA2残基并随后将其转移至IgG1构建体。然而，为了完全完成工程化活动，然后进行半合理的方法来微调CH2和CH3工程化，以改善与FcαRI的结合。如上所述，IgG1和IgA2的β折叠共有高度的结构同源性。通过用等效的IgG1β链顺序取代，分别扫描了IgA2 CH2和CH3的反平行β链A、B、C、D、E、F和G(IMGT命名法)。随后，根据其在IgA2-FcαRI相互作用中的作用，将IgG1的β链用等效的IgA2β链两个两个地和三个三个地等替换。
可以将IgG1和IgA2 CH2和CH3结构域有效地描述为“构造块”，并且因此可以将这些结构域切割成片段。沿着横向平面(上-下截面)，然后是前向平面(前-侧截面)切割两种不同类型的截面。这给出了含有IgG1/IgA2杂合CH2或CH3结构域的构建体，其包含50％IgA2和50％IgG1。
还将半合理设计用于确定IgA2 Fc区的哪些部分是其与FcαRI相互作用所必需的，尽管在远离FcαRI界面处有明显不相关的作用或位置。据发现在空间上位于IgA2 CH2顶部(参见图3)的二硫键和连接β折叠的环在CH2残基于FcαRI结合位点处的正确定位方面起重要作用。另外，暴露在溶剂中的位于CH3中的α螺旋也显示出对IgA2-FcaRI相互作用具有影响。鉴于这些区域与IgA2-FcαRI结合位点的距离，令人惊讶地发现这些区域在FcαRI相互作用方面的重要性。
上述工作使得能够产生包含IgG1 Fc区的工程化同二聚物免疫球蛋白，其中许多残基被IgA残基取代以赋予FcαRI结合特性。在一个实施例中，本披露提供了包含许多取代的工程化IgG1免疫球蛋白，其中IgG1免疫球蛋白能够识别FcαRI并与FcαRI结合。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其中Fc结构域中少于35％的IgG1残基被来自IgA的对应残基替换。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其中Fc结构域中少于约35％、30％、25％、20％、15％、10％的残基被来自IgA的对应残基替换。在一个实施例中，本披露提供了包含经修饰的Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白，其中Fc结构域中的残基已被来自IgA的对应残基替换，并且其中经修饰的Fc结构域与来自野生型IgG1(SEQ ID NO:1)的Fc结构域具有至少约65％、70％、75％、80％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在一个实施例中，Fc结构域与来自野生型IgG1的Fc结构域具有至少70％的氨基酸序列同一性。在优选的实施例中，Fc结构域与来自野生型IgG1的Fc结构域具有至少75％的氨基酸序列同一性。
在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其在Fc结构域的某些位置处包含多个取代。所有取代位置的编号均根据C结构域的IMGT编号。在一个实施例中，本披露提供了Fc结构域，其中CH2结构域中的位置处的氨基酸，例如，如表6、表10、表14和表18中所列，已经被来自IgA2的对应氨基酸取代。在一个实施例中，本披露提供了Fc结构域，其中CH3结构域中的位置处的氨基酸，例如，如表8、表12、表16和表20中所列，已经被来自IgA2的对应氨基酸取代。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其中Fc结构域的CH2和CH3结构域中的位置处的氨基酸，例如，如表22中所列，已经被来自IgA2的对应氨基酸取代。
将经修饰的Fc结构域掺入全长抗HER2抗体(氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH-CH1-铰链和SEQ ID NO:124的轻链)中，并在哺乳动物HEK细胞系中表达。使用
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T200仪器(通用医疗保健(GE Healthcare))，使用表面等离子体共振测定表达的免疫球蛋白变体的结合亲和力。在一个实施例中，本披露提供了在CH2结构域中包含氨基酸取代的工程化IgG1免疫球蛋白，其中这些氨基酸已经被来自IgA2的对应氨基酸取代，并且其中该工程化免疫球蛋白以如表7、表11、表15和表19中所列的结合亲和力与人FcαRI结合。在一个实施例中，本披露提供了在CH3结构域中包含氨基酸取代的工程化IgG1免疫球蛋白，其中这些氨基酸已经被来自IgA2的对应氨基酸取代，并且其中该工程化免疫球蛋白以如表9、表13、表17和表21中所列的结合亲和力与人FcαRI结合。在一个实施例中，本披露提供了在Fc结构域的CH2和CH3结构域中包含氨基酸取代的工程化IgG1免疫球蛋白，其中这些氨基酸已经被来自IgA2的对应氨基酸取代，并且其中该工程化免疫球蛋白以如表23和表24中所列的结合亲和力与人FcαRI结合。
分别按照实例6和7中描述的程序，在ADCC和ADCP细胞杀伤测定中测试了对Fc结构域的CH2和CH3结构域进行了修饰的工程化IgG1免疫球蛋白的选择。结果在图10、图11和图12中示出，并且表明工程化IgG1免疫球蛋白的表现与野生型免疫球蛋白一样好。
如上所述，我们已经产生了工程化免疫球蛋白，其中IgA2免疫球蛋白的FcαRI结合特性已经转移至IgG1免疫球蛋白。然而，IgG1的Fc区中的氨基酸取代导致组成型FcRn结合特性的丧失，从而导致IgG1免疫球蛋白的半衰期缩短。鉴定了用于FcRn结合的关键残基，并且在IgA2免疫球蛋白中进行了CH3取代A_CH3.15_H、F_CH3.116_Y或P_CH3.113_H、L_CH3.114_N、A_CH3.115_H、F_CH3.116_Y(C结构域的IMGT编号)。通过这些突变，FcRn结合得以恢复；然而，由于与FcRn相互作用的IgG1 CH3的关键残基位于负责FcαRI相互作用的IgA2CH3的对应区域，因此不可能将这些残基工程化回来自IgG1的残基而不失去一些FcαRI结合，如表25所示。
此外，IgG1的Fc区中的氨基酸取代赋予FcαRI结合导致工程化IgG1免疫球蛋白的组成型FcγR结合特性的丧失。将氨基酸修饰引入工程化IgG1免疫球蛋白的CH2结构域中，以恢复FcγR效应子功能。CH2结构域的突变，例如S239D和I332E/S_CH2.3_D和I_CH2.117_E的“SDIE”突变或三重突变S239D、I332E和A330L/S_CH2.3_D、I_CH2.117_E和A_CH2.115_L(C结构域的EU/IMGT编号；Lazar等人(2006)PNAS USA[美国国家科学院院刊]103(11):4005-10)已被描述用于改善FcγR效应子功能。在本披露的实施例中，在工程化IgG1免疫球蛋白的CH2结构域中进行SDIE突变，该工程化IgG1免疫球蛋白包含赋予与FcαRI结合的突变，如表26所列出。总之，这些突变足以部分恢复FcγR效应子功能。
通过SPR测定包含氨基酸修饰以恢复与人FcαRI结合以及与人FcγRI和FcγRIIIa结合的工程化IgG1免疫球蛋白的结合亲和力。在一个实施例中，本披露提供了在Fc结构域中包含氨基酸取代的工程化IgG1免疫球蛋白，其中工程化免疫球蛋白以分别列于表27、表28和表29中的结合亲和力与人FcαRI、FcγRI和FcγRIIIa结合。在体外PMN/PBMC杀伤测定和ADCP测定中测试了许多工程化IgG1免疫球蛋白的效应子功能，结果在图13-16中示出。
2.募集FcαR功能、FcγR功能和FcRn结合的工程化异二聚物免疫球蛋白
上述蛋白质工程化工作导致产生了具有结合FcαR、FcγR和FcRn特性的工程化同二聚物免疫球蛋白。然而，与一类Fc受体的结合通常是以与另一类受体的结合为代价的，并且需要进一步的优化工作。因此，为了产生优化的工程化免疫球蛋白，产生了异二聚物Fc区，其中IgG1 Fc区的第一Fc结构域被工程化以募集FcαRI，并且IgG1 Fc区的第二Fc结构域保持不变。本发明的第二方面提供了包含异二聚物Fc区的工程化IgG1免疫球蛋白，该异二聚物Fc区可以募集FcαRI和FcγR功能两者并与FcRn结合。当在空间上位于工程化免疫球蛋白的CH2顶部的残基衍生自IgG1时，在异二聚物Fc区中不需要进一步的氨基酸修饰来恢复FcRn结合。因此，在一个实施例中，提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其包含在空间上位于CH2顶部的来自IgG1的残基。在另一个实施例中，为了完全恢复FcγR效应子功能，在衍生自IgG1的第二Fc结构域的CH2结构域中进行双突变S239D/I332E(EU编号)/S_CH2.3_D/I_CH2.117_E(C结构域的IMGT编号)。在另一个实施例中，当在空间上位于CH2顶部的残基衍生自IgA2时，例如，堆积环和二硫键，需要添加“LS”或“YTE”突变来恢复FcRn结合；然而，与FcγR的结合丧失。
为了确保本披露的工程化免疫球蛋白的Fc区的两个Fc结构域充分异二聚化，可以使用多种方法来增强二聚化，如例如EP 1870459；US 5,582,996；US 5,731,168；US 5,910,573；US 5,932,448；US 6,833,441；US 7,183,076；US 2006204493 A1；WO 09/089004 A1中所述。在一个方面，对包含重链恒定结构域的工程化免疫球蛋白的第一Fc结构域的一个或多个突变产生“杵”，并且对包含重链恒定结构域的工程化免疫球蛋白的第二Fc结构域的一个或多个突变产生“臼”，使得第一和第二Fc结构域的异二聚化产生“杵”以与“臼”接合(例如，相互作用，例如，第一Fc结构域的CH2结构域与第二Fc结构域的CH2结构域相互作用，或第一Fc结构域的CH3结构域与第二Fc结构域的CH3结构域相互作用)。如本文所用的术语，“杵”是指至少一个氨基酸侧链，该氨基酸侧链从包含重链恒定结构域的工程化免疫球蛋白的第一Fc结构域的界面上突出并且因此可定位于在与包含重链恒定结构域的工程化免疫球蛋白的第二Fc结构域的界面中的互补性“臼”中以稳定异二聚物，并且从而有利于异二聚物形成(例如相对于同二聚物形成)。用于形成杵的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在优选的实施例中，用于形成突起的最初残基具有小侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“臼”是指至少一个氨基酸侧链，该氨基酸侧链凹进包含重链恒定结构域的工程化免疫球蛋白的第二Fc结构域的界面中并且因此容纳包含重链恒定结构域的工程化免疫球蛋白的第一Fc结构域的相邻交界表面上的对应的杵。用于形成臼的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在优选实施例中，用于形成臼的最初的残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
在一个实施例中，在残基366、405或407(EU编号)/CH3.22、CH3.85.1、CH3.86(C结构域的IMGT编号)处使第一CH3结构域突变以产生“杵”或“臼”(如上所述)，并且在以下处使与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域突变以产生与第一CH3结构域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”：残基407/CH3.86(如果使第一CH3结构域中的残基366/CH3.22突变)、残基394/CH3.81(如果使第一CH3结构域中的残基405/CH3.85.1突变)、或残基366/CH3.22(如果使第一CH3结构域中的残基407/CH3.86突变)(C结构域的EU/IMGT编号)。
在另一个实施例中，在残基366/CH3.22处使第一CH3结构域突变以产生“杵”或“臼”(如上所述)，并且在残基366/CH3.22、368/CH3.24和/或407/CH3.86(C结构域的EU/IMGT编号)处使与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域突变以产生与第一CH3结构域的“杵”或“臼”互补的“臼”或“杵”。在一个实施例中，对第一CH3结构域的突变在位置366/CH3.22处引入了酪氨酸(Y)残基。在实施例中，对第一CH3的突变是T366Y/T_CH3.22_Y。在一个实施例中，对第一CH3结构域的突变在位置366/CH3.22处引入色氨酸(W)残基。在实施例中，对第一CH3的突变是T366W/T_CH3.22_W。在实施例中，对与第一CH3结构域(在位置366/CH3.22处进行了突变(例如，具有在位置366/CH3.22处引入的酪氨酸(Y)或色氨酸(W)，例如，包含突变T366Y/T_CH3.22_Y或T366W/T_CH3.22_W))异二聚化的第二CH3结构域的突变包含在位置366/CH3.22处的突变、在位置368/CH3.24处的突变和在位置407/CH3.86处的突变(C结构域的EU/IMGT编号)。在实施例中，在位置366/CH3.22处的突变引入了丝氨酸(S)残基，在位置368/CH3.22处的突变引入了丙氨酸(A)，并且在位置407/CH3.86处的突变引入了缬氨酸(V)。在实施例中，突变包括T366S、L368A和Y407V/T_CH3.22_S、L_CH3.24_A和Y_CH3.86_V(EU/IMGT编号))。在一个实施例中，多特异性结合分子的第一CH3结构域包含突变T366Y/T_CH3.22_Y，并且与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V(T_CH3.22_S、L_CH3.24_A和Y_CH3.86_V)，反之亦然。在一个实施例中，多特异性结合分子的第一CH3结构域包含突变T366W/T_CH3.22_W，并且与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域包含突变T366S、L368A和Y407V/T_CH3.22_S、L_CH3.24_A和Y_CH3.86_V，反之亦然。
在优选的实施例中，被突变以产生“臼”的CH3结构域在工程化IgG1免疫球蛋白的Fc区的第一Fc结构域中，该工程化IgG1免疫球蛋白包含用于募集FcαRI效应子功能的氨基酸修饰，并且被突变以产生“杵”的CH3结构域在工程化IgG1免疫球蛋白的Fc区的第二Fc结构域中，该工程化IgG1免疫球蛋白不包含用于募集FcαRI效应子功能的氨基酸修饰。在一个实施例中，本披露提供了包含Fc“臼”结构域的工程化IgG1免疫球蛋白，该Fc“臼”结构域具有包含在SEQ ID NO:137或157内的氨基酸序列。在另一个实施例中，本披露提供了包含Fc“杵”结构域的工程化IgG1免疫球蛋白，该Fc“杵”结构域具有包含在SEQ ID NO:154、159、160、161或162内的氨基酸序列。在优选的实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其具有来自选自以下的氨基酸序列的第一和第二Fc结构域：SEQ ID NO:137或157，以及SEQID NO:154、159、160、161或162。如果不需要γ效应子功能(即与FcγR结合)，则优选分别具有来自氨基酸序列SEQ ID NO:157和159的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白。如果需要γ效应子功能(即与FcγR结合)，则优选分别具有来自氨基酸序列SEQ ID NO:157和161的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白。这种工程化IgG1免疫球蛋白(SEQID NO:161)的第二Fc结构域还包含SDIE突变。此外，包含在SEQ ID NO:157内的工程化IgG1免疫球蛋白的第一Fc结构域包含衍生自亲和力成熟活动的突变，以改善与FcαRI的结合。
适用于本披露的任何工程化免疫球蛋白的另外的杵臼结构突变对进一步描述于例如，WO 1996/027011和Merchant等人,(1998)同上中，其内容通过引用以其全文特此并入。
对工程化免疫球蛋白的进一步修饰
为了进一步增强工程化IgG1免疫球蛋白对FcαRI的结合亲和力，使用酵母展示进行了亲和力成熟活动，以鉴定增强IgA2对FcαRI亲和力的氨基酸突变。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其在CH2结构域和/或CH3结构域中的一个或多个以下位置处包含氨基酸突变：CH2.10、CH2.89、CH2.91、CH2.94、CH2.97、CH2.99、CH3.45、CH3.105、CH3.109、CH3.118和/或CH3.124，其中编号是根据C结构域的IMGT编号。在一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其在CH2结构域和/或CH3结构域中包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：A_CH2.10_S、L_CH2.89_I、G_CH2.91_Q、G_CH2.91_V、Q_CH2.94_E、N_CH2.97_H、N_CH2.97_Y、G_CH2.99_W、S_CH3.45_D、M_CH3.105_Y、E_CH3.109_D、Q_CH3.118_Y和L_CH3.124_F，其中编号是根据C结构域的IMGT编号。在另一个实施例中，本披露提供了工程化IgG1免疫球蛋白，其在CH2结构域和/或CH3结构域中包含选自表39中所列突变组之一的氨基酸取代。在一个实施例中，本披露提供了包含以下氨基酸取代的工程化IgG1免疫球蛋白：Q_CH2.94_E、N_CH2.97_Y、S_CH3.45_D、M_CH3.105_Y、Q_CH3.118_Y(C结构域的IMGT编号)。在优选的实施例中，本披露提供了包含以下氨基酸取代的工程化IgG1免疫球蛋白：Q_CH2.94_E、L_CH2.97_Y和S_CH3.45_D(C结构域的IMGT编号)。将此突变组应用于包含在SEQ ID NO:157内的异二聚物Fc的“臼”臂，从而产生SEQ ID NO:252。在PMN杀伤测定中，与它们的亲代免疫球蛋白和IgA2相比，具有来自选自SEQ ID 252和159或SEQ ID 252和161并包含在其内的氨基酸序列的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白被证明对SK-BR-3细胞具有更好的杀伤特性(图24)。如果不需要γ效应子功能(即与FcγR结合)，则优选分别具有来自氨基酸序列SEQ ID NO:252和159的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白。如果需要γ效应子功能(即与FcγR结合)，则优选分别具有来自氨基酸序列SEQ ID NO:252和161的第一和第二Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白。SEQ ID NO:161内包含的工程化IgG1免疫球蛋白的第二Fc结构域还包含SDIE突变。
在本文描述的任何实施例中，CH3结构域可以另外突变以引入半胱氨酸残基对。不受理论束缚，据信，引入能够形成二硫键的一对半胱氨酸残基向异二聚物工程化免疫球蛋白提供了稳定性。在实施例中，第一CH3结构域包含在位置354/CH3.10(C结构域的EU/IMGT编号)处的半胱氨酸，并且与第一CH3结构域异二聚化的第二CH3结构域包含在位置349/CH3.5(C结构域的EU/IMGT编号)处的半胱氨酸。
在另一个方面，工程化免疫球蛋白的Fc结构域的异二聚化通过引入基于“极性桥接”原理的突变而增加，该原理导致两个Fc结构域结合界面处的残基与异二聚体构型中具有相似(或互补)物理特性的残基相互作用。特别地，设计这些突变使得在异二聚体形成中，极性残基与极性残基相互作用，而疏水残基与疏水残基相互作用。相比之下，在同二聚体形成中，使残基突变，使得极性残基与疏水残基相互作用。异二聚体构型中有利的相互作用和同二聚体构型中不利的相互作用一起作用使得CH3结构域形成异二聚体比形成同二聚体的可能性更大。
在示例性实施例中，在CH3结构域(C结构域的IMGT编号)/CH3.20、CH3.22、CH3.24、CH3.84.2、CH3.85.1、CH3.86、CH3.88、CH3.90(C结构域的IMGT编号)中残基364、366、368、399、405、407、409和411的一个或多个位置处产生上述突变。在一个方面，一个CH3结构域具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：S364L、T366V、L368Q、D399L、F405S、K409F和T411K/S_CH3.20_L、T_CH3.22_V、L_CH3.24_Q、D_CH3.84.2_L、F_CH3.85.1_S、K_CH3.88_F、T_CH3.90_K(C结构域的EU/IMGT编号)，而另一个CH3结构域具有一个或多个选自由以下组成的组的突变：Y407F、K409Q和T411D/Y_CH3.86_F、K_CH3.88_Q和T_CH3.90_D(EU/IMGT编号)。极性桥策略描述于例如，WO 2006/106905、WO 2009/089004和Gunasekaran K等人,(2010)J Biol Chem.[生物化学杂志],285:19637-19646中，其内容通过引用以其全文特此并入。
使用本领域已知的技术将本文所述的氨基酸置换引入CH3结构域中。通常，使用Mutagenesis:a Practical Approach[诱变：实用方法]中描述的技术对编码一条或多条重链的DNA进行遗传工程化。寡核苷酸介导的诱变是用于制备编码两条杂合重链的DNA的取代变体的优选方法。如Adelman等人,(1983)DNA,2:183所述，此技术是本领域已知的。
缀合物
本披露包括与异源蛋白或多肽(或其片段，优选与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合两者)以产生融合蛋白的工程化免疫球蛋白(例如，抗体)或其片段。将蛋白质、多肽或肽与抗体或抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见例如，US 5,336,603、US 5,622,929、US 5,359,046、US 5,349,053、US 5,447,851和US 5,112,946；EP 307434和EP 367166；WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等人,(1991)PNAS.USA[美国国家科学院院刊]88:10535-10539；Zheng等人,(1995)J.Immunol.[免疫学杂志]154:5590-5600；和Vil等人,(1992)PNAS.USA[美国国家科学院院刊]89:11337-11341。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术生成另外的融合蛋白。DNA改组可以用来改变本披露的分子或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的分子或其片段)。通常参见，US 5,605,793、US 5,811,238、US 5,830,721、US 5,834,252和US 5,837,458；Patten等人,(1997)Curr.OpinionBiotechnol.[生物技术新观点]8:724-33；Harayama(1998)Trends Biotechnol.[生物技术趋势]16(2):76-82；Hansson等人,(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:265-76；以及Lorenzo和Blasco(1998)Biotechniques[生物技术],24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一个均通过引用以其全文特此并入)。可以通过在重组之前借助易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变本文所述的分子或其片段。编码本发明的分子的片段的多核苷酸可以与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，本披露的工程化免疫球蛋白可以与标志物序列诸如肽融合以促进纯化。在优选的实施例中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ ID NO:255)，诸如pQE运载体中提供的标签(凯杰公司(QIAGEN,Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue)9259号，加利福尼亚州查茨沃思(Chatsworth)，91311)等，其中许多是商购可得的。如Gentz等人,(1989)PNAS.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824中所述，例如，六组氨酸(SEQ ID NO:255)为融合蛋白的纯化提供了方便。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,(1984)Cell[细胞]37:767)的血凝素(“HA”)标签和“旗帜(flag)”标签。
在其他实施例中，本披露的工程化免疫球蛋白与诊断或可检测试剂缀合。这种分子可用于监测或预后疾病或障碍的发作、发展、进展和/或严重程度，其作为临床试验程序(如确定特定功效的效果)的一部分。此种诊断和检测可以通过将分子与可检测物质偶联来完成，这些可检测物质包括但不限于各种酶，诸如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素和水母素；放射性物质，诸如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；以及使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本申请进一步涵盖与治疗部分缀合的本披露的工程化免疫球蛋白的用途。例如，治疗部分可以是细胞毒素，例如，细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子(例如，α-发射体)。细胞毒素剂或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。
此外，工程化免疫球蛋白可以与调节给定生物应答的治疗部分或药物部分缀合。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这种蛋白质可包括例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；如下蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原活化物、凋亡剂、抗血管生成剂；或生物应答调节剂例如像淋巴因子。
关于细胞毒素类型、接头和使治疗剂与工程化免疫球蛋白缀合的方法的进一步讨论，还参见Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物递送评论]55:199-215；Trail等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学和免疫治疗]52:328-337；Payne(2003)Cancer Cell[癌细胞]3:207-212；Allen(2002)Nat.Rev.Cancer[自然综述-癌症],2:750-763；Pastan和Kreitman(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs[药理研究现代观点],3:1089-1091；Senter和Springer(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物递送评论]53:247-264。
本披露的工程化免疫球蛋白也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射免疫缀合物。可以与工程化免疫球蛋白缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的实例包括但不限于碘l31、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。参见例如，Denardo等人,(1998)Clin Cancer Res.[临床癌症研究]4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.[生物缀合化学]10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.[核医学和生物学]26(8):943-50，这些文献中的每一个均通过引用以其全文并入。
用于将治疗部分与工程化免疫球蛋白诸如抗体或抗体样分子缀合的技术是已知的，参见例如，Arnon等人,“Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs inCancer Therapy[癌症疗法中用于药物免疫靶向的单克隆抗体]”,在MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Reisfeld等人(编),第243-56页(艾伦丽思出版公司(Alan R.Liss,Inc.)1985)中；Hellstrom等人,“Antibodies ForDrug Delivery[用于药物递送的抗体]”,在Controlled Drug Delivery[药物控制递送](第2版),Robinson等人(编),第623-53页(马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)1987)中；Thorpe,“Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review[癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载剂：综述]”，在Monoclonal Antibodies 84:Biologicaland Clinical Applications[单克隆抗体84：生物和临床应用],Pinchera等人(编),第475-506页(1985)中；“Analysis,Results,and Future Prospective of the TherapeuticUse of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy[放射标记的抗体在癌症疗法中的治疗用途的分析、结果和未来前景]”,在Monoclonal Antibodies for Cancer Detectionand Therapy[用于癌症检测和治疗的单克隆抗体],Baldwin等人(编),第303-16页(学术出版社(Academic Press)1985)中以及Thorpe等人,(1982)Immunol.Rev.[免疫学评论]62:119-58。
工程化免疫球蛋白也可以与固体支持物附接，这些支持物特别适用于免疫测定或靶标抗原的纯化。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
制备工程化免疫球蛋白的方法
制备多肽链
抗体或免疫球蛋白及其片段可以通过多种技术产生，这些技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,(1975)Nature[自然]256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用许多用于产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已建立的程序。免疫方案和分离免疫脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备嵌合抗体或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤中获得，并使用标准分子生物学技术工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如，Cabilly等人的US 4,816,567)。为产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物CDR区域插入人框架中。参见例如，Winter的US 5,225,539和US 5,530,101；US 5,585,089；Queen等人的US 5,693,762和US6,180,370。
在某个实施例中，本披露的抗体或免疫球蛋白是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HUMAB小鼠和KM小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”的小鼠。
HUMAB小鼠(梅达瑞克斯公司(Medarex,Inc.))含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，Lonberg等人,(1994)Nature[自然]368(6474):856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg等人,(1994)同上；在Lonberg,(1994)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]113:49-101中综述；Lonberg和Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学综述]13:65-93，以及Harding和Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报]764:536-546)。HUMAB小鼠的制备和用途以及由此类小鼠进行的基因组修饰进一步描述于以下文献中：Taylor等人,(1992)Nucleic Acids Research[核酸研究]20:6287-6295；Chen Y.,(1993)International Immunology[国际免疫学]5:647-656；Tuaillon Y.,(1993)PNAS USA[美国国家科学院院刊]94:3720-3724；Choi Y.,(1993)Nature Genetics[自然遗传学]4:117-123；Chen Y.,(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:821-830；Tuaillon等人,(1994)J.Immunol.[免疫学杂志]152:2912-2920；Taylor Y.,(1994)InternationalImmunology[国际免疫学]579-591；以及Fishwild Y.,(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14:845-851，所有文献的内容均特此通过引用以其全文特别地并入。进一步参见，US 5,545,806；US 5,569,825；US 5,625,126；US 5,633,425；US 5,789,650；US 5,877,397；US 5,661,016；US 5,814,318；US 5,874,299；和US 5,770,429；全部属于Lonberg和Kay；Surani等人的US 5,545,807；WO 92/103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/113852、WO 98/24884和WO 99/45962，全部属于Lonberg和Kay；以及Korman等人的WO 01/14424。
在另一个实施例中，本披露中使用的人抗体或免疫球蛋白可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生。此类小鼠(在本文中称为“KM小鼠”)在WO 02/43478(Ishida等人)中有详细描述。
仍进一步，表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统是本领域中可获得的，并且可以用于产生人抗体。例如，可以使用被称为Xenomouse(安根尼克斯公司(Abgenix,Inc.))的替代性转基因系统。此类小鼠描述于例如，US 5,939,598；US 6,075,181；US 6,114,598；US 6,150,584和US 6,162,963(Kucherlapati等人)中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统是本领域中可获得的，并且可以用于产生本披露的人抗体或免疫球蛋白。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的被称为“TC小鼠”的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人,(2000)PNASUSA[美国国家科学院院刊]97:722-727中。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa(2002)Nature Biotechnology[自然生物技术]20:889-894)，并且这些牛可以用于产生本申请中使用的人抗体。
还可以使用针对筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备人单克隆抗体。用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法在本领域中建立或在以下实例中描述。参见例如：US 5,223,409；US 5,403,484；和US 5,571,698(Ladner等人)；US 5,427,908和US 5,580,717(Dower等人)；US 5,969,108和US 6,172,197(McCafferty等人)；和US 5,885,793；US 6,521,404；US 6,544,731；US 6,555,313；US 6,582,915和US 6,593,081(Griffiths等人)。
本披露中使用的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠制备，已经在这些SCID小鼠中重建人免疫细胞，使得免疫后可以产生人抗体应答。此类小鼠描述于例如，US 5,476,996和US 5,698,767(Wilson等人)中。
在一个实施例中，本披露提供了通过任何前述方法产生的抗体，该抗体包含至少一个如本文所述的经修饰的Fc结构域。
核酸和表达系统
本发明还涵盖编码本文所述工程化免疫球蛋白的多肽链、Fc结构域或Fc区的核酸。本披露的核酸分子包括单链和双链形式的DNA和RNA，以及对应的互补序列。本披露的核酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段的组合。本披露的核酸衍生自人来源，但可以包括衍生自非人物种的核酸。
“分离的核酸”是在从天然存在的来源分离的核酸的情况下，与分离了核酸的生物体的基因组中存在的相邻遗传序列分开的核酸。在以酶促方式从模板或以化学方式合成的核酸(如PCR产物、cDNA分子、或寡核苷酸)的情况下，应理解，由此类过程产生的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选实施例中，核酸基本上不含污染性的内源材料。核酸分子优选地衍生自以基本上纯的形式和以使得能够通过标准生物化学方法(诸如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)(1989)中概述的那些)鉴定、操纵和回收其组分核苷酸序列的量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。此类序列优选以不被典型地存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的可读框的形式提供和/或构建。非翻译DNA的序列可以存在于可读框的5'或3'，其中这些序列不干扰编码区的操纵或表达。
变体序列可以通过以下方式制备：使用盒或PCR诱变或本领域熟知的其他技术进行编码多肽的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变，以产生编码变体的DNA，然后如本文所概述的那样在细胞培养物中表达重组DNA。
“优化的核苷酸序列”意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO))中优选的密码子编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列工程化以完全保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲代”序列。
本披露还提供了包含至少一种如上该的多核苷酸的呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体。另外，本披露提供了包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。工程化IgG1免疫球蛋白或其片段的重链和轻链可以由单个核酸(例如，插入单个载体中)编码，或者可以由多个核酸分子(例如，两个核酸分子(也称为“组”))编码，该多个核酸分子可以插入多个载体(例如，两个载体，即一组载体)中。
在一个实施例中，本发明提供了制备包含Fc区的工程化IgG1免疫球蛋白或其片段的方法，该Fc区包含经修饰的第一和第二Fc结构域，该方法包括以下步骤：(a)培养包含编码构成工程化Fc结构域多肽的重链的核酸和包含轻链多肽的核酸的宿主细胞，其中培养的宿主细胞表达工程化多肽；以及(b)从宿主细胞培养物中回收工程化IgG1免疫球蛋白。
用于本披露的表达载体可以由起始载体(诸如商购可得的载体)构建。在构建载体并将编码工程化免疫球蛋白的多肽链的核酸分子插入载体的适当位点之后，可以将完成的载体插入合适的宿主细胞中以用于扩增和/或多肽表达。表达载体到所选宿主细胞中的转化可以通过已知方法完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、或其他已知技术。所选方法将部分地取决于有待使用的宿主细胞类型的功能。这些方法和其他合适的方法是技术人员公知的，并且阐述于例如Sambrook等人,2001,同上。
典型地，宿主细胞中所用的表达载体将含有用于质粒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施例中，此类序列，统称为“旁侧序列”，通常将包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码有待表达的多肽的核酸的多接头区、以及可选择标志物元件。
当在适当条件下培养时，宿主细胞可以用于表达双特异性抗体，该抗体随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果不是分泌性的)。适当宿主细胞的选择将取决于各种因素，如期望的表达水平、活性(如糖基化或磷酸化)期望或必需的多肽修饰以及折叠成生物活性分子的便宜性。宿主细胞可以是真核或原核细胞。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，并且本领域已知的表达系统中使用的任何细胞系均可以用于制备包含本披露的工程化免疫球蛋白的多肽。一般来讲，用包含编码期望工程化免疫球蛋白的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可采用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(bacilli)。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7细胞、L细胞、Cl27细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或在无血清培养基中生长的它们的衍生物和相关细胞系、HeLa细胞、BHK细胞系、CVIIEBNA细胞系、人胚胎肾细胞(如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、衍生自原代组织的体外培养的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地，当期望在各种信号转导或报告蛋白测定中使用多肽时，哺乳动物细胞系(如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49)可以用于多肽的表达。替代性地，可以在低等真核生物(如酵母)或在原核生物(如细菌)中产生多肽。合适的酵母包括酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母属、或能够表达异源多肽的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、或能够表达异源多肽的任何细菌菌株。如果工程化免疫球蛋白在酵母或细菌中制备，则可能期望修饰其中产生的产物，例如通过适当位点的磷酸化或糖基化，以便获得功能性产物。此类共价附接可以使用已知的化学或酶促方法实现。
药物组合物和给药
本文提供了包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物组合物。工程化免疫球蛋白可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂组合。
为了制备包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物或无菌组合物，将该免疫球蛋白与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。术语“药学上可接受”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍认可的药典中适用于动物并且更特别地适用于人。术语“药物组合物”是指至少一种活性成分(例如，本披露的工程化免疫球蛋白)和至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的混合物。“药物”是指用于医疗的物质。
治疗剂和诊断剂的药物组合物可以通过与生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水性溶液、洗剂或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，Hardman等人,(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],麦格劳-希尔集团(McGraw-Hill),纽约州纽约市(New York,N.Y.)；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,and Wilkins),纽约州纽约市；Avis等人(编)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Oral Medications[药物剂型：口服药物],马塞尔德克尔公司,纽约州；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets[药物剂型：片剂],马塞尔德克尔出版公司,纽约州；Lieberman等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems[药物剂型：分散系统],马塞尔德克尔公司,纽约州；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety[赋形剂毒性和安全性],马塞尔德克尔公司,纽约州纽约市)。
为治疗剂选择施用方案取决于若干种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性、和生物基质中的靶细胞的可及性。在某些实施例中，施用方案使递送至患者的与可接受水平的副作用一致的治疗剂的量达最大。因此，递送的生物制品的量部分地取决于特定的实体和正在治疗的病症的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy[抗体疗法],Bios Scientific Pub.Ltd(Bios科学出版社有限公司),牛津郡,英国；Kresina(编),(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis[单克隆抗体、细胞因子和关节炎],马塞尔德克尔公司,纽约州纽约市；Bach(编),(1993)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases[自身免疫疾病中的单克隆抗体和肽疗法],马塞尔德克尔公司,纽约州纽约市；Baert等人,(2003)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:601-608；Milgrom等人,(1999)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973；Slamon等人,(2001)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]342:613-619；Ghosh等人(2003)NewEngl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:24-32；Lipsky等人,(2000)New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适当的剂量。通常，剂量始于略小于最佳剂量的量并此后将其以小增量增加，直至相对于任何不利副作用，实现所希望的或最佳的效果。重要的诊断量值包括症状(例如炎症)的那些量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以改变本披露的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的期望的治疗应答，而对该患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本披露的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，正在使用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，正在治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康和既往病史，以及医学领域中已知的类似因素。
包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物组合物可以通过连续输注，或以例如一天、一周的间隔或每周1-7次按剂量提供。可通过静脉内、皮下、局部、口、鼻、直肠、肌内、脑内、或通过吸入来提供剂量。
以摩尔/千克体重计，包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗剂的所期望剂量与抗体或多肽的剂量大致相同。施用至受试者的剂量可以是至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次或12次或更多次。
对于包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗剂，施用至患者的剂量可以是约0.0001mg/kg至约100mg/kg患者体重。
在施用一系列剂量的情况下，这些剂量可以例如大约每天、大约每周、大约每月施用。这些剂量可以例如继续施用，直至疾病进展，出现不良事件或由医生确定的其他时间为止。
特定患者的有效量可以根据诸如以下的因素改变：所治疗的病症、患者的总体健康状况、施用的方法途径和剂量和副作用的严重程度(参见例如，Maynard等人(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice[用于良好临床实践的SOP指南],国际药物出版社(Interpharm Press),佛罗里达州波卡拉顿(Boca Raton,Fla.)；Dent(2001)GoodLaboratory and Good Clinical Practice[良好实验和良好临床实践],厄奇出版社(UrchPubl.),伦敦,英国)。
必要时，可以将包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗剂掺入包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因(lidocaine)的组合物中以减轻注射位点的疼痛。另外，也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的配制品。参见例如，US 6,019,968、US 5,985,320、US 5,985,309、US 5,934,272、US 5,874,064、US 5,855,913、US 5,290,540和US 4,880,078；以及WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO99/66903，每一篇文献均通过引用以其全文并入本文。
包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗剂还可以经由一种或多种施用途径使用本领域已知的多种方法中的一种或多种来施用。如本领域技术人员将理解的，施用途经和/或方式将根据所希望的结果而变化。抗体的所选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、经脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。肠胃外施用可以代表除经肠和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。替代性地，本披露内容的组合物可以通过非肠胃外途径施用，诸如局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。
可以使用例如，注射装置、注射笔、小瓶和注射筒、预填充注射筒、自动注射器、输液泵、贴片泵、输注袋和针等，经由任何上述途径施用包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗剂。如果本披露的分子或其片段以控释或缓释系统施用，则可以使用泵来实现控释或缓释(参见Langer,同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.[CRC在生物医学工程中的参考评论]14:20；Buchwald等人,1980,Surgery[外科手术]88:507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]321:574)。可以使用聚合物材料来实现本披露治疗剂的控释或缓释(参见例如，Medical Applications of Controlled Release[控释的医学应用],Langer和Wise(编),CRC出版社(CRC Pres.),佛罗里达州波卡拉顿市(Boca Raton,Fla.)(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance[受控的药物生物利用率、药物产物设计以及性能],Smolen和Ball(编),威利出版公司(Wiley),纽约市(1984)；Ranger和Peppas(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.[高分子科学杂志-高分子化学评论]23:61；还参见Levy等人,(1985)Science[科学]228:190；During等人,(1989)Ann.Neurol.[神经病学进展]25:351；Howard等人,(1989)J.Neurosurg.[神经外科杂志],7(1):105；US 5,679,377；US 5,916,597；US 5,912,015；US5,989,463；US 5,128,326；WO 99/15154；和WO 99/20253。用于缓释配制品中的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)以及聚原酸酯。在一个实施例中，用于缓释配制品的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质，在储存时稳定，无菌并且可生物降解。可以将控释或缓释系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,在Medical Applications of ControlledRelease[控释的医学应用],同上,第2卷,第115-138页(1984)中)。
在Langer(Science[科学](1990)249:1527-1533)的综述中讨论了控释系统。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含本申请的一种或多种分子或其片段的缓释配制品。参见例如，US 4,526,938、WO91/05548、WO 96/20698、Ning等人,(1996)Radiotherapy&Oncology[放射疗法和肿瘤学]39:179-189；Song等人,(1995)PDA Journalof Pharm Sci&Tech.[PDA药物科学与技术杂志],50:372-397；Cleek等人,(1997)Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.[控制释放生物活性材料的国际研讨会会议记录]24:853-854；Lam等人,(1997)Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.[控制释放生物活性材料的国际研讨会会议记录],24:759-760，每一篇文献均通过引用以其全文并入本文。
如果局部施用包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物组合物，则可以将其以油膏剂、乳膏剂、透皮贴片、洗剂、凝胶、香波、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳液的形式或本领域技术人员已知的其他形式配制。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences andIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms[雷明顿制药科学和药物剂型简介],第19版,Mack Pub.Co.(马克出版公司),伊斯顿,宾夕法尼亚州(1995)中。对于不可喷雾的局部剂型，通常使用粘性至半固体或固体形式，其包含载剂或一种或多种与局部施用相容并且具有动态粘度的赋形剂，在一些情况下，其具有大于水的动态粘度。合适的配制品包括而不限于溶液、悬浮液、乳液、乳膏剂、油膏剂、粉末、搽剂、药膏剂等，如果需要，对它们进行灭菌或与影响各种特性诸如像渗透压的助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。其他合适的局部剂型包括可喷雾气溶胶制剂，其中在一些情况下将活性成分与固体或液体惰性载剂组合包装在具有加压的挥发性物质(例如，气体推进剂，诸如氟利昂(Freon))的混合物中或挤瓶中。如果希望，还可以将保湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型中。此类另外的成分的实例是本领域已知的。
如果鼻内施用包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物组合物，则可以将它以气溶胶形式、喷雾剂、雾化剂或以滴剂形式配制。特别地，用于根据本披露使用的预防剂和治疗剂可以使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以从加压式包装或喷雾器的气溶胶喷雾展现的形式方便地进行递送。在加压的气溶胶的情况下，可通过提供阀门来确定剂量单位，以递送经计量的量。在吸入器或吹入器中使用的胶囊剂和药筒(由例如明胶组成)可以配制成含有化合物和合适散剂基料(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
还可以将包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物组合物循环施用至患者。
在某些实施例中，可以配制包含本披露的工程化免疫球蛋白的药物组合物以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为确保本披露的治疗性化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们以例如脂质体配制。对于制造脂质体的方法，参见例如，US 4,522,811；US 5,374,548；和US 5,399,331。脂质体可以包含一个或多个部分，该一个或多个部分被选择性运输至特定细胞或器官中，因此增强靶向药物递送(参见例如，Ranade VV(1989)J.Clin.Pharmacol.[临床药理学杂志],29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等人的US 5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报],357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法],39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.[美国生理学杂志]1233:134)；p 120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:9090)；还参见
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和Laukkanen(1994)FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报],346:123-6；Killion和Fidler(1994)Immunomethods[免疫方法],4:273。
本申请还提供了使用包含本披露的工程化免疫球蛋白和其他疗法或一种或多种治疗剂的组合的药物组合物共同施用或治疗患者的方案。与另外的治疗剂，例如，细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射共同施用或治疗的方法是本领域已知的(参见例如，Hardman等人,(编)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],第10增版,麦格劳-希尔集团,纽约州纽约市；Poole和Peterson(编)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach[用于先进实践的药物治疗学：实用方法],利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司,宾夕法尼亚州费城市(Phila.,Pa.)；Chabner和Longo(编)(2001)CancerChemotherapy and Biotherapy[癌症化学疗法和生物疗法],利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司,宾夕法尼亚州费城市)。有效量的治疗剂可以将症状减轻至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。
在一些实施例中，本披露内容的药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
除上述治疗方案之外，还可以对患者进行手术和其他形式的物理疗法。
治疗应用
包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物，尽管不限于此，可用于治疗、预防或改善其中存在细胞异常增殖的细胞增殖性障碍或病症，在本文中被称为“细胞增殖性障碍或病症”。在一个方面，本披露提供了用于治疗细胞增殖性障碍或病症的方法。在一个方面，治疗的受试者是人。
可以使用包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物治疗、预防或改善的细胞增殖性障碍或病症的实例包括但不限于纤维化和癌症。如本文使用的术语“癌症”意欲包括所有类型的癌性生长或致癌性过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭的阶段。
在一个实施例中，工程化免疫球蛋白结合选自由以下组成的列表的靶抗原：纤连蛋白EDA、HER2、EGFR、CD20、CD30、EpCAM、GD2和实体瘤抗原。
在具体实施例中，根据本文所述的方法将包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物施用至受试者实现了以下一种、两种或三种或更多种结果：(1)减少肿瘤或赘生物的生长；(2)减少肿瘤的形成；(3)根除、除去或控制原发性、区域性和/或转移性癌症；(4)减少转移性扩散；(5)降低死亡率；(6)提高生存率；(7)延长生存期；(8)增加缓解期的患者人数；(9)降低住院率；(10)缩短住院时间；以及(11)维持肿瘤的大小，使得其增加不超过约10％、或不超过约8％、或不超过约6％、或不超过约4％；优选地，肿瘤的大小增加不超过约2％。
在具体的实施例中，相对于施用阴性对照的患有癌症的受试者中(在一些实施例中，在相同的癌症动物模型中)的肿瘤的生长，根据本文所述的方法将包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物施用至患有癌症的受试者(在一些实施例中，癌症的动物模型)使肿瘤的生长抑制或减少至少约2倍、优选至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7倍、或至少约10倍，如使用本领域熟知的测定法所测量。在另一个实施例中，相对于施用阴性对照的患有癌症的受试者中(在一些实施例中，在相同的癌症动物模型中)的肿瘤的生长，根据本文所述的方法将包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物施用至患有癌症的受试者(在一些实施例中，癌症的动物模型)使肿瘤的生长抑制或减少至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％，如使用本领域熟知的测定法所测量。
癌性疾病的实例包括但不限于实体瘤、血液癌症、软组织肿瘤和转移性病灶。
在具体的实施例中，癌症是乳腺癌、成神经细胞瘤、淋巴瘤、结肠癌、胰腺导管腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
组合疗法
关于另外的治疗剂，“组合”施用意指在受试者患有障碍的过程中，向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。这被称为“顺序递送”。在每一种情况的一些实施例中，由于是组合施用，该治疗更有效。还可以循环施用本披露的组合疗法的一种或多种另外的治疗剂。组合循环疗法包括在一段时间内施用第一种疗法，随后在一段时间内施用第二种疗法，并重复这种顺序施用。
包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物可以与一种或多种其他疗法(例如，抗癌剂、细胞因子或抗激素剂)一起施用，以治疗和/或控制癌症。可以与包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物组合使用的其他疗法包括但不限于小分子、合成药物、肽(包括环状肽)、多肽、蛋白质、核酸(例如，DNA和RNA核苷酸，包括但不限于反义核苷酸序列、三螺旋、RNAi和编码生物活性蛋白、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成或天然无机分子、模拟剂以及合成或天然有机分子。
除了包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物之外，可以使用的一种或多种其他疗法的非限制性实例包括但不限于化疗、放疗、细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、激酶抑制剂、低剂量吉西他滨、5-氟尿嘧啶和细胞因子调节剂。特别地，除了包含本披露的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物之外，可以使用的一种或多种其他疗法尤其包括将扰乱肿瘤微环境的免疫肿瘤学方法，例如，重组IL-2、重组IL-15、重组IL-12、重组IL-21、抗IL1β、抗TGFβ、抗CD39、抗CD73、抗CTLA4、抗PD(L)1、抗TIM3、HDAC抑制剂、HIF1a抑制剂和抗血管生成剂(诸如抗VEGF)。
试剂盒
本披露还涵盖用于治疗患有细胞增殖性障碍的患者的试剂盒。此类试剂盒包含治疗有效量的包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物。另外，此类试剂盒可以包含用于施用包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物的工具(例如，自动注射器、注射筒和小瓶、预填充注射筒、预填充笔)以及使用说明书。这些试剂盒可以含有用于治疗细胞增殖性障碍的另外的治疗剂(如下所述)。此类试剂盒还可以包括用于施用包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物以治疗患者的说明书。此类说明书可以提供用于包含如本文所述的工程化免疫球蛋白的治疗或药物组合物的剂量、施用途径、方案和总治疗持续时间。
短语“用于施用的工具”用于指示用于向患者全身施用药物的任何可用工具，该工具包括但不限于预填充注射筒、小瓶和注射筒、注射笔、自动注射器、IV滴注器和袋、输注泵、贴片、输注袋和针等。使用此类物品，患者可以自我施用药物(即，在没有医生的帮助下施用药物)或者医生可以施用药物。
实例
提供以下实例以进一步说明本披露，但不限制本披露的范围。本披露的其他变型对本领域普通技术人员而言将是显而易见的，且也为所附权利要求书所涵盖。
将根据实例1、2和3产生的衍生自氨基酸序列的所有构建体在哺乳动物系统中表达并纯化(实例4)，以使用表面等离子体共振(SPR)评估与FcαRI、FcRn、FcγRIa和FcγRIIIa的结合(实例5)。使用人新鲜分离的PMN、PBMC和单核细胞衍生的巨噬细胞，通过基于细胞的测定来评估工程化免疫球蛋白的功能性(实例6和7)。用差示扫描量热法(DSC)测量研究热稳定性(实例8)。所有实例均使用抗体形式的工程化免疫球蛋白进行，该抗体形式包含识别抗原HER2的VH和VL结构域以及基于IgA2或IgG1的工程化铰链和Fc区。SEQ ID NO:1是抗HER2结合抗体的全长重链序列，该抗体具有结合HER2的VH结构域以及来自IgG1的铰链和恒定结构域。SEQ ID NO:3是抗HER2结合抗体的全长重链序列，该抗体具有结合HER2的VH结构域以及来自IgA2的m2同种异型的铰链和恒定结构域(Lombana等人,(2019)MABS[单克隆抗体],11(6):1122-38)。SEQ ID NO:124是抗HER2结合抗体的轻链序列，该抗体具有结合HER2的VL结构域和来自IgG1的恒定结构域(CL；κ)。
实例1：IgA/IgG蛋白工程化
1.1将IgAFc/hFcαRI界面从人IgA转移至人IgG免疫球蛋白
最初的实验工作集中于恒定结构域从IgG1同种型抗体至IgA2同种型抗体的逐步转移，该IgA2同种型抗体包含与HER2结合的VH和VL结构域。
1.1.1.用于单体IgA2产生的α尾部(tail-piece)去除和P_CH1.124_R(C结构域的IMGT编号)
IgA以三种不同的形式存在，一种是在血液中循环的单体形式，一种是在粘膜区室中发现的二聚物形式，以及一种是与经历胞吞转运的分泌区室相关的分泌形式。对于目前的工作，使用IgA2的单体形式，有必要生成不太容易被蛋白水解酶降解的IgA2的单体形式。因此，使用由Geneart(德国雷根斯堡(Regensburg,DE))合成的经修饰的序列，通过标准克隆和PCR方法除去存在于SEQ ID NO:130(图2a)中的位于IgA2 CH3结构域C末端处的尾部。所得单体形式的IgA2缺少尾部，并且在SEQ ID NO:2中示出(图2b)。此外，CH1结构域中位置124(C结构域的IMGT编号)处和铰链区正前方的氨基酸残基脯氨酸的存在影响IgA2轻链如何与其重链配对(Lombana等人,(2019)MABS[单克隆抗体],11(1):75-93)。用精氨酸取代位置124处的脯氨酸(P124R)显著降低了IgA2的异质性(即轻链-重链错配)，而不影响IgA2与hFcαRI相互作用的能力(表2)，如通过SDS-PAGE分析所确定(结果未示出)。这种修饰是在具有尾部的IgA2序列(如SEQ ID NO:131所示)以及没有尾部的IgA2序列(如SEQ ID NO:3所示)中进行的。
表2：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000671
1.1.2.IgG1/IgA2 CH1置换(C结构域的IMGT编号)
包含IgA2恒定结构域的抗HER2抗体的CH1结构域被IgG1的对应CH1结构域替换(图2c)。当测试工程化抗体的hFcαRI结合时，发现如SEQ ID NO:4所示的CH1结构域的取代对hFcαRI结合的影响有限，如使用表面等离子体共振所确定(表3)。
表3：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000672
Figure BDA0003909357670000681
1.1.3.IgG1/IgA2铰链置换(C结构域的IMGT编号)
用来自IgG1的对应CH1和铰链结构域替换IgA2抗HER2抗体的重链的CH1和铰链结构域(图2d)。当测试工程化抗体的hFcαRI结合时，发现如SEQ ID NO:7、8和9所示的CH1和铰链结构域的取代对hFcαRI结合几乎没有影响，如使用表面等离子体共振所确定(表4)。
表4：按照实例5a中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000682
1.1.4.IgA2 Fc/hFcαRI复合物的计算机分析(Yasara和PyMol)
使用晶体结构PDB 1D 1OW0，对IgA1 Fc与hFcαRI的复合物进行了计算机分析。将用于分子可视化的计算机程序YASARA(www.yasara.org)和开源分子可视化系统PyMOL(https://pymol.org)用于显示和处理3D复杂结构。所有暴露于溶剂的残留物和位于hFcαRI附近(距离d<7埃)的残留物被认为可能参与了IgA1 Fc与hFcαRI的相互作用。
1.1.5.叠置IgG1/IgA1 Fc(PyMOL)
使用IgA1 Fc/hFcαRI晶体结构(PDB ID 1OW0)和IgG1 Fc晶体结构PDB 1FC1进行IgG1和IgA1 Fc的计算机叠置。基于这种叠置和“项链”表示(IMGT资源)，鉴定出了在结构上等效于参与IgA1 Fc/hFcαRI相互作用的IgA1残基的IgG1残基。
1.1.6.IgA/hFcαRI相互作用位点和二级结构元件提取(C结构域的IMGT编号)
先前鉴定的IgG1残基(参见1.1.4节)被来自IgA2的对应残基替换。此外，将负责二级结构(α螺旋、β链和转角保持或与上述1.1.4中描述的残基相关)的残基从IgA2转移至IgG1中，因为从晶体结构中观察到它们保持和定向与hFcαRI直接相互作用的残基。
1.1.7.IgG/IgA CH2、CH3和CH2/CH3弯头长度调整(C结构域的IMGT编号)
虽然IgG1和IgA2共有相同的结构同源性，但氨基酸序列长度以及与hFcαRI相互作用的CH2和CH3保持残基之间的角度是不同的。由于这个原因，IgG1 CH2和CH3结构域的长度在CH2/CH3界面(在本文中被称为“CH2/CH3弯头”)的一个区域中被调节(图2e)。基于如SEQID NO:4、5、6、7、8和9所示的结构IgG1/IgA1的比较和“项链”显示(IMGT资源)，将这种包含IgA2的CH2结构域的大约最后三个残基和CH3结构域的前六个残基的区域(在图8中示意性地示出)缩短。这种弯头的长度对与hFcαRI结合的影响在表5中示出。
表5：按照实例5a中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000691
1.1.8.基于合理设计的IgG/IgA CH2/CH2修饰
在已经包含来自IgG1的CH1结构域和铰链区的工程化抗HER2抗体中，然后用来自IgG1的CH2结构域替换CH2结构域(图2f)。使用合理设计，基于如上述1.1.5节中描述的叠置工作，在CH2结构域中的位置处进行各种氨基酸修饰，以用来自IgA2的对应残基取代IgG1残基(如SEQ ID NO:10至12、14至23所示)。与野生型IgG1(SEQ ID NO:1)相比，这些CH2突变总结于下表6中，并且它们对hFcαRI上结合的影响呈现于表7中。
表6：CH2突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000701
Figure BDA0003909357670000711
表7：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000712
1.1.9使用合理设计置换IgG/IgA CH3/CH3核心界面
上述CH2修饰不足以恢复hFcαRI与工程化抗体的结合。因此，为了研究对CH3结构域的修饰是否可以有助于hFcαRI结合，产生了工程化抗HER2抗体，其包含来自IgG1的CH1结构域和CH3结构域，但保留了来自IgA2的铰链和CH2结构域，并且具有来自IgG1的CH2/CH3弯头区。另外，将进一步修饰引入CH3结构域中以用由β折叠保持的与hFcαRI相互作用的IgA2残基替换IgG1残基。从结构分析已知，β折叠的一侧将IgA2 CH3结构域氨基酸残基的侧链转向hFcαRI，而β折叠的另一侧将IgA2 CH3残基的侧链转向CH3/CH3核心界面。CH3/CH3核心残基可以影响残基侧链在它们与hFcαRI相互作用中的定位，这取决于它们的特性和空间位阻。由于这个原因，将CH3/CH3界面处的IgG1 CH3核心残基与IgA2残基交换，以便正确定向与位于β折叠另一侧的hFcαRI相互作用的残基(图2g；如SEQ ID NO:13、24至27、46至48和87至94所示)。这些CH2突变总结于下表8中，并且它们对hFcαRI结合的影响呈现于表9中。
表8：CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000721
Figure BDA0003909357670000731
Figure BDA0003909357670000741
表9：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000742
1.2半合理设计-从IgA2至IgG1
如上述1.1节所述的纯合理设计提供了鉴定参与IgA2/hFcαRI相互作用的残基的可能性，以便随后将这些残基转移至IgG1 Fc中。对于铰链、CH2/CH3弯头和CH3工程化，相互作用残基和结构元件的转移、CH3/CH3核心残基的长度调整和工程化是成功的。然而，对于CH2和CH3工程化的微调，有必要使用半合理的方法来完成活动。
1.2.1.ABCDEFGβ链扫描
如先前所讨论，IgG1和IgA2共有高度的结构同源性，并且CH2和CH3结构域两者均由从反平行β链A、B、C、D、E、F和G(IMGT命名法)制备的β折叠构成。通过用等效的IgG1β链顺序取代来单独扫描IgA2 CH2和CH3β链中的每一条。此外，β链取决于它们在IgA2/hFcαRI相互作用中的作用而被替换，因为已知一些链含有与hFcαRI直接相互作用的hey残基。这些置换是：A+B、E+F、C+D、C+D+G、A+B+E+F、C+D+E+F+G、A+B+C+D+G，其中最多五条IgA2β链被IgG1β链替换。SEQ ID NO:28至41中描绘的氨基酸序列举例说明了通过用来自IgG1 CH2结构域的残基取代而对IgA2 CH2结构域进行的修饰(图3a)。SEQ ID NO:58至68中描绘的氨基酸序列举例说明了通过用来自IgG1 CH3结构域的残基取代而对IgA2 CH3结构域进行的修饰(图3b)。这些CH2和CH3突变总结于下表10和12中，并且它们对hFcαRI结合的影响呈现于表11和13中。
表10：CH2突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000751
Figure BDA0003909357670000761
Figure BDA0003909357670000771
Figure BDA0003909357670000781
表11：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000782
Figure BDA0003909357670000791
表12：CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000792
Figure BDA0003909357670000801
Figure BDA0003909357670000811
表13：按照实例5a中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000812
Figure BDA0003909357670000821
1.2.2.结构域切割(顶部/底部、前部/侧面)
鉴于它们的结构相似性，可以将IgG1和IgA2 CH2和CH3定义为“构造块”，有可能将这些结构域切割成片段。切割两种不同类型的截面：(i)沿着横向平面的截面(上/下截面)，以及(ii)沿着前向平面的截面(前/侧截面)。基于具有来自IgG1的CH1结构域的抗HER2抗体的最终构建体含有由50％ IgA2和50％ IgG1组成的IgG1/IgA2杂合CH2或CH3结构域。SEQID NO:42至45中描绘的氨基酸序列举例说明了对CH2结构域进行的修饰，并且SEQ ID NO:69和70中描绘的氨基酸序列举例说明了通过横切面或正面截面取代而对CH3结构域进行的修饰。这些CH2和CH3突变在图3c-图3g中示意性地示出，总结于下表14和16中，并且它们对hFcαRI结合的影响呈现于表15和17中。
表14：CH2突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000822
Figure BDA0003909357670000831
表15：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000832
表16：CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000833
表17：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000841
1.2.3.顶部-CH2二硫化物节点，暴露于CH3的α螺旋
将半合理设计用于确定IgA2的Fc区的哪些氨基酸残基是与hFcαRI相互作用所必需的，尽管它们的作用在这种相互作用中明显不相关，或者这些残基与hFcαRI界面相距很远。据发现在空间上位于IgA2的CH2结构域顶部的二硫键和堆积环(在图9中示出)在CH2结构域残基于hFcαRI结合位点处的正确定位方面起重要作用。发现这种作用非常令人惊讶，因为当IgA2结合hFcαRI时，发现CH2结构域的这一部分远离结合位点。还发现位于IgA2(暴露于溶剂并远离hFcαRI定位)的CH3结构域上的α螺旋对IgA2 Fc/hFcαRI相互作用具有影响。SEQ ID NO:49至57和73至79中描绘的氨基酸序列举例说明了对CH2结构域进行的修饰，以确定参与间接hFcαRI结合的残基。SEQ ID NO:80至99中描绘的氨基酸序列举例说明了对CH3结构域进行的修饰，以确定参与间接hFcαRI结合的残基。这些CH2和CH3突变在图3h和图3i中示意性地示出，总结于下表18和20中，并且它们对hFcαRI结合的影响呈现于表19和21中。
表18：CH2突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000842
Figure BDA0003909357670000851
Figure BDA0003909357670000861
Figure BDA0003909357670000871
表19：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000872
表20：CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000873
Figure BDA0003909357670000881
Figure BDA0003909357670000891
Figure BDA0003909357670000901
表21：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670000902
Figure BDA0003909357670000911
1.3产生同二聚体的合理和半合理设计的概述
将如上所述鉴定的来自IgG1 CH2、CH3和CH2/CH3弯头的优选工程化序列组装在一起，以产生能够保留IgA免疫球蛋白的hFcαRI结合能力的工程化IgG1。描绘CH2和CH3突变位置的优选结构在图4a和图4b中示意性地示出。工程化序列的CH2和CH3突变列于表22中。通过表面等离子体共振表征与hFcαRI的结合，如表23和表24所示。所得工程化免疫球蛋白的hFcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至比亲代IgA2低约10倍的结合。
从这一轮工程化中选择的先导候选物包括SEQ ID NO:119、120、122和123，并且与hFcαRI的对应结合数据呈现于表24中。然后分别按照实例6和7中描述的程序，在ADCC和ADCP测定中测试这些候选物。结果在图10、11和12中示出。在SK-BR-3细胞PMN杀伤测定中，包含SEQ ID NO:119、120、122和123的工程化IgG1免疫球蛋白被证明与亲代IgA2相比具有改善的功效(图10)。如图11所示，在Calu-3细胞PMN杀伤测定中，包含SEQ ID NO:122的工程化IgG1免疫球蛋白被证明具有与亲代IgA2相当的功效。在ADCP测定中测定了包含SEQ IDNO:122的工程化IgG1免疫球蛋白的吞噬活性，并且在图12中示出。这种免疫球蛋白的吞噬活性被证明于与野生型IgG1(SEQ ID NO:1)和亲代IgA2(SEQ ID NO:3)两者相当。
表22：CH2和CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670000912
Figure BDA0003909357670000921
Figure BDA0003909357670000931
Figure BDA0003909357670000941
Figure BDA0003909357670000951
Figure BDA0003909357670000961
Figure BDA0003909357670000971
Figure BDA0003909357670000981
Figure BDA0003909357670000991
Figure BDA0003909357670001001
Figure BDA0003909357670001011
Figure BDA0003909357670001021
表23：按照实例5a中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001022
Figure BDA0003909357670001031
表24：按照实例5b中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001032
实例2：hFcRn结合、hFcγR结合的恢复以及组合α/γ效应子功能和hFcRn结合的异二聚体的产生
2.1用于延长半衰期的hFcRn结合恢复
与hFcRn相互作用的IgG1 Fc的关键残基位于负责hFcαRI相互作用的IgA2 Fc(CH3)的对应区域中。由于这个原因，不可能将完整的hFcαRI相互作用位点从IgA2 CH3转移至IgG1 CH3而不丧失hFcRn结合能力。为了确定hFcRn结合是否可以赋予至包含来自IgA2的CH2和CH3结构域的工程化免疫球蛋白，用来自IgG1的对应氨基酸残基进行对CH3结构域的取代(在图5a中示意性地示出；参见表25)。利用工程化免疫球蛋白中的这些突变，有可能恢复hFcRn结合；然而，这不利于hFcαR结合，并且因此工程化免疫球蛋白对hFcαRI的应答有一些损失，如表25所示。
表25：CH3突变(基于亲代IgA2(SEQ ID NO:3)并且根据C结构域的IMGT编号进行编号)，以及按照实例5b中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答的概述。
Figure BDA0003909357670001041
2.2γ应答恢复
基于IgG1 Fc区并具有恢复IgA结合的突变的工程化免疫球蛋白缺乏通过与hFcγR结合募集γ效应子功能的能力。因此，有必要用IgG1残基替换位于顶部-CH2二硫化物节点区中的IgA残基。通过引入对同二聚体的进一步突变，增强与hFcγR的结合是可能的。这些突变S239D和I332E(“SDIE”；EU编号；Lazar等人(2006)同上)被引入同二聚体的两个Fc结构域的CH2结构域中(在图5b中示意性地示出)，并且在恢复工程化同二聚物免疫球蛋白的IgG效应子功能方面是有效的。SEQ ID NO:150至153所示的氨基酸序列包括SDIE突变和在下表26中示出的另外的突变。
然而，hFcγRIa和hFcγRIIIa与工程化同二聚物免疫球蛋白相互作用的恢复降低了与hFcαRI的结合，如表27、28和29所示。从表27中可以看出，与具有较低含量IgA残基的工程化免疫球蛋白相比，包含较高含量衍生自IgA的残基的工程化免疫球蛋白具有改善的hFcαRI结合亲和力。从表28中可以看出，与具有较高含量IgA残基的工程化免疫球蛋白相比，包含较低含量衍生自IgA的残基的工程化免疫球蛋白具有改善的hFcγRIa结合亲和力。仅当在空间上位于CH2顶部的残基完全衍生自IgG1时，才观察到与hFcγRIa的结合。从表29中可以看出，与具有较高含量IgA残基的工程化免疫球蛋白相比，包含较低含量衍生自IgA的残基的工程化免疫球蛋白具有改善的hFcγRIIIa结合亲和力。
因此，难以使用同二聚物Fc形式将α和γ效应子两种功能维持在IgA2或IgG1水平。如图13-16所示，对于包含SEQ ID NO:122、148和152的工程化免疫球蛋白，体外PMN/PBMC杀伤测定和ADCP测定证实了这些观察结果。
具有hFcαRI、hFcγRIa和hFcγRIIIa结合特性的优选同二聚物工程化IgG1免疫球蛋白候选物包含SEQ ID NO:148和152内包含的Fc结构域。
表26：CH2和CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670001051
Figure BDA0003909357670001061
表27：如按照实例5b中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001062
表28：如按照实例5b中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcγRIa的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001071
表29：如按照实例5b中描述的程序，通过表面等离子体共振测定的工程化免疫球蛋白对hFcγRIIIa的最大应答。确定最大应答仅是为了加速筛选过程。
Figure BDA0003909357670001072
Figure BDA0003909357670001081
2.3异二聚物Fc(杵臼结构)
因此，通过使用基于“杵臼结构”技术的工程化异二聚物免疫球蛋白Fc区来解决试图将α和γ效应子两种功能维持在IgA2或IgG1水平的挑战(Merchant等人,(1998)同上)。在这样的分子中，当一半的IgG1Fc被工程化以结合并募集hFcαRI，并且后半部分的IgG1 Fc保持不变时，与hFcRn的结合被恢复。还发现，当后半部分的IgG1 Fc包含在空间上位于衍生自IgA2的CH2顶部的残基(例如，堆积环和二硫键)时，氨基酸突变“LS”(M428L、N434S(EU编号)/M_CH3.107_L/N_CH3.114_S(C结构域的IMGT编号)；Zalevsky等人,(2010)同上)和“YTE”突变(M252Y、S254T、T256E(EU编号)/M_CH2.15.1_Y/S_CH3.16_T/T_CH2.18_E(C结构域的IMGT编号)；Dall'acqua等人,(2002)同上)，在后半部分的IgG1 Fc中被要求恢复与hFcRn的结合。SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、154、159、160、161、162、163和164内包含的Fc结构域包括引入“杵”的突变S354C/S_CH3.10_C和T366W/T_CH3.22_W(C结构域的EU/IMGT编号)。SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、155、156、157和158内包含的Fc结构域包括引入“臼”的突变Y349C/Y_CH3.5_C、T366S/T_CH3.22_S、L368A/L_CH3.24_S和Y407V/Y_CH3.86_V(C结构域的EU/IMGT编号)。SEQ ID NO:154、160和162内包含的Fc结构域还包括LS突变，并且SEQ ID NO:163内包含的Fc结构域还包括YTE突变。包含“杵”突变和另外的突变的Fc结构域的完整突变组的细节在下表30中示出。包含“臼”突变和另外的突变的Fc结构域的完整突变组的细节在下表31中示出。
对于这种“杵臼结构”结构的功能来说，重要的是“臼”突变发生在包含募集hFcαRI的残基的一半Fc中，而“杵”突变发生在另一半Fc中。据发现在募集hFcαRI的一半Fc中制造“杵”突变导致工程化IgG1免疫球蛋白对hFcαRI亲和力的高度丧失。
对于包含具有恢复IgA效应子功能的突变的第一Fc结构域和来自IgG1的第二Fc结构域(两个Fc结构域分别具有“臼”和“杵”突变)的异二聚物工程化IgG1免疫球蛋白，如实例1.3中所述，通过添加SDIE突变，完整的FcγR效应子功能得以恢复。然而，有必要将SDIE突变引入仅含有“杵”突变的Fc结构域中，以便不干扰FcαRI结合。SEQ ID NO:161、162和164内包含的Fc结构域包括SDIE突变以及产生用于异二聚体稳定的“杵”的突变。SEQ ID NO:162内包含的Fc结构域还包括恢复hFcRn结合的LS突变。产生的异二聚物形式在图6a-e中示意性示出。
通过表面等离子体共振表征工程化异二聚物免疫球蛋白与hFcαRI、hFcγRIa、hFcγRIIIa和hFcRn的结合。结果在表32-36中示出。异二聚物先导候选物(在图6a和图6b中示意性地示出)列于表37中，并且在体外ADCC和ADCP测定中进行了测试，分别如实例6和7中所述。结果在图17、图18和图19中示出。构建所得工程化免疫球蛋白以实现以下结合特性(参见表37)：
a.hFcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至比亲代IgA2低约10倍；
b.hFcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至低约10倍，以及对hFcγ受体的野生型IgG1样结合；
c.hFcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至低约10倍，以及对hFcRn的野生型IgG1样结合；以及
d.hFcαRI结合范围从亲代IgA2样结合至低约10倍，以及对hFcγRIa、hFcγRIIIa和hFcRn的野生型IgG1样结合。
在评估吞噬作用的ADCP测定中，与亲代IgA2(SEQ ID NO:3)和野生型IgG1(SEQ IDNO:1)相比，除了SEQ ID NO:137-154对之外的所有异二聚物候选物均显示出随着浓度增加吞噬作用改善，如图19所示。
表30：CH2和CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670001101
Figure BDA0003909357670001111
表31：CH2和CH3突变(基于序列SEQ ID NO:1)的概述
Figure BDA0003909357670001121
Figure BDA0003909357670001131
Figure BDA0003909357670001141
表32：按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001142
Figure BDA0003909357670001151
表33：按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcγRIa的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001152
Figure BDA0003909357670001161
表34：按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcγRIIIa的最大应答。确定最大应答仅是为了驱动选择和加速筛选。
Figure BDA0003909357670001162
表35：按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcRn的最大应答。确定最大应答仅是为了驱动选择和加速筛选。
Figure BDA0003909357670001163
Figure BDA0003909357670001171
表36：按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定的工程化免疫球蛋白对hFcRn的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001172
概述
实例1和2中描述的蛋白质工程化活动导致产生具有α和γ效应子两种功能的工程化IgG1免疫球蛋白。这些工程化免疫球蛋白可以构建为具有或不具有用于延长半衰期的hFcRn结合，并且先导候选物的结合特性和细胞效应子功能在表37中示出。
表37：通过实例1和2中描述的工程化活动选择的先导候选物，以及它们介导α和γ效应子功能的能力的描述。
Figure BDA0003909357670001181
实例3：IgA2 Fc对hFcαRI的亲和力成熟
3.1 IgA2 Fc文库设计
由于IgA1与IgA2具有相似的结构，仅在铰链区不同，因此使用晶体结构PDB 1OW0对IgA1 Fc/hFcαRI复合物进行了计算机分析。位于hFcαRI附近的所有残基均被认为可能参与IgA1 Fc/hFcαRI相互作用，并被分为两类：(i)来自“核心”界面区域的残基(LCH2.15、LCH2.15.1、MCH3.105、ECH3.109、PCH3.113、LCH3.114、ACH3.115、FCH3.116、QCH3.118，使用C结构域的IMGT编号)和(ii)来自围绕核心的“壳”区域的残基(QCH2.94、NCH2.97、HCH2.98、RCH3.1、ECH3.3、RCH3.40、LCH3.42、SCH3.45、ECH3.45.2，使用C结构域的IMGT编号)。使用基于三核苷酸定向诱变(TRIM)的方法使两组残基多样化(
Figure BDA0003909357670001182
等人,(1994)NucleicAcids Res.[核酸研究],22:5600-5607；Knappik等人,(2000)J Mol Biol.[分子生物学杂志],296:57-86)以产生两个文库L1和L2，分别对应于“壳”区域和“核心”区域。
使用IgA2 Fc结构域的易错PCR产生第三个文库(EP文库)(Gram等人,(1992)PNASUSA[美国国家科学院院刊],89:3576-3580)。
3.2通过酵母展示筛选文库
使用酵母展示技术筛选所有三个IgA2 Fc文库(Boder等人,(1997)Nature Biot.[自然生物技术],15:553-557)。简而言之，经由α-凝集素(Aga1/Aga2)蛋白异二聚体将IgAFc展示在酵母细胞膜上，其中IgA2Fc与Aga2蛋白的N末端融合。进行了四轮分选：
(i)在第一轮分选过程中，将所有三个文库在含有1％棉子糖和2％半乳糖的选择性培养基中于20℃下振荡生长两天，以诱导酵母细胞表面上的IgA2 Fc表达。将每种培养物沉淀，除去上清液，并用含有1％ BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA的PBSM(PBS(Gibco，马萨诸塞州沃尔瑟姆市(Waltham,MA)))洗涤沉淀一次。将沉淀重悬于20ml PBSM后，添加各100μl链霉亲和素和抗生物素微珠(Miltenyi Biotec公司，德国贝吉施格拉德巴赫(BergischGladbach,Germany))。将细胞在室温下旋转孵育1小时。然后使用MACS LS柱(美天旎公司(Miltenyi))除去珠子。接着将文库沉淀并重悬于20ml PBSM+50nM生物素化FcαRI(CD89)(SEQ ID NO:253)中，并且在室温下旋转孵育1小时。然后沉淀细胞，除去上清液，在PBSM中洗涤一次，然后重悬于20ml PBSM+100μl链霉亲和素微球(美天旎公司)中。将文库在冰上孵育5分钟，偶尔振荡，然后沉淀细胞，除去上清液，重悬于20ml PBSM中，然后在MACS LS柱(美天旎公司)上分离。用5ml PBSM洗涤柱一次，然后用选择性培养基洗脱结合的细胞，在选择性培养基中达到最终10ml，并在30℃下振荡生长过夜。
(ii)对于第二轮分选，将来自三个文库中每一个的第一轮输出在含有1％棉子糖和2％半乳糖的选择性培养基中于20℃下生长24小时，以诱导IgA表达。将文库沉淀，在PBSF(PBS(Gibco)+0.1％牛血清白蛋白)中洗涤一次，并重悬于PBSF中。将每个文库分成两个样品；将第一个样品带至PBSF中的25nM生物素化FcαRI，并且将第二个样品带至PBSF中的10nM生物素化FcαRI。向每个样品中添加最终稀释度为1:100的兔抗myc标签Dylight 488(Rockland公司，宾夕法尼亚州利默里克(Limerick,PA))，并且将样品在室温下旋转孵育1.5小时。将样品沉淀，用PBSF洗涤一次，然后与PBSF+1:100最终链霉亲和素Dylight 633(英杰公司(Invitrogen)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))一起旋转孵育5分钟。然后将样品沉淀，洗涤一次，重悬于PBSF中，通过40μm过滤器过滤，然后使用流式细胞仪在FACSAria细胞分选仪(贝克顿·迪金森生物科学公司(Becton Dickinson Biosciences)，加利福尼亚州圣何塞市(San Jose,CA))上进行分析和分选。对于L1和L2文库，对10nM FcαRI样品进行分选，并且对于EP文库，对25nM FcαRI样品进行分选。在每种情况下，显示最高1％-2％信号的酵母被选通、收集并在选择性培养基中于30℃下生长过夜。
(iii)对于第三轮分选，将来自第二轮分选的培养物接种到选择性培养基+1％棉子糖+2％半乳糖中，并在20℃下生长过夜以诱导IgA表达。除了使用鸡抗myc标签FITC(Genetex公司，加利福尼亚州尔湾(Irvine,CA))和Neutravidin Dylight 633(英杰公司)作为检测试剂之外，如第二轮中所做的，制备并分选来自三个文库中每一个的细胞。将生物素化FcαRI以5nM用于EP文库，以2nM用于L1文库，并且以1nM用于L2文库。在每种情况下，显示最高1％-2％信号的酵母被选通、收集并在选择性培养基中于30℃下生长过夜。
(iv)第四轮分选仅对EP和L1文库完成。将来自第三轮分选的培养物接种到选择性培养基+1％棉子糖+2％半乳糖中，并在20℃下生长过夜以诱导IgA表达。除了使用小鼠抗cmyc Dylight 488(英杰公司)和链霉亲和素cy5(英杰公司)作为检测试剂之外，如第二轮中所做的，制备并分选来自每个文库的细胞。将生物素化FcαRI以2nM用于EP文库，并且以1nM用于L1文库。在每种情况下，显示最高1％-2％信号的酵母被选通、收集并在选择性培养基中于30℃下生长过夜。
3.3全长免疫球蛋白中的热点鉴定和翻译
从第三轮(L2文库)和第四轮(EP和L1文库)培养物中纯化质粒，转化入大肠杆菌(E.coli)中，铺在选择性琼脂板上，在37℃下生长过夜，并提交给金唯智公司(Genewiz)(新泽西州南普莱恩菲尔德(South Plainfield,NJ))进行Sanger测序(Sanger等人(1975)JMol Biol.[分子生物学杂志],94(3):441-8；Sanger等人(1977)PNAS USA.[美国国家科学院院刊],74(12):5463-7)。基于其出现频率选择顶部克隆，并且用于鉴定增强IgA2/FcαRI相互作用的突变。IgA2残基位置呈现于表38中。
表38：通过酵母展示确定的突变用于增强IgA2对hFcαRI的亲和力。
Figure BDA0003909357670001211
将鉴定的突变以单点突变或组合形式掺入具有SEQ ID NO:3的全长IgA2免疫球蛋白中(图7a)，并在HEK293细胞中瞬时表达(如实例4所述)。还将相同的突变掺入具有SEQ IDNO:122和148并且含有能够与hFcαRI结合的工程化IgG Fc的IgG1同种型免疫球蛋白中(分别为图7b和图7c)。测试的突变组呈现于表39(基于SEQ ID NO:3)、表41(基于SEQ ID NO:122)和表43(基于SEQ ID NO:148)中。
使用表面等离子体共振(SPR)对Fc变体进行纯化和评估，针对hFcαRI进行测量，以评价特定突变对免疫球蛋白与hFcαRI亲和力的影响。有趣的是，所有突变对各自免疫球蛋白的表达产量和聚集倾向的影响均有限或没有实际影响。捕获后的SPR数据和聚集含量在表40、表42和表44中示出。
最后，基于SPR和聚集数据选择先导候选物，并且使用更大范围的hFcαRI浓度重复SPR实验。使用适应的浓度范围能够更精确地测量工程化免疫球蛋白和hFcαRI之间的相互作用。结果在表45、表46和表47中示出。
表39：基于亲代IgA2免疫球蛋白SEQ ID 3的测试突变组。
Figure BDA0003909357670001221
Figure BDA0003909357670001231
表40：基于亲代IgA2 SEQ ID No:3的Fc变体的生物物理学特征。
Figure BDA0003909357670001232
1按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
2按照实例4中描述的程序测量聚集倾向。
nd：未确定的
表41：基于亲代IgG1工程化免疫球蛋白SEQ ID 122的测试突变组。
Figure BDA0003909357670001241
表42：基于亲代工程化免疫球蛋白SEQ ID NO:122的Fc变体的生物物理学特征
Figure BDA0003909357670001251
1按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
2按照实例4中描述的程序测量聚集倾向。
nd：未确定的
表43：基于亲代IgG1工程化免疫球蛋白SEQ ID 148的测试突变组
Figure BDA0003909357670001252
Figure BDA0003909357670001261
表44：基于亲代工程化免疫球蛋白SEQ ID NO:148的Fc变体的生物物理学特征
Figure BDA0003909357670001262
Figure BDA0003909357670001271
1按照实例5b中描述的程序，通过SPR实验测定工程化免疫球蛋白对hFcαRI的亲和力和最大应答。
2按照实例4中描述的程序测量聚集倾向。
nd：未确定的
表45：如通过实例5b中描述的SPR实验确定的基于亲代IgA2(SEQ ID NO:3)的Fc变体对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001272
表46：如通过实例5b中描述的SPR实验确定的基于亲代IgG1工程化免疫球蛋白(SEQ ID NO:122)的Fc变体对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001273
Figure BDA0003909357670001281
表47：如通过实例5b中描述的SPR实验确定的基于亲代IgG1工程化免疫球蛋白(SEQ ID NO:148)的Fc变体对hFcαRI的亲和力和最大应答。
Figure BDA0003909357670001282
3.4体外测定中亲和力成熟转化为α效应子功能增强
选择具有包含在SEQ ID NO:204、209和214内的同二聚物Fc的先导候选物，因为它们对hFcαRI的结合能力提高了。接下来，按照实例6中描述的程序，在PMN杀伤测定中对它们进行测试。效力(EC50；产生其最大效果的50％所需的免疫球蛋白浓度)和功效(Emax；免疫球蛋白的最大预期效果)结果在图20至图24中示出。
所有经测试的候选物均是活性的，并且在SK-BR-3PMN杀伤测定中被证明与亲代IgA2相比具有改善的功效(图20)。
另外，在使用Calu-3细胞的PMN杀伤测定中显示了功效的实质性改善(图21)，其中已知HER2受体密度低于SK-BR-3细胞(在实例6中描述)。此外，在对MDA-MB-453细胞的PMN杀伤测定中，显示了具有SEQ ID NO:214的变体效力的实质性改善，也已知表达较低水平的HER2受体(图22)。
最后，在使用MDA-MB-175细胞的PMN杀伤测定中测试了具有SEQ ID NO:214的亲和力成熟变体，这些MDA-MB-175细胞被称为HER2表达最低的细胞系，并且即使在非常高的浓度下也没有显示出杀伤作用(图23)。这一观察突出了经测试的候选物的安全概况。
将Q_CH2.94_E、L_CH2.97_Y和S_CH3.45_D的突变组应用于包含在SEQ ID NO:157内的异二聚物Fc的“臼”臂，从而产生SEQ ID NO:252。针对来自实例2的具有SEQ ID NO:157-159和SEQ ID NO:157-161的先导Fc异二聚体，测试了包含SEQ ID NO:252-159和SEQID NO:252-161的异二聚物Fc候选物(在图7d中示意性地示出)。与它们的亲代免疫球蛋白和IgA2相比，具有SEQ ID NO:252-159和SEQ ID NO:252-161内包含的Fc结构域的工程化IgG1免疫球蛋白在PMN杀伤测定中被证明对SK-BR-3细胞具有更好的杀伤特性(图24a和24c)，但在PBMC杀伤测定中显示对介导γ应答没有效果(图24b和24d)。将源自亲和力成熟的突变引入识别hFcαRI的Fc结构域中改善了α受体结合，但不影响γ受体结合。
实例4：工程化蛋白的表达和纯化
在Geneart(生命技术公司(LifeTechnologies))上合成编码重链和轻链的核酸序列，并使用基于限制性酶连接的克隆技术将其克隆到哺乳动物表达载体中。将所得质粒共转染到HEK293T细胞中。简而言之，为了瞬时表达免疫球蛋白(IgG、IgA和工程化免疫球蛋白)，使用聚乙烯亚胺((PEI)参考目录号24765，聚合科学公司(Polysciences,Inc.))将轻链和每种工程化重链的等量载体共转染到悬浮适应的HEK293T细胞中。典型地，用含有50μg编码工程化重链的表达载体和50μg编码轻链的表达载体的DNA转染以1-2Mio细胞/ml的密度悬浮的100ml细胞。然后将重组表达载体引入宿主细胞中，并通过进一步培养细胞7天的时段来产生构建体，以允许分泌到补充有0.1％普朗尼克酸(pluronic acid)、4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml抗生素的培养基(HEK，无血清培养基)中。
然后使用免疫亲和色谱从无细胞上清液中纯化所产生的构建体。使用液相色谱系统(Aekta纯色谱系统，通用电气医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))，将用pH 7.4的PBS缓冲液平衡的抗κLC树脂(KappaSelect，通用电气医疗生命科学公司)与过滤的条件培养基一起孵育。用pH 7.4的PBS洗涤树脂，然后用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸盐、90mM NaCl，pH 2.7)洗脱构建体。
捕获后，使用1M TRIS pH 10.0溶液pH中和洗脱的蛋白质，并使用尺寸排阻色谱技术(HiPrep Superdex 200 16/60，通用电气医疗生命科学公司)抛光。最终在pH 7.4的PBS缓冲液中配制纯化的蛋白质。
在捕获和pH中和步骤后，使用分析型尺寸排阻色谱技术(Superdex200Increase3.2/300GL，通用电气医疗生命科学公司)测量聚集倾向。
实例5：针对人Fc受体的SPR测量
进行直接结合测定以表征工程化免疫球蛋白(为完全抗体形式)对hFcαR、hFcγR1a、hFcγRIIIa或hFcRn的结合。
在室温下，在
Figure BDA0003909357670001301
T200仪器(通用电气医疗公司(GE Healthcare)，瑞士格拉特布鲁格(Glattbrugg,Switzerland))上测量动力学结合亲和力常数(KD)，其中蛋白质在10mM NaP、150mM NaCl、0.05％ Tween 20、pH 7.6的运行缓冲液中稀释。将通过胺偶联固定有抗κ轻链scFv的CM5传感器芯片(传感器芯片SA，通用电气医疗生命科学公司)(实例5a)或固定有生物素化抗κ轻链scFv的链霉亲和素传感器芯片(传感器芯片SA，通用电气医疗生命科学公司)(实例5b)用于捕获工程化免疫球蛋白，并且视情况将重组人hFcαR、重组人hFcγR1a、重组人hFcγRIIIa或重组人hFcRn用作分析物。
为了作为参考，一个流动池未捕获任何免疫球蛋白。通过随后在参考和测量流动池上注射分析物稀释液系列获得结合数据。纳入零浓度样品(仅操作缓冲液)以允许在数据评价期间进行双重参考。对于数据评价，通过应用1:1结合模型分析来分析双重参考传感图，以产生平衡解离常数(KD)。另外，监测实验期间达到的最大应答。最大应答根据饱和时的应答来描述表面的结合能力。
实例6：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定
根据瑞士人体研究法案(巴塞尔组织供体计划-Prevomed)，从健康供体获得血液样品，从新鲜抽取的外周血中采集。用ACK裂解缓冲液裂解红细胞后，通过ficoll-paque梯度分离多形核细胞(PMN)或外周血单核细胞(PBMC)。将PMN用于表征工程化免疫球蛋白的α效应子功能，而将PBMC用于表征工程化免疫球蛋白的γ效应子功能。
将效应细胞(新鲜分离的PMN或PBMC细胞)添加至表达HER2的靶细胞(SK-BR-3、Calu-3、MDA-MB-453或MDA-MB-175细胞，购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)，马里兰州洛克维尔(Rockville MD))中，效应细胞与靶细胞比率为20:1。SK-BR-3是一种过表达HER2的乳腺癌细胞系。Calu-3和MDA-MB-453分别是肺癌和乳腺癌细胞系，与SK-BR-3相比，以较低的水平过表达HER2(Cheung等人,2019)。MDA-MD-175是表达最低量HER2的乳腺癌细胞系(Crocker等人,2005)。
以指定的浓度添加免疫球蛋白构建体，并轻轻混合该组合，并且然后在260xg下不间断地离心4分钟，以促进靶细胞和效应细胞的共定位。然后将该测定在标准组织培养孵育箱中，于37℃下在5％ CO2中孵育18小时。18小时后，根据制造商说明，使用Cytotox96试剂(普洛麦格公司(Promega))将上清液用于LDH释放测量。在Biotek Synergy HT板读数器上读取490nm处的吸光度。绘制数据，并使用GraphPad Prism 6.0进行分析。
实例7：抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)测定
从健康人血液中新鲜分离单核细胞，并使用人M-CSF分化6天。将Celltrace紫色标记的单核细胞衍生的巨噬细胞(效应细胞)添加至CFSE标记的表达HER2的靶细胞(SK-BR-3过表达细胞)中，效应细胞与靶细胞比率为8:1。以指定的浓度添加免疫球蛋白，并轻轻混合该组合。然后将该测定在标准组织培养孵育箱中，于37℃下在5％ CO2中孵育2小时。通过使用BD science FACS Fortessa流式细胞仪分析双阳性群体来定量吞噬作用。绘制数据，并使用GraphPad Prism 6.0进行分析。
实例8：通过差示扫描量热法(DSC)评估热稳定性
如下所述，使用量热测量比较工程化免疫球蛋白及其亲代IgG1和IgA2的热稳定性。
在差示扫描微量热计(Nano DSC，TA仪器公司(TA Instrument))上进行量热测量。池容积为0.3ml并且加热速率为1℃/分钟。所有蛋白质以在PBS(pH 7.4)中1mg/ml的浓度使用。通过与含有相同缓冲液的重复样品(其中没有蛋白质)进行比较来估计每种蛋白质的摩尔热容。使用标准程序分析部分摩尔热容和溶解曲线。对热谱图进行基线校正和浓度标准化。
图25示出了与亲代IgA2和野生型IgG1两者相比，工程化免疫球蛋白热稳定性的总体改善，从而证明免疫球蛋白工程化产生了热稳定性优于亲代免疫球蛋白的稳定分子。
独立于Fab，使用相同的方法(图26)产生对应的重组Fc并比较它们的热稳定性。可以确定单个CH2和CH3结构域的溶解温度(TM)(表48)，从而显示工程化Fc如何都比亲代IgA2和IgG1两者更稳定。Fc和工程化免疫球蛋白关于其总体热稳定性的排名保持不变，但有趣的是发现Fab融合可以影响Fc热稳定性。
表48：在不含Fab片段的Fc构建体上测量的单个CH2和CH3结构域的溶解温度(TM)。TM与亲代IgA2 Fc相比的变化显示在括号中。
SEQ ID NO CH2 TM(℃) CH3 TM(℃)
SEQ ID NO:125-IgA_Fc 73 77
SEQ ID NO:126-2768_Fc 77(+4) 77
SEQ ID NO:127-2729_Fc 73 77
SEQ ID NO:128-2771_Fc 84(+11) 89(+12)
SEQ ID NO:129-2772_Fc 83(+10) 89(+12)
实例9：工程化免疫球蛋白药代动力学(PK)特性与IgA相比的改善
9.1工程化免疫球蛋白材料生产
在Geneart(生命技术公司)上合成编码抗HER2工程化免疫球蛋白重链变体SEQ IDNO:1、3、157、159、212、252、256、257、258的核酸，并使用基于限制性酶连接的克隆技术将其克隆到哺乳动物表达载体中。通过用Ala取代相关的Asp残基来去除选定的N-糖基化位点。将所得的编码重链的质粒与编码轻链(SEQ ID NO:124)的质粒共转染到哺乳动物表达系统中。对于HEK293T表达细胞系，根据实例4中描述的程序进行表达。对于CHO-S表达细胞系(赛默公司(Thermo))，使用以下程序。简而言之，为了瞬时蛋白质表达，使用ExpifectamineCHO转染剂(赛默公司)将表达载体转染到悬浮液适应的CHO-S细胞中。典型地，用含有400μg编码工程化蛋白质的表达载体的DNA转染以6Mio细胞/ml的密度悬浮的400ml细胞。然后将重组表达载体引入宿主细胞中以在培养基(ExpiCHO表达培养基，补充有ExpiCHO料和增强剂(赛默公司))中进一步分泌七天。然后根据实例4中描述的程序，从无细胞上清液中纯化产生的构建体。产生的物质在表49和50中描述，并且将血清中测量的免疫球蛋白浓度作为时间的函数作图，并呈现于图27和28中。
表49：HEK293T哺乳动物系统中产生的免疫球蛋白的描述
Figure BDA0003909357670001331
表50：CHO哺乳动物系统中产生的免疫球蛋白的描述
Figure BDA0003909357670001332
Figure BDA0003909357670001341
与构建体设计和先前的SPR测量一致，具有序列SEQ ID NO:157-159和SEQ ID NO:252-159的工程化免疫球蛋白结合CD89，同时保持与FcRn的结合(如实例5所述)，并显示出与IgA免疫球蛋白相比改善的PK特性和改善的半衰期，如图27所示。
此外，如图27所示，具有序列SEQ ID NO:252-159的亲和力成熟变体表现出与具有序列SEQ ID NO:157-159的亲代免疫球蛋白相同的PK曲线。这表明对CD89的亲和力成熟确实损害了工程化免疫球蛋白的PK特性。
呈现于图28中的数据描述了N-糖基化模式如何影响免疫球蛋白PK。如图所示，工程化免疫球蛋白的PK特性与IgA相比得到改善，并且在单个N-糖基化位点CH2.84.4被去除时得到改善(SEQ ID NO:257)。
9.2小鼠研究
雄性CD1小鼠从查尔斯河(Charles River)实验室获得。到达后，将所有小鼠保持在无病原体的动物设施中，在21℃室温下进行标准的12小时光照/12小时黑暗循环，可随意获得食物和水。所有小鼠均接受单次静脉(IV)注射如上所述生产和纯化的IgG或IgA或工程化免疫球蛋白(3mg/kg)。将每种化合物注射到三只小鼠体内。在注射后的不同时间，经由隐静脉将血液样品收集到血清分离管中。使血液在环境温度下凝结至少20分钟。将凝结的样品保持在室温下，直至在收集时间的1小时内开始离心。将每个样品在2℃-8℃下以1500-2000x g的相对离心力离心5分钟。离心后20分钟内从血液样品中分离出血清，并转移至标记的2.0mL聚丙烯锥形底微量离心管中。仅将看起来健康且没有明显异常的动物用于研究。所进行的所有动物工作均由诺华股份有限公司(Novartis)机构动物护理和使用委员会审查和批准。
9.3用于药代动力学研究的免疫球蛋白ELISA
通过连续夹心ELISA测量免疫球蛋白水平。对于IgA给药，将Nunc Maxisorp微量滴定板的孔在4℃下用山羊抗人IgA(南方生物技术公司(Southern Biotech)，目录号2053-01)包被过夜。对于IgG和工程化免疫球蛋白给药，将Roche StreptaWell微量滴定板的孔在室温下用生物素化的SB山羊抗人IgG(南方生物技术公司，目录号2049-08)包被1小时。用封闭缓冲液(PBS，0.5％牛血清白蛋白(BSA))孵育1小时后，将在相同封闭缓冲液中稀释的样品添加至封闭的板中，并在室温下孵育2小时。孵育后，添加辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgA(南方生物技术公司，目录号2053-05)或辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(南方生物技术公司，目录号2049-05)，并在室温下孵育1小时。然后将板与底物溶液(BM Blue POD底物TMB，罗氏公司(Roche)，目录号11484281001)一起孵育，并用0.5M硫酸终止反应。吸光度使用板读数器在450nm处测量，并在650nm处减小。在步骤之间，用洗涤缓冲液(PBS中的0.05％ Tween-20)洗涤板3次。
序列信息
表51列出了包含如实例中所述的变体Fc区的全长重链以及用于产生完整抗体的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO)。可以使用常规重组蛋白生产和纯化方法生产如本文所述的工程化IgG1免疫球蛋白、全长重链、轻链或完整抗体。
本说明书中涉及的所有序列(SEQ ID NO)见表51。在本申请的全文中，如果说明书文本(例如，表51)与序列表之间存在差异，则以说明书文本为准。参考号是指内部序列参考号。
表51：序列表
Figure BDA0003909357670001361
Figure BDA0003909357670001371
Figure BDA0003909357670001381
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Figure BDA0003909357670001621

Claims (29)

1.一种包含Fc区的工程化、人IgG1免疫球蛋白或其片段，所述Fc区包含第一和第二Fc结构域，其中所述第一Fc结构域包含至少一个氨基酸修饰，并且其中所述第一Fc结构域具有与野生型IgG1的Fc结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸CH2-1.6至CH3-125(C结构域的IMGT编号))至少65％相同的氨基酸序列，并且其中所述工程化IgG1免疫球蛋白或其片段结合并激活人FcαRI。
2.根据权利要求1所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域中的所述至少一个氨基酸修饰是对应于IgA1的Fc结构域(SEQ ID NO:254)、野生型IgA2的Fc结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸CH2-1.2至CH3-125(C结构域的IMGT编号))、亲代IgA2的Fc结构域(SEQ ID NO:3的氨基酸CH2-1.2至CH3-125(C结构域的IMGT编号))或者IgA1或IgA2的亲和力成熟变体Fc结构域中的氨基酸的取代。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中，由于所述第一Fc结构域中的所述至少一个氨基酸修饰，所述工程化免疫球蛋白或其片段能够与人FcRn结合。
4.根据权利要求3所述的工程化免疫球蛋白或其片段，所述工程化免疫球蛋白或其片段能够以与野生型IgG1相当的亲和力与人FcRn结合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域进一步包含至少一个另外的氨基酸修饰，使得所述工程化免疫球蛋白或其片段能够与人FcγR结合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述工程化免疫球蛋白或其片段是同二聚体，并且其中所述第二Fc结构域具有与来自野生型IgG1(SEQID NO:1)的Fc结构域至少65％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述工程化免疫球蛋白或其片段是异二聚体，并且其中所述第二Fc结构域具有与来自野生型IgG1(SEQID NO:1)的Fc结构域至少70％相同的氨基酸序列，并且其中所述工程化免疫球蛋白或其片段结合并激活人FcγR。
8.根据权利要求7所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第二Fc结构域与FcRn结合。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述FcγR是人FcγRIa和人FcγRIIIa。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域具有SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:148或SEQ ID NO:214内分别包含的氨基酸序列，并且其中所述第二Fc结构域具有SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:148或SEQ ID NO:214内分别包含的氨基酸序列。
11.根据权利要求3或权利要求4所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域具有SEQ ID NO:188至193、234至242、205至209或223内包含的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO:194至199、244至251、210至214或224内包含的氨基酸序列。
12.根据权利要求5所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域具有SEQ ID NO:150、151、152或153内包含的氨基酸序列。
13.根据权利要求7-9中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域具有SEQ ID NO:133、135、137、139、141、143、145、155、156、157、158或252内包含的氨基酸序列，并且其中所述第二Fc结构域具有SEQ ID NO:132、134、136、138、140、142、144、154、159、160、161、162、163或164内包含的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域具有SEQ ID NO:157内包含的氨基酸序列，并且所述第二Fc结构域具有SEQ ID NO:159或161内包含的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述第一Fc结构域具有SEQ ID NO:252内包含的氨基酸序列，并且所述第二Fc结构域具有SEQ ID NO:159或161内包含的氨基酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，所述工程化免疫球蛋白或其片段进一步包含可变重链结构域和轻链，并且其中所述工程化免疫球蛋白或其片段识别并结合靶抗原。
17.根据权利要求16所述的工程化免疫球蛋白或其片段，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：纤连蛋白EDA、HER2、EGFR、CD20、CD30、EpCAM、GD2和实体瘤抗原。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含一种或多种另外的治疗剂。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，或者根据权利要求18或权利要求19所述的药物组合物，其用于治疗细胞增殖性障碍。
21.根据权利要求20所述的用于使用的工程化免疫球蛋白或其片段或药物组合物，其中所述增殖性障碍选自由以下组成的组：纤维化、乳腺癌、成神经细胞瘤、淋巴瘤、结肠癌、上皮癌、结直肠癌、肾癌和粘膜肿瘤。
22.一种治疗细胞增殖性障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段，或者根据权利要求18或权利要求19所述的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述增殖性障碍选自由以下组成的组：纤维化、乳腺癌、成神经细胞瘤、淋巴瘤、结肠癌、上皮癌、结直肠癌、肾癌和粘膜肿瘤。
24.一种分离的核酸分子或核酸分子组，所述分离的核酸分子或核酸分子组编码根据权利要求1至17中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段。
25.根据权利要求24所述的分离的核酸分子或核酸分子组，所述分离的核酸分子或核酸分子组是互补DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA)。
26.一种克隆或表达载体，所述克隆或表达载体包含一种或多种根据权利要求24或权利要求25所述的核酸分子或核酸分子组，其中所述载体适用于重组产生所述工程化免疫球蛋白或其片段。
27.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种根据权利要求26所述的克隆或表达载体。
28.一种用于产生根据权利要求1至17中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段的方法，所述方法包括在足以表达所述工程化免疫球蛋白或其片段的条件下培养根据权利要求27所述的宿主细胞，并且之后从所述宿主细胞培养物中纯化并回收所述工程化免疫球蛋白或其片段。
29.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至17中任一项所述的工程化免疫球蛋白或其片段或者根据权利要求18或19所述的药物组合物，其中所述试剂盒另外包含使用说明书和用于向有需要的受试者施用所述工程化免疫球蛋白或其片段或所述药物组合物的工具。
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