CN113671196B - Lair-1分子与脂联素的相互作用对于t细胞活化作用影响的研究方法 - Google Patents
Lair-1分子与脂联素的相互作用对于t细胞活化作用影响的研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了LAIR‑1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，包括步骤S1.探究APN与LAIR‑1之间的关系；S2.测定APN与LAIR‑1结合的结构域所在的位置；S3.探究APN球状区重组蛋白与LAIR‑1结合时，对于LAIR‑1下游SHP‑2的影响；S4.探究APN球状区重组蛋白对于T细胞活化作用的抑制影响；S5.T细胞抑制作用与T细胞中SHP‑2、ZAP‑70途径之间的关系；本研究证实：APN与LAIR‑1结合，结合位点在gAdp上；同时LAIR‑1与gAdp相互作用能够抑制T细胞活化，为脂联素在抗炎活性中的作用提供了研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法。
背景技术
脂联素(Adiponectin，APN)是脂肪因子中的一员，主要由白色脂肪组织分泌；人的APN是一个30kDa的蛋白质，由244个氨基酸组成，由N-末端胶原区和C-末端球状结构域组成；在健康人中，血清脂联素的浓度在3到30μg/ml之间，是胰岛素抵抗、糖脂代谢以及心脏重构的关键调节剂；相反，肥胖者的脂联素血清水平较低，这一现象会导致胰岛素抵抗、动脉粥样硬化和其他与炎症相关的心血管疾病；APN可以升高eNOS和IL-10等抗炎因子，减轻右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎症；在小鼠中，APN缺乏会导致严重的过敏性气道炎症或增加多发性硬化症小鼠模型的疾病严重程度；这种抗炎活性也可以由APN球部的蛋白来发挥；报道表明：APN及其球状结构域在诱导抗炎作用中起着关键作用；此外，APN的促炎作用也有报道；例如：gAdp能激活NF-κB，从而诱导各种促炎基因的表达，而它的过表达可导致类风湿性关节炎患者发病；据报道，炎症滑膜关节组织中APN的上调增强了Th17反应，并加重了关节炎；APN的这种相互矛盾的作用归因于它通过激活不同的信号通路与不同靶细胞上的不同细胞表面受体结合的能力；
一般认为APN通过与1型脂联素受体(AdipoR1)和2型脂联素受体(AdipoR2)结合发挥作用；最近发现了一些新的APN结合蛋白，包括C1q、钙网蛋白受体、T-cadherin和E-选择素配体-1(ESL-1)；尽管APN通过与这些受体结合来调节多种生理过程，如促炎、细胞粘附和心脏保护，但没有足够的证据表明APN与这些受体及其下游信号通路对免疫反应具有负调节作用；白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)-1是一种在淋巴细胞普遍表达的抑制性受体，其胞浆尾部含有抑制性信号模块(基于免疫受体酪氨酸的抑制性模体(ITIMS))；研究认为，胶原蛋白是LAIR-1的高亲和力配体；一些含有胶原区的分子，如C1q和表面活性蛋白D，也被发现是LAIR-1的配体；
综上，LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用到底有何种影响成为本领域一个亟需研究的课题。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，本方法研究证实，APN与LAIR-1结合，结合位点在APN的球状结构域(gAdp)上，而不是在其胶原区上；同时LAIR-1与gAdp相互作用激活下游含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)途径，能够抑制T细胞活化，为脂联素在抗炎活性中的作用提供了研究基础。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，包括步骤
S1.将LAIR-1与APN特异性结合，探究APN与LAIR-1之间的关系；
S2.再将LAIR-1与APN特异性结合后，测定APN与LAIR-1结合的结构域所在的位置，得到APN球状区重组蛋白；
S3.探究APN球状区重组蛋白与T细胞表面的LAIR-1结合时，对于LAIR-1下游SHP-2的影响；
S4.探究APN球状区重组蛋白抑制T细胞活化的作用，以及该作用与LAIR-1中和抗体之间的关系；
S5.探究APN球状区重组蛋白引起的T细胞抑制作用与调节T细胞活化的SHP-2与ZAP-70之间的关系。
优选的，步骤S1所述的将LAIR-1与APN特异性结合的过程包括：
S101.首先对293T细胞中共表达的外源蛋白LAIR-1和APN进行免疫沉淀，用抗FLAG抗体对上述的外源蛋白进行免疫沉淀，然后用抗APN抗体进行免疫印迹分析；
S102.明确Jurkat T细胞表面表达LAIR-1受体后，再将Jurkat T细胞与APN重组蛋白在培养体系中孵育，用抗LAIR-1抗体对细胞表面的LAIR-1蛋白进行免疫沉淀，然后用抗APN抗体进行免疫印迹分析；
S103.明确用pCDNA-3.0-LAIR-1质粒转染293T细胞只表达LAIR-1受体，而不表达其他已经报道的APN受体；
S104.用pCDNA-3.0-LAIR-1质粒转染293T细胞与APN重组蛋白在培养体系中孵育，用流式细胞仪分析APN在细胞表面的表达水平；
S105.对LAIR-1-APN复合物进行表面等离子体共振，测量分子之间的相互作用亲和力。
优选的，步骤S105所述的表面等离子体共振过程包括：
(1)将抗His单抗固定在芯片上，捕获His标记的LAIR-1；
(2)然后注射Fc标记的APN，观察响应单位随时间的变化，得到人LAIR-1与APN的相互作用的KD值为6.38×10-6M。
优选的，步骤S2所述的APN与LAIR-1结合的结构域的测定过程包括：
S201.已知APN包括一个胶原区和一个球状区，根据APN编码两个不同结构域的Myc标记质粒；
S202.在293T细胞中进行共沉淀，通过将步骤S201描述的质粒转染293T细胞，使APN每个结构域片段在293T细胞表达；用抗FLAG抗体对外源蛋白进行免疫沉淀，然后用抗Myc抗体进行免疫印迹分析；
S203.分析全长APN、APN胶原区和APN球状区重组蛋白的表达水平；
S204.用LAIR-1质粒转染293T细胞，并与APN球状区重组蛋白孵育，利用流式细胞仪检测APN抗体染色后细胞表面APN球状区重组蛋白的表达水平；
S205.对LAIR-1-APN球部复合物进行表面等离子体共振，测量分子之间的相互作用亲和力；得到亲和力KD值为1.11×10-5M；结合位点在APN的球状区gAdp上；
S206.对LAIR-1-APN胶原部复合物进行表面等离子体共振，测量分子之间的相互作用亲和力；由于响应单位过低，该结果认为LAIR-1不与APN胶原部结合；
S207.用LAIR-1质粒转染293T细胞，并与APN胶原区重组蛋白孵育，利用流式细胞仪检测APN抗体染色后细胞表面APN胶原区重组蛋白的表达水平。
优选的，步骤S3所述的探究APN球状区重组蛋白与T细胞表面的LAIR-1结合时，对于LAIR-1下游SHP-2的影响的研究过程包括：
S301.用10μg/ml的APN和gAdp重组蛋白分别处理JurkatT细胞，然后使用蛋白免疫印迹法测定SHP-1和SHP-2的磷酸化水平；
S302.用10μg/ml的APN和gAdp重组蛋白分别处理JurkatT细胞，在Jurkat T细胞中进行共沉淀，用抗LAIR-1抗体进行免疫沉淀，然后用抗SHP-2抗体进行免疫印迹分析，明确APN和gAdp重组蛋白刺激后，Jurkat T细胞中的SHP-2与LAIR-1确实可以结合。
优选的，步骤S4所述的APN球状区重组蛋白抑制T细胞活化的作用的探究过程包括：
S401.PBMC中的T细胞被包被于细胞培养板上的CD3 mAb和CD28 mAb激活，并同时用每种重组蛋白的10μg/ml处理，培养24h后再用流式细胞仪测定T细胞活化标志物CD69和CD25的表达水平；
S402.首先筛选LAIR-1mAb，根据步骤S104，用LAIR-1质粒转染293T细胞；将转染的293T细胞与APN重组蛋白以及LAIR-1mAb孵育，通过流式细胞术对细胞表面的APN进行测定；
S403.PBMC中的T细胞被包被于细胞培养板上的CD3 mAb和CD28 mAb激活，并在TCR活化的T细胞中同时加入10μg/ml的LAIR-1mAb和10μg/ml的gAdp，培养24小时，然后流式细胞术分析T细胞表面的CD69和CD25活化标志物；
S404.根据步骤S403验证其他克隆号的LAIR-1mAb，并没有中和APN抑制T细胞活化的作用。
优选的，步骤S5所述的APN球状区重组蛋白引起的T细胞抑制作用与调节T细胞活化的SHP-2与ZAP-70之间关系的究过程包括：
S501.用gAdp处理PBMC 5分钟，同时向PBMC中加入LAIR-1mAb和gAdp重组蛋白，流式细胞术分析细胞内SHP-2的磷酸化水平；
S502.使用SSG来检测SHP-2在gAdp/LAIR-1诱导的T细胞抑制中的作用；
S503.使用流式细胞术分析T细胞中ZAP-70的磷酸化，发现用CD3 mAb和CD28 mAb刺激PBMC 15分钟，同时用gAdp重组蛋白处理，导致CD4+和CD8+T细胞中p-ZAP70+细胞的百分比降低，即SHP-2和ZAP-70都参与了gAdp介导的T细胞抑制。
优选的，所述的LAIR-1分子与脂联素的相互作用可以应用于抗炎药物的制备。
本发明的有益效果是：本发明公开了LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
(1)本发明设计了一种LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，通过本方法证明了脂联素/LAIR-1之间的一种新的配体-受体关系，同时发现了脂联素作用于T细胞的一种新的免疫调节机制，为脂联素在抗炎活性中的作用提供了研究基础；
(2)通过本发明所述研究方法，证实了APN与LAIR-1结合，结合位点在APN的球状结构域(gAdp)上，二者结合的亲合力为6.38μM，而不是在其胶原区上；同时LAIR-1与gAdp相互作用激活下游含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)途径，抑制T细胞活化，为脂联素在抗炎活性中的作用提供了进一步的理论基础。
附图说明
图1为本发明LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法的研究流程图。
图2为本发明脂联素与LAIR-1之间的相互作用图。
图3为LAIR-1、APN/APN截断和APN受体的表达情况图。
图4本发明脂联素的球状区域与LAIR-1相互作用图。
图5为APN胶原结构域与LAIR-1的相互作用图。
图6为本发明由脂联素及其球状结构域诱导的JurkatT细胞中SHP-2的磷酸化作用图。
图7为Jurkat T细胞中SHP-2与LAIR-1的相互作用图。
图8本发明脂联素及其球状结构域通过LAIR-1通路抑制T细胞的激活图。
图9为筛选出LAIR-1中和抗体阻断APN和LAIR-1之间的相互作用图。
图10本发明SHP-2参与gAdp/LAIR-1信号通路表达图。
图11为本发明ZAP-70参与GAdp诱导的T细胞抑制表达图。
其中：在图2中：图A表示通过Co-IP来检测293T细胞中LAIR-1与脂联素(APN)的相互作用；图B表示通过Co-IP来检测Jurkat T细胞表面LAIR-1和APN重组蛋白之间的相互作用图；图C表示转染了LAIR-1质粒的293T细胞与APN重组蛋白孵育后，其表面APN表达的流式细胞图；图D代表C的统计结果图；图E-F分别代表素LAIR-1与APN的表面等离子体共振(SPR)分析图；
在图3中：图A表示LAIR-1在Jurkat T细胞表面的表达图；图B表示仅转染FLAG-LAIR-1质粒的293T细胞表面LAIR-1、AdipoR1、AdipoR2、CRT和钙粘蛋白的表达图；图C转染LAIR-1的293T细胞与APN球部重组蛋白孵育后LAIR-1+细胞上APN表达的图；图D表示人外周血T细胞上LAIR-1的表达图；图E表示APN全长、N端、C端重组蛋白的表达图；
在图4中：图A表示两个构造的脂联素截短体的原理图；图B代表通过Co-IP检测293T细胞中LAIR-1与脂联素截短体之间的相互作用图；图C代表转染了LAIR-1质粒的293T细胞与gAdp孵育后，其细胞表面APN表达的流式细胞图；图D代表C的统计结果图；图E-F分别代表LAIR-1与gAdp表面等离子体共振(SPR)分析图；
在图5中：图A-B分别代表LAIR-1与APN胶原结构域相互作用的SPR分析图；图C代表转染了LAIR-1质粒的293T细胞与APN教员结构域重组蛋白孵育后，其细胞表面APN表达的流式细胞图；
在图6中：图A和图C分别表示p-SHP-1和p-SHP-2表达的代表性图；图B和图D表示A和C的灰度密度定量统计图；A代表在不同时间点用10μg/ml脂联素处理的Jurkat T细胞中p-SHP-1和p-SHP-2的表达图；C代表在不同时间点用10μg/ml脂联蛋白球状结构域处理的Jurkat T细胞中p-SHP-1和p-SHP-2的表达图；
在图7中：图A表示Jurkat T细胞上APN受体表面表达的流式细胞图；图B表示APN/gAdp重组蛋白处理下JurkatT细胞LAIR-1与SHP-2的相互作用图；
在图8中：图A-图D表示CD4+ T(A-B)和CD8+ T细胞(C-D)表面CD25和CD69表达的百分比图和平均荧光强度统计图；图E-图H分别显示CD4+ T细胞(E和F)和CD8+ T细胞(G和H)表面的CD25和CD69表达百分比图和统计图；
在图9中：图A表示293T细胞转染LAIR-1质粒后并与gAdp重组蛋白和LAIR-1中和抗体孵育后，其表面APN表达的流式细胞图；图B表示LAIR-1中和抗体与LAIR-1其他抗体对gAdp抑制T细胞活化作用的流式细胞术图；
在图10中：图A表示gAdp重组蛋白刺激PBMC后，CD4+ T和CD8+ T细胞上p-SHP-2表达代表性流式细胞图；图B表示A的统计结果图；图C表示向活化的PBMC中加入SHP抑制剂葡萄糖酸锑钠(SSG)后，CD4+ T和CD8+ T细胞上CD69表达的代表性流式细胞图；图D表示C的统计图；
在图11中：图A显示不同条件下CD4+ T和CD8+ T细胞中ZAP-70磷酸化水平的代表性流式细胞点图；图B表示A的统计图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：参照附图1-11所示的LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，包括的材料和实验方法如下：
步骤一：材料准备
(一)抗体和试剂：(1)Percp-Cy5.5-LAIR-1(NKTA255)、PE-Cy7-CD4(A161A1)、APC-Cy7-CD8(SK1)、FITC-CD69(FN50)、APC-CD25(BC96)、Zombie red-PE Texas和Alex fluro-488-p-ZAP-70(1503310)的直接标记抗体的直接标记抗体(标有抗体克隆号)从从Biolegend购买，用于流式细胞测试；(2)PE-LAIR-1(DX26)和Alexfluro-647-p-SHP-2(L99-921)来自BDbioscience；其他未标记抗体，包括AdipoR1(ab135702)、AdipoR2(ab77612)和T-钙粘蛋白(Tcad、ab133395)从Abcam购买，而钙网蛋白(CRT)从Cell SignalingTechnology购买；(3)用于TCR激活的CD3 mAb(HIT3A)和CD28 mAb(CD28.2)来自Invitrogon，而用于免疫沉淀的抗FLAG(M2)和抗LAIR-1(HPA011155)抗体从Sigma购买；(4)抗Myc-HRP抗体(9E10)来自Santa Cruz，抗FLAG(兔源性)抗体来自Proteintech公司(20543-1-AP)，脂联素多克隆(PA1-054)和脂联素单克隆(MA1-054)抗体均来自ThermoFisher公司；(5)IgG对照抗体也来自CST，而针对不同物种的HRP偶联二抗来自ThermoFisher公司；SHP-1(C14H6)/SHP-2(D50F2)/p-SHP-1(Y564)/p-SHP-2(Y500)抗体，以及Actin抗体都来自CST；(6)LAIR-1mAb(编号9.1C3和2A6)(分泌9.1C3mAb和2A6mAb的杂交瘤)，由澳大利亚纽卡斯尔大学癌症研究室Gordon Burns博士提供；(7)FLAG-LAIR-1、pCMV3-Myc-APN质粒购自中国生物公司；(8)构建了APN的Myc标记的N-末端结构域(1-107aa)和Myc标记的APN的C-末端结构域(108-244aa)；转染试剂脂质体3000来源于Invitrogen，而APN的His标记的重组蛋白来源于Novoprotein(CatNo.C552)，其球形结构域来自PeproTech(CatNo.450-21)；基因克隆技术表达纯化APN胶原区。
(二)细胞：
(1)HEK293T(293T)细胞从Takara购买并储存在液氮中，而JurkatT细胞(克隆E6-1)也在同样的条件下储存在实验室中，直到使用；(2)45例健康献血者的Buffy外衣由西安西京医院血液中心提供；在纳入研究之前，捐赠者根据西京医院血液中心的协议签署了知情同意书；用Ficoll梯度离心法从捐献者的血液中提取外周血单个核细胞(PBMC)；利用Ficoll梯度中心从供体血中分离出外周血单核细胞(PBMCs)融合。
步骤二：研究过程：
S1.将LAIR-1与APN特异性结合，探究APN与LAIR-1之间的关系，证实脂联素(APN)与LAIR-1结合：
S101.含有胶原区的蛋白质是LAIR-1的高亲和力配体；APN具有与C1q相似的结构，C1q已被发现是一种新的LAIR-1配体；在此基础上，推测APN可能是LAIR-1的配体之一，为验证这一点，使用蛋白质和基于细胞的分析方法检测了全长APN与LAIR-1结合的能力；
S102.对293T细胞中共表达的LAIR-1和APN进行了免疫沉淀：用抗FLAG抗体对LAIR-1进行免疫沉淀，然后用抗APN抗体进行免疫印迹分析，结果表明APN蛋白与LAIR-1特异性共沉淀，如图2A所示；
S103.再将在步骤S102的细胞表面表达LAIR-1的Jurkat T细胞(图3A)与APN重组蛋白在细胞培养体系中孵育(含10％胎牛血清的RPMI培养液)，以确定LAIR-1定位于细胞表面时是否与细胞表面发生了结合，LAIR-1蛋白被抗体拉下，用APN抗体检测，在27kDa处显示明显条带，表明APN重组蛋白能与细胞表面表达的LAIR-1结合，如图2B所示；
S104.而IgG抗体对照组也可检测到APN，可以看出APN重组蛋白可能与抗体/微球复合物有粘附作用，为了进一步验证APN与LAIR-1的特异性结合，用pCDNA-3.0-LAIR-1质粒转染步骤S101的293T细胞，用流式细胞仪分析LAIR-1和其他APN受体在细胞表面的表达，如图3B所示；用pCDNA-3.0-LAIR-1质粒转染293T细胞与APN重组蛋白在培养体系中孵育，用流式细胞仪分析APN在细胞表面的表达水平；APN重组蛋白处理的LAIR-1表达293T细胞的平均荧光强度明显高于各对照组，如图2C和D所示；这些结果表明：APN可以与活细胞表面表达的LAIR-1结合；
S105.随后对LAIR-1-APN复合物进行表面等离子体共振(SPR)，测量分子之间的相互作用亲和力：将抗His单抗固定在芯片上，捕获His标记的LAIR-1，然后注射带Fc标签的APN；响应单位(RU)随时间的变化证明了LAIR-1与APN之间的特异性结合，如图2E所示；亲和解离常数的测定表明，人LAIR-1与APN的相互作用的KD值为6.38×10-6M，如图2F所示；
S2.在将LAIR-1与APN特异性结合后，测定APN与LAIR-1结合的结构域所在的位置：
S201.APN包括胶原区(N端，1-107aa)和球状区(C端，108-244aa)，在此基础上，根据APN编码两个不同结构域的Myc标记质粒，如图4A所示；
S202.在293T细胞中进行共沉淀，通过将步骤S201描述的质粒转染293T细胞，使APN每个结构域片段在293T细胞表达；用抗FLAG抗体对外源蛋白进行免疫沉淀，然后用抗Myc抗体进行免疫印迹分析；带Myc标记的108-244aa(球部结构域)可以与带FLAG标签的LAIR-1共沉淀，如图4B所示；
S203.分析全长APN、APN胶原区和APN球状区(gAdp)重组蛋白的表达水平，如图3E所示；
S204.为了证实细胞表面是否存在结合，用LAIR-1质粒转染293T细胞，并与APN球状区重组蛋白(gAdp)孵育，发现流式细胞仪检测APN-PAb染色后细胞表面gAdp的表达水平，而gAdp处理的LAIR-1表达细胞的MFI水平明显高于各对照组，图如4C和D所示；此外，LAIR-1+APN+细胞百分比增加，如图3C所示，强烈提示gAdp蛋白与表面LAIR-1+细胞相互作用；
S205.为了提供关于gAdp-LAIR-1相互作用的更多的证据，SPR揭示了LAIR-1与gAdp之间的特异性结合，亲和力KD值为1.11×10-5M，如图4E-F所示；
S206.分析研究LAIR-1与APN胶原结构域的相互作用，然而，未发现直接相互作用的证据，如图5A-B所示，得到结合位点在APN的球状区gAdp上；
S207.还在细胞表面检测到APN和LAIR-1的胶原结构域之间没有结合，如图5C所示；总的来说，通过上述结果证明是脂联素的C端，即gAdp与细胞表面的LAIR-1相互作用。
S3.探究APN球状区重组蛋白与LAIR-1结合时，对于LAIR-1下游SHP-2的影响，得到APN及gAdp与LAIR-1结合可引起LAIR-1下游SHP-2的磷酸化：
S301.LAIR-1通过募集引起细胞内激酶后续失活的SHP传递负信号，这是由细胞质尾部包含的ITIM基序引起的；因此，认为有必要确定APN/LAIR-1相互作用是否可以触发LAIR-1的下游信号通路；因此，分别用10μg/ml的APN(图6A-B)和gAdp重组蛋白(图6C-D)处理Jurkat T细胞，然后使用蛋白免疫印迹法测定SHP-1和SHP-2的磷酸化水平；结果显示，APN和gAdp处理分别在处理5分钟和10分钟内引起p-SHP-2水平的增加，如图6所示；
S302.为了排除APN的其他受体可能参与APN/gAdp处理下的下游信号通路，用流式细胞仪分析了其他APN表面受体的表达，结果显示：LAIR-1是Jurkat T细胞表面的主要受体如图7A所示；为了进一步证实SHP-2在APN和gAdp处理下被招募到LAIR-1，LAIR-1和SHP-2之间的相互作用被免疫共沉淀确定；正如预期的那样，SHP-2蛋白在72kDa被LAIR-1mAb的免疫沉淀拉下，如图7B所示；
根据上述SPR结果，认为APN和gAdp与LAIR-1的结合系数不同；在APN或gAdp处理下，LAIR-1和SHP-2之间的结合强度也不同；而且两种重组蛋白也有不同的来源；因此，APN或gAdp刺激后SHP-2磷酸化的动力学可能完全不同。
S4.探究APN球状区重组蛋白对于T细胞活化作用的抑制影响，以及该影响与LAIR-1中和抗体之间的关系，证实gAdp可通过LAIR-1抑制T细胞活化，该抑制作用可被LAIR-1抗体中和：
S401.LAIR-1可以抑制TCR介导的T细胞活化，结果显示LAIR-1在T淋巴细胞上高表达，如图3D所示；根据步骤S3的检验结果分析全长APN(APN FL)、N端结构域和gAdp重组蛋白的表达水平后，如图3E所示，然后，确定APN及其截断是否可以通过LAIR-1抑制T细胞活化；
S402.PBMC被包被于细胞培养板上的CD3 mAb和CD28 mAb激活，并同时用每种重组蛋白的10μg/ml处理，培养24h后再用流式细胞仪测定CD69、CD25等T细胞活化标志物的表达水平，可以看出：APN FL和gAdp处理的MFI和CD4+CD69+和CD4+CD25+T细胞百分比均降低；此外，APN的N端胶原结构域对CD4+T细胞无抑制作用，如图8A-B所示；同样，APN FL和N端胶原结构域对CD8+T细胞的活化没有任何抑制作用，如图8C-D所示；而CD8+CD25+和CD8+CD69+T细胞百分比随gAdp处理而显著下降；总的来说，这些结果提示gAdp抑制T细胞活化；
S403.先前的研究报告称，AdipoR1在TCR活化的T细胞中上调，也参与抗炎调节；因此，需要确定APN/gAdp引起的T细胞抑制是否由LAIR-1介导，首先，筛选了之前在实验室制备的LAIR-1mAb；通过流式细胞术，发现LAIR-1mAb(克隆号9.1c3)可以阻断gAdp和LAIR-1之间的相互作用，如图9A所示；
S404.然后，同时加入LAIR-1mAb(编号9.1C3)(10μg/ml)和gAdp(10μg/ml)在TCR活化的T细胞中，培养24小时，然后分析T细胞的CD69和CD25活化标志物；得到LAIR-1mAb处理通过增加CD25和CD69阳性细胞的百分比部分减轻了gAdp对T细胞活化的抑制作用(图8E-H)；
S405.其他LAIR-1mAb(编号2A6)对gAdp诱导的T细胞抑制无中和作用，如图9B所示；这些结果证明gAdp通过LAIR-1途径抑制T细胞活化；
S5.探究APN球状区重组蛋白引起的T细胞抑制作用与T细胞中SHP-2、ZAP-70途径之间的关系，得到SHP-2、ZAP-70途径参与了gAdp引起的T细胞抑制：
S501.使用Phosflow流式细胞术分析T细胞中SHP-2的磷酸化(p-SHP-2)，并确定它是否介导gAdp/LAIR-1诱导的T细胞抑制；用gAdp处理PBMC 5分钟，检测到T细胞中SHP-2磷酸化升高，同时加入LAIR-1mAb和gAdp，T细胞中的p-SHP-2减弱，如图10A-B所示；
S502.接下来，使用PTP抑制剂，即SSG来进一步检测SHP-2在gAdp/LAIR-1诱导的T细胞抑制中的作用；实验结果证明：SSG可部分增加CD69的MFI，但对CD25表达影响不大，如图10C-D所示；
S503.ZAP-70是T细胞活化的关键调节因子，可被SHP-2去磷酸化；为了进一步了解ZAP-70是否参与gAdp/LAIR-1/SHP-2信号，使用流式细胞术分析了T细胞中ZAP-70的磷酸化；发现：用CD3 mAb和CD28 mAb刺激PBMC 15分钟，同时用gAdp重组蛋白处理，导致CD4+和CD8+T细胞中p-ZAP70+细胞的百分比降低，如图11所示；
基于上述结果，可以得到SHP-2和ZAP-70都参与了gAdp介导的T细胞抑制。
优选的，通过上述研究方法证明所述LAIR-1分子与脂联素的相互作用可以应用于抗炎药物的制备。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，共免疫沉淀和Westernblot分析的具体过程包括：
(1)通过用2μg质粒(FLAG-LAIR-1、APN、Myc-1-107aa、Myc-108-244Aa、FLAG-PCMV和Myc-PCMV)转染293T细胞，然后在48小时后收集细胞；
(2)然后通过在室温下下用20μg/mlAPN预孵育30分钟的Jurkat T细胞来检测APN重组蛋白与表面表达的LAIR-1之间的结合；
(3)然后在RT与2.5mmM二甲基3、3′-二硫丙酸盐酸(Sigma)交联30分钟后收集T细胞，收集到的293T和Jurkat细胞在RIPA裂解液中；
(4)然后用蛋白A/G-琼脂糖珠预洗细胞裂解液，以制备全细胞裂解液(WCL)作为对照，对LAIR-1进行免疫沉淀：每次测试加入1μg抗FLAG抗体和30μlA/G-琼脂糖珠加入细胞裂解物，并在4摄氏度旋转孵化混合物过夜；
(5)琼脂糖珠用RIPA裂解液洗5次，在上样缓冲液中煮5min，以最大速度离心1min以获得上清液；蛋白质经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离(SDS-PAGE)，并使用半干转仪器(Bio-Rad)转移到硝化纤维素膜上(NC膜)；
(6)NC膜在TBS-T中用5％(w/v)脱脂牛奶封闭，然后在4℃与一抗孵育过夜；
(7)然后与过氧化物酶(HRP)标记的二抗一起孵育1小时，然后进行发光显影。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，为检测APN重组蛋白与从Jurkat T细胞中提取的LAIR-1蛋白之间的体外结合：
(1)在含有蛋白的RIPA裂解液中裂解约5个×106个Jurkat T细胞通过添加1μg抗LAIR-1mAb和A/G-琼脂糖珠来提取所产生的蛋白质，设置抗IgG mAb作为对照；
(2)然后混合物在4℃的颠倒混匀仪上反应2小时，然后与10μgAPN重组蛋白一起孵育，连续混匀4℃过夜；用RIPA缓冲液洗混合物5次，离心后收上清液，然后进行SDS-PAGE电泳；
(3)后续步骤如上所述，同时使用抗APN抗体抗体进行免疫印迹。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，为了检测LAIR-1和SHP-2之间的相互作用：
(1)在37℃下用10μg/mlAPN或gAdp刺激5×106Jurkat T细胞(这些细胞用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行裂解)1μg抗LAIR-1mAb和蛋白A/G-琼脂糖珠提取蛋白，设置抗IgG mAb为对照组；
(2)WB步骤如上所述，使用抗SHP-2mAb进行免疫印迹，之后通过孵育HRP偶联二抗产生信号；
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，为了检测SHP-1和SHP-2的磷酸化：
(1)将5×106Jurkat T细胞接种在24孔板中，并使用APN重组蛋白(10μg/ml)或其球状结构域(10μg/ml)进行刺激0min、10min、15min、20min和30min；
(2)然后使用RIPA裂解液裂解细胞，并在SDS-PAGE上分离所得蛋白质，用半干转仪器将蛋白转移到NC膜上，用p-SHP-1和p-SHP-2一抗在TBS-T的3％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)中免疫印迹，4℃过夜；
(3)然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在RT条件下孵育1h；
(4)在增强化学发光下显影，洗涤和重新检测SHP-1、SHP-2和肌动蛋白；
(5)通过比较磷酸化蛋白(p-SHP1和p-SHP2)的带强度，并标准化其与总蛋白SHP-1和SHP-2的带的信号强度来对信号进行量化。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，表面等离子体共振(SPR)分析的具体过程包括：
(1)使用Biacore T200系统(GE Healthcare)在Acro Biosystems中对APN及其球状结构域进行SPR分析；简单地说，使用固定缓冲液(10mM乙酸钠，pH4.5)，及GE His捕获试剂盒(28-9950-56，GE)中)将抗组氨酸抗体稀释至50μg/ml，并固定在CM5传感器芯片(GEHeathcare)上；His标记的LAIR-1(10μg/ml，Acro Biossystem，CatNo.CD5-H52H1)作为配体被捕获，捕获水平为386个响应单位(RU)；
(2)结合反应是在一个流动的缓冲液中进行的，包括：10mM Hepes、150mM氯化钠、3mM EDTA和0.05％(体积/体积)(pH7.4)吐温20，同时在25℃下以10μl/min的流速进行；
(3)分析物[Fc标记的APN(312.5-10000nM，Acro Biosystem，CatNo.ADQ-H5250)或APN的球状结构域(375-3000nM，CatNo.PeproTech，CatNo.450-21)，然后注入流动细胞，记录分析物和配体之间的相互作用；
(4)通过注射包括在GE His Capture Kit(28-9950-56，GE)中的30μl的10mM甘氨酸盐酸(pH1.5)来解除二者的结合，同时使用BIAAver3.0软件分析相互作用的传感器图，我们从反应表面数据中减去参照物，以消除溶液的折射率变化、注入噪声和与空白表面的非特异性结合；
(5)从得到的反应数据中减去仅带有缓冲液的空白注射的数据；数据被拟合到1：1结合的Lagmuir模型。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，对于胶原结构域，通过将30μg/ml的抗小鼠IgG抗体固定到CM5传感器芯片上来进行SPR分析：
(1)Anti-APN mAb(10μg/ml，Thermo Fisher，Cat.No.MA1-054)，作为配体1，捕获水平为846RU，而APN的胶原结构域(36μg/ml，由Genecopeia表达和纯化)被捕获为配体2，捕获水平设置为108.3RU；
(2)而APN的胶原区(36μg/ml，由Genecopeia表达和纯化)被捕获为配体1，捕获水平为846RU；在25℃下，以10μl/min的流速进行结合分析，并在记录分析物与配体之间的结合之前，将得到的分析物[His标记的LAIR-1(156.25-250nM)]注入流动细胞中；其他步骤如上所述。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，流式细胞术：
(1)为了评估细胞表面相关标记物，使用包被在细胞培养板上的抗CD3 mAb(3μg/ml)和抗CD28 mAb(5μg/ml)刺激3×106新鲜分离或解冻的PBMC，同时加入APN/APN截短物重组蛋白(10μg/ml)；
(2)LAIR-1mAb(No.9.1C3)(10μg/ml)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)抑制剂，100μg/ml硫代葡萄糖酸钠(SSG)和5μMNSC-87877(87877)，以逆转gAdp/LAIR-1结合的效应，细胞在5％二氧化碳培养箱中维持在37℃，24h后收集并重悬于流式染色缓冲液中(PBS含有3％FCS和0.01％叠氮化钠)；
(3)混合物与山羊血清(阻断剂)在冰上孵育30min，然后加入荧光标记抗体和适当的同型匹配对照30min；
(4)用染色缓冲液洗涤细胞一次，再次悬浮在染色缓冲液中，然后在ACEANovoExpress System(Agilent Bio)上进行流式细胞仪检测。使用FlowJo软件(TreeStar)对获得的数据进行分析，结果以阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中：
(1)为了进行流式磷酸化分析，将4×106个新鲜分离的PBMC接种在96孔圆形底板中，并如前所述进行刺激；
(2)然后收集细胞，并用4％的副细胞固定RT处醛10min，然后用CD4和CD8染色；
(3)对于p-ZAP70和p-SHP-2分析，在使用细胞内染色试剂盒(BD Phosflow Lyse/Fix Buffer和Perm Buffer III，BD Biosciences，CA，San Jose)固定和细胞破膜后，用相应的抗体或适当的同型对照进行细胞内染色。按照制造商的说明进行操作。
优选的，在上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法中，为了检测APN和LAIR-1的表面结合：
(1)将293T细胞接种在6孔板中，并用1μgpcDNA3.0-LAIR-1转染；
(2)48小时后收集细胞，与10μg/ml的APN/APN截短物重组蛋白在37℃孵育30min；
(3)洗涤细胞后，分别以抗APN的单克隆抗体(检测APN全长)和多克隆抗体(检测gAdp)(均为1：500)为一抗，FITC偶联的抗鼠IgG和抗兔IgG为二抗进行染色；(4)用完整的293T细胞、表达LAIR-1的293T细胞以及与APN/APN截短的重组蛋白孵育的完整的293T细胞进行对照实验；
统计分析：(1)使用GraphPadPrism 8软件分析所有数据，并以三个独立实验的平均值(SEM)的平均值±标准误差表示；
(2)不同组之间分别使用双尾和单向变量进行比较，P≤0.05之后的数据被认为具有统计学意义。
通过上述LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法证明了：APN与LAIR-1结合，结合位点在APN的球状结构域(gAdp)上，而不是在其胶原区上；同时LAIR-1与gAdp相互作用激活下游含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)途径，抑制T细胞活化；证明所述LAIR-1分子与脂联素的相互作用可以应用于抗炎药物的制备。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，其特征在于：包括步骤
S1.将LAIR-1与APN特异性结合，探究APN与LAIR-1之间的关系；
步骤S1所述的将LAIR-1与APN特异性结合的过程包括：
S101.首先对293T细胞中共表达的外源蛋白LAIR-1和APN进行免疫沉淀，用抗FLAG抗体对上述的外源蛋白进行免疫沉淀，然后用抗APN抗体进行免疫印迹分析；
S102.明确Jurkat T细胞表面表达LAIR-1受体后，再将Jurkat T细胞与APN重组蛋白在培养体系中孵育，用抗LAIR-1抗体对细胞表面的LAIR-1蛋白进行免疫沉淀，然后用抗APN抗体进行免疫印迹分析；
S103.明确用pCDNA-3.0-LAIR-1质粒转染293T细胞只表达LAIR-1受体，而不表达其他已经报道的APN受体；
S104.用pCDNA-3.0-LAIR-1质粒转染293T细胞与APN重组蛋白在培养体系中孵育，用流式细胞仪分析APN在细胞表面的表达水平；
S105.对LAIR-1-APN复合物进行表面等离子体共振，测量分子之间的相互作用亲和力；
S2.再将LAIR-1与APN特异性结合后，测定APN与LAIR-1结合的结构域所在的位置，得到APN球状区重组蛋白；
步骤S2所述的APN与LAIR-1结合的结构域的测定过程包括：
S201.已知APN包括一个胶原区和一个球状区，根据APN编码两个不同结构域的Myc标记质粒；
S202.在293T细胞中进行共沉淀，通过将步骤S201描述的质粒转染293T细胞，使APN每个结构域片段在293T细胞表达；用抗FLAG抗体对外源蛋白进行免疫沉淀，然后用抗Myc抗体进行免疫印迹分析；
S203.分析全长APN、APN胶原区和APN球状区重组蛋白的表达水平；
S204.用LAIR-1质粒转染293T细胞，并与APN球状区重组蛋白孵育，利用流式细胞仪检测APN抗体染色后细胞表面APN球状区重组蛋白的表达水平；
S205.对LAIR-1-APN球部复合物进行表面等离子体共振，测量分子之间的相互作用亲和力；得到亲和力KD值为1.11×10-5 M；结合位点在APN的球状区gAdp上；
S206.对LAIR-1-APN胶原部复合物进行表面等离子体共振，测量分子之间的相互作用亲和力；由于响应单位过低，该结果认为LAIR-1不与APN胶原部结合；
S207.用LAIR-1质粒转染293T细胞，并与APN胶原区重组蛋白孵育，利用流式细胞仪检测APN抗体染色后细胞表面APN胶原区重组蛋白的表达水平；
S3.探究APN球状区重组蛋白与T细胞表面的LAIR-1结合时，对于LAIR-1下游SHP-2的影响；
步骤S3所述的探究APN球状区重组蛋白与T细胞表面的LAIR-1结合时，对于LAIR-1下游SHP-2的影响的研究过程包括：
S301.用10 µg/ml的APN和gAdp重组蛋白分别处理Jurkat T细胞，然后使用蛋白免疫印迹法测定SHP-1和SHP-2的磷酸化水平；
S302.用10 µg/ml的APN和gAdp重组蛋白分别处理Jurkat T细胞，在Jurkat T细胞中进行共沉淀，用抗LAIR-1抗体进行免疫沉淀，然后用抗SHP-2抗体进行免疫印迹分析，明确APN和gAdp重组蛋白刺激后，Jurkat T细胞中的SHP-2与LAIR-1确实可以结合；
S4.探究APN球状区重组蛋白抑制T细胞活化的作用，以及该作用与LAIR-1中和抗体之间的关系；
步骤S4所述的APN球状区重组蛋白抑制T细胞活化的作用的探究过程包括：
S401. PBMC中的T细胞被包被于细胞培养板上的CD3 mAb和CD28 mAb激活，并同时用每种重组蛋白的10 µg/ml处理，培养24h后再用流式细胞仪测定T细胞活化标志物CD69和CD25的表达水平；
S402.首先筛选LAIR-1 mAb，根据步骤S104，用LAIR-1质粒转染293T细胞；将转染的293T细胞与APN重组蛋白以及LAIR-1 mAb孵育，通过流式细胞术对细胞表面的APN进行测定；
S403. PBMC中的T细胞被包被于细胞培养板上的CD3 mAb和CD28 mAb激活，并在TCR活化的T细胞中同时加入10 µg/ml 的LAIR-1 mAb和10 µg/ml 的gAdp，培养24小时，然后流式细胞术分析T细胞表面的CD69和CD25活化标志物；
S404.根据步骤S403验证其他克隆号的LAIR-1 mAb，并没有中和APN抑制T细胞活化的作用；
S5.探究APN球状区重组蛋白引起的T细胞抑制作用与调节T细胞活化的SHP-2与ZAP-70之间的关系；
步骤S5所述的APN球状区重组蛋白引起的T细胞抑制作用与调节T细胞活化的SHP-2与ZAP-70之间关系的探究过程包括：
S501.用gAdp处理PBMC 5分钟，同时向PBMC中加入LAIR-1 mAb和gAdp重组蛋白，流式细胞术分析细胞内SHP-2的磷酸化水平；
S502.使用SSG来检测SHP-2在gAdp/LAIR-1诱导的T细胞抑制中的作用；
S503.使用流式细胞术分析T细胞中ZAP-70的磷酸化，发现用CD3 mAb和CD28 mAb刺激PBMC 15分钟，同时用gAdp重组蛋白处理，导致CD4+和CD8+T细胞中p-ZAP70+细胞的百分比降低，即SHP-2和ZAP-70都参与了gAdp介导的T细胞抑制。
2.根据权利要求1所述的LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，其特征在于：步骤S105所述的表面等离子体共振过程包括：
（1）将抗His单抗固定在芯片上，捕获His标记的LAIR-1；
（2）然后注射Fc标记的APN，观察响应单位随时间的变化，得到人LAIR-1与APN的相互作用的KD值为6.38×10-6 M。
3.根据权利要求1所述的LAIR-1分子与脂联素的相互作用对于T细胞活化作用影响的研究方法，其特征在于：所述的LAIR-1分子与脂联素的相互作用应用于抗炎药物的制备。
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