CN108558997B - 一种重组融合蛋白TIGIT-Fc及其抗移植排斥反应的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组融合蛋白TIGIT‑Fc及其抗移植排斥反应的应用。该线性串联多肽能够诱导特异性T细胞应答发挥免疫保护作用。该重组融合蛋白TIGIT‑Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码所述重组融合蛋白TIGIT‑Fc的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。本发明公开的重组融合蛋白TIGIT‑Fc，其可以通过干预CD226/TIGIT‑CD155信号通路有效的调控巨噬细胞极化，有助于诱导同种异体移植物耐受。

Description

一种重组融合蛋白TIGIT-Fc及其抗移植排斥反应的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种重组融合蛋白TIGIT-Fc及其抗移植排斥反应的应用。

背景技术

器官移植是挽救终末期器官衰竭患者生命、改善生存质量重要的、甚至唯一的治疗手段。自20世纪80年代以来，器官移植领域飞速发展，肾、心、肝、胰腺与胰岛、甲状旁腺、肺、骨髓、角膜等组织是目前常用的实体移植器官，发达国家的肾移植手术已成为良性终末期肾病的首选常规疗法，手术操作已不再是限制器官移植术开展的主要问题。

得益于医疗技术的进步和广谱免疫抑制药物的广泛使用，术后第一年内的移植物失功现象已经比较少见，90％以上的移植物都可以获得良好的功能性存活。尽管不同组织器官移植的预后不同，但异体排斥反应却是所有受术患者需要终生面对的问题。围手术期需要大剂量免疫抑制剂冲击治疗以抑制急性排斥反应，同时也带来了严重的全身毒副反应。为了让移植物长期存活，一般情况下还需要终生应用免疫抑制药物，这导致了患者容易罹患移植术后新发肿瘤、机会感染、代谢综合征、高尿酸血症、心脑血管疾病等并发症，不但威胁健康，还造成额外的经济负担。而且，现在临床常用的免疫排斥药物主要针对急性移植排斥，并不能有效的预防慢性排斥，受者仍要面对移植物逐渐纤维化、慢性失功的困境。因此，探索参与移植排斥反应调控的机制、开发新的免疫干预策略以提高移植器官存活率、减轻移植患者生理、心理、经济负担，始终是器官移植领域的研究重点之一。2015年在美国费城举办的美国器官移植年会上，从事组织器官移植领域工作的临床和基础研究人员报道了相关研究进展，主动诱导临床免疫耐受已经从动物实验开始转向临床实际应用；扩增Treg细胞的技术发展迅速，可以通过药品生产质量管理规范(GMP标准)技术来进行制造；同时，越来越多的研究聚焦于移植免疫分子标志物和新的分子靶点的开发。机体的免疫应答、免疫调控是极为复杂的网络系统。在移植物耐受机理研究和临床治疗措施研发领域，基于免疫分子和免疫细胞的生物治疗方案是其中重要环节，其中特别是Treg细胞和M2型极化的巨噬细胞，以其强大的免疫抑制功能受到广泛的关注。

TIGIT分子是细胞膜上一种重要的抑制型受体，已知的功能主要参与调控淋巴细胞的分化与杀伤、细胞间黏附等细胞免疫学过程。随着研究的深入与实验技术手段的发展，该分子在多种免疫细胞上新的功能和调控效应不断被发现，在临床应用、特别是肿瘤和炎症相关疾病的机制研究方面获得了越来越多的重视。TIGIT的主要配体是CD155分子，同时CD155还与CD226、CD96两个分子存在相互作用。在同一细胞表面，3个分子竞争性结合同一配体CD155，CD155、CD96和TIGIT胞质区含有ITIM基序，可传递抑制性信号，CD226传递活化性信号，构成了复杂的调控网络。利用siRNA或者特异性mAb阻断CD155分子的信号，可以调控巨噬细胞等抗原提呈细胞内GATA3和CREB等多种转录因子的表达，从而影响免疫细胞的发育分化、增殖杀伤和细胞因子分泌等生物学功能。近年来，TIGIT分子的日益受到广泛关注，其在临床实践中的机制和应用研究也日渐深入。TIGIT分子通过与其配体相互作用影响免疫突触形成、细胞间黏附，调控造血发育和免疫细胞的分化与杀伤等生物学过程，参与了多种类型临床疾病的发生发展。TIGIT分子高表达于T细胞表面，在抗肿瘤效应方面的研究一直是关注的热点。

在共刺激分子调控CTL细胞与肿瘤治疗关系方面，CTLA-4和PD-1最早获得关注，抗体和重组蛋白等相关的生物治疗制剂已经进入临床应用。但实际应用中仍有相当比例的患者没有达到理想的治疗效果，提示仍然需要开展更深入的研究，探寻更多共刺激分子调控机制。Johnston等人研究发现，肿瘤细胞表面高表达的CD155分子结合TIGIT后抑制了CD8⁺T细胞的杀伤功能，利用抗体阻断TIGIT的结合则可以有效逆转这一现象。TIGIT抗体和抑制剂一类的药物在恶性肿瘤的治疗中已经获得较多的研究。但是，与之相反的是，对于移植排斥的治疗，则需要干预TIGIT/CD226-CD155信号平衡，通过增强TIGIT的信号，促进CD155阳性巨噬细胞向M2型极化，在免疫识别阶段抑制抗原提呈细胞的活化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组融合蛋白TIGIT-Fc及其制备方法和抗移植排斥反应的应用。

本发明公开了一种重组融合蛋白TIGIT-Fc，该重组融合蛋白TIGIT-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还公开了上述重组融合蛋白TIGIT-Fc作为移植排斥反应抑制剂的应用。

本发明还公开了上述重组融合蛋白TIGIT-Fc在制备防治移植排斥反应药物中的应用。

优选地，所述的药物为通过干预CD226/TIGIT-CD155信号通路调控巨噬细胞极化诱导同种异体移植物耐受的药物。

优选地，所述的药物为上调巨噬细胞IL-10和Arg1(包括但不限于)表达的药物。

优选地，所述的药物下调iNOS、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL6及IL-1β因子(包括但不限于)表达的药物。

优选地，所述的药物为抑制巨噬细胞胞内SHP-1分子的磷酸化，通过ERK1/2-MSK1通路增加CREB核转位，促进IL10转录的药物。

优选地，所述的药物为促进Treg分化、抑制CD4+Th细胞增殖的药物。

优选地，所述的药物为能够提高Treg细胞比例，降低M1型巨噬细胞比例、增加M2型巨噬细胞比例的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的重组融合蛋白TIGIT-Fc，其可以通过干预CD226/TIGIT-CD155信号通路有效的调控巨噬细胞极化，有助于诱导同种异体移植物耐受。利用体外培养LPS刺激巨噬细胞模型，通过流式细胞术、RT-PCR、Luminex、WB和免疫荧光染色等实验手段，检测TIGIT-Fc重组蛋白对巨噬细胞极化的影响及IL-10分泌的信号通路。结果显示：

TIGIT-Fc能够显著上调巨噬细胞IL-10和Arg1表达，下调iNOS、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-1β等细胞因子水平，促进其向M2型极化；其机制在于TIGIT-Fc可抑制巨噬细胞胞内SHP-1分子的磷酸化，通过ERK1/2-MSK1通路增加CREB核转位，促进IL10转录。检测TIGIT-Fc预处理巨噬细胞对T细胞增殖及调节性T细胞分化的影响，发现TIGIT-Fc预处理的巨噬细胞抑制CD4+T细胞向Th1、Th17分化，促进向Treg分化，抑制CD4+Th细胞增殖。在C57/BL6-Balb/c小鼠同种异体带血管皮瓣移植模型上，观察TIGIT-Fc对异体移植物排斥反应的调控；检测宿主Treg比例、巨噬细胞极化以及淋巴细胞对供体或第三方抗原的反应性。实验发现，TIGIT-Fc处理可以显著延长移植物存活时间，提高Treg细胞比例，M1型巨噬细胞比例降低、M2型比例增加；受体淋巴细胞对供体抗原反应性显著下降，而对第三方抗原反应性无显著差异；排斥终点血清中IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-17A显著降低，IL-10水平显著增高。

附图说明

图1为TIGIT-Fc重组融合蛋白促进巨噬细胞向M2型极化的实验结果图；

图2为TIGIT-Fc抑制LPS刺激巨噬细胞SHP-1磷酸化水平实验结果图；

图3为TIGIT-Fc融合蛋白处理延长移植物存活时间实验结果图；

图4为TGIT-Fc处理促使巨噬细胞向M2型极化实验结果图；

图5为同种异体皮瓣移植术后血清中细胞因子含量；

图6为TIGIT-Fc重组蛋白处理后巨噬细胞极化相关分子表达水平；

图7为TIGIT-Fc处理促进CREB核转位实验结果图。

具体实施方式

本发明首先在小鼠细胞中克隆出TIGIT全长序列，利用生物信息学分析，将胞膜外区序列插入真核表达载体pSectag2-Fc，基因测序确定该融合基因序列；转染CHO细胞后收集细胞培养上清，利用抗Fc亲和层析技术纯化出TIGIT-Fc重组融合蛋白；在巨噬细胞体外培养及LPS刺激的模型上检测TIGIT-Fc重组融合蛋白对巨噬细胞极化的影响；检测TIGIT-Fc预处理巨噬细胞对T细胞增殖分化的影响。建立C57/BL6-Balb/c小鼠同种异体带血管皮瓣移植模型，观察TIGIT-Fc对异体移植物排斥反应的调控；检测宿主Treg比例、巨噬细胞极化以及淋巴细胞对供体或第三方移植物抗原的反应性。

下面结合具体重组融合蛋白的制备方法和生物学活性检测对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、TIGIT-Fc重组融合蛋白的设计与制备

1.1TIGIT-Fc融合基因序列，利用生物信息学分析，将胞膜外区序列插入真核表达载体pSectag2-Fc，基因测序确定该融合基因序列。具体而言，含有3c酶切位点和人IgG分子Fc段融合基因的表达载体pSectag2-Fc(该载体有公开文献记载：《CD226及其配体CD112/CD155分子相互作用机制的研究(第四军医大学)》，公众可以联系作者索取或根据该发表文献自行合成制备)；检测人IgG和可溶型Fc融合蛋白的夹心ELISA试剂盒、小鼠抗人IgG分子Fc段单克隆抗体(mAb)为购买得到的商品化产品。大肠杆菌菌株DN5α、中国仓鼠卵巢细胞系CHO，人胚肾上皮细胞系293T(均为通过生物技术公司购买商品化产品)培养于10％NCSRPMI 1640或DMEM培养基(Hyclone公司产品)中。CNBr-activated Sepharose 4B层析柱填料购自Pharmacia公司，转染试剂脂质体lipofectamin2000(LF2000)购自Invitrogen公司。RNA提取试剂Trizol购自Gibco公司。用于逆转录合成cDNA的AMV逆转录酶、逆转录引物oligo(dT)，rTaq DNA聚合酶、Pyrobest高保真聚合酶、dNTPs、pMD18-T载体及连接试剂盒(DNA Ligation Kit Ver.2.0)等购自宝生物工程(大连)有限公司。序列特异性引物由北京奥科公司合成。胰蛋白胨、酵母提取物和低熔点琼脂糖购自英国OXOID公司。DNA快速纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海天根生物技术有限公司。

分离小鼠脾细胞，PBS洗涤2次并计数细胞，按每1×10⁷个细胞样品加1ml Trizol裂解细胞。酚-氯仿法抽提1次，以提取得到的总RNA为模板，以oligo(dT)15为引物，逆转录合成cDNA。

根据GenBank登录的TIGIT基因序列设计扩增胞膜外区基因的上下游外侧引物为：

TIGIT-F：GGGGTACCgccttcctcgctacagga(加Kpn I酶切位点)

TIGIT-B：CGGGATCCtccaagcggggcagtct(加BamH I酶切位点)

以小鼠脾细胞cDNA为模板，加入高保真DNA聚合酶Pyrobest和引物混匀后进行PCR。反应条件为：94℃变性10min，94℃30s，58℃30s，72℃40s，共35个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到的DNA片段利用rTaq DNA聚合酶给DNA片段3’端添加“A”：反应体系包括扩增所得到的DNA片段、rTaq酶、dNTP、PCR buffer，反应参数：94℃变性10min，72℃40min。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳确认长度，胶回收试剂盒溶胶回收目的片段，连接入pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α，参数：16℃连接2h，与感受态DH5α菌轻柔混合后冰浴10min，42℃热休克90s，涂布于Amp抗性(Amp浓度120μg/ml)LB琼脂平板，过夜培养后挑取阳性转化子克隆进行PCR鉴定，阳性克隆再转入含氨苄青霉素的液体LB培养基(Amp浓度120μg/ml)扩大培养、小量提取质粒DNA进行Kpn I和BamH I双酶切鉴定，挑取阳性克隆进行DNA测序。将含有正确序列的克隆扩大培养，提取质粒，用Kpn I和BamH I进行双酶切，电泳纯化回收酶切片段，连接入pSectag2-Fc载体，测序确定融合基因序列的正确性。

重组融合蛋白TIGIT-Fc的氨基酸序列为：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLGTMHGWLLLVWVQGLIQAAFLATGATAGTIDTKRNISAEEGGSVILQCHFSSDTAEVTQVDWKQQDQLLAIYSVDLGWHVASVFSDRVVPGPSLGLTFQSLTMNDTGEYFCTYHTYPGGIYKGRIFLKVQESSVAQFQTAPLGGSTSPVWWNSEVLFQGPFEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV。(如SEQ ID NO：1所示)

1.2TIGIT-Fc蛋白的表达与分泌TIGIT-Fc重组融合蛋白稳定转染细胞系的建立：

在24孔细胞培养板中按2×10⁵/well密度接种CHO细胞，培养过夜后细胞达到约90％汇合率。将pSectag2-TIGIT-Fc质粒与具有新霉素抗性的质粒(pEGFP-N1)按10:1(2μg:0.2μg)比例混合后，脂质体LF2000法转染CHO细胞。培养48h后转种至25cm²细胞培养瓶，加入终浓度为0.8g/L的G-418进行选择性培养，以获取G418抗性克隆。7-10d后，收集每孔的培养上清，用检测可溶型人Fc段融合蛋白的夹心ELISA试剂盒筛选阳性克隆，并将阳性克隆通过有限稀释法进行克隆化。简言之，细胞计数后取100个细胞放入15ml完全培养基，混匀后滴入96孔板，3滴/孔，平均每孔1个细胞。培养至第7～9天时，肉眼可见细胞克隆，间接ELISA法检测有单个克隆生长孔的培养上清。重复筛选和克隆化3-4次，直至克隆生长孔阳性率达100％后，挑取表达量最高孔的细胞扩大培养并冻存，命名此稳定表达TIGIT-Fc融合蛋白的细胞株为TIGIT-Fc，此时培养基中G-418的浓度调整至0.2g/L。

2、TIGIT-Fc重组融合蛋白的大量制备和纯化

用含5％NCS的RPMI 1640培养基大规模培养CHO/TIGIT-Fc细胞株，生长至约95％汇合率时消化并按1:4比例传代培养；收获上清：细胞自传代至约90％汇合率约需时4d，此时收获一次上清，换为新鲜培养基继续培养4-5d后收获一次上清并添加新鲜培养基继续培养至大多数细胞死亡时收集培养上清。平均每个75cm²细胞培养瓶可以收获上清35ml。此过程中随时取样测定上清中Fc融合蛋白含量。每批收获上清均立即冻存于-30℃。

将抗人Fc单克隆抗体(mAb，本教研室制备，克隆号WT6)交联CNBr-activatedSepharose 4B琼脂糖凝胶，制备亲和层析柱。简言之，CNBr-activated Sepharose 4B琼脂糖先经1mmol/L盐酸活化，立即与纯化的mAb在pH8.3交联缓冲液中室温轻柔混合2h，比例为每ml溶胀凝胶加8mg纯化mAb，随后转至pH8.3甘氨酸溶液中封闭剩余活性位点，pH4.0和pH8.3缓冲液交替洗涤3次，PBS洗涤2次，加入终浓度为0.01％NaN₃后装塑料层析柱，置于4℃冰箱保存。

CHO/TIGIT-Fc细胞培养上清经8500rpm高速低温离心，0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片和颗粒，使用医用输液器缓慢上柱，流速控制在1-1.5ml/min，上样完成后以10倍柱床体积的PBS冲洗亲和层析柱，加入洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用Eppendorf管收集洗脱液，迅速加入碱性中和液中和，预先滴定中和比例为每12滴洗脱液加75μl中和液。上样前上清、穿过液均留样品待测。洗脱液用截留分子量为30kDa的超滤离心管浓缩蛋白并更换缓冲体系至0.15mol/L PBS，紫外分光光度法定量蛋白。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及其分子量。检测可溶型人Fc段融合蛋白的夹心ELISA试剂盒检测上样前上清和穿过液含量。

3、重组融合蛋白TIGIT-Fc抗移植排斥反应

3.1检测TIGIT-Fc预处理巨噬细胞对T细胞增殖分化的影响

在体外细胞培养的实验体系中，混合培养小鼠腹腔巨噬细胞和T细胞，加入TIGIT-Fc重组融合蛋白处理，结果参见图1，发现TIGIT-Fc能够显著上调巨噬细胞CD206的表达，抑制CD11c的表达，促进其向M2型极化。

3.2TIGIT-Fc可抑制巨噬细胞受到LPS刺激时的胞内SHP-1磷酸化

免疫印迹：灌制5％-10％不连续SDS-PAGE胶，以细胞裂解液蛋白为抗原，上样(100μg/道)，恒压120V、180V电泳；蛋白电转移至NC膜上，脱脂奶粉封闭液室温封闭1h；用封闭液按1:2000稀释识别不同信号蛋白分子的抗体，与NC膜4℃孵育过夜；洗膜后加入HRP标记羊抗鼠二抗，室温作用1h；ECL发光液发光，X光片显影和定影。结果参见图2，在不同的刺激时间点，均可以看到TIGIT-Fc处理对于SHP-1磷酸化的减弱作用。

3.3TIGIT-Fc促进同种异体移植物耐受

建立C57/BL6-Balb/c小鼠同种异体带血管皮瓣移植模型，观察TIGIT-Fc对异体移植物排斥反应的调控；检测宿主Treg比例、巨噬细胞极化以及淋巴细胞对供体或第三方移植物抗原的反应性。TIGIT-Fc处理显著延长移植物存活时间：给予宿主小鼠静脉输注TIGIT-Fc重组蛋白，小鼠的移植皮瓣存活时间结果参见图3，可以看出，该组小鼠的移植皮瓣存活时间显著延长，而且分离脾细胞中巨噬细胞向M1型极化的比例降低、向M2型极化的比例增加，结果参见图4；宿主小鼠淋巴细胞对供体抗原反应性显著下降，而对第三方抗原反应性无显著差异。

3.4TIGIT-Fc重组蛋白对巨噬细胞极化及IL-10分泌的影响

利用体外培养LPS刺激巨噬细胞模型，通过流式细胞术、RT-PCR、Luminex、WB和免疫荧光染色等方法，检测TIGIT-Fc重组蛋白对巨噬细胞极化的影响及IL-10分泌的信号通路。结果表明：TIGIT-Fc能够显著上调巨噬细胞IL-10和Arg1表达，下调iNOS、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL6、IL-1β等细胞因子水平，促进其向M2型极化。具体实验结果参见图6，与单纯LPS刺激组相比，额外加入TIGIT-Fc融合蛋白处理，可以显著下调促炎性细胞因子的表达水平，上调抑炎性分子的表达。其机制在于TIGIT-Fc可增加CREB核转位，促进IL10转录，结果参见图7。分别提取不同处理组细胞的胞浆和胞质成分，进行蛋白电泳和WB检测，结果发现TIGIT-Fc重组蛋白处理的细胞，细胞质中CREB含量减少，细胞核中CREB含量增加，说明该蛋白处理可以促进CREB的核转位。检测TIGIT-Fc预处理巨噬细胞对T细胞增殖及调节性T细胞分化的影响，发现TIGIT-Fc预处理的巨噬细胞抑制CD4+T细胞向Th1、Th17分化，促进向Treg分化，抑制CD4+Th细胞增殖。

在C57/BL6-Balb/c小鼠同种异体带血管皮瓣移植模型上，观察TIGIT-Fc对异体移植物排斥反应的调控；检测宿主Treg比例、巨噬细胞极化以及淋巴细胞对供体或第三方抗原的反应性。实验发现，TIGIT-Fc处理可以显著延长移植物存活时间，M1型巨噬细胞比例降低、M2型比例增加，结果参见图4，免疫荧光染色和流式细胞术分析巨噬细胞极化的标志性分子CD206/CD11c的表达水平，发现TIGIT-Fc处理可以增加巨噬细胞膜上CD206的表达，降低CD11c的水平，说明巨噬细胞向M2型极化增加；排斥终点血清中IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-17A显著降低，IL-10水平显著增高，结果参见图5，在皮瓣排斥的终点，静脉注射TIGIT-Fc处理组小鼠的血清中，促炎性细胞因子的表达水平显著低于实验对照组，抑炎性分子的表达水平高于实验对照组，说明TIGIT-Fc重组蛋白可以有效的抑制受体小鼠对同种异体移植物的免疫排斥反应。

Claims (8)

1.一种重组融合蛋白TIGIT-Fc，其特征在于，该重组融合蛋白TIGIT-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的重组融合蛋白TIGIT-Fc在制备防治移植排斥反应药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过干预CD226/TIGIT-CD155信号通路调控巨噬细胞极化诱导同种异体移植物耐受的药物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为上调巨噬细胞IL-10和Arg1表达的药物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为下调IL-12p40、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6及IL-1β因子表达的药物。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制巨噬细胞胞内SHP-1分子的磷酸化，通过ERK1/2-MSK1通路增加CREB核转位，促进IL10转录的药物。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为促进Treg分化、抑制CD4+Th细胞增殖的药物。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为能够提高Treg细胞比例，降低M1型巨噬细胞比例、增加M2型巨噬细胞比例的药物。

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