CN110240653A - 抗gp73单克隆抗体和获得抗gp73单克隆抗体的方法 - Google Patents

抗gp73单克隆抗体和获得抗gp73单克隆抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗GP73单克隆抗体和获得抗GP73单克隆抗体的方法。本文公开了抗体和使用所述抗体检测样品中高尔基体蛋白73（GP73）和岩藻糖基化GP73的方法。

Description

抗GP73单克隆抗体和获得抗GP73单克隆抗体的方法
本申请是国际申请日为2014年3月14日的国际申请PCT/US2014/028725进入中国、申请号为201480024760.4的题为“抗GP73单克隆抗体和获得抗GP73单克隆抗体的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及GP73，特别是抗GP73单克隆抗体，涉及使用至少一种抗体（例如，单克隆抗体）的测定法（诸如免疫测定法），以及相关的氨基酸和核酸序列和载体和包含所述载体的宿主细胞。
背景技术
高尔基体蛋白73（“GP73”）是73kd驻留高尔基体膜蛋白。GP73是II型跨膜蛋白，并具有单一N-末端跨膜结构域和位于高尔基体的腔表面上的广泛的C端卷曲螺旋结构域。GP73已证明在病毒和非病毒性慢性肝病的肝细胞中上调，这表明该蛋白可能参与肝细胞的细胞疾病应答。另外，GP73水平在肝癌患者中比在健康个体中高。已在四分之三的来自肝细胞癌（HCC）患者的分泌的GP73中发现岩藻糖基化。早期的研究表明，GP73和岩藻糖基化的GP73对肝脏疾病的早期诊断可能是比当前标志物诸如α-甲胎蛋白（AFP）更可靠的生物标志物，其具有产生假阳性结果的缺点，因为AFP在很多情况下产生，包括其它肝脏疾病。此外，AFP不存在于所有的HCC患者中。此外，先前已知的抗GP73抗体，14H4-23单克隆抗体（由Drexel University School of Medicine的Anand Mehta博士提供），对于GP73分子上的岩藻糖糖部分存在或不存在是不敏感的。
鉴于上述情况，本公开的一个目标是提供抗GP73单克隆抗体，其对于GP73分子上的岩藻糖糖部分存在或不存在是敏感的，并结合GP73的岩藻糖基化形式，或者可选地，对于GP73分子上的岩藻糖糖部分存在或不存在是不敏感的，但具有足以用在检测GP73和/或岩藻糖基化的GP73的免疫测定法中的结合亲和力。这个和其它的目的和优点，以及创造性特征，根据本文所提供的详细描述将将变得显而易见。
发明内容
本发明涉及能够结合VSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGR（hGP73307-339）（SEQID NO：101）的氨基酸序列中表位的分离的抗体或其抗体片段。所述分离的抗体或抗体片段选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。分离的抗体或抗体片段是人的。所述分离的抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。
本发明涉及能够结合EQVVEDRPVGGR (hGP73 276-287) (SEQ ID NO:102)的氨基酸序列中表位的分离的抗体或其抗体片段。所述分离的抗体或抗体片段选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。分离的抗体或抗体是人的。所述分离的抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。
本发明涉及能够结合LRGEDDYNMDENEAESETDK (hGP73 344-363) (SEQ ID NO:103)的氨基酸序列中表位的分离的抗体或其抗体片段。所述抗体选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。所述抗体或抗体片段是人的。所述抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。
本发明涉及能够结合ELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQLESVNK (hGP73 63-96)(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列中表位的分离的抗体或其抗体片段。所述抗体选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。所述抗体或抗体片段是人的。所述抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。
本发明涉及分离的抗体或其抗体片段，其免疫特异性结合高尔基体蛋白73（“GP73”），其中所述抗体或抗体片段对GP73的结合对于GP73的岩藻糖基化是敏感的。所述抗体选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。所述抗体或抗体片段是人的。所述抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。
本发明涉及分离的抗体或其抗体片段，其免疫特异性结合高尔基体蛋白73（“GP73”），其中所述抗体或抗体片段对GP73的结合对于GP73的岩藻糖基化是不敏感的。所述抗体选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。所述抗体或抗体片段是人的。所述抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。
本发明涉及结合高尔基体蛋白73（“GP73”）的分离的抗体或其抗体片段，其中所述抗体包含选自下列的结构域或区域：（a）包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重结构域区，（b）包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变轻结构域区，（c）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变重结构域区，（d）包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变轻结构域区，（e）包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变重结构域区，（f）包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变轻结构域区，（g）包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的可变重结构域区，（h）包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的可变轻结构域区，（i）包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变重结构域区，（j）包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变轻结构域区；（k）包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域区；（l）包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的可变轻结构域区；（m）包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重结构域和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变轻结构域区，（n）包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变重结构域和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变轻结构域区，（o）包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变重结构域和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变轻结构域区，（p）包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的可变重结构域和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变轻结构域区，（q）包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变重结构域和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变轻结构域区，（r）包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重结构域和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的可变轻结构域区，（s）包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的互补决定区（CDR）1、包括SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链，（t）包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，（u）包含包括SEQ ID 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NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，（ff）包含包括SEQ IDNO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，（gg）包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，（hh）包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和包含包括SEQ IDNO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，（ii）包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，（jj）包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述抗体选自人类抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、TVD、Fab'、双特异性抗体、F（ab'）2和Fv。所述抗体或抗体片段是人的。所述抗体或抗体片段包括选自人IgM恒定域、人IgG4恒定域、人IgG1恒定域、人IgE恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域和人IgA恒定域的重链免疫球蛋白恒定域。抗体或抗体片段包含包括选自下列的序列的可变重区：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:41。抗体或抗体片段包含包括选自下列的序列的可变轻区：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:45。抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域区。抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域区。抗体或抗体片段包含包括SEQID NO: 17的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的可变轻结构域区。抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域区。抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的可变轻结构域区。抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域区。抗体或抗体片段包含包括下列互补决定区（CDR）残基的可变重结构域：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；或SEQ ID NO:42、SEQID NO:43和SEQ ID NO:44。抗体或抗体片段包含包括下列互补决定区（CDR）残基的可变轻结构域：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16；SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQID NO:32；SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；或SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48。抗体或抗体片段包含包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4的可变重结构域，和包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的可变轻结构域。抗体或抗体片段包含包括互补决定区（CDR）残基SEQID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的可变重结构域，和包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的可变轻结构域。抗体或抗体片段包含包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的可变重结构域，和包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的可变轻结构域。抗体或抗体片段包含包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的可变重结构域，和包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32的可变轻结构域。抗体或抗体片段包含包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36的可变重结构域，和包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的可变轻结构域。抗体或抗体片段包含包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的可变重结构域，和包括互补决定区（CDR）残基SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的可变轻结构域。抗体或抗体片段还包含选自下列的试剂：免疫粘附的分子，显像剂和治疗剂。显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。放射性标记选自3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。所述抗体或抗体片段结合VSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGR（hGP73307-339）（SEQ ID NO：101）的氨基酸序列中GP73表位。所述抗体或抗体片段包含：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的可变重结构域区；包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述抗体或抗体片段结合EQVVEDRPVGGR (hGP73 276-287) (SEQ ID NO:102)的氨基酸序列中GP73表位。所述抗体或抗体片段包含：包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的可变重结构域区；包含SEQID NO：21的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述抗体或抗体片段结合LRGEDDYNMDENEAESETDK (hGP73 344-363) (SEQ ID NO:103)的氨基酸序列中GP73表位。所述抗体或抗体片段包含：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变重结构域区；包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述抗体或抗体片段结合ELKKNEFQGELEKQREQLDKIQSSHNFQLESVNK (hGP73 63-96)(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列中GP73表位。所述抗体或抗体片段包含：包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的可变重结构域区；包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。抗体或抗体片段对GP73的结合对于GP73上的岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的。所述抗体或抗体片段包含：包括SEQ ID NO：25或SEQID NO：33的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ IDNO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ IDNO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。抗体或抗体片段对GP73的结合对于GP73上的岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的。所述抗体或抗体片段包含：包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQID NO：17或SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。
本发明涉及分离的抗体，其特异性结合GP-73，并具有具有式：X5-X6-X7-X8-X9 (SEQID NO:108)的CDR-H1、具有式：X10-I-X11-X12-X13-X14-X15-X16X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27 (SEQ ID NO:109)的CDR-H2、具有式：X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-Y (SEQ ID NO:110)的CDR-H3、具有式：X40-X41-S-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50-X51-X52-X53-X54 (SEQ ID NO:111)的CDR-L1、具有式：X55-X56-S-X57-X58-X59-X60 (SEQ IDNO:112)的CDR-L2和具有式：X61-Q-X62-X63-X64-X65-P-X66-T (SEQ ID NO:113)的CDR-L3，其中X5 是S、N或T；X6是Y或N；X7 是W、V、G、A或T；X8是I、V或M；X9是E、H、S或N；X10是E、Y、V、T或R；X11是L、W、S或R；X12是P、S、R或T；X13不存在或是K；X14不存在或是R；X15是G、T或Y；X16是S、G或N；X17是G、D、S、T或Y；X18是N、S、Y、G或T；X19是T或I；X20是N、K、Y或F；X21是Y或F；X22是N、P或A；X23是E、S或D；X24是K、A或S；X25是F、L或V；X26是K或M；X27是G、S或D；X28是G、Q、D、E或N；X29是R、Q、P、Y、W或G；X30是G、L、F、D或T；X31是S、T、S或G；X32是Y、D、G、E或T；X33是R、Y、D、L或F；X34是Y、F、T或H；X35是H或Y；X36是W、D或Y；X37是F、Y或A；X38不存在或是F或M；X39是A或D；X40是K、T、R或S；X41是A或S；X42是Q、S或K；X43是S或G；X44是V或L；X45是D或L；X46是Y、D或H；X47不存在或是S；X48是D、V、N或I；X49是G、V或S；X50是D、K、S或I；X51是S、T、I或N；X52是Y或D；X53是M、L或V；X54是N、I、S、H或Y；X55是A、L、S、Q或R；X56是A、V、T或M；X57是N、K、Y或S；X58是L或R；X59是E、D、Y或A；X60是S或I；X61是Q、W、H或A；X62是S、G、H、Y或N；X63是N、T、F、H或L；X64是E、H、T、R或S；X65是D、F、T、S、L或I；并且X66是Y或L。
本发明涉及免疫特异性结合高尔基体蛋白73（“GP73”）的分离的抗体或其抗体片段，其中所述抗体具有约4.0 x 10-9至约1.8 x 10-12的平衡解离常数（KD）。
本发明涉及免疫特异性结合高尔基体蛋白73（“GP73”）的分离的抗体或其抗体片段，其中所述抗体具有约1.5 x 10-3至约8.0 x 10-6的解离速率（koff）。
本发明涉及免疫特异性结合高尔基体蛋白73（“GP73”）的分离的抗体或其抗体片段，其中所述抗体具有约1.0 x 105至约4.1 x 106的结合速率（kon）。
本发明涉及编码SEQ ID NO:1-48任一条的分离的核酸。
本发明涉及编码权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的抗体或抗体片段的分离的核酸。
本发明涉及包含SEQ ID NO:49-96的至少一条核酸序列的分离的核酸。
本发明涉及包含编码下列的核苷酸序列的分离的核酸：（i）SEQ ID NO:1、（ii）SEQID NO:5或（iii）SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:9、（ii）SEQ ID NO:13或（iii）SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:17、（ii）SEQ ID NO:21或（iii）SEQ ID NO:17和SEQID NO:21的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:25、（ii）SEQ ID NO:29或（iii）SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQID NO:33、（ii）SEQ ID NO:37或（iii）SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:37的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；或（i）SEQ ID NO:41、（ii）SEQ ID NO:45或（iii）SEQ ID NO:41和SEQID NO:45的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分。权利要求67的分离的核酸，其中所述核酸包含：（i）SEQ ID NO:49、（ii）SEQ ID NO:53或（iii）SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:53的核苷酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:57、（ii）SEQ ID NO:61或（iii）SEQ IDNO:57和SEQ ID NO:61的核苷酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:65、（ii）SEQ ID NO:69或（iii）SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:69的核苷酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:73、（ii）SEQ ID NO:77或（iii）SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:77的核苷酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:81、（ii）SEQ ID NO:85或（iii）SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:85的核苷酸序列，任选地作为载体的一部分；或（i）SEQ ID NO:89、（ii）SEQ ID NO:93或（iii）SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:93的核苷酸序列，任选地作为载体的一部分。
本发明涉及包含和表达分离的核酸的宿主细胞，所述分离的核酸包含编码下列的核苷酸序列：（i）SEQ ID NO:1、（ii）SEQ ID NO:5或（iii）SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:9、（ii）SEQ ID NO:13或（iii）SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:13的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:17、（ii）SEQID NO:21或（iii）SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:25、（ii）SEQ ID NO:29或（iii）SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；（i）SEQ ID NO:33、（ii）SEQ ID NO:37或（iii）SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:37的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分；或（i）SEQ ID NO:41、（ii）SEQID NO:45或（iii）SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:45的氨基酸序列，任选地作为载体的一部分。
本发明涉及包含权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的抗体、抗体片段、其混合物或衍生物的药物组合物。本发明涉及用于确定在测试样品中GP73浓度的方法，所述方法包括：使测试样品与至少一种捕获抗体接触，其中所述捕获抗体结合GP73或GP73的片段上的表位以形成捕获抗体-GP73抗原复合物；使所述捕获抗体-GP73抗原复合物与至少一种包含可检测标记物的检测抗体接触，其中所述检测抗体结合GP73上不被捕获抗体结合的表位并形成捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物；并基于在先前步骤中形成的捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中GP73浓度；其中所述至少一种捕获抗体包含权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的分离抗体或抗体片段，并且所述至少一种可检测抗体包含权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的分离抗体或抗体片段，并且其中所述至少一种捕获抗体不同于所述至少一种检测抗体。所述方法进一步包括比较测试样品中作为GP73浓度的直接或间接指示的可检测标记物产生的信号与对照或校准物中作为GP73浓度的直接或间接指示产生的信号。测试样品中的GP73浓度用于确定或评价对象是否具有肝脏疾病或处于发展肝脏疾病的风险中。相比对照或校准物中GP73浓度增加的GP73浓度指示所述对象具有肝脏疾病。所述肝脏疾病是肝硬化或肝癌。
本发明涉及用于确定在测试样品中GP73浓度的方法，所述方法包括：使测试样品与至少一种捕获抗体接触，其中所述捕获抗体结合GP73或GP73的片段上的表位以形成捕获抗体-GP73抗原复合物；使所述捕获抗体-GP73抗原复合物与至少一种包含可检测标记物的检测抗体接触，其中所述检测抗体结合GP73上不被捕获抗体结合的表位并形成捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物；并基于（b）中形成的捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中GP73浓度；其中所述至少一种捕获抗体包含：包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区（CDR）1、包括SEQID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；其中所述至少一种检测抗体包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。
本发明涉及用于确定测试样品中岩藻糖基化GP73浓度的方法，所述方法包括：使所述测试样品与至少一种捕获结合蛋白接触，其中所述捕获结合蛋白结合GP73的区域或GP73的片段以形成捕获结合蛋白-GP73复合物；使所述捕获结合蛋白-GP73复合物与至少一种包含可检测标记物的检测结合蛋白接触，其中所述检测结合蛋白结合GP73上不被捕获结合蛋白结合的区域并形成捕获结合蛋白-GP73-检测结合蛋白复合物；并基于在先前步骤中形成的捕获结合蛋白-GP73-检测结合蛋白复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中GP73浓度；其中，所述至少一种捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的，并且所述至少一种检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的。
本发明涉及用于确定在测试样品中岩藻糖基化的GP73浓度的方法，所述方法包括：使测试样品与至少一种捕获结合蛋白接触，其中所述捕获结合蛋白结合GP73的区域或GP73的片段以形成捕获结合蛋白-GP73复合物；使所述捕获结合蛋白-GP73复合物与至少一种包含可检测标记物的检测结合蛋白接触，其中所述检测结合蛋白结合GP73上不被捕获结合蛋白结合的区域并形成捕获结合蛋白-GP73-检测结合蛋白复合物；并基于在先前步骤中形成的捕获结合蛋白-GP73-检测结合蛋白复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中GP73浓度；其中，所述至少一种捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的，并且所述至少一种检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的。其与GP73的结合对GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的蛋白、抗体或抗体片段包括：橙黄网胞盘菌凝集素（Aleuria aurantia lectin (AAL)）或其片段；包括SEQID NO：25或SEQ ID NO：33的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ IDNO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。其与GP73的结合对GP73的岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的蛋白、抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：41的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ IDNO: 17的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述方法进一步包括比较测试样品中作为GP73浓度的直接或间接指示的可检测标记物产生的信号与对照或校准物中作为GP73浓度的直接或间接指示产生的信号。测试样品中的GP73浓度用于确定或评价对象是否具有或处于发展肝脏疾病的风险中。相比对照或校准物中GP73浓度增加的GP73浓度指示所述对象具有肝脏疾病。所述肝脏疾病是肝硬化或肝癌。
本发明涉及诊断和治疗对象中肝脏疾病的方法，所述方法包括：从对象获得包括血液的生物样品；使用权利要求81的方法，确定来自对象生物样品中的GP73浓度；比较生物样品中GP73浓度与正常对照或校准物中的GP73浓度；如果生物样品中GP73浓度大于正常对照或校准物中GP73浓度，则诊断对象为具有肝脏疾病；并且对诊断为具有肝脏疾病的对象施用肝脏疾病治疗方案。对象的生物样品选自组织样品、体液、全血、血浆、血清、尿、支气管肺泡灌洗液、以及细胞培养物悬浮液或其级分。对象的生物样品是血浆或血清。所述肝脏疾病是肝硬化或肝癌。所述方法进一步包括确定生物样品中至少一种额外的肝脏疾病生物标志物的水平，并比较所述至少一种额外的肝脏疾病生物标志物的水平与对于所述至少一种肝脏疾病生物标准物参考水平值进行比较。所述额外的肝脏疾病生物标志物选自PIVKA-II、AFP、AFP-L3、Fuc-HPX、Fc-Kin和F-AT。
本发明涉及用于确定对象对一种或多种药物组合物的施用是否应答的方法，所述方法包括：使用权利要求81的方法测量来自对象的样品中GP73的浓度；比较样品中GP73浓度与正常对照或校准物中GP73浓度，其中改变的GP73浓度指示对象对一种或多种药物组合物的施用不应答；并且如果所述对象对一种或多种药物组合物的施用不应答，则调整所述对象的治疗。
本发明涉及诊断和治疗对象中肝脏疾病的方法，所述方法包括：使测试样品与至少一种捕获抗体接触，其中所述捕获抗体结合GP73或GP73的片段上的表位以形成捕获抗体-GP73抗原复合物；使所述捕获抗体-GP73抗原复合物与至少一种包含可检测标记物的检测抗体接触，其中所述检测抗体结合GP73上不被捕获抗体结合的表位并形成捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物；基于（b）中形成的捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中GP73浓度；比较样品中GP73浓度与正常对照或校准物中的GP73浓度；如果生物样品中GP73浓度大于正常对照或校准物中GP73浓度，则诊断对象为具有肝脏疾病；并且对诊断为具有肝脏疾病的对象施用肝脏疾病治疗方案；其中所述至少一种捕获抗体包含：包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ IDNO：45的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区（CDR）1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；其中至少一种检测抗体包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述肝脏疾病是肝硬化或肝癌。
本发明涉及包含权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的抗体、抗体片段、其混合物或衍生物的试剂盒。
本发明涉及包含编码权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的抗体或抗体片段的分离的核酸的试剂盒。
本发明涉及用于测定测试样品GP73的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种捕获抗体，其中所述捕获抗体结合GP73或GP73的片段上的表位，至少一种检测抗体，其中所述检测抗体结合GP73上不被捕获抗体结合的表位，以及用于测定测试样品GP73的指导，其中所述至少一种捕获抗体包含权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的分离的抗体或抗体片段，并且所述至少一种可检测抗体包含权利要求1、5、9、13、17、21、25、60、61、62或63的分离的抗体或抗体片段，并且其中所述至少一种捕获抗体不同于所述至少一种检测抗体。所述试剂盒进一步包含指示对照或校准物中GP73浓度的参考标准物。
本发明涉及用于测定测试样品GP73的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种捕获抗体，其中所述捕获抗体结合GP73或GP73的片段上的表位，至少一种检测抗体，其中所述检测抗体结合GP73上不被捕获抗体结合的表位，以及用于测定测试样品GP73的指导，其中所述至少一种捕获抗体包含：包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ IDNO：45的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的互补决定区（CDR）1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；其中所述至少一种检测抗体包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，其中所述至少一种检测抗体是任选地可检测地标记的。
本发明涉及用于测定测试样品岩藻糖基化GP73的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种捕获结合蛋白，其中所述捕获结合蛋白结合GP73或GP73的片段，至少一种检测结合蛋白，其中所述检测结合蛋白结合不被捕获结合蛋白结合的GP73，以及用于测定测试样品GP73的指导，其中，所述至少一种捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的，并且所述至少一种检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73岩藻糖基化是敏感的。
本发明涉及用于测定测试样品岩藻糖基化GP73的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种捕获结合蛋白，其中所述捕获结合蛋白结合GP73或GP73的片段，至少一种检测结合蛋白，其中所述检测结合蛋白结合不被捕获结合蛋白结合的GP73，以及用于测定测试样品GP73的指导，其中，所述至少一种捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73的岩藻糖基化是敏感的，并且所述至少一种检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73的结合对GP73岩藻糖基化是不敏感的。其与GP73的结合对GP73上岩藻糖基化是敏感的蛋白、抗体或抗体片段包括：橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）或其片段；包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：33的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ IDNO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。其与GP73的结合对GP73的岩藻糖基化是不敏感的蛋白、抗体或抗体片段包含包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ IDNO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ IDNO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述试剂盒进一步包含指示对照或校准物中GP73浓度的参考标准物。
附图说明
图1显示大肠杆菌GP73构建体。
图2显示CHO和HEK GP73-hFc构建体。
图3显示生物素标记的抗GP73mAb与游离AAL的竞争性抑制测定。
图4显示抗GP73mAb与小鼠-人嵌合IgG、表达GP73的大肠杆菌和HEK中表达的GP73-hFc重组抗原的反应性。
图5显示生物素标记的抗GP73mAb与游离岩藻糖的竞争性抑制测定。
图6显示mAb 1A-3187与高碘酸化（periodated）的GP73的反应性。
图7显示mAb 1A-4246与高碘酸化的GP73的反应性。
图8显示mAb 1B-3246与高碘酸化的GP73的反应性。
图9显示mAb 1B-3440与高碘酸化的GP73的反应性。
图10显示mAb 1B-4863与高碘酸化的GP73的反应性。
图11显示mAb 1B-4971与高碘酸化的GP73的反应性。
图12显示对于mAb 1A-3187的图解和可变重链序列（图12A）和轻链序列（图12B）的核苷酸和氨基酸序列。
图13显示对于mAb 1A-4246的图解和可变重链序列（图13A）和轻链序列（图13B）的核苷酸和氨基酸序列。
图14显示对于mAb 1B-3246的图解和可变重链序列（图14A）和轻链序列（图14B）的核苷酸和氨基酸序列。
图15显示对于mAb 1B-3440的图解和可变重链序列（图15A）和轻链序列（图15B）的核苷酸和氨基酸序列。
图16显示对于mAb 1B-4863的图解和可变重链序列（图16A）和轻链序列（图16B）的核苷酸和氨基酸序列。
图17显示对于mAb 1B-4971的图解和可变重链序列（图17A）和轻链序列（图17B）的核苷酸和氨基酸序列。
图18显示针对GP73-hFc的抗GP73mAb的表位肽图。
图19显示ARCHITECT®夹心免疫测定原理的实例。
图20显示使用mAb 14H4-23或1A-4246作为捕获抗体（0.1mg/mL）和1B-4863作为检测抗体（0.5nM）的GP73 ARCHITECT®测定。
图21显示使用mAb 1A-4246（0.2 mg/mL）作为捕获抗体和1B-4863作为检测抗体（0.5或2 nM）的GP73 ARCHITECT®测定。
具体实施方式
本发明涉及抗高尔基体蛋白73（GP73）抗体和所述抗体在免疫测定中的用途，所述测定用于分析GP73和岩藻糖基化GP73水平以鉴定、诊断和治疗有需要的对象中的疾病。本发明的抗GP73抗体具有比先前可用抗体更高的结合亲和力。本发明的抗体可以在用于检测GP73和/或岩藻糖基化GP73的免疫测定中使用，从而提供独特的抗体组合，以检测样品中跨更大浓度范围的GP73和/或岩藻糖基化的GP73。这些抗体在这些免疫测定中的使用提供了更多功能和更敏感的测定。还已经发现本发明的抗体在免疫测定中表现优于已知抗GP73抗体约3倍。
所公开的免疫测定的增加的可检测的浓度范围提供更准确和更敏感的测定，用于诊断和区分患者中肝脏疾病和癌症。因此，所公开的免疫测定可以用于检测样品中相比对照或校准样品增加或降低的GP73浓度，并且从而用于鉴定患者中各种疾病，诸如肝脏疾病和癌症。GP73免疫测定的使用可以提供具有疾病诸如肝脏疾病或癌症的患者的准确的诊断和后续治疗。
在此章节中使用章节标题并且本文公开整体内容仅用于组织目的并且不意在限制。
1. 定义
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本领域技术人员的通常理解具有相同的含义。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。下面描述了优选的方法和材料，尽管类似或等价于本文所述那些方法和材料的方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其它参考文献都通过引用以其整体并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是意在进行限制。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、“可以”、“包含”和其各种变体，意在是末端开放的过渡性短语，术语或词语，其不排除附加动作或结构的可能性。单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数参考，除非上下文清楚地另外指示。本公开还考虑包含本文所述实施方案或元素的其它实施方案、由本文所述实施方案或元素组成的其它实施方案和基本上由本文所述实施方案或元素组成的其它实施方案,无论是否明确阐述。
如本文所互换使用的“14H4-23”、“14H4-23单克隆抗体”和“单克隆抗体14H4-23”指结合GP73的小鼠单克隆抗体。14H4-23单克隆抗体来自在Drexel University Collegeof Medicine的Anand Mehta和Tim Block博士的实验室。14H4-23单克隆抗体的结合对于GP73上的岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的。
如本文所用“亲和力成熟的抗体”指在一个或多个CDR中具有一种或多种改变的抗体，其导致抗体对于靶抗原的亲和力（即，KD、kd或ka）相比不具有改变的亲本抗体改善。示例性的亲和力成熟的抗体对于靶抗原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。用于产生亲和力成熟的抗体的各种方法是本领域已知的，包括筛选使用生物展示制备的组合抗体库。例如，Marks 等, BioTechnology, 10: 779-783 (1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas 等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,91: 3809-3813 (1994)；Schier 等, Gene, 169: 147-155 (1995)；Yelton 等, J.Immunol., 155: 1994-2004 (1995)；Jackson 等, J. Immunol., 154(7): 3310-3319(1995)和Hawkins 等, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)。在选择性诱变位置以及在接触或高变位置的用增强活性的氨基酸残基的选择性突变描述于美国专利号6,914,128B1。
如本文互换使用的“橙黄网胞盘菌凝集素”和“AAL”指由两个相同的特异性识别岩藻糖基化的聚糖的312-氨基酸亚基构成的真菌蛋白，并且广泛用作对于岩藻糖特异性的探针。AAL优先结合至岩藻糖连接的（α-1,6）至N-乙酰葡糖胺或结合至岩藻糖连接的（α-1,3）至N-乙酰基乳糖胺。
如本文所用“抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体（完全或部分人源化）、动物抗体（诸如但不限于，鸟（例如鸭或鹅）、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类（例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等）或非人类灵长类（例如，猴、黑猩猩等））、重组抗体、嵌合抗体、单链Fvs（“scFv“）、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F（ab'）片段、F（ab'）2片段、二硫键连接的Fvs（“sdFv”）以及抗独特型（“抗-Id”）抗体、双结构域抗体、双重可变结构域（DVD）或三重可变结构域（TVD）抗体（双重可变结构域免疫球蛋白以及制造它们的方法描述于Wu, C., 等, Nature Biotechnology,25(11):1290-1297 (2007)和PCT国际申请WO 2001/058956，其每一个的内容通过引用并入本文），以及任何上述的功能活性表位结合片段。特别是，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，所述免疫球蛋白分子即包含分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY），种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。为了简单起见，针对分析物的抗体经常在本文中称为“抗分析物抗体”或仅仅是“分析物抗体”（例如，抗GP73抗体或GP73抗体）。
如本文所用“抗体片段”指完整抗体的部分，其包含抗原结合位点或可变区。该部分不包括完整抗体的Fc区的重链恒定结构域（即CH2，CH3或CH4，取决于抗体同种型）。抗体片段的实例包括，但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F（ab'）2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv（scFv）分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽和含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。
“曲线下面积”或“AUC”指ROC曲线下的面积。ROC曲线下的AUC是准确性的量度。面积1代表完美的测试，而面积0.5代表不显著的测试。优选的AUC可以是至少约0.700、至少约0.750、至少约0.800、至少约0.850、至少约0.900、至少约0.910、至少约0.920¸ 至少约0.930、至少约0.940、至少约0.950、至少约0.960、至少约0.970、至少约0.980、至少约0.990或至少约0.995。
“结合常数”如本文所述。如本文所用术语“结合速率常数”、“kon”或“ka”，是指指示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体与抗原之间复合物形成的速率的值，并且如下面方程所示：
抗体 (Ab) + 抗原 (Ag) → Ab-Ag。
如本文互换使用的术语“解离速率常数”、“koff”或“kd”，是指指示抗体与其靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随时间分开成游离的抗体和抗原的值，并且如下面方程所示：
抗体 (Ab) + 抗原 (Ag) ← Ab-Ag。
用于确定结合和解离速率常数的方法是本领域众所周知的。使用基于荧光的技术提供检验在生理缓冲液中平衡状态的样品的高灵敏度和能力。可以使用其它实验方法和设备诸如BIAcore®（生物分子相互作用分析）测定（例如，设备可以购自BIAcoreInternational AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden）。此外，还可以使用KinExA®（动力学排除测定）测定，可以得自Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)。
如本文互换使用的术语“平衡解离常数”、“Kd”、“Kd”或“KD”指通过将解离速率（koff）除以结合速率（kon）获得的值。结合速率、解离速率和平衡解离常数用于表示抗体对抗原的结合亲和力。
“结合蛋白”在本文用于指结合到结合配偶体并与之形成复合物的单体或多聚体蛋白，所述结合配偶体诸如，例如，多肽、抗原、化学化合物或其它分子，或任何种类的底物。结合蛋白特异性结合结合配偶体。结合蛋白包括抗体，及其抗原结合片段，以及如本领域已和在本文下文描述的其其它各种形式和衍生物，和包含一个或多个抗原结合结构域的其它分子，所述结构域结合抗原分子或抗原分子上的特定位点（表位）。因此，结合蛋白包括，但不限于，抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR重排抗体、人源化抗体、亲和力成熟的抗体、以及保留结合抗原能力的任何这些抗体的片段。
“双特异性抗体”本文用于指通过细胞杂交瘤（quadroma）技术产生的全长抗体（参见Milstein 等, Nature, 305(5934): 537-540 (1983)），通过两种不同单克隆抗体的化学缀合（参见Staerz 等, Nature, 314(6012): 628-631 (1985)），或通过节进孔（knob-into-hole）或类似方法在Fc区引入突变（参见，Holliger 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90(14): 6444-6448 (1993)），导致多种不同的免疫球蛋白种类，其中仅有一种是功能上双特异性的抗体。双特异性抗体在其两个结合臂（一对HC/LC）之一上结合一种抗原（或表位），并在其第二个臂（另一对不同HC/LC）上结合不同抗原（或表位）。通过此定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂（在特异性和CDR序列两者），并且对于每种其结合的抗原是单价的。
对于本文数值范围的记载，其间的每个中间数字均以相同程度的精度被明确地预期。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确地预期数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
本文使用“癌症”指机体内异常细胞的不受控制和不受调节的生长。癌细胞也称为恶性细胞。癌症可以侵袭邻近的机体部分并且还可以通过淋巴系统或血流扩散到更远的机体部分。癌症包括肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、脑瘤、乳腺癌、类癌肿瘤、胃肠道癌、不明原发癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤因家族肿瘤（PNET）、颅外生殖细胞肿瘤、眼内黑色素瘤眼癌、胆囊癌、胃癌（胃）、性腺外生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈部癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌（肾细胞癌）、喉癌、急性淋巴细胞白血病、白血病、急性髓性、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、毛细胞白血病、嘴唇和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经系统（原发）淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病淋巴瘤、非霍奇金病淋巴瘤、恶性间皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、具有隐匿性原发性癌的转移性鳞状颈部癌、多发性骨髓瘤和其他浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、鼻咽癌、成神经细胞瘤（euroblastoma）、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、外分泌胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、浆细胞肿瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌（肾脏的癌症）、肾盂和输尿管移行细胞癌、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、恶性胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、儿童异常癌症（Unusual Cancer ofChildhood）、阴道癌、外阴癌和肾母细胞瘤。
CDR在本文用于指抗体可变序列内的“互补决定区”。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，其对于每个可变区称为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。如本文所用术语“CDR组”指在结合抗原的单个可变区中出现的一组三个CDR。这些CDR的确切边界根据不同的系统已被不同地定义。Kabat (Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))描述的系统不仅提供了可以应用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，而且提供了限定三个CDR的准确的残基边界。这些CDR可以称为“Kabat CDR”。Chothia和其同事(Chothia and Lesk,J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)；和Chothia 等, Nature, 342: 877-883 (1989))发现Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平具有极大的多样性。这些子部分被称为“L1”、“L2”和“L3”，或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区。这些区域可以称为“Chothia CDR”，其具有与Kabat CDR重叠的边界。与Kabat CDR重叠的限定CDR的其它边界已由Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995)和MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996)描述。仍然其它的CDR边界定义可能不严格遵循本文系统之一，但仍将与Kabat的CDRs重叠，尽管它们可以缩短或加长，鉴于如下的预测或实验发现，即特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合。本文所使用的方法可以利用根据任意这些系统限定的CDR，尽管某些实施方案使用Kabat-或Chothia定义的CDR。
“组分”、“多个组分”或“至少一个组分”通常指捕获抗体、检测或缀合物、校准物、对照、灵敏度实验对象组、容器、缓冲剂、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物（例如，作为溶液）、停止溶液，等等，其可以包括在试剂盒中用于根据本文所述方法和本领域已知的其它方法测定测试样品，诸如患者尿、血清或血浆样品。一些组分可以在溶液中或冻干用于重构，用于在测定中使用。
如本文所用抗体的“衍生物”可以指当与原版或亲本抗体相比时，对其氨基酸序列具有一个或多个修饰的抗体，并展示修饰的结构域结构。衍生物可以仍然能够采取在天然抗体中发现的典型的结构域构象和氨基酸序列，能够特异性结合靶（抗原）。抗体衍生物的典型实例是偶联到其它多肽的抗体，重排的抗体结构域或抗体片段。所述衍生物还可以包含至少一种另外的化合物，例如，蛋白结构域，所述蛋白结构域通过共价或非共价键连接。所述连接可以基于基因融合，根据本领域已知方法。在包含根据本发明利用的抗体的融合蛋白中存在的额外的结构域可以优选地通过柔性接头连接，所述接头有利地是肽接头，其中所述肽接头包含长度足以跨越进一步的蛋白结构域的C末端和抗体的N末端（或反之亦然）之间距离的多个亲水肽键氨基酸。抗体可以连接到效应子分子，所述效应子分子具有对于生物活性合适的构象或选择性结合固体支持物、生物活性物质（例如，细胞因子或生长激素）、化学试剂、肽、蛋白或药物，例如。
“双特异性抗体”在本文用于指可以在其两个结合臂（一对HC/LC）的每一个结合两种不同抗原（或表位）的全长抗体（参见PCT公开WO 02/02773）。因此，双重特异性结合蛋白具有两个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，并且对于其结合的每种抗原是二价的。
“双重可变结构域”在本文用于指在结合蛋白上的两个或更多抗原结合位点，其可以是二价（两个抗原结合位点）、四价（四个抗原结合位点），或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性，即能够结合一种抗原（或一种特异性表位），或多特异性，即能够结合两种或更多抗原（即，相同靶抗原分子的两种或更多表位，或不同靶抗原的两种或更多表位）。优选的DVD结合蛋白包括两个重链的DVD多肽和两个轻链的DVD多肽，并被称作“DVD免疫球蛋白”或“DVD Ig”。这样的DVD-Ig结合蛋白因此是四聚体并且让人联想起IgG分子，但是比IgG分子提供更多的抗原结合位点。因此，每一半四聚体DVD-Ig分子都让人联想到一半IgG分子并包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但是不像IgG分子的一对重和轻链那样提供单个抗原结合结构域，一对DVD-Ig的重和轻链提供两个或更多抗原结合位点。
DVD-IgG结合蛋白的每个抗原结合位点可以衍生自供体（“亲本”）单克隆抗体并从而包含具有每个抗原结合位点抗原结合中涉及的总共6个CDR的重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）。因此，结合两个不同表位（即，两个不同抗原分子或相同抗原分子的两个不同表位）的DVD-Ig结合蛋白包含衍生自第一亲本单克隆抗体的抗原结合位点和衍生自第二亲本单克隆抗体的抗原结合位点。
DVD-Ig结合分子的设计、表达和表征的描述提供于PCT公开号WO 2007/024715、美国专利号7,612,181和Wu 等, Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007)。这些DVD-Ig分子的优选实例包括包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，前提是其不是CH1，X2是Fc区，并且n是0或1，但优选1；和包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，前提是其不是CH1，并且X2不包含Fc区；并且n是0或1，但优选1。这样的DVD-Ig可以包含两个这种重链和两个这种轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，而在可变区之间没有介入恒定区，其中重链和轻链关联形成串联功能性抗原结合位点，并且一对重和轻链可以与另一对重和轻链关联形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。在另一个实例中，DVD-Ig分子可以包含重和轻链，其每个包含串联连接的三个可变结构域（VD1、VD2、VD3），而在可变结构域之间没有介入恒定区，其中一对重和轻链可以关联形成三个抗原结合位点，并且其中一对重和轻链可以与另一对重和轻链关联形成具有六个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。
在优选的实施方案中，根据本发明的DVD-Ig结合蛋白不仅结合被其亲本单克隆抗体结合的相同靶分子，还具有一种或多种其亲本单克隆抗体的一种或多种期望特性。优选地，这种额外特性是一种或多种亲本单克隆抗体的抗体参数。可以从其亲本单克隆抗体贡献给DVD-Ig结合蛋白的抗体参数包括，但不限于，抗原特异性、抗原亲和力、效价、生物功能、表位识别、蛋白稳定性、蛋白溶解性、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直向同源抗原结合。
DVD-Ig结合蛋白结合GP73的至少一个表位。DVD-Ig结合蛋白的非限制性实例包括结合GP73的一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白、结合人GP73的表位和另一物种（例如，小鼠）的GP73的表位的DVD-Ig结合蛋白，和结合人GP73的表位和另一靶分子的表位的DVD-Ig结合蛋白。
“表位”或“目的表位”指任何分子上的一个或多个位点，所述位点被识别并可以结合到其特异性结合配偶体上的互补位点。分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的部分。例如，表位可以在多肽、蛋白、半抗原、碳水化合物抗原（诸如但不限于，糖脂、糖蛋白或脂多糖）或多糖上。其特异性结合配偶体可以是，但不限于，抗体。
如本文所用“F(ab')2”片段指通过完整IgG抗体的胃蛋白酶消化以去除大部分Fc区同时保留完整的铰链区部分而产生的抗体。F(ab')2片段具有通过二硫键连接到一起的两个抗原结合F(ab)部分，并且因此是二价的，具有约110kDa的分子量。二价抗体片段（F(ab')2片段）小于完整IgG分子并且能够更好地渗入组织从而促进免疫组织化学中更好的抗原识别。F(ab')2片段的使用还避免对活细胞上Fc受体或对蛋白A/G的非特异性结合。F(ab')2片段可以结合并沉淀抗原。
如本文所用“框架”（FR）或“框架序列”可以指可变区减去CDR的剩余序列。因为，CDR序列的确切定义可以通过不同系统确定（例如，参见上文），框架序列的含义受到相应不同的解释。六个CDR（轻链的CDR-L1、-L2和-L3和重链的CDR-H1、-H2和-H3）也将轻链和重链上的框架区在每条链上分成四个子区域（FR1、FR2、FR3和FR4），其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间并且CDR3位于FR3和FR4之间。不指定特定亚区为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内组合的FR。如本文所用，FR表示四个亚区之一，并且FR表示构成框架区的四个亚区中的两个或更多个。
人重链和轻链FR序列是本领域已知的，其可以用作重链和轻链“接纳体”框架序列（或简单地，“接纳体”序列）以使用本领域已知技术人源化非人抗体。在一个实施方案中，人重链和轻链接纳体序列选自公开获得的数据库，诸如V-数据库（超文本传输协定://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）中所列举的框架序列，或国际ImMunoGeneTics®（IMGT®）信息系统（超文本传输协定://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/）中所列举的框架序列。
“岩藻糖基化的GP73”在本文用于描述高尔基体膜蛋白73，其具有添加至其的岩藻糖糖部分。
如本文所用“功能性抗原结合位点”可以指能够结合靶抗原的结合蛋白（抗体）上的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力可以不如亲本结合蛋白强烈，例如从其衍生出抗原结合位点的亲本结合蛋白，但是结合抗原的能力必须是使用任一已知的各种用于评价蛋白（例如抗体）结合抗原的方法可以测量的。此外，多价蛋白（例如多价抗体）的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力在本文中不需要是定量相同的。
“GP73”在本文用于描述高尔基体蛋白73，也称为高尔基体膜蛋白1（GOLM1）和高尔基体磷蛋白2（GOLPH2）。GP73是由GOLM1基因编码的蛋白。其加工在粗面内质网中合成的蛋白并帮助蛋白货物通过高尔基体转运。GP73在来自几种组织的正常表皮细胞中广泛表达。上调的细胞内GP73表达增强其通过内体途径的细胞内运输，其提供GP73的内切蛋白酶裂解机会，导致截短的GP73的分泌。GP73表达响应病毒感染上调，但是还发现在来自患有病毒性和非病毒性肝脏疾病的患者的肝细胞中上调。GP73在前列腺癌和肺腺癌组织中过表达。已在四分之三的来自肝细胞癌患者的分泌的GP73中发现岩藻糖基化。
“人源化抗体”在本文用于描述包含来自非人物种（例如小鼠）的重和轻链可变区序列的抗体，但是其中至少一部分VH和/或VL序列已被改变为更“人样”，即更类似人种系可变序列。“人源化抗体”是抗体或其变体、其衍生物、其类似物或其片段，其免疫特异性地结合目的抗原，并且其包含基本上具有人抗体氨基酸序列的框架（FR）区和基本上具有非人抗体氨基酸序列的互补决定区（CDR）。如本文所用，在CDR的上下文中，术语“基本上”指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本上包含所有至少一个，并且典型地两个可变结构域（Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv），其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白（即，供体抗体）的那些CDR区，并且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。在一个实施方案中，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区（Fc），通常是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链，以及至少重链的可变区。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅包含人源化轻链可变结构域和/或人源化重链。
人源化抗体可以选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和 IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自超过一类或同种型的序列，并且特别是可以选择恒定结构域以使用本领域熟知的技术优化期望的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR不需要精确对应亲本序列，例如供体抗体CDR，或者共有框架可以通过至少一个氨基酸残基的替换、插入和/或缺失进行突变，以便在该位点的CDR或框架残基不对应供体抗体或共有框架。但是，在优选的实施方案中，这些突变不会是广泛的。通常，至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，并且最优选至少95%的人源化抗体残基将对应亲本FR和CDR序列的那些残基。如本文所用，术语“共有框架”指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”指从在在相关免疫球蛋白序列家族中最经常发生的氨基酸（或核苷酸）形成的序列（参见，例如，Winnaker, From Genes toClones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)）。“共有免疫球蛋白序列”因此可以包含”共有框架区”和/或“共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置被在家族中该位置最经常出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸出现频率相同，则任一个都可以包括在共有序列中。
如本文所用在两种或更多种多肽或多核苷酸序列的上下文中，“相同”或“同一性”可以指该序列具有指定百分比的相对指定区域相同的残基。百分比可以通过如下计算：最佳地比对两条序列，比较相对指定区域的两条序列，确定在两条序列中出现的相同残基所在位置的数目以获得匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数，并将结果乘以100，以获得序列同一性百分比。在其中序列长度不同或比对产生一个或多个交错末端并且指定比较区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基包括在计算的分母中而不是分子中。
如本文所用“分离的多核苷酸”可以指这样的多核苷酸（例如，基因组的、cDNA的或合成来源的，或其组合），凭借其来源，所述分离的多核苷酸不与所述“分离的多核苷酸”天然发现的多核苷酸的所有或部分关联；与其天然不连接的多核苷酸可操作地连接；或不作为更大序列的部分天然出现。
如本文所用“标记物”和“可检测标记物”指连接到抗体或分析物上的部分，以使得抗体和分析物之间的反应可检测，并且这样标记的抗体或分析物称为“可检测标记的”。标记物可以产生可以通过肉眼或设备手段检测的信号。各种标记物包括产生信号的物质，诸如色原、荧光素化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。标记物的代表性实例包括产生光的部分，例如，吖啶鎓化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。其它标记物如本文所述。因此，部分本身可以检测不到，但是可在与另一部分反应后变得可检测。使用术语“可检测标记的”意在涵盖这些标记。
可以使用任何本领域已知的任何合适的可检测标记物。例如，可检测标记物可以是放射性标记物（诸如3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm），酶标记物（诸如辣根过氧化物酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等），化学发光标记物（诸如吖啶鎓酯、硫酯、或磺胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等），荧光标记物（诸如荧光素（例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5（6）-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等）），罗丹明，藻胆蛋白，R-藻红蛋白，量子点（例如，硫化锌封端的硒化镉），温度测量标记物，或免疫-聚合酶链反应标记物。对标记物、标记方法和标记物检测的介绍可以见于Polak and Van Noorden, Introduction toImmunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997)，和Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)，其是MolecularProbes, Inc., Eugene, Oregon出版的组合的手册和目录。荧光素标记物可以用于FPIA（参见，例如美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，其通过引用以其整体在此并入）。吖啶鎓化合物可以在均质化学发光测定中用作可检测标记物（参见，例如Adamczyk 等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006)；Adamczyk等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004)；Adamczyk 等, Biorg. Med.Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004)和Adamczyk 等, Org. Lett. 5: 3779-3782(2003)）。
在一方面，吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酰胺。制备吖啶鎓-9-甲酰胺的方法描述于Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991)；Adamczyk 等, J. Org.Chem. 63: 5636-5639 (1998)；Adamczyk 等, Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999)；Adamczyk 等, Org. Lett. 1: 779-781 (1999)；Adamczyk 等, Bioconjugate Chem. 11:714-724 (2000)；Mattingly 等, In Luminescence Biotechnology: Instruments andApplications；Dyke, K. V. Ed.；CRC Press: Boca Raton, pp. 77–105 (2002)；Adamczyk 等, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)；和美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699（其每个通过引用以其整体关于其涉及相同内容的教导并入本文）。
吖啶鎓化合物的另一实例是吖啶鎓-9-羧酸芳基酯。式II的吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的一个实例是10-甲基-9-（苯氧羰基）吖啶鎓氟磺酸盐（购自Cayman Chemical，Ann Arbor，MI）。制备吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的方法描述于McCapra 等, Photochem. Photobiol. 4:1111-21 (1965)；Razavi 等, Luminescence 15: 245-249 (2000)；Razavi 等,Luminescence 15: 239-244 (2000)；和美国专利号5,241,070（其每个通过引用以其整体关于其涉及相同内容的教导并入本文）。此类吖啶鎓-9-羧酸芳基酯是针对分析物被至少一种氧化酶氧化产生的过氧化氢在信号强度和/或信号的快速性的方面有效的化学发光指示物。吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的化学发光发射的过程迅速地完成，即，在1秒内，而吖啶鎓-9-甲酰胺的化学发光发射延伸超过2秒。但是，吖啶鎓-9-羧酸芳基酯在蛋白的存在下失去其化学发光特性。因此，它的使用需要在信号产生和检测期间不存在蛋白。用于分离或去除样品中蛋白的方法是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于，超滤、萃取、沉淀、透析、层析和/或消化（参见，例如，Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation.Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)）。从测试样品去除或分离的蛋白的量可以是约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%。关于吖啶鎓-9-羧酸芳基酯和其使用的进一步的细节描述于2007年4月9日提交的美国专利申请号11/697,835。吖啶鎓-9-羧酸芳基酯可以溶于任何合适的溶剂，诸如脱气的无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）或含水胆酸钠。
“接头序列”或“接头肽序列”指连接到一种或多种目的多肽序列（例如，全长、片段等）的天然或人工多肽序列。术语“连接的”指连接序列接合到目的多肽序列。这些多肽序列优选通过一个或多个肽键接合。连接序列可以具有约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度从约6至约30个氨基酸。天然连接序列可以通过氨基酸替换、添加或缺失进行修饰以产生人工连接序列。示例性连接序列包括，但不限于：（i）组氨酸（His）标签，诸如6xHis标签，其具有HHHHHH (SEQ ID NO:105)的氨基酸序列，可以用作连接序列以促进多肽和目的抗体的分离和纯化；（ii）肠激酶切割位点，如His标签，可用于蛋白和目的抗体的分离和纯化。经常地，在蛋白和目的抗体的分离和纯化中，肠激酶切割位点与His标签一起使用。各种肠激酶切割位点是本领域已知的。肠激酶切割位点的实例包括，但不限于，氨基酸序列DDDDK (SEQ ID NO:106)和其衍生物（例如ADDDDK (SEQ ID NO:107)）；（iii）其它序列可用于连接或连接单链可变区片段的轻和/或重链可变区。其它连接序列的实例可以见于Bird等, Science 242: 423-426 (1988)；Huston 等, PNAS USA 85: 5879-5883 (1988)；和McCafferty 等, Nature 348: 552-554 (1990)。为了额外的功能，还可以修饰连接序列，诸如连接药物或连接到固体支持。在公开的上下文中，单克隆抗体，例如，可以包含连接序列，诸如His标签、肠激酶切割位点，或两者。
如本文所用“肝癌”指源自肝脏的癌症。肝癌包括肝细胞癌（HCC）与纤维板层癌。在大多数情况下，肝癌的原因通常是肝脏的瘢痕形成（即，肝硬化）。
如本文所用“肝硬化”指慢性肝脏疾病的结果，其特征在于肝脏组织被纤维化，瘢痕组织，和再生结节（由于其中受损组织再生的过程发生的结块）取代，导致肝功能的损失。肝脏的功能单元的结构组织变得如此被破坏，使得通过肝脏的血流和肝功能变得被破坏。肝硬化最通常由酗酒、乙型和丙型肝炎，以及脂肪肝疾病引起，但是有许多其它可能的原因。有些病例是特发性的（即，原因不明）。一旦发生肝硬化，则可发生肝脏疾病的严重并发症，包括门静脉高血压，肝功能衰竭，和肝癌。一旦发生肝硬化则癌症的风险大大增加，并且肝硬化应当被认为是恶变前状况。肝硬化可以由酒精滥用、肝脏的自身免疫性疾病、乙型或丙型肝炎病毒感染、肝脏的长期（慢性）炎症、以及机体中铁超负荷（血色病）引起。具有乙型或丙型肝炎的患者在肝癌风险中，即使他们还没有发展为肝硬化。
如本文所用的“肝脏疾病”，是指对肝脏的损伤或肝脏的疾病。肝功能障碍的症状包括物理表征和涉及消化问题、血糖问题、免疫病症、脂肪的异常吸收和代谢问题的各种症状。肝脏疾病包括肝纤维化、肝硬化和肝癌。所有慢性肝病均可导致肝纤维化。慢性肝脏疾病可由慢性病毒性乙型肝炎和酒精性肝病引起。
如本文所用“肝纤维化”指细胞外基质蛋白，包括胶原的过度积累，其发生在大多数类型的慢性肝病中。肝纤维化是结疤过程，其表示肝脏对受伤或疾病的反应。肝纤维化可由下列原因导致：由于乙型和丙型肝炎的感染、寄生虫、过量饮酒和暴露于有毒化学品包括药品并堵塞胆管。晚期肝纤维化导致肝硬化、肝功能衰竭、门静脉高压症并且经常需要肝移植。
如本文所用“单克隆抗体”指获自一群基本上同源的抗体的抗体，即包括该群体的个别抗体除了可能自然发生的突变（其可以少量存在）之外是相同的。单克隆抗体针对单个抗原是高度特异性的。并且，与多克隆抗体制剂相反，其典型地包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中一部分重和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体，以及这些抗体的片段中相应序列相同或同源，只要它们展示所希望的生物活性。
“多价结合蛋白”在本文中用于指包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白（本文也称为“抗原结合结构域”）。多价结合蛋白优选被改造成具有三个或更多的抗原结合位并且通常是非天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指可以结合两种或更多相关或不相关靶的结合蛋白，包括能够结合相同靶分子的两种或更多不同表位的结合蛋白。
如本文所用“预定截止”和“预定水平”指用于通过比较针对预定截止/水平的测定结果评价诊断、预后或治疗效力结果的测定截止值，其中预定截止/水平已与各种临床参数（例如，疾病的存在，疾病分期，疾病严重程度，疾病进展、非进展或改善）连接或关联。本公开提供了示例性预定水平。但是，众所周知的是截止值可以取决于免疫测定的性质而变化（例如，采用的抗体、反应条件、样品纯度等）。本领域技术人员完全可以调整本文公开内容用于其它免疫测定以对于基于本公开提供的描述的那些其它免疫测定获得免疫特异性截止值。而预定截止/水平的精确值可以在测定之间不同，如本文所述的关联应当普遍适用。
如在如本文所述的诊断测定中使用的“预处理试剂”，例如，裂解、沉淀和/或溶解试剂，是裂解测试样品中存在的任何细胞和/或溶解测试样品中存在的任何分析物的试剂。如本文进一步所述，预处理不是对于所有样品必须的。尤其是，溶解分析物（即，GP73、GP73的片段、GP73的变体或其任何组合）带来分析物从样品中存在的任何内源结合蛋白上的释放。预处理试剂可以是均质的（不需要分离步骤）或异质的（需要分离步骤）。使用异质预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤之前从测试样品去除任何沉淀的分析物结合蛋白。预处理试剂可以任选地包含：（a）一种或多种溶剂和盐，（b）一种或多种溶剂，盐和去垢剂，（c）去垢剂，（d）去垢剂和盐，或（e）适合于细胞裂解和/或分析物溶解的任何试剂或试剂的组合。
在本文所述免疫测定和试剂盒的语境中，“质量控制试剂”包括但不限于，校准物、对照和灵敏度实验对象组（sensitivity panels）。通常使用“校准物”或“标准物”（例如，一个或多个，例如多个），以建立校准（标准）曲线用于内推分析物诸如抗体或分析物的浓度。可替代地，可以使用预定截止/水平附近的单一校准物。可以使用多重校准物（即，超过一种校准物或不同量的一种或多种校准物），结合包括“灵敏度实验对象组”。
“接受者操作特征”曲线或“ROC”曲线指阐释当其鉴别阈值变化时二元分类系统性能的绘图。其通过将出自阳性的真阳性的分数（TPR=真阳性率）相对出自阴性的真阴性的分数（FPR=真阴性率）在不同阈值设置下绘图产生。TPR也被称为敏感度，并且FPR是1减去特异性或真阴性率。
“重组抗体”指通过一个或多个步骤制备的抗体，包括通过重组技术将编码所有或部分一种或多种单克隆抗体的核酸序列克隆到适当的表达载体中，并随后在适当的宿主细胞中表达抗体。该术语包括，但不限于，重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体（完全或部分人源化的）、从抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能抗体、异源缀合Ab、DVD-Ig®s和如本文（i）中所述其它抗体。（双重可变结构域免疫球蛋白和用于制造它们的方法描述于Wu, C., 等, Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)）。如本文所用术语“双功能抗体”，指包含对于一种抗原位点具有特异性的第一臂和对于不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即，双功能抗体具有双重特异性。
如本文所用对象（即患者）的“风险评估”、“风险分级”、“风险鉴定”或“风险分层”指包括生物标记物的因子的评估，以预测包括疾病发生或疾病进展的未来事件的发生风险，使得关于该患者的治疗决定可以在更知情的基础上作出。
如本文所用“样品”、“测试样品”、“样本”、“来自对象的样品”和“患者样品”可以互换使用，并且可以是血液、组织、尿、血清、血浆、羊水、脑脊髓液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品。样品可以从患者获得时直接使用，或可以被预处理，诸如通过过滤、蒸馏、萃取、浓缩、离心、干扰组分的灭活、试剂的添加等，以修饰样品的特征，以如本文讨论的一些方式，或以如本领域已知的其它方式。
可以利用任何细胞类型、组织或体液获得样品。这样的细胞类型、组织和液体可以包括组织诸如活组织检查和尸检样品的切片、为了组织学目的而取的冷冻切片、血液（诸如全血）、血浆、血清、痰、粪便、眼泪、粘液、唾液、支气管肺泡的部分灌洗（BAL）液、毛发、皮肤、红血细胞、血小板、间质液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、鼻液、滑液、经血、羊水、精液等。细胞类型和组织中也可包括淋巴液、腹水、妇科液、尿液、腹膜液、脑脊髓液、阴道冲洗收集的流体，或由阴道冲洗收集的流体。组织或细胞类型可以通过从动物中取细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞来完成（例如，由另一人在另一时间和/或用于另一目的而分离的）。也可以使用存档组织，诸如那些具有治疗或结果历史的组织。蛋白或核苷酸分离和/或纯化可以不是必须的。
“校准组合物的系列”指包含已知浓度的GP73的多种组合物，其中系列中每种组合物彼此不同之处在于GP73的浓度。
“固相”指不溶的任何材料，或可以通过后续反应造成不溶。可以针对其吸纳和固定化捕获剂的内在能力选择固相。可替代地，固相可以在其上附加具有吸纳和固定化捕获剂能力的连接剂。例如，连接剂可以包括相对捕获剂本身或缀合到捕获剂的带电物质带相反电荷的带电物质。通常，连接剂可以是任何结合配偶体（优选特异性的），其固定化在（或连接到）固相上，并且其具有通过结合反应固定化捕获剂的能力。连接剂使得在进行测定之前或进行测定的过程中，捕获剂能够间接结合到固相材料上。例如，固相可以是塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括，例如，试管、微量滴定孔、片、珠子、微粒、芯片和那些本领域技术人员已知的其它构造。
如本文所用“特异性结合”或“特异性地结合”指抗体、蛋白或肽与第二化学品的相互作用，其中相互作用取决于化学品上的特定结构（例如，抗原决定簇或表位）；例如，抗体识别并结合特定蛋白结构而不是普遍地结合蛋白。如果抗体对于表位“A”是特异性的，则包含表位A的分子的存在（或游离的未标记的A），在包含标记的“A”和抗体的反应中，将减少结合到抗体的标记的A的量。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包括两种不同的分子，其通过化学或物理手段特异性结合彼此。因此，除了常规免疫测定的抗原和抗体特异性结合对之外，其它特异性结合对可以包括生物素和亲和素（或链霉亲和素），碳水化合物和凝集素，互补核苷酸序列，效应子和受体分子，辅因子和酶，酶和酶抑制剂等。此外，特异性结合对可以包括原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原，抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及复合物和其片段，无论分离或重组产生。
如本文中可互换使用的“对象”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于，哺乳动物（例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物（例如，猴，诸如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等）和人）。在一些实施方案中，对象可以是人类或非人类。对象或患者可以进行其他形式的治疗。
“治疗（treat）”，“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”各自本文中可互换使用以描述逆转，减轻或抑制该术语适用的疾病的进展，或这种疾病的一种或多种症状。根据对象的状况，该术语还指预防疾病，并且包括预防疾病的发作，或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性的方式执行。该术语还指在患病之前减少疾病的严重程度或减少与该疾病相关的症状。这种在患病之前预防或减少疾病严重程度是指将本发明的抗体或药物组合物施用给对象，而不是在患病时施用。“预防”还指预防疾病的复发或与这种疾病相关的一种或多种症状的复发。“治疗”和“治疗地”是指治疗的行为，因为“治疗”在上文定义。
“变体”在本文中用于描述肽或多肽，其通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列中不同，但保留至少一种生物活性。“生物活性”的代表性实例包括被特定抗体结合或促进免疫应答的能力。变体在本文也可用于描述具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白。氨基酸的保守取代，即，用具有类似特性（例如，亲水性，度，和带电区域分布）的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域中被认为一般涉及小改变。这些小的改变可以通过考虑氨基酸的亲水指数被部分鉴定，如本领域理解的。Kyte 等, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。氨基酸的疏水指数基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知类似疏水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一方面，具有±2的疏水指数的氨基酸被取代。氨基酸的疏水性也可以用于揭示将会导致保留生物功能的蛋白的取代。在肽的语境下，氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一个有用的量度，其已被报道与抗原性和免疫原性良好地相关。美国专利号4,554,101，通过引用完全并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以导致肽保留生物活性，例如免疫原性，如本领域理解的。取代可以用彼此具有±2之内亲水性值的氨基酸来执行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受该氨基酸的特定侧链影响。根据这一观察，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其它属性所揭示的，与生物学功能相容的氨基酸取代理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是这些氨基酸的侧链。“变体”也可以用来指抗GP73抗体的抗原反应性片段，其氨基酸序列不同于抗GP73抗体的对应片段，但仍具有抗原反应性，并可以与抗GP73抗体的相应片段竞争结合GP73。“变体”也可用于描述已差异化处理的多肽或其片段，例如通过蛋白酶解、磷酸化或其它翻译后修饰，但保留其抗原反应性。
“载体”在本文中用于描述核酸分子，其可以运输其连接到的另一个核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指的是环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体（例如，非附加型哺乳动物载体）在引入宿主细胞后可以整合到宿主细胞的基因组中，并由此沿着宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简单地，“表达载体”）。一般而言，在重组DNA技术中利用的表达载体通常是质粒的形式。“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，可以使用其它形式的表达载体，诸如病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒），其发挥等效功能。在这方面，载体的RNA版本（包括RNA病毒载体）也可以在本公开内容的上下文中找到用途。
除非文中另外定义，联系本公开使用的科技术语应具有本领域普通技术人员一般都了解的含义。例如，本文所述关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法，以及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交的技术是本领域熟知和常规使用的那些。术语的含义和范围应当是清楚的；但是在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有需要，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
2. GP73抗体
本文提供了用于在检测和治疗疾病，诸如肝脏疾病和/或癌症的方法中使用的抗体。在本文中提供了分离的抗体，其特异性结合到高尔基体蛋白73（“GP73”）（或其片段），并称为“GP73抗体”。
a. 高尔基体蛋白73（GP73）
高尔基蛋白73（GP73），也被称为“高尔基体膜蛋白1”，“高尔基磷蛋白2”和“高尔基体膜蛋白GP73”，是加工在粗面内质网中合成的蛋白，并协助蛋白货物通过高尔基体运输的蛋白。人GP73是由GOLM1基因编码的400个氨基酸的蛋白。GP73在来自几种组织的正常表皮细胞中广泛表达。上调的细胞内GP73表达增强其通过内体途径的细胞内运输，其提供GP73的内切蛋白酶裂解机会，导致截短的GP73的分泌。GP73表达响应病毒感染上调，但是还发现在来自患有病毒性和非病毒性肝脏疾病的患者的肝细胞中上调。GP73在前列腺癌和肺腺癌组织中过表达。人GP73可具有下列氨基酸序列：
(SEQ ID NO:97;GenBank 登录号: AAF44663)。
人GP73可以是SEQ ID NO:97的片段或变体。GP73可以是5-400个氨基酸、10-400个氨基酸、50-400个氨基酸、60-400个氨基酸、65-400个氨基酸、100-400个氨基酸、150-400个氨基酸、100-300个氨基酸或200-300个氨基酸的长度。所述片段可以包含来自SEQ ID NO:97的连续数目的氨基酸。
人GP73的片段可具有下列氨基酸序列：
(SEQ ID NO:100)，其对应SEQ ID NO:97的氨基酸63-400。
b. GP73-识别抗体
该抗体是结合GP73、其片段、GP73的表位，或其变体的抗体。所述抗体可以是抗GP73抗体或其变体或其衍生物的片段。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。该抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟的抗体、人抗体、人源化抗体、完全的人抗体或抗体片段，诸如Fab片段，或其混合物。抗体片段或衍生物可以包含F（ab'）2、FV或scFv片段。抗体衍生物可通过模拟肽来产生。此外，用于生产单链抗体的所述技术可以调整以产生单链抗体。
抗GP73抗体可以是嵌合抗GP73或人源化抗GP73抗体。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体是单价的。在一个实施方案中，人源化抗体和嵌合抗体包含连接Fc区的单一Fab区。
人抗体可以衍生自噬菌体展示技术，或衍生自表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可作为人体内的免疫应答的结果而产生并被分离。参见，例如，Funaro等，BMC生物技术，2008（8）：85。因此，该抗体可以是人而不是动物的全套抗体（repertoire）的产物。因为它是人源的，所以针对自身抗原的反应性的风险可被最小化。可替代地，可以使用标准的酵母展示文库和显示技术来选择并分离人抗GP73的抗体。例如，可以使用幼稚人单链可变片段（scFv）的文库选择人抗GP73抗体。可以使用转基因动物表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，其与期望抗原结合，具有来自非人物种的一个或多个互补决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的框架区。
抗体与已知抗体的可区分之处在于其具有与本领域中已知的那些抗体不同的一种或多种生物学功能。
(1) 表位
所述抗体可以免疫特异性结合到GP73 (SEQ ID NO:97)、SEQ ID NO:100、其片段或其变体。所述抗体可以免疫特异性地识别并结合到下列表位肽：SEQ ID NO:101 (SEQ ID NO:97的氨基酸307-339)、SEQ ID NO: 102 (SEQ ID NO:97的氨基酸276-287)、SEQ ID NO:103 (SEQ ID NO:97的氨基酸344-363)或SEQ ID NO: 104 (SEQ ID NO:97的氨基酸63-96)。抗体可以免疫特异性识别和结合SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104的表位肽内至少3个氨基酸，至少4个氨基酸，至少5个氨基酸，至少6个氨基酸，至少7个氨基酸，至少8个氨基酸，至少9个氨基酸，或至少10个氨基酸。抗体可以免疫特异性识别和结合具有SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：104的表位肽的至少3个连续氨基酸，至少4个连续氨基酸，至少5个连续氨基酸，至少6个连续氨基酸，至少7个连续氨基酸，至少8个连续氨基酸，至少9个连续氨基酸，或至少10个连续氨基酸的表位。
(2) 抗体结合表征
抗体可以免疫特异性地结合GP73 (SEQ ID NO:97)、SEQ ID NO:100、其片段、或其变体并具有KD 至少1.5 x 10-12 M、至少1.6 x 10-12 M、至少1.7 x 10-12 M、至少1.8 x 10-12 M、至少1.9 x 10-12 M、至少2.0 x 10-12 M、至少2.1 x 10-12 M、至少2.2 x 10-12 M、至少2.3 x10-12 M、至少2.4 x 10-12 M、至少2.5 x 10-12 M、至少5.0 x 10-12 M、至少10.0 x 10-12 M、至少15 x 10-12 M、至少50 x 10-12 M 、至少100 x 10-12 M、至少500 x 10-12 M、至少1000 x10-12 M、至少2000 x 10-12 M、至少3000 x 10-12 M、至少3500 x 10-12 M，或具有Kd 范围是从约1.5 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约10.0 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约25.0 x10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约50.0 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约100.0 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约150.0 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约200 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约500 x 10-12 M至约3500 x 10-12 M、从约1000 x 10-12 M至约3500 x10-12 M、从约1.5 x 10-12 M至约3000 x 10-12 M、从约10.0 x 10-12 M至约3000 x 10-12 M、从约25.0 x 10-12 M至约3000 x 10-12 M、从约50.0 x 10-12 M 至约3000 x 10-12 M、从约1.5 x 10-12 M至约1000 x 10-12 M、从约25.0 x 10-12 M至约1000 x 10-12 M、从约50.0 x10-12 M至约1000 x 10-12 M、从约100.0 x 10-12 M至约1000 x 10-12 M、从约1.5 x 10-12 M至约500 x 10-12 M、从约50 x 10-12 M至约500 x 10-12 M、从约100 x 10-12 M至约500 x10-12 M、从约1.5 x 10-12 M至约100 x 10-12 M、从约25.0 x 10-12 M至约100 x 10-12 M、从约50.0 x 10-12 M至约100 x 10-12 M、从约1.5 x 10-12 M至约50 x 10-12 M、从约10.0 x10-12 M至约50.0 x 10-12 M、或从约从约25.0 x 10-12 M至约50 x 10-12 M。所述片段可以是SEQ ID NO: 97或SEQ ID NO: 100。
抗体对GP73的结合可以对于GP73分子上的岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感或不敏感的。对于GP73分子上的岩藻糖部分的存在或不存在敏感的抗体意味着该抗体对GP73的结合亲和力取决于在GP73分子上存在或不存在岩藻糖部分而变化。例如，如果存在岩藻糖部分,则其结合对于GP73分子上的岩藻糖部分的存在或不存在敏感的抗体可对GP73具有较低的结合亲和力。或者，如果不存在岩藻糖部分,则其结合对于GP73分子上的岩藻糖部分的存在或不存在敏感的抗体可对GP73具有较低的结合亲和力。对于GP73分子上的岩藻糖部分的存在或不存在不敏感的抗体意味着如果在GP73分子上存在或不存在岩藻糖部分该抗体对GP73的结合亲和力不变。
(3) 抗体结构
(a)重链和轻链CDR
抗体可以免疫特异性结合GP73（SEQ ID NO：97）、SEQ ID NO：100、其片段或其变体，并且包括在表1中所示的可变重链（VH）和/或可变轻链（V L）。抗体可以免疫特异性结合GP73，其片段，或其变体，并包含也示于表1的一个或多个重链或轻链CDR序列。该抗体的轻链可以是κ链或λ链。例如，参见表1。
所述抗体或其变体或其衍生物可以含有与SEQ ID NO:1-48的一个或多个大于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同的一个或多个氨基酸序列。所述抗体或其变体或其衍生物可以由与SEQ ID NO:49-96的一个或多个大于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同的一个或多个核酸序列编码。可以例如通过报道：Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726-730 (1983)中描述的算法确定多肽同一性和同源性。本文所述抗体、其变体或其衍生物可由在严格条件下与SEQ ID NO: 17-32的一个或多个的互补物杂交的核酸编码。本文所述抗体、其变体或其衍生物可由在严格条件下与编码SEQ ID NO: 1-48的一个或多个的一个或多个核酸的互补物杂交的核酸编码。
在一方面，所述分离的抗体特异性结合GP73并具有下式的CDR-H1：CDR-H1，X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO:108)，其中：X5是S、N或T；X6是Y或N；X7 是W、V、G、A或T；X8是I、V或M；并且X9是E、H、S或N。
在另一方面，所述分离的抗体特异性结合GP73并具有下式的CDR-H2：CDR-H2，X10-I-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19- X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27 (SEQ ID NO:109)，其中X10是E、Y、V、T或R；X11s L、W、S或R；X12是P、S、R或T；X13不存在或是K；X14不存在或是R；X15是G、T或Y；X16是S、G或N；X17是G、D、S、T或Y；X18是N、S、Y、G或T；X19是T或I；X20是N、K、Y或F；X21是Y或F；X22是N、P或A；X23是E、S或D；X24是K、A或S；X25是F、L或V；X26是K或M；并且X27是G、S或D。
在又另一方面，所述分离的抗体特异性结合GP73并具有下式的CDR-H3：CDR-H3，X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-Y (SEQ ID NO:110)，其中：X28是G、Q、D、E或N；X29是R、Q、P、Y、W或G；X30是G、L、F、D或T；X31是S、T、S或G；X32是Y、D、G、E或T；X33是R、Y、D、L或F；X34是Y、F、T或H；X35是H或Y；X36是W、D或Y；X37是F、Y或A；X38不存在或是F或M；并且X39是A或D。
在又另一方面，所述分离的抗体特异性结合GP73并具有下式的CDR-L1：CDR-L1,X40-X41-S-X42-X43-X44-X45-X46X47-X48-X49-X50-X51-X52-X53-X54 (SEQ ID NO:111)，其中：X40是K、T、R或S；X41是A或S；X42是Q、S或K；X43是S或G；X44是V或L；X45是D或L；X46是Y、D或H；X47不存在或是S；X48是D、V、N或I；X49是G、V或S；X50是D、K、S或I；X51是S、T、I或N；X52是Y或D；X53是M、L或V；并且X54是N、I、S、H或Y。
在又另一方面，所述分离的抗体特异性结合GP73并具有下式的CDR-L2：CDR-L2,X55-X56-S-X57-X58-X59-X60 (SEQ ID NO:112)，其中：X55是A、L、S、Q或R；X56是A、V、T或M；X57是N、K、Y或S；X58是L或R；X59是E、D、Y或A；并且X60是S或I。
在又另一方面，所述分离的抗体特异性结合GP73并具有下式的CDR-L3：CDR-L3,X61-Q-X62-X63-X64-X65-P-X62-T (SEQ ID NO:113)，其中：X61是Q、W、H或A；X62是S、G、H、Y或N；X63是N、T、F、H或L；X64是E、H、T、R或S；X65是D、F、T、S、L或I；并且X66是Y或L。
在又另一方面，所述分离的抗体特异性结合GP-73，并具有具有式：X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:108)的CDR-H1、具有式：X10-I-X11-X12-X13-X14-X15-X16X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27 (SEQ ID NO:109)的CDR-H2、具有式：X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39-Y (SEQ ID NO:110)的CDR-H3、具有式：X40-X41-S-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50-X51-X52-X53-X54 (SEQ ID NO:111)的CDR-L1、具有式：X55-X56-S-X57-X58-X59-X60(SEQ ID NO:112)的CDR-L2和具有式：X61-Q-X62-X63-X64-X65-P-X62-T (SEQ ID NO:113)的CDR-L3，其中X5 是S、N或T；X6是Y或N；X7 是W、V、G、A或T；X8是I、V或M；X9是E、H、S或N；X10是E、Y、V、T或R；X11s L、W、S或R；X12是P、S、R或T；X13不存在或是K；X14不存在或是R；X15是G、T或Y；X16是S、G或N；X17是G、D、S、T或Y；X18是N、S、Y、G或T；X19是T或I；X20是N、K、Y或F；X21是Y或F；X22是N、P或A；X23是E、S或D；X24是K、A或S；X25是F、L或V；X26是K或M；X27是G、S或D；X28是G、Q、D、E或N；X29是R、Q、P、Y、W或G；X30是G、L、F、D或T；X31是S、T、S或G；X32是Y、D、G、E或T；X33是R、Y、D、L或F；X34是Y、F、T或H；X35是H或Y；X36是W、D或Y；X37是F、Y或A；X38不存在或是F或M；X39是A或D；X40是K、T、R或S；X41是A或S；X42是Q、S或K；X43是S或G；X44是V或L；X45是D或L；X46是Y、D或H；X47不存在或是S；X48是D、V、N或I；X49是G、V或S；X50是D、K、S或I；X51是S、T、I或N；X52是Y或D；X53是M、L或V；X54是N、I、S、H或Y；X55是A、L、S、Q或R；X56是A、V、T或M；X57是N、K、Y或S；X58是L或R；X59是E、D、Y或A；X60是S或I；X61是Q、W、H或A；X62是S、G、H、Y或N；X63是N、T、F、H或L；X64是E、H、T、R或S；X65是D、F、T、S、L或I；并且X66是Y或L。
抗体可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY分子种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。
(b) 核苷酸序列
本文提供分离的核酸，其编码免疫特异性结合GP73的抗体，其片段，或其变体。分离的核酸可以包括在严格条件下杂交到编码包含表1中所示的重链或轻链CDR序列的抗体的核酸分子的核苷酸序列。分离的核酸可以包含在表2所示的核苷酸序列。
c. 抗体制备/产生
可以通过任意各种技术制备抗体。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括单克隆抗体的产生，所述单克隆抗体的产生经由常规技术，或经由抗体基因、重链和/或轻链转染入合适的细菌或哺乳动物细胞宿主，以允许产生抗体，其中所述抗体可以是重组体。各种形式的术语“转染”意在包括各种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，在真核细胞中表达抗体是优选的，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为这样的真核细胞（且特别是哺乳动物细胞）更可能比原核细胞装配和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）（包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 77: 4216-4220 (1980)），所述CHO细胞与DHFR选择性标志物一起使用，例如，如描述于Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞，和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间生产所述抗体，所述时间足够允许抗体在宿主细胞中的表达，或者更优选地，抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
还可以使用宿主细胞产生功能性抗体片段，诸如Fab片段或scFv分子。应该理解的是，上述程序的变化是在本发明的范围之内。例如，可希望用编码本发明抗体的任一轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除对于结合目的抗原没有必要的一些或全部编码轻链和重链的任一个或两者的DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也被本发明的抗体包括。此外，可以通过标准化学交联方法将本发明的抗体交联到第二抗体产生双功能抗体，其中所述双功能抗体一条重链和一条轻链是本发明的抗体（即，结合人GP73）并且另一条重链和轻链特异性针对除人GP73之外的抗原。
在用于本发明的抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接到CMV增强子/ AdMLP启动子调节元件以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。选择的转化的宿主细胞进行培养，以允许抗体重和轻链的表达，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，和从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供合成本发明的重组抗体的方法，通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体被合成。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法涉及能产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系的制备。这样的细胞系可以从获自免疫的动物的脾细胞产生。可以用GP73或其片段和/或变体免疫动物。例如，任意SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:104的片段，或SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:104的变体都可以用于免疫接种动物。用于免疫动物的肽可包含编码人Fc的氨基酸，例如人抗体的片段可结晶区域或尾部区域。脾细胞然后可以通过例如与骨髓瘤细胞融合配偶体融合而被永生化。可以采用多种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可与非离子去垢剂组合几分钟，并然后以低密度铺板在选择性培养基上，所述选择性培养基支持杂交细胞但不是骨髓瘤细胞的生长。一种这样的技术使用次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶（HAT）选择。另一种技术包括电融合。经过足够的时间，通常约1至2周，观察杂交体集落。选择单个集落并且测试它们的培养物上清液针对多肽的结合活性。也可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长杂交瘤集落的上清中分离单克隆抗体。另外，可以采用各种技术增强产量，诸如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主诸如小鼠的腹腔内。单克隆抗体然后可从腹水或血液中收获。可以通过常规技术诸如层析、凝胶过滤、沉淀和萃取从抗体去除污染物。亲和层析是可以在过程中使用以纯化抗体的方法的一个实例。
该蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子，以获得几个片段，其中（所述F（ab）片段）的两个各自包含共价异源二聚体，其包括完整的抗原结合位点。胃蛋白酶能够切割IgG分子，以提供几个片段，包括F（ab'）2片段，其包括两个抗原结合位点。
Fv片段可通过IgM并在极少数情况下，IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解切割来产生。Fv片段可使用重组技术来得出。Fv片段包括非共价的VH::VL异源二聚体，其包括保留大部分的抗原识别和天然抗体分子的结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包括重链和轻链互补决定区（“CDR”）集合，分别插入在重链和轻链框架（“FR”）集合之间，所述框架为CDR提供支持，并限定CDR相对彼此的空间关系。DR集合可以包含重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端出发，这些区域分别被表示为“CDR1”，“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，其包含来自每一个重链和轻链V区的CDR集合。包含单个CDR（例如，CDR1，CDR2或CDR3）的多肽可以被称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体的分析表明，CDR的氨基酸残基形成与结合的抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元可以是主要负责抗原结合位点的特异性。一般而言，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
可以使用生产或分离所需特异性的抗体的其它合适的方法，包括，但不限于，使用本领域中已知的方法从肽或蛋白文库（例如，但不限于，噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA、酵母等，展示文库）选择重组抗体的方法；例如，如可以从各种商业供应商获得的文库，诸如Camridge Antibody Technologies（Cambridgeshire, UK）、MorphoSys（Martinsreid/ Planegg，Del）、Biovation（Aberdeen, Scotland, UK）BioInvent（Lund,Sweden）。参见，美国专利号4,704,692；5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862。可选的方法依赖于转基因动物的免疫（例如，SCID小鼠，Nguyen 等(1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907；Sandhu 等 (1996) Crit. Rev. Biotechnol.16:95-118；Eren 等 (1998) Immunol. 93:154-161），其能够产生人抗体的全套抗体，如本领域已知的和/或如本文所述。这些技术包括，但不限于，核糖体展示(Hanes 等 (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942；Hanes 等 (1998) Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 95:14130-14135)；单细胞抗体生产技术(例如，选择的淋巴细胞抗体方法 ("SLAM") (美国专利号 5,627,052, Wen 等 (1987) J. Immunol. 17:887-892；Babcook 等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848)； 凝胶微滴和流式细胞术(Powell等 (1990) Biotechnol. 8:333-337；One Cell Systems, (Cambridge, Mass)；Gray 等(1995) J. Imm. Meth. 182:155-163；Kenny 等 (1995) Bio/Technol. 13:787-790)；B-细胞选择(Steenbakkers 等 (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994))。
可以通过本领域已知的很多方法的任一个生产亲和力成熟的抗体。例如，参见Marks 等, BioTechnology, 10: 779-783 (1992) 描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas 等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,91: 3809-3813 (1994)；Schier 等, Gene, 169: 147-155 (1995)；Yelton 等, J.Immunol., 155: 1994-2004 (1995)；Jackson 等, J. Immunol., 154(7): 3310-3319(1995)；Hawkins 等, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)。在选择性诱变位置以及在接触或高变位置的用增强活性的氨基酸残基的选择性突变描述于美国专利号6,914,128B1。
本发明的抗体变体也可以使用如下来制备：递送编码本发明抗体的多核苷酸到合适的宿主，诸如以提供在它们的奶中产生这些抗体的转基因动物或哺乳动物，诸如山羊、牛、马、绵羊等。这些方法是本领域已知的并且描述于，例如美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；和5,304,489。
还可以通过递送本发明的多核苷酸以提供转基因植物和培养的植物细胞（例如，但不限于烟草、玉米和浮萍）来制备抗体变体，所述转基因植物和培养的植物细胞在植物部分或从其培养的细胞产生这样的抗体，特定部分或变体。例如，Cramer 等 (1999) Curr.Top. Microbol. Immunol. 240:95-118和其中引用的文献，描述了表达大量重组蛋白的转基因烟草叶的生产，例如，使用诱导型启动子。转基因玉米已被用于在商业生产水平表达哺乳动物蛋白，所述哺乳动物蛋白生物活性与在其它重组系统或从天然来源纯化的那些等同。参见，例如，Hood 等, Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147和其中引用的文献。也已从转基因植物种子中大量生产抗体变体，包括抗体片段，诸如单链抗体（scFv），包括烟草种子和马铃薯块茎。参见，例如Conrad 等 (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109，以及其中引用的参考文献。因此，本发明的抗体也可以根据已知的方法利用转基因植物产生。
可以例如如下产生抗体衍生物：通过添加外源序列来修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期或任何其它合适的特性。通常，维持部分或全部的非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人类序列被替换为人或其它的氨基酸。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中所述片段包含连接到相同多肽链（VH VL）中的轻链可变结构域（VL）的重链可变结构域（VH）。参见，例如 EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger 等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448。通过使用太短而不能允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。还参见Chen等的美国专利号6,632,926，其在此通过引用以其整体并入，并公开了具有在亲本抗体的高变区插入一个或多个氨基酸和比亲本抗体对抗原的结合亲和力更强至少约两倍的对靶抗原的结合亲和力的抗体变体。
该抗体可以是线性抗体。制备线性抗体的方法是本领域已知的，并且描述于Zapata 等 (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段（VH-CH1-VH-CH1），其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
所述抗体可以通过已知方法从重组细胞培养回收并纯化，所述方法包括，但不限于，蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析（“HPLC”）也可用于纯化。
其对于可检测地或治疗性地标记抗体可以是有用的。将抗体缀合到这些试剂的方法是本领域已知的。仅为了说明的目的，抗体可以用可检测部分进行标记，诸如放射性原子、生色团、荧光团等。这种标记的抗体可用于诊断技术，在体内，或者在独立的测试样品中。抗体也可以例如，缀合到药剂，诸如化疗药物或毒素。它们可以连接到细胞因子，连接到配体，连接到另一抗体。用于偶联抗体以实现抗肿瘤效果的合适的试剂，包括细胞因子，诸如白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）；光敏剂，用于光动力疗法，包括酞菁四磺酸铝（III）、血卟啉和酞菁；放射性核素，诸如131碘（131I）、钇-90（90 Y）、铋-212（212Bi）、铋-213（213Bi）、锝-99m（99mTc）、铼-186（186Re）和铼-188 （188铼）；抗生素，诸如多柔比星（doxorubicin）、阿霉素（adriamycin）、道诺霉素（daunorubicin）、氨甲蝶呤、柔红霉素（daunomycin）、新制癌菌素，和碳铂；细菌、植物和其它毒素，诸如白喉毒素、绿脓杆菌外毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素A、相思豆-A毒素、蓖麻毒素A（去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A）、TGF-α毒素、来自中国眼镜蛇的毒素（naja naja atra），和白树毒素（一种植物毒素）；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，诸如局限曲菌素（局限曲霉（Aspergillusrestrictus）产生的核糖体失活蛋白），皂草素（来自肥皂草（Saponaria officinalis）的核糖体失活蛋白），和RNA酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702（二氟化嘌呤核苷）；含有抗囊性剂（例如，反义寡核苷酸，编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等）的脂质体；和其它抗体或抗体片段，诸如F（ab）。
所述抗体可以进行测序并通过重组或合成手段复制。它们也可以进一步测序向下到编码它们的核苷酸的线性序列。因此，本发明提供了这些多核苷酸，单独或与如上所述编码本发明的抗体序列的载体（carrier），载体（vector）或宿主细胞组合。
通过使用杂交瘤技术、所选择的淋巴细胞抗体法（SLAM）、转基因动物和重组抗体文库的抗体的产生在下面更详细地描述。
(1) 使用杂交瘤技术的抗GP73单克隆抗体
单克隆抗体可使用多种本领域已知的技术来制备，包括使用杂交瘤，重组，和噬菌体展示技术，或它们的组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术，包括那些本领域已知的和在下列文献中教导的，例如，Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, secondedition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988);Hammerling, 等, In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier,N.Y., 1981)。人们还注意到，如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指从单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆衍生的抗体，而不是产生其的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了生成单克隆抗体的方法，以及通过该方法产生的抗体。所述方法可以包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过如下生成所述杂交瘤：使从用GP73免疫的动物（例如，大鼠或小鼠）分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选融合所得的杂交瘤中分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。简而言之，大鼠可以用GP73抗原免疫。在一个优选的实施方案中，GP73抗原与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。这样的佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。这种佐剂可保护多肽免于快速扩散，通过截存其在局部沉积，或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫系统其它组分是趋化性的因子的物质。优选地，如果多肽被施用，免疫接种日程将涉及分布在几个星期的两种或更多种多肽的施用；然而，也可以使用所述多肽的单次施用。
动物用GP73抗原免疫后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过放血或处死动物从动物获得含抗GP73抗体的血清。可以如其从动物中获得时使用血清，可以从血清获得免疫球蛋白级分，或可以从血清纯化抗GP73抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有性质的异质阵列。
一旦免疫应答被检测到，例如，在大鼠血清中检测到特异性针对抗原GP73的抗体，则收获大鼠的脾并分离脾细胞。然后通过已知的技术将脾细胞融合到任何合适的骨髓瘤细胞，例如，来自细胞系SP20的细胞，可得自美国典型培养物保藏中心（ATCC, Manassas,Va., US）。选择杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。然后通过本领域中已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合GP73的抗体的细胞。腹水液，其通常含有高水平的抗体，可以通过免疫大鼠用阳性杂交瘤克隆产生。
在另一个实施方案中，产生抗体的永生化的杂交瘤可以从免疫的动物来制备。免疫后，将动物处死，并将脾B细胞融合至永生化骨髓瘤细胞，如本领域熟知的。参见，例如，Harlow和Lane，同上。在优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽（非分泌型细胞系）。融合和抗生素选择后，使用GP73，或其部分，或表达GP73的细胞筛选杂交瘤。在优选的实施方案中，使用酶联免疫测定（ELISA）或放射免疫测定（RIA），优选ELISA进行初步筛选。ELISA筛选的实例提供于PCT公开号WO00/37504。
选择，克隆和进一步针对所期望的特征筛选生产抗GP73抗体的杂交瘤，所述特征包括强健的杂交瘤生长、高抗体产生和所期望的抗体特征。可以在体内在同系动物中，在缺乏免疫系统的动物（例如裸鼠）中，或在细胞培养物在体外培养和扩增杂交瘤。选择，克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域技术人员所熟知的。
在优选的实施方案中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人，非大鼠物种诸如小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中生产。在又另一个优选实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤融合表达抗GP73抗体的人细胞。
可以通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F（ab'）2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生，使用酶诸如木瓜蛋白酶（以产生两个相同的Fab片段）或胃蛋白酶（以产生F（ab'）2片段）。IgG分子的F（ab'）2片段保留较大（“亲本”）IgG分子的两个抗原结合位点，包括亲本IgG分子的两条轻链（包含可变轻链和恒定轻链区），重链的CH1结构域，和形成二硫键的铰链区。因此，F（ab'）2片段仍然能够像亲本IgG分子那样交联抗原分子。
(2) 使用SLAM的抗GP73单克隆抗体
在本发明的另一个方面，使用本领域中称为选择的淋巴细胞抗体法（SLAM）的方法从单个、分离的淋巴细胞中产生重组抗体，如描述于美国专利号5,627,052；PCT公开号WO92/02551和Babcook 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996)。在该方法中，分泌目的抗体的单细胞，例如，利用抗原特异性溶血空斑测定筛选衍生自任一免疫的动物的淋巴细胞，其中所述抗原GP73，GP73的亚基，或其片段，使用接头诸如生物素偶联到绵羊红血细胞，并用于鉴定分泌对GP73具有特异性的抗体的单细胞。在鉴定分泌抗体的目的细胞后，从所述细胞通过逆转录酶-PCR（RT-PCR）挽救重链和轻链可变区cDNA，并且然后可以表达这些可变区，在合适的免疫球蛋白恒定区的背景下（例如，人恒定区），在哺乳动物宿主细胞，诸如COS或CHO细胞中。用扩增的免疫球蛋白序列（衍生自在体内选择的淋巴细胞）转染的宿主细胞，然后可以在体外进行进一步的分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达GP73抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以在体外操作，例如通过体外亲和力成熟方法。参见，例如，PCT公开号WO97/29131和PCT公开号WO00/56772。
(3) 利用转基因动物的抗GP73单克隆抗体
在本发明的另一个实施方案中，通过用GP73抗原免疫非人动物产生包含一些或全部人免疫球蛋白基因座的抗体。在一个实施方案中，非人动物是XENOMOUSE®转基因小鼠，工程改造的小鼠品系，其包括人免疫球蛋白基因座大片段且缺乏小鼠抗体产生。参见，例如Green 等, Nature Genetics, 7: 13-21 (1994)和美国专利号5,916,771；5,939,598；5,985,615；5,998,209；6,075,181；6,091,001；6,114,598；和6,130,364。还参见PCT公开号WO91/10741；WO 94/02602；WO 96/34096；WO 96/33735；WO 98/16654；WO 98/24893；WO 98/50433；WO 99/45031；WO 99/53049；WO 00/09560；和WO 00/37504。所述XENOMOUSE®转基因小鼠产生成人样人的全人抗体的全套抗体，且产生抗原特异性人单克隆抗体。所述XENOMOUSE®转基因小鼠通过导入兆碱基大小的，人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段而含有约80％的人全套抗体。参见，Mendez 等, Nature Genetics, 15: 146-156(1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998)，其公开内容在此通过引用并入。
(4) 使用重组抗体文库的抗GP73单克隆抗体
体外方法也可以用于制造本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需GP73结合特异性的抗体。这种重组抗体文库筛选的方法是本领域熟知的，并且包括描述于下列的方法，例如，美国专利号5,223,409 (Ladner等)；PCT公开号WO 92/18619（Kang等）；PCT公开号WO 91/17271（Dower等）；PCT公开号WO 92/20791（Winter等）；PCT公开号WO 92/15679（Markland等）；PCT公开号WO 93/01288（Breitling等）；PCT公开号WO 92/01047（McCafferty等）；PCT公开号WO 92/09690（Garrard等）；Fuchs 等, Bio/Technology, 9:1369-1372 (1991)；Hay 等, Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992)；Huse 等,Science, 246: 1275-1281 (1989)；McCafferty 等, Nature, 348: 552-554 (1990)；Griffiths 等, EMBO J., 12: 725-734 (1993)；Hawkins 等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)；Clackson 等, Nature, 352: 624-628 (1991)；Gram 等, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)；Garrard 等, Bio/Technology, 9: 1373-1377(1991)；Hoogenboom 等, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)；Barbas 等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)；美国专利申请公开号 2003/0186374；和PCT公开号WO 97/29131，其每一个的内容通过引用并入本文。
重组抗体文库可以来自用GP73或GP73的部分免疫的对象。可选地，重组抗体文库可以来自幼稚对象，即尚未用GP73免疫的对象，诸如来自没有用人GP73免疫的人对象的人抗体文库。通过用包含人GP73的肽筛选重组抗体文库来选择本发明的抗体，从而选择那些识别GP73的抗体。进行这些筛选和选择的方法本领域熟知的，诸如在前面段落中的参考文献中所述。为了选择具有针对GP73的特定结合亲和力的本发明的抗体，诸如那些以特定Koff速率常数从人GP73解离的抗体，可以使用表面等离子体共振的本领域已知的方法来选择具有所需Koff 速率常数的抗体。选择具有对hGP73的特定中和活性的本发明的抗体，诸如那些具有特定IC50的抗体，可以使用本领域已知的用于评估GP73活性的抑制的标准方法。
在一个方面，本发明涉及结合人GP73的分离的抗体，或其抗原结合部分。优选地，所述抗体是中和抗体。在各种不同的实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。这种噬菌体可以用于展示从全套抗体或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。可以用抗原选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠的抗原。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从噬菌体表达的fd和M13结合域，并且Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。可以用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括公开于下列的那些：Brinkmann 等, J. Immunol. Methods, 182: 41-50(1995)；Ames 等, J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995)；Kettleborough 等,Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994)；Persic 等, Gene, 187: 9-18 (1997)；Burton等, Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994)；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108。
如在上述参考文献中所述，噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并用于产生完整抗体，包括人抗体或任何其它所需抗原结合片段，并在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可以采用重组产生Fab、Fab'和F（ab'）2片段的技术，使用本领域已知的方法，如公开于下列的那些：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax 等, BioTechniques, 12(6): 864-869(1992)；Sawai 等, Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995)；和Better 等,Science, 240: 1041-1043 (1988)。可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括描述于下列的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston 等, Methods in Enzymology,203: 46-88 (1991)；Shu 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993)；和Skerra 等, Science, 240: 1038-1041 (1988)。
作为对通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，用于筛选大的组合文库的本领域已知的其它方法可以应用于本发明的抗体的鉴定。一类替代的表达系统是其中重组抗体文库表达为RNA-蛋白融合物的系统，如描述于PCT公开号WO98/31700 (Szostak andRoberts)，和Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302(1997)。在这个系统中，通过在其3'端携带嘌呤霉素-肽基受体抗生素的合成mRNA的体外翻译，在mRNA和其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，可以从mRNA的复杂混合物（例如，组合文库）中富集特定的mRNA，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，诸如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合。从这样的文库筛选中回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如上所述重组方法表达（例如，在哺乳动物宿主细胞中）并且，此外，可以进行进一步的亲和力成熟，通过其中最初选择的一个或多个序列中已导入突变的mRNA-肽融合体的附加轮次筛选，或通过用于重组抗体的体外亲和力成熟的其它方法，如上所述。这种方法的一个优选的实例，是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生本发明的抗体。在酵母展示方法中，使用遗传学方法将抗体结构域栓系到酵母细胞壁并在酵母表面上把它们显示出来。特别是，这种酵母可以用于展示从全套抗体或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域。可用于制造本发明抗体的酵母展示方法的实例包括公开于通过引用并入本文的美国专利号6,699,658（Wittrup等）的那些。
d. 重组GP73抗体的生产
本发明的抗体可以通过任何本领域已知的一些技术进行生产。例如，从宿主细胞表达，其中一个或多个编码重链和轻链的表达载体被通过标准技术转染入宿主细胞。各种形式的术语“转染”意在包括各种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，在真核细胞中表达抗体是优选的，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为这样的真核细胞（且特别是哺乳动物细胞）更可能比原核细胞装配和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）（包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 77: 4216-4220 (1980)），与DHFR选择性标记物一起使用，例如，如描述于Kaufmanand Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞，和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间生产所述抗体，所述时间足够允许抗体在宿主细胞中的表达，或者更优选地，抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
还可以使用宿主细胞产生功能性抗体片段，诸如Fab片段或scFv分子。应该理解的是，上述程序的变化是在本发明的范围之内。例如，可希望用编码本发明抗体的任一轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除对于结合目的抗原没有必要的一些或全部编码轻链和重链的任一个或两者的DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也被本发明的抗体包括。此外，可以通过标准化学交联方法将本发明的抗体交联到第二抗体产生双功能抗体，其中所述双功能抗体一条重链和一条轻链是本发明的抗体（即，结合人GP73）并且另一条重链和轻链特异性针对除人GP73之外的抗原。
在用于本发明的抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接到CMV增强子/ AdMLP启动子调节元件以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。选择的转化的宿主细胞进行培养，以允许抗体重和轻链的表达，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，和从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供合成本发明的重组抗体的方法，通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体被合成。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
(1) 人源化抗体
人源化抗体可以是抗体或其变体、其衍生物、其类似物或其部分，其免疫特异性地结合目的抗原，并且其包含基本上具有人抗体氨基酸序列的框架（FR）区和基本上具有非人抗体氨基酸序列的互补决定区（CDR）。人源化抗体可以是来自非人类物种的抗体分子，其与期望抗原结合，具有来自非人物种的一个或多个互补决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的框架区。
如本文所用，在CDR的上下文中，术语“基本上”指具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体基本上包含所有至少一个，并且典型地两个可变结构域（Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv），其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白（即，供体抗体）的那些CDR区，并且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。根据一个方面，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区（Fc），通常是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变区两者。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅包含人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅包含人源化的轻链和/或重链的可变结构域。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和 IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自超过一类或同种型的序列，并且特别是可以选择恒定结构域以使用本领域熟知的技术优化期望的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR区不需要精确对应亲本序列，例如供体抗体CDR，或者共有框架可以通过至少一个氨基酸残基的替换、插入和/或缺失进行突变，以便在该位点的CDR或框架残基不对应供体抗体或共有框架。但是，在一个实施方案中，这些突变不会是广泛的。通常，至少90%，优选至少95%，至少98%或至少99%的人源化抗体残基将对应亲本FR和CDR序列的那些残基。如本文所用，术语“共有框架”指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”指从在在相关免疫球蛋白序列家族中最经常发生的氨基酸（或核苷酸）形成的序列（参见，例如，Winnaker, From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)）。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置被在家族中该位置最经常出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸出现频率相同，则任一个都可以包括在共有序列中。
可以设计人源化抗体以最小化不希望的针对啮齿类抗人抗体的免疫应答，其限制人接受者中那些部分的治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可以在其中引入来自非人来源的一种或多种氨基酸残基。这些非人残基经常称为“输入”残基，其通常取自可变结构域。可以通过针对人抗体的相应序列替换高变区序列进行人源化。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体，其中大大少于完整人可变结构域已被来自非人物种的相应序列替换。例如，参见美国专利号4,816,567，其内容通过引用并入本文。人源化抗体可以是人抗体，其中一些高变区残基，和可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基所替换。本发明的抗体的人源化或改造可以使用任何已知方法进行，诸如，但不限于描述于美国专利号5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；和4,816,567。
人源化抗体可以保留对于GP73的高亲和力和其它有利的生物学性质。可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产品的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得的。阐释和展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许在候选免疫球蛋白序列发挥功能中残基的可能作用的分析，即影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。以这种方式，可以从接受者和输入序列选择并组合FR残基，以便获得所需抗体特征，诸如对GP73增加的亲和力。一般而言，高变区残基可以直接且最实质地参与影响抗原结合。
作为人源化的替代，可以生成人抗体（本文中也称为“完全人抗体”）。例如，有可能从经由PROfusion和/或酵母相关技术的文库分离人抗体。也可以产生转基因动物（例如小鼠，其能够在免疫后在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体完整全套抗体（repertoire））。例如，在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区（JH）基因的纯合性缺失导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击时产生人抗体。人源化或完全人抗体可以根据如下所述方法制备：美国专利号5770429；5,833,985；5,837,243；5,922,845；6,017,517；6,096,311；6,111,166；6,270,765；6,303,755；6,365,116；6,410,690；6,682,928；和6,984,720，其每个的内容通过引用并入本文。
3. 抗GP73抗体
可以使用上述技术产生抗GP73抗体。抗-GP73抗体可以是1B-3440 单克隆抗体、1B-4971 单克隆抗体、1B-3246 单克隆抗体、1B-4863 单克隆抗体、1A-3187 单克隆抗体、1A-4246 单克隆抗体或其抗体片段。
(1) 1B-3440
如本文所用，“1B-3440”或“mAb 1B-3440”指通过使用用重组GP73免疫的RBF/DnJ小鼠品系制备的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NS/ 0骨髓瘤细胞融合。
1B-3440结合到GP73上的表位，其与1B-4971、1B-3246、1B-4863、1A-3187和1A-4246结合的表位不同。1B-3440识别SEQ ID NO：67的表位肽。1B-3440对于GP73具有9.1 x10-11 M的结合亲和力（KD）。1B-3440具有SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：49的核苷酸序列编码，和SEQ ID NO：5的轻链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：53的核苷酸序列编码。1B-3440包括CDR-H1（SEQ ID NO：2）、CDR-H2（SEQ ID NO：3）和CDR-H3（SEQ ID NO：4）和CDR-L1（SEQ ID NO：6）、CDR -L2（SEQ ID NO：7）和CDR-L3（SEQ ID NO：8），其分别由SEQID NO：50-52和54-56的核苷酸序列编码。
(2) 1B-4971
如本文所用，“1B-4971”或“mAb 1B-4971”指通过使用用重组GP73免疫的RBF/DnJ小鼠品系制备的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NS/ 0骨髓瘤细胞融合。
1B-4971结合到GP73上的表位，其与1B-3440、1B-3246、1B-4863、1A-3187和1A-4246结合的表位不同。1B-4971识别SEQ ID NO：65的表位肽。1B-4971对于GP73具有2.0 x10-12 M的结合亲和力（KD）。1B-4971具有SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：57的核苷酸序列编码，和SEQ ID NO：13的轻链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：61的核苷酸序列编码。1B-3440包括CDR-H1（SEQ ID NO：10）、CDR-H2（SEQ ID NO：11）和CDR-H3（SEQ IDNO：12）和CDR-L1（SEQ ID NO：14）、CDR -L2（SEQ ID NO：15）和CDR-L3（SEQ ID NO：16），其分别由SEQ ID NO：58-60和62-64的核苷酸序列编码。
(3) 1B-3246
如本文所用，“1B-3246”或“mAb 1B-3246”指通过使用用重组GP73免疫的RBF/DnJ小鼠品系制备的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NS/ 0骨髓瘤细胞融合。
1B-3246结合到GP73上的表位，其与1B-3440、1B-4971、1B-4863、1A-3187和1A-4246结合的表位不同。1B-3246识别SEQ ID NO：66的表位肽。1B-3246对于GP73具有7.9 x10-11 M的结合亲和力（KD）。1B-3246具有SEQ ID NO：17的重链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：65的核苷酸序列编码，和SEQ ID NO：21的轻链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：69的核苷酸序列编码。1B-3246包括CDR-H1（SEQ ID NO：18）、CDR-H2（SEQ ID NO：19）和CDR-H3（SEQ IDNO：20）和CDR-L1（SEQ ID NO：22）、CDR -L2（SEQ ID NO：23）和CDR-L3（SEQ ID NO：24），其分别由SEQ ID NO：66-68和70-72的核苷酸序列编码。
(4) 1B-4863
如本文所用，“1B-4863”或“mAb 1B-4863”指通过使用用重组GP73免疫的RBF/DnJ小鼠品系制备的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NS/ 0骨髓瘤细胞融合。
1B-4863结合到GP73上的表位，其与1B-3440、1B-4971、1B-3246、1A-3187和1A-4246结合的表位不同。1B-4863对于GP73具有1.2 x 10-10 M的结合亲和力（KD）。1B-4863具有SEQ ID NO：25的重链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：73的核苷酸序列编码，和SEQ ID NO：29的轻链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：77的核苷酸序列编码。1B-4863包括CDR-H1（SEQ IDNO：26）、CDR-H2（SEQ ID NO：27）和CDR-H3（SEQ ID NO：28）和CDR-L1（SEQ ID NO：30）、CDR -L2（SEQ ID NO：31）和CDR-L3（SEQ ID NO：32），其分别由SEQ ID NO：74-76和78-80的核苷酸序列编码。
(5) 1A-3187
如本文所用，“1A-3187”或“mAb 1A-3187”指通过使用用重组GP73免疫的CAF1/J小鼠品系制备的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NS/ 0骨髓瘤细胞融合。
1A-3187结合到GP73上的表位，其与1B-3440、1B-4971、1B-3246、1B-4863和1A-4246结合的表位不同。1A-3187识别SEQ ID NO：68的表位肽。1A-3187对于GP73具有2.0 x10-9 M的结合亲和力（KD）。1A-3187具有SEQ ID NO：33的重链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：81的核苷酸序列编码，和SEQ ID NO：37的轻链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：85的核苷酸序列编码。1A-3187包括CDR-H1（SEQ ID NO：34）、CDR-H2（SEQ ID NO：35）和CDR-H3（SEQ IDNO：36）和CDR-L1（SEQ ID NO：38）、CDR -L2（SEQ ID NO：39）和CDR-L3（SEQ ID NO：40），其分别由SEQ ID NO：82-84和86-88的核苷酸序列编码。
(6) 1A-4246
如本文所用，“1A-4246”或“mAb 1A-4246”指通过使用用重组GP73免疫的CAF1/J小鼠品系制备的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NS/ 0骨髓瘤细胞融合。
1A-4246结合到GP73上的表位，其与1B-3440、1B-4971、1B-3246、1B-4863和1A-3187结合的表位不同。1A-4246识别SEQ ID NO：67的表位肽。1A-4246对于GP73具有3.8 x10-9 M的结合亲和力（KD）。1A-4246具有SEQ ID NO：41的重链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：89的核苷酸序列编码，和SEQ ID NO：45的轻链氨基酸序列，其由SEQ ID NO：93的核苷酸序列编码。1A-4246包括CDR-H1（SEQ ID NO：42）、CDR-H2（SEQ ID NO：43）和CDR-H3（SEQ IDNO：44）和CDR-L1（SEQ ID NO：46）、CDR -L2（SEQ ID NO：47）和CDR-L3（SEQ ID NO：48），其分别由SEQ ID NO：90-92和94-96的核苷酸序列编码。
3. 药物组合物
所述抗体可以是药物组合物的组分。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。包含本发明的抗体的药物组合物用于，但不限于，诊断、检测或监控病症，用于预防、治疗、处置或减轻病症或其一种或多种症状，和/或用于研究。在一个具体的实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种抗体。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含本发明的一种或多种抗体和本发明的抗体之外的一种或多种预防或治疗剂，用于治疗其中被靶向的GP73的活性是有害的病症。在进一步的实施方案中，预防或治疗剂已知可用于，或已经用于或目前正在用于预防、治疗、处置或减轻病症，或其一种或多种症状。在根据这些实施方案，所述组合物可以进一步包含载体，稀释剂或赋形剂。
本发明的抗体可以掺入适合用于施用给对象的药物组合物。典型地，所述药物组合物包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学可接受的载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例包括一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇（诸如甘露醇、山梨醇）或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂、或缓冲剂，其增强抗体的保质期或效力。
各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的一种或多种抗体或本发明的一种或多种抗体的组合和可用于预防、处置、治疗或减轻病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂，例如，包封在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的内吞作用（参见，例如，Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)）、作为逆转录病毒或其它载体的部分的核酸的构建，等等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括，但不限于，肠胃外施用（例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下），硬膜外施用，肿瘤内施用，和粘膜施用（例如，鼻内和口服途径）。此外，可以采用肺施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和与雾化剂一起配制。参见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244；WO97/32572；WO97/44013；WO98/31346；和WO99/66903，其每个通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，本发明的抗体或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.）施用。在一个具体的实施方案中，本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、口服、鼻内、肺、或皮下施用。所述预防或治疗剂可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤内层吸收（例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜等），并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
在一个具体的实施方案中，可能期望将本发明的抗体局部施用到需要治疗的区域；这可通过以下方式实现，例如，而不限于，局部输注，通过注射，或通过植入物的方式，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，诸如硅橡胶膜、聚合物、纤维基质（例如，Tissuel®）、或胶原基质。在一个实施方案中，将有效量本发明的一种或多种抗体局部施用到对象患处以预防、治疗、处置，和/或减轻病症或其症状。
在另一个实施方案中，抗体可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵实现受控或持续释放（参见Langer, supra；Sefton, 1987, CRC Crit.Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald 等, 1980, Surgery 88:507；Saudek 等, 1989, N.Engl. J. Med. 321:574）。在另一个实施方案中，可使用聚合材料来实现本发明治疗剂的受控或持续的释放(参见，例如Medical Applications of Controlled Release, Langerand Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled DrugBioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.),Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev.Macromol. Chem. 23:61；还参见Levy 等, 1985, Science 228:190；During 等, 1989,Ann. Neurol. 25:351；Howard 等, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号 WO99/15154；和PCT公开号 WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括，但不限于，聚（2-羟基乙基甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸）、聚（乙烯乙酸乙烯酯）共聚物、聚（甲基丙烯酸）、聚乙醇酸交酯（PLG）、聚酐类、聚（N-乙烯基吡咯烷酮）、聚（乙烯醇）、聚丙烯酰胺、聚（乙二醇）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚原酸酯。在具体实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的，不含可浸出的杂质，贮藏稳定，无菌和生物可降解的。在又另一个实施方案中，受控或持续释放系统可以放置在预防或治疗靶的附近，从而仅需要全身剂量的一部分（参见，例如，Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp.115-138 (1984)）。
受控的释放系统在Langer (1990, Science 249:1527-1533)的综述中讨论。任何本领域技术人员已知的技术都可以用于生产包含本发明的一种或多种抗体的持续释放制剂。参见，例如美国专利号4,526, 938；PCT公开WO91/05548；PCT公开WO96/20698；Ning 等,1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer XenograftUsing a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189；Song 等,1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDAJournal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleek 等, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for CardiovascularApplication," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；和Lam等, 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibodyfor Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760，其每个通过引用以其整体并入本文。
在具体的实施方案中，当本发明的组合物是编码抗体的核酸时，所述核酸可以体内施用以促进其编码的抗体的表达，通过构建其作为合适的核酸表达载体的一部分并施用它使之变成细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体（见美国专利号4,980,286），或者通过直接注射，或通过使用微粒轰击（例如，基因枪；Biolistic, Dupont），或包被有脂质或细胞表面受体或转染试剂，或将其与已知进入核的同源异型框样肽连锁施用（参见，例如，Joliot 等, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868）。可选地，核酸可以引入细胞内并通过同源重组掺入宿主细胞DNA内表达。
本发明的药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、口服、鼻内（例如，吸入）、经皮（例如，局部），经粘膜和直肠施用。在具体的实施方案中，依照常规程序将组合物配制作为适用于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内或局部施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉施用的组合物是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。在必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。
如果本发明的组合物是局部施用，则所述组合物可以配制为软膏、霜剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液的形式或本领域技术人员熟知的其它形式。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)。对于非喷雾的局部剂型，通常使用包含载体或一种或多种与局部应用相容的赋形剂并具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、油膏等，它们是，如果需要的话，灭菌的或与助剂（例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐）混合的，为了影响各种性质，诸如，例如，渗透压。其它合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，例如与固体或液体惰性载体组合，包装在与加压挥发物（例如，气体推进剂，诸如氟利昂）的混合物中或包装在挤瓶中。如果需要的话，也可以将增湿剂或湿润剂加到药物组合物和剂型中。这些额外成分的实例是本领域熟知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可以配制为气溶胶形式，喷雾剂，雾，或滴剂形式。特别是，根据本发明使用的预防或治疗剂可以方便地以气溶胶喷雾的形式从加压包装或喷雾器递送，并使用合适的抛射剂（例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体）。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒（例如，由明胶构成）可配制成含有化合物的粉末混合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉。
如果本发明的方法包括口服施用，组合物可以口服地以片剂、胶囊剂、扁囊剂、软胶囊、溶液、悬浮液等的形式配制。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学上可接受的赋形剂制备，所述赋形剂诸如粘合剂（例如，预胶化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，或羟丙基甲基纤维素）；填料（例如，乳糖，微晶纤维素，或磷酸氢钙）；润滑剂（例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅）；崩解剂（例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙醇酸钠）；或润湿剂（例如，月桂基硫酸钠）。片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。口服施用的液体制剂可以采取但不限于下列形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其它适合的媒介物重构。可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备这种液体制剂，所述添加剂诸如悬浮剂（例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪）；乳化剂（例如卵磷脂或阿拉伯胶）；非水载体（例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油）；和防腐剂（例如，甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸）。该制剂也可适当含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可适当地配制成用于一种或多种预防或治疗剂的缓慢释放，控释，或持续释放。
本发明的方法可以包括配制有雾化剂的组合物的经肺施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号6,019, 968；5,985, 320；5, 985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，其每个通过引用以其整体并入本文。在具体实施方案中，本发明的抗体和/或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术（Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.）施用。
本发明的方法可以包括施用配制用于通过注射肠胃外施用的组合物（例如，通过推注或连续输注）。用于注射的制剂可以以单位剂量形式（例如，在安瓿或多剂量容器中）与添加的防腐剂一起存在。组合物可以采取这样的形式，诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂诸如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物（例如，无菌无热原水）重构。本发明的方法可以另外包括配制为贮库制备物的组合物的施用。这种长效制剂可通过植入（例如，皮下或肌内）或通过肌内注射施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料配制（例如，作为在可接受的油中的乳剂）或离子交换树脂，或作为微溶衍生物（例如，作为微溶盐）。
本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，诸如那些衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的那些盐，诸如那些衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
通常，组合物的成分以单位剂型单独提供或混合在一起提供，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物在指示活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小袋中。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。当施用方式是通过注射时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得成分可以在施用前混合。
特别是，本发明还提供了本发明的一种或多种抗体或药物组合物包装在指示抗体的量的密封容器诸如安瓿或小袋中。在一个实施方案中，本发明的一种或多种抗体或药物组合物提供为在密封容器中的干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物，并可以重构（例如，用水或盐水）至合适浓度用于施用给对象。在一个实施方案中，本发明的一种或多种抗体或药物组合物提供为在密封容器中的干燥灭菌的冻干粉末，以至少5 mg的单位剂量，例如至少10mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35 mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg或至少100 mg。本发明的冻干抗体或药物组合物应贮存在2℃与8℃之间，在其原来的容器中，并且本发明的抗体或药物组合物应在重构后1周内施用，例如5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或1小时内。在替代实施方案中，本发明的一种或多种抗体或药物组合物以液体形式提供在指示该抗体的量和浓度的密封容器中。在进一步的实施方案中，所施用的组合物的液体形式在密封的容器中提供至少0.25 mg/ml，例如至少0.5 mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15 mg/ml、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应储存在2℃-8℃之间，在其原来的容器内。
本发明的抗体可以掺入适合用于胃肠外施用的药物组合物。在一个方面中，抗体将制备为包含0.1-250mg/ml抗体的注射液。注射液可以包含在燧石或琥珀色小瓶，安瓿或预填充注射器中的液体或冻干剂型。缓冲剂可以是L-组氨酸（1-50 mM），最佳地5-10 mM，在pH5.0-7.0（最佳地pH 6.0）。其它合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰溶液的张力，在0-300 mM（对于液体剂型最佳地150mM）的浓度。对于冻干剂型可以包括冷冻保护剂，主要是0-10％蔗糖（最佳0.5-1.0％）。其它合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可以包括填充剂，主要是1-10％甘露糖醇（最佳2-4％）。可以在液体和冻干剂型中使用稳定剂，主要是1-50 mM L-甲硫氨酸（最佳地5-10mM）。其它合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸，可以包括为0-0.05％聚山梨醇酯-80（最佳0.005-0.01％）。额外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。包含本发明抗体的药物组合物，其制备为用于胃肠外给药的注射液，可以进一步包含用作佐剂的试剂，诸如那些用于增加抗体的吸收或分散的试剂。特别有用的佐剂是透明质酸酶，诸如Hylenex®（重组人透明质酸酶）。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善在肠胃外施用特别是皮下施用后的人生物利用度。其也允许更大的注射部位体积（即大于1ml）并具有较少疼痛和不适，以及最小化的注射部位反应发生率。（参见国际申请公开号WO04/078140和美国专利申请公开号US2006104968，其通过引用并入本文。）。
本发明的组合物可以是各种形式。这些包括例如，液体，半固体和固体剂型，诸如液体溶液（例如，可注射和可输注溶液），分散体或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期方式。组合物可以是可注射或可输注的溶液形式，诸如类似于那些用于人用其它抗体被动免疫的组合物。在一个实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射施用。在另一个实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射施用。
在制造和储存的条件下，治疗组合物通常必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液，微乳剂，分散体，脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。如需要，可通过将所需量的活性化合物（即，本发明的结合蛋白，例如，抗体）在适当的溶剂中掺入以上列举的一种成分或成分的组合，随后过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自那些上述列举的所需的其它成分的无菌媒介物来制备分散体。在无菌冻干粉末的情况下，对于无菌注射液的制备，制备方法包括真空干燥和喷雾干燥，其获得来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。可以保持溶液适当的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持所要求的粒径和通过使用表面活性剂。注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来实现。
本发明的抗体可以通过本领域已知的各种方法施用。对于许多治疗应用，施用途径/模式可以是皮下注射，静脉内注射或输注。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据所期望的结果而变化。在某些实施方案中，所述活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，诸如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的很多方法是专利保护的或对于本领域技术人员是普遍知晓的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
在某些实施方案中，本发明的抗体可以口服施用，例如，与惰性稀释剂或可同化的食用载体一起。所述抗体（和其它成分，如果需要的话）也可以包装入硬或软壳明胶胶囊，压制成片剂，或直接掺入对象的饮食。对于口服治疗施用，所述抗体可与赋形剂掺合并以可摄食的片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸等形式使用。为了通过除肠胃外施用之外施用本发明的抗体，可能需要用防止其失活的材料涂敷抗体或与防止其失活的材料一起共施用所述抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体连接到本领域已知的半衰期延长媒介物。此种媒介物包括但不限于，Fc结构域，聚乙二醇，和葡聚糖。此种媒介物描述于，例如，美国申请序列号09/428,082和公开的PCT申请号WO99/25044，其为任何目的通过引用并入本文。
在具体的实施方案中，包含编码本发明抗体的核苷酸序列的核酸序列通过基因疗法的方式被施用，以治疗、预防、处置或减轻病症或其一种或多种症状。基因治疗是指通过对对象施用表达的或可表达的核酸进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的介导预防或治疗作用的本发明抗体。
本领域中可获得的任何一种用于基因治疗的方法都可根据本发明进行使用。对于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel 等, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol.Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926- 932 (1993)；和Morgan andAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215。重组DNA技术的领域通常已知的可以使用的方法描述于Ausubel 等 (eds.), CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；和Kriegler, GeneTransfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)。基因治疗的各种方法的详细描述公开于US20050042664 A1，其通过引用并入本文。
本发明的抗体可单独使用或组合使用以治疗与肝脏疾病和/或癌症相关联的疾病或状况，或与GP73相关联的任何其它疾病或状况。还应该理解的是，组合是可用于其预期目的的那些组合。
所述药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体。“治疗有效量”是指在需要的剂量和时间阶段，有效实现所需要的治疗效果的量。抗体的治疗有效量可以由本领域技术人员确定，并可以根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述抗体激发个体中所需应答的能力而改变。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益作用超出所述抗体的任何毒性或有害作用，如果有的话。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间阶段，有效获得需要的预防效果的量。通常，由于预防剂量是用在疾病之前或在疾病的较早阶段用于对象，所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答（例如，治疗或预防应答）。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开剂量，或可以如治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物对象的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生与所需的药物载体组合产生所需的治疗效果的活性化合物的预定量。对于剂量单位形式的说明是由（a）活性化合物的独特性质和要实现的特定的治疗或预防效果，以及（b）在配制此类活性化合物用于个体中敏感度治疗的领域中固有的限制决定的，并直接取决于其。
对于抗体的治疗性或预防性有效量的示例性、非限制性的范围是0.1-200 mg/kg，例如0.1-10 mg/kg的剂量。抗体的治疗性或预防性有效的量可以是1-200 mg/kg、10-200mg/kg、20-200 mg/kg、50-200 mg/kg、75-200 mg/kg、100-200 mg/kg、150-200 mg/kg、50-100 mg/kg、5-10 mg/kg或1-10 mg/kg。应该指出的是，剂量值可根据待减轻的病症的类型和严重程度而有所不同。此外，抗体剂量可以由本领域技术人员确定，并可以根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述抗体激发个体中所需应答的能力而改变。所述剂量还是这样的量，其中治疗有益作用超出所述抗体的任何毒性或有害作用，如果有的话。但是应当进一步理解，对于任何特定对象，具体的剂量方案应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的并不打算限制所要求保护的组合物的范围或实践。
4. GP73检测
本发明还涉及使用结合不同的GP73或岩藻糖基化GP73表位的上述GP73抗体检测和测量来自对象样品中GP73或岩藻糖基化的GP73的方法。所述方法包括：（a）从对象获得生物样品，（b）使所述生物样品与捕获抗体接触，所述捕获抗体结合GP73（或GP73片段）或岩藻糖基化GP73（或岩藻糖基化GP73片段）上的表位，以形成捕获抗体-GP73抗原复合物，（c）使所述捕获抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物与检测抗体接触，所述检测抗体包括可检测的标记物并结合GP73或岩藻糖基化GP73上未被捕获抗体结合的表位，以形成捕获抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-检测抗体，以及（d）基于通过在捕获抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-检测抗体复合物中可检测标记物所产生的信号，确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的存在、量或浓度。
本发明还涉及使用上述GP73抗体检测和测量样品中岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73的方法。GP73抗体的结合可以是或可以不是对GP73的岩藻糖基化敏感的。所述方法包括（a）使所述测试样品与至少一种捕获结合蛋白接触，其中所述捕获结合蛋白结合GP73的区域（或GP73的片段）或岩藻糖基化GP73（或岩藻糖基化GP73的片段）以形成捕获结合蛋白-GP73或岩藻糖基化GP73复合物；（b）使所述捕获结合蛋白-GP73或岩藻糖基化GP73复合物与至少一种包含可检测标记物的检测结合蛋白接触，其中所述检测结合蛋白结合GP73或岩藻糖基化GP73上不被捕获结合蛋白结合的区域并形成捕获结合蛋白-GP73或岩藻糖基化GP73-检测结合蛋白复合物；和（c）基于在（b）中形成的捕获结合蛋白-GP73或岩藻糖基化GP73-检测结合蛋白复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度。所述捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73或岩藻糖基化GP73的结合对GP73或岩藻糖基化GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的，并且所述检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73或岩藻糖基化GP73的结合对GP73或岩藻糖基化GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的。可选地，所述捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73或岩藻糖基化GP73的结合对GP73或岩藻糖基化GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的，并且所述检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与GP73或岩藻糖基化GP73的结合对GP73或岩藻糖基化GP73上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的。
本发明还涉及一种方法，其用于基于来自对象的样品中GP73（或GP73片段）水平或岩藻糖基化GP73（或岩藻糖基化GP73片段）水平来诊断对象中的疾病。该方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，（d）如果生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平大于GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，则鉴定对象患有疾病，以及（e）对鉴定为具有疾病的对象施用治疗方案。
可以检测到生物样品中GP73（或GP73片段）或岩藻糖基化GP73（或岩藻糖基化GP73片段）水平为至少0.05 ng/mL、0.06 ng/mL、0.07 ng/mL、0.08 ng/mL、0.09 ng/mL、0.10ng/mL、0.11 ng/mL、0.12 ng/mL、0.13 ng/mL、0.14 ng/mL、0.15 ng/mL、0.16 ng/mL、0.17ng/mL、0.18 ng/mL、0.19 ng/mL、0.20 ng/mL、0.25 ng/mL、0.30 ng/mL、0.35 ng/mL、0.40ng/mL、0.45 ng/mL、0.50 ng/mL、0.55 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20ng/mL、21 ng/mL、22 ng/mL、23 ng/mL、24 ng/mL、25 ng/mL、26 ng/mL、27 ng/mL、28 ng/mL、29 ng/mL或30 ng/mL。
GP73或岩藻糖基化GP73检测的范围相比其它可商购获得的GP73或岩藻糖基化GP73免疫测定具有至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、400%或500%改善的范围大小。
可以检测范围约0 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.05 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.06ng/mL 至约30 ng/mL、约0.07 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.08 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.09ng/mL 至约30 ng/mL、约0.095 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.10 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.105 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.11 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.12 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.13 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.14 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.15 ng/mL 至约30 ng/mL、约0.20 ng/mL 至约30 ng/mL、约1.00 ng/mL 至约30、约0 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.05 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.06 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.07 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.08 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.09 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.095 ng/mL 至约27.5ng/mL、0.10 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.105 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.11 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.12 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.13 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.14 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.15 ng/mL 至约27.5 ng/mL、0.20 ng/mL 至约27.5 ng/mL、1.00 ng/mL至约27.5 ng/mL、约0 ng/mL 至约26 ng/mL、约0.05 ng/mL 至约26 ng/mL、0.06 ng/mL 至约26 ng/mL、0.07 ng/mL 至约26 ng/mL、0.08 ng/mL 至约26 ng/mL、0.09 ng/mL 至约26ng/mL、0.095 ng/mL 至约26 ng/mL、0.10 ng/mL 至约26 ng/mL、0.105 ng/mL 至约26 ng/mL、0.11 ng/mL 至约26 ng/mL、 0.12 ng/mL 至约26 ng/mL、0.13 ng/mL 至约26 ng/mL、0.14 ng/mL 至约26 ng/mL、0.15 ng/mL 至约26 ng/mL、0.20 ng/mL 至约26 ng/mL、1.00ng/mL 至约26 ng/mL、约0 ng/mL 至约25 ng/mL、0.05 ng/mL 至约25 ng/mL、0.06 ng/mL至约25 ng/mL、0.07 ng/mL 至约25 ng/mL、0.08 ng/mL 至约25 ng/mL、0.09 ng/mL 至约25 ng/mL、0.095 ng/mL 至约25 ng/mL、0.10 ng/mL 至约25 ng/mL、0.105 ng/mL 至约25ng/mL、0.11 ng/mL 至约25 ng/mL、0.12 ng/mL 至约25 ng/mL、0.13 ng/mL 至约25 ng/mL、0.14 ng/mL 至约25 ng/mL、0.15 ng/mL 至约25 ng/mL、0.20 ng/mL 至约25 ng/mL、1.00 ng/mL 至约25 ng/mL、约0 ng/mL 至约24 ng/mL、0.05 ng/mL 至约24 ng/mL、0.06ng/mL 至约24 ng/mL、0.07 ng/mL 至约24 ng/mL、0.08 ng/mL 至约24 ng/mL、0.09 ng/mL至约24 ng/mL、0.095 ng/mL 至约24 ng/mL、0.10 ng/mL 至约24 ng/mL、0.105 ng/mL 至约24 ng/mL、0.11 ng/mL 至约24 ng/mL、0.12 ng/mL 至约24 ng/mL、0.13 ng/mL 至约24ng/mL、0.14 ng/mL 至约24 ng/mL、0.15 ng/mL 至约24 ng/mL、0.20 ng/mL 至约24 ng/mL、1.00 ng/mL 至约24 ng/mL、约0 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.05 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.06 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.07 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.08 ng/mL 至约22.5ng/mL、0.09 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.095 0 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.10 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.105 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.11 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.12 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.13 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.14 ng/mL 至约22.5 ng/mL、0.15 ng/mL至约22.5 ng/mL、0.20 ng/mL 至约22.5 ng/mL、1.00 ng/mL 至约22.5 ng/Ml、约0 ng/mL至约20 ng/mL、0.05 ng/mL 至约20 ng/mL、0.06 ng/mL 至约20 ng/mL、0.07 ng/mL 至约20 ng/mL、0.08 ng/mL 至约20 ng/mL、0.09 ng/mL 至约20 ng/mL、0.095 ng/mL 至约20ng/mL、0.10 ng/mL 至约20 ng/mL、0.105 ng/mL 至约20 ng/mL、0.11 ng/mL 至约20 ng/mL、0.12 ng/mL 至约20 ng/mL、0.13 ng/mL 至约20 ng/mL、0.14 ng/mL 至约20 ng/mL、0.15 ng/mL 至约20 ng/mL、0.20 ng/mL 至约20 ng/mL、1.00 ng/mL 至约20 ng/mL、约0ng/mL 至约15 ng/mL、0.05 ng/mL 至约15 ng/mL、0.06 ng/mL 至约15 ng/mL、0.07 ng/mL至约15 ng/mL、0.08 ng/mL 至约15 ng/mL、0.09 ng/mL 至约15 ng/mL、0.095 ng/mL 至约15 ng/mL、0.10 ng/mL 至约15 ng/mL、0.105 ng/mL 至约15 ng/mL、0.11 ng/mL 至约15ng/mL、0.12 ng/mL 至约15 ng/mL、0.13 ng/mL 至约15 ng/mL、0.14 ng/mL 至约15 ng/mL、0.15 ng/mL 至约15 ng/mL、0.20 ng/mL 至约15 ng/mL或1.00 ng/mL 至约15 ng/mL的GP73或岩藻糖基化的GP73。
a. 免疫测定
GP73和岩藻糖基化GP73，和/或其肽或其片段，即，GP73和岩藻糖基化GP73的片段，可以在免疫测定中使用上述抗体来分析。GP73和岩藻糖基化GP73的存在或量可以通过使用抗体和检测特异性结合GP73或岩藻糖基化GP73来确定。例如，所述抗体，或其抗体片段，可以特异性结合GP73或岩藻糖基化GP73。如果需要，一种或多种抗体可以与一种或多种可商购获得的单克隆/多克隆抗体组合使用。这些抗体可获得自公司，诸如R&D Systems, Inc.(Minneapolis, MN) 和Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting,PA)。
在机体样品中GP73或岩藻糖基化GP73的存在或量可使用免疫测定容易地测定，诸如夹心免疫测定（例如，单克隆-多克隆夹心免疫测定，包括放射性同位素检测（放射免疫测定（RIA））和酶检测（酶免疫测定（EIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA）（例如，QuantikineELISA测定，R&D Systems, Minneapolis, MN)）。化学发光微粒免疫测定，特别是采用ARCHITECT®自动化分析仪（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）的化学发光微粒免疫测定，是优选的免疫测定的实例。其它方法包括，例如，质谱法和免疫组化（例如，使用来自组织活检的切片）使用GP73抗体（单克隆的，多克隆的，嵌合的，人源化的，人的等）或其针对GP73的抗体片段。其它检测方法包括描述于下列的那些，例如美国专利号6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792，其每个通过引用以其整体并入本文。抗体对GP73的特异性免疫结合可以经由连接到抗体的直接标记物，诸如荧光或发光标签，金属和放射性核素，或经由间接标记物，诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行检测。
固定化的抗体或其抗体片段的使用可掺入到免疫测定中。抗体可以固定化到各种载体，诸如磁性或层析基质颗粒，测定板的表面（诸如微滴定孔），固体基底材料片等。测定条带可以通过在固体支持物上的阵列中包被抗体或多种抗体来制备。此条带然后可以浸入测试生物样品，并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量的信号，诸如有色斑点。
可以使用异质形式。例如，从对象获得所述测试样品后，制备第一混合物。该混合物包含被评估GP73或岩藻糖基化GP73的测试样品和第一特异性结合配偶体，其中所述第一特异性结合配偶体和包含在测试样品中的任何GP73或岩藻糖基化GP73形成第一特异性结合配偶体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物。第一特异性结合配偶可以是抗GP73抗体，其结合具有包含SEQ ID NO：97中至少三个连续（3）氨基酸的氨基酸序列的表位。添加测试样品和第一特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不关键。第一特异性结合配偶可以固定在固相上。在免疫测定中使用的固相（用于第一特异性结合配偶体和任选地第二特异性结合配偶体）可以是本领域中已知的任何固相，诸如但不限于，磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘和芯片。
形成包含第一特异性结合配偶体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物的混合物后，使用本领域已知的任何技术从复合物去除任何未结合GP73或岩藻糖基化GP73。例如，未结合的GP73或岩藻糖基化GP73可通过洗涤去除。但是，理想的是，第一特异性结合配偶体存在量超过测试样品中存在的任何GP73或岩藻糖基化GP73，使得存在于测试样品中所有GP73或岩藻糖基化GP73被第一特异性结合配偶体结合。
任何未结合GP73或岩藻糖基化GP73被去除之后，将第二特异性结合配偶体加入混合物以形成第一特异性结合配偶体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-第二特异性结合配偶体复合物。第二特异性结合配偶可以是抗GP73或岩藻糖基化GP73抗体，其结合具有包含SEQID NO：33中至少三个连续（3）氨基酸的氨基酸序列的表位。此外，第二特异性结合配偶体标记有或含有可检测标记物，如上所述。
固定化的抗体或其抗体片段的使用可掺入到免疫测定中。抗体可以固定化到各种支持物，诸如磁性或层析基质颗粒，测定板的表面（诸如微滴定孔），固体基底材料片等。测定条带可以通过在固体支持物上的阵列中包被抗体或多种抗体来制备。此条带然后可以浸入测试生物样品，并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量的信号，诸如有色斑点。
(1) 夹心ELISA
夹心ELISA测量两层抗体（即，至少一种捕获抗体）和检测抗体（即至少一种检测抗体）之间的抗原的量。捕获抗体和检测抗体结合抗原（例如，GP73或岩藻糖基化GP73）上的不同表位。期望地，捕获抗体与表位的结合不会干扰检测抗体与表位的结合。单克隆或多克隆抗体任一均可以在夹心ELISA中用作捕获和检测抗体。
通常，利用至少两种抗体来分离和定量测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73。更具体而言，至少两种抗体结合GP73或岩藻糖基化GP73的特定表位，形成被称为“夹心”的免疫复合物。一种或多种抗体可以用于捕获测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73（这些抗体经常被称为“捕获”抗体或“捕获”抗体）并且一种或多种抗体被用于结合对于夹心的可检测的（即，可定量的）标记物（这些抗体经常被称为“检测”抗体或“检测”抗体）。在夹心测定中，抗体与其表位的结合期望未被测定中任何其它抗体对其相应表位的结合所消除。选择抗体使得与怀疑含有GP73或岩藻糖基化GP73的测试样品接触的一种或多种第一抗体不结合所有或部分被第二或后续抗体所识别的表位，由此干扰一种或多种第二检测抗体结合GP73或岩藻糖基化GP73的能力。
在所述免疫测定中所述抗体可用作第一抗体。所述抗体免疫特异性结合在GP73或岩藻糖基化GP73上的表位。除了本发明的抗体，所述免疫测定法还可包含免疫特异性结合到未被第一抗体识别或结合的表位的第二抗体。
怀疑含有GP73或岩藻糖基化GP73的测试样品可以与至少一种第一捕获抗体和至少一种第二检测抗体同时或顺序接触。在夹心测定形式中，怀疑含有GP73或岩藻糖基化GP73的测试样品首先与至少一个第一捕获抗体接触，所述抗体在允许形成第一抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物的条件下特异性结合到特定表位。如果使用多于一种捕获抗体，则形成第一多重捕获抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物。在夹心测定中，抗体，优选地，所述至少一种捕获抗体，以测试样品中预期的GP73或岩藻糖化GP73的最大量的摩尔过量的量使用。例如，可以使用每ml微粒包被缓冲液从约5 µg/ml至约1 mg/ml的抗体。
(a) 抗GP73捕获抗体
任选地，测试样品与所述至少一种第一捕获抗体接触之前，所述至少一种第一捕获抗体可以结合到固相支持物上，这便于从测试样品分离第一抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物。可以使用本领域中已知的任何固体支持物，包括但不限于，用聚合物材料做成的以孔、管、或珠形式的固体支持物。一种抗体（或多种抗体）可以通过吸附，通过使用化学偶联剂共价键合或通过本领域中已知的其它方式结合到固体支持物上，只要这种结合不干扰抗体结合GP73或岩藻糖基化GP73的能力。此外，如果需要的话，固体支持可以被衍生化，以允许与抗体上的各种官能团发生反应。这样衍生化要求使用某些偶联剂，诸如，但不限于，马来酸酐，N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺。
怀疑含有GP73或GP73或岩藻糖基化GP73的测试样品被孵育以允许形成第一捕获抗体（或多重抗体）-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物之后。可以在pH约4.5至约10.0，在温度为约2℃至约45℃进行孵育并且持续时期从至少约一（1）分钟至约十八（18 ）小时，约2-6分钟，或约3-4分钟。
(b) 检测抗体
形成第一/多重捕获抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物后，然后使该复合体与至少一种第二检测抗体接触（在允许形成第一/多重抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-第二抗体复合物的条件下）。如果第一抗体-GP73或岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物与多于一种检测抗体接触，则形成第一/多重捕获抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-多重抗体检测复合物。关于第一抗体，当所述至少第二（和随后的）抗体与第一抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物进行接触时，需要在类似于上述那些的条件下孵育一段时间，以形成第一/多重抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-第二/多重种抗体复合物。优选地，至少一种第二抗体包含可检测标记物。可检测标记物可以在形成第一/多重抗体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-第二/多重抗体复合物之前，同时或之后结合到至少一种第二抗体。可以使用任何本领域已知的可检测标记物。
化学发光测定可以按照Adamczyk 等, Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67(2006)中描述的方法来进行。虽然可以使用任何合适的测定形式，但是微孔板化学发光仪（Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, TN）使得能够快速测定小体积的多个样品。该化学发光仪可配备有多个试剂注射器，使用96孔黑色聚苯乙烯微孔板（Costar＃3792）。每个样本可以被添加到单独孔中，然后同时/顺序加入其它试剂，如通过所用类型的测定所确定的。理想的是，避免了在使用吖啶鎓芳基酯的中性或碱性溶液中假碱的形成，诸如通过酸化。然后逐孔记录化学发光响应。在这方面，对于记录化学发光响应的时间将部分地取决于试剂添加之间的延迟和所使用具体吖啶鎓。
添加测试样品和一种或多种特异性结合配偶体以形成混合物的顺序对于化学发光测定并不关键。如果第一特异性结合配偶体可检测地标记有吖啶鎓化合物，则形成可检测标记的第一特异性结合配偶体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原复合物。可选地，如果使用第二特异性结合配偶并且所述第二特异性结合配偶体可检测地标记有吖啶鎓化合物，则形成可检测标记的第一特异性结合配偶体-GP73或岩藻糖基化GP73抗原-第二特异性结合配偶物。任何未结合的特异性结合配偶体，无论是标记的或未标记，都可以使用本领域已知的任何技术，诸如洗涤从混合物中除去。
过氧化氢可以在混合物中原位产生，或在加入上述吖啶鎓化合物之前、同时或之后提供或供应给混合物。过氧化氢可以原位产生，以很多方式，如本领域技术人员将显而易见的。
可选地，可以简单地将过氧化氢来源加入到混合物中。例如，过氧化氢来源可以是已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲剂或其它溶液。在这方面，可以简单地加入过氧化氢溶液。
在向样品同时或随后加入至少一种碱性溶液之后，生成指示GP73或岩藻糖基化GP73存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液含有至少一种碱且pH值为大于或等于10，优选大于或等于12。碱性溶液的实例包括，但不限于，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。加入到样品的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。基于使用的碱性溶液的浓度，本领域的技术人员可以容易地确定添加到样品中碱性溶液的量。
可以使用本领域技术人员已知的那些常规技术来检测所生成的化学发光信号。基于生成的信号的强度，可以量化样品中GP73或岩藻糖基化GP73的量。具体地，样品中GP73的量正比于所产生的信号的强度。存在的GP73或岩藻糖化GP73的量可以通过比较产生的光的量与用于GP73或岩藻糖基化GP73的标准曲线或通过比较参考标准物来定量。可以使用已知浓度的GP73或岩藻糖基化GP73的连续稀释液或溶液通过质谱法，重量分析法，和本领域中已知的其它技术来产生标准曲线。
在采用ARCHITECT®（或它的后续产品）分析器的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH应为约6.0+/- 0.2，微粒包被缓冲液应维持在室温下（即在约17至约27℃），微粒包被缓冲液pH应为约6.5+/-0.2，并且微粒稀释剂pH应为约7.8+/-0.2。固体优选为少于约0.2％，诸如少于约0.15％，小于约0.14％，小于约0.13％，小于约0.12％，或少于约0.11％，例如约0.10％。
(2) 使用抗GP73抗体的方法
本发明涉及使用所公开的抗GP73抗体或其抗体片段来确定测试样品中GP73或GP73片段的存在、量或浓度的方法。所述方法包括以下步骤：（a）使测试样品与捕获抗体接触，所述捕获抗体结合GP73或GP73片段上的表位，使得形成捕获抗体-GP73或GP73片段抗原复合物；（b）使所述捕获抗体-GP73或GP73片段抗原复合物与至少一种检测抗体接触，所述检测抗体包括可检测的标记物并结合GP73或GP73片段上未被捕获抗体结合的表位，以形成捕获抗体-GP73或GP73片段抗原-检测抗体复合物；和（c）基于捕获抗体-GP73或GP73片段抗原-检测抗体复合物中可检测标记物生成的信号确定测试样品中GP73或GP73片段的存在、量或浓度，由此确定测试样品中GP73或GP73片段的存在、量或浓度。
所述捕获抗体和检测抗体可以是上述的抗GP73抗体。例如，所述捕获抗体可包括1A-4246抗体或下列结构域或区域：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的互补决定区（CDR）1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述检测抗体可包括1B-4863抗体或下列结构域或区域：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。
本发明涉及使用所公开的抗GP73抗体或其抗体片段来确定测试样品中岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的存在、量或浓度的方法。所述方法包括以下步骤：（a）使测试样品与捕获抗体接触，所述捕获抗体结合岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段上的表位，使得形成捕获抗体-岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段抗原复合物；（b）使所述捕获抗体-岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段抗原复合物与至少一种检测抗体接触，所述检测抗体包括可检测的标记物并结合岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段上未被捕获抗体结合的表位，以形成捕获抗体-岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段抗原-检测抗体复合物；以及（c）基于通过在捕获抗体-岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段抗原-检测抗体复合物中可检测标记物所产生的信号，确定测试样品中岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的存在、量或浓度,由此确定测试样品中岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的存在、量或浓度，其中所述捕获结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的结合对岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的，并且所述检测结合蛋白包括蛋白、抗体或抗体片段，其与岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的结合对岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段上岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的。
其与岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的结合对岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段上岩藻糖糖部分的存在或不存在是敏感的蛋白、抗体或抗体片段可包括：橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)或其片段；包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：33的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ IDNO:34的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:39的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。
其与岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的结合对岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段上的岩藻糖糖部分的存在或不存在是不敏感的蛋白、抗体或抗体片段可包含包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41的氨基酸序列的可变重结构域区；包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 21的氨基酸序列的可变轻结构域区；包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻结构域区；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ IDNO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；包含包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。
所述捕获抗体和检测抗体可以是上述的抗GP73抗体。例如，所述捕获抗体可包括1A-4246抗体或下列结构域或区域：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的互补决定区（CDR）1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ IDNO:4的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。所述检测抗体可包括1B-4863抗体或下列结构域或区域：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的可变重结构域；包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的可变轻结构域；包括SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的可变重结构域和包括SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的可变轻结构域；包含包括SEQID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链；包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链；或包含包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3的可变重链和包含包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3的可变轻链。
b. 对照
可能需要包括对照样品。对照样品可以同时与来自上述对象的样品进行分析。从对象样品获得的结果可以与从对照样品获得的结果进行比较。可以提供标准曲线，可用标准曲线与生物样品的测定结果进行比较。这样的标准曲线展示标志物水平作为测定单位的函数，即如果使用荧光标记物，则测定单位为荧光信号的强度。使用从多个供体采集的样品，对于正常健康组织中GP73或岩藻糖基化GP73的对照水平，以及对于从供体采集的组织中GP73或岩藻糖基化GP73的“处于风险中”的水平，可以提供标准曲线，所述供体可具有一种或多种上述特征。
因此，鉴于上述情况，提供了确定测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的存在，量或浓度的方法。所述方法包括：通过免疫测定法测定测试样品GP73或岩藻糖基化GP73，例如，采用结合GP73或岩藻糖基化GP73或或岩藻糖基化GP73上的表位的至少一种捕获抗体，和结合GP73或岩藻糖基化GP73上表位的至少一种检测抗体，所述检测抗体结合的表位不同于捕获抗体结合的表位，并且任选地包括可检测的标记物，并包括：比较作为测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的存在、量或浓度的直接或间接指示的由所述可检测标记物生成的信号和作为校准物中GP73或岩藻糖基化GP73的存在、量或浓度的直接或间接指示的生成的信号。校准物是任选的，并且优选地，是一系列校准物的部分，其中，系列中每种校准物与其它校准物的不同之处在于GP73或岩藻糖基化GP73的浓度。
5. 诊断、预后或评估治疗性/预防性治疗疗效的方法
方法可以进一步包括诊断、预后或评估从其获得测试样品的患者的治疗性/预防性治疗的疗效。如果所述方法还包括评估从其获得测试样品的患者的治疗性/预防性治疗的疗效，则根据提高疗效的需要，方法任选还包括，修饰所述患者的治疗性/预防性治疗。通过测量和检测GP73和岩藻糖基化GP73，所述方法允许更多的疾病被更准确的诊断和随后更成功地治疗，相对于其它可商购获得的GP73免疫测定法。所述方法可适于在自动化系统或半自动化系统中使用。
通常，预定水平可用作基准，针对其评估在测定测试样品GP73或岩藻糖基化GP73之后所获得的结果。通常，在进行这样的比较中，通过运行特定测定足够次数获得预定水平，并在适当条件下使得分析物的存在、量或浓度可以与疾病、病症或状况（例如，肝脏疾病或癌症）的特定阶段或终点或与特定适应症发生连锁或关联。通常情况下，获得参考对象（或对象群体）的测定的预定水平。测量的GP73可以包括其GP73片段、其降解产物，和/或其酶裂解产物。岩藻糖基化GP73可以包括其糖基化GP73片段、其降解产物，和/或其酶裂解产物。
特别是，关于用于监测疾病进展和/或治疗所采用的预定水平，GP73或GP73片段或岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段的量或浓度可以是“不变的”、“有利的”（或“有利地改变的”），或“不利的”（或“不利地改变的”）。“升高的”或“增加的”指的是测试样品中的量或浓度高于或大于一般或正常水平或范围（例如预定水平），或高于或大于另一个参考水平或范围（例如，较早的或基线样品）。术语“降低的”或“减少的”指的是测试样品中的量或浓度低于或小于一般或正常水平或范围（例如预定水平），或低于或小于另一个参考水平或范围（例如，较早的或基线样品）。术语“改变的”指的是测试样品中的量或浓度相对一般或正常水平或范围（例如预定水平），或相对于另一个参考水平或范围（例如，较早的或基线样品）改变（增加或减少）。
对于GP73或岩藻糖基化GP73的一般或正常水平或范围按照标准实践定义。当相比于一般或正常水平或范围，或参考水平或范围，存在不能由实验误差或样品差异解释的任何净变化时，可以认为已经发生所谓水平改变或改变。因此，在特定样品中测量的水平将与来自所谓的正常对象的类似样品中确定的水平或水平的范围进行比较。在这样的背景下，例如，“正常对象”是无可检测的疾病或病症的个体，并且“正常”（有时称为“对照”）患者或群体是表现出无可检测的疾病或病症的个体或群体。“明显正常的对象”是其中GP73或岩藻糖基化GP73或岩藻糖化GP73尚未或正在被评估的对象。当分析物通常为不可检测的（例如，正常水平是零，或在正常群体的从约百分之25至约75内），但在测试样品中被检测到，以及当分析物以高于正常水平存在于测试样品中时，分析物的水平被认为是“升高的”。因此，尤其是，本公开内容提供了筛选具有肝脏疾病或癌症，或在具有肝脏疾病或癌症的风险中的对象的方法。
a. 对具有疾病的对象提供诊断的方法
可以使用本文所述方法通过确定对象中的GP73或岩藻糖基GP73的水平对具有疾病的对象提供诊断。所述方法可以用于使用如上所述的抗GP73的抗体，或其抗体片段，来检测对象中的疾病。所述方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）使用抗GP73抗体或其抗体片段确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，（d）如果生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平大于GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，则鉴定对象患有疾病，以及（e）对鉴定为具有疾病的对象施用治疗方案。所述方法中使用的抗GP73抗体可以是1A-4246抗体和1B-4863抗体，或它们的抗体片段。
(1) 肝脏疾病
可以使用本文所述方法通过确定对象中的GP73或岩藻糖基GP73的水平对具有肝脏疾病的对象提供诊断。所述方法可以用于使用如上所述的抗GP73的抗体，或其抗体片段，来检测对象中的肝脏疾病。所述方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）使用抗GP73抗体或其抗体片段确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，（d）如果生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平大于GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，则鉴定对象患有肝脏疾病，以及（e）对鉴定为具有肝脏疾病的对象施用治疗方案。所述方法中使用的抗GP73抗体可以是1A-4246抗体和1B-4863抗体，或它们的抗体片段。
此方法中的参考水平可以是在具有肝脏疾病的患者中GP73或岩藻糖基化GP73的水平。GP73或岩藻糖基化的GP73在血清中高于或等于0.30 ng/mL、0.31 ng/mL、0.32 ng/mL、0.33 ng/mL、0.34 ng/mL、0.35 ng/mL、0.36 ng/mL、0.37 ng/mL、0.38 ng/mL、0.39 ng/mL、0.40 ng/mL、0.41 ng/mL、0.42 ng/mL、0.43 ng/mL、0.44 ng/mL、0.45 ng/mL、0.46 ng/mL、0.47 ng/mL、0.48 ng/mL、0.49 ng/mL、0.50 ng/mL、0.51 ng/mL、0.52 ng/mL、0.53 ng/mL、0.54 ng/mL、0.55 ng/mL、0.56 ng/mL、0.57 ng/mL、0.58 ng/mL、0.59 ng/mL、0.60 ng/mL、0.61 ng/mL、0.62 ng/mL、0.63 ng/mL、0.64 ng/mL、0.65 ng/mL、0.66 ng/mL、0.67 ng/mL、0.68 ng/mL、0.69 ng/mL、0.70 ng/mL、0.71 ng/mL、0.72 ng/mL、0.73 ng/mL、0.74 ng/mL、0.75 ng/mL、0.76 ng/mL、0.77 ng/mL、0.78 ng/mL、0.79 ng/mL、0.80 ng/mL、0.81 ng/mL、0.82 ng/mL、0.83 ng/mL、0.84 ng/mL、0.85 ng/mL、0.86 ng/mL、0.87 ng/mL、0.88 ng/mL、0.89 ng/mL、0.90 ng/mL、0.91 ng/mL、或0.92 ng/mL的水平鉴定所述对象为具有肝脏疾病。
(a) 肝硬化
可以使用本文所述方法通过确定对象中的GP73或岩藻糖基GP73的水平对具有肝硬化的对象提供诊断。所述方法可以用于使用如上所述的抗GP73的抗体，或其抗体片段，来检测对象中的肝硬化。所述方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）使用抗GP73抗体或其抗体片段确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，（d）如果生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平大于GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，则鉴定对象患有肝硬化，以及（e）对鉴定为具有肝硬化的对象施用治疗方案。所述方法中使用的抗GP73抗体可以是1A-4246抗体和1B-4863抗体，或它们的抗体片段。
此方法中的参考水平可以是在具有肝硬化的患者中GP73或岩藻糖基化GP73的水平。GP73或岩藻糖基化的GP73在血清中高于或等于0.68 ng/mL、0.69 ng/mL、0.70 ng/mL、0.71 ng/mL、0.72 ng/mL、0.73 ng/mL、0.74 ng/mL、0.75 ng/mL、0.76 ng/mL、0.77 ng/mL、0.78 ng/mL、0.79 ng/mL、0.80 ng/mL、0.81 ng/mL、0.82 ng/mL、0.83 ng/mL、0.84 ng/mL、0.85 ng/mL、0.86 ng/mL、0.87 ng/mL、0.88 ng/mL、0.89 ng/mL、0.90 ng/mL、0.91 ng/mL、或0.92 ng/mL的水平鉴定所述对象为具有肝硬化。
(b) 肝癌
可以使用本文所述方法通过确定对象中的GP73或岩藻糖基GP73的水平对具有肝癌的对象提供诊断。所述方法可以用于使用如上所述的抗GP73的抗体，或其抗体片段，来检测对象中的肝癌。所述方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）使用上述抗GP73抗体或其抗体片段确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，（d）如果生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平大于GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，则鉴定对象患有肝癌，以及（e）对鉴定为具有肝癌的对象施用治疗方案。所述方法中使用的抗GP73抗体可以是1A-4246抗体和1B-4863抗体，或它们的抗体片段。
此方法中的参考水平可以是在具有肝癌的患者中GP73或岩藻糖基化GP73的水平。GP73或岩藻糖基化的GP73在血清中高于或等于0.30 ng/mL、0.31 ng/mL、0.32 ng/mL、0.33ng/mL、0.34 ng/mL、0.35 ng/mL、0.36 ng/mL、0.37 ng/mL、0.38 ng/mL、0.39 ng/mL、0.40ng/mL、0.45 ng/mL、0.50 ng/mL、0.55 ng/mL、0.58 ng/mL、0.59 ng/mL、0.60 ng/mL、0.61ng/mL、0.62 ng/mL、0.63 ng/mL、0.64 ng/mL、0.65 ng/mL、0.66 ng/mL、0.67 ng/mL或0.68ng/mL的水平鉴定所述对象为具有肝癌。
(2) 癌症
可以使用本文所述方法通过确定对象中的GP73或岩藻糖基GP73的水平对具有癌症的对象提供诊断。所述方法可以用于使用如上所述的抗GP73的抗体，或其抗体片段，来检测对象中的癌症。所述方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）使用抗GP73抗体或其抗体片段确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，（d）如果生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平大于GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，则鉴定对象患有癌症，以及（e）对鉴定为具有癌症的对象施用治疗方案。所述方法中使用的抗GP73抗体可以是1A-4246抗体和1B-4863抗体，或它们的抗体片段。
此方法中的参考水平可以是在具有癌症的患者中GP73或岩藻糖基化GP73的水平。GP73或岩藻糖基化的GP73在血清中高于或等于0.29 ng/mL、0.30 ng/mL、0.31 ng/mL、0.32ng/mL、0.33 ng/mL、0.34 ng/mL、0.35 ng/mL、0.36 ng/mL、0.37 ng/mL、0.38 ng/mL、0.39ng/mL、0.40 ng/mL、0.41 ng/mL、0.42 ng/mL、0.43 ng/mL、0.44 ng/mL、0.45 ng/mL、0.46ng/mL、0.47 ng/mL、0.48 ng/mL、0.49 ng/mL、0.50 ng/mL、0.51 ng/mL、0.52 ng/mL、0.53ng/mL、0.54 ng/mL、0.55 ng/mL、0.56 ng/mL、0.57 ng/mL、0.58 ng/mL、0.59 ng/mL、0.60ng/mL、0.61 ng/mL、0.62 ng/mL、0.63 ng/mL、0.64 ng/mL、0.65 ng/mL、0.66 ng/mL、0.67ng/mL、0.68 ng/mL、0.69 ng/mL、0.70 ng/mL、0.71 ng/mL、0.72 ng/mL、0.73 ng/mL、0.74ng/mL、0.75 ng/mL、0.76 ng/mL、0.77 ng/mL、0.78 ng/mL、0.79 ng/mL、0.80 ng/mL、0.81ng/mL、0.82 ng/mL、0.83 ng/mL、0.84 ng/mL、0.85 ng/mL、0.86 ng/mL、0.87 ng/mL、0.88ng/mL、0.89 ng/mL、0.90 ng/mL、0.91 ng/mL、0.92 ng/mL、0.93 ng/mL、0.94 ng/mL、0.95ng/mL、0.96 ng/mL、0.97 ng/mL、0.98 ng/mL、0.99 ng/mL、1.00 ng/mL、1.01 ng/mL、1.02ng/mL、1.03 ng/mL、1.04 ng/mL、1.05 ng/mL、1.06 ng/mL、1.07 ng/mL、1.08 ng/mL、1.09ng/mL或1.10 ng/mL的水平鉴定所述对象为具有癌症。
b. 用于确定对象发生肝脏疾病风险的方法
本文所述方法还可用于通过使用上述抗GP73抗体或其抗体片段确定对象中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，来确定对象是否具有肝脏疾病或处于发生肝脏疾病的风险中。因此，在具体实施方案中，本公开内容还提供了用于确定本文讨论和本领域已知的具有肝脏疾病或处于肝脏疾病风险中的对象是否是治疗或处理的候选者的方法。通常，对象是已经历该疾病的某些症状或实际上已诊断为患有该疾病或处于该疾病风险中，和/或展示不利浓度或量的GP73或GP73片段的对象，如本文所述。
具体而言，这样的方法可以包括以下步骤：（a）使用本文所述方法或本领域已知方法确定来自对象的测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量；和（b）与预定水平比较步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量，其中，如果步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相对于预定水平是有利的，则确定对象不具有如本文所讨论和本领域中已知的肝脏疾病或处于如本文所讨论和本领域中已知的肝脏疾病的风险中。然而，如果步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相对于预定水平是不利的，则确定对象具有如本文所讨论和本领域中已知的肝脏疾病或处于如本文所讨论和本领域中已知的肝脏疾病的风险中。所述肝脏疾病可以是肝硬化或肝癌。
c. 用于确定对象发生癌症风险的方法
本文所述方法还可用于通过使用上述抗GP73抗体或其抗体片段确定对象中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，来确定对象是否具有癌症或处于发生癌症的风险中。因此，在具体实施方案中，本公开内容还提供了用于确定本文讨论和本领域已知的具有癌症或处于癌症风险中的对象是否是治疗或处理的候选者的方法。通常，对象是已经历该疾病的某些症状或实际上已诊断为患有该疾病或处于该疾病风险中，和/或展示不利浓度或量的GP73或岩藻糖基化GP73的对象，如本文所述。
具体而言，这样的方法可以包括以下步骤：（a）使用本文所述方法或本领域已知方法确定来自对象的测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量；和（b）与预定水平比较步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量，其中，如果步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相对于预定水平是有利的，则确定对象不具有如本文所讨论和本领域中已知的癌症或处于如本文所讨论和本领域中已知的癌症的风险中。然而，如果步骤（a）中确定的GP73的浓度或量相对于预定水平是不利的，则确定对象具有如本文所讨论和本领域中已知的肝脏疾病或处于如本文所讨论和本领域中已知的癌症的风险中。所述癌症可以是结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌或肝癌。
d. 监测对象中疾病进展的方法
本文所述方法还可用于通过使用上述抗GP73抗体或其抗体片段确定对象中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，来监测对象中疾病，诸如肝脏疾病或癌症的进展。最佳地，所述方法包括下列步骤：（a）使用上述的抗GP73的抗体，或其抗体片段确定来自对象的测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量，（b）使用上述的抗GP73的抗体，或其抗体片段确定来自后来的测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量，以及（c）比较如步骤（b）中所确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量与步骤（a）中所确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量，其中，如果当与步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相比，步骤（b）中确定的浓度或量是不变的或是不利的，则对象中的疾病被确定为继续、进展或恶化。通过比较，如果当与步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相比，步骤（b）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量是有利的，则对象中的疾病被确定为已中止、消退或改善。
任选地，该方法还包括将如步骤（b）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量与例如预定水平进行比较。此外，任选地，所述方法包括如果比较显示，如步骤（b）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量，例如，相对于预定水平是不利地改变，则用一种或多种药物组合物治疗对象一段时间。
更进一步地，方法可用于在接受一种或多种药物组合物治疗的对象中监测治疗。具体而言，这样的方法涉及在对象被施用一种或多种药物组合物之前，从对象提供第一测试样品。接着，确定来自对象的第一测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量（例如，使用本文所述的或如本领域中已知的方法）。确定GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量之后，任选地，然后将GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量与预定水平相比较。如果在第一测试样品中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量低于预定水平，则所述对象不用一种或多种药物组合物治疗，或者可选地，所述对象可用一种或多种药物组合物治疗。如果在第一测试样品中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量高于预定水平，则所述对象用一种或多种药物组合物治疗一段时间，或者可选地，所述对象不用一种或多种药物组合物治疗。所述对象用一种或多种药物组合物治疗的时间段可以由本领域技术人员确定（例如，该时间段可以从约七（7）天至约两年，优选从约十四（14）天至约一（1）年）。
在用一种或多种药物组合物治疗的过程中，然后从对象获得第二和后续的测试样品。测试样本的数目和其中从对象获得所述测试样品的时间并不关键。例如，可以在对象首次施用一种或多种药物组合物七（7）天后获得第二测试样品，在对象首次施用一种或多种药物组合物两（2）周后获得第三测试样品，在对象首次施用一种或多种药物组合物三（3）周后获得第四测试样品，在对象首次施用一种或多种药物组合物四（4）周后获得第五测试样品，等等。
从对象获得每第二或后续测试样品之后，确定第二或后续测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量（例如，使用本文所述的或如本领域中已知的方法）。然后将每个第二或后续测试样品中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量与第一测试样品（例如，最初任选地与预定水平进行比较的测试样品）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量进行比较。如果当与步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相比，步骤（c）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量是有利的，则对象中的疾病被确定为已中止、消退或改善，并且所述对象应当继续施用步骤（b）的一种或多种药物组合物。然而，如果当与步骤（a）中确定的GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或量相比，步骤（c）中确定的浓度或量未变化或是不利的，则对象中的疾病被确定为已继续、进展或恶化，并且所述对象应当用更高浓度的步骤（b）中施用给对象的一种或多种药物组合物进行治疗，或者所述对象应当用与步骤（b）中施用给对象的一种或多种药物组合物不同的一种或多种组合物进行治疗。具体地，所述对象可以用与对象先前接受的一种或多种药物组合物不同的一种或多种组合物进行治疗，以减少或降低所述对象的GP73或岩藻糖基化的GP73水平。
通常，对于其中可以进行重复测试的测定（例如，监测疾病进展和/或对治疗的反应），则在已从对象获得第一测试样品之后的时间段获得第二或后续测试样品。具体地，在已从对象获得第一测试样品之后分钟，小时，天，周或年从所述对象获得第二测试样品。例如，可以在从对象获得第一测试样品后下列时间段从对象获得第二测试样品：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18 小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年。当用于监测疾病进展时，上述测定可用于监测患有急性状况的对象中的疾病进展。急性状况，也称为病危护理状况，指涉及例如，心血管系统或排泄系统的急性，威胁生命的疾病或其它危急医学状况。通常，病危护理状况指需要基于医院的场合（包括但不限于急诊室，重症监护室，创伤中心，或其它紧急护理场合）中的急性医疗干预或由医务人员或其他基于现场的医务人员施用的状况。对于病危护理状况，重复监测一般在较短的时间框架内完成，即分钟、小时或天(例如约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，并且最初的测定同样一般在较短的时间框架内完成，例如疾病或状况发生的约分钟、小时或天。
该测定也可用于监测患有慢性或非急性状况的对象中疾病的进展。非病危护理状况或非急性状况指除了涉及例如，心血管系统或排泄系统的急性，威胁生命的疾病或其它危急医学状况之外的状况。通常，非急性状况包括那些长期或慢性持续时间的状况。对于非急性状况，通常用更长的时间框架完成重复监测，例如，小时、天、周、月或年（例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年)，并且,最初的测定同样一般是在较长的时间框架内完成，例如，约小时、天、月或年的疾病或状况的发生。
此外，上述测定可使用从对象获得的第一测试样品来进行，其中所述第一测试样品获自一个来源，诸如尿、血清或血浆。任选地，上述测定可以随后使用第二测试样品来重复，其中所述第二测试样品获自另一个来源。例如，如果第一测试样品从尿获得，则第二测试样品可以从血清或血浆获得。从使用第一测试样品和第二测试样品的测定获得的结果可以进行比较。该比较可用于评估对象中疾病或状况的状态。
e. 用于确定对象是否易患或患有疾病的方法
此外，本文所述方法可以用来确定易患或患有疾病（例如，肝脏疾病或癌症，如本文所讨论和本领域已知的）的对象是否将受益于治疗。具体地，本公开涉及GP73护理诊断方法和产品。因此，如本文所述“监测对象中疾病的治疗”的方法进一步最佳地也可包括选择或鉴定对于肝脏疾病治疗，诸如肝切除肝移植，或对于癌症治疗，诸如手术、放射疗法、靶向治疗和化疗的候选者。
f. 用于确定对象是否对药物组合物的施用有响应的方法
本文所述方法还可用于通过使用上述抗GP73抗体或其抗体片段确定对象中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，来确定对象是否对一种或多种药物组合物的施用有响应。所述方法任选地包括如本文所述的测定法，其中，在用一种或多种药物组合物（例如，特别是用与涉及GP73或岩藻糖基化GP73作用机制的药物）治疗对象之前或之后评估GP73或岩藻糖基化GP73的水平，或其中在这些治疗之后评估GP73的水平并且GP73或岩藻糖基化GP73的浓度或水平与预定水平进行比较。治疗后观察到不利浓度的GP73或岩藻糖基化GP73，证实对象不会从接受进一步或继续治疗中受益，而治疗后观察到有利浓度或量的GP73或岩藻糖基化GP73，证实对象将会从接受进一步或继续治疗中受益。该证实帮助临床研究的管理，并提供改善的患者护理。
所述方法包括以下步骤：（a）从对象获得生物样品，（b）使用上述抗GP73抗体或其抗体片段确定生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平，（c）比较生物样品中GP73或岩藻糖基化GP73的水平与GP73或岩藻糖基化GP73的参考水平，其中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度改变指示对象对施用一种或多种药物组合物没有响应，和（d）如果所述对象对施用一种或多种药物组合物没有响应，则调整所述对象的治疗。
6. 生物标志物的组合
上述抗体和方法可用于结合疾病特异性的一种或多种生物标志物或免疫测定来检测和测量GP73或岩藻糖基化GP73的水平和浓度。GP73或岩藻糖基化GP73与疾病特异性的一种或多种生物标志物或免疫测定的组合相比单独测量GP73或岩藻糖基化GP73可以在健康对照和患病个体之间提供更大区别。例如，测量一组GP73或岩藻糖基化GP73和额外的肝脏疾病生物标志物相比单独一组GP73或岩藻糖基化GP73可以在健康对照和患病个体之间提供更大区别。GP73或岩藻糖基化GP73与至少一种或多种生物标志物的组合可以在健康对照和患有肝脏疾病的个体和/或患有癌症的个体之间提供更大区别。
所述一种或多种生物标志物的实例包括缺乏维生素K诱导的蛋白或拮抗剂-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ）、α-甲胎蛋白（AFP）、AFP-L3、血红素结合蛋白（HPX）、岩藻糖基化血红素结合蛋白（Fuc-HPX）、岩藻糖基化激肽原（FC-Kin）和岩藻糖基化a-1-抗胰蛋白酶（F-AT）。
a. PIVKA-II
缺乏维生素K诱导的蛋白或拮抗剂-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ），也称为脱-g-羧基凝血酶原（DCP），是凝固蛋白凝血酶原的异常形式，并且在日本被广泛与AFP一起使用在HCC治疗期间和之后预测不良后果，并检测早期复发和潜在的恶性肿瘤。PIVKA-II对于HCC风险因素（如肝硬化）是最不敏感的，并因此在预测HCC中是最有用的。其区分HCC与非恶性肝脏疾病，然而，在下列情况中发现PIVKA-Ⅱ浓度的虚假增加：在具有由于肝内胆汁淤积的严重的阻塞性黄疸的患者中，或在其中具有长期维生素K缺乏症的个体中维生素K的作用受损的状况下，以及在那些已摄入华法林或广谱抗生素的个体中。
b. AFP
α-胎儿蛋白（AFP），也被称为甲胎蛋白，α-1-胎蛋白和α-胎球蛋白，是在人中的蛋白，由AFP基因编码。AFP被广泛用于世界临床实践，用于筛选对于HCC高风险的患者，用于HCC患者的诊断和监测与超声结合使用以检测早期复发，用于监测对治疗的反应，以及用于检测早期复发。但是，AFP可以在许多情况下产生，包括其它肝脏疾病，从而导致假阳性，并且不在所有具有HCC的患者中存在。
扁豆AFP（AFP-L3）的血凝素反应活性级分是AFP的岩藻糖基化糖型，其可以用作标志物来表示HCC生物恶性程度。因为其高于AFP的特异性，AFP-L3测定也得到了美国食品和药物管理局的批准用于HCC的诊断。
c. HPX
血红素结合蛋白（HPX），也被称为β-1B糖蛋白，由HPX基因编码。HPX主要在肝脏中表达，并且是在人血清中丰富的和急性期蛋白。HPX以与任何已知蛋白最高的亲和力结合血红素。其功能是清除由血红素蛋白诸如血红蛋白的周转释放或丢失的血红素，并从而保护机体免受游离血红素可导致的氧化损伤。此外，HPX当与位于肝细胞表面上的特定受体相互作用时释放其结合的配体而内化。HPX的这种功能是保持体内的铁。这种蛋白质具有N-连接到受体序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸的5葡糖胺寡糖。在人血清中岩藻糖基化HPX（Fuc-HPX）具有两个核心HPX岩藻糖基化位点，其利用蛋白质组学方法鉴定。岩藻糖基化血红素（Fuc-HPX）可以是HCC的潜在生物标志物，因为在使用小样本集合的研究中，扁豆血凝素凝集素结合的血清组分中Fuc-HPX的水平显示对于HCC良好的诊断准确性。
d. 血清糖蛋白
已经报道糖基化的改变已与肝硬化和HCC的发展相关。当独立地或与其它HCC标志物组合使用时，血清糖蛋白诸如岩藻糖基化激肽原（Fc-kin）和岩藻糖基化a1-抗胰蛋白酶（F-AT）的糖基化改变，可以是潜在生物标志物。
7. 患有肝脏疾病的对象的治疗
在上述方法中鉴定为具有大于或等于上文讨论值的GP73水平的对象被鉴定为患有肝脏疾病的患者。然后针对肝脏疾病治疗所述对象。肝脏疾病的治疗可以包括小分子GP73或岩藻糖基化GP73抑制剂和抗GP73中和抗体。
a. 肝硬化
在上述方法中鉴定为具有大于或等于上文讨论值的GP73或岩藻糖基化GP73水平的对象被鉴定为患有肝硬化的患者。然后针对肝硬化治疗所述对象。治疗可包括低钠盐饮食，药物，手术诸如肝脏移植、有或无蛋白（白蛋白）输注的腹腔穿刺、内镜下曲张静脉绑扎或硬化、气囊压迫、经颈静脉肝内门体分流术（TIPS），避免饮酒，避免镇静药物诸如安眠药、抗焦虑药和麻醉剂，并避免非类固醇消炎药（NSAID）诸如如阿司匹林、布洛芬和萘普生。药物的实例可以包括GP73抑制剂，利尿药诸如安体舒通和呋塞米，抗生素诸如环丙沙星、新霉素或甲硝唑（灭滴灵）以及头孢噻肟，β-阻断剂药物诸如如普萘洛尔和纳多洛尔，血管收缩剂药物诸如奥曲肽，乳果糖，免疫抑制剂诸如强的松和硫唑嘌呤，熊去氧胆酸（UDCA；ursodiol（Actigall），秋水仙素，甲氨蝶呤，促红细胞生成素和红细胞生成素α（Epogen，Procrit）。
b. 肝癌
在上述方法中鉴定为具有大于或等于上文讨论值的GP73或岩藻糖基化GP73水平的对象被鉴定为患有肝癌的患者。然后针对肝癌治疗所述对象。治疗可以包括有或没有肝脏移植的手术去除癌症（肝切除术），化疗诸如多柔比星（阿霉素）、5-氟尿嘧啶（5 FU）、他莫昔芬（Nolvadex）、奥曲肽（Sandostatin）、吉西他滨、顺铂和奥沙利铂，生物治疗诸如贝伐单抗，化学栓塞（反动脉化学栓塞或TACE），放射性栓塞（选择性内部放射疗法；“SIRT”），消融诸如射频消融（RFA）疗法、经皮乙醇（酒精）注射和冷冻消融，立体定向放射外科，以及质子束治疗。治疗还可以包括阻断血管生成途径的组分的药物，诸如索拉非尼（多吉美）。治疗也可包括GP73抑制剂。该药物可通过肝动脉或门静脉递送。
8. 患癌症的对象的治疗
在上述方法中鉴定为具有大于或等于上文讨论值的GP73或岩藻糖基化GP73水平的对象被鉴定为患有癌症的患者。然后针对癌症治疗所述对象。癌症治疗可包括外科手术、化学疗法、放射疗法、小分子GP73或岩藻糖基化GP73抑制剂和/或GP73或岩藻糖基化GP73抑制剂。
9. 试剂盒
本文提供试剂盒，其可用于测定测试样品中GP73或GP73片段或岩藻糖基化GP73或岩藻糖基化GP73片段。所述试剂盒包含至少一个组分用于测定测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73，以及用于测定测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的指导。例如，试剂盒可包括用于通过免疫测定，例如化学发光微粒免疫测定法来测定测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的指导。包括在试剂盒中的指导，可贴到包装材料上，或者可以被包括作为包装插页。尽管指导通常是书面或印刷材料，但是它们不限于此。任何能够存储这样的指导，并将它们传达给终端用户的介质都是由本公开内容考虑的。这样的介质包括，但不限于，电子存储介质（例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片），光学介质（例如，CD-ROM）等。如本文所用，术语“指导”可包括提供指令的互联网网站地址。
所述至少一个组分可以包括至少一种组合物，其包含特异性结合GP73或岩藻糖基化GP73的一种或多种分离的抗体或其抗体片段。所述抗体可以是GP73或岩藻糖基化GP73捕获抗体和/或GP73或岩藻糖基化GP73检测抗体。所述抗体可包括1A-4246抗体、1B-4863抗体，或其抗体片段。抗体被任选地可检测地标记。
可选地或另外地，所述试剂盒可包含校准物或对照，例如，纯化的并任选地冻干的GP73或或岩藻糖基化GP73，和/或用于进行测定的至少一种容器（例如，管、微量滴定板或条带，其可以已经包被有抗GP73单克隆抗体），和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其任一个都可提供为浓缩溶液、用于可检测标记物的底物溶液（如酶标记物）或终止溶液。优选地，试剂盒包含所有组分，即执行测定所必需的试剂、标准物、缓冲剂、稀释剂等。指导还可以包括用于产生标准曲线的指导。
所述试剂盒可进一步包括参考标准物用于定量GP73或岩藻糖基化GP73。可以利用参考标准物建立标准曲线用于内推和/或外推GP73或岩藻糖基化GP73浓度。参考标准物可以包括高的GP73或岩藻糖基化GP73浓度水平，例如约100 ng/mL、约125 ng/mL、约150 ng/mL、约175 ng/mL、约200 ng/mL、约225 ng/mL、约250 ng/mL、约275 ng/mL或约300 ng/mL；中等的GP73浓度水平，例如约25 ng/mL、约40 ng/mL、约45 ng/mL、约50 ng/mL、约55 ng/mL、约60 ng/mL、约75 ng/mL或约100 ng/mL；和/或低的GP73浓度水平，例如约1 ng/mL、约5ng/mL、约10 ng/mL、约12.5 ng/mL、约15 ng/mL、约20 ng/mL或约25 ng/mL。
任何抗体，其在试剂盒中提供，诸如特异性针对GP73的重组抗体，都可以掺入可检测标记物，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/亲和素标记物、生色团、化学发光标记等，或试剂盒可以包括用于标记抗体的试剂或用于检测抗体（例如，检测抗体）的试剂和/或用于标记分析物的试剂或用于检测分析物的试剂。抗体，校准物和/或对照可以在分开的容器中提供，或预先分配到合适的测定形式中，例如，微量滴定板中。
任选地，试剂盒包括质量控制组分（例如，灵敏度实验对象组，校准物和阳性对照）。对于多种免疫诊断产品，质量控制试剂的制备是本领域熟知的技术，并描述在插页上。灵敏度实验对象组成员任选地用于建立测定性能表征，并进一步任选地是免疫测定试剂盒试剂完整性和测定的标准化有用的指示物。
所述试剂盒还可以任选包括进行诊断测定或帮助质量控制评价所需的其它试剂，诸如缓冲剂、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。在试剂盒中还可以包括其它组分，诸如用于测试样品的分离和/或处理的缓冲剂和溶液（例如，预处理试剂）。所述试剂盒可以另外包括一个或多个其它对照。试剂盒的一个或多个组分可以被冻干，在此情况下，试剂盒可以进一步包括适合用于冻干的组分重构的试剂。
所述试剂盒的各种组分任选地根据需要提供在适当的容器中，例如，微量滴定板。所述试剂盒可以进一步包括用于保持或贮存样品的容器（例如，用于尿、血浆或血清样品的容器或药筒）。在适当情况下，所述试剂盒任选也可以包括反应容器、混合容器和帮助制备试剂或测试样品的其他组分。所述试剂盒还可以包括一个或多个工具以协助获得测试样品，诸如注射器、移液管、镊、测量匙等。
如果可检测标记物是至少一种吖啶鎓化合物，则所述试剂盒可以包含至少一种吖啶鎓-9-羧酰胺、至少一种吖啶鎓-9-羧酸芳基酯，或其任意组合。如果可检测标记物是至少一种吖啶鎓化合物，则所述试剂盒也可以包含过氧化氢来源，诸如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。如果需要的话，所述试剂盒可以包含固相，诸如磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、比色皿、膜、支架分子、膜、滤纸、盘或芯片。
如果需要，所述试剂盒可以进一步包括一种或多种组分，单独或进一步组合指导，用于测定测试样品的另一种分析物，其可以是生物标志物，诸如肝脏疾病或病症的生物标志物。
a. 试剂盒和方法的适应性
用于通过如本文所述的免疫测定确定测试样品中GP73或岩藻糖基化GP73的浓度的试剂盒（或其组分），以及方法，可以适用于多种自动化和半自动化系统（包括其中固相包含微粒的那些），如上所述的例如，美国专利号5,089,424和5,006,309，以及如商业销售的，例如，由Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)作为ARCHITECT®销售。
一些自动化或半自动化的系统相比于非自动化系统（例如，ELISA）之间的差异包括第一特异性结合配偶体（例如，分析物抗体或捕获抗体）连接到的基质（其可以影响夹心形成和分析物反应性），和捕获、检测和/或任何任选洗涤步骤的的长度和定时。鉴于非自动化形式诸如ELISA可能需要相对较长的与样品和捕获试剂的孵育时间（例如，约2小时），自动化或半自动化形式（例如，ARCHITECT®和任何后继的平台，Abbott Laboratories）可以具有相对较短的孵育时间（例如，对于ARCHITECT®大约18分钟）。类似地，鉴于非自动化形式诸如ELISA可能孵育检测抗体诸如缀合试剂相对较长的时间（例如，约2小时），自动化或半自动化形式（例如，ARCHITECT®和任何后继的平台）可以具有相对较短的孵育时间（例如，对于ARCHITECT®和任何后续平台大约4分钟）。
其它可以得自Abbott Laboratories平台包括，但不限于AxSYM®、IMx® (参见，例如美国专利号5,294,404，其在此通过引用以其整体并入）、PRISM®、EIA (珠)和Quantum™ II，以及其它平台。额外地，可以利用其它形式的测定、试剂盒和试剂盒组分，例如在电化学或其它手持或现场即时测定系统上。本公开内容，例如，可应用于进行夹心免疫测定的商业化Abbott现场即时（i-STAT®, Abbott Laboratories）电化学免疫测定系统。在单用途测试装置中的免疫传感器和它们的制造和操作方法描述于，例如美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、美国专利申请公开号2004/0018577、美国专利申请公开号2005/0054078和美国专利申请公开号2006/0160164，其通过引用关于其相同的教导以其整体并入。
特别是，对于测定适用于I-STAT®系统，优选下述构型。用一对金电流分析工作电极和银-氯化银参比电极制造微制造硅芯片。在工作电极之一上，将聚苯乙烯珠（直径0.2mm）与固定化的捕获抗体附着于在电极上的图案化聚乙烯醇的聚合物涂层。该芯片被组装进具有适于免疫测定的流体形式的I-STAT®盒。盒的样品保持室的壁的一部分上，存在包括用碱性磷酸酶（或其它标记物）标记的检测抗体的层。盒的流体袋内是水性试剂，其包括对氨基苯酚磷酸。
在操作中，怀疑含有GP73或岩藻糖基化GP73的样品被添加到测试盒的保持室并将盒插入I-STAT®阅读器。第二抗体（检测抗体）溶解到样品中之后，盒中的泵元件迫使样品进入含有管道的芯片。这里振荡以促进在第一捕获抗体、GP73或岩藻糖基化GP73，和标记的第二检测抗体之间形成夹心。在测定的倒数第二个步骤，流体被挤出袋并进入管道，以从芯片上洗涤样品并进入废液室中。在测定的最终步骤，碱性磷酸酶标记物与对氨基苯酚磷酸反应，以切割磷酸基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极上进行电化学氧化。基于所测量的电流，阅读器能够通过嵌入算法和工厂确定的校准曲线，来计算样品中分析物GP73或岩藻糖基化GP73的量。
本文所述方法和试剂盒必然包括用于进行免疫测定的其它试剂和方法。例如，包括各种缓冲液，诸如本领域已知的和/或其可以容易地制备或优化以被采用，例如用于洗涤，作为缀合稀释剂，和/或作为校准物稀释剂。示例性缀合稀释剂是ARCHITECT®缀合稀释剂，其用于某些试剂盒（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL），并包含2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、盐、蛋白阻滞剂、抗微生物剂和去垢剂。示例性校准物稀释剂是用于某些试剂盒的ARCHITECT®人校准物稀释剂（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL），其包含含有MES、其他盐、蛋白阻滞剂和抗微生物剂的缓冲液。此外，如在2008年12月31日提交的美国专利申请号61/142048中所述，可以获得改善的信号产生，例如，在I-STAT®盒形式中，使用连接到信号抗体的核酸序列作为信号放大器。
虽然本文某些实施方案在用于评估疾病诸如肝脏疾病或癌症时是有利的，但是所述测定和试剂盒也可任选地可用于评估其它疾病、病症和状况中的GP73。
测定方法还可用于鉴定缓解疾病诸如肝脏疾病或癌症的化合物。例如，表达GP73的细胞可以与候选化合物接触。使用本文所述的测定方法，在与化合物接触的细胞中GP73或岩藻糖基化GP73的表达水平可以与在对照细胞中进行比较。
本发明具有多个方面，由以下的非限制性实施例说明。
10. 实施例
本领域技术人员将是显而易见的，本文所述本公开内容的方法的其它适当的修饰和调整是是容易适用和理解的，并且可以使用合适的等价物，而不偏离本公开内容或本文所公开的方面和实施方案的范围。现在已描述了本公开内容的细节，同样的公开内容通过参考下面的实施例会被更清楚地理解，这些实施例仅仅用于说明本公开实施方案的某些方面和实施方案，而不应被视为限制所述公开内容的范围。本文所有刊物参考文献、美国专利和提到的出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入。
本发明具有多个方面，由以下的非限制性实施例说明。
实施例1
人GP73基因表达
人GP73蛋白（又名GOLM1，GOLPH2）是400个氨基酸（45.2 kDa）的顺式高尔基体膜的整合蛋白。合成人GP73（基于GenBank中的序列AAF44663.1氨基酸63-400）（SEQ ID NO：97）并克隆到pET载体（Novagen）中进行表达。在C端融合6xHis标签用于纯化。最终质粒pET-GP73（SEQ ID NO：98，参见图1）转化到BL21（DE3）细胞并通过1mM IPTG在30℃下诱导4小时。诱导的大肠杆菌细胞在3900转离心20分钟，并用PBS洗涤一次。洗涤过的细胞沉淀用每克细胞沉淀约5mL BugBuster®蛋白提取试剂（Novagen）重悬。细胞悬浮液在室温下轻轻摇动孵育30分钟。将裂解物在4℃以14,000rpm离心20分钟。按照制造商（Novagen）的指导使用镍亲和柱层析法纯化上清液。
另外，将洗涤的细胞沉淀溶解在1xHis-结合结合缓冲液（Novagen）中与蛋白酶抑制剂（Sigma）一起并在冰浴中超声处理5×10秒脉冲，脉冲之间具有30秒的休息。将裂解物在4℃以14,000rpm离心20分钟。按照制造商（Novagen）的指导使用镍亲和柱层析法将上清液纯化。
人GP73（氨基酸63-400）也被克隆入pFuse-hIgG1-Fc的载体（InvivoGen）。人Fc区融合在C端，以产生GP73-hFC（GP73连接到人IgG的片段结晶区域；SEQ ID NO：99，参见图2）。最终的质粒DNA pFuse-GP73-Fc与线性聚乙烯亚胺（PEI，MW25kDa）（Polysciences，Inc.）转染入HEK293F、CHO或HepG2细胞。经过5天的培养，将上清液以1000rpm进行20分钟离心收获并随后过滤（0.2微米过滤器）。将收获的上清液按照制造商的指导（GE healthcare）通过蛋白G柱层析纯化。
实施例2
动物免疫
雌性CAF1/J和RBF/DnJ小鼠（均来自The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine）免疫两次，每七周，用乳化在完全或不完全Adjulite弗氏佐剂（Pacific Immunology,Ramona, CA）中的20 µg纯化的GP73-hFc（实施例1中所述）。完全弗氏佐剂用于初次免疫并且不完全弗氏佐剂用于第二次免疫。每个接种物的制备是首先将GP73-hFc在无菌盐水（0.9％氯化钠，Abbott Laboratories）中稀释到适当浓度，添加等体积佐剂，并然后通过在两个注射器之间经由三路活塞来回穿过混合直到形成粘稠的、稳定的乳液。在第二次免疫10-14天之后取血清样品。在收获B细胞之前第四和第三天，对RBF/DnJ小鼠施用稀释在无菌盐水中的35 µg GP73-hFc。将这种接种物递送到脾脏附近的体腔。在收获B细胞之前第三天，对CAF1/J小鼠施用稀释在无菌盐水中的50 µg GP73-hFc。将这种接种物也递送到脾脏附近的体腔。
实施例3
针对抗原反应性的小鼠血清筛选
血清样品在96孔微滴定酶免疫测定（EIA）中测试对溶液相GP73-hFc的反应性。测定板（NUNC Corporation, Naperville, IL）用在磷酸盐缓冲盐水（PBS，Abbott Laboratories）稀释至2 µg/mL的100μL/孔羊抗小鼠IgG Fc特异性抗体（Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA）包被。板孵育过夜，除去捕获抗体，并加入200 µL/孔封闭溶液（稀释在PBS中的3％w/v[重量/体积]牛血清白蛋白（BSA）和0.5％v/v[体积/体积]聚山梨醇酯-20（所有均来自Abbott Laboratories））。将板孵育约30分钟，然后用蒸馏水（dH2O, AbbottLaboratories）洗涤。将小鼠血清或阳性对照的系列稀释液（在封闭溶液中）添加到测定板（100μL/孔），培养约60分钟，然后用dH2O洗涤。加入100µL/孔的正常血清溶液（NSS；含有2％v/v正常小鼠血清的封闭溶液），用于额外的封闭。此溶液有助于防止分析孔中非特异性结合。将板孵育约30分钟，并然后用dH2O洗涤。随后，将100μL/孔的GP73-hFc的500 ng/mL溶液加入到测定孔进行短暂孵育，之后，将板用dH2O洗涤。将在NSS中稀释至500 ng/mL的兔抗GP73抗体（Drexel University）加入到所有测定孔（100μL/孔），其孵育30分钟，并然后用dH2O洗涤。接着，加入100μL在NSS中稀释至200 ng/mL的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（Jackson ImmunoResearch），使其孵育约30分钟，并然后洗涤板。使用邻苯二胺（OPD）底物（Abbott Laboratories）作为色原以产生信号，并用1N硫酸（Abbott Laboratories）淬灭反应。在492nm波长读取信号。
实施例4
针对相对亲和力的小鼠血清筛选
测试样品对限制抗原浓度的反应性，以确定每个血清样品对GP73-hFc抗原的相对亲和力。测定形式与上述相同，除了不是制备小鼠血清测试样品的系列稀释液，而是将各样品制备成单一稀释，在封闭液中。此外，测试不同浓度的GP73-hFc抗原，从在NSS中2000 ng/mL开始，其后是10个log 3的稀释液，也在NSS中。生成结合曲线并用于确定相对亲和力。基于这些结果，选择CAF1/J小鼠（“小鼠＃458”）和RBF/DnJ小鼠（“小鼠＃501”）用于B细胞融合。
实施例5
小鼠脾细胞融合
在融合当天，将小鼠安乐死，并收获含有抗GP73脾细胞的它们的脾并置于补充有PenStrep (Invitrogen Corporation)的杂交瘤无血清培养基（HSFM）中。如Kohler和Milstein(Nature (1975) 256:495-7)所描述的进行细胞融合。各小鼠的脾脏置于含有HSFM的单独培养皿中。使用含有HSFM的注射器和细胞刮刀将脾细胞从每个脾脏灌注洗出，并然后使用血球计数板计数。来自小鼠＃458的大约3.9 x 107个脾细胞分离在50mL离心管中进行融合1A，并且来自小鼠＃501的3.8×107个脾细胞分离在50mL离心管中进行融合1B。来自每只小鼠的脾细胞通过离心成细胞沉淀并重新悬浮于HSFM进行洗涤。这些脾细胞混合同等数量的NS/0骨髓瘤细胞（美国典型培养物保藏中心），并离心成沉淀。通过使脾细胞和NS/0细胞暴露于HSFM中的50％聚乙二醇（PEG）（MW1300-1600）实现融合。将1 ml PEG溶液加入到每个细胞沉淀超过30秒，然后额外孵育1分钟。将PEG和细胞沉淀通过在30秒内缓慢地加入30 mLHSFM进行稀释。将融合细胞然后通过离心从悬浮液中去除并倾析上清液。来自各融合的细胞沉淀物再悬浮于补充有大约10％的牛胎儿血清（FBS）（Hyclone Laboratories）、HAT（次黄嘌呤，氨基喋，胸腺嘧啶）（Sigma Laboratories）、HT补充剂（Invitrogen Corporation）、BM Condimed H1（Roche Applied Science）、胆固醇和L-谷氨酰胺（InvitrogenCorporation）的约300mL HSFM中以选择杂交瘤。以2.5×105细胞/mL的近似密度将融合细胞接种于T162培养瓶中，并在37℃和5％CO2中批量培养约48小时。HAT选择48小时后，批量培养物离心，并将沉淀重新悬浮在半固体组织培养基中。半固体组织培养培养基由2X的IMDM（Invitrogen）与CloneMatrix（Molecular Devices）的50%混合物组成，其补充有10％FBS、HT补充物、Penn/Strep、L-谷氨酰胺和CloneDetect（Molecular Devices）的5 µg/mL溶液。该半固体培养板被允许在ClonepixFL（Molecular Devices）上集落筛选之前孵育7-10天。在半固体培养基中生长的集落被认为是克隆，因为发起它的单细胞在生长期间不允许移动和与其它细胞混合。所有目标细胞系被亚克隆，以确保克隆能力。在集落产生的抗体和发荧光的山羊抗小鼠IgG Fc-FITC之间发生免疫沉淀反应。观察到的荧光信号越亮，产生的抗体越多。分析在ClonepixFL上集落的荧光并且选择那些具有最明亮的荧光信号的集落以自动传递到含有具有10％FBS和L-谷氨酰胺的HSFM的96孔组织培养板中。允许96孔组织培养板在37℃生长3至5天，之后筛选上清液的抗体产生。
实施例6
杂交瘤筛选和选择
通过EIA分析细胞上清液样品的抗GP73抗体。以1 µg/m将绵羊抗小鼠IgG Fc（JacksonImmunoresearch）包被在96孔微量滴定EIA板上。将捕获试剂包被在固相上之后，去除其并将板用BSA/PBS封闭溶液封闭。将孔用蒸馏水洗涤并将细胞上清液加入到封闭的板，并允许在室温下孵育至少一个小时。使用鼠单克隆抗体14H4-23（Drexel University）作为阳性对照。抗小鼠IgG Fc从上清液捕获抗GP73小鼠抗体。孵育后，将上清液用蒸馏水洗掉。将无关小鼠-人嵌合抗体加入到所有孔中，并在室温下孵育30分钟，以封闭与连接到GP73抗原的人IgG Fc融合蛋白反应的任何捕获的小鼠抗体。将孔用蒸馏水洗涤并将GP73-hFc以200 ng/mL加入到该板，并孵育30分钟。此孵育后，用蒸馏水将抗原从板上洗涤。将生物素标记的山羊抗GP73加入到该板以200 ng/mL，并在室温下孵育30分钟。洗涤板，并将链霉亲和素-HRPO（Jackson Immunoresearch）（稀释至约200 ng/mL）添加至板，并允许其孵育30分钟。将板用蒸馏水洗涤并使用OPD底物作为色原以产生信号。在492nm处读取平板并分析结果。如果杂交体EIA信号比背景至少大3倍，则杂交体被认为是阳性。参见表3。
阳性克隆扩大到24孔板中的补充有10％FBS和HT补充剂的IMDM中。5-14天生长后，通过EIA以如先前所述相同方式评估24孔的培养物，除了上清液样品针对GP73-hFc和BSA进行滴定以消除非特异性蛋白结合。再一次，产生比背景大至少3倍以上信号的克隆被认为是阳性的并选择用于进一步的评估。参见表4。
24孔的培养物然后通过EIA评价它们与直接包被在固相上用作捕获试剂的兔抗GP73形成夹心的能力。使用先前所述的相同的EIA方案，除了以1 µg/mL包被兔抗GP73抗体，测试在200 ng/mL的GP73-hFc，并且使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG Fc抗体作为缀合试剂以产生信号。参见表5。
扩增在24孔阶段鉴定阳性的克隆用于冷冻保存，之后生成高密度细胞上清液。以EIA形式使用Southern Biotech 克隆分型试剂盒测试了来自这些克隆的上清液的小鼠抗体同种型。参见表6。
实施例7
杂交瘤扩大规模、抗体纯化和抗体标记
细胞系在补充有L-谷氨酰胺和10％超低IgG FBS（Invitrogen Corporation）的IMDM（Invitrogen Corporation）中扩增，并以0.5 x105个细胞/mL接种到滚瓶中。该培养物在37℃孵育，同时以每分钟约1转旋转持续10-14天，或直至获得末端培养物。收获终端滚瓶上清液并用0.45微米的过滤器澄清。将澄清的上清液用pH8.9的等体积的1.5M甘氨酸/3 N NaCl缓冲液（Abbott Laboratories）稀释，然后装入使用AKTA自动纯化系统（Amersham/Pharmacia/GE）的预平衡的5mL的蛋白A柱。然后将柱用约5个柱体积的结合缓冲液洗涤，并当获得稳定的基线时，用pH3.0的柠檬酸缓冲液（Abbott Laboratories）洗脱mAb。然后将mAb转移到脱盐柱以交换到PBS中，并然后进一步用10,000分子量截断透析膜（PierceChemical）在PBS中透析。纯化的抗体用生物素标记用作二次筛选试剂。磺基-NHS-LC-生物素（Pierce）以20摩尔过量加入纯化的抗体，并使其温育30分钟。未结合的生物素通过透析在PBS中除去，并且mAb用EIA试验，确认它们已成功地标记。
实施例8
纯化的抗体的表征
1. 对岩藻糖的灵敏度——与橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）的竞争性抑制测定
通过EIA测试生物素标记的抗GP73 mAb，以确定它们是否对于GP73-hFc抗原上岩藻糖的存在是敏感的。橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）（Vector Laboratories）以高度特异性结合岩藻糖。以约1 µg/mL将预先用高碘酸氧化任何糖基化/岩藻糖基化位点的驴抗人IgG Fc（Jackson Immunoresearch）包被在96孔微滴定EIA板上。完成高碘酸处理以防止AAL非特异性结合到捕获试剂。将捕获试剂包被在固相上之后，去除包被试剂并将板用Protein-FreeT20 (TBS) 封闭缓冲液 (Thermo Scientific)封闭30分钟。将孔用蒸馏水洗涤并将200ng/mL的GP73-hFc抗原溶液加入到封闭的板，并使其在室温下孵育至少30分钟。抗人IgG Fc捕获GP73抗原上的人IgG融合蛋白。将孔用蒸馏水洗涤并将AAL以0-200 ng/mL的系列稀释液加入到孔中，并孵育至少30分钟。此孵育后，用蒸馏水将抗原从板上洗涤。以预定的浓度将生物素标记的抗GP73 mAb加入到所述板，所述浓度对于每种mAb范围为50至2000 ng/mL，并在室温下孵育15分钟。使用生物素标记的AAL作为测定的阳性对照，并使用生物素标记的无关mAb作为阴性对照。洗涤板，并将链霉亲和素-HRPO（稀释至约200 ng/mL）添加至板，并允许其孵育30分钟。将板用蒸馏水洗涤并使用OPD底物作为色原以产生信号。在492nm处读取平板并分析结果。参见图3。如图3所示，在此测定中，生物素标记的抗GP73 mAb 1A-3187和1B-4863在较高浓度下对游离AAL展示一些竞争性抑制。所有其它生物素标记的mAb均不展示抑制，即使在200 ng/mL。
2. 与IgG、GP73和GP73-hFc的反应性
测试纯化的抗GP73 mAb对人IgG、在大肠杆菌中产生的GP73和在HEK293细胞中产生的GP73-hFc的EIA反应性。小鼠-人嵌合抗体、在大肠杆菌中产生的GP73和在HEK293细胞中产生的GP73-hFc以约1000 ng/mL包被在微滴定板上，并允许在4-8℃孵育过夜。捕获试剂包被在固相上之后，去除捕获试剂并用BSA/PBS封闭溶液封闭。孔用蒸馏水洗涤。纯化的抗GP73和阴性对照mAb加入到封闭的板在从1000 ng/mL开始的连续稀释液中，并允许其在室温下孵育大约30分钟。将孔用蒸馏水洗涤。将山羊抗小鼠IgG-HRP（Jackson Immunoresearch）以大约250 ng/mL加入到孔中，并使其在室温下孵育大约30分钟。将板用蒸馏水洗涤并且将OPD底物用作色原以产生信号。在492nm处读取平板并分析结果。参见图4。如图4所示，没有测试的mAb与小鼠-人嵌合体上的人IgGFc反应，并且所有测试的mAb表现出与GP73-hFc的反应性。1A-3187和1A-4246展示与大肠杆菌产生的无人IgG Fc融合蛋白的GP73无反应性，表明这与GP73-hFc结构上不同，可能是由于大肠杆菌生产生物体缺乏糖基化。
3. 岩藻糖灵敏度——游离岩藻糖抑制
通过EIA测试生物素标记的抗GP73 mAb，以确定它们是否对于GP73-hFc抗原上岩藻糖的存在是敏感的。橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）（Vector Laboratories）以高度特异性结合岩藻糖。以约1 µg/m将驴抗人IgG Fc（Jackson Immunoresearch）包被在96孔微量滴定EIA板上。将捕获试剂包被在固相上之后，去除包被试剂并将板用Protein-Free T20 (TBS) 封闭缓冲液 (Thermo Scientific)封闭30分钟。孔用蒸馏水洗涤。将GP73-hFc抗原的200 ng/mL溶液加入到封闭的板并允许在室温孵育至少45分钟，然后用蒸馏水洗涤。将岩藻糖加入到单独的非吸附性微量滴定板的孔中在从1000 µg/mL开始的系列稀释液中。以预定的浓度将生物素标记的抗GP73 mAb加入到所述板，所述浓度对于每种mAb范围为50至2000 ng/mL，并在室温下孵育45分钟。将混合物添加到微量滴定板与捕获的GP73-hFc一起并允许在室温下孵育15-20分钟。使用生物素标记的AAL作为测定的阳性对照，并使用生物素标记的无关mAb作为阴性对照。洗涤板。并将链霉亲和素-HRPO（稀释至约200 ng/mL）添加至板，并允许其孵育30分钟。将板用蒸馏水洗涤并使用OPD底物作为色原以产生信号。在492nm处读取平板并分析结果。参见图5。图5指示生物素标记的AAL结合被游离岩藻糖抑制，但是没有生物素标记的抗GP73 mAb展示任何来自游离AAL的抑制。这些结果指示没有GP73 mAb特异性结合在溶液中单独的岩藻糖。
4. 与高碘酸处理和无高碘酸处理的GP73-hFc的反应性
进一步评估生物素标记的mAb以比较它们对高碘酸处理和无高碘酸处理的GP73-hFc的反应性。高碘酸处理应当氧化抗原上的糖基化/岩藻糖基化位点，使得与岩藻糖反应的抗体不应与高碘酸处理的材料反应。以约1 µg/mL将预先用高碘酸氧化任何糖基化/岩藻糖基化位点的驴抗人IgG Fc（Jackson Immunoresearch）包被在96孔微滴定EIA板上。完成高碘酸处理以防止岩藻糖反应性抗体与捕获试剂的非特异性结合。将捕获试剂包被在固相上之后，去除包被试剂并将板用Protein-Free T20 (TBS) 封闭缓冲液 (Thermo Scientific)在室温下封闭30分钟。孔用蒸馏水洗涤。将100 ng/mL开始的高碘酸处理的和无高碘酸处理的GP73-hFc抗原的系列稀释液添加到封闭的板并允许在室温下孵育至少30分钟。洗涤板。将链霉亲和素-HRPO（稀释到约200 ng/mL）添加到板并允许在室温下孵育30分钟。将板用蒸馏水洗涤并且将OPD底物用作色原以产生信号。如图6-11所示，抗体1A-3187、1B-4863和1B-4971展示对高碘酸处理的GP73-hFc相比无高碘酸处理的材料减少的结合。
5. 结合对
通过EIA测试纯化的抗GP73 mAb与GP73-hFc抗原形成结合对的能力。将产生的抗GP73抗体以约1000 ng/mL包被在微滴定板上，并允许在4-8℃孵育过夜。捕获试剂包被在固相上之后，板用BSA/PBS封闭溶液封闭。将孔用蒸馏水洗涤并将纯化的GP73-hFc以稀释于BSA封闭液的0-100 ng/mL系列稀释添加到封闭的板，并允许在室温下孵育大约30分钟。板用蒸馏水洗涤并以预定的浓度将生物素标记的抗GP73 mAb添加到所述板，所述浓度对于每种mAb范围为50至5000 ng/mL，并在室温下孵育30分钟。洗涤板。并将链霉亲和素-HRPO（稀释至约200 ng/mL）添加至板，并允许其在室温下孵育30分钟。将板用蒸馏水洗涤并使用OPD底物作为色原以产生信号。在492nm处读取平板并分析结果。表7总结了对于每个抗体对组合的测定信号，其指示每个结合对是否是能够形成夹心。这些抗体基于它们的夹心形成模式被分组为6种不同表位。未形成夹心或形成弱夹心的抗体被分配到相同的表位组。据推断，结合相同或相似的表位的抗体不能一起形成GP73夹心，因为它们竞争相同的结合位点。对于像抗体1B-4863的情况对此存在例外，抗体1B-4863能够与所有的抗体包括自身的生物素标记的形式形成夹心。因为有两种GP73分子连接到一个人IgG Fc，所以对于抗体与其自身形成夹心是可能的，但对于大多数这些mAb来说，第一抗体的结合似乎封闭存在于相同GP73-hFc分子上的第二表位并阻止针对相同表位的另一抗体的结合。
6. 使用抗GP73抗体的Western印迹
如上所述，哺乳动物细胞（HEK和CHO）表达的GP73-hFc或大肠杆菌表达的GP73，在4-20％SDS-PAGE凝胶中进行电泳。在标准转印缓冲液中（25mM Tris，192 mM 甘氨酸和20％的甲醇，pH 8.3）在100伏将所述GP73蛋白转移至硝酸纤维素膜1-2小时。将硝酸纤维素膜用含5％非脂肪干乳和0.05％吐温20的PBS缓冲液封闭约1小时。将硝酸纤维素膜与适当量的抗GP73单克隆抗体在10 mL的2.5％脱脂奶粉和0.05％吐温20 PBS缓冲液，pH7.2中孵育。所述硝酸纤维素膜用0.05％吐温20/ PBS，pH7.2洗涤，与缀合有HRP的山羊抗小鼠IgG抗体在室温下孵育1小时，并用0.05％吐温20/PBS缓冲液洗涤。结合GP73蛋白的抗体通过加入新鲜配制的在稳定的过氧化物缓冲液（Pierce, IL）中金属增强的、3,3'-二氨基联苯胺进行可视化。参见表8。
表8
抗体 HEK表达的GP73-hFc抗原上的Western印迹 CHO表达的GP73-hFc抗原上的Western印迹 大肠杆菌表达的GP73-hFc抗原上的Western印迹
抗-GP73 1B-3246 阳性 阳性 阳性
抗-GP73 1A-4246 阳性 阳性 阴性
抗-GP73 1A-3187 阳性 阳性 阴性
抗-GP73 1B-4863 阳性 阳性 阳性
抗-GP73 1B-3440 阳性 阳性 未完成
抗-GP73 1B-3263 阳性 阳性 未完成
GP73 14H4-23-288 阳性 未完成 阳性
抗体表征的总结显示在表9和10中。
表9
克隆# 同种型 Western印迹 CHO GP73 Western印迹 HEK GP73
1A-3187 lgG1k + +
1A-4246 lgG1k + +
1B-3246 lgG1k + +
1B-3440 lgG1k + +
1B-4863 lgG1k + +
1B-4971 lgG1k + +
14H4-23 N/A + +
表10
克隆# 游离AAL替换 结合大肠杆菌GP73 结合人IgG 游离岩藻糖替换 高碘酸化的GP73反应性
1A-3187 是 否 否 否 减少
1A-4246 否 否 否 否 强烈
1B-3246 否 是 否 否 强烈
1B-3440 否 是 否 否 强烈
1B-4863 是 是 否 否 减少
1B-4971 否 是 否 否 减少
14H4-23 否 是 否 否 强烈
实施例9
抗GP73单克隆抗体基因测序
使用可商购获得的试剂（Oligotex 直接mRNA试剂盒, Qiagen）按照制造商的建议，从适当的杂交瘤细胞培养物提取mRNA。重链和κ轻链的cDNA使用Superscript III（LifeTechnologies）和寡聚dT引物（Novagen），按照标准方案从提取的mRNA生成。根据制造商的指导，扩增子被克隆到可商购获得的载体（Life technologies）中，并转化到大肠杆菌中。使用M13正向和反向引物，使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒（AppliedBiosystems, Foster City, CA）在从多个转化的大肠杆菌菌落分离的质粒上进行序列分析，以鉴定重和轻链编码序列。参见表1和表2。图12-17显示具有鉴定的CDR序列的可变重和轻区域的图和氨基酸和核苷酸序列。
1A-3187可变轻（VL）序列使用IGKV21亚群的V区段。1A-4246和1B-3440 VL使用IGKV4/5亚群的V区段。1A-4863 VL序列使用IGKV19/28亚群的V区段。1B-3246 VL序列使用IGKV24/25亚群的V区段。1B-4971 VL序列使用IGKV2亚群的V区段。
1A-3187可变重（VH）序列使用Igh-VJ558 VH1家族的V区段。CDR-H2从CDR附近的典型抗体序列进行变化后的第一个氨基酸具有T而非K/R。1B-4971 VH序列还使用Igh-VJ558VH1家族的V区段。1B-3440 VH序列还使用IgH-V10 VH10家族的V区段。1B-4863 VH序列还使用Igh-VQ52 VH2家族的V区段。1A-4246和1B-3246 VH序列使用Igh-V7183 VH5家族的V区段。
实施例10
用抗GP73 MAb作图的GP73表位
使用表位切除随后通过LC/MS/MS方法用抗GP73单克隆抗体完成GP73的表位作图。所用的样品是GP73-hFc抗原和抗GP73MAb。
1.抗GP73MAb固定化到CNBr活化的琼脂糖树脂：20 mg的CNBr活化的琼脂糖树脂称重到具有玻璃料的紧凑的反应柱上。将树脂用200μL1mM的盐酸洗涤三次。将树脂用200μL100 mM NaHCO3 pH 8/500 mM NaCl缓冲液洗涤三次。将抗GP73 MAb加到该柱上。反应柱置于旋转器上在室温下4小时。将树脂用200μL 100 mM NaHCO3 pH 8/500 mM NaCl缓冲液洗涤三次。将200 µL的100mM Tris-HCl pH8/500 mM NaCl加到该柱，并将该柱在室温下旋转1小时。将树脂用200μl的100mM乙酸钠pH4/500 mM NaCl缓冲液和100mM的Tris-HCl pH8/500mM NaCl缓冲液洗涤三次。将树脂用200μL 100 mM NaHCO3 pH 8/100 mM NaCl缓冲液洗涤三次。加入200 µL 的100 mM NaHCO3 pH 8/100 mM NaCl缓冲液，并固定柱的顶盖。
2.抗原结合：将反应柱用200μL 100 mM NaHCO3 pH 8/500 mM NaCl缓冲液洗涤三次。将步骤1中制备的50 µL抗体树脂转移到新的反应柱。将树脂用200 µL 100 mM NaHCO3pH 8/100 mM NaCl缓冲液洗涤三次。将GP73-hFc抗原样品加到该柱上。反应柱置于旋转器上在室温下4小时。将树脂用200 µl 100 mM NaHCO3 pH 8/100 mM NaCl 缓冲液洗涤三次。
3.蛋白酶解：将200 µL 100 mM NaHCO3 pH 8/100 mM NaCl添加到柱。将胰蛋白酶添加到柱并且将所述反应柱置于旋转器上在室温下过夜。
4.洗脱：溶液冲洗通过并收集为流过级分。将树脂两次用200 µL 100 mM NaHCO3pH 8/100 mM NaCl缓冲液洗涤三次。将树脂用200 µL 100 mM NaHCO3 pH 8/500 mM NaCl缓冲液洗涤三次。将树脂用200 µL 100 mM NaHCO3 pH 8/100 mM NaCl缓冲液洗涤三次。添加200 µL 2%的甲酸用于洗脱。洗脱的级分和其它级分用Eppendorf Vacufuge干燥。
5.LC/MS/MS注射之前样品的C18 ziptip脱盐：洗脱的级分重构在10 µL 0.1% 三氟乙酸(TFA)中。C18 ziptip用50% ACN/H2O湿润3次。C18 ziptip用0.1% TFA湿润3次。抽吸和分配样品15次以结合。吸头用0.1% TFA洗涤7次。将样品用10 µL 50% ACN/H2O、0.1% TFA洗脱。
6.使用偶联Agilent 1200 HPLC的AB Sciex Q-Star Elite MS仪器通过LC/MS/MS分析洗脱的级分。参见表11和图18。
实施例11
GP73 mAb 结合动力学
使用Biacore2000仪器（GE Healthcare, Piscataway, NJ）确定抗-人GP73单克隆抗体1A-3187、1A-4246、1B-3246、1B-3440、1B-4863和1B-4971对于HEK表达的重组GP73-hFc（Abbott, Illinois, USA）的亲和力/动力学。首先，在用100 mM HCl、50 mM NaOH和0.1%SDS的两次注射预处理生物传感器之后，经由胺偶联试剂盒(GE Healthcare)提供的EDC/NHS/乙醇胺化学通过胺偶联兔抗小鼠IgG抗体（GE Healthcare）到CM5生物传感器芯片（GEHealthcare）上产生约13000-15000 RU的兔抗小鼠IgG捕获生物传感器。将纯化的GP73抗体和抗原（HEK GP73-hFc）稀释入包含补充有0.1％BSA和0.1％ CM-Dextran的HBS-EP缓冲液（GE Healthcare）的运行缓冲液（下文称为“运行缓冲液”）。每种GP73抗体稀释至1 µg/mL。所述GP73-hFc抗原使用3倍稀释系列稀释至0.412至100 nM的浓度，假设490 kDa的低聚分子量（Abbott Laboratories）。
该GP73-hFc抗原的程序如下。用运行缓冲液以5 µL/分钟平衡兔抗小鼠IgG捕获生物传感器3分钟之后，将GP73抗体（7-14 µL）注射到个别流通池，其中一个流通池留作空白，作为参考流通池。用运行缓冲液以60 µL/分钟的流速洗涤流通池3分钟。以随机浓度的150µL HEK293表达的GP73-hFc抗原注射横跨生物传感器。生物传感器随后以60 µL/分钟的流速用运行缓冲液重新平衡5分钟。所有的生物传感器表面用 10mM 甘氨酸，pH 1.7（GEHealthcare）的30 µL注射，以10 µL/分钟的流速进行再生。所有浓度的HEK293表达的抗原以一式两份进行测试。结合动力学（结合和解离）经由抗原注射和运行缓冲液再平衡过程中的传感图进行监测。传感图进行双重参考并使用Scrubber 2.0软件（BioLogic SoftwarePty Ltd., Australia）拟合到1：1结合模型，以确定结合和解离速率，以及总体KD。结果示于表12。确定的值的标准误差关于最小数位值报告于括号中。
实施例12
ARCHITECT® GP73数据
ARCHITECT®夹心免疫测定原理显示于图19。简而言之，包被在微粒上的抗体捕获目标分析物，然后缀合到吖啶鎓的第二抗体结合分析物上的第二表位，然后进行颗粒从标记物的分离和后续读取，以确定来自化学发光反应的相对光单位（RLU）。
单克隆抗体对，诸如作为捕获单克隆抗体的1A-4246和作为检测单克隆抗体的1B-4863，通过ELISA测试，以模仿GP73的相同表位，所述表位结合用作捕获抗体的DrexelUniversity小鼠单克隆抗体14H4-23，和用作检测抗体的兔多克隆抗体。最初的ARCHITECT®实验比较Drexel捕获抗体14H4-23与捕获抗体1A-4246。每个捕获抗体与稀释到0.5 nM的检测抗体1-B4863配对。对于1B-4863，吖啶鎓对抗体的掺入比例为3.9。如图20所示，基于使用在HEK293瞬时转染中产生的范围0-14.4 ng/mL的重组GP73-hFc融合蛋白的标准曲线，捕获抗体1A-4246优于Drexel捕获抗体14H4-23大约3倍。参见表13。
在后续的ARCHITECT®实验中，以0.2mg/mL的浓度的1A-4246用作捕获抗体，并且以0.5nM或2nM的浓度的1B-4863用作检测抗体。对于1B-4863，吖啶鎓对抗体的掺入比例为6.18。如预期的，2 nM的更高的缀合物浓度产生更大的信号（参见图21），但在Cal A中存在更高的背景（参见表14）。此GP73 ARCHITECT®数据显示，对于两种单克隆抗体对对重组GP73-hFc抗原非常线性的响应。
应当理解，前面的详细描述和所附实施例仅仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，其仅由所附权利要求及其等同物来限定。
对所公开的实施方案的各种变化和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。可以进行这些变化和修饰，包括但不限于那些涉及本发明的化学结构、取代、衍生物、中间体、合成、组合物、配方或使用方法的变化和修饰，而不偏离其精神和范围。

Claims (7)

1.至少一种捕获抗体和至少一种检测抗体在制备用于确定测试样品中GP73浓度的试剂盒中的用途，包括：
(a) 使所述测试样品与至少一种捕获抗体接触，所述捕获抗体包含：(i)包含包括SEQID NO:42的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和(ii)包含包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，所述捕获抗体结合GP73上的表位以形成捕获抗体-GP73抗原复合物；
(b) 使所述捕获抗体-GP73抗原复合物与至少一种包含可检测标记物的检测抗体接触，其中所述检测抗体包含：(i)包含包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:27的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3的可变重链，和(ii)包含包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR2和包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR3的可变轻链，所述检测抗体结合GP73上不被捕获抗体结合的表位并形成捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物；和
(c) 基于（b）中形成的捕获抗体-GP73抗原-检测抗体复合物中的可检测标记物产生的信号确定测试样品中的GP73浓度。
2.权利要求1的用途，其进一步包括比较测试样品中作为GP73浓度的直接或间接指示的可检测标记物产生的信号与对照或校准物中作为GP73浓度的直接或间接指示产生的信号。
3.权利要求2的用途，其中使用测试样品中的GP73浓度确定或评价对象是否具有肝脏疾病或处于发展肝脏疾病的风险中。
4.权利要求3的用途，其中相比对照或校准物中GP73浓度增加的GP73浓度指示所述对象具有肝脏疾病。
5.权利要求4的用途，其中所述肝脏疾病是肝硬化或肝癌。
6.权利要求1的用途，其中所述捕获抗体包含包括SEQ ID NO: 41的氨基酸序列的可变重链结构域和包括SEQ ID NO: 45的氨基酸序列的可变轻链结构域区。
7.权利要求1的用途，其中所述检测抗体包含包括SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的可变重链结构域和包括SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的可变轻链结构域区。
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