TR201809967T4 - Nörit dejenerasyonu ile ilişkili hastalıkların tanısı ve tedavisi için bileşim ve yöntem. - Google Patents

Nörit dejenerasyonu ile ilişkili hastalıkların tanısı ve tedavisi için bileşim ve yöntem. Download PDF

Info

Publication number
TR201809967T4
TR201809967T4 TR2018/09967T TR201809967T TR201809967T4 TR 201809967 T4 TR201809967 T4 TR 201809967T4 TR 2018/09967 T TR2018/09967 T TR 2018/09967T TR 201809967 T TR201809967 T TR 201809967T TR 201809967 T4 TR201809967 T4 TR 201809967T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
rgma
antibodies
binding
cdr
Prior art date
Application number
TR2018/09967T
Other languages
English (en)
Inventor
Mueller Bernhard
Huang Lili
D Bardwell Philip
Kutskova Yuliya
Memmott John
Original Assignee
Abbvie Deutschland
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Deutschland, Abbvie Inc filed Critical Abbvie Deutschland
Publication of TR201809967T4 publication Critical patent/TR201809967T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1021—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against cytokines, e.g. growth factors, VEGF, TNF, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/008—Peptides; Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Burada sağlanan, antikorlar ve nörit dejeneratif hastalıkların veya bozuklukların tedavisi ve tanısında kullanıma yönelik yöntemlerdir.

Description

TARIFNAME NÖRIT DEJENERASYONU iLE ILISKILI HASTALIKLARIN TANISI VE TEDAVISI içiN BILESIM VE YÖNTEM ILGILI BASVURU BILGISI talep etmektedir.
BULUSUN SAHASI Mevcut bulus, nörit dejenerasyonu ile iliskili hastaliklari, örnegin, multipl sklerozu, tedavi etmek ve bunlarin tanisini koymak için antikorlar ile ilgilidir.
ALT YAPI Çok sayida nörodejeneratif hastaligin erken evreleri, nörit hasari ve taviz verilmis sinaptik fonksiyon ile karakterize edilir. Nörit dejenerasyonu siklikla, nöronal hücre ölümüne yol açar ve etkilenmis sinirlerde sinyallerin iletimini bozabilir, bu algilamada, harekette, biliste veya hangi sinirlerin tutulduguna bagli olarak diger fonksiyonlarda bozulmaya neden olur. Nörit dejenerasyonu ayricai multipl sklerozun ("MS") bir patolojik özelligidir. MS, Amerika Birlesik Devletleri'nde yaklasik 350.000 insani etkileyen bir otoimmün, nörodejeneratif hastaliktir ve genç eriskinlerde sinir sistemi engelliliginin veya ölümün majör bir nedenidir. MS'den etkilenmis insanlardaki yaygin bir klinik rahatsizlik, nöronlarin aksonlarini çevreleyen miyelin kiliflarin kapsamli parçalanmasindan ve aksonlarin kendisinin nihai parçalanmasindan kaynaklanan nöral enzimlerinin üç majör nörolojik protein üzerine saldirisi ile baslatildigina inanilir: miyelin bazik protein (MBP), proteo-Iipit protein (PLP) ve miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG). Mekanistik olarak, MS, en azindan kismen miyelin parçalanma ürünlerine bir otoimmün yanittan kaynaklanan bir enflamatuvar demiyelinizan hastaliktir. Yakin tarihli çalismalar, iyi bilinen demiyelinasyon ve enflamatuvar mekanizmalarina ek olarak nörit ve aksonal yaralanmanin rolünü vurgulamistir.
Hastalara tipik olarak, hastanin öyküsünün ve beynin ve omuriligin manyetik rezonans görüntülemesini (MRI), elektro-ta nisal prosedürleri (örnegin, uyarilmis potansiyel testlerini. örnegin, görsel uyarilmis potansiyelleri, beyin kökü duyusal uyarilmis potansiyelleri veya somatosensori uyarilmis potansiyelleri) ve beyin-omurilik sivisinda immünoglobülin sentezinin bulgusunu aramak için Iumbar ponksiyonu içeren nörolojik muayenenin bir kombinasyonuna göre bir nörit dejeneratif hastaliga sahip oldugu sekilde tani koyulur.
Güncel olarak, nörit dejenerasyonu ile iliskili hastaliklar için kür yoktur, böylece tedavi tipik olarak, semptomlarin yönetimini ve relapslarin sikliginin ve siddetinin tedavisini RGM A reseptörünü ve diger RGM A baglama proteinlerini baglamasini önleyen ve böylelikle retinal sinir lifi tabakasi (RNFL) dejenerasyonunun tedavisinde kullanim için RGM A'nin fonksiyonunu nötralize eden RGM A baglama proteinlerini, özel olarak monoklonal antikorlari ve özellikle bunlarin CDR greft edilmis, hümanize versiyonlarini tarif eder. WHO 02/051438 A2, RGM'nin ve bunun modülatörlerinin kullanimi ile ilgilidir ve poliklonal antikorlar anti-RGMi'i ve anti-RGMZ'yi ayni zamanda monoklonal anti- etkilesimin modülatörleri ile ilgilidir ve ayrica monoklonal anti-RGM antikoru F3D4'ü de nöritlerin asiri-büyümesini in vitro inhibe ettigini ve söz konusu inhibitör etkinin bir poliklonal anti-RGMa antikorunun varliginda feshedildigini bildirir.
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bir yönünde, mevcut bulus, bir izole edilmis monoklonal anti-Itici Yönlendirme Molekülü a ("RGMa") antikoruna yöneliktir. Antikor, SEO ID NO: 2 amino asit dizisini içeren bir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) 1, SEQ ID NO: 3 amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 4 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir degisken agir amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 8 veya SEQ ID NO: 73 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir hafif zincir bölgesi içerir. Özel uygulamalarda, antikor (a) SEQ ID NO: 1 amino asit dizisini içeren bir degisken agir alan ve SEO lD NO: 5 amino asit dizisini içeren bir degisken hafif alan bölgesi, (b) SEO ID NO: 2 amino asit dizisini içeren bir CDR1, SEO ID NO: 3 amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 4 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir degisken agir zincir ve SEO ID NO: 6 amino asit dizisini içeren bir CDR1, SEO ID NO: 7 amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 8 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir degisken hafif zincir, (c) (SEO ID NO: 2 amino asit dizisini içeren bir CDR1, SEO ID NO: 3 amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 4 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir degisken agir zincir ve SEO ID NO: 6 amino asit dizisini içeren bir CDR1, SEO ID NO: 7 amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 73 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir degisken hafif zincir arasindan seçilen bir alan veya bölge içerir.
Antikor insan olabilir.
Antikor bir insan IgM sabit alanindan, bir insan IgG4 sabit alanindan, bir insan IgG1 sabit alanindan, bir insan IgE sabit alanindan, bir insan IgG2 sabit alanindan, bir insan zincir immünoglobülin sabit alani içerebilir. insan lgG1 sabit alani, SEO ID NO: 140'i içerebilir veya olusabilir.
Antikor, SEO ID NO: 1 dizisini içeren bir degisken agir bölge içerebilir. izole edilmis antikor, SEO ID NO: 5 dizisini içeren bir degisken hafif bölge içerebilir. izole edilmis antikor, SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7 ve SEO ID NO: 8 veya SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7 ve SEO ID NO: 73 tamamlayicilik-belirleme bölgesi (CDR) rezidülerini içeren bir degisken hafif alan içerir. izole edilmis antikor, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3 ve SEO ID NO: 4 tamamlayicilik- belirleme bölgesi (CDR) rezidülerini içeren bir degisken agir alan içerir. izole edilmis antikor, SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3 ve SEO ID NO: 4 tamamlayicilik- belirleme bölgesi (CDR) rezidülerini içeren bir degisken agir alan ve SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7 ve SEO ID NO: 8 tamamlayicilik-belirleme bölgesi (CDR) rezidülerini içeren bir degisken hafif alan içerebilir. izole edilmis antikor, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir ajan içerebilir: bir immünoadezyon molekülü, bir görüntüleme ajani ve bir terapötik ajan. Görüntüleme ajani, radyo-etiket, bir enzim, bir flüoresan etiket, bir lüminesan etiket, bir biyolüminesan etiket, bir manyetik etiket veya biyotin, olabilir. Radyo-etiket, 3H, 140, Bulusun antikoru, RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS epitopunu (hRGMa baglayabilir. RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS epitopunu (hRGMa 47-69) (SEO ID NO: 79) baglayan antikor, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ve SEO ID NO: 4 tamamlayicilik-belirleme bölgesi (CDR) rezidülerini içeren bir degisken agir alan ve SEO ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ve SEO ID NO: 8 tamamlayicilik-belirleme bölgesi (CDR) rezidülerini içeren bir degisken hafif alan içerebilir.
Bir baska yönünde, mevcut bulus burada tarif edilen antikoru veya bunun karisimini içeren bir farmasötik bilesime yöneliktir.
Nörit dejenerasyonu ile iliskili bir hastaligi veya bozuklugu tedavi etmenin, önlemenin, modüle etmenin veya atenüe etmenin, buna ihtiyaci olan bir süjeye burada tarif edilen antikorun bir terapötik olarak etkili miktarini uygulamayi içeren bir yöntemi ilaveten burada tarif edilir. Nörit dejeneratif bozukluk, multipl skleroz, Parkinson hastaligi; Alzheimer hastaligi; Huntington hastaligi; amiyotrofik lateral skleroz ve baska moto- nöron hastaliklar; Tay-Sachs hastaligi; Niemann-Pick hastaligi; Gaucher hastaligi; Hurler sendromu; idiyopatik enflamatuvar demiyelinizan hastaliklar; 812 vitamini eksikligi; santral pontin miyelinoliz; omurilik zafiyeti; transvers miyelit; Devic hastaligi, progresif multifokal Iökoensefalopati; optik nörit; CNS'ye travmatik yaralama; iskemik serebral inme; bir retinopati; örnegin, glokom, diyabetik retinopati veya yasa-bagli maküler dejenerasyon ve bir Iökodistrofi olabilir. ilaveten, bir süjenin bir nörit dejeneratif bozukluga sahip olup olmadigini belirlemek için bir yöntem burada tarif edilir. Yöntem, süjeden elde edilen bir örnek içinde RGMa'nin düzeyini ölçmeyi ve örnek içindeki RGMa'nin düzeyini bir normal kontrol ile karsilastirmayi içerebilir. RGMA'nin bir degistirilmis düzeyi, süjenin bir nörit dejeneratif bozukluga sahip oldugunu gösterir. Normal kontrole kiyasla RGMa'nin bir arttirilmis düzeyi, süjenin nörit dejeneratif bozukluga sahip oldugunu gösterir. Örnek bir kan örnegi veya bir serum örnegi veya bir beyin-omurilik sivisi örnegi olabilir. Bir örnek içindeki RGMa'nin düzeyini ölçmenin adimi, bir immünoanaliz ile yürütülebilir.
Immünoanaliz, bir enzime-bagli bagisiklik analizi (ELISA) olabilir. ELlSA, bir sandviç ELISA olabilir.
Bir baska yönünde, mevcut bulus, SEQ lD NO.'Iari: 1-7 ve 73'ü içeren bir izole edilmis antikora yöneliktir.
Bir baska yönünde, mevcut bulus, RGMa PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa epitopunu baglayan SEQ ID NO.'Iari: 1-7 ve 73'ü içeren bir izole edilmis monoklonal antikora yöneliktir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, bir hRGMa fragmaninin 50 pg/ml'sinin kullanildigi bir nörit asiri-büyüme analizinden elde edilen test sonuçlarini gösterir. Bu fragman, SEQ ID NO. 65'in hem yüksek afiniteli neogenin- hem de kemik morfogenetik protein-etkilesim alanlarini içerir.
Sekil 2, tam boy hRGMa'nin 50 ug/ml'sinin kullanildigi nörit asiri-büyüme analizinden elde edilen test sonuçlarini gösterir.
Sekil 3, antikor AE12-1 varliginda retinal gangliyon hücreleri aksonlarinin peri- olan bir çubuk grafigini gösterir.
Sekil 4, insan 5F9.23'ü ile dogrudan karsilastirmada antikor AE12-1 varliginda retinal gangliyon hücresi aksonlarinin (500-1000 um) in vivo rejeneratif büyümesinin düzeyinin yansimasi olan bir çubuk grafigini gösterir.
Sekil 5, tripsin/Asp-N ile kesip çikarilmis E. coli hRGMa'nin AE12-1 mAb ile indirgenmis E1 fragmanindan elde edilen MS spektrumlarini gösterir, spektrumlar üzerinde gösterilen dizilere karsilik gelen iki peptidin (görünüs sirasina göre sirasiyla SEQ ID NO.'Iari: 74 ve 80) +3 ve +4 yüklü hallerini (kutu içine alinmis) gösterir. ile etiketlenmis pikler, hRGMa antijenine tayin edilemeyebilen peptitlerdir ve antikor ile ilgili olabilir.
Sekil 6, hRGMa'nin tripsin ve Asp-N ile kesip çikarilmis AE12-1 mAb ile denatüre edilmis, indirgenmis E1 fraksiy0nundan (MYC yapisi) elde edilen MS (üstte) ve MS/MS (altta) spektrumlarini gösterir, kesip çikarilmis peptidin dizisini KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO: 81) olarak konfirme Sekil 7, hRGMa'nin tripsin ve Asp-N ile kesip çikarilmis AE12-1 mAb ile denatüre edilmis, indirgenmis E1 fraksiy0nundan (MYC yapisi) elde edilen MS (üstte) ve MS/MS (altta) spektrumlarini gösterir, kesip çikarilmis peptidin dizisini AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEO ID NO:89) olarak konfirme edilir.
Sekil 8, bir kontrol antikoru (10 mg/kg'da hlgG; bakiniz, üst panel), 1 mg/kg'da AE12-1 antikoru (bakiniz, orta panel) veya 1 mg/kg'da h5F9.23 antikoru (bakiniz, alt panel) ile muamele edilmis siçanlarda sinir Iezyonlarinin mikrograflarini gösterir.
Sekil 9, tam boy insan RGMa'si ile muameleden ve bunun AE12-1 (sol çubuk grafigi) ve AE12-1-H (sag çubuk grafigi) ile nötralizasyonundan sonra bir substrat olarak fibronektin ile kaplanmis 96 gözlü plakalarda SH-SY5Y hücrelerinin nörit asiri-büyümesinin bir analizinin sonuçlarini gösterir. Antikor ve tam boy hRGMa ayni zamanda eklenmistir ve bunu takiben kültürler 24 saat boyunca inkübe edilmistir.
Sekil 10, tam boy insan RGMa'si ile muameleden ve bunun AE12-1-K (sol çubuk grafigi) ve AE12-1-F (sag çubuk grafigi) ile nötralizasyonundan sonra bir substrat olarak fibronektin ile kaplanmis 96 gözlü plakalarda SH-SYSY hücrelerinin nörit asiri-büyümesinin bir analizinin sonuçlarini gösterir. Antikor ve tam boy hRGMa ayni zamanda eklenmistir ve bunu takiben kültürler 24 saat boyunca inkübe edilmistir.
Sekil 11, tam boy insan RGMa'si ile muameleden ve bunun AE-12-1-I (sol çubuk grafigi) ve AE-12-L (sag çubuk grafigi) ile nötralizasyonundan sonra bir substrat olarak fibronektin ile kaplanmis 96 gözlü plakalarda SH-SYSY hücrelerinin nörit asiri-büyümesinin bir analizinin sonuçlarini gösterir. Antikor ve tam boy hRGMa ayni zamanda eklenmistir ve bunu takiben kültürler 24 saat boyunca inkübe edilmistir.
Sekil 12, tam boy insan RGMa`si ile muameleden ve bunun AE12-1-V (sol çubuk grafigi) ve AE-12-1-Y (sag çubuk grafigi) ile nötralizasyonundan sonra bir substrat olarak fibronektin ile kaplanmis 96 gözlü plakalarda SH-SY5Y hücrelerinin nörit asiri-büyümesinin bir analizinin sonuçlarini gösterir. Antikor ve tam boy hRGMa ayni zamanda eklenmistir ve bunu takiben kültürler 24 saat boyunca inkübe edilmistir. primer nöronlar (HCA Yüksek Içerik Analizi) üzerinde bir RGMa baglama analizinin sonuçlarini gösterir.
Sekil 14, AE12-1 ve AE12-1 sistein varyantlari kullanilarak SH-SY5Y hücreleri (Yüksek Içerik Analizi (HCA) vasitasiyla) üzerinde bir RGMa baglama inhibisyon analizinin sonuçlarini gösterir.
Sekil 15, siçan hipokampal primer nöronlari üzerinde bir nörit asiri-büyüme analizinde AE12-1'in ve AE12-6'nin RGMa nörit asiri-büyüme repulsiyonunun nötralize etme etkisini gösterir. r5F9 antikoru, bir kontrol olarak kullanilir.
Sekil 16, üç (3) RGMa selektif monoklonal antikorun, spesifik olarak, AE12-1'in, AE12-1Y'nin ve h5F9.23'ün, Örnek 9'da tarif edildigi üzere ezilme yeri ötesinde GAP-43 pozitif Iiflerin masif rejenerasyonunu indükledigini gösterir. Y-ekseni = ezilme yerinin ötesinde 0-500 um alan içinde akson demetlerinin sayisi. *** p < 0,001: hlgG'ye kiyasla anlamlilik. ** p < 0.01: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, * p < 0,05: insan lgG'ye kiyasla anlamlilik.
Sekil 17, üç (3) RGMa selektif monoklonal antikorun, spesifik olarak, AE12-1'in, AE12-1Y'nin ve h5F9.23'ün, retinal aksonal demetlerin sayisini arttirdigini, böylece retinal sinir lifi tabakasini korudugunu, gösterir. Y-ekseni = Örnek 10'da tarif edildigi üzere retinadaki lif demetlerinin sayisi. ** p < 0,01: hlgG'ye kiyasla anlamlilik. * p < 0,05: hlgG'ye kiyasla anlamlilik. tarif edildigi üzere spinal tEAE modelinde fonksiyonel geri-kazanimi hizlandirdigini gösterir. Antikor muamelesi (iv), sitokin enjeksiyonundan yaklasik olarak bir hafta sonra baslatilmistir ve haftada bir tekrar edilmistir.
Verilen dozlar10 mg/kg'dir. *** p < 0,001: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, ** p < 0,01: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, * p < 0,05: hlgG'ye kiyasla anlamlilik.
Sekil 19, RGMa mAb'Ieri AE, Örnek 11'de tarif edildigi üzere insan IgG kontrol antikoru ile dogrudan karsilastirmada GAP-43 ve MBP alanini arttirdigini ve enflamatuvar lezyonu azalttigini gösterir. *** p < 0,001: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, ** p < 0,01: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, * p < 0,05: hlgG'ye kiyasla anlamlilik.
Sekil 20, RGMa mAb'si AE12-1Y-QL'nin, Örnek 11'de tarif edildigi üzere haftada bir kere intravenöz olarak verilen 0,1; 1 ve 10 mg/kg olan üç farkli dozda spinal tEAE modelinde fonksiyonel geri-kazanimi hizlandirdigini gösterir. Antikor muamelesi (iv), sitokin enjeksiyonundan yaklasik olarak bir hafta sonra baslatilmistir ve haftada bir tekrar edilmistir. *** p < 0,001: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, ** p < 0,01: hlgG'ye kiyasla anlamlilik, * p < 0,05: hlgG'ye kiyasla anlamlilik.
DETAYLI AÇIKLAMA Bulusun sahipleri Itici Yönlendirme Molekülü a'yi ("RGMa") baglayan ve nörit dejenerasyonu ile ilgili hastaliklari tedavi etmek için kullanilabilen yeni antikorlar kesfetmistir. Nörit dejenerasyonu ile ilgili hastaliklar ile iliskili klinik bulgulari atenüe edebilen spesifik ve spesifik-olmayan antikorlar burada saglanir. 1. Tanimlar Burada kullanilan terminoloji, yalnizca özel uygulamalari tarif etme amaciyladir ve sinirlayici olmasi amaçlanmaz. Spesifikasyonda ve ekli istemlerde kullanildigi üzere, göndergeleri içerir. a. Yaklasik Burada kullanildigi sekliyle, "yaklasik", ifade edilen degerden yaklasik olarak bir +/- yapilsin veya yapilmasin, burada saglanan verilen herhangi bir degere daima dahil edildigi anlasilacaktir. b. Afinite Matüre Edilmis Antikor bir ana antikor ile karsilastirildiginda bir hedef antijen için antikorun afinitesinde (yani, KD, kd veya ka) bir iyilesme ile sonuçlanan, bir veya birden fazla degisime sahip olan bir antikoru ifade etmek için burada kullanilir. Emsal afinite matüre edilmis antikorlar, hedef antijen için nano-molar veya hatta piko-molar afinitelere sahip olacaktir. Afinite matüre edilmis antikorlar üretmek için, biyo-gösterim kullanilarak hazirlanmis bir kombinasyonel antikor kütüphanesinin taramasini içeren, çesitli prosedürler teknikte karmasi ile afinite matürasyonunu tarif eder. CDR ve/veya çerçeve rezidülerinin bir aktivite-güçlendiren amino asit rezidüsü olan temas veya hiper-mutasyon pozisyonlarinda selektif mutasyon 6,914,128 B1 Numarali U.S. Patenti'nde tarif edilir. c. Antikor ve Antikorlar Burada kullanildigi sekliyle, "antikor" ve "antikorlar", monoklonal antikorlari, multispesifik antikorlari, insan antikorlarini, hümanize (tam olarak veya parsiyel olarak hümanize) antikorlari, hayvan antikorlarini, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir kus (örnegin, bir ördek veya bir kaz), bir köpek baligi, bir yunus ve bir primat- olmayan (örnegin, bir inek, bir domuz, bir deve, bir lama, bir at, bir keçi, bir tavsan, bir koyun, bir hamster, bir gine domuzu, bir kedi, bir köpek, bir siçan, birfare, vb.) veya bir insan-olmayan primat (örnegin, bir maymun, bir sempanze, vb.) türlerini içeren bir memeli, rekombinant antikorlari, kimerik antikorlari, tek-Zincirli Fv'leri ("scFv"), tek zincirli antikorlari, tek alanli antikorlari, Fab fragmanlarini, F(ab') fragmanlarini, F(ab')2 fragmanlarini, disülfit-bagli Fv'Ieri ("dev") ve anti-idiyotipik ("anti-Id") antikorlari, ikili- alanli antikorlari, ikili degisken alanli (DVD) veya üçlü degisken alanli (TVD) antikorlari (ikili-degisken alanli Immünoglobülinler ve bunlari yapmak için yöntemler, Wu, C. et al., ve yukaridakilerin herhangi birinin fonksiyonel olarak aktif epitop-baglama fragmanlarini, ifade eder. Özel olarak, antikorlar immünoglobülin moleküllerini ve immünoglobülin moleküllerinin immünolojik olarak aktif fragmanlarini, yani, bir analit-baglama yeri içeren molekülleri içerir. immünoglobülin molekülleri, herhangi bir tipten (örnegin, IgG, IgE, lgM, IgD, lgA ve lgY), siniftan (örnegin, IgGi. IgG2, IgGß, IgG4, IgA1 ve IgA2) veya alt-siniftan olabilir. Sadelik adina, bir analite karsi bir antikor siklikla burada bir "anti-analit antikoru" veya yalnizca bir "analit antikoru" (örnegin, bir anti-RGMa antikoru veya bir RGMa antikoru) olarak ifade edilir. d. Antikor Fragmani Burada kullanildigi sekliyle, "antikor fragmani”, antijen-baglama yeri veya degisken bölge içeren bir intakt antikorun bir kismini ifade eder. Kisim, intakt antikorun Fc bölgesinin sabit agir zincir alanlarini (yani, antikor izotipine bagli olarak, CH2, CH3 veya CH4) içermez. Antikor fragmanlarinin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Fab fragmanlarini, Fab' fragmanlarini, Fab'-SH fragmanlarini, F(ab')2 fragmanlarini, Fd fragmanlarini, Fv fragmanlarini, diabodileri, tek-zincirli FV (scFv) moleküllerini, yalnizca bir hafif zincir degisken alani içeren tek-zincirli polipeptitleri, hafif-zincir degisken alaninin üç CDR'sini içeren tek-zincirli polipeptitleri, yalnizca bir agir zincir degisken bölgesini içeren tek-zincirli polipeptitleri ve agir zincir degisken bölgesinin üç CDR'sini içeren tek-zincirli polipeptitleri içerir. 9. Baglama Sabitleri asagidaki denklem ile gösterildigi üzere bir antikor ve antijen arasinda kompleks olusumunun hizini gösteren degeri ifade eder: Antikor (Ab) + Antijen (Ag) -› Ab-Ag.
Burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanildigi sekliyle, "ayrilma hiz sabiti", "kon" veya "kd" terimi, bir antikorun bunun hedef antijeninden ayrilma hizini veya asagidaki denklem ile gösterildigi üzere zamanla Ab-Ag kompleksinin serbest antikora ve antijene ayrilmasini gösteren degeri ifade eder: Antikor (Ab) + Antijen (Ag) (- Ab-Ag.
Birlesme ve ayrilma hiz sabitlerini belirlemek için yöntemler teknikte iyi bilinir.
FIüoresans-temelli teknikleri kullanma, yüksek duyarlilik ve dengede fizyolojik tamponlar içinde örnekleri inceleme yetisini öne sürer. Diger deneysel yaklasimlar ve aygitlar, örnegin, bir BIAcore® (biyomoleküler etkilesim analizi) analizi, (örnegin, BIAcore International AB, bir GE Healthcare firmasi'ndan, Uppsala, Isveç, erisilebilen aygit) kullanilabilir. Ilave olarak, Sapidyne Instruments (Boise, Idaho) firmasidan, bir KinExA® (Kinetik Dislama Analizi) analizi de kullanilabilir.
Burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanildigi üzere, "denge ayrilma sabiti" veya eder. Birlesme hizi, ayrilma hizi ve denge ayrilma sabiti, bir antikorun bir antijeni baglama afinitesini temsil etmek için kullanilir. f. Baglama Proteini olusturan bir monomerik veya multimerik proteini, örnegin, mesela, bir polipeptidi, bir antijeni, bir kimyasal bilesigi veya baska molekülü veya herhangi bir çesitteki bir substrati, ifade etmek için burada kullanilir. Bir baglama proteini bir baglama partnerini spesifik olarak baglar. Baglama proteinleri, antikorlari ayni zamanda bunlarin antijen- baglama fragmanlarini ve teknikte bilindigi ve burada asagida tarif edildigi üzere bunlarin çesitli diger formlarini ve türevlerini ve bir antijen molekülünü veya antijen molekülü üzerindeki bir özel yeri (epitopu) baglayan bir veya birden fazla antijen- baglama alani içeren diger molekülleri içerir. Bu dogrultuda, bir baglama proteini, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir antikoru, bir tetramerik immünoglobülini, bir IgG molekülünü, bir IgG1 molekülünü, bir monoklonal antikoru, bir kimerik antikoru, bir CDR-greft edilmis antikoru, bir hümanize antikoru, bir afinite matüre edilmis antikoru ve bu tarz herhangi bir antikorun, bir antijeni baglama yetisini muhafaza eden fragmanlarini içerir. 9. Bispesifik Antikor uygulayan delik içine topuz veya benzer yaklasimlar ile (bakiniz, Holliger et al., Proc. bispesifik antikor oldugu çok sayida farkli immünoglobülin türleri ile sonuçlanan, bir tam-boy antikoru ifade etmek için burada kullanilir. Bir bispesifik antikor, bunun iki baglama kolu (bir HC/LC çifti) üzerindeki bir antijeni (veya epitopu) baglar ve bunun ikinci kolu (farkli bir HC/LC çifti) üzerindeki farkli bir antijeni (veya epitopu) baglar. Bu tanim ile, bir bispesifik antikor (hem özgüllük hem de CDR dizilerinde) iki ayri antijen- baglama koluna sahiptir ve bunun bagladigi her bir antijen için tek-degerliklidir. etmek için burada kullanilir. Agir zincirin ve hafif zincirin degisken bölgelerinin her birinde, degisken bölgelerin her biri için "CDR1", "CDR2" ve "CDR3" olarak gösterilen, üç CDR vardir. Burada kullanildigi sekliyle "CDR kümesi" terimi, antijeni baglayan bir tek degisken bölge içinde bulunan üç CDR'Iik bir grubu ifade eder. Bu CDR'Ierin tam sinirlari, farkli sistemlere göre farkli sekilde tanimlanmistir. Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest (National lnstitutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)) tarafindan tarif edilen sistem, yalnizca bir antikorun herhangi bir degisken bölgesine uygulanabilen kesin bir rezidü numaralandirma sistemi saglamaz, ayni zamanda üç CDR'yi tanimlayan kesin rezidü sinirlarini da saglar. Bu CDR'Ier, "Kabat CDR'Ieri" olarak ifade edilebilir. Chothia ve is arkadaslari (Chothia and (1989)), Kabat CDR'Ieri içindeki belirli alt-kisimlarin, amino asit dizisi düzeyinde büyük çesitlilige sahip olmalarina ragmen, neredeyse özdes peptit omurgasi konformasyonlarini benimsedigini bulmustur. Bu alt-kisimlar, "L1", "L2" ve "L3" veya zincir bölgelerini gösterir. Bu bölgeler, Kabat CDR'Ieri ile kesisen sinirlara sahip olan rezidülerin gruplarinin veya hatta tüm CDR'Ierin antijen baglamasini anlamli bir sekilde etkilemedigine yönelik tahmin veya deneysel bulgular isiginda kisaltilabilmesine veya uzatilabilmesine ragmen, daha baska CDR siniri tanimlamalari, buradaki sistemlerin birini kati bir sekilde izlemeyebilir, ancak yine de Kabat CDR'Ieri ile kesisecektir. Belirli uygulamalarin Kabat- veya Chothia-tanimli CDR'Ieri kullanmasina ragmen, burada kullanilan yöntemler bu sistemlerin herhangi birine göre tanimlanmis CDR'Ierden yararlanabilir. i. Bilesen veya Bilesenler yöntemlere ve teknikte bilinen diger yöntemlere göre, bir test örneginin, örnegin, bir hasta idrar, serum veya plazma örneginin, analizi için bir kite dahil edilebilen bir yakalama antikorunu, bir saptama veya konjugat kalibratörünü, bir kontrolü, bir duyarlilik panelini, bir kabi, bir tamponu, bir diluenti, bir tuzu, bir enzimi. bir enzim için bir ko-faktörü, bir saptama reaktifini, bir ön-muamele reaktifini/çözeltisini, bir substrati (örnegin, bir çözelti olarak), bir durdurma çözeltisini ve benzerlerini ifade eder. bazi bilesenler, çözelti içinde olabilir veya bir analizde kullanim için rekonstitüsyon için j. Konsensüs veya Konsensüs Dizisi Burada kullanildigi sekliyle, "Konsensüs" veya "Konsensüs Dizisi", bir özel antijenin çok sayida alt-tipinin bir hizalamasinin analizine göre yapilan, bir sentetik nükleik asit sayida alt-tipine veya sero-tipine karsi genis immünite indüklemek için kullanilabilir.
Sentetik antijenler, örnegin, füzyon proteinleri, konsensüs dizilerine (veya konsensüs antijenlerine) manipüle edilebilir. k. Kontrol Burada kullanildigi sekliyle, "kontrol", söz konusu bir analiti, örnegin, RGMa'yi (örnegin, membran-iliskili RGMa'yi, çözünebilen RGMa'yi, membran-iliskili RGMa'nin fragmanlarini, çözünebilen RGMa'nin fragmanlarini, RGMa'nin (membran-iliskili veya çözünebilen RGMa'nin) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunun) varyantlarini, içermedigi ("negatif") veya söz konusu bir analiti, örnegin, RGMa'yi (örnegin, membran- iliskili RGMa'yi, çözünebilen RGMa'yi, membran-iliskili RGMa'nin fragmanlarini, çözünebilen RGMa'nin fragmanlarini, RGMa'nin (membran-iliskili veya çözünebilen RGMa'nin) veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunun) varyantlarini, içerdigi ("pozitif kontrol") bilinen bir bilesimi ifade eder. Bir pozitif kontrol, RGMa'nin bilinen bir konsantrasyonunu içerebilir. "Kontrol", "pozitif kontrol" ve "kalibratör", RGMa'nin bilinen bir konsantrasyonunu içeren bir bilesimi ifade etmek için burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilabilir. Bir "pozitif kontrol", analiz performans karakteristiklerini olusturmak için kullanilabilir ve reaktiflerin (örnegin, analitlerin) bütünlügünün kullanisli bir indikatörüdür. Bir "normal kontrol", bir demir ile ilgili hastaliktan veya bozukluktan yoksun olan bir örnegi veya bir süjeyi ifade edebilir. l. Türev Burada kullanildigi sekliyle, bir antikorun “türevi", bir hakiki veya ana antikor ile karsilastirildiginda bunun amino asit dizisine bir veya birden fazla modifikasyonla sahip olan bir antikoru ifade edebilir ve bir modifiye edilmis alan yapisi gösterebilir. Türev hala, natif antikorlarda bulunan tipik alan konfigürasyonuna ayni zamanda hedefleri (antijenleri) özgüllük ile baglayabilen bir amino asit dizisine uyum saglayabilir. Antikor türevlerinin tipik örnekleri, antikorlarin diger polipeptitlerine, yeniden-dizilmis antikor alanlarina veya fragmanlarina kuple edilen antikorlardir. Türev ayrica, en az bir ilave bilesik, örnegin, bir protein alani, da içerebilir, söz konusu protein alani kovalent veya kovalent-olmayan baglar ile baglanir. Baglanti, teknikte bilinen yöntemlere göre genetik füzyona dayanabilir. Bulusa uygun sekilde kullanilan antikoru içeren füzyon proteininde bulunan ilave alan tercihen, bir esnek baglayici, avantajli bir sekilde, bir peptit baglayici, ile baglanabilir, burada söz konusu peptit baglayici, ilave protein alaninin C- terminali ucu ve antikorun N- terminali ucu veya tam tersi arasindaki mesafeyi geçmek için yeterli bir uzunluktaki çok sayida, hidrofilik, peptit-bagli amino asit içerir. Antikor, biyolojik aktivite veya bir örnegin, kati destegi, bir biyolojik olarak aktif maddeyi (örnegin, bir sitokini veya büyüme hormonunu), bir kimyasal ajani, bir peptidi, bir proteini veya bir ilaci selektif baglama için uygun bir konformasyona sahip olan bir m. Ikili-Spesifik Antikor antijeni (veya epitopu) baglayabilen bir tam-boy antikoru ifade etmek için burada kullanilir (bakiniz, WO . Bu dogrultuda, bir ikili-spesifik baglama proteini, özdes özgüllük ve özdes CDR dizileri ile, iki özdes antijen baglama koluna sahiptir ve bunun bagladigi her bir antijen için iki-degerliklidir. n. Ikili Degisken Alan baglama yeri) veya çok-degerlikli baglama proteinleri olabilen bir baglama proteininin iki veya daha fazla antijen baglama yerini ifade etmek için burada kullanilir. DVD'ler, monospesifik, yani, bir antijeni (veya bir spesifik epitopu) baglayabilen veya multispesifik, yani, iki veya daha fazla antijeni (yani, ayni hedef antijen molekülünün iki veya daha fazla epitopunu veya farkli hedef antijenlerin iki veya daha fazla epitopunu) baglayabilen, olabilir. Bir tercih edilen DVD baglama proteini, iki agir zincir DVD polipeptidi ve iki hafif zincir DVD polipeptidi içerir ve bir “DVD immünoglobülini'i veya ve bir lgG molekülünü animsatir, ancak bir lgG molekülüne kiyasla daha fazla antijen baglama yeri saglar. Böylelikle, bir tetramerik DVD-lg molekülünün her bir yarisi, bir lgG molekülünün bir yarisini animsatir ve bir agir zincir DVD polipeptidi ve bir hafif zincir DVD polipeptidi içerir, ancak bir tek antijen baglama alani saglayan bir lgG molekülünün agir ve hafif zincirlerinin bir çiftinden farkli olarak, bir DVD-lg'nin agir ve hafif zincirlerinin bir çifti iki veya daha fazla antijen baglama yeri saglar.
Bir DVD-lg baglama proteininin her bir antijen baglama yeri, bir donör ("parental") monoklonal antikordan türetilebilir ve böylelikle, her bir antijen baglama yeri için antijen baglamaya dahil edilen toplamda alti CDR içeren bir agir zincir degisken alani (VH) ve bir hafif zincir degisken alani (VL) içerir. Bu dogrultuda, iki farkli epitopu (yani, iki farkli antijen molekülünün iki farkli epitopunu veya ayni antijen molekülünün iki farkli epitopunu) baglayan bir DVD-lg baglama proteini, bir birinci parental monoklonal antikordan türetilen bir antijen baglama yeri ve bir ikinci parental monoklonal antikorun bir antijen baglama yerini içerir.
DVD-lg baglama moleküllerinin tasariminin, ekspresyonunun ve karakterizasyonunun Bu tarz DVD-lg moleküllerinin tercih edilen bir örnegi, VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n yapisal formülünü içeren bir agir zincir, burada VD1, bir birinci agir zincir degisken alanidir, VD2, bir ikinci agir zincir degisken alanidiri C, bir agir zincir sabit alanidir, X1, bunun CH1 olmamasi kaydiyla, bir baglayicidir, X2, bir FC bölgesidir ve n, 0'dir veya 1'dir, ancak tercihen 1'dir; ve VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n yapisal formülünü içeren bir hafif zincir, burada VD1, bir birinci hafif zincir degisken alanidir, VD2, bir ikinci hafif zincir degisken alanidir, C, bir hafif zincir sabit alanidir, X1, bunun CH1 olmamasi kaydiyla, bir baglayicidir ve X2, bir Fc bölgesi içermez; ve n, 0'dir veya 1'dir, ancak tercihen 1'dir.
Bu tarz bir DVD-lg, bu tarz iki agir zincir ve bu tarz iki hafif zincir içerebilir, burada her bir zincir, degisken bölgeler arasinda bir araya-giren sabit bölge olmadan arka arkaya dizilmis sekilde baglanmis degisken alanlar içerir, burada bir agir zincir ve bir hafif zincir, arka arkaya dizilmis sekilde fonksiyonel antijen baglama yerleri olusturmak için birlesir ve agir ve hafif zincirlerin bir çifti, dört fonksiyonel antijen baglama yeri olan bir tetramerik baglama proteini olusturmak için agir ve hafif zincirlerin bir baska çifti ile birlesebilir. Bir baska örnekte, bir DVD-lg molekülü, her bir zincir, degisken alanlar arasinda bir araya-giren sabit bölge olmadan arka arkaya dizilmis sekilde baglanmis üç degisken alan (VD1, VDZ, VD3) içeren agir ve hafif zincirleri içerebilir, burada agir ve hafif zincirlerin bir çifti, üç antijen baglama yeri olusturmak için birlesebilir ve burada agir ve hafif zincirlerin bir çifti alti antijen baglama yeri olan bir tetramerik baglama proteini olusturmak için agir ve hafif zincirlerin bir baska çifti ile birlesebilir.
Tercih edilen bir uygulamada, bulusa göre bir DVD-lg baglama proteini yalnizca bunun parental monoklonal antikorlari tarafindan baglanmis ayni hedef molekülleri baglamaz, ayni zamanda bunun parental monoklonal antikorlarinin birinin veya birden fazlasinin bir veya birden fazla arzu edilebilen özelligine de sahiptir. Tercihen, bu tarz bir ilave özellik, parental monoklonal antikorlarin birinin veya birden fazlasinin bir antikor parametresidir. Bunun parental monoklonal antikorlarinin birinden veya birden fazlasindan bir DVD-lg baglama proteinine katkida bulunabilen antikor parametreleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, antijen özgüllügünü, antijen afinitesini, potensi, biyolojik fonksiyonu, epitop tanimayi, protein kararliligini, protein çözünürlügünü, üretim etkililigini, immünojenisiteyi, farmakokinetikleri, biyoyararlanimi, doku çapraz reaktivitesini ve ortolog antijen baglamayi içerir.
Bir DVD-lg baglama proteini, RGMa'nin en az bir epitopunu baglar. Bir DVD-lg baglama proteininin sinirlayici-olmayan örnekleri, RGMa'nin bir veya birden fazla epitopunu baglayan bir DVD-lg baglama proteinini, bir insan RGMa'sinin bir epitopunu ve bir baska türden (örnegin, fare) bir RGMa'nin bir epitopunu baglayan bir DVD-lg baglama proteinini ve bir insan RGMa'sinin bir epitopunu ve bir baska hedef molekülün (örnegin, VEGFRZ veya VEGFRl) bir epitopunu baglayan bir DVD-lg baglama proteinini içerir. 0. Epitop veya Epitoplar taninan bir yeri ifade eder ve bunun spesifik baglama partneri üzerindeki bir komplementer yeri baglayabilir. Molekül ve spesifik baglama partneri, bir spesifik baglama çiftinin parçasidir. Örnegin, bir epitop bir polipeptit, bir protein, bir hapten, bir karbonhidrat antijeni (örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, glikolipitler, glikoproteinler veya Iipopolisakkaritler) veya bir polisakkarit üzerinde olabilir. Bunun spesifik baglama partneri, bir antikor olabilir, ancak bununla sinirlandirilmaz.
Burada kullanildigi sekliyle, "Çerçeve" (FR) veya "Çerçeve dizisi", bir degisken bölgeden CDR'ler çikarildiktan sonra kalan diziler anlamina gelebilir. Bir CDR dizisinin tam tanimi farkli sistemler (örnegin, yukariya bakiniz) ile belirlenebildiginden, bir çerçeve dizisinin anlami karsilik gelen bir sekilde farkli yorumlara tabidir. Alti CDR (hafif zincirin CDR-Ll'i, -L2'si ve -L3'ü ve agir zincirin CDR-Hl'i, -H2'si ve -H3'ü) ayrica, hafif zincir ve agir zincir üzerindeki çerçeve bölgelerini her bir zincir üzerinde dört alt- bölgeye (FR1, FR2, FR3 ve FR4) de böler, burada CDR1, FR1 ve FR2 arasinda, CDR2, FR2 ve FR3 arasinda ve CDR3, FR3 ve FR4 arasinda konumlandirilir. Özel alt- bölgeleri FR1, FR2, FR3 veya FR4 olarak belirtmeden, digerleri tarafindan ifade edildigi üzere, bir çerçeve bölgesi, bir tek, dogal olusumlu immünoglobülin zincirinin degisken bölgesi içindeki birlestirilmis FR'Ieri temsil eder. Burada kullanildigi sekliyle, bir FR, dört alt-bölgenin birini temsil eder ve FR'Ier, bir çerçeve bölgesini olusturan dört alt-bölgenin ikisini veya daha fazlasini temsil eder.
Teknikte bilinen teknikler kullanilarak bir insan-olmayan antikoru hümanize etmek için agir zincir ve hafif zincir “akseptör" çerçeve dizileri (veya basitçe, "akseptör diziler) olarak kullanilabilen insan agir zincir ve hafif zincir FR dizileri teknikte bilinir. Bir uygulamada, insan agir zincir ve hafif zincir akseptör dizileri, halka açik veri tabanlarinda, örnegin, V-base'de (hiper-metin transfer protokolü://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) veya uluslararasi ImMunoGeneTics® (IMGT®) bilgi sisteminde (hiper- metin transfer protokolü://imgt.cines.fr/texts/lMGTrepertoire/LocusGenesl), listelenen çerçeve dizilerinden seçilir. q. Fonksiyonel Antijen Baglama Yeri Burada kullanildigi sekliyle, "fonksiyonel antijen baglama yeri", bir baglama proteini (örnegin, bir antikor) üzerindeki, bir hedef antijeni baglayabilen bir yer anlamina gelebilir. Antijen baglama yerinin antijen baglama afinitesi, antijen baglama yerinin bundan türetildigi ana baglama proteini, örnegin, ana antikor, kadar güçlü olmayabilir, ancak antijeni baglama yetisi proteinin, örnegin, antikorun, bir antijeni baglamasini degerlendirmek için bilinen çesitli yöntemlerin herhangi biri kullanilarak ölçülebilir olmak zorundadir. Dahasi, burada bir çok-degerlikli proteinin, örnegin, çok-degerlikli antikorun, antijen baglama yerlerinin her birinin antijen baglama afinitesinin kantitatif olarak ayni olmasi gerekmez. r. Insan Antikoru Burada kullanildigi sekliyle, "insan antikoru", insan germ-hatti immünoglobülin dizilerinden türetilen degisken ve sabit bölgelere sahip olan antikorlari içerebilir.
Bulusun insan antikorlari, insan germ-hatti immünoglobülin dizileri tarafindan kodlanmayan amino asit rezidülerini (örnegin, in vitro rastgele veya yer-spesifik mutajenez ile veya in vivo somatik mutasyon ile uygulanan mutasyonlari) içerebilir.
Bununla birlikte, burada kullanildigi sekliyle, "insan antikoru" teriminin, burada bir baska memeli türünün, örnegin, bir farenin, germ-hattindan türetilen CDR dizilerinin insan çerçeve dizileri üzerine grefte edildigi antikorlari içermesi amaçlanmaz. s. Hümanize Antikor hafif zincir degisken bölge dizilerini içeren bir antikoru tarif etmek için burada kullanilir, ancak burada VH ve/veya VL dizisinin en az bir kismi daha "insan-benzeri", yani, insan germ-hatti degisken dizilerine daha benzer, olmasi için degistirilmistir. Bir "hümanize antikor", söz konusu bir antijeni immünospesifik olarak baglayan ve bir insan antikorunun amino asit dizisine büyük ölçüde sahip olan bir çerçeve (FR) bölgesi ve bir insan-olmayan antikorun amino asit dizisine büyük ölçüde sahip olan bir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) içeren bir antikordur veya bunun bir varyantidir, türevidir, analogudur veya fragmanidir. Burada kullanildigi sekliyle, bir CDR baglaminda "büyük ölçüde" terimi, bir insan-olmayan antikor CDR'sinin amino asit dizisine en az %80, en dizisine sahip olan bir CDR'yi ifade eder. Bir hümanize antikor, burada CDR bölgelerinin tümünün veya büyük ölçüde tümünün bir insan-olmayan immünoglobülininkilere (yani, donör antikorunkine) karsilik geldigi ve çerçeve bölgelerinin tümünün veya büyük ölçüde tümünün bir insan immünoglobülin konsensüs dizisininkiler oldugu, en az bir ve tipik olarak iki degisken alanin (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) büyük ölçüde tümünü içerir. Bir uygulamada, bir hümanize antikor ayrica, bir immünoglobülin sabit bölgesinin (Fc), tipik olarak bir insan immünoglobülininin, en azindan bir kismini da içerir. Bazi uygulamalarda, bir hümanize antikor, hem hafif zinciri hem de bir agir zincirin en azindan degisken alanini içerir. Antikor ayrica, agir zincirin CH1, mentese, CH2, CH3 ve CH4 bölgelerini de içerebilir. Bazi uygulamalarda, bir hümanize antikor yalnizca, bir hümanize hafif zincir içerir. Bazi uygulamalarda, bir hümanize antikor yalnizca, bir hümanize agir zincir içerir. Spesifik uygulamalarda, bir hümanize antikor yalnizca, bir hafif zincirin ve/veya bir agir zincirin bir hümanize degisken alanini içerir.
Bir hümanize antikor, immünoglobülinlerin, IgM, IgG, IgD, IgA ve IgE'yi içeren herhangi bir sinifindan ve sinirlandirma olmaksizin, IgG1, IgG2, IgGS ve IgG4'ü içeren herhangi bir izotipten seçilebilir. Bir hümanize antikor, birden fazla siniftan veya izotipten diziler içerebilir ve özel sabit alanlar teknikte iyi-bilinen teknikler kullanilarak arzu edilen efektörfonksiyonlari optimize etmek için seçilebilir.
Bir hümanize antikorun çerçeve bölgelerinin ve CDR'Ierin, parental dizilere kesin bir sekilde karsilik gelmesi gerekmez, örnegin, donör antikor CDR'si veya konsensüs çerçevesi, en az bir amino asit rezidüsünün sübstitüsyonu, içeri yerlestirilmesi ve/veya silinmesi ile mutajenize edilebilir, böylece bu yerdeki CDR veya çerçeve rezidüsü donör antikora veya konsensüs çerçeveye karsilik gelmez. Tercih edilen bir uygulamada, bu tarz mutasyonlar, bununla birlikte, genis çapli olmayacaktir. Genel olarak, hümanize antikor rezidülerinin en az %80'i, tercihen en az %85'i, daha tercihen en az %90'i ve en tercihen en az %95'i parental FR ve CDR dizilerininkine karsilik gelecektir. Burada kullanildigi sekliyle, "konsensüs çerçevesi" terimi, konsensüs immünoglobülin dizisi içindeki çerçeve bölgesini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle, "konsensüs immünoglobülin dizisi" terimi, ilgili immünoglobülin dizilerinin bir familyasinda en sik bulunan amino asitlerden (veya nükleotidlerden) olusturulan diziyi ifade eder (bakiniz, örnegin, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Bir bir "konsensüs CDR'si'* içerebilir. Immünoglobülinlerin bir familyasinda, konsensüs dizisi içindeki her bir pozisyon, familya içinde bu pozisyonda en sik bulunan amino asit tarafindan mesgul edilir. Iki amino asit esit siklikta bulundugunda, ikisinden biri konsensüs dizisine dahil edilebilir. t. Özdes veya özdeslik Iki veya daha fazla polipeptit veya polinükleotid dizisi baglaminda, burada kullanildigi sekliyle, "özdes" veya "özdeslik", dizilerin bir belirtilen bölge boyunca ayni olan rezidülerin belirli bir yüzdesine sahip oldugu anlamina gelebilir. Yüzde, iki diziyi optimal olarak hizalama, iki diziyi belirtilen bölge boyunca karsilastirma, eslesmis pozisyonlarin sayisini elde etmek için burada her iki dizide bulunan özdes rezidünün eslesmis pozisyonlarinin sayisini belirleme ve dizi özdesliginin yüzdesini elde etmek için sonucu 100 ile çarpma ile hesaplanabilir. Burada iki dizinin farkli uzunluklarda oldugu veya hizalamanin bir veya birden fazla yapiskan uç ürettigi ve karsilastirmanin belirtilen bölgesinin yalnizca bir tek dizi içerdigi durumlarda, tek zincirin rezidüleri paydaya dahil edilir, ancak hesaplamanin payina dahil edilmez.
Burada kullanildigi sekliyle, "izole edilmis polinükleotid", bunun orijini nedeniyle, izole edilmis polinükleotidin, "izole edilmis polinükleotid'in" dogada bununla birlikte bulundugu bir polinükleotidin tümü veya bir kismi ile iliskili olmadigi, dogada bagli olmadigi bir polinükleotide; operatif olarak bagli oldugu; veya daha büyük bir dizinin parçasi olarak dogada bulunmadigi, bir polinükleotid (örnegin, genomik, cDNA veya sentetik orijinli veya bunlarin bir kombinasyonu) anlamina gelebilir. v. Etiket ve Saptanabilen Etiket Burada kullanildigi sekliyle, "etiket" ve "saptanabilen etiket", antikor ve analit arasindaki reaksiyonu saptanabilen hale getirmek için bir antikora ve bir analite tutturulmus bir kismi ifade eder ve bu sekilde etiketlenmis antikor veya analit, "saptanabilen bir sekilde etiketlenmis" olarak ifade edilir. Bir etiket görsel veya aygitsal araçlar ile saptanabilen bir sinyal üretebilir. Çesitli etiketler, sinyal-üreten maddeleri, örnegin, kromogenleri, flüoresan bilesikleri, kemilüminesan bilesikleri, radyoaktif bilesikleri ve benzerlerini içerir. Etiketlerin temsili örnekleri, isik üreten kisimlari, örnegin, akridiniyum bilesiklerini ve flüoresans üreten kisimlari, örnegin, floreseini içerir. Diger etiketler burada tarif edilir. Bu baglamda, kisim, kendi basina, saptanabilen bir madde olmayabilir, ancak daha baska bir kisim ile reaksiyona üzerine saptanabilen hale gelebilir. "Saptanabilen bir sekilde etiketlenmis" teriminin kullaniminin, bu tarz etiketlemeyi kapsamasi amaçlanir.
Teknikte bilindigi üzere herhangi bir uygun saptanabilen etiket kullanilabilir. Örnegin, enzimatik etiket (örnegin, yaban turpu peroksidazi, alkalin peroksidaz, glikoz 6-fosfat dehidrojenaz ve benzerleri), bir kemilüminesan etiket (örnegin. akridinyum esterleri, tiyoesterler veya sülfonamidler; Iüminol, izolüminol, fenantridinyum esterleri ve benzerleri), bir flüoresan etiket (örnegin, floresein (örnegin, 5-fl0resein, 6- karboksifloresein, 3'6-karboksifloresein, 5(6)-karboksifloresein, 6-hekzakl0r0-floresein, 6-tetraklorofloresein, floresein izotiyosiyanat ve benzerleri)), rodamin, fikobiliproteinler, R-fikoeritrin, kuantum noktalari (örnegin, çinko sülfit-baslikli kadmiyum selenid), bir termometrik etiket veya bir immüno-polimeraz zincir reaksiyonu etiketi, olabilir.
Etiketlerin bir uygulamasi, etiketleme prosedürleri ve etiketlerin saptanmasi, Polak ve Van Noorden, Introduction to lmmunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997) kaynaginda ve Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon tarafindan yayimlanan bir birlestirilmis eI-kitabi ve katalog olan Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996) kaynaginda bulunur. Bir flüoresan etiket, FPIA'da ,352,803 Numarali U.S. Patentleri).
Bir akridinyum bilesigi, bir homojen kemilüminesan analizde bir saptanabilen etiket olarak kullanilabilir (bakiniz, örnegin, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: Bir yönünde, akridinyum bilesigi, bir akridinyum-9-karboksamiddir. Akridinyum 9- karboksamidler hazirlamak için yöntemler, Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107- Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Bir akridinyum bilesiginin bir baska örnegi, bir akridinyum-9-karb0ksilat aril esterdir.
Formül Il'nin bir akridinyum-Q-karboksilat aril esterinin bir örnegi, 10-metII-9- (fenoksikarbonil)akridinyum florosülfonattir (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, firmasinda mevcuttur). Akridinyum 9-karboksilat aril esterleri hazirlamak için yöntemler, Numarali U.S. Patenti kaynaklarinda tarif edilir.
Bu tarz akridinyum-9-karboksilat aril esterleri, sinyalin yogunlugu ve/veya sinyalin çabuklugu açisindan en az bir oksidaz tarafindan bir analitin oksidasyonundan üretilen hidrojen peroksit için etkili kemilüminesan indikatörlerdir. Akridinyum-9-karb0ksilat aril ester için kemilüminesan emisyon süreci çabucak, yani, 1 saniye içinde, tamamlanirken, akridinyum-9-karboksamid kemilüminesan emisyonu 2 saniyenin üstünde uzar. Akridinyum-9-karboksilat aril esteri, bununla birlikte, protein varliginda bunun kemilüminesan özelliklerini kaybeder. Bundan dolayi, bunun kullanimi, sinyal üretimi ve saptanmasi sirasinda, proteinin yoklugunu gerektirir. Örnek içindeki proteinleri ayirmak veya uzaklastirmak için yöntemler, teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinir ve bunlarla sinirli kalmama kaydiyla, ultrafiltrasyonu, ekstraksiyonu, presipitasyonu, diyalizi, kromatografiyi ve/veya sindirmeyi içerir (bakiniz, örnegin, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). Test örneginden uzaklastirilan veya ayrilan proteinin veya yaklasik %95 olabilir. Akridinyum-9-karb0ksilat aril esterine ve bunun kullanimina Basvurusu'nda izah edilir. Akridinyum-9-karboksilat aril esterleri, herhangi bir uygun çözücü, örnegin, gazindan arindirilmis anhidröz N,N-dimetilformamid (DMF) veya sulu sodyum kolat, içinde çözünebilir. w. Baglama Dizisi ve Baglama Peptidi Dizisi polipeptit dizisine baglanmis bir dogal veya yapay polipeptit dizisini (örnegin, tam-boy, fragmanlar, vb.) ifade eder. “Baglanmis” terimi, baglama dizisini söz konusu polipeptit dizisine birlestirmeyi ifade eder. Bu tarz polipeptit dizileri tercihen, bir veya birden fazla peptit bagi ile birlestirilir. Baglama dizileri, yaklasik 4 ila yaklasik 50 amino asit araliginda bir uzunluga sahip olabilir. Tercihen, baglama dizisinin uzunlugu, yaklasik 6 ila yaklasik 30 amino asit araligindadir. Dogal baglama dizileri, yapay baglama dizileri olusturmak için amino asit sübstitüsyonlari, eklenmeleri veya silinmeleri ile modifiye edilebilir. Emsal baglama dizileri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, asagidakileri içerir: (i) Histidin (His) etiketleri, örnegin, HHHHHH olan bir amino asit dizisine (SEQ lD NO: , söz konusu polipeptitlerin ve antikorlarin izolasyonunu ve saflastirilmasini kolaylastirmak için baglama dizileri olarak kullanislidir; (ii) Enterokinaz klevaj yerleri, His etiketleri gibi, söz konusu proteinlerin ve antikorlarin izolasyonunda ve saflastirilmasinda kullanilir. Siklikla, enterokinaz klevaj yerleri, söz konusu proteinlerin ve antikorlarin izolasyonunda ve saflastirilmasinda His etiketleri ile birlikte kullanilir. Çesitli enterokinaz klevaj yerleri teknikte bilinir.
Enterokinaz klevaj yerlerinin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, DDDDK amino asit dizisini (SEQ ID NO: 149) ve bunun türevlerini (örnegin, ADDDDK (SEO ID NO: 150), vb.) içerir; (iii) Muhtelif diziler, tek zincirli degisken bölge fragmanlarinin hafif ve/veya agir zincir degisken bölgelerini birlestirmek veya baglama için kullanilabilir. kaynaklarinda bulunabilir. Baglama dizileri ayrica, ilave fonksiyonlar, örnegin, ilaçlarin tutturulmasi veya kati desteklere tutturma, için de modifiye edilebilir. Mevcut açiklama baglaminda, monoklonal antikor, örnegin, bir baglama dizisi, örnegin, bir His etiketi, bir enterokinaz klevaj yeri veya her ikisini de, içerebilir. x. Çok-degerlikli Baglama Proteini burada "antijen baglama alanlari“ olarak da ifade edilir) içeren bir baglama proteinini ifade etmek için burada kullanilir. Bir çok-degerlikli baglama proteinine tercihen, üç veya daha fazla antijen baglama yerine sahip olmasi için mühendislik uygulanir ve bu genel olarak bir dogal olusumlu antikor degildir. "Multispesifik baglama proteini" terimi, ayni hedef molekülün iki veya daha fazla farkli epitopunu baglayabilen bir baglama proteinini içeren, iki veya daha fazla ilgili veya ilgisiz hedefi baglayabilen bir baglama proteinini ifade eder. y. Önceden-Belirlenmis Kesim-Degeri ve Önceden-Belirlenmis Düzey önceden-belirlenmis kesim-degerine/düzeyine karsi analiz sonuçlarini karsilastirma ile tanisaI/prognostik/terapötik etkinlik sonuçlarini degerlendirmek için kullanilan bir analiz kesim-degerini ifade eder, burada önceden-belirlenmis kesim-degeri/düzey halihazirda çesitli klinik parametrelere (örnegin, hastaligin siddetine, progresyona/progresyon- olmamasina/iyilesmeye, vb.) baglanmistir veya bunlarla iliskilendirilmistir. Mevcut açiklama, emsal önceden-belirlenmis düzeyler saglar. Bununla birlikte, kesim- degerlerinin immünoanalizin dogasina (örnegin, kullanilan antikorlara, vb.) bagli olarak çesitlilik gösterebilecegi iyi-bilinir. ilaveten, buradaki açiklamayi bu açiklamaya göre diger immünoanalizler için immünoanaliz-spesifik kesim-degerleri elde etmek amaciyla diger immünoanalizler için uyarlamak teknikteki birinin normal uzmanliginin içindedir. Önceden-belirlenmis kesim-degerinin/düzeyinin kesin degeri, analizler arasinda çesitlilik gösterebilirken, burada tarif edildigi sekilde korelasyonlar genel olarak uygulanabilir olmalidir. 2. Ön-Muamele Reaktifi Burada tarif edildigi üzere bir tanisal analizde kullanildigi üzere, "ön-muamele reaktifi", örnegin, Iizis, presipitasyon ve/veya çözündürme reaktifi, bir test örnegi içinde bulunan herhangi bir hücreyi lize eden ve/veya herhangi bir analiti çözündüren bir reaktiftir. Ön- muamele, burada ilaveten tarif edildigi üzere, tüm örnekler için gerekli degildir. Diger seyler arasinda, analiti (yani, RGMa'yi (örnegin, membran-iliskili RGMa'yi, çözünebilen RGMa'yi, membran-iliskili RGMa'nin fragmanlarini, çözünebilen RGMa'nin fragmanlarini, RGMa'nin (membran-iliskili veya çözünebilen RGMa'nin) fragmanlarini veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu) çözündürme analitin, örnek içinde bulunan herhangi bir endojen baglama proteininden salimini zorunlu kilar. Bir ön- muamele reaktifi, homojen olabilir (bir ayirma adimi gerektirmez) veya heterojen olabilir (bir ayirma adimi gerektirir). Bir heterojen ön-muamele reaktifinin kullanimi ile, burada analizin sonraki adimina ilerlemeden önce test örneginden herhangi bir çökeltilmis analit baglama proteininin uzaklastirilmasi vardir. Ön-muamele reaktifi opsiyonel olarak asagidakileri içerebilir: (a) bir veya birden fazla çözücü ve tuz, (b) bir veya birde fazla çözücü, tuz ve deterjan, (c) deterjan, (d) deterjan ve tuz veya (e) hücre Iizisi ve/veya analitin çözündürülmesi için uygun olan herhangi bir reaktif veya reaktiflerin kombinasyonu.
Burada tarif edilen immünoanalizler ve kitler baglaminda "kalite kontrol reaktifleri", bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kalibratörleri, kontrolleri ve duyarlilik panellerini içerir. Bir "kalibratör" veya "standart" (örnegin, bir veya çok, örnegin, birden fazla) tipik olarak, bir analitin, örnegin, bir antikorun veya bir analitin, konsantrasyonunun ara- degerlemesi için kalibrasyon (standart) egrileri olusturmak amaciyla kullanilir. Alternatif olarak, bir önceden-belirlenmis pozitif/negatif kesim-degerine yakin olan bir tek kalibratör, kullanilabilir. Çok sayida kalibratör (yani, birden fazla kalibratör veya bir çesitlilik gösteren miktardaki kalibratör (kalibratörler), bir "duyarlilik paneli" içermesi amaciyla baglantili olarak kullanilabilir. bb. Rekombinant Antikor ve Rekombinant Antikorlar antikorun tümünü veya bir parçasini kodlayan nükleik asit dizilerini rekombinant teknikler ile uygun bir ekspresyon vektörüne klonlamayi ve bunu takiben antikoru uygun bir konak hücre içinde eksprese etmeyi içeren, bir veya birden fazla adim ile hazirlanan antikorlari ifade eder. Terimler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, rekombinant olarak üretilen monoklonal antikorlari, kimerik antikorlari, hümanize antikorlari (tam olarak veya parsiyel olarak hümanize), antikor fragmanlarindan olusturulan multispesifik veya çok-degerlikli yapilari, bifonksiyonel antikorlari, heterokonjugat Ab'leri, DVD-Ig®'leri ve burada (i)'de tarif edildigi üzere diger antikorlari içerir (Ikili-degisken alanli immünoglobülinler ve bunlari yapmak için yöntemler, Wu, C. kullanildigi sekliyle, "bifonksiyonel antikor“ terimi, bir antijen yeri için bir özgüllüge sahip olan bir birinci kolu ve bir farkli antijenik ter için bir özgüllüge sahip olan bir ikinci kolu içeren bir antikoru ifade eder, yani, bifonksiyonel antikorlar, bir ikili özgüllüge sahiptir. cc. Örnek, Test Örnegi ve Hasta Örnegi kullanilabilir. Örnek, örnegin, bir idrar, serum, plazma, amniyotik sivi, beyin-omurilik sivisi, plasental hücreler veya doku, endotelyal hücreler, Iökositler veya monositler örnegi bir hastadan elde edildigi sekilde dogrudan kullanilabilir veya bunlara burada tarif edildigi sekilde veya teknikte bilindigi üzere baska sekilde örnegin karakterini modifiye etmek için, örnegin, filtrasyon, distilasyon, ekstraksiyon, konsantrasyon, sentrifügasyon, araya-giren bilesenlerin inaktivasyonu, reaktiflerin eklenmesi ve benzeri ile ön-muamele edilebilir. dd. Bir Dizi Kalibre Etme Bilesimi birden fazla bilesimi ifade eder, burada bilesimlerin her biri Cys-CRGMa'nin konsantrasyonu açisindan dizi içindeki diger bilesimlerden farklilik gösterir. ee. Kati Faz herhangi bir materyali ifade eder. Kati faz, bunun bir yakalama ajanina saldirmasina ve bunu immobilize etmesine yönelik içsel yetisi seçilebilir. Alternatif olarak, kati faz, yakalama fazina saldirmaya ve bunu immobilize etmeye yönelik yetiye sahip olan buna eklenmis bir baglama ajanina sahip olabilir. Baglama ajani, örnegin, yakalama ajaninin kendisi açisindan veya yakalama ajanina konjuge edilmis bir yüklü madde açisindan zit yüklü olan bir yüklü maddeyi, içerebilir. Genel olarak, baglama ajani kati faz üzerinde immobilize edilen (buna tutturulan) ve bir baglama reaksiyonu yoluyla yakalama ajanini immobilize etme yetisine sahip olan (tercihen spesifik) herhangi bir baglama partneri olabilir. Baglama ajani, analizin gerçeklestirilmesinden önce veya analizin gerçeklestirilmesi sirasinda yakalama ajaninin bir kati faz materyali dolayli baglamasina olanak saglar. Kati faz, örnegin, bir test tüpünü, mikro-titre gözü, kagidi, bilyeyi, mikro-parçacikli çipi ve teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinen diger konfigürasyonlari içeren, örnegin, plastik, türevlendirilmis plastik, manyetik veya manyetik-olmayan metal, cam veya silikon, olabilir. ff. Spesifik Baglama Burada kullanildigi sekliyle, "spesifik baglama" veya "spesifik olarak baglama", bir antikorun, bir proteinin veya bir peptidin bir Ikinci kimyasal tür ile etkilesimini ifade edebilir, burada etkilesim, kimyasal tür üzerinde bir özel yapinin (örnegin, bir antijenik belirleyicinin veya epitopun) varligina dayanir; örnegin, bir antikor genel olarak proteinlerden ziyade bir spesifik protein yapisini tanir ve baglar. Bir antikor epitop (veya serbest, etiketlenmemis A) içeren bir molekülün varligi antikora baglanmis etiketlenmis A'nin miktarini düsürecektir. gg. Spesifik Baglama Partneri baglama çifti, kimyasal veya fiziksel araçlar yoluyla birbirini spesifik olarak baglayan iki farkli molekülü içerir. Bundan dolayi, yaygin immünoanalizlerin antijen ve antikor spesifik baglama çiftlerine ek olarak, diger spesifik baglama çiftleri biyotini ve avidini (veya streptavidini), karbonhidratlari ve Iektinleri, komplementer nükleotid dizilerini, efektör ve reseptör moleküllerini, kofaktörleri ve enzimleri, enzimleri ve enzim inhibitörlerini ve benzerlerini içerebilir. ilaveten, spesifik baglama çiftleri, orijinal spesifik baglama üyelerinin analoglari olan üyeleri, örnegin, bir analit-analogunu, içerebilir.
Immünoreaktif spesifik baglama üyeleri, antijenleri, antijen fragmanlarini ve monoklonal ve poliklonal antikorlari içeren antikorlari ayni zamanda kompleksleri ve bunlarin fragmanlarini, izole edilmis veya rekombinant olarak üretilmis içerir. hh. Sert Kosullar i'Sert kosullar", filtreye-bagli DNA'ya 6x sodyum klorür/sodyum sitrat (SSC) içinde içinde bir veya birden fazla yikamayi tarif etmek için burada kullanilir. "Hayli yüksek- sertlikteki kosullar" terimi, filtreye-bagli nükleik aside 6x 880 içinde yaklasik 45°C'de hibridizasyonu, akabinde bir O,1xSSC/%O,2 SDS, içinde yaklasik 68°C'de bir veya birden fazla yikamayi veya diger sert hibridizasyon kosullari altini ifade eder. Bakiniz, örnegin, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. ii. Tedavi Etmek, Tedavi Etme veya Tedavi uygulandigi, bir hastaligin veya bu tarz hastaligin bir veya birden fazla semptomunun progresyonunu tersine çevirmeyi, hafifletmeyi veya inhibe etmeyi tarif etmek için burada birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilir. Süjenin rahatsizligina bagli olarak, terim ayrica bir hastaligi önlemeyi de ifade eder ve bir hastaligin baslamasini önlemeyi veya bir hastalik ile iliskili semptomlari önlemeyi içerir. Bir tedavi, bir akut veya kronik sekilde gerçeklestirilebilir. Terim ayrica, hastaliktan etkilenmeden önce bir hastaligin veya bu tarz hastalik ile iliskili semptomlarin siddetini azaltmayi da ifade eder.
Etkilenmeden önce bir hastaligin bu tarz önlenmesi veya siddetinin azaltilmasi, uygulama zamaninda hastaliktan etkilenmemis olan bir süjeye mevcut bulusun bir antikorunun veya farmasötik bilesiminin uygulanmasini ifade eder. "Önleme" ayrica, bir hastaligin veya bu taiz hastalik ile iliskili bir veya birden fazla semptomun reküransini önlemeyi de ifade eder. "Tedavi" ve "terapötik olarak", yukarida "tedavi etme" teriminin tanimlandigi gibi, tedavi etme eylemini ifade eder. jj. Izleyici Burada kullanildigi sekliyle, "izleyici" bir etikete konjuge edilmis bir analiti veya analit fragmanini, örnegin, bir floresein kismina konjuge edilmis Cys-CRGMa'yi, ifade eder, burada etikete konjuge edilmis analit, analite spesifik bir antikor üzerindeki yerler için analit ile etkili bir sekilde rekabete girebilir. kk. Varyant ile amino asit dizisinde farklilik gösteren, ancak en az bir biyolojik aktiviteyi muhafaza eden bir peptidi veya polipeptidi tarif etmek için burada kullanilir. "Biyolojik aktivite'nin" temsili örnekleri, bir spesifik antikor tarafindan baglanma veya bir immün yaniti tesvik etme yetisini içerir. Varyant ayrica, en az bir biyolojik aktiviteyi muhafaza eden bir amino asit dizisi olan bir referanslanmis proteine büyük ölçüde özdes olan bir amino asit dizisi olan bir proteini tarif etmek için de burada kullanilir. Bir amino asidin bir konservatif sübstitüsyonu, yani, bir amino asidi benzer özellikleri (örnegin, hidrofilisitesi, yüklü bölgelerin derecesi ve dagilimi) olan farkli bir amino asit ile degistirme, tipik olarak bir minör degisimi içerdigi üzere teknikte bilinir. Bu minör degisimler, kismen, teknikte anlasildigi üzere, amino asitlerin hidropatik indeksini göz önünde bulundurma hidropatik indeksi, bunun hidrofobisitesinin ve yükünün bir degerlendirmesine dayanir.
Benzer hidropatik indeksleri olan amino asitlerin sübstitüe edilebildigi ve hala protein fonksiyonunu muhafaza ettigi teknikte bilinir. Bir yönünde, ±2'lik hidropatik indekslere sahip olan amino asitler sübstitüe edilir. Amino asitlerin hidrofilisitesi ayrica, biyolojik fonksiyonu muhafaza eden proteinler ile sonuçlanacak olan sübstitüsyonlari ortaya çikarmak için de kullanilabilir. Bir peptit baglaminda amino asitlerin hidrofilitesinin bir degerlendirmesi, bu peptidin en büyük lokal ortalama hidrofilitesinin hesaplanmasina izin verir, bu antijenisite ve immünojenisite ile iyi korele oldugu bildirilmis olan yararli bir ölçümdür. 4,554,101 Numarali U.S. Patenti.
Benzer hidrofilisite degerlerine sahip olan amino asitlerin sübstitüsyonu, teknikte anlasildigi üzere, biyolojik aktiviteyi, örnegin, immünojenisiteyi, muhafaza eden peptitler ile sonuçlanabilir. Substitüsyonlar, birbirinin ±2'si içinde olan hidrofilisite degerlerine sahip olan amino asitler ile gerçeklestirilebilir. Amino asitlerin hem hidrofobisite indeksi hem de hidrofilisite degeri, bu amino asidin özel yan zincirinden etkilenir. Bu gözlem ile uyumlu olarak, biyolojik fonksiyon ile uyumlu olan amino asit sübstitüsyonlarinin, hidrofobisite, hidrofilisite, yük, boyut ve diger özellikler ile ortaya çikarildigi üzere, amino asitlerin bagil benzerligine ve özellikle bu amino asitlerin yan zincirlerine, bagli oldugu anlasilir. "Varyant" ayrica, amino asit dizisi açisindan anti- RGMa antikorunun karsilik gelen fragmanindan farklilik gösteren ancak yine de antijenik olarak reaktif olan ve RGMa ile baglama için anti-RGMa antikorunun karsilik gelen fragmani ile rekabet edebilen bir anti-RGMa antikorunun bir antijenik olarak reaktif fragmanini ifade etmek için de burada kullanilabilir. "Varyant" ayrica, diferansiyel bir sekilde, örnegin, proteoliz, fosforilasyon veya baska post-translasyonel modifikasyon ile, islenmis olan, yine de bunun antijen reaktivitesini muhafaza eden bir polipeptidi veya bunun bir fragmanini tarif etmek için de kullanilabilir. ll. Vektör molekülünü tarif etmek için burada kullanilir. Vektörün bir tipi, bunun içine ilave DNA segmentlerinin baglanabildigi bir dairesel çift-sarmalli DNA kivrimini ifade eden bir viral genom içine baglanabilir. Belirli vektörler (örnegin, bir bakteriyel replikasyon orijinine sahip olan bakteriyel vektörler ve epizomal memeli vektörleri), içine bunlarin uygulandigi bir konak hücre içinde otonom bir sekilde kopyalayabilir. Diger vektörler (örnegin, epizomal-olmayan memeli vektörleri), konak hücre içine uygulama üzerine bir konak hücrenin genomuna entegre edilebilir ve böylece konak genomu ile birlikte kopyalanabilir. Dahasi, belirli vektörler, bunlarin operatif olarak baglanmis oldugu genlerin ekspresyonunu yönlendirebilir. Bu tarz vektörler burada "rekombinant ekspresyon vektörleri" (veya basit bir sekilde, "ekspresyon vektörleri") olarak ifade edilir. Genel olarak, Rekombinant DNA tekniklerinde yararlanilan ekspresyon vektörleri siklikla, plazmidler formundadir. "Plazmid" veya "vektör", plazmid vektörün en yaygin sekilde kullanilan formu oldugundan, birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilabilir.
Bununla birlikte, ekspresyon vektörlerinin diger formlari, örnegin, es-deger fonksiyonlar veren viral vektörler (örnegin, replikasyon kusurlu retrovirüsler, adenovirüsler ve adeno- iliskili virüsler) kullanilabilir. Bu baglamda. vektörlerin (RNA viral vektörleri içeren) RNA versiyonlari da mevcut açiklamanin baglaminda kullanim alani bulabilir.
Burada sayisal araliklarin nakledilmesi için, ayni kesinlik derecesi ile burada aradaki her bir araya-giren sayi açik bir sekilde göz önünde bulundurulur. Örnegin, 6-9 araligi için, 6'ya ve 9'de ek olarak 7 ve 8 sayilari göz önünde bulundurulur ve 6,0-7,0 araligi önünde bulundurulur. 2. Anti-RGMa Antikorlari Nörit dejeneratif hastaliklari ve bozukluklari tedavi etmenin yöntemlerinde kullanim için antikorlar burada saglanir. Burada tarif edilen antikorlarin bir kaçi, RGMa'yi baglamak için seçilmis iken, Itici Yönlendirme Molekülü c ("RGMC") ile reaktivite minimuma indirilir veya elimine edilir. Örnegin, bakiniz, Tablo 4, burada PROfusion-kaynakli monoklonal olmadan RGMa nötralize etme aktivitesi gösterir. RGMa'ya karsi ortaya çikan antikorlar siklikla RGMc ile çapraz-reaksiyona girebileceginden ve yüksek intravenöz dozlarda hepatositlerde demir birikmesi ile sonuçlanabildiginden, RGMa için burada tarif edilen antikorlarin spesifik baglamasinin terapötik yarari vardir. ilaveten, bu antikorlarin yüksek selektivitesi, tedavi Için genis terapötik doz pencereleri veya araliklari sunar. 47 amino asitlik bir tahmin edilen N-ucu sinyal peptidi ve bir C-ucu GPI-tutturma sinyali olan bir 450 amino asitlik protein olarak var olabilen insan RGMa'sinin ilk olarak, neogenini, ayrica, nöronal gelisimde ve hücre sag kaliminda bir rol oynayan salgilanmis moleküller olan netrinler için bir reseptör de olan bir transmembran proteinini, saglama ile retinal aksonlarin yönlendirilesini regüle ettigi önerilmistir. Retinal aksonal yönlendirmeyi regüle etmeye ek olarak, RGMa'nin eriskin siçanlarda akson büyümesini inhibe ettigi gösterilmistir. Bakiniz, Yamashita et al., Current Opinion in Neurobiology (2007)17:1-6. Bu mekanizmalar ile tutarli olarak, RGMa ekspresyonu omurilige bir yaralamadan sonra artar, bu sirada RGMa'nin inhibisyonu aksonal büyümeyi arttirir. Bakiniz, Kitayama et al., PLoS One, (2011) Vol.6 (9), pages 1-9 ve iskemiden veya travmatik beyin yaralanmasindan muzdarip olan insanlarin lezyon yerinde ve skar dokusunda da yukari-yönde regüle edilir. Bakiniz, Yamashita et al., Current Opinion in Neurobiology (2007)17:1-6; Schwab et al., Arch Neurol RGMa, asagidaki amino asit dizisine sahip olabilir: HQPPR FR! \`\' TUR -\(.\\ `-.l('i\l(i Rhuikh `il (iF `A PTI -\FI l("5 FP& NTNP( 'K1 LK('.\SL[^\\ SA. [SGSHÂ PASDD'I'PLH' .\.\LR>Y.\L('I RRI.\R1('R(›D LAYHSAVHGJ FD] MSQHVCH Kl)(iPl`SQPRIV R`I'l PPAUDSQ l-RSI)'\I'FI( `H `i'FKSFHKHRA ('iSAATATSKI TIITK` RGMa, SEQ ID NO: 65'in bir fragmani veya varyanti olabilir. amino asit uzunlugunda olabilir. Fragman, SEO ID NO: 65'ten bir kesintisiz sayida amino asit içerebilir.
RGMa'nin fragmani, asagidaki amino asit dizisine sahip olabilir: SEQ ID NO: 65'in 47- 168 arasindaki amino asitlerine karsilik gelen PCKI LKCNSEFWSA TSGSHA PASDDTPEFC AALRSYALCT RRTARTCRGD LAYHSAVHGI EDLMSQHNCS KDGPTSQPRL RTLPPAGDSQ ERSDSPEICH YEKSFHKHSA TPNYTHCGLF GD (SEQ ID NO: 66). RGMa fragmani, SEQ ID NO: 66'nin bir fragmani olabilir. RGMa fragmani, SEQ ID NO: 66`nin bir varyanti olabilir. RGMa fragmani, asagidaki RGMa dizisine sahip olabilir: PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO:74).
RGMa, bir hücre membranina bagli form olarak ve/veya bir çözünebilen form olarak bulunabilir. b. RGMa - Tanima Antikoru Antikor, RGMa'yi, bunun bir fragmanini veya bunun bir varyantini baglayan bir antikordur. ilaveten, anti-RGMa antikorunun fragmanlarini, bunlarin varyantlari ve türevleri ayni zamanda bir poliklonal veya monoklonal antikor, bir kimerik antikor, bir tek Zincirli antikor, bir afinite matüre edilmis antikor, bir insan antikoru, bir hümanize antikor, bir tam olarak insan antikoru veya bir antikor fragmani, örnegin, bir Fab fragmani veya bunlarin bir karisimi olan bir anti-RGMa antikoru burada tarif edilir.
Antikor fragmanlari veya türevleri, F(ab')2, Fv veya scFv fragmanlari içerebilir. Antikor türevleri, peptidomimetikler ile üretilebilir. ilaveten, tek Zincirli antikorlarin üretilmesi için tarif edilen teknikler, tek zincirli antikorlar üretmek için uyarlanabilir.
Insan antikorlari, faj-gösterim teknolojisinden veya insan immünoglobülin genlerini eksprese eden transgenik farelerden türetilebilir. Insan antikoru, bir insan iri vivo immün yanitinin bir sonucu olarak üretilebilir ve izole edilebilir. Bakiniz, örnegin, Funaro et al., BMC Biotechnology, 2008(8):85. Bundan dolayi, antikor insanin bir ürünü olabilir ve hayvan repertuvari olmayabilir. Bu insan orijinli oldugundan, kendi-antijenlerine karsi reaktivite riski minimuma indirilebilir. Alternatif olarak, standart maya gösterim kütüphaneleri ve gösterim teknolojileri, insan anti-RGMa antikorlarini seçmek ve izole etmek için kullanilabilir. Örnegin, naif insan tek zincirli degisken fragmanlarin (scFv) kütüphaneleri insan anti-RGMa antikorlarini seçmek için kullanilabilir. Transgenik hayvanlar, insan antikorlarini eksprese etmek için kullanilabilir.
Hümanize antikorlar, insan-olmayan türden bir veya birden fazla tamamlayicilik belirleme bölgesine (CDR'ye) ve bir insan immünoglobülin molekülünden çerçeve bölgelerine sahip olan arzu edilen antijeni baglayan insan-olmayan türdeki antikordan elde edilen antikor molekülleri olabilir.
Antikor, bunun teknikte bilinenlere kiyasla farkli biyolojik fonksiyona (fonksiyonlara) sahip olmasi açisindan bilinen antikorlardan ayirt edilebilir. Örnegin, yalnizca bulusun antikorlarini tanima ve RGMa'yi baglama ile degil, bunlar ayrica bir ilave biyolojik aktiviteye, örnegin, nörit dejenerasyonu ile ilgili hastaliklar ile iliskili klinik bulgulari atenüe etme yetisine, sahip olmak ile de karakterize edilir.
Antikor, RGMa'yi spesifik olarak baglayabilir. RGMa-spesifik RGMa antikoru, EQ ID ve 73'ü içerebilir. Antikor, SEQ ID NO: 65'i, SEQ ID NO: 66'yi, SEO ID NO: 74'ü veya bunlarin bir fragmanini veya varyantini baglayabilir. Antikor, yukarida tarif edildigi üzere, bir RGMa polipeptidi veya bir varyanti üzerinde bulunan bir epitopu taniyabilir ve spesifik olarak baglayabilir. Epitop, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74 veya bunlarin bir varyanti olabilir. (1) Antikor Baglama Karakteristikleri Antikor, RGMa'yi (SEO ID NO: 65), SEQ ID NO: 66'yi, SEQ ID NO: 74'ü, bunun bir fragmanini veya bunun bir varyantini immünospesifik olarak baglayabilir ve en az degerine sahiptir. Fragman, SEQ ID NO: 66 veya SEQ ID NO: 74 olabilir.
Antikor, RGMa'yi (SEQ ID NO: 65), SEQ ID NO: 66'yi, SEQ ID NO: 74'ü, bunun bir fragmanini veya bunun bir varyantini immünospesifik olarak baglayabilir ve en az araliginda bir kan (veya ka) degerine sahiptir. Fragman, SEQ ID NO: 66 veya SEQ lD NO: 74 olabilir. (2) Antikor Yapisi (a) Agir Zincir ve Hafif Zincir CDR'leri Antikor, RGMa'yi (SEQ ID NO: 65), SEQ ID NO: 66'yi, SEQ ID NO: 74'ü, bunun bir fragmanini veya bunun bir varyantini Immünospesifik olarak baglayabilir ve Tablo 1'de gösterilen bir degisken agir zincir ve/veya degisken hafif zincir içerebilir. Antikor, RGMa'yi, bunun bir fragmanini veya bunun bir varyantini immünospesifik olarak baglayabilir ve Tablo 1'de de gösterilen agir zincir veya hafif zincir CDR dizilerinin birini veya birden fazlasini içerebilir. Antikorun hafif zinciri, bir kappa zinciri veya bir lamda zinciri olabilir. Örnegin, bakiniz, Tablo 1.
RGMa'yi, bunun bir fragmanini veya bunun bir varyantini immünospesifik olarak baglayan bir antikoru kodlayan bir izole edilmis nükleik asit burada saglanir. Izole edilmis nükleik asit, sert kosullar altinda, Tablo 1'de gösterilen agir zincir veya hafif zincir CDR dizilerini içeren bir antikoru kodlayan nükleik asit molekülüne hibridize olan bir nükleotid dizisi içerebilir.
Tablo 1 Tam Olarak Insan Anti-RGMa Monoklonal Antikorlarinin (AE12-1 ila AE12-8, PROTEIN BÖLGESI SEQ ID NO. DIZI EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA GYTFTSHGI SWVRQAPGQGLDW'MC WlSPYSGNTNYAQKLQGRVTMTTD TSTSTAYMELS SLRSEDTAVYYCAR VGSGPYYYM DVWGQGTLVTVSS AE CDR-H1 2 SHGIS AE CDR-H2 3 WISPYSGNTNYAQKLQG AE CDR-H3 4 VGSGPYYYMDV QSATATQPRSVSGSPGQSVTISCTG TSSSVGDSIVVSVVYQQHPGK APK LMLYDVTKRPSGVPDRFSGSKSG NIASL'I'ISGLQAEDEADYYCCSY AGTD'J`Ll<`GGG'JKV'I'VL AE CDR-L1 6 TGTSSSVGDSIYVS AE CDR-L2 7 DVTKRPS PROTEIN BÖLGESI AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 SEQ ID NO. DIZI 111517 CSYAGTDTL EVQLVQSGAEVKKPGASVKVS(` KASGYTFTSYD[NWVRQATGQG LE“MGWMNPN SON TGYAQKFQ GRVIM l`RI\ l`SlS'l`AY MtLSSLRSE DTAVY YCARSTSLS \" W (j QG'l`LVT WMNPNSGNTGYAQKFQG SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD KLGDKYAÇWYQQKPGQSPV LV 1 Y QDSKRPSG IPKRFSGSN SG DTA'I'L'I' FGPGTKVTVI, SGDKLGDKYAC QDSKRPS QAW DSSTGV EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCA ASGFI FDD YAMHW VRQAPG KÜL EWVAVISY DGSN KY YADSVKGR FTISRDN SKNTLYLQMN SLKAED PROTEIN BÖLGESI AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 SEQ ID NO. DIZI 19 VISYDGSNKYYADSVKG ERVYSSGKEGYYYGMDV QSGLTQPPSVSAAPGQRVTISCTU SGSNIGAGYGVHWYQQLPA'I'APK lLl YGDYNRPSQVPDRFSGSRSG'I'S LRGVTTGGGTKITVI, 22 TGSGSNIGAGYGVH 23 GDYNRPS 24 QSYDNSLRGVL EVQLVESGGGVVQPGTSL RLS CAASG FPFSSYGMHW VRQAPGKGLEWVAAISG DGILKYYTDSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNNLSGEDTG LYYCARN YDI\ SLDY WGQGTL 28 SYG MH 27 AISGDGILKYYTDSVKG 28 NYDNSLDY QPVT.TQSPSVSASTGASVKV TCTLSSGHSAYAIAWHQQQP EKGPRYLMKYNSDGSHNK GDGVPDRFSGSSSGAERYL PGIRVEGGG'IKLTVL PROTEIN BÖLGESI AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 SEQ ID NO. DIZI TLSSGHSAYAIA VNSDGS H NKG D QTWGPGIRV EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK VSGHSLSELTIHWVRQAPGKGLEW MGGFDPtDGRGl'YAPNERGRVTM YCA'IL LGL-'YDSYI'DLWG RG I`L\-”I`\-` GFDPEDGRGTYAPNFRG LLGEYDSYFDL DV\`MTQSPDFQSVTPEDKVTITCR ASQSIGSCLHWYQQKPDQSPKLLI KYASQSISUVPSRUSGSGSGTDFTL TINSLEAFDAATYYCI IQSSSU'YT FGQGTKLEIK RASQSIGSCLH HQSSSLPYT EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YI l"INYDI/\W\='R().i\P(iQ(iL EWMGWM NPDSGXTGFVQKFKGRVTATSNTDITT DLDHWGQGTL VTVSS PROTEIN BÖLGESI AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 SEQ ID NO. DIZI WMNPDSGNTGFVQKFKG DRFGSGYDLDH SYELTQ PPSVS\-`APGQ'[`ARI'I`CGGNNIGS KSVIlWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPS(j YCQVWGSSSDI I`i"`v'[<`G'i`G'l`KV'1`\/L GGNNIGSKSVH QVWGSSSDHYV EVQT ,VE SGGGI ,VQPGGSTRI SCAA SGF TSS SYA MT“VRQA PGKGLE\VVSGIS GS GESTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MN SLRVEDTAJYYCARQGYGAHDY WG QG'ILVTVSS GISGSGESTYYADSVKG QGYGAHDY QSVLTQPPSAS GTPGQRVTISC SGASSNV G SNRVN WYQQFPGMAPKLLIY SNNQRPSGV PDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC A AWDDSLNGYVFGTGTKVTVL SGASSNVGSNRVN PROTEIN BÖLGESI AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-LZ AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 SEQ ID NO. DIZI AAWDDSLNGYV FVQU ,PSGGGLVKPGGSI.RISCAASGFTFD DYA M H W\-"RQA PG KGLEW VSLI SWDGG STYYADSVKGRPTISRDNSKNSLYLQMN SLRAEDTALYYCAKDIPKVGGYSYGYG ALG Y WGQGI'P \-"'l`\/'SS LISWDGGSTYYADSVKG DIPKVGGYSYGYGALGY SVFITQPPSVSVAPGQTARTTCGGNVIGD Y HCQVWDSGSGH H VFGTGTKVTV L GGNNIGDISVH QVWDSGSGHHV EVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGG SFSGYYWSWIRQPPGKGL EWIGEINHS GS'IN Y N PSLKSRV HS \-'D'[`SK.\QFSLKL SSVTAÄD'IAVY YCARDDGAU Vl-DLW GRGTLVTVSS EINHSGSTNYNPSLKS DDGAGVFDL PROTEIN BÖLGESI AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 SEQ ID NO. DIZI DIQT.TQSPSSI.SASVGDGVTITÜQASQ DISNYLNWYQQKPGKA PKLLIYDASN LETGVPSRFSGSGSGTFFTI .TINNLQPF DFATYYCQQSGNTPWTFGQGTK VEINR QASQDISNYLN DASNLET QQSGNTPWT EVQLVQSG AEVKEPGASVKVSCKA SGY'I'F'IDYY IQWVRQAPGI IGI.li\-\"M GVVINPKTGGTNYLQKFQGRVTMTR DTSTRTAYMELSSLRSDDTAFYYCV RED MNTVLATSWFDPWGQGTLVTV SS WINPKTGGTNYLQKFQG EDMNTVLATSWFDP SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGNQ LUHKl-`AS\\› YQQKPGQSPV\-V1YJ:`D KKRPSGlPtRFSGSNSGN'I`A'1`L'I`ISG SGNQLGHKFAS EDKKRPS QVW DVITDHW PROTEIN BÖLGESI AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 SEQ ID NO. DIZI FVQLVQSGSFVKKPGASVKISCKT SGYTFTNSAIHWVRQAPGQRLEWM D'l'SAS'i`AYNIELSSLRSED'IAVYYCA WAYCGGD(`YSLDYWGQGTLVTVSS WINAGNGNTKYSQKFQG AYCGGDCYSLDY QDTSNYLNWYQQRPG KAPKLLIYDA SNI ,FII'GVPPRFSGDGSGTHFSFTITNV` QPEDVGTYYCQQYDSLPLTFGQGTR lil-ZI KR QASQDISNYLN DASNLET QQYDSLPLT ljVQLLJjSGGDLVRPG USLRLTCEGSG FNFFIQ'H HWV RQAPGKG LEWVASIS SDSVYIYIIADSTKGRFTVSRDNAQDS VFI QMNS 1 .R\-' FIDTAVYYCA RDII ,I .PP LAPHYYYGLDVWGQGTTVTVSS SISSDSNYIYHADSLKG DILLEPLAPHYYYGLDV PROTEIN BÖLGESI SEQ ID NO. DIZI AE 119 AE CDR-L1 AE CDR-L2 AE CDR-L3 AE CDR-H1 AE CDR-H2 AE CDR-H3 AE 127 AE CDR-L1 AE CDR-L2 DIQVTQSPSSLSASVG DRVTITCRAS QPIS'l'Y\-"N\\v"'YQQKPGKAPKH ,IYDA STI FIGVPSRISGSGSGTDFTFTISSI#Q PEDIATYYCQQYDNFPI .TFGGGTKV RASQPISTYVN DASTLEI QQYDNFPLT GSISGYYW'SWTRQSPGKGI ,FW'IGFI FH TGRTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSL KLS SLTAAD'TAVYYC ARDSAF G SF D YWGQG'l'LV'iVSS EIFHTG RTYYNPSLRS DSAFGSFDY EDISIYLNWYQQRPGKAPKLLIYDA SNLETGVPSRFSGSGSGTDFT FTI SS LQPFDFATYYCQQYIiTYPFTFGGGT QANEDISIYLN DASNLET PROTEIN BÖLGESI SEQ ID NO. DIZI AE CDR-L3 130 QQYHTYPFT AE 131 FVQIQESGPGI.VKPSFTLSLTCNVSG GSISSYYWSWI RQPPGKGI EWIGNIYY SGSTNYNPSLKSRVTISVDT SKS OFSLK LSS VTAADTA\-'YYCARALDFWSGQY FDY WGQG'ILVJ'VSS AE CDR-H1 132 SYYWS AE CDR-H3 134 ALDFWSGQYFDY AE 135 DIVVITQTPSSTSASVGDRVTITCQASQD SGVPSRFSGSGSGTDFTLTJSGLQPEDF ATYYCQQSYS]PPTFGPGTRLEIKR AE CDR-L1 136 QASQDISDYLN AE CDR-L2 137 DASTLES AE CDR-L3 138 QQSYSIPPT Antikor veya bunun varyanti veya türevi, SEQ ID NO.'Iari: 1-64'ün ve 67-73'ün birine amino asit dizisi içerebilir. Antikor veya bunun varyanti veya türevi, SEQ ID NO.'Iari: 1- veya birden fazla nükleik asit dizisi tarafindan kodlanabilir. Polipeptit kimligi ve homolojisi, örnegin, asagidaki raporda tarif edilen algoritma ile, belirlenebilir: Wilbur. W. antikor, bunun varyanti veya türevi, sert kosullar altinda SEQ ID NO.'Iari: 3-42'nin birinin veya birden fazlasinin komplemani ile hibridize olan bir nükleik asit tarafindan kodlanabilir. Burada tarif edilen antikor, bunun varyanti veya türevi, sert kosullar altinda SEQ ID NO.'Iari: 1-64'ün ve 67-73'ün birini veya birden fazlasini kodlayan bir veya birden fazla nükleik asidin komplemani ile hibridize olan bir nükleik asit tarafindan kodlanabilir.
Antikor, SEQ ID NO: 8'i içerebilir, burada SEQ ID NO: 8'in Cys rezidüsü, bir baska amino asit ile sübstitüe edilir. Antikor, SEQ ID NO.'Iari: 1'i ve 5'i veya 2-4'ü ve 6-8'i içerebilir, burada SEQ ID NO: 8'in Cys rezidüsü bir baska amino asit ile sübstitüe edilir veya burada SEQ ID NO: 5'in pozisyon 91'indeki Cys rezidüsü bir baska amino asit ile sübstitüe edilir. SEQ ID NO: 5'in pozisyon 91'indeki Cys rezidüsü, örnegin, bir fenilalanin, bir histidin, bir Iösin, bir valin, bir izolösin, bir lizin veya bir tirozin, ile sübstitüe edilebilir. SEQ ID NO: 8'in Cys rezidüsü, örnegin, bir fenilalanin (bakiniz, SEQ ID NO: 67), bir histidin (bakiniz, SEQ ID NO: 68), bir Iösin (bakiniz, SEQ ID NO: 69), bir valin (bakiniz, SEQ ID NO: 70), bir izolösin (bakiniz, SEQ ID NO: 71), bir lizin (bakiniz, SEQ ID NO: 72) veya bir tirozin (bakiniz, SEO ID NO: 73), ile sübstitüe edilebilir. Bakiniz, Tablo 2.
Antikor, bir IgG, IgE, lgM, lgD, IgA ve lgY molekül sinifi (örnegin, IgG1, lgG2, lgG3, dizisine sahip olan bir IgG1 molekülü olabilir: AS l k(`il'.\.\ I'I'l ÄI)SSl\\IÄ\(i(iI ,~\.~\l (1( lli i`ll) I'Pl PYI \ S“ \."\'(iw\l l`$(i\`ll l I*|'~\\'l UNS (il `t HI .\.\\ \' I '\ I'\.\.\;ll I()| `î I('\\4T\Hkl'.\f\ I k\'l)k|\\ I'I'k\(`l)k I II I( i'i'( 'i'H'I'ßh (il'\\ I LI I'l'kl*l\L) l'L`r1ISR I FLV l('\'\ `i l)\ \IlLL)l'L`\ KI \\\'\ \ D( i\ L\ llhÄlx I &I'RLLU ) \ç I YIM \ 8).] l`i l IIQIW& lM'ilxlN K( k\ <\I\i'\l I'.i\|'ll'Kl ISRÄKGQPIH FOX \ `ll PP* RHzM IK\U\ b_ l(_`[ \ kül YPSIHAN II“ 1 SVDIJPI `J\\ KI'lPPHDSDUSll'l)5l\1.`l'\`l) h\`}{\\ i`)i`l(jl\\ l \`(Ä.\\ \lllL \L|t\li\ lQköLNLNI'Ok I\LII`) IL) \l] Hill sabit bölge dizisinin iki (2) mutasyonunu içerir. Spesifik olarak, bu mutasyonlar, pozisyonlar 234 ve 235'in her birinde lösinden alanine degisimlerdir (bu "LLAA" mutasyonlari olarak ifade edilir). Bu mutasyonlar yukarida koyu renkte ve alti çizili olarak gösterilir. Bu mutasyonlarin amaci, efektör fonksiyonu elimine etmektir.
Alternatif olarak, bir IgG1 molekülü, bir veya birden fazla mutasyon içeren yukaridaki sabit bölge dizisine (SEO ID NO: 140) sahip olabilir. Örnegin, SEQ ID NO: 140'in sabit bölge dizisi, asagida Tablo 2A'da gösterildigi üzere, amino asit 250'de bir mutasyon, burada treonin glutamin ile degistirilir (SEO ID NO: 141), amino asit 428'de bir mutasyon, burada metiyonin Iösin ile degistirilir (SEO lD NO: 142) veya amino asit 250'te mutasyonlar, burada treonin glutamin ile degistirilir ve amino asit 428'de bir mutasyon, burada metiyonin Iösin ile degistirilir (SEO ID NO: 143, içerebilir.
Alternatif olarak, bir IgG1 molekülü asagidakileri içeren bir agir zincir: AE H3 (SEO ID NO: 4) ve asagidakileri içeren bir hafif zincir: AE CDR-L1 (SEO NO: 70) ve asagida Tablo ZB'de gösterildigi üzere SEO lD NO: 143'ün bir sabit dizisini içerebilir (bu antikor, AE12-1 V-OL olarak ifade edilir ve SEO ID NO: 144'ün bir hafif zincir dizisine ve SEO ID NO: 145'in bir agir zincir dizisine sahiptir).
Alternatif olarak, bir IgG1 molekülü asagidakileri içeren bir agir zincir: AE H3 (SEO ID NO: 4) ve asagidakileri içeren bir hafif zincir: AE CDR-L1 (SEO NO: 73) ve asagida Tablo 2B'de gösterildigi üzere SEO ID NO: 143'ün bir sabit dizisini içerebilir (bu antikor, AE12-1Y-OL olarak ifade edilir ve SEO lD NO: 146'nin bir hafif zincir dizisine ve SEO ID NO: 147'nin bir agir zincir dizisine sahiptir).
PROTEIN BÖLGESI SEQ ID NO. DIZI AE CDR-L3 67 FSYAGTDTL AE CDR-L3 68 HSYAGTDTL AE12-1-L (VL) CDR-L3 69 LSYAGTDTL AE CDR-L3 70 VSYAGTDTL AE CDR-L3 71 ISYAGTDTL AE12-1-K (VL) CDR-L3 72 KSYAGTDTL AE12-1-Y (VL) CDR-L3 73 YSYAGTDTL Tablo 2A Amino asit Mutasyonu T250Q M428L T250Q ve M428L ASTKGPS \'FPLAPSSKSTSGGTAALGÇL \-7KDYFPEP\›"TVSW1\' SOA I (TSC VI ITFPAV I (QSSGI ,YS I SSVVTVPSSSI .GTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC'PAPEAAGGPSVFLFP PK PKI)II .\i'1 [SR I`PI'I\*”I`(,`V V\-"l)\f'SI llîl)PliV I( I"N WYV[)GVI{VI l NAKTKPREFQYNSTYRVVSVI .TVI .HQD W] NGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMI IEAU TNI IYTQK SI ,SI .SPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGAI TSGW iTFPAvi ..QSSGI ,YSI .SSVVTVPSSSI ..GTQTYKNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDQLMISRI'PEV'l'CVV\--'D\-'SH1;`L)PJ:`VKFN WYVDGVEVH NAKTKPREFQYNSTYRVVSVI ,TVI .I IQDWI NGKFYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTIÇVQVSLTCL VKGFYPSDlAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGWFSCSVMHFAI,H\ HYTQKSISI SPGK ASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTA AI .GCI .VKDYFPFPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NE IKI'SNTKV DKKV UPKSCDK'I'I l'l`(`PP(.`PAPEAAUGPSVI*`LI-`P PKPKDILNIISRTPEVTC V VVDVSHE DPEVKFN\VYVDG\”EV H NAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KA LPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VK GFX'PSDIAVEWFSNGQP FNNYKTTPPVI .DSDGSFFI ,YSKI, TVDKS RWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGAL'ISG VH'I'FPAV LQSSGLYSLSS\`V'I'\"'PSSSLGI`Q'[`YICNV NI IKPSNTKVDKKVFPKSCDKTI !TCPPCPAPFAAGGPSVFI FP PKPKDQLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNVVYVDGVEVH NAKIKPREEQYNS'J'YRVVSVL'I`VLHQDWLNGKEYKCKVSN KAI.PAPIFKTISKAKGQPRFPQVYTT(PPSRFFMTKVQVSITCI.
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL Tablo ZB PROTEIN SEQ BÖLGESI ID AE12-1V-QL 144 Hafif zinciri (CDR'Ierin alti çizilidir ve mutasyonlar koyu ren ktedir) AE12-1V-QL Agir 145 zinciri (CDR'Ierin alti çizilidir ve mutasyonlar koyu ren ktedir) AE12-1Y-QL 146 Hafif zinciri (CDR'Ierin alti çizilidir ve mutasyonlar koyu ren ktedir) AE12-1Y-QL Agir 147 zinciri (CDR'Ierin alti çizilidir ve mutasyonlar koyu ren ktedir) QSALTQPRSVSGS PGQSVTISCTGTSS VGDSIYVSWYQQI-IPGKAPK LMLYJVTKPQSGVQDRr-SGSKS GNTPSLTISGLQAEDEPDYYCVSYA GTDTI.;_FGCGTKI\PI'VLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKA'T'LVCLISDF YPGÂVTVAWKADSSP *KAC-VETTTPSKQSNNKYAÄSSYLSLTPEQWKS HRSYS CQ\i'l`I-1EGS*E'VE KT\I`APTECS* EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHGiSWVRQAPGQGLDW MGWISPYSGNIgXAQKLOGRVTMTTÜTSTSTÄYMELSSLRSEDTAVY YCARVGSGPYYYMDVWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGC TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVFSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVUKKVEPKSCDKTHTCPPCPÄPEÄ ÄGCPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNÄKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGOPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIÃ VEWESNGQPENNYKETPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VLHEALHNHYTQKSLSLSPGK* ` QSALTQPKSVSGSPGÇ'S\I'1`ISC"I`G'1`SSS\i"GDSIYVSWYQQHPGKAP KLMLYDVTKRPSGVPDRFSGSKSGN'IASLTISGLQAEDEADYYCXS MQEFGGGTFWTVLGQPKAAPSVTLFP PSSEELQANKATLVCLI SDF'YPGAVTVAWKADSSPî/YAGVETTTPS KQSNNKi'AASSYLSLTPE QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEICL'VADTECS * EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHGISWVRQAPGQGLDWM GWISPYSGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARVGSGPYYYMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLÃPSSKSTSGGTAAL GCLVKD"FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAÄGGPSVF LFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVJVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKÂKG OPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSPFLYSKLTVDKSRMQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSL c. Antikor PreparasyonulÜretimi Antikorlar, çesitli tekniklerin herhangi biri ile üretilebilir. Genel olarak, antikorlar antikorlarin üretimine olanak saglamak için, geleneksel teknikler vasitasiyla veya antikor genlerinin, agir zincirlerin ve/veya hafif zincirlerin uygun bakteriyel veya memeli hücre konaklarina transfeksiyonu vasitasiyla monoklonal antikorlarin üretimini içeren, hücre kültürü teknikleri ile üretilebilir, burada antikorlar rekombinant olabilir. ökaryotik konak hücreye uygulanmasi için yaygin bir sekilde kullanilan çok çesitli teknikleri, örnegin, elektroporasyonu, kalsiyum-fosfat presipitasyonunu, DEAE-dekstran transfeksiyonunu ve benzerlerini, kapsamasi amaçlanir. Prokaryotik veya ökaryotik konak hücrelerde bulusun antikorlarini eksprese etmenin mümkün olmasina ragmen, prokaryotik hücrelere kiyasla bu tarz ökaryotik hücrelerin (ve Özellikle memeli hücrelerinin) bir uygun sekilde katlanmis ve immünolojik olarak aktif antikoru birlestirmesi ve salgilamasi daha olasi oldugundan, antikorlarin ekspresyonu ökaryotik hücrelerde tercih edilir ve memeli konak hücrelerinde en çok tercih edilir.
Bulusun rekombinant antikorlarini eksprese etmesi için emsal memeli konak hücreleri, Çin Hamsteri Over (CHO hücrelerini), örnegin, Kaufman ve Sharp, J. Mol. Biol., 159: kaynaginda tarif edilen dhfr-CHO hücreleri dahil), NSO miyelom hücrelerini. COS hücrelerini ve SP2 hücrelerini içerir. Antikor genlerini kodlayan rekombinant ekspresyon vektörleri memeli konak hücrelerine uygulandiginda, antikorlar konak hücreleri, konak hücrelerde antikorun ekspresyonuna veya daha tercihen antikorun konak hücrelerin büyütüldügü kültür vasatina salgilanmasina süre tanimak için yeterli bir zaman periyodu boyunca kültürleme ile üretilir. Antikorlar, standart protein saflastirma yöntemleri kullanilarak kültür vasatindan geri-kazanilabilir.
Konak hücreler ayrica, fonksiyonel antikor fragmanlari, örnegin, Fab fragmanlari veya scFv molekülleri, üretmek için de kullanilabilir. Yukaridaki prosedür üzerindeki varyasyonlarin mevcut açiklamanin kapsami içinde oldugu anlasilacaktir. Örnegin, bir konak hücreyi bu bulusun bir antikorunun hafif zincirinin ve/veya agir zincirinin fonksiyonel fragmanlarini kodlayan DNA ile transfekte etmek arzu edilebilir.
Rekombinant DNA teknolojisi ayrica, söz konusu antijenleri baglamak için gerekli olmayan ya hafif veya agir zinciri ve her iki zinciri kodlayan DNA'nin birazini veya tümünü uzaklastirmak için de kullanilabilir. Bu tarz kirpilmis DNA moleküllerinden eksprese edilen moleküller ayrica bulusun antikorlari tarafindan da kapsanir. Buna ek olarak, burada bir agir ve bir hafif zincirin bulusun bir antikoru oldugu (yani, insan RGMa'sini bagladigi) ve diger agir ve hafif zincirin insan RGMa'sindan baska bir antijene spesifik oldugu bifonksiyonel antikorlar, bulusun bir antikorunu bir ikinci antikora standart kimyasal çapraz-baglama yöntemleri ile çapraz-baglama ile üretilebilir.
Bulusun bir antikorunun rekombinant ekspresyonu için tercih edilen bir sistemde, hem antikor agir zincirini hem de antikor hafif zincirini kodlayan bir rekombinant ekspreSyon vektörü, kalsiyum fosfat-aracili transfeksiyon ile dhfr-CHO hücrelerine uygulanir.
Rekombinant ekspresyon vektörü içinde, antikor agir ve hafif zincir genlerinin her biri, genlerin yüksek düzeylerdeki transkripsiyonuna yön vermek için CMV hizlandiricisi/AdMLP promotörü regülatör elemanlarina operatif olarak baglanir.
Rekombinant ekspresyon vektörü ayrica, metotreksat seleksiyonu/amplifikasyonu kullanilarak vektör ile transfekte edilmis CHO hücrelerinin seleksiyonuna olanak saglayan bir DHFR geni de tasir. Seçilen transformant konak hücreler, antikor agir ve hafif zincirlerinin ekspresyonuna olanak saglamak için kültürlenir ve aynen antikor kültür vasatindan geri-kazanilir. Standart moleküler biyoloji teknikleri, rekombinant ekspresyon vektörünü hazirlamak, konak hücreleri transfekte etmek, transformantlar için seçmek, konak hücreleri kültürlemek ve antikoru kültür vasatindan geri-kazanmak için kullanilir. Daha ilaveten, açiklama açiklamanin bir konak hücresini, bulusun bir rekombinant antikoru sentezlenene kadar, uygun bir kültür vasati içinde kültürleme ile bulusun bir rekombinant antikorunu sentezlemenin bir yöntemini saglar. Yöntem ilaveten, rekombinant antikoru kültür vasatindan izole etmeyi içerebilir.
Monoklonal antikorlari hazirlamanin yöntemleri, arzu edilen özgüllüge sahip olan antikorlari üretebilen ölümsüz hücre hatlarinin preparasyonunu içerir. Bu tarz hücre hatlari, bir immünize edilmis hayvandan elde edilen dalak hücrelerinden üretilebilir.
Hayvan, RGMa veya bunun bir fragmani ve/veya varyanti ile immünize edilebilir. Örnegin, SEQ ID NO: 65'in, SEQ ID NO: 66'nin, SEQ ID NO: 74'ün, SEQ ID NO: 65'in, SEQ ID NO: 66'nin veya SEQ ID NO: 74'ün bir fragmaninin veya SEQ ID NO: 65'in, SEQ ID NO: 66'nin veya SEQ ID NO: 74'ün bir varyantinin herhangi biri hayvani immünize etmek için kullanilabilir. Hayvani immünize etmek için kullanilan peptit, insan Fc'sini, örnegin, insan antikorunun fragman kristallenebilen bölgesini veya kuyruk bölgesini, kodlayan amino asitler içerebilir. Dalak hücreleri akabinde, örnegin, bir miyelom hücresi füzyon partneri ile füzyon, ile ölümsüz hale getirilebilir. Çesitli füzyon teknikleri kullanilabilir. Örnegin, dalak hücreleri ve miyelom hücreleri bir kaç dakika boyunca bir iyonik-olmayan deterjan ile birlestirilebilir ve akabinde miyelom hücrelerinin degil ancak hibrit hücrelerin büyümesini destekleyen bir selektif vasat üzerinde düsük yogunlukta plakalanabilir. Bu tarz bir teknik, hipoksantin, aminopterin, timidin (HAT) seleksiyonu kullanir. Yeterli bir süre, genel olarak yaklasik 1 ila 2 hafta, sonra, hibritlerin kolonileri gözlenir. Tek koloniler seçilir ve bunlarin kültür süpernatantlari polipeptidi karsi baglama aktivitesi için test edilmistir. Yüksek reaktiviteye ve özgüllüge sahip olan hibridomlar kullanilabilir.
Monoklonal antikorlar, büyüyen hibridom kolonilerinin süpernatantlarindan izole edilebilir. Buna ek olarak, çesitli teknikler, örnegin, hibridom hücre hattinin bir uygun omurgali konagin, örnegin, bir farenin, peritoneal kavitesine enjeksiyonu, verimi arttirmak için, kullanilabilir. Monoklonal antikorlar akabinde, assitler sivisindan veya kandan hasat edilebilir. Kontaminantlar geleneksel teknikler, örnegin, kromatografi, jel filtrasyonu, presipitasyon ve ekstraksiyon, ile antikorlardan uzaklastirilabilir. Afinite kromatografisi, antikorlari saflastirmak için bir proseste kullanilabilen bir yöntemin bir örnegidir.
Papain proteolitik enzimi tercihli bir sekilde, ikisinin (F(ab) fragmanlarinin) her birinin bir aynen antijen-baglama yeri içeren bir kovalent heterodimer içerdigi bir kaç fragman üretmek için IgG moleküllerini yarar. Pepsin enzimi, her iki antijen-baglama yerini içeren F(ab')2 fragmanini içeren, bir kaç fragman saglamak için IgG moleküllerini yarabilir.
Fv fragmani, bir IgM ve nadir durumlarda IgG veya lgA immünoglobülin moleküllerinin tercihli proteolitik klevaji ile üretilebilir. Fv fragmani, rekombinant teknikler kullanilarak türetilebilir. Fv fragmani, natif antikor molekülünün antijen tanima ve baglama kapasitelerinin çogunu muhafaza eden bir antijen-baglama yeri içeren bir kovalent- olmayan VH::VL heterodimerini içerir.
Antikor, antikor fragmani veya türevi, CDR'Iere destek saglayan ve CDR'Ierin birbirlerine göre uzaysal iliskisini tanimlayan, bir agir zincir ve bir hafif zincir çerçeve ("FR") kümesi arasina sirasiyla koyulmus bir agir zincir ve bir hafif zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi ("CDR") kümesini içerebilir. CDR kümesi, bir agir ve hafif zincir V bölgesinin üç hiper-degisken bölgesini içerebilir. Bir agir veya hafif zincirin N-ucundan ilerleyerek, bu bölgeler sirasiyla "CDR1", "CDR2" ve "CDR3" olarak gösterilir. Bundan dolayi, bir antijen-baglama yeri bir agir ve bir hafif zincir V bölgesinin her birinden CDR kümesi içeren alti CDR içerebilir. Bir tek CDR (örnegin, bir CDR1, CDR2 veya CDR3) içeren bir polipeptit bir "moleküler tanima birimi" olarak ifade edilebilir. Antijen-antikor komplekslerinin kristalografik analizleri, CDR'Ierin amino asit rezidülerinin baglanmis antijen ile kapsamli temas olusturdugunu göstermistir, burada en kapsamli antijen temasi, agir zincir CDR3'ü iledir. Böylelikle, moleküler tanima birimleri primer olarak, bir antijen-baglama yerinin özgüllügünden sorumlu olabilir. Genel olarak, CDR rezidüleri dogrudan ve en büyük ölçüde antijen baglamayi etkilemeye dahil edilir.
Zorunlu özgüllügü olan antikorlari üretmenin veya izole etmenin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, örnegin, çesitli ticari saticilardan, örnegin, Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Scotland, UK) Biolnvent (Lund, Isveç), erisilebildigi üzere, teknikte bilinen yöntemler kullanilarak, bir peptit veya protein kütüphanesinden (örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir bakteriyofaj, ribozom, oligonükleotid, RNA, CDNA, maya veya benzeri, gösterim kütüphanesinden) rekombinant antikoru seçen yöntemleri, içeren yöntemler, teknikte bilindigi üzere ve/veya burada tarif edildigi üzere, insan antikorlarinin bir repertuvarini üretebilen transgenik hayvanlarin (örnegin, SCID immünizasyonuna dayanir. Bu tarz teknikler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Hanes et al. (; tek hücre antikor üretme teknolojilerini (örnegin, seçilmis Ienfosit antikor yöntemini ("SLAM") (5,627,052 (; jel mikro-damla ve akis sitometrisini 134 (1994)) içerir.
Bir afinite matüre edilmis antikor, teknikte bilinen çok sayida prosedürün herhangi biri ve VL alani karma ile afinite matürasyonunu tarif eder. CDR ve/veya çerçeve rezidülerinin rastgele mutajenezi, Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809- pozisyonlarinda ve bir aktivite güçlendiren amino asit rezidüsü ile temas veya hiper- mutasyon pozisyonlarinda Selektif mutasyon 6,914,128 B1 Numarali U.S. Patenti'nde tarif edilir.
Mevcut bulusun antikor varyantlari ayrica, bu bulusun bir antikorunu kodlayan bir polinükleotidi, bunlarin sütünde bu tarz antikorlari üreten transgenik hayvanlar veya memeliler, örnegin, keçiler, inekler, atlar, koyunlar ve benzerlerini, saglamak amaciyla uygun bir konaga aktarma kullanilarak da hazirlanabilir. Bu yöntemler teknikte bilinir ve ,304,489 Numarali U.S. Patentleri'nde, tarif edilir.
Antikor varyantlari ayrica, bu bulusun bir polinükleotidini, bu tarz antikorlari, belirtilmis kisimlari veya varyantlari bitki parçalarinda veya bundan kültürlenen hücreler içinde üreten transgenik bitkiler ve kültürlenmis bitki hücreleri (örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, tütün, dari ve su-mercimegi) saglamak için aktarma ile de ve burada alinti yapilan referanslar, örnegin, bir indüklenebilen promotör kullanilarak, rekombinant proteinlerin büyük miktarlarini eksprese eden transgenik tütün yapraklarinin üretimini tarif eder. Transgenik dari, diger rekombinant sistemlerde üretilenlere veya dogal kaynaklardan saflastirilanlara es-deger olan biyolojik aktiviteleri olan, ticari üretim düzeylerinde memeli proteinlerini eksprese etmek için 147 ve burada alinti yapilan referanslar. Antikor varyantlari ayrica, antikor fragmanlarini, örnegin, tek Zincirli antikorlari (scFv'leri) içeren, tütün tohumlarini ve patates yumrularini içeren transgenik bitki tohumlarindan büyük miktarlarda üretilmistir. yapilan referanslar. Böylelikle, mevcut bulusun antikorlari ayrica, bilinen yöntemlere göre, Transgenik bitkiler kullanilarak da üretilebilir.
Antikor türevleri, örnegin, immünojenisiteyi modifiye etmek veya baglamayi, afiniteyi, birlesme-hizini, ayrilma-hizini, aviditeyi, özgüllügü, yari-ömrü veya herhangi bir baska uygun karakteristigi düsürmek, arttirmak veya modifiye etmek için ekzojen dizileri ekleme ile üretilebilir. Genel olarak, insan-olmayan veya insan CDR dizilerinin bir kismi veya tümü idame ettirilirken, degisken ve sabit bölgelerin insan-olmayan dizileri insan veya baska amino asitler ile degistirilir.
Küçük antikor fragmanlari, iki antijen-baglama yerine sahip olan diyabodiler olabilir, burada fragmanlar ayni polipeptit zinciri (VH VL) içinde bir hafif zincir degisken alanina (VL) baglanmis bir agir zincir degisken alanini (VH) içerir. Bakiniz, örnegin, EP 6448. Ayni zincir üzerindeki iki alan arasinda eslesmeye izin vermek için çok kisa olan bir baglayici kullanma ile, alanlar bir baska zincirin komplementer alanlari ile eslesmeye ve iki antijen-baglama yeri olusturmaya zorlanir. Bakiniz, örnegin, ana antikorun bir hiper-degisken bölgesi içine yerlestirilmis bir veya birden fazla amino aside ve bir hedef antijen için ana antikorun antijen için baglama afinitesine kiyasla en az yaklasik iki kat daha güçlü olan bir baglama afinitesine sahip olan antikor varyantlarini açiklayan Chen et al. için 6,632,926 Numarali U.S. Patenti.
Antikor bir lineer antikor olabilir. Bir lineer antikor yapmak için prosedür teknikte bilinir olarak, bu antikorlar antijen baglama bölgelerinin bir çiftini olusturan arka arkaya dizilmis Fd segmentlerinin (VH-CH1-VH-CH1) bir çiftini içerir. Lineer antikorlar bispesifik veya monospesifik olabilir.
Antikorlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, protein A saflastirmasini, amonyum sülfat veya etanol presipitasyonunu asit ekstraksiyonunu, anyon veya katyon degisim kromatografisini, fosfoselüloz kromatografisini, hidrofobik etkilesim kromatografisini, afinite kromatografisini, hidroksilapatit kromatografisini ve Iektin kromatografisini, içeren bilinen yöntemler ile rekombinant hücre kültürlerinden geri-kazanilabilir ve saflastirilabilir. Yüksek performansli sivi kromatografisi ("HPLC") de saflastirma için kullanilabilir.
Antikoru saptanabilen veya terapötik bir sekilde etiketlemek kullanisli olabilir. Antikorlari bu ajanlara konjuge etmek için yöntemler teknikte bilinir. Yalnizca örnek amaciyla, antikorlar, bir saptanabilen kisim, örnegin, bir radyoaktif atom, bir kromofor, bir florofor veya benzerleri, ile etiketlenebilir. Bu tarz etiketlenmis antikorlar tanisal teknikler için, iri vivo veya bir izole edilmis test örneginde, kullanilabilir. Antikorlar ayrica, örnegin, bir farmasötik ajana, örnegin, kemoterapötik ilaca veya bir toksine, de konjuge edilebilir.
Bunlar bir sitokine, bir Iiganda, bir baska antikora, baglanabilir. Bir anti-tümör etki saglamak için antikorlara kuplaj için uygun ajanlar, sitokinleri, örnegin, interlökin 2'yi (IL-2) ve Tümör Nekroz Faktörü'nü (TNF); fotodinamik terapide kullanim için, alüminyum (III) fitalosiyanin tetrasülfonati, hematoporfirini ve ftalosyanini, içeren foto- (186Re) ve renyum-188'i (188Re); antibiyotikleri örnegin, doksorubisini, adriamisini, daunorubisini, metotreksati, daunomisini, neokarzinostatini ve karboplatini; bakteriyel, bitkisel ve baska toksinleri, örnegin, difteri toksinini, pseudomonas ekzotoksini A'yi, stafilokoksal enterotoksin A'yi, abrin-A toksinini, risin A'yi (deglikosile edilmis risin A'yi ve natif risin A'yi), TGF-alfa toksinini, Çin kobrasindan (naja naja atra) elde edilen sitotoksini ve jelonini (bir bitki toksini): bitkilerden, bakterilerden ve funguslardan elde edilen ribozom inaktive etme proteinlerini, örnegin, restriktosini (Aspergillus restrictus tarafindan üretilen bir ribozom inaktive etme proteini), saporini (Saponaria officinalis'ten elde edilen bir ribozom inaktive etme proteini) ve RNaz`i; tirozin kinazi inhibitörlerini; oligonükleotidler, toksinleri, metotreksati kodlayan plazmidler, vb.) içeren Iipozomlari ve diger antikorlari veya antikor fragmanlarini, örnegin, F(ab) içerir.
Antikorlar dizilenebilir ve rekombinant veya sentetik araçlar ile kopyalanabilir. Bunlar ayrica ilaveten, bunlari kodlayan nükleotidlerin lineer dizisine dogru asagi dizilenebilir.
Bu dogrultuda, bu bulus, bu bulusun bir antikorunun bir dizisini kodlayan bu polinükleotidleri, yukarida tarif edildigi üzere, tek basina veya bir tasiyici, vektör veya konak hücre ile kombinasyon halinde, saglar.
Hibridom teknolojisinin, seçilmis Ienfosit antikor yönteminin (SLAM), transgenik hayvanlarin ve rekombinant antikor kütüphanelerinin kullanimi vasitasiyla antikor üretimi asagida daha detayli bir sekilde tarif edilir. (1) Hibridom Teknolojisi Kullanilan Anti-RGMa Monoklonal Antikorlari Monoklonal antikorlar, teknikte bilinen, hidridom, rekombinant ve faj gösterim teknolojilerinin veya bunlarin bir kombinasyonunun kullanimini içeren, çok çesitli teknikler kullanilarak hazirlanabilir. Örnegin, monoklonal antikorlar, teknikte bilinenleri ve örnegin, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, second edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling et al.,: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981) kaynaklarinda ögretilenleri içeren hibridom teknikleri kullanilarak üretilebilir. Burada kullanildigi sekliyle, "monoklonal antikor“ terimi, hibridom teknolojisi yoluyla üretilen antikorlar ile sinirlandirilmaz. "Monoklonal antikor" terimi, bunun bu yolla üretildigi yöntem olmayan ve herhangi bir ökaryotik, prokaryotik veya faj klonunu içeren bir tek klondan türetilen bir antikoru ifade eder.
Monoklonal antikorlar üretmenin yöntemleri ayni zamanda yöntem ile üretilen antikorlar burada saglanir. Yöntem bulusun bir antikorunu salgilayan bir hibridom hücresini kültürlemeyi içerebilir, burada tercihen, hibridom RGMa ile immünize edilmis bir hayvandan, örnegin, bir siçandan veya bir fareden, izole edilmis splenositleri miyelom hücreleri ile kaynastirma ve akabinde füzyondan elde edilen hibridomlari bulusun bir polipeptidini baglayabilen bir antikoru salgilayan hibridom klonlari Için tarama ile üretilir. Özet olarak, siçanlar, bir RGMa antijeni ile immünize edilebilir. Tercihen, RGMa antijeni, immün yaniti stimüle etmek için bir adjuvan ile uygulanir. Bu tarz adjuvanlar, komplet ve inkomplet Freund adjuvanini, RIBI'yi (muramil dipeptitleri) veya ISCOM (immüno-stimüle etme komplekslerini) içerir. Bu tarz adjuvanlar, polipeptidi bir lokal depo içinde sikistirma ile çabuk dagilmadan koruyabilir veya bunlar konagin makrofajlar ve immün sistemin diger bilesenleri için kemotaktik olan faktörleri salgilamasini stimüle eden maddeler içerebilir. Tercihen, bir polipeptit uygulanmakta oldugunda, immünizasyon planlamasi, polipeptidin, bir kaç haftaya yayilmis, iki veya daha fazla uygulamasini içerecektir; bununla birlikte, polipeptidin bir tek uygulamasi da kullanilabilir.
Bir hayvanin bir RGMa antijeni ile immünizasyonundan sonra, antikorlar ve/veya antikor-üreten hücreler hayvandan elde edilebilir. Bir anti-RGMa antikoru-içeren serum, kan alma veya hayvani kurban etme ile hayvandan elde edilir. Serum, hayvandan elde edildigi sekilde kullanilabilir, bir immünoglobülin fraksiyonu serumdan elde edilebilir veya anti-RGMa antikorlari serumdan saflastirilabilir. Bu sekilde elde edilen serum veya immünoglobülinler poliklonaldir, böylelikle bir dizi heterojen özellige sahiptir.
Bir immün yanit saptandiginda, örnegin, antijen RGMa'ya spesifik antikorlar siçan serumunda saptandiginda, siçan dalagi hasat edilir ve splenositler izole edilir.
Böylelikle, splenositler iyi-bilinen teknikler ile herhangi bir uygun miyelom hücresine, örnegin, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan (ATCC, Manassas, Va., US) erisilebilen SP20 hücre hattindan elde edilen hücrelere kaynastirilir. Hibridomlar seçilir ve sinirlandirilmis seyreltme ile klonlanir. Hibridom klonlari akabinde, RGMa'yi baglayabilen antikorlari salgilayan hücreler için teknikte bilinen yöntemler ile analiz edilir. Genel olarak yüksek düzeylerde antikor içeren assitler sivisi, siçanlari pozitif hibridom klonlari ile immünize etme ile üretilebilir.
Antikor-üreten ölümsüz hale getirilmis hibridomlar, immünize edilmis hayvandan hazirlanabilir. Immünizasyondan sonra, hayvanlar kurban edilir ve splenik B hücreleri, teknikte iyi bilindigi üzere ölümsüz hale getirilmis miyelom hücrelerine kaynastirilir.
Bakiniz, örnegin, Harlow ve Lane, yukarida. Tercihen, miyelom hücreleri (bir sekretuvar-olmayan hücre hatti), immünoglobülin polipeptitleri salgilamaz. Füzyondan ve antibiyotik seleksiyonundan sonra, hibridomlar RGMa veya bunun bir kismi veya RGMa eksprese eden bir hücre kullanilarak taranir. Ilk taramanin, bir enzime-bagli bagisiklik analizi (ELISA) veya bir radyoimmünoanaliz (RIA), tercihen bir ELISA kullanilarak gerçeklestirilmesi de tercih edilir. ELISA taramasinin bir örnegi, WO 00137504 Numarali PCT Yayininda saglanir.
Anti-RGMa antikoru-üreten hibridomlar, asagida ilaveten tartisildigi üzere, güçlü hibridom büyümesini, yüksek antikor üretimini ve arzu edilebilen antikor karakteristiklerini içeren, arzu edilebilen karakteristikler için seçilir, klonlanir ve ilaveten taranir. Hibridomlar, in vivo singeneik hayvanlarda, bir immün sistemden yoksun olan hayvanlarda, örnegin, çiplak farelerde veya in vitro hücre kültüründe, kültürlenebilir ve genisletilebilir. Hibridomlari seçmenin, klonlamanin ve genisletmenin yöntemleri, teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan iyi bilinir.
Tercihen, hibridomlar, siçan hibridomlaridir. Alternatif olarak, hibridomlar bir insan- olmayan, siçan-olmayan türde, örnegin, farelerde, siçanlarda, koyunlarda, domuzlarda, keçilerde, sigirlarda veya atlarda, üretilebilir. Insan hibridomlari a tercih edilir, burada bir insan sekretuvar-olmayan miyelomu, bir anti-RGMa antikoru eksprese eden bir insan hücresi ile kaynastirilir.
Spesifik epitoplari taniyan antikor fragmanlari, bilinen teknikler ile üretilebilir. Örnegin, bulusun Fab ve F(ab')2 fragmanlari, enzimler, örnegin, (iki özdes Fab fragmani üretmek için) papain veya (bir F(ab')2 fragmani üretmek için) pepsin, kullanilarak, immünoglobülin moleküllerinin proteolitik klevaji ile üretilebilir. Bir lgG molekülünün bir F(ab')2 fragmani, daha büyük ("ana") lgG molekülünün, hem hafif zincirleri (degisken hafif zincir ve sabit hafif zincir bölgeleri dahil), agir zincirlerin CH1 alanlarini ve ana lgG molekülünün bir disülfit-olusturan mentese bölgesini içeren, iki antijen-baglama yerini muhafaza eder. Bu dogrultuda, bir F(ab')2 fragmani, ana lgG molekülü gibi antijen moleküllerini hala çapraz-baglayabilir. (2) SLAM Kullanilan Anti-RGMa Monoklonal Antikorlari kaynaginda tarif edildigi üzere, teknikte seçilmis Ienfosit antikor yöntemi (SLAM) olarak ifade edilen bir prosedür kullanilarak tek, izole edilmis Ienfositlerden üretilir. Bu yöntemde, söz konusu antikorlari salgilayan tek hücreler, örnegin, immünize edilmis hayvanlarin herhangi birinden türetilen lenfositler, bir antijen-spesifik hemolitik plak analizi kullanilarak taranir, burada, antijen RGMa, RGMa'nin bir alt-birimi veya bunun bir fragmani, bir baglayici, örnegin, biyotin, kullanilarak koyun kirmizi kan hücrelerine kuple edilir ve RGMa için özgüllügü olan antikorlari salgilayan tek hücreleri tanimlamak için kullanilir. Söz konusu antikor-salgilayan hücrelerin tanimlanmasini takiben, agir- ve hafif-zincir degisken bölge cDNA'lari, ters transkriptaz-PCR (RT-PCR) ile hücrelerden kurtarilir ve akabinde bu degisken bölgeler, memeli konak hücreleri, örnegin, COS veya CHO hücreleri, içinde, uygun immünoglobülin sabit bölgeleri (örnegin, insan sabit bölgeleri) baglaminda, eksprese edilebilir. In vivo seçilmis Ienfositlerden türetilen, çogaltilmis immünoglobülin dizileri ile transfekte edilmis konak hücreler akabinde, örnegin, RGMa için antikorlar eksprese eden hücreleri izole etmek amaciyla, transfekte edilmis hücreleri panlama ile, in vitro ilave analiz ve seleksiyon geçirebilir. Çogaltilmis immünoglobülin dizileri ilaveten, örnegin, in vitro afinite matürasyon yöntemi ile, in vitro manipüle edilebilir. Bakiniz, örnegin, WO 97/29131 Numarali PCT Yayini ve WO 00/56772 Numarali PCT Yayini. (3) Transgenik Hayvanlar Kullanilan Anti-RGMa Monoklonal Antikorlari Antikorlar ayrica, insan immünoglobülin Iokusunun birazini veya tümünü içeren bir insan-olmayan hayvani bir RGMa antijeni ile immünize etme ile de üretilebilir. Bir örnekte, insan-olmayan hayvan, bir XENOMOUSE® transgenik faredir, insan immünoglobülin lokuslarinin büyük fragmanlarini içeren ve fare antikor üretiminde kusurlu olan bir mühendislik uygulanmis fare susudur. Bakiniz, örnegin, Green et al., 00/37504 Numarali PCT Yayinlari. XENOMOUSE® transgenik faresi, tam olarak insan antikorlarinin bir eriskin-benzeri insan repertuvarini üretir ve antijen-spesifik insan monoklonal antikorlarini üretir. XENOMOUSE® transgenik faresi, insan agir zincir YAC fragmanlarinin uygulanmasi yoluyla insan antikor repertuvarinin yaklasik olarak (4) Rekombinant Antikor Kütüphaneleri Kullanilan Anti-RGMa Monoklonal Antikorlari In vitro yöntemler ayrica, bulusun antikorlarini yapmak için de kullanilabilir, burada bir antikor kütüphanesi, arzu edilen RGMa-baglama özgüllügüne sahip olan bir antikoru tanimlamak için taranir. Rekombinant antikor kütüphanelerinin bu tarz taranmasi için yöntemler teknikte iyi bilinir ve örnegin, 5,223,409 Numarali U.S. Patenti (Ladner et al.,); WO ; WO 91/17271 Numarali PCT Yayini (Dower et al.,); WO ; WO (Breitling et al.,); WO ; WO Basvurusu Yayini; ve WO 97/29131 Numarali PCT Yayini kaynaklarinda tarif edilen yöntemleri içerir.
Rekombinant antikor kütüphanesi, RGMa veya RGMa'nin bir kismi ile immünize edilmis bir süjeden elde edilebilir. Alternatif olarak, rekombinant antikor kütüphanesi, bir naif süjeden, yani, RGMa ile immünize edilmemis birinden, insan RGMa'si ile immünize edilmemis olan bir insan süjeden elde edilen bir insan antikoru kütüphanesinden, elde edilebilir. Bulusun antikorlari, böylece RGMa'yi taniyan antikorlari seçmek için, rekombinant antikor kütüphanesini insan RGMa'sini içeren peptit ile tarama ile seçilir.
Bu tarz taramayi ve seleksiyonu yürütmek için yöntemler, örnegin, önceki paragraftaki referanslarda tarif edilenler, teknikte iyi bilinir. Bulusun RGMa'si için özel baglama afinitelerine sahip olan antikorlarini, örnegin, insan RGMa'sindan bir özel koff hiz sabiti ile ayrilanlari, seçmek için, yüzey plazmon rezonansinin teknikte-bilinen yöntemi, arzu edilen kon hiz sabitine sahip olan antikorlari seçmek için kullanilabilir. Bulusun hRGMa için bir özel nötralize etme aktivitesine sahip olan antikorlarini, örnegin, özel bir ICso'si olanlari, seçmek için, RGMa'nin aktivitesinin inhibisyonunu degerlendirmek için teknikte bilinen standart yöntemler kullanilabilir.
Bir yönünde, açiklama, insan RGMa'sini baglayan bir izole edilmis antikor veya bunun bir antijen-baglama kismi ile ilgilidir. Tercihen, antikor, bir nötralize etme antikorudur. Çesitli uygulamalarda, antikor bir rekombinant antikordur veya bir monoklonal antikordur. Örnegin, mevcut bulusun antikorlari ayrica, teknikte bilinen çesitli faj gösterim yöntemleri kullanilarak da üretilebilir. Faj gösterim yöntemlerinde, fonksiyonel antikor alanlari, bunlari kodlayan polinükleotid dizilerini tasiyan faj parçaciklarinin yüzeyi üzerinde gösterilir. Bu tarz fajdan, bir repertuvardan veya kombinasyonel antikor kütüphanesinden (örnegin, insan veya mürin) eksprese edilen antijen-baglama alanlarini göstermek için yararlanilabilir. Söz konusu antijeni baglayan bir antijen baglama alanini eksprese eden faj, örnegin, etiketlenmis antijen veya bir kati yüzeye veya bilyeye baglanmis veya yakalanmis antijen kullanilarak, antijen ile seçilebilir veya tanimlanabilir. Bu yöntemlerde kullanilan faj tipik olarak, faj gen III veya gen VIII proteinine rekombinant olarak kaynastirilmis Fab, Fv veya disülfit stabilize edilmis Fv antikor alanlari tasiyan fajdan eksprese edilen fd ve M13 baglama alanlarini içeren filamentöz fajdir. Mevcut bulusun antikorlarini yapmak için kullanilabilen faj gösterim açiklananlari içerir.
Yukaridaki referanslarda tarif edildigi üzere, faj seleksiyonundan sonra, fajdan, örnegin, asagida detayli bir sekilde tarif edildigi üzere, antikor kodlama bölgeleri izole edilebilir ve insan antikorlarini veya herhangi bir baska arzu edilen antijen baglama fragmanini içeren tam antikorlar üretmek için kullanilabilir ve memeli hücrelerini, böcek hücrelerini, bitki hücrelerini, mayalari ve bakterileri içeren, arzu edilen herhangi bir konak içinde eksprese edilebilir. Örnegin, Fab, Fab' ve F(ab')2 fragmanlarini rekombinant bir sekilde üretmek için teknikler ayrica, teknikte bilinen yöntemler, örnegin, WO 92122324 (1988) kaynaklarinda açiklananlar kullanilarak da uygulanabilir. Tek-Zincirli Fv'leri ve Faj gösterimi ile rekombinant antikor kütüphanelerinin taranmasina alternatif olarak, büyük kombinasyonel kütüphaneleri taramak için teknikte bilinen diger metodolojiler, bulusun antikorlarinin tanimlanmasina uygulanabilir. Alternatif ekspresyon sisteminin bir tipi, burada rekombinant antikor kütüphanesinin WO 98131700 Numarali PCT Yayininda (Szostak ve Roberts) ve Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, eksprese edildigi bir tiptir. Bu sistemde, bir kovalent füzyon, bir mRNA ve bunu kodlayan peptit veya protein arasinda, bunlarin 3' ucunda puromisin, bir peptidil akseptör antibiyotigi, tasiyan sentetik mRNA'Iarin in vitro translasyonu ile olusturulur.
Böylelikle, bir spesifik mRNA, kodlanmis peptidin veya proteinin, örnegin, antikorun veya bunun kisminin, özelliklerine, örnegin, antikorun veya bunun kisminin ikili özgüllüklü antijeni baglamasina, göre mRNA'Iarin bir kompleks karisimindan (örnegin, bir kombinasyonel kütüphaneden) zenginlestirilebilir. Bu tarz kütüphanelerin taranmasindan geri-kazanilan, antikorlari veya bunlarin kisimlarini kodlayan nükleik asit dizileri, yukarida tarif edildigi üzere (örnegin, memeli konak hücrelerinde) rekombinant araçlar ile eksprese edilebilir ve dahasi, yukarida tarif edildigi üzere, burada mutasyonlarin orijinal olarak seçilen diziye uygulanmis oldugu mRNA-peptit füzyonlarinin taranmasinin ilave turlari ile veya rekombinant antikorlarin in vitro afinite matürasyonu için diger yöntemler ile, ilave afinite matürasyonuna tabi tutulabilir. Bu metodolojinin tercih edilen bir örnegi, PROfusion gösterim teknolojisidir.
Bir baska yaklasimda, mevcut bulusun antikorlari ayrica, teknikte bilinen maya gösterim yöntemleri kullanilarak da üretilebilir. Maya gösterim yöntemlerinde, genetik yöntemler, antikor alanlarini maya hücre duvarina baglamak ve bunlari mayanin yüzeyi üzerinde göstermek için kullanilir. Özel olarak, bu tarz mayadan, bir repertuvardan veya kombinasyonel antikor kütüphanesinden (örnegin, insan veya mürin) eksprese edilen antijen-baglama alanlarini göstermek için yararlanilabilir. Mevcut bulusun antikorlarini yapmak Için kullanilabilen maya gösterim yöntemlerinin örnekleri, 6,699,658 Numarali U.S. Patentinde (Wittrup et al.) açiklananlari içerir. d. Rekombinant RGMa Antikorlarinin Üretimi Mevcut bulusun antikorlari, teknikte bilinen çok sayida teknigin herhangi biri ile üretilebilir. Örnegin, konak hücrelerden ekspresyon, burada agir ve hafif zincirleri kodlayan ekspresyon vektörü standart teknikler ile bir konak hücreye transfekte edilir. ökaryotik konak hücreye uygulanmasi için yaygin bir sekilde kullanilan çok çesitli teknikleri, örnegin, elektroporasyonu, kalsiyum-fosfat çökeltmesini, DEAE-dekstran transfeksiyonunu ve benzerlerini, kapsamasi amaçlanir. Prokaryotik veya ökaryotik konak hücrelerde bulusun antikorlarini eksprese etmenin mümkün olmasina ragmen, prokaryotik hücrelere kiyasla bu tarz ökaryotik hücrelerin (ve özellikle memeli hücrelerinin) bir uygun sekilde katlanmis ve immünolojik olarak aktif antikoru birlestirmesi ve salgilamasi daha olasi oldugundan, antikorlarin ekspresyonu ökaryotik hücrelerde tercih edilir ve memeli konak hücrelerinde en çok tercih edilir.
Bulusun rekombinant antikorlarini eksprese etmek için emsal memeli konak hücreleri, Çin Hamsteri Over (CHO hücrelerini) (örnegin, Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: kaynaginda tarif edilen dhfr-CHO hücreleri dahil), NSO miyelom hücrelerini, COS hücrelerini ve SP2 hücrelerini içerir. Antikor genlerini kodlayan rekombinant ekspresyon vektörleri memeli konak hücrelerine uygulandiginda, antikorlar konak hücreleri, konak hücrelerde antikorun ekspresyonuna veya daha tercihen antikorun konak hücrelerin büyütüldügü kültür vasatina salgilanmasina izin vermek için yeterli bir zaman periyodu boyunca kültürleme ile üretilir. Antikorlar, standart protein saflastirma yöntemleri kullanilarak kültür vasatindan geri-kazanilabilir.
Konak hücreler ayrica, fonksiyonel antikor fragmanlari, örnegin, Fab fragmanlari veya scFv molekülleri, üretmek için de kullanilabilir. Yukaridaki prosedür üzerindeki varyasyonlarin mevcut açiklamanin kapsami içinde oldugu anlasilacaktir. Örnegin, bir konak hücreyi bu bulusun bir antikorunun hafif zincirinin ve/veya agir zincirinin fonksiyonel fragmanlarini kodlayan DNA ile transfekte etmek arzu edilebilir.
Rekombinant DNA teknolojisi ayrica, söz konusu antijenleri baglamak için gerekli olmayan ya hafif veya agir zinciri veya her iki zinciri kodlayan DNA'nin birazini veya tümünü uzaklastirmak için de kullanilabilir. Bu tarz kirpilmis DNA moleküllerinden eksprese edilen moleküller ayrica, bulusun antikorlari ile de kapsanir. Buna ek olarak, burada bir agir ve bir hafif zincirin bulusun bir antikoru (örnegin insan RGMa'yi baglar) oldugu ve diger agir ve hafif zincirin insan RGMa'sindan baska bir antijene spesifik oldugu bifonksiyonel antikorlar, bulusun bir antikorunu bir ikinci antikora standart kimyasal çapraz-baglama yöntemleri ile çapraz-baglama ile üretilebilir.
Bulusun bir antikorunun veya bunun antijen-baglama kisminin rekombinant ekspresyonu için tercih edilen bir sistemde, hem antikor agir zincirini hem de antikor hafif zincirini kodlayan bir rekombinant ekspresyon vektörü, kalsiyum fosfat-aracin transfeksiyon ile dhfr-CHO hücrelerine uygulanir. Rekombinant ekspresyon vektörü içinde, antikor agir ve hafif zincir genlerinin her biri, genlerin yüksek düzeylerdeki transkripsiyonuna yön vermek için CMV hizlandiricisi/AdMLP promotörü regülatör elemanlarina operatif olarak baglanir. Rekombinant ekspresyon vektörü ayrica, metotreksat seIeksiyonu/amplifikasyonu kullanilarak vektör ile transfekte edilmis CHO hücrelerinin seleksiyonuna olanak saglayan bir DHFR geni de tasir. Seçilen transformant konak hücreler, antikor agir ve hafif zincirlerinin ekspresyonuna süre tanimak için kültürlenir ve aynen antikor kültür vasatindan geri kazanilir. Standart moleküler biyoloji teknikleri, rekombinant ekspresyon vektörünü hazirlamak, konak hücreleri transfekte etmek, transformantlar için seçmek, konak hücreleri kültürlemek ve antikoru kültür vasatindan geri kazanmak için kullanilir. Daha ilaveten, açiklama burada tarif edilen bir konak hücreyi, bulusun bir rekombinant antikoru sentezlenene kadar, uygun bir kültür vasati içinde kültürleme ile bulusun bir rekombinant antikorunu sentezlemenin bir yöntemini saglar. Yöntem ilaveten, rekombinant antikoru kültür vasatindan izole etmeyi içerebilir. (a) Hümanize Antikor Hümanize antikor, söz konusu bir antijeni immünospesifik olarak baglayan ve bir insan antikorunun amino asit dizisine büyük ölçüde sahip olan bir çerçeve (FR) bölgesi ve bir insan-olmayan antikorun amino asit dizisine büyük ölçüde sahip olan bir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) içeren bir antikor veya bunun bir varyanti, türevi, analogu veya kismi olabilir. Hümanize antikor, insan-olmayan türden bir veya birden fazla tamamlayicilik belirleme bölgesine (CDR'Ier) ve bir insan immünoglobülin molekülünden çerçeve bölgelerine sahip olan arzu edilen antijeni baglayan bir insan- olmayan türdeki antikordan olabilir.
Burada kullanildigi sekliyle, bir CDR baglaminda "büyük ölçüde" terimi, bir insan- olmayan antikor CDR'sinin amino asit dizisine en az %90, en az %95, en az %98 veya en az %99 özdes olan bir amino asit dizisine sahip olan bir CDR'yi ifade eder. Bir hümanize antikor, burada CDR bölgelerinin tümünün veya büyük ölçüde tümünün bir insan-olmayan immünoglobülininkilere (yani, donör antikorunkine) karsilik geldigi ve çerçeve bölgelerinin tümünün veya büyük ölçüde tümünün bir insan immünoglobülin konsensüs dizisininkiler oldugu, en az bir ve tipik olarak iki degisken alanin (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) büyük ölçüde tümünü içerir. Bir yönüne göre, bir hümanize antikor ayrica, bir immünoglobülin sabit bölgesinin (Fc), tipik olarak bir insan immünoglobülininin, en azindan bir kismini da içerir. Bazi uygulamalarda, bir hümanize antikor, hem hafif zinciri hem de bir agir zincirin en azindan degisken alanini içerir.
Antikor ayrica, agir zincirin CH1, mentese, CH2, CHP› ve CH4 bölgelerini de içerebilir.
Bazi uygulamalarda, bir hümanize antikor yalnizca, bir hümanize hafif zincir içerir. Bazi uygulamalarda, bir hümanize antikor yalnizca, bir hümanize agir zincir içerir. Spesifik uygulamalarda, bir hümanize antikor yalnizca, bir hafif zincirin ve/veya bir agir zincirin bir hümanize degisken alanini içerir.
Hümanize antikor, immünoglobülinlerin, IgM, lgG, lgD, IgA ve IgE'yi içeren herhangi bir sinifindan ve sinirlandirma olmaksizin, lgG 1, lgGZ, lgG3 ve IgG4'ü içeren herhangi bir izotipten seçilebilir. Hümanize antikor, birden fazla siniftan veya izotipten diziler içerebilir ve özel sabit alanlar teknikte iyi-bilinen teknikler kullanilarak arzu edilen efektör fonksiyonlari optimize etmek için seçilebilir.
Bir hümanize antikorun çerçeve ve CDR bölgelerinin, parental dizilere kesin bir sekilde karsilik gelmesi gerekmez, örnegin, donör antikor CDR'si veya konsensüs çerçevesi, en az bir amino asit rezidüsünün sübstitüsyonu, içeri yerlestirilmesi ve/veya silinmesi ile mutajenize edilebilir, böylece bu yerdeki CDR veya çerçeve rezidüsü donör antikora veya konsensüs çerçeveye karsilik gelmez. Bir örnekte, bu tarz mutasyonlar, bununla birlikte, genis çapli olmayacaktir. Genel olarak, hümanize antikor rezidülerinin en az karsilik gelecektir. Burada kullanildigi sekliyle, "konsensüs çerçevesi" terimi, konsensüs immünoglobülin dizisi içindeki çerçeve bölgesini ifade eder. Burada kullanildigi sekliyle, "konsensüs immünoglobülin dizisi" terimi, ilgili immünoglobülin dizilerinin bir familyasinda en sik bulunan amino asitlerden (veya nükleotidlerden) olusturulan diziyi ifade eder (Bakiniz, örnegin, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). Immünoglobülinlerin bir familyasinda, konsensüs dizisi içindeki her bir pozisyon, familya içinde bu pozisyonda en sik bulunan amino asit tarafindan mesgul edilir. Iki amino asit esit siklikta bulundugunda, ikisinden biri konsensüs dizisine dahil edilebilir.
Hümanize antikor, insan alicilarda bu kisimlarin terapötik uygulamalarinin süresini ve etkililigini sinirlandiran, kemirgen anti-insan antikorlarina karsi istenmeyen immünolojik yaniti minimuma indirmek için tasarlanabilir. Hümanize antikor, bunun içine insan- olmayan bir kaynaktan uygulanan bir veya birden fazla amino asit rezidüsüne sahip olabilir. Bu insan-olmayan rezidüler siklikla, tipik olarak bir degisken alandan alinan, dizileri için hiper-degisken bölge dizilerini sübstitüe etme ile gerçeklestirilebilir. Bu dogrultuda, bu tarz "hümanize" antikorlar, kimerik antikorlardir, burada bir aynen insan degisken alanindan büyük ölçüde daha azi, bir insan-olmayan türden karsilik gelen dizi ile sübstitüe edilmistir. Örnegin, bakiniz, 4,816,567 Numarali U.S. Patenti.
Hümanize antikor, burada bazi hiper-degisken bölge rezidülerinin ve büyük olasilikla bazi FR rezidülerinin, kemirgen antikorlarindaki analog yerlerden rezidüler ile sübstitüe edildigi bir insan antikoru olabilir. Mevcut bulusun antikorlarinin hümanize edilmesi veya mühendisligi, bilinen herhangi bir yöntem, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kullanilarak gerçeklestirilebilir.
Hümanize antikor, RGMa için yüksek afiniteyi ve diger avantajli biyolojik Özellikleri muhafaza edebilir. Hümanize antikor, parental dizilerin ve çesitli kavramsal hümanize ürünlerin parental ve hümanize dizilerin üç-boyutlu modellerini kullanarak analizinin bir prosesi ile hazirlanabilir. Üç-boyutlu immünoglobülin modellerine yaygin bir sekilde erisilebilir. Seçilmis aday immünoglobülin dizilerinin olasi üç-boyutlu konformasyonel yapilarini açiklayan ve gösteren bilgisayar programlari mevcuttur. Bunlarin incelenmesi, aday immünoglobülin dizisinin islev göstermesinde rezidülerin olasi rolünün analizine, yani, aday immünoglobülinin bunun antijenini baglama yetisini etkileyen rezidülerin analizine, izin verir. Bu yolla, FR rezidüleri, alici dizilerinden ve alinan dizilerden seçilebilir ve birlestirilebilir, böylece arzu edilen antikor karakteristikleri, örnegin, RGMa için arttirilmis afinite, basarilir. Genel olarak, hiper- degisken bölge rezidüleri dogrudan ve en büyük ölçüde antijen baglamayi etkilemeye dahil edilebilir.
Hümanize etmeye bir alternatif olarak, insan antikorlari (burada ayni zamanda "tam olarak insan antikorlari" olarak da ifade edilir) üretilebilir. Örnegin, insan antikorlarini kütüphanelerden PROfusion ve/veya maya iliskili teknolojiler vasitasiyla izole etmek mümkündür. Bakiniz, asagida saglanan Örnekler. Transgenik hayvanlar (örnegin, immünizasyon üzerine, endojen immünoglobülin üretimi yoklugunda insan antikorlarinin bir tam repertuvarini üretebilen fareler) üretmek de mümkündür. Örnegin, kimerik ve germ-hatti mutant farelerde antikor agir-zincir birlestirme bölgesi (JH) geninin homozigot silinmesi, endojen antikor üretiminin tam inhibisyonu ile sonuçlanir. Bu tarz germ-hatti mutant farelerde insan germ-hatti immünoglobülin gen dizisinin transferi, antijen yüklemesi üzerine insan antikorlarinin üretimi ile sonuçlanacaktir. Hümanize hazirlanabilir. 3. Farmasötik Bilesimler Antikor bir farmasötik bilesim içindeki bir bilesen olabilir. Farmasötik bilesim ayrica, bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici da içerebilir. Bulusun antikorlarini içeren farmasötik bilesimler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir bozuklugun tanisinda, saptanmasinda veya izlenmesinde, bir bozuklugun veya bunun bir veya birden fazla semptomunun önlenmesinde, tedavisinde, yönetiminde veya sagaltilmasinda ve/veya arastirmada kullanim içindir. Spesifik bir uygulamada, bir bilesim bulusun bir veya birden fazla antikorunu içerir. Bir baska uygulamada, farmasötik bilesim, bulusun bir veya birden fazla antikorunu ve burada bir hedeflenmis RGMa'nin aktivitesinin zararli oldugu bir bozuklugu tedavi etmek için bulusun antikorlari disinda bir veya birden fazla profilaktik veya terapötik ajan içerir. Ilave bir uygulamada, profilaktik veya terapötik ajanlarin, bir bozuklugun veya bunun bir veya birden fazla semptomunun önlenmesi, tedavisi, yönetimi veya sagaltilmasi için yararli oldugu veya bunlarin kullanilmis oldugu veya güncel olarak kullanilmakta oldugu bilinir. Bu uygulamalara uygun olarak, bilesim ilaveten bir tasiyici, diluent veya eksipiyan içerebilir.
Bulusun antikorlari, bir süjeye uygulama için uygun olan farmasötik bilesimlere katilabilir. Tipik olarak, farmasötik bilesim, bulusun bir antikorunu ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici", fizyolojik olarak uyumlu olan herhangi bir ve tüm çözücüleri, dispersiyon vasatlarini, kaplamalari, antibakteriyel ve antifungal ajanlari, izotonik ajanlari ve emilim geciktirme ajanlarini ve benzerlerini içerir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilarin örnekleri, suyun, salinin, fosfat tamponlu salinin, dekstrozun, gliserolün, etanolün ve benzerlerinin birini veya birden fazlasini ayni zamanda bunlarin kombinasyonlarini içerir. Çogu durumda, bilesimin bunun izotonik ajanlar, örnegin, sekerler, polialkoller, örnegin, mannitol, sorbitol veya sodyum klorür, içermesi tercih edilebilir olacaktir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ilaveten, antikorun raf ömrünü veya etkililigini arttiran minör miktarlarda yardimci maddeler, örnegin, islatma veya emülsifiye etme ajanlari, koruyucular veya tamponlar, içerebilir.
Ilave bir uygulamada, farmasötik bilesim burada açiklandigi üzere bir bozuklugu tedavi etmek için en az bir ilave terapötik ajan içerir.
Bulusun bir veya birden fazla antikorunu veya bulusun bir veya birden fazla antikorunun ve bir bozuklugu veya bunun bir veya birden fazla semptomunu önlemek, yönetmek, tedavi etmek veya sagaltmak için yararli olan bir profilaktik ajanin veya terapötik ajanin kombinasyonunu uygulamak için çesitli aktarim sistemleri, örnegin, edebilen rekombinant hücreler, reseptör-aracin endositoz (bakiniz, örnegin, Wu and olarak bir nükleik asidin yapilmasi, vb., bilinir ve kullanilabilir. Bulusun bir profilaktik veya terapötik ajanini uygulamanin yöntemleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, parenteral uygulamayi (örnegin, intradermal, intramüsküler, intraperitoneal, intravenöz ve subkütan), epidural uygulamayi, intratümoral uygulamayi ve mukozal uygulamayi (örnegin, intranazal ve oral yollari) içerir. Buna ek olarak, pulmoner uygulama, örnegin, bir solunum cihazi veya nebülizör ve bir aerosolize etme ajani içeren formülasyon PCT Yayinlari. Örnegin, bulusun bir antikoru, kombinasyon terapisi veya bulusun bir bilesimi, Alkermes AIR® pulmoner ilaç aktarim teknolojisi (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.) kullanilarak uygulanabilir. Bulusun profilaktik veya terapötik ajanlari ayrica, intramüsküler, intravenöz, intratümoral, oral, intranazal, pulmoner veya subkütan olarak da uygulanabilir. Profilaktik veya terapötik ajanlar, herhangi bir uygun yol ile, örnegin, infüzyon veya bolus enjeksiyon ile, epitelyal veya mukokütanöz astarlar (örnegin, oral mukoza, rektal ve intestinal mukoza, vb.) yoluyla emilim ile, uygulanabilir ve diger biyolojik olarak aktif ajanlar ile birlikte uygulanabilir. Uygulama sistemik veya lokal olabilir.
Spesifik durumlarda, bulusun antikorlarini tedaviye ihtiyaci olan alana lokal olarak uygulamak arzu edilebilir; bu, örnegin ve sinirlandirma yolu olmaksizin, lokal infüzyon ile, enjeksiyon ile veya bir implant vasitasiyla basarilabilir, söz konusu implant membranlari ve matriksleri, örnegin, siyalastik membranlari, polimerleri, fibröz matriksleri (örnegin, Tissuel®) veya kollajen matriksleri, Içeren bir poröz veya poröz- olmayan materyaldendir. Örnegin, bulusun bir veya birden fazla antikorunun bir etkili miktari, bir bozuklugu veya bunun bir semptomunu önlemek, tedavi etmek, yönetmek ve/veya sagaltmak için bir süjenin etkilenmis alanina lokal olarak uygulanabilir. ilaveten, bulusun bir veya birden fazla antikorunun bir etkili miktari, bir bozuklugu veya bunun bir veya birden fazla semptomunu önlemek, tedavi etmek, yönetmek ve/veya sagaltmak için bulusun bir antikoru disindaki bir veya birden fazla terapinin (örnegin, bir veya birden fazla profilaktik veya terapötik ajanin) bir etkili miktari ile kombinasyon halinde bir süjenin etkilenmis alanina lokal olarak uygulanabilir.
Antikor ayrica, bir kontrollü salim veya sürdürülmüs salim sistemi içinde de aktarilabilir. Örnegin, bir pompa kontrollü veya sürdürülmüs salimi basarmak için kullanilabilir (bakiniz, Langer, yukarida; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Bir baska örnekte, polimerik materyaller, terapilerin kontrollü veya sürdürülmüs salimini basarmak Için kullanilabilir (bakiniz, örnegin, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol.
Numarali PCT Yayini; ve W099/20253 Numarali PCT Yayini. Sürdürülmüs salim formülasyonlarinda kullanilan polimerlerin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, poli(2-hidr0ksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilik asit), poli(etilen-ko-vinil asetat), poli(metakrilik asit), poliglikolidleri (PLG), polianhidritleri, poli(N-vinil pirrolidon), poli(vinil alkol), poliakrilamidi, poli(etilen glikol), polilaktidleri (PLA), poli(laktid-k0- glikolidler) (PLGA) ve poliortoesterleri içerir. Özel bir uygulamada, bir sürdürülmüs salim formülasyonunda kullanilan polimer, inerttir, sizinti yapabilen safsizliklardan yoksundur, saklama sirasinda kararlidir, sterildir ve biyo-parçalanabilir. Daha bir baska uygulamada, bir kontrollü veya sürdürülmüs salim sistemi profilaktik veya terapötik hedefin yakinina yerlestirilebilir, böylece sistemik dozun yalnizca bir fraksiyonu gerekli olur (bakiniz, örnegin, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, incelemede tartisilir. Teknikte uzmanligi olan biri tarafindan bilinen herhangi bir teknik, bulusun bir veya birden fazla antikorunu içeren sürdürülmüs salim formülasyonlarini üretmek için kullanilabilir. Bakiniz, örnegin, 4,526, 938 Numarali U.S. Patenti, Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained- Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. lnt'l.
Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760.
Bilesim bir antikoru kodlayan bir nükleotid asit oldugunda, nükleik asit, bunu uygun bir nükleik asit ekspresyon vektörünün parçasi olarak yapma ve bunu, örnegin, bir retroviral vektör kullanilmasi ile (bakiniz 4,980,286 Numarali U.S. Patenti) veya dogrudan enjeksiyon ile veya mikro-parçacik bombardimani (örnegin, bir gen tabancasi; Biolistic, Dupont) veya Iipitler veya hücre-yüzeyi reseptörleri veya transfekte etme ajanlari ile kaplama kullanilmasi ile veya bunu nükleusa girdigi bilinen bir homeokutu-benzeri peptide baglantili sekilde uygulama ile, intraselüler hale gelecegi sekilde uygulama ile, bunun kodlanan antikorunun ekspresyonunu tesvik etmek için in vivo uygulanabilir (bakiniz, örnegin, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA homolog rekombinasyon ile ekspresyon için konak hücre DNA'si içine katilabilir.
Bulusun bir farmasötik bilesimi, bunun hedefleme uygulama yolu ile uyumlu olacak sekilde formüle edilir. Uygulama yollarinin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, parenteral, örnegin, intravenöz, intradermal, subkütan, oral, intranazal (örnegin, inhalasyon), transdermal (örnegin, topikal), transmukozal ve rektal uygulamayi içerir.
Spesifik bir uygulamada, bilesim insanogluna intravenöz, subkütan, intramüsküler, oral, intranazal veya topikal uygulama için uyarlanmis bir farmasötik bilesim olarak rutin prosedürlere uygun sekilde formüle edilir. Tipik olarak, intravenöz uygulama için bilesimler steril izotonik sulu tampon içindeki çözeltilerdir. Gerekli oldugunda, bilesim ayrica bir çözündürme ajani ve bir lokal anestetik, örnegin, enjeksiyon yerindeki agriyi hafifletmek için lignokain de içerebilir.
Bulusun bilesimleri topikal olarak uygulanacaginda, bilesimler bir merhem, krem, transdermal yama, losyon, jel, sampuan, sprey, aerosol, çözelti, emülsiyon formunda veya teknikte uzmanligi olan bir kisi tarafindan iyi-bilinen bir baska formda formüle edilebilir. Bakiniz, örnegin, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995).
Püskürtülemeyen topikal dozaj formlari için, topikal uygulama ile uyumlu bir tasiyici veya bir veya birden fazla eksipiyan içeren ve sudan daha büyük olan bir dinamik viskoziteye sahip olan viskoz ila yari-kati veya kati formlar tipik olarak kullanilir. Uygun formülasyonlar, sinirlandirma olmaksizin, arzu edildiginde, sterilize edilen veya çesitli özellikleri, örnegin, mesela, ozmotik basinci, etkilemek için yardimci ajanlar (örnegin, koruyucular, stabilazörler, islatma ajanlari, tamponlar veya tuzlar) ile karistirilmis, çözeltileri, süspansiyonlari, emülsiyonlari, kremleri, merhemleri, tozlari, Iinimentleri, salvajlari ve benzerlerini içerir. Diger uygun topikal dozaj formlari, püskürtülebilen aerosol preparasyonlarini içerir, burada, örnegin, bir kati veya sivi inert tasiyici ile kombinasyon halindeki, etken madde bir basinçlandirilmis uçucu madde (örnegin, bir gazli itici gaz, örnegin, freon) ile bir karisim halinde veya bir sikistirilabilir sise içinde ambalajlanir. Nemlendiriciler veya nem tutucular ayrica, farmasötik bilesimlere ve arzu edildiginde dozaj formlarina da eklenebilir. Bu tarz ilave içerik maddelerinin örnekleri, teknikte iyi bilinir.
Bilesim intranazal olarak uygulanacaginda, bilesim bir aerosol form, sprey, bugu halinde veya damlalar formunda formüle edilebilir. Özel olarak, mevcut bulusa göre kullanim için profilaktik veya terapötik ajanlar, bir uygun itici gaz (örnegin, diklorodiflorometan, trikloroflorometan, diklorotetrafloroetan, karbon dioksit veya baska uygun gaz) kullanilmasi ile, basinçlandirilmis paketlerden veya bir nebülizörden bir aerosol sprey sunumu formunda kolaylikla aktarilabilir. Bir basinçlandirilmis aerosol durumunda, dozaj birimi bir ölçülmüs miktari aktarmak için bir valf saglama ile belirlenebilir. Bir solunum cihazi veya insüflatör içinde kullanim için, bilesigin ve bir uygun toz bazin, örnegin, Iaktozun veya nisastanin, bir toz karisimini içeren (örnegin, jelatinden olusturulan) kapsüller ve kartuslar formüle edilebilir.
Bilesim oral olarak uygulanacaginda, bilesimler tabletler, kapsüller, kaseler, jelkaplar (jelatin-kapsüller), çözeltiler, süspansiyonlar ve benzerleri formunda oral olarak formüle edilebilir. Tabletler veya kapsüller, farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar, örnegin, baglama ajanlari (örnegin, önceden-jelatin haline getirilmis misir nisastasi, polivinilpirrolidon veya hidroksipropil metilselüloz); dolgular (örnegin, laktoz, mikro- kristalli selüloz veya kalsiyum hidrojen fosfat); yaglayicilar (örnegin, magnezyum stearat, talk veya silika): parçalayicilar (örnegin, patates nisastasi veya sodyum nisasta glikolat): veya islatma ajanlari (örnegin, sodyum Iauril sülfat), ile geleneksel araçlar vasitasiyla hazirlanabilir. Tabletler, teknikte iyi-bilinen yöntemler ile kaplanabilir. Oral uygulama için sivi preparasyonlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, çözeltiler, suruplar veya süspansiyonlar, formunu alabilir veya bunlar kullanilmadan önce su veya baska uygun vehikül ile sulandirma için bir kuru ürün olarak sunulabilir. Bu tarz sivi preparasyonlar, farmasötik olarak kabul edilebilir katki maddeleri, örnegin, süspanse etme ajanlari (örnegin, sorbitol surubu, selüloz türevleri veya hidrojenlenmis yenilebilen kati yaglar); emülsifiye etme ajanlari (örnegin, Iesitin veya akasya): sulu-olmayan vehiküller (örnegin, badem yagi, yagli esterler, etil alkol veya fraksiyone edilmis bitkisel sivi yaglar); ve koruyucular (örnegin, metil veya propiI-p- hidroksibenzoatlar veya sorbik asit) ile geleneksel araçlar vasitasiyla hazirlanabilir. Preparasyonlar ayrica, uygun oldugu üzere, tampon tuzlari, aroma verme, renk verme ve tatlandirma ajanlari da içerebilir. Oral uygulama için preparasyonlar, bir profilaktik veya terapötik ajanin yavas salimi, kontrollü salimi veya sürdürülmüs salimi için uygun sekilde formüle edilebilir. Örnegin, bir solunum cihazi veya nebülizör kullanilmasi ile, pulmoner uygulama için, bilesimler bir aerosolize etme ajani ile formüle edilebilir. Bakiniz, örnegin, 6,019,968; antikoru, kombinasyon terapisi ve/veya bilesim, Alkermes AIR® pulmoner ilaç aktarim teknolojisi (Alkermes, lnc., Cambridge, Mass.) kullanilarak uygulanabilir.
Bilesimler enjeksiyon ile (örnegin, bolus enjeksiyon veya sürekli infüzyon ile) parenteral uygulama için formüle edilebilir. Enjeksiyon için formülasyonlar, bir eklenmis katki maddesi ile birim dozaj formu halinde (örnegin, ampuller halinde veya çok-dozlu kaplar halinde) sunulabilir. Bilesimler, süspansiyonlar, çözeltiler veya yagli veya sulu vehiküller içinde emülsiyonlar tarzindaki formlari alabilir ve formülatör ajanlar, örnegin, süspanse etme, stabilize etme ve/veya dagitma ajanlari, içerebilir. Alternatif olarak, etken madde, kullanilmadan önce bir uygun vehikül (örnegin, steril pirojensiz su) ile sulandirma için toz formunda olabilir. Ilave olarak, bilesimler depo preparasyonlari olarak formüle edilebilir. Bu tarz uzun-etkili formülasyonlar, implantasyon ile (örnegin, subkütan veya intramüsküler olarak) veya intramüsküler enjeksiyon ile uygulanabilir.
Böylelikle, örnegin, bilesimler uygun polimerik veya hidrofobik materyaller ile (örnegin, bir kabul edilebilir sivi yag içinde bir emülsiyon olarak) veya iyon degisim reçineleri ile veya eser miktarda çözünebilen türevler olarak (örnegin, bir eser miktarda çözünebilen tuz olarak) formüle edilebilir.
Bilesimler, nötral formlar veya tuz formlari olarak formüle edilebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar, anyonlar, örnegin, hidroklorik, fosforik, asetik, oksalik, tartarik asitler ve benzerlerinden türetilenler, ile olusturulanlari ve katyonlar, örnegin, sodyumdan, potasyumdan, amonyumdan, kalsiyumdan, ferrik hidroksitlerden, izopropilaminden, trietilaminden, 2-etilamino etanolden, histidinden, prokain ve benzerlerinden türetilenler ile olusturulanlari içerir.
Genel olarak, bilesimlerin içerik maddeleri ayri ayri veya birim dozaj formu içinde birlikte karistirilmis olarak, örnegin, bir hermetik olarak sizdirmaz hale getirilmis kap, örnegin, aktif ajanin miktarini gösteren bir ampul veya tek dozluk paket, içinde bir kuru oldugunda, bilesim steril farmasötik gradli su veya salin içeren bir infüzyon sisesi ile dagitilabilir. Uygulama modu enjeksiyon ile oldugunda, bir enjeksiyonluk steril su veya salin ampulü saglanabilir, böylece içerik maddeleri uygulamadan önce karistirilabilir. Özel olarak, bulus ayrica, bulusun antikorlarinin veya farmasötik bilesimlerinin birinin veya birden fazlasinin, bir hermetik olarak sizdirmaz hale getirilmis kap, örnegin, antikorun miktarini gösteren bir ampul veya tek dozluk paket, içinde ambalajlanmasini da saglar. Bir uygulamada, bulusun antikorlarinin veya farmasötik bilesimlerinin biri veya birden fazlasi, bir hermetik olarak sizdirmaz hale getirilmis kap içinde bir kuru sterilize edilmis Iiyofilize edilmis toz veya susuz konsantre olarak saglanir ve bir süjeye uygulama için uygun konsantrasyona (örnegin, su veya salin ile) rekonstitüye edilebilir.
Bir uygulamada, bulusun antikorlarinin veya farmasötik bilesimlerinin biri veya birden fazlasi, en az 5 mg, örnegin, en az 10 mg, en az 15 mg, en az 25 mg, en az 35 mg, en az 45 mg, en az 50 mg, en az 75 mg veya en az 100 mg olan bir birim dozajda bir hermetik olarak sizdirmaz hale getirilmis kap içinde bir kuru steril Iiyofilize edilmis toz olarak saglanir. Bulusun Iiyofilize edilmis antikorlari veya farmasötik bilesimleri, bunun orijinal kabi içinde 2°C ila 8°C araliginda saklanmalidir ve bulusun antikorlari veya farmasötik bilesimleri, rekonstitüye edildikten sonra 1 hafta içinde, örnegin, 5 gün saat içinde, 3 saat içinde veya 1 saat içinde uygulanmalidir. Bir alternatif yönünde, bulusun antikorlarinin veya farmasötik bilesimlerinin biri veya birden fazlasi, antikorun miktarini ve konsantrasyonunu gösteren bir hermetik olarak sizdirmaz hale getirilmis kap içinde sivi formda saglanir. Bir ilave uygulamada, uygulanan bilesimin sivi formu, bir hermetik olarak sizdirmaz hale getirilmis kap içinde en az 0,25 mg/ml, örnegin, en mg/ml, en az 15 mg/kg, en az 25 mg/ml, en az 50 mg/ml, en az 75 mg/ml veya en az 100 mg/ml olarak saglanir. Sivi form, bunun orijinal kabi içinde 2°C ila 8°C araliginda saklanmalidir.
Bulusun antikorlari, parenteral uygulama için uygun bir farmasötik bilesime katilabilir.
Bir yönünde, antikorlar, 0,1-250 mg/ml antikor içeren bir enjektabl çözelti olarak hazirlanacaktir. Enjektabl çözelti, bir flint veya amber viyal, ampul veya önceden- doldurulmus siringa içindeki bir sivi veya Iiyofilize edilmis dozaj formundan olusturulabilir. Tampon, pH 5,0 ila 7,0'da (optimal olarak pH 6,0'da), optimal olarak olabilir. Diger uygun tamponlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sodyum süksinati, sodyum sitrati, sodyum fosfati veya potasyum fosfati içerir.
Sodyum klorür, bir konsantrasyonda çözeltinin toksisitesini modifiye etmek için kullanilabilir. Dondurarak- koruyucular, prensip olarak %0-10'luk sükroz (optimal olarak %0,5-1,0), bir Iiyofilize edilmis dozaj formu için dahil edilebilir. Diger uygun dondurarak-koruyucular, trehalozu ve laktozu içerir. Yiginlama ajanlari, prensip olarak %1-10'Iuk mannitol (optimal olarak dozaj formlarinda kullanilabilir. Diger uygun yiginlama ajanlari, glisini, arjinini içerir, %0- sürfaktanlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, polisorbat 20 ve BRIJ sürfaktanlarini içerir. Parenteral uygulama için bir enjektabl çözelti olarak hazirlanan bulusun antikorlarini içeren farmasötik bilesim ilaveten, bir adjuvan olarak kullanisli bir ajan, örnegin, antikorun emilimini veya dispersiyonunu arttirmak için kullanilanlari, içerebilir.
Bir özel olarak kullanisli adjuvan, bir hiyalüronidazdir, örnegin, Hylenex® (rekombinant insan hiyalüronidazidir). Enjektabl çözeltiye hiyalüronidaz eklenmesi, parenteral uygulamayi, özellikle subkütan uygulamayi, takiben insan biyo-yararlanimini iyilestirir.
Bu ayrica, daha az agri ve rahatsizlik ve minimum enjeksiyon yeri reaksiyonlari insidansi ile daha büyük (yani, 1 ml'den daha büyük) enjeksiyon yeri hacmine de izin Numarali U.S. Patent Basvurusu Yayini).
Bu bulusun bilesimleri, çesitli formlarda olabilir. Bunlar, örnegin, sivi, yari-kati ve kati dozaj formlarini, örnegin, sivi çözeltileri (örnegin, enjektabl ve infüze edilebilen çözeltileri), dispersiyonlari veya süspansiyonlari, tabletleri, haplari, tozlari, Iipozomlari ve süpozituvarlari içerir. Tercih edilen form, hedeflenen uygulama moduna ve terapötik uygulamaya dayanir. Bilesimler, enjektabl veya infüze edilebilen çözeltiler, örnegin, insanlarin diger antikorlar ile pasif immünizasyonu için kullanilanlara benzeyen bilesimler, formunda olabilir. Bir uygulamada, antikor intravenöz infüzyon veya enjeksiyon ile uygulanir. Bir baska uygulamada, antikor intramüsküler veya subkütan enjeksiyon ile uygulanir.
Terapötik bilesimler tipik olarak, üretim ve saklama kosullari altinda steril ve kararli olmalidir. Bilesim, bir çözelti, mikro-emülsiyon, dispersiyon, Iipozom veya yüksek ilaç konsantrasyonuna uygun baska düzenli yapi olarak formüle edilebilir. Steril enjektabl çözeltiler, uygun bir çözücü içinde gerekli miktardaki aktif bilesigi (yani, mevcut bulusun bir baglama proteinini, örnegin, bir antikorunu) yukarida listelenen içerik maddelerinin birine veya bir kombinasyonuna katma, gerektiginde, akabinde filtreli sterilizasyon, ile hazirlanabilir. Genel olarak, dispersiyonlar, aktif bilesigi bir bazik dispersiyon vasati ve yukarida Iistelenenlerden gerekli olan baska içerik maddelerini içeren bir steril vehiküle katma ile hazirlanir. Steril enjektabl çözeltilerin preparasyonu için steril, Iiyofilize edilmis tozlar durumunda, preparasyon yöntemleri, bunun bir önceden steril-filtrelenmis çözeltisinden etken maddenin arti herhangi bir ilave arzu edilen içerik maddesinin bir tozunu üreten vakum ile kurutmadir ve sprey ile kurutmadir. Bir çözeltinin uygun akiskanligi, örnegin, bir kaplama, örnegin, lesitin, kullanilmasi ile, dispersiyon durumunda gerekli olan parçacik boyunun idamesi ile ve sürfaktanlarin kullanilmasi ile, idame ettirilebilir. Enjektabl bilesimlerin uzatilmis emilimi, bilesime emilimi geciktiren bir ajani, örnegin, monostearat tuzlarini ve jelatini, dahil etme ile gerçeklestirilebilir.
Mevcut bulusun antikorlari, teknikte bilinen çesitli yöntemler ile uygulanabilir. Çok sayida terapötik uygulama için, tercih edilen uygulama yolu/modu subkütan enjeksiyon, intravenöz enjeksiyon veya infüzyon olabilir. Uzmanligi olan kisi tarafindan anlasilacagi üzere, uygulama yolu ve/veya modu, arzu edilen sonuçlara bagli olarak çesitlilik gösterecektir. Belirli uygulamalarda, aktif bilesik, bilesigi çabuk salima karsi koruyacak olan, implantlari, transdermal yamalari ve mikro-enkapsüle edilmis aktarim sistemlerini içeren, bir tasici, örnegin, bir kontrollü salim formülasyonu, ile hazirlanabilir. Biyo- parçalanabilen, biyo-uyumlu polimerler, örnegin, etilen vinil asetat, polianhidritler, poliglikolik asit, kollajen, poliortoesterler ve polilaktik asit, kullanilabilir. Bu tarz formülasyonlarin preparasyonu için çok sayida yöntem patentlidir veya genel olarak teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinir. Bakiniz, örnegin, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Belirli uygulamalarda, bulusun bir antikoru, örnegin, bir inert diluent veya bir benzetilebilir yenilebilen tasiyici ile, oral olarak uygulanabilir. Bilesik (ve arzu edildiginde, baska içerik maddeleri) ayrica, bir sert veya yumusak kilifli jelatin kapsül içine de koyulabilir, tabletler halinde sikistirilabilir veya süjenin diyetine dogrudan katilabilir. Oral terapötik uygulama için, bilesikler, eksipiyan ile katilabilir ve agizdan alinabilen tabletler, bukkal tabletler, yuvarlak yassi haplar, kapsüller, eliksirler, süspansiyonlar, suruplar, vaferler ve benzerleri formunda kullanilabilir. Bulusun bir antikorunu parenteral uygulama disindaki bir uygulama ile uygulamak için, antikoru bunun inaktivasyonunu önleyen bir materyal ile kaplamak veya bilesigi bunun inaktivasyonunu önleyen bir materyal ile birlikte-uygulamak gerekebilir.
Takviyesel aktif bilesikler ayrica, bilesimlere de katilabilir. Belirli uygulamalarda, bulusun bir antikoru, burada tarif edilen bozukluklari veya hastaliklari tedavi etmek için yararli olan bir veya birden fazla ilave terapötik ajan ile birlikte-formüle edilir ve/veya ile birlikte-uygulanir. Örnegin, bulusun bir anti-RGMa antikoru, diger hedefleri baglayan bir veya birden fazla ilave antikor (örnegin, diger çözünebilen antijenleri baglayan veya hücre yüzeyi moleküllerini baglayan antikorlar) ile birlikte-formüle edilebilir ve/veya ile birlikte-uygulanabilir. ilaveten, bulusun bir veya birden fazla antikoru, yukaridaki terapötik ajanlarin ikisi veya daha fazlasi ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Bu tarz kombinasyon terapileri avantajli bir sekilde, uygulanan terapötik ajanlarin daha düsük dozajlarindan yararlanabilir, böylece çesitli monoterapiler ile iliskili olasi toksisitelerden veya komplikasyonlardan kaçinilabilir.
Belirli uygulamalarda, bulusun bir antikoru teknikte bilinen bir yari-ömrü uzatan vehiküle baglanir. Bu tarz vehiküller, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, FC alanini, polietilen glikolü ve dekstrani içerir. Bu tarz vehiküller, örnegin, O9/428,082 Seri Numaralari U.S.
Basvurusunda ve yayinlanmis WO 99125044 Numarali PCT Basvurusunda tarif edilir.
Bulusun bir antikorunu kodlayan nükleotid dizileri içeren nükleik asit dizileri. gen terapisi yoluyla bir bozuklugu veya bunun bir veya birden fazla semptomunu tedavi etmek, önlemek, yönetmek veya sagaltmak için uygulanabilir. Gen terapisi, bir süjeye bir eksprese edilmis veya eksprese edilebilen nükleik asidin uygulamasi ile gerçeklestirilen terapiyi ifade eder. Nükleik asitler, bulusun, bir profilaktik veya terapötik etkiye aracilik eden bunlarin kodlanmis antikorunu üretebilir.
Teknikte mevcut olan gen terapisi için yöntemlerin herhangi biri mevcut bulusa göre kullanilabilir. Gen terapisinin yöntemlerinin genel incelemeleri için, bakiniz, Goldspiel et May, :155-215. Kullanilabilen rekombinant DNA teknolojisi tekniginde yaygin bir sekilde bilinen yöntemler, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, .John Wiley & Sons, NY (1993); ve Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press. NY (1990) kaynaklarinda tarif edilir.
Bulusun antikorlari, nörit dejenerasyonu ile iliskili hastaliklari veya rahatsizliklari, örnegin, multipl sklerozu, Alzheimer hastaligini, Down sendromunu, demansi, Parkinson hastaligini, santral sinir Sistemine bir travmatik yaralanmayi veya RGMa ile iliskili herhangi bir baska hastaligi veya rahatsizligi, tedavi etmek için tek basina veya kombinasyon halinde kullanilabilir.
Bulusun antikorlarinin tek basina veya bir veya birden fazla ilave ajan, örnegin, bir terapötik ajan (örnegin, bir küçük molekül veya biyolojik), ile kombinasyon halinde kullanilabilecegi anlasilmalidir, söz konusu ilave ajan bunun hedeflenen amaci için uzmanligi olan kisi tarafindan seçilir. Örnegin, ilave terapötik ajan, multipl skleroz ile iliskili bir veya birden fazla semptomu tedavi eden bir immunosüpresan veya bir ajan olabilir. Ilave ilaç bir beta interferon olabilir. Beta interferonlar, örnegin, Avonex, Betaseron, Extavia ve Rebif, multipl skleroz semptomlarinin zamanla agirlasma hizini yavaslatabilir. Ilave ajan, immün sistemin miyelin üzerindeki saldirisini bloke edebilen Glatiramer (Copaxone) olabilir. Ilave ajan, immün hücreleri lenf nodlari içinde kistirabilen Fingolimod (Gilenya) olabilir. Ilave ajan, potansiyel olarak hasar veren immün hücrelerin kan dolasimindan beyne ve omurilige hareketine müdahale edebilen Natalizumab (Tysabri) olabilir. Ilave ilaç, bir immunosüpresan ilaç olan Mitoxantrone (Novantrone) olabilir.
Ilave terapötik ajan, beynin bozulmus insan bilissel yetilerini (yani, düsünmeyi, ögrenmeyi ve hafizayi) iyilestiren bir ilaç olan bir "bilissel güçlendirme ilaci" olabilir.
Bilissel güçlendirme ilaçlari, nörokimyasallarin (örnegin, nörotransmitterlerin, enzimlerin ve hormonlarin) yararlanimini degistirme ile, oksijen tedariki iyilestirme ile, sinir büyümesini stimüle etme ile veya sinir hasarini inhibe etme ile, çalisir. Bilissel güçlendirme ilaçlarinin örnekleri, asetilkolinin aktivitesini arttiran bir bilesigi, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, bir asetilkolin reseptörü agonistini (örnegin, bir nikotinik 0i-7 reseptörü agonistini veya allosterik modülatörünü, bir 04ß2 nikotinik reseptörü agonistini veya allosterik modülatörlerini), bir asetilkolinesteraz inhibitörünü (örnegin, donepezil, rivastigmin ve galantamin), bir bütirilkolinesteraz inhibitörünü, bir N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörü antagonistini (örnegin, memantin), bir aktivite- bagimli nöro-koruyucu protein (ADNP) agonistini, bir serotonin 5-HT1A reseptörü agonistini (örnegin, ksaliproden), bir 5-HT4 reseptörü agonistini, bir 5-HT6 reseptörü antagonistini, bir serotonin 1A reseptörü antagonistini, bir histamin H3 reseptörü antagonistini, bir kalpain inhibitörünü, bir vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) proteinini veya agonistini, bir trofik büyüme faktörünü, bir anti-apoptotik bilesigi, bir AMPA-tipi glutamat reseptörü aktivatörünü, bir L-tipi veya N-tipi kalsiyum kanali blokörünü veya modülatörünü, bir potasyum kanali blokörünü, bir hipoksi ile indüklenebilen faktör (HIF) aktivatörünü, bir HIF prolil 4-hidr0ksilaz inhibitörünü, bir anti- enflamatuvar ajani, amiloid Aß peptidinin veya amiloid plaginin bir inhibitörünü, tau hipeifosforilasyonunun bir inhibitörünü, bir fosfodiesteraz 5 inhibitörünü (örnegin, tadalafil, sildenafil), bir fosfodiesteraz 4 inhibitörünü, bir monoamin oksidaz inhibitörünü veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir tuzunu içerir. Bu taiz bilissel güçlendirme ilaçlarinin spesifik örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, kolinesteraz inhibitörlerini, örnegin, donepezili (Aricept®), rivastigmini (Exelon®), galantamini (Reminyl®), N-metil-D-aspartat antagonistlerini, örnegin, memantini (Namenda®) içerir.
En az bir bilissel güçlendirme ilaci, mevcut bulusun antikorlari ile es-zamanli olarak veya mevcut bulusun bir antikoru ile tedavi edilmekte olan hastaligi veya rahatsizligi tedavi etmek için yararli oldugu güncel olarak bilinen veya gelecekte bilinecek olan ajanlari içeren mevcut bulusun antikorlari ile (ve herhangi bir sirada) sirali olarak uygulanabilir. Ilave olarak, burada tarif edilen bilesimlerin, yukarida-tarif edilen tedavide kullanildiginda, eklemeli veya sinerjistik etkilere sahip olabilecegine inanilir. Ilave ajan ayrica, terapötik bilesime bir yararli özellik veren bir ajan, örnegin, bilesimin viskozitesini etkileyen bir ajan da olabilir.
Kombinasyonlarin bunlarin hedeflenen amaci için yararli olan kombinasyonlar oldugu ilaveten anlasilmalidir. Yukarida izah edilen ajanlar açiklayici amaçlar içindir ve sinirlayici olmasi amaçlanmaz. Kombinasyonlar bir antikor ve asagidaki listelerden seçilen en az bir ilave ajan içerebilir. Kombinasyon ayrica, kombinasyon olusturulan bilesimin bunun hedeflenen fonksiyonunu gerçeklestirebilecegi sekilde oldugunda, birden fazla Ilave ajan, örnegin, iki veya Üç ilave ajan da içerebilir.
Farmasötik bilesimler, bir antikorun bir "terapötik olarak etkili miktarini" veya bir edilen terapötik sonucu basarmak için, gerekli olan dozajlarda ve zaman periyotlari boyunca, etkili olan bir miktari ifade eder. Antikorun bir terapötik olarak etkili miktari, teknikte uzmanligi olan bir kisi tarafindan belirlenebilir ve faktörlere, örnegin, bireyin hastalik durumuna, yasina, Cinsiyetine ve agirligina ve antikorun bireyde arzu edilen bir yaniti ortaya çikarma yetisine, göre çesitlilik gösterebilir. Bir terapötik olarak etkili miktar ayrica, burada antikorun, eger varsa, toksik veya zararli etkilerine kiyasla terapötik olarak yararli etkilerinin agir bastigi bir miktardir. Bir "profilaktik olarak etkili miktar", arzu edilen profilaktik sonucu basarmak için, gerekli olan dozajlarda zaman periyotlari boyunca, etkili olan bir miktari ifade eder. Tipik olarak, bir profilaktik doz hastaliktan önce veya hastaligin erken bir evresinde süjelerde kullanildigindan, profilaktik olarak etkili miktar, terapötik olarak etkili miktara kiyasla daha az olacaktir.
Dozaj rejimleri, arzu edilen optimum yaniti (örnegin, bir terapötik veya profilaktik yaniti) saglamak için ayarlanabilir. Örnegin, bir tek bolus, uygulanabilir, zaman içinde birkaç bölünmüs doz uygulanabilir veya doz terapötik durumun mecburiyetleri ile gösterildigi üzere orantili bir sekilde azaltilabilir veya arttirilabilir. Uygulama kolayligi ve dozaj tekdüzeligi için parenteral bilesimleri dozaj birim formu halinde formüle etmek özellikle avantajlidir. Burada kullanildigi sekliyle, dozaj birim formu, tedavi edilecek olan memeli süjeler için birimsel dozajlar olarak uygun fiziksel olarak ayrik birimleri ifade eder; her bir birim, aktif bilesigin gerekli olan farmasötik tasiyici ile iliskili olarak arzu edilen terapötik etkiyi üretmek için hesaplanan bir önceden-belirlenmis miktarini içerir. Dozaj birim formlari için spesifikasyon, (a) aktif bilesigin essiz karakteristikleri ve basarilacak olan özel terapötik veya profilaktik etki ve (b) bireylerdeki duyarliligin tedavisi için bu tarz bir aktif bilesigin bilesik haline getirme teknigindeki içsel sinirlandirmalari ile dikte edilir ve dogrudan bunlara baglidir.
Antikorun bir terapötik veya profilaktik olarak etkili miktari için bir emsal, sinirlayici- olmayan aralik, 0,1 ve 200 mg/kg araligindaki, örnegin, 0,1 ve 10 mg/kg araligindaki, bir dozdur. Antikorun terapötik veya profilaktik olarak etkili miktari, 1 ve 200 mg/kg, 10 olabilir. Dozaj degerlerinin hafifletilecek olan rahatsizligin tipi ve siddeti ile çesitlilik gösterebilecegi bildirilecektir. Ilaveten, antikorun dozu teknikte uzmanligi olan bir kisi tarafindan belirlenebilir ve faktörlere, örnegin, bireyin hastalik durumuna, yasina, cinsiyetine ve agirligina ve antikorun bireyde arzu edilen bir yaniti ortaya çikarma yetisine göre çesitlilik gösterebilir. Doz ayrica, burada antikorun, eger varsa, toksik veya zararli etkilerine kiyasla terapötik olarak yararli etkilerinin agir bastigi bir dozdur. ilaveten, herhangi bir özel süje için, spesifik dozaj rejimlerinin. bireyin ihtiyacina ve bilesimlerin uygulamasini yapan veya denetleyen kisinin profesyonel yargisina göre zaman içinde ayarlanmasi gerektigi ve burada izah edilen dozaj araliklarinin yalnizca emsal oldugu anlasilacaktir. 4. Nörit Dejenerasyonu ile Iliskili bir Hastaligi Tedavi Etmenin, Önlemenin, Modüle Etmenin veya Atenüe Etmenin Yöntemi Herhangi bir süjede, süjenin bir nörit dejeneratif bozukluga sahip olup olmadigi ile ilgili bir degerlendirme yapilabilir. Degerlendirme, terapinin uygun bir seyrini, örnegin, önleyici terapiyi, idame terapisini veya modülatif terapiyi, gösterebilir. Bu dogrultuda, nörit dejenerasyonunun bir hastaligini/bozuklugunu tedavi etmenin, önlemenin, modüle etmenin veya atenüe etmenin bir yöntemi burada saglanir. Antikor, buna ihtiyaci olan bir süjeye uygulanabilir. Antikor bir terapötik olarak etkili miktarda uygulanabilir.
Genel olarak, uygulanan antikorlarin dozaji, hastanin yasi, agirligi, boyu, cinsiyeti, genel saglik durumu ve önceki tibbi öyküsü tarzinda faktörlere bagli olarak çesitlilik gösterecektir. Sartlar gerektirdiginde, bir daha düsük veya daha yüksek dozajin da uygulanabilmesine ragmen, tipik olarak, aliciya antikor bileseninin, immüno-konjugatin veya füzyon proteininin yaklasik 1 pg/kg ila 10 mg/kg (ajanin miktari/hastanin vücut agirligi) araligindaki bir dozajini saglamak arzu edilebilir. Dozaj rejimleri, arzu edilen optimum yaniti (örnegin, bir terapötik veya profilaktik yaniti) saglamak için ayarlanabilir. Örnegin, bir tek bolus, uygulanabilir, zaman içinde bir kaç bölünmüs doz uygulanabilir veya doz terapötik durumun mecburiyetleri ile gösterildigi üzere orantili bir sekilde azaltilabilir veya arttirilabilir. Uygulama kolayligi ve dozaj tekdüzeligi için parenteral bilesimleri dozaj birim formu halinde formüle etmek özellikle avantajlidir. Burada kullanildigi sekliyle, dozaj birim formu, tedavi edilecek olan memeli süjeler için birimsel dozajlar olarak uygun fiziksel olarak ayrik birimleri ifade eder; her bir birim, aktif bilesigin gerekli olan farmasötik tasiyici ile iliskili olarak arzu edilen terapötik etkiyi üretmek Için hesaplanan bir önceden-belirlenmis miktarini içerir. Mevcut bulus dozaj birim formlari için spesifikasyon, (a) aktif bilesigin essiz karakteristikleri ve basarilacak olan özel terapötik veya profilaktik etki ve (b) bireylerdeki duyarliligin tedavisi için bu tarz bir aktif bilesigin bilesik haline getirme teknigindeki içsel sinirlandirmalari ile dikte edilir ve dogrudan bunlara baglidir.
Bulusun bir antikorunun veya antikor kisminin bir terapötik veya profilaktik olarak etkili miktari için bir emsal, sinirlayici-olmayan aralik, 0,1-20 mg/kg, daha tercihen 0,5-10 mg/kg, araligindadir. Dozaj degerlerinin hafifletilecek olan rahatsizligin tipi ve siddeti ile çesitlilik gösterebilecegi bildirilecektir. ilaveten, herhangi bir özel süje için, spesifik dozaj rejimlerinin, bireyin ihtiyacina ve bilesimlerin uygulamasini yapan veya denetleyen kisinin profesyonel yargisina göre zaman içinde ayarlanmasi gerektigi ve burada izah edilen dozaj araliklarinin yalnizca emsal oldugu anlasilacaktir.
Antikorlarin bir hastaya uygulanmasi, intravenöz, intraarteriyel, intraperitoneal, intramüsküler, subkütan, intraplevral, intratekal, intraoküler, intravitreal, bir rejyonel kateter yoluyla perfüzyon ile veya dogrudan intralezyonel enjeksiyon ile olabilir.
Terapötik proteinleri enjeksiyon ile uygularken, uygulama, sürekli infüzyon ile veya tek veya çok sayida bolus ile olabilir. intravenöz enjeksiyon, antikorlari çabuk bir sekilde dagitmada dolasimin bütünlügünden dolayi uygulamanin yararli bir modunu saglar.
Antikor oral olarak, örnegin, bir inert diluent veya bir benzetilebilen yenilebilen tasiyici ile, uygulanabilir. Antikor ve diger içerik maddeleri, arzu edildiginde, bir sert veya yumusak kilifli jelatin kapsül içine de koyulabilir, tabletler, bukkal tabletler, yuvarlak yassi haplar, kapsüller, eliksirler, süspansiyonlar, suruplar, vaferler ve benzerleri halinde sikistirilabilir.
Anti-RGMa antikorlari, düsük protein dozlarinda, örnegin, bir kere veya tekrarli bir sekilde, parenteral olarak, verilen her bir doz için 20 miligram ila 2 gram protein, olarak uygulanabilir. Alternatif olarak, antikorlar, her bir doz için 20 ila 1000 miligram protein miligram protein olan dozlarda uygulanabilir.
Antikorlar tek basina uygulanabilir veya bunlar lipozomlara konjuge edilebilir ve farmasötik olarak yararli bilesimler hazirlamak için bilinen yöntemlere göre formüle edilebilir, bu yolla antikorlar bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici ile bir karisim içinde birlestirilir. Bir “farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici", bir alici hasta tarafindan tolere edilebilir. Steril fosfat-tamponu salin, bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicinin bir örnegidir. Diger uygun tasiyicilar teknikteki kisiler tarafindan iyi bilinir. Bakiniz, örnegin, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (1995).
Terapi amaçlariyla, antikorlar bir hastaya bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici içinde bir terapötik olarak etkili miktarda uygulanir. Bir "terapötik olarak etkili miktar", fizyolojik olarak anlamli olan bir miktardir. Antikor, bunun varligi bir alici hastanin fizyolojisinde bir saptanabilen degisim ile sonuçlandiginda, fizyolojik olarak anlamlidir.
Mevcut baglamda, antikor, bunun varligi, örnegin, CD4+ T hücrelerinden azaltilmis interferon-y (INF-y), interlökin-2 (IL-2), lL-4 ve/veya lL-17 salgilanmasi, ile sonuçlandiginda, fizyolojik olarak anlamli olabilir. Bir ajan, bunun varligi, örnegin, periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'Ierde) azaltilmis proliferatif yanitlar ve/veya pro-enflamatuvar sitokin ekspresyonu, ile sonuçlandiginda, fizyolojik olarak anlamlidir.
Ilave tedavi yöntemleri, bir terapötik uygulamada bir antikorun etkisinin süresini kontrol etmek için kullanilabilir. Kontrollü salim preparasyonlari, antikoru kompleks haline getirmek veya adsorbe etmek için polimerlerin kullanimi yoluyla hazirlanabilir. Örnegin, biyo-uyumlu polimerler, poli(etilen-k0-vinil asetat) matrikslerini ve bir stearik asit dimerinin ve sebasik asidin bir polianhidrit kopolimerinin matrikslerini içerir. Sherwood proteinin moleküler agirligina, antikorun matriks içindeki miktarina ve dagilmis parçaciklarin boyutuna baglidir. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989); Sherwood et al., yukarida. Diger kati dozaj formlari, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th ed. (1995) kaynaginda tarif edilir. 3. Nörit Dejeneratif Bozukluklar/Hastaliklar Nörit bozukluk/hastalik, burada nörit hasarinin ve taviz verilmis sinaptik fonksiyonun bulundugu herhangi bir hastalik veya bozukluk olabilir. Bu hasar ve taviz verilmis fonksiyon, yeterli miyelinasyondan ve/veya akson transeksiyonundan yoksun olan sinirlerden kaynaklanabilir. Nörit dejeneratif bozukluk veya hastalik, örnegin, multipl skleroz, Alzheimer hastaligi; Parkinson hastaligi; amiyotrofik lateral skleroz ve baska moto-nöron hastaliklar; huntington hastaligi; Tay-Sachs hastaligi; Niemann-Pick hastaligi; Gaucher hastaligi; Hurler sendromu; idiyopatik enflamatuvar demiyelinizan hastaliklar; B12 vitamini eksikligi; santral pontin miyelinoliz; omurilik zafiyeti; transvers miyelit; Devic hastaligi, progresif multifokal Iökoensefalopati; optik nörit ve nörit dejenerasyonu ile iliskili baska retinopatiler, örnegin, glokom, diyabetik retinopati ve yasa-bagli maküler dejenerasyon, santral sinir sistemine travmatik yaralanma veya bir adlandirilan bir yagdan (lipoproteinden) olusan dokunun katmanlarinin yeterli sarilmasindan yolun olan sinir liflerinden kaynaklanabilir. Bu katmanlar miyelin kilifi olusturur. Miyelin kilif, elektriksel uyarilarin hiz ve kesinlik ile sinir lifi boyunca iletilmesine olanak saglayabilir. Miyelin kilif hasar gördügünde veya eksik oldugunda, sinirler elektriksel uyarilari normal bir sekilde iletmez. Bazen, hasar görmüs veya eksik miyelin kilifin bir sonucu olarak, sinir Iifleri de hasar görebilir.
Genç infantlar normal olarak, matür miyelin kiliflardan yoksun olabilir. Bunun bir sonucu olarak, bunlarin hareketleri sarsintili, koordine olmamis ve beceriksizdir. Miyelin kiliflar gelistikçe, hareketler daha yumusak, daha amaçli ve daha koordine olmus hale gelir.
Bununla birlikte, miyelin kiliflar belirli hastaliklari, örnegin, Tay-Sachs hastaligi, Niemann-Pick hastaligi, Gaucher hastaligi ve Hurler sendromu, olan çocuklarda normal bir sekilde gelismez.
Eriskinlerde, miyelin kilif inme, enflamasyon, immün bozukluklar, metabolik bozukluklar ve besinsel eksiklikler (örnegin, B12 vitamini eksikligi) ile yok edilebilir. Zehirler, ilaçlar (Örnegin, etambütol antibiyotigi) ve asiri alkol kullanimi miyelin kilifa hasar verebilir veya miyelin kilifi yok edebilir. Kilif kendini onarabildiginde ve yenileyebildiginde, normal sinir fonksiyonu geri dönebilir. Bununla birlikte, kilif siddetli bir sekilde hasar gördügünde, altta yatan sinir lifi ölebilir. Santral sinir sistemindeki (beyindeki ve omurilikteki) sinir Iifleri nadiren yenilediginden, bu tarz hasar geri-dönüsümsüzdür.
Demiyelinasyona neden olan bazi nörit dejeneratif bozukluklar agirlikli olarak santral sinir sistemini etkiler. Digerleri agirlikli olarak vücudun diger parçalarindaki sinirleri etkiler. Santral sinir sisteminde demiyelinasyona neden olan ve bilinen bir nedene sahip olmayan nörit dejeneratif bozukluklar primer demiyelinizan bozukluklar olarak adlandirilir. Multipl skleroz, bu bozukluklarin en yayginidir. (1) Multipl Skleroz MS'nin klinik seyri, dört majör kategoriye (veya alt-tipe) bölünebilir: relaps tekrarlayan (RRMS), sekonder progresif (SPMS), primer progresif (PMS) ve progresif relaps (PRMS). Araya-giren klinik olarak kararli periyotlar ile her bir kaç ayda veya yilda bir klinik relapslara sahip olan hastalar RRMS'yi tanimlar. RRMS, yasamin ikinci veya üçüncü on yilinda erkeklere kiyasla kadinlarda iki kat daha yaygin olabilir. RRMS'nin aksine, SPMS'si olan hastalar relapslar arasinda progresif bozulma gösterir. RRMS hastalari, zamanla nörolojik fonksiyonda bir kademeli düsüs ile karakterize edilen SPMS'ye dönüsebilir. MS hastalarin yaklasik %15'i, geç baslangiç veya hastalik baslangicindan itibaren nörolojik fonksiyonun bir amansiz bozulmasi ile karakterize edilen PPMS'ye sahiptir. Benign MS, ilk taniyi takiben 15 yildan daha uzun bir süre sonra hala hareketli olan ve yalnizca hafif-derecede kusurlar (Genisletilmis Engellilik Durumu Ölçegi [EDSS]) gösteren RRMS hastalari olarak keyfi bir sekilde tanimlanir.
Tipik olarak bu hastalar bunlarin ilk atagindan sonra çok az progresyon gösterir veya hiç progresyon göstermez ve terapötik müdahale gerektirmez; bununla birlikte, MS'nin bu formuna MS baslangicindan itibaren 5 yila kadar tani koymak mümkün degildir. (2) Parkinson Hastaligi Parkinson hastaligi, Bati Yarim Küre boyunca yaygindir ve ilk olarak 1817'de hekim James Parkinson tarafindan bildirilmistir. Parkinson hastaligi ilk olarak, bir uzuvda bir tremor olarak saptanabilir ve nihayetinde üç baska belirtiyi içerecek sekilde ilerleyebilir: (i) "disli çark" benzeri hareket ve "kursun boru" rijiditesi ile karakterize edilen rijidite; (ii) bradikinezi veya harekette yavaslama ve (iii) bir kambur durus ve bir bozulmus yürüyüs ile iliskili postural denge yoklugu. Bu degistirilmis hareketler, bir motor fonksiyon- bozuklugunun özellikleridir, ancak buna ek olarak, burada tüm Parkinson hastalarinin Parkinson hastaligi, beyinde Ievodopaminin bir kusurlu halinden kaynaklanabilir. Daha spesifik olarak, levodopamin Parkinson hastalarinda diskinezileri indükleyebilir ve siyah maddenin denervasyonu ile sonuçlanabilir. Günümüze kadar, tip bilimi, beyine ulasmak ve kan beyin bariyerini basarili bir sekilde geçmek için Ievodopanin bir enjektabl formuna izin verecek olan bir madde bulamamistir. Güncel dopamin replasman terapisi, dogrudan replasmani veya beyinde dopamin reseptörü yerlerinde etkinin taklit edilmesi amaçlanir. Levodopa terapisi baslangiçta bazi yararli degisimlere neden olurken, bu degisimler zamanla azalabilir ve diger problemlere, örnegin, siddetli uyku bozukluguna, diskinezilere ve sürekli bulantiya, neden olur. Parkinson hastaligina tibbi yaklasimlar, beynin dokusunun cerrahi tahribatini ve beynin etkilenmis kisimlarina mikro-elektrotlarin yerlestirilmesini (derin beyin elektriksel stimülasyonu) içerir.
Elektrotlarin yerlestirilmesi, geri-dönüsümlü olma avantajina sahiptir. Bununla birlikte, bu müdahaleler, genel olarak geçicidir ve ne Parkinsoniyan durumda bir kalici degisim üretir ne de hastaligin etkilerini tersine çevirir.
Parkinson hastaligi, asiri oksidasyondan dolayi evrilen, bir çok-faktörlü, nörodejeneratif bozukluk olabilir. Siyah madde, oksidatif hasara duyarlidir, bu Parkinson hastaliginin olusumunun bu teorisini destekler. Oksidatif fosforilasyonun anormallikleri, siyah maddenin mitokondrisini bozar ve serbest radikal üretimini arttirir. (3) Reaktif Oksijen Türlerinden (Serbest Radikallerden) Kaynaklanan Yaralanma Reaktif oksijen türleri (ROS) bir kaç doku tipine saldirabilir ve ROS'a kronik maruziyet çesitli biyolojik fonksiyonlari atenüe edebilir ve nörit dejeneratif bozukluklari ve hastaliklari içeren, bir kaç ciddi bozukluk tipinin riskini arttirabilir. ROS, nöronlara saldirabilir ve hücre ölümünü indükleyebilir. Örnegin, hidrojen peroksidin düsük konsantrasyonlari ile nöronlarin tedavisi nörit morfolojisindeki, bazen nörit boncuklanmasi olarak adlandirilan, zararli degisimleri etkileme ile nörit yaralanmasini indükleyebilir. Nörit boncuklanmasi, hidrojen peroksit ile muamele edilmis nöronlarin ölümünün indüksiyonundan önce nöronal dejenerasyonun erken olaylarinin biri olabilir. (4) Alzheimer Hastaligi Alzheimer hastaligi (AD), yaslilarda demansin majör nedenidir. AD'nin nadir genetik formlarinin var olmasina ragmen, genellikle aile öyküsü tanimlanmadigindan, çogu hasta sporadik AD'ye sahip oldugu sekilde siniflandirilir. Patolojik olarak, AD, karsilastirilabilir yastaki demans-olmamis bireylere kiyasla yaslilik plaklarinin ve nörofibriler yumaklarin bir arttirilmis sayisi ile nöronal ve sinaptik dejenerasyon ile karakterize edilir.
Alzheimer hastaliginin karakteristigi olan, yaslilik plaklari, amiloid öncül proteininin (APP) bir yikim ürünü olan kümelenmis beta-amiloidin bir santral çekirdeginden olusturulur. Nörofibriler yumaklar, mikrotübüller ile iliskili olan, tau olarak adlandirilan bir proteinin bir hiper-fosforile edilmis formundan yapilan çözünemeyen intraselüler iplik- benzeri yapilardir.
Alzheimer hastaliginin kurbanlarinin beyin dokusunun post-mortem kesitleri AD'nin karakteristigi olan nöritik plaklarin proteinli ekstraselüler çekirdeklerinin formu içinde amiloidin varligini gösterir. Bu nöritik plaklarin amiloid çekirdekleri, bir agirlikli olarak beta-plakalanmis yaprak konfigürasyonunda dizilen ß-amiloid olarak adlandirilan bir Kirschner et al., PNAS 83: 503 (1986). Nöritik plaklar, hastaligin bir erken ve invaryant Terry et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987).
Aß'nin ilk depolanmasi, klinik semptomlar fark edilebilir olmadan önce gerçeklesebilir.
AD'nin tanisi için güncel olarak tavsiye edilen "minimum mikroskobik kriterler", beyinde bulunan nöritik plaklarin sayisina dayanir. Khachaturian, Arch. Neurol., yukarida (1985). Ne yazik ki, nöritik plak sayilarinin degerlendirmesinin, ölümden sonraya ertelenmesi gerekir.
Amiloid-içeren nöritik plaklar, AD'de ayni zamanda Down Sendromu'nda ve AD gelistirmesi çok olasi olan, apolipoprotein E4 aleli için homozigot olan kisilerde beynin (ed.): PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY (Grune and Stratton, N.Y. 1973) pp. 1-26.
Beyin amiloidi, beyin kesitlerini tiyoflavin 8 veya Kongo kirmizisi ile boyama ile kolaylikla gösterilir. Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Kongo kirmizini ile boyanmis amiloid, bir sari-yesil polarizasyon rengi gösteren, bir dikronik görünüs ile karakterize edilir. Dikronik baglama, amiloid proteinlerin beta-plakalanmis biyokimyasinin ve histokimyasinin bir detayli tartismasi, Glenner, N. Eng. J. Med., 302: 1333 (1980) kaynaginda bulunabilir. (5) Santral Sinir Sistemine Travmatik Yaralama Amerika Birlesik Devletleri'nde travmatik beyin yaralanmasinin (TBI) insidansinin, yaklasik olarak 500.000 hastaneye yatis ile yillik olarak 2 milyondan fazla insan oldugu yaralanmasindan sag kalanlar kalici bir sekilde engellidir.
Bir süjenin santral sinir sistemindeki nöral yollar, nöronlar mekanik veya kimyasal travmaya veya nöronlari ölüm riskine atmak için yeterli olan nöropatik dejenerasyona tabi tutuldugunda, risk altindadir. Bazilarinin yalnizca periferik veya santral sinir sistemlerindeki nöronlarin bir alt-popülasyonunu veya bir sistemini etkiledigi nöropatilerin bir konagi günümüze kadar tanimlanmistir. Nöronlarin kendisini veya iliskili gliyal hücreleri etkileyebilen nöropatiler, hücresel metabolik fonksiyon- bozuklugundan, enfeksiyondan, toksik ajanlara maruziyetten, otoimmünite fonksiyon- bozuklugundan, yanlis-beslenmeden veya iskemiden kaynaklanabilir. Bazi olgularda, hücresel fonksiyon-bozuklugunun dogrudan hücre Ölümünü indükledigi düsünülür.
Diger olgularda, nöropati vücudun immün/enflamatuvar sistemini stimüle etmek yeterli olan doku nekrozunu indükleyebilir ve vücudun ilk nöral yaralanmaya immün yanitinin mekanizmalari akabinde, nöronlari ve bu nöronlar tarafindan tanimlanan yolu yok edebilir.
Süje, bir insan olabilen bir memeli olabilir. Süje, bir nörit dejeneratif bozukluga veya hastaliga sahip olabilir veya bir nörit dejeneratif bozukluk veya hastalik gelistirme riskinde olabilir. Süje bir nörit dejeneratif bozukluk veya hastalik için halihazirda tedavi aliyor olabilir.
. Taninin Yöntemi Bir süjenin nörit dejeneratif hastaliga veya bozukluga sahip olup olmadigini belirlemek için bir yöntem burada saglanir. Membran iliskili RGMa'nin düzeyi, ölçülebilir ve bir kontrol örnegindeki bir RGMa düzeyi ile karsilastirilabilir. Kontrol örnegi, bir normal dokudan olabilir. Kontrole kiyasla RGMa'nin bir degistirilmis düzeyi, süjenin bir nörit dejeneratif hastaliga veya bozukluga sahip oldugunu gösterebilir. Örnegin, bir normal kontrol ile karsilastirildiginda, RGMa'nin bir arttirilmis düzeyi süjenin bir nörit dejeneratif hastaliga veya bozukluga sahip oldugunu gösterebilir. RGMa'nin düzeyi, burada tarif edilen antikorlar kullanilarak ölçülebilir. a. Örnek Örnek, süjeden herhangi bir doku örnegi olabilir. Örnek, süjeden protein içerebilir. Örnek, kan, serum, plazma veya bir doku biyopsisi olabilir. Örnek, süjeden elde edildigi sekilde dogrudan veya örnegin bir karakteristigini modifiye etmek için ön-muameleyi takiben kullanilabilir. Ön-muamele, ekstraksiyonu, araya-giren bilesenlerin inaktivasyonunu ve/veya reaktiflerin eklenmesini içerebilir.
Herhangi bir hücre tipinden, dokudan veya vücut sivisindan bir örnek elde etmek amaciyla yararlanilabilir. Bu tarz hücre tipleri, dokular ve sivi, dokularin kesitlerini, örnegin, biyopsi ve otopsi örneklerini, histolojik amaçlar için alinan dondurulmus kesitleri, kani, plazmayi, serumu, balgami, diskiyi, gözyaslarini, mukusu, tükürügü, kili ve cildi içerebilir. Hücre tipleri ve dokular ayrica, lenf sivisini, assetik siviyi, jinekolojik siviyi, idrari, peritoneal siviyi, beyin-omurilik sivisini, vajinal çalkalamalar ile toplanan bir siviyi veya vajinal durulamalar ile toplanan bir siviyi da içerebilir. Bir doku veya hücre tipi, bir hayvandan elde edilen hücrelerin bir örnegini uzaklastirma ile saglanabilir, ancak ayrica önceden izole edilmis (örnegin, bir baska kisi tarafindan, bir baska zamana ve/veya bir baska amaç için izole edilmis) hücreler kullanilarak da tamamlanabilir. Arsivsel dokular, örnegin, tedavi veya sonuç öyküsüne sahip olanlar, da kullanilabilir. Protein saflastirmasi gerekli olmayabilir. b. RGMa Saptanmasi Bir vücut örneginde bulunan RGMa'nin varligi veya miktari, örnegin, RGMa'ya karsi burada tarif edilen antikorlar (monoklonal veya poliklonal) veya bunlarin fragmanlari kullanilarak kütle spektrometrisi, immünoanalizler veya immünohistokimya (örnegin, doku biyopsilerinden elde edilen kesitler ile), ile kolaylikla belirlenebilir. Anti-RGMa antikorlari ve bunlarin fragmanlari, yukarida tarif edildigi sekilde üretilebilir. Saptamanin ,480,792 Numarali U.S. Patentleri'nde, tarif edilenleri içerir. (1) Immünoanaliz RGMa ve/veya bunun peptitleri, bir immünoanaliz kullanilarak analiz edilebilir.
RGMa'nin varligi veya miktari, burada tarif edilen antikorlar kullanilarak ve RGMa'nin spesifik baglamasi saptanarak belirlenebilir. Örnegin, antikor veya bunun fragmani SEO ID NO: 65'i içeren bir polipeptidi veya bunun bir fragmanini spesifik olarak baglayabilir. Antikor veya bunun fragmani SEQ lD NO: 66'yi içeren bir polipeptidi veya bunun bir fragmanini spesifik olarak baglayabilir.
Herhangi bir immünoanalizden yararlanilabilir. Immünoanaliz, örnegin, bir enzime-bagli immünoanaliz (ELISA), radyoimmünoanaliz (RIA), bir kompetitif inhibisyon analizi, örnegin, ileri veya geri kompetitif inhibisyon analizleri, bir flüoresans polarizasyon analizi veya bir kompetitif baglama analizi, olabilir. ELISA bir sandviç ELISA olabilir.
Antikorun RGMa'yi spesifik immünolojik baglamasi dogrudan etiketler, örnegin, flüoresan veya Iüminesan etiketler, metaller ve antikora tutturulmus radyonüklidler, vasitasiyla veya dolayli etiketler, örnegin, alkalin fosfataz veya yaban turpu peroksidazi, vasitasiyla saptanabilir. immobilize edilmis antikorlarin veya bunlarin fragmanlarinin kullanimi, immünoanalize katilabilir. Antikorlar çesitli desteklere, örnegin, manyetik veya kromatografik matriks parçaciklarina, bir analiz plakasinin (örnegin, mikro-titre gözlerin) yüzeyine, bir kati substrat materyalinin parçalarina ve benzerlerine, immobilize edilebilir. Bir analiz seridi, bir dizilim içindeki antikoru veya birden fazla antikoru bir kati destege kaplama ile hazirlanabilir. Bu serit akabinde, test biyolojik örnegine daldirilabilir ve akabinde bir ölçülebilen sinyal, örnegin, bir renkli nokta, üretmek için yikamalar ve saptama adimlari yoluyla çabucak islenebilir. (a) Sandviç ELISA Sandviç ELISA, antikorlarin iki katmani (yani, yakalama ve bir saptama antikoru) arasinda antijenin miktarini ölçer. Ölçülecek olan RGMa, antikoru baglayabilen en az iki antijenik yer içerebilir. Monoklonal veya poliklonal antikorlar, sandviç ELlSA'da yakalama ve saptama antikorlari olarak kullanilabilir.
Genel olarak, en az iki antikor bir test örneginde RGMa'yi veya RGMa fragmanini ayirmak ve kantifiye etmek için kullanilir. Daha spesifik olarak, en az iki antikor RGMa'nin veya RGMa fragmanini belirli epitoplarini baglar, böylece bir "sandviç" olarak ifade edilen bir immün kompleks olusturur. Bir veya birden fazla antikor, test örnegi içindeki RGMa'yi veya RGMa fragmanini yakalamak için kullanilabilir (bu antikorlar siklikla bir "yakalama" antikoru veya "yakalama" antikorlari olarak ifade edilir) ve bir veya birden fazla antikor sandviçe bir saptanabilen (yani, kantifiye edilebilen) etiketi baglamak için kullanilir (bu antikorlar siklikla "saptama" antikoru veya "saptama" antikorlari olarak ifade edilir). Bir sandviç analizde, bunlarin epitopunu baglayan her iki antikor, analizdeki herhangi bir baska antikorun bunun ilgili epitopunu baglamasi ile azaltilmayabilir. Bir baska ifadeyle, antikorlar, RGMa veya RGMa fragmani içerdiginden süphelenilen bir test örnegi ile temas ettirilen bir veya birden fazla birinci antikorun ikinci veya müteakip antikorlar tarafindan taninan bir epitopun tümünü veya parçasini baglamadigi, böylece bir veya birden fazla ikinci saptama antikorunun RGMa'yi veya RGMa fragmanini baglama yetisine müdahale edildigi, sekilde seçilebilir.
Antikorlar, söz konusu immünoanalizde bir birinci antikor olarak kullanilabilir. Tercihen, antikor SEQ ID NO.'lari: 65'in, 66'nin veya 74'ün en az üç (3) bitisik amino asidini içeren epitoplari immünospesifik olarak baglar. Mevcut bulusun antikorlarina ek olarak, söz konusu immünoanaliz, SEQ ID NO.'lari: 65'in, 66'nin veya 74'ün en az üç (3) bitisik amino asidini içeren bir amino asit dizisine sahip olan epitoplari immünospesifik olarak baglayan bir ikinci antikoru içerebilir, burada ikinci antikorun bagladigi bitisik (3) amino asit birinci antikorun bagladigi bitisik (3) amino asitten farklidir.
Tercihen, RGMa veya RGMa fragmani içerdiginden süphelenilen bir test örnegi en az bir birinci yakalama antikoru (veya antikorlari) ve en az bir ikinci saptama antikorlari ile es-zamanli olarak veya sirali olarak temas ettirilebilir. Sandviç analiz formatinda, RGMA veya RGMa fragmani içerdiginden süphelenilen bir test örnegi ilk olarak, bir özel epitopu spesifik olarak baglayan en az bir birinci yakalama antikoru ile bir birinci antikor-RGMa kompleksinin olusumuna izin veren kosullar altinda temas ettirilir. Birden fazla yakalama antikoru kullanildiginda, bir birinci çok sayida yakalama antikoru-RGMa kompleksi olusturulur. Bir sandviç analizde, antikorlar, tercihen, en az bir yakalama antikoru, test örneginde beklenen RGMa veya RGMa fragmaninin maksimum miktarinin molar fazla miktarlarinda kullanilir. Örnegin, mikro-parçacik kaplama tamponunun her bir ml'si için antikorun yaklasik 5 pg/ml ila yaklasik 1 mg/ml'si kullanilabilir.
Opsiyonel olarak, test örnegini en az bir birinci yakalama antikoru ile temas ettirmeden önce, en az bir birinci yakalama antikoru birinci antikor-RGMa kompleksini test örneginden ayirmayi kolaylastiran bir kati destege baglanabilir. Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, gözler, tüpler veya bilyeler formlarinda polimerik materyallerden yapilan kati destekleri içeren teknikte bilinen herhangi bir kati destek kullanilabilir.
Antikor (veya antikorlar). bu tarz baglamanin antikorun RGMA`yi veya RGMa fragmanini baglama yetisine müdahale etmemesi kaydiyla, adsorpsiyon ile, bir kimyasal kuplaj ajani kullanilarak kovalent baglama ile veya teknikte bilinen diger araçlar ile kati destege baglanabilir. Dahasi, gerektiginde, kati destek antikor üzerindeki çesitli fonksiyonel gruplar ile reaktiviteye olanak saglamak için türevlendirilebilir. Bu tarz türevlendirme, belirli kuplaj ajanlarinin, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, maleik anhidritin, N-hidroksisüksinimidin ve 1-etiI-3-(3- dimetilaminopropil)karbodiimidin, kullanimini gerektirir.
RGMa veya RGMa fragmani içerdiginden süphelenilen test örnegi en az bir birinci yakalama antikoru ile temas ettirildikten sonra, test örnegi bir birinci yakalama antikoru (veya birden fazla antikor)-RGMa kompleksinin olusmasina olanak saglamak için inkübe edilir. Inkübasyon yaklasik 4.5 ile yaklasik 10,0 araligindaki bir pH'ta, yaklasik 2°C ila yaklasik 45°C araligindaki bir sicaklikta ve en az bir (1) dakika ila yaklasik on sekiz (18) saat, yaklasik 2-6 dakika veya yaklasik 3-4 dakika, araligindaki bir periyot boyunca yürütülebilir.
Birinci/çok sayida yakalama antikoru-RGMa k0mpleksinin olusumundan sonra, kompleks akabinde en az bir ikinci saptama antikoru ile (bir birinci/çok sayida antikor- RGMa-ikinci antikor kompleksinin olusumuna izin veren kosullar altinda) temas ettirilir.
Birinci antikor-RGMa kompleksi birden fazla saptama antikoru ile temas ettirildiginde, akabinde bir birinci/çok sayida yakalama antikoru-RGMa-çok sayida antikor saptama kompleksi olusturulur. Birinci antikor ile oldugu gibi, en azindan ikinci (ve müteakip) antikor birinci antikor-RGMa kompleksi ile temas ettirildiginde, yukarida tarif edilenlere benzer kosullar altinda bir inkübasyon periyodu birinci/çok sayida antikor-RGMa- ikinci/çok sayida antikor kompleksinin olusumu için gereklidir. Tercihen, en az bir ikinci antikor bir saptanabilen etiket içerir. Saptanabilen etiket, birinci/çok sayida antikor- RGMa-ikinci/çok sayida antikor kompleksinin olusumu öncesinde, sirasinda veya sonrasinda en az bir ikinci antikora baglanabilir. Teknikte bilinen herhangi bir saptanabilen etiket kullanilabilir. (b) Ileri Kompetitif Inhibisyon Bir ileri kompetitif formatta, bilinen bir konsantrasyondaki etiketlenmis RGMa'nin, RGMa fragmaninin veya bunun RGMa varyantinin bir alikotu, RGMa antikorunu (örnegin, mevcut bulusun bir antikorunu) baglama için bir test örnegi içindeki RGMa veya RGMa fragmani ile rekabet etmek için kullanilir.
Bir ileri kompetisyon analizinde, bir immobilize edilmis antikor (örnegin, mevcut bulusun bir antikoru) test örnegi ve bir etiketlenmis RGMa, RGMa fragmani veya bunun RGMa varyanti ile sirali olarak veya es-zamanli olarak temas ettirilebilir. RGMa peptidi, RGMa fragmani veya RGMa varyanti, anti-RGMa antikorlari ile baglantili olarak yukarida tartisilan saptanabilen etiketleri içeren, herhangi bir saptanabilen etiket ile etiketlenebilir. Bu analizde, antikor bir kati destek üzerinde immobilize edilebilir.
Alternatif olarak, antikor, bir kati destege, örnegin, mikro-parçaciga, immobilize edilmis olan bir antikora, örnegin, bir anti-tür antikora, kuple edilebilir.
Etiketlenmis RGMa peptidi, RGMa fragmani veya RGMa varyanti, test örnegi ve antikor, sandviç analiz formati ile baglantili olarak yukarida tarif edilenlere benzer kosullar altinda inkübe edilir. Akabinde, antikor-RGMa komplekslerinin iki farkli türü üretilebilir. Spesifik olarak, üretilen antikor-RGMa komplekslerinin biri bir saptanabilen etiket içerirken, diger antikor-RGMa kompleksi bir saptanabilen etiket içermez. Antikor- RGMa kompleksi, saptanabilen etiketin kantifikasyonundan önce test örneginin kalanindan ayrilabilir. ancak bu zorunlu degildir. Antikor-RGMa kompleksinin test örneginin kalanindan ayrilip ayrilmadigina bakilmaksizin, akabinde antikor-RGMa kompleksi içinde saptanabilen etiketin miktari kantifiye edilir. Test örnegi içinde RGMa`nin veya RGMa fragmaninin konsantrasyonu akabinde, antikor-RGMa kompleksi içinde saptanabilen etiketin miktarini bir standart egri ile karsilastirma ile belirlenebilir. Standart egri, bilinen konsantrasyondaki RGMa'nin veya RGMa fragmaninin seri seyreltmeleri kullanilarak, kütle spektrometrisi, gravimetrik olarak ve teknikte bilinen diger teknikler ile üretilebilir.
Antikor-RGMa kompleksi, antikoru bir kati destege, örnegin, sandviç analiz formati ile baglantili olarak yukarida tartisilan kati desteklere, baglama ve akabinde test örneginin kalanini kati destek ile temastan uzaklastirma ile test örneginden ayrilabilir. (c) Geri Kompetisyon Analizi Bir geri kompetisyon analizinde, bir immobilize edilmis RGMa peptidi, RGMa fragmani veya bunun RGMa varyanti bir test örnegi ve en az bir etiketlenmis antikor ile sirali olarak veya es-zamanli bir sekilde temas ettirilebilir. Tercihen, antikor SEQ ID NO: 65'in veya 66'nin en az üç (3) bitisik amino asidini içeren bir amino asit dizisine sahip olan bir epitopu spesifik olarak baglar. RGMa peptidi, RGMa fragmani veya RGMa varyanti, bir kati destege, örnegin, sandviç analiz formati ile baglantili olarak yukarida tartisilan kati desteklere, baglanabilir. RGMa peptit fragmani, SEQ lD NO: 65'i veya 66'yi içeren bir amino asit dizisine sahip olabilir. immobilize edilmis RGMa peptidi, RGMa peptit fragmani veya bunun RGMa varyanti, test örnegi ve en az bir etiketlenmis antikor, sandviç analiz formati ile baglantili olarak yukarida tarif edilenlere benzer kosullar altinda inkübe edilir. Iki farkli türdeki RGMa- antikor kompleksi akabinde üretilir. Spesifik olarak, üretilen RGMa-antikor komplekslerinin biri immobilize edilirken ve bir saptanabilen etiket içerirken, diger RGMa-antikor kompleksi immobilize edilmez ve bir saptanabilen etiket içerir. immobilize edilmemis RGMa-antikor kompleksi ve test örneginin kalani, teknikte bilinen teknikler, örnegin, yikama, yoluyla immobilize edilmis RGMa-antikor kompleksinin varligindan uzaklastirilir. immobilize edilmemis RGMa antikor kompleksi uzaklastirildiginda, akabinde immobilize edilmis RGMa-antikor kompleksi içinde saptanabilen etiketin miktari kantifiye edilir. Test örnegi içindeki RGMa'nin veya RGMa fragmaninin konsantrasyonu akabinde, RGMa-kompleks içindeki saptanabilen etiketin miktarini bir standart egri ile karsilastirma ile belirlenebilir. Standart egri, bilinen konsantrasyondaki RGMa'nin veya RGMa fragmaninin seri seyreltmeleri kullanilarak, kütle spektrometrisi, gravimetrik olarak ve teknikte bilinen diger teknikler ile üretilebilir. (d) Flüoresans Polarizasyon Bir flüoresans polarizasyon analizinde, bir antikor veya bunun fonksiyonel olarak aktif fragmani ilk olarak, bir etiketlenmemis RGMa-antikor kompleksi olusturmak için RGMa veya bunun bir RGMa fragmanini içerdiginden süphelenilen bir etiketlenmemis test örnegi ile temas ettirilebilir. Etiketlenmemis RGMa-antikor kompleksi akabinde, bir flüoresan olarak etiketlenmis RGMa, RGMa fragmani veya bunun RGMa varyanti ile temas ettirilir. Etiketlenmis RGMa, RGMa fragmani veya RGMa varyanti antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif fragmani baglama için test örnegi içindeki herhangi bir etiketlenmemis RGMa veya RGMa fragmani ile rekabet eder. Olusturulan etiketlemis RGMa-antikor kompleksinin miktari belirlenir ve test örnegindeki RGMa'nin miktari bir standart egrinin kullanimi vasitasiyla belirlenir.
Bir flüoresans polarizasyon analizinde kullanilan antikor, SEO ID NO: 65'ten veya SEQ dizisine sahip olan bir epitopu spesifik olarak baglar.
Antikor, etiketlenmis RGMa peptidi, RGMa peptit fragmani veya bunun RGMa varyanti ve test örnegi ve en az bir etiketlenmis antikor, sandviç immünoanaliz ile baglantili olarak yukarida tarif edilenlere benzer kosullar altinda inkübe edilebilir.
Alternatif olarak, bir antikor veya bunun fonksiyonel olarak aktif fragmani hem etiketlenmis RGMa-antikor komplekslerini hem de etiketlenmemis RGMa-antikor komplekslerini olusturmak için birflüoresan olarak etiketlenmis RGMa, RGMa fragmani veya bunun RGMa varyanti ve RGMa veya bunun RGMa fragmanini içerdiginden süphelenilen bir etiketlenmemis test örnegi ile es-zamanli olarak temas ettirilebilir.
Olusturulan etiketlenmis RGMa-antikor kompleksinin miktarini belirlenir ve test örnegindeki RGMa'nin miktari bir standart egrinin kullanimi vasitasiyla belirlenir.
Alternatif olarak, bir antikor veya bunun fonksiyonel olarak aktif fragmani ilk olarak, bir etiketlenmis RGMa-antikor kompleksi olusturmak için bir flüoresan olarak etiketlenmis RGMa, RGMa fragmani veya bunun RGMa varyanti ile temas ettirilir. Etiketlenmis BNP-antikor kompleksi akabinde, RGMa veya bunun bir RGMa fragmanini içerdiginden sphelenilen bir etiketlenmemis test örnegi ile temas ettirilir. Test örnegi içindeki herhangi bir etiketlenmemis RGMa veya RGMa fragmani, antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif fragmanini baglama için etiketlenmis RGMa, RGMa fragmani veya RGMa varyanti ile rekabet eder. Olusturulan etiketlenmis RGMa-antikor kompleksinin miktari belirlenir, test örnegindeki RGMa'nin miktari bir standart egrinin kullanimi vasitasiyla belirlenir. Bu immünoanalizde kullanilan antikor, SEQ ID NO.'Iari: 65'in, 66'nin veya 74'ün en az üç (3) bitisik amino asit dizisini içeren bir amino asit dizisine sahip olan bir epitopu spesifik olarak baglar. (e) Kütle Spektrometrisi Kütle spektrometrisi (MS) analizi, tek basina veya diger yöntemleri le kombinasyon halinde kullanilabilir. Diger yöntemler, immünoanalizleri ve spesifik polinükleotidleri saptamak için yukarida tarif edilenleri içerir. Kütle spektrometrisi yöntemi, bir veya birden fazla biyo-markörün varligini ve/veya miktarini belirlemek için kullanilabilir. MS analizi, matriks-yardimli lazer desorpsiyonu/iyonizasyon (MALDI) uçus-süresi (TOF) MS analizini, örnegin, mesela, yönlendirilmis-nokta MALDl-TOF veya sivi kromatografisi MALDl-TOF kütle spektrometrisi analizini içerebilir. Bazi uygulamalarda, MS analizi, elektrosprey iyonizasyon (ESI) MS'yi, örnegin, sivi kromatografisi (LC) ESI- MS içerir. Kütle analizi, piyasada satilan spektrometreler kullanilarak tamamlanabilir.
Biyolojik örneklerde biyo-markör peptitlerin varligini ve miktarini saptamak için, MALDI- TOF MS'yi ve ESI-MS'yi içeren, MS analizinden yararlanmak için yöntemler U.S. Patentleri. c. Kontrol Bir kontrol örnegi dahil etmek tercih edilebilir. Kontrol örnegi, yukarida tarif edildigi üzere süjeden elde edilen örnek ile es-zamanli olarak analiz edilebilir. Süje örneginden elde edilen sonuçlar, kontrol örneginden elde edilen sonuçlar ile karsilastirilabilir.
Biyolojik örnek için analiz sonuçlarinin bununla karsilastirilabilecegi standart egriler saglanabilir. Bu tarz standart egriler, analiz birimlerinin bir fonksiyonu, yani, bir flüoresan etiket kullanildiginda, flüoresan sinyal yogunlugu, olarak markörün düzeylerini sunar. Çok sayida donörden alinan örnekler kullanilarak, standart egriler normal dokuda RGMa'nin kontrol düzeyleri için ayni zamanda yukarida izah edilen karakteristiklerin birine veya birden fazlasina sahip olabilen donörlerden alinan dokuda RGMa'nin "risk-altindaki" düzeyleri için saglanabilir. 6. Kit Bir süjeyi tedavi etmek veya bir süjeye tani koymak için kullanilabilen bir kit burada saglanir. Kit, antikoru ve antikoru uygulamak için bir araci içerebilir. Kit ilaveten, kiti kullanmak ve analizi, izlemeyi veya tedaviyi yürütmek için talimatlari içerebilir.
Kit ayrica, her bir kabin ayri bir reaktif içermesi ile, bir veya birden fazla kap, örnegin, viyaller veya siseler, de içerebilir. Kit ilaveten, burada tarif edilen bir analizin, izlemenin, tedavinin veya yöntemin nasil gerçeklestirilecegini veya yorumlanacagini tarif edebilen yazili talimatlar içerebilir.
Mevcut bulus, asagidaki sinirlayici-olmayan örnekler ile gösterilen, çok sayida yöne sahiptir. ÖRNEKLER Anti-RGMa Insan Monoklonal Antikoru Üretimi ve izolasyonu PROfusion mRNA gösterim teknolojisi kullanilarak, havuzlanmis insan dalagi, tonsil, PBMC ve lenf nodu antikor kütüphaneleri, RGMa antijenleri: 100nM biyotin ile etiketlenmis insan veya siçan RGMa'ya karsi sekiz tur boyunca seçilmistir. PROfusion Yayinlari'nda tarif edilir.
Seçilmis sc-Fv fragmanlari, tam olarak insan lgG'Ierine yeniden-formatlanmistir.
RGMa-temelli ELISA'Iarda IgG'Ierin taranmasini takiben, AE12-1. ila AE12-8, insan ve siçan RGMa'sini pozitif baglayicilar olarak tanimlanmistir. maya gösterim teknolojileri kullanilarak insan RGMa'sina karsi seçilmis genis naif insan scFv maya kütüphanelerinden tanimlanmis tam olarak insan anti-RGMa antikorlaridir. 2 tur Manyetik-aktive edilmis hücre siniflandirma (MACS) ve 4 tur FIüoresans-aktive edilmis hücre siniflandirma (FACS) seleksiyon antijeni olarak 100 nM biyotinlenmis insan RGMa'si kullanilarak kütüphaneler üzerinde gerçeklestirilmistir. Siniflandirmanin son turu için, hücreler ayrica, insan RGMc-Fc antijenine karsi negatif bir sekilde de seçilmistir. Seçilmis sc-Fv fragmanlari tam olarak insan lgG'Ierine yeniden- formatlanmistir. Insan RGMa ELISA'sinda IgG'Ierin taranmasini takiben, AE12-13, -15, çapraz-reaksiyona da girmistir.
Antikor Karakterizasyonu AE ve siçan RGMa'sini baglamayi ve hRGMc'ye çapraz-reaktiviteyi incelemek için dogrudan baglama ELISA'Iari ile test edilmistir. hRGMa kompetisyon ELISA'si, bu mAb'Ierin herhangi birinin hRGMa'yi baglama için h5F9.23 ile rekabet edip etmeyecegini test etmek için kullanilmistir. h5F9.23, siçan hibridomundan türetilen ve RGMa'nin N-ucu alanini bagladigi bilinen bir hümanize anti- RGMa öncü mAb'dir. h5F9.23, asagidaki dizilere sahiptir: FVQTVFSGGGI VQPGGSIRLSCAASGFTFS NVGVINWIRQAPGKGI FWlGMlYYDSSEKl-lYA DSVKGRFTlSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCAKGTTPDYWGQGTM VTVSS DVVLTQSPISI PVTl GOPASISCRSSQSTFY SDGYTFLEWFQQRPGQSPRLLIYEVSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTI .KISR VFAFDVGVYY C`FQATH DP LTFGQGTKLEIKR VH h5F9.23 CDR-H1 153 NYGMN VH h5F9.23 CDR-H2 154 MIYYDSSEKHYADSVKG VH h5F9.23 CDR-H3 155 GTTPDY VL h5F9.23 CDR-L1 156 RSSQSLEYSDGYTFLE VL h5F9.23 CDR-L2 157 EVSNRFS VL h5F9.23 CDR-L3 158 FQATHDPLT Neogenin veya BMP-2/BMP-4 kompetisyon ELlSA, bu mAb'Ierin hRGMa`nin bunun reseptörü neogenini veya BMP-2/BMP-4'ü baglamasini bloke edip etmeyecegini belirlemek için kullanilmistir.
ELISA verilerine göre, 8 PROfusion mAb'sinin tümü, insan ve siçan RGMa'sini baglamistir (Tablo 3). ELISA'da RGMC baglama için, 3 mAb (AE12-6, -7 ve -8), hRGMc'yI baglama göstermistir, AE12-4, yüksek konsantrasyonlarda zayif baglama konsantrasyonlarda hRGMC'yi baglama göstermemistir. hRGMa kompetisyon edebilmistir, bu, bu 3 mAb'nin baglama epitoplarinin h5F9.23 epitopuna yakin oldugunu veya bununla kesistigini öne sürer. hRGMa fragmanlari ile nokta blotlama 4'ün C-ucu fragmanini bagladigini ve diger 4 Ab'nin herhangi bir saptanabilen baglama sinyali göstermedigini göstermistir. Kompetisyon ELISA'da hRGMa'nin neogenini veya buna kiyasla daha iyi bloke etme aktivitesi göstermistir, AE12-1 ve AE12-4. zayif inhibisyon göstermistir ve AE12-2, -3, -7 ve -8, 100 nM'a kadar olan konsantrasyonlarda inhibisyon göstermemistir. BMP-2/BMP-4 kompetisyon ELISA'da, etmistir.
PROfusion mAb'Ieri ilaveten, bunlarin hRGMa'nin nöronal hücreleri baglamasini bloke etme yetisi için hücre-temelli baglama analizlerinde test edilmistir. Burada hücrelerin biyotinlenmis hRGMa-FC ile oda sicakliginda inkübe edildigi ve hRGMa baglamasinin streptavidin-Sülfo-Etiketi ile saptandigi MSD-temelli hücre baglama analizinde, yalnizca hücrelerini baglamasini bloke etmistir (Tablo 3).
Bununla birlikte, burada hücrelerin 37°C'de hRGMa-FC ile inkübe edildigi ve hRGMa baglamasinin Cy3-etiketli anti-FC Ab ile saptandigi ve yüksek içerik flüoresan görüntü analizi ile hesaplandigi bir yüksek içerik tarama (HCS) analizinde, PROfusion antikorlari arasinda yalnizca AE12-6, RGMa'nin hem SH-SYSY nöronal hücrelerini hem de siçan hipokampal primer nöronlarini baglamasi üzerinde güçlü inhibisyon göstermistir (Tablo 3, Sekil 13). Ayrica Sekil 13'te gösterildigi üzere, naif insan scFv maya kütüphanelerinden türetilen antikorlar, AE12-15 ve AE12-23, hRGMa'nin hücreleri baglamasini inhibe etmistir.
BMP yanit-veren eleman (BRE), Korchynskyi ve ten Dijke (J. Biol. Chem. 2002, 27724883) tarafindan tarif edilen dizilere göre kesisen oligolari kullanarak yapilmistir ve bir BRE lüsiferaz raportör yapisini üretmek için bir basit lüsiferaz raportör vektör pGL içine klonlanmistir. RGM familyasi üyeleri (RGMa, RGMb ve RGMc), BMP sinyallemesi için ko-reseptörlerdir. Hem RGMa hem de RGMc BMP raportör analizleri, 293HEK hücrelerinin BMP raportör plazmid ve RGMa veya RGMC ekspresyon kaseti ile ko-transfeksiyonu ile olusturulmustur ve RGMa'ya ve RGMc'ye dogru nötralize etme aktivitesi için mAb'Ieri taramak için kullanilmistir. RGMa BMP raportör analizinde, AE12-1 ve AE12-6, RGMa aktivitesini nötralize etmistir, bu MSD-temelli hücre baglama analizinden elde edilen veriler ile uyumludur (Tablo 3). RGMc BMP raportör analizinde, AE12-6 RGMc aktivitesini nötralize etmisken, AE12-1 nötralize etmemistir. Böylelikle, AE12-1, RGMa'ya spesifik bir nötralize etme mAb'sidir.
PROfusion mAb'leri ilaveten, SH-SYSY nöronal hücreleri ile bir kemotaksis analizde bunlarin RGMa'yi nötralize etme yetisi için test edilmistir. Bu analizde, RGMa hücre kemotaksisini inhibe etmek için bir itici molekül olarak etki eder. AE12-1, hRGMa'ya dogru güçlü nötralize etme aktivitesi göstermistir (Tablo 3). AE12-4 ve AE12-6, biraz nötralize etme aktivitesi göstermistir.
AE12-1, insan SH-SY5Y nöronal hücreleri ile nörit asiri-büyümesi analizinde test edilmistir. Bu analizde, RGMa, tam-boy veya N-ucu fragmani, nörit asiri-büyümesini inhibe eder. RGMa BMP raportör analizinde ve kemotaksis analizinde bunun fonksiyonel aktivitesi ile uyumlu olarak, AE12-1, tam-boy hRGMa'ya veya N-ucu fragmanina dogru güçlü nötralize etme aktivitesi göstermistir (Tablo 3).
AE maymunu ve siçan RGMa'si üzerindeki BIAcore analizi, AE12-1'in hRGMc'yi baglamadigini, ancak karsilastirabilir afinite ile insan, sino ve siçan RGMa'sina iyi çapraz-reaktivite gösterdigini göstermistir. Bakiniz, hRGMa baglama (ELISA) Siçan RGMa'si baglama (ELISA) hRGMc-His ELISA hRGMa'yi baglama için h hRGMa fragmanlarini haritalama neo-His'i baglama için biot-hRGMa-Fc ile rekabet etme b hRGMa-Fc'nin SH-SY5Y hücrelerini baglamasini bloke etme (MSD) ° hRGMa-Fc'nin SH-SYSY hücrelerini baglamasini bloke etme (HCS) BMP-2'yi baglama için FL-RGMa-Fc ile rekabet etme BMP-4'ü baglama için FL-RGMa-Fc ile rekabet etme AE12- AE12- AE12- AE12- AE12- AE12- AE12- AE12- h5F9.23 1 2 3 4 5 6 7 8 RGMa BMP raportör analizinde hRGMa'yi nötralize etme ++ - - - - ++ - - ++ RGMc BMP rapoitör analizinde hRGMc'yi nötralize etme - - - - - ++ - - ++ SH-SY5Y hücreleri ile Kemotaksiste hRGMa'yi nötralize +++ - - f+ - + - - ++ Nörit asiri-büyümesi analizinde hRGMa'yi nötralize etme ++ H Tablo 3 açisindan, "aNeg", nokta blotlamada test edilen tüm fragmanlar ile negatif baglamaya karsilik gelir. "bMSD", streptavidin-Sülfo-Etiketi ile kompleks haline getirilmis biyotinlenmis hRGma-Fc ve hücreler ile oda sicakliginda (RT) inkübasyon kullanimina karsilik gelir. ”HCS", Cy3-etiketli anti-FC Ab ile kompleks haline getirilmis biyotinlenmis hRGMa-Fc ve hücreler ile 37°C'de inkübasyon kullanimina karsilik gelir. "dAE12-1", MSD ile biyotin-RGMa-Fc'nin SH-SYSY hücrelerini baglamasini inhibe etmenin aksine, hücreleri bir dramatik olarak arttirilmis RGMa-FC baglamasina karsilik gelir. "e?", AE12- 7 için sonuca varilamayan verilere karsilik gelir. "fAE12-4" - kemotaksis analizinde AE12-4'ün konsantrasyonu nötralize etme aktivitesi ile ters bir sekilde koreledir.
Burada RGMa'nin veya RGMc'nin BMP'Ier ile etkilesime girme ile BMP sinyallemesini güçlendirdigi bir BMP-yanit-veren raportör analizinde, SEQ ID NO.'Iari: 1'i ve 5'i içeren bir antikor (AE12-1), RGMa aktivitesini bloke etmistir, ancak RGMc aktivitesini bloke etmemistir, bu bunun RGMa için fonksiyonel antagonizmi ve baglama özgüllügü ile uyumludur.
Sekiller 13 ve 14, SH-SY5Y hücreleri ve siçan hipokampal primer nöronlari üzerinde bir canli hücre baglama analizi kullanilarak RGMa'nin nöronal hücreleri baglamasi Üzerinde belirtilen antikorlarin nötralize etme etkilerini gösterir. Fc-etiketlenmis RGMa ve Cy3-etiketlenmis anti-FC antikorlari, 4°C'de 60 dakika boyunca kompleks haline getirilmistir, bunu kompleksin oda sicakliginda 10 dakika boyunca bir bloke etme antikoru ile bir inkübasyonu izler. RGMa-Cy3 + antikor kompleksi akabinde, hücreler üzerinde baglamaya izin vermek için Hoechsts 33342 ile birlikte hücrelere 37°C'de 30 dakika boyunca eklenmistir. Hücreler akabinde, kültür vasati içinde iki kere yikanmistir ve PFH ile fikse edilmistir. Hücre görüntüleme BD Pathway ile gerçeklestirilmistir ve görüntüler Definiens Architect yazilimi ile analiz edilmistir. hücrelerini ve primer nöronlari baglamasini bloke etmistir. Bakiniz, Sekil 13. HCS analizinde, AE12-1, SH-SYSY hücreleri üzerinde RGMa'nin baglamasini inhibe etmemistir. Bakiniz, Sekil 14. AE12-1'in en yüksek konsantrasyonlari, RGMa-Fc'nin hücreleri baglamasini arttirmisken, daha düsük konsantrasyonlarda düzeyler kontrol RGMa baglama düzeylerine esittir. Bu, MSD ile SH-SY5Y hücrelerini biyotin-RGMa-Fc baglamasini inhibe etmenin aksidir (MSD, streptavidin-Sülfo-Etiketi ile kompleks haline getirilmis biyotinlenmis hRGMa-Fc ve hücreler ile oda sicakliginda inkübasyon kullanimina karsilik gelir). MSD ve HCS analizi arasindaki farklilik, farkli analiz kosullarindan kaynaklanabilir. tarafindan RGMa repulsiyonu üzerindeki nötralizasyon etkilerini gösterir. Her bir göz için 6500 siçan hipokampal primer nöron, poIi-1-Iizin kapli 96-gözlü görüntüleme plakalarina plakalanmistir. Hücrelere, anti-RGMa antikorlari ile kombinasyon halinde SEQ ID NO: 65'in RGMa fragmani ile 24 saat boyunca muamele edilmistir. Hücreler fikse edilmistir ve Millipore firmasindan bir nörit asiri- büyümesi kit protokolü kullanilarak BIII-tübülin ile boyanmistir. Görüntüler bir BD Pathway ile alinmistir ve her bir nöron için nörit asiri-büyümesini ölçmek amaciyla Definiens Architect ile analiz edilmistir.
Antikor Varyantlari ve Baglama Verileri Tablo 4, AE içindeki Cys rezidüsü için sübstitüe etme ile, bir kisinin hRGMa'ya iyilestirilmis afiniteye sahip olan varyantlar üretebilecegini gösterir. Bakiniz, SEQ ID NO.'Iari: 67-73. Örnegin, bakiniz, Tablo 4, burada antikor klonu AE12-1-Y, hRGMa'ya en az bir 10-kat arttirilmis afinite göstermistir ve AE12-1-F, hRGMa'ya bir 5-kat arttirilmis afinite göstermistir. Digerleri, parental AE12-1 ile karsilastirilabilir afinite göstermistir. Tüm varyantlar, MSD-temelli hücre baglama analizinde SH-SYSY hücrelerini hRGMa baglamasini bloke etmistir, BMP raportör analizlerinde RGMa aktivitesini nötralize etmistir, anca RGMc aktivitesini nötralize etmemistir ve pre-formülasyon çalismalarinda yüksek termal kararlilik ve iyi çözünürlük göstermistir. hRGMa baglama (ELISA) Sino RGMa baglama (EUSA) Siria Küfürlü& (\-Ii Swan RGMavHis IH› Eken? :isg sms SH-SYâY hücrelerini hRGMa- Fc baglamasini bloke etme katmam çozunurlugüv'karadiligi Nörit Asiri-Büyümesi Sekiller 1'de, 2'de ve 15'te gösterildigi üzere, AE12-1, SH-SYSY hücreleri ve siçan hipokampal primer nöronlar üzerinde gösterildigi üzere, tam boy hRGMa'yi ve hRGMa'nin bir fragmanini tam olarak nötralize etmistir. hRGMa'nin bu fragmani, burada gösterildigi üzere, SEO ID NO. 65'in 47-127 arasindaki amino asitlerine karsilik gelir: PCKI LKCNSEFWSA TSGSHAPASD DTPEFCAALR SYALCTRRTA RTCRGDLAYH SAVHGIEDLM SQHNCSKDGP TSQPRLR (SEO ID NO: 139).
Ilave nörit asiri-büyümesi deneyleri AE12-1'in ayni zamanda AE12-1 varyantlarinin etkilerini degerlendirmek için gerçeklestirilmistir, burada antikor, SEQ ID NO.'lari: 1'i ve 'i veya 2-4'ü ve 6-8'i içerir, burada SEQ ID NO: 8'in Cys rezidüsü bir baska amino asit için sübstitüe edilir veya burada SEQ ID NO: 5'in pozisyon 91'indeki Cys rezidüsü bir K ve AE12-1-Y) ile sübstitüe edilir. Bakiniz, Sekiller 9-12, burada FL hRGMa ile muamele edilmis SH-SY5Y hücrelerinin nörit asiri-büyümesi üzerinde burada tarif edilen antikor tarafindan inhibisyon (24 saatlik inkübasyon) gösterilir.
In Vivo Çalismalar Sekiller 3'te ve 4'te gösterildigi üzere, AE12-1, retinal gangliyon hücre aksonlarinin rejeneratif büyümesini peri-Iezyonel (0-500 pm) olarak arttirmistir (n = 3-5 siçan/grup).
Bakiniz, Sekil 3. Antikor AE12-1 ayrica, retinal gangliyon hücre aksonlarinin Iezyondan daha uzak alanlara rejeneratif büyümesini de arttirmistir (500-1000 pm) (n = 3-5 siçan/grup).
Siçan Optik Sinir Ezilme Deneyleri AE12-1, siçan optik sinir ezilme deneylerinde aktiftir. Bakiniz, Sekil 8. Bir unilateral optik sinir ezilme Iezyonu, erkek Wistar siçanlarinda, gözün 2-4 mm arkasinda, yapilmistir. Siçanlar 6 hafta boyunca takip edilmistir (8 grup. n = 6) ve antikorlar haftada bir kere intravenöz olarak 10 mg/kg, 1 mg/kg veya 0.1 mg/kg'da uygulanmistir.
Siçan hIgG1 kontrolü, intravenöz olarak haftada bir kere 10 mg/kg'da uygulanmistir (n = 6 siçan). AE12-1 ile muamele edilmis siçanlarda, rejenere olan lifler optik sinir ezilme siçanlarda, rejenere olan lifler bunlarin lezyonlarin üstesinden gelme yetisi olmadigindan Iezyonda birikir. Bakiniz, Sekil 8.
Monoklonal Antikor AE Epitop Haritalamasi Epitop haritalama çalismalari, monoklonal antikor AE12-1 için yapilmistir. Veriler, AE12-1 için epitopun RGMa'nin N-ucu bölgesinde yer aldigini öne sürmüstür. hRGMa için bir kaç yapi, AE12-1 için epitopu belirlemeye tesebbüs etmek için kullanilmistir. Bu yapilar asagidakileri içermistir: peIB-M-[RGMA( (E.coli) rekombinant olarak üretilmistir. Antijen, ChemTag#16211, 8100 tamponu, pH 8, 25 mM Tris, gliserol içinde 0,41 mg/mL'dir. Bu birinci antijen yapisinin dizisi asagidaki sekildedir: MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MAMPC KILKC NSEFW SATSG SHAPA SDDTP EFCAA LRSYA LCTRR TARTC RGDLA YHSAV HGIED LMSQH NCSKD GPTSQ PRLRT LPPAG DSQER SDSPE ICHYE KSFHK HSATP NYTHC GLFGD HHHHHH (SEQ ID NO: 75). açiklanan "6His") rekombinant olarak üretilmistir, PBS içinde 0,85 mg/ml'dir. Bu ikinci antijen yapisinin dizisi asagidaki sekildedir: METDT LLLWV LLLWV PGSTG DAAQP ARRAR RTKLG TELGS TSPVW WNSAD ITSLY KKAGS PCKIL KCNSE FWSAT SGSHA PASDD TPEFC AALRS YALCT RRTAR TCRGD LAYHS AVHGI EDLMS QHNCS KDGPT SQPRL RTLPP AGDSQ ERSDS PEICH YEKSF HKHSA TPNYT HCGLF GDPHL RTFTD RFQTC KVQGA WPLID NNYLN VQVTN TPVLP GSAAT ATSKL TIIFK FNQEC VDQKV YQAEM DELPA AFVDG SKNGG DKHGA NSLKI TEKVS GQHVE IQAKY NQQlD FQAFH TNAEG TGARR LAAAS PAPTA PETFP YETAV AKCKE KLPVE DLYYQ ACVFD LLTTG DVNFT LAAYY ALEDV KMLHS NKDKL HLYER TRDLP GNPAF LYKW ISSTV AAARG GPEQK LISEE DLNSA VDHHH HHH (SEQ ID NO: 76). rekombinant olarak üretilmistir, PBS içinde 1,18 mg/mL'dir. Bu üçüncü antijen yapisinin dizisi asagidaki sekildedir: METDT LLLWV LLLWV PGSTG DAAQP ARRAR RTKLP CKILK CNSEF WSATS GSHAP ASDDT PEFCA ALRSY ALCTR RTART CRGDL AYHSA VHGIE DLMSQ [0306] HNCSK DGPTS QPRLR TLPPA GDSQE RSDSP EICHY EKSFH KHSAT PNYTH CGLFG DLNSA DIEGR MDPPC PAPEL LGGPS VFLFP PKPKD TLMIS RTPEV TCVVV DVSHE DPEVK FNWYV DGVEV HNAKT KPREE QYNST YRVVS VLTVL HQDWL NGKEY KCKVS NKALP APIEK TISKA KGQPR EPQVY TLPPS REEMT KNQVS LTCLV KGFYP SDIAV EWESN GQPEN NYKTT PPVLD SDGSF FLYSK LTVDK SRWQQ GNVFS CSVMH EALHN HYTQK SLSLS PGK (SEQ ID NO: 77).
Kullanilan antijenlerin tümü, RGMa'nin amino asit dizisini (47-168) içerir, burada dizi pozisyonlarini tanimlamak için kullanilan numaralandirma, ana proteinin numaralandirmasina karsilik gelir. hRGMa'nin dizisi (47-168) asagidaki sekildedir: PCKI LKCNS EFWSA TSGSH APASD DTPEF CAALR SYALC TRRTA RTCRG DLAYH SAVHG IEDLM SQHNC SKDGP TSQPR LRTLP PAGDS QERSD SPEIC HYEKS FHKHS ATPNY THCGL FGD (SEQ ID NO: 78).
Epitoplari kesip çikarmak için kullanilan tamponlar asagidaki sekildedir: Tampon A: 100 mM NaHCog, 500 mM NaCl, pH 8; Tampon C: 100 mM NaOAo, 500 mM NaCI, pH 4 ve Tampon D: 100 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, pH 8.
Monoklonal antikor asagida oldugu sekilde immobilize edilmistir. CNBr-aktive edilmis Sepharose bilyelerin (GE Healthcare, Uppsala Isveç) yirmi miligrami bir 35 pm'lik renkli cam tozu ile bir kompakt reaksiyon kolonu (USB Corp., Cleveland, OH) içine tartilmistir ve 200 pl 1 mM HCI ile 3 kere yikanmistir, bunu 200 pl Tampon A ile 3 kere yikama izlemistir.
Yaklasik olarak 5-6 nmol AE12-1 mAb çözeltisi, Sepharose'u antikor baglamasina müdahale edecek olan histidin tamponunu uzaklastirmak için yaklasik olarak 40 dakika boyunca bir kullanilarak PBS'ye karsi diyalize edilmistir. Diyalize edilmis mAb çözeltisi aktive edilmis reçineye eklenmistir ve bir rotator (Mix-All Laboratory Tube Mixer, Torrey Pines Scientific, San Marcos, CA) üzerinde oda sicakliginda 4 saat boyunca karismasina izin vermistir. Baglamadan sonra, reçineden asagi akanlar toplanmistir ve reçine 200 ul Tampon A ile üç kere yikanmistir. Reçine 200 ul Tampon D içinde süspanse edilmistir ve reçine içindeki fazla baglama yerlerini bloke etmek için oda sicakliginda 1 saat boyunca döndürülmüstür. Tampon D çözeltisi çikarilmistir ve reçine alternatif olarak, toplamda her biri için üç kere, 200 pl Tampon C ve Tampon D (düsük/yüksek pH'Ii yikama) ile yikanmistir. Reçine, bunu antijen ile kuplaj için hazir hale getirmek amaciyla 200 ul Tampon B ile üç kere yikanmistir.
Immobilize edilmis AE12-1 monoklonal antikoru hRGMa'ya kuple edilmistir. Kompakt reaksiyon kolonlari (CRC), CRC'nin 35 um renkli cam tozunu 200 ul Tampon B ile üç kere yikama ile antijen kuplaji için hazirlanmistir. Bagli antikor ile reçine, reçineyi homojen bir sekilde yeniden-süspanse etmek için nazikçe karistirilmistir ve 50 |JI reçine her bir hazirlanmis CRC içine yerlestirilmistir. Reçine, 200 pl Tampon B ile üç kere yikanmistir. Yaklasik olarak 1,5 nmol hRGMa antijeni, toplamda en az 200 ul'lik bir hacim yapmak için yeterli Tampon B ile reçineye eklenmistir. Antijen kuplajindan önce, E. coli ile üretilmis antijen, antijen tamponundan DTT'yi uzaklastirmak için bir 3500 MWCO SIide-A-Lyzer mini-diyaliz birimi kullanilarak yaklasik 30 dakika boyunca PBS'ye karsi diyalize edilmistir. Antijen/reçine karisiminin oda sicakliginda 4 saat boyunca bir rotator üzerinde karismasina izin verilmistir. Asagiya akanlar (FT) toplanmistir ve reçine 200 pl Tampon B ile üç kere yikanmistir.
Epitoplar, tripsin ve endoproteinaz Asp-N kullanilarak kesip çikarilmistir. Immobilize edilmis antikor/antijen kompleksini içeren reçine 200 ul Tampon B içinde süspanse edilmistir. 20 ug tripsin (Promega, Madison, WI) içeren bir viyal 0,2 ug/ul'lik bir konsantrasyon için içinde çözünmüstür ve endoproteinaz Asp-N'nin bir 2 ug'lik viyali (Roche), 50 ul su (0,04 ug/ul) içinde çözünmüstür. Antijen klevajlari 1:100 enzimzantijen oranlari (w/w) ile gerçeklestirilmistir. Reaksiyon oda sicakliginda rotasyon ile 4-6 saat boyunca ilerlemistir.
Sindirmeden sonra, FT toplanmistir ve reçine, her bir yikamanin ayri ayri toplamasi ile (Yikama 1 ve 2) 200 pl Tampon B ile iki kere, 200 ul Tampon A (Yikama 3) ile ve akabinde 200 ul Tampon B (Yikama 4) ile yikanmistir. Antikora baglanmis antijen peptitleri, %2'lik formik asidin 200 ul'lik üç alikotu ile reçineden ayristirilmistir ve her bir elüsyOn ayri ayri toplanmistir (Elüsyon 1, 2 ve 3). Elüsyon 1 fraksiyonu epitop bölgesini belirlemek için kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile analiz edilmistir.
Sindirmeden sonra toplanan Elüsyon 1 fraksiyonlari, bir Agilent 6510 QTOF MS'ye ara- yüzlenmis bir Chip Cube (40 nL zenginlestirme kolonu, 75 um x 43 mm analitik kolon, 08 ZORBAX çip) ile bir Agilent (Santa Clara, CA) 1100 kapiler HPLC yükleme pompasi analiz edilmistir. 7 ul'ye kadar olan enjeksiyonlar kullanilmistir ve MS/MS belirtilen MS sinyal kriterlerini tasiyan en üst 3 iyon üzerinde gerçeklestirilmistir.
Epitop kesip-çikarma fraksiyonlarinin (Elüsyon 1) baslangiç MS analizi, büyük olasilikla disülfit bagli peptitlerin varligindan dolayi beklenen proteolitik peptitler ile eslestirilemeyebilen büyük peptit türlerinin varligini göstermistir. Disülfit baglari indirgemek için, 10 ul'lik alikotlarin pH'i, seyreltilmis NaOH kullanilarak pH~8'e ayarlanmistir ve MS ile yeniden-analizden önce 37°C'de 30 dakika boyunca 5 mM ditiyotreitol (DTT) içinde indirgenmistir. Bazi fraksiyonlar indirgemeyi basarmak için denatürasyon gerektirmistir, bu durumda alikot DTT'nin eklenmesinden önce esit bir hacimdeki 8M guanidin hidroklorür, içinde seyreltilmistir. hRGMa'nin çesitli yapilari ile kuple edilmis AE12-1 mAb'sinin enzimatik sindiriminin tüm Elüsyon 1 fraksiyonlarinin LC-ESI-MS/MS analizi, moleküler agirliklari 8,5 - 12 kDa araliginda olan bir kaç büyük peptit türünün varligini göstermistir. Büyük türlerin kütleleri ve fragmentasyonu peptitleri tanimlamak için yeterli degildir. Epitop peptitlerini tanimlamak için, disülfit baglarinin indirgenmesi gerekmistir. Tüm durumlarda, peptitlerin MS sinyali yogunlugu indirgemeden sonra anlamli bir sekilde düsmüstür, bazi durumlarda, bir denatürant varliginda indirgeme olmadan saptanamayacak düzeydedir.
Elüsyon 1 fraksiyonunun DTT ile indirgenmesinden sonra, fraksiyonlar LC-MS/MS ile yeniden-analiz edilmistir. E. coli ile üretilen hRGMa kullanilan kesip-çikarma deneyinde, iyon kromatogramindan gözlenen piklerin çogu tek yüklü türlerdir, çogu polimerler veya diger katki maddeleri ile ilgilidir. Iki peptidin, kullanilan hRGMa yapisi ile iliskili oldugu tanimlanmistir. Bakiniz, Sekil 5. Ilki, 2420,2 Da'luk bir monoizotopik moleküler agirligi olan bir peptittir. Peptidin moleküler agirligi ve MS/MS spektrumlarinda gözlenen bir kaç fragmanin kütleleri (gösterilmemistir), tayinin enzim özgüllügü ile tutarsiz olmasina ragmen, PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa dizisi ile tutarlidir. 25512 Da'luk bir monoizotopik moleküler agirligi olan ikinci potansiyel epitop peptidi, MPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ çikarmistir. Enzim özgüllügü tutarli degildir; bununla birlikte, baslangiç antijeninin moleküler agirligi tam dizinin hesaplanan kütlesi ile eslemediginden, antijenin görünür tutarsiz enzim özgüllügüne katki saglayacak olan N-ucu heterojenligine sahip olmasi olasidir.
Ikinci antijen yapisi kullanilarak, DTT indirgemesinden sonra MS spektrumunda peptitler gözlenemeyebilir. Denatüre etme kosullari altinda indirgemeden sonra MS analizi, tek yüklü, arka-plan iyonlari arasinda peptitleri ortaya çikarmistir. Antijenden dört peptit, denatüre edilmis ve indirgenmis E1 fraksiyonunda tanimlanmistir. Birinci antijen-iliskili peptit, MS/MS fragmentasyonu ile birlikte, KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEQ ID NO: 81) (4 ilave N-ucu rezidüsü olan hRGMa 47-69) dizisi ile tutarli olan 27633 Da'luk bir monoizotopik moleküler agirliga sahiptir. Bu peptit ile iliskili spektrumlar, Sekil 6'de gösterilir. Ayni spektrumdaki çok yildiz isaretli ile isaretlenmistir), KAGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPASD (SEQ ID NO: 82) dizisi ile tutarlidir. Sekil 7'de gösterildigi üzere, MW 2635.2'lik bir peptit, AGSPCKILKCNSEFWSATSGSHAPPAS (SEQ ID NO: 90) dizisi ile tutarlidir. Sekil 7'de bir yildiz isareti ile isaretlenmis, m/z 688,82'deki bir ilave peptit (en bol izotop, +4 yüklü halde), MW 2635,2'Iik peptit ile birlikte-ayrismistir. Bu düsük yogunluklu bilesen üzerinde elde edilen sinirli MS/MS verileri, AGSPCKlLKCNSEFWSATSGSHAPPASD (SEO ID NO: 83) (MW 2750.13 Da) dizisi ile tutarlidir. hRGMa'nin üçüncü yapisi, AE12-1 ile epitopu konfirme etmeyi denemek için kullanilmistir. DTT ile indirgenmis Elüsyon 1 fraksiyonunda, çok az indirgeme gözlenmistir, ancak bir peptidin hRGMa antijeni ile ilgili oldugu ve diger antijen yapilarindan elde edilen sonuçlar ile tutarli oldugu tanimlanmistir. Peptit, m/z 691,60'ta (+4 yüklü halde) gözlenmistir, bu buna 2762,4 Da'luk bir monoizotopik moleküler agirlik vermistir. Bu peptitten elde edilen sinirli MS/MS verileri (gösterilmemistir), diziyi TKLPCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (SEO ID NO: 84) olarak öne sürer. MS spektrumunda gözlenen, hRGMa (47-168) bölgesi ile iliskili oldugu seklinde tayin edilebilen diger peptitler, DSPEICHYEK'yi (SEQ ID NO: 85); GDLAYHSAVHGIE'yi (SEO ID NO: 86); DLAYHSAVHGIE'yi (SEQ ID NO: 87) ve DDTPEFCAALR'yi (SEQ ID NO: 88) içermistir.
AE12-1'e baglanmis hRGMa'nin epitop kesip-çikarma deneyinden elde edilen Elüsyon 1 fraksiyonlarinda (tripsin/Asp-N sindirme), peptit hRGMa (47-69), antijenin üç yapisindan tanimlanmistir. AE12-1 ile hRGMa için epitop olarak tanimlanan epitop asagidakidir: PCKILKCNSEFWSATSGSHAPAS (hRGMa .
TOKSIKOLOJI ÇALISMALARI Hepatositlerde demir birikmesi ve dalaktaki demirin azalmasi RGMC nötralizasyonundan kaynaklanabileceginden, burada tarif edilen RGMa-selektif monoklonal antikorun toksikokinetikleri ve tolerabilitesi çalisilmistir. Çalismalarin, RGMa-selektif monoklonal antikorlar Sprague-Dawley siçanlarina uygulandiginda, hepatositlerde demir birikmesinin ve dalakta demir deplesyonunun gerçeklesmeyecegini göstermesi beklenir.
RGMa-Selektif Monoklonal Antikorlar AE12-1 ve AE12-1Y, Hümanize Monoklonal Antikor 5F9 gibi, optik sinir varalanmasinin bir sican modelinde ezilmis, hasar görmüs optik sinir aksonlarinin rejenerasyonunu indükler Optik Sinir Ezilmesi (ayni zamanda "Optik Sinir Yaralanmasi" olarak da ifade edilir) modeli, optik sinir liflerinin rejenerasyonunu stimüle eden ve retinal gangliyon hücrelerinin masif hücre ölümünü azaltan çesitli maddeleri test etmek için bir hayvan modeli saglar.
Deneyler, Charles River (D) Laboratories'den (Almanya) elde edilen erisken erkek Wistar siçanlarinda yürütülmüstür. Hayvanlar, besine ve suya serbest erisim ile bir 12:12 saat aydinlik/karanlik siklus ile tek kafeslerde tutulmustur. Optik sinir ezilmesi üzere minimal anteriyor cerrahi ile yalnizca sol gözde gerçeklestirilir ve insan anteriyor görsel cerrahi yöntemleri izlenir. Cerrahi öncesinde ve sirasinda, prosedür hayvanlarina Sevoflurane (Abbott GmbH C0. & KG, Delkenheim, Almanya) kullanilarak inhalasyon anestezi ile anestezi uygulanir ve hayvanlar çene kelepçesi ve uzuvlar için yapiskan bant kullanilarak cerrahi masasina sabitlenir. Vücut sicakligindaki bir düsüs, hayvanlari bir isitma pedi üzerine koyma ile önlenir. Siçan optik sinirinin anteriyor ezilmesi cerrahisi için, sol göz Iigamentte ve bag dokudan dikkatlice kurtarilir. Bir birinci adim olarak, gözün dis kösesindeki bitisik dokunun bir mikro-cerrahi kesi (2-3 mm) gerçeklestirilir. Bir sonraki adim olarak, optik sinir göz kaslarini ve gözyasi bezini yana hareket ettirmek için bir çift kiskaç kullanilarak açiga çikarilir, böylece bu ayrilir. Bir ilave adim olarak, optik siniri açiga çikarmak Için mikro-makaslar kullanilarak meninksler boylamasina açilmistir. Bu, gözün daha yüksek bir mobilitesi ile sonuçlanir ve gözün lateral rotasyonuna ve bunun sol optik sinirine erisime olanak saglar. Optik sinir, 10-20 saniye boyunca bir sabitlenmis maksimum basinç saglamak için ayarlanmis bir çift kiskaç kullanilarak gözün yaklasik 1-3 mm arkasindan yaralanir.
Göze vasküler tedarike hasar vermemek için özellikle dikkat edilmelidir.
Minimal invasif cerrahiden sonra, hayvanlar, hareket etmeye baslayana kadar, vücut sicakligini kontrol etmek Için daha ilik olan bir yere yerlestirilmis temiz kafes içinde kagit havlular üzerine koyulur. Antibiyotik içeren bir merhem (Gentamytrex, Dr. Mann Pharma), bakteriyel enfeksiyondan ve skleranin tamamen kurumasindan kaçinmak için göze uygulanir.
Carprofen (Rimadyl, 5 mg/kg), cerrahiden hemen sonra ve akabinde bir 3 günlük periyot boyunca günde iki kere post-operatif agir terapisi için intraperitoneal olarak uygulanir. Hayvanlar, cerrahiden hemen sonra bir kaç saat boyunca ve sonraki 2-4 gün içinde, tüm hayvanlarin sag kaldigindan ve anesteziden ve cerrahiden derlendiginden emin olmak için düzenli olarak gözlenir ve kontrol edilir.
Yukarida tarif edilen modifiye edilmis anteriyor optik sinir ezilmesi yaklasimi, gözün posteriyor parçasindan köken alan standart optik sinir ezilmesi prosedürüne kiyasla anlamli avantajlara sahiptir. Spesifik olarak, burada tarif edilen prosedürde, dikis atmayi gerektiren genis açik yaralar olusturulmaz ve çok küçük yaralarin enfeksiyon riski anlamli olarak azaltilir. Buna ek olarak, ezilme için gerekli olan daha az sürenin bir sonucu olarak (yukarida tarif edilen anteriyor yöntemi teknikte bilinen posteriyor yöntemine kiyasla yaklasik olarak 3 kat daha hizlidir), hayvanlar daha az aci çeker ve böylelikle daha az stresli olur. Dahasi, hayvanlarin tarafindan çekilen agrinin miktari anlamli bir sekilde azaltilir ve hayvanlar bir daha çok oranlarda ve çok daha çabuk bir sekilde derlenir.
Antikorlarin sistemik uygulamasi Sistemik antikor aktarimi için, erkek Wistar siçanlarina, sistemik intravenöz olarak (iv), bir hümanize RGMa ve RGMc-bloke etme 5F9 antikoru (h5F9) (n = 8 hayvan) burada tarif edilen, bir RGMa-selektif, insan antikoru, AE12-1, ile ve ayrica burada tarif edilen, bir yakindan iliskili RGMa mAb, AE12-1Y, ile ve bir insan Izotop kontrol antikoru (hlgG) (n = 8 hayvan) ile muamele edilmistir. Siçanlara verilen antikorun 10 mg/kg'i haftada bir kere intravenöz olarak enjekte edilmistir ve enjeksiyonlar optik sinir ezilmesinden hemen sonra baslatilmistir. Tüm siçanlar 5 enjeksiyon almistir ve hayvanlara ezilme yaralanmasindan 6 hafta sonra ötanazi yapilmistir. Deneyi yapan kisiler kördür ve doku izolasyonu, isleme, kesitlerin preparasyonu ve kantitatif analiz, P.
Siçan optik sinirlerinin kompozit görüntüleri hazirlanmistir, ezilme yeri tanimlanmistir ve ezilme yerinden 500 pm öteye uzanan GAP-43 pozitif lifler sayilmistir. Sekil 16'da gösterildigi üzere, üç RGMa antikorunun tümü - h5F9, AE12-1 ve AE12-1Y - hlgG ile muamele edilmis kontrol hayvanlarinin aksine, ezilme yerinin ötesinde anlamli rejeneratif büyümeyi indüklemistir.
RGMa-selektif Monoklonal Antiorlar AE12-1 ve AE12-1Y, Hümanize Antikor 5F9 ggn ret_inal sini_r lifi ta_bakasini (RNLF) deienerasvongan korg RNLF dejenerasyonunun korunmasini gözlemlemek için, bir yeni laboratuvar analiz yöntemi kullanilmistir. Bu yöntem, optik sinir ezilmesi olan ve antikor 5F9, AE12-1, AE2-1Y ve kontrol antikoru, insan lgG'si ile sistemik olarak muamele edilmis siçanlarin gözlerinden elde edilen eriskin siçan retinasini ek3plante etmeye ve analiz etmeye kaynaklarinda tarif edilen yöntemin bir adaptasyonudur. Charles River Laboratories'den (Almanya) elde edilen eriskin erkek Wistar siçanlarina verilen antikorun 10 mg/kg'i haftada bir kere intravenöz olarak enjekte edilmistir ve enjeksiyonlar optik sinir ezilmesinden hemen sonra baslatilmistir. Tüm siçanlar 5 enjeksiyon almistir ve hayvanlara ezilme yaralanmasindan 6 hafta sonra ötanazi yapilmistir.
Retina preparasyonu ve immünoflüoresan boyama: Hayvanlara, Sevoflurane (%8; Abbott GmbH C0. & KG, Delkenheim, Almanya) ile derin anestezi uygulanmistir, akabinde hayvanlar hemen gögüs kafesini açma ile kurban edilmistir ve sol kalp ventriküleri yoluyla %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile perfüze edilmistir. Gözler ayarlanan bag doku ile diseke edilmistir ve retina preparasyonu gerçeklestirilene kadar %4 PFA içine koyulmustur.
Retina preparasyonu Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS, Magnezyum ve Kalsiyum içermez; Invitrogen, #14170070) içinde gerçeklestirilmistir. Göz dondurucu tarafindan bag dokuda fikse edilmistir ve korneanin hemen etrafinda sklerada bir yuvarlak kesi yapilmistir.
Retinanin yarim-küresi dört noktada kesilmistir, açilmistir ve bir gri nitroselüloz membran (Sartorius, #13006-50-N) üzerine yayilmistir. Gerektiginde, üzerinde retina olan membranin 5-10 saniye boyunca hava ile kurumasina izin verilmistir.
Bundan sonra, membran üzerindeki retina, immünoflüoresan boyama gerçeklestirilene kadar, +4°C'de %10 nötral fosfat-tamponlu formaldehit çözeltisine (pH 7,3; Fisher Scientific, #F/1520/21) koyulmustur. Boyama asagida tarif edilen protokole göre gerçeklestirilir.
Retina preparasyonu TBS ile yikanmistir, bunu TBS içinde %5 BSA, %1 Triton X-100 ile 30 dakika boyunca bloke etme ve geçirimli hale getirme izlemistir ve akabinde TBS ile yeniden yikanmistir. Primer antikorlar, yani, monoklonal Ab TUJ-1, bir fare anti-ß III sicakliginda 1 saat boyunca eklenmistir, bunu TBS, %O,1 Tween 20 ile yikama izlemistir. Sonra, bir sekonder antikor, yani, Esek anti-fare Cy3; Jackson TBS, %5 BSA içinde 12100 seyreltme) karanlikta oda sicakliginda 1 saat boyunca eklenmistir, bunu TBS, %O,1 Tween 20 ile yikama ve tuzundan arindirilmis HZO ile müteakip yikama izlemistir. Preparasyon akabinde Fluoromount G ile birlestirilmistir ve karanlikta +4°C'de saklanmistir.
RGMa antikorlarinin gözdeki retinal sinir lifi tabakasi (RNFL) üzerindeki koruyucu etkisinin kantitatif analizi Axiovision yazilimi kullanilarak, her bir retinan rastgele seçilmis görüntüleri (n = 12) seçilmistir ve her bir görüntü için sinir Iiflerinin sayisi belirlenmistir. Bu deneyler için, ezilmis optik sinirleri olan 5-8 retina her bir grup için kullanilmistir: h5F9 MAb grubu, hIgG kontrol MAb grubu ve AE12.1 ve AE12-1Y MAb gruplari. Veri analizi ve istatistiksel analiz GraphPad prism programi kullanilarak gerçeklestirilmistir.
Sonuçlar Sekil 17'de gösterilir. Spesifik olarak, hlgG kontrol antikoru ile muamele edilmis hayvanlar ile karsilastirildiginda mevcut bulusun RGMa antikorlari ile sistemik olarak muamele edilmis hayvanlarin retinalarinda bir anlamli olarak daha yüksek sayida sinir lifi demeti gözlenir.
RGMa antikorlari bir fokal spinal Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Model'inde fonksiyonel geri-kazanimi hizlandirir EAE modeli gelistirmistir, burada genis enflamatuvar lezyonlar omurilikte, beyinde ve optik sinirde rastgele yayilmamistir, ancak omurilikte veya diger beyin alanlarinda selektif bir sekilde indüklenebilir. Bu fokal veya hedeflenmis EAE modeli kullanilarak, MS omurilik Iezyonlarina çok benzeyen, büyük enflamatuvar lezyonlar, korteks-omurilik yolu etkilenerek, omuriligin dorsal kolonlarinda indüklenir. Bu modelde, siçanlar ile olarak miyelin proteini MOG ile immünize edilir. Immünizasyondan iki ila üç hafta sonra, MOG antikoru titreleri belirlenmistir ve bir pozitif immün yaniti olan hayvanlara torasikal düzey 8'den (T8) lokal olarak bir sitokin karisimi (TNFoi enjekte edilmistir. Sitokin enjeksiyonundan sonraki bir hafta içinde, siçanlar 25'lik bir EAE skoruna ulasan arka-bacak motor kusurlari, kuyruk paralizi ve yürüyüs bozukluklari gelistirmistir. Sitokin enjeksiyonundan dört hafta sonra, bu skor, 1'Iik bir EAE skoruna Disi Lewis siçanlarina salin içinde çözünmüstür ve 75 ul Eksik Freund Adjuvani (IFA, Biotech, Worcester, MA) subkütan olarak enjekte edilmistir. Enjeksiyondan hemen önce ve akabinde her 7-8. günde bir, MOG antikorlari için örnekleri analiz etmek amaciyla hayvanlardan kan örnekleri alinmistir.
MOG immünizasyonundan iki veya üç hafta sonra, immünize edilmis siçanlardan kari alinmistir ve MOG-spesifik antikorlari saptamak için bir ELISA gerçeklestirilmistir.
Immünizasyon, immünize edilmis siçanlarin %90'indan fazlasinda MOG antikorlarinin indüksiyonu ile sonuçlanir. Bununla birlikte, bu susta, MOG antikoru indüksiyonu herhangi bir hastalik semptomu ile sonuçlanmamistir. Lewis siçanlari, torasikal düzey 8'den (T8) trosikal omurilige 2 enflamatuvar sitokinin (TNF o, IFNg) lokal enjeksiyonundan sonra yalnizca motor kusurlari gelistirmistir.
Sitokin enjeksiyonu için, siçanlar Sevoflurane (%8; Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Almanya) ile Inhalasyon anestezine tabi tutulmustur ve bir Iaminektomi bir standart prosedür ile gerçeklestirilmistir. Spesifik olarak, siçanlarin sirtindaki cilt tiras edilmistir ve %70'Iik etanol ile dezenfekte edilmistir, akabinde tiras edilmis alan prodin ile silinmistir ve nester ile yaklasik olarak T3-4'ten baslayip T11-12'ye kadar 2-3 cm'lik bir kesi yapilmistir. Süperfisyal yag, kaslardan ince makas ile ayrilmistir ve kaslar bir yandan omurga boyunca orta hattan kesilmistir. T8 ve T9 arasinda bosluk yerlestirilmistir ve T8, bitisik dokudan temizlenmistir. Bir cerrahi mikro-matkap T8'de yaklasik olarak 1-2 mm'lik çapi olan bir yuvarlak delik yapmak için kullanilmistir ve küçük uçlu kiskaçlar periosteumu ve herhangi bir kemik fragmanini uzaklastirmak için kullanilmistir. Sonra, sert-zar mikro makas ile uzaklastirilmistir ve bir stereotaktik enjeksiyon, Luer Tip (LT) ile bir 10 ul'lik Hamilton enjektöre baglanmis ve mineral sivi yag (Sigma Aldrich) ile doldurulmus bir çok ince cam kapiler ile yapilmistir.
Bir otomatik enjektör kullanilarak, kapiler PBS içinde sitokin karisiminin veya eser miktarda Evans mavisi bulunan yalnizca PBS'nin 3 pl'si ile doldurulmustur. TNFd'nin ( ayni dozu Kerschensteiner et al. (2004) tarafindan bildirildigi sekilde kullanilmistir. Dört kat daha yüksek doz, vehikül veya kontrol ile muamele edilmis siçanlarda geri-kazanim prosesinin anlamli bir uzamasi ile sonuçlanmistir.
Sonraki adimda, bir cam kapiler 0,7 mm'lik bir derinlige yerlestirilmistir ve 2 pl sitokin karisimi bir otomatik enjektör kullanilarak bir 5 dakikalik-periyot boyunca (T8)'den omuriligin ortasina enjekte edilmistir. Lidocaine uygulandiktan ve yara kapatildiktan sonra, siçanlara bir analjezik ilaç Rimadyl ile (dogrudan cerrahiden sonra bir baska 3-4 gün boyunca günlük olarak) muamele edilmistir. Akabinde, siçanlar bir temiz kafes içinde kagit havlular üzerine yerlestirilmistir ve bunlar uyanana kadar ilik yerde tutulmustur.
Siçanlar, sitokin enjeksiyonundan sonraki bir hafta içinde ilk semptomlari gelistirmistir.
Antikor muamelesi, sitokin uygulamasindan sonra gün 7'de veya 8'de baslatilmistir. Bir hlgG kontrol antikoru ve bir kaç farkli RGMa antikoru (yani, AE12-1, AE12-1Y ve kullanilmistir ve siçanlara intravenöz yol vasitasiyla haftada bir kere muamele edilmistir. EAE skorlamasi günlük olarak yapilmistir ve skorlar belgelenmistir. Deneyleri yürüten bireyler farkli tedavi gruplari için kördür. Sitokin uygulamasindan 27-29 günlük bir periyottan sonra, hayvanlar öldürülmüstür, omurilikler izole edilmistir ve asagidaki proteinlerin ekspresyonu Için analiz edilmistir: GAP-43 (rejenerasyon markörü), CD68 (aktive edilmis mikrogliya hücreleri ve makrofajlar için enflamatuvar markör) ve MP8 (miyelin bazik protein, remiyelinasyon veya korunmus miyelin yollari için bir markör).
Bu markörlerin alani ölçülmüstür, analiz edilmistir ve bir yönlü ANOVA ve Bonferroni anlamlilik testi kullanilarak istatistiksel olarak degerlendirilmistir. Sekil 18'de gösterildigi üzere, üç RGMa antikorunun tümü spinal tEAE modelinde fonksiyonel geri-kazanimi hizlandirmistir.
Spinal tEAE modelinde, tüm RGMa antikorlari çok benzer rejenerasyon- ve nörokoruma stimüle etme aktivitesi göstermistir. RGMa-selektif antikorlar AE12-1 ve AE12-1Y, hem RGMa'yi hem de RGMc'yi nötralize eden h5F9.23'e kiyasla benzer aktivite göstermistir. RGMc'nin nötralizasyonunun, etkinlik için gerekli oldugu görülmemistir. Bundan dolayi, fokal spinal EAE modelinde üç RGMa mAb'sinin antikorlari ile muamele edilmis siçanlarin omuriliklerinin seri kesitlerinde degerlendirilen bir kaç markör, rejenerasyon alanini (GAP-43), remiyelinasyon alanini (miyelin bazik protein (MBP)) arttirmistir ve spinal lezyon yeri etrafindaki enflamatuvar CD68 (CD68- pozitif) alanini azaltmistir (Bakiniz, Sekil 19).
RGMa-selektif antikor AE12-1Y-QL, bu antikorun hangi dozlarinin bu spinal tEAE modelinde aktif oldugunu belirlemek için test edilmistir. Spesifik olarak, 4 farkli antikor dozu (yani, 0,01, 0,1, 1, 10 mg/k) siçanlara haftada bir kere IV sistemik olarak Bununla birlikte, 0,01 mg/kg'lik bir doz etkinlik göstermemistir.

Claims (1)

  1. ISTEMLER . Bir izole edilmis monoklonal anti-itici Yönlendirme Molekülü a (RGMa) antikoru olup, özelligi SEQ ID NO: 2 amino asit dizisini içeren bir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR), SEQ ID NO: 3 amino asit dizisini içeren bir CDR2 ve SEO ID NO: 4 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir degisken agir zincir bölgesi ve SEO ID NO: 6 amino asit dizisini içeren bir CDR1, SEQ ID NO: 7 amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir hafif zincir bölgesini içermesidir. . Istem 1'e göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi degisken hafif zincir bölgesinin CDR3'ünün, SEQ ID NO: 73 amino asit dizisini içermesidir. . Istem 1'e veya istem 2'ye göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi antikorun insan olmasidir. . Istem 1'e veya istem 2'ye göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi antikorun, bir !96 izotipinin bir agir zincir immünoglobülin sabit alanini Içermesidir. . Istem 4'e göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, Özelligi IgG izotipinin, insan IgG1 izotipi olmasidir. . Istem 5'e göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi insan . Istem 5'e göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi insan . Istem 1'e veya istem 2'ye göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi antikorun, bir Iamda hafif zincir sabit bölgesi içermesidir. . Istemler 1-8'den herhangi birine göre izole edilmis monoklonal anti-RGMa antikoru olup, özelligi antikorun, SEQ ID NO: 146'da izah edildigi sekilde bir hafif zincir dizisi ve SEO ID NO: 147'de izah edildigi üzere bir agir zincir dizisi içermesidir. Istemler 1-9'dan herhangi birine göre anti-RGMa antikoru olup, özelligi antikorun ilaveten asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir ajan içermesidir: bir immünoadezyon molekülü, bir görüntüleme ajani ve bir terapötik ajan, burada görüntüleme ajani, radyo-etiketten, bir enzimden, birflüoresan etiketten, bir Iüminesan etiketten, bir biyolüminesan etiketten, bir manyetik etiketten ve biyotinden olusan gruptan seçilir ve veya 1538m'den olusan gruptan seçilir. Bir farmasötik bilesim olup, özelligi istemler 1-9'dan herhangi birine göre anti- RGMa antikorunu içermesidir.
TR2018/09967T 2012-01-27 2013-01-25 Nörit dejenerasyonu ile ilişkili hastalıkların tanısı ve tedavisi için bileşim ve yöntem. TR201809967T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261591324P 2012-01-27 2012-01-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809967T4 true TR201809967T4 (tr) 2018-08-27

Family

ID=47710338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09967T TR201809967T4 (tr) 2012-01-27 2013-01-25 Nörit dejenerasyonu ile ilişkili hastalıkların tanısı ve tedavisi için bileşim ve yöntem.

Country Status (36)

Country Link
US (6) US20130330347A1 (tr)
EP (3) EP3369746A1 (tr)
JP (4) JP6271441B2 (tr)
KR (1) KR102129234B1 (tr)
CN (2) CN104487455A (tr)
AU (4) AU2013211939C1 (tr)
BR (1) BR112014018592B1 (tr)
CA (1) CA2857967C (tr)
CL (1) CL2014001963A1 (tr)
CO (1) CO7020876A2 (tr)
CR (1) CR20140360A (tr)
CY (1) CY1120390T1 (tr)
DK (1) DK2807192T3 (tr)
DO (1) DOP2014000174A (tr)
EC (1) ECSP14010817A (tr)
ES (1) ES2676725T3 (tr)
GT (1) GT201400162A (tr)
HK (1) HK1198831A1 (tr)
HR (1) HRP20181087T1 (tr)
HU (1) HUE039611T2 (tr)
IL (5) IL297229A (tr)
LT (1) LT2807192T (tr)
MX (2) MX352772B (tr)
MY (2) MY176695A (tr)
NZ (2) NZ714482A (tr)
PE (2) PE20142168A1 (tr)
PH (1) PH12014501682B1 (tr)
PL (1) PL2807192T3 (tr)
PT (1) PT2807192T (tr)
RS (1) RS57603B1 (tr)
RU (2) RU2644337C2 (tr)
SG (3) SG10201600316SA (tr)
SI (1) SI2807192T1 (tr)
TR (1) TR201809967T4 (tr)
UA (1) UA118083C2 (tr)
WO (1) WO2013112922A1 (tr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012013734A2 (pt) * 2009-12-08 2017-01-10 Abbott Gmbh & Co Kg anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina.
AU2011285852B2 (en) 2010-08-03 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
IL297229A (en) * 2012-01-27 2022-12-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
BR112015012014A2 (pt) 2012-12-04 2017-07-11 Abbvie Inc proteínas de ligação específicas duais penetrando a barreira hematoencefálica (bbb)
EP3037817B1 (en) 2013-08-19 2019-06-12 Osaka University Screening method for pain suppressors and pharmaceutical composition for prevention or treatment of pain
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
TW201617612A (zh) * 2014-09-10 2016-05-16 艾伯維德國有限及兩合公司 以ＲＧＭａ片段為主的診斷分析
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
GB201502447D0 (en) 2015-02-13 2015-04-01 Univ Liverpool Method and apparatus for sample analysis
CR20200517A (es) * 2015-04-28 2021-01-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp PROTEINA DE UNION A RGma Y SUS USO
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3347378A1 (en) * 2015-09-11 2018-07-18 AbbVie Inc. Methods for treating relapsing forms of multiple sclerosis
WO2017161327A1 (en) * 2016-03-17 2017-09-21 Diazyme Laboratories, Inc. Use of fusion proteins to improve the availability of antigenic peptide epitopes in immunoassays
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
JP2019517480A (ja) * 2016-06-01 2019-06-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 脊髄損傷及び疼痛を処置するための抗ＲＧＭａ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａ）アンタゴニスト抗体
GB201618432D0 (en) 2016-11-01 2016-12-14 Matn Scient Ltd Detection and treatment of demyelinating diseases
CN108558997B (zh) * 2017-10-20 2021-10-08 中国人民解放军第四军医大学 一种重组融合蛋白TIGIT-Fc及其抗移植排斥反应的应用
CN112533635A (zh) 2018-07-10 2021-03-19 田边三菱制药株式会社 末梢神经病变或者伴随确认到末梢神经病变或星形胶质细胞病变的疾病的疼痛的预防或治疗方法
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
EP4091632A1 (en) 2020-01-15 2022-11-23 Osaka University Agent for prevention or treatment of diabetic autonomic neuropathy
US20230090965A1 (en) 2020-01-15 2023-03-23 Osaka University Prophylactic or therapeutic agent for dementia

Family Cites Families (339)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
AU588161B2 (en) 1984-08-09 1989-09-07 National Research Development Corporation. Flushing cisterns
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP1186660A3 (fr) 1985-03-30 2002-03-20 KAUFFMAN, Stuart A. Procédé d'obtension d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombination d'ADN
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5635600A (en) 1986-07-07 1997-06-03 Trustees Of Dartmouth College Bifunctional and heteroantibodies specific for the high affinity Fc receptor for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
ES2063735T3 (es) 1986-10-22 1995-01-16 Abbott Lab Sales de acridinio quimioluminiscentes.
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
MC2115A1 (fr) 1987-12-15 1991-07-05 Gene Shears Pty Ltd Ribozynes
US5006309A (en) 1988-04-22 1991-04-09 Abbott Laboratories Immunoassay device with liquid transfer between wells by washing
US5089424A (en) 1988-06-14 1992-02-18 Abbott Laboratories Method and apparatus for heterogeneous chemiluminescence assay
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
US5241070A (en) 1988-09-26 1993-08-31 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
GB8826530D0 (en) 1988-11-12 1988-12-14 Ped Capacitors Ltd Electrical capacitors
US5063081A (en) 1988-11-14 1991-11-05 I-Stat Corporation Method of manufacturing a plurality of uniform microfabricated sensing devices having an immobilized ligand receptor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5939272A (en) 1989-01-10 1999-08-17 Biosite Diagnostics Incorporated Non-competitive threshold ligand-receptor assays
US5028535A (en) 1989-01-10 1991-07-02 Biosite Diagnostics, Inc. Threshold ligand-receptor assay
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
US5139400A (en) 1989-10-11 1992-08-18 Ide Russell D Progressive cavity drive train
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
FR2656431B1 (fr) 1989-12-22 1994-06-10 Essilor Int Procede et solution pour decontaminer une lentille souple, en particulier du type hydrophile.
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5922615A (en) 1990-03-12 1999-07-13 Biosite Diagnostics Incorporated Assay devices comprising a porous capture membrane in fluid-withdrawing contact with a nonabsorbent capillary network
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5135875A (en) 1990-08-15 1992-08-04 Abbott Laboratories Protein precipitation reagent
CA2048302A1 (en) 1990-08-15 1992-02-16 Victoria P. Meucci Solubilization reagent for biological test samples
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU658374B2 (en) 1990-09-14 1995-04-13 Biosite Diagnostics Incorporated Antibodies to complexes of ligand receptors and ligands and their utility in ligand-receptor assays
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2105300C (en) 1991-03-01 2008-12-23 Robert C. Ladner Process for the development of binding mini-proteins
AU1772992A (en) 1991-04-10 1992-11-17 Biosite Diagnostics Incorporated Crosstalk inhibitors and their uses
WO1992018866A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 Biosite Diagnostics Incorporated Novel conjugates and assays for simultaneous detection of multiple ligands
JP3672306B2 (ja) 1991-04-10 2005-07-20 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー
AU666852B2 (en) 1991-05-01 1996-02-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
CA2069530A1 (en) 1991-06-03 1992-12-04 Cass J. Grandone Reagent pack for immunoassays
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
US5766886A (en) 1991-12-13 1998-06-16 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5352803A (en) 1992-03-30 1994-10-04 Abbott Laboratories 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives
DE69328622T2 (de) 1992-03-30 2001-02-08 Abbott Lab Reagenzien und verfahren zum nachweis und zur quantifizierung von thyroxin in flüssigen proben
US5885527A (en) 1992-05-21 1999-03-23 Biosite Diagnostics, Inc. Diagnostic devices and apparatus for the controlled movement of reagents without membrances
US6143576A (en) 1992-05-21 2000-11-07 Biosite Diagnostics, Inc. Non-porous diagnostic devices for the controlled movement of reagents
WO1994001234A2 (de) 1992-07-10 1994-01-20 Horst Warneke Fertigungsstrasse zur herstellung einer stahlkassette für decken- und/oder wandkonstruktionen aus einer blechtafel
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
JP3626187B2 (ja) 1993-06-07 2005-03-02 バイカル インコーポレイテッド 遺伝子治療に適するプラスミド
US5824799A (en) 1993-09-24 1998-10-20 Biosite Diagnostics Incorporated Hybrid phthalocyanine derivatives and their uses
US5565352A (en) 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
ES2178669T3 (es) 1994-03-07 2003-01-01 Medarex Inc Moleculas biespecificas que tienen utilidad clinica.
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5541109A (en) 1994-04-19 1996-07-30 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Expression cloning of c-src SH3-domain binding proteins
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
EP1405911A1 (en) 1994-07-20 2004-04-07 The General Hospital Corporation Interaction trap systems for detecting protein interactions
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
DE69532857T2 (de) 1994-10-27 2005-04-28 Genentech Inc., San Francisco Neurotrophischer AL-1 Faktor, einer Ligand verwandt mit dem EPH Tyrosine Kinase Receptor
GB9425232D0 (en) 1994-12-14 1995-02-08 Secr Defence Method of authenticating watermarked paper
WO1996020698A2 (en) 1995-01-05 1996-07-11 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
JPH11503914A (ja) 1995-04-21 1999-04-06 セル ジェネシス，インコーポレイテッド 大ゲノムｄｎａ欠失の生成
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
CA2225460A1 (en) 1995-06-23 1997-01-09 Winston Campbell Patterson Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
CA2229043C (en) 1995-08-18 2016-06-07 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
CA2230494A1 (en) 1995-08-31 1997-03-06 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Composition for sustained release of an agent
US5747262A (en) 1995-10-16 1998-05-05 The Regents Of The University Of California Neurological drug screens
US20020136725A1 (en) 1996-01-17 2002-09-26 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
DK0929578T3 (da) 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
FR2754461B1 (fr) 1996-10-16 1999-02-12 Husson Olivier Fixation demontable manuellement pour patin en ligne avec une jambiere de maintien qui commande un systeme de freinage
US6113855A (en) 1996-11-15 2000-09-05 Biosite Diagnostics, Inc. Devices comprising multiple capillarity inducing surfaces
CA2616914C (en) 1996-12-03 2012-05-29 Abgenix, Inc. Egfr-binding antibody
DE69732537T2 (de) 1996-12-11 2006-03-30 Bristol-Myers Squibb Co. Prokaryotisches zwei-hybrid system
US6017517A (en) 1996-12-18 2000-01-25 The Dial Corporation Method for treating human nails
CA2277801C (en) 1997-01-16 2002-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
EP0971946B1 (en) 1997-01-21 2006-07-05 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US5947124A (en) 1997-03-11 1999-09-07 Biosite Diagnostics Incorporated Diagnostic for determining the time of a heart attack
JP2002514919A (ja) 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
AU7171098A (en) 1997-05-01 1998-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IT1294449B1 (it) 1997-07-02 1999-03-24 F B C Di Giuliano Frati & C Sn Struttura calzabile sportiva e metodi per attuare la stessa in particolare per pattini monofilari e da shortracking.
US6440455B1 (en) 1997-09-02 2002-08-27 Children's Medical Center Corporation Methods for modulating the axonal outgrowth of central nervous system neurons
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
WO1999028349A2 (en) 1997-12-02 1999-06-10 Medarex, Inc. CELLS EXPRESSING ANTI-Fc RECEPTOR BINDING COMPONENTS
US6464686B1 (en) 1998-01-21 2002-10-15 Abbott Laboratories Polyurethane feeding tube and associated adaptors
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
JP2002510490A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 キュラジェン コーポレイション Ｌｙｓｔタンパク質複合体およびｌｙｓｔ相互作用タンパク質
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
TWI242563B (en) 1998-04-30 2005-11-01 Tanox Inc Monoclonal agonist antibodies which specifically bind to or interact with human G-CSF receptor
WO1999066903A2 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
CA2332625A1 (en) 1998-07-10 2000-01-20 Curagen Corporation Interaction of human beta amyloid precursor protein (.beta.-app) with human lon-protease like protein (hslon)
IL128017A0 (en) 1998-07-22 1999-11-30 Technion Res & Dev Foundation Method for detecting protein-protein interactions and a kit therefor
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
JP2002524087A (ja) 1998-09-03 2002-08-06 ローマ リンダ ユニバーシティー インビボにおいてタンパク質相互作用を調べる方法
JP2002526756A (ja) 1998-09-24 2002-08-20 デューク ユニバーシティ 生細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用の測定方法
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
PT1135498E (pt) 1998-11-18 2008-04-30 Genentech Inc Variantes de anticorpos com maior afinidade de ligação em comparação com os anticorpos parentais
CZ302706B6 (cs) 1998-12-23 2011-09-14 Pfizer Inc. Lidská monoklonální protilátka, farmaceutická kompozice tuto protilátku obsahující, bunecná linie produkující tuto protilátku, izolovaná molekula kódující težký nebo lehký retezec uvedené protilátky, hostitelská bunka obsahující tuto izolovanou molek
US6231768B1 (en) 1999-01-19 2001-05-15 Nalco Chemical Company Rheology modification of settled solids in mineral processing
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
TR200102715T2 (tr) 1999-03-25 2002-09-23 Knoll Gmbh Beşeri IL-12'yi bağlayan beşeri antikorlar ve bunları üretmek için yöntemler.
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
JP2003518364A (ja) 1999-05-28 2003-06-10 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 乳癌、胃癌および前立腺癌関連抗原ならびにそれらの使用
EP1396543A3 (en) 1999-07-08 2004-03-31 Research Association for Biotechnology Primers for synthesizing full length cDNA clones and their use
MXPA02001911A (es) 1999-08-24 2003-07-21 Medarex Inc Anticuerpos ctla-4 humanos y sus usos.
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
CA2396719A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. 22 human secreted proteins
TW201305214A (zh) 2000-02-10 2013-02-01 Abbott Gmbh & Co Kg 與人類間白素－１８結合之抗體，及其製法及用途
US20030235584A1 (en) 2000-02-28 2003-12-25 Kloetzer William S. Method for preparing anti-MIF antibodies
US6800455B2 (en) 2000-03-31 2004-10-05 Scios Inc. Secreted factors
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
AU5943201A (en) 2000-05-03 2001-11-12 Amgen Inc Modified peptides as therapeutic agents
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU7684201A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Glycofi Inc Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
DE60137421D1 (de) 2000-06-29 2009-03-05 Abbott Lab Antikörper mit zwei spezifizitäten und verfahren zur deren herstellung und verwendung
IL153856A0 (en) 2000-07-18 2003-07-31 Correlogic Systems Inc A process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data
WO2002036771A2 (en) 2000-11-06 2002-05-10 Cancer Research Technology Limited Imaging, diagnosis and treatment of disease
WO2002051438A2 (en) * 2000-12-22 2002-07-04 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
IL156618A0 (en) 2000-12-28 2004-01-04 Altus Biologics Inc Crystals of whole antibodies and fragments thereof, methods for the preparation thereof and diagnostic kits utilizing the same
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6890763B2 (en) 2001-04-30 2005-05-10 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1350 daltons
EP1270044A3 (en) 2001-06-18 2003-03-12 Pfizer Limited Wound healing biomarkers
CA2452501A1 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Incyte Genomics, Inc. Secreted proteins
EP1432444A4 (en) 2001-08-17 2005-11-02 Lilly Co Eli ANTI-BETA ANTIBODIES
WO2003020894A2 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Joslin Diabetes Center, Inc. Insulin related transcription factor and uses thereof
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
WO2003029456A1 (en) 2001-10-01 2003-04-10 Dyax Corp. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
EP1461081A4 (en) 2001-12-03 2006-05-17 Abgenix Inc ANTI-CD45RB ANTIBODY FOR USE IN THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES AND TRANSPLANT ABLUSION
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US7419821B2 (en) 2002-03-05 2008-09-02 I-Stat Corporation Apparatus and methods for analyte measurement and immunoassay
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
WO2003080659A1 (en) 2002-03-27 2003-10-02 Theratechnologies Inc. Methods and compounds for prevention and treatment of elevated intraocular pressure and related conditions
EP1490108A4 (en) 2002-04-18 2006-08-09 Gen Hospital Corp DRAG11 GENERAL FAMILY (DRAGON)
WO2003095978A2 (en) 2002-05-09 2003-11-20 Surromed, Inc. Methods for time-alignment of liquid chromatography-mass spectrometry data
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
WO2003103608A2 (en) 2002-06-11 2003-12-18 The Burnham Institute Neuroprotective synergy of erythropoietin and insulin-like growth factor
US7771952B2 (en) 2002-06-26 2010-08-10 Abott Laboratories Modulators and modulation of the interaction between RGM and Neogenin
EP1380644A1 (en) 2002-07-08 2004-01-14 Kylix B.V. The use of specified TCF target genes to identify drugs for the treatment of cancer, in particular colorectal cancer, in which TCF/beta-catenin/WNT signalling plays a central role
US20040018577A1 (en) 2002-07-29 2004-01-29 Emerson Campbell John Lewis Multiple hybrid immunoassay
TWI323265B (en) 2002-08-06 2010-04-11 Glaxo Group Ltd Antibodies
US7541440B2 (en) 2002-09-30 2009-06-02 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-granulocyte antibodies and methods of use
JP2006517188A (ja) 2002-12-02 2006-07-20 アブジェニックス・インコーポレーテッド ホスホリパーゼａ２に対する抗体及びその使用
WO2004050032A2 (en) 2002-12-02 2004-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies against drugs of abuse
EP1440981A3 (en) 2003-01-21 2005-11-23 Research Association for Biotechnology Full-length human cdna
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
JP4464395B2 (ja) 2003-03-05 2010-05-19 ヘイローザイム インコーポレイテッド 可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、その調製プロセス、使用およびそれを含む薬学的組成物
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
GB0306309D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Glaxo Group Ltd Method of treatment
WO2004092405A2 (en) 2003-04-15 2004-10-28 Xenon Pharmaceuticals Inc. Juvenile hemochromatosis gene (hfe2a), expression products and uses thereof
CN100417414C (zh) 2003-04-30 2008-09-10 苏黎世大学 免疫毒素在制备治疗头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌药物中的应用
JP2007501612A (ja) 2003-08-07 2007-02-01 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｎｏｇｏ受容体アンタゴニスト
US20080274112A1 (en) 2003-08-07 2008-11-06 Lee Daniel H S Nogo Receptor Antagonists
JP2007521232A (ja) 2003-08-08 2007-08-02 アブジェニックス・インコーポレーテッド 副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）に対する抗体およびその使用
US20060003391A1 (en) 2003-08-11 2006-01-05 Ring Brian Z Reagents and methods for use in cancer diagnosis, classification and therapy
EP1660534A2 (en) 2003-08-22 2006-05-31 MedImmune, Inc. Humanization of antibodies
US7723099B2 (en) 2003-09-10 2010-05-25 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with immuno-reference electrode
US7682833B2 (en) 2003-09-10 2010-03-23 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with improved sample closure
JP2007534307A (ja) 2003-11-07 2007-11-29 キュラジェン コーポレイション 分泌性白血球プロテアーゼインヒビターに対する抗体
JP4901480B2 (ja) 2003-12-22 2012-03-21 グラクソ グループ リミテッド 神経疾患治療用の、ｎｏｇｏ−ａを中和する免疫グロブリン
WO2005061554A1 (ja) 2003-12-24 2005-07-07 Idemitsu Kosan Co., Ltd. ポリオレフィンの製造方法及びその製造装置
EP1733737A4 (en) 2004-03-11 2007-09-05 Bioclues Inc AXON REGENERATION PROMOTER
WO2005100584A2 (en) 2004-04-15 2005-10-27 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US20060063208A1 (en) 2004-08-02 2006-03-23 Woolf Clifford J DRG11-responsive (DRAGON) gene and uses thereof
WO2006021955A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Mor Research Applications Ltd. Use of bat monoclonal antibody for immunotherapy
EP1781824A2 (en) 2004-08-25 2007-05-09 Genentech, Inc. Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP2194144B1 (en) 2004-11-16 2015-01-07 Trustees of Boston University Anti-Dual Endothelin-1/Angiotensin II receptor (DEAR) antibody for inhibiting disease-associated or pathological angiogenesis.
EP1814579B1 (fr) 2004-11-22 2014-01-08 Centre National de la Recherche Scientifique Netrine 4 mutee, ses fragments et leur utilisation comme medicaments
TW200635608A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
EP1677113A1 (en) 2004-12-29 2006-07-05 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Method for the identification of protein-protein interactions in disease related protein networks
JP5063366B2 (ja) 2005-02-16 2012-10-31 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ヘプシジンによる鉄代謝を制御するためのＴＧＦ−βスーパーファミリーの化合物の調節因子の使用
EP1861422B1 (en) 2005-03-05 2010-02-24 Abbott GmbH & Co. KG Screening method, process for purifying of non-diffusible a-beta oligomers, selective antibodies against said non-diffusible a-beta oligomers and a process for manufacturing of said antibodies
US7504225B2 (en) 2005-05-12 2009-03-17 Applied Genomics, Inc. Reagents and methods for use in cancer diagnosis, classification and therapy
WO2006127861A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Expression Pathology, Inc. Diagnosis of diseases and conditions by analysis of histopathologically processed biological samples using liquid tissue preparations
KR101245462B1 (ko) 2005-07-08 2013-03-20 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｓｐ35 항체 및 그의 용도
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
SG2014010029A (en) 2005-08-19 2014-08-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP1928905B1 (de) * 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
CA2625222A1 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Domantis Limited Antibody polypeptide library screening and selected antibody polypeptides
US20070155687A1 (en) 2005-10-14 2007-07-05 Alltech, Inc. Methods and compositions for altering cell function
US8871715B2 (en) 2005-10-14 2014-10-28 Alltech, Inc. Use of selenium compounds, especially selenium yeasts for altering cognitive function
US20080004255A1 (en) 2005-10-14 2008-01-03 Alltech, Inc. Methods and compositions for altering cell function
US8865763B2 (en) 2005-10-14 2014-10-21 Alltech, Inc. Methods and compositions for altering cell function
AU2006339538A1 (en) 2005-11-08 2007-09-13 Euclid Diagnostics Llc Materials and methods for assaying for methylation of CpG islands associated with genes in the evaluation of cancer
WO2007058671A1 (en) 2005-11-21 2007-05-24 West Michael D Novel uses of cells with prenatal patterns of gene expression
KR20080090408A (ko) 2005-11-30 2008-10-08 아보트 러보러터리즈 항-Ａβ 글로불로머 항체, 이의 항원-결합 잔기, 상응하는하이브리도마, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 당해 항체의 제조방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 용도 및당해 항체의 사용 방법
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US7420040B2 (en) 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
ES2527695T3 (es) 2006-03-08 2015-01-28 Archemix Llc Aptámeros de unión a complemento y agentes anti-C5 útiles en el tratamiento de trastornos oculares
WO2007106507A2 (en) 2006-03-14 2007-09-20 Petrie Howard T Detection of gene expression in mixed sample or tissue
EP1865071A1 (en) 2006-06-09 2007-12-12 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Method for early diagnosis of proliferative diabetic retinopathy
US7883855B2 (en) 2006-07-21 2011-02-08 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
WO2008013492A1 (en) 2006-07-28 2008-01-31 Chundsell Medicals Ab Embryonic stem cell markers for cancer diagnosis and prognosis
JPWO2008038599A1 (ja) 2006-09-25 2010-01-28 国立大学法人 千葉大学 軸索再生促進剤
KR20090052358A (ko) * 2006-09-29 2009-05-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｃｃｒ5 에 대한 항체 및 이의 용도
US8066154B2 (en) 2006-10-02 2011-11-29 Norman Schmidt Device for controlled metering of semi solid food products
CA2607490C (en) 2006-10-18 2018-04-10 Norman G. Schmidt Device to allow for cleaning access in semi-solid metering machines
US20100036091A1 (en) 2006-11-10 2010-02-11 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
US20100015665A1 (en) 2006-11-10 2010-01-21 Ucb Pharma S.A. Antibodies and diagnostics
WO2008064292A2 (en) 2006-11-21 2008-05-29 Abbott Laboratories Neutralizing monoclonal antibodies against the nogo-66 receptor (ngr) and uses thereof
AU2007333106A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
AU2007333110A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miRNA regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
KR101343916B1 (ko) 2006-12-21 2013-12-20 삼성전자주식회사 폐암의 림프절 미세전이 진단용 마커, 상기 마커에 대한프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 폐암의 림프절미세전이 여부를 진단하는 방법
WO2008082651A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Dual-specific il-1a/ il-1b antibodies
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
EP1947114A1 (en) 2007-01-19 2008-07-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated netrin 4, fragments thereof and uses thereof as drugs
BRPI0809594A2 (pt) 2007-04-03 2019-08-27 Micromet Ag polipeptídeo, seqüência de ácido nucléico, vetor, hospedeiro, processo para a produção de um polipeptídeo, composição farmacêutica, uso de um polipeptídeo, método para prevenção, tratamento ou melhora de uma doença, em um indivíduo com necessidade do mesmo, kit, método para a identificação de um polipeptídeo(s)
US7906293B2 (en) 2007-04-09 2011-03-15 Abbott Laboratories Acridinium phenyl esters useful in the analysis of biological
WO2008127735A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Stemline Therapeutics, Inc. Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof
US20100279289A1 (en) 2007-05-24 2010-11-04 Fanqing Frank Chen Size-dependent biological effect of nanoparticles
WO2009006543A1 (en) 2007-07-02 2009-01-08 Euclid Diagnostics Llc Methods for evaluating the methylation status of a polynucleotide
US20090054984A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Histogenics Corporation Method For Use Of A Double-Structured Tissue Implant For Treatment Of Tissue Defects
US8070827B2 (en) 2007-07-03 2011-12-06 Histogenics Corporation Method for use of a double-structured tissue implant for treatment of tissue defects
EP2182887B1 (en) 2007-08-20 2016-12-14 Histogenics Corporation A method for improvement of differentiation of mesenchymal stem cells using a double-structured tissue implant
EP2033971A1 (de) 2007-09-06 2009-03-11 Abbott GmbH & Co. KG Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung
US7981415B2 (en) 2007-09-07 2011-07-19 Cisthera, Inc. Humanized PAI-1 antibodies
CN101980603A (zh) 2007-10-11 2011-02-23 比奥根艾迪克Ma公司 LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途
EP2220122A2 (en) 2007-11-13 2010-08-25 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Humanized antibodies against tl1a
GB2456390A (en) 2008-01-15 2009-07-22 Glaxo Group Ltd Bipolar disorder treatments
AU2009205920A1 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Suregene Llc Genetic markers of mental illness
WO2009094592A2 (en) 2008-01-23 2009-07-30 Perlegen Sciences, Inc. Genetic basis of alzheimer's disease and diagnosis and treatment thereof
PT2242773T (pt) 2008-02-11 2017-09-15 Cure Tech Ltd Anticorpos monoclonais para o tratamento de tumores
WO2009105624A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Simultaneous delivery of receptors and/or co-receptors for growth factor stability and activity
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
EP2257626A2 (en) 2008-03-01 2010-12-08 Abraxis BioScience, LLC Treatment, diagnostic, and method for discovering antagonist using sparc specific mirnas
DE102008014880A1 (de) 2008-03-12 2009-09-17 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Antientzündliches Polypeptid
US8314213B2 (en) 2008-04-18 2012-11-20 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
WO2009140383A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Archemix Corp. Aptamers that bind to p-selectin and their use as coagulation, thrombotic, inflammatory, and metastatic disease therapeutics
EP2297208A4 (en) 2008-06-03 2012-07-11 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
NZ589434A (en) 2008-06-03 2012-11-30 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2729949A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010006184A2 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Emory University Small-molecule inhibitors of hif and angiogenesis
WO2010006189A2 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Emory University Small-molecule inhibitors of hif and angiogenesis
US20100184033A1 (en) 2008-07-16 2010-07-22 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
EP2303921A2 (en) 2008-07-18 2011-04-06 Centre National de la Recherche Scientifique Mutated netrin-4 proteins, fragments thereof and their uses as drugs
WO2010017451A2 (en) 2008-08-07 2010-02-11 Exogenesis Corporation Medical device for bone implant and method for producing such a device
EP2324129A4 (en) 2008-08-18 2012-06-20 Univ Leland Stanford Junior METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETERMINING A TOLERANT PHENOTYPE IN A GRAFT IN A SUBJECT
AU2009298501A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Abbvie Inc. Improved antibody libraries
CN102227638B (zh) 2008-09-30 2015-05-20 Abbvie公司 Rna展示的改良方法
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
KR101039751B1 (ko) 2008-10-16 2011-06-09 한국생명공학연구원 Ｔｍｐｒｓｓ４―특이적인 인간항체
US20110293526A1 (en) 2008-11-20 2011-12-01 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
US10927415B2 (en) 2008-11-26 2021-02-23 The Johns Hopkins University Methods for identifying cancer risk
HUE029946T2 (en) 2008-12-26 2017-04-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-CD4 antibody
WO2010088688A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 Biotheranostics, Inc. Diagnosis of in situ and invasive breast cancer
US20100254979A1 (en) 2009-03-06 2010-10-07 Cisthera, Incorporated Humanized PAI-1 Antibodies and Uses Thereof
WO2010105298A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Simon Barry Peptidase inhibitor 16 (pi16) as a biomarker for regulatory t (treg) cells and uses thereof
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
US20110263827A1 (en) 2009-05-01 2011-10-27 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunnoglobulins and Uses Thereof
CA2766065C (en) * 2009-06-30 2020-07-21 Research Development Foundation Immunoglobulin fc polypeptides
CA2775978A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Protagen Ag Marker sequences for pancreatic cancer diseases, pancreatic carcinoma and use thereof
WO2011039734A2 (en) 2009-10-02 2011-04-07 Enzo Medico Use of genes involved in anchorage independence for the optimization of diagnosis and treatment of human cancer
US8785600B2 (en) 2009-10-23 2014-07-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-GCC antibody molecules and related compositions and methods
CA2782620A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Compendia Bioscience, Inc. Classification of cancers
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
BR112012013734A2 (pt) * 2009-12-08 2017-01-10 Abbott Gmbh & Co Kg anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina.
CN102811739A (zh) 2009-12-09 2012-12-05 田边三菱制药株式会社 T细胞活化抑制剂、含有其的药物组合物以及抑制t细胞活化的物质的筛选方法
EP2523680A4 (en) 2010-01-11 2013-06-19 Ct Molecular Med & Immunology REINFORCED CYTOTOXICITY OF ANTIBODIES TO CD74 AND HLA-DR WITH INTERFERON GAMMA
EP2533810B1 (en) 2010-02-10 2016-10-12 ImmunoGen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
WO2011123428A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Immunomedics, Inc. Antibody-based depletion of antigen-presenting cells and dendritic cells
IL297229A (en) 2012-01-27 2022-12-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
BR112015012014A2 (pt) * 2012-12-04 2017-07-11 Abbvie Inc proteínas de ligação específicas duais penetrando a barreira hematoencefálica (bbb)

Also Published As

Publication number Publication date
US20150118156A1 (en) 2015-04-30
AU2013211939A1 (en) 2014-06-12
HRP20181087T1 (hr) 2018-09-07
WO2013112922A1 (en) 2013-08-01
ES2676725T3 (es) 2018-07-24
CN104487455A (zh) 2015-04-01
US20160326240A1 (en) 2016-11-10
PH12014501682A1 (en) 2014-11-10
AU2019261719A1 (en) 2019-11-28
JP2015508061A (ja) 2015-03-16
MX352772B (es) 2017-12-07
CN107880124A (zh) 2018-04-06
IL284769A (en) 2021-08-31
US10106602B2 (en) 2018-10-23
SG11201404263TA (en) 2014-08-28
CL2014001963A1 (es) 2014-12-26
RU2644337C2 (ru) 2018-02-08
IL262478A (en) 2018-12-31
NZ714482A (en) 2017-08-25
IL232782A0 (en) 2014-07-31
RU2017145268A3 (tr) 2021-05-14
CN107880124B (zh) 2021-08-13
US9365643B2 (en) 2016-06-14
MY194587A (en) 2022-12-05
PE20190907A1 (es) 2019-06-26
AU2013211939C1 (en) 2018-06-07
CY1120390T1 (el) 2019-07-10
DOP2014000174A (es) 2014-10-15
PL2807192T3 (pl) 2019-02-28
HUE039611T2 (hu) 2019-01-28
SI2807192T1 (sl) 2018-10-30
GT201400162A (es) 2015-10-13
CA2857967C (en) 2020-08-11
US20210238270A1 (en) 2021-08-05
RS57603B1 (sr) 2018-11-30
SG10202006762PA (en) 2020-08-28
KR20140125825A (ko) 2014-10-29
SG10201600316SA (en) 2016-02-26
US20140023659A1 (en) 2014-01-23
BR112014018592B1 (pt) 2022-03-15
EP2807192A1 (en) 2014-12-03
JP6722324B2 (ja) 2020-07-15
IL232782B (en) 2018-11-29
JP2020183384A (ja) 2020-11-12
EP3369746A1 (en) 2018-09-05
MY176695A (en) 2020-08-19
AU2021290298A1 (en) 2022-01-27
PE20142168A1 (es) 2015-01-17
UA118083C2 (uk) 2018-11-26
RU2014134897A (ru) 2016-03-20
ECSP14010817A (es) 2016-01-29
DK2807192T3 (en) 2018-07-23
KR102129234B1 (ko) 2020-07-02
IL297229A (en) 2022-12-01
AU2017276338A1 (en) 2018-01-18
JP6514762B2 (ja) 2019-05-15
AU2013211939B2 (en) 2017-09-21
EP2807192B1 (en) 2018-04-18
MX2022004300A (es) 2022-06-14
JP2018111686A (ja) 2018-07-19
JP6271441B2 (ja) 2018-01-31
HK1198831A1 (en) 2015-06-12
US9102722B2 (en) 2015-08-11
CO7020876A2 (es) 2014-08-11
EP3653647A1 (en) 2020-05-20
IL262478B (en) 2021-07-29
NZ625403A (en) 2016-03-31
PH12014501682B1 (en) 2014-11-10
PT2807192T (pt) 2018-07-12
US20190276526A1 (en) 2019-09-12
MX2014009095A (es) 2015-06-02
US20130330347A1 (en) 2013-12-12
CR20140360A (es) 2014-10-31
BR112014018592A2 (pt) 2017-07-04
IL305223A (en) 2023-10-01
LT2807192T (lt) 2018-07-25
CA2857967A1 (en) 2013-08-01
JP2019163261A (ja) 2019-09-26
RU2017145268A (ru) 2019-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210238270A1 (en) Composition and method for the diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
JP7455787B2 (ja) グリコシル化ｐｄ－１に対して特異的な抗体およびその使用方法
JP7499228B2 (ja) 神経成長因子に対するモノクローナル抗体、並びにそれをコードする遺伝子及びその使用
CN110240653A (zh) 抗gp73单克隆抗体和获得抗gp73单克隆抗体的方法
EA037397B1 (ru) Гуманизированные антитела к рецептору ccr7
KR20160067846A (ko) Nav1.7 항체 및 그의 사용 방법
TWI808086B (zh) 抗-trkb抗體
KR20210020839A (ko) 항-tie2 항체 및 이의 용도