KR102129234B1 - 신경돌기 변성과 연관된 질환의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

신경돌기 변성과 연관된 질환의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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릴리 후앙
필립 디. 바드웰
율리야 쿠츠코바
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아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게
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Abstract

본원에는 신경돌기 변성 질환 및 장애를 치료 및 진단하기 위한 항체 및 이 항체를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

신경돌기 변성과 연관된 질환의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF DISEASE ASSOCIATED WITH NEURITE DEGENERATION}
관련 출원 정보
본 출원은, 2012년 1월 27일에 출원된 미국 출원 번호 제61/591,324호의 이익을 주장하며, 이의 내용은 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
서열목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열목록을 포함하며, 서열목록은 전부 본원에 인용에 의해 포함된다. 2013년 1월 25일에 작성된 상기 ASCII 카피는 11423USO.txt로 명명하고, 100,936바이트 크기이다.
본 발명의 기술분야
본 발명은, 다발성 경화증과 같은 신경돌기 변성(neurite degeneration)과 연관된 질환의 치료 및 진단을 위한 항체 및 이 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
많은 신경변성 질환의 초기 단계는 신경돌기 손상 및 약화된 시냅스 기능을 특징으로 한다. 신경돌기 변성은 종종 뉴런 세포 사멸을 유도하고, 영향을 받은 신경에서 시그널 전달을 손상시킴으로써, 어떤 신경이 관여되는지에 따라, 감각, 운동, 인지, 또는 기타 기능들에 손상을 야기할 수 있다. 신경돌기 변성은, 또한, 다발성 경화증("MS")의 병리학적 특징이다. MS는, 미국에서 약 350,000명의 사람들이 걸린 자가면역의 신경변성 질환이며, 젊은 성인의 신경계 장애 또는 죽음의 주요 원인이다. MS에 걸린 사람에서 공통적인 임상학적 병태는 뉴런의 축색돌기 주위의 수초의 광범위한 분해, 및 축색돌기 자체의 최종적 분해로부터 얻어지는 신경 병변의 변성 형성이다. MS에서 발생하는 탈수초화는, 3개의 주요 신경 단백질: 수초 염기성 단백질(MBP), 단백지질 단백질(PLP) 및 수초 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)에 대한 프로테아제 효소의 공격에 의해 개시되는 것으로 생각된다. 기작적으로, MS는, 적어도 부분적으로 수초 분해 생성물에 대한 자가면역 반응에 의해 야기되는, 염증성 탈수초화 질환이다. 최근 연구는, 익히 공지되어 있는 탈수초화 및 염증성 기작에 추가하여, 신경돌기의 역할 및 축색돌기 손상을 강조하고 있다.
환자들은, 전형적으로 환자의 병력, 및 뇌 및 척수의 자기 공명 영상(MRI), 전기진단 절차(예: 시각적 유발 전위, 뇌간 청각 유발 전위, 또는 체성감각 유발 전위와 같은 유발된 전위 시험)와 뇌척수액에서의 면역글로불린 합성의 증거를 찾기 위한 요추 천공을 포함하는, 신경학적 조사의 조합에 기초하여 신경돌기 변성 질환을 갖는 것으로 진단된다.
현재, 신경돌기 변성과 연관된 질환에 대한 치료법이 없으므로, 치료는, 전형적으로 증상을 제어하고 재발의 빈도 및 중증도를 관리하는 것을 포함한다.
발명의 요약
한 양상에서, 본 발명은, 반발 유도 분자 a(Repulsive Guidance molecule a: "RGMa")에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 상기 항체는 하기로부터 선택되는 도메인 또는 영역을 포함한다: (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (c) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (d) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (e) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (f) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (g) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (h) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (j) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역; (k) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역; (l) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역; (m) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역; (n) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (o) 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (p) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (q) 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (r) 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (s) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (t) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (u) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역, (v) 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도메인 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (pp) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (qq) 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (rr) 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (ss) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역 및 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (tt) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (uu) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역 및 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (vv) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (ww) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인 영역 및 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인 영역, (xx) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (yy) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (zz) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (aaa) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 16 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (bbb) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (ccc) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (ddd) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (eee) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (fff) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (ggg) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (hhh) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄; (iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄; (jjj) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (kkk) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (lll) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (mmm) 서열번호 92 또는 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 93 또는 154의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 94 또는 155의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (nnn) 서열번호 96 또는 156의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 97 또는 157의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 98 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (ooo) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (ppp) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (qqq) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (rrr) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (sss) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (ttt) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (uuu) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (vvv) 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (www) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄, (xxx) 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (yyy) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (zzz) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (aaaa) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (bbbb) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (cccc) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (dddd) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (eeee) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (ffff) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (gggg) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (hhhh) 서열번호 92 또는 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 93 또는 154의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 94 또는 155의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 96 또는 156의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 97 또는 157의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 98 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (iiii) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (jjjj) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (kkkk) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (llll) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (mmmm) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (nnnn) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (oooo) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (pppp) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (qqqq) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (rrrr) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (ssss) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (tttt) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (uuuu) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (vvvv) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (wwww) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (xxxx) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄; (yyyy) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄, (zzzz) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 사람 항체, 면역글로불린 분자, 디설파이드 연결된 Fv, 모노클로날 항체, 친화성 성숙된 항체, scFv, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, CDR-절편이식된 항체, 디아바디, 사람화된 항체, 다특이적 항체, Fab, 이중 특이적 항체, DVD, Fab', 이특이적 항체, F(ab')2, 또는 Fv일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 사람의 것일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은, 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 또는 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함할 수 있다. 사람 IgG1 불변 도메인은 서열번호 140을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
항체 또는 이의 단편은, 서열번호 1, 서열번호 9, 서열번호 17, 서열번호 25, 서열번호 33, 서열번호 41, 서열번호 49, 서열번호 57, 서열번호 91, 서열번호 99, 서열번호 107, 서열번호 115, 서열번호 123, 및 서열번호 131로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 5, 서열번호 13, 서열번호 21, 서열번호 29, 서열번호 37, 서열번호 45, 서열번호 53, 서열번호 61, 서열번호 95, 서열번호 103, 서열번호 111, 서열번호 119, 서열번호 127, 및 서열번호 135로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8; 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 67; 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 68; 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 69; 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 70; 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 71; 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 72; 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 73; 또는 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16; 또는 서열번호 22, 서열번호 23, 및 서열번호 24; 또는 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 32; 또는 서열번호 38, 서열번호 39, 및 서열번호 40; 또는 서열번호 54, 서열번호 55, 및 서열번호 56; 또는 서열번호 62, 서열번호 63, 및 서열번호 64; 또는 서열번호 46, 서열번호 47, 및 서열번호 48; 서열번호 96, 서열번호 97, 및 서열번호 98; 서열번호 104, 서열번호 105, 및 서열번호 106; 서열번호 112, 서열번호 113, 및 서열번호 114; 서열번호 120, 서열번호 121, 및 서열번호 122; 서열번호 128, 서열번호 129, 및 서열번호 130; 서열번호 136, 서열번호 137, 및 서열번호 138; 및 서열번호 156, 및 서열번호 157, 및 서열번호 158의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4; 또는 서열번호 10, 서열번호 11, 및 서열번호 12; 또는 서열번호 18, 서열번호 19, 및 서열번호 20; 또는 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28; 또는 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36; 또는 서열번호 50, 서열번호 51, 및 서열번호 52; 또는 서열번호 58, 서열번호 59, 및 서열번호 60; 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 44; 서열번호 92, 서열번호 93, 및 서열번호 94; 서열번호 100, 서열번호 101, 및 서열번호 102; 서열번호 108, 서열번호 109, 및 서열번호 110; 서열번호 116, 서열번호 117, 및 서열번호 118; 서열번호 124, 서열번호 125, 및 서열번호 126; 서열번호 132, 서열번호 133, 및 서열번호 134; 및 서열번호 153, 및 서열번호 154, 및 서열번호 155의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 10, 서열번호 11, 및 서열번호 12의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 18, 서열번호 19, 및 서열번호 20의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 22, 서열번호 23, 및 서열번호 24의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 30, 서열번호 31, 및 서열번호 32의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 38, 서열번호 39, 및 서열번호 40의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 50, 서열번호 51, 및 서열번호 52의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 54, 서열번호 55, 및 서열번호 56의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 58, 서열번호 59, 및 서열번호 60의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 62, 서열번호 63, 및 서열번호 64의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 44의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 46, 서열번호 47, 및 서열번호 48의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 92 또는 153, 서열번호 93 또는 154, 및 서열번호 94 또는 155의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 96 또는 156, 서열번호 97 또는 157, 및 서열번호 98 또는 158의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 100, 서열번호 101, 및 서열번호 102의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 104, 서열번호 105, 및 서열번호 106의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 108, 서열번호 109, 및 서열번호 110의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 112, 서열번호 113, 및 서열번호 114의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 116, 서열번호 117, 및 서열번호 118의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 120, 서열번호 121, 및 서열번호 122의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 124, 서열번호 125, 및 서열번호 126의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 128, 서열번호 129, 및 서열번호 130의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 서열번호 132, 서열번호 133, 및 서열번호 134의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열번호 136, 서열번호 137, 및 서열번호 138의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기들을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 항체 또는 항체 단편은, 면역부착 분자, 영상화제, 및 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 포함할 수 있다. 영상화제는 방사성 표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자성 표지, 또는 비오틴일 수 있다. 방사성 표지는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm 일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, RGMa 에피토프 PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (서열번호 79)에 결합하는, 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. RGMa 에피토프 PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (서열번호 79)에 결합하는 항체는, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 상보성-결정 영역(CDR) 잔기를 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, 반발 유도 분자 a("RGMa")에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 항체 또는 항체 단편은, 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-H1, H2 및 H3)을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 (서열식 1 - CDR-H1)[상기 식에서, Xaa1은 S, D, E, N, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 H, Y, L, S, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 G, D, A, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 I, M, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, N, H, A, T, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다];
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-H2)[상기 식에서, n은 0 또는 1이고, Xaa1은 Y, V, A, G, L, E, S, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 I, M, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, N, D, F, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 P, Y, G, W, H, A, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 Y, N, D, E, S, K, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, D, T, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 G, S, I, E, N, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 N, L, R, S, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 T, K, G, N, I, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 N, G, Y, T, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Y, F, N, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 A, T, V, P, L, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Q, D, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 K, S, N, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 L, F, V, K, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Q, K, R, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 글리신이다]; 및
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-H3)[상기 식에서, n은 0 내지 11이고, Xaa1은 V, S, E, N, L, D, Q, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, T, R, Y, L, I, D, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 G, L, Y, N, E, K, A, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 P, S, Y, A, V, G, T, E, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 Y, V, S, L, D, G, H, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu, 및 Cys로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Tyr, Lys, Asp, Ala, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Tyr, Gly, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ala, Leu, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 Met, Leu, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Asp 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 Val, Asp, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다].
다른 양상에서, 본 발명은, 반발 유도 분자 a("RGMa")에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 항체 또는 항체 단편은 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-L1, L2 및 L3)을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - (Xaa)n (서열식 1 - CDR-L1)[상기 식에서, n은 0 내지 3이고, Xaa1은 T, S, R, G, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, D, S, N 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 S, K, G, Q, N, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, L, G, I, D, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, N, H, 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 V, D, I, S, G 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 G, K, A, S, I, N, T, 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 D, Y, A, C, S, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 S, A, G, L, V, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 I, C, Y, H, R, N, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr, Gly, Ala, 및 Val로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Val, 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다];
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-L2)[상기 식에서, n은 0 내지 4이고, Xaa1은 D, Q, G, V, Y, S 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 V, D, N, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, S, Y, N, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 K, N, D, Q 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 R, G, S, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 P, S, I, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 S, H, I, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Asn이고; Xaa9는 Lys이고; Xaa10은 Gly이고; Xaa11은 Asp이다]; 및
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-L3)[상기 식에서, n은 0 내지 2이고, Xaa1은 C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 S, A, T, Q, 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 Y, W, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 A, D, G, S, H 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 G, S, N, P, D, V, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 I, T, S, G, L, F 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 D, T, L, I, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 T, G, R, Y, D, N, W, L, F 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 L, V, G, T, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Val, Tyr, 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Leu 또는 Val이다].
다른 양상에서, 본 발명은, 반발 유도 분자 a("RGMa")에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 항체 단편은, 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-H1, H2, 및 H3)을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 또한, 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-L1, L2, 및 L3)을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 반발 유도 분자 a("RGMa")에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 (서열식 1 - CDR-H1)[상기 식에서, Xaa1은 S, D, E, N, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 H, Y, L, S, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 G, D, A, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 I, M, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, N, H, A, T, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다];
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-H2)[상기 식에서, n은 0 또는 1이고, Xaa1은 Y, V, A, G, L, G, S, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 I, M, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, N, D, F, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 P, Y, G, W, H, A, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 Y, N, D, E, S, K, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, D, T, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 G, S, I, E, N, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 N, L, R, S, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 T, K, G, N, I, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 N, G, Y, T, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Y, F, N, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 A, T, V, P, L, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Q, D, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 K, S, N, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 L, F, V, K, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Q, K, R, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 글리신이다]; 및
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-H3)[상기 식에서, n은 0 내지 11이고, Xaa1은 V, S, E, N, L, D, Q, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, T, R, Y, L, I, D, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 G, L, Y, N, E, K, A, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 P, S, Y, A, V, G, T, E, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 Y, V, S, L, D, G, H, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu, 및 Cys로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Tyr, Lys, Asp, Ala, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Tyr, Gly, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ala, Leu, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 Met, Leu, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Asp 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 Val, Asp, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다]; 및
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - (Xaa)n (서열식 1 - CDR-L1)[상기 식에서, n은 0 내지 3이고, Xaa1은 T, S, R, G, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, D, S, N 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 S, K, G, Q, N, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, L, G, I, D, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, N, H, 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 V, D, I, S, G 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 G, K, A, S, I, N, T, 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 D, Y, A, C, S, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 S, A, G, L, V, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 I, C, Y, H, R, N, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr, Gly, Ala, 및 Val로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Val 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다];
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-L2)[상기 식에서, n은 0 내지 4이고, Xaa1은 D, Q, G, V, Y, S 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 V, D, N, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, S, Y, N, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 K, N, D, Q 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 R, G, S, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 P, S, I, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 S, H, I, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Asn이고; Xaa9는 Lys이고; Xaa10은 Gly이고; Xaa11은 Asp이다]; 및
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-L3)[상기 식에서, n은 0 내지 2이고, Xaa1은 C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 S, A, T, Q, 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 Y, W, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 A, D, G, S, H 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 G, S, N, P, D, V, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 I, T, S, G, L, F 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 D, T, L, I, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 T, G, R, Y, D, N, W, L, F 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 L, V, G, T, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Val, Tyr, 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Leu 또는 Val이다].
다른 양상에서, 본 발명은, 본원에서 기술되는 항체, 항체 단편, 또는 이의 혼합물 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 신경돌기 변성과 연관된 질환 또는 장애의 치료, 예방, 조절 또는 약화가 필요한 피험자에게 본원에서 기술되는 항체의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신경돌기 변성과 연관된 질환 또는 장애를 치료, 예방, 조절 또는 약화시키는 방법에 관한 것이다. 신경돌기 변성 장애는, 다발성 경화증, 파킨슨병; 알츠하이머병; 헌팅톤병; 근위축 측삭 경화증 및 기타 운동뉴런 질환; 테이-삭스병 (Tay-Sachs disease); 니이만-픽병 (Niemann-Pick disease); 고오셔병 (Gaucher's disease); 헐러 증후군 (Hurler's syndrome); 특발적 염증성 탈수초병; 비타민 B12 결핍증; 뇌교 중심부 수초용해증; 척수매독; 횡단 척수염; 데빅병 (Devic's disease), 진행성 다초점 백질뇌증; 시신경염; CNS에 대한 외상성 손상; 허혈성 뇌졸중; 망막병증; 예를 들어, 녹내장, 당뇨 망막병증 또는 연령-의존적 황반 변성; 및 백질 이영양증일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, 피험자가 신경돌기 변성 장애를 갖는지를 측정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 피험자로부터의 샘플에서 RGMa 수준을 측정하고; 샘플 중의 RGMa의 수준을 정상 대조군과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 변화된 RGMa 수준은 피험자가 신경돌기 변성 장애를 갖는다는 것을 나타낸다. 정상 대조군과 비교하여 증가된 수준의 RGMa는 피험자가 신경돌기 변성 장애를 갖는다는 것을 나타낸다. 샘플은 혈액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 뇌척수액 샘플일 수 있다. 샘플 중의 RGMa의 수준을 측정하는 단계는 면역검정으로 수행될 수 있다. 면역검정은 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)일 수 있다. ELISA는 샌드위치 ELISA일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 67을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 68을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 69를포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 70을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 71을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 72를 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, 서열번호 1 내지 7 및 73을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은, RGMa 에피토프 PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69) (서열번호 79)에 결합하는 서열번호 1 내지 7 및 67, 68, 69, 70, 71, 72, 또는 73을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
도 1은, 50μg/ml의 hRGMa 단편을 사용한 신경돌기 생장 검정으로부터의 시험 결과를 도시한다. 상기 단편은, 서열번호 65(서열번호 139 참조)의 N-말단 아미노산 47-127을 포함하며, 고친화성 네오게닌- 및 골 형태형성 단백질-상호작용 도메인 둘 다를 포함한다.
도 2는, 50μg/ml의 전장 hRGMa를 사용한 신경돌기 생장 검정으로부터의 시험 결과를 도시한다.
도 3은, 항체 AE12-1의 존재 하에 병변 주위에서의(0 내지 500μm) 망막 신경절 세포 축색돌기의 생체내 재생적 성장의 수준을 반영하는 막대 그래프를 도시한다.
도 4는, 사람 5F9.23과의 직접적 비교에 있어서, 항체 AE12-1의 존재 하에 망막 신경절 세포 축색돌기 (500 내지 1000μm)의 생체내 재생적 성장 수준을 반영하는 막대 그래프를 도시한다.
도 5는, AE12-1 mAb와 관련하여, 트립신/Asp-N 절단된 이. 콜라이 hRGMa의 환원된 E1 분획물로부터의 MS 스펙트럼으로서, 2개의 펩타이드의 (박스 표시된) +3 및 +4 전하 상태가 스펙트럼 상에 보이는 서열 (보이는 순서로 각각 서열번호 74 및 80)에 상응한다는 것을 도시한다. *로 표지된 피크는, hRGMa 항원으로 지정될 수 없는 펩타이드이며 항체와 관련될 수 있다.
도 6은, AE12-1 mAb와 관련하여, 트립신 및 Asp-N으로 절단된 hRGMa (MYC 작제물)의 변성된 환원 E1 분획물로부터의 MS(상단) 및 MS/MS (하단) 스펙트럼을 도시하고, 절단된 펩타이드의 서열을 KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (서열번호 81)로 확정한다.
도 7은, AE12-1 mAb와 관련하여, 트립신 및 Asp-N으로 절단된 hRGMa(MYC 작제물)의 변성된 환원 E1 분획물로부터의 MS(상단) 및 MS/MS(하단) 스펙트럼을 도시하고, 절단된 펩타이드의 서열을 AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (서열번호 89)로 확정한다.
도 8은, 대조군 항체(hIgG, 10mg/kg; 상단 패널 참조), 1mg/kg의 AE12-1 항체(중간 패널 참조), 또는 1mg/kg의 h5F9.23 항체(하단 패널 참조)로 치료된 래트에서의 신경 병변의 현미경 사진을 도시한다.
도 9는, 전장 사람 RGMa로의 치료 및 AE12-1(좌측 막대 그래프) 및 AE12-1-H(우측 막대 그래프)에 의한 이의 중화 후 기질로서 피브로넥틴으로 코팅된 96 웰 플레이트 상에서 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 생장을 분석한 결과를 도시한다. 항체 및 전장 hRGMa를 동시에 가하고, 후속적으로, 배양물을 24시간 동안 인큐베이션하였다.
도 10은, 전장 사람 RGMa로의 치료 및 AE12-1-K(좌측 막대 그래프) 및 AE12-1-F(우측 막대 그래프)에 의한 이의 중화 후 기질로서 피브로넥틴으로 코팅된 96 웰 플레이트 상에서의 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 생장의 분석 결과를 도시한다. 항체 및 전장 hRGMa를 동시에 가하고, 후속적으로, 배양물을 24시간 동안 인큐베이션하였다.
도 11은, 전장 사람 RGMa로의 치료 및 AE12-1-I(좌측 막대 그래프) 및 AE12-1-L(우측 막대 그래프)에 의한 이의 중화 후 기질로서 피브로넥틴으로 코팅된 96 웰 플레이트 상에서 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 생장을 분석한 결과를 도시한다. 항체 및 전장 hRGMa를 동시에 가하고, 후속적으로, 배양물을 24시간 동안 인큐베이션하였다.
도 12는, 전장 사람 RGMa로의 치료 및 AE12-1-V(좌측 막대 그래프) 및 AE12-1-Y(우측 막대 그래프)에 의한 이의 중화 후 기질로서 피브로넥틴으로 코팅된 96 웰 플레이트 상에서 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 생장을 분석한 결과를 도시한다. 항체 및 전장 hRGMa를 동시에 가하고, 후속적으로, 배양물을 24시간 동안 인큐베이션하였다.
도 13은, AE12-6, AE12-15 및 AE12-23을 사용하여 (고함량 분석(HCA)으로) SH-SY5Y 세포 및 일차 뉴런에 대한 RGMa 결합 검정의 결과를 도시한다.
도 14는, AE12-1 및 AE12-1 시스테인 변이체를 사용하여 (HCA로) SH-SY5Y 세포에 대한 RGMa 결합 억제 검정의 결과를 도시한다.
도 15는, 래트 해마 일차 뉴런에 대한 신경돌기 생장 검정으로 RGMa 신경돌기 생장 반발에 대한 AE12-1 및 AE12-6의 중화 효과를 도시한다. r5F9 항체는 대조군으로서 사용된다.
도 16은, 3개의 RGMa 선택적 모노클로날 항체, 구체적으로, AE12-1, AE12-1Y 및 h5F9.23이 실시예 9에서 기술되는 바와 같이 압궤 부위 너머로 GAP-43 포지티브 섬유의 강력한 재생을 유도한다는 것을 도시한다. Y축 = 압궤 부위 너머 0 내지 500μm 부위에서의 축색돌기 다발의 수. *** p < 0.001: hIgG에 대한 유의성, ** p < 0.01: hIgG에 대한 유의성, * p < 0.05: 사람 IgG에 대한 유의성.
도 17은, 3개의 RGMa 선택적 모노클로날 항체, 구체적으로, AE12-1, AE12-1Y 및 h5F9.23이 망막 축색돌기 다발의 수를 증가시켜 망막 신경 섬유층을 보호한다는 것을 도시한다. Y축 = 실시예 10에서 기술되는 바와 같이 망막에서의 섬유 다발의 수. ** p < 0.01: hIgG에 대한 유의성, * p < 0.05: hIgG에 대한 유의성.
도 18은, RGMa mAb인 AE12-1, AE12-1Y 및 h5F9.23이 실시예 11에서 기술되는 바와 같이 척수 tEAE 모델에서 기능 회복을 촉진한다는 것을 도시한다. 항체 치료 (iv)는 사이토킨을 주사 후 약 1주째에 시작하여 주당 1회 반복하였다. 제공된 용량은 10mg/kg이었다. *** p < 0.001: hIgG에 대한 유의성, ** p < 0.01: hIgG에 대한 유의성, * p < 0.05: hIgG에 대한 유의성.
도 19는, RGMa mAb인 AE12-1, AE12-1Y 및 ABT-207 (h5F9.23)이 실시예 11에서 기술되는 바와 같이 사람 IgG 대조군 항체와 직접적으로 비교하여 GAP-43 및 MBP 면적을 증가시키고 염증 병변을 감소시킨다는 것을 도시한다. *** p < 0.001: hIgG에 대한 유의성, ** p < 0.01: hIgG에 대한 유의성, * p < 0.05: hIgG에 대한 유의성.
도 20은, RGMa mAb인 AE12-1Y-QL이 실시예 11에서 기술되는 바와 같이 정맥내로 주당 1회 제공되는 3개의 상이한 용량 0.1; 1 및 10mg/kg으로 척수 tEAE 모델의 기능 회복을 촉진하였음을 도시한다. 항체 치료 (iv)는 사이토카인의 주사 후 약 1주째에 시작하여 주당 1회 반복하였다. *** p < 0.001: hIgG에 대한 유의성, ** p < 0.01: hIgG에 대한 유의성, * p < 0.05: hIgG에 대한 유의성.
본 발명자들은 반발 유도 분자 a("RGMa")에 결합하고 신경돌기 변성과 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 새로운 항체를 밝혀내었다. 신경돌기 변성과 관련된 질환과 연관된 임상 증상을 약화시킬 수 있는 특이적 및 비-특이적 항체가 본원에 제공된다.
1. 정의
본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것으로서, 제한하려는 것이 아니다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수의 것을 포함한다.
a. 약
본원에서 사용되는 "약"은 기술된 값으로부터 약 +/- 10%의 변화를 지칭할 수 있다. 이러한 변화는 이에 대해 특정 언급이 있든 없든 본원에서 제공되는 임의의 값에 항상 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
b. 친화성 성숙된 항체
본원에서 "친화성 성숙된 항체"는, 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변형을 가짐으로써 변형(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 표적 항원에 대한 항체의 친화성(즉, KD, kd 또는 ka)이 개선된 항체를 지칭하기 위해 사용된다. 예시적인 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 가질 것이다. 바이오-디스플레이를 사용하여 제조된 조합적 항체 라이브러리의 스크리닝을 포함하여, 친화성 성숙된 항체를 생성하기 위한 다양한 절차가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙을 기술한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]에 기술되어 있다. 선별적 돌연변이유발 위치에서의 선별적 돌연변이유발 및 활성-증진 아미노산 잔기와의 접촉 또는 과변이 위치에서의 선별적 돌연변이유발이 미국 특허 번호 6,914,128 B1에 기술되어 있다.
c. 항체 및 항체들
본원에서 사용되는 "항체" 및 "항체들"은 모노클로날 항체, 다특이적 항체, 사람 항체, 사람화된 항체(완전히 또는 부분적으로 사람화된 항체), 동물 항체, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 새(예: 오리 또는 거위), 상어, 고래, 및 비-영장류(예: 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 고양이, 개, 래트, 마우스 등) 또는 비-사람 영장류(예: 원숭이, 침팬지 등)를 포함한 포유동물 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 단일쇄 Fv("scFv"), 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드-연결된 Fv("sdFv"), 및 항-유전형("항-Id") 항체, 이중-도메인 항체, 이중 가변 도메인(DVD) 또는 삼중 가변 도메인(TVD) 항체 {이중-가변 도메인 면역글로불린 및 이의 제조 방법은 문헌 [Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007) 및 PCT International Application WO 2001/058956, 이들 각각의 내용이 본원에 인용에 의해 포함된]에 기술되어 있다}, 및 이들 중 임의의 것의 작용적 활성 에피토프-결합 단편을 지칭한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 분석물-결합 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다. 간단히, 분석물에 대한 항체는 종종 본원에서 "항-분석물 항체" 또는 단순히 "분석물 항체"(예: 항-RGMa 항체 또는 RGMa 항체)로 지칭된다.
d. 항체 단편
본원에서 사용되는 "항체 단편"은 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 부분을 지칭한다. 상기 부분은 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체의 이소타입에 따라 CH2, CH3 또는 CH4)을 포함하지 않는다. 항체 단편의 예는, 이로 제한됨이 없이, Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 단일쇄 Fv(scFv) 분자, 단지 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩타이드, 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 포함하는 단일쇄 폴리펩타이드, 단지 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단일쇄 폴리펩타이드, 및 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는 단일쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
e. 결합 상수
"결합 상수"가 본원에서 기술된다. 본원에서 사용되는 용어 "결합 상수", "kon" 또는 "ka" 는 표적 항원에 대한 항체의 결합 속도 또는 하기 식으로 나타내어지는 바와 같은 항체와 항원 사이의 컴플렉스 형성 속도를 나타내는 값을 지칭한다:
항체 (Ab) + 항원 (Ag) → Ab-Ag.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "해리 속도 상수" "koff" 또는 "kd"는 표적 항원으로부터 항체의 해리 속도 또는 하기 식으로 나타내어지는 바와 같은 Ab-Ag 컴플렉스의 시간에 따른 유리 항체 및 항원으로의 분리를 나타내는 값을 지칭한다:
항체 (Ab) + 항원 (Ag) ← Ab-Ag.
결합 및 해리 속도 상수를 측정하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 형광-기반 기술의 이용은 평형 상태에서 생리학적 완충액 중의 샘플을 조사하기 위한 높은 감도 및 능력을 제공한다. 다른 실험적 접근법 및 기구, 예를 들어, BIAcore®(생체분자 상호작용 분석) 검정 및 비아코아 인터내셔날 AB(BIAcore International AB)(GE 의료 회사, Uppsala, Sweden)으로부터 입수가능한 기구가 이용될 수 있다. 또한, 사피딘 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments)(Boise, Idaho)로부터 입수가능한 KinExA®(역학적 배제 검정)도 이용될 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "평형 해리 상수" 또는 "KD"는 해리 속도 상수(koff)를 결합 속도 상수(kon)로 나누어 얻은 값을 지칭한다. 결합 속도 상수, 해리 속도 상수 및 평형 해리 상수는 항체의 항원에 대한 결합 친화성을 나타내는데 이용된다.
f. 결합 단백질
본원에서 "결합 단백질"은 결합 파트너, 예를 들어, 폴리펩타이드, 항원, 화학적 화합물 또는 다른 분자, 또는 임의의 종류의 물질에 결합하고 이와 컴플렉스를 형성하는 단량체 또는 다량체 단백질을 지칭하기 위해 사용된다. 결합 단백질은 결합 파트너에 특이적으로 결합된다. 결합 단백질은 항체 및 이의 항원-결합 단편, 당업계에 알려져 있고 하기에서 기술되는 이의 다른 다양한 형태 및 유도체, 및 항원 분자에 결합하거나 항원 분자 상의 특정 부위(에피토프)에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 다른 분자를 포함한다. 따라서, 결합 단백질은 항체, 사량체 면역글로불린, IgG 분자, IgG1 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-절편이식된 항체, 사람화된 항체, 친화성 성숙된 항체, 및 항원에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 이러한 항체의 단편을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
g. 이특이적 항체
본원에서 "이특이적 항체"는, 쿼드로마(quadroma) 기술 [참조: Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)], 2개의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 컨주게이션 [참조: Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)], Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 또는 유사한 접근법 [참조: Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)](단지 하나의 종만이 기능적인 이특이적 항체인 다수의 상이한 면역글로불린 종들을 생성)에 의해 생성되는 항체이다. 이특이적 항체는 2개의 결합 암 중 하나의 암(한 쌍의 HC/LC)에서 하나의 항원(또는 에피토프)에 결합되고, 제2의 암(상이한 쌍의 HC/LC)에서 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합된다. 이러한 정의에 의해, 이특이적 항체는 (특이성 및 CDR 서열 모두에 있어서) 2개의 구분되는 항원-결합 암을 가지며, 결합하는 각각의 항원에 대해 일가이다.
h. CDR
본원에서 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 "상보성 결정 영역"을 지칭하기 위해 사용된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 3개의 CDR이 있으며, 각각의 가변 영역에 대해 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"로 표시된다. 본원에서 사용되는 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합하는 단일 가변 영역에서 나타나는 3개의 CDR 그룹을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 문헌 [참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)]에서 기술되는 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 "카벳 CDR"로 지칭될 수 있다. 초티아 및 공동연구자들은 카벳 CDR 내의 특정 서브-부분들이 아미노산 서열 수준에서 커다란 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 구조를 취한다는 것을 밝혀내었다 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); 및 Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989)]. 이들 서브-부분들은 "L1", "L2", 및 "L3", 또는 "H1", "H2", 및 "H3"로 표시되며, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 나타낸다. 이들 영역은 "초티아 CDR"이라 지칭될 수 있으며, 카벳 CDR과 겹치는 경계를 갖는다. 카벳 CDR과 겹치는 CDR을 정의하는 다른 경계가 문헌 [Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995), and MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996)]에 기술되어 있다. 다른 CDR 경계 정의들이 여기에서의 시스템 중 하나를 엄격히 따를 수는 없다. 그러나, 다른 CDR 경계 정의들은, 비록 특정 잔기 또는 잔기의 그룹들 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 끼치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 짧아지거나 길어질 수 있기는 해도, 카벳 CDR과 겹칠 것이다. 본원에서 이용되는 방법은, 비록 특정 실시형태가 카뱃- 또는 초티아-정의된 CDR을 이용하긴 하지만, 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의되는 CDR을 이용할 수 있다.
i. 성분 또는 성분들
"성분", "성분들" 또는 "하나 이상의 성분"은 일반적으로 캡쳐 항체, 검출 또는 컨주게이트 캘리브레이터, 대조군, 민감성 패널, 용기, 완충액, 희석제, 염, 효소, 효소의 보조인자. 검출 시약, 전처리 시약/용액, 기질(예: 용액 기질), 정지 용액, 및 본원에서 기술되는 방법 및 당업계에 공지된 다른 방법에 따라 시험 샘플, 예를 들어, 환자 소변, 혈청 또는 혈장 샘플 검정용 키트에 포함될 수 있는 것들을 지칭한다. 일부 성분들은 용액 상태이거나 검정에 사용하기 위해 재구성되는 동결건조물 형태일 수 있다.
j. 컨센서스 또는 컨센서스 서열
본원에서 사용되는 "컨센서스" 또는 "컨센서스 서열"은 특정 항원에 대한 다수의 서브타입의 정렬에 기초하여 구성되는 합성 핵산 서열 또는 상응하는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 상기 서열은 특정 항원에 대한 다수의 서브타입 또는 혈청타입에 대해 광범위한 면역을 유도하는데 사용될 수 있다. 합성 항원, 예를 들어, 융합 단백질이 컨센서스 서열(또는 컨센서스 항원)로 조작될 수 있다.
k. 대조군
본원에서 사용되는 "대조군"은, RGMa(예를 들어, 막-결합된 RGMa, 가용성 RGMa, 막-결합된 RGMa의 단편, 가용성 RGMa의 단편, RGMa(막-결합되거나 가용성인 RGMa)의 변이체 또는 이들의 임의의 배합)와 같은 관심 분석물을 함유하지 않거나("네가티브 대조군"), RGMa(예를 들어, 막-결합된 RGMa, 가용성 RGMa, 막-결합된 RGMa의 단편, 가용성 RGMa의 단편, RGMa(막-결합되거나 가용성인 RGMa)의 변이체 또는 이들의 임의의 배합)와 같은 관심 분석물을 함유하는 ("포지티브 대조군") 조성물을 지칭한다. 포지티브 대조군은 공지된 농도의 RGMa를 포함할 수 있다. 본원에서 "대조군", "포지티브 대조군" 및 "캘리브레이터"는 공지된 농도의 RGMa를 포함하는 조성물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. "포지티브 대조군"은 검정 수행 특성을 확립하는데 사용될 수 있고, 시약(예: 분석물)의 신뢰도에 대한 유용한 지시자이다. "정상 대조군"은 철-관련된 질환 또는 장애가 없는 샘플 또는 피험자를 지칭할 수 있다.
l. 유도체
본원에서 사용되는 항체의 "유도체"는 순수(genuine) 또는 모(parent) 항체와 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 지칭할 수 있으며, 변형된 도메인 구조를 나타낼 수 있다. 그런데도 유도체는, 표적물(항원)에 특이적으로 결합할 수 있는, 천연 항체에서 발견되는 일반적인 도메인 배열 및 아미노산 서열을 채택할 수 있다. 전형적인 항체 유도체의 예는 다른 폴리펩타이드에 커플링된 항체, 재배열된 항체 도메인 또는 항체의 단편이다. 유도체는 또한 하나 이상의 추가의 화합물, 예를 들어, 단백질 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 단백질 도메인은 공유 또는 비-공유 결합으로 연결된다. 연결은 당업계에 공지된 방법에 따른 유전적 융합에 기초할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항체를 포함하는 융합 단백질에 존재하는 추가의 도메인은 바람직하게는 가요성 링커, 유리하게는 펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있으며, 상기 펩타이드 링커는 추가의 단백질 도메인의 C-말단과 항체의 N-말단 사이 또는 추가의 단백질 도메인의 N-말단과 항체의 C-말단 사이의 거리에 걸친 충분한 길이의 다수의 친수성 펩타이드-결합된 아미노산을 포함한다. 항체는, 예를 들어, 생물학적 활성 또는 고체 지지체에 대한 선택적 결합에 적합한 구조를 갖는 이펙터 분자, 생물학적 활성 물질(예: 사이토킨 또는 성장 호르몬), 화학적 제제, 펩타이드, 단백질 또는 약물에 연결될 수 있다.
m. 이중-특이적 항체
본원에서 "이중-특이적 항체"는 2개의 결합 암(HC/LC의 쌍) 각각에서 2개의 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합될 수 있는 전장 항체를 지칭한다 [참조: PCT 공개 WO 02/02773]. 따라서, 이중-특이적 결합 단백질은 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원 결합 암을 가지며, 항체가 결합하는 각각의 항원에 대해 이가이다.
n. 이중 가변 도메인
본원에서 "이중 가변 도메인"(DVD)은, 2가(2개의 항원 결합 부위), 4가(4개의 항원 결합 부위), 또는 다가 결합 단백질일 수 있는 결합 단백질 상의 2개 이상의 항원 결합 부위를 지칭하기 위해 사용된다. DVD는 일특이적, 즉 하나의 항원(또는 하나의 특이적 에피토프)에 결합되거나, 다특이적, 즉 2개 이상의 항원(즉, 동일한 표적 항원 분자의 2개 이상의 에피토프 또는 상이한 표적 항원의 2개 이상의 에피토프)에 결합될 수 있다. 바람직한 DVD 결합 단백질은 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하고, "DVD 면역글로불린" 또는 "DVD-Ig"로 지칭된다. 따라서, 이러한 DVD-Ig 결합 단백질은 사량체이고 IgG 분자를 연상시키나 IgG 분자보다 더욱 많은 항원 결합 부위를 제공한다. 따라서, 사량체 DVD-Ig 분자의 각각의 절반은 IgG 분자의 절반을 연상시키고 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하나, 단일 항원 결합 도메인을 제공하는 IgG 분자의 중쇄 및 경쇄의 쌍과는 달리, DVD-Ig의 중쇄 및 경쇄의 쌍은 2개 이상의 항원 결합 부위를 제공한다.
DVD-Ig 결합 단백질의 각각의 항원 결합 부위는 공여자 ("모") 모노클로날 항체로부터 유도될 수 있으므로 항원 결합 부위 당 항원 결합에 수반되는 총 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 따라서, 2개의 상이한 에피토프(즉, 2개의 상이한 항원 분자의 2개의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 분자의 2개의 상이한 에피토프)에 결합되는 DVD-Ig 결합 단백질은, 제1의 모 모노클로날 항체로부터 유도되는 항원 결합 부위 및 제2의 모 모노클로날 항체의 항원 결합 부위를 포함한다.
DVD-Ig 결합 분자의 디자인, 발현 및 특성에 대한 기술이 문헌 [PCT Publication No. WO 2007/024715, U.S. Pat. No. 7,612,181, and Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007)]에서 제공된다. 이러한 DVD-Ig 분자의 바람직한 예는, 구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(여기서, VD1는 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커로서 단 CH1은 아니고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1, 바람직하게는 1이다)을 포함하는 중쇄, 및 구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커로서 단 CH1은 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않고, n은 0 또는 1, 바람직하게는 1이다)을 포함하는 경쇄를 포함한다. 이러한 DVD-Ig는 2개의 이러한 중쇄 및 2개의 이러한 경쇄를 포함할 수 있으며, 이때 각각의 쇄는 가변 영역 사이에 끼어드는 불변 영역 없이 세로로 연결된 가변 도메인을 포함하고, 중쇄 및 경쇄는 세로로 연결된 작용성 항원 결합 부위를 형성하도록 화합하며, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄가 또 다른 쌍의 중쇄 및 경쇄와 화합하여 4개의 작용성 항원 결합 부위를 갖는 사량체 결합 단백질을 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, DVD-Ig 분자는, 각각 가변 도메인 사이에 끼이는 불변 영역 없이 세로로 연결된 3개의 가변 도메인(VD1, VD2, VD3)을 포함하는, 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있으며, 이때 한 쌍의 중쇄 및 경쇄는 3개의 항원 결합 부위를 형성하도록 화합할 수 있고, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄가 또 다른 한 쌍의 중쇄 및 경쇄와 화합하여 6개의 항원 결합 부위를 갖는 사량체 결합 단백질을 형성할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 DVD-Ig 결합 단백질은 이의 모(parent) 모노클로날 항체에 의해 결합되는 동일한 표적 분자에 결합될뿐만 아니라 이의 모 모노클로날 항체의 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는다. 바람직하게는, 이러한 추가의 특성은 하나 이상의 모 모노클로날 항체의 항체 파라미터이다. 하나 이상의 이의 모 모노클로날 항체로부터 DVD-Ig 결합 단백질에 제공될 수 있는 항체 파라미터는 항원 특이성, 항원 친화성, 효능, 생물학적 기능, 에피토프 인식, 단백질 안정성, 단백질 가용성, 생산 효율, 면역원성, 약동학, 생체이용성, 조직 교차 반응성 및 오르톨로거스(orthologous) 항원 결합을 포함하고 이에 제한되지 않는다.
DVD-Ig 결합 단백질은 RGMa의 하나 이상의 에피토프에 결합된다. DVD-Ig 결합 단백질의 비제한적 예는 RGMa의 하나 이상의 에피토프에 결합되는 DVD-Ig 결합 단백질, 사람 RGMa의 에피토프 및 또 다른 종(예: 마우스)의 RGMa의 에피토프에 결합되는 DVD-Ig 결합 단백질, 및 사람 RGMa의 에피토프 및 또 다른 표적 분자(예: VEGFR2 또는 VEGFR1)의 에피토프에 결합되는 DVD-Ig 결합 단백질을 포함한다.
o. 에피토프 또는 에피토프들
"에피토프" 또는 "에피토프들" 또는 "관심 에피토프들"은 인식되고 특정 결합 파트너 상의 상보적 부위(들)에 결합될 수 있는 임의의 분자 상의 부위(들)을 지칭한다. 상기 분자 및 특정 결합 파트너는 특정 결합 쌍의 부분이다. 예를 들어, 에피토프는 폴리펩타이드, 단백질, 합텐, 탄수화물 항원(예: 이로 제한됨이 없이, 당지질, 당단백질 또는 지다당류), 또는 다당류일 수 있다. 이의 특정한 결합 파트너는, 이로 제한됨이 없이, 항체일 수 있다.
p. 프레임워크 또는 프레임워크 서열
본원에서 사용되는 "프레임워크"(FR) 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 뺀 가변 영역의 나머지 서열을 의미할 수 있다. CDR 서열의 정확한 정의가 상이한 시스템(예를 들어, 상기 참조)에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미도 상응하게 다르게 해석된다. 또한, 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상의 4개의 서브-영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)으로 나누며, 이때 CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치되고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치되며, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치된다. 달리, 프레임워크 영역은, 특정 서브-영역을 FR1, FR2, FR3, 또는 FR4로 구체화하지 않고, 단일 천연 발생 면역글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합된 FR을 나타낸다. 본원에서 하나의 FR은 4개의 서브-영역 중 하나를 나타내며, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 서브-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
당업계에 알려진 기술을 이용하여 비-사람 항체를 사람화하기 위해 중쇄 및 경쇄 "수용체" 프레임워크 서열(또는 간단히 "수용체" 서열)로서 사용될 수 있는 사람 중쇄 및 경쇄 FR 서열이 당업계에 알려져 있다. 한 실시형태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스, 예를 들어, V-베이스(hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 또는 인터내셔널 ImMunoGeneTics®(IMGT®) 정보 시스템(hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)에 실린 프레임워크 서열로부터 선택된다.
q. 작용성 항원 결합 부위
본원에서 사용되는 "작용성 항원 결합 부위"는 표적 항원에 결합될 수 있는 결합 단백질(예: 항체) 상의 부위를 의미할 수 있다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화성은 항원 결합 부위가 유도되는 모 결합 단백질, 예를 들어, 모 항체와 같이 강력하지 않을 수 있으나, 항원에 결합하는 능력은 항원에 결합하는 단백질, 예를 들어, 항체를 평가하기 위한 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법을 이용하여 측정가능해야 한다. 또한, 본원에서 다가 단백질, 예를 들어, 다가 항체의 항원 결합 부위 각각의 항원 결합 친화성은 정량적으로 동일할 필요는 없다.
r. 사람 항체
본원에서 사용되는 "사람 항체"는 사람 생식선(germline) 면역글로불린 서열로부터 유도되는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 사람 항체는 사람 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예: 시험관내에서 무작위 또는 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이유발에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "사람 항체"에 다른 포유동물 종, 예를 들어, 마우스의 생식선으로부터 유도되는 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열로 절편이식된 항체를 포함하려는 것은 아니다.
s. 사람화된 항체
본원에서 "사람화된 항체"는 비-사람 종(예: 마우스)로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하나 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 보다 "사람 같이", 즉 사람 생식선 가변 서열에 보다 유사하게 변형된 항체를 기술하기 위해 사용된다. "사람화된 항체"는 관심 항원에 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 동족체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다. 사람화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-사람 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 것에 상응하는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 모두를 실질적으로 포함한다. 한 실시형태에서, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 사람 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 경쇄만을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 중쇄만을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 포함한다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE, 및 이소타입(제한 없이, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4을 포함)을 포함한 임의의 클래스의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 하나 초과의 클래스 또는 이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인은 당업계에 널리-알려진 기술을 이용하여 목적하는 이펙터 기능을 최적화하도록 선택될 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 영역 및 CDR은 모 서열과 정확히 상응할 필요는 없으며, 예를 들어, 공여 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 그 자리에서 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공여 항체 또는 컨센서스 프레임워크와 상응하지 않게 될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 통상적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 95%가 모 FR 및 CDR 서열의 것에 상응할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크 영역을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련된 면역글로불린 서열의 패밀리에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성되는 서열을 지칭한다 [참조: 예를 들어, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)]. 따라서, "컨센서스 면역글로불린 서열"은 "컨센서스 프레임워크 영역(들)" 및/또는 "컨센서스 CDR(들)"을 포함할 수 있다. 일 패밀리의 면역글로불린에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 그 패밀리 내의 그 위치에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산에 의해 차지된다. 2개의 아미노산이 동일한 빈도로 나타나는 경우, 어떠한 것도 컨센서스 서열 내에 포함될 수 있다.
t. 동일 또는 동일성
2개 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 "동일" 또는 "동일성"은 상기 서열들이 특정 영역에 걸쳐 동일한 특정 비율(%)의 잔기를 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 그 비율은 2개의 서열을 최적으로 정렬시키고, 특정 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하며, 동일한 잔기가 두 서열 모두에서 나타나는 위치의 수를 측정하여 매칭되는 위치의 수를 얻고, 매칭되는 위치의 수를 특정 영역 내의 위치의 총수로 나누며, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 비율(%)을 구함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열의 길이가 상이하거나 정렬시 하나 이상의 엇갈린 말단이 생기고 비교되는 특정 영역이 단지 하나의 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산시 분모에는 포함되나 분자에는 포함되지 않는다.
u. 분리된 폴리뉴클레오타이드
본원에서 사용되는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는, 이의 기원에 의해, 분리된 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 함께 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 화합되지 않거나; 자연적으로는 연결되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되거나; 보다 큰 서열의 일부로서 자연적으로는 발생하지 않는, (예를 들어, 게놈, cDNA 또는 합성 기원, 또는 이들의 조합으로부터의) 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있다.
v. 표지 및 검출가능한 표지
본원에서 사용되는 "표지" 및 "검출가능한 표지"는 항체와 분석물 사이의 반응이 검출가능하도록 항체 또는 분석물에 부착되는 모이어티를 지칭하며, 이렇게 표지되는 항체 또는 분석물은 "검출가능하게 표지된다"고 지칭된다. 표지는 시각적으로나 기구를 사용하여 검출가능한 시그널을 생성할 수 있다. 다양한 표지는 시그널-발생 물질, 예를 들어, 색소원, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 방사성 화합물 등을 포함한다. 표지의 대표적인 예는 빛을 생성하는 모이어티, 예를 들어, 아크리디늄 화합물, 및 형광을 생성하는 모이어티, 예를 들어, 플루오레세인을 포함한다. 다른 표지들이 본원에 기술되어 있다. 이와 관련하여, 모이어티 자체는 검출가능하지 않지만 또 다른 모이어티와 반응하여 검출가능하게 될 수 있다. 용어 "검출가능하게 표지된"은 이러한 표지화를 포함하고자 한다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 검출가능한 표지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 방사성 표지(예: 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 및 33P), 효소 표지(예: 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 퍼옥시다제, 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나제 등), 화학발광 표지(예: 아크리디늄 에스테르, 티오에스테르, 또는 설폰아미드; 루미놀, 이소루미놀, 페난트리디늄 에스테르 등), 형광 표지(예: 플루오레세인(예: 5-플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 3'6-카복시플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 6-헥사클로로-플루오레세인, 6-테트라클로로플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등), 로다민, 피코빌리단백질, R-피코에리트린, 양자점(예: 황화아연-캡핑된 셀렌화카드뮴), 온도측정 표지, 또는 면역-폴리머라제 연쇄 반응 표지이다. 표지의 도입, 표지화 절차 및 표지 검출은 문헌 [참조: Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996) (Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon)에 의해 출간된 조합된 안내서 및 카달로그]에 기술되어 있다. 형광 표지는 FPIA [참조: 예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, and 5,352,803, 본원에 전부 인용에 의해 포함됨]에서 사용될 수 있다. 아크리디늄 화합물은 균질 화학발광 검정에서 검출가능한 표지로 사용될 수 있다 [참조: Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); and Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)].
한 양상에서, 아크리디늄 화합물은 아크리디늄-9-카복사미드이다. 아크리디늄-9-카복사미드를 제조하는 방법은 문헌 [Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); and U.S. Pat. Nos. 5,468,646, 5,543,524 and 5,783,699, 이들 각각은 전부 본원에 인용에 의해 포함됨]에 기술되어 있다.
아크리디늄 화합물의 또 다른 예는 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르이다. 화학식 II의 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르의 예는 10-메틸-9-(페녹시카보닐)아크리디늄 플루오로설포네이트(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)이다. 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르를 제조하는 방법은 문헌 [McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); and U.S. Patent No. 5,241,070, 이들 각각은 전부 본원에 인용에 의해 포함됨]에 기술되어 있다. 이러한 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르는 시그널의 강도 및/또는 시그널의 신속성면에서 하나 이상의 옥시다제에 의해 분석물의 산화로 생긴 과산화수소에 대한 효과적인 화학발광 지시자이다. 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르에 대한 화학발광 방출 과정은 신속히, 즉 1초 이내에 완성되며, 아크리디늄-9-카복사미드 화학발광 방출은 2초 이상 걸린다. 그러나, 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르는 단백질의 존재 하에서 이의 화학발광 특성을 상실한다. 따라서, 이의 사용은 시그널 생성 및 검출 동안 단백질이 없어야 한다. 샘플 중의 단백질을 분리 또는 제거하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 이로 제한됨이 없이, 한외여과, 추출, 침전, 투석, 크로마토그래피 및/또는 분해를 포함한다 [참조: 예를 들어, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)]. 시험 샘플로부터 제거 또는 분리되는 단백질의 양은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%일 수 있다 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르 및 이의 사용에 대한 추가의 세부 사항은 미국 특허 출원 제11/697,835호(2007년 4월 9일 출원)에 기술되어 있다. 아크리디늄-9-카복실레이트 아릴 에스테르는 임의의 적합한 용매, 예를 들어, 무수 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 수성 나트륨 콜레이트 중에 용해될 수 있다.
w. 연결 서열 및 연결 펩타이드 서열
"연결 서열" 또는 "연결 펩타이드 서열"은 관심의 하나 이상의 폴리펩타이드에 연결된 천연 또는 인위적 폴리펩타이드 서열(예: 전장, 단편 등)을 지칭한다. 용어 '연결된"은 관심 폴리펩타이드 서열에 연결 서열을 합치는 것을 지칭한다. 이러한 폴리펩타이드 서열은 바람직하게는 하나 이상의 펩타이드 결합으로 합쳐진다. 연결 서열은 약 4 내지 약 50개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 연결 서열의 길이는 약 6내지 약 30개의 아미노산이다. 천연 연결 서열은 아미노산 치환, 부가, 또는 결실에 의해 변형되어 인위적 연결 서열을 생성할 수 있다. 예시적인 연결 서열은, 이로 제한됨이 없이, (i) 히스티딘(His) 택 [예를 들어, HHHHHH (서열번호 148)의 아미노산 서열을 갖고 관심 폴리펩타이드 및 항체의 분리 및 정제를 용이하게 하기 위한 연결 서열로서 유용한, 6X His 택 (서열번호 148) ]; (ii) 엔테로키나제 절단 부위 [His 택과 같이 관심 단백질 및 항체의 분리 및 정제에 사용된다. 종종, 엔테로키나제 절단 부위는 관심 단백질 및 항체의 분리 및 정제시 His 택과 함께 사용된다. 다양한 엔테로키나제 절단 부위가 당업계에 공지되어 있다. 엔테로키나제 절단 부위의 예는, 이로 제한됨이 없이, DDDDK (서열번호 149)의 아미노산 서열 및 이의 유도체(예: ADDDDK (서열번호 150) 등)를 포함한다]; (iii) 단일쇄 가변 영역 단편의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결하거나 있는데 사용될 수 있는 기타 서열을 포함한다. 다른 연결 서열의 예는 문헌 [Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85: 5879-5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)]에서 찾을 수 있다. 연결 서열은 또한 추가의 기능, 예를 들어, 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 본 기술과 관련하여, 예를 들어, 모노클로날 항체는 연결 서열, 예를 들어, His 택, 엔테로키나제 절단 부위, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
x. 다가 결합 단백질
본원에서 "다가 결합 단백질"은 2개 이상의 항원 결합 부위(본원에서 또한 "항원 결합 도메인"으로도 지칭됨)를 포함하는 결합 단백질을 지칭하는데 사용된다. 다가 결합 단백질은 바람직하게는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작되며, 일반적으로 천연 발생 항체가 아니다. 용어 "다특이적 결합 단백질"은 동일한 표적 분자의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합될 수 있는 결합 단백질을 포함하여 2개 이상의 관련 또는 비관련 표적물에 결합될 수 있는 결합 단백질을 지칭한다.
y. 예정된 컷오프 및 예정된 수준
"예정된 컷오프" 및 "예정된 수준"은 일반적으로 검정 결과를 예정된 컷오프/수준에 대해 비교함으로써 진단/예후/치료 효능 결과를 평가하는데 사용되는 검정 컷오프 값을 지칭하며, 예정된 컷오프/수준은 이미 다양한 임상 파라미터(예: 질환의 중증도, 진행/비진행/개선 등)와 연결되거나 연관되어 있다. 본 기술은 예시적인 예정된 수준을 제공한다. 그러나, 컷오프 값은 면역검정의 유형(예: 사용되는 항체 등)에 따라 달라질 수 있는 것으로 널리 알려져 있다. 본 기술에 기초하여 다른 면역검정에 대한 면역검정-특이적 컷오프 값을 수득하기 위해 다른 면역검정에 대해 본 기술을 적용하는 것을 당업자의 기술 범위 내에 있다. 예정된 컷오프/수준의 정확한 값은 검정에 따라 달라질 수 있는 반면, 본원에서 기술되는 바와 같은 상관관계는 일반적으로 적용가능할 것이다.
z. 전처리 시약
본원에서 기술되는 바와 같은 진단 검정에서 사용되는 바와 같이, "전처리 시약", 예를 들어, 용해, 침전 및/또는 가용화 시약은 시험 샘플 중에 존재하는 임의의 세포를 용해시키고/시키거나 임의의 분석물을 가용화시키는 것이다. 전처리는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이 모든 샘플에 대해 필수적인 것은 아니다. 특히, 분석물(즉, RGMa(예: 막-결합된 RGMa, 가용성 RGMa, 막-결합된 RGMa의 단편, 가용성 RGMa의 단편, RGMA(막-결합되거나 가용성인 RGMa)의 변이체) 또는 이들의 임의의 조합)을 가용화시키는 것은 샘플 중에 존재하는 임의의 내생적 결합 단백질로부터 분석물을 방출시키는 것을 수반한다. 전처리 시약은 균질(분리 단계가 불필요함) 또는 불균질(분리 단계가 필요함)일 수 있다. 불균질 전처리 시약을 사용하는 경우 검정의 다음 단계를 수행하기 전 시험 샘플로부터 임의의 침전된 분석물 결합 단백질을 제거한다. 전처리 시약은 임의로 (a) 하나 이상의 용매 및 염, (b) 하나 이상의 용매, 염 및 세제, (c) 세제, (d) 세제 및 염, 또는 (e) 세포 용해 및/또는 분석물의 가용화에 적합한 임의의 시약 및 시약의 조합을 포함할 수 있다.
aa. 품질 조절 시약
면역검정 및 키트와 관련하여 본원에서 기술되는 "품질 조절 시약"은, 이로 제한됨이 없이, 캘리브레이터, 대조군 및 민감도 패널을 포함한다. "캘리브레이터" 또는 "표준"은 전형적으로 분석물, 예를 들어, 항체 또는 분석물의 농도를 내삽하기 위한 보정(표준) 곡선을 확립하기 위해(예를 들어, 1개 이상, 예를 들어, 다수개) 사용된다. 달리, 예정된 포지티브/네가티브 컷오프에 가까운 단일 캘리브레이터가 사용될 수도 있다. 다수의 캘리브레이터(즉, 하나 초과의 캘리브레이터 또는 다양한 양이 캘리브레이터(들))가 "민감도 패널"을 포함하도록 하기 위해 함께 사용될 수 있다.
bb. 재조합 항체 및 재조합 항체들
"재조합 항체" 및 "재조합 항체들"은 재조합 기술에 의해 하나 이상의 모노클로날 항체의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 적합한 발현 벡터로 클로닝한 후 항체를 적합한 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하여 하나 이상의 단계로 제조되는 항체를 지칭한다. 이 용어는, 이로 제한됨이 없이, 재조합적으로 생성되는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체(완전히 또는 부분적으로 사람화된 항체), 항체 단편으로부터 형성되는 다특이적 또는 다가 구조물, 이작용성 항체, 헤테로컨주게이트 Ab, DVD-Ig®, 및 본원에서 기술되는 바와 같은 다른 항체를 포함한다. 이중-가변 도메인 면역글로불린 및 이의 제조 방법은 문헌 [Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)]에 기술되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "이작용성 항체"는 하나의 항원 부위에 대해 특이성을 갖는 제1 암 및 상이한 항원 부위에 대해 특이성을 갖는 제2 암을 포함하는 항체를 지칭한다. 즉, 이작용성 항체는 이중 특이성을 갖는다.
cc. 샘플, 시험 샘플 및 환자 샘플
본원에서 "샘플", "시험 샘플 및 "환자 샘플"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 샘플, 예를 들어, 소변, 혈청, 혈장, 양수, 뇌척수액, 태반 세포 또는 조직, 내피 세포, 백혈구, 또는 단핵구가 환자로부터 수득되는 바와 같이 직접적으로 사용되거나, 본원에서 기술되거나 당업계에 공지되는 바와 같이 일부 방식으로 샘플의 특성을 변화시키기 위해, 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 원심분리, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에 의해 전처리될 수 있다.
dd. 보정 조성물 시리즈
"보정 조성물 시리즈"는 공지된 농도의 Cys-CRGMa를 포함하는 다수의 조성물을 지칭하며, 각각의 조성물은 시리즈의 다른 조성물과 Cys-CRGMa 농도가 상이하다.
ee. 고체상
"고체상"은 불용성이거나 후속 반응에 의해 불용성이게 될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 고체상은 포획제를 끌어당기고 고정화시키는 이의 고유한 능력에 따라 선택될 수 있다. 달리, 고체상은 포획제를 끌어당기고 고정화시키는 능력을 갖는 연결제를 이에 부착시킬 수 있다. 연결제는, 예를 들어, 포착제 자체에 대해 또는 포착제에 컨주게이션되는 하전된 물질에 대해 반대로 하전되는 하전된 물질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 연결제는 고체상에 고정화되고(부착되고) 결합 반응을 통해 포착제를 고정화시키는 능력을 갖는 임의의 결합 파트너(바람직하게는 특이적인 결합 파트너)일 수 있다. 연결제는 검정 수행 전 또는 검정 수행 동안 포착제를 고체상 물질에 간접적 결합시킬 수 있다. 고체상은, 예를 들어, 시험관, 마이크로역가 웰, 시트, 비드, 마이크로입자, 칩 및 당업자에게 공지된 다른 구조물을 포함한, 플라스틱, 유도체화된 플라스틱, 자성 또는 비-자성 금속, 유리 또는 실리콘일 수 있다.
ff. 특이적 결합
본원에서 사용되는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질 또는 펩타이드의 제2의 화학물질 종과의 상호작용을 지칭할 수 있으며, 상호작용은 화학물질 종 상의 특정 구조물(예: 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존적이다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다 특정 단백질 구조물을 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 에피토프 A를 포함하는 분자(또는 유리된 비표지된 A)의 존재는 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서 항체에 결합되는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
gg. 특이적 결합 파트너
"특이적 결합 파트너"는 특이적 결합쌍의 구성원이다. 특이적 결합쌍은 화학적 또는 물리적 수단을 통해 서로 특이적으로 결합되는 2개의 상이한 분자를 포함한다. 따라서, 일반적인 면역검정물의 항원 및 항체의 특이적 결합쌍 이외의, 다른 특이적 결합쌍은 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙트아비딘), 탄수화물 및 렉틴, 상보적 뉴클레오타이드 서열, 이펙터 및 수용체 분자, 보조인자 및 효소, 효소 및 효소 억제제 등을 포함한다. 또한, 특이적 결합쌍은 최초 특이적 결합 구성원의 동족체인 구성원, 예를 들어, 분석물 동족체를 포함할 수 있다. 면역반응적 특이적 결합 구성원은 항원, 항원 단편, 및 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 분리되거나 재조합적으로 생성되는 이의 컴플렉스 및 단편을 포함한하는 항체를 포함한다.
hh. 엄격한 조건
본원에서 "엄격한 조건"은 약 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 필터-결합된 DNA에 대해 하이브리드화한 후 약 50 내지 65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것을 기술하기 위해 사용된다. 용어 "고도로 엄격한 조건 하"는 약 45℃에서 6xSSC 중에서 필터-결합된 핵산에 대해 하이브리화한 후 약 68℃에서 0.1xSSC/0.2% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것을 지칭한다 [참조: 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3].
ii . 치료 또는 치료하기
본원에서 "치료" 또는 "치료하기"는 질환 또는 이러한 질환의 하나 이상의 증상의 진행이 역전, 경감 또는 억제되는 것을 기술하기 위해 사용된다. 피험자의 상태에 따라, 상기 용어는 또한 질환을 예방하는 것을 지칭하고, 질환의 발병의 예방 또는 질환과 연관된 증상의 예방을 포함한다. 치료는 단기적으로 또는 장기적으로 수행될 수 있다. 이 용어는 또한 질환으로의 고통 전에 질환 또는 이러한 질환과 연관된 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다. 질환으로의 고통 전 질환의 예방 또는 중증도의 감소는 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물을 투여 시점에서 질환에 걸리지 않은 피험자에게 투여하는 것을 지칭한다. "예방"은 또한 질환 또는 이러한 질환과 연관된 하나 이상의 증상이 재발하는 것을 방지하는 것을 지칭한다. "치료하기" 또는 "치료학적으로"는 치료하는 행위를 지칭한다.
jj. 트레이서
본원에서 사용되는 "트레이서"는 표지에 컨주게이션되는 분석물 또는 분석물 단편, 예를 들어, 플루오레세인 모이어티에 컨주게이션되는 Cys-CRGMa을 지칭하며, 표지에 컨주게이션된 분석물은 분석물에 대해 특이적인 항체 상의 부위에 대해 분석물과 효과적으로 경쟁할 수 있다.
kk. 변이체
본원에서 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에 차이가 나지만 적어도 하나의 생물학적 활성은 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 기술하는데 사용된다. "생물학적 활성"의 대표적인 예는 특정 항체에 의해 결합되거나 면역 반응을 증진시키는 능력을 포함한다. 본원에서 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 기술하는데 사용된다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예: 친수성, 하전 영역의 정도 및 분포)의 다른 아미노산으로의 아미노산 대체는 당업계에서 통상적으로 작은 변화를 수반하는 것으로 인식된다. 이들 작은 변화는, 부분적으로, 당업계에서 이해되는 바와 같은 아미노산의 수치료법(hydropathic) 지수를 고려함으로써 확인될 수 있다 [Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)]. 아미노산의 수치료법 지수는 이의 소수성 및 하전의 고찰에 기초한다. 유사한 수치료법 지수의 아미노산들이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다고 당업계에 알려져 있다. 한 양상에서, ±2의 수치료법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 또한, 아미노산의 친수성이 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성하는 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성에 대한 고찰은, 항원성 및 면역원성과 상당히 상관관계가 있는 것으로 보고된 유용한 척도인, 펩타이드의 최대 국소 평균 친수성 계산을 가능하게 한다 [미국 특허 번호 4,554,101, 본원에 전부 인용에 의해 포함됨]. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어, 면역원성을 보유하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 모두 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관측과 일치하게, 생물학적 기능에 적합한 아미노산 치환은, 소수성, 친수성, 하전, 크기 및 기타 특성에 의해 보여지는 바와 같이, 아미노산의 상대적 유사성 및 특히 아미노산의 측쇄에 의존적인 것으로 이해된다. 또한, "변이체"는 아미노산 서열에서는 항-RGMa 항체의 상응하는 단편과 상이하지만 여전히 항원과 반응성이고 RGMa와의 결합에 대해 항-RGMa 항체의 상응하는 단편과 경쟁할 수 있는 항-RGMa 항체의 항원적 반응 단편을 지칭하는데 사용될 수 있다. 또한, "변이체"는, 예를 들어, 단백질 분해, 인산화, 또는 다른 해독 후 변형에 의해 차등적으로 프로세싱되나 이의 항원 반응성은 보유하는, 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 기술하는데 사용될 수 있다.
ll. 벡터
본원에서 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 기술하기 위해 사용된다. 벡터의 일 유형은 추가의 DNA 절편이 결합될 수 있는 환형 이중-가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈에 결합될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터(예를 들어, 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터)는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터(예: 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본원에서 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터이므로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 동일한 기능을 제공하는, 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터(예: 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, RNA 버젼의 벡터(RNA 바이러스 벡터 포함)도 본원의 기술과 관련하여 사용될 수 있다.
본원에서 수 범위의 인용과 관련하여, 인용된 수 사이에 낀 수도 명백히 동일한 정밀도로 고려된다. 예를 들어, 범위 6-9에 대해, 6 및 9 이외에 7 및 8도 고려되며, 범위 6.0 내지 7.0에 대해 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명백히 고려된다.
2. 항-RGMa 항체
본원에는 신경돌기 변성 질환 및 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항체가 제공된다. 본원에서 기술되는 항체는 반발 유도 분자 c("RGMc")와의 반응성을 최소화하거나 제거하면서 RGMa에 대한 결합을 위해 선택되었다. 예를 들어, PROfusion-유도된 모노클로날 항체 AE12-1 및 AE12-1 변이체(AE12-1F, AE12-1H, AE12-1L, AE12-1V, AE12-1I, AE12-1K, 및 AE12-1Y)가 RGMc와의 교차 반응 없이(낮은 검출) RGMa 중화 활성을 나타내는 표 4를 참조한다. RGMa에 대해 생성된 항체는 종종 RGMc와 교차-반응할 수 있고, 높은 정맥내 용량에서 간세포에 철을 축적시킬 수 있으므로, RGMa에 대한 본원에서 기술되는 항체의 특이적 결합은 치료에 유리하다. 또한, 이들 항체의 높은 선택성은 커다란 치료 용량 윈도우 또는 치료 범위를 제공한다.
a. RGMa
47개 아미노산의 예측된 N-말단 시그널 펩타이드 및 C-말단 GPI-부착 시그널을 갖는 450개 아미노산의 단백질로서 존재할 수 있는 사람 RGMa는 처음에는, 뉴런 발달 및 세포 생존에 역할을 하는 분비되는 분자인, 네트린에 대한 수용체인 트랜스막 단백질인, 네오게닌에 대한 결합에 의해 망막 축색돌기의 유도를 조절하는 것으로 제시되었다. RGMa는, 망막 축색돌기 유도를 조절하는 것에 추가하여, 나이든 래트에서 축색돌기 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 [참조: Yamashita et al., Current Opinion in Neurobiology (2007)17:1-6]. 이러한 기작과 일치하게, RGMa 발현은 척수 손상 후 증가하며, 이러는 동안 RGMa 억제는 축색돌기 성장을 증진시킨다 [참조: Kitayama et al., PLoS One, (2011) Vol.6 (9), pages 1-9; and Hata et al., J. Cell Biol. (2006)173:47-58]. 또한, RGMa 발현은 국소 뇌 허혈 또는 외상성 뇌 손상을 겪는 사람의 병변 부위 및 흉터 조직에서 상향조절된다 [참조: Yamashita et al., Current Opinion in Neurobiology (2007)17:1-6; Schwab et al., Arch Neurol (2005)22:2134-2144; and Muramatsu et al., Nat. Medicine (2011) 17:488-94].
RGMa는 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다: MQPPRERLVV TGRAGWMGMG RGAGRSALGF WPTLAFLLCS FPAATSPCKI LKCNSEFWSA TSGSHA PASDDTPEFC AALRSYALCT RRTARTCRGD LAYHSAVHGI EDLMSQHNCS KDGPTSQPRL RTLPPAGDSQ ERSDSPEICH YEKSFHKHSA TPNYTHCGLF GDPHLRTFTD RFQTCKVQGA WPLIDNNYLN VQVTNTPVLP GSAATATSKL TIIFKNFQEC VDQKVYQAEM DELPAAFVDG SKNGGDKHGA NSLKITEKVS GQHVEIQAKY IGTTIVVRQV GRYLTFAVRM PEEVVNAVED WDSQGLYLCL RGCPLNQQID FQAFHTNAEG TGARRLAAAS PAPTAPETFP YETAVAKCKE KLPVEDLYYQ ACVFDLLTTG DVNFTLAAYY ALEDVKMLHS NKDKLHLYER TRDLPGRAAA GLPLAPRPLL GALVPLLALL PVFC (서열번호 65). RGMa는 서열번호 65의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RGMa의 단편은 5 내지 425개의 아미노산, 10 내지 400개의 아미노산, 50 내지 350개의 아미노산, 100 내지 300개의 아미노산, 150 내지 250개의 아미노산, 200 내지 300개의 아미노산, 또는 75 내지 150개의 아미노산 길이일 수 있다. 단편은 서열번호 65로부터의 아미노산의 연속적인 수를 포함할 수 있다.
RGMa의 단편은 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다: PCKI LKCNSEFWSA TSGSHA PASDDTPEFC AALRSYALCT RRTARTCRGD LAYHSAVHGI EDLMSQHNCS KDGPTSQPRL RTLPPAGDSQ ERSDSPEICH YEKSFHKHSA TPNYTHCGLF GD (서열번호 66)(서열번호 65의 아미노산 47-168에 상응). RGMa 단편은 서열번호 66의 단편일 수 있다. RGMa 단편은 서열번호 66의 변이체일 수 있다. RGMa 단편은 하기 RGMa 서열을 가질 수 있다: PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (서열번호 74).
RGMa는 세포막 결합된 형태 및/또는 가용성 형태로 존재할 수 있다.
b. RGMa - 인식 항체
항체는 RGMa에 결합하는 항체, 이의 단편, 또는 이의 변이체이다. 항체는 항-RGMa 항체의 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체일 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 친화성 성숙된 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 완전 사람 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 항체 단편 또는 유도체는 F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편을 포함할 수 있다. 항체 유도체는 펩타이드모방제(peptidomimetics)에 의해 생성될 수 있다. 또한, 단일쇄 항체 생성 기술을 적용하여 단일쇄 항체를 생성할 수 있다.
사람 항체는 파지-디스플레이 기술을 이용하거나 사람 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스로부터 유도될 수 있다. 사람 항체는 사람 생체내 면역 반응의 결과로 생성되고 분리될 수 있다 [참조: 예를 들어, Funaro et al., BMC Biotechnology, 2008(8):85]. 따라서, 항체는 사람의 생성물이고 동물 레퍼토리는 아닐 수 있다. 사람 기원이기 때문에, 자가-항원에 대한 반응성의 위험이 최소화될 수 있다. 달리, 표준 효모 디스플레이 라이브러리 및 디스플레이 기술을 이용하여 사람 항-RGMa 항체를 선별하고 분리할 수 있다. 예를 들어, 나이브(naive) 사람 단일쇄 가변 단편(scFv)의 라이브러리를 사용하여 사람 항-RGMa 항체를 선별할 수 있다. 트랜스제닉 동물을 사용하여 사람 항체를 발현할 수 있다.
사람화된 항체는 비-사람 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 인자(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크를 갖는 목적하는 항원에 결합하는 비-사람 종 항체로부터의 항체 분자일 수 있다.
상기 항체는 당업계에 공지된 것과 상이한 생물학적 기능(들)을 갖는다는 점에서 공지된 항체와 구별될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 RGMa를 인식하고 이에 결합될 뿐만 아니라 추가의 생물학적 활성, 예를 들어, 신경돌기 변성과 관련된 질환과 연관된 임상적 징후를 약화시키는 능력을 갖는 것으로 더욱 특징지어진다.
항체는 RGMa에 특이적으로 결합될 수 있다. RGMa-특이적 RGMa 항체는 서열번호 1 및 5; 서열번호 2-4 및 6-8; 서열번호 2-4, 6, 7, 및 67; 서열번호 2-4, 6, 7, 및 68; 서열번호 2-4, 6, 7, 및 69; 서열번호 2-4, 6, 7, 및 70; 서열번호 2-4, 6, 7, 및 71; 서열번호 2-4, 6, 7, 및 72; 또는 서열번호 2-4, 6, 7, 및 73을 포함할 수 있다. 항체는 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 74, 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합할 수 있다. 항체는 상기 기술되는 바와 같은 RGMa 폴리펩타이드 또는 변이체에 존재하는 에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합될 수 있다. 에피토프는 서열번호 66, 서열번호 74, 또는 이의 변이체일 수 있다.
(1) 항체 결합 특성확인
항체는 RGMa (서열번호 65), 서열번호 66, 서열번호 74, 이의 단편, 또는 이의 변이체에 면역특이적으로 결합하고 적어도 1.0x10-3 s-1, 1.0x10-4 s-1, 적어도 1.0x10-5 s-1, 적어도 1.0x10-6 s-1의 k off (또는 k d )를 가질 수 있거나 1.0x10-3 s-1 내지 1.0x10-6 s-1, 1.0x10-3 s-1 내지 1.0x10-5 s-1 또는 1.0x10-3 s-1 내지 1.0x10-4 s-1 범위의 k off (또는 k d )를 갖는다. 단편은 서열번호 66 또는 서열번호 74일 수 있다.
항체는 RGMa(서열번호 65), 서열번호 66, 서열번호 74, 이의 단편, 또는 이의 변이체에 면역특이적으로 결합하고 적어도 2.4x104 M-1s-1, 적어도 약 2.5x104 M-1s-1, 적어도 약 3.3x104 M-1s-1, 적어도 약 5.0x104 M-1s-1, 적어도 약 1.25x106 M-1s-1, 적어도 약 1.35x106 M-1s-1, 적어도 약 1.0x106 M-1s-1, 적어도 약 1.0x107 M-1s-1의 k on (또는 k a )를 갖거나 약 5.0x104 M-1s-1 내지 약 1.0x108 M-1s-1, 약 3.3x104 M-1s-1 내지 약 1.0x109 M-1s-1, 약 2.5x104 M-1s-1 내지 약 1.25x106 M-1s-1, 약 2.4x104 M-1s-1 내지 약 1.35x107 M-1s-1 범위의 k on (또는 k a )을 갖는다. 단편은 서열번호 66 또는 서열번호 74일 수 있다.
(2) 항체 구조
(a) 중쇄 및 경쇄 CDR 들
항체는 RGMa(서열번호 65), 서열번호 66, 서열번호 74, 이의 단편, 또는 이의 변이체에 면역특이적으로 결합하고 표 1에 나타낸 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 포함한다. 항체는 RGMa, 이의 단편, 또는 이의 변이체에 면역특이적으로 결합하고 표 1에 나타낸 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 항체의 경쇄는 카파쇄 또는 람다쇄일 수 있다. 예를 들어, 표 1을 참조한다.
본원에는 RGMa, 이의 단편, 또는 이의 변이체에 면역특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 분리된 핵산은 엄격한 조건 하에서 표 1에 나타낸 중쇄 또는 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항체를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
Figure 112014081376914-pct00001
Figure 112014081376914-pct00002
Figure 112014081376914-pct00003
Figure 112014081376914-pct00004
Figure 112014081376914-pct00005
Figure 112014081376914-pct00006
Figure 112014081376914-pct00007
Figure 112014081376914-pct00008
항체 또는 이의 변이체 또는 유도체는 서열번호 1-64 및 67-73 중 하나 이상과 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 초과로 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 또는 이의 변이체 또는 유도체는 서열번호 1-64 및 67-73 중 하나 이상과 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 초과로 동일한 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 폴리펩타이드 동일성 및 상동성은 예를 들어, 문헌 [Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726-730 (1983)]에서 기술되는 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 기술되는 항체 또는 이의 변이체 또는 유도체는 서열번호 3-42 중 하나 이상의 상보체와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 본원에서 기술되는 항체 또는 이의 변이체 또는 유도체는 서열번호 1-64 및 67-73 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산의 상보체와 고도로 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
항체는 서열번호 8을 포함할 수 있으며, 서열번호 8의 Cys 잔기는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 항체는 서열번호 1 및 5, 또는 2-4 및 6-8을 포함할 수 있으며, 서열번호 8의 Cys 잔기는 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 서열번호 5의 위치 91의 Cys 잔기는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 서열번호 5의 위치 91의 Cys 잔기는, 예를 들어, 페닐알라닌, 히스티딘, 루이신, 발린, 이소루이신, 리신 또는 타이로신으로 대체될 수 있다. 서열번호 8의 Cys 잔기는, 예를 들어, 페닐알라닌(서열번호 67 참조), 히스티딘(서열번호 68 참조), 루이신(서열번호 69 참조), 발린(서열번호 70 참조), 이소루이신(서열번호 71 참조), 리신(서열번호 72 참조), 또는 타이로신(서열번호 73 참조)로 치환될 수 있다. 표 2를 참조한다.
항체는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 분자 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수있다. 예를 들어, 항체는 하기 불변 영역 서열을 갖는 IgG1 분자일 수 있다: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 140).
서열번호 140의 상기 불변 영역은 위치 234 및 235에서 야생형 불변 영역 서열의 2개의 돌연변이를 포함한다. 구체적으로, 이들 돌연변이는 위치 234 및 235 각각에서 루이신이 알라닌으로 교체된다(""lLAA" 돌연변이로 지칭된다). 상기에서 이들 돌연변이는 굵게 밑줄을 그어 나타내었다. 이들 돌연변이의 목적은 이펙터 기능을 제거시키기 위한 것이다.
달리, IgG1 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 상기 불변 영역 서열(서열번호 140)을 가질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 140의 불변 영역 서열은, 하기 표 2A에 나타나 있는 바와 같이, 아미노산 250에 돌연변이(트레오닌이 글루타민으로 대체됨)(서열번호 141)를 포함하거나, 아미노산 428에 돌연변이(메티오닌이 루이신으로 대체됨)(서열번호 142)를 포함하거나, 아미노산 250에 돌연변이(트레오닌이 글루타민으로 대체됨) 및 아미노산 428에 돌연변이(메티오닌이 루이신으로 대체됨)(서열번호 143)를 포함할 수 있다.
달리, IgG1 분자는, 하기 표 2B에 나타나 있는 바와 같이, AE12-1 (VH) CDR-H1 (서열번호 2), AE12-1 (VH) CDR-H2 (서열번호 3), AE12-1 (VH) CDR-H3 (서열번호 4)의 중쇄 및 AE12-1 (VL) CDR-L1 (서열번호 6), AE12-1 (VL) CDR-L2 (서열번호 7) 및 AE12-1-V (VL) CDR-L3 (서열번호 70)의 경쇄 및 서열번호 143의 불변 서열을 포함할 수 있다(이 항체는 AE12-1V-QL로 지칭되며, 서열번호 144의 경쇄 서열 및 서열번호 145의 중쇄 서열을 갖는다).
달리, IgG1 분자는, 하기 표 2B에 나타나 있는 바와 같이, AE12-1 (VH) CDR-H1 (서열번호 2), AE12-1 (VH) CDR-H2 (서열번호 3), AE12-1 (VH) CDR-H3 (서열번호 4)을 포함하는 중쇄 및 AE12-1 (VL) CDR-L1 (서열번호 6), AE12-1 (VL) CDR-L2 (서열번호 7) 및 AE12-1-Y (VL) CDR-L3 (서열번호 73)을 포함하는 경쇄 및 서열번호 143의 불변 서열을 포함할 수 있다(이 항체는 AE12-1Y-QL로 지칭되며, 서열번호 146의 경쇄 서열 및 서열번호 147의 중쇄 서열을 갖는다).
Figure 112014081376914-pct00009
[표 2A]
Figure 112014081376914-pct00010
[표 2B]
Figure 112014081376914-pct00011
항체 또는 항체 단편은 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-H1, H2 및 H3)을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함할 수 있다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 (서열식 1 - CDR-H1), 상기 식에서, Xaa1은 S, D, E, N, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 H, Y, L, S, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 G, D, A, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 I, M, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, N, H, A, T, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-H2), 상기 식에서, n은 0 또는 1이고, Xaa1은 Y, V, A, G, L, G, S, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 I, M, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, N, D, F, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 P, Y, G, W, H, A, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 Y, N, D, E, S, K, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, D, T, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 G, S, I, E, N, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 N, L, R, S, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 T, K, G, N, I, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 N, G, Y, T, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Y, F, N, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 A, T, V, P, L, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Q, D, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 K, S, N, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 L, F, V, K, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Q, K, R, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 글리신이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-H3), 상기 식에서, n은 0 내지 11이고, Xaa1은 V, S, E, N, L, D, Q, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, T, R, Y, L, I, D, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 G, L, Y, N, E, K, A, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 P, S, Y, A, V, G, T, E, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 Y, V, S, L, D, G, H, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu, 및 Cys로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Tyr, Lys, Asp, Ala, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Tyr, Gly, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ala, Leu, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 Met, Leu, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Asp 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 Val, Asp, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이다.
단리된 항체 또는 이의 항체 단편은 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-L1, L2 및 L3)을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - (Xaa)n (서열식 1 - CDR-L1), 상기 식에서, n은 0 내지 3이고, Xaa1은 T, S, R, G, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, D, S, N 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 S, K, G, Q, N, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, L, G, I , D, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, N, H, 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 V, D, I, S, G 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 G, K, A, S, I, N, T, 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 D, Y, A, C, S, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 S, A, G, L, V, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 I, C, Y, H, R, N, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr, Gly, Ala, 및 Val로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Val, 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-L2), 상기 식에서, n은 0 내지 4이고, Xaa1은 D, Q, G, V, Y, S 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 V, D, N, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, S, Y, N, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 K, N, D, Q 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 R, G, S, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 P, S, I, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 S, H, I, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Asn이고; Xaa9는 Lys이고; Xaa10은 Gly이고; Xaa11은 Asp이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-L3), 상기 식에서, n은 0 내지 2이고, Xaa1은 C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 S, A, T, Q, 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 Y, W, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 A, D, G, S, H 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 G, S, N, P, D, V, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 I, T, S, G, L, F 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 D, T, L, I, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 T, G, R, Y, D, N, W, L, F 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 L, V, G, T, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Val, Tyr, 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Leu 또는 Val이다.
항체 또는 항체 단편은 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-H1, H2, 및 H3)을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 또한 각각 하기 서열식들에 상응하는 3개의 상보성-결정 영역들(CDR-L1, L2, 및 L3)을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 (서열식 1 - CDR-H1), 상기 식에서, Xaa1은 S, D, E, N, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 H, Y, L, S, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 G, D, A, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 I, M, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, N, H, A, T, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-H2), 상기 식에서, n은 0 또는 1이고, Xaa1은 Y, V, A, G, L, G, S, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 I, M, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, N, D, F, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 P, Y, G, W, H, A, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 Y, N, D, E, S, K, G, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, D, T, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 G, S, I, E, N, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 N, L, R, S, T, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 T, K, G, N, I, 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 N, G, Y, T, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Y, F, N, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 A, T, V, P, L, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Q, D, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 K, S, N, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 L, F, V, K, 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Q, K, R, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 글리신이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-H3), 상기 식에서, n은 0 내지 11이고, Xaa1은 V, S, E, N, L, D, Q, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, T, R, Y, L, I, D, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 S, V, D, G, F, Y, P, M, C, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 G, L, Y, N, E, K, A, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 P, S, Y, A, V, G, T, E, 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 Y, V, S, L, D, G, H, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 Tyr, Asp, Gly, Ser, Phe, Leu, 및 Cys로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Tyr, Lys, Asp, Ala, 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 Met, Glu, Phe, Leu, Ser, Thr, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Asp, Gly, Tyr, Ser, Leu, His, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Val, Tyr, Leu, His, Gly, Trp, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Tyr, Gly, 및 Asp로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ala, Leu, Pro, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa15는 Met, Leu, 및 Phe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa16은 Asp 및 Gly로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa17은 Val, Asp, 및 Tyr로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - (Xaa)n (서열식 1 - CDR-L1), 상기 식에서, n은 0 내지 3이고, Xaa1은 T, S, R, G, 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 G, L, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, D, S, N 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 S, K, G, Q, N, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 S, L, G, I , D, 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 S, G, N, H, 및 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 V, D, I, S, G 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 G, K, A, S, I, N, T, 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 D, Y, A, C, S, 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 S, A, G, L, V, 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 I, C, Y, H, R, N, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa12는 Tyr, Gly, Ala, 및 Val로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa13은 Val, 및 Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa14는 Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - (Xaa)n (서열식 2 - CDR-L2), 상기 식에서, n은 0 내지 4이고, Xaa1은 D, Q, G, V, Y, S 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 V, D, N, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 T, S, Y, N, 및 K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 K, N, D, Q 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 R, G, S, 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 P, S, I, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 S, H, I, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 Asn이고; Xaa9는 Lys이고; Xaa10은 Gly이고; Xaa11은 Asp이고;
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - (Xaa)n (서열식 3 - CDR-L3), 상기 식에서, n은 0 내지 2이고, Xaa1은 C, Q, H, F, H, L, V, I, K, Y, 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa2는 S, A, T, Q, 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa3은 Y, W, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa4는 A, D, G, S, H 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa5는 G, S, N, P, D, V, 및 T로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa6은 I, T, S, G, L, F 및 Y로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa7은 D, T, L, I, P, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa8은 T, G, R, Y, D, N, W, L, F 및 P로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa9는 L, V, G, T, 및 H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa10은 Val, Tyr, 및 His로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산이고; Xaa11은 Leu 또는 Val이다.
서열식 1 - CDR-L1에서, n이 1인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12.
서열식 1 - CDR-L1에서, n이 2인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13.
서열식 1 - CDR-L1에서, n이 3인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14.
서열식 2 - CDR-L2에서, n이 1인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8.
서열식 2 - CDR-L2에서, n이 2인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9.
서열식 2 - CDR-L2에서, n이 3인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10.
서열식 2 - CDR-L2에서, n이 4인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11.
서열식 3 - CDR-L3에서, n이 1인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10.
서열식 3 - CDR-L3에서, n이 2인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11.
서열식 2 - CDR-H2에서, n이 1인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16 - Xaa17.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 1인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 2인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 3인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 4인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 5인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 6인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 7인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 8인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 9인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 10인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16.
서열식 3 - CDR-H3에서, n이 11인 경우, 서열식은 하기와 같을 것이다:
Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15- Xaa16 - Xaa17.
c. 항체 제조/생산
항체는 다양한 기술 중 임의의 것으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 항체는 통상의 기술을 통한 모노클로날 항체의 생성을 포함하는 세포 배양 기술에 의하거나, 재조합적일 수 있는 항체를 생성하도록 항체 유전자, 중쇄 및/또는 경쇄를 적합한 세균 또는 포유동물 세포 숙주로 트랜스펙션하는 것을 통해 생성될 수 있다. 용어 "트랜스펙션"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하는데 일반적으로 이용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천동, 이산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포함하고자 한다. 비록 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현할 수 있으나, 진핵 세포(및 특히 포유동물 세포)가 원핵 세포보다 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 좀더 잘 어셈블링하고 분비할 것 같으므로, 진핵세포에서의 항체 발현이 바람직하고, 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포){문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에서 기술되고, 예를 들어, 문헌 [Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)]에서 기술되는 바와 같이 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는 dhfr-CHO 세포를 포함}, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 가능하게 하거나 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 작용성 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. 상기 절차에 대한 변형이 본 발명의 범위에 속한다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 작용성 단편을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 이용하여 관심 항원에 대한 결합에 필요하지 않는 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현되는 분자도 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄는 본 발명의 항체(즉, 사람 RGMa에 결합되는 항체)이고 다른 중쇄 및 경쇄는 사람 RGMa와 다른 항원에 특이적인 이작용성 항체를 표준 화학 가교결합 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2 항체에 가교결합시킴으로서 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개된 트랜스펙션에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 유전자의 고수준 전사를 유도하기 위해 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 각각 작동적으로 연결된다. 또한, 재조합 발현 벡터는 메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포의 선별을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 갖는다. 선별된 형질전환 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현이 가능하도록 배양되고, 온전한 항체가 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 트랜스펙션시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하며, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적합한 배양 배지에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하는 방법은 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생성할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는 면역화된 동물로부터 수득되는 비장 세포로부터 생성될 수 있다. 동물은 RGMa 또는 이의 단편 및/또는 변이체로 면역화될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 74, 또는 서열번호 65, 서열번호 66 및 서열번호 74의 단편, 또는 서열번호 65, 서열번호 66 또는 서열번호 74의 변이체 중 임의의 것이 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있다. 동물을 면역화시키는데 사용되는 펩타이드는 사람 Fc, 예를 들어, 사람 항체의 결정화가능한 영역 또는 테일 영역 단편을 포함할 수 있다. 이어서, 비장 세포는, 예를 들어, 골수종 세포 융합 파트너와의 융합으로 불멸화될 수 있다. 다양한 융합 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 비장 세포 및 골수종 세포는 수분 동안 비이온성 세제와 배합된 후, 하이브리드 세포의 성장을 지지하난 골수종 세포의 성장은 지지하지 않는 선별 배지 상에 저밀도로 플레이팅할 수 있다. 하나의 이러한 기술은 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘(HAT) 선별을 이용한다. 충분한 시간, 보통 약 1 내지 2주 후, 하이브리드 콜로니가 관측된다. 단일 콜로니를 선별하고 이들의 배양 상등액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 고반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마를 사용할 수 있다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 분리될 수 있다. 또한, 다양한 기술, 예를 들어, 하이브리도마 세포를 적합한 숙주, 예를 들어, 마우스의 복강에 주사하는 기술을 이용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 이어서, 모노클로날 항체는 복수 또는 혈액으로부터 수거될 수 있다. 오염물은 통상의 기술, 예를 들어, 크로마토그래피, 겔 여과, 침전, 및 추출에 의해 항체로부터 제거될 수 있다. 친화성 크로마토그래피가 항체를 정제하기 위한 방법에 이용될 수 있는 방법에 대한 예이다.
단백분해 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여, 2개의 단편(F(ab) 단편) 각각이 온전한 항원-부위를 포함하는 공유적 헤테로이량체를 포함하는, 수개의 단편을 생성한다. 효소 파파인은, 항원-결합 부위 둘 다를 포함하는, F(ab')2 단편을 포함하는 수개의 단편을 제공하도록 IgG 분자를 절단할 수 있다.
Fv 단편은 IgM 및 드물게는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 우선적 단백분해적 절단에 의해 생성될 수 있다. Fv 단편은 재조합 기술을 이용하여 유도될 수 있다. Fv 단편은, 천연 항체 분자의 항원 인식 및 결합 능력의 많은 것을 보유하는 항원-결합 부위를 포함한, 비-공유적 VH::VL 이종이량체를 포함한다.
항체, 항체 단편 또는 유도체는, 상보성 결정 영역("CDR")들을 지탱하고 CDR들 서로에 대한 CDR들의 공간적 상호관계를 규정하는 중쇄 프레임워크("FR")와 경쇄 프레임워크("FR") 사이에 각각 삽입되는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 세트를 포함할 수 있다. 상기 CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 과가변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 진행하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"로 표시된다. 따라서, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다. 단일 CDR(예: CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩타이드는 "분자 인식 단위"로 지칭될 수 있다. 항원-항체 컴플렉스의 결정학적 분석은, CDR의 아미노산 잔기들이, 결합된 항원과의 집중적인 접촉을 형성하고, 가장 집중적인 항원 접촉은 중쇄 CDR3에 의해 이루어진다는 것을 입증하였다. 따라서, 분자 인식 단위들이 항원-결합 부위의 특이성에 일차적으로 책임이 있다. 일반적으로, CDR 잔기들은, 항원 결합에 영향을 끼치는데 있어 직접적이고 가장 실질적으로 관계된다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, 다양한 시판사, 예를 들어, 캠브리지 항체 테크놀로지스(Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, UK), 모르포시스(MorphoSys, Martinsreid/Planegg, Del.), 바이오베이션(Biovation , Aberdeen, Scotland, UK), 바이오인벤트(BioInvent, Lund, Sweden)로부터 입수가능한, 펩타이드 또는 단백질 라이브러리리(예: 이로 제한됨이 없이, 박테리오파지, 리보좀, 올리고뉴클레오타이드, RNA, cDNA, 효모 등의 디스플레이 라이브러리)로부터의 재조합 항체를 선별하는 방법을 포함하고 이에 제한되지 않는 방법을 포함한, 필수적인 특이성을 갖는 항체를 생성 또는 분리하는 다른 적합한 방법이 이용될 수 있다 [참조: U.S. Pat. Nos. 4,704,692; 5,723,323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862]. 다른 방법은, 당업계에 공지되고/되거나 본원에서 기술되는 바와 같이, 사람 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예: SCID 마우스)의 면역화에 의존한다 [참조: Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161]. 이러한 기술은, 이로 제한됨이 없이, 리보좀 디스플레이 [Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135]; 단일 세포 항체 생성 기술(예: 선별된 림프구 항체 방법("SLAM") [U.S. Pat. No. 5,627,052, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]; 겔 마이크로드로플릿(microdroplet) 및 유동 세포계측 [Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337]; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787-790]; B-세포 선별 [Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)]을 포함한다.
친화성 성숙된 항체는 당업계에 공지된 다수의 절차 중 임의의 것으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙을 기술한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]에 기술되어 있다. 활성 증진 아미노산 잔기를 사용하는 선별적 돌연변이유발 위치 및 접촉 또는 과변이 위치에서의 선별적 돌연변이가 미국 특허 번호 6,914,128 B1에 기술되어 있다.
또한, 본 발명의 항체 변이체는 우유 중에 본 발명의 항체를 생성하는 트랜스제닉 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 염소, 소, 말, 양 등을 제공하도록 적합한 숙주에 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전달함으로써 제조될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되고, 예를 들어, 문헌 [U.S. Pat. Nos. 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; and 5,304,489]에 기술되어 있다.
또한, 항체 변이체는 식물부 또는 이로부터 배양된 세포에서 본 발명의 항체, 특정 부분 또는 변이체를 생성하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포(예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 담배, 옥수수 및 개구리밥)를 제공하도록 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 전달함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 및 이에 인용된 참조문]은, 예를 들어, 유도성 프로모터를 사용하여 다량의 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담배잎의 생성을 기술한다. 트랜스제닉 옥수수가 다른 재조합 시스템에서 생성되거나 천연 공급원으로부터 정제되는 것과 동등한 생물학적 활성을 갖는 포유동물 단백질을 시판 생성 수준으로 발현하는데 사용되어 왔다 [참조: 예를 들어, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147 및 이에 인용된 참조문]. 또한, 항체 단편, 예를 들어, 단일쇄 항체(scFv's)를 포함하는 항체 변이체가 담배 종자 및 감자 괴경을 포함한 트랜스제닉 식물 종자로부터 다량으로 생성되었다 [참조: 예를 들어, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 및 이에 인용된 참조문]. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지된 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 이용하여 생성될 수 있다.
항체 유도체는, 예를 들어, 면역원성을 변형시키거나 결합, 친화성, 온-레이트, 오프-레이트, 결합활성, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 증진 또는 변형시키기 위해 외인성 서열을 첨가함으로서 생성될 수 있다. 일반적으로, 가변 및 불변 영역의 비-사람 서열을 사람 또는 다른 아미노산으로 대체시키면서 비-사람 또는 사람 CDR 서열의 일부 또는 전부를 유지시킨다.
작은 항체 단편은, 단편이 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH VL) 중의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 디아바디일 수 있다 [참조: 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인이 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 문헌 [Chen 등의 미국 특허 번호 6,632,926, 본원에 전부 인용에 의해 포함됨]은 모 항체의 초가변 영역에 삽입되는 하나 이상의 아미노산 및 항원에 대한 모 항체의 결합 친화성보다 약 2배 이상 강력한 표적 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 항체 변이체를 기술한다.
항체는 선형 항체일 수 있다. 선형 항체를 제조하는 절차는 당업계에 공지되어 있고 문헌 [Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기술되어 있다. 간단히, 이들 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 세로로 연결된 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이특이적 또는 다특이적일 수 있다.
항체는, 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하고 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제에 이용될 수 있다.
이는 항체를 검출가능하게 또는 치료학적으로 표지하는데 유용할 수 있다. 항체를 이들 제제에 컨주게이션하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 단지 설명의 목적상, 항체는 방사성 원자, 발색단, 형광단 등과 같은 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 생체내에서 또는 분리된 시험 샘플 중에서의 진단 기술에 이용될 수 있다. 또한, 항체는, 예를 들어, 화학치료 약물 또는 독소와 같은 약제학적 제제에 컨주게이션될 수 있다. 이들은 사이토킨, 리간드 또는 또 다른 항체에 연결될 수 있다. 항-종양 효과를 달성하기 위해 항체에 커플링기 하기 위한 적합한 제제는 사이토킨, 예를 들어, 인터루킨 2(IL-2) 및 종양 괴사 인자(TNF); 광역학 치료에 사용하기 위한 알루미늄(III) 프탈로시아닌 테트라설포네이트, 헤마토포피린 및 프탈로시아닌를 포함한 감광제; 방사성핵종, 예를 들어, 요오드-131(131I), 이트륨-90(90Y), 비스무트-212(212Bi), 비스무트-213(213Bi), 테트네튬-99m(99mTc), 레늄-186(186Re), 및 레늄-188(188Re); 항생제, 예를 들어, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 다우노마이신, 네오카르지노스타틴 및 카보플라틴; 세균, 식물 및 다른 독소, 예를 들어, 디프테리아 독소, 슈도모나즈 엑소톡신 A, 스타필로코쿠스 엔테로톡신 A, 아브린-A 독소, 리신 A(탈당화된 리신 A 및 언연 리신 A), TGF-알파 독소, 차이니즈 코브라(나자 나자 아트라) 및 겔로닌(식물 독소); 식물, 세균 및 진균으로부터의 리보좀 불활성화 단백질, 예를 들어, 레스트릭토신(아스퍼질루스 레스트릭투스에 의해 생성되는 리보좀 불활성화 단백질), 사포린(사포나리아 오피시날리스로부터의 리보좀 불활성화 단백질), 및 RNase; 타이로신 키나제 억제제; ly207702(이플루오로화된 퓨린 뉴클레오사이드); 항 낭성 제제(anti cystic agent)(예: 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 독소를 암호화하는 플라스미드, 메토트렉세이트 등)을 포함하는 리포좀; 및 다른 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, as F(ab)를 포함한다.
항체는 서열분석되고 재조합 또는 합성적 수단으로 복제될 수 있다. 또한, 항체는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드의 선형 서열로 추가로 서열분석될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 항체의 서열을 암호화하는, 이들 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 제공하거나 상기에서 기술되는 바와 같은 캐리어, 벡터 또는 숙주세포와 함께 제공한다.
하이브리도마 기술, 선택된 림프구 항체 방법(SLAM), 트랜스제닉 동물 및 제조합 항체 라이브러리를 이용한 항체 생성이 하기에서 더욱 상세히 기술된다.
(1) 하이브리도마 기술을 이용한 항-RGMa 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이의 조합을 포함한 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되고, 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antobodies: A Laboratory Manual, second edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981)]에서 교시되는 기술을 포함한 하이브리도마 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성되는 항체로 제한되지 않는다는 것에 주목한다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵세포, 원핵세포 또는 파지 크론을 포함한 단일 클론으로부터 유도되는 항체를 지칭하며, 하이브리도마 항체가 생성되는 방법을 지칭하는 것은 아니다.
한 실시형태에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생성하는 방법 및 이 방법에 의해 생성되는 항체를 제공한다. 이 방법은 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포, 바람직하게는 RGMa로 면역화된 동물, 예를 들어, 래트 또는 마우스로부터 분리되는 비장 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 생성되는 하이브리도마를 배양한 후, 융합으로부터 생성되는 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 간단히, 래트가 RGMa 항원으로 면역화될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, RGMa 항원이 면역 반응을 자극하기 위해 애주번트와 함께 투여된다. 이러한 애주번트는 완전 또는 불완전 프로인트 애주번트, RIBI(무라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역자극 컴플렉스)를 포함한다. 이러한 애주번트는 폴리펩타이드를 국소 침전물로 격리시킴으로써 폴리펩타이드가 빠르게 분산되는 것을 방지하거나, 대식구 및 면역계의 다른 성분에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드가 투여되는 경우, 면역화 스케쥴은 수주에 걸쳐 2회 이상의 폴리펩타이드 투여를 포함할 것이나, 폴리펩타이드의 단일 투여도 이용될 수 있다.
RGMa 항원으로의 동물 면역화 후, 항체 및/또는 항원-생성 세포가 동물로부터 수득될 수 있다. 항-RGMa 항체-포함 혈청은 동물을 출혈시키거나 동물을 희생시킴으로써 수득된다. 혈청은 동물로부터 수득되는 데로 사용되거나, 면역글로불린 분획은 혈청으로부터 수득되거나, 항-RGMa 항체는 혈청으로부터 정제될 수 있다. 이러한 방식으로 수득되는 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이므로, 혼성적 특성 배열을 갖는다.
일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원 RGMa에 대해 특이적인 항체가 래트 혈청에서 검출되고, 래트 비장이 수거되며, 비장 세포가 분리된다. 이어서, 비장 세포는 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어, ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, Va., US)로부터 입수가능한 세포주 SP20으로부터의 세포에 널리-공지된 기술로 융합된다. 하이브리도마는 제한 희석으로 선별되고 클로닝된다. 이어서, 하이브리도마 클론은 RGMa에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당업계에 공지된 방법으로 검정된다. 래트를 포지티브 하이브리도마 클론으로 면역화시킴으로써 일반적으로 고수준의 항체를 포함하는 복수가 생성될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 항체-생성 불멸화된 하이브리도마가 면역화된 동물로부터 제조될 수 있다. 면역화 후, 동물은 희생되며, 비장 B 세포는 당업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이 불멸화된 골수종 세포에 융합된다 [참조: Harlow and Lane, supra]. 바람직한 실시형태에서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드를 분비하지 않는다(비-분비성 세포주). 융합 및 항생제 선별 후, 하이브리도마는 RGMa 또는 이의 부분 또는 RGMa 발현 세포를 사용하여 스크리닝된다. 바람직한 실시형태에서, 초기 스크리닝은 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA) 또는 방사성면역검정(RIA), 바람직하게는 ELISA를 이용하여 수행된다. ELISA 스크리닝의 예가 PCT 공개 번호 WO 00/37504에 제공된다.
항-RGMa 항체-생성 하이브리도마가 하기에서 더욱 논의되는 바와 같이, 선별되고, 클로닝되며, 왕성한 하이브리도마 성장, 높은 항체 생성 및 목적하는 항체 특성을 포함한 바람직한 특성에 대해 추가로 스크리닝된다. 하이브리도마는 동계의 동물에서 생체내에서 배양 및 증식되거나, 면역계가 결여된 동물, 예를 들어, 누드 마우스에서 배양 및 증식되거나, 세포 배양으로 시험관내에서 배양 및 증식될 수 있다. 하이브리도마의 선별, 클로닝 및 증식 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
바람직한 실시형태에서, 하이브리도마는 래트 하이브리도마이다. 또 다른 실시형태에서, 하이브리도마는 비-사람, 비-래트 종, 예를 들어, 마우스, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말에서 생성된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마이며, 사람 비-분비성 골수종이 항-RGMa 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(2개의 동일한 Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백분해 절단으로 생성될 수 있다. IgG 분자의 F(ab')2 단편은, 모 IgG 분자의 경쇄 모두(가변 경쇄 및 불변 경쇄 영역을 포함), 중쇄의 CH1 도메인 및 디설파이드-형성 힌지 영역을 포함한, 큰("모") IgG 분자의 2개의 항원-결합 부위를 보유한다. 따라서, F(ab')2 단편은 모 IgG 분자와 같이 여전히 항원 분자를 가교결합할 수 있다.
(2) SLAM을 이용한 항-RGMa 모노클로날 항체
본 발명의 또 다른 양상에서, 재조합 항체는, 문헌 [참조:U.S. Pat. No. 5,627,052; PCT Publication No. WO 92/02551; and Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996)]에 기술되는 바와 같이, 단일의 분리된 림프구로부터 당업계에서 선별된 림프구 항체 방법(SLAM)으로 지칭되는 절차를 이용하여 생성된다. 이러한 방법에서, 관심 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들어, 면역화된 동물 중 임의의 동물로부터 유도되는 림프구는 항원-특이적 용혈성 플라크 검정을 이용하여 스크리닝되며, 이 검정에서 항원 RGMa, 이의 서브유니트 또는 이의 단편은 비오틴과 같은 링커를 사용하여 양의 적혈구에 커플링되고 RGMa에 대해 특이성을 갖는 항체를 분비하는 단일 세포를 확인하는데 사용된다. 관심의 항체-분비 세포 확인 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA는 역전사효소-PCR(RT-PCR)에 의해 상기 세포로부터 구조되고, 이어서 이들 가변 영역은, 적합한 면역글로불린 불변 영역(예: 사람 불변 영역)과 관련하여, 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, COS 또는 CHO 세포에서 발현될 수 있다. 이어서, 생체내 선별된 림프구로부터 유도되는 증폭된 면역글로불린 서열로 트랜스펙션된 숙주 세포는, 예를 들어, RGMa에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리하기 위해 트랜스펙션된 세포를 패닝함으로써 더욱 분석되고 시험관내에서 선별될 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은, 예를 들어, 시험관내 친화성 성숙 방법에 의해 시험관내에서 더욱 조작될 수 있다 [참조: 예를 들어, CT Publication No. WO 97/29131 and PCT Publication No. WO 00/56772].
(3) 트랜스제닉 동물을 이용한 항-RGMa 모노클로날 항체
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체는 사람 면역글로불린 유전자자리의 일부 또는 전체를 포함하는 비-사람 동물을 RGMa 항원으로 면역화시킴으로써 생성된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 사람 면역글로불린 유전자의 커다란 단편을 포함하고 마우스 항체 생성이 결핍된 조작된 마우스 스트레인인 XENOMOUSE®이다 [참조: 예를 들어, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) and U.S. Pat. Nos. 5,916,771; 5,939,598; 5,985,615; 5,998,209; 6,075,181; 6,091,001; 6,114,598; 6,130,364; PCT Publication Nos. WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; and WO 00/37504]. XENOMOUSE® 트랜스제닉 마우스는 완전 사람 항체의 성인-유사 사람 레퍼토리를 생성하고, 항원-특이적 사람 모노클로날 항체를 생성한다. XENOMOUSE® 트랜스제닉 마우스는 사람 중쇄 유전자자리 및 x 경쇄 유전자 자리의 메가염기 크기의 생식선 배열 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 약 80%를 포함한다 [참조: Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998), 이의 기술이 본원에 참조로 삽입됨].
(4) 재조합 항체 라이브러리를 이용한 항-RGMa 모노클로날 항체
또한, 목적하는 RGMa-결합 특이성을 갖는 항체를 확인하기위해 항체 라이브러리를 스크리닝하는 시험관내 방법이 본 발명의 항체를 생성하는데 이용될 수 있다. 재조합 항체 라이브러리에 대한 이러한 스크리닝 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 하기에 기술된 방법을 포함한다: U.S. Pat. No. 5,223,409 (Ladner et al.); PCT Publication No. WO 92/18619 (Kang et al.); PCT Publication No. WO 91/17271 (Dower et al.); PCT Publication No. WO 92/20791 (Winter et al.); PCT Publication No. WO 92/15679 (Markland et al.); PCT Publication No. WO 93/01288 (Breitling et al.); PCT Publication No. WO 92/01047 (McCafferty et al.); PCT Publication No. WO 92/09690 (Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); US Patent Application Publication No. 2003/0186374; and PCT Publication No. WO 97/29131(이들 각각의 내용이 본원에 인용에 의해 포함됨).
재조합 항체 라이브러리는 RGMa 또는 RGMA이 부분으로 면역화된 피험자로부터의 것일 수 있다. 달리, 재조합 항체 라이브러니는 나이브 피험자, 즉 RGMa로 면역화되지 않은 피험자로부터의 라이브러리, 예를 들어, 사람 RGMa로 면역화되지 않은 사람 피험자로부터의 사람 항체 라이브러리일 수 있다. 본 발명의 항체는 사람 RGMa를 포함하는 펩타이드로 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 RGMa를 인식하는 항체를 선별함으로써 선택될 수 있다. 이러한 스크리닝 및 선별을 수행하는 방법이 앞선 단락에서의 참조문에서 기술되는 바와 같이 당업계에 널리 알려져 있다. RGMa 대해 특정한 결합 친화성을 갖는 본 발명의 항체, 예를 들어, 특정한 Koff 속도 상수로 사람 RGMa로부터 해리하는 항체를 선별하기위해, 표면 플라즈몬 공명의 당업계에 공지된 방법을 이용하여 목적하는 Koff 속도 상수를 갖는 항체를 선별할 수 있다. hRGMa에 대해 특정한 중화 활성을 갖는 본 발명의 항체, 예를 들어, 특정한 IC50을 갖는 항체를 선별하기 위해, RGMa 활성 억제를 평가하기 위한 당업계에 공지된 표준 방법이 이용될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 사람 RGMa에 결합되는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합부에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체는 중화 항체이다. 다양한 실시형태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 작용성 항체 도메인이 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 이러한 파지는 레퍼토리 또는 조합적 항체 라이브러리(예: 사람 또는 뮤린)로부터 발현되는 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용될 수 있다. 목적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원을 사용하여, 예를 들어, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 캡쳐된 항원을 사용하여 선별되거나 확인될 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파지는 전형적으로, 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인과 함께 파지로부터 발현되는 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트성 파지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌 [Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); PCT Publication No. WO 92/01047; PCT Publication Nos. WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and U.S. Pat. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; and 5,969,108]에 기술된 것들을 포함한다.
상기 참조문에서 기술되는 바와 같이, 파지 선별 후, 파이지로부터 항체 암호화 영역이 분리되고 사람 항체 또는 임의의 목적하는 항원 결합 단편을 포함한 전체 항체를 생성하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함한 임의의 바람직한 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); and Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988)]에 기술되어 있는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하는 기술도 이용될 수 있다. 단일쇄 Fvs 및 항체를 생성하는데 이용될 수 있는 기술의 예는 문헌 [U.S. Pat. Nos. 4,946,778 and 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988)]에 기술되어 있는 것들을 포함한다.
파지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 다른 스크리닝 방법, 커다란 조합적 라이브러리를 스크리닝하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법이 본 발명의 항체를 확인하는데 적용될 수 있다. 일 유형의 다른 발현 시스템이 문헌 [PCT Publication No. WO 98/31700 (Szostak and Roberts), and Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997)]에서 기술되는 바와 같이 RNA-단백질 융합물로서 발현된다. 이러한 시스템에서, 공유적 융합물이 mRNA와 펩타이드 또는 단백질 사이에서 3' 말단에 펩타이드 수용체 항생제인 푸로마이신을 갖는 합성적 mRNA의 시험관내 해독에 의해 생성된다. 따라서, 특정 mRNA가 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 부분의 특성, 예를 들어, 항체 또는 이의 부분의 이중 특이성 항원에 대한 결합에 기초하여 mRNA의 컴플렉스 혼합물(예: 조합적 라이블러리)로부터 농축될 수 있다. 이러한 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수되는 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 서열은 상기 기술되는 바와 같은 재조합적 수단에 의해(예: 포유동물 숙주 세포에서) 발현될 수 있으며, 또한 최초에 선택된 서열(들)에 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합물의 추가 라운드의 스크리닝에 의해 또는 상기 기술되는 바와 같은, 재조합 항체의 시험관내에서의 친화성 성숙을 위한 다른 방법에 의해 추가로 친화성 성숙하게 될 수 있다. 이러한 방법의 바람직한 예가 PROfuson 디스플레이 기술이다.
또 다른 접근으로, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전적 방법이 항체 도메인을 효모 세포벽에 테더링하고 이를 효모의 표면에 디스플레이하는데 이용된다. 특히, 이러한 효모는 레퍼토리 또는 조합적 항체 라이브러리(예: 사람 또는 뮤린)로부터 발현되는 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항체를 생성하는데 이용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 번호 6,699,658(Wittrup 등)에 기술되어 있는 것을 포함한다.
d. 재조합 RGMa 항체의 생산
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다수의 기술 중 임의의 기술에 의해 생성될 수있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)이 표준 기술로 숙주 세포로 트랜스펙션되는, 숙주 세포로부터의 발현을 이용한다. 용어 "트랜스펙션"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하는데 일반적으로 이용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포함하고자 한다. 비록 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현할 수 있으나, 진핵 세포(및 특히 포유동물 세포)가 원핵 세포보다 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 좀더 잘 어셈블링하고 분비할 것 같으므로, 진핵세포에서의 항체 발현이 바람직하고, 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포) {문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에서 기술되고, 예를 들어, 문헌 [Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)]에서 기술되는 바와 같이 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는 dhfr-CHO 세포를 포함}, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 가능하게 하거나 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 작용성 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. 상기 절차에 대한 변형이 본 발명의 범위에 속한다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 작용성 단편을 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 이용하여 관심 항원에 대한 결합에 필요하지 않는 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현되는 분자도 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄는 본 발명의 항체(즉, 사람 RGMa에 결합되는 항체)이고 다른 중쇄 및 경쇄는 사람 RGMa와 다른 항원에 특이적인 이작용성 항체를 표준 화학 가교결합 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2 항체에 가교결합시킴으로서 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개된 트랜스펙션에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 유전자의 고수준 전사를 유도하기 위해 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 각각 작동적으로 연결된다. 또한, 재조합 발현 벡터는 메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 벡터로 트랜스펙션된 CHO 세포의 선별을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 갖는다. 선별된 형질전환 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현이 가능하도록 배양되고, 온전한 항체가 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 트랜스펙션시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하며, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적합한 배양 배지에서 배양함으로써 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
(a) 사람화된 항체
사람화된 항체는, 사람 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 비-사람 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 관심 항원에 면역특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 동족체 또는 부분일 수 있다. 사람화된 항체는 비-사람 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 및 사람 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖고 목적하는 항체에 결합하는 비-사람 종의 항체로부터의 것일 수 있다.
CDR과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다. 사람화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-사람 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 것에 상응하는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 모두를 실질적으로 포함한다. 한 실시형태에서, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 사람 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 경쇄만을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 중쇄만을 포함한다. 특정 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 포함한다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA, 및 IgE, 및 이소타입(제한 없이, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4을 포함)을 포함한 임의의 클래스의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 하나 초과의 클래스 또는 이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 특정 불변 도메인은 당업계에 널리-알려진 기술을 이용하여 목적하는 이펙터 기능을 최적화하도록 선택될 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 영역 및 CDR은 모 서열과 정확히 상응할 필요는 없으며, 예를 들어, 공여 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 그 자리에서 CDR 또는 프레임워크 잔기가 공여 항체 또는 컨센서스 프레임워크와 상응하지 않게 될 수 있다. 그러나, 한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 통상적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 및 적어도 99%가 모 FR 및 CDR 서열의 것에 상응할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크 영역을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련된 면역글로불린 서열의 패밀리에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성되는 서열을 지칭한다 [참조: 예를 들어, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)]. 일 패밀리의 면역글로불린에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 그 패밀리 내의 그 위치에서 가장 빈번히 발생하는 아미노산에 의해 차지된다. 2개의 아미노산이 동일한 빈도로 나타나는 경우, 어떠한 것도 컨센서스 서열 내에 포함될 수 있다.
사람화된 항체는, 사람 수령자에서 항체 모이어티의 치료적 적용 기간 및 효과를 제한하는, 설치류 항-사람 항체에 대한 원치 않는 면역학적 반응을 최소화하도록 고안될 수 있다. 사람화된 항체는 비-사람인 공급원으로부터 이에 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-사람 잔기는 종종 "이입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 통상적으로 가변 도메인으로부터 취해진다. 사람화는 사람 항체의 상응하는 서열을 과가변 영역 서열로 대체시킴으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "사람화된" 항체는 결코 온전하지 못한 사람 가변 도메인이 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열로 대체되는 키메라 항체이다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567(이의 내용이 본원에 인용에 의해 포함됨)을 참조한다. 사람화된 항체는 일부 과가변 영역 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 위치로부터의 잔기로 대체되는 사람 항체일 수 있다. 본 발명의 항체의 사람화 또는 조작은 문헌 [U.S. Pat. Nos. 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; and 4,816,567]에 기술되고 이로 제한되지 않는 임의의 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
사람화된 항체는 RGMa에 대한 고친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유할 수 있다. 사람화된 항체는 모 서열및 사람화되 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 사람화된 생성물을 분석하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원적 면역글로불린 모델은 일반적으로 입수가능하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원적 입체 구조를 도해하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 작용시 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린의 항원 결합 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 모적하는 항체의 특성, 예를 들어, RGMa에 대해 증가된 친화성이 달성되도록 수령 및 이입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 과가변 영역 잔기가 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 포함될 수 있다.
사람화에 대한 다른 실시형태로, 사람 항체(본원에서 "완전 사람 항체"로도 지칭됨)가 생성될 수 있다. 예를 들어, PROfusion 및/또는 효모 관련 기술을 통해 라이브러리로부터 사람 항체를 분리할 수 있다. 하기에서 제공되는 실시예를 참조한다. 또한, 트랜스제닉 동물(예를 들어, 면역화시, 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 사람 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 마우스)을 생성할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생성을 완전히 억제시킨다. 이러한 생식선 돌연변이 마우스에 사람 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지시 사람 항체를 생성할 것이다. 사람화된 또는 완전 사람 항체는 문헌 [U.S. Patent Nos. 5,770,429; 5,833,985; 5,837,243; 5,922,845; 6,017,517; 6,096,311; 6,111,166; 6,270,765; 6,303,755; 6,365,116; 6,410,690; 6,682,928; and 6,984,720, 이들 각각의 내용이 참조로 본원에 포함됨]에 기술되는 방법에 따라 제조될 수 있다.
3. 약제학적 조성물
항체는 약제학적 조성물 중의 성분일 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 장애를 진단, 검출 또는 모니터링하고/하거나, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 호전시키고/시키거나, 연구하는데 사용되며, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체 및 표적화된 RGMa 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 본 발명의 항체 이외의 다른 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 호전시키는데 유용한 것으로 공지되거나, 사용되어 왔거나, 또는 현재 사용되고 있는 것이 바람직하다. 이들 실시형태에 따라, 조성물은 추가로 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 피험자에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상 뿐만 아니라 이의 배합물을 포함한다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체의 저장 수명 또는 효과를 증가시키는 습윤제, 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량으로 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술되는 바와 같은 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 하나 이상의 항체와 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 호전시키는데 유용한 예방제 또는 치료제의 배합물을 투여하는데 사용될 수 있으며, 그 예로는 리포좀으로의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내이입 [참조: 예를 들어, Wu and Wu, J.Biol.Chem. 262: 4429-4432(1987)], 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등이 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예: 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여(예: 비강내 및 구강 경로)를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 또한, 폐 투여는, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 에어로졸화제를 사용한 제형으로 수행될 수 있다 [참조: 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; and 4,880,078; and PCT Publication Nos. WO 92/19244; WO97/32572; WO97/44013; WO98/31346; and WO99/66903, 이들 각각이 전부 참조로 본원에 포함됨]. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체, 병용 요법제 또는 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용하여 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 예방제 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구, 비강내, 폐 또는 피하 투여된다. 예방제 또는 치료제는, 임의의 통상의 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사로, 상피 또는 점막피부 라이닝(예: 구강 점막, 직장, 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 치료를 요하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는, 예를 들어, 국소 주입, 주사, 또는 이식체에 의해 달성될 수 있고 이에 제한되지 않으며, 상기 이식체는 다공성 또는 비다공성 물질로서, 막 및 매트릭스, 예를 들어, 시알라스틱(sialastic) 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예: Tisseel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체의 유효량은 장애 또는 이의 증상의 예방, 치료, 관리 및/또는 호전을 위해 피험자의 환부에 국소적으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체의 유효량은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 및/또는 호전을 위해 피험자에게 본 발명의 항체 이외의 하나 이상의 요법제(예: 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 병용하여 환부에 국소적으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 항체는 조절 방출 또는 지속 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시형태에서, 펌프를 사용하여 조절 또는 지속 방출을 달성할 수 있다 [참조: Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574]. 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질을 사용하여 본 발명의 요법제의 조절 또는 지속 방출을 달성할 수 있다 [참조: 예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. No. 5,679,377; U.S. Pat. No. 5,916,597; U. S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; PCT Publication No. WO99/15154; and PCT Publication No. WO99/20253]. 지속 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리안하이드라이드, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 지속 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고 침출성 불순물이 없으며, 보관 시 안정하고, 멸균성이고, 생체분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 조절 또는 지속 방출 시스템은 예방 또는 치료 표적물 가까이에 위치되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다 [참조: 예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)].
조절 방출 시스템은 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533]의 검토에서 논의된다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 지속 방속 제형을 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [U. S. Pat. No. 4,526, 938, PCT publication WO91/05548, PCT publication WO96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760, 이들 각각이 전부 본원에 인용에 의해 포함됨]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물이 항체를 암호화하는 핵산인 경우, 핵산은 이를 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 이용하거나 [참조: U. S. Pat. No. 4,980,286], 직접 주사하거나, 마이크로입자 충격(예: 유전자 총; Biolistic, Dupont)을 이용하거나, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅을 이용하거나, 핵에 유입되는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩타이드에 연결시켜 투여하여 세포내에 있도록 함으로써, 생체내 투여하여 암호화된 항체의 발현을 촉진할 수 있다 [참조: 예를 들어, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868]. 달리, 핵산은 세포내로 도입된 뒤, 상동성 재조합에 의해 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 삽입될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하게 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비강내(예: 흡입), 경피(예: 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물은 통상의 절차에 따라 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 국소 투여에 적합한 약제학적 조성물로 제형화된다. 일반적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 경감시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 국소 투여되는 경우, 조성물은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 젤, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼 또는 당업자에게 공지된 다른 형태로 제형화될 수 있다 [참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.]. 분무할 수 없는 국소 투약 형태의 경우, 국소 투여에 적합한 하나 이상의 부형제 또는 담체를 포함하고 물보다 큰 동적 점도를 갖는 점성 내지 반-고체 또는 고체 형태가 전형적으로 사용된다. 적당한 제형은 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 도찰제(liniment), 고약 등을 포함하고 이에 제한되지 않으며, 필요한 경우, 멸균되거나, 예를 들어, 삼투압과 같은 각종 성질에 영향을 끼치는 보조제(예: 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)와 혼합된다. 다른 적당한 국소 투약 형태는, 활성 성분이, 예를 들어, 고체 또는 액체 불활성 담체와 함께, 가압 휘발성 물질(예: 기체 분사제, 예를 들어, 프레온)과의 혼합물로 포장되거나 압축병에 포장된, 분무가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 모이스쳐라이저 또는 보습제도 필요한 경우 약제학적 조성물 및 투약 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 추가 성분들의 예는 당업계에 널리 알려져 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비강내 투여를 포함하는 경우, 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 점적제 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 사용을 위해 예방제 또는 치료제는 적당한 분사제(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로-플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체)를 사용하여 압축 팩이나 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸인 경우, 정량을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 투약 단위가 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적당한 분말 베이스를 포함하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 조성물은 정제, 캡슐, 카시에(cachet), 젤캡, 용액, 현탁액 등의 형태로 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캡슐은 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 결합제(예: 프리젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈); 충전제(예: 락토즈, 미세결정성 셀룰로즈 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제(예: 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예: 나트륨 라우릴 설페이트)를 사용하여 통상의 수단으로 제조될 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 방법으로 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 용액, 시럽 또는 현탁액 형태일 수 있고 이로 제한되지 않으며, 또는 사용 전에 물이나 다른 적당한 비히클을 사용하여 구성되는 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예: 소르비톨 시럽, 셀룰로즈 유도체 또는 경화 식용 지방); 유화제(예: 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예: 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별화된 식물성유); 및 보존제(예: 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 사용하여 통상의 수단으로 제조될 수 있다. 이 제제는 또한 적합한 경우 완충액 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 경구 투여용 제제는 예방제 또는 치료제(들)의 서방형, 조절 방출형 또는 지속 방출형으로 적당히 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 에어로졸화제를 사용하여 제형화되는 조성물의 폐 투여, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 사용한 폐 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [U.S. Pat. Nos. 6,019, 968; 5,985, 320; 5, 985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; and 4,880,078; and PCT Publication Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; and WO 99/66903, 이들 각각이 전부 참조로 본원에 포함됨]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체, 병용 요법제 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용하여 투여된다.
본 발명의 방법은 주사(예: 볼루스 주사 또는 연속 주입)에 의한 비경구 투여를 위해 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태(예: 앰플 또는 다용량 용기)로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제를 포함할 수 있다. 달리, 활성 성분은 사용 전에 적당한 비히클(예: 멸균 발열 물질-비함유 물)을 사용하여 구성되는 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 방법은 추가로 데포(depot) 제제로 제형화되는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 이식(예: 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예: 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온교환수지와 함께 제형화되거거나, 난용성 유도체(예: 난용성 염)로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 형태 또는 염 형태로 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래되는 음이온과 같은 음이온으로 형성된 염 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래되는 양이온과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분들은 별도로 공급되거나, 예를 들어, 활성제의 양을 표시한 앰플이나 사셋(sachette)과 같은 밀봉 용기 중의 건조 동결 분말 또는 물-비함유 농축물과 같은 단위 투여 형태에서 함께 혼합된다. 투여 방식이 주입(infusion)인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급 수 또는 식염수를 포함하는 주입 병에 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플이 제공될 수 있다.
특히, 본 발명은 항체의 양을 표시한 앰플 또는 사셋과 같은 밀봉 용기에 포장된 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 약제학적 조성물은 밀봉 용기에 건조 멸균 동결건조된 분말 또는 물 비함유 농축물로 제공되고, 피험자에게 투여하기에 적당한 농도로(예를 들어, 물이나 식염수를 사용하여) 재구성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 조성물은 적어도 5 mg, 예를 들어, 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg, 또는 적어도 100 mg의 단위 용량으로 밀봉 용기에 건조 멸균 동결건조된 분말로서 공급된다. 본 발명의 동결건조된 항체 또는 약제학적 조성물은 원 용기 중에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야 하며, 본 발명의 항체 또는 약제학적 조성물은 재구성 후 1주 내에, 예를 들어, 5일 내에, 72시간 내에, 48시간 내에, 24시간 내에, 12시간 내에, 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 약제학적 조성물은 항체의 양과 농도를 표시한 밀봉 용기에 액체 형태로 공급된다. 추가의 실시형태에서, 투여 조성물의 액체 형태는 적어도 0.25 mg/ml, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/ml, 적어도 1 mg/ml, 적어도 2.5 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml 또는 적어도 100 mg/ml로 밀봉 용기에 공급된다. 액체 형태는 원 용기 중에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야 한다.
본 발명의 항체는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 한 실시형태에서, 항체는 0.1 내지 250 mg/ml 항체를 포함하는 주사가능 용액으로 제조될 것이다. 주사가능 용액은 플린트(flint) 또는 호박색 바이엘, 앰플 또는 예비충전된 주사기에 액체 또는 동결건조된 투약 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 L-히스티딘(1-50 mM), 최적으로는 5 내지 10 mM, pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)일 수 있다. 다른 적당한 완충액은 나트륨 석시네이트, 나트륨 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 염화나트륨을 사용하여 용액의 강장성(tonicity)을 0 내지 300mM(액체 투약 형태에 대해 최적으로는 150 mM) 농도로 조절할 수 있다. 동결방지제가 동결건조 투약 형태에 포함될 수 있으며, 주로 0 내지 10% 수크로즈(최적으로는 0.5 내지 1.0%)를 포함한다. 다른 적당한 동결방지제는 트레할로즈 및 락토즈를 포함한다. 벌크제가 동결건조 투약 형태에 포함될 수 있으며, 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2 내지 4%)이다. 안정화제는 액체 및 동결건조 투약 형태 모두에 사용될 수 있고, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10 mM)이다. 다른 적당한 벌크제는 글리신, 아르기닌을 포함하고, 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%)으로 포함될 수 있다. 추가의 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함하고 이에 제한되지 않는다. 비경구 투여용의 주사가능 용액으로 제조되는 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 애주번트로 유용한 제제, 예를 들어, 항체의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 특히 유용한 애주번트는 히알루로니다제, 예를 들어, Hylenex®(재조합 사람 히알루로니다제)이다. 주사가능 용액에 히알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후, 특히 피하 투여 후, 사람 생체이용율을 향상시킨다. 또한, 이는 주사 부위 용량을 증대(즉, 1ml 이상)시키고, 통증과 불안을 감소시키며, 주사 부위 반응의 빈도를 최소화할 수 있다 [참조: 국제 출원 공개 번호 WO 2004078140 및 U.S. 특허 출원 공개 제US2006104968호, 본원에 인용에 의해 포함됨].
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 그 예로는 액체, 반고체 및 고체 투약 형태, 예를 들어, 액체 용액(예: 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도한 투여 방식 및 치료 적용에 따라 달라진다. 조성물은 주사가능 용액 또는 주입가능 용액의 형태, 예를 들어, 다른 항체와 함께 사람을 수동 면역화하기 위해 사용되는 것과 유사한 조성물의 형태일 수 있다. 한 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료 조성물은 일반적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균성이고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고농도 약물에 적합한 다른 주문 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 화합물(즉, 본 발명의 결합 단백질, 예를 들어, 항체)을 필요에 따라 상기된 성분 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 적당한 용매에 포함시킨 후 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 상술된 성분들 중에서 선택된 다른 필요 성분들을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액을 제조하기 위한 멸균 동결건조 분말의 경우, 제조방법은 사전 멸균-여과된 용액으로부터 활성성분 + 임의의 추가 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 분무 건조를 포함한다. 용액의 적당한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용하여 유지시킬 수 있다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 첨가함으로써 유도될 수 있다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 많은 치료 적용에서, 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입일 수 있다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 실시형태에서, 활성 화합물은 화합물을 빠른 방출로부터 보호하는 담체를 사용하여 제조될 수 있고, 그 예로는 조절 방출 제형(이식체, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템 포함)이 있다. 생체분해성의 생체적합성 중합체가 사용될 수 있고, 그 예로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 항체(및 필요한 경우 다른 성분들)는 또한 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 포함되거나, 정제로 압축되거나, 피험자의 음식에 직접적으로 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 항체는 부형제와 혼합되고 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 다른 방식으로 본 발명의 항체를 투여하기 위해, 항체를 불활성화 방지 물질로 코팅하거나 불활성화 방지 물질과 함께 공동투여하는 것이 필요할 수 있다.
또한, 보충적 활성 화합물을 조성물에 첨가할 수도 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 본원에서 기술되는 장애 또는 질환을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동제형화되고/되거나 공동투여된다. 예를 들어, 본 발명의 항-RGMa 항체는 다른 표적물에 결합하는 하나 이상의 추가 항체(예: 다른 가용성 항원에 결합하는 항체 또는 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 공동제형화 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 중 2종 이상과 병용될 수 있다. 이러한 병용 요법은 유리하게는 투여되는 치료제의 용량을 낮출 수 있어 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 반감기 연장 비히클에 연결된다. 이러한 비히클은 Fc 도메인, 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 이러한 비히클은, 예를 들어, U.S. 특허 출원 일련 번호 제09/428,082호 및 공개된 PCT 출원 제WO 99/25044호(본원에 인용에 의해 포함됨)에 기술되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 유전자 요법으로 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 관리 또는 호전시키기 위해 투여된다. 유전자 요법은 발현되는 또는 발현성 핵산을 피험자에게 투여함으로써 수행되는 요법을 지칭한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 본 발명의 암호화된 항체를 생산한다.
당업계에서 이용가능한 유전자 요법에 대한 임의의 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 요법의 방법에 대한 일반적인 검토 위해, 문헌 [Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 대한 당업계에 일반적으로 공지된 방법이 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 요법의 다양한 방법에 대한 상세한 설명이 US20050042664 A1(본원에 인용에 의해 포함됨)에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 신경돌기 변성, 예를 들어, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 다운 증후군, 치매, 파킨슨병, 중수신경계에 대한 외상성 손상, 또는 RGMa와 연관된 임의의 다른 질환 또는 병태를 치료하기 위해 단독으로 사용되거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용되거나 의도된 목적을 위해 당업자에 의해 선택되는 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들어, 치료제(예: 소분자 또는 생물제)와 병용하여 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 추가의 치료제는 면역억제제 또는 다발성 경화증과 연관된 하나 이상의 증상을 치료하는 제제일 수 있다. 추가의 약물은 베타 인터페론일 수 있다. 베타 인터페론, 예를 들어, 아보넥스, 베타세론, 엑스타비아 및 레비프는 다발성 경화증 증상이 시간의 흐름에 따라 악화되는 속도를 느리게 할 수 있다. 추가의 제제는 수초에 대한 면역계 공격을 차단할 수 있는 글라티라머(코팍손)일 수 있다. 추가의 제제는 면역 세포를 림프절에 트랩할 수 있는 핀골리모드(길레냐)일 수 있다. 추가의 제제는 잠재적으로 해로운 면역 세포가 혈류로부터 뇌 및 척수로 이동하는 것을 방해할 수 있는 나탈리주마브(티사브리)일 수 있다. 추가의 약물은 면역억제 약물인 미톡산트론(노반트론)일 수 있다.
추가의 치료제는 사람의 뇌의 손상된 인지 능력(즉, 사고, 학습 및 기억)을 개선하는 약물인 "인지 향상 약물"일 수 있다. 인지 향상 약물은 신경화학물질(신경전달물질, 효소 및 호르몬)의 유용성을 변화시키거나, 산소 공급을 개선하거나, 신경 성장을 자극하거나, 신경 손상을 억제함으로써 작용한다. 인지 향상 약물의 예는 아세틸콜린의 활성을 증가시키는 화합물, 예를 들어, 아세틸콜린 수용체 아고니스트(예: 니코티닉 α-7 수용체 아고니스트 또는 알로스테릭 조절제, α4β2 니코티닉 수용체 아고니스트 또는 알로스테릭 조절제), 아세틸콜린에스테라제 억제제(예: 도네페질, 리바스티그민 및 갈란타민), 부티릴콜린에스테라제 억제제, N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체 길항제(예: 메만틴), 활성-의존적 신경보호 단백질(ADNP) 아고니스트, 세로토닌 5-HT1A 수용체 아고니스트(예: 잘리프로덴), 5-HT4 수용체 아고니스트, 5-HT6 수용체 길항제, 세로토닌 1A 수용체 길항제, 히스타민 H3 수용체 길항제, 칼파인 억제제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 단백질 또는 아고니스트, 영양 성장 인자, 항-아폽토시스 화합물, AMPA-타입 글루카메이트 수용체 활성화제, L-타입 또는 N-타입 칼슘 채널 차단제 또는 조절제, 칼륨 채널 차단제, 저산소증 유래 인자(HIF) 활성화제, HIF 프롤릴 4-하이드록실라제 억제제, 소염제, 아밀로이드 Aβ펩타이드 또는 아밀로이드 플라크 억제제, 타우(tau) 과인산화 억제제, 포스포디에스테라제 5 억제제(예: 타달라필, 실데나필), 포스포디에스테라제 4 억제제, 모노아민 옥시다제 억제제, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 이러한 인지 향상 약물의 특정 예는 콜린에스테라제 억제제, 예를 들어, 도네페질(Aricept®), 리바스티그민(Exelon®), 갈란타민(Reminyl®), N-메틸-D-아스파테이트 길항제, 예를 들어, 메만틴(Namenda®)을 포함하고 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로 현재 인식되거나 미래에 인식될 제제를 포함하는, 하나 이상의 인지 향상 약물은, 본 발명의 항체와 동시에 또는 본 발명의 항체와 순차적으로(임의의 순서로) 투여될 수 있다. 추가로, 본원에서 기술되는 배합물은 상술된 치료에 사용되는 경우 부가적이거나 상승적 효과를 가질 수 있는 것으로 믿어진다. 추가의 제제는 또한 치료 조성물에 유리한 속성을 부여하는 제제, 예를 들어, 조성물의 점도에 영향을 끼치는 제제일 수 있다.
또한, 배합물은 의도된 목적에 유용한 배합물인 것으로 이해되어야 한다. 상기 제시된 제제들은 설명을 위한 것으로서 제한하려는 것이 아니다. 배합물은 항체 및 상기 열거된 것들 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가 제제를 포함할 수 있다. 또한, 배합물은 형성된 조성물이 의도된 기능을 수행할 수 있는 배합물인 경우 하나 초과의 제제, 예를 들어, 2개 또는 3개의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 항체를 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 용량에서 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 항체의 치료학적 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적 유익 효과가 항체의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방 효과를 달성하는데 효과적인 용량에서 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 일반적으로, 예방 투약량은 질병 전이나 초기 단계에서 피험자에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
투약 요법은 최적의 목적하는 반응(예: 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며, 또는 치료 상황의 위급에 따라 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 특히, 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에서 사용되는 투약 단위 형태는 치료될 포유동물 피험자를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 의미한다; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 공동으로 목적하는 치료 효과를 초래하는 것으로 계산된 예정량의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 세부사항은 (a) 활성 화합물 고유의 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 다루기 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재하는 한계에 의해 조정되고 직접적으로 좌우된다.
항체의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 0.1 내지 200mg/kg, 예를 들어, 0.1 내지 10mg/kg이다. 항체의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 1 내지 200mg/kg, 10 내지 200mg/kg, 20 내지 200mg/kg, 50 내지 200mg/kg, 75 내지 200mg/kg, 100 내지 200mg/kg, 150 내지 200mg/kg, 50 내지 100mg/kg, 5 내지 10mg/kg, 또는 1 내지 10mg/kg일 수 있다. 용량은 경감될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것에 주목해야 한다. 또한, 항체 용량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 개체의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중과 같은 인자 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 용량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. 임의의 특정 피험자에 대해, 특정 투약 요법은 투여가 필요한 개체 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 제시된 용량 범위는 단지 예시적인 것으로서 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아니라는 것을 알아야 한다.
4. 신경돌기 변성과 연관된 질환을 치료, 예방, 조절 또는 약화시키는 방법
임의의 피험자에서 피험자가 신경돌기 변성 장애를 갖는지에 대해 평가할 수 있다. 평가는 적합한 치료 과정, 예를 들어, 예방적 치료, 유지 치료 또는 조절 치료를 제시할 수 있다. 따라서, 본원에는 신경돌기 변성 질환/장애를 치료, 예방, 조절 또는 약화시키는 방법이 제공된다. 항체는 이를 필요로 하는 피험자에게 투여될 수 있다. 항체는 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 투여되는 항체의 용량은 환자의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적 의학 상태 및 이전의 병력과 같은 인자에 따라 다를 수 있을 것이다. 더욱 낮거나 높은 용량도 상황에 따라 투여될 수 있지만, 전형적으로, 약 1 pg/kg 내지 10mg/kg(제제의 양/환자의 체중) 범위의 항체 성분, 면역접합체 또는 융합 단백질의 용량을 제공하는 것이 바람직하다. 투약 요법은 최적의 목적하는 반응(예: 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여되거나, 수개의 분할 용량이 투여되거나, 치료 상황의 위급에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투약 단위 형태는 치료될 포유동물 피험자를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 지칭한다; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 공동으로 목적하는 치료 효과를 초래하는 것으로 계산된 예정량의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 세부사항은 (a) 활성 화합물 고유의 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 다루기 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재하는 한계에 의해 조정되고 직접적으로 좌우된다.
본 발명의 항체 또는 항체 부분의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비제한적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 보다 바람직하게는 0.5 내지 10mg/kg이다. 용량은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것에 주목해야 한다. 또한, 임의의 특정한 피험자에 대해서는 개체의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조절되어야 하며, 본원에 기술된 용량 범위는 단지 예시적인 것으로서 청구되는 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.
환자에 대한 항체의 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉강내, 경막내, 안내, 유리체내, 국소적 카테터를 통한 관류에 의해, 또는 직접적 병변내 주사에 의해 수행될 수 있다. 주사로 치료 단백질을 투여하는 경우, 투여는 연속 주입 또는 단일 또는 다수 볼루스에 의해 수행될 수 있다. 정맥내 주사는 완전한 순환에 기인하여 항체를 신속히 공급 분배하는 유용한 투여 방식을 제공한다. 항체는 경구적으로, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체를 사용하여 투여될 수 있다. 항체 및 기타 성분들은, 필요한 경우, 경질 또는 연질 캡슐에 포함되거나, 정제로 압축되거나, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태일 수 있다.
항-RGMa 항체는 저용량으로, 예를 들어, 투여당 20 mg 내지 2 mg 단백질로 1회 또는 반복적으로 비경구적으로 투여될 수 있다. 달리, 항체는 투여당 20 내지 1000 mg 단백질, 또는 투여당 20 내지 500 mg 단백질, 또는 투여당 20 내지 100 mg 단백질의 용량으로 투여될 수 있다.
항체는 단독으로 투여되거나 리포좀에 컨주게이션될 수 있으며, 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 이로써 항체는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 배합된다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 수용 환자에 의해 허용되는 것일 수 있다. 멸균 인산염-완충된 식염수가 약제학적으로 허용되는 담체의 일례이다. 다른 적합한 담체도 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (1995)]을 참조한다.
치료 목적 상, 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. "치료학적 유효량"은 생리학적으로 유의한 양이다. 항체는 이의 존재로 수용 환자의 생리학에 검출가능한 변화를 초래하는 경우 생리학적으로 유의하다. 본 발명에서, 항체는 이의 존재로, 예를 들어, CD4+ T 세포로부터 인터페론-γ(INF-γ), 인터루킨-2(IL-2), IL-4 및/또는 IL-17 분비를 감소시키는 경우, 생리학적으로 유의할 수 있다. 제제는 이의 존재로, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 증식 반응 및/또는 프로-염증성 사이토킨 발현을 감소시키는 경우, 생리학적으로 유의하다.
추가의 치료 방법을 이용하여 치료 적용에서 항체의 작용 지속 기간을 조절할 수 있다. 항체와 컴플렉스를 형성하거나 항체를 흡수하도록 중합체를 사용함으로써 조절 방출 제제가 제조될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 중합체는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 이량체와 세바크산의 폴리무수물 공중합체의 매트릭스를 포함한다 [Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992)]. 이러한 매트릭스로부터의 항체의 방출 속도는 단백질의 분자량, 매트릭스 중의 항체의 양 및 분산된 입자의 크기에 의존적이다 [참조: Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989); Sherwood et al., supra]. 기타 고체 투약 형태가 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th ed. (1995)]에 기술되어 있다.
a. 신경돌기 변성 장애/질환
신경돌기 장애/질환은 신경돌기 손상 및 약화된 시냅스 기능이 있는 임의의 질환 또는 장애일 수 있다. 이러한 손상 및 약화된 기능은 충분한 수초화 및/또는 축색돌기 횡단이 결여된 신경으로부터 발생할 수 있다. 신경돌기 변성 장애 또는 질환은, 예를 들어, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증 및 다른 운동뉴런 질환, 헌팅톤병, 테이-삭스병, 니이만-픽병, 고오셔병, 헐러 증후군, 특발적 염증성 탈수초병, 비타민 B12 결핍증, 뇌교 중심부 수초용해증, 척수매독, 횡단 척수염, 데빅병, 진행성 다초점 백질뇌증, 시신경염 및 신경돌기 변성과 연관된 다른 망막병증, 예를 들어, 녹내장, 당뇨병성 신경병증 및 연령-의존적 황반 변성, 중추 신경계에 대한 외상성 손상, 또는 백질 이영양증일 수 있다. 신경돌기 변성 장애 또는 질환은 미엘린이라 불리는 지방(지단백질)으로 구성되는 조직 층의 충분한 포장이 결여된 신경 섬유로부터 발생할 수 있다. 이들 층은 수초를 형성한다. 수초는 전기 자극이 신경 섬유를 따라 빠르고 정확하게 전달되게 할 수 있다. 수초가 손상되거나 손실되는 경우, 신경은 전기 자극을 정상적으로 전달하지 못한다. 때때로, 손상되거나 손실된 수초에 의해 신경 섬유도 손상될 수 있다.
어린 유아들은 보통 성숙한 수초가 결여될 수 있다. 그 결과, 이들의 동작은 경련적이고(jerky), 무질서하고(incoordinated), 어색하다. 수초가 발달함에 따라 동작이 보다 원활해지고, 보다 목적지향적이게 되고, 질서가 잡히게 된다. 그러나, 특정 질환, 예를 들어, 테이-삭스병, 니이만-픽병, 고오셔병, 및 헐러 증후군을 갖는 어린이에서는 수초가 정상적으로 발달되지 않는다.
성인에서, 수초는 뇌졸중, 염증, 면역 장애, 대사 장애 및 영양 결핍(예: 비타민 B12 결여)에 의해 파괴될 수 있다. 독물, 약물(예: 항생제 에탐부톨) 및 과도한 알콜 사용은 수초를 손상시키거나 파괴할 수 있다. 수초가 그 자신을 복구 및 재생할 수 있는 경우, 정상적 신경 기능이 회복될 수 있다. 그러나, 수초가 심각하게 손상되는 경우, 밑에 있는 신경 섬유가 죽을 수 있다. 중추 신경계(뇌 및 척수)의 신경 섬유는 좀처럼 재생되지 않기 때문에, 이러한 손상은 비가역적이다.
탈수초화를 일으키는 일부 신경돌기 변성 장애는 주로 중추 신경계에 영향을 끼친다. 다른 신경돌기 변성 장애는 주로 신체의 다른 부분에 있는 신경에 영향을 끼친다. 중추 신경계에서 탈수초화를 일으키고 미지의 원인을 갖는 신경돌기 변성 장애는 원발성 탈수초화 장애라 불린다. 다발성 경화증이 이들 장애에서 가장 일반적이다.
(1) 다발성 경화증
MS의 임상적 경로는 4개의 주요 범주(또는 서브유형)으로 구분될 수 있다: 재발성 경감형(RRMS), 이차적 진행성(SPMS), 일차적 진행성(PMS) 및 진행성 재발형(PRMS) 다발성 경화증. 임상적 안정기를 사이에 두고 수개월 또는 수년마다 임상적 재발을 갖는 환자가 RRMS를 규정한다. RRMS는 20대 또는 30대의 여성에서 남성에서보다 2배 이상 흔할 수 있다. RRMS와는 대조적으로, SPMS를 갖는 환자는 재발 사이에 진행적 악화를 나타낸다. RRMS 환자는 시간이 경과함에 따라 신경학적 기능이 점진적으로 쇠퇴하는 것으로 특징지어지는 SPMS로 전환될 수 있다. MS 환자의 약 15%가 고령에 발생하고 발병부터 신경학적 기능의 끊임없는 악화로 특징지어지는 PPMS를 갖는다. 양성 MS는 임의로 초기 진단 후 15년을 초과한 후에도 여전히 활동적이고 단지 약한 결핍(확장된 장애 상태 스케일 [EDSS])만을 나타내는 RRMS 환자로 규정된다. 전형적으로, 이들 환자는 초기 발병 후 약간의 진행을 나타내거나 어떠한 진행도 나타내지 않으며 치료적 중재를 필요로 하지 않는다; 그러나, MS 발병 후 5년까지는 이러한 형태의 MS로 진단될 수 없다.
(2) 파킨슨병
파킨슨병은 서반구 도처에 퍼져 있으며, 1817년에 의사인 제임스 파킨슨에 의해 처음으로 보고되었다. 파킨슨병은 처음에는 사지의 떨림으로 감지되며, 종국에는 3개의 다른 징후를 포함하도록 진행될 수 있다: (1) "물림 기어"와 같은 동작 및 "연관" 경직으로 특징지어지는 경직성; (ii) 느리거나 우둔한 동작; 및 (iii) 구부정한 자세 및 장애를 갖는 보행과 연관된 자세 불안정. 이들 변화된 동작은 운동 기능이상의 특징이며, 이외에도 또한 모든 파킨슨 환자의 40%에서 정신적 손상이 있을 수 있다.
파킨슨병은 뇌의 레보도파민이 결핍된 상태에 의해 야기될 수 있다. 보다 구체적으로, 레보도파민은 파킨슨 환자에서 운동 장애를 유발하며 흑질 변성의 결과일 수 있다. 오늘날, 의학은 주사가능한 형태의 레보도파가 뇌에 도달하고 성공적으로 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있게 하는 물질을 발견하지 못하였다. 현재의 도파민 대체 요법은 직접적 대체 또는 뇌의 도파민 수용체 부위에서 작용을 모방하는 것을 목표로 한다. 레보도파 요법이 처음에는 일부 유리한 변화를 나타낼 수 있지만, 이들 변화는 시간이 경과함에 따라 약해질 수 있으며, 심각한 수면 방해, 운동 장애 및 지속적 구심과 같은 다른 문제를 낳을 수 있다. 파킨슨병에 대한 의학적 접근은 뇌 조직의 외과적 파괴 및 뇌의 병든 부분에 마이크로전극 삽입(강한 뇌 전기 자극)을 포함한다. 전극의 삽입은 가역적인 이점을 갖는다. 그러나, 이들 중재는 일반적으로 일시적이고 파킨슨 상태에 영구적인 변화를 주거나 질환의 영향을 역전시키지 못한다.
파킨슨병은 과도한 산화에 기인하여 전개되는 다수요인의 신경변성 장애일 수 있다. 흑질은, 파킨슨병 형성에 대한 이러한 이론을 지지하는, 산화적 손상을 받기 쉽다. 산화적 인산화의 이상은 흑질의 미토콘드리아를 손상시키고, 유리 라디칼 생성을 증대시킨다.
(3) 반응성 산소종(유리 라디칼)으로부터의 손상
반응성 산소종(ROS)은 수개 유형의 조직을 공격할 수 있으며, ROS에 대한 만성 노출은 다양한 생물학적 기능을 약화시키고 신경돌기 변성 장애 및 질환을 포함한 수개의 유형의 심각한 장애 위험을 증가시킨다. ROS는 뉴런을 공격하고 세포사를 유발할 수 있다. 예를 들어, 저농도의 과산화수소로 뉴런을 처리하면 때때로 신경돌기 비딩으로 불리는 신경돌기 형태의 유해한 변화를 초래함으로써 신경돌기 손상을 유발할 수 있다. 신경돌기 비딩은 과산화수소-처리된 뉴런의 죽음 유도 전 뉴런 변성의 초기 사건 중 하나일 수 있다.
(4) 알츠하이머병
알츠하이머병(AD)는 노인들에서 치매의 주요 원인이다. 희귀한 유전적 형태의 AD가 존재하기는 하지만, 대부분의 환자는 통상 어떠한 가족력도 확인되지 않기 때문에 산발성 AD를 갖는 것으로 분류된다. 병리학적으로, AD는 비슷한 연령의 비-치매 개체와 비교하여 증가된 수의 노인성 플라크 및 신경원섬유 매듭을 갖는 뉴런 및 시냅스 변성으로 특징지어진다.
알츠하이머병의 특징적인 노인성 플라크는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 분해 생성물인 응집된 베타-아미로이드의 중심 코어로 구성된다. 신경원섬유 매듭은 미소관과 연관된 타우라 불리는 과인산화된 형태의 단백질로 제조된 불용성의 세포내 실-유사 구조물이다.
알츠하이머병의 희생물인 뇌 조직의 죽은 후 슬라이스는 AD의 특징인 신경염 플라크의 단백질성 세포외 코어 형태의 아밀로이드의 존재를 나타낸다. 이들 신경염 플라크의 아밀로이드 코어는 주로 베타-주름진 시트 구조로 배열된 β-아밀로이드라 불리는 단백질로 구성된다 [Mori et al., Journal of Biological Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al., PNAS 83: 503 (1986)]. 신경염 플라크는 이 질환의 초기의 불변 양상이다 [Mann et al., J. Neurol. Sci. 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985); Terry et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987)].
Aβ의 초기 축적은 임상적 증상이 뚜렷하기 전에 발생할 수 있다. AD 진단을 위해 현재 권장되는 "최소한의 현미경적 기준"은 뇌에서 발견되는 신경염 플라크의 수에 기초한다 [Khachaturian, Arch. Neurol., supra (1985)]. 불행하게도, 신경염 플라크 수에 대한 평가는 죽은 후까지 늦춰져야 한다.
아밀로이드-포함 신경염 플라크는 AD 및 다운 증후군의 뇌 및 AD가 발병될 것 같은 아포지단백질 E4 대립인자에 대해 동형접합성인 사람의 뇌의 선택적 부위에 대해 두드러진 특징이다 [Corder et al., Science 261: 921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27: 643-657 (1927); Wisniewski et al., in Zimmerman, H. M. (ed.): PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY (Grune and Stratton, N.Y. 1973) pp. 1-26]. 뇌 아밀로이드는 티오플라빈 S 또는 콩고 레드로 뇌 절편을 염색함으로써 쉽게 확인된다 [Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962)]. 콩고 레드 염색된 아밀로이드는 황색-녹색의 양극성 색상을 나타내는 이색성 출현으로 특징지어진다. 이색성 결합은 아밀로이드 단백질의 베타-주름진 시트 구조의 결과이다 [Glenner, G. N. Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). A detailed discussion of the biochemistry and histochemistry of amyloid can be found in Glenner, N. Eng. J. Med., 302: 1333 (1980)].
(5) 중추 신경계에 대한 외상성 손상
미국에서 외상성 뇌 손상(TBI)의 발생은 줄잡아 매년 2백만명 초과인 것으로 추정되며 약 500,000명이 입원을 한다. 이중 약 70,000 내지 90,000명의 두부 손상 생존자가 영구히 장애를 갖는다.
피험자의 중추신경계의 신경 경로는 뉴런이 기계적 또는 화학적 외상을 받거나 뉴런이 죽을 위험에 처하기에 충분한 신경병성 변성에 처하는 경우 위험에 처한다. 지금까지 다수의 신경병증이 확인되었으며, 이중 일부는 말초 또는 중추 신경계에 있는 뉴런의 서브군 또는 시스템만을 침범한다. 뉴런 자체 또는 연관 신경교 세포에 영향을 끼칠 수 있는 신경병증은 세포의 대사 이상, 감염, 독성제에의 노출, 자가면역 이상, 영양실조 또는 허혈에 의해 발생할 수 있다. 일부의 경우, 세포 기능이상이 세포사를 직접적으로 유발하는 것으로 생각된다. 다른 경우에서는, 신경병증이 신체 면역/염증계를 자극하기에 충분한 조직 괴사를 유발할 수 있으므로, 초기 신경 손상에 대한 신체의 면역 반응 기작이 뉴런 및 이들 뉴런으로 규정되는 경로를 파괴한다.
b. 피험자
피험자는 포유동물일 수 있으며, 사람일 수 있다. 피험자는 신경돌기 변성 장애 또는 질환을 갖거나 이러한 장애 또는 질환을 발병시킬 위험에 있을 수 있다. 피험자는 이미 신경돌기 변성 장애 또는 질환에 대한 치료를 받고 있을 수 있다.
5. 진단 방법
피험자가 신경돌기 변성 질환 또는 장애를 갖는지의 여부를 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 막 결합된 RGMa의 수준이 측정되고 대조군 샘플 중의 RGMa 수준과 비교될 수 있다. 대조군 샘플은 정상 조직으로부터의 것일 수 있다. 대조군과 비교하여 RGMa의 변화된 수준은 피험자가 신경돌기 변성 질환 또는 장애를 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 정상 대조군과 비교하여 RGMa의 증가된 수준은 피험자가 신경돌기 변성 질환 또는 장애를 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. RGMa의 수준은 본원에서 기술되는 항체를 사용하여 측정될 수 있다.
a. 샘플
샘플은 피험자로부터의 임의의 조직 샘플일 수 있다. 샘플은 피험자로부터의 단백질을 포함할 수 있다. 샘플은 혈청, 혈장 또는 조직 생검일 수 있다. 샘플은 피험자로부터 직접적으로 수득되거나 샘플의 특성을 변형시키기 위해 전처리될 수 있다. 전처리는 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화 및/또는 시약의 첨가를 포함할 수 있다.
임의의 세포 유형, 조직 또는 체액을 사용하여 샘플을 얻을 수 있다. 이러한 세포 유형, 조직 및 체액은 생검 및 부검 샘플과 같은 조직의 절편, 조직학적 목적을 위해 취해진 냉동 절편, 혈액, 혈장, 혈청, 가래, 대변, 눈물, 점액, 타액, 모발 및 피부를 포함할 수 있다. 세포 유형 및 조직은 또한 림프액, 복수액, 부인과진찰액, 소변, 복막액, 뇌척수액, 질세정에 의해 수집된 유체 또는 질 플러싱에 의해 수집된 유체를 포함할 수 있다. 조직 또는 세포 유형은 동물로부터 세포의 샘플을 떼어냄으로써 제공될 수 있으나, 미리 분리된 세포(예: 또 다른 사람에 의해, 또 다른 시간에 및/또는 또 다른 목적으로 분리된 세포)를 사용하여 달성될 수도 있다. 기록(Archival) 조직, 예를 들어, 치료 또는 결과 이력을 갖는 기록 조직도 사용될 수 있다. 단백질 정제는 필요하지 않을 수 있다.
b. RGMa 검출
신체 샘플 중의 RGMa의 존재 또는 양은, 예를 들어, 질광 분광분석, 면역검정 또는 면역조직화학에 의해(예를 들어, 조직 생검으로부터의 절편으로) RGMa에 대한 본원에서 기술되는 항체(모노클로날 또는 폴리클로날) 또는 이의 단편을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 항-GRMa 항체 및 이의 단편은 상술된 바와 같이 생성될 수 있다. 다른 검출 방법은, 예를 들어, 문헌 [U.S. Patent Nos. 6,143,576; 6,113,855; 6,019,944; 5,985,579; 5,947,124; 5,939,272; 5,922,615; 5,885,527; 5,851,776; 5,824,799; 5,679,526; 5,525,524; and 5,480,792, 이들 각각이 전부 본원에 인용에 의해 포함됨]에 기술되어 있는 것들을 포함한다.
(1) 면역검정
RGMa 및/또는 이의 펩타이드는 면역검정을 이용하여 분석될 수 있다. RGMa의 존재 또는 양은 본원에서 기술되는 항체를 사용하여 RGM에 대한 특이적 결합을 검출함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 65를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 서열번호 65를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
임의의 면역검정이 이용될 수 있다. 면역검정은, 예를 들어, 효소-결합된 면역검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 경쟁적 억제 검정, 예를 들어, 포워드(forward) 또는 리버스(reverse) 경쟁적 억제 검정, 형광 편광화 검정 또는 경쟁적 결합 검정일 수 있다. ELISA는 샌드위치 ELISA일 수 있다. RGMa에 대한 항체의 특이적 면역학적 결합은 항체에 부착된 직접적 표지, 예를 들어, 형광 또는 발광 택, 금속 및 방사성핵종을 통하거나 간접적 표지, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제를 통해 검출될 수 있다.
고정화된 항체 또는 이의 단편의 이용이 면역검정에 포함될 수 있다. 항체는 다수의 지지체, 예를 들어, 자성 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 검정 플레이트(마이크로역가 웰)의 표면, 고체 지지체 물질의 부분 등에 고정화될 수 있다. 검정 스트립은 검정물 중의 항체 또는 다수의 항체를 고체 지지체 상에 코팅함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 이러한 스트립을 시험 생물학적 샘플에 담근 후, 세척 및 검출 단계를 거쳐 신속히 진행함으로써 측정가능한 시그널, 예를 들어, 착색된 스폿을 생성할 수 있다.
(a) 샌드위치 ELISA
샌드위치 ELISA는 2층의 항체(즉, 캡쳐 및 검출 항체) 사이의 항원의 양을 측정한다. 측정될 RGMa는 항체에 대해 결합할 수 있는 2개 이상의 항원성 부위를 포함할 수 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 샌드위치 ELISA에서 캡쳐 및 검출 항체로서 사용될 수 있다.
일반적으로, 2개 이상의 항체가 시험 샘플 중의 RGMa 또는 RGMa 단편을 분리하고 정량하는데 사용된다. 보다 구체적으로, 2개 이상의 항체는 "샌드위치"라 지칭되는 면역 컴플렉스를 형성하는 RGMa 또는 RGMa 단편의 특정 에피토프에 결합한다. 하나 이상의 항체는 시험 샘플 중의 RGMa 또는 RGMa 단편을 캡쳐하는데 사용되고(이들 항체는 종종 "캡쳐" 항체 또는 "캡쳐" 항체들이라 지칭된다), 하나 이상의 항체는 샌드위치에 대한 검출가능한(즉, 정량가능한) 표지를 결합하는데 사용된다(이들 항체는 종종 "검출" 항체 또는 "검출" 항체들이라 지칭된다). 샌드위치 검정에서, 이들의 에피토프에 결합하는 두 항체 모두는 검정물 중의 임의의 다른 항체의 이의 각각의 에피토프에 대한 결합에 의해 감소될 수 없다. 달리, 항체는 RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플과 접촉되는 하나 이상의 제1 항체가 제2 또는 후속 항체에 의해 인지되는 에피토프 모두 또는 이의 부분에 결합하지 않음으로써 하나 이상의 제2 검출 항체가 RGMa 또는 RGMa 단편에 결합하는 능력을 방해하지 않도록 선택될 수 있다.
항체는 상기 면역검정에서 제1 항체로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 서열번호 65, 66 또는 74의 적어도 3개의 연속한 (3) 아미노산들을 포함하는 에피토프에 면역특이적으로 결합한다. 상기 면역검정물은, 본 발명의 항체 이외에, 서열번호 65, 66 또는 74의 적어도 3개의 연속한 (3) 아미노산들을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 제2 항체를 포함할 수 있으며, 이때 제2 항체가 결합하는 연속한 (3) 아미노산들은 제1 항체가 결합하는 연속한 (3) 아미노산들과 상이하다.
바람직한 실시형태에서, RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플은 하나 이상의 캡쳐 항체(또는 항체들) 및 하나 이상의 제2 검출 항체와 동시에 또는 순차적으로 접촉될 수 있다. 샌드위치 검정 포맷에서, RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플은 먼저 제1 항체-RGMa 컴플렉스가 형성되는 조건 하에서 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 캡쳐 항체와 접촉된다. 하나 초과의 캡쳐 항체가 사용되는 경우, 제1의 다수 캡쳐 항체-RGMa 컴플렉스가 형성된다. 샌드위치 검정에서, 항체, 바람직하게는 하나 이상의 캡쳐 항체는 시험 샘플 중에서 예상되는 RGMa 또는 RGMa 단편의 최대량에 대해 몰과량으로 사용된다. 예를 들어, 마이크로입자 코팅 완충액 ml 당 약 5 μg/ml 내지 약 1 mg/ml의 항체가 사용될 수 있다.
임의로, 시험 샘플을 하나 이상의 제1 캡쳐 항체와 접촉시키기 전에, 하나 이상의 제1 캡쳐 항체는 시험 샘플로부터 제1 항체-RGMa 컴플렉스의 분리를 용이하게 하는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 웰, 튜브 또는 비드 형태의 중합체 물질로 제조되는 고체 지지체를 포함하여 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 고체 지지체가 사용될 수 있다. 항체가 RGMa 또는 RGMa 단편에 결합하는 능력이 방해되지 않는 한, 항체(또는 항체들)는 흡착, 화학적 커플링제를 사용한 공유 결합, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 또한, 필요한 경우, 고체 지지체는 항체 상의 다양한 작용기와 반응적이도록 유도체화될 수 있다. 이러한 유도체화는 특정한 커플링제, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 말레산 무수물, N-하이드록시석신이미드 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드의 사용을 필요로 한다.
RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 시험 샘플을 하나 이상의 제1 캡쳐 항체와 접촉시킨 후, 시험 샘플을 제1 캡쳐 항체(또는 다수 항체)-RGMa 컴플렉스가 형성되도록 인큐베이션한다. 인큐베이션은 약 4.5 내지 약 10.0의 pH에서 약 2℃ 내지 약 5℃의 온도에서 적어도 약 1분 내지 약 18시간 동안, 약 2 내지 6분 또는 약 3 내지 4분의 기간 동안 수행될 수 있다.
제1/다수 캡쳐 항체-RGMa 컴플렉스의 형성 후, 컴플렉스는(제1/다수 항체-RGMa-제2 항체 컴플렉스가 형성되는 조건 하에) 하나 이상의 제2 검출 항체와 접촉된다. 제1 항체-RGMa 컴플렉스가 하나 초과의 검출 항체와 접촉되는 경우, 제1/다수 캡쳐 항체-RGMa-다수 항체 검출 컴플렉스가 형성된다. 제1 항체와 같이, 적어도 제2(및 후속) 항체가 제1 항체-RGMa 컴플렉스와 접촉되는 경우, 제1/다수 항체-RGMa-제2/다수 항체 컴플렉스의 형성에 대해 상술된 조건과 유사한 조건 하에서의 인큐베이션 기간이 필요하다. 바람직하게는, 하나 이상의 제2 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 검출가능한 표지는 제1/다수 항체-RGMa-제2/다수 항체 컴플렉스 형성 전, 동시 또는 후에 하나 이상의 제2 항체에 결합될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 표지가 사용될 수 있다.
(b) 포워드 경쟁적 억제
포워드 경쟁 포맷에서, 공지된 농도의 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMA 변이체의 분취물이 RGMa 항체(예: 본 발명의 항체)에 대한 결합에 대해 시험 샘플 중의 RGMa 또는 RGMa 단편과 경쟁하는데 사용된다.
포워드 경쟁 검정에서, 고정화된 항체(예: 본 발명의 항체)는 시험 샘플 및 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체와 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다. RGMa 펩타이드, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체는 항-RGMa 항체와 관련하여 상기에서 기술되는 검출 표지를 포함하는 임의의 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 이러한 검정에서, 항체는 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 달리, 항체는 고체 지지체, 예를 들어, 마이크로입자에 고정화된 항체, 예를 들어, 안티스피시스(antispecies) 항체에 커플링될 수 있다.
표지된 RGMa 펩타이드, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체, 시험 샘플 및 항체는 샌드위치 검정 포맷과 관련하여 상기 기술되는 조건과 유사한 조건 하에서 인큐베이션된다. 이때, 2개의 상이한 종의 항체-RGMa 컴플렉스가 생성될 수 있다. 구체적으로, 생성되는 항체-RGMa 컴플렉스 중의 하나는 검출가능한 표지를 포함하고, 다른 항체-RGMa 컴플렉스는 검출가능한 표지를 포함하지 않는다. 항체-RGMa 컴플렉스는 검출가능한 표지의 정량화 전 시험 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있으며 분리되어야 하는 것은 아니다. 항체-RGMa 컴플렉스가 시험 샘플 중의 나머지로부터 분리되는 지의 여부와 무관하게, 항체-RGMa 컴플렉스 중의 검출가능한 표지의 양이 정량화된다. 이어서, 시험 샘플 중의 RGMa 또는 RGMa 단편의 농도가 항체-RGMa 컴플렉스 중의 검출가능한 표지의 양을 표준 곡선에 대해 비교함으로써 측정될 수 있다. 표준 곡선은 공지된 농도의 RGMa 또는 RGMa 단편의 일련의 희석물을 사용하여 질량 분광분석으로, 중량 측정에 의해 당업계에 공지된 다른 기술로 생성될 수 있다.
항체-RGMa 컴플렉스는 샌드위치 검정 포맷과 관련하여 상기에서 기술되는 고체 지지체와 같은 고체 지지체에 항체를 결합시킨 후 고체 지지체와의 접촉물로부터 시험 샘플의 나머지를 제거함으로써 시험 샘플로부터 분리될 수 있다.
(c) 리버스 경쟁적 검정
리버스 경쟁적 검정에서, 고정화된 RGMa 펩타이드, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체는 시험 샘플 및 하나 이상의 표지된 항체와 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 서열번호 65 또는 66의 적어도 3개의 연속 (3) 아미노산들을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합된다. RGMa 펩타이드, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체는 샌드위치 검정 포맷과 관련하여 상기에서 기술되는 고체 지지체와 같은 고체 지지체에 결합될 수 있다. RGMa 펩타이드 단편은 서열번호 65 또는 66을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
고정화된 RGMa 펩타이드, RGMa 펩타이드 단편 또는 RGMa 변이체, 시험 샘플 및 하나 이상의 표지된 항체를 샌드위치 검정 포맷과 관련하여 상기에서 기술되는 조건과 유사한 조건 하에서 인큐베이션한다. 이때 2개의 상이한 종의 RGMa=항체 컴플렉스가 생성된다. 구체적으로, 생성되는 RGMa-항체 컴플렉스 중의 하나는 고정화되고 검출가능한 표지를 포함하고, 다른 RGMa-항체 컴플렉스는 고정화되지 않고 검출가능한 표지를 포함한다. 비-고정화된 RGMa-항체 컴플렉스 및 나머지 시험 샘플은 당업계에 공지된 기술, 예를 들어, 세척을 통해 고정화된 RGMa-항체 컴플렉스로부터 제거된다. 일단 비-고정화된 RGMa 항체 컴플렉스가 제거되면, 고정화된 RGMa-항체 컴플렉스 중의 검출가능한 표지의 양이 정량화된다. 이어서, RGMa-컴플렉스 중의 검출가능한 표지의 양을 표준 곡선과 비교함으로써 시험 샘플 중의 RGMa 또는 RGMa 단편의 농도가 측정될 수 있다. 표준 곡선은 공지된 농도의 RGMa 또는 RGMa 단편의 일련의 희석물을 사용하여 질량 분광분석으로, 중량 측정에 의해 당업계에 공지된 다른 기술로 생성될 수 있다.
(d) 형광 편광화
형광 편광화 검정에서, 항체 또는 이의 작용적 활성 단편은 먼저 비표지된 RGMa-항체 컴플렉스를 형성하도록 RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 비표지된 시험 샘플과 접촉될 수 있다. 이어서, 비표지된 RGMa-항체 컴플렉스는 형광 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체와 접촉된다. 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체는 항체 또는 이의 작용적 활성 단편에 대한 결합에 대해 시험 샘플 중의 비표지된 RGMa 또는 RGMa 단편과 경쟁한다. 형성되는 표지된 RGMa-컴플렉스의 양이 측정되고, 시험 샘플 중의 RGMa의 양은 표준 곡선을 통해 결정된다.
형광 편광화 검정에 사용되는 항체는 서열번호 65 또는 서열번호 66 또는 서열번호 74로부터의 적어도 3개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
항체, 표지된 RGMa 펩타이드, RGMa 펩타이드 단편 또는 RGMa 변이체 및 시험 샘플 및 하나 이상의 표지된 항체는 샌드위치 면역검정과 관련하여 상기 기술되는 조건과 유사한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
달리, 항체 또는 이의 작용적 활성 단편은 표지된 RGMa-항체 컴플렉스 및 비표지된 RGMa-항체 컴플렉스를 형성하도록 형광 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체, 및 RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 비표지된 시험 샘플과 동시에 접촉될 수 있다. 형성되는 표지된 RGMa-항체 컴플렉스의 양이 측정되며, 시험 샘플 중의 RGMa의 양은 표준 곡선을 통해 결정된다.
달리, 항체 또는 이의 작용적 활성 단편은 먼저 표지된 RGMa-항체 컴플렉스를 형성하도록 형광 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체와 접촉된다. 이어서, 표지된 BNP-항체 컴플렉스는 RGMa 또는 RGMa 단편을 포함하는 것으로 의심되는 비표지된 시험 샘플과 접촉된다. 시험 샘플 중의 임의의 비표지된 RGMa 또는 RGMa 단편은 항체 또는 이의 작용적 활성 단편에 대한 결합에 대해 표지된 RGMa, RGMa 단편 또는 RGMa 변이체와 경쟁한다. 형성되는 표지된 RGMa-항체 컴플렉스의 양이 측정된다. 시험 샘플 중의 RGMa의 양은 표준 곡선을 통해 결정된다. 이러한 면역검정에 사용되는 항체는 서열번호 65, 66 또는 74의 적어도 3개의 연속 (3) 아미노산들을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
(e) 질량 분광분석
질량 분광분석(MS)은 단독으로 이용되거나 다른 방법과 병용하여 이용될 수 있다. 다른 방법은 면역검정 및 특정한 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위해 상기에서 기술되는 것들을 포함한다. 질량 분광분석법은 하나 이상의 바이오마커의 존재 및/또는 양을 측정하는데 이용될 수 있다. MS 분석은 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI) 비행시간(TOF) MS 분석, 예를 들어, 지시된-스폿 MALDI-TOF 또는 액체 크로마토그래피 MALDI-TOF 질량 분광분석을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, MS 분석은 전기분무 이온화(ESI) MS, 예를 들어, 액체 크로마토그래피(LC) ESI-MS를 포함한다. 질량 분석은 시판되는 분광계를 사용하여 달성될 수 있다. 생물학적 샘플 중의 바이오마커 펩타이드의 존재 및 양을 검출하기 위해서 MALDI-TOF MS 및 ESI-MS를 포함한 MS 분석을 이용하는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [U.S. Patent Nos. 6,925,389; 6,989,100; and 6,890,763, 교시를 위해, 이들 각각이 본원에 인용에 의해 포함됨]을 참조한다.
c. 대조군
대조군 샘플을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대조군 샘플은 상술된 바와 같이 피험자로부터의 샘플과 동시에 분석될 수 있다. 피험자 샘플로부터 수득된 결과는 대조군 샘플로부터 수득된 결과와 비교될 수 있다. 표준 곡선이 제공될 수 있으며, 이로써 생물학적 샘플에 대한 검정 결과가 비교될 수 있다. 이러한 표준 곡선은 검정 단위, 즉 형광 표지가 사용되는 경우 형광 시그널 강도의 함수로서 마커의 수준을 나타낸다. 다수의 공여자로부터 취해진 샘플을 사용함으로써, 정상 조직 중의 RGMa의 대조군 수준에 대한 표준 곡선뿐만 아니라 상기된 특성 중 하나 이상을 가질 수 있는 공여자로부터 취해진 조직 중의 RGMa의 "위험" 수준에 대한 표준 곡선이 제공될 수 있다.
6. 키트
피험자를 치료 또는 진단하는데 사용될 수 있는 키트가 본원에 제공된다. 키트는 항체 및 항체를 투여하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 키트는 이를 사용하고 분석, 모니터링 또는 처리를 수행하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 키트는 각각의 용기가 개별 시약을 포함하는 바이알 또는 병과 같은 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기술된 분석, 모니터링, 처리 또는 방법을 수행하는 방법을 기술하거나 이를 설명할 수 있는 서면 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 다수의 양상을 가지며, 하기의 비-제한적 실시예로 설명된다.
실시예
실시예 1
항- RGMa 사람 모노클로날 항체 생산 및 단리
PROfusion mRNA 디스플레이 기술을 이용하여, 풀링된 사람 비장, 편도선, PBMC 및 림프절 항체 라이브러리를 8 라운드에 거쳐 RGMa 항원인 100nM 비오틴-표지된 사람 또는 래트 RGMa에 대해 선별하였다. PROfusion 기술은 미국 특허 출원 공개 제20100099103호 및 제20100105569호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용이 본원에 인용에 의해 포함된다. 선별된 sc-Fv 단편을 완전한 사람 IgG로 재포맷하였다. RGMa-기반 ELISA에서 IgG 스크리닝 후, AE12-1 내지 AE12-8이 사람 및 래트 RGMa에 대한 포지티브 결합자로 동정되었다.
항체 AE12-13, AE12-15, AE12-20, AE12-21, AE12-23, 및 AE12-24는 표준 효모 디스플레이 기술을 이용하여 사람 RGMa에 대해 선별된 대형 나이브(naive) 사람 scFv 효모 라이브러리로부터 동정된 완전 사람 항-RGMa 항체이다. 2 라운드의 자석-활성화된 세포 분류(MACS) 및 4 라운드의 형광-활성화된 세포 분류(FACS)를, 선별 항원으로서 100nM 비오티닐화된 사람 RGMa를 사용하여 라이브러리에 대해 수행하였다. 마지락 라운드의 분류에서, 세포는, 또한, 사람 RGMc-Fc 항원에 대해 네가티브로 선별되었다. 선별된 sc-Fv 단편을 완전한 사람 IgG로 재포맷하였다. 사람 RGMa ELISA에서의 IgG 스크리닝 후, AE12-13, -15, -20, -21, -23, 및 -24가 사람 RGMa에 대한 포지티브 결합자로 동정되었다. AE12-13, AE12-15 및 AE12-23은, 또한, ELISA로 평가시 사람 RGMc에 대해 교차-반응하였다.
실시예 2
항체 특성확인
8개의 PROfusion mAb(AE12-1, AE12-2, AE12-3, AE12-4, AE12-5, AE12-6, AE12-7, 및 AE12-8)를 직접 결합 ELISA로 시험하여 사람 RGMa(hRGMa) 및 래트 RGMa에 대한 결합 및 hRGMc에 대한 교차-반응성을 조사하였다. hRGMa 경쟁 ELISA를 이용하여 이들 mAb 중 임의의 것이 hRGMa에 대해 결합하기 위해 h5F9.23와 경쟁하는지를 시험하였다. h5F9.23은, 래트 하이브리도마로부터 유도되고 RGMa의 N-말단 도메인에 결합하는 것으로 알려져 있는, 사람화된 항-RGMa 리드 mAb이다. h5F9.23은 하기 서열을 갖는다:
Figure 112014081376914-pct00012
네오게닌 또는 BMP-2/BMP-4 경쟁 ELISA를 이용하여 이들 mAb가 수용체 네오게닌 또는 BMP-2/BMP-4에 대한 hRGMa 결합을 차단하는지를 측정하였다.
ELISA 데이터에 기초하여, 모든 8개의 PROfusion mAB가 사람 및 래트 RGMa에 결합하였다(표 3). ELISA에서의 RGMc 결합에 대해, 3개의 mAb(AE12-6, -7 및 -8)가 hRGMc에 대해 결합을 나타내었으며, AE12-4는 고농도에서 약한 결합을 나타내었고, 다른 4개의 mAb(AE12-1, -2, -3 및 -5)는 100nM 이하의 농도에서 hRGMc에 대해 결합을 나타내지 않았다. hRGMa 경쟁 ELISA에서, AE12-1, AE12-3 및 AE12-6은 hRGMa에 대한 결합시 h5F9.23과 경쟁할 수 있었으며, 이는, 이들 3개의 mAb의 결합 에피토프가 h5F9.23 에피토프와 유사하거나 겹친다는 것을 시사한다. hRGMa 단편을 사용한 도트 블롯팅 검정은, AE12-1 및 AE12-6이 N-말단 단편에 결합하고, AE12-2 및 AE12-4는 C-말단 단편에 결합하고, 다른 4개의 Ab는 어떠한 검출가능한 결합 시그널도 보이지 않았음을 나타냈다. 경쟁 ELISA에서 네오게닌에 대한 hRGMa 결합 차단에 대해, 단지 AE12-5 및 AE12-6만이 h5F9.23에 필적하거나 이보다 우수한 차단 활성을 나타내었으며, AE12-1 및 AE12-4는 약한 억제를 나타내었으며, AE12-2, -3, -7, 및 -8은 100nM 이하의 농도에서 억제를 나타내지 않았다. BMP-2/BMP-4 경쟁 ELISA에서, 단지 AE12-1, AE12-4 및 AE12-6만이 BMP-2/BMP-4 대한 hRGMa 결합을 차단하였다.
PROfusion mAb는, 뉴런 세포에 대한 hRGMa 결합을 차단하는 상기 PROfusion mAb의 능력에 대해 세포-기반 결합 검정으로 추가로 시험하였다. 세포를 실온에서 비오티닐화된 hRGMa-Fc와 함께 인큐베이션하고 hRGMa 결합을 스트렙트아비딘-설포-태그로 검출하는, MSD-기반 세포 결합 검정에서, 단지 AE12-1 및 AE12-6만이, h5F9.23과 유사하게, 사람 SH-SY5Y 뉴런 세포에 대한 hRGMa 결합을 차단하였다(표 3).
그러나, 세포를 37℃에서 hRGMa-Fc와 함께 인큐베이션하고 hRGMa 결합을 Cy3-표지된 항-Fc Ab로 검출하고 고함량 형광 영상 분석으로 계산하는, 고함량 스크리닝(HCS) 검정에서, PROfusion 항체들 중 단지 AE12-6만이 SH-SY5Y 뉴런 세포 및 래트 해마 일차 뉴런 둘 다에 대한 RGMa 결합에 대해 강력한 억제를 나타내었다(표 3, 도 13). 또한, 도 13에 도시되는 바와 같이, 나이브 사람 scFv 효모 라이브러리로부터 유도되는 항체인 AE12-15 및 AE12-23이 세포에 대한 hRGMa 결합을 억제하였다.
문헌 [Korchynskyi and ten Dijke(J. Biol. Chem. 2002, 277:4883)]에 기재되는 서열에 기초한 중첩 올리고를 사용하여 BMP 반응 요소(BRE)를 작제하고, 염기성 루시페라제 리포터 벡터 pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro](Promega)로 클로닝하여 BRE 루시페라제 리포터 작제물을 생성하였다. RGM 패밀리 구성원(RGMa, RGMb 및 RGMc)은 BMP 시그널링에 대한 공동수용체이다. RGMa 및 RGMc BMP 리포터 검정 둘 다는, 293HEK 세포를 BMP 리포터 플라스미드 및 RGMa 또는 RGMc 발현 플라스미드로 공동트랜스펙션시켜 확립하고, RGMa 및 RGMc에 대한 중화 활성에 대해 mAb를 스크리닝하는데 이용하였다. RGMa BMP 리포터 검정에서, AE12-1 및 AE12-6이 RGMa 활성을 중화시켰으며, 이는 MSD-기반 세포 결합 검정으로부터의 데이터와 일치한다(표 3). RGMc BMP 리포터 검정에서, AE12-6은 RGMc 활성을 중화시켰고, 반면, AE12-1은 그렇지 않았다. 따라서, AE12-1은 RGMa에 대해 특이적인 중화 mAb이다.
PROfusion mAb는, SH-SY5Y 뉴런 세포를 사용한 주화성 검정으로 RGMa를 중화시키는 PROfusion mAb의 능력에 대해 추가로 시험하였다. 이러한 검정에서, RGMa는 세포 주화성을 억제하는 반발 분자로서 작용한다. AE12-1이 hRGMa에 대해 강한 중화 활성을 나타내었다(표 3). AE12-4 및 AE12-6은 약간의 중화 활성을 나타내었다.
AE12-1는, 사람 SH-SY5Y 뉴런 세포를 사용한 신경돌기 생장(outgrowth) 검정으로 시험하였다. 이러한 검정에서, 전장 RGMa 또는 N-말단 단편은 신경돌기 생장을 억제하였다. RGMa BMP 리포터 검정 및 주화성 검정에서의 기능성 활성과 일치하게, AE12-1은 전장 hRGMa 또는 N-말단 단편에 대해 강한 중화 활성을 나타내었다(표 3).
hRGMc 및 사람, 사이노몰거스(cyno) 원숭이 및 래트 RGMa에 대한 AE12-1의 BIAcore 분석은, AE12-1이 hRGMc에 결합하지 않지만, 사람, cyno 및 래트 RGMa에 대해서는 유사한 친화성로 우수한 교차-반응성을 나타냄을 입증하였다. 표 4를 참조한다.
Figure 112014081376914-pct00013
Figure 112014081376914-pct00014
표 3에 관해서, "aNeg"은, 모든 단편이 도트 블롯팅으로 시험되는 네가티브 결합에 상응한다. "bMSD"는, 스트렙트아비딘-설포-태그와 컴플렉스를 형성하는 비오티닐화된 hRGMa-Fc를 사용하고 실온(RT)에서 세포와 함께 인큐베이션하는 것에 상응한다. "CHCS"는, Cy3-표지된 항-Fc Ab와 컴플렉스를 형성하는 hRGMa-Fc를 사용하고 37℃에서 세포와 함께 인큐베이션하는 것에 상응한다. "dAE12-1"은, MSD에 의한 SH-SY5Y 세포에 대한 비오틴-RGMa-Fc 결합의 억제와는 대조적으로, 세포에 대한 현저히 증진된 RGMa-Fc 결합에 상응한다. "e?"는, AE12-7에 대해 결론에 이르지 못한 데이터에 상응한다. "fAE12-4" - 주화성 검정에서 AE12-4의 농도는 중화 활성과 서로 역관계에 있다.
RGMa 또는 RGMc가 BMP와 상호작용함으로써 BMP 시그널링을 증진시키는, BMP-반응 리포터 검정에서, 서열번호 1 및 5를 포함하는 항체(AE12-1)는, RGMa 활성을 차단하였지만, RGMc 활성은 차단하지 않았으며, 이는 RGMa에 대한 길항작용 및 결합 특이성과 일치한다.
도 13 및 14는, SH-SY5Y 세포 및 래트 해마 일차 뉴런에 대한 생세포 결합 검정을 이용하여, 뉴런 세포에 대한 RGMa 결합에 대한 명시된 항체의 중화 효과를 도시한다. Fc-태그된 RGMa 및 Cy3-표지된 항-Fc 항체를 60분 동안 4℃에서 컴플렉스를 형성시킨 후, 이 컴플렉스를 10분 동안 실온에서 차단 항체와 인큐베이션하였다. 이어서, RGMa-Cy3 + 항체 컴플렉스를 37℃에서 30분 동안 획스트(Hoechsts) 33342와 함께 세포에 가하여 세포 상에 결합시켰다. 이어서, 세포를 배양 배지에서 2회 세척하고, PFH로 고정화시켰다. 세포 영상화를 BD 경로로 수행하고, 영상을 Definiens Architect 소프트웨어로 분석하였다.
상술된 바와 같이, AE12-6, AE12-15, 및 AE12-23은 SH-SY5Y 세포 및 일차 뉴런에 대한 RGMa의 결합을 차단시켰다. 도 13을 참조한다. HCS 검정에서, AE12-1은 SH-SY5Y 세포에 대한 RGMa의 결합을 억제시키지 않았다. 도 14를 참조한다. 최고 농도의 AE12-1은 세포에 대한 RGMa-Fc 결합을 증진시켰으며, 보다 낮은 농도에서는 그 수준이 대조군 RGMa 결합 수준과 같았다. 이는 MSD에 의한 SH-SY5Y 세포에 대한 비오틴-RGMa-Fc 결합 억제와 대조적이다(MSD는, 스트렙트아비딘-설포-태그와 컴플렉스를 형성하는 비오티닐화된 hRGMa-Fc를 사용하고 실온(RT)에서 세포와 함께 인큐베이션하는 것에 상응한다). MDS와 HCS 검정 간의 차이는 상이한 검정 조건에 기인할 수 있다.
도 15는, 신경돌기 생장 검정에서 r5F9(대조군), AE12-1, 및 AE12-6에 의한 RGMa 반발에 대한 중화 효과를 도시한다. 웰당 6500개의 래트 해마 일차 뉴런을 폴리-l-리신 코팅된 96-웰 영상화 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포를 항-RGMa 항체와 병용하여 서열번호 65의 RGMa 단편 47-127(서열번호 139)로 24시간 처리하였다. 세포를 고정화시키고, 밀리포어(Millipore)로부터의 신경돌기 생장 키트 프로토콜을 이용하여 BIII-투불린으로 염색하였다. 영상을 BD 경로로 획득하고, Definiens architect로 분석하여 뉴런당 신경돌기 생장을 측정하였다.
실시예 3
항체 변이체 및 결합 데이터
표 4는, AE12-1 VL CDR3(서열번호 8)의 Cys 잔기를 치환함으로써, 본 발명자가, hRGMa에 대해 개선된 친화성을 갖는 변이체를 생성할 수 있음을 나타낸다. 서열번호 67 내지 73을 참조한다. 예를 들면, 항체 클론 AE12-1-Y가, hRGMa에 대해 10배 이상 증가된 친화성을 나타내고, AE12-1-F가, hRGMa에 대해 5배 증가된 친화성을 나타내는, 표 4를 참조한다. 다른 것들은 모 AE12-1와 유사한 친화성을 나타내었다. 모든 변이체가 MSD-기반 세포 결합 검정에서 SH-SY5Y 세포에 대한 hRGMa 결합을 차단하였으며, BMP 리포터 검정에서 RGMa 활성은 중화시켰으나 RGMc 활성은 중화시키지 않았으며, 전 제형(preformulation) 연구에서 높은 열적 안정성 및 우수한 가용성을 나타내었다.
Figure 112014081376914-pct00015
실시예 4
신경돌기 생장
도 1, 2 및 15에 도시되는 바와 같이, AE12-1은, SH-SY5Y 세포 및 래트 해마 일차 뉴런에서 나타나는 바와 같이, 전장 hRGMa 및 hRGMa의 단편을 완전히 중화시켰다. hRGMa의 이러한 단편은, PCKI LKCNSEFWSA TSGSHAPASD DTPEFCAALR SYALCTRRTA RTCRGDLAYH SAVHGIEDLM SQHNCSKDGP TSQPRLR(서열번호 139)와 같이 여기에 나타낸 서열번호 65의 아미노산 47 내지 127에 상응한다.
추가의 신경돌기 생장 실험을 수행하여 AE12-1 및 AE12-1 변이체(여기서, 이 항체는 서열번호 1 및 5, 또는 2 내지 4 및 6 내지 8을 포함하고, 서열번호 8의 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 여기서, 서열번호 5의 위치 91의 Cys 잔기가 다른 아미노산으로 치환된다)(즉, AE12-1-F, AE12-1-H, AE12-1-L, AE12-1-V, AE12-1-I, AE12-1-K, 및 AE12-1-Y)의 효과를 평가하였다. FL hRGMa로 처리된 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 생장에 대한 기재된 항체에 의한 억제(24시간 인큐베이션)가 도시되는 도 9 내지 12를 참조한다.
실시예 5
생체내 연구
도 3 및 4에 도시되는 바와 같이, AE12-1은 병변 주위에서(0 내지 500μm) 망막 신경절 세포 축색돌기의 재생적 성장을 증진시켰다(n = 3 내지 5마리 래트/그룹). 도 3을 참조한다. 항체 AE12-1은, 또한, 망막 신경절 세포 축색돌기의 병변으로부터 멀리 떨어진(500 내지 1000μm) 부위로의 재생적 성장도 증진시켰다(n = 3 내지 5마리 래트/그룹).
실시예 6
래트 시신경 압궤 실험
AE12-1는, 래트 시신경 압궤(optic nerve crush) 실험에서 활성이었다. 도 8을 참조한다. 수컷 위스타 래트에서 눈 뒤 2 내지 4mm에서 일측성 시신경 압궤 병변을 만들었다. 래트를 6주 동안 주당 1회씩 10mg/kg, 1mg/kg, 또는 0.1mg/kg의 항체를 정맥내 투여하였다(8개 그룹, n=6). hIgG1 대조군을 주당 1회씩 10mg/kg의 농도로 정맥내 투여하였다(n=6 래트). AE12-1 처리된 래트에서는 시신경 압궤 병변 너머로 재생 섬유가 성장할 수 있었으나, 대조군 항체 hIgG1-처리된 래트에서는 병변을 압도할 능력이 없기 때문에 재생 섬유가 병변에 축적되었다. 도 8을 참조한다.
실시예 7
모노클로날 항체 AE12 -1와 관련한 사람 RGMa(hRGMa )의 에피토프 맵핑
에피토프 맵핑 연구를 모노클로날 항체 AE12-1에 대해 수행하였다. 데이터는, AE12-1에 대한 에피토프가 RGMa의 N-말단 영역에 위치함을 시사하였다. 수개의 hRGMa 작제물을 AE12-1에 대한 에피토프의 측정을 위한 시도에 사용하였다. 이들 작제물은 하기를 포함하였다:
pelB-M-[RGMA(47-168)]-6His("6His"는 서열번호 148로 기술됨)(이. 콜라이), 재조합적으로 생산됨. 항원은 ChemTag#16211, S100 완충액, pH8, 25mM Tris, 100mM NaCl, 1mM DTT, 10%(v/v) 글리세롤 중 0.41mg/mL이다. 이러한 제1 항원 작제물의 서열은 하기와 같다: MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MAMPC KILKC NSEFW SATSG SHAPA SDDTP EFCAA LRSYA LCTRR TARTC RGDLA YHSAV HGIED LMSQH NCSKD GPTSQ PRLRT LPPAG DSQER SDSPE ICHYE KSFHK HSATP NYTHC GLFGD HHHHHH (서열번호 75).
[IgK-leader]-AttB1-[hRGMA(47-422)]-AttB2-MYC-6His("6His"은 서열번호 148로 기술됨), 재조합적으로 생산됨, PBS 중 0.85 mg/ml. 이러한 제2 항원 작제물의 서열은 하기와 같다: METDT LLLWV LLLWV PGSTG DAAQP ARRAR RTKLG TELGS TSPVW WNSAD ITSLY KKAGS PCKIL KCNSE FWSAT SGSHA PASDD TPEFC AALRS YALCT RRTAR TCRGD LAYHS AVHGI EDLMS QHNCS KDGPT SQPRL RTLPP AGDSQ ERSDS PEICH YEKSF HKHSA TPNYT HCGLF GDPHL RTFTD RFQTC KVQGA WPLID NNYLN VQVTN TPVLP GSAAT ATSKL TIIFK FNQEC VDQKV YQAEM DELPA AFVDG SKNGG DKHGA NSLKI TEKVS GQHVE IQAKY IGTTI VVRQV GRYLT FAVRM PEEVV NAVED WDSQG LYLCL RGCPL NQQID FQAFH TNAEG TGARR LAAAS PAPTA PETFP YETAV AKCKE KLPVE DLYYQ ACVFD LLTTG DVNFT LAAYY ALEDV KMLHS NKDKL HLYER TRDLP GNPAF LYKVV ISSTV AAARG GPEQK LISEE DLNSA VDHHH HHH (서열번호 76).
[IgK-leader]-AttB1-[hRGMA(47-168)]-Xa-[hlgG L Fc (257-481)](포유동물 작제물), 재조합적으로 생산됨, PBS 중 1.18 mg/ml. 이러한 제3 항원 작제물의 서열은 하기와 같다: METDT LLLWV LLLWV PGSTG DAAQP ARRAR RTKLP CKILK CNSEF WSATS GSHAP ASDDT PEFCA ALRSY ALCTR RTART CRGDL AYHSA VHGIE DLMSQ HNCSK DGPTS QPRLR TLPPA GDSQE RSDSP EICHY EKSFH KHSAT PNYTH CGLFG DLNSA DIEGR MDPPC PAPEL LGGPS VFLFP PKPKD TLMIS RTPEV TCVVV DVSHE DPEVK FNWYV DGVEV HNAKT KPREE QYNST YRVVS VLTVL HQDWL NGKEY KCKVS NKALP APIEK TISKA KGQPR EPQVY TLPPS REEMT KNQVS LTCLV KGFYP SDIAV EWESN GQPEN NYKTT PPVLD SDGSF FLYSK LTVDK SRWQQ GNVFS CSVMH EALHN HYTQK SLSLS PGK (서열번호 77).
사용된 항원 모두 RGMa(47-168)의 아미노산 서열을 포함하며, 서열 위치를 동정하는데 사용된 넘버링은 모 단백질의 넘버링에 상응한다. hRGMa(47-168)의 서열은 하기와 같다: PCKI LKCNS EFWSA TSGSH APASD DTPEF CAALR SYALC TRRTA RTCRG DLAYH SAVHG IEDLM SQHNC SKDGP TSQPR LRTLP PAGDS QERSD SPEIC HYEKS FHKHS ATPNY THCGL FGD (서열번호 78).
에피토프를 절단하는데 사용된 완충액은 하기와 같았다:
완충액 A: 100mM NaHCO3, 500mM NaCl, pH 8;
완충액 B: 100mM NaHCO3, 100mM NaCl, pH 8;
완충액 C: 100mM NaOAc, 500mM NaCl, pH 4; 및
완충액 D: 100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 8.
모노클로날 항체를 하기와 같이 고정화시켰다. 20 mg의 CNBr-활성화된 세파로즈 비드(GE Healthcare, Uppsala Sweden)를 35μm 프릿을 갖는 소형(compact) 반응 컬럼(USB Corp., Cleveland, OH)에 가하고, 200μl의 1mM HCl로 3회 세척한 후, 200μl의 완충액 A로 3회 세척하였다.
약 5 내지 6 nmol의 AE12-1 mAb 용액을 10,000 MWCO Slide-A-Lyzer 미니 투석 유니트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 약 40분 동안 PBS에 대해 투석하여, 세파로즈에 대한 항체 결합을 방해할 수 있는 히스티딘 완충액을 제거하였다. 투석된 mAb 용액을 활성화된 수지에 가하고, 실온에서 4시간 동안 회전자(Mix-All Laboratory Tube Mixer, Torrey Pines Scientific, San Marcos, CA) 상에서 혼합하였다. 결합 후, 수지 관류물(flow-through)을 수집하고, 수지를 200μl 완충액 A로 3회 세척하였다. 수지를 200μl의 완충액 D에 현탁시키고, 1시간 동안 실온에서 회전시켜 수지 중의 과도한 결합 부위를 차단하였다. 완충액 D 용액을 플러싱하고, 수지를 200μl의 완충액 C 및 완충액 D(저/고 pH 세척)로 교대로 각각 총 3회 세척하였다. 수지를 200μl의 완충액 B로 3회 세척하여 항원과의 커플링을 준비하였다.
고정화된 AE12-1 모노클로날 항체를 hRGMa에 커플링하였다. 항원 커플링을 위해 35μm 프릿의 소형 반응 컬럼(CRC)을 200μl의 완충액 B로 3회 세척함으로써 CRC를 준비하였다. 결합된 항체를 갖는 수지를 약하게 혼합하여 수지를 균질하게 재현탁시키고, 50μl의 수지를 각각의 준비된 CRC에 가하였다. 수지를 200μl 완충액 B로 3회 세척하였다. 약 1.5 nmol의 hRGMa 항원을 총 용적이 200μl 이상이 되게 하기에 충분한 완충액 B와 함께 수지에 가하였다. 항원 커플링 전, 이. 콜라이 생성된 항원을 3500 MWCO Slide-A-Lyzer 미니-투석 유니트를 사용하여 약 30분 동안 PBS 완충액에 대해 투석하여 항원 완충액으로부터 DTT를 제거하였다. 항원/수지 혼합물을 4시간 동안 실온에서 회전자 상에서 혼합하였다. 관류물(FT)을 수집하고, 수지를 200μl의 완충액 B로 3회 세척하였다.
에피토프를 트립신 및 엔도프로테이나제 Asp-N으로 절단하였다. 고정화된 항체/항원 컴플렉스를 포함하는 수지를 200μl의 완충액 B에 현탁시켰다. 20 μg의 트립신(Promega, Madison, WI)을 갖는 바이알을 0.2μg/μl의 농도가 되도록 100μl의 재현탁 완충액(50mM HOAc)에 용해시키고, 2 μg 바이알의 엔도프로테이나제 Asp-N(Roche)를 50μl 물(0.04μg/μl)에 용해시켰다. 항원 절단을 1:100 비(w/w)의 효소:항원으로 수행하였다. 반응을 실온에서 회전시키면서 4 내지 6 시간 동안 수행하였다.
분해 후, FT를 수집하고, 수지를 200μl의 완충액 B로 2회 세척하고, 각각의 세척물을 구분해서 수집하고(세척 1 및 2), 200μl의 완충액 A(세척 3)로 세척하고, 이어서, 200μl의 완충액 B(세척 4)로 세척하였다. 항체에 결합된 항원 펩타이드를 3개의 200μl 분량의 2% 포름산으로 수지로부터 용출시킨 후, 각각의 용출물을 구분해서 수집하였다(용출 1, 2 및 3). 용출 분획물을 질량 분광분석(LC-MS/MS)으로 분석하여 에피토프 영역을 측정하였다.
분해 후 수집된 용출 1 분획물을 Agilent(Santa Clara, CA) 1100 모세관 HPLC 로딩 펌프 및 1200 나노-HPLC 구배 펌프를 사용하여 LC-ESI-MS/MS(포지티브 이온)로 분석하였다(칩 큐브(40 nL 농축 컬럼, 75μm x 43 mm 분석 컬럼, C8 ZORBAX 칩)가 Agilent 6510 QTOF MS에 인터페이스로 연결됨). 7μl 이하의 주입물을 사용하고 MS/MS는 명시된 MS 시그널 기준을 만족시키는 탑 3 이온에 대해 수행하였다.
에피토프 절단 분획물(용출 1)에 대한 초기 MS 분석은, 아마도 디설파이드 결합된 펩타이드의 존재 때문에, 예상된 단백분해 펩타이드와 일치될 수 없었던 커다란 펩타이드 종의 존재를 나타내었다. 디설파이드 결합을 감소시키기 위해서, 10μl 분취물을 희석된 NaOH를 사용하여 약 pH 8로 조절하고, MS로 재분석하기 전에 30분 동안 37℃에서 5mM 디티오트레이톨(DTT) 중에서 환원시켰다. 일부 분획물은 환원을 위해 변성이 필요하였으며, 이 경우 DTT를 가하기 전에 분취물을 등용적의 8 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 100mM Tris(pH 8) 중에 희석시켰다.
다양한 hRGMa 작제물에 커플링된 AE12-1 mAb의 효소적 분해물에 대한 용출 1 분획물 모두를 LC-ESI-MS/MS 분석한 결과, 8.5 - 12 kDa 분자량 범위를 갖는 수개의 커다란 펩타이드 종의 존재가 나타났다. 이러한 커다란 종의 질량 및 분절화가 펩타이드를 확인하는데 충분하지 않았다. 에피토프 펩타이드를 확인하기 위해, 디설파이드 결합을 환원시키는 것이 필수적이었다. 모든 경우에서, 펩타이드는 환원 후 MS 시그널 강도가 상당히 감소되었으며, 일부의 경우에서는 변성제 존재 하에 환원되지 않는 한 검출가능하지 않았다.
DTT를 사용한 용출 1 분획물의 환원 후, 이 분획물을 LC-MS/MS로 재분석하였다. 이. 콜라이 생성된 hRGMa를 사용한 절단 실험에서, 이온 크로마토그램에서 관측된 대부분의 피크는 단일 하전 종이었으며, 많은 종들이 중합체 또는 다른 첨가물과 관련되었다. 2개의 펩타이드가 사용된 hRGMa 작제물과 관련되는 것으로 확인되었다. 도 5를 참조한다. 제1 펩타이드는 2420.2 Da의 모노이소토픽(monoisotopic) 분자량을 갖는 펩타이드였다. 이 펩타이드의 분자량 및 MS/MS 스펙트럼에서 관측된 몇몇 단편의 질량(도시되지 않음)은, 비록 배치가 효소 특이성과는 불일치했지만, 서열 PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69)(서열번호 79)과 일치한다. 2551.2 Da의 모노이소토픽 분자량을 갖는 제2 포텐셜 에피토프 펩타이드는, 서열 MPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (서열번호 80)과 일치하는, 단지 2 내지 3개의 확인가능한 MS/MS 단편을 보였다. 효소 특이성은 일치하지 않았다; 그러나, 출발 항원의 분자량이 전체 서열의 계산된 질량과 일치하지 않았으므로, 이 항원은 식별가능한(apparent) 불일치 효소 특이성을 설명할 N-말단 이질성을 가질 수 있다.
제2 항원 작제물을 사용하는 경우, DTT 환원 후 MS 스펙트럼에서 어떠한 펩타이드도 관측될 수 없었다. 변성 조건 하에서의 환원 후 MS 분석 결과, 단일 하전된 백그라운드 이온 중에서 펩타이드를 보였다. 이 항원으로부터의 4개의 펩타이드가 변성되고 환원된 E1 분획물에서 확인되었다. 제1 항원-관련된 펩타이드는, MS/MS 분절화에 따라, 서열 KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (서열번호 81)(4개의 추가의 N-말단 잔기를 갖는 hRGMa 47-69)과 일치하는, 2763.3 Da의 모노이소토픽 분자량을 가졌다. 이 펩타이드와 연관된 스펙트럼이 도 6에 나타나 있다. 동일한 스펙트럼에서 매우 약한 강도의 펩타이드 시그널(MW 2878.4 Da; m/z 720.84에서 +4, 도 6에서 별표로 표시됨)은 서열 KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPASD (서열번호 82)와 일치하였다. 도 7에 나타난 MW 2635.2의 펩타이드는 서열 AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPAS (서열번호 90)와 일치하였다. m/z 688.82(가장 풍부한 동위원소, +4 하전 상태)에서의 추가의 펩타이드(도 7에서 별표로 표시됨)가 MW 2635.2 펩타이드와 함께 공동-용출되었다. 이러한 낮은 강도 성분 상에서 수득된 제한된 MS/MS 데이터는 서열 AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPASD(서열번호 83)(MW 2750.3 Da)와 일치하였다.
제3의 hRGMa 작제물을 사용하여 AE12-1과 관련된 에피토프를 확인하고자 하였다. DTT-환원된 용출 1 분획물에서, 매우 적은 환원이 관측되었으나, 하나의 펩타이드가 hRGMa 항원과 관련되고 다른 항원 작제물로부터의 결과와 일치하는 것으로 확인될 수 있었다. 이 펩타이드는 m/z 691.60(+ 4 하전 상태)에서 관측되었으며, 2762.4 Da의 모노이소토픽 분자량을 가졌다. 이 펩타이드에 대해 수득된 제한된 MS/MS 데이터(도시되지 않음)는 이 서열을 TKLPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (서열번호 84)로 제시한다. hRGMa(47-168) 영역과 관련되는 것으로 지정될 수 있었던 MS 스펙트럼에서 관측된 다른 펩타이드는 DSPEICHYEK (서열번호 85); GDLAYHSAVHGIE (서열번호 86); DLAYHSAVHGIE (서열번호 87); 및 DDTPEFCAALR (서열번호 88)을 포함하였다.
AE12-1에 결합된 hRGMa의 에피토프 절단 실험으로부터의 용출 1 분획물(트립신/Asp-N 분해)에서, 3개의 항원 작제물로부터 펩타이드 hRGMa(47-69)가 확인되었다. AE12-1과 관련된 hRGMa에 대한 에피토프로 확인된 펩타이드는 PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa 47-69)(서열번호 79)이다.
실시예 8
독성 연구
간세포에서의 철 축적 및 비장에서의 철 감소가 RGMc 중화로부터 발생할 수 있으므로, 본원에서 기술되는 RGMa-선택적 모노클로날 항체의 독성역학 및 내성을 조사하였다. 본 연구는 RGMa-선택적 모노클로날 항체가 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에게 투여되는 경우 간세포에서의 철 축적 및 비장에서의 철 고갈이 발생하지 않을 것이라는 것을 보일 것으로 기대된다.
실시예 9
RGMa-선택적 모노클로날 항체 AE12-1 및 AE12-1Y는 사람화된 모노클로날 항체 5F9와 같이 시신경 손상 래트 모델에서 압궤되고 손상된 시신경 축색돌기의 재생을 유도한다.
시신경 압궤(또한 "시신경 손상"으로도 지칭됨) 모델은 시신경 섬유의 재생을 자극하고 망막 신경절 세포의 대량 세포사를 감소시키는 다양한 물질을 시험하기 위한 동물 모델을 제공한다.
본 실험은 챨스 리버 (D) 래보러토리즈(Charles River (D) Laboratories, 독일)로부터 입수된 다자란 수컷 위스타 래트에서 수행되었다. 이 동물을 음식과 물의 무제한 공급과 함께 12:12 시간 낮/밤 주기로 단일 우리에서 가두었다. 시신경 압궤는 문헌 [P. Monnier et al., J. Neurosci ., 31:10494-10505 (2011), 이의 내용이 본원에 인용에 의해 포함됨]에서 기술되는 바와 같이 항상 최소한의 전방 수술에 의해 좌측 눈에서만 수행되고, 사람 전방 시각 수술법을 따른다. 수술 전 및 수술 동안, 동물을 세보플루란(Sevoflurane)(Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Germany)을 사용하여 흡입 마취로 마취시키고, 죠 클램프(jaw clamp) 및 접착 테이프를 사용하여 사지를 수술대에 고정화시킨다. 동물을 가열 패드 위에 두어 체온 강하를 방지한다. 래트 시신경의 전방 압궤 수술을 위해, 좌측 눈의 인대 및 연결 조직을 조심스럽게 제거한다. 제1 단계로서, 눈 바깥 코너의 인접 조직을 미세수술로 절개한다(2-3 mm). 다음 단계로서, 눈 근육 및 눈물샘을 옆으로 이동시키기 위해 한 쌍의 겸자를 사용하여 시신경을 노출시킴으로써 시신경에 위해를 가하지 않는다. 다음 단계로서, 시신경을 노출시키기 위해 미세가위를 사용하여 뇌척수막을 세로로 개방한다. 그 결과, 눈의 이동성을 높이고 눈의 측면 회전 및 좌측 시신경에의 접근을 가능하게 한다. 10 내지 20초 동안 고정화된 최대 압력을 제공하기 위해 한 쌍의 겸자를 사용하여 시신경을 눈 뒤 약 1-3mm에서 손상시킨다. 눈에 대한 혈관 공급에 손상을 주지 않도록 특별한 주의를 기울인다.
최소한의 침입성 수술 후, 동물이 움직이기 시작할 때까지 동물을 체온을 조절하기 위해 보온기에 놓인 청결한 우리의 페이퍼 타올 상에 놓는다. 항생제 Gentamytrex, Dr. Mann Pharma)를 포함하는 연고를 눈에 발라 세균 감염 및 공막 건조를 방지한다.
카프로펜(Carprofen)(Rimadyl, 5mg/kg)을 수술 직후 및 이어서 3일 동안 하루에 2회씩 수술후 통증 치료를 위해 복강내 투여한다. 수술 직후 및 그 다음 2 내지 4일에 수시간 동안 규칙적으로 동물을 관측하고 관리함으로써 모든 동물이 마취 및 수술로부터 생존하고 회복되도록 한다.
상술된 변형된 전방 시신경 압궤 접근법은 눈의 후방부로부터 유래되는 표준 시신경 압궤 수술과 비교해 상당한 이점을 갖는다. 구체적으로, 본원에서 기술되는 수술에서, 봉합이 필요한 커다란 개방 상처가 생기지 않으며, 매우 작은 상처에 대한 감염 위험이 상당히 감소된다. 또한, 압궤에 필요한 시간이 짧으므로(상술된 전방 방법은 당업계에 공지된 후방 방법에 비해 약 3배 빠르다), 동물들은 덜 고통을 받고 따라서 덜 스트레스를 받는다. 또한, 동물들이 겪는 통증의 양이 상당히 줄고 동물들은 더욱 빠른 속도로 더욱 신속하게 회복된다.
항체의 전신 투여
전신 항체 전달을 위해, 수컷 위스타 래트를 사람화된 RGMa 및 RGMc-차단 5F9 항체(h5F9)(n = 8 동물)(사람화된 항체 5F9는 미국 특허 공개 번호 2010/0028340에 기술되어 있으며, 이의 내용이 본원에 인용에 의해 포함된다), 본원에서 기술되는 RGMa-선택적 사람 항체인 AE12-1, 본원에서 기술되는 밀접히 관련된 RGMa mAb인 AE12-1Y, 및 사람 이소타입 대조군 항체(hIgG)(n = 8 동물)를 사용하여 전신적으로 정맥내(iv) 처리하였다. 래트에게 10mg/kg의 항체를 주당 1회씩 정맥내로 주사하였으며, 주사는 시신경 압궤직 후 개시하였다. 모든 래트는 5회 주사되었으며, 압궤 손상 6주 후 안락사시켰다. 실험은 블라인드 처리하였으며, 조직 분리, 프로세싱, 절편 제조 및 정량 분석은 문헌 [P. Monnier et al., J. Neurosci., 31:10494-10505 (2011) and Koeberle et al., Neuroscience, 169:495-504 (2010), 이의 내용이 본원에 인용에 의해 포함됨]에서 기술되는 바와 같이 수행하였다. 래트 시신경의 복합 영상을 준비하고, 압궤 부위를 확인한 후, 압궤 부위를 너머 500μm 길이로 연장된 GAP-43 포지티브 섬유를 계수하였다. 도 16에 도시되는 바와 같이, 모든 3개의 RGMa 항체 - h5F9, AE12-1 및 AE12-1Y는, hIgG로 처리된 대조군 동물과는 반대로, 압궤 부위 너머로 상당한 재생적 성장을 유도하였다.
실시예 10
RGMa -선택적 모노클로날 항체 AE12 -1 및 AE12 -1Y는 사람화된 항체 5F9와 같이 변성으로부터 망막 신경 섬유층(RNLF )를 보호한다
RNLF 변성에 대한 보호를 관찰하기 위해서, 새로운 실험실 검정법을 이용하였다. 이 방법은 시신경 압궤를 갖고 항체 5F9, AE12-1, AE2-1Y 및 대조군 항체 사람 IgG로 전신적으로 처리된 래트 눈으로부터 다자란 래트 망막을 설명하고 분석하는 것에 기초한다. 이 방법은 문헌 [P. Monnier et al., J. Neurosci ., 31:10494-10505 (2011) and Koeberle et al., Neuroscience, 169:495-504 (2010). P. Monnier et al., J. Neurosci ., 31:10494-10505 (2011) 및 Koeberle et al., Neuroscience, 169:495-504 (2010)]의 방법을 따른다. 챨스 리버 래보러터리즈(독일)로부터 입수된 다자란 수컷 위스타 래트에 10mg/kg의 항체를 주당 1회씩 정맥내 주사하였으며, 주사는 시신경 압궤직 후 개시하였다. 모든 래트는 5회 주사되었으며, 압궤 손상 6주 후 안락사시켰다.
망막 제조 및 면역형광 염색:
동물들을 세보플루란(8%; Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Germany)으로 강하게 마취시킨 후, 흉곽을 개방하여 즉시 희생시키고, 좌심실을 통해 4% 파라포름알데하이드(PFA) 용액을 관류시켰다. 눈을 적응된 연결 조직과 함께 절개하고 망막이 제조될 때까지 4% PFA에 두었다.
망막 제조를 행크 균형 염 용액(HBSS, 마그네슘- 및 칼슘-비함유; Invitrogen, #14170070) 중에서 수행하였다. 눈을 핀셋으로 연결 조직에 고정화시키고, 각막을 바로 둘러싸는 공막에 둥근 절개를 만들었다.
망막의 반구를 4개의 포인트로 자르고, 개방한 후, 그레이 니트로셀룰로즈 막(Sartorius, #13006-50-N)에 펼쳤다. 필요한 경우, 망막을 갖는 막을 5 내지 10초 동안 공기 건조시켰다.
이후, 면역형광 염색을 수행할 때까지 막 상의 망막을 +4℃에서 10% 중성 포스페이트-완충된 포름알데하이드 용액(pH 7.3; Fisher Scientific, #F/1520/21)에 두었다. 후술되는 프로토콜에 따라 염색을 수행한다.
망막 제조물을 TBS로 세척하고, 30분 동안 TBS 중의 5 % BSA, 1 % Triton X-100으로 차단 및 투과화 처리한 후, TBS로 다시 세척하였다. 일차 항체, 즉 모노클로날 Ab TUJ-1(마우스 항-β III 투불린 Ab, AbCam, # ab14545;1:500 희석, TBS 중, 5% BSA)를 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 가한 후, TBS, 0.1 % Tween 20으로 세척하였다. 이어서, 2차 항체, 즉 당나귀 항-마우스 Cy3(Jackson ImmunoResearch(Dianova) 715-165-151, 1:1000 희석) 및 비스벤즈이미드(50 μg/ml 1:100 희석, TBS 중, 5 % BSA)를 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 가한 후, TBS, 0.1 % Tween 20으로 세척하고, 이어서 탈염된 H2O로 세척하였다. 이어서, 제조물을 플루오로마운트(Fluoromount) G와 함께 마운팅하고, 어둠 속에서 +4℃에서 저장하였다.
눈의 망막 신경 섬유층(RNFL)에 대한 RGMa 항체의 보호 효과의 정량적 분석
악시오비젼(Axiovision) 소프트웨어를 사용하여, 각각의 망막에 대한 무작위로 선택된 영상(n = 12)을 골라 각각의 영상에 대한 신경 섬유의 수를 측정하였다. 이들 실험을 위해, 압궤된 시신경을 갖는 5 내지 8개의 망막을 h5F9 MAb 그룹, hIgG 대조군 MAb 그룹 및 AE12.1 및 AE12-1Y MAb 그룹 각각에 대해 사용하였다: . 데이터 분석 및 통계학적 분석은 GraphPad 프리즘 프로그램을 이용하여 수행하였다.
그 결과가 도 17에 도시되어 있다. 구체적으로, hIgG 대조군 항체 처리된 동물에 비해, 본 발명의 RGMa 항체로 전신적으로 처리된 동물의 망막에서 상당히 큰 수의 신경 섬유 다발이 관측된다.
실시예 11
RGMa 항체는 국소적인 척수의 실험적 자가면역 뇌척수염( EAE ) 모델에서 기능 회복을 촉진시킨다 .
Kerschensteiner 등[Am . J. Pathol . 164: 1455 - 69, 2004]은 커다란 염증 병변이 척수, 뇌 및 시신경에서 무작위로 번지지 않고 척수 또는 다른 뇌 부위에서 선택적으로 유도될 수 있는 국소적으로 국한된 실험적 자가면역 뇌척수염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: EAE) 모델을 개발하였다. 이러한 국소적 또는 표적화된 EAE 모델을 사용하여, MS 척수 병변과 매우 유사한 커다란 염증 병변을 척수의 척주에서 유도하여 피질척수로를 병들게 하였다. 이러한 모델에서, 래트는 먼저 수초 단백질 MOG로 면역화된다. 면역화 후 2 내지 3주에, MOG 항체 역가를 측정하였으며, 포지티브 면역 반응을 갖는 동물에 흉부 수준 8(T8)에서 국소적으로 사이토킨 혼합물(TNF α 250 ng, IFNg 150 U)을 주사하였다. 사이토킨 주사 후 1주일 내에, 래트는 EAE 스코어 2.5에 달하는 뒷다리 운동 결함, 꼬리 마비 및 보행 장애를 나타내었다. 사이토킨 주사 후 4주에, 이러한 스코어는 EAE 스코어 1로 개선되었다 [Kerschensteiner et al., Am. J. Pathol. 164: 1455 - 69, 2004].
암컷 루이스 래트에 염수 중에 용해되고 이어서 75μl의 불환전 프로인트 보조제(IFA, Sigma, #F5506)와 함께 유화된 75μl의 MOG(75 μg, 1-125 aa, BlueSky Biotech, Worcester, MA)를 피하 주사하였다. 주사직 전 및 이어서 매 7 내지 8일마다 동물로부터 혈액 샘플을 취하여 MOG 항체에 대해 분석하였다.
MOG 면역화 후 2 또는 3주에, 면역화된 래트로부터 혈액을 수집하고, ELISA를 수행하여 MOG-특이적 항체를 검출하였다. 면역화에 의해 90% 초과의 면역화된 래트에서 MOG 항체가 유도되었다. 그러나, 이러한 스트레인에서, MOG 항체 유도는 어떠한 질환 증상도 초래하지 않았다. 루이스 래트는 단지 흉부 수준 8(T8)에서 흉부 척수로 2개의 염증성 사이토킨을 주사한 후 운동 결함을 나타내었다.
사이토킨 주사를 위해, 래트를 세보플루란(8%; Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Germany)으로 흡입 마취시키고, 척추후궁절제를 표준 절차에 따라 수행하였다. 구체적으로, 래트의 등 피부를 면도질하고, 70% 에탄올로 소독한 후, 면도된 부위를 프로딘으로 닦고, 약 T3-4부터 T11-12까지 메스로 2 내지 3 cm 절개하였다. 표층 지방을 근육으로부터 미세한 가위를 사용해 분리시키고, 근육을 중간선 가까이서 척추를 따라 한쪽으로부터 절개하였다. T8과 T9 사이에 갭이 위치되며 인접 조직으로부터 T8을 정리하였다. 미세드릴을 사용하여 T8에 직경 약 1 내지 2 mm의 둥근 구멍을 만들고, 작은 팁을 갖는 핀셋을 사용하여 골막 및 임의의 골 단편을 제거하였다. 이어서, 미세가위로 경막을 제거하고, 루어 팁(Luer Tip: LT)을 갖고 광유(Sigma Aldrich)로 채워진 10μl 해밀톤 주사기에 연결된 매우 가는 유리 모세관으로 정위 주사를 수행하였다.
자동 주입기를 사용하여, 모세관을 PBS 중의 3μl의 사이토킨 혼합물 또는 단지 미량의 에반스 블루(Evans blue)를 갖는 PBS로 채웠다. 문헌 [Kerschensteiner et al. (2004)]에서 보고되는 바와 같이, 4배(4x) 고용량의 TNF α(1000ng) 및 동일 용량의 IFNγ(150 U)를 사용하였다. 4배 고용량은 비히클 또는 대조군 처리된 래트에서 회복 과정을 상당히 연장시켰다.
다음 단계에서, 유리 모세관을 0.7 mm 깊이로 삽입하고, 2μl의 사이토킨 혼합물을 자동 주입기를 사용하여 5분 동안(T8)에서 척수 중간에 주사하였다. 리도카인을 적용하고 상처를 닫은 후, 래트를 (수술 직후 및 이어서 3 내지 4일 동안 매일) 진통약인 리마딜(Rimadyl)로 처리하였다. 이어서, 래트를 페이퍼 타올 상의 청결한 면에 놓고, 깨어날 때까지 따뜻하게 유지하였다.
래트는 사이토킨 주사 후 1주 내에 제1 증상을 나타내었다. 사이토킨 적용 후 7 또는 8일에 항체 처리를 개시하였다. hIgG 대조군 항체 및 수개의 상이한 RGMa 항체[즉, AE12-1, AE12-1Y 및 사람화된 5F9.23(미국 특허 공개 번호 2010/0028340에 기술된 h5f9.23)]를 사용하여 래트를 정맥내 경로를 통해 주당 1회 처리하였다. EAE 스코어를 매일 측정하고 스코어를 기록하였다. 실험을 수행하는 개체는 상이한 처리 그룹에 대해 블라인드 처리되었다. 사이토킨 투여 후 27 내지 29일 기간 후, 동물을 죽이고, 척수를 분리한 후, GAP-43(재생 마커), CD68(활성화된 소교세포 및 대식구에 대한 염증 마커) 및 MPB(수초 염기성 단백질, 재수초화 또는 보존된 수초로에 대한 마커) 단백질 발현에 대해 분석하였다. 이들 마커의 부위를 측정하고, 분석한 후, 일방적 ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 유의성 시험을 이용하여 통계학적으로 평가하였다. 도 18에 도시되는 바와 같이, 3개의 RGMa 항체 모두 척수 tEAE 모델에서 기능 회복을 촉진시켰다.
척수 tEAE 모델에서, RGMa 항체 모두 매우 유사한 재생- 및 신경보호 자극 활성을 나타내었다. RGMa-선택적 항체인 AE12-1 및 AE12-1Y는 RGMa 및 RGMc 모두를 중화하는 h5F9.25와 비교하여 유사한 활성을 나타내었다. RGMc의 중화는 효능에 필요한 것으로 보이지 않는다. 따라서, 국소 척수 EAE 모델에서 3개의 RGMa mAb 모두에 대한 작용 기작을 더욱 잘 이해하기 위해, 항체 처리된 래트의 일련의 척수 절편에서 수개의 마커를 평가하였다. AE12-1Y, AE12-1 및 h5F9.23은 재생 부위(AGP-43) 및 재수초화 부위(수초 염기성 단백질(MBP))를 증가시켰으며, 척수 병변 부위 주위의 염증성 CD68(CD68-포지티브) 부위를 감소시켰다(도 19 참조).
이러한 척수 tEAE 모델에서 활성인 RGMa-선택적 항체 AE12-1Y-QL의 용량을 측정하기 위해 상기 항체를 시험하였다. 구체적으로 4개의 상이한 항체 용량(즉, 0.01, 0.1, 1, 10mg/kg)이 상기 래트에 주당 1회씩 전신적으로 IV 투여되었다. AE12-1Y-QL은 0.1, 1 및 10mg/kg에서 유의한 활성을 나타내었다(도 20). 그러나, 0.01mg/kg의 용량에서는 효능을 나타내지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE DEUTSCHLAND GMBH & CO. KG; ABBVIE INC. <120> COMPOSITION AND METHOD FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF DISEASE ASSOCIATED WITH NEURITE DEGENERATION <130> 11423USO1 <150> US 61/591,324 <151> 2012-01-27 <160> 158 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ser Gly Pro Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ser His Gly Ile Ser 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Val Gly Ser Gly Pro Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Ser Val Gly Asp Ser 20 25 30 Ile Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Leu Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Thr 85 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Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Val Tyr Ser Ser Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 17 <212> 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Glu 1 5 10 15 Asp Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Cys 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Cys Leu His 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asp Ser Gly Asn Thr Gly Phe Val Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asp Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Phe Gly Ser Gly Tyr Asp Leu Asp His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Asn Tyr Asp Ile Ala 1 5 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Trp Met Asn Pro Asp Ser Gly Asn Thr Gly Phe Val Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Asp Arg Phe Gly Ser Gly Tyr Asp Leu Asp His 1 5 10 <210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Gly Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 46 <211> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Asp Ile Pro Lys Val Gly Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Gly Ala Leu Gly 1 5 10 15 Tyr <210> 61 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Ile Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Ser Ser Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Gly His 85 90 95 His Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Asp Ile Ser Val His 1 5 10 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Gly His His Val 1 5 10 <210> 65 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 1 5 10 15 Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60 His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95 Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln 100 105 110 His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ala Gly Asp 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 93 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Asp Asp Gly Ala Gly Val Phe Asp Leu 1 5 <210> 95 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Gly Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Phe Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 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<400> 109 Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Ala Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 111 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Asp Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Phe Thr Ile Thr Asn Val Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 115 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Glu Gly Ser Gly Phe Asn Phe Phe Thr Gln 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Asp Ser Asn Tyr Ile Tyr His Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asp Ser Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 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Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Asp Ser Ala Phe Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 127 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 127 Asp Ile Arg Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Asn Glu Asp Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Gln Ala Asn Glu Asp Ile Ser Ile Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 131 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 131 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Asp Phe Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 133 Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 134 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 134 Ala Leu Asp Phe Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 135 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 135 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala 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Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 147 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 147 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 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Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 148 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 148 His His His His His His 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 149 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 150 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 150 Ala Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 151 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 151 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 152 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 152 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala 85 90 95 Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 153 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 154 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 155 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Gly Thr Thr Pro Asp Tyr 1 5 <210> 156 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 156 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu 1 5 10 15 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 157 Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 158 Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr 1 5

Claims (47)

  1. 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 영역; 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 8 또는 73에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항-반발 유도 분자 a (anti-Repulsive Guidance Molecule a: 항-RGMa) 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가변 경쇄 영역의 CDR3이 서열번호 73에 제시된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체가 사람 항체인, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체가 IgG 이소타입의 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IgG 이소타입이 사람 IgG1 이소타입인, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 사람 IgG1 불변 도메인이 서열번호 140, 141, 142 또는 143을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 사람 IgG1 불변 도메인이 서열번호 143을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
  9. 서열번호 146에 제시된 경쇄 서열 및 서열번호 147에 제시된 중쇄 서열을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-RGMa 항체.
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