WO2004058970A1 - アディポネクチンプロモーターおよびその用途 - Google Patents

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WO2004058970A1
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syndrome
sequence
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dna
screening
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Yuji Matsuzawa
Iichiro Shimomura
Makoto Makishima
Tohru Funahashi
Masanori Iwaki
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Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a promoter containing a single nucleotide sequence of a novel regulator for gene expression and its use. Specifically, a DNA containing a promoter region containing a human adiponectin gene regulator sequence, a transformant transformed with the DNA, a compound that promotes adiponectin promoter activity through the regiulator sequence, or It relates to methods for screening the salts.
  • Conventional technology a DNA containing a promoter region containing a human adiponectin gene regulator sequence, a transformant transformed with the DNA, a compound that promotes adiponectin promoter activity through the regiulator sequence, or It relates to methods for screening the salts.
  • Conventional technology Conventional technology
  • Adipose tissue has traditionally been considered to be a passive tissue that stores fat, but has recently been regarded as an endocrine tissue that actively produces and secretes various bioactive factors.
  • Adipocytes that form adipose tissue secrete various bioactive factors called adipocytokines and have recently been shown to play a crucial role in the regulation of systemic glucose and lipid metabolism (Nature, vol. 414, 2001). Year, see pages 799-806).
  • Adiponectin was identified as the most abundantly expressed gene in human adipocytes and as honolemon (see Biochemical and Biophysical Research Communication, Vol. 221, 1996, pp. 286-289). Adiponectin is produced and secreted specifically in fat cells, and is abundant in the blood.
  • adiponectin is a hormone that has anti-diabetic, anti-atherosclerotic, and anti-obesity effects, and is deeply involved in the development and progression of metabolic diseases.
  • plasma adiponectin levels are reduced in patients with ischemic heart disease and insulin-resistant diabetes (Circulation, 100, 1999, 2473-2476).
  • P. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 20, 2000, pp. 1595-1599).
  • a decrease in plasma adiponectin concentration was correlated with the onset of insulin-resistant diabetes and arteriosclerosis (see Diabetes, Vol.
  • mice deficient in the adiponectin gene high sucrose and high-fat diets induced diabetes, and arterial thickening was markedly increased when the arteries were damaged.
  • the lesions were markedly improved (Nature Medicine, Vol. 8, 2002, pp. 731-737, Journal of Biological Chemistry, 277, 2002). Year, pp. 37487-37491).
  • mice deficient in apolipoprotein E administration of the adiponectin gene using adenovirus suppressed the progression of arteriosclerosis (see Circulation, Volume 106, 2002, 2767-2770).
  • Administration of recombinant adiponectin protein to mice with metabolic abnormalities showed an improvement in insulin resistance and a hypoglycemic effect (Nature Medicine, Vol. 7, 2001, pages 941-946, Nature Medicine, Vol. 7, 2001). , Pp. 947-953).
  • treatments that increase plasma adiponectin levels in patients with metabolic syndrome associated with hypoadiponectinemia may be effective in improving the condition.
  • the plasma concentration of adiponectin in humans is 5-20 ⁇ g / m1 (see Biochemical and Biophysical Research Communication, 257, 1999, pp. 79-83), which is absolutely lower than that of other blood hormones.
  • the quantity is extremely high.
  • supplementation therapy with recombinant adiponectin protein aimed at normalization of plasma concentration requires continuous high-dose administration of the protein and in vivo enzymes of the protein. It is thought that various major difficulties are involved, including prevention of decomposition. Disclosure of the invention
  • protein production can be regulated at various stages, the most fundamental of which is transcription from genes to messenger RNA.
  • One of the most effective means is to modify the amount of protein produced by regulating the expression of disease-related genes to improve the condition of the disease. Transcription is controlled by a promoter region located near the base sequence to be transcribed into messenger RNA.
  • a base sequence called a regulator sequence existing in the promoter region is used to regulate a specific protein as a transcription control factor. It is important that the quality binds.
  • transcription factors are a group of proteins called nuclear receptors that exert their actions by binding to low molecular weight molecules (ligands).
  • PPAR Peroxisome Proliferator-Activated Receptor 7
  • RXR Retinoid X Receptor
  • PPARY is activated by an unspecified endogenous ligand or an exogenous ligand such as a thiazolidinedione derivative (Annu. Rev. Biochem., 70, 341-367 (2001)).
  • the regulator sequence PPRE is composed of a characteristic nucleotide sequence represented by 5, -AGGTCA n AGGTCA-3, but the nucleotide sequence is slightly different depending on the type of gene having PRE.
  • a drug that modulates the expression of a gene to improve its disease state by changing its protein production its activity is regulated by a small molecule ligand present in the promoter region of the gene.
  • Identification of nuclear receptor regulator sequences is an efficient and And it is useful for constructing the best screening system to find drug candidate compounds. Therefore, a transformant produced by identifying a regulator sequence present in the human adiponectin gene promoter region that regulates its transcriptional activity and linking the DNA containing the regulatory sequence to an appropriate reporter gene is produced.
  • adiponectin gene expression such as diabetes, obesity, hypercholesterolemia, hyperlipoproteinemia, and other metabolic disorders, hyperlipidemia, arteriosclerosis, hypertension, cardiovascular disease, bulimia, etc.
  • the transformant further prevents various syndromes caused by the above diseases (syndrome X, metabolic syndrome, multiple risk factor syndrome, insulin resistance syndrome, quartet of death, visceral fat syndrome, etc.). Or as a useful screening system for therapeutic agents.
  • the regulator sequence involved in the regulation of expression of the human adiponectin gene has not been identified, and there has been no method capable of effectively screening for an expression promoting substance.
  • the present inventors have conducted intensive studies with the aim of establishing a screening method for searching for an adiponectin gene expression promoting substance.
  • the human adiponectin gene 5 a regulator sequence specific to the adiponectin gene, PPRE, was located in the upstream promoter region.
  • LRH—RE liver receptor homologue-1 responsive element
  • a DNA comprising a promoter region having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the DNA comprises a human adiponectin regulator sequence; 2.
  • regulator sequence is a nucleotide sequence having both the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • Syndrome X metabolic syndrome, multiple risk factor syndrome, insulin, wherein the transformant according to 11 is used.
  • a method for screening for a prophylactic and / or therapeutic agent for a syndrome selected from the group consisting of:
  • the disease that causes the syndrome is diabetes, obesity, hypercholesterolemia, hyperlipoproteinemia and other metabolic disorders, hyperlipidemia, arteriosclerosis, high blood pressure, cardiovascular disease, or bulimia
  • a screening kit for a compound or a salt thereof which promotes human adiponectin promoter activity characterized by using the transformant according to the above-mentioned 11;
  • a compound or a salt thereof that promotes human adiponectin promoter one activity obtained by using the screening kit according to 15 above,
  • a symptom group selected from Syndrome X, Metapolic Syndrome, Multiple Risk Factor 1 Syndrome, Insulin Resistance Syndrome, Insulin Resistance Syndrome, quartet of Death, and Visceral Fat Syndrome obtained by using the screening kit according to 16 above.
  • Prophylactic and / or therapeutic drugs are included in the screening kit according to 16 above.
  • a pharmaceutical composition comprising the compound or a salt thereof which promotes human adiponectin promoter activity according to the above item 17 or 19, and 22.
  • a medicament comprising a preventive and / or therapeutic drug for a syndrome selected from the syndrome X, metapolic syndrome, multiple risk factor syndrome, insulin resistance syndrome, death quartet, and visceral fat syndrome according to the above 18 or 20, Composition.
  • the DNA of the present invention comprising a regulator A sequence in the human adiponectin gene promoter region P PRE or LRH-RE, or a DNA containing both P PRE and LRH-RE contains the regulator sequence and has adiponectin promoter activity. Anything can be used. Specifically, any nucleotide may be used as long as it contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, its complementary sequence, or a part thereof. Further, any of genomic DNA, cDNA and synthetic DNA derived from humans may be used.
  • the recombinant DNA containing the promoter region containing either the regulator sequence P PRE or LRH-RE of the human adiponectin promoter region or both in the present invention can be specifically obtained as follows.
  • a primer corresponding to the previously reported nucleotide sequence of the human adiponectin promoter region (Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 24, 861-868 (2000)) was designed, and a human tissue-derived genome was designed.
  • the target DNA fragment is amplified by a PCR method using DNA (eg, Clontech) as a type I PCR.
  • the obtained DNA is cloned into a plasmid for E. coli or the like, and the nucleotide sequence is determined.
  • the obtained DNA can be used as it is or by digesting with a restriction enzyme or adding a linker depending on the purpose.
  • reporter gene whose transcript amount can be detected is ligated downstream of the obtained DNA
  • reporter genes luciferase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, alkaline phosphatase gene, ⁇ -galactosidase gene and the like are widely used. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Any other structural gene can be used if its gene product is detectable.
  • yeast As a host to be transformed with the recombinant plasmid DNA, yeast, insect cells, animal cells and the like are used.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22R-, NA87-11A, DKD-5D and the like.
  • insect cells for example, night rob moth Sf9 cells, silkworm BmN cells, and the like are used.
  • animal cells include sal COS-1 cells, COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, 293T cells, 3T3-L1 cells, human HEK293 cells, HepG2 cells, and white fat cells. Cells that are induced to differentiate under appropriate differentiation conditions are used.
  • Transformation of insect cells can be carried out, for example, by appropriately modifying the method described in Bio / Technology, vol. 6, 47, (1988).
  • a method described in Cell Engineering Annex 8 New Cell Engineering Experimental Protocol, 263 (published by Shujunsha in 1995) or Virology, vol. 52, 456 (1973) is used. It can be carried out with appropriate modification.
  • the transformant is cultured in the presence of a specific compound, and the ability of the compound to promote promoter activity can be known by measuring and comparing the amount of the gene product in the culture.
  • the culture medium may be, for example, Burkholder minimal medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA , vol.77, 4505 (1980)).
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20 ° C to 30 ° C for about 24 to 72 hours, and if necessary aeration and agitation. Add stirring.
  • a medium for example, Dulbecco's modified Idal medium (Nakarai) containing about 5 to 20% fetal bovine serum is used.
  • the pH of the medium is adjusted to about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
  • the DNA of the present invention is a DNA containing a promoter region containing one or both of the human adiponectin promoter region and the regulatory sequence P PRE or LRH-RE, by using a transformant thereof, Compounds or salts thereof that promote the activity of the human adiponectin promoter can be screened.
  • the screening method, the screening kit, the screening method, and the compound or salt thereof that promotes the human adiponectin promoter activity obtained by using the screening kit will be specifically described.
  • the human adiponectin promoter region regulator sequence P PRE or LRH-RE of the present invention, or a DNA containing a promoter region containing either or both, and a transformant transformed with the DNA are human adiponectin It is useful for screening a compound or a salt thereof that promotes the activity of a promoter.
  • the method for determining a compound or a salt thereof which promotes the activity of the human adiponectin promoter of the present invention comprising contacting the transformant of the present invention with a test compound and the method comprising not including a sequence of the regulator of the present invention, It is characterized by measuring and comparing the expression level of polypeptide when the transformant is brought into contact with the test compound.
  • Test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a polypeptide encoded by the above structural gene preferably a reporter gene or the like is used.
  • a method for measuring the expression level of a polypeptide for example, a method similar to the method of Brasier, AR et al. (Biotechniques vol. 7, 1116-1122 (1989)) may be used to measure ⁇ "luciferase activity. Can be
  • the screening kit for a compound or a salt thereof that promotes the activity of the human adiponectin promoter of the present invention is characterized by using the above-mentioned transformant, and examples thereof include the following.
  • Cell culture medium Dulbecco's modified Eagle's medium (Nakarai) supplemented with 5% inactivated fetal serum (JRH Biosciences).
  • Plasmid for measuring human adiponectin promoter activity The DNA of the present invention, which contains both the regulator sequence of the human adiponectin promoter region PRE and LRH-RE, is inserted into the multicloning site of the luciferase gene-containing pGL3-basic vector (Promega). What was inserted. Plasmids for nuclear receptor expression: full length of human PPARy, human RXR, and human LRH-1. 08 are obtained by the PCR method using a human cDNA library (Clontech) as a template. Acquired cDNA and expression for mammalian cells Use a plasmid that has been treated with the same restriction enzyme and ligated.
  • Host cell line HEK293 cells (human embryonic kidney-derived cell line, obtained from ATCC)
  • Test compound Store in aqueous solution at 4 ° C or 120 ° C, and use in cell culture medium before use Dilute to 50. Test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethyl sulfoxide, ethanol, etc.
  • HEK 293 cells were seeded into 96-well multiplate (Nunc), cultured overnight at 37 ° C, 5% C0 2 conditions.
  • the method for gene transfer is based on the method described in Lu et al.'S report (Mol. Cell, 6, 507-515 (2000)).
  • the plasmid for measuring the activity of the human adiponectin promoter of the present invention is transiently introduced into cells using a 50 ng / well hole and a plasmid for expressing a nuclear receptor at 15 ng / well, respectively, using the calcium phosphate method. Eight hours after gene transfer, add 1/5 of the test compound dilution to the culture supernatant.
  • a compound that promotes human adiponectin promoter activity is found using the above-described screening method or screening kit, the compound will increase adiponectin production and secretion in adipose tissue, and as a result, increase plasma adiponectin concentration
  • the compound is further used as a prophylactic / therapeutic agent for various syndromes caused by the above diseases (Syndrome X, metabolic syndrome, multiple risk factor syndrome, insulin resistance syndrome, quartet of death, visceral fat syndrome, etc.). Can be used.
  • non-toxic salt of the compound obtained by using the above-described screening method or screening kit examples include salts of alkali metals (such as potassium, sodium, and lithium) and salts of alkaline earth metals (such as calcium and magnesium). Salts, ammonium salts (tetramethylammonium salts, tetrabutylammonium salts, etc.), organic amines (triethylamine, methylamine, dimethylamine, cyclopentinoleamine, penzinoleamine, phenethylenamine, piperidin, monoethanolamine) Min, diethanolamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, lysine, arginine, N-methyl-D-dalcamine, etc.
  • alkali metals such as potassium, sodium, and lithium
  • alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • salts acid adduct salts (inorganic acid salts (hydrochloride, hydrobromide, borohydride) Hydrochloride, sulfate, phosphate, nitric acid Etc.), organic acid salts (acetate, trifluoroacetate, lactate, tartrate, oxalate, fumarate, maleate, benzoate, citrate, methanesulfonate, ethanesulfonate, Benzenesulfonate, toluenesulfonate, isethionate, glucuronate, gluconate, etc.).
  • organic acid salts acetate, trifluoroacetate, lactate, tartrate, oxalate, fumarate, maleate, benzoate, citrate, methanesulfonate, ethanesulfonate, Benzenesulfonate, toluenesulfonate, isethionate, glucuronate, glu
  • the non-toxic salt of the compound of the present invention also includes a solvate or a solvate of the above-mentioned alkali (earth) metal salt, ammonium salt, organic amine salt or acid adduct salt of the compound of the present invention.
  • the solvate is non-toxic and water-soluble.
  • Suitable solvates include, for example, solvates such as water and alcohol solvents (such as ethanol).
  • a solid preparation for oral administration a liquid preparation for internal use, an injection for parenteral administration, an external preparation, and a suppository It is used as an agent.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like. Capsules include hard capsules and soft capsules.
  • the active substance is used as is, or excipients (ratatose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, starch, etc.), binders (hydroxypropylcellulose, polybutylpyrrolidone, Mixed with magnesium aluminate metasilicate, disintegrant (calcium cellulose glycolate, etc.), lubricant (magnesium stearate, etc.), stabilizer, dissolution aid (glutamic acid, aspartic acid, etc.) It is formulated and used according to the usual method.
  • a coating agent sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc.
  • capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid preparations for oral administration include pharmaceutically acceptable solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and the like.
  • the active substance is dissolved, suspended or emulsified in a commonly used diluent (eg, purified water, ethanol or a mixture thereof).
  • the liquid preparation may contain a wetting agent, a suspending agent, an emulsifying agent, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance, a preservative, a buffering agent and the like.
  • Injections for parenteral administration include solutions, suspensions, emulsions, and solid injections that are used by dissolving or suspending in a solvent for use.
  • Injectables are used by dissolving, suspending or emulsifying the active substance in a solvent.
  • a solvent for example, distilled water for injection, physiological saline, vegetable oil, propylene glycol, polyethylene glycol, alcohols such as ethanol, or a combination thereof are used.
  • this injection contains a stabilizer, a solubilizer (glutamic acid, aspartic acid, polysorbate 80 (registered trademark), etc.), a suspending agent, an emulsifier, a soothing agent, a buffer, a preservative, and the like. Is also good. These are manufactured by sterilization or aseptic processing in the final step.
  • a sterile solid preparation for example, a freeze-dried product
  • Topical dosage forms for parenteral administration include, for example, ointments, gels, tablets, poultices, patches, liniments, sprays, inhalants, sprays, aerosols, eye drops And nasal drops. They contain the active substance and are prepared by known methods or commonly used formulations.
  • the ointment is manufactured by a known or commonly used formulation. For example, it is prepared by mixing or melting the active substance with a base.
  • the ointment base is selected from known or commonly used ones. For example, higher fatty acids or higher fatty acid esters (adipic acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, adipic acid ester, myristic acid esterol, panolemitic acid ester, stearic acid ester, oleic acid ester, etc.), waxes ( Millo®, spermaceti, ceresin, etc.), surfactants (polyoxyethylene alkyl ether phosphate ester, etc.), higher alcohols (cetanol, stearyl alcohol, setosteryl alcohol, etc.), silicone oil (dimethyl polysiloxane, etc.) ), Hydrocarbons (hydrophilic petrolatum, white petrolatum, purified lanolin, liquid paraffin, etc.), glyco
  • the gel is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is produced by melting an active substance in a base.
  • the gel base is selected from known or commonly used ones.
  • lower alcohols ethanol, isopropyl alcohol, etc.
  • gelling agents carboxymethylcellulose, hydroxyxetinoresenorelose, hydroxypropinoresenorelose, ethylsenorelose, etc.
  • neutralizing agents triethanol, etc.
  • Surfactants eg, polyethylene glycol monostearate
  • gums water, absorption enhancers, and rash preventives can be used alone or as a mixture of two or more. Further, they may contain preservatives, antioxidants, flavoring agents and the like.
  • the cream is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is prepared by melting or emulsifying the active substance in a base.
  • the cream base is selected from those known or commonly used. For example, higher fatty acid esters, lower alcohols, hydrocarbons, polyhydric alcohols (propylene glycol, 1,3-butylene glycol, etc.), higher alcohols (2-hexyldecanol, cetanol, etc.), emulsifiers (polyoxyethylene alkyl) Ethers, fatty acid esters, etc.), water, absorption enhancers, and rash preventives, singly or in combination of two or more. Further, they may contain preservatives, antioxidants, flavoring agents and the like.
  • the poultice is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is produced by melting an active substance in a base material, forming a kneaded product, and spreading and applying the mixture on a support.
  • the compress base is selected from known or commonly used ones. For example, thickeners (polyacrylic acid, polybutylpyrrolidone, gum arabic, starch, gelatin, methyl cellulose, etc.), wetting agents (urea, glycerin, propylene glycol, etc.), fillers (kaolin, zinc oxide, talc, calcium, Magnesium, etc.), water, dissolution aids, tackifiers, and anti-rash agents are used alone or in combination of two or more. Further, they may contain preservatives, antioxidants, flavoring agents and the like.
  • the patch is produced by a known or commonly used formulation. For example, it is manufactured by melting an active substance in a base material and spreading and applying the composition on a support.
  • the base for the patch is selected from known or commonly used ones. For example, one selected from a polymer base, oils and fats, higher fatty acids, tackifiers and anti-rash agents may be used alone or in combination of two or more. In addition, preservatives, antioxidants, flavors Etc. may be included.
  • the liniment is manufactured by a known or commonly used formulation.
  • the active substance is dissolved, suspended or emulsified in one or more selected from water, alcohol (ethanol, polyethylene glycol, etc.), higher fatty acids, glycerin, soap, emulsifier, suspending agent, etc. Be prepared.
  • preservatives, antioxidants, flavoring agents and the like may be included.
  • Sprays, inhalants, sprays and nasal drops may be used in addition to commonly used diluents, buffers to give isotonicity with stabilizers such as sodium bisulfite, for example sodium chloride, sodium taenate or It may contain isotonic agents such as citric acid.
  • stabilizers such as sodium bisulfite, for example sodium chloride, sodium taenate or It may contain isotonic agents such as citric acid.
  • a nasal drop When a nasal drop is administered, it is usually sprayed quantitatively into the nasal cavity with a solution or powder containing the drug and using a special nasal dropper or nebulizer.
  • Ophthalmic solutions for parenteral administration include eye drops, suspension-type eye drops, emulsion-type eye drops, B-jira-dissolved-type eye drops, and ointments.
  • the active substance is used by dissolving, suspending or emulsifying in a solvent.
  • a solvent for the eye drops for example, sterilized purified water, physiological saline, other aqueous solvents or non-aqueous preparations for injection (eg, vegetable oil) and the like, and combinations thereof are used.
  • Eye drops include isotonic agents (sodium chloride, concentrated glycerin, etc.), buffering agents (sodium phosphate, sodium acetate, etc.), surfactants (polysorbate 80 (trade name), polyoxyl stearate 40, Polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc.), stabilizing agents (sodium citrate, sodium edetate, etc.), preservatives (benzalkonium chloride, paraben, etc.) and the like may be appropriately selected and included as necessary. . These are manufactured by sterilizing power and aseptic processing in the final process. It is.
  • a sterile solid preparation for example, a lyophilized product
  • a sterile solid preparation for example, a lyophilized product
  • inhalants for parenteral administration include aerosols, powders for inhalation, and solutions for inhalation.
  • the inhalation solution is used by dissolving or suspending in water or other appropriate medium at the time of use. It may be in a form. These inhalants are manufactured according to a known method.
  • preservatives benzalkonium chloride, paraben, etc.
  • coloring agents for example, coloring agents, buffering agents (sodium phosphate, sodium acetate, etc.), tonicity agents (sodium chloride, concentrated glycerin, etc.)
  • buffering agents sodium phosphate, sodium acetate, etc.
  • tonicity agents sodium chloride, concentrated glycerin, etc.
  • a thickener such as a riboxyvinyl polymer
  • an absorption enhancer as needed.
  • lubricants stearic acid and its salts, etc.
  • binders starch, dextrin, etc.
  • excipients lactose, cellulose, etc.
  • coloring agents preservatives (salts, etc.) It is prepared by appropriately selecting, as necessary, luconium, paraben, etc.) and an absorption enhancer.
  • a nebulizer (atomizer, nebulizer) is usually used to administer inhaled liquids, and a powdered inhaler is usually used to administer inhaled powders.
  • compositions for parenteral administration include suppositories for rectal administration and pessaries for vaginal administration, which contain the active substance and are formulated in a conventional manner.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, human mammals (for example, rats, mice, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dosage of the compound or a salt thereof varies depending on the age, body weight, symptom, therapeutic effect, administration method, treatment time, and the like, but is generally within a range of 1 ng to 100 mg per adult per dose.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA containing the promoter region of human adiponectin.
  • FIG. 2 shows the structures of the human adiponectin promoter / reporter plasmid DNA and various promoter-deleted DNAs.
  • FIG. 3 shows the transcription promoting activity of the human adiponectin promoter reporter plasmid DNA by constitutively activated PPART / and RXRa.
  • FIG. 4 shows the transcription promoting activity of human adiponectin promoter Z reporter plasmid DNA and various promoter-deleted DNAs.
  • FIG. 5 shows a comparison of the nucleotide sequence of PPRE having a group of genes transcriptionally regulated by the PPAR dimer.
  • FIG. 6 shows the structures of the PRE sequence on the human adiponectin gene and the reporter plasmid DNA of the human adiponectin promoter with a mutation introduced into the PPRE sequence.
  • FIG. 7 shows the transcription-promoting activity of the mutant promoter Noreporter Plasmid DNA by the constitutively active DNAPPARy and RXR.
  • FIG. 8 shows the direct binding of the PPARyZRXR dimer to the regulator sequence P PRE of the human adiponectin promoter (gel shift assay).
  • FIG. 9 shows a comparison of the base sequences of LRH-REs of genes that are transcriptionally regulated by LRH-1.
  • FIG. 10 shows the structures of the LRH-RE sequence on the human adiponectin gene and the DNA of the human adiponectin promoter Z repo-plasmid plasmid having a mutation introduced into the LRH-RE sequence.
  • FIG. 11 shows the transcription promoting activity of human adiponectin promoter Z reporter plasmid DNA by pioglitazone when PPARyZRXR dimer and LRH-1 were expressed.
  • FIG. 12 shows the direct binding of the human adiponectin promoter of LRH-1 to the regulatory regulator sequence LRH-RE (gel shift assay).
  • FIG. 13 shows the transcription promoting activity of human adiponectin promoter Z reporter plasmid DNA in differentiated adipocytes by pioglitazone.
  • Example 1 Construction of human adiponectin promoter Z reporter plasmid DNA
  • DNA containing the promoter region of human adiponectin was obtained by PCR using the DNA fragment (Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord, 24, 861-868 (2000)) obtained by the method of Takahashi et al. Amplified.
  • a clone containing a human adiponectin gene was obtained from human Pl-derived artificial chromosome (PAC) DNA pools (Genome Systems) and digested with restriction enzymes BamHI and XbaI.
  • PAC Pl-derived artificial chromosome
  • the DNA fragment was designated as type I, and the transcription start site of the human adiponectin gene was designated as base number 1 from 5 'upstream 908th to 3' downstream 1 Primers designed to amplify up to the fourth nucleotide sequence (5, -TTT CGG GGT ACC GCT TCT AGG CCA GAG CTG GG TTC-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5, -TTT CGG GAG CTC CTG CAG TCA
  • the DNA fragment containing the human adiponectin promoter region was amplified by PCR using GAA TGG AAG TGA GAA-3 ′ (SEQ ID NO: 6)), and the nucleotide sequence was determined.
  • Figure 1 shows the determined nucleotide sequence.
  • the amplified DNA fragment and the pGL3 basic plasmid (Promega) having the firefly luciferase gene were digested with restriction enzymes KpnI and SacI, respectively, and both were ligated.
  • Figure 2 shows the outline of the structure.
  • this human adiponectin promoter / reporter plasmid is referred to as p (-908) ZLUC.
  • Example 2 Assay for transcription promoting activity of human adiponectin promoter reporter plasmid DNA
  • Example 2 The activation of the p (-908) ZLUC constructed in Example 1 by a dimer of the nuclear receptor PPAR / RXR was assayed by luciferase assay.
  • Example 2 the chimeric proteins (VP16-PPAR7, and VP16-RXR ⁇ ) in which the transcription activation region of the herpesvirus protein VP16 and the nuclear receptor PPARy and RXRo; The activity was assayed by introducing a gene into an expression plasmid DNA that expresses in a cell. These chimeric nuclear receptors have the ability to activate the transcription of response genes without depending on the respective activation ligands (Mol. Endocrinol. 16, 1040-1048 (2002)).
  • p (-908) ZLUC constructed in Example 1 was transfected simultaneously with the nuclear receptor expression plasmid.
  • HEK293 cells derived from human fetal kidney were used as host cells. Cells are seeded on a 96-well multiplate (Nunc) and immobilized 5% Using Dulbecco's modified Eagle's medium containing fetal serum (Nacalai Inc.) were cultured overnight at 37 ° C, 5% C0 2 under the conditions, were transformed. The method of gene transfer followed the method described in Lu et al.'S report (Mol. Cell 6, 507-515 (2000)).
  • a human adiponectin promoter-deleted mutant having the structure shown in the lower part of FIG. 2 was prepared for the purpose of specifying which region on the human adiponectin motor increases the transcriptional activity observed in Example 2. . 5.
  • a primer having a restriction enzyme cleavage site at the end was designed so as to obtain a promoter DNA of a desired length, and was amplified by PCR using the p (-908) ZLUC described above as a type III. Amplified DNA fragment and pGL3 Basic Plus The mid (pGL3 basic plasmid) was digested with a restriction enzyme and ligated to construct a deletion mutant.
  • each of these deletions was used as a reporter to transiently express both VP16-PPARy and VP16-RXR ⁇ expression plasmids, and luciferase was treated in the same manner as in Example 2. Activity was measured.
  • Fig. 4 shows the results. Deletion of the sequence from 286 bp to 267 bp in the human adiponectin promoter region eliminated the increase in luciferase activity due to the expression of both VP16-PPAR ⁇ and VP16-RXRa. From these results, it was presumed that there was a regulatory sequence P PRE on which the PPAR ⁇ / RXR dimer acts, between 1 286 bp and 1 267 bp of the human adiponectin promoter region.
  • Figure 5 shows the nucleotide sequence of PPRE present in the promoter region of a gene reported to be transcriptionally regulated by PPARoz / RXR dimer (Genes Dev., 8, 1224-1234 (1994) Chem., 275, 9131-9135 (2000), Mol. Cell, 7, 161-171 (2001), J. Biol. Chem., 276, 48572-48579 (2001)). Each has a similar structure consisting of 13 bases called direct repeat 1 (DR1).
  • DR1 direct repeat 1
  • a reporter plasmid was prepared in which a two-base mutation was introduced into the deduced sequence, as shown in FIG. Mutations were introduced using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) according to the attached protocol.
  • VP was transferred to HEK293 cells. 16—? ? 1 7 and ⁇ ?
  • a gel shift assay was performed to confirm that the PPAR YZRXR dimer directly binds to the regulator sequence P PRE identified from 1 285 bp to 1 273 bp of the human adiponectin promoter region.
  • P PAR gamma RXRA protein is human PPARy, an expression plasmid expressing human RXRA and ⁇ , using T N T T7 Quick Coupled Transcription / Translation Systems ( Promega) attached protocol was synthesized in an in vitro system.
  • Oligo DNA (5, -TGG TTT TGA CTT TTG CCC CAT CTT C-3, (SEQ ID NO: 7) and 5 ') having a nucleotide sequence from 1 291 bp to 267 bp of the human adiponectin promoter region GCA AAA GTC AAA ACC A- 3, labeled with (SEQ ID NO: 8)), respectively [ ⁇ - 32 P] ATP (Amersham Biosciences) and T 4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo), and the double-stranded Those were used as labeled probes.
  • the underlined base sequence indicates P PRE ing.
  • the binding reaction between the labeled probe and the protein synthesized in the in vitro system was performed in a 20 ⁇ l solution.
  • the reaction solution 2 Omm HEP ES Ba Ffa ( ⁇ 8 ⁇ 0), 6 OmM KC 1, 1 mM Jichiosurei Torr consists composition of 1 0% glycerol, further 1 mu ⁇ poly (dl-dC), 1 mu 1
  • the reaction mixture was prepared by adding a 200,000 cpm labeled probe to a synthesis reaction solution containing the nuclear receptor of Example 1 to make 20 ⁇ l. After mixing, the mixture was reacted at 25 ° C for 20 minutes, and further allowed to stand at 4 ° C for 15 minutes.
  • the complex of the labeled probe and the nuclear receptor and the uncomplexed labeled probe were separated by electrophoresis using a 4% polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis was performed using 0.5XTBE buffer (45 mM Tris, 45 mM boric acid, 1 mM EDTA) at a voltage of 200 V for 90 minutes.
  • the gel after the electrophoresis was dried and image-analyzed using a BAS2500 system (Fujisha Shin Kogyo).
  • a competition reaction was also performed. Competition reactions were performed using unlabeled oligo DNA containing wild-type P PRE or oligo DNA with the same mutation introduced in P PRE as shown in Fig.
  • the reaction was performed by adding a molar concentration to the reaction solution.
  • the nucleotide sequence of the oligo DNA in which the mutation was introduced into PPRE was 5, -TGG TTT TGA CTT TTG tt C CAT CTT C-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5, one GAA GAT GG aa CA AAA GTC AAA ACC A -3 '(array number 10). Mutated bases are shown in lower case.
  • the underline attached to the nucleotide sequence indicates PRE.
  • Fig. 8 shows the results. The arrow points to the slower band on the gel due to the binding of the labeled probe to the higher molecular weight protein.
  • FIG. 9 shows the nucleotide sequence of LRH-RE in the promoter region of a gene that is reported to be regulated by LRH-1 (Mol. Cell 6, 507-515 (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6660-6665 (1999), J. Biol. Chem. 276, 24767-24773 (2001), J. Biol. Chem., 275, 17793-17799 (2000)).
  • the sequence found in the human adiponectin promoter region differed only by one base from the LRH-RE present in the rat and human CYP7A1 gene promoter regions.
  • FIG. 10 shows the location of the putative LRH-RE sequence.
  • the putative LRH-RE sequence was located between 237 bp and 229 bp between the PRE and the transcription start site described above.
  • the presence of the putative LRH-RE sequence in the human adiponectin promoter region suggests that the adiponectin promoter may be transcriptionally regulated by the nuclear receptor LRH-1. Therefore, in HEK293 cells, the above-mentioned p (-908) ZLUC was used as the reporter plasmid, and PPARy, RXRa, Then, an expression plasmid expressing LRH-1 was transiently expressed by the same method as that used in Example 2.
  • LRH-1 had no effect alone, but enhanced the promotion of human adiponectin promoter 1 activity by the PPARyZ RXR dimer.
  • FIG. 11 A reporter plasmid containing a mutation was prepared, and luciferase activity was measured (Fig. 11).
  • a gel shift assay was performed to confirm that LRH-1 directly binds to the LEG-RE sequence, a regulator sequence found in the human adiponectin promoter region.
  • Gel shift assay was performed by the same method as that used in Example 4.
  • the LRH_1 protein used in the binding reaction was synthesized in an in vitro system using an expression plasmid expressing human LRH-1 as type III.
  • Labeled probes include oligo DNA (5'—AAT AAG GGT CAA GGC CTG GAA AC AC—3 '(SEQ ID NO: 11) and 5' having a nucleotide sequence from 1 245 bp to 1 221 bp of the human adiponectin promoter region.
  • oligo DNA (5'-AAT AAG GGT GGT) was used in which the same oligo DNA as that used for the labeled probe was used as a wild type, and a mutation was introduced into LRH-RE in the same manner as shown in Fig. 10.
  • mice were cultured in a 6-well plate (Bettaton Dickinson) coated with type IV collagen, and 5 ⁇ g / m1 insulin, 0.5 mM isoptylmethylxanthine, Differentiation was induced in a medium containing 1 ⁇ dexamethasone. Cells 6 days after the start of differentiation induction were used for transformation experiments. Gene transfer was performed using LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) according to the attached protocol.
  • a ⁇ (—908) / LUC reporter with a wild-type human adiponectin promoter was used. Luciferase activity increased 19-fold. Treatment with 1 pioglitazone resulted in an additional 9-fold increase compared to no treatment.
  • a reporter in which a mutation was introduced into the regulator sequence PPRE Fig. 6
  • the luciferase activity was significantly reduced as compared with the wild type, and no effect of treatment with piodaritazone was observed.
  • a reporter having a mutation in LRH-RE Fig.
  • the regulatory sequence in the human adiponectin promoter region of the present invention is PPRE (Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 24, 861-868 (2000)).
  • PPRE Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 24, 861-868 (2000).
  • the 5 the base sequence located between the 273rd and 285th positions on the upstream side
  • the LRH-RE (the same as the PPRE described above, the 5th base sequence located between the 229th and 237th positions on the upstream side)
  • Nuclear receptors PPARo /, RXR, LRH- 1 Direct binding sequence and play a crucial role in the activation of the adiponectin promoter in adipocytes.
  • Transformants transformed with a reporter plasmid in which an appropriate reporter gene is ligated to a DNA containing a promoter region including the regulator sequence are similar in expression to the physiological human adiponectin gene.
  • Drugs for the treatment of human diseases Very useful for re-junging c

Abstract

ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むプロモーター領域を有するDNA、そのDNAで形質転換された形質転換体、その形質転換体を用いるヒトアディポネクチンプロモーター活性促進化合物のスクリーニング法およびスクリーニング用キット、その形質転換体を用いるシンドロームX、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、内臓脂肪症候群等の症候群、糖尿病、肥満、高コレステロール血症、高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、循環器系疾患、過食症等の予防/治療薬のスクリーニング法、及びそれらを用いて得られる医薬組成物に関する。

Description

明 細 書 -ーターおょぴその用途 技術分野
本発明は、 遺伝子発現用新規レギユレータ一塩基配列を含むプロモーター およびその用途に関する。 具体的には、 ヒトアディポネクチン遺伝子レギュ レータ一配列を含むプロモータ一領域を含有する D NA、 当該 D NAで形質 転換された形質転換体、 当該レギユレータ一配列を介してアディポネクチン プロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法など に関する。 従来技術
脂肪組織は、 従来脂肪を蓄える受動的な組織であるとされていたが、 近年、 様々な生理活性因子を活発に生産、 分泌する内分泌組織であると捉えられて いる。 脂肪組織を形成する脂肪細胞はアディポサイトカインといわれる種々 の生理活性因子を分泌し、 全身の糖 ·脂質代謝制御に重大な役割をはたして いることが近年明らかにされている （Nature, 414卷， 2001 年， 799-806頁参 照） 。 アディポネクチンは、 ヒト脂肪細胞に最も豊富に発現する遺伝子とし て、 またホノレモンとして同定された （Biochemical and Biophysical Research Communication, 221卷， 1996年， 286-289頁参照） 。 アディポネクチンは脂肪 細胞特異的に産生、 分泌され、 血中に豊富に存在する。 数多くの研究結果か ら、 アディポネクチンは抗糖尿病、 抗動脈硬化、 抗肥満作用を有するホルモ ンであり、 代謝疾患の発症、 進展に深く関与することが示されている。 例え ば、 血漿アディポネクチン濃度は、 虚血性心疾患やインスリン抵抗性糖尿病 を有する患者において低下している （Circulation, 100巻， 1999年， 2473-2476 頁、 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 20巻， 2000年， 1595-1599 頁参照） 。 一方、 アディポネクチン遺伝子に変異を有する患者において、 血 漿アディポネクチン濃度の低下は、 インスリン抵抗性糖尿病や動脈硬化の発 症と相関していた （Diabetes, 51卷， 2002年， 2325-2328頁参照） 。 食餌性に惹 起された肥満サルにおいて、 血漿アディポネクチン濃度は経年的に低下した 力 、 その変化はィンス リン抵抗性の悪化と極めてよく相関していた (Diabetes, 50卷， 2001年， 1126-1133頁参照） 。 また、 アディポネクチン遺伝 子を欠損したマウスにおいては、 高ショ糖、 高脂肪食の負荷により糖尿病が 惹起され、 動脈に傷害を与えた際の動脈肥厚が著しく亢進していた。 それら マウスにアデノウイルスを用いて外来性にアディポネクチン遺伝子を補充す ると、 病変は著明に改善した （Nature Medicine, 8卷， 2002年， 731-737頁、 Journal of Biological Chemistry, 277卷， 2002年， 37487-37491頁参照） 。 ァポリ ポタンパク質 Eを欠損したマウスにおいては、 アデノウィルスを用いてアデ ィポネクチン遺伝子を投与すると、 動脈硬化の進展が抑制された (Circulation, 106卷， 2002年， 2767-2770頁参照） 。 代謝異常マウスへ組み換 えアディポネクチンタンパク質を投与すると、 インスリン抵抗性の改善や血 糖降下作用が認められた （Nature Medicine, 7卷， 2001年， 941-946頁、 Nature Medicine, 7卷， 2001年， 947-953頁参照） 。 これら事実に基づき、 低アディポ ネクチン血症を伴う代謝異常症候群の患者の血漿アディポネクチン濃度を上 昇させる治療は、 病態の改善に有効であると考えられる。 しかしながら、 ヒ トにおけるアディポネクチンの血漿中濃度は 5〜 2 0 μ g /m 1であり (Biochemical and Biophysical Research Communication, 257 , 1999年, 79-83 頁参照） 、 他の血中ホルモンと比較すると絶対量として極めて高い水準にあ る。 この点を考慮すると、 血漿アディポネクチン濃度の低下した患者におい て、 血漿濃度の正常化を目指した組み換えアディポネクチンタンパク質の補 充療法は、 該タンパク質の持続的高用量投与や、 該タンパク質の生体内酵素 分解などの防止を含め種々の大きな困難を伴うものと考えられる。 発明の開示
生体において、 タンパク質の産生は様々な段階で制御されうるが、 そのう ち最も根源的であるのは遺伝子からメッセンジャー RNAへの転写段階であ る。 疾患関連遺伝子の発現調節を通じてその産物であるタンパク質の量を変 化させ、 病態改善を図る治療法は、 有力な手段のひとつである。 転写制御は、 メッセンジャー RNAへ転写される塩基配列の近傍に位置するプロモーター 領域ゃェンハンサー領域によりなされ、 特に、 プロモーター領域内に存在す るレギュレーター配列と呼ばれる塩基配列に、 転写制御因子として特定のタ ンパク質が結合することが重要である。 それら転写制御因子の中には、 低分 子量の分子 （リガンド） と結合することにより、 その作用を発揮する核内受 容体と呼ばれる一群のタンパク質が含まれる。 例えば、 脂肪細胞分化に重要 な核内受容体である P PAR (Peroxisome Proliferator- Activated Receptor 7) は、 別の核内受容体 RXR (Retinoid X Receptor) と二量体を形成し、 遺伝子のプロモーター領域内にあるレギュレーター配列 P P R E (Peroxisome Proliferator-activated receptor Responsive Element) ίこ特異的 ίこ結 合して転写を調節する。 P PAR Yは、 未だ特定されていない内因性のリガ ンド、 あるいはチアゾリジンジォン誘導体のような外来性のリガンドにより 活性化される （Annu. Rev. Biochem., 70, 341-367 (2001)) 。 レギュレーター配 列 PPREは、 5， -AGGTCA n AGGTCA— 3， に代表される特 徴的な塩基配列で構成されているが、 P PREを有する遺伝子の種類により その塩基配列は若干異なっている。 ある遺伝子の発現を調節することによつ てそのタンパク質産生量を変化させ病態改善を図る薬剤を創製するに当たつ て、 遺伝子のプロモーター領域内に存在する、 低分子リガンドにより活性が 調節される核内受容体のレギュレーター配列を同定することは、 効率よく、 かつ医薬品候補化合物を見出すために最良のスクリーニング系を構築する上 で有用である。 従って、 ヒトアディポネクチン遺伝子プロモーター領域内に 存在する、 その転写活性を調節するレギュレーター配列を同定し、 当該レギ ユレータ一配列を含む D N Aを適当なレポ一タ一遺伝子と連結させ、 作出さ れる形質転換体は、 アディポネクチン遺伝子の発現促進を通じて作用し得る 糖尿病、 肥満、 高コレステロール血症、 高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、 高脂血症、 動脈硬化症、 高血圧、 循環器系疾患、 過食症等の予防および ま たは治療薬の有用なスクリーニング系として使用できる。 当該形質転換体は さらに、 上記疾患が病因になっている種々の症候群 （シンドローム X、 メタ ボリックシンドローム、 マルチプルリスクファクター症候群、 インスリン抵 抗性症候群、 死の四重奏、 内臓脂肪症候群等） の予防おょぴ または治療薬 の有用なスクリーニング系としても使用できる。 しかしながら、 現在まで、 ヒ トアディポネクチン遺伝子の発現調節に関わるレギュレーター配列は同定 されておらず、 発現促進物質を実質的に有効にスクリーニングできる方法は 存在しなかった。
本発明者らは、 アディポネクチン遺伝子発現促進物質を探索するスクリー ユング法の確立を目指して、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒトアディポネクチン 遺伝子 5， 上流のプロモーター領域内に、 アディポネクチン遺伝子に固有の レギュレーター配列 P P R Eと L R H— R E (liver receptor homologue-1 responsive element) を発見し、 同定した。 さらに、 同定したレギュレーター 配列 P P R Eと L R H— R Eが、 生理的なヒトアディポネクチンプロモータ 一活性の調節に機能していることを見出した。 本発明者らは、 これらの知見 に基づき、 さらに研究した結果、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、
1 . ヒ トアディポネクチンのレギュレーター配列を含むことを特徴とする配 列番号 1で表される塩基配列を有するプロモータ一領域を含む D N A、 2. ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むことを特徴とする配 列番号 1で表される塩基配列を有するプロモータ一領域からなる前記 1記載 の DNA、
3. レギュレーター酉己歹 [J力、 P P R E (Peroxisome Proliferator-activated Receptor Responsive Element) を含有する配列である前記 2記載の DNA、
4. レギュレーター酉己歹 Uが、 L R H— R E (Liver Receptor Homologue-1 Responsive Element) を舍有する配列である前記 2記載の D N A、
5. レギュレーター配列が、 配列番号 2で表される塩基配列である前記 2記 載の DNA、
6. レギュレーター配列が、 配列番号 3で表される塩基配列である前記 2記 載の DNA、
7. レギユレータ一配列が、 配列番号 2で表される塩基配列および配列番号 3で表される塩基配列の両方を有する塩基配列である前記 2記載の D N A、
8. レギュレーター配列が、 配列番号 4で表される塩基配列である前記 2記 載の DNA、
9. 前記 2記載の DN Aを含む組み換えプラスミド DNA、
10. ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むプロモーター領域 の制御下に構造遺伝子を発現する機能を有することを特徴とする前記 9記載 の組み換えプラスミド DNA、
1 1. 前記 9または 10記載の組み換えプラスミド DNAで形質転換された 形質転換体、
1 2. 前記 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒトアディポネ クチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方 法、
13. 前記 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするシンドローム X、 メタボリックシンドローム、 マルチプルリスクファクター症候群、 インスリ ン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の 予防および/または治療薬のスクリーニング方法、
1 4 . 症候群の病因である疾患が、 糖尿病、 肥満、 高コレステロール血症、 高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、 高脂血症、 動脈硬化症、 高血圧、 循環器 系疾患、 または過食症である前記 1 3記載のスクリーニング方法、
1 5 . 前記 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒトアディポネ クチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用 キット、
1 6 . 前記 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするシンドローム X、 メタボリックシンドローム、 マルチプルリスクファクター症候群、 インスリ ン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の 予防および Zまたは治療薬のスクリーニング用キット、
1 7 . 前記 1 2記載のスクリーニング方法を用いて得られるヒトアディポネ クチンプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩、
1 8 . 前記 1 3記載のスクリーニング方法を用いて得られるシンドローム X、 メタボリックシンドローム、 マルチプルリスクファクタ一症候群、 インスリ ン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の 予防およぴ Zまたは治療薬、
1 9 . 前記 1 5記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒトアディ ポネクチンプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩、
2 0 . 前記 1 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られるシンドロー ム X、 メタポリックシンドローム、 マルチプルリスクファクタ一症候群、 ィ ンスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる症 候群の予防および/または治療薬、
2 1 . 前記 1 7または 1 9記載のヒトアディポネクチンプロモーター活性を 促進する化合物またはその塩を含有する医薬組成物、 およぴ 22. 前記 18または 20記載のシンドローム X、 メタポリックシンドロ一 ム、 マルチプルリスクファクター症候群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四 重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防および/または治療 薬を含有する医薬組成物に関する。
本発明のヒトアディポネクチン遺伝子プロモーター領域内のレギユレータ 一配列 P PREあるいは LRH— REを含有する DNA、 または P PREと LRH— REの両者を含有するDNAは、 当該レギュレーター配列を含み、 アディポネクチンプロモーター活性を有するものであればいかなるものであ つてもよい。 具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列、 その相補配列ま たはそれらの一部を含有するものであればいかなるものであってもよい。 ま たヒト由来のゲノム DNA、 cDNA、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明におけるヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター 配列 P PREあるいは LRH— REのどちらか、 またはその両者を含有する プロモーター領域を含む組み換え DN Aは、 具体的には次のようにして得る ことができる。
まず既に報告されているヒトアディポネクチンプロモーター領域 （Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 24, 861-868 (2000)) の塩基配列に対応したプライ マーを設計し、 ヒト組織由来のゲノム DNA (例えば、 クロンテック社製） を錄型とした PCR法により、 目的の DNA断片を増幅する。 得られた DN Aは大腸菌用のプラスミドなどにクローユングし、 塩基配列を決定する。 得 られた DNA は目的によりそのまま、 または制限酵素により消化したり、 リンカーを付加したりして使用することができる。 さらにプロモーター活性 を調べる手段としては、 得られた DNAの下流に、 転写量の検出可能なレポ 一ター遺伝子を連結する方法が好用される。 レポーター遺伝子としては、 ル シフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエニコールァセチル転移酵素遺伝子、 アル カリフォスファターゼ遺伝子、 β—ガラクトシダーゼ遺伝子等が汎用される ヽ 他のいかなる構造遺伝子であっても、 その遺伝子産物が検出可能であれ ば用いることができる。
上記組み換えプラスミド DNAにより形質転換する宿主としては、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。 酵母としては、 例えば、 サッカロミ セス セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH22R―、 NA87— 1 1 A、 DKD— 5Dなどが挙げられる。 昆虫細胞としては、 例えば、 夜盗蛾 S f 9細胞、 蚕 BmN細胞などが用いられる。 動物細胞としては、 例えば， サ ル COS— 1細胞、 COS— 7細胞、 チャイニーズハムスター CHO細胞、 マウス L細胞、 293T細胞、 3T3— L 1細胞、 ヒ ト HEK293細胞、 He pG 2細胞、 白色脂肪細胞、 また適当な分化条件により分化誘導された 細胞などが用いられる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75, 1929 (1978)に記載の方法を適宜改変して行われる。 昆虫細胞を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) , vol.6, 47, (1988)などに記 載の方法を適宜改変して行うことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロ トコール， 263 (秀潤社より 1995年に発行） や Virology, vol.52, 456 (1973)などに記載の方法を適宜改変し て行うことができる。
上記形質転換体は、 特定の化合物の存在下に培養し、 培養物中の遺伝子産 物の量を測定し比較することにより、 当該化合物によるプロモーター活性の 促進能を知ることができる。 形質転換体の培養は、 それ自体公知の方法で行 宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バー クホルダー （Burkholder) 最小培地 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.77, 4505 (1980)) が挙げられる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが望ましい。 培 養は通常約 20 °C〜 30 °Cで約 24〜 72時間行い、 必要に応じて通気ゃ撹 拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、
Grace's Insect Medium (Nature, vol.195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ 血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6.2〜 6.4 に調整するのが望ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行い、 必 要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %の牛胎児血清を含むダルべッコ改変ィ一ダル培地 （ナカライ 社） などが用いられる。 培地の pHは約 6〜8に調整するのが望ましい。 培 養は通常約 30 °C〜 40 °Cで約 15〜 60時間行い、 必要に応じて通気ゃ撹 拌を加える。
本発明の DNAは、 ヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギユレ一 ター配列 P PREあるいは LRH— REのどちらか一方、 または両者を含有 するプロモーター領域を含む DNAであるため、 その形質転換体を用いるこ とによって、 ヒ トアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物ま たはその塩をスクリーニングすることができる。 以下に当該スクリーニング 方法、 スクリーニング用キットおよびこれらスクリーニング方法、 スクリー ユング用キットを用いて得られるヒトアディポネクチンプロモーター活性を 促進する化合物またはその塩について具体的に説明する。
(1) ヒ トアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはそ の塩をスクリーニングする方法
本発明のヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列 P PREあるいは LRH— REのどちらか一方、 または両者を含有するプロモ 一タ一領域を含む DNA、 および当該 DNAで形質転換された形質転換体は、 ヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩を スクリーニングするために有用である。 本発明のヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物また はその塩の決定方法においては、 本発明の形質転換体を被験化合物と接触さ せた場合と本発明のレギユレータ一配列を含有しなレ、形質転換体を被験化合 物と接触させた場合のポリぺプチドの発現量を測定し比較することなどを特 徴とする。
被験化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、 発酵生産物などが挙げられる。 これら化合物は新規な化合物であって もよいし、 公知の化合物であってもよい。 発現されるポリペプチドとしては、 上記の構造遺伝子 （好ましくはレポ一タ一遺伝子） がコードするポリぺプチ ドなどが用いられる。 ポリペプチドの発現量の測定方法としては、 例えば、 Brasier, A.R.らの方法 （Biotechniques vol.7, 1116-1122(1989)) に準じた方法に より、 ^"シフェラーゼ活性を測定することなどが挙げられる。
(2) ヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはそ の塩をスクリーニングするために用いるスクリーニング用キット
本発明のヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物また はその塩のスクリーニング用キットは、 上述の形質転換体を用いることを特 徴とするが、 その例として、 次のものが挙げられる。
細胞培養用培地：ダルベッコ改変イーグル培地 （ナカライ社） に非働化ゥシ 胎児血清 （ J RHバイオサイエンス社） を 5%添加したもの。
ヒトアディポネクチンプロモーター活性測定用プラスミド：本発明の、 ヒト アディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列 P PREと LRH — RE両者を含有する DNAを、 ルシフェラーゼ遺伝子を含有する pGL3- basicベクター （プロメガ社） のマルチクローニング部位に挿入したもの。 核内受容体発現用プラスミ ド： ヒ ト PPARy、 ヒ ト RXRひ、 ヒ ト LRH ー1の全長。0 八を、 ヒ ト cDNAライブラリー （クロンテック社） を铸 型とした PC R法により取得する。 取得した c DN Aと哺乳動物細胞用発現 プラスミ ドを同じ制限酵素で処理して連結したものを用いる。
宿主細胞株： HEK293細胞 （ヒト胎児腎臓由来細胞株、 AT C Cより入手） 被験化合物：水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時 に細胞培養用培地にて 50 に希釈する。 水に難溶性を示す被験化合物に ついては、 ジメチルスルホキシド、 エタノール等に溶解する。
(3) スクリーニング法
HEK 293細胞を 96穴マルチプレート （ヌンク社） に播種し、 37°C、 5%C02条件下で一晩培養する。 遺伝子導入の方法は、 L uらの報告 (Mol. Cell, 6, 507-515 (2000)) 中に記載された方法に基いて行う。 本発明の ヒ トアディポネクチンプロモーター活性測定用プラスミ ドを 50n gZ穴、 核内受容体発現用のプラスミ ドを各々 1 5 n g/穴、 リン酸カルシウム法を 用いて細胞に一過性に導入する。 遺伝子導入から 8時間後に、 培養上清の 5 分の 1量の被験化合物希釈液を添加する。 さらに 37°C、 5%C02条件下 で培養し、 被験化合物添加から 18時間後にピッカジーン L T (東洋ィンキ 社） を Ι Ο Ο μ Ιノ穴加え、 5分間撹拌後、 Lm a Xマイクロプレートルミ ノメーター （モレキュラーデバイス社） で発光活性を測定する。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて、 ヒ ト アディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物が見出せれば、 当該化 合物は脂肪組織におけるアディポネクチン産生 ·分泌を増加し、 その結果血 漿アディポネクチン濃度を上昇させることから、 糖尿病、 肥満、 高コレステ ロール血症、 高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、 高脂血症、 動脈硬化症、 高 血圧、 循環器系疾患、 過食症等の予防 ·治療薬として用いることができる。 当該化合物はさらに、 上記疾患が病因となっている種々の症候群 （シンド ローム X、 メタボリックシンドローム、 マルチプルリスクファクター症候群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 内臓脂肪症候群等） の予防 ·治療薬 としても用いることができる。 上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物の非毒性塩としては、 例えば、 アルカリ金属 （力リゥム、 ナトリウ ム、 リチウム等） の塩、 アルカリ土類金属 （カルシウム、 マグネシウム等） の塩、 アンモニゥム塩 （テトラメチルアンモニゥム塩、 テトラプチルアンモ 二ゥム塩等) 、 有機ァミン （トリェチルァミン、 メチルァミン、 ジメチルァ ミン、 シクロペンチノレアミン、 ペンジノレアミン、 フエネチノレアミン、 ピペリ ジン、 モノエタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリス （ヒ ドロキシメ チル） メチルァミン、 リジン、 アルギニン、 N—メチルー D—ダルカミン 等） の塩、 酸付加物塩 （無機酸塩 （塩酸塩、 臭化水素酸塩、 ョゥ化水素酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩、 硝酸塩等） 、 有機酸塩 （酢酸塩、 トリフルォロ酢酸塩、 乳酸塩、 酒石酸塩、 シユウ酸塩、 フマル酸塩、 マレイン酸塩、 安息香酸塩、 クェン酸塩、 メタンスルホン酸塩、 エタンスルホン酸塩、 ベンゼンスルホン 酸塩、 トルエンスルホン酸塩、 イセチオン酸塩、 グルクロン酸塩、 グルコン 酸塩等） 等） が挙げられる。
本発明化合物の非毒性塩には、 溶媒和物、 または上記本発明化合物のアル カリ （土類） 金属塩、 アンモニゥム塩、 有機アミン塩、 酸付加物塩の溶媒和 物も含まれる。
溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。 適当な溶媒和物とし ては、 例えば水、 アルコール系溶媒 （エタノール等） 等の溶媒和物が挙げら れる。
当該化合物またはその塩を上記の疾患の予防または治療剤として使用する 場合は、 経口投与のための内服用固形剤、 内服用液剤、 およぴ非経口投与の ための注射剤、 外用剤、 坐剤等として用いられる。
経口投与のための内服用固形剤には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆 粒剤等が含まれる。 カプセル剤には、 ハードカプセルおよびソフトカプセル が含まれる。 このような内服用固形剤においては、 活性物質はそのままか、 または賦形 剤 （ラタ トース、 マンニトール、 グルコース、 微結晶セルロース、 デンプン 等） 、 結合剤 （ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ポリビュルピロリ ドン、 メ タケイ酸アルミン酸マグネシウム等） 、 崩壌剤 （繊維素グリコール酸カルシ ゥム等） 、 滑沢剤 （ステアリン酸マグネシウム等） 、 安定剤、 溶解補助剤 (グルタミン酸、 ァスパラギン酸等） 等と混合され、 常法に従って製剤化し て用いられる。 また、 必要によりコーティング剤 （白糖、 ゼラチン、 ヒドロ キシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロースフタレート 等） で被覆していてもよいし、 また 2以上の層で被覆していてもよい。 さら にゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための内服用液剤は、 薬剤的に許容される水剤、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含む。 このような液剤においては、 活性物質 力 一般的に用いられる希釈剤 （精製水、 エタノールまたはそれらの混液 等） に溶解、 懸濁または乳化される。 さらにこの液剤は、 湿潤剤、 懸濁化剤、 乳化剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 保存剤、 緩衝剤等を含有していてもよい。 非経口投与のための注射剤としては、 溶液、 懸濁液、 乳濁液および用時溶 剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。 注射剤は、 活性物 質を溶剤に溶解、 懸濁または乳化させて用いられる。 溶剤として、 例えば注 射用蒸留水、 生理食塩水、 植物油、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコール、 エタノールのようなアルコール類等おょぴそれらの組み合わせが 用いられる。 さらにこの注射剤は、 安定剤、 溶解補助剤 （グルタミン酸、 ァ スパラギン酸、 ポリソルベート 8 0 (登録商標） 等） 、 懸濁化剤、 乳化剤、 無痛化剤、 緩衝剤、 保存剤等を含んでいてもよい。 これらは最終工程におい て滅菌するか無菌操作法によって製造される。 また無菌の固形剤、 例えば凍 結乾燥品を製造し、 その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他 の溶剤に溶解して使用することもできる。 非経口投与のための外用剤の剤形には、 例えば、 軟膏剤、 ゲル剤、 タリー ム剤、 湿布剤、 貼付剤、 リニメント剤、 噴霧剤、 吸入剤、 スプレー剤、 エア ゾル剤、 点眼剤および点鼻剤等が含まれる。 これらは活性物質を含み、 公知 の方法または通常使用されている処方により製造される。
軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。 例えば、 活性物質を基剤に混和、 または溶融させて調製される。 軟膏基剤は公知ある いは通常使用されているものから選ばれる。 例えば、 高級脂肪酸または高級 脂肪酸エステル （アジピン酸、 ミリスチン酸、 パルミチン酸、 ステアリン酸、 ォレイン酸、 アジピン酸エステル、 ミリスチン酸エステノレ、 パノレミチン酸ェ ステル、 ステアリン酸エステル、 ォレイン酸エステル等） 、 ロウ類 （ミッロ ゥ、 鯨ロウ、 セレシン等） 、 界面活性剤 （ポリオキシエチレンアルキルエー テルリン酸エステル等） 、 高級アルコール （セタノール、 ステアリルアルコ ール、 セトステアリルアルコール等） 、 シリコン油 (ジメチルポリシロキサ ン等） 、 炭化水素類 （親水ワセリン、 白色ワセリン、 精製ラノリン、 流動パ ラフィン等) 、 グリコーノレ類 (エチレングリコ一ノレ、 ジエチレングリコーノレ、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 マクロゴール等） 、 植物 油 （ヒマシ油、 ォリーブ油、 ごま油、 テレビン油等） 、 動物油 （ミンク油、 卵黄油、 スクヮラン、 スクワレン等） 、 水、 吸収促進剤、 かぶれ防止剤から 選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用いられる。 さらに、 保湿剤、 保存剤、 安定化剤、 抗酸化剤、 着香剤等を含んでいてもよい。
ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。 例えば、 活性物質を基剤に溶融させて製造される。 ゲル基剤は公知あるいは通常使用 されているものから選ばれる。 例えば、 低級アルコール （エタノール、 イソ プロピルアルコール等） 、 ゲル化剤 （カルボキシメチルセルロース、 ヒ ドロ キシェチノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロピノレセノレロース、 ェチルセノレロース 等） 、 中和剤 （トリエタノールァミン、 ジイソプロパノールアミン等） 、 界 面活性剤 （モノステアリン酸ポリエチレングリコール等） 、 ガム類、 水、 吸 収促進剤、 かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または 2種以上を混合して用 いられる。 さらに、 保存剤、 抗酸化剤、 着香剤等を含んでいてもよい。
クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。 例え ば、 活性物質を基剤に溶融または乳化させて調製される。 クリーム基剤は公 知あるいは通常使用されているものから選ばれる。 例えば、 高級脂肪酸エス テル、 低級アルコール、 炭化水素類、 多価アルコール （プロピレングリコー ル、 1 , 3—ブチレングリコール等） 、 高級アルコール ( 2—へキシルデカ ノール、 セタノール等） 、 乳化剤 （ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、 脂肪酸エステル類等） 、 水、 吸収促進剤、 かぶれ防止剤から選ばれるもの単 独または 2種以上を混合して用いられる。 さらに、 保存剤、 抗酸化剤、 着香 剤等を含んでいてもよい。
湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。 例えば、 活性物質を基剤に溶融させ、 練合物とし支持体上に展延塗布して製造される。 湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。 例えば、 増 粘剤 （ポリアクリル酸、 ポリビュルピロリ ドン、 アラビアゴム、 デンプン、 ゼラチン、 メチルセルロース等） 、 湿潤剤 （尿素、 グリセリン、 プロピレン グリコール等） 、 充填剤 （カオリン、 酸化亜鉛、 タルク、 カルシウム、 マグ ネシゥム等） 、 水、 溶解補助剤、 粘着付与剤、 かぶれ防止剤から選ばれるも の単独または 2種以上を混合して用いられる。 さらに、 保存剤、 抗酸化剤、 着香剤等を含んでいてもよい。
貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。 例えば、 活性物質を基剤に溶融させ、 支持体上に展延塗布して製造される。 貼付剤用 基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。 例えば、 高分子 基剤、 油脂、 高級脂肪酸、 粘着付与剤、 かぶれ防止剤から選ばれるもの単独 または 2種以上を混合して用いられる。 さらに、 保存剤、 抗酸化剤、 着香剤 等を含んでいてもよい。
リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。 例 えば、 活性物質を水、 アルコール （エタノール、 ポリエチレングリコール 等） 、 高級脂肪酸、 グリセリン、 セッケン、 乳化剤、 懸濁化剤等から選ばれ るもの単独または 2種以上に溶解、 懸濁または乳化させて調製される。 さら に、 保存剤、 抗酸化剤、 着香剤等を含んでいてもよい。
噴霧剤、 吸入剤、 スプレー剤および点鼻剤は、 一般的に用いられる希釈剤 以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、 例えば塩化ナトリゥム、 タエン酸ナトリゥムあるいはクェン酸のような等張 剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法は、 例えば米国特許第 2,868,691号および同第 3,095,355号に詳しく記載されている。
点鼻剤を投与する際には通常一般に薬剤を含有した溶液および粉末で、 専 用の点鼻器あるいは噴霧器を用い鼻腔内に定量的にスプレー （嘖霧） 投与さ れる。
非経口投与のための点眼剤には、 点眼液、 懸濁型点眼液、 乳濁型点眼液、 用 B寺溶解型点眼液およぴ眼軟膏が含まれる。
これらの点眼剤は公知の方法に準じて製造される。 例えば、 活性物質を溶 剤に溶解、 懸濁または乳化させて用いられる。 点眼剤の溶剤としては、 例え ば、 滅菌精製水、 生理食塩水、 その他の水性溶剤または注射用非水性用剤 (例えば、 植物油等） 等およびそれらの組み合わせが用いられる。 点眼剤は、 等張化剤 （塩化ナトリウム、 濃グリセリン等） 、 緩衝化剤 （リン酸ナトリウ ム、 酢酸ナトリウム等） 、 界面活性化剤 （ポリソルベート 8 0 (商品名） 、 ステアリン酸ポリオキシル 4 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等） 、 安 定化剤 （クェン酸ナトリウム、 ェデト酸ナトリウム等） 、 防腐剤 （塩化ベン ザルコニゥム、 パラベン等） 等などを必要に応じて適宜選択して含んでいて もよい。 これらは最終工程において滅菌する力、 無菌操作法によって製造さ れる。 また無菌の固形剤、 例えば凍結乾燥品を製造し、 その使用前に無菌化 または無菌の滅菌精製水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。 非経口投与のための吸入剤としては、 エアロゾル剤、 吸入用粉末剤または 吸入用液剤が含まれ、 当該吸入用液剤は用時に水または他の適当な媒体に溶 解または懸濁させて使用する形態であってもよい。 これらの吸入剤は公知の 方法に準じて製造される。 例えば、 吸入用液剤の場合には、 防腐剤 （塩化べ ンザルコニゥム、 パラベン等） 、 着色剤、 緩衝化剤 （リン酸ナトリウム、 酢 酸ナトリウム等） 、 等張化剤 （塩化ナトリウム、 濃グリセリン等） 、 増粘剤 (力リボキシビニルポリマー等） 、 吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択 して調製される。
吸入用粉末剤の場合には、 滑沢剤 （ステアリン酸およびその塩等） 、 結合 剤 （デンプン、 デキストリン等） 、 賦形剤 （乳糖、 セルロース等） 、 着色剤、 防腐剤 （塩ィヒベンザルコニゥム、 パラベン等) 、 吸収促進剤などを必要に応 じて適宜選択して調製される。
吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器 （アトマイザ一、 ネブライザ一） が使用され、 吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使 用される。
非経口投与のためその他の組成物としては、 活性物質を含み、 常法により 処方される直腸内投与のための坐剤およぴ膣内投与のためのペッサリー等が 含まれる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対 して投与することができる。 当該化合物またはその塩の投与量は、 年齢、 体 重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異なるが、 通常、 成人一 人当たり、 一回につき、 1 n gから 1 0 O m gの範囲で一日一回から数回経 口投与されるか、 または成人一人当たり、 一回につき、 O.l n gから 1 0 m gの範囲で一日一回から数回非経口投与されるか、 または一日 1時間から 2 4時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、 投与量は種々の条件により変動するので、 上記 投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて投与の必要な 場合もある。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒトアディポネクチンのプロモーター領域を含む DNAの塩基配 列を示す。
図 2は、 ヒトアディポネクチンプロモーター/レポータープラスミド DN Aおよび各種プロモーター欠失体 DN Aの構造を示す。
図 3は、 恒常的活性化 P PAR T /および RXRaによるヒトアディポネク チンプロモーター レポータープラスミド DN Aの転写促進活性を示す。 図 4は、 ヒトアディポネクチンプロモーター Zレポータープラスミド DN A および各種プロモーター欠失体 DN Aの転写促進活性を示す。
図 5は、 P PAR 二量体により転写制御される遺伝子群が有す る P P R Eの塩基配列の比較を示す。
図 6は、 ヒトアディポネクチン遺伝子上の P PRE配列、 および PPRE 配列に変異を導入したヒトアディポネクチンプロモーター レポーターブラ スミ ド DNAの構造を示す。
図 7は、 恒常的活性ィ匕 P PARyおよび RXRひによる変異プロモーター ノレポータープラスミ ド DNAの転写促進活性を示す。
図 8は、 PPARyZRXR二量体のヒトアディポネクチンプロモーター のレギュレーター配列 P PREへの直接結合 （ゲルシフトアツセィ） を示す。 図 9は、 LRH—1により転写制御される遺伝子群が有する LRH— RE の塩基配列の比較を示す。 図 10は、 ヒ トアディポネクチン遺伝子上の LRH— RE配列、 および L RH— RE配列に変異を導入したヒ トアディポネクチンプロモーター Zレポ 一タープラスミ ド DNAの構造を示す。
図 11は、 P PARyZRXR二量体、 また LRH— 1を発現させた際の ヒ トアディポネクチンプロモーター Zレポータープラスミ ド DNAのピオグ リタゾンによる転写促進活性を示す。
図 12は、 LRH— 1のヒ トアディポネクチンプロモーターのレギユレ一 ター配列 LRH— REへの直接結合 （ゲルシフトアツセィ） を示す。
図 13は、 分化脂肪細胞におけるヒトアディポネクチンプロモーター Zレ ポータープラスミ ド DNAのピオグリタゾンによる転写促進活性を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明 の範囲を限定するものではない。 実施例 1 ： ヒトアディポネクチンプロモーター Zレポータープラスミ ド DN Aの構築
ヒトアディポネクチンのプロモーター領域を含む DNAを、 高橋らの方法 で取得した D N A断片 （Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord, 24， 861-868 (2000)) を铸型とした P CR法により増幅した。 具体的には、 ヒ ト Pl-derived artificial chromosome (PAC) DNA pools (ゲノムシステム社） から、 ヒ トアデ ィポネクチン遺伝子を含むクローンを得、 制限酵素 B amHIと Xb a Iで 消化した。 得られた断片のうち 2.9k bの DNA断片は、 ヒ トアディポネク チン遺伝子の 5， 上流領域を含んでいた （Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord.24, 861-868 (2000)) 。 当該 DNA 断片を錶型とし、 ヒ トアディポネクチン遺伝 子の転写開始点を塩基番号 1として 5 ' 上流側 908番目から 3' 下流側 1 4番目までの塩基配列が増幅されるよう設計したプライマー （5， -TTT CGG GGT ACC GCT TCT AGG CCA GAG CTG GG T TC- 3 ' (配列番号 5) および 5， -TTT CGG GAG CTC CTG CAG TCA GAA TGG AAG TGA GAA— 3 ' (配列 番号 6) ) を用いた PCR法によりヒ トアディポネクチンプロモーター領域 を含む DNA断片を増幅し、 塩基配列を決定した。 決定した塩基配列を図 1 に示す。 増幅した DNA 断片、 およぴホタルルシフェラーゼ遺伝子を有す る p G L 3 basic プラスミド （プロメガ社） をそれぞれ制限酵素 K p n Iと S a c Iで消化し、 両者を結合した。 構造の概略を図 2に示す。 以降、 この ヒ トアディポネクチンプロモーター/レポータープラスミ ドを p (-90 8) ZLUCと表記する。 実施例 2 ： ヒトアディポネクチンプロモーターノレポータープラスミド DN Aの転写促進活性の検定
実施例 1で構築した p (— 908) ZLUCが、 核内受容体である PPA R /RXRの二量体によつて活性化されることを、 ルシフェラーゼアツセ ィにより検定した。 実施例 2では、 ヘルぺスウィルスタンパク質 VP 1 6の 転写活性化領域と核内受容体 PPARy、 および RXRo;を結合させたキメ ラタンパク質 （VP 16-PPAR7, および VP 16 -RXR αと表記す る。 ） を細胞内で発現する発現プラスミド DNAを遺伝子導入することによ り活性の検定を行った。 これらキメラ核内受容体は、 それぞれの活性化リガ ンドに依存せず、 応答遺伝子の転写を活性化する能力を有している （Mol. Endocrinol. 16, 1040-1048 (2002)) 。 レポータープラスミドとして、 実施例 1 で構築した p (-908) ZLUCを、 核内受容体発現プラスミドと同時に 遺伝子導入した。 宿主細胞には、 ヒ ト胎児腎臓由来の HEK 293細胞を用 いた。 細胞を 96穴マルチプレート （ヌンク社） に播種し、 非働化 5%ゥシ 胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地 （ナカライ社） を用いて 37°C、 5%C02条件下で一晩培養し、 形質転換させた。 遺伝子導入の方法は、 L uらの報告 (Mol. Cell 6, 507-515 (2000)) 中に記載された方法に従った。 1 穴当たり、 50 n gのレポータープラスミド p (― 908) /LUCと 20 n gの b—ガラクトシダーゼ発現プラスミド、 核内受容体発現用のプラスミ ド各々 15 n gを、 リン酸カルシウム法を用いて導入した。 遺伝子導入から 26時間後にルシフェラーゼ活性、 およぴ内部標準用の b _ガラクトシダー ゼ活性をそれぞれ Lm a xマイクロプレートルミノメーター、 および Em a xマイクロプレートリーダー （いずれもモレキュラーデバイス社） を用いて 測定した。 測定結果は、 ルシフエラーゼ活性の測定値を i3—ガラタトシダー ゼ活性の値で除し、 相対活性として表現した。 結果を図 3に示す。 VP 16 ー？？ 1^7と¥? 16—RXR αの両者を発現させた細胞において、 顕著 なルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。 VP 16のみ、 あるいは VP 1 6-PPAR7. VP 16— RXR ctそれぞれ単独の発現によっては、 顕著 な変化はみられなかった。 これらの結果から、 用いたヒトアディポネクチン プロモーター領域に P PAR γ/RXR二量体が作用し、 転写調節を行うも のと考えられた。 実施例 3 ： ヒトアディポネクチンプロモーター領域内のレギュレーター配列 (P PRE) の同定
実施例 2において認められた転写活性の上昇が、 ヒトアディポネクチンプ 口モーター上のどの領域に依存するのかを特定する目的で、 図 2下部に示し た構造を有するヒトアディポネクチンプロモーター欠失体を作製した。 5， 末端に制限酵素切断部位を有するプライマーを目的の長さのプロモーター D NAが得られるように設計し、 上述の p (— 908) ZLUCを錶型として PCR法により増幅した。 増幅した DN A断片と p GL 3ベーシックプラス ミ ド （pGL3 basic plasmid) を制限酵素処理した後、 連結して欠失体を構築し た。 HEK 293細胞において、 これら各欠失体をレポーターとして用い、 VP 16— PPARyと VP 16— R X R αの両発現プラスミドを一過的に 発現させ、 実施例 2で用いたのと同様な方法でルシフェラーゼ活性を測定し た。 結果を図 4に示す。 ヒトアディポネクチンプロモーター領域の、 一28 6 b pから一 267 b pの配列を欠失することにより、 VP 16—PPAR γと VP 16—RXRa両者の発現によるルシフェラーゼ活性の上昇が消失 した。 この結果から、 ヒトアディポネクチンプロモーター領域の一 286 b pから一 267 b pの間に、 P P AR γ/RXR二量体が作用するレギユレ 一ター配列 P PREが存在すると推定された。
図 5は、 PPARoz/RXR 二量体により転写制御を受けることが報告さ れている遺伝子のプロモーター領域に存在する P P R Eの塩基配列を示して いる （Genes Dev., 8, 1224-1234 (1994)、 J. Biol. Chem., 275， 9131-9135 (2000)、 Mol. Cell, 7, 161-171 (2001)、 J. Biol. Chem., 276, 48572-48579 (2001)) 。 いずれ もダイレクトリピート 1 (DR1) と呼ばれる 13塩基からなる類似の構造 を有している。 ヒトアディポネクチンプロモーター領域の一 286 b pから -267 b pまでの塩基配列を詳細に調べた結果、 報告されている P P R E と類似した配列が、 一273 b pから一 285 b pまでの間に存在すること が明らかとなった （図 5、 6) 。 推定された配列が、 レギュレーター配列 P PREとして機能することを確認する目的で、 図 6に示すように、 推定され た配列内に 2塩基の変異を導入したレポータープラスミドを作製した。 変異 の導入は、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (ストラタジーン社） を 用い、 添付のプロトコールに従い行った。 野生型の P PREを有するレポ一 タープラスミド p (—908) ZLUCと、 P PREと推定された配列に変 異を導入したレポータープラスミ ドの転写活生を比較する目的で、 HEK2 93細胞に VP 16—？？ 1 7と¥? 16— R X R αの両発現プラスミド を一過的に発現させ、 実施例 2で用いたのと同様な方法でルシフェラーゼ活 性を測定した。 結果を図 7に示す。 P PREと推定された配列に変異を導入 したレポータープラスミドを用いた場合、 野生型の P PREを有する p (— 908) ZLUCでみられるような、 VP 16— PPARyと VP 16— R XRa両者の発現によるルシフェラーゼ活性の上昇は消失した。 この結果か ら、 P PREと推定された配列が、 レギュレーター配列として機能し、 ヒト アディポネクチンプロモーターの PPARy/RXR二量体による転写活性 化に必要であると考えられた。 実施例 4 ： PPARyZRXR二量体のレギュレーター配列 PPREへの直 接結合
ヒトアディポネクチンプロモーター領域の一 285 b pから一 273 b p に同定されたレギュレーター配列 P PREに、 P PAR YZRXR二量体が 直接結合することを確認する目的で、 ゲルシフトアツセィを行った。 ゲルシ フトアツセィは文献に記された方法 （J. Biol. Chem., 276， 48572-48579 (2001)) に基づいて行った。 結合反応に用いる P PAR γ、 RXRaタンパ ク質は、 ヒト PPARy、 ヒト RXRaを発現する発現プラスミドを铸型と し、 TNT T7 Quick Coupled Transcription / Translation Systems (プロメガ社） を 用いて添付のプロトコールに従い、 インビトロ （in vitro) 系にて合成した。 ヒトアディポネクチンプロモーター領域の一 291 b pから一 267 b pま での塩基配列を有するオリゴ DN A (5， -TGG TTT TGA CTT TTG CCC CAT CTT C—3， （配列番号 7) および 5' — GAA GAT GGG GCA AAA GTC AAA ACC A— 3， （配列番号 8) ) をそれぞれ [γ— 32P] ATP (アマシャムバイオサイエンス社） と T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （宝酒造） を用いて標識し、 二本鎖にしたも のを標識プローブとして用いた。 塩基配列に付した下線は、 P PREを示し ている。 インビトロ （in vitro) 系で合成したタンパク質と標識プローブの結 合反応は、 20 μ 1の溶液中で行った。 反応液は、 2 OmM HEP E Sバ ッファー （ρΗ8·0) 、 6 OmM KC 1、 1 mM ジチオスレィ トール、 1 0% グリセロールの組成からなり、 さらに 1 μ §のポリ （d l— dC) 、 1 μ 1の核内受容体を含む合成反応液、 200，000c pmの標識プローブを添 加し、 20 μ 1としたものである。 混合後、 25 °Cで 20分間反応させ、 さ らに 4°Cで 15分間静置した。 標識プローブと核内受容体の複合体と、 複合 体を形成していない標識プローブの分離は、 4%ポリアクリルアミ ドゲルを 用いた電気泳動により行った。 電気泳動は 0.5XTBEバッファー （45m M トリス、 45mM ホウ酸、 1 mM EDTA) を用いて 200Vの電圧 で 90分間行った。 泳動後のゲルは乾燥させ、 BAS2500 システム （富士写 真工業） を用いて画像解析した。 標識プローブと核内受容体の結合が特異的 であることを確認する目的で、 競合反応も同時に行った。 競合反応は、 未標 識の野生型 P PREを含むオリゴ DNA、 あるいは P PREに図 6に示した のと同様な変異を導入したオリゴ DNAを、 標識プローブの 10倍、 あるい は 50倍のモル濃度で反応液に追加することにより行った。 P P R Eに変異 を導入したオリゴ DNAの塩基配列は、 5， -TGG TTT TGA CT T TTG t t C CAT CTT C- 3 ' (配列番号 9) 、 および 5， 一 GAA GAT GG a a CA AAA GTC AAA ACC A- 3 ' (配 列番号 10) である。 変異させた塩基は小文字で示している。 塩基配列に付 した下線は、 P PREを示している。 結果を図 8に示す。 矢印は、 標識プロ ーブが分子量の大きなタンパク質と結合することで、 ゲル上の移動が遅くな つたバンドを指している。 PPARvと RXRaの両者を加えて反応させた 場合、 標識プローブとの複合体のバンドが検出された （レーン 4) 。 競合反 応を行うと、 未標識の野生型 P PREを有するオリゴ DNAを過剰量加えた 際には、 レーン 4でみられたバンドが濃度依存的に消失した （レーン 5とレ ーン 6) 。 しかしながら、 P PREに変異を導入した未標識オリゴ DNAを 加えた際には、 野生型の場合と比較して、 明らかな競合効果の減弱が認めら れた （レーン 7とレーン 8) 。 以上の結果から、 ヒトアディポネクチンプロ モーター領域に同定したレギュレーター配列 P PREに、 P P AR γ/RX R二量体が特異的に結合することが明らかとなった。 実施例 5 ： ヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列 (LRH-RE) の同定
ヒトアディポネクチンプロモーター領域に P PRE以外のレギュレーター 配列が存在しないか、 その塩基配列を詳細に解析したところ、 LRH— 1 (Liver Recepter Homologue-l) と呼ばれる別の核内受容体が結合するレギュ レータ一配列 L R H— R E (LRH- 1 responsive element) と推定される配列が 存在した。 図 9には、 LRH— 1により転写制御を受けることが報告されて いる遺伝子のプロモータ一領域にある LRH— REの塩基配列を示している (Mol. Cell 6, 507-515 (2000)、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.96, 6660-6665 (1999)、 J. Biol. Chem.276, 24767-24773 (2001)、 J. Biol. Chem., 275, 17793- 17799 (2000)) 。 ヒ トアディポネクチンプロモーター領域に見出された配列 は、 ラットおよびヒトの CYP 7 A 1遺伝子のプロモーター領域に存在する LRH— REと 1塩基しか異なっていなかった。
図 10は、 LRH— REと推定される配列の存在する位置を示している。 LRH— REと推定される配列は、 上述の P PREと転写開始点の間の、 一 237 b pから一 229 b pまでに位置した。 ヒトアディポネクチンプロモ 一タ一領域に LRH— REと推定される配列が存在したことから、 アディポ ネクチンプロモーターが核内受容体 LRH— 1により転写制御を受ける可能 性が考えられた。 そこで、 HEK293細胞において、 レポータープラスミ ドとして上述の p (—908) ZLUCを用い、 PPARy、 RXRa、 そ して LRH— 1を発現する発現プラスミドを、 実施例 2で用いたのと同様な 方法で一過性に発現させた。 核内受容体を機能させるために、 PPARyを 活性化する作用の知られているピオグリタゾンを遺伝子導入から 8時間後に 終濃度が 1 μ Μになるように添加し、 その後細胞を 1 8時間培養した。 結果 を図 1 1に示す。 P PAR T/と RXR CKの発現により、 ルシフェラーゼ活性 は 2倍上昇した。 ピオグリタゾン処理により転写活性はさらに上昇した （レ ーン 2) 。 一方、 LRH— 1のみを発現させてもルシフェラーゼ活性の上昇 はみられなかった （レーン 3) 。 ところが P PAR Y、 RXRaと LRH— 1を同時に発現させると、 P PARYと RXRaのみを発現させた場合と比 ベて、 ルシフェラーゼ活性がさらに 2倍上昇した。 その効果は、 ピオグリタ ゾン処理の有無に関わらず認められた (レーン 2に対してレーン 4) 。 これ らの結果から、 LRH— 1は単独では作用を示さないものの、 PPARyZ RXR二量体によるヒトアディポネクチンプロモータ一活性の促進を増強す ることが明らかとなった。 次に LRH— 1による作用が、 プロモーター領域 の LRH— REと推定される配列に依存したものであることを確認する目的 で、 図 10に示すように LRH— REと推定される配列内に 2塩基の変異を 導入したレポータープラスミ ドを作製し、 ルシフェラーゼ活性を測定した (図 1 1) 。 その結果、 PPARyと RXRaのみの発現によるルシフェラ ーゼ活性の上昇は、 野生型 LRH— REを有する p (— 908) /LUCを 用いた場合と、 LRH— REと推定される配列に変異を導入したレポーター プラスミ ドを用いた場合で差がみられなかった （レーン 2に対してレーン 6) 。 一方、 PPARy、 RXR αと LRH— 1を同時に発現させた場合、 野生型レポーターを用いた際にみられた LRH— 1による効果 （レーン 2に 対してレーン 4) は、 変異体レポーターでは消失した （レーン 6に対してレ ーン 8) 。 以上の結果から、 本実施例で見出された LRH— 1の作用は、 ヒ トアディポネクチンプロモータ一領域の L R H— R Eと推定される配列に依 存したものであることが明らかとなった。 同時に、 LRH— REと推定され る配列は、 レギュレーター配列として機能すると考えられた。 実施例 6 ： LRH— 1のレギュレーター配列 LRH— REへの直接結合
LRH— 1が、 ヒトアディポネクチンプロモーター領域に見出されたレギ ユレータ一配列 L R H— R Eへ直接結合することを確認する目的で、 ゲルシ フトアツセィを行った。 ゲルシフトアツセィは実施例 4で用いたのと同様な 方法で行った。 結合反応に用いた LRH_ 1タンパク質は、 ヒト LRH— 1 を発現する発現プラスミドを錶型とし、 インビトロ （in vitro) 系にて合成し た。 標識プローブには、 ヒトアディポネクチンプロモーター領域の一 245 b pから一 221 b pまでの塩基配列を有するオリゴ DNA (5 ' — AAT AAG GGT CAA GGC CTG GAA AC A C— 3' (配列番号 1 1) および 5' -GTG TTT CCA GGC CTT GAC CCT TAT T— 3， （配列番号 12) ) を用いた。 塩基配列に付した下線は L RH— REを示している。 競合反応は、 標識プローブに用いたのと同じオリ ゴ DNA を野生型として、 また LRH— REに、 図 10に示されているの と同様に変異を導入したオリゴ DNA (5 ' -AAT AAG GGT CA A c c C CTG GAA ACA C—3， （配列番号 13 ) および 5， - GTG TTT CCA GG g gTT GAC CCT TAT T— 3' (配 列番号 14) ) を変異体として用い、 標識プローブの 10倍、 あるいは 50 倍のモル濃度で反応液に加えた。 変異させた塩基は小文字で示している。 塩 基配列に付した下線は、 LRH— REを示している。 結果を図 12に示す。 インビトロ （in vitro) 系で合成した L RH— 1と野生型 L RH_ R Eを含む 標識プローブの複合体が矢印で指した位置に検出された （レーン 2) 。 競合 反応を行うと、 野生型の LRH— REを有するオリゴ DNAを過剰量加えた 場合は、 濃度依存的な複合体の消失がみられた （レーン 3とレーン 4) 。 一 方、 変異を導入した LRH— REを有するオリゴ DNAを加えた場合は、 野 生型を加えた場合と比較して複合体のパンドの減弱はわずかであった （レー ン 5とレーン 6) 。 以上の結果から、 ヒ トアディポネクチンプロモーター領 域に同定されたレギュレーター配列 LRH— REに、 LRH— 1が特異的に 結合することが明らかとなった。 実施例 7 ：同定されたレギュレーター配列 P PREと LRH— REの脂肪細 胞における役割
アディポネクチンプロモーター領域内に同定したレギュレーター配列 P P REと LRH— REが、 脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の転写活 性化に関与していることを示す目的で以下の実験を実施した。 マウス前駆脂 肪細胞 3 T 3— L 1を、 タイプ IV コラーゲンでコートした 6穴プレート (ベタトン 'ディッキンソン社) を用いて培養し、 5 μ g/m 1インスリン、 0.5 mM ィソプチルメチルキサンチン、 1 μΜ デキサメタゾンを含む培地 で分化誘導した。 分化誘導を開始してから 6日目の細胞を、 形質転換実験に 用いた。 遺伝子導入には、 LipofectAMINE 2000 (インビトロジェン社） を使 用し、 添付のプロトコールにしたがって行った。 1穴当たり各々のレポータ 一プラスミ ドを 2 g、 内部標準用の /3—ガラク トシダーゼ発現プラスミ ド を 1 μ g使用した。 LipofectAMINE 2000 とプラスミ ドを ΟΡΉ-ΜΕΜ (イン ビトロジヱン社） で希釈し、 細胞に添加して 3.5 時間培養した。 その後 2 0 %ゥシ胎児血清を含む培地を等量加えて 44時間培養し、 ルシフエラーゼ 活性および —ガラタ トシダーゼ活性を測定した。 ピオグリタゾンは、 2 0%ゥシ胎児血清を含む培地を加える際に終濃度 1 になるよう添加した。 結果を図 1 3に示す。 アディポネクチンプロモーター領域を持たない p GL 3ベーシックプラスミ ドにより形質転換した場合に比べ、 野生型のヒ トアデ ィポネクチンプロモーターを有する ρ (— 908) /LUCレポーターを用 いた際、 ルシフェラーゼ活性は 19倍上昇した。 1 のピオグリタゾンで 処理した場合には、 処理しない場合と比べてさらに 9倍の上昇がみられた。 一方、 レギュレーター配列 PPREに変異を導入したレポーター （図 6) を 用いた場合には、 野生型と比較してルシフェラーゼ活性が著しく低下し、 ピ オダリタゾン処理による効果も全く認められなかった。 また、 LRH— RE に変異を有するレポーター （図 10) を用いた場合も、 野生型の場合と比較 してルシフェラーゼ活性の低下がみられた。 しかしながら、 ピオグリタゾン 処理した場合は、 処理しない場合に比べてルシフェラーゼ活性が 7.5倍上昇 し、 ピオグリタゾンに対する応答性は保たれていた。 以上の結果から、 同定 されたレギュレーター配列 P PREと LRH— REが、 脂肪細胞におけるァ ディポネクチンプロモーターの活性化に重大な役割を果たしていることが明 らかとなつた。 同時に、 これらレギュレーター配列は、 生理的な条件におけ るアディポネクチンの遺伝子発現に深く関与しているものと考えられた。 産業上の利用可能性
本発明のヒトアディポネクチンプロモーター領域内のレギュレーター配列 である P P R E (Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord.24, 861-868 (2000)) に記載 されているヒトアディポネクチン遺伝子の転写開始点を基準として、 その 5， 上流側 273番目から 285番目の間に位置する塩基配列、 および LR H-RE (上述の PPREと同じく 5， 上流側 229番目から 237番目の 間に位置する塩基配列） は、 核内受容体 PPARo/、 RXR、 LRH— l力 S 直接結合する配列であり、 脂肪細胞におけるアディポネクチンプロモーター の活性化に重大な役割を果たしている。 これらレギュレーター配列を含むプ 口モータ一領域を含む DNAと適当なレポータ一遺伝子を連結したレポータ 一プラスミドにより形質転換した形質転換体は、 生理的なヒトアディポネク チン遺伝子の発現様式に近いものであり、 ヒト疾患に対する治療薬剤をスク リ一ユングする上で極めて有用である c

Claims

請求 の範 囲
1. ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むことを特徴とする 配列番号 1で表される塩基配列を有するプロモータ一領域を含む D N A。
2. ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むことを特徴とする 配列番号 1で表される塩基配列を有するプロモータ一領域からなる請求の範 囲 1記載の DNA。
3. レギュレーター酉己歹 [Jが、 P PRE ( Peroxisome Proliferator-activated Receptor Responsive Element) を含有する配列である請求の範囲 2記載の D N A。
4. レギユレータ一配列が、 L R H— R E (Liver Receptor Homologue-1 Responsive Element) を含有する配列である請求の範囲 2記載の DNA。
5. レギユレータ一配列が、 配列番号 2で表される塩基配列である請求の 範囲 2記載の DNA。
6. レギュレーター配列が、 配列番号 3で表される塩基配列である請求の 範囲 2記載の DNA。
7. レギユレータ一配列が、 配列番号 2で表される塩基配列およぴ配列番 号 3で表される塩基配列の両方を有する塩基配列である請求の範囲 2記載の DNA。
8. レギュレーター配列が、 配列番号 4で表される塩基配列である請求の 範囲 2記載の DNA。
9. 請求の範囲 2記載の DN Aを含む組み換えプラスミド DNA。
10. ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むプロモーター領 域の制御下に構造遺伝子を発現する機能を有することを特徴とする請求の範 囲 9記載の組み換えプラスミド DNA。
1 1. 請求の範囲 9または 10記載の組み換えプラスミド DNAで形質転 換された形質転換体。
12. 請求の範囲 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒトァ ディポネクチンプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩のスクリー ユング方法。
1 3. 請求の範囲 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするシンド ローム X、 メタボリ ックシンドローム、 マルチプルリスクファクタ一症候群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる 症候群の予防おょぴ Zまたは治療薬のスクリ一二ング方法。
14. 症候群の病因である疾患が、 糖尿病、 肥満、 高コレステロール血症、 高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、 高脂血症、 動脈硬化症、 高血圧、 循環器 系疾患、 または過食症である請求の範囲 13記載のスクリーニング方法。
15. 請求の範囲 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒトァ -ーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリー ユング用キット。
1 6 . 請求の範囲 1 1記載の形質転換体を用いることを特徴とするシンド ローム X、 メタボリ ックシンドローム、 マルチプルリスクファクタ一症候群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる 症候群の予防および/または治療薬のスクリーニング用キット。
1 7 . 請求の範囲 1 2記載のスクリーニング方法を用いて得られるヒトァ ディポネクチンプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩。
1 8 . 請求の範囲 1 3記載のスクリーニング方法を用いて得られるシンドロ ーム X、 メタボリ ックシンドローム、 マルチプルリスクファクタ一症候群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる 症候群の予防およぴ Zまたは治療薬。
1 9 . 請求の範囲 1 5記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒ
-タ一活性を促進する化合物またはその塩。
2 0 . 請求の範囲 1 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られるシン ドローム X、 メタボリ ックシンドローム、 マルチプルリスクファクタ一症候 群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ば れる症候群の予防および/または治療薬。
2 1 . 請求の範囲 1 7または 1 9記載のヒ トアディポネクチンプロモータ 一活性を促進する化合物またはその塩を含有する医薬組成物。
2 2 . 請求の範囲 1 8または 2 0記載のシンドローム X、 メタボリックシ ンドローム、 マルチプルリスクファクター症候群、 インスリン抵抗性症候群、 死の四重奏、 および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防およひンまた は治療薬を含有する医薬組成物。
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