BR112014013656B1 - Anticorpo monoclonal isolado anti-rgmc, uso do mesmo para o tratamento de uma doença do metabolismo do ferro, bem como composição farmacêutica, kit e método para determinar presença, quantidade ou concentração de rgmc em amostras - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS RELACIONADOS AO FERRO INFORMAÇÃO DE APLICATIVO RELACIONADO São proporcionados aqui métodos para o uso de anticorpos que se ligam ao RGMc para tratar e diagnosticar distúrbios relacionados ao ferro.

Description

INFORMAÇÃO DE PEDIDO RELACIONADO

[001] Esse aplicativo reivindica os benefícios da U.S. Provisional Patent Application No. 61/570.715 depositada em 14 de Dezembro de 2011, os conteúdos da qual estão aqui totalmente incorporados para referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente aplicativo contém uma Listagem de Sequências a qual foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e está aqui incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 13 de Fevereiro de 2013, está nomeada como 029996-1767-WOO1_SL.txt e tem 105.782 bites de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção diz respeito a anticorpos e métodos de uso dos anticorpos para tratar e diagnosticar distúrbios relacionados ao ferro.

ANTECEDENTES

[004] Homeostase de ferro é crítica para o funcionamento normal do corpo. Devido o ferro ser central para a produção de hemoglobina, níveis deficientes de ferro resulta em anemia por deficiência de ferro. A sobrecarga de ferro pode também perturbar o equilíbrio de ferro ao inapropriadamente aumentar a absorção de ferro intestinal. Esse aumento frequentemente resulta na deposição de ferro no fígado, pâncreas, coração, pituitário, e outros órgãos, levando a danos no tecido e insuficiência do funcionamento normal desses órgãos.

[005] Uma variedade de distúrbios relacionados ao ferro pode ser atribuída, ao menos em parte, à má regulação de ferro e pode ser difícil para diagnosticar e tratar. Tais distúrbios incluindo doença de fígado, hipogonadismo, diabetes, cirrose, cardiomiopatia, anemia por deficiência de ferro, e anemia de doença crônica (“ACD”), que é caracterizada por uma má distribuição de ferro que é associada com infecção, malignidade e/ou inflamação crônica. Porque os sintomas relacionados a distúrbios relacionados ao ferro são frequentemente vagos e os efeitos resultantes tendem a não aparecer imediatamente, procedimentos atuais frequentemente falham para diagnosticar e tratar corretamente um distúrbio de ferro. Essas dificuldades podem causar atrasos ao administrar a apropriada terapia.

[006] Conformemente, há uma necessidade para métodos confiáveis de diagnóstico e tratamento para distúrbios relacionados ao ferro. Opções de tratamento atuais para distúrbios relacionados ao ferro, incluindo anemia de doença crônica, inclui a administração de agentes eritropoiéticos, tais como epoetina alfa, epoetina beta, e darbepoetina. Outros tratamentos incluem terapia com ferro e/ou transfusões de sangue oral e parental. Terapias de ferro, contudo, possuem eficácia limitada e são usualmente não recomendadas para indivíduos com ACD. Em adição, transfusões de sangue tem a questão permanente de falência de múltiplos órgãos e um aumento de mortalidade em pacientes em terapia intensiva. Conformemente existe uma necessidade para um novo método de tratamento para distúrbios relacionados ao ferro que é altamente específico, bem tolerado, e pode servir como uma terapia útil para aqueles indivíduos que não respondem à epoetina e os seus análogos relacionados de um modo suficiente.

RESUMO DA INVENÇÃO

[007] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada para um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo do mesmo o qual se liga à Molécula de Orientação Repulsiva c (“RGMc). O anticorpo compreende um domínio ou região selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (i) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, a CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, (j) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (k) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, (1) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (m) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, (n) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (o) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, (p) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (q) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34. O anticorpo pode ser uma molécula de imunoglobulina, um Fv ligado por dissulfeto, um anticorpo de afinidade maturada, um scFv, um anticorpo quimérico, um anticorpo de domínio simples, um anticorpo enxertado com CDR, um diacorpo, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo multiespecífico, um Fab, um anticorpo específico duplo, um DVD, um Fab', um anticorpo biespecífico, um F(ab')2, e um Fv. O anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo da reivindicação 2, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo compreende um domínio constante de imunoglobulina de cadeia pesada selecionado a partir do grupo consistindo em um domínio constante de IgM humano, um domínio constante de IgG4 humano, um domínio constante de IgG1 humano, um domínio constante de IgE humano, um domínio constante de IgG 2 humano, um domínio constante de IgG3 humano, e um constante domínio de IgA humano.

[008] O anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo pode compreender uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, ou uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9. O anticorpo pode compreender uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, ou uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10. O anticorpo pode compreender uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.

[009] O anticorpo pode compreender uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6. O anticorpo pode compreender uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8. O anticorpo pode compreender uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13.

[0010] O anticorpo pode compreender uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19.

[0011] O anticorpo pode compreender uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22.

[0012] O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25. O anticorpo pode compreender uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31. O anticorpo pode compreender uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16.

[0013] O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22.

[0014] O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28.

[0015] O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ainda compreender um agente selecionado a partir do grupo consistindo de: uma molécula de imunoadesão, um agente de imagem, e um agente terapêutico. O agente de imagem pode ser um marcador radioativo, uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador bioluminescente, um marcador magnético, ou biotina. O marcador radioativo pode ser 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 1311, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm.

[0016] Em outro aspecto, apresente invenção é também direcionada para um ácido nucleico isolado codificando qualquer um dos anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, aqui descritos. A presente descoberta é também direcionada a composições farmacêuticas que compreendem o aqui descrito anticorpo, fragmento de anticorpo, mistura ou derivados do mesmo.

[0017] Em outro aspecto, a presente invenção é também direcionada para um método de tratar uma doença de metabolismo de ferro. O método compreende as etapas de administração para um indivíduo na necessidade do mesmo de uma quantidade efetiva profilaticamente ou terapeuticamente de um anticorpo, em que o anticorpo compreende um domínio ou região selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (i) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, (j) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (k) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, (1) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (m) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, (n) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (o) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, (p) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (q) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, e (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (u) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, (v) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44, (w) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51, (x) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, (y) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, (z) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, (aa) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, (bb) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, (cc) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, (dd) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, (ee) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97, (ff) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100. (gg) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:119, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:120, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121, (hh) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:122, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:123, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:124, (ii) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:125, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:126, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127, (jj) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (kk) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:137, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:139, (11) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:141, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142, (mm) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:174, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:175, (nn) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:176, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:177, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:178, (oo) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100, (pp) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:119, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:120, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:122, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:123, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:124, (qq) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:125, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:126, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (rr) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:137, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:139 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:141, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142, (ss) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:174, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:175 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:176, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:177, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:178, em que uma doença de metabolismo de ferro no indivíduo é tratada terapeuticamente ou profilaticamente. Por exemplo, a doença de metabolismo de ferro tratada no método pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em Anemia de Doença Crônica (“ACD”), A anemia ferropriva refratária ao ferro, anemia da doença renal crônica, resistência aos agentes estimuladores da eritropoiese, e ß-talassemia.

[0018] Em outro aspecto, a presente invenção também diz respeito a um método para determinar se um indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. O método compreende as etapas de: a. medir o nível de RGMc solúvel ou associada à membrana em uma amostra a partir de um indivíduo; e b. comparar o nível de RGMc na amostra com o nível de RGMc de um controle ou calibrador normal, em que um nível alterado de RGMc indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro; e c. diagnosticar o indivíduo como possuindo um distúrbio relacionado ao ferro. Um nível alterado de RGMc conforme comparado ao controle pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. No método acima, um nível diminuído de RGMc associado à membrana conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, um nível diminuído de RGMc associado à membrana conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, um nível aumentado de RGMc associado à membrana conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. No método acima, um nível diminuído de RGMc solúvel conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. No método acima, um nível aumentado de RGMc solúvel conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, o indivíduo tem sido ou pode ter sido previamente diagnosticado com um distúrbio selecionado a partir do grupo consistindo em câncer, infecção aguda, infecção crônica, doença autoimune, doença hepática, e doença renal crônica. No método acima, a amostra pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em uma amostra de sangue e uma amostra de soro. No método acima, a etapa (a) é um imunoensaio, tal como um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

[0019] Especificamente, o ELISA pode ser um ELISA sanduíche. No método acima, o nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel em uma amostra pode ser determinado usando qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima.

[0020] Em outro aspecto, a presente invenção também diz respeito a um método de determinar a presença, quantidade ou concentração de RGMc ou um fragmento da mesma em uma amostra de teste. O método compreende as etapas de ensaio da amostra de teste para RGMc (ou um fragmento da mesma) através de um imunoensaio empregando ao menos um anticorpo e ao menos um marcador detectável e compreende a comparação de um sinal gerado pelo marcador detectável como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste a um sinal gerado como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de RGMc em um controle ou calibrador, em que um dos, pelo menos, um anticorpo é um anticorpo isolado, o qual especificamente se liga à RGMc ou um fragmento da mesma, e em que o anticorpo compreende uma região ou domínio selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N0:9, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (i) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, (j) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (k) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, (1) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (m) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, (n) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (o) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29 ,uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, (p) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (q) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (u) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, (v) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44, (w) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51, (x) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, (y) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, (z) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, (aa) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, (bb) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, (cc) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, (dd) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, (ee) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97, (ff) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100. (gg) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:119, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:120, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121, (hh) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:122, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:123, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:124, (ii) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:125, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:126, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127, (jj) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (kk) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:137, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:139, (11) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:141, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142, (mm) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:174, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:175, (nn) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:176, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:177, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:178, (oo) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100, (pp) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:119, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:120, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:122, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:123, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:124, (qq) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:125, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:126, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (rr) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:137, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:139 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:141, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142, (ss) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:174, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:175 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:176, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:177, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:178, após o que a presença, quantidade ou concentração de RGMc ou um fragmento da mesma em uma amostra de teste é determinada.

[0021] No método acima, a presença, quantidade ou concentração de RGMc ou um fragmento da mesma em uma amostra de teste é usada para determinar ou avaliar se um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver um distúrbio relacionado ao ferro. No método acima, a RGMc é RGMc associada à membrana ou RGMc solúvel. No método acima, um nível diminuído de RGMc associada à membrana conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, um nível aumentado de RGMc associada à membrana conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. No método acima, um nível diminuído de RGMc solúvel conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. No método acima, um nível aumentado de RGMc solúvel conforme comparado ao nível de RGMc de um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, o distúrbio relacionado ao ferro é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer, infecção aguda, infecção crônica, doença autoimune, doença hepática, e doença renal crônica. Adicionalmente, o método acima pode ainda compreender as seguintes etapas: a. contatar a amostra de teste com ao menos um anticorpo de captura, o qual se liga a um epítopo na RGMc (ou um fragmento da mesma) de modo a formar um complexo de RGMc/ anticorpo de captura (ou um fragmento do mesmo), b. contatar o complexo de RGMc/ anticorpo de captura (ou um fragmento do mesmo) com ao menos um anticorpo de detecção, o qual compreende um marcador detectável e se liga a um epítopo na RGMc (ou fragmento da mesma) que não está vinculada pelo anticorpo de captura, para formar um complexo de anticorpo de captura/ RGMc (ou um fragmento da mesma)/ anticorpo de detecção, e c. determinar a presença, quantidade ou concentração de RGMc (ou um fragmento da mesma) na amostra de teste baseada no sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura/ RGMc (ou um fragmento da mesma)/ anticorpo de detecção formado em (b), sobre o qual a presença, quantidade ou concentração de RGMc (ou um fragmento da mesma) na amostra de teste é determinada.

[0022] Alternativamente, o método acima pode ainda compreender as seguintes etapas: a. contatar a amostra de teste com ao menos um anticorpo de captura, o qual se liga a um epítopo na RGMc (ou um fragmento da mesma) assim como para formar um complexo de anticorpo de captura/ RGMc (ou um fragmento da mesma), e simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem, contatar a amostra de teste com RGMc (ou fragmento da mesma) detectavelmente marcada, a qual pode competir com qualquer RGMc (ou fragmento da mesma) na amostra de teste pela ligação ao, ao menos um, anticorpo de captura, em que qualquer RGMc (ou um fragmento da mesma) presente na amostra de teste e a RGMc detectavelmente marcada competem uma com a outra para formar um complexo de anticorpo de captura/ RGMc (ou um fragmento da mesma) e um complexo de anticorpo de captura/ RGMc detectavelmente marcada (ou um fragmento da mesma), respectivamente, e b. determinar a presença, quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste baseado no sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura/ RGMc detectavelmente marcada (ou um fragmento da mesma) formado em (b), em que o sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura/ RGMc detectavelmente marcada (ou um fragmento da mesma) é inversamente proporcional à quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste, sobre o qual a presença, quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste é determinada. O método acima pode ainda compreender ensaio da amostra de teste para hepcidina.

[0023] Em outro aspecto, a presente invenção também diz respeito a um método para determinar se um indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. O método compreende as etapas de: a. medir o nível de RGMc solúvel ou associada à membrana em uma primeira amostra de teste do indivíduo; b. medir o nível de hepcidina em uma segunda amostra do indivíduo; c. comparar o nível de RGMc na primeira amostra de teste com o nível de RGMc em um controle normal ou calibrador, e d. comparar o nível de hepcidina na segunda amostra com o nível de hepcidina em um controle normal ou calibrador, em que um nível alterado de cada RGMc e hepcidina indicam que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro; e e. diagnosticar o indivíduo como possuindo um distúrbio relacionado ao ferro.

[0024] No método acima, um nível diminuído de RGMc associada à membrana conforme comparado ao nível de RGMc associado à membrana em um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, um nível aumentado de RGMc associado à membrana conforme comparado ao nível de RGMc associado à membrana em um controle normal, indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. No método acima, um nível diminuído de RGMc solúvel conforme comparado ao nível de RGMc solúvel em um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. No método acima, um nível aumentado de RGMc solúvel conforme comparado ao nível de RGMc solúvel em um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, um nível diminuído de hepcidina conforme comparado ao nível de hepcidina em um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. No método acima, um nível aumentado de hepcidina conforme comparado ao nível de hepcidina em um controle normal indica que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro.

[0025] No método acima, um indivíduo tem sido diagnosticado com um distúrbio selecionado a partir do grupo consistindo em câncer, infecção aguda, infecção crônica, doença autoimune, doença hepática, e doença renal crônica. No método acima, o nível de RGMc solúvel ou associada à membrana e o nível de hepcidina em cada uma da primeira e segunda amostra são determinados sequencialmente. No método acima, o nível de RGMc solúvel ou associada à membrana e o nível de hepcidina em cada uma da primeira e da segunda amostra são determinados simultaneamente.

[0026] No método acima, a amostra é selecionada a partir do grupo consistindo em uma amostra de sangue e uma amostra de soro. No método acima, a etapa a) é um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Por exemplo, o ELISA é um ELISA sanduíche. No método acima, o nível de RGMc associada à membrana ou RGMc solúvel em uma amostra é determinado usando qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima.

[0027] Qualquer ensaio para RGMc (tal como RGMc associado à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associados à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (RGMc solúvel ou associada à membrana) ou quaisquer combinações das mesmas) e hepcidina podem ser simultânea ou sequencial, em qualquer ordem, usando o mesmo tipo de metodologia ou diferente metodologia e usando a mesma amostra de teste ou uma diferente amostra de teste obtida a partir da mesma fonte, tal como o mesmo paciente. Alternativamente, o método pode também compreender o uso de dados obtidos a partir de ensaio de uma amostra de teste obtida a partir da mesma fonte, tal como o mesmo paciente, mas tanto analisada ou obtida e analisada para hepcidina em um ponto diferente no tempo.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção também diz respeito a um kit para analisar uma amostra de teste para RGMc (ou um fragmento da mesma). O kit pode compreender ao menos um componente para analisar a amostra de teste para RGMc (ou um fragmento da mesma) e instruções para analisar a amostra de teste para RGMc (ou um fragmento da mesma), em que o ao menos um componente inclui ao menos uma composição compreendendo um anticorpo isolado que especificamente se liga à RGMc (ou um fragmento da mesma), em que o anticorpo compreende um domínio ou região selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (i) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, (j) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (k) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, (1) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (m) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, (n) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (o) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, (p) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (q) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (u) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, (v) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44, (w) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51, (x) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, (y) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, (z) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, (aa) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, (bb) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, (cc) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, (dd) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, (ee) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97, (ff) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100, (gg) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:119, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:120, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121, (hh) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:122, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:123, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:124, (ii) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:125, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:126, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127, (jj) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (kk) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:137, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:139, (11) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:141, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142, (mm) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:174, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:175, (nn) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:176, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:177, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:178, (oo) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:95, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:96, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:97 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:98, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:99, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:100, (pp) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:119, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:120, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:122, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:123, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:124, (qq) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:125, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:126, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:127 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:128, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130, (rr) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:137, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:139 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:141, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142, (ss) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:174, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:175 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:176, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:177, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:178, em que o anticorpo é opcionalmente detectavelmente marcado. No kit acima, a RGMc ou um fragmento da mesma analisada na amostra de teste é usada para determinar ou avaliar se um indivíduo possui ou está em risco de desenvolver um distúrbio relacionado ao ferro. Adicionalmente, a RGMc analisada é RGMc solúvel ou RGMc associada à membrana. O kit pode ainda compreender ao menos um componente para analisar uma amostra de teste para hepcidina e instruções para analisar a amostra de teste para hepcidina.

BREVE DECRIÇÃO DOS DESENHOS

[0029] A figura 1 mostra um esquema simplificado de uma via de sinalização relacionada à homeostasia de ferro.

[0030] A figura 2 mostra outro esquema simplificado de uma via de sinalização relacionada à homeostasia de ferro.

[0031] A figura 3 é um histograma que mostra o 5F9.23 (h5F9.23) humanizado aumenta os níveis de ferro no sangue de ratos. A figura 3 mostra os dados a partir de ratos tratados uma vez por semana por uma injeção intravenosa de 0, 20, 60 ou 200 mg/kg. Os níveis de ferro no sangue foram aumentados significantemente em todas as doses de h5F9.23 usadas (significância: **p<0,01; *** P<0,001). Estes dados mostram que o h5F9.23 aumenta os níveis de ferro no sangue de ratos.

[0032] A figura 4 é um histograma que mostra que h5F9.23 aumenta os níveis de transferrina 1 saturada (%) em ratos. Os níveis de transferrina 1 saturada foram medidos em ratos que foram tratados uma vez por semana por uma injeção IV de 0, 20, 60 ou 200 mg/kg de h5F9.23. Os níveis de transferrina 1 saturada estavam significantemente aumentados em todas as doses h5F9.23 (significância: *** p < 0,001).

[0033] A figura 5 é um histograma que mostra que h5F9.23 aumenta os níveis de transferrina 2 saturada (%) em ratos. Os níveis de transferrina 2 saturada foram medidos em ratos que foram tratados uma vez por semana por uma injeção IV de 0, 20, 60 ou 200 mg/kg de h5F9.23. Os níveis de transferrina 2 saturada estavam aumentados significantemente em todas as doses de h5F9.23 (significância: ** p<0,01; *** p<0,001).

[0034] A figura 6 é um histograma que mostra que h5F9.23 diminui a capacidade de ligação do ferro insaturado (UIBC) em ratos. A capacidade de ligação do ferro insaturado (UIBC) foi então medida em ratos que foram tratados uma vez por semana por uma injeção IV de 0, 20, 60 ou 200 mg/kg de h5F9.23. Os níveis de UIBC estavam diminuídos significantemente para todas as doses de h5F9.23 (significância: *** p < 0,001).

[0035] A figura 7 mostra uma amostra de fígado de rato fixada (controle) manchada com azul da Prússia (X100 magnificação). As setas são direcionadas para a região periportal do lobo hepático.

[0036] A figura 8 mostra uma amostra de fígado de rato fixada (tratada — 200 mg/kg/por semana de h5F9.23) manchada com azul da Prússia (X100 magnificação). As setas são direcionadas para a região periportal do lobo hepático. Os grânulos coloridos em preto representam o ferro.

[0037] A figura 9 mostra uma amostra de baço de rato fixada (controle) manchada com azul da Prússia (X40 magnificação). Os macrófagos carregados com ferro são mostrados na polpa vermelha entre os folículos linfáticos (F).

[0038] A figura 10 mostra uma amostra de baço de rato fixada (tratada — 200 mg/kg/por semana de h5F9.23) colorida com azul da Prússia (X40 magnificação). Os macrófagos na polpa vermelha entre os folículos linfáticos (F) liberaram ferro no soro.

[0039] A figura 11 mostra um ensaio reporter de BMP mediado por RGMc em células 293HEK para avaliar Abs de afinidade maturada de h5F9 para bloquear a função RGMc. (A) Um esquema do ensaio reporter BMP mediado por RGM. (B) O hibridoma do rato mAb 5F9, h5F9.23 e seus Abs de afinidade maturada inibiram a atividade luc mediada por RGMc de uma maneira dose dependente. Os valores IC50 são mostrados perto da legenda. O eixo Y representa uma atividade de luciferase como unidades de luz relativas (RLU).

[0040] A figura 12 é um histograma que mostra os resultados do exemplo 5 onde as fêmeas de macaco ciano foram tratadas com diferentes doses de anticorpo humanizado 5F9.23 (h5F9.23). Os macacos foram injetados subcutaneamente, subcutaneamente com 60 mg/kg (sc) ou intravenosamente com 20, 60. 200 mg/kg (iv) uma vez por semana por 4 semanas. No dia 22 o sangue de soro de primatas foi coletado a 0,5 horas, 4 horas, 24 horas após a aplicação do anticorpo (4a dose). A Hepicidina foi medida usando um método de espectrometria de massa. *** p < 0,001: significância versus pré-teste, * p < 0,05: significância versus pré-teste, p < 0,05: significância versus controle.

[0041] A figura 13 é um histograma que mostra os resultados do Exemplo 6, onde as fêmeas de ratos Sprague Dawley foram tratadas com diferentes doses de anticorpo h5F923.AM8. Os ratos foram injetados intravenosamente com 2,5 mg/kg, 5 mg/kg 10mg/kg ou 20 mg/kg uma vez por semana por 4 semanas. No final da semana 4, o soro foi coletado e determinado o seguinte: (1) níveis de ferro livre no sangue (Figura 13A) e (2) capacidade de ligação ao ferro insaturado (Figura 13B). *** significância versus salina tamponada com fosfato (PBS) (cinza claro), *** p < 0,01: significância versus anticorpo monoclonal IgG humano (preto). O controle é um anticorpo IgG humano direcionado contra o IL-18 que foi obtido a partir do Abbott Laboratories, Worcestser, MA. O controle não foi reativo cruzado com a proteína de rato IL-18.

[0042] A figura 14 é um histograma que mostra os resultados do Exemplo 7, onde as fêmeas de ratos Sprague Dawley foram tratadas com doses diferentes de anticorpo h5F923.AM8. Os ratos forma injetados intravenosamente com 0,02 mg/kg, 0,2 mg/kg 2,0 mg/kg ou 20 mg/kg uma vez por semana por 4 semanas. No final da semana 4, o soro foi coletado e determinado o seguinte: (1) níveis de ferro livre no sangue (Figura 14A) e (2) capacidade de ligação ao ferro insaturada (Figura 14B). *** p < 0,001 significância versus veículo de controle; ** p <0,01 significância versus veículo de controle; * p <0,05 significância versus veículo de controle. O veículo de controle compreende uma solução de 30mM de Histidina, 8% w/v de sacarose, pH 6,0 plus 0,02% Tween 80 em água.

[0043] A figura 15 é um histograma que mostra os resultados de um primeiro conjunto de experimentos descritos no exemplo 8, demonstrando que o h5F923.AM8 e o 1A-2989 melhoraram a anemia em ratos com ACD no dia 30 aumentando o nível de hemoglobina. Também mostrado nesta figura, a dorsomorfina foi inativa.

[0044] A figura 16 é um histograma que mostra os resultados específicos de uma segunda série de experimentos descritos no exemplo 8. Especialmente, a figura 16A mostra que o anticorpo de controle hIgG não muda significantemente o nível de hemoglobina baixo dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51. * p < 0,05: significância versus nível de hemoglobina DO. A figura 16B mostra que o anticorpo monoclonal humanizado que foi seletivo para RGM A não muda significantemente o nível de hemoglobina baixo dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51. * p < 0,05, ** p < 0,01, significância versus nível de hemoglobina DO. A figura 16C mostra que o anticorpo h5F9.AM8 aumenta significantemente o nível de hemoglobina baixo (D24) dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51. >'** p < 0,001, significância versus Dia 0 (DO) nível de hemoglobina. D41: * p < 0,05 significância versus D24, D47/55: * p < 0,05 significância versus D24. A figura 16D mostra que o anticorpo h5F9.23, aumenta o nível de hemoglobina baixo (dia 24 (D24) dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51.* p < 0,05; ** p < 0,001, significância versus nível de hemoglobina DO no dia 41: p < 0,05 significância versus dias 24, 47 e 51: p < 0,05 significância versus dia.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0045] RGMc é um uma proteína de membrana ancorada por glicosilfosfatidilinositol ("GPI") expressa no músculo, na retina e nos hepatócitos periportal. O RGMc funciona em conjunto com a hepicidina através de proteínas de sinalização para manter a homesostátese de ferro no corpo. Veja, por exemplo, Severyn et al., Biochem. J., 422: 393-403 (2009) e Pietrangelo, J. Hepatology, 54: 173181 (2011). O Cell membrane RGMc de membrana celular se liga a neogenina e facilita a sinalização através das proteínas morfogenéticas do osso (BMPs), que desencadeia uma sinalização intracelular através dos efetores abaixo para promover a expressão de gene de hepicidina. Veja novamente, por exemplo, Pietrangelo, J. Hepatology, 54: 173-181 (2011). O RGMc solúvel é liberado por clivagem do RGMc ligado a membrana por uma protease de serina, matriptase-2 (TMPRSS6). A liberação do RGMc solúvel é induzida pela diminuição das concentrações extracelulares de ferro e, conversamente, inibida pelas concentrações extracelulares aumentadas de ferro. Veja novamente, por exemplo, Severyn et al,, Biochem. J., 422: 393-403 (2009) e a Figura 1. A forma solúvel de RGMc sequestra o BMP6 do RGMc ligado a membrana, prevenindo ali a indução de uma expressão de hepicidina. Veja a figura 2.

[0046] Após a ligação do BMP aos receptores BMP I e II, um complexo de membrana associada é formado com a neogenina, BMP6 e RGMc. Este complexo, junto com as proteínas intracelulares, chamadas Smads (Smads 1, 5 e 8), transduzem os sinais extracelulares iniciando ali um caminho de sinalização que governa a expressão de hepicidina, e finalmente, o metabolismo de ferro sistêmico. Veja novamente, por exemplo, Pietrangelo, J. Hepatology, 54: 173-181 (2011) e a figura 1. A hepicidina se liga a ferroportinaa, o exportador de ferro exclusive dos mamíferos. Após a hepicidina se ligar a ferroportinaa, a ferroportinaa é internalizada por macrófagos e enterócitos duodenais onde este é reduzido, fechando ali o caminho de exportação de ferro. Veja, por exemplo, Hentz et al, Cell, 142: 24-38 (2010) e Cheng et al., Clin. Exp. Med., 11: 33-42 (2011).

[0047] Ambos macrófagos e enterócitos duodenais expressam ferroportina; a níveis de altos de hepcidina, a degradação induzida por hepcidina da ferroportina fecha o único caminho de exportação de ferro disponível. Como uma consequência, ambos macrófagos e enterócitos duodenais acumulam grandes quantidades de ferro intracelular. Veja a figura 1. A Anemia de doença crônica ("ACD") é uma consequência comum, já que estas células não são mais capazes de liberar o ferro no sangue. Veja novamente, por exemplo, Cheng et al., Clin. Exp. Med., 11: 33-42 (2011).

[0048] Os anticorpos específicos de RGMc interrompem a expressão normal de hepcidina, que regula diretamente a concentração de ferro no plasma e a distribuição de ferro para uma variedade de tecidos. Os anticorpos podem prevenir a ligação entre BMPs e RGMc. Os anticorpos podem prevenir a ligação entre os BMPs e o N-terminal de RGMc. Uma consequência desta ação, é a expressão diminuída ou inibida de hepcidina. Como os níveis de hepcidina diminuem, a exportação dependente de ferroportina do ferro é aumentada porque a hepcidina não está mais disponível para se ligar a ferroportina e induzir sua internalização e degradação. Veja a figura 2.

[0049] Os inventores fizeram uma descoberta surpreendente de que os anticorpos, que se ligam à Molécula de Orientação Repulsiva c ("RGMc"), podem ser usados para regular o metabolismo do ferro. Proporcionado aqui estão os anticorpos que interrompem a expressão natural da hepcidina, que regula diretamente a concentração de ferro no plasma e a distribuição do ferro para uma variedade de tecidos. Níveis em excesso de hepcidina causam uma anemia restrita por ferro. Por exemplo, um aumento pronunciado nos níveis de hepcidina foram reportados em pacientes sofrendo de ACD e em pacientes sofrendo com inflamação aguda (AI). Os níveis de hepcidina levemente aumentados foram observados em pacientes sofrendo de ACD e anemia por deficiência de ferro (ACD-IDA). Os pacientes sofrendo apenas de anemia por deficiência de ferro (IDA) mostraram uma tendência em direção a níveis de hepcidina no soro menores. Por exemplo, os níveis de hepcidina no soro tem sido mostrado como sendo 177,58 µg/l (+/- 119,84) em controles saudáveis, 434,83 µg//l (+/- 217) em pacientes com ACD, 410,08 µg/l (+/-299,96) em pacientes com AI, 238,32 µg/l (+/-93.85) em pacientes com ACD-IDA e um nível de hepcidina de soro levemente diminuído em pacientes com IDA 110,79 µg/l (+/-19,22). Em contraste, a hemocromatose é caracterizada pelos níveis baixos de hepcidina no soro. Além disso, a ß-talassemia é uma doença onde os níveis de hepcidina podem ser baixos.

[0050] Os anticorpos divulgados aqui são úteis no tratamento das doenças do metabolismo do ferro. Além disso, os anticorpos divulgados aqui são usados em ensaios de diagnóstico para determinar se um indivíduo tem um distúrbio relacionado ao ferro.

1. DEFINIÇÕES

[0051] A terminologia usada aqui é com o propósito de descrever as modalidades particulares apenas e não pretende ser limitante. Como usado aqui na especificação e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma, “o” e “a” incluem suas referências no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário.

a. CERCA

[0052] "Cerca" como usado aqui pode se referir a aproximadamente +/- 10% em variação a partir de um estado de valor. Também é para ser entendido que tal variação é sempre incluída em qualquer dado valor proporcionado aqui, especificada ou não a referência é feita a este.

b. ANTICORPO DE AFINIDADE MATURADA

[0053] "Anticorpo de afinidade maturada" é usado aqui para se referir a um anticorpo com uma ou mais alterações em um ou mais CDRs, que resulta em um aperfeiçoamento da afinidade (isto é, KD, kd ou ka) do anticorpo para um antígeno alvo comparado a um anticorpo parente, que não possui a alteração(s). Os exemplos de anticorpos de afinidade maturada terão afinidades nanomoleculares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Uma variedade de procedimentos para produzir os anticorpos de afinidade maturada são conhecidos na arte, incluindo a triagem de uma biblioteca de anticorpo combinatório que tem sido preparada usando uma bio-exibição. Por exemplo, Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade misturando o domínio VH e VL. A mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 38093813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). Uma mutação seletiva em posições de mutagênese seletiva e em posições de contato ou hipermutação com um resíduo de aminoácido aumentando a atividade é descrito na U.S. Pat. No. 6,914,128 Bl.

c. ANTICORPO E ANTICORPOS

[0054] "Anticorpo" e "anticorpos" como usado aqui se referem a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados (completamente ou particularmente humanizados), anticorpos de aninais (tal como, mas não limitado a, um pássaro (por exemplo, um pato ou um ganso), um tubarão, uma baleia, e um mamífero, incluindo um não primata (por exemplo, uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um Coelho, uma ovelha, um hamster, um porquinho da índia, um gato, um cachorro, um rato, um camundongo, etc.) ou um primata não humano (por exemplo, um macaco, um chimpanzé, etc.), anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples ("scFv"), anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples, Fragmentos Fab, Fragmentos F(ab’), fragmentos F(ab')2, Fvs ligados por dissulfetos ("sdFv"), e anticorpos antiidiotípicos ("anti-Id"), anticorpos de domínio duplo, anticorpos de domínio variável triplo (TVD) ou domínio variável duplo (DVD) (métodos e imunoglobulinas de domínio variável duplo para fazê-las são descritos em Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11): 1290-1297 (2007) e PCT International Application WO 2001/058956, conteúdo de cada um dos quais está aqui incorporado para referência), e fragmentos de ligação de epítopo ativo funcionalmente de qualquer um dos acima. Em particular os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos ativos imunologicamente de moléculas de imunoglobulina, chamados moléculas que contém um local de ligação ao analito. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse. Para facilitar as explicações, um anticorpo contra um analito é frequentemente referido aqui como sendo tanto um, “anticorpo anti-analito”, ou meramente um “anticorpo analito”, (por exemplo, um anticorpo anti-RGMc ou um anticorpo RGMc).

d. FRAGMENTO DE ANTICORPO

[0055] Um "fragmento de anticorpo" como usado aqui se refere a uma parte de um anticorpo intacto compreendendo o local de ligação ao antígeno ou região variável. A parte não inclui os domínios de cadeia pesada constantes (isto é, CH2, CH3 ou CH4, dependendo do isótipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacorpos, moléculas Fv de cadeia simples (scFv), polipeptídios de cadeia simples contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, polipeptídios de cadeia simples contendo os três CDRs do domínio variável de cadeia leve, polipeptídios de cadeia simples contendo apenas uma região variável de cadeia pesada, e polipeptídios de cadeia simples contendo os três CDRs da região variável de cadeia pesada.

e. CONSTANTES DE LIGAÇÃO

[0056] As "Constantes de Ligação " são descritas aqui. O termo “constante da taxa de associação”, "kon" ou "ka" como usado aqui, refere-se ao valor indicando a taxa de ligação de um anticorpo a seu antígeno alvo ou a taxa de formação de complexo entre um anticorpo e um antígeno como mostrado pela equação abaixo:

[0057] O termo "constante da taxa de dissociação," "koff" ou "kd" como usado intercambiadamente aqui, refere-se ao valor indicando a taxa de dissociação de um anticorpo forme seu antígeno alvo ou separação de um complexo Ab-Ag ao longo do tempo nos antígenos e anticorpos livres como mostrado pela equação abaixo:

[0058] Os métodos para determinar a associação e a constante taxa de dissociações são bem conhecidos na arte. Usando técnicas com base em fluorescência oferece uma alta sensibilidade e a capacidade de examinar as amostras nos tampões fisiológicos em equilíbrio. Outras abordagens experimentais e instrumentos tal como o ensaio BlAcore® (análise de interação molecular) pode ser usado (por exemplo, um instrumento disponível pela BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Suécia). Adicionalmente, um ensaio KinExA® (Ensaio de Exclusão Cinética), disponível pela Sapidyne Instruments (Boise, Idaho) pode ser usado.

[0059] O termo "constante de dissociação de equilíbrio" ou "KD" como usado intercambiadamente, aqui, refere-se ao valor obtido dividindo uma taxa de dissociação (koff) pela taxa de associação (kon). A taxa de associação, a taxa de dissociação e a constante de dissociação de equilíbrio são usados para representar uma afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno.

f. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO

[0060] A "proteína de ligação" é usada aqui para se referir a uma proteína monomérica ou multimérica que se liga a e forma um complexo com o parceiro de ligação, tal como, por exemplo, um polipeptídio, um antígeno, um composto químico ou outra molécula, ou um substrato de qualquer tipo. Uma proteína de ligação se liga especificamente a um parceiro. As proteínas de ligação incluem anticorpos, assim como os fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo e outras várias formas e derivados do mesmo como são conhecidos na arte e descritos aqui abaixo, e outras moléculas compreendendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno que se ligam a uma molécula e antígeno ou a um local em particular (epitopo) na molécula e antígeno. Portanto, uma proteína de ligação inclui, mas não está limitada a, um anticorpo, uma imunoglobulina tetramérica, uma molécula IgG, uma molécula IgGi, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo humanizado, um anticorpo de afinidade maturada, e fragmentos de qualquer um dos tais anticorpos que retém a capacidade de se ligar a um antígeno.

g. ANTICORPO BIESPECÍFICO

[0061] O "anticorpo biespecífico" é usado aqui para se referir a um anticorpo de comprimento complete que é gerado pela tecnologia quadroma (veja Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)), pela conjugação química de dois anticorpos monoclonais diferentes (veja, Staerz et al., Nature, 314(6012): 628631 (1985)), ou por calombo no buraco ou abordagens similares, que introduzem mutações nas regiões Fc (veja Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)), resultando em múltiplas espécies de imunoglobulina diferentes das quais apenas uma é um anticorpo biespecífico funcional. Um anticorpo biespecífico liga um antígeno (ou epítopo) em um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC), e liga um antígeno (ou epítopo) em seu segundo braço (um par diferente de HC/LC). Por esta definição, um anticorpo biespecífico tem dois braços de ligação ao antígeno distintos (e ambas a especificidade e as sequências CDR), e é monovalente para cada antígeno ao qual este se liga.

h. CDR

[0062] "CDR" é usado aqui para se referir a uma "região determinando complementariedade" dentro de uma sequência variável de anticorpo. Há três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas "CDRl", "CDR2", e "CDR3", para cada uma das regiões variáveis. O termo "conjunto CDR" como usado aqui refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável que se liga ao antígeno. Os limites exatos destes CDRs têm sido definidos diferentemente de acordo com sistemas diferentes. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al.. Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)) não apenas proporcionam um Sistema de numeração de resíduo ambíguo aplicável a qualquer região variável uma taxa de dissociação, mas também proporciona limites de resíduo precisos definindo os três CDRs. Estes CDRs podem ser referidos como "Kabat CDRs". Chothia e seus colegas de trabalho (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); e Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989)) descobriram que certas subposições dentro dos Kabat CDRs adotam conformações de esqueleto de peptídeo quase idênticas, em vez de ter uma grande diversidade no nível da sequência de aminoácido. Estas subpartes foram designadas como "Ll", "L2". e "L3", ou "Hl", "H2", e "H3", onde o "L" e o "H" designam as regiões de cadeia leve e pesada, respectivamente. Estas regiões podem ser referidas como "Chothium CDRs", que tem limites que se sobrepõe com os Kabat CDRs. Outros limites definindo a sobreposição com os Kabat CDRs tem sido descrita por Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995), e MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996). Ainda outras definições de limites CDR pode não seguir estritamente um dos sistemas aqui, mas, no entanto, se sobrepõe com os Kabat CDRs, embora eles possam ser encurtados ou alongados tendo em conta a predição ou as descobertas experimentais de que os resíduos particulares ou os grupos de resíduos ou ainda os CDRs inteiros não impactam significantemente na ligação de antígeno. Os métodos usados aqui podem utilizar os CDRs definidos de acordo com qualquer um destes sistemas, embora certas modalidades usem os CDRs definidos por Kabat- ou Chothia.

i. COMPONENTE OU COMPONENTES

[0063] "Componente," "componentes," ou "pelo menos um componente," refere-se geralmente a um anticorpo de captura, uma detecção ou conjugar um calibrador, um controle, um painel com sensibilidade, um container, um tampão, um diluente, um sal, uma enzima, um co-fator para uma enzima, um reagente de detecção, uma solução/ reagente de pré-tratamento, um substrato, (por exemplo, como uma solução), uma solução de parada, e similares que podem ser incluídos em um kit para ensaio de uma amostra de teste, tal como uma urina de paciente, um soro ou amostra de plasma, de acordo com os métodos descritos aqui e outros métodos conhecidos na arte. Alguns componentes podem estar em uma solução ou liofilizados para reconstrução para uso em um ensaio.

j. CONSENSO OU SEQUÊNCIA CONSENSO

[0064] "Consenso" ou "Sequência Consenso" como usado aqui refere-se a uma sequência de ácido nucleico sintético, ou uma sequência de polipeptídio correspondente, construída com base em análise de um alinhamento de subtipos múltiplos de um antígeno em particular. A sequência pode ser usada para induzir uma imunidade ampla contra os sorotipos e os subtipos múltiplos de um antígeno em particular. Os antígenos sintéticos, tal como as proteínas de fusão, podem ser manipulados para sequências de consenso (ou antígenos de consenso).

k. CONTROLE

[0065] "Controle" como usado aqui refere-se a uma composição conhecida por não conter um analito de interesse ("negativo"), por exemplo, RGMc (tal como um RGMc associado a membrana, um RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associados a membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (RGMc solúvel ou associado a membrana) ou quaisquer combinações dos mesmos), ou para conter um analito de interesse ("controle positivo"), por exemplo, RGMc (tal como um RGMc associado a membrana, um RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associado a membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (RGMc solúvel ou associado a membrana) ou quaisquer combinações dos mesmos). Um controle positivo pode compreender uma concentração conhecida de RGMc. "Controle," "controle positivo," e "calibrador" podem ser usados intercambiadamente aqui para se referir a uma composição compreendendo uma concentração conhecida de RGMc. O "controle positivo " pode ser usado para estabelecer características de desempenho de ensaio e é um indicador útil da integridade dos reagentes (por exemplo, analitos). Um "controle normal" pode se referir a uma amostra ou um indivíduo que é livre de um distúrbio ou doença relacionada ao ferro.

l. DERIVADO

[0066] "Derivado" de um anticorpo como usado aqui pode se referir a um anticorpo tendo uma ou mais modificações em sua sequência de aminoácidos quando comparado a um anticorpo parental ou genuíno e exibe uma estrutura de domínio modificada. O derivado pode ainda ser capaz de adotar uma configuração de domínio típica encontrada nos anticorpos nativos, assim como uma sequência de aminoácido, que pé capaz de se ligar aos alvos (antígenos) com especificidade. Os exemplos típicos de derivados de anticorpos são anticorpos acoplados a outros polipeptídios, domínios de anticorpos rearranjados ou fragmentos de anticorpos. O derivado também pode compreender pelo menos um outro composto, por exemplo, um domínio de proteína, tal domínio de proteína sendo ligado por ligações covalentes ou não covalentes. A ligação pode ser com base em uma fusão genética de acordo com os métodos conhecidos na arte. O domínio adicional presente na proteína de fusão compreende um anticorpo empregado de acordo com a invenção pode ser preferencialmente ligado por um ligante flexível, vantajosamente um ligante de peptídeo, onde tal ligante de peptídeo compreende aminoácidos ligados por peptídeos hidrofílicos no plural de um comprimento suficiente para abranger a distância entre a extremidade de C-terminal de um outro domínio de proteína e a extremidade de N- terminal do anticorpo ou vice-versa. O anticorpo pode ser ligado a uma molécula efetora tendo uma conformação compatível para a atividade biológica ou uma ligação seletiva para um suporte sólido, uma substância ativa biologicamente (por exemplo, uma citocina ou um hormônio do crescimento), um agente químico, um peptídeo, uma proteína ou um fármaco, por exemplo.

m. ANTICORPO ESPECÍFICO DUPLO

[0067] Um "anticorpo específico duplo" é usado aqui para se referir a um anticorpo de comprimento completo que pode ligar dois antígenos diferentes (ou epítopos) em cada um de seus dois braços de ligação (um par de HC/LC) (veja PCT publication WO 02/02773). Portanto, uma proteína específica dupla tem dois braços de ligação de antígenos idênticos, com sequências CDR idênticas e especificidade idêntica, e é bivalente para cada antígeno ao qual se liga.

n. DOMÍNIO VARIÁVEL DUPLO

[0068] O "Domínio variável duplo" é usado aqui para se referir a dois ou mais locais de ligação de antígeno em uma proteína, que pode ser bivalente (dois locais de ligação ao antígeno, tetravalente (quatro locais de ligação de antígeno), ou proteínas de ligação multivalente. Os DVDs podem ser monoespecíficos, isto é, capazes de ligar um antígeno (ou um epítopo específico), ou multiespecífico, isto é, capaz de ligar dois ou mais antígenos (isto é, dois ou mais epítopos de uma mesma molécula de antígeno alvo ou dois ou mais epítopos de antígeno alvo diferente). Uma proteína de ligação de DVD preferida compreende dois polipeptídios DVD de cadeia pesada e dois polipeptídios DVD de cadeia leve e é referido como uma "imunoglobulina DVD" ou "DVD-Ig". Tal proteína de ligação DVD-Ig é, assim tetramérica e remanescente de uma molécula IgG, mas proporciona mis locais de ligação ao antígeno do que a molécula IgG. Desse modo, cada fração de uma molécula DVD-Ig tetramérica é remanescente de uma fração de uma molécula e compreende um polipeptídio DVD de cadeia pesada e um polipeptídio DVD de cadeia leve, mas ao contrário um par de cadeias pesada e leve de uma molécula IgG que proporciona um único domínio de ligação de antígeno, um par de cadeias pesada e leve de um DVD-Ig proporciona dois ou mais locais de ligação de antígeno.

[0069] Cada local de ligação ao antígeno da proteína de ligação DVD-Ig pode ser derivado de um anticorpo monoclonal doador ("parental") e assim compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) com um total de seis CDRs envolvidos em uma ligação de antígeno por local de ligação ao antígeno. Portanto, uma proteína de ligação DVD-Ig que liga dois epítopos diferentes (isto é, dois epítopos diferentes de duas moléculas de antígeno diferentes ou dois epítopos diferentes da mesma molécula de antígeno) compreende um local de ligação de antígeno derivado de um primeiro anticorpo monoclonal parental e um local de ligação de antígeno de um segundo anticorpo monoclonal parental.

[0070] Uma descrição de um projeto, expressão, e caracterização das moléculas de ligação DVD-Ig é proporcionado no PCT Publication No. WO 2007/024715, U.S. Pat. No. 7,612,181, e Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007). Um exemplo preferido de tais moléculas DVD-Ig compreende uma cadeia pesada que compreende uma fórmula estrutural VD1-(Xl)n-VD2-C(X2)n, onde VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada, VD2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada, C é um domínio constante de cadeia pesada, X1 é um ligante desde que não seja CHL X2 é uma região Fc, e n é 0 ou 1, mas preferencialmente 1; e uma cadeia leve que compreende a formula estrutural VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n, onde VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve, VD2 é um segundo domínio variável de cadeia leve, C é um domínio constante de cadeia leve, X1 é um ligante desde que este não seja CH1, e X2 não compreende uma região Fc; e n é 0 ou 1, mas preferencialmente 1. Tal DVD-Ig pode compreender duas ou mais cadeias pesadas e tais duas cadeias leves, onde cada cadeia compreende domínios variáveis ligados em paralelo sem uma região constante de intervenção entre as regiões variáveis, onde a cadeia pesada e a cadeia leve se associam para formar locais de ligação ao antígeno funcionais paralelos, e um par de cadeias pesadas e leves pode ser associado com outro par de cadeias pesadas e leves para formar uma proteína de ligação tetramérica com quatro locais de ligação ao antígeno. Em outro exemplo, uma molécula de DVD- Ig pode compreender cadeias pesadas e leves que cada uma compreende três domínios variáveis (VD1, VD2, VD3) ligados em paralelo sem uma região constante de intervenção entre os domínios variáveis, onde um par de cadeias pesadas e leves pode ser associado pra formar três locais de ligação ao antígeno, e onde um par de cadeias pesadas e leves pode ser associado com outro par de cadeias pesadas e leves para formar uma proteína de ligação tetramérica com seis locais de ligação ao antígeno.

[0071] Em uma modalidade preferida, uma proteína de ligação DVD-Ig de acordo com a invenção não apenas liga as mesmas moléculas alvo por seus anticorpos monoclonais parentais, mas também possui uma ou m ais propriedades desejáveis de um ou mais anticorpos monoclonais parentais. Preferencialmente, tal propriedade adicional é um parâmetro de anticorpo de um ou mais anticorpos monoclonais parentais. Os parâmetros de anticorpos que podem ser contribuídos para uma proteína de ligação DVD-Ig a partir de um ou mais anticorpos monoclonais parentais inclui, mas não está limitado a, especificidade do antígeno, afinidade do antígeno, potência, função biológica, reconhecimento do epítopo, estabilidade da proteína, solubilidade da proteína, produção eficaz, imunogenicidade, farmacocinéticos, biodisponibilidade, reatividade cruzada de tecido, e ligação de antígeno ortólogo.

[0072] Uma proteína de ligação DVD-Ig liga pelo menos um epítopo de um RGMc. Os exemplos não limitantes de uma proteína de ligação DVD-Ig incluem uma proteína de ligação DVD-Ig que liga um ou mais epítopos de RGMc, uma proteína de ligação DVD-Ig que liga um epítopo de um RGMc humano e um epítopo de um RGMc de outras espécies (por exemplo, camundongo), e uma proteína de ligação DVD-Ig que liga um epítopo de um RGMc humano e um epítopo de outra molécula alvo (por exemplo, VEGFR2 ou VEGFR1).

o. EPÍTOPO OU EPÍTOPOS

[0073] "Epítopo," ou "epítopos," ou "epítopos de interesse" referem-se a um local(s) em qualquer molécula que é reconhecido e pode se ligar a um local(s) complementar em seu parceiro de ligação específico. A molécula e o parceiro de ligação específico são parte de um par de ligação específica. Por exemplo, um epítopo pode ser um polipeptídio, uma proteína, um hapteno, um antígeno de carboidrato (tal como, mas não limitado a, glicolipídios, glicoproteinas ou lipopolissacarídeos), ou um polissacarídeo. Seu parceiro de ligação específico pode ser, mas não está limitado a, um anticorpo.

p. SEQUÊNCIA DO ARCABOUÇO OU ARCABOUÇO

[0074] "Arcabouço" (FR) ou "sequência do arcabouço" como usado aqui pode significar as sequências remanescentes de uma região variável menos os CDRs. Devido a uma definição exata de uma sequência de CDR pode ser determinado por diferentes sistemas (por exemplo, veja acima), o significado de uma sequência de arcabouço é submetido a diferentes interpretações correspondentemente. Os seis CDRs (CDR- L1, -L2, e -L3 da cadeia leve e CDR-H1, -H2, e -H3 da cadeia pesada) também dividem as regiões de arcabouço na cadeia leve e na cadeia pesada em quarto sub-regiões (FR1, FR2, FR3, e FR4) em cada cadeia, em que CDR1 é posicionado entre FR1 e FR2, CDR2 entre PR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3, ou FR4, uma região de arcabouço, como referido por outros, representa os FRs combinados dentro da região variável de uma única cadeia de imunoglobulina ocorrendo naturalmente. Como usado aqui, um FR representa uma das quarto sub-regiões, e FRs representa duas ou mais sub-regiões constituindo uma região de arcabouço.

[0075] As sequências FR de cadeias pesada e cadeia leve humana são conhecidas na arte que podem ser usadas como sequências de arcabouço “aceitadora” de cadeia pesada e de cadeia leve (ou simplesmente, sequências “aceitadoras”) para humanizar um anticorpo não humanizado usando técnicas conhecidas na arte. Em uma modalidade, as sequências aceitadoras de cadeia pesada e cadeia leve humana são selecionadas a partir das sequências de arcabouço listadas nos bancos de dados disponíveis publicamente tal como V-base (protocolo de transferência de hipertexto: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)ou ImMunoGeneTics® internacional (IMGT®) sistema de informação (protocolo de transferência de hipertexto: //imgt.cines.fr/texts/I1VIGTrepertoire/LocusGenes/).

q. LOCAL DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO FUNCIONAL

[0076] O " local de ligação ao antígeno funcional " como usado aqui pode significar um local em uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) que é capaz de ligar um antígeno alvo. Uma afinidade de ligação de antígeno do local de ligação ao antígeno pode não ser tão forte quanto a proteína de ligação parental, por exemplo, um anticorpo parental, a partir do qual o local de ligação ao antígeno é derivado, mas a capacidade de ligação ao antígeno deve ser medida usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos para avaliação de proteína, por exemplo, anticorpo, ligando a um antígeno. Além disso, a afinidade de ligação ao antígeno de cada um dos locais de ligação ao antígeno de uma proteína multivalente, por exemplo, um anticorpo multivalente, aqui sem a necessidade de ser quantitativamente a mesma.

r. ANTICORPO HUMANIZADO

[0077] O "anticorpo humanizado" é usado aqui para descrever um anticorpo que compreende sequências de região variável de cadeia leve e pesada a partir de espécies não humanas (por exemplo, um camundongo), mas no qual pelo menos uma parte da sequência VH e/ou VL tem sido alterado para ser mais do “tipo humano”, isto é, mais similar as sequências variáveis de células tronco humanas. Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo ou uma variante, análogo, ou um fragmento do mesmo, que se liga imunoespecificamente a um antígeno de interesse e que compreende uma região de arcabouço (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e a uma região determinando complementariedade (CDR) tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Como usado aqui, o termo "substancialmente" no contexto de um CDR refere-se ao um CDR tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano CDR. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos os de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) em que todos ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem a aquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões de arcabouço são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém a cadeia leve assim como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir um CHL articulado, regiões CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado apenas contém uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado apenas contém uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado apenas contém um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada humanizada.

[0078] Um anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE, e qualquer isótipo, incluindo sem limitação IgG 1, IgG2, IgG3, e IgG4. Um anticorpo humanizado pode compreender as sequências de mais de uma classe ou isótipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções e efetores desejados usando técnicas bem conhecidas na arte.

[0079] As regiões estruturais e as CDRs de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente as sequências parentais, por exemplo, o anticorpo doador CDR ou a estrutura de consenso pode ser mutagenizada por substituição, inserção, e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido de forma que a CDR ou o resíduo de estrutura não corresponda tanto ao anticorpo doador quanto a estrutura de consenso. Em uma modalidade preferida, tais mutações, entretanto, não serão extensivas. Usualmente, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 95% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão a aqueles das sequências FR parental e CDR. Como usado aqui, o termo "estrutura de consenso" refere-se a região de estrutura na sequência de imunoglobulina de consenso. Como usado aqui, o termo "sequência de imunoglobulina de consenso" refere-se a sequência formada a partir dos aminoácidos ocorrendo mais frequentemente (ou nucleotídeos) em uma família de sequências de imunoglobulina relacionadas (veja, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Uma "sequência de imunoglobulina de consenso" pode assim compreender uma "região(s) de estrutura de consenso" e/ou uma CDR(s) de consendo". Em uma família de imunoglobulinas, cada posição na sequência de consenso é ocupada pelo aminoácido ocorrendo mais frequentemente naquela posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem igualmente frequentemente, tanto pode ser inclusa na sequência de consenso.

s. IDÊNTICA OU IDENTIDADE

[0080] "Idêntica" ou "identidade," como usado aqui no contexto de duas ou mais sequências de polinucleotídeos ou polipeptídios, pode significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são os mesmos sobre uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada alinhando otimamente as duas sequências, comparando as duas sequências sobre uma região específica, determinando o número de posições nas quais o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para render o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na região especificada e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem da identidade de sequência. Em casos onde as duas sequências são de dois comprimentos diferentes ou os procedimentos de alinhamento produzam uma ou mais extremidades escalonadas e a região específica de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos da única sequência são incluídos no denominador, mas não o numerador do cálculo.

t. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO

[0081] O "Polinucleotídeo isolado" como usado aqui pode significar um polinucleotídeo (por exemplo de uma origem genômica, cDNA ou sintética, ou uma combinação dos memos) que por virtude de sua origem, o polinucleotídeo isolado não está associado com toda ou uma parte de um polinucleotídeo com o qual o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza; é ligado de forma operável a um polinucleotídeo que este não está ligado na natureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma grande sequência.

u. MARCADOR E MARCADOR DETECTÁVEL

[0082] "Marcador" e "marcador detectável" como usado aqui refere-se a uma fração anexada a um anticorpo ou um analito para render a reação entre o anticorpo e o analito detectável, e o analito e o anticorpo então marcado é referido como um “detectavelmente marcado”. Uma marca pode produzir um sinal que é detectável por meios visuais e instrumentais. Várias marcas incluem substâncias de produção de sinal, tal como cromogenes, compostos fluorescentes, compostos quimiluminescentes, compostos radioativos, e similares. Os exemplos representativos de marcas incluem frações que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e frações que produzem fluorescência, por exemplo, fluoresceína. Outras marcas são descritas aqui. Em relação a isto, a própria fração pode não ser detectável, mas pode se tornar detectável após a reação ainda com outra fração. O uso do termo "detectavelmente marcado” pretende abranger tal marcação.

[0083] Qualquer marcador detectável compatível como é conhecido na arte pode ser usado. Por exemplo, o marcador detectável 5j 35s 14C, 32P, pode ser um marcador radioativo (tal como 3H, 12 e 33P), e um marcador enzimático (tal como peroxidase de raiz-forte, peroxidase alcalina, glucose 6-fosfato deidrogenase, e similares), um marcador quimiluminescente (tal como ésteres de acridínio, tioésteres, ou sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio, e similares), um marcador fluorescente (tal como fluoresceína (por exemplo, 5-fluoresceína, 6- carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)- carboxifluoresceína. 6-hexacloro- fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, e similares)), rodamina, ficobiliproteinas, R-ficoeritrina, pontos quantum (por exemplo, zinco coberto de sulfeto de seleneto de cádmio), um marcador termométrico, ou um marcador de reação de cadeia de imunopolimerase. Uma produção para marcadores, procedimentos de marcação e detecção de marcadores é encontrado em Polak e Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry,2a edição, Springer Verlag, N.Y. (1997), e em Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que é um livro de bolso e um catálogo combinado publicado pela Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Um marcador fluorescente pode ser usado em FPIA (veja, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, e 5,352,803, as quais estão incorporadas aqui para referência em sua totalidade). Um composto de acridínio pode ser usado como um marcador detectável iem um ensaio quimioluminescente homogêneo (veja, por exemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); e Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 37793782 (2003)).

[0084] Em um aspecto, o composto de acridínio é um acridinínio-9- carboxamida. Os métodos para preparer o acridínio 9-carboxamida são descritos em Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al,, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); e U.S. Pat. Nos. 5,468,646, 5,543,524 e 5,783,699 (cada uma das quais estão incorporadas aqui para referência em sua totalidade para seus ensinamentos em relação ao mesmo).

[0085] Outro exemplo de um composto acridínio é um acridínio -9-carboxilato aril éster. Um exemplo de um acridínio -9-carboxilato aril éster da fórmula II é 10-metil- 9- (fenoxicarbonil)acridínio fluorosulfonato (disponível pela Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Os métodos para preparer um acridínio -9-carboxilato aril éster são descritos em McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); e U.S. Patent No. 5,241,070 (cada uma das quais estão incorporadas aqui para referência em sua totalidade para seus ensinamentos em relação ao mesmo). Tais acridínio -9-carboxilato aril ésteres são indicadores quimioluminescentes eficazes para o peróxido de hidrogênio produzido na oxidação de um analito por pelo menos uma oxidase em termos de intensidade do sinal e/ou rapidez do sinal. O curso da emissão quimioluminescente para o acridínio -9-carboxilato aril éster é completado rapidamente, isto é, em menos de 1 segundo, enquanto a emissão quimioluminescente acridínio-9-carboxamida se estende por 2 segundos. O acridínio -9-carboxilato aril éster, entretanto, perde suas propriedades quimioluminescentes na presença da proteína. Portanto, seu uso requer a ausência da proteína durante a detecção e geração de sinal. Os métodos para separar ou remover as proteínas em uma amostra são bem conhecidos pelos peritos na arte e incluem, mas não estão limitados a, ultrafiltração, extração, precipitação, diálise, cromatografia, e/ou digestão (veja, por exemplo, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). A quantidade de proteína removida ou separada a partir de uma amostra de teste pode ser de cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%. Outros detalhes em relação ao acridínio -9-carboxilato aril éster e seu uso estão estabelecidos na U.S. Pat. App. No. 11/697,835, depositada em 9 de abril de 2007. Os acridínio -9-carboxilato aril ésteres podem ser dissolvidos em qualquer solvente compatível, tal como um anidrido N,N-dimetilformamida desgaseifficado (DMF) ou um colato de sódio aquoso.

v. SEQUÊNCIA DE LIGAÇÃO E SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO

[0086] Uma "sequência de ligação" ou uma "sequência de peptídeo de ligação" refere-se a uma sequência de polipeptídio artificial que é conectada a uma ou mais sequências de polipeptídio de interesse (por exemplo, de comprimento completo, fragmentos, etc.). O termo "conectado" refere-se a junção da sequência de ligação para a sequência de polipeptídio de interesse. Tais sequências de polipeptídio são preferencialmente juntadas por uma ligação de um ou mais peptídeos. As sequências de ligação podem ter um comprimento de cerca de 4 a cerca de 50 aminoácidos. Preferencialmente, o comprimento da sequência de ligação é de cerca de 6 a cerca de 30 aminoácidos. As sequências de ligação naturais podem ser modificadas por substituições, adições ou deleções de aminoácidos para criar as sequências de ligação artificiais. As sequências de ligação exemplares incluem, mas não estão limitadas a: (i) Histidina (His) marcadores, tal como um 6X His marcador (SEQ ID NO: 197), que tem uma sequência de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO: 197), são úteis como sequências de ligação para facilitar o isolamento e a purificação dos polipeptídios e os anticorpos de interesse; (ii) locais de clivagem enteroquinase, do tipo His marcadores, são usados no isolamento e na purificação das proteínas e anticorpos de interesse. Frequentemente, os locais de clivagem enteroquinase são usados juntos com os His marcadores no isolamento e na purificação das proteínas e dos anticorpos de interesse. Vários locais de clivagem enteroquinase são conhecidos na arte. Os exemplos de locais de clivagem enteroquinase incluem, mas não estão limitados a, a sequência de aminoácidos de DDDDK (SEQ ID NO: 198) e os derivados do mesmo (por exemplo, ADDDDK (SEQ ID NO: 199), etc.); (iii) as sequências de miscelânea podem ser usadas para ligar ou conectar as regiões variáveis de cadeia leve e/ou de cadeia pesada dos fragmentos de região variável de cadeia única. Os exemplos de outras sequências de ligação podem ser encontrados em Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85: 5879-5883 (1988); e McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). As sequências de ligação também podem ser modificadas para as funções de adicionais, tais como a anexação de fármacos ou a anexação de suportes sólidos. No contexto da presente divulgação, o anticorpo monoclonal, por exemplo, pode conter uma sequência de ligação, tal como um His marcador, um local de clivagem enteroquinase, ou ambos.

w. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO MULTIVALENTE

[0087] A "Proteína de ligação multivalente" é usada aqui para se referir a uma proteína de ligação compreendendo dois ou mais locais de ligação de antígeno (também referido aqui como "domínios de ligação ao antígeno"). Uma proteína de ligação multivalente é preferencialmente projetada para ter três ou mais locais de ligação ao antígeno, e geralmente não é um anticorpo ocorrendo naturalmente. O termo "proteína de ligação multiespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que pode ligar dois ou mais alvos relacionados ou não relacionados, incluindo uma proteína de ligação capaz de ligar dois ou mais epítopos diferentes da mesma molécula alvo.

x. CORTE PREDETERMINADO E NÍVEL PREDETERMINADO

[0088] O "corte predeterminado" e o "nível predeterminado" refere-se geralmente a um valor de corte de ensaio que é usado para avaliar os resultados de eficácia do diagnóstico/prognóstico/terapêutico comparando os resultados de ensaios contra o nível/corte predeterminado, onde o nível/corte predeterminado já foi ligado ou associado com vários parâmetros clínicos (por exemplo, gravidade da doença, progressão/não progressão/melhora, etc.). A presente divulgação proporciona níveis de predeterminados exemplares. Entretanto, é bem conhecido que os valores de corte podem variar dependendo da natureza do imunoensaio (por exemplo, os anticorpos empregados, etc.). Ainda é bem conhecido dos peritos na arte adaptar a divulgação aqui para outros imunoensaios para obter valores de corte imunoespecíficos para aqueles outros imunoensaios com base nesta divulgação. Enquanto o valor preciso do nível/corte pode variar entre os ensaios, as correlações como descritas aqui devem ser geralmente aplicáveis.

y. REAGENTE DE PRÉ-TRATAMENTO

[0089] O "reagente pre-tratamento," por exemplo, reagente de lisagem, precipitação e/ou solubilização, como usado aqui em um ensaio de diagnóstico como descrito aqui é um que lisa qualquer célula e/ou solubiliza qualquer analito que esteja presente em uma amostra de teste. O pre-tratamento não é necessário para todas as amostras, como descrito ainda aqui. Entre outras coisas, a solubilização do analito (isto é, RGMc (tal como RGMc associado a membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associado a membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (RGMc solúvel ou associado a membrana) ou quaisquer combinações dos mesmos)) implicam a liberação dos analitos de qualquer proteína de ligação endógena presente na amostra. Um pre-tratamento pode ser homogênea (não requerendo uma etapa de separação) ou heterogêneo (requerendo uma etapa de separação). Com o uso de um pre-tratamento de reagente heterogêneo há uma remoção de uma proteína de ligação ao analito precipitada da amostra de teste antes de proceder para a próxima etapa do ensaio. O pre-tratamento de reagente opcionalmente pode compreender: (a) um ou mais solventes e sal, (b) um ou mais solventes, sal e detergente, (c) detergente, (d) detergente e sal, ou (e) qualquer reagente ou uma combinação de reagentes apropriados para a lisagem de célula e/ou solubilização de analito.

z. REAGENTES DE CONTROLE DE QUALIDADE

[0090] Os "reagentes de controle de qualidade" no contexto dos imunoensaio e os kits descritos aqui, incluem, mas não estão limitados a, calibradores, controles, e painéis de sensibilidade. Um "calibrador" ou um "padrão" tipicamente é usado (por exemplo, um ou mais, tal como uma pluralidade) s fim de estabelecer a curva de calibração (padrão) para a interpolação da concentração de um analito, tal como um anticorpo ou um analito. Alternativamente, um único calibrador, que está próximo a um corte positive/negative predeterminado, pode ser usado. Os calibradores múltiplos (isto é, mais do que um calibrador ou uma quantidade variante de calibradores) pode ser usada em conjunto de forma que compreenda um "painel de sensibilidade."

aa. ANTICORPO RECOMBINANTE E ANTICORPOS RECOMBINANTES

[0091] O "anticorpo recombinante" e os "anticorpos recombinantes" referem- se a anticorpos preparados por uma ou mais etapas, incluindo clonagem de sequências de ácido nucleico codificando todos ou parte dos anticorpos monoclonais em um vetor de expressão apropriado por técnicas recombinantes e expressando subsequencialmente o anticorpo em uma célula hospedeira apropriada. Os termos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais produzidos recombinantemente, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados (completamente ou parcialmente humanizados), estruturas multiespecíficas ou multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticorpo, anticorpos bifuncionais, Abs heteroconjugado, DVD-Ig®s, e outros anticorpos descritos aqui em (i). (métodos e imunoglobulinas de domínio variável duplo para fazê-las são descritos em Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25: 1290-1297 (2007)). O termo "anticorpo bifuncional", como usado aqui, refere-se a um anticorpo que compreende um primeiro braço tendo uma especificidade para um local antigênico e um segundo braço tendo uma especificidade para um local antigênico diferente, isto é, os anticorpos bifuncionais tem uma especificidade dupla.

bb. AMOSTRA, AMOSTRA DE TESTE, E AMOSTRA DE PACIENTE

[0092] A "amostra," "amostra de teste," e a "amostra de paciente" pode ser usada aqui intercambiadamente. A amostra, tal como uma amostra de urina, soro, fluido amniótico, fluido cérebro-espinhal, células de placenta ou tecido, células endoteliais, leucócitos, ou monócitos podem ser usados diretamente como obtido a partir de um paciente ou pode ser pre-tratado, tal como por filtração, destilação, extração, concentração, centrifugação, inativação de componentes interferindo, adição de reagentes, e similares, para modificar o caráter de uma amostra de alguma maneira como discutido aqui ou de outra maneira como é conhecido na arte.

cc. SÉRIES DE COMPOSIÇÕES DE CALIBRAMENTO

[0093] As "series de composições der calibramento" referem-se a uma pluralidade de composições compreendendo uma concentração conhecida de Cys- RGMcC, onde cada uma das composições difere das outras composições nas séries pela concentração de Cys-CRGMc.

dd. FASE SÓLIDA

[0094] A "fase sólida" refere-se a qualquer material que seja insolúvel, ou pode se tornar solúvel por uma reação subsequente. A fase sólida pode ser escolhida por sua capacidade intrínseca de atrair e imobilizar um agente de captura. O agente de ligação pode, por exemplo, incluir uma substância carregada que é opostamente carregada em relação ao próprio agente de captura ou a uma substância carregada conjugada para um agente de captura. Em geral, o agente de ligação pode ser qualquer parceiro de ligação (preferencialmente específico) que é imobilizado na (anexado a) fase sólida e que tem a capacidade de imobilizar o agente de captura através de uma reação de ligação. O agente de ligação possibilita uma ligação indireta do agente de captura para um material de fase sólida antes de desempenhar o ensaio ou durante o desenvolvimento do ensaio. A fase sólida pode, por exemplo, ser elástico, plástico derivado, metal magnético ou não magnético, vidro ou silício, incluindo, por exemplo, um tubo de teste, uma fonte de microtítulo, uma folha, grânulos, micropartículas, chip, e outras configurações conhecidas pelos peritos na arte.

ee. LIGAÇÃO ESPECÍFICA

[0095] Uma "ligação específica" ou "especificamente ligada" como usado aqui pode se referir a uma interação da taxa de dissociação, uma proteína, ou um peptídeo com uma segunda espécie química, onde a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) nas espécies químicas; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura de proteína específica do que as proteínas geralmente. Se um anticorpo é específico para o epítopo "A", a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou A livre não marcado), em uma reação contendo um "A" marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo.

ff. PARCEIRO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA

[0096] Um "parceiro de ligação específica" é um membro de um par de ligação específica. Um par de ligação específica compreende duas moléculas diferentes, que se ligam especificamente um ao outro através de meios químicos ou físicos. Portanto, além dos pares de ligação específica de antígeno e anticorpo de imunoensaio comuns, outros pares de ligação específica podem incluir biotina e avidina (ou estreptavidina), carbohidratos e lectinas, sequências de nucleotídeos complementares, moléculas receptoras e efetoras, cofactores e enzimas, inibidores de enzimas e enzimas, e similares. Além disso, os pares de ligação específica podem incluir membros que são análogos dos membros de ligação específica originais, por exemplo, um análogo analito. Os membros de ligação específica imunoreativos incluem antígenos, fragmentos de antígeno, e anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais assim como os complexos e fragmentos dos mesmos, se produzido isolado ou recombinantemente.

gg. CONDIÇÕES ESTRINGENTES

[0097] As "condições estringentes" são usadas aqui para descrever uma hibridização para um DNA ligado por filtro em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0.2xSSC/0.1% SDS a cerca de 50-65°C. O termo "sob condições altamente estringentes", refere-se a hibridização para um ácido nucleico ligado por filtro em 6xSSC a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0.1xSSC/0.2% SDS a cerca de 68°C., ou sob outras condições de hibrtidização de estringente. Veja, por exemplo, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York nas páginas 6.3.1-6.3.6 e 2.10.3.

hh. TRATAR, TRATANDO OU TRATAMENTO

[0098] "Tratar", "tratando" ou "tratamento" é cada um usado aqui intercambiadamente para descrever o reverso, alívio ou a inibição do processo de uma doença, ou um ou mais sintomas de tal doença, para a qual o termo se aplica. Dependendo da condição do indivíduo, o termo também se referee a prevenção de uma doença, e inclui prevenir o começo de uma doença, ou prevenir os sintomas associados a esta doença. O tratamento pode ser tanto realizado de uma forma aguda quanto crônica. O termo também se refere a redução da gravidade de uma doença ou sintomas associados com tal doença antes da aflição com a doença. Tal prevenção ou redução da gravidade de uma doença antes da aflição refere-se a administração de anticorpos ou uma composição farmacêutica da presente invenção a um indivíduo que não está no momento de administração aflita com a doença. "Prevenir" também se refere a prevenção da recorrencia e uma doença ou de um ou mais sintomas associados a tal doença. “Tratamento" e "terapeuticamente," referem-se ao ato de tratar, como "tratando" é definido acima.

ii. MARCADOR

[0099] “Marcador" como usado aqui se refere a um analito ou um fragmento de analito conjugado a um marcador, tal como Cys-CRGMc conjugado a uma fração de fluoresceína, onde o analito conjugado ao marcador pode competir eficazmente com o analito para os locais em um anticorpo específico para o analito.

jj. VARIANTE

[00100] "Variante" é usado aqui para descrever um peptídeo ou polipeptídio que difere na sequência de aminoácidos pela inserção, deleção ou substituição conservadora de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica. Os exemplos representativos de “atividade biológica” incluem a capacidade de ser ligado por um anticorpo específico ou para promover uma resposta imune. Variante também é usado aqui para descrever uma proteína com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácidos que retém pelo menos uma atividade biológica. Uma substituição conservadora de um aminoácido, isto é, substituir um aminoácido com um aminoácido diferente com propriedades similares (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecido na arte como envolvendo tipicamente uma mudança menor. Estas mudanças menores podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático de aminoácidos, como entendido na arte. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é com base em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga. É conhecido na arte que os aminoácidos de índices hidropáticos similares podem ser substituídos e ainda reter uma função de proteína. Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de ±2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que poderiam resultar em uma função biológica de retenção de proteína. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da melhor média de local de hidrofilicidade daquele peptídeo, uma medição útil que tem sido reportada para correlacionar bem com a antigenicidade e a imunogenicidade. U.S. Patent No. 4,554,101, incorporada aqui em sua totalidade por referência. A substituição de aminoácidos, tendo valores de hidrofilicidade pode resultar em uma atividade de biológica de retenção de peptídeo, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na arte. As substituições podem ser realizadas com os aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade dentro de ±2 de cada um. Ambos o índice de hidrofilicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia de lado particular daquele aminoácido. Consistente com aquela observação, as substituições de aminoácido que são compatíveis com a função biológica são entendidos como dependentes de uma similaridade relativa dos aminoácidos, e particularmente as cadeias de lado daqueles aminoácidos, como revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e outras propriedades. "Variante" também pode ser usado para se referir a um fragmento reativo antigenicamente de um anticorpo anti-RGMc que difere do fragmento correspondente de um anticorpo anti-RGMc em uma sequência de aminoácido, mas ainda é reativo antigenicamente e pode competir com o fragmento correspondente de um anticorpo anti-RGMc para se ligar com o RGMc. "Variante" também pode ser usado para descrever um polipeptídio ou um fragmento do mesmo que tem sido processado diferentemente, tal como por proteólise, fosforilação, ou outra modificação translacional, ainda retém sua reatividade de antígeno.

kk. VETOR

[00101] O "Vetor" é usado aqui para descrever uma molécula de ácido nucleico que pode suportar outro ácido nucleico ao qual este foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma volta de DNA de cadeia dupla circular em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados em um genoma viral. Certos vetores podem se reproduzir autonomamente em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, os vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de vetores mamíferos e de reprodução). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não episomais) pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira, e assim são reproduzidos junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes para o qual eles são ligados operativamente. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de expressão").em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. O "plasmídeo" e o "vetor" podem ser usados intercambiadamente já que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, outras formas de vetores de expressão, tal como os vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituoso reproduzido, adenovírus e viroses associadas ao adeno), que servem funções equivalentes, podem ser usados. Em relação a isto, as versões RNA de vetores (incluindo os vetores virais RNA) também podem encontrar um uso no contexto da presente divulgação.

[00102] Para recitar os intervalos numéricos aqui, cada número de intervenção entre eles com o mesmo grau de precisão é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além do 6 e do 9, e para a faixa de 6,0-7,0, o número 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são explicitamente contemplados.

2. ANTICORPOS ANTI-RGMc

[00103] Estão proporcionados aqui os anticorpos que se ligam ao RGMc e interrompem a expressão normal da hepcidina, que regula diretamente a concentração de ferro no plasma e a distribuição de ferro para uma variedade de tecidos.

a. RGMc

[00104] Como discutido anteriormente aqui, o RGMc é uma proteína de membrana ancorada glicosilfosfatidilinositol ("GPI") expressa nos músculos, nos hepatócitos da retina e periporais. O RGMc funciona em conjunto com a hepcidina através de proteínas de sinalização para manter a homeostase do ferro no corpo. A hepcidina é um peptídeo pequeno (20 - 25 aminoácidos) que regulam o metabolismo de ferro sistêmico se ligado a ferroportina, o exportador exclusivo de ferro dos mamíferos. A anemia de doença crônica ("ACD") é uma consequência comum, já que estas células não são mais capazes de liberar o ferro no sangue. A degradação induzida por hepcidina de ferroportina pode ocorrer em um nível maior do que 300 mg/1 de hepcidina, maior do que 325 mg/1 de hepcidina, maior do que 350 mg/1 de hepcidina, maior do que 375 mg/1 de hepcidina, maior do que 400 mg/1 de hepcidina, maior do que 425 mg/1 de hepcidina, maior do que 450 mg/1 de hepcidina, ou maior do que 475 mg/1 de hepcidina.

[00105] O RGMc humano, uma proteína de aminoácido 426 com um peptídeo de sinal N-terminal previsto de 31 aminoácidos e um sinal de anexação GPI C-terminal de 45 aminoácidos, foi primeiro proposto para ser envolvido em um metabolismo de ferro sistêmico quando as mutações no gene humano foram ligadas a um distúrbio por sobrecarga de ferro grave, hemocromatose juvenil. A expressão de hepcidina é controlada pelo RGMc ligado por membrane na superfície dos hepatócitos e pelo RGMc solúvel presente em uma concentração de aproximadamente 1 lag/m1 no sangue humano. O RGMc solúvel é produzido pela clivagem do RGMc ligado a membrane por matriptase-2 (TMPRSS6). A forma solúvel de RGMc se liga a e sequestra o BMP-6, prevenindo assim a indução da expressão de hepcidina. A forma de membrana do RGMc tem um efeito oposto: aumenta a expressão de hepcidina.

[00106] O RGMc humano pode ter a seguinte sequência e aminoácido: MGEPGQSPSPRSSHGSPPTLSTLTLLLLLCGHAHSQCKILRCNAEYVSSTL SLRGGGSSGALRGGGGGGRGGGVGSGGLCRALRSYALCTRRTARTCRGDLAFHS AVHGIEDLMIQHNCSRQGPTAPPPPRGPALPGAGSGLPAPDPCDYEGRFSRLHGR PPGFLHCASFGDPHVRSFHHHFHTCRVQGAWPLLDNDFLFVQATSSPMALGANAT ATRKLTIIFKNMQECIDQKVYQAEVDNLPVAFEDGSINGGDRPGGSSLSIQTANPGN HVEIQAAYIGTTIIIRQTAGQLSFSIKVAEDVAMAFSAEQDLQLCVGGCPPSQRLSRS ERNRRGAITIDTARRLCKEGLPVEDAYFHSCVFDVLISDPNFTVAAQAALEDARAFLP DLEKLHLFPSDAGVPLSSATLLAPLLSGLFVLWLCIQ (SEQ ID NO: 1). O RGMc humano pode ser um fragmento ou um variante da SEQ ID NO: 1.

[00107] O fragmento de RGMc pode ser entre cerca de 5 e cerca de 425 aminoácidos, entre cerca de 10 e cerca de 400 aminoácidos, entre cerca de 50 e cerca de 350 aminoácidos, entre cerca de 100 e cerca de 300 aminoácidos, entre cerca de 150 e cerca de 250 aminoácidos, entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos, ou entre cerca de 75 e cerca de 150 aminoácidos em comprimento. O fragmento pode compreender um número contíguo de aminoácidos a partir de RGMc.

[00108] O fragmento de RGMc pode ter a seguinte sequência de aminoácido: AHSQCKILRCNAEYVSSTLSLRGGGSSGALRGGGGGGRGGGVGSGGLCR ALRSYALCTRRTARTCRGDLAFHSAVHGIEDLMIQHNCSRQGPTAPPPPRGPALPG AGSGLPAPDPCDYEGRFSRLHGRPPGFLHCASFGDPHVRSFHHHFHTCRVQGAW PLLDNDFLFVQATSSPMALGANATATRKLTIIFKNMQECIDQKVYQAEVDNLPVAFE DGSINGGDRPGGSSLSIQTANPGNHVEIQAAYIGTTIIIRQTAGQLSFSIKVAEDVAMA FSAEQDLQLCVGGCPPSQRLSRSERNRRGAITIDTARRLCKEGLPVEDAYFHSCVF DVLISGDPNFTVAAQAALEDARAFLPDL (SEQ ID NO: 2). O fragmento de RGMc pode ser uma variante da SEQ ID NO: 2.

b. RGMc — ANTICORPO DE RECONHECIMENTO

[00109] O anticorpo é um anticorpo que se liga ao RGMc humano (tal como RGMc associado a membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associado a membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (RGMc solúvel ou associado a membrana) ou quaisquer combinações dos mesmos). O anticorpo pode ser um fragmento do anticorpo anti-RGMc ou uma variante ou derivado do mesmo. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano completo ou um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, ou uma mistura dos mesmos. O anticorpo pode ser uma molécula e imunoglobulina, um Fv ligado por dissulfeto, um anticorpo de afinidade maturada, um scFv, um anticorpo quimérico, um anticorpo de domínio simples, um anticorpo enxertado com CDR, um diacorpo, um anticorpo humanizado, anticorpo humano completo, um anticorpo multiespecífico, um Fab, um anticorpo específico duplo, um DVD, um Fab', um anticorpo biespecífico, um F(ab')2, ou um Fv. Os fragmentos de anticorpo ou derivados podem compreender fragmentos de F(ab')2, Fv ou scFv. Os derivados de anticorpos podem ser produzidos por peptidomiméticos. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas de acordo com os métodos conhecidos na arte para a produção de anticorpos de cadeia simples. Também, os animais transgênicos podem ser usados para expressar os anticorpos humanos completes ou humanizados.

[00110] O anticorpo pode reconhecer e se ligar especificamente a um epítopo presente em um polipeptídeo de RGMc ou uma variante como descrito acima (por exemplo, um epítopo contido na SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 1). O epítopo pode ser um epítopo contido na SEQ ID NO: 2 ou uma variante da SEQ ID NO: 2.

[00111] O anticorpo é distinguível a partir de anticorpos anti-RGMc conhecidos, preferencialmente por possuir função biológica(s) diferente dos anticorpos anti-RGMc conhecidos na arte. Por exemplo, além de reconhecer e se ligar ao RGMc ligado por membrana, o anticorpo preferencialmente tem uma atividade biológica adicional, por exemplo, a capacidade de aumentar ou diminuir a expressão de hepcidina. Adicionalmente, ou alternativamente, o anticorpo tem a capacidade de bloquear a interação de neogenina de RGMc e/ou a interação RGMc-BMP-6 (proteína morfogenética do osso 6).

(1) CARACTERÍSTICAS DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO

[00112] O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente ao RGMc (RGMc associado a membrana, RGMc solúvel ou combinações dos mesmos), um fragmento do mesmo, ou uma variante do mesmo e ter um koff (ou kd) de pelo menos cerca de 1.0x10-3 s-1, de pelo menos cerca de 1.0x10-4 s-1, de pelo menos cerca de 1.0x10-5 s1, de pelo menos cerca de 1.0x10-6 s-1 ou tem um koff (ou kd) variando de cerca de 1.0x10- 3 s-1 a cerca de 1.0x10-6 s-1, de cerca de 1.0x10-3 s-1 a cerca de 1.0x10-5 s-1 ou de cerca de 1.0x10-3 s-1 a cerca de 1.0x10-4 s-1. O fragmento deve ser SEQ ID NO: 2.

[00113] O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente a um RGMc (RGMc associado a membrana, RGMc solúvel ou uma combinação do mesmo), um fragmento do mesmo, ou uma variante do mesmo e tem an (ou ka) de pelo menos cerca de 2.4x104 M-1s-i, de pelo menos cerca de 2.5x104 M-1s-1, de pelo menos cerca de 3.3x104 M-is-1, de pelo menos cerca de 5.0x104 M-1s-1, de pelo menos cerca de 1.25x107 M-1s- 1 de pelo menos cerca de 1.35x107 M-is-1, de pelo menos cerca de 1.0x108 M-is-1, de pelo menos cerca de 1.0x109 M-is-1, ou tem um k0 (ou ka) variando de cerca de 5.0x104 M-1s-1 a cerca de 1.0x108 MASA, de cerca de 3.3x104 M-1s-1 a cerca de 1.0x109 M-1s-1, de cerca de 2.5x104 M-1s-1 a cerca de 1.25x107 M-1s-1, de cerca de 2.4x104 M-1s-1 a cerca de 1.35x107 M-1s-1. O fragmento pode ser SEQ ID NO: 2.

(2) ESTRUTURA DO ANTICORPO (a) Regiões variáveis de cadeia pesada e leve e CDRs de cadeia pesada e leve

[00114] O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente a um RGMc, um fragmento do mesmo, ou uma variante do mesmo e compreender uma cadeia pesada variável e/ou uma cadeia leve variável mostrada na Tabela 1. O anticorpo pode se ligar imunoespecificamente ao RGMc, um fragmento do mesmo, ou uma variante do mesmo e compreende uma ou mais das sequências de CDR de cadeia pesada ou cadeia leve CDR também mostradas na Tabela 1 e/ou na Tabela 2. Tabela 1 lista de sequência de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos anti-RGMc humanizados

[00115] Os anticorpos humanizados descritos acima na Tabela 2 e métodos para fazê-los são descritos na U.S. Patent Publication no 2010/0028340, os conteúdos os quais estão aqui incorporados por referência.

[00116] Conforme mostrado na Tabela 2, os domínios de CDR-H1 de região variável (VH e VL) são todos idênticos em sequência. Também, cada um dos domínios de CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 são respectivamente idênticos em sequência (por exemplo, o domínio de CDR-H2 da região VH h5F9.1 é idêntico ao domínio de CDR-H2 da região VH h5F9.2 é idêntico ao domínio de CDR-H2 da região VH h5F9.3 e etc. O domínio de CDR-H3 da região VH h5F9.1 é idêntico ao domínio de CDR-H3 da região VH h5F9.2 é idêntico ao domínio de CDR-H3 da região VH h5F9.3, etc...).

[00117] Um anticorpo isolado que especificamente se liga à RGMc (ou fragmento da mesma) da presente descoberta pode possuir uma região ou domínio selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4. (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (i) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, (j) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (k) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, (1) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (m) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, (n) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (o) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, (p) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (q) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34.

[00118] O anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante ou um derivado do mesmo pode conter uma ou mais sequências de aminoácido que são iguais a, ou tem identidade maior do que aproximadamente 95%, aproximadamente 90%, aproximadamente 85%, aproximadamente 80%, aproximadamente 75%, aproximadamente 70%, aproximadamente 65%, aproximadamente 60%, aproximadamente 55%, ou aproximadamente 50% para um ou mais da SEQ ID NOs:3-34. O anticorpo ou variante ou derivado do mesmo pode ser codificado por uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais da SEQ ID NOs:3- 34. Identidade e homologia de polipeptídeo podem ser determinadas, por exemplo, pelo algoritmo descrito no relatório: Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726-730 (1983). O anticorpo aqui descrito, fragmento do mesmo, variante do mesmo ou um derivado do mesmo pode ser codificado por um ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas com o complemento de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais da SEQ ID NOs:3-34. O anticorpo aqui descrito, fragmento do mesmo, variante do mesmo, ou derivado do mesmo pode ser codificado por um ácido nucleico que hibridiza sob condições altamente rigorosas com o complemento de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais da SEQ ID NOs:3-34.

c. Produção/Preparação do anticorpo

[00119] Anticorpos podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas. Em geral, anticorpos podem ser produzidos através de técnica de cultura de célula, incluindo a geração de anticorpos monoclonais via técnicas convencionais, ou via transfecção de genes de anticorpos, cadeias pesadas e/ou cadeias leves em hospedeiros celulares bacterianos ou de mamíferos adequados, a fim de permitir a produção de anticorpos, em que os anticorpos podem ser recombinantes. As várias formas do termo “transfecção” são destinadas a englobar uma larga variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e os similares. Embora seja possível expressar os anticorpos da invenção, quer em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferível, e mais preferível em células hospedeiras de mamíferos, porque tais células eucarióticas (e as células de mamíferos em particular) são mais propensas que as células procarióticas para montar e secretar um anticorpo devidamente envolto e imunologicamente ativo.

[00120] Exemplos de células hospedeiras de mamíferos para expressar os anticorpos recombinantes da invenção, inclui Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindo células de CHO dhfr, descrito em Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980), usado com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células de mieloma NS0, células COS, e células SP2. Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos através da cultura de células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo na célula hospedeira ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo para o meio da cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Anticorpos podem ser recuperados a partir do meio da cultura usando métodos de purificação de proteína padrão.

[00121] Células hospedeiras podem também ser usadas para produzir fragmentos de anticorpos funcionais, tais como fragmentos de Fab ou moléculas de scFv. Será entendido que variações no procedimento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando fragmentos funcionais tanto da cadeia leve e/ ou da cadeia pesada de um anticorpo dessa invenção. Tecnologia de DNA recombinante pode também ser usada para remover alguns, ou todos, do DNA codificando quer uma ou ambas das cadeias pesadas e leves que não são necessárias para ligar os antígenos de interesse. As moléculas expressadas a partir de tais moléculas de DNA truncadas são também englobadas pelos anticorpos da invenção. Em adição, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em que uma cadeia leve e uma pesada são um anticorpo da invenção (por exemplo, liga RGMc humana) e a outra cadeia leve e pesada são específicas para um antígeno com exceção de RGMc humana por reticulação de um anticorpo da invenção para um segundo anticorpo através de métodos de reticulação química padrão.

[00122] Em um sistema preferível para expressão recombinante de um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, da invenção, um vetor de expressão recombinante codificando ambos as cadeias pesadas do anticorpo e as cadeias leves do anticorpo é introduzido dentro de células de CHO dhfr através de transfecção mediada por fosfato de cálcio. No interior do vetor de expressão recombinante, os genes de cadeia leve e pesada de anticorpo são cada um operacionalmente ligado aos elementos reguladores potenciadores de CMV/ promotores de AdMLP para dirigir altos níveis de transcrição de genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene de DHFR, que permite a seleção de células de CHO que tem sido transfectadas com o vetor usando seleção/ amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio da cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar para transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Ainda adicionalmente a invenção fornece um método de sintetizar um anticorpo recombinante da invenção ao cultivar uma célula hospedeira da invenção em um adequado meio de cultura até um anticorpo recombinante da invenção ser sintetizado. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

[00123] Métodos de preparar anticorpos monoclonais envolve a preparação de linhas de células imortais capazes de produzir anticorpos possuindo a especificidade desejada. Tais linhas de células podem ser produzidas a partir de células do baço obtidas a partir de um animal imunizado. O animal pode ser imunizado com RGMc ou um fragmento e/ou variante da mesma. Por exemplo, qualquer uma da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, um fragmento da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, ou uma variante da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 pode ser usada para imunizar o animal. O animal pode ser imunizado com RGMa ou um fragmento e/ ou variante da mesma. Por exemplo, qualquer uma da SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, um fragmento da SEQ ID NO:35 ou SEQ ID NO:36, ou uma variante da SEQ ID NO:35 ou SEQ ID NO:36 pode ser usado para imunizar o animal. A RGMa pode possuir a seguinte sequência de aminoácido: MGMGRGAGRSALGFWPTLAFLLCSFPAATSPCKILKCNSEFWSATSGSHA PASDDTPEFCAALRSYALCTRRTARTCRGDLAYHSAVHGIEDLMSQHNCS KDGPTSQPRLRTLPPAGDSQERSDSPEICHYEKSFHKHSATPNYTHCGLF GDPHLRTFTDRFQTCKVQGAWPLIDNNYLNVQVTNTPVLPGSAATATSKL TIIFKNFQECVDQKVYQAEMDELPAAFVDGSKNGGDKHGANSLKITEKVS GQHVEIQAKYIGTTIVVRQVGRYLTFAVRMPEEVVNAVEDWDSQGLYLCL RGCPLNQQIDFQAFHTNAEGTGARRLAAASPAPTAPETFPYETAVAKCKE KLPVEDLYYQACVFDLLTTGDVNFTLAAYYALEDVKMLHSNKDKLHLYER TRDLPGRAAAGLPLAPRPLLGALVPLLALLPVFC (SEQ ID NO:35). A RGMa pode ser um fragmento ou variante da SEQ ID NO:35.

[00124] O fragmento de, pode ser de entre 5 e 425 aminoácidos, entre 10 e 400 aminoácidos, entre 50 e 350 aminoácidos, entre 100 e 300 aminoácidos, entre 150 e 250 aminoácidos, entre 200 e 300 aminoácidos, ou entre 75 e 150 aminoácidos de comprimento. O fragmento pode compreender um número contíguo de aminoácidos a partir da SEQ ID NO:35.

[00125] O fragmento de RGMa pode possuir a seguinte sequência de aminoácido: MGMGRGAGRSALGFWPTLAFLLCSFPAATSPCKILKCNSEFWSATSGSHA PASDDTPEFCAALRSYALCTRRTARTCRGDLAYHSAVHGIEDLMSQHNCSKDGPTS QPRLRTLPPAGDSQERSDSPEICHYEKSFHKHSATPNYTHCGLFGDPHLRTFTDRF QTCKVQGAWPLIDNNYLNVQVTNTPVLPGSAATATSKL (SEQ ID NO: 36). O fragmento de RGMa pode ser um fragmento da SEQ ID NO:36. O fragmento de RGMa poder ser uma variante da SEQ ID NO:36.

[00126] O peptídeo usado para imunizar o animal pode compreender aminoácidos codificando Fc humano, por exemplo, a região cristalizável do fragmento ou região da cauda do anticorpo humano. As células do baço podem ser imortalizadas através da, por exemplo, fusão com um parceiro de fusão de células de mieloma. Uma variedade de técnicas de fusão pode ser empregada. Por exemplo, as células de baço e as células de mieloma podem ser combinadas com um detergente não iônico por alguns minutos e então plaqueadas a baixa densidade em um meio seletivo que suporta aquele crescimento de células híbridas, mas não células de mieloma. Uma dessas técnicas usa seleção de hipoxantina, aminopterina, timidina (HAT). Após um tempo suficiente, geralmente de cerca de 1 a 2 semanas, colônias de híbridos são observados. Colônias únicas são selecionadas e seus sobrenadantes de cultura testados para atividade de ligação contra o polipeptídeo. Hibridomas possuindo alta especificidade e reatividade podem ser usados.

[00127] Anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir de supernadantes de crescentes colônias de hibridoma. Em adição, várias técnicas podem ser empregadas para aumentar o rendimento, tal como injeção de linha de célula de hibridoma dentro da cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado adequado, tal como um camundongo. Anticorpos monoclonais podem então ser colhidos dos fluídos acíticos ou do sangue. Contaminantes podem ser removidos dos anticorpos através de técnicas convencionais, tais como cromatografia, filtragem de gel, precipitação e extração. Cromatografia de afinidade é um exemplo de um método que pode ser usado em um processo para purificar os anticorpos.

[00128] A enzima proteolítica papaína preferencialmente fende moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) cada um compreende um heterodímero covalente que inclui um local de ligação de antígeno intacto. A pepsina de enzima é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab')2, o qual compreende ambos os locais de ligação de antígeno.

[00129] O fragmento de Fv pode ser produzido através da clivagem proteolítica preferencial de uma IgM, e em raras ocasiões moléculas de imunoglobulina de IgA ou IgG. O fragmento de Fv pode ser derivado usando técnicas recombinantes. O fragmento de Fv inclui um heterodímero de VH::VL não covalente incluindo um local de ligação de antígeno o qual retém muito das capacidades de ligação e reconhecimento do antígeno da molécula de anticorpo nativa.

[00130] O anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado pode compreender um conjunto de região determinante de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve (“CDR”), respectivamente interposto entre um conjunto de arcabouço (“FR”) de cadeia leve e uma cadeia pesada o qual fornece suporte aos CDRs e define a relação espacial dos CDRs relativo a cada um. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia leve ou pesada. Procedendo a partir do N-terminal de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são denotadas como "CDR1," "CDR2," e "CDR3," respectivamente. Um local de ligação de antígeno, portanto, inclui seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada um da região V de cadeia leve e uma pesada. Um polipeptídio compreendendo uma única CDR (por exemplo, uma CDR1, CDR2 ou CDR3) pode ser referido como uma “unidade de reconhecimento molecular”. Análises cristalográficas de complexos de anticorpo/ antígeno tem demonstrado que os resíduos de aminoácido de CDRs de contato extensivo com o antígeno de ligação, em que o mais extensivo contato de antígeno é com a CDR3 de cadeia pesada. Deste modo, as unidades de reconhecimento molecular podem ser primariamente responsáveis pela especificidade de um local de ligação de antígeno. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação de antígeno.

[00131] O anticorpo humanizado pode ser designado para minimizar a resposta imunológica indesejada com respeito aos anticorpos anti-humanos de roedores, o qual limita a duração e efetividade das aplicações terapêuticas dessas porções em receptores humanos. O anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos dentro dele de uma fonte que é não humana. Esses resíduos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de “importação”, que são tipicamente tomados de um domínio variável. A humanização pode ser desempenhada através da substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Conformemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto tem sido substituído pela correspondente sequência de espécies não humanas. Por exemplo, veja a U.S. Patent No. 4.816.567, os conteúdos os quais estão aqui incorporados por referência. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo humano em que alguns resíduos de regiões hipervariáveis, e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. Humanização ou engenharia de anticorpos da presente invenção podem ser desempenhadas usando qualquer método conhecido, tais como, mas não limitados a aqueles descritos nas U.S. Pat. Nos. 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483, 5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; e 4.816.567.

[00132] O anticorpo humanizado pode reter alta afinidade para RGMc e outras propriedades biológicas favoráveis. O anticorpo humanizado pode ser preparado através de um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências humanizadas e parentais. Modelos de imunoglobulinas tridimensionais são comumente disponíveis. Programas de computador estão disponíveis que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. Inspeções dessas exibições permitem análises do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, por exemplo, as análises de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antígeno. Dessa maneira, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e importar sequências de modo que as características do anticorpo desejadas, tal como a afinidade aumentada para RGMc, é atingida. Em geral, os resíduos de regiões hipervariáveis podem ser diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação antígena.

[00133] Como uma alternativa à humanização, anticorpos humanos (também referidos aqui como “anticorpos totalmente humanos” podem ser gerados. Por exemplo, é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, a deleção homozigótica do gene (JH) da região de ligação da cadeia pesada do anticorpo em resultados de camundongos mutantes quiméricos e de linha germinativa em completa inibição de produção de anticorpo endógena. Transferência da matriz de gene de imunoglobulina da linha germinativa humana em tal camundongo mutante de linha germinativa irá resultar na produção de anticorpos humanos após desafio antígeno. Os anticorpos totalmente humanos ou humanizados podem ser preparados de acordo com os métodos descritos na U.S. Patent Nos. 5.770.429; 5.833.985; 5.837.243; 5.922.845; 6.017.517; 6.096.311; 6.111.166; 6.270.765; 6.303.755; 6.365.116; 6.410.690; 6.682.928; e 6,984,720, os conteúdos de cada um em que estão aqui incorporados por referência.

[00134] Outros métodos adequados de produzir ou isolar anticorpos da requisitada especificidade podem ser usados, incluindo, mas não limitado a, métodos que selecionam anticorpos recombinantes a partir de uma biblioteca de proteína ou peptídeo (por exemplo, mas não limitado a, um bacteriófago, ribossomo, oligonucleótido, RNA, cDNA, ou os similares, biblioteca de exibição; por exemplo, conforme disponível a partir de vários vendedores comerciais tais como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Alemanha), Biovation (Aberdeen, Scotland, Reino Unido) Biolnvent (Lund, Suécia), usando métodos conhecidos na técnica. Veja as U.S. Pat. Nos. 4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862. Métodos alternativos contam com a imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen et al. (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161 que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, conforme conhecidos na técnica e/ou conforme aqui descritos. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a, exibição de ribossomo (Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135); tecnologias de produção de anticorpo de célula única (por exemplo, método de anticorpo de linfócito selecionado (“SLAM”) (U.S. Pat. No. 5.627.052, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); microgotículas de gel e citometria de fluxo (Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; Sistemas de Célula Única, (Cambridge, Massachusetts); Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787790); Seleção de células B (Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994).

[00135] Um anticorpo de afinidade maturada pode ser produzido por qualquer um de um número de procedimentos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, veja Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade através de embaralhamento de domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de arcabouço são descritos por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). Mutação seletiva em posições de mutagênese seletiva e em posição de hipermutação ou de contato com uma atividade aumentando o resíduo de aminoácido é descrita na U.S. Pat. No. 6.914.128 Bl.

[00136] Variantes do anticorpo da presente invenção podem também ser preparados usando entregar um polinucleotídeo codificando um anticorpo dessa invenção para um hospedeiro adequado tal como fornecer animais transgênicos ou mamíferos, tais como cabras, vacas, cavalos, ovelhas, e os similares, que produzem tais anticorpos em seu leite. Esses métodos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas U.S. Pat. Nos. 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; e 5.304.489.

[00137] Variantes de anticorpos também podem ser preparados ao entregar um polinucleotídeo desta invenção para fornecer plantas transgênicas e células de plantas cultivadas (por exemplo, mas não limitadas ao tabaco, milho e lentilha) que produzem tais anticorpos, porções especificadas ou variantes nas partes das plantas ou em células cultivadas dos mesmos. Por exemplo, Cramer et al. (1999) Cuff. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 e referências ali citadas, descrevem a produção de folhas de tabaco transgênico expressando grandes quantidades de proteínas recombinantes. Por exemplo, usando um promotor indutível. Milho transgênico tem sido usado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentes a aqueles produzidos em outros sistemas recombinantes ou purificados a partir de fontes naturais. Veja, por exemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147 e referências ali citadas. Variantes de anticorpos tem também sido em grandes quantidades a partir de sementes de plantas transgênicas incluindo fragmentos de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia simples (scFv's), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Veja, por exemplo, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 e referências ali citadas. Deste modo, anticorpos da presente invenção podem também ser produzidos usando plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos.

[00138] Derivados de anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, ao adicionar sequências exógenas para modificar a imunogenicidade ou reduzir, aumentar ou modificar a ligação, afinidade, taxa de associação, taxa de desligamento, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada. Geralmente partes ou todas as sequências de CDR humano ou não humano são mantidas enquanto as sequências não humanas da variável e regiões constantes são substituídas com aminoácidos humano ou outros.

[00139] Pequenos fragmentos de anticorpos podem ser diacorpos possuindo dois locais de ligação de antígeno, em que os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH VL). Veja por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448. Ao usar um vinculador que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois locais de ligação de antígeno. Veja também, U.S. Pat. No. 6.632.926 to Chen et al. que é aqui incorporada por referência em sua totalidade e descobre variantes de anticorpos que possuem um ou mais aminoácidos inseridos dentro de uma região hipervariável do anticorpo parental e uma afinidade de ligação para um antígeno alvo o qual é ao menos aproximadamente duas dobras mais forte do que a afinidade de ligação do anticorpo parental para o antígeno.

[00140] O anticorpo pode ser um anticorpo linear. O procedimento para fazer um anticorpo linear é conhecido na técnica e descrito em Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Resumidamente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos de Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[00141] Os anticorpos podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes através de métodos conhecidos incluindo, mas não limitados a, purificação de proteína A, sulfato de amônia ou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografia de troca catiônica ou aniônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite e cromatografia de lectina. Cromatografia líquida de alta eficiência (“HPLC”) pode também ser usada para purificação.

[00142] Pode ser útil etiquetar terapeuticamente ou detectavelmente o anticorpo. Métodos para conjugar anticorpos para esses agentes são conhecidos na técnica. Apenas para o propósito de ilustração, anticorpos podem ser etiquetados com uma porção detectável tais como um átomo radioativo, um cromóforo, um fluoróforo, ou os similares. Tais anticorpos etiquetados podem ser usados para técnicas diagnósticas, tanto em uma amostra de teste isolada quanto uma in vivo. Anticorpos podem também ser conjugados, por exemplo, para um agente farmacêutico, tais como um fármaco quimioterápico ou uma toxina. Eles podem ser ligados a uma citocina, a um ligante, a outro anticorpo. Agentes adequados para o acoplamento aos anticorpos para atingir um efeito anti tumor inclui citocinas, tais como interleucina 2 (IL-2) e Fator de Necrose Tumoral (TNF); fotossensibilizantes, para uso em terapia fotodinâmica, incluindo tetrasulfonato de ftalocianina de alumínio (III), hematoporfirina, e ftalocianina; radionuclídeos, tais como iodo-131 (131I), ítrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto- 213 (213Bi), tecnécio-99m (99mTc), rênio-186 (186Re), e rênio-188 (188Re); antibióticos, tais como doxorrubicina, adriamicina, daunorubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina, e carboplatina; bactérias, plantas e outras toxinas, tais como toxina da difteria, exotoxina A de Pseudomonas, enterotoxina estafilocócica, toxina de abrina A, ricina A (ricina A deglicosilada e ricina A nativa), toxina de TGF alfa, citotoxina da cobra chinesa (naja atra), e gelonina (uma toxina de planta); proteínas de inativação de ribossomos de plantas, bactérias e fungos (uma proteína de inativação de ribossomo produzidos pelo Aspergillus restrictus, saporina (uma proteína de inativação de ribossomos da Saponaria officinalis), e RNase; inibidores de tirosina quinase; ly207702 (uma nucleosídeo de purina difluorada); lipossomas contendo agentes anti císticos (por exemplo, oligonucleótidos anti-sentido, plasmídeos que codificam para as toxinas, metotrexato, etc.); e outros anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tal como F(ab).

[00143] Os anticorpos podem ser sequenciados e replicados através de meios sintéticos ou recombinantes. Eles também podem ser ainda sequenciados para baixo para a sequência linear de nucleotídeos que os codificam. Conformemente, essa invenção fornece esses polinucleotídeos, sozinhos ou em combinação com um veículo, vetor ou célula hospedeira conforme acima descrito, que codifica uma sequência de um anticorpo dessa invenção.

[00144] A produção de anticorpo através do uso de tecnologia de hibridoma, o método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM), animais transgênicos, e bibliotecas de anticorpos recombinantes são descritos em mais detalhes abaixo. (1) Anticorpos monoclonais anti-RGMc usando tecnologia de hibridoma

[00145] Conforme descrito acima, anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma larga variedade de técnicas conhecidas na arte incluindo o uso de tecnologias de exibição de fago, recombinante e de hibridoma, ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na arte e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edição, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981). É também notado que o termo “anticorpo monoclonal” conforme aqui usado não está limitado a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. O termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo que é derivado de um clone único, incluindo qualquer clone de fago, procariótico, ou eucariótico, e não o método pelo qual ele é produzido.

[00146] Em uma modalidade, são fornecidos métodos de geração de anticorpos monoclonais assim como anticorpos produzidos através do método compreendendo a cultivação de célula de hibridoma secretando um anticorpo em que, preferivelmente, o hibridoma é gerado ao fundir esplenócitos isolados a partir de um animal, por exemplo, um rato ou um camundongo, imunizado com RGMc com células de mieloma e então triando os hibridomas resultando a partir da fusão para clones de hibridoma que secretam um anticorpo que pode ligar à RGMc (ou um fragmento ou um variante da mesma). Resumidamente, ratos podem ser imunizados com um antígeno de RGMc (veja exemplo abaixo). Em uma modalidade preferida, o antígeno de RGMc é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tais adjuvantes incluem adjuvantes de Freund completos ou incompletos, RIBI (muramil dipeptídeos) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídeo a partir de uma rápida dispersão ao sequestrá-lo em um depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferivelmente, se um polipeptídeo está sendo administrado, o calendário de imunização irá envolver duas ou mais administrações do polipeptídeo, distribuída ao longo de várias semanas; contudo, uma única administração do polipeptídeo pode também ser usada.

[00147] Após imunização de um animal com um antígeno de RGMc, anticorpos e/ ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidas a partir do animal. Um soro contendo anticorpo anti-RGMc é obtido a partir do animal por sangramento ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado conforme ele é obtido a partir do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida a partir do soro, ou os anticorpos anti- RGMc podem ser purificados a partir do soro. O soro ou as imunoglobulinas obtidas desta maneira são policlonais, deste modo possuindo uma matriz heterogênea de propriedades.

[00148] Uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpo específicos para o antígeno de RGMc são detectados no soro do rato, o baço do rato é colhido e esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos através de técnicas nem conhecidas a quaisquer células mieloma adequada, por exemplo, células da linha de células SP20 disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virgínia., EUA). Hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são então analisados através de métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos que podem ligas RGMc (ou um fragmento ou uma variante da mesma). Líquido ascítico, o qual geralmente contém altos níveis de anticorpos, podem ser gerados ao imunizar ratos com clones de hibridoma positivos.

[00149] Em outra modalidade, hibridomas imortalizadas produtoras de anticorpos podem ser preparadas a partir de animais imunizados. Após imunização, o animal é sacrificado e as células B do baço são fundidas às células de mieloma imortalizadas conforme é bem conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Em uma modalidade preferida as células de mieloma não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linha celular não secretora). Após fusão e seleção antibiótica, os hibridomas são rastreados usando RGMc, ou um fragmento ou uma variante dos mesmos, ou uma células expressando RGMc (ou um fragmento ou uma variante da mesma). Em uma modalidade preferida, o rastreamento inicial é desempenhado usando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferivelmente um ELISA. Um exemplo de ELISA rastreando é fornecido em PCT Publication No. WO 00/37504.

[00150] Hibridomas produtoras de anticorpos anti-RGMc são selecionados, clonados e ainda rastreados para características desejáveis, incluindo crescimento robusto de hibridoma, alta produção de anticorpo, e características desejáveis do anticorpo, conforme discutido mais abaixo. Hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que não possuem um sistema imune, por exemplo, camundongos nude, ou em cultura de células in vitro. Métodos de seleção, clonagem e de expansão de Hibridomas são bem conhecidos por aqueles que são peritos técnica.

[00151] Em uma modalidade preferida, hibridomas são hibridomas de ratos, conforme aqui descrito. Em outra modalidade, hibridomas são produzidos em espécies não humanas, e não ratos tais como camundongos, ovelhas, porcos, cabras, gado, ou cavalos. Ainda em outra modalidade preferida, os hibridomas são hibridomas humanos, em que um mieloma não secretor humano é fundido com uma célula humana expressando um anticorpo anti-RGMc.

[00152] Fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos de Fab e F(ab')2 podem ser produzidos através de clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir dos fragmentos idênticos de Fac) ou pepsina (para produzir um fragmento de F(ab')2). Um fragmento de F(ab')2 de uma molécula de IgG retém os dois locais de ligação de antígeno da maior molécula de IgG (“materna”), incluindo ambas as cadeias leves (contendo a cadeia variável leve e as regiões de cadeia leve constantes), os domínios de CH1 das cadeias pesadas, e uma região charneira de formação de dissulfeto da molécula de IgG materna. Conformemente, uma fragmento de F(ab')2 pode ligar transversalmente moléculas de antígeno como a molécula de IgG materna. (2) Anticorpos monoclonais anti-RGMc usando SLAM

[00153] Anticorpos recombinantes podem ser gerados a partir de um único, linfócito isolado usando um procedimento referido na técnica como método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM), conforme descrito na U.S. Pat. No. 5.627.052; PCT Publication No. WO 92/02551; e Babcook et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996). Neste método, células únicas secretando anticorpos de interesse, por exemplo, linfócitos derivados a partir de qualquer um dos animais imunizados descritos na Seção I.A.1 (acima), são rastreados usando um ensaio de placa hemolítica específica de antígeno, em que a RGMc de antígeno, uma subunidade de RGMc, ou um fragmento da mesma, é acoplada às células sanguíneas vermelhos de ovelha usando um vinculador, tal como biotina, e usada para identificar células únicas que secretam anticorpos com especificidade para RGMc. Seguindo a identificação de células de secreção de anticorpo de interesse, cDNAs de região variável de cadeia leve e pesada são resgatados das células por transcriptase-PCR reversa (RT-PCR) e essas regiões variáveis podem então ser expressas, no contexto de regiões constantes de imunoglobulina apropriada (por exemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamíferos, tais como células de CHO ou COS. As células hospedeiras transfectadas com as sequências de imunoglobulinas amplificadas, derivadas de linfócitos selecionados in vivo, podem então submeter-se a uma análise adicional e seleção in vitro, por exemplo, ao garimpar as células transfectadas para células isoladas expressando anticorpos para RGMc. As sequências de imunoglobulina amplificadas podem ainda ser manipuladas in vitro, tal como através de um método de maturação de afinidade in vitro. Veja, por exemplo, a PCT Publication No. WO 97/29131 e PCT Publication No. WO 00/56772. (3) Anticorpos monoclonais anti-RGMc usando animais transgênicos

[00154] Anticorpos também podem ser produzidos ao imunizar um animal não humano compreendendo alguns, ou todos, do locus de imunoglobulina humana com um antígeno de RGMc. Em uma modalidade, o animal não humano é um camundongo transgênico XENOMOUSE®, uma cepa de camundongo projetada que compreende grandes fragmentos do locus de imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpos de camundongo. Veja, pode exemplo, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) e U.S. Pat. Nos. 5.916.771; 5.939.598; 5.985.615; 5.998.209; 6.075.181; 6.091.001; 6.114.598; e 6.130.364. Vela também PCT Publication Nos. WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; e WO 00/37504. O camundongo transgênico XENOMOUSE® produz um repertório humano do tipo adulto de anticorpos totalmente humanos, e gera anticorpos monoclonais humanos específicos de antígenos. O camundongo transgênico XENOMOUSE® contém aproximadamente 80% do repertório de anticorpos humanos através da introdução de, dimensionados em megabase, fragmentos de YAC de configuração germinativa do loci de cadeia pesada e loci de cadeia leve x humanas. Veja Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998), as descobertas dos quais estão aqui incorporados por referência. (4) Anticorpos monoclonais anti-RGMc usando bibliotecas de anticorpos recombinantes

[00155] Métodos in vitro também ser usados para fazer os anticorpos, em que uma biblioteca de anticorpo é rastreada para identificar um anticorpo possuindo a desejada especificidade de RGMc de ligação. Métodos para tal rastreamento de bibliotecas de anticorpos recombinantes são bem conhecidos na técnica e incluem métodos descritos em, por exemplo, U.S. Pat. No. 5.223.409 (Ladner et al.); PCT Publication No. WO 92/18619 (Kang et al.); PCT Publication No. WO 91/17271 (Dower et al.); PCT Publication No. WO 92/20791 (Winter et al.); PCT Publication No. WO 92/15679 (Markland et al.); PCT Publication No. WO 93/01288 (Breitling et al.); PCT Publication No. WO 92/01047 (McCafferty et al.); PCT Publication No. WO 92/09690 (Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al,, Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); US Patent Application Publication No. 2003/0186374; e PCT Publication No. WO 97/29131, os conteúdos de cada um os quais estão incorporados aqui por referência.

[00156] A biblioteca de anticorpo recombinante pode ser de um indivíduo imunizado com RGMc, ou uma porção de RGMc. Alternativamente, a biblioteca de anticorpo recombinante pode ser de um indivíduo ingênuo, por exemplo, um que não tenha sido imunizado com RGMc, tal como uma biblioteca de anticorpo humano de um indivíduo humano que não tenha sido imunizada com RGMc humano. Anticorpos são selecionados ao rastrear a biblioteca de anticorpo recombinante com o peptídeo compreendendo RGMc humana para selecionar aqueles anticorpos que reconhecem RGMc. Métodos para conduzir tal rastreamento e seleção são bem conhecidos na técnica, tais como os descritos nas referências do parágrafo precedente. Para selecionar anticorpos possuindo afinidades de ligação particulares para RGMc, tais como aqueles que se dissociam de RGMc humana com uma constante de taxa Koff particular, o método de técnica conhecido de ressonância de plasmon de superfície pode ser usado para selecionar anticorpos possuindo a desejada constante de taxa Koff. Para selecionar anticorpos possuindo uma atividade de neutralização particular para hRGMc, tais como aquelas com um IC50 particular, métodos padrões conhecidos na técnica para avaliar a inibição de atividade de RGMc podem ser usados.

[00157] Em um aspecto, o anticorpo isolado, ou uma porção de antígeno de ligação do mesmo, que liga RGMc humana. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal.

[00158] Por exemplo, anticorpos podem também ser gerados usando vários métodos de exibição em fagos conhecidos na técnica. Em métodos de exibição em fagos, domínios de anticorpos funcionais são exibidos na superfície das partículas de fago os quais transportam as sequências de polinucleotídeo os codificando. Tal fago pode ser utilizados para exibir domínios de antígeno de ligação expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpo combinatorial (por exemplo, humana ou murina). Fago expressando um domínio de antígeno de ligação que liga o antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno vinculado ou capturado a uma superfície sólida ou grânulo. Fagos usados nesses métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo domínios de ligação M13 e fd expressos a partir de fagos com Fab, Fv, ou domínios de anticorpos de Fv de dissulfeto estabilizado recombinantemente fundidos a qualquer proteína de gene III ou gene VIII do fago. Exemplos de métodos de exibição em fagos que podem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles descobertos em Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); PCT Publication Nos. WO 92/01047; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e U.S. Pat. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; e 5.969.108.

[00159] Conforme descrito nas referências acima, após a seleção de fago, as regiões de anticorpo de codificação do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos completos incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de antígeno de ligação desejado, e expressado em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células de plantas, leveduras, e bactérias, por exemplo, conforme descrito em detalhes abaixo. Por exemplo, técnicas para produzir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab', e F(ab')2 podem também ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles descobertos na PCT publication No. WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); e Better et al.. Science, 240: 1041-1043 (1988). Exemplos de técnicas as quais podem ser usadas para produzir anticorpos e Fvs de cadeia única incluem aqueles descritos nas U.S. Pat. Nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988).

[00160] Alternativa para rastreamento de bibliotecas de anticorpos recombinantes através de exibição em fagos, outras metodologias conhecidas na técnica para rastrear grandes bibliotecas combinatórias podem ser aplicadas à identificação dos anticorpos. Um tipo de sistema de expressão alternativa é um em que a biblioteca de anticorpo recombinante é expressa como fusões de RNA-proteína, conforme descrito na PCT Publication No. WO 98/31700 (Szostak and Roberts), e em Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). Nesse sistema, uma fusão covalente é criada entre uma mRna e um peptídeo ou proteína que codifica através da tradução in vitro de mRNAs sintéticos que transportam puromicina, um antibiótico aceitador de peptidil, em sua extremidade 3’. Deste modo, um mRNA específica pode ser enriquecido a partir de uma complexa mistura de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatória) baseada nas propriedades da proteína ou peptídeo codificado, por exemplo, anticorpo, ou porção do mesmo, tal como ligação do anticorpo, ou porção do mesmo, para o antígeno de especificidade dupla. Sequências de ácido nucleico codificando anticorpos, ou porções do mesmo, recuperadas do rastreamento de tais bibliotecas podem ser expressas através de meios recombinantes conforme descrito acima (por exemplo, em células hospedeiras de mamíferos) e, além disso, podem ser sujeitas a posterior maturação de afinidade ou por rodadas adicionais de rastreamento de fusões de RNA-peptídeo em que mutações têm sido introduzidas em sequência(s) originalmente selecionada(s), ou através de outros métodos para maturação de afinidade in vitro de anticorpos recombinantes, conforme descrito acima. Um exemplo preferido dessa metodologia é a tecnologia de exibição de PROfusão.

[00161] Em outra abordagem, os anticorpos podem também ser gerados usando métodos de exibição de leveduras conhecidos na técnica. Em métodos de exibição de leveduras, métodos genéticos são usados para amarrar domínios de anticorpos à parede de célula da levedura e exibi-los na superfície da levedura. Em particular, tais leveduras podem ser utilizadas para exibir domínios de antígeno de ligação expressados a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpos combinatórios (por exemplo, humano ou murina). Exemplos de métodos de exibição de leveduras que podem ser usados para fazer os anticorpos incluem aqueles descobertos na U.S. Pat. No. 6.699.658 (Wittrup et al.), a qual está incorporada aqui por referência. (5) Produção Sintética

[00162] Uma vez sequenciado, polipeptídios, tais como um anticorpo monoclonal (ou um fragmento dos mesmos), o qual especificamente se liga à RGMc, pode ser sintetizado usando métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, síntese em fase sólida exclusiva, síntese em fase sólida parcial, condensação de fragmento, e síntese de solução clássica. Veja, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963). Em fase sólida, a síntese tipicamente começa a partir da extremidade C-terminal do peptídeo usando uma resina de alfa-amino protegida. Um material de início adequado pode ser preparado, por exemplo, ao anexar a requerida resina de alfa-amino protegida a uma resina clorometilada, uma resina de hidroximetilo ou uma resina de benzidrilamina. Uma tal resina clorometilada é vendida sob o nome comercial BIO-BEADS SX-1 pelo Bio Rad Laboratories (Richmond, Califórnia, EUA), e a preparação da resina de hidroximetil é descrita por Bodonszky et al., Chem. Ind. (London) 38: 1597 (1966). A resina de benzidrilamina (BHA) foi descrita por Pietta e Marshall, Chem. Comm. 650 (1970) e é comercialmente disponível pela Instruments, Inc. (Palo Alto, Califórnia, EUA) na forma de hidrocloreto. Sintetizadores de peptídeo automatizados estão comercialmente disponíveis, como são os serviços que fazem peptídeos para encomendar.

[00163] Deste modo, os polipeptídios podem ser preparados ao acoplar um aminoácido de alfa-amino de proteção à resina clorometilada com o auxílio de, por exemplo, catalisador de bicarbonato de césio, de acordo com o método descrito por Gisin, Hely. Chim. Acta. 56: 1467 (1973). Após o acoplamento inicial, o grupo de proteção alfa-amino é removido por uma escolha de reagentes incluindo soluções de ácido trifluoroacético (TFA) ou ácido clorídrico (HCl) em solventes orgânicos em temperatura ambiente.

[00164] Grupos protetores alfa-amino adequados incluem aqueles conhecidos por ser úteis na técnica de síntese de peptídeos passo a passo. Exemplos de grupos protetores alfa-amino são: Os grupos protetores do tipo acilo (por exemplo, formil, trifluoroacetil e acetil), grupos protetores do tipo uretano aromático (por exemplo, benziloxicarbonil (Cbz) e Cbz susbtituído), grupos protetores de uretano alifático (por exemplo, t-butiloxicarbonil (Boc), isopropiloxicarbonil, e ciclohexiloxicarbonil), e grupos protetores do tipo alquil (por exemplo, benzil e trifenilmetil). Boc e Fmoc são grupos protetores preferidos. O grupo protetor da cadeia lateral permanece intacto durante acoplagem e não é separado durante a desproteção do grupo protetor amino terminal ou durante a acoplagem. O grupo protetor da cadeia lateral deve ser removível mediante a conclusão da síntese do peptídeo final e sob condições de reação que não irão alterar o tédio alvo.

[00165] Após a remoção do grupo protetor de alfa-amino, os aminoácidos remanescentes são acoplados passo a passo na ordem desejada. Um excesso de cada aminoácido protegido é geralmente usado com um apropriado grupo carboxil ativador tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) em solução, por exemplo, misturas de cloreto de metileno e dimetil formamida (DMF).

[00166] Após a desejada sequência de aminoácidos ter sido completada, o peptídeo desejado é desacoplado do suporte de resina através de tratamento com um reagente, tais como TFA ou fluoreto de hidrogênio (HF), o qual não apenas cliva o peptídeo a partir da resina, mas também cliva todos os grupos protetores de cadeia lateral remanescentes. Quando a resina clorometilada é usada, o tratamento de HF resulta na formação dos ácidos de peptídeo livre. Quando a resina de resina de benzidrilamina é usada, o tratamento de HF resulta diretamente na amida de tédio livre. Alternativamente, quando a resina clorometilada é empregada, o peptídeo protetor de cadeia lateral pode ser desacoplado através do tratamento de resina de peptídeo com amônia para dar a desejada amida protetora de cadeia lateral ou com uma alquilamina para dar uma alquilamida ou dialquilamida protetora de cadeia lateral. O protetor de cadeia lateral é então removido na forma usual através do tratamento com fluoreto de hidrogênio para dar amidas, alquilamidas ou dialquilamidas livres.

[00167] Esse e outros procedimentos de síntese de tédio em fase sólida são bem conhecidos na técnica. Tais procedimentos são também descrito por Stewart e Young em Solid Phase Peptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984).

3. Composição Farmacêutica

[00168] Os anticorpos podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para a administração em um indivíduo (tal como um paciente, o qual pode ser humano ou não humano). Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacteriais e antifúngicos, agentes retardadores de absorção e isotônicos, e os similares que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis inclui um ou mais de água, salina, salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e os similares, como também as combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agente isotônicos, por exemplo, açucares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ainda compreender quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, os quais aumentam o prazo de validade ou a efetividade do anticorpo.

[00169] Em uma outra forma de realização, a composição farmacêutica compreende ao menos um agente terapêutico adicional para tratar, prevenir, modular ou atenuar um distúrbio conforme aqui descoberto. O agente terapêutico adicional pode ser uma eritropoietina ou outro agente estimulador da eritropoiese (ESA). O agente terapêutico adicional pode ser um ou mais outros anticorpos que ativam o receptor de EPO, tais como um anticorpo biespecífico ou um anticorpo variável duplo, e/ ou que se liga à IL-6, BMP-2, BMP-4, e ou BMP-6. Outros agentes terapêuticos, tais como compostos de redução de hepcidina podem ser usados. Exemplos de compostos de redução de hepcidina incluem spiegelmere NOX-H94 e/ ou Dorsomorphin.

[00170] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar um ou mais anticorpos ou uma combinação de um ou mais anticorpos e um agente profilático ou agente terapêutico úteis para tratar ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartícula, microcápsulas, células recombinantes que podem expressar o anticorpo ou fragmento de anticorpo, endocitose mediada por receptores (veja, por exemplo, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um retroviral ou outro vetor, etc. Métodos de administrar um agente profilático ou terapêutico incluem, mas não estão limitados a, administração parenteral, (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), administração epidural, administração intratumoral e administração mucosa (por exemplo, rotas orais e intranasais). Em adendo, administração pulmonar pode ser empregada, por exemplo, através do uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de aerossolização. Veja, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e PCT Publication Nos. WO 92/19244, W097/32572, W097/44013, W098/31346, e W099/66903, cada uma das quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade. Em uma modalidade, um anticorpo, terapia de combinação, ou uma composição é administrada usando fármaco com tecnologia de dispersão pulmonar AIR® da Alkermes (Alkermes, Inc., Cambridge, Massachusets, EUA). Em uma modalidade específica, agentes terapêuticos ou profiláticos são administrados intramuscularmente, intravenosamente, intratumoralmente, oralmente, intranasalmente, pulmonar, ou subcutaneamente. Os agentes terapêuticos ou profiláticos podem ser administrados por qualquer rota conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolus, através da absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administrados junto com outros agentes ativos biologicamente. Administração pode ser sistêmica ou local.

[00171] Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar os anticorpos localmente na área em necessidade de tratamento; isso pode ser atingido através de, por exemplo, e não por meio de limitação, infusão local, por injeção, ou por meios de um implante, o dito implante endo de um material poroso ou não poroso, incluindo membranas e matrizes, tais como membranas sialásticas, polímeros, matrizes fibrosas (por exemplo, Tissuel®), ou matrizes de colágeno. Em uma modalidade, uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos é administrada localmente na área afetada em um indivíduo para prevenir, tratar, gerir, e/ ou melhorar um distúrbio ou um sintoma do mesmo. Em outra modalidade, uma quantidade efetiva de um ou mais, uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos é administrada localmente na área afetada em combinação com uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos) que não seja um anticorpo da invenção em um indivíduo para prevenir, tratar, gerir, e/ ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo.

[00172] Em outra modalidade, o anticorpo pode ser entregue em uma liberação controlada ou sistema de liberação sustentado. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada para atingir a liberação sustentada ou controlada (veja Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados para atingir a liberação sustentada ou controlada das terapias (veja, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; veja também, Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. No. 5.679.377; U.S. Pat. No. 5.916.597; U. S. Pat. No. 5.912.015; U.S. Pat. No. 5.989.463; U.S. Pat. No. 5.128.326; PCT Publication No. W099/15154; e PCT Publication No. W099/20253. Exemplos de polímeros usados em formulações de liberação sustentada incluem, mas não estão limitados a, poli (2-hidroxi etil metacrilato), poli (metil metacrilato), poli (ácido acrílico), poli (etileno- co-vinil acetato), poli (ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianidridos, poli (N-vinil pirrolidona), poli (álcool vinílico), poliacrilamida, poli (etileno glicol), poliláctidos (PLA), poli (lactido- co-glicólidos) (PLGA), e poliortoésteres. Em uma modalidade particular, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, livre de impurezas lixiviáveis, estável em armazenamento, estéril, e biodegradável. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação sustentado ou controlado pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico ou profilático, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica (veja, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

[00173] Sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Qualquer técnica conhecida por alguém com habilidade na técnica pode ser usada para produzir formulações de liberação sustentada compreendendo um ou mais anticorpos. Veja, por exemplo, U. S. Pat. No. 4.526.938, PCT publication W091/05548, PCT publication W096/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Câncer Xenograft Using a Sustained- Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853854, e Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760, cada uma das quais estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00174] Em uma modalidade específica, onde a composição é um ácido nucleico codificando um anticorpo, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de se anticorpo codificado, ao construí-lo como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico apropriado e administrando-o de modo que ele se torne intracelular, por exemplo, através do uso de um vetor retroviral (veja a U. S. Pat. No. 4.980.286), ou através de injeção direta, ou através do ou de bombardeamento de micropartícula (por exemplo, injetor de gene; Biolistic, Dupont), ou revestindo com lipídios ou receptores de superfície de célula ou agentes transfectantes, ou ao administrá-lo em ligação com um peptídeo tipo homeobox o qual é conhecido por entrar no núcleo (veja, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente no DNA da célula hospedeira para expressão através de recombinação homóloga.

[00175] Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com sua rota de administração pretendida. Exemplos de rotas de administração incluem, mas não estão limitados a, parental, por exemplo, intravenosa, intraderma, subcutânea, oral, intranasal (por exemplo, inalação), transdérmica (por exemplo, tópica), transmucosa, e administração retal. Em uma modalidade específica, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina conforme uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, intranasal, ou tópica em seres humanos. Tipicamente, composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção.

[00176] Se as composições são para ser administradas topicamente, as composições podem ser formuladas na forma de uma pomada, creme, emplastro transdérmico, loção, gel, xampu, pulverizador, aerosol, solução, emulsão, ou outra forma bem conhecido para alguém com habilidade na técnica. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosagem tópicas não pulverizáveis, formas sólidas ou viscosas a semi-sólida compreendendo um veículo ou um ou mais excipientes compatíveis com aplicação tópica e possuindo uma viscosidade dinâmica maior que a água são tipicamente empregados. Formulações adequadas incluem, sem limitação, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomada, pós, linimentos, unguentos, e os similares, os quais são, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares (por exemplo, preservativos, estabilizadores, agentes molhantes, tampões, ou sais) para influenciar diversas propriedades, tais como, por exemplo, pressão osmótica. Outras formas adequadas de dosagem tópica incluem preparações de aerosol pulverizáveis em que o ingrediente ativo, por exemplo, em combinação com um veículo inerte líquido ou sólido, é embalado em uma mistura com um volátil pressurizado (por exemplo, um propulsor gasoso, tal como freon) ou em uma garrafa de compressão. Hidratantes ou umectantes podem também ser adicionados a composições farmacêuticas e formas de dosagem se desejado. Exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na técnica.

[00177] Se o método compreende administração intranasal de uma composição, a composição pode ser formulada em uma forma de aerosol, pulverizadora, nevoeiro, ou na forma de gotas. Em particular, agentes profiláticos ou terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção podem ser convencionalmente entregues na forma de uma apresentação em pulverização de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado (por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano ou outro gás adequado). No caso de um aerosol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada ao fornecer uma válvula para entregar uma quantidade doseada. Cápsulas e cartuchos (compostos de, por exemplo, gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada tais como lactose ou amido.

[00178] Se o método compreende administração oral, composições podem ser formuladas oralmente na forma de comprimidos, cápsulas, drágeas, cápsulas de gel, soluções, suspensões, e os similares. Comprimidos ou cápsulas podem ser preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona, ou hidroxipropilmetilcelulose); enchimentos (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido sódico); ou agentes molhantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica. Preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, mas não limitadas a, soluções, xaropes ou suspensões, ou eles podem ser apresentados como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações de líquidos podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose, ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e preservativos (por exemplo, metil ou propil-p- hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tampão e agentes aromatizantes, corantes e adoçantes apropriados. Preparações para a administração oral podem ser adequadamente formuladas para liberação lenta, liberação controlada, ou liberação sustentada de um(s) agente(s) profilático ou terapêutico.

[00179] O método pode compreender administração pulmonar, por exemplo, através do uso de um inalador ou nebulizador, de uma composição formulada com um agente de aerosolização. Veja, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, e WO 99/66903, cada uma das quais está aqui incorporada por referência em suas totalidades. Em uma modalidade específica, um anticorpo, terapia de combinação, e/ ou composição é administrado usando fármaco com tecnologia de dispersão pulmonar AIR® da Alkermes (Alkermes, Inc, Cambridge, Massachusets, EUA).

[00180] O método pode compreender a administração de uma composição formulada para administração parenteral através de injeção (por exemplo, através de injeção de bolus ou infusão contínua). Formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária (por exemplo, em ampolas ou em contêineres multidose) com um preservativo adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos aquosos ou oleosos, e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de dispersão, estabilização e/ ou suspensão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser em forma de pó para constituição com um veículo adequado (por exemplo, água isenta de pirógenos estéril) antes do uso. Os métodos podem adicionalmente compreender a administração de composições formuladas como preparações de depósito. Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas através da implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou através de injeção intramuscular. Deste modo, por exemplo, as composições podem ser formuladas com materiais hidrofóbicos ou poliméricos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados pouco solúveis (por exemplo, como um sal pouco solúvel).

[00181] Os métodos englobam a administração de composições formuladas como formas neutras ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions tais como aqueles derivados a partir de ácidos tartárico, oxálico, acético, fosfórico, clorídrico, etc., e aqueles formados com cátions tais como aqueles derivados a partir de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[00182] Geralmente, os ingredientes das composições são fornecidos ou separadamente ou misturados juntos na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado livre de água em um contêiner selado hermeticamente tais como uma ampola ou saché indicando a quantidade do agente ativo. Onde o modo de administração é infusão, a composição pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo soro fisiológico ou água de grau farmaceuticamente estéril. Onde o modo de administração é através de injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou soro fisiológico pode ser fornecido de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00183] Em particular, um ou mais dos anticorpos, ou composições farmacêuticas, podem ser embaladas em um contêiner selado hermeticamente tais como uma ampola ou saché indicando a quantidade do anticorpo. Em uma modalidade, um ou mais dos anticorpos, ou composições farmacêuticas é/ são fornecidos como um pó liofilizado seco esterilizado ou concentrado livre de água em um contêiner selado hermeticamente e podem ser reconstituídos (por exemplo, com água ou soro fisiológico) à apropriada concentração para administração em um indivíduo. Em uma modalidade, um ou mais dos anticorpos ou composições farmaceuticamente é fornecido com um pó liofilizado, estéril, seco em um contêiner selado hermeticamente em uma unidade de dosagem de ao menos 5 mg, por exemplo, ao menos 10 mg, ao menos 15 mg, ao menos 25 mg, ao menos 35 mg, ao menos 45 mg, ao menos 50 mg, ao menos 75 mg, ou ao menos 100 mg. Os anticorpos liofilizados ou composições farmacêuticas devem ser armazenados entre 2°C e 8°C no contêiner original e os anticorpos ou composições farmacêuticas devem ser administradas dentro de 1 semana, por exemplo, dentro de 5 dias, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, ou dentro de 1 hora após ser reconstituído. Em uma modalidade alternativa, um ou mais dos anticorpos ou composições farmacêuticas é fornecido em forma líquida em um contêiner selado hermeticamente indicando a quantidade e concentração do anticorpo. Em uma outra forma de modalidade, a forma líquida da composição administrada é fornecida em um contêiner hermeticamente selado de ao menos 0,25 mg/ml, por exemplo, ao menos 0,5 mg/ml, ao menos 1 mg/ml, ao menos 2,5 mg/ml, ao menos 5 mg/ml, ao menos 8 mg/ml, ao menos 10 mg/ml, ao menos 15 mg/kg, ao menos 25 mg/ml, ao menos 50 mg/ml, ao menos 75 mg/ml ou ao menos 100 mg/ml. A forma do líquido deve ser armazenada entre 2°C e 8°C em seu contêiner original.

[00184] Os anticorpos podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral. Em um aspecto, anticorpos serão preparados como uma solução injetável contendo 0,1-250 mg/ml de anticorpo. A solução injetável pode ser composta ou de um líquido ou forma de dosagem liofilizada em um frasco de pederneira ou âmbar, ampola ou seringa pré-cheia. O tampão pode ser L-histidina (1-50 mM), otimamente 5-10 mM, a pH de 5,0 a 7,0 (otimamente pH 6,0). Outros tampões adequados incluem, mas não estão limitados a, succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Cloreto de sódio pode ser usado para mudar a toxicidade da solução a uma concentração de 0-300 mM (otimamente 150 mM para uma forma de dosagem líquida). Crioprotetores podem ser incluídos para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 0-10% de sacarose (otimamente 0,5-1,0%). Outros crioprotetores adequados incluem trealose e lactose. Agentes espessantes podem ser incluídos para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 1-10% de manitol (otimamente 2-4%). Estabilizadores podem ser usados em ambas a formas, líquida e de dosagem liofilizada, principalmente 1-50 mM de L-Metionina (otimamente 5-10 mM). Outros agentes estabilizadores adequados incluem glicina, arginina, podem ser incluídas como 00,05% de polissorbato-80 (otimamente 0,005-0,01%). Surfactantes adicionais incluem, mas não estão limitados a polissorbato-20 e surfactantes BRIJ. A composição farmacêutica compreendendo os anticorpos preparada como uma solução injetável para administração parental, pode ainda compreender um agente útil como um adjuvante, tal como aqueles usados para aumentar a absorção, ou dispersão do anticorpo. Um adjuvante particularmente útil é a hialuronidase, tal como Hylenex® (hialuronidase humana recombinante). Adição de hialuronidase na solução injetável aumenta a biodisponibilidade humana após a administração parenteral, particularmente a administração subcutânea. Também permite por maiores volumes no local da injeção (por exemplo, maior que 1 ml) com menos dor e desconforto e incidência mínima de reações no local da injeção. (Veja International Appln. Publication No. WO 04/078140 e U.S. Patent Appln. Publication No. US 2006104968, incorporadas aqui por referência.)

[00185] As composições podem ser em uma variedade de formas. Essas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida e sólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e aplicação terapêutica. Composições podem ser na forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais como composições similares a aquelas usadas para imunização passiva de humanos com outros anticorpos. Em uma modalidade, o anticorpo é administrado através de infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade, o anticorpo é administrado através de injeção subcutânea ou intramuscular.

[00186] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de manufatura e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada à alta concentração de medicamentos. Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas ao incorporar o composto ativo (por exemplo, uma proteína de ligação, por exemplo, um anticorpo) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido pela esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas ao incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis, liofilizados para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação compreendem secagem a vácuo e secagem por pulverização que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal com a lecitina, através da manutenção do requerido tamanho da partícula no caso da dispersão e através do uso de surfactantes. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser conseguida incluindo, na composição, um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de sais e a gelatina.

[00187] Os anticorpos podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Para muitas aplicações terapêuticas, a rota/ modo de administração pode ser injeção subcutânea, injeção intravenosa ou infusão. Como será apreciado pelos peritos na arte, a rota e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Em certas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o composto contra a rápida liberação, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biocompatíveis, biodegradáveis podem ser usados, tais como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteadas ou geralmente conhecidas por aqueles com habilidades na técnica. Por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00188] Em certas modalidades, um anticorpo pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. O anticorpo (e outros ingredientes, e desejado), pode também ser incluso em uma cápsula com invólucro de gelatina mole ou duro, prensada em comprimidos, ou incorporada diretamente nas dietas dos indivíduos. Para administração terapêutica oral, o anticorpo pode ser incorporado com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, e os similares. Para administrar um anticorpo através de outra que não a administração parenteral, será necessário revestir o anticorpo com, ou coadministrar o anticorpo com, um material para prevenir sua inativação.

[00189] Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições. Em certas modalidades, um anticorpo é co-formulado com e/ ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que são úteis para tratar distúrbios ou doenças descritas aqui. Por exemplo, um anticorpo anti- globulômero de RGMc pode ser co-formulado e/ ou coadministrado com um ou mais anticorpos adicionais que ligam outros alvos (Por exemplo, anticorpos que ligam outros antígenos solúveis ou que ligam moléculas de superfície de célula). Além disso, um ou mais anticorpos podem ser usados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos anteriores. Tais terapias de combinação podem vantajosamente utilizar dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, deste modo evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com as várias monoterapias.

[00190] Em certas modalidades, um anticorpo é ligado a um veículo prorrogador de meia vida conhecido na técnica. Tais veículos incluem, mas não estão limitados a, o domínio de Fc, polietilenoglicol, e dextrano. Tais veículos são descritos, por exemplo, na U.S. Application Serial No. 09/428.082 e na publicada PCT Application No. WO 99/25044, as quais estão aqui incorporadas por referência para esse propósito.

[00191] Em uma modalidade específica, sequências de ácido nucleico compreendendo sequências nucleotídeas codificando um anticorpo são administradas para tratar, prevenir, gerir, ou melhorar um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo por meio de terapia de gene. Terapia de gene se refere à terapia desempenhada através da administração a um indivíduo de um ácido nucleico expressável ou expresso. Nesta modalidade, o ácido nucleico produz seu anticorpo codificado que medeia um efeito terapêutico ou profilático.

[00192] Quaisquer um dos métodos para terapia de gene disponíveis na técnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Para revisões gerais sobre os métodos de terapia de gene, veja Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488- 505, (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95, (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596, (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante os quais podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Uma descrição detalhada de vários métodos de terapia de gene é descoberta em US 20050042664 A1 a qual está incorporada aqui por referência.

[00193] Deve ser entendido adiante que as combinações são aquelas combinações úteis para seus propósitos pretendidos. Os agentes definidos acima são para propósitos ilustrativos e não pretendidos para serem limitantes. As combinações podem compreender um anticorpo e ao menos um agente adicional selecionado a partir da lista abaixo. A combinação pode também incluir mais que um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes adicionais se a combinação é de tal modo que a composição formada pode desempenhar uma função pretendida.

[00194] As composições farmacêuticas podem incluir uma “quantidade efetiva terapeuticamente” ou uma “quantidade efetiva profilaticamente” de um anticorpo. Uma “quantidade efetiva terapeuticamente” se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens e para períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade efetiva terapeuticamente do anticorpo pode ser determinada por uma pessoa com habilidade na técnica e pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade efetiva terapeuticamente é também uma em que efeitos tóxicos ou detrimentais, se houver, do anticorpo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade efetiva profilaticamente” se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, desde que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou numa fase precoce da doença, a quantidade efetiva profilaticamente será menos que a quantidade efetiva terapeuticamente.

[00195] Regimes de dosagens podem ser ajustados para fornecer a ótima resposta desejada (por exemplo, uma resposta profilática ou terapêutica). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado através das exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. Forma unitária de dosagem conforme aqui usada se refere a unidades discretas fisicamente adequadas como dosagens unitárias para indivíduos mamíferos para serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o requerido veículo farmacêutico. A especificação para as formas unitárias de dosagem são ditadas por e diretamente dependentes (a) das características únicas do composto ativo e do particular efeito profilático ou terapêutico para ser atingido, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[00196] Uma exemplar faixa não limitativa para uma quantidade efetiva profilaticamente ou terapeuticamente do anticorpo é uma dose de entre 0,1 e 200 mg/kg, por exemplo, entre 0,1 e 10 mg/kg. A quantidade efetiva profilaticamente ou terapeuticamente do anticorpo pode ser entre 1 e 200 mg/kg, 10 e 200 mg/kg, 20 e 200 mg/kg, 50 e 200 mg/kg, 75 e 200 mg/kg, 100 e 200 mg/kg, 150 e 200 mg/kg, 50 e 100 mg/kg, 5 e 10 mg/kg, ou 1 e 10 mg/kg. É para ser notado que valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição para ser avaliada. Além disso, a dose de anticorpo pode ser determinada por uma pessoa habilitada na técnica e pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo para induzir uma resposta desejada no indivíduo. A dose é também uma em que efeitos tóxicos ou detrimentais, se houver, do anticorpo são compensados por efeitos terapeuticamente benéficos. É para ser além disso entendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específica devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições, e aquelas faixas de dosagem aqui estabelecidas são exemplarmente apenas e não estão pretendidas a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. 4. Método de Tratamento, Prevenção, Modulação ou Atenuação de uma Doença do Metabolismo do Ferro

[00197] Em qualquer indivíduo, uma avaliação pode ser feita para saber se o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao metabolismo do ferro usando técnicas de rotina conhecidas na técnica (por exemplo, tal avaliação pode incluir um ou mais testes de sangue para determinar o nível de hemoglobina, contagem de glóbulos vermelhos, contagem de reticulócitos, ferritina sérica, ferro sérico, transferrina sérica saturada, hepcidina sérica, RGMc sérica, etc.). A avaliação pode ser feita para saber se o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro ou sobrecarga de ferro e, deste modo, pode indicar um curso adequado de terapia, tal como terapia preventiva, terapia de manutenção, ou terapia modulatória. Como uma referência, um hematologista pode usar os seguintes números de referência para indicar que o paciente possui níveis normais dos parâmetros correspondentes. Veja a Tabela 2. Tabela 3

[00198] Conformemente, fornecido aqui é um método de tratamento, prevenção, modulação ou de atenuar uma doença do metabolismo do ferro. O anticorpo pode ser administrado em um indivíduo em necessidade do mesmo. O anticorpo pode ser administrado em um indivíduo em uma quantidade efetiva terapeuticamente, em que a dita quantidade pode ser prontamente determinada por alguém habilitado na técnica. O método de tratamento, prevenção, modulação ou de atenuação da doença pode modular para cima ou para baixo o nível de proteína da hepcidina em uma célula ou tecido conforme comparado ao nível de hepcidina em um controle normal ou um calibrador. O método de tratamento, prevenção, modulação ou de atenuação da doença pode atenuar o nível de proteína de hepcidina, uma célula ou tecido conforme comparado a um nível de hepcidina em um controle normal ou um calibrador.

a. Doença do Metabolismo do Ferro

[00199] A doença ou distúrbio do metabolismo do ferro pode ser qualquer doença ou distúrbio em que a homeostase do ferro é perturbada em um indivíduo. Essa homeostase conta com a regulamentação apropriada dos níveis de ferro plasmáticos adequados. O ferro circula em plasma ligado a transferrina, o qual é um veículo para a entrega de ferro dentro das células. A transferrina de plasma é normalmente cerca de 30% saturada com ferro. Conformemente, a saturação de transferrina deve ser mantida a níveis fisiológicos apropriados em resposta a uma variedade de sinais de vias envolvidas no consumo de ferro.

[00200] A hepcidina coordena fluxos de ferro sistêmicos e controla os níveis de ferro plasmático através da ligação à ferroportina e induzindo a sua degradação. Devido a ferroportina ser degradada, macrófagos e enterócitos duodenais não são mais capazes de liberar ferro no sangue e, como uma consequência, a transferência de ferro à transferrina é reduzida. Conformemente, doenças hereditárias e adquiridas que perturbam a produção normal de hepcidina pode causar deficiência de ferro (altos níveis de hepcidina) ou sobrecarga de ferro (deficiência de hepcidina).

[00201] Essa perturbação pode resultar em uma deficiência de ferro, uma sobrecarga de ferro, ou uma sobrecarga de ferro com anemia. Essa perturbação pode também resultar em anemia de doença crônica, em que um indivíduo com a doença exibe altos níveis de hepcidina de sangue. O indivíduo pode possuir, ou estar em risco de, uma doença ou um distúrbio tais como fadiga, dor nas articulações, doenças ósseas ou de articulações (osteoartrite, osteoporose), artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, falta de ar, batimento cardíaco irregular, problemas de fígado, diabetes, infertilidade, impotência, depressão, distúrbios mentais ou de humor, habilidades cognitivas pobres ou doenças neurodegenerativas, ACD, A anemia ferropriva refratária ao ferro, anemia de doença renal crônica, resistência aos agentes estimuladores da eritropoiese, anemia aplástica, síndromes mielodisplásicas, anemia sideroblástica, anemias hipoplásicas, hemoglobinúria paroxística noturna, doença de von Willebrand, hemofilia telangiectasia hemorrágica hereditária, enzimopatias de glóbulos vermelhos: glucose- 6-fosfato-desidrogenase (G6PD) ou deficiência de piruvato quinase (PKD), atransferrinemia ou hipotransferrinemia, aceruloplasminemia ou hipoceruloplasmina, CDAII (anemia diseritropoiética congênita), que é também chamada: HEMPAS (multinuclearidade eritropoética hereditária com este de lise soro acidificado positivo).

[00202] A supressão de hepcidina no fígado, juntamente com o aumento da expressão de ferroportina e ferro intracelular reduzido e estresse oxidativo no interior dos macrófagos peritoniais, são associados com a expressão aumentada das proteínas de efluxo de colesterol de macrófagos ABCA1 e ABCG1, as quais são transportadores ABC. Veja Saeed et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 32 (February, 2012), Accepted on November 5, 2011. A supressão de hepcidina aumenta a expressão de ABCA1 e ABCG1, a qual pode resultar em aumento do efluxo de lipídeos e reduzida formação de células de espuma. Conformemente, o anticorpo pode ser administrado em um indivíduo em necessidade do mesmo. O anticorpo pode ser administrado em um indivíduo em uma quantidade efetiva terapeuticamente, em que a formação de células de espuma e aterosclerose podem ser limitadas e/ ou aterosclerose pode ser tratada, prevenida, modulada ou atenuada. O anticorpo pode reduzir a liderança de ferro intracelular macrófago para aumentar a expressão de transportadores ABC e a capacidade de efluxo de lipídeos.

[00203] A atividade cíclica de folículos pilosos pode ser regulada por moléculas de sinalização normalmente expressas no macro ambiente dérmico. Veja, por exemplo, a U.S. Patent Application No. 2011/0293526, o conteúdo da qual está aqui incorporado em sua totalidade. Por exemplo, a expressão de BMP pode ser negativamente correlacionada com o crescimento de pelos. O anticorpo pode ser usado para estimular folículos pilosos em repouso para ter reativado o crescimento novamente. O anticorpo pode romper, diretamente ou indiretamente, a sinalização de moléculas normalmente expressas no macro ambiente dérmico.

(1) Deficiência de ferro

[00204] A doença do metabolismo do ferro pode ser uma na qual há demasiado pouco ferro no corpo. Por exemplo, um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se o ferro sérico é encontrado abaixo de 60 µg/dl, abaixo de 55 µg/dl, abaixo de 50 µg/dl, abaixo de 45 µg/dl, ou abaixo de 40 µg/dl. Um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se a capacidade de ligação ao ferro total (“TIBC”) dele/ dela é mais baixa que 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, ou 10%. Um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se ele/ ela possui níveis aumentados de ferritina conforme comparado a um indivíduo que não possui uma deficiência de ferro. Um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se ele/ ela possui um nível de hemoglobina mais baixa que 15,5, 15, 14,5, 14, 13,5, 13, 12,5, 12, 11,5, 11, 10,5, 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, ou 6 g/dl. Uma saturação de transferrina de menos de 25%, menos de 20%, menos de 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, ou 7% pode ser indicativo de deficiência de ferro. Um indivíduo pode ser diagnosticado como tendo uma deficiência de ferro baseado em um ou mais fatores conforme definidos acima.

[00205] Deficiência de ferro em momentos críticos de crescimento e desenvolvimento podem resultar em nascimentos prematuros, bebês de baixo peso ao nascer, crescimento e desenvolvimento atrasado, e movimento e atividade infantil normal atrasada; a deficiência de ferro pode resultar em memória fraca ou habilidades cognitivas pobres (função mental) resultando em desempenho pobre na escola, trabalho, forças armadas ou na recreação. Baixos QIs tem sido ligados à deficiência de ferro ocorridas durante períodos críticos de crescimento.

[00206] A Anemia por Deficiência de Ferro (“IDA”) é uma condição onde um indivíduo possui quantidades inadequadas de ferro para atender às demandas do corpo. IDA resulta a partir de um decréscimo na quantidade de células no sangue, que se relaciona ao indivíduo possuindo demasiado pouco ferro. IDA pode ser causada por uma dieta insuficiente em ferro ou a partir da perda de sangue. IDA é a forma mais comum de anemia. Cerca de 20% das mulheres, 50% de mulheres grávidas, e 3% dos homens são deficientes em ferro.

[00207] A anemia ferropriva refratária ao ferro (“IRIDA”) atingiu indivíduos sofrendo de anemia microcítica e não respondem à terapia oral e são parcialmente refratários ao ferro parenteral, devido a níveis de hepcidina inapropriadamente altos. IRIDA é causada pela mutação no gene matriptase-2 (TMPRSS6), o qual codifica uma protease de serina que negativamente regula expressão de hepcidina ao clivar uma RGMc ligada à membrana.

(2) Sobrecarga de ferro

[00208] Exemplos de distúrbios associados com a sobrecarga de ferro incluem: fadiga crônica, dor nas articulações, dor abdominal, doença hepática (cirrose, câncer de fígado), diabetes melito, ritmo cardíaco irregular, ataque cardíaco, ou insuficiência cardíaca, mudanças na cor da pele (bronze, verde cinzento), perda de tempo, perda de interesse em sexo, osteoartrite, osteoporose, perda de cabelo, aumento do fígado ou baço, impotência, infertilidade, hipogonadismo, hipotireoidismo, hipopituitarismo, depressão, problemas de função suprarrenais, doença neurodegenerativa de início precoce, açúcar elevado no sangue, elevação das enzimas hepáticas e ferro elevado (ferro sérico, ferritina sérica). Por exemplo, um indivíduo pode ser diagnosticado com uma sobrecarga de ferro se o ferro sérico é encontrado sendo acima de 150 µg/dl, acima de 155 µg/dl, acima de 160 µg/dl, acima de 165 µg/dl, ou acima de 170 µg/dl. Um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se a capacidade de ligação ao ferro total (“TIBC”) dele/ dela sendo maior que 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80%. Um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se ele/ ela teve aumentado os níveis de ferritina conforme comparado a um indivíduo que não possui uma deficiência de ferro. Um indivíduo pode ser diagnosticado com uma deficiência de ferro se ele/ ela possui um nível de hemoglobina maior que 18,5, 18, 17,5, 17, 16,5, 16, 15,5, 15, 14,5, 14, 13,5, 13, 12,5 ou 12 g/dl. Uma saturação de transferrina maior do que 35%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, ou 70% pode ser indicativa de uma sobrecarga de ferro. Um indivíduo pode ser diagnosticado como possuindo uma sobrecarga de ferro baseado em um ou mais fatores conforme definidos acima.

[00209] Hemocromatose (HH) é outro distúrbio que resulta a partir de quantidades excessivas de ferro no corpo (sobrecarga de ferro). Hemocromatose hereditária (genética) (HHC) uma doença hereditária do metabolismo do ferro anormal. Indivíduos com HHC absorvem demasiado ferro na dieta. Uma vez absorvido, o corpo não possui uma maneira eficiente de excretar excessos de ferro. Ao longo do tempo, esses excessos constroem uma condição de sobrecarga de ferro, o qual é um tóxico para as células. Glândulas e órgãos, incluindo o fígado, coração, pituitário, tireoide, pâncreas, sinóvia (articulações) e medula óssea sobrecarregados com excesso de ferro não podem funcionar adequadamente. Sintomas se desenvolvem e doenças progridem.

[00210] Há diversos tipos de HHC. Esses incluem: Tipo I ou Clássica )HHC); Tipo II a, b, ou juvenil (JHC); Tipo III ou Mutação de Receptor de Transferrina; e Tipo IV ou Mutação de Ferroportina.

[00211] HHC é uma doença autossômica recessiva que pode levar à sobrecarga de ferro do fígado e de outros órgãos. Quatro genes têm sido implicados na hemocromatose: o HFE (C282Y), TfR2, hemojuvelina (HJV), e genes HAMP (hepcidina). As formas recessivas da doença são um resultado de inadequadamente baixa expressão da hepcidina, por meio de que a severidade da doença e a idade de início pode se correlacionar com o grau de expressão de hepcidina.

[00212] Uma forma dominante de hemocromatose hereditária é causada através de mutações de sentido trocado no exportador de ferro celular, e receptor de hepcidina, ferroportina. Por exemplo, mutações que reduzem a localização da membrana da ferroportina ou sua habilidade em exportar ferro resultam em sobrecarga de ferro dos macrófagos ou retenção, normais para níveis baixos de ferro do plasma, e em alguns casos eritropoiese em ferro restrito.

[00213] Distúrbios relacionados à hemocromatose, em que há alta acumulação de ferro de plasma e ferro hepatócito pode ser causado por mutações de ferroportina resistentes à hepcidina, por meio de que a hepcidina falha em ligar ferroportina (C326) ou a internalização e degradação da ferroportina seguindo a ligação de hepcidina é prejudicada.

[00214] Níveis de hepcidina podem também ser inapropriadamente baixos em “anemia carregadoras de ferro”, por meio de que sinais eritropoiéticos suprimem a transcrição de hepcidina mesmo quando o ferro sistêmico é alto. A talassemia ß intermédia é um exemplo de tal anemia e é caracterizada pelas sobrecargas de ferro independentes de transfusão e baixa ausência de níveis de hepcidina.

(3) Sobrecarga de Ferro com Anemia

[00215] Sobrecarga de ferro com anemia (IOA), também chamada de aceruloplasminemia, é um distúrbio recessivo e pode ser caracterizado pela anemia, sobrecarga de ferro, e neurodegeneração. O distúrbio é causado por mutações no gene que codifica para a ceruloplasmina ferroxidase contendo cobre. Pacientes sofrendo de aceruloplasminemia possuem níveis mais baixos de hepcidina sérica e uma expressão de ferroportina decrescida no fígado, devido à falta de uma função de um estabilizante da ceruloplasmina mutante na ferroportina.

[00216] Sobrecarga de ferro é considerada como a principal causa de mortalidade e morbidez em anemias com eritropoiese ineficaz (por exemplo, talassemias ß, e anemias congênitas diseritropoiéticas). Nesses distúrbios, altos níveis de eritropoietina estimulam uma extensiva porém ineficaz eritropoiese. Sobrecarga de ferro severa assemelhando-se a hemocromatose juvenil pode desenvolver em um indivíduo que raramente ou nunca recebeu uma transfusão de sangue e indica que ferro na dieta é hiperabsorvido sob essas condições. Aqueles pacientes que não receberam transfusões geralmente têm baixos níveis de hepcidina, apesar dos altos níveis de ferritina sérica e alta sobrecarga de ferro no fígado. Pode ser assumido que a ineficaz eritropoiese produz mediadores como GDF-15, o qual pode suprimir a síntese de hepcidina hepática. Veja Ganz, T., Blood, 117:4425-33, 2011, Hepcidin and Iron Regulation: 10 Years Later.

[00217] IOA é frequentemente causada por circunstâncias pelo meio de que indivíduos possuem ferro no organismo muito elevado, o qual pode ser devido a totais transfusões de sangue ou distúrbios de células de sangue que causam anemia hemolítica crônica (a rotatividade prematura, ou falha, de células vermelhas do sangue). Esse processo pode causar acumulações de ferro no corpo similar a aquelas encontradas em pacientes de hemocromatose. Várias circunstâncias (incluindo alto consumo de dieta) podem causar excedentes de ferro para construir rapidamente. Os níveis de eritropoietina, hepcidina, e/ ou fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF-15) podem ser usados para distinguir indivíduos que possuem IOA. Na talassemia ß, por exemplo, indivíduos possuem níveis de GDF-15 dramaticamente elevados. Um indivíduo que possui talassemia ß pode possuir superior a 45.000 pg/ml de GDF-15, superior a 50.000 pg/ml de GDF-15, superior a 55.000 pg/ml de GDF-15, superior a 60.000 pg/ml de GDF-15, superior a 65.000 pg/ml de GDF-15, superior a 66.000 pg/ml de GDF-15, ou superior a 70.000 pg/ml de GDF-15. Por exemplo, indivíduos com talassemia ß podem possuir níveis médios de GDF-15 a ou próximo de 66.000 +/- 9.600 pg/ml conforme comparado a níveis a ou próximo de 450 +/- 50 pg/ml em indivíduos saudáveis. As células vermelhas do sangue na hemoglobina podem ser demasiadas poucas para sustentar vida e totais transfusões podem ser necessárias para o indivíduo para sobreviver. Exemplos de distúrbios associados com sobrecarga de ferro com anemia incluem anemia falciforme, talassemia, anemia sideroblástica, e deficiência de enzima.

b. Indivíduo

[00218] O indivíduo pode ser um mamífero, o qual pode ser um humano ou um não humano. O indivíduo pode ser um paciente de cuidados intensivos, submetido a quimioterapia, recuperado de cirurgia, ou estar em risco de, ou possuir, uma infecção, câncer, um distúrbio ou doença autoimune, doença orgânica crônica e/ ou inflamação, e/ ou rejeição crônica de um órgão após transplante de órgão sólido. A infecção pode ser aguda ou crônica, tal como um tumor sólido ou hematológico. A doença autoimune pode ser qualquer uma doença autoimune, tal como artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico e doenças do tecido conectivo, vasculite, sarcoidose, e doença inflamatória do intestino. A doença crônica do órgão pode ser uma doença renal crônica, na qual o indivíduo pode ou pode não estar submetido à diálise. A infecção viral pode ser infecção de hepatite B ou C, infecção do vírus da imunodeficiência humana. Quaisquer uma das doenças ou distúrbios podem ser uma causa subjacente de ACD. A cirurgia pode ser perioperatória ou pós-operatório. A cirurgia pode ser uma cirurgia oncológica.

5. Método de Diagnóstico

[00219] Aqui fornecido é um método para determinar se um indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. O nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel pode ser medido em uma amostra de um indivíduo e comparada a um nível de RGMc em uma amostra de controle ou um calibrador, tal como uma série de calibradores. A amostra de controle pode ser a partir de um tecido normal ou um tecido corporal (tais como a partir de sangue inteiro, soro, plasma, etc.). Um nível alterado de RGMc conforme comparado ao controle pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. Por exemplo, um nível diminuído de RGMc associada à membrana conforme comparado ao nível de RGMc associado à membrana em um controle normal pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. Alternativamente, um nível aumentado de RGMc associada à membrana, conforme comparado ao nível de RGMc associado à membrana em um controle normal, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. Além disso, um nível aumentado de RGMc solúvel, ou um fragmento solúvel da mesma, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. Um nível diminuído de RGMc solúvel, ou um fragmento solúvel da mesma, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. O nível de RGMc (associada à membrana ou solúvel) pode ser medida usando os anticorpos aqui descritos.

[00220] Os métodos para determinar se um indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro pode também envolver medir o nível de hepcidina em adição à medição do nível de RGMc associada à membrana ou RGMc solúvel em um ou mais amostras obtidas a partir de um indivíduo. Especificamente, em um aspecto, o nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel em uma amostra a partir de um indivíduo pode ser medida e comparada a um nível de RGMc em uma amostra de controle ou um calibrador, tal como uma série de calibradores. A amostra de controle para a RGMc associada à membrana ou RGMc solúvel pode ser a partir de um tecido normal ou um fluido corporal (tais como a partir de sangue inteiro, soro, plasma, etc.). O método pode também envolver a medição do nível de hepcidina na mesma amostra e comparando ao nível de hepcidina em uma amostra de controle ou um calibrador, tal como uma série de calibradores. A amostra de controle para a hepcidina pode ser a partir de um tecido normal ou um fluido corporal (tais como a partir de sangue inteiro, soro, plasma, etc.). Um nível de RGMc alterado como comparado ao nível de RGMc em um controle pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. Por exemplo, um nível diminuído de RGMc associada à membrana conforme comparado à membrana associada à RGMc em um controle normal pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. Alternativamente, um nível aumentado de RGMc associado à membrana, conforme comparado ao nível de RGMc associado à membrana em um controle normal, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. Além disso, um nível aumentado de RGMc solúvel, ou um fragmento solúvel da mesma, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. Um nível diminuído de RGMc solúvel, ou um fragmento solúvel da mesma, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. O nível de RGMc pode ser medido usando os anticorpos aqui descritos. Um nível alterado de hepcidina conforme comparado ao nível de hepcidina em um controle normal pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro. Por exemplo, um nível decrescido de hepcidina conforme comparado ao nível de hepcidina em um controle normal pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à sobrecarga de ferro. Alternativamente, um nível aumentado de hepcidina, conforme comparado ao nível de hepcidina em um controle normal, pode indicar que o indivíduo possui um distúrbio relacionado ao ferro relacionado à deficiência de ferro. A ordem em que o nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel e a hepcidina são medidos não é crítico. Eles podem ser medidos simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em adendo, o nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel e a hepcidina podem ser medidos no mesmo recipiente de reação ou em diferentes vasos de reação. Em outro aspecto, o nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel e a hepcidina não foram determinados na mesma amostra a partir de um indivíduo. Por exemplo, o nível de RGMc associado à membrana ou RGMc solúvel pode ser determinada em uma primeira amostra obtida a partir de um indivíduo. O nível de hepcidina pode ser determinado em uma segunda amostra obtida em um indivíduo. Alternativamente, o nível de hepcidina pode ser determinado em uma primeira amostra obtida a partir de um indivíduo e o nível de RGMc associada à membrana ou RGMc solúvel podem ser determinadas em uma segunda amostra obtida a partir de um indivíduo. A primeira e segunda amostra obtida a partir do paciente podem ser obtidas ao mesmo tempo ou em diferentes períodos de tempo uma da outra. O nível de RGMc (associada à membrana ou solúvel) pode ser medida usando os anticorpos aqui descritos.

[00221] O método pode além disso compreende analisar uma amostra de teste para a presença, quantidade ou concentração de hepcidina, em que ou (i) a amostra de teste analisada para hepcidina pode ser a mesma amostra de teste analisada para RGMc ou (ii) a amostra de teste analisada para hepcidina é uma amostra de teste diferente da amostra de teste analisada para RGMc mas a fonte da amostra de teste analisada para hepcidina e a fonte da amostra de teste analisada para RGMc são as mesmas. A amostra de teste é, ou as amostras de teste são, analisadas para RGMc e hepcidina simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem usando o mesmo tipo de metodologia ou diferentes tipos de metodologias conforme aqui descritos e conhecidos na técnica. Alternativamente, o método pode além disso compreender o uso dos resultados de uma análise de uma amostra de teste para a presença, quantidade ou concentração de hepcidina, em que ou (i) a amostra de teste analisada para hepcidina é a mesma amostra de teste analisada para RGMc ou (ii) a amostra de teste analisada para hepcidina é uma amostra de teste diferente da amostra de teste analisada para RGMc mas a fonte da amostra de teste analisada para hepcidina e a fonte da amostra de teste analisada para RGMc é a mesma. A este respeito, a análise de uma amostra teste para hepcidina, os resultados dos quais são usados no contexto do método acima, pode ser desempenhado em um ponto diferente no tempo, ou antes ou depois, a partir do tempo da análise de uma amostra de teste para RGMc, tais como horas (por exemplo, 12 horas), um dia, dois dias, três dias, uma semana, duas semanas, três semanas, ou mesmo um mês, desde que os resultados continuem a ser considerados representativos e confiáveis. Pode ser preferido que a análise de uma amostra de teste para hepcidina habilite a determinação da presença, quantidade ou concentração de hepcidina 25. Uma amostra, tal como uma amostra de plasma, uma amostra de soro, ou uma amostra de urina, podem ser analisadas para hepcidina 25 usando TOF-MS e um padrão interno, por exemplo.

[00222] O nível de hepcidina pode ser medido usando anticorpos de hepcidina conhecidos na técnica, tais como aqueles disponíveis a partir da ABCAM® (Cambridge, Massachusets, EUA) e BACHEM® (Torrance, Califórnia, EUA), tais como os anticorpos de Hepcidina 25. O nível de hepcidina em uma amostra pode ser determinado usando os vários formatos aqui descritos (tal como um imunoensaio).

[00223] O nível de hepcidina e o nível de RGMc determinado por qualquer um dos métodos aqui descritos, pode ser comparado para indicar a presença de um distúrbio relacionado ao ferro. Por exemplo, uma razão de RGMc membrana à associada para hepcidina em uma amostra de teste que é diferente de uma razão de RGMc associada à membrana para hepcidina em um controle normal, pode indicar que o indivíduo a partir do qual a amostra de teste é derivada possui um distúrbio relacionado ao ferro. Por exemplo, uma razão aumentada de RGMc solúvel para hepcidina em uma amostra de teste, conforme comparada à razão da RGMc solúvel para hepcidina em um controle normal, pode indicar que o indivíduo do qual a amostra de teste é derivada possui um distúrbio relacionado ao ferro, tal como uma sobrecarga de ferro. Uma razão decrescente de RGMc associada à membrana para hepcidina em uma amostra de teste, conforme comparado à razão de RGMc solúvel para hepcidina em um controle normal, pode indicar que o indivíduo do qual a amostra de teste é derivada possui um distúrbio relacionado ao ferro, tal como uma deficiência de ferro.

a. Amostra

[00224] A amostra pode ser qualquer amostra de tecido a partir de um indivíduo. A amostra pode compreender proteína a partir do indivíduo.

[00225] Qualquer tipo de célula, tecido ou fluído corporal pode ser utilizado para obter uma amostra. Tais tipos de células, tecidos, e fluídos podem incluir seções de tecidos tais como amostras de autópsia e biópsia, seções congeladas retiradas por propósitos histológicos, sangue (tal como sangue total), plasma, escarro sérico, fezes, lágrimas, muco, saliva, cabelo, e pele. Tipos de células e tecidos podem também incluir fluido linfático, fluido ascético, fluido ginecológico, urina, soro, plasma, fluido peritoneal, um líquido coletado através de enxágue vaginal, ou um fluído coletado a partir de lavagem vaginal. Um tecido ou tipo de célula pode ser fornecido ao remover uma amostra de células a partir de um animal, mas também pode ser realizado ao usar células previamente isoladas (por exemplo, isoladas por outra pessoa, em outro momento, e/ ou por outro propósito). Tecidos arquivísticos, tais como aqueles possuindo histórico de resultado ou tratamento, podem também ser usados. Purificação de proteína pode não ser necessária.

[00226] Métodos bem conhecidos na técnica para coletar, manusear ou processar urina, sangue, soro e plasma, e outros fluídos corporais, são usados na prática da presente descoberta, por exemplo, quando os anticorpos aqui fornecidos são empregados como reagentes imunodiagnósticos, e/ ou em um kit de imunoensaio de RGMc. A amostra de teste pode compreender além disso as porções em adição ao analito de RGMc de interesse, tais como anticorpos, antígenos, haptenos, hormônios, medicamentos, enzimas, receptores, proteínas, peptídeos, polipeptídeos, oligonucleótidos ou polinucleótidos. Por exemplo, a amostra pode ser uma amostra de sangue total a partir de um indivíduo. Pode ser necessário ou desejável que a amostra de teste, particularmente sangue total, seja tratada antes do imunoensaio conforme aqui descrito, por exemplo, com um reagente pré tratamento. Mesmo em casos onde o pré tratamento não é necessário (por exemplo, a maioria das amostras de urina), o pré tratamento opcionalmente pode ser feito por mera conveniência (por exemplo, como parte de um regime em uma plataforma comercial). A amostra pode ser usada diretamente conforme obtida a partir do indivíduo ou seguindo o pré tratamento para modificar a característica da amostra. O pré tratamento pode incluir extração, concentração, inativação de componentes interferentes, e/ou a adição de reagentes.

[00227] O reagente de pré tratamento pode ser qualquer reagente apropriado para uso com o ensaio, por exemplo, imunoensaio, e o kit aqui descrito. O pré tratamento opcionalmente compreende: (a) um ou mais solventes (por exemplo, metanol e etilenoglicol) e sal, (b) um ou mais solventes, sal e detergente, (c) detergente, ou (d) detergente e sal. Reagentes pré tratamento são conhecidos na técnica, e tal pré tratamento pode ser empregado, por exemplo, conforme usado para analisar em analisadores Abbott TDx, AxSYM®, e ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, EUA), conforme descrito na literatura (veja, por exemplo, Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), e Wallemacq et al., Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)), e/ ou conforme comercialmente disponível. Adicionalmente, o pré tratamento pode ser feito conforme descrito em Abbott's U.S. Pat. No. 5.135.875, European Pat. Pub. No. 0 471 293, e U.S. Pat. App. Pub. No. 2008/0020401 (incorporadas por referência em sua totalidade por seus ensinamentos a respeito de pré tratamento). O reagente de pré tratamento pode ser um agente heterogêneo ou um agente homogêneo.

[00228] Com o uso de um reagente de pré tratamento heterogêneo, o reagente de pré tratamento precipita a proteína de ligação analito (por exemplo, proteína que pode se ligar à RGMc (RGMc associada à membrana ou RGMc solúvel) ou um fragmento da mesma) presente na amostra. Tal etapa de pré-tratamento compreende remover qualquer proteína de ligação analito ao separar a partir da proteína de ligação analito precipitada o sobrenadante da mistura formada através da adição do agente de pré tratamento para a amostra. Em tal ensaio, o sobrenadante da mistura na ausência de qualquer proteína de ligação é usado no ensaio, prosseguindo diretamente para a etapa de captura de anticorpos.

[00229] Com o uso de um reagente de pré tratamento homogêneo não há tal etapa de separação. Toda a mistura da amostra de teste e o reagente pré tratamento são contatadas com um parceiro de ligação específico marcado para RGMc (RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associado à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), tais como um anticorpo monoclonal anti-RGMc marcado (ou um fragmento reativo antigenicamente do mesmo). O reagente de pré tratamento empregado para tal ensaio tipicamente é diluído na mistura de amostra de teste pré tratada, ou antes ou durante a captura pelo primeiro parceiro de ligação específico. Apesar de tal diluição, uma certa quantidade do reagente de pré tratamento (por exemplo, 5 M metanol e/ ou 0,6 M etilenoglicol) ainda está presente (ou permanece) na mistura de amostra de teste durante a captura.

b. Detecção de RGMc

[00230] A presença ou quantidade de RGMc (RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) presente em uma amostra de corpo pode ser prontamente determinada usando qualquer ensaio adequado conforme é conhecido na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, imunoensaio, tal como imunoensaio sanduíche (por exemplo, imunoensaios sanduíche monoclonal-policlonal, incluindo detecção de radioisótopo (radioimunoensaio (RIA)) e detecção de enzima (imunoensaio de enzima (EIA) ou ensaio de imunossorvente ligado à enzima (ELISA) (por exemplo, ensaios Quantikine ELISA, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EUA)), imunoensaio de inibição competitiva (por exemplo, frente e reverso), imunoensaio por fluorescência polarizada (FPIA), técnica de imunoensaio enzimático de multiplicação (EMIT), transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET), e ensaio quimioluminescente homogêneo, etc. Em um imunoensaio baseado em SELDI, um reagente de captura que especificamente liga a RGMc (ou um fragmento da mesma) de interesse é anexado à superfície de uma sonda de espectrometria de massa, tal como uma matriz de chips de proteína pré-activada. A RGMc (RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) é então especificamente capturada no biochip, e a RGMc capturada (RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) é detectada através de espectrometria de massa. Alternativamente, a RGMc (RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) pode ser eluída do reagente de captura e detectada através do tradicional MALDI (Ionização e dessorção a laser assistida por matriz) ou através de SELDI. Um imunoensaio quimioluminescente de micropartículas, em particular um empregando o analisador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, EUA), é um exemplo de um imunoensaio preferido. Outros métodos incluem, por exemplo, espectrometria de massa e imunohistoquímica (por exemplo, com seções de biópsias de tecidos) usando os anticorpos aqui descritos (monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado, humano, etc) ou fragmentos dos mesmos contra RGMc. Anticorpos anti-RGMc e fragmentos dos mesmos podem ser produzidos conforme descrito acima. Outros métodos de detecção incluem aqueles descritos nas, por exemplo, U.S. Patent Nos. 6.143.576; 6.113.855; 6.019.944; 5.985.579; 5.947.124; 5.939.272; 5.922.615; 5.885.527; 5.851.776; 5.824.799; 5.679.526; 5.525.524; e 5.480.792, cada um dos quais está aqui incorporado por referência em sua totalidade. (1) IMUNOENSAIO

[00231] RGMc, e/ ou peptídeos ou fragmentos dos mesmos (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), podem ser analisados usando um imunoensaio. A presença ou quantidade de RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) pode ser determinada usando os aqui descritos anticorpos e detectando ligação específica para RGMc. Por exemplo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, pode especificamente ligar a um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO:1, ou um fragmento da mesma. O anticorpo, ou fragmento do mesmo, pode especificamente ligar a um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO:2, ou um fragmento da mesma. Se desejado, um ou mais dos anticorpos aqui descritos podem ser usados em combinação com um ou mais anticorpos policlonais/ monoclonais comercialmente disponíveis. Tais anticorpos estão disponíveis a partir de companhias tais como R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota, EUA) e Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, Pennsylvania, EUA).

[00232] Qualquer imunoensaio pode ser utilizado. O imunoensaio pode ser um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), um ensaio de inibição competitiva, tais como ensaios de inibição competitiva frente e reverso, um ensaio de polarização de fluorescência, ou um ensaio de ligação competitiva, por exemplo. O ELISA pode ser um ELISA sanduíche.

[00233] Um formato heterogêneo pode ser usado. Por exemplo, após a amostra de teste ser obtida a partir de um indivíduo, uma primeira mistura é preparada. A mistura contém a amostra de teste sendo avaliada para RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) e um primeiro parceiro de ligação específico, em que o primeiro parceiro de ligação específico e qualquer RGMc contido na amostra de teste formam um complexo de RGMc parceiro de ligação específico. Preferivelmente, o primeiro parceiro de ligação específico é um anticorpo anti-RGMc ou um fragmento do mesmo. A ordem a qual a amostra de teste e o primeiro parceiro de ligação específico são adicionados para formar a mistura não é crítica. Preferivelmente, o primeiro parceiro de ligação específico é imobilizado em uma fase sólida. A fase sólida usada no imunoensaio (para o primeiro parceiro de ligação específico e, opcionalmente, o segundo parceiro de ligação específico) pode ser qualquer fase sólida conhecida na técnica, tal como, mas não limitado a, uma partícula magnética, um grânulo, um tubo de teste, uma placa de microtitulação, um cuvete, uma membrana, uma molécula de andaimes, uma película, um papel de filtro, um disco e um chip.

[00234] Após a mistura contendo o primeiro complexo de RGMc parceiro de ligação específico estar formado, qualquer RGMc desvinculada é removida do complexo usando qualquer técnica conhecida na arte. Por exemplo, a RGMc desvinculada pode ser removida através de lavagem. Desejavelmente, contudo, o primeiro parceiro de ligação específica em excesso de qualquer RGMc presente na amostra de teste, de tal modo que todas as RGMc que estão presentes na amostra de teste está vinculada pelo primeiro parceiro de ligação específico.

[00235] Após qualquer RGMc desvinculado ser removido, um segundo parceiro de ligação específico é adicionado à mistura para formar um complexo de primeiro parceiro de ligação específico-RGMc-segundo parceiro de ligação específico. O segundo parceiro de ligação específico é preferivelmente um anticorpo anti-RGMc que se liga a um epítopo na RGMc que difere do epítopo na RGMc limite através do primeiro parceiro de ligação específico. Além disso, também preferivelmente, o segundo parceiro de ligação específico é marcado com ou contém um marcador detectável conforme descrito acima.

[00236] O uso de anticorpos imobilizados ou fragmentos do mesmo podem ser incorporados dentro do imunoensaio. Os anticorpos podem ser imobilizados sobre uma variedade de suportes, tais como partículas de matriz cromatográficas ou magnéticas, a superfície de uma placa de ensaio (tal como poços de microtitulação), pedaços de um material substrato sólido, e os similares. Uma tira de teste pode ser preparada ao revestir o anticorpo ou pluralidade de anticorpos em uma matriz sobre um suporte sólido. Esta faixa pode então ser mergulhada na amostra de teste biológico e então processada rapidamente através de etapas de detecção e lavagem para gerar um sinal mensurável, tal como uma mancha colorida.

(a) ELISA SANDUÍCHE

[00237] O ELISA sanduíche mede a quantidade de antígeno entre duas camadas de anticorpos (por exemplo, um anticorpo capturado (por exemplo, ao menos um anticorpo capturado) e um anticorpo de detecção (por exemplo, ao menos um anticorpo de detecção). O anticorpo de captura e o anticorpo de detecção se ligam a diferentes epítopos no antígeno, por exemplo, a RGMc. Desejavelmente, a ligação do anticorpo de captura a um epítopo não interfere com a ligação do anticorpo de detecção de um epítopo. Ou anticorpos policlonais ou monoclonais podem ser usados como os anticorpos de detecção e de captura no ELISA sanduíche.

[00238] Geralmente, ao menos dois anticorpos são empregados para separar e quantificar a RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) em uma amostra de teste. Mais especificamente, os ao menos dois anticorpos se ligam a certos epítopos de RGMc ou um fragmento de RGMc formando um complexo imune o qual se é referido como um “sanduíche”. Um ou mais anticorpos podem ser usados para capturar a RGMc (tal como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) na amostra de teste (esses anticorpos são frequentemente referidos como um anticorpo de “captura” ou anticorpos de “captura” e um ou mais anticorpos são usados para ligar um marcador detectável (nomeadamente, quantificável) ao sanduíche (esses anticorpos são frequentemente referidos como o anticorpo de “detecção” ou anticorpos de “detecção”. Em um ensaio sanduíche, a ligação de um anticorpo ao seu epítopo desejavelmente não é diminuída pela ligação de qualquer outro anticorpo no ensaio a seus respectivo epítopo. Em outras palavras, anticorpos são selecionados de modo que o um ou mais primeiros anticorpos colocados em contato com uma amostra de teste suspeita de conter RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) não se ligam a todo ou parte de um epítopo reconhecido pelo segundo ou subsequentes anticorpos, interferindo assim com a habilidade de um ou mais segundos anticorpos de detecção para ligar à RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associadas à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma).

[00239] Os anticorpos podem ser usados com um primeiro anticorpo no dito imunoensaio. Preferivelmente, o anticorpo imunoespecificamente se liga a um epítopo compreendendo ao menos 3 aminoácidos contíguos (3) da SEQ ID NO:2 com um KD de partir de 4,2x10-11 M a 7,4x10-13 M. O imunoensaio pode compreender um segundo anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo compreendendo ao menos três aminoácidos contíguos (3) da SEQ ID NO:2, em que os aminoácidos contíguos (3) ao qual o segundo anticorpo se liga é diferente dos três aminoácidos contíguos (3) para o qual o primeiro anticorpo se liga.

[00240] Em uma modalidade preferida, uma amostra de teste suspeita de conter RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) podem ser contatados com ao menos um anticorpo de captura (ou anticorpos) e ao menos um anticorpo de detecção ou simultaneamente ou sequencialmente. No formato de ensaio sanduíche, uma amostra de teste suspeita de contem RGMc (RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) é primeiro colocada em contato com o ao menos um anticorpo de captura que especificamente se liga a um epítopo particular sob condições as quais permitem a formação de um complexo de RGMc - anticorpo. Se mais do que um anticorpo de captura é usada, um complexo de múltiplos anticorpos de captura-RGMc é formado. Em um ensaio sanduíche, os anticorpos, preferivelmente, o ao menos um anticorpo de captura, são usados em quantidades molares em excesso da quantidade máxima de RGMc ou o fragmento de RGMc esperado na amostra de teste. Por exemplo, a partir de aproximadamente 5µg/mL a aproximadamente 1 mg/mL de anticorpo por mL de tampão de revestimento de micropartícula pode ser usado.

[00241] Opcionalmente, antes de contatar a amostra de teste com o ao menos um primeiro anticorpo de captura, o ao menos um anticorpo de captura pode ser vinculado a um suporte sólido o qual facilita a separação do complexo de anticorpo-RGMc a partir da amostra de teste. Qualquer suporte sólido conhecido na técnica pode ser usado, incluindo mas não limitado a, suportes sólidos feitos de materiais poliméricos nas formas de poços, tubos ou contas. O anticorpo (ou anticorpos) podem ser ligados ao suporte sólido por absorção, através de ligação covalente usando um agente de acoplamento químico ou através de outros meios conhecidos na técnica, desde que tal ligação não interfira com a habilidade do anticorpo se liga à RGMc ou ao fragmento de RGMc. Além disso, se necessário, o suporte sólido pode ser derivatizado para permitir reatividade com vários grupos funcionais no anticorpo. Tal derivatização requer o uso de certos agentes de acoplamento tais como, mas não limitados a, anidrido maleico, N-hidroxissuccinimida e etil-3 -(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.

[00242] Após a amostra de teste suspeita de conter RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) ser posta em contato com o ao menos um anticorpo de captura, a amostra de teste é incubada a fim de permitir a formação de um complexo de anticorpo de captura (ou anticorpos de captura)-RGMc. A incubação pode ser realizada a um pH a partir de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 10,0, a uma temperatura a partir de aproximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, e por um período a partir de ao menos aproximadamente um (1) minuto a aproximadamente dezoito (18) horas, a partir de aproximadamente 2-6 minutos, ou a partir de aproximadamente 3-4 minutos.

[00243] Após a formação do complexo de anticorpo (anticorpos) de captura- RGMc, o complexo é então contatado com ao menos um anticorpo de detecção (sob condições que permitem a formação de um complexo de anticorpo (anticorpos) de captura-RGMc-anticorpo (anticorpos) de detecção). Se o complexo de anticorpo de captura-RGMc é contatado com mais do que um anticorpo de detecção, então um complexo de anticorpo (anticorpos) de captura-RGMc-anticorpo (anticorpos) de detecção é formado. Tal como com o anticorpo de captura, quando o ao menos um anticorpo de detecção (e subsequente) é colocado em contato com o complexo de anticorpo de captura-RGMc, um período de incubação sob condições similares a aquelas descritas acima é requerido para a formação do complexo de anticorpo (anticorpos) de captura-RGMc-anticorpo (anticorpos) de detecção. Preferivelmente, ao menos um anticorpo de detecção contém um marcador detectável. O marcador detectável pode ser vinculado ao menos um anticorpo de detecção antes de, simultaneamente com ou após a formação do complexo de anticorpo (anticorpos) de captura-RGMc-anticorpo (anticorpos) de detecção. Qualquer marcador detectável conhecido na técnica pode ser usado conforme aqui discutido e conhecido na técnica.

[00244] Ensaios quimioluminescentes podem ser desempenhados de acordo com os métodos descritos em Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Enquanto qualquer formato de ensaio adequado pode ser usado, um quimioluminômetro de microplaca (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, Tennessee, EUA) habilita o ensaio de múltiplas amostras de pequenos volumes rapidamente. O quimioluminômetro pode ser equipado com múltiplos injetores de reagente usando microplacas de poliestireno pretas de 96 poços (Costar #3792). Cada amostra pode ser adicionada dentro de um poço deparado, seguido por adição simultânea/sequencial de outros reagentes conforme determinado pelo tipo de ensaio empregado. Desejavelmente, a formação de pseudobases em soluções básicas ou neutras empregando um éster de acridinio arilo é evitada, tal como por acidificação. A resposta quimioluminescente é então registrada poço a poço. A este respeito, o tempo para registrar a resposta quimioluminescente irá depender, em parte, na demora entre a adição dos reagentes e o acridinio particular empregado.

[00245] A ordem em que a amostra de teste e o(s) parceiro(s) de ligação específico são adicionados para formar a mistura para ensaio quimioluminescente não é crítico. Se o primeiro parceiro de ligação específico é detectavelmente marcado com um composto de acridinio, forma-se complexos de primeiro parceiro de ligação específico detectavelmente marcado-RGMc. Alternativamente, se um segundo parceiro de ligação específico é usado e o segundo parceiro de ligação específico é detectavelmente marcado com um composto de acridinio, forma-se complexos de primeiro parceiro de ligação específico detectavelmente marcado-RGMc-segundo parceiro de ligação específico. Qualquer parceiro de ligação específico desvinculado, seja marcado ou não marcado, pode ser removido da mistura usando qualquer técnica conhecida na arte, tal como lavagem.

[00246] O peróxido de hidrogênio pode ser gerado in situ na mistura ou providenciado ou fornecido à mistura antes, simultaneamente com, ou após a adição de um composto de acridinio acima descrito. O peróxido de hidrogênio pode ser gerado in situ em um número de formas tais como seriam aparente para qualquer um habilitado na técnica.

[00247] Alternativamente, uma fonte de peróxido de hidrogênio pode ser simplesmente adicionada à mistura. Por exemplo, a fonte do peróxido de hidrogênio pode ser um ou mais tampões ou outras soluções que são conhecidas por conter peróxido de hidrogênio. A este respeito, a solução de peróxido de hidrogênio pode simplesmente ser adicionada.

[00248] Após a adição simultânea ou subsequente de ao menos uma solução básica à amostra, um sinal detectável, nomeadamente, um sinal quimioluminescente, indicativo da presença de RGMc ou um fragmento da mesma é gerado. A solução básica contem ao menos uma base e possui um pH maior que ou igual a 10, preferivelmente, maior que ou igual a 12. Exemplos de soluções básicas incluem, mas não estão limitadas a, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de amônio, hidróxido de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, e bicarbonato de cálcio. A quantidade de solução básica adicionada à amostra depende da concentração da solução básica. Baseado na concentração da solução básica utilizada, qualquer um habilitado na técnica pode facilmente determinar a quantidade de solução básica para adicionar à amostra.

[00249] O sinal quimioluminescente que é gerado pode ser detectado usando técnicas de rotina conhecidos para aqueles com habilidade na técnica. Baseado na intensidade do sinal gerado, a quantidade de RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associadas à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) na amostra pode ser quantificada. Especificamente, a quantidade de RGMc na amostra é proporcional à intensidade do sinal gerado. A quantidade de RGMc presente pode ser quantificada ao comparar a quantidade de luz gerada a uma curva padrão para RGMc ou através de comparação a um padrão de referência. A curva padrão pode ser gerada utilizando diluições em série ou soluções de concentrações conhecidas de RGMc através de espectroscopia de massa, métodos gravimétricos, e outras técnicas conhecidas na arte.

[00250] Em um ensaio de micropartículas quimioluminescente empregando o analisador ARCHITECT® (ou o seu sucessor), o pH conjugado diluente deve ser de aproximadamente 6,0 +/- 0,2, o pH de tampão de revestimento de micropartícula deve ser mantido em temperatura ambiente (por exemplo, a aproximadamente 17 a aproximadamente 27oC, o pH de tampão de revestimento de micropartícula deve ser de aproximadamente 6,5 +/- 0,2, e o pH de micropartículas diluentes deve ser de aproximadamente 7,8 +/- 0,2. Sólidos são preferivelmente menos do que aproximadamente 0,2% tal como menos do que aproximadamente 0,15%, menos do que aproximadamente 0,14%, menos do que aproximadamente 0,13%, menos do que aproximadamente 0,12%, ou menos do que aproximadamente 0,11%, tal como aproximadamente 0,10%.

(b) INIBIÇÃO COMPETITIVA DIRETA

[00251] Em um formato competitivo direto, uma alíquota de RGMc marcada (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, peptídeo de fragmentos de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) de uma concentração conhecida é usada para competir com a RGMc em uma amostra de teste para ligar ao anticorpo de RGMc (tal como um anticorpo).

[00252] Em um ensaio de competição direto, um anticorpo imobilizado (tal como um anticorpo) pode ou ser sequencialmente ou simultaneamente contatado com a amostra de teste e uma RGMc marcada, fragmento de RGMc ou variante de RGMc da mesma. O peptídeo de RGMc, fragmento de RGMc ou variante de RGMc podem ser marcadas com qualquer marcador detectável, incluindo aqueles marcadores detectáveis discutidos acima em conexão com os anticorpos anti-RGMc. Neste ensaio, o anticorpo pode ser imobilizado sobre um suporte sólido. Alternativamente, o anticorpo pode ser acoplado a um anticorpo, tal como um anticorpo anti espécies, que tenha sido imobilizado sobre um suporte sólido, tal como uma micropartícula.

[00253] A RGMc marcada (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), a amostra de teste e o anticorpo são incubados sob condições similares a aquelas descritas acima em conexão com o formato de ensaio sanduíche. Duas diferentes espécies de complexos de anticorpo-RGMc gerados contém um marcador detectável enquanto o outro complexo de anticorpo-RGMc não contém um marcador detectável. O complexo de anticorpo-RGMc pode ser, mas não tem que ser, separado a partir de um restante da amostra de teste antes da quantificação do marcador detectável. Independentemente de o complexo de anticorpo-RGMc estar separado a partir do restante da amostra de teste, a quantidade de marcador detectável no complexo de anticorpo-RGMc é então quantificada. A concentração de RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) na amostra de teste pode então ser determinada ao comparar a quantidade de marcador detectável no complexo de anticorpo-RGMc a uma curva padrão. A curva padrão pode ser gerada usando diluições em série de RGMc (tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) de uma concentração conhecida, através de espectroscopia de massa, gravimetricamente e através de outras técnicas conhecidas na arte.

[00254] O complexo de anticorpo-RGMc pode ser separado a partir da amostra de teste ao ligar o anticorpo a um suporte sólido, tais como os suportes sólidos discutidos acima em conexão com o formato de ensaio sanduíche, e então removendo o restante da amostra de teste do contato com o suporte sólido.

(c) Ensaio de Competição Reverso

[00255] Em um ensaio de competição reverso, uma RGMc imobilizada (tal como um peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) podem ou ser sequencialmente ou simultaneamente contatadas com uma amostra de teste e ao menos um anticorpo marcado. Preferivelmente, o anticorpo especificamente se liga a um epítopo compreendendo ao menos três (3) aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou a um epítopo compreendendo aminoácidos 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 713, 7-13, 7-11, 7-10, 7-9, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 9-13, 9-12, 9-11, 10-13, 10-12 ou 11-13 da RGMc (SEQ ID NO:1).

[00256] A RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) podem ser vinculados a um suporte sólido, tais como os suportes sólidos discutidos acima em conexão com o formato de ensaio sanduíche. Preferivelmente, o fragmento de peptídeo de RGMc (associada à membrana ou solúvel) compreende aminoácidos 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 7-13, 7-13, 7-11, 7-10, 7-9, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 913, 9-12, 9-11, 10-13, 10-12 ou 11-13 da RGMc (SEQ ID NO:1).

[00257] A RGMc imobilizada (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), a amostra de teste e ao menos um anticorpo marcado são incubados sob condições similares a aquelas descritas acima em conexão com o formato de ensaio sanduíche. Duas espécies diferentes de complexos de RGMc-anticorpo são então gerados. Especificamente, um dos complexos de RGMc-anticorpo gerados está imobilizado e contém um marcador detectável enquanto o outro complexo de RGMc-anticorpo não está imobilizado e contém um marcador detectável. O complexo de RGMc-anticorpo não imobilizado e o restante da amostra de teste são removidos da presença do complexo de RGMc-anticorpo através de técnicas conhecidas na arte, tal como lavagem. Um vez que o complexo de RGMc-anticorpo não imobilizado é removido, a quantidade de marcador detectável no complexo de RGMc-anticorpo imobilizado é então quantificado. A concentração de RGMc ((tais como RGMc associada à membrana, RGMc solúvel, fragmentos de RGMc associadas à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) na amostra de teste pode então ser determinado ao comparar a quantidade de marcador detectável no complexo de RGMc para uma curva padrão. A curva padrão pode ser gerada usando diluições em série de RGMc ou fragmento de RGMc de concentração conhecida, através de espectroscopia de massa, gravimetricamente e através de outras técnicas conhecidas na arte.

(d) Polarização de Fluorescência

[00258] Em um ensaio de polarização de fluorescência, um anticorpo ou fragmento funcionalmente ativo do mesmo pode ser primeiro contatado com uma amostra de teste não marcada suspeita de conter RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associadas à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) para formar um complexo não marcado de RGMc-anticorpo. O complexo não marcado de RGMc-anticorpo é então contatado com uma RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associadas à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) marcada fluorescentemente. A RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) marcada compete com qualquer RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) não marcada em uma amostra de teste para ligar ao anticorpo ou fragmento funcionalmente ativo do mesmo. A quantidade de complexo de RGMc-anticorpo marcado é determinada e a quantidade de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) na amostra de teste determinada via uso de uma curva padrão.

[00259] O anticorpo usado em um ensaio de polarização de fluorescência especificamente se liga a um epítopo compreendendo ao menos três (3) aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou a um epítopo compreendendo aminoácidos 5-13, 5-12, 5-11, 510, 5-9, 5-8, 5-7, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 7-13, 7-13, 711, 7-10, 7-9, 8-13, 812, 8-11, 8-10, 9-13, 9-12, 9-11, 10-13, 10-12 ou 11-13 de RGMc (SEQ ID NO:1).

[00260] O anticorpo, a RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) marcada e a amostra de teste e ao menos um anticorpo marcado pode ser incubado sob condições similares a aquelas descritas acima em conexão com o imunoensaio sanduíche.

[00261] Alternativamente, um anticorpo ou fragmento ativo funcionalmente do mesmo pode ser simultaneamente contatado com uma RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) florescentemente marcada e uma amostra de teste não marcada suspeita de conter RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) do mesmo para formar ambos, complexos de RGMc-anticorpo marcados e complexos de RGMc-anticorpo não marcados. A quantidade de complexos de RGMc-anticorpo marcados formados é determinado e a quantidade de RGMc na amostra de teste é determinada via uso de uma curva padrão. O anticorpo usado neste imunoensaio especificamente pode se ligar a um epítopo possuindo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou 2 a um epítopo possuindo uma sequência de aminoácidos contendo aminoácidos 5-13, 5-12, 5-11, 510, 5-9, 5-8, 5-7, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 7-13, 7-13, 7-11, 7-10, 7-9, 8-13, 812, 8-11, 8-10, 9-13, 9-12, 9-11, 10-13, 10-12 ou 11-13 de RGMc (SEQ ID NO:1 ou 2).

[00262] Alternativamente, um anticorpo ou fragmento ativo funcionalmente do mesmo é primeiro contatado com uma RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) marcada fluorescentemente para formar um complexo de RGMc-anticorpo marcado. O complexo de RGMc-anticorpo marcado é então contatado com uma amostra de teste não marcada suspeita de conter RGMc (tais como peptídeo de RGMc associadas à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma). Qualquer RGMc não marcada na amostra de teste compete com a RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) marcada para a ligação ao anticorpo ou fragmento ativo funcionalmente do mesmo. A quantidade de complexos de RGMc-anticorpo marcados formado é determinada a quantidade de RGMc em uma amostra de teste determinada via uso de uma curva padrão. O anticorpo usado neste imunoensaio especificamente se liga a um epítopo compreendendo ao menos três (3) aminoácidos de aminoácidos 5-13 de RGMc (SEQ ID NO:2) ou a um epítopo compreendendo aminoácidos 13-20, 13-19, 13-18, 13-17, 13-16, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 15-20, 15-19, 15-18, 16-20, 16-19, 17-24, 17-23, 17-22, 17-21, 17-20, 17-19, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-24, 19-23, 19-22 ou 19-21 de RGMc (SEQ ID NO:1 ou 2). (e) Espectrometria de Massa

[00263] Análise de espectrometria de massa (MS) pode ser usada sozinha ou em combinação com outros métodos. Outros métodos incluem imunoensaios e aqueles descritos acima para detectar polinucleotídeos específicos. O método de espectrometria de massa pode ser usado para determinar a presença e/ ou quantidade de um ou mais biomarcadores. A análise de MS pode compreender uma análise de MS por tempo de voo (TOF) de ionização e dessorção a laser assistida por matriz, tais como, por exemplo, MALDI/TOF de local dirigido ou análise MALDI/TOF de cromatografia líquida. Em algumas modalidades, a análise de MS compreende MS com ionização por eletrospray (ESI), tal como a ESI-MS de cromatografia líquida (LC). Análise de massa pode ser realizada usando espectrômetros comercialmente disponíveis. Métodos para utilizar análises de MS, incluindo MALDI-TOF MS e ESIMS, para detectar a presença e quantidade de peptídeos de biomarcadores em amostras biológicas podem ser usados. Veja, por exemplo, U.S. Patent Nos. 6.925.389; 6.989.100; e 6.890.763 para orientação, cada uma das quais estão incorporadas aqui por referência.

c. CONTROLE

[00264] Pode ser desejável incluir uma amostra de controle ou um calibrador, tal com uma série de calibradores. A amostra de controle pode ser analisada concorrentemente com a amostra a partir de indivíduo conforme descrito acima. Os resultados obtidos a partir da amostra do indivíduo podem ser comparados aos resultados obtidos a partir da amostra de controle. Curvas padrão podem ser fornecidas, com o qual os resultados do ensaio para a amostra biológica podem ser comparados. Tais níveis presentes das curvas padrão como uma função de unidades de ensaio, por exemplo, intensidade de sinal fluorescente, se um marcador fluorescente é usado. Usando amostras retiradas a partir de múltiplos doadores, curvas padrão podem ser fornecidas para níveis de controle da RGMc em tecido normal, assim como para níveis “em risco” da RGMc em tecidos retirados a partir de doadores, que pode ter uma ou mais das características definidas acima.

[00265] Deste modo, em face do exposto, um método para determinar a presença, quantidade ou concentração de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) em uma amostra de teste é fornecido. O método compreende analisar a análise de teste para RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) através de um imunoensaio, por exemplo, empregando ao menos um anticorpo e ao menos um marcador detectável e compreendendo a comparação de um sinal gerado através do marcador detectável como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste para um sinal gerado como uma indicação direta ou indireta da presença, quantidade, ou concentração de RGMc em um calibrador. O calibrador é opcionalmente, e é preferivelmente, parte de uma série de calibradores em que cada um dos calibradores se difere dos outros calibradores nas séries através da concentração de RGMc. Um dos ao menos um anticorpo é um anticorpo isolado, o qual especificamente se liga à RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), em que o anticorpo possui um domínio ou região selecionado a partir de (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (i) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13, (j) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (k) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19, (l) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (m) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25, (n) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (o) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31, (p) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34, (q) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34.

[00266] Opcionalmente, o anticorpo possui um domínio ou região selecionados a partir das sequências fornecidas na Tabela 2. Por exemplo, o anticorpo possui um domínio ou região selecionados a partir de (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:41, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44, (i) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45, (j) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, (k) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47, (l) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48, (m) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, (n) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50, (o) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51, (p) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, (q) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, (r) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, (s) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, (t) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56, (u) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, (v) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, (w) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, (x) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60, (y) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, (z) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:62, (aa) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, (bb) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64, (cc) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65, (dd) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, (ee) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67, (ff) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68, (gg) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, (hh) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, (ii) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71, (jj) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, (kk) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73, (ll) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74, (mm) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, (nn) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76, (oo) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79, (pp) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82, ou (qq) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82.

[00267] O método pode compreender (i) contatar a amostra de teste com ao menos um anticorpo de captura, o qual se liga a um epítopo na RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), de modo a formar um complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), (ii) contatar o complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) com ao menos um anticorpo de detecção, o qual compreende um marcador detectável e se liga a epítopo na RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) que não está ligado pelo anticorpo de captura, para formar um complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) /anticorpo de detecção, e (iii) determinar a quantidade de RGMc (ou um fragmento da mesma) na amostra de teste baseada no sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) /anticorpo de detecção formado em (ii).

[00268] Alternativamente, o método pode compreender (i) contatar a amostra de teste com ao menos um anticorpo de captura, o qual se liga a um epítopo na RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) de modo a formar um complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), e simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem, contatar a amostra de teste com RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) detectavelmente marcada, a qual pode competir com qualquer RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) na amostra de teste para se ligar ao menos um anticorpo de captura. Qualquer RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) presente na amostra de teste e a RGMc detectavelmente marcada competem uma com a outra para formar um complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) e um complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada á membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) detectavelmente marcada, respectivamente. O método ainda compreende (ii) determinar a presença, quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste baseada no sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associado à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) detectavelmente marcada formado em (ii). O sinal gerado pelo marcador detectável no complexo de anticorpo de captura/RGMc (tais como peptídeo de RGMc associado à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) detectavelmente marcada é inversamente proporcional à quantidade ou concentração de RGMc na amostra de teste.

[00269] Em uma modalidade, um Ab anti-RGMc de camundongo pode ser anexado diretamente ou indiretamente, por exemplo, através de um Ab anti- camundongo de ovelha, a um suporte sólido. Qualquer RGMc, a qual está presente em uma amostra e posta em contato com o suporte sólido, é vinculada pelo Ab anti- RGMc de camundongo. Um Ab anti-RGMc de cabra marcado com biotina também se liga à RGMc. Estreptavidina, a qual é ligada à peroxidase de rábano silvestre (HRPO), se liga à biotina na Ab anti-RGMc de cabra. Após ser contatada com o-fenilenodiamina, a HRPO converte a o-fenilenodiamina em 2,3 - diaminofenazina, a qual é marrom alaranjada em cor e pode ser medida espectrofotometricamente a 492 nm.

[00270] O método pode ainda compreender diagnosticar, prognosticar ou avaliar a eficácia de um tratamento profilático/terapêutico de um paciente do qual a amostra de teste foi obtida. Se o método ainda compreender avaliar a eficácia de um tratamento profilático/ terapêutico do paciente de quem a amostra de teste foi obtida, o método opcionalmente ainda compreende modificar o tratamento profilático/ terapêutico do paciente conforme necessário para aumentar a eficácia. O método pode ser adaptado para uso em um sistema automatizado ou um sistema semiautomatizado.

[00271] Geralmente, um nível predeterminado pode ser empregado como uma referência contra a qual para avaliar os resultados obtidos após analisar uma amostra de teste para RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma). Geralmente, em fazer tal comparação, o nível predeterminado é obtido ao executar um ensaio particular um número suficiente de vezes e sob condições apropriadas de tal modo que uma ligação ou associação da presença, quantidade ou concentração de analito com um estágio particular ou ponto de extremidade de uma doença, distúrbio ou condição (por exemplo, um distúrbio relacionado ao ferro, tal como um relacionado à sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro conforme aqui discutidos e/ ou conhecidos na técnica) ou com indicações particulares pode ser feito. Tipicamente, o nível predeterminado é obtido com ensaios de indivíduos de referência (ou populações ou indivíduos). A RGMc medida pode incluir fragmentos da mesma, produtos de degradação da mesma, e/ ou produtos de clivagem enzimática dos mesmos.

[00272] Em particular, com respeito a um nível predeterminado conforme empregado para monitorar a progressão da doença e/ ou tratamento, a quantidade ou concentração de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) pode ser “inalterada”, “favorável” (ou “favoravelmente alterada”), ou “desfavorável” (ou “desfavoravelmente alterada”). “Elevada” ou “aumentada” se refere a uma quantidade ou uma concentração em uma amostra de teste que é mais alta do que um nível ou faixa normal ou típica (por exemplo, nível predeterminado), ou é mais alto do que outro nível ou faixa de referência (por exemplo, amostra de linha de base ou anterior). O termo "baixado" ou "reduzido" se refere a uma quantidade ou uma concentração em uma amostra de teste que é mais baixa que um nível ou faixa normal ou típica (por exemplo, nível predeterminado), ou é mais baixa que outro nível ou faixa de referência (por exemplo, amostra de linha de base ou anterior). O termo “alterado” se refere a uma quantidade ou uma concentração em uma amostra que é alterada (aumentada ou decrescida) ao longo de um nível ou faixa normal ou típico (por exemplo, nível predeterminado), ou alo longo de outro nível ou faixa de referência (por exemplo, amostra de linha de base ou anterior).

[00273] O nível ou faixa típica ou normal para RGMc é definido de acordo com prática padrão. Um assim chamado nível alterado ou alteração pode ser considerado ter ocorrido quando há qualquer variação líquida conforme comparado ao nível ou faixa típica ou normal, ou nível ou faixa de referência, que não pode ser explicada através de erro experimental ou variação de amostra. Deste modo, o nível medido em uma amostra particular será comparado com o nível ou faixa de níveis determinados em amostras similares a partir de um assim chamado indivíduo normal. Neste contexto, um “indivíduo normal” é um indivíduo com distúrbio ou doença não detectável, e um paciente ou população “normal” (às vezes chamado de "controle”) é/ são um(s) que exibe(m) distúrbio ou doença detectável, respectivamente, por exemplo. Um “indivíduo aparentemente normal” é um em que a RGMc não tem sido ou está sendo avaliada. O nível de um analito é dito ser “elevado” quando o analito é normalmente indetectável (por exemplo, o nível normal é zero, ou dentro de uma faixa a partir de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 percentis de populações normais), mas é detectado em uma amostra de teste, assim como quando o analito está presente na amostra de teste a um nível mais alto do que o normal. Deste modo, inter alia, a descoberta fornece um método de rastreamento para um indivíduo que tem, ou em risco de ter, um distúrbio relacionado ao ferro, tal como um relacionado à sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro conforme aqui discutido e/ou conhecido na técnica.

[00274] Geralmente, um nível predeterminado pode ser empregado como uma referência contra a qual para avaliar os resultados obtidos após analisar uma amostra de teste para hepcidina. Geralmente, ao se fazer tal comparação, o nível predeterminado é obtido ao executar um ensaio particular um número suficiente de vezes sob condições apropriadas de tal modo que a ligação ou associação da presença, quantidade ou concentração de analito com um estágio particular ou ponto de extremidade de um doença, distúrbio ou condição (por exemplo, um distúrbio relacionado ao ferro, tal como um relacionado à sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro conforme aqui discutido e/ ou conhecido na técnica) ou com indicações particulares pode ser feito. Tipicamente, o nível predeterminado é obtido com ensaios de indivíduos de referência (ou populações ou indivíduos). A hepcidina medida pode incluir fragmentos da mesma, produtos de degradação da mesma, e/ ou produtos de clivagem enzimática dos mesmos.

[00275] Em particular, com respeito a um nível predeterminado conforme empregado para monitorar a progressão da doença e/ ou tratamento, a quantidade ou concentração de hepcidina pode ser “inalterada”, “favorável” (ou “favoravelmente alterada”), ou “desfavorável” (ou “desfavoravelmente alterada”). “Elevada” ou “aumentada” se refere a uma quantidade ou uma concentração em uma amostra de teste que é mais alta do que um nível ou faixa normal ou típica (por exemplo, nível predeterminado), ou é mais alto do que outro nível ou faixa de referência (por exemplo, amostra de linha de base ou anterior). O termo "baixado" ou "reduzido" se refere a uma quantidade ou uma concentração em uma amostra de teste que é mais baixa que um nível ou faixa normal ou típica (por exemplo, nível predeterminado), ou é mais baixa que outro nível ou faixa de referência (por exemplo, amostra de linha de base ou anterior). O termo “alterado” se refere a uma quantidade ou uma concentração em uma amostra que é alterada (aumentada ou decrescida) ao longo de um nível ou faixa normal ou típico (por exemplo, nível predeterminado), ou alo longo de outro nível ou faixa de referência (por exemplo, amostra de linha de base ou anterior).

[00276] O nível ou faixa típica ou normal para hepcidina é definido de acordo com prática padrão. Um assim chamado nível alterado ou alteração pode ser considerado ter ocorrido quando há qualquer variação líquida conforme comparado ao nível ou faixa típica ou normal, ou nível ou faixa de referência, que não pode ser explicada através de erro experimental ou variação de amostra. Deste modo, o nível medido em uma amostra particular será comparado com o nível ou faixa de níveis determinados em amostras similares a partir de um assim chamado indivíduo normal. Neste contexto, um “indivíduo normal” é um indivíduo com distúrbio ou doença não detectável, e um paciente ou população “normal” (às vezes chamado de "controle”) é/ são um(s) que exibe(m) distúrbio ou doença detectável, respectivamente, por exemplo. Um “indivíduo aparentemente normal” é um em que a hepcidina não tem sido ou está sendo avaliada. O nível de um analito é dito ser “elevado” quando o analito é normalmente indetectável (por exemplo, o nível normal é zero, ou dentro de uma faixa a partir de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 percentis de populações normais), mas é detectado em uma amostra de teste, assim como quando o analito está presente na amostra de teste a um nível mais alto do que o normal. Deste modo, inter alia, a descoberta fornece um método de rastreamento para um indivíduo que tem, ou em risco de ter, um distúrbio relacionado ao ferro, tal como um relacionado à sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro conforme aqui discutido e/ou conhecido na técnica.

[00277] O método de ensaio pode também envolver o ensaio de outro marcador e os similares conforme aqui discutido e conhecido na técnica. Por exemplo, o método de ensaio pode também envolver o ensaio de hepcidina (conforme descrito acima), neogenin, fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF-15), lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL), interleucina (IL-6), e/ ou BMP-6, por exemplo.

[00278] Os métodos aqui descritos podem também ser usados para determinar se ou se não um indivíduo possui ou está em risco de desenvolver um distúrbio relacionado ao ferro, tal como discutido aqui e conhecido na técnica. Especificamente, tal método pode compreender as etapas de: (a) determinar a concentração ou quantidade em uma amostra de a partir de um indivíduo de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma usando os métodos aqui descritos, ou métodos conhecidos na técnica); e (b) comparar a concentração ou quantidade de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) determinados na etapa (a) com um nível predeterminado, em que, se a concentração ou quantidade de RGMc determinada na etapa (a) é favorável com respeito a um nível predeterminado, então o indivíduo é determinado não possuindo ou estando em risco de um distúrbio relacionado ao ferro conforme discutido aqui e conhecido na técnica. Contudo, se a concentração ou quantidade de RGMc determinada na etapa (a) é desfavorável com respeito a um nível predeterminado, então o indivíduo é determinado possuindo ou estando em risco de um distúrbio relacionado ao ferro conforme aqui discutido e conhecido na técnica.

[00279] Adicionalmente, fornecido aqui é um método de monitoramente da progressão da doença em um indivíduo. Idealmente, o método compreende as etapas de: (a) determinar a concentração ou quantidade em uma amostra de teste a partir de um indivíduo de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma); (b) determinar a concentração ou quantidade em uma amostra de teste posterior a partir de um indivíduo de RGMc; e (c) comparar a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (b) com a concentração ou quantidade de RGMc determinada na etapa (a), em que se a concentração ou quantidade determinada na etapa (b) é inalterada ou é desfavorável quando comparada à concentração ou quantidade de RGMc determinada na etapa (a), então a doença no indivíduo é determinada como tendo continuado, progredido ou piorado. Por comparação, se a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (b) é favorável quando comparada à concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (a), então a doença no indivíduo é determinada como tendo descontinuada, regredida ou melhorada.

[00280] Opcionalmente, o método ainda compreende comparar a concentração ou quantidade de RGMc como determinado na etapa (b), por exemplo, com um nível predeterminado. Além disso, opcionalmente o método compreende tratar o indivíduo com um ou mais composições farmacêuticas por um período de tempo se a comparação mostrar que a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (b), por exemplo, é desfavoravelmente alterada com respeito ao nível predeterminado.

[00281] Ainda adiante, os métodos podem ser usados para monitorar o tratamento em um indivíduo recebendo tratamento com um ou mais composições farmacêuticas. Especificamente, tais métodos envolvem fornecer uma primeira amostra de teste a partir de um indivíduo antes do indivíduo ter sido administrado uma ou mais composições farmacêuticas. Em seguida, a concentração ou quantidade em uma primeira amostra de teste a partir de um indivíduo de RGMc é determinada (por exemplo, usando os métodos aqui descritos ou conhecidos na técnica). Após a concentração ou quantidade de RGMc ser determinada, opcionalmente a concentração ou quantidade de RGMc é então comparada com um nível predeterminado. Se a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinada na primeira amostra de teste é mais baixa do que o nível predeterminado, então o indivíduo não é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas. Contudo, se a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na primeira amostra de teste é mais alta do que o nível predeterminado, então o indivíduo é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas por um período de tempo. O período de tempo que o indivíduo é tratado com uma ou mais composições farmacêuticas pode ser determinado através de alguém com habilidade na técnica (por exemplo, o período de tempo pode ser a partir de aproximadamente sete (7) dias a aproximadamente dois anos, preferivelmente a partir de aproximadamente catorze (14) dias a aproximadamente um (1) ano).

[00282] Durante o curso do tratamento com um ou mais composições farmacêuticas, a segunda e subsequentes amostras de teste são então obtidas a partir de um indivíduo. O número de amostras de teste e o tempo em que as ditas amostras de teste são obtidas a partir de um indivíduo não são críticas. Por exemplo, uma segunda amostra de teste pode ser obtida sete (7) dias após o indivíduo ser administrado pela primeira vez a uma ou mais composições farmacêuticas, uma terceira amostra de teste pode ser obtida duas (2) semanas após o indivíduo ser pela primeira vez administrado a uma ou mais composições farmacêuticas, uma quarta amostra de teste pode ser obtida três (3) semanas após o indivíduo ser administrado pela primeira vez a um ou mais composições farmacêuticas, uma quinta amostra de teste pode ser obtida quatro (4) semanas após o indivíduo ser administrado pela primeira vez a uma ou mais composições farmacêuticas, etc.

[00283] Após cada segunda ou subsequentes amostras de teste ser obtida a partir do indivíduo, a concentração ou quantidade de RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) é determinada na segundo ou subsequente amostra de teste é determinada (por exemplo, usando os métodos aqui descritos ou conhecidos na técnica). A concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado em cada uma das segunda e subsequentes amostras de teste são então comparadas com a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na primeira amostra de teste (por exemplo, a amostra de teste que foi originalmente, opcionalmente comparada ao nível predeterminado). Se a concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (c) é favorável quando comparada à concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (a), então a doença no indivíduo é determinada como tendo descontinuado, regredido ou melhorado, e o indivíduo deve continuar sendo administrado a uma ou mais composições farmacêuticas da etapa (b). Contudo, se a concentração ou quantidade determinada na etapa (c) é inalterada ou é desfavorável quando comparada à concentração ou quantidade de RGMc conforme determinado na etapa (a) então a doença no indivíduo é determinada como tendo continuado, progredido ou piorado, e o indivíduo deve ser tratado com uma concentração mais alta de uma ou mais composições farmacêuticas administrada no indivíduo na etapa (b) ou o indivíduo deve ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que são diferentes das uma ou mais composições farmacêuticas administradas ao indivíduo na etapa (b). Especificamente, o indivíduo pode ser tratado com uma ou mais composições farmacêuticas que o indivíduo teve previamente recebido para decrescer ou diminuir o dito nível de RGMc do indivíduo.

[00284] Geralmente, para ensaios no qual a repetição dos testes pode ser feita (por exemplo, monitorar a progressão da doença e/ou resposta ao tratamento), uma segunda amostra de teste subsequente é obtida em um período de tempo após a primeira amostra de teste ter sido obtida a partir do indivíduo. Especificamente, uma segunda amostra de teste a partir de um indivíduo pode ser obtida minutos, horas, dias, semanas ou anos após a primeira amostra de teste ter sido obtida a partir de um indivíduo. Por exemplo, a segunda amostra de teste pode ser obtida a partir de um indivíduo em um período de tempo de cerca de 1 minuto, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 13 semanas, cerca de 14 semanas, cerca de 15 semanas, cerca de 16 semanas, cerca de 17 semanas, cerca de 18 semanas, cerca de 19 semanas, cerca de 20 semanas, cerca de 21 semanas, cerca de 22 semanas, cerca de 23 semanas, cerca de 24 semanas, cerca de 25 semanas, cerca de 26 semanas, cerca de 27 semanas, cerca de 28 semanas, cerca de 29 semanas, cerca de 30 semanas, cerca de 31 semanas, cerca de 32 semanas, cerca de 33 semanas, cerca de 34 semanas, cerca de 35 semanas, cerca de 36 semanas, cerca de 37 semanas, cerca de 38 semanas, cerca de 39 semanas, cerca de 40 semanas, cerca de 41 semanas, cerca de 42 semanas, cerca de 43 semanas, cerca de 44 semanas, cerca de 45 semanas, cerca de 46 semanas, cerca de 47 semanas, cerca de 48 semanas, cerca de 49 semanas, cerca de 50 semanas, cerca de 51 semanas, cerca de 52 semanas, cerca de 1,5 anos, cerca de 2 anos, cerca de 2,5 anos, cerca de 3,0 anos, cerca de 3,5 anos, cerca de 4,0 anos, cerca de 4,5 anos, cerca de 5,0 anos, cerca de 5,5 anos, cerca de 6,0 anos, cerca de 6,5 anos, cerca de 7,0 anos, cerca de 7,5 anos, cerca de 8,0 anos, cerca de 8,5 anos, cerca de 9,0 anos, cerca de 9,5 anos ou cerca de 10,0 anos após a primeira amostra de teste a partir de um indivíduo ser obtida. Quando usada para monitorar a progressão da doença, o ensaio acima pode ser usado para monitorar a progressão da soneca em indivíduos sofrendo de condições agudas. As condições agudas, também conhecidas como condições de cuidados críticos, refere-se a doenças potencialmente fatais, ou outras condições médicas críticas envolvendo, por exemplo, o sistema cardiovascular ou sistema excretor. Tipicamente, as condições de cuidados críticos referem-se a aquelas condições requerendo uma intervenção médica aguda em um conjunto com base hospitalar (incluindo, mas não limitado a, uma sala de emergência, unidade de tratamento intensivo, centro de trauma, ou outro conjunto de cuidados emergentes trauma center) ou a administração por um paramédico ou outro pessoal médico com base em campo. Para condições de cuidados críticos, a repetição do monitoramento é geralmente feita em um curto período de tempo, nomeado, minutos, horas ou dias (por exemplo, cerca de 1 minuto, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, 4cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias ou cerca de 7 dias), e o ensaio inicial também é geralmente feito dentro de um período de tempo curto, por exemplo, cerca de minutos, horas ou dias do início da doença ou condição.

[00285] Os ensaios também podem ser usados para monitorar a progressão da doença nos indivíduos sofrendo de condições não agudas ou crônicas. Um cuidado não agudo ou, as condições de cuidado não aguda, refere-se a condições outras que não a aguda, doença com risco de vida ou outras condições médicas críticas envolvendo, por exemplo, o sistema cardiovascular e/ou o sistema excretor. Tipicamente, as condições não agudas incluem aquelas de longo prazo ou duração crônica. Para as condições não agudas, a repetição de monitoramento geralmente é feita com um período de tempo maior, por exemplo, horas, dias, semanas, meses ou anos (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 13 semanas, cerca de 14 semanas, cerca de 15 semanas, cerca de 16 semanas, cerca de 17 semanas, cerca de 18 semanas, cerca de 19 semanas, cerca de 20 semanas, cerca de 21 semanas, cerca de 22 semanas, cerca de 23 semanas, cerca de 24 semanas, cerca de 25 semanas, cerca de 26 semanas, cerca de 27 semanas, cerca de 28 semanas, cerca de 29 semanas, cerca de 30 semanas, cerca de 31 semanas, cerca de 32 semanas, cerca de 33 semanas, cerca de 34 semanas, cerca de 35 semanas, cerca de 36 semanas, cerca de 37 semanas, cerca de 38 semanas, cerca de 39 semanas, cerca de 40 semanas, cerca de 41 semanas, cerca de 42 semanas, cerca de 43 semanas, cerca de 44 semanas, cerca de 45 semanas, cerca de 46 semanas, cerca de 47 semanas, cerca de 48 semanas, cerca de 49 semanas, cerca de 50 semanas, cerca de 51 semanas , cerca de 52 semanas, cerca de 1,5 anos, cerca de 2 anos, cerca de 2,5 anos, cerca de 3,0 anos, cerca de 3,5 anos, cerca de 4,0 anos, cerca de 4,5 anos, cerca de 5,0 anos, cerca de 5,5 anos, cerca de 6,0 anos, cerca de 6,5 anos, cerca de 7,0 anos, cerca de 7,5 anos, cerca de 8,0 anos, cerca de 8,5 anos, cerca de 9,0 anos, cerca de 9,5 anos ou cerca de 10,0 anos), e o ensaio inicial também geralmente é feito dentro de um período de tempo maior, por exemplo, cerca de horas, dias, meses ou anos do início da doença ou condição.

[00286] Além disso, os ensaios acima podem ser desempenhados usando uma primeira amostra de teste obtida a partir de um indivíduo onde a primeira amostra de teste obtida a partir de uma fonte, tal como urina, soro ou plasma. Opcionalmente os ensaios acima podem ser então repetidos usando uma segunda amostra de teste obtida a partir de um indivíduo onde a segunda amostra de teste é obtida a partir de outra fonte. Por exemplo, se a primeira amostra de teste foi obtida a partir da urina, a segunda amostra de teste pode ser obtida a partir do soro ou plasma. Os resultados obtidos a partir de ensaios usando a primeira amostra de teste e a segunda amostra de teste podem ser comparados. A comparação pode ser usada para avaliar o estado de uma doença ou condição no indivíduo.

[00287] Além disso, a presente descoberta também se relaciona a métodos de determinação se um indivíduo predisposto a ou sofrendo de uma doença (por exemplo, um distúrbio relacionado ao ferro, tais como sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro, conforme aqui discutido e conhecido na técnica) irá se beneficiar do tratamento. Em particular, a descoberta se relaciona métodos de diagnóstico de companhia de RGMc e produtos. Deste modo, o método de “monitorar o tratamento da doença em um indivíduo” conforme aqui descrito ainda mais otimamente também podem englobar selecionar ou identificar candidatos para terapia, tal como terapia com eritropoietina (EPO).

[00288] Deste modo, em modalidades particulares, a descoberta também fornece um método de determinar se um indivíduo possuindo, ou em risco de, um distúrbio relacionado ao ferro, tais como sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro, conforme aqui discutido e conhecido na técnica, é um candidato para terapia. Geralmente, o indivíduo é um que tenha experimentado algum sintoma da doença quem tenha realmente sido diagnosticado como possuindo, ou estando em risco de, uma tal doença, e/ ou quem demonstra uma concentração ou quantidade desfavorável de RGMc ou um fragmento da mesma, conforma aqui descrito.

[00289] O método opcionalmente compreende um ensaio conforme descrito aqui, onde o analito é avaliado antes e seguindo o tratamento de um indivíduo com um ou mais composições farmacêuticas (por exemplo, particularmente com um farmacêutico relacionado a um mecanismo de ação envolvendo RGMc), ou onde o analito é avaliado seguindo tal tratamento e a concentração ou a quantidade de analito é comparada contra um nível predeterminado. Uma concentração ou quantidade desfavorável de analito observado seguindo o tratamento confira que o indivíduo não irá se beneficiar de receber tratamento continuado ou adicional, enquanto que uma concentração ou quantidade favorável de analito observado seguindo o tratamento confirma que o indivíduo irá se beneficiar de receber tratamento continuado ou adicional. Esta confirmação auxilia na gestão de estudos clínicos, e provisão de uma melhor assistência ao paciente.

[00290] Não é necessário dizer que, enquanto certas modalidades aqui são vantajosas quando empregas para avaliar um distúrbio relacionado ao ferro, tais como deficiência de ferro ou sobrecarga de ferro, os ensaios e kits também opcionalmente podem ser empregados para avaliar a RGMc em outras doenças, distúrbios e condições conforme apropriadas.

[00291] O método de ensaio também pode ser usado para identificar um composto que melhora um distúrbio relacionado ao ferro, tais como deficiência de ferro ou sobrecarga de ferro. Por exemplo, uma célula que expressa RGMc pode ser contatada com um composto candidato. O nível de expressão de RGMc na célula contatada com o composto pode ser comparado a aquele em uma célula de controle usando o método de ensaio descrito acima.

6. KITS

[00292] Aqui fornecido é um kit, o qual pode ser usado para tratar um indivíduo sofrendo de um distúrbio relacionado ao ferro ou diagnosticar um indivíduo como possuindo um distúrbio relacionado ao ferro conforme descrito aqui previamente.

[00293] Kits para serem usados para tratar um paciente irão conter um anticorpo específico para RGMc. Os kits preferivelmente incluem instruções para tratar um indivíduo usando os anticorpos aqui descritos. Instruções incluídas em kits podem ser afixadas na embalagem do material ou podem ser incluídas como uma bula. Enquanto as instruções são tipicamente materiais escritos ou impressos elas não estão limitadas a tal. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicando-as a um usuário final está contemplado por essa descoberta. Tais meios incluem, mas não estão limitados a, mídia de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitar, cartuchos, chips), mídia óptica (por exemplo, CD ROM), e os similares. Conforme aqui usado, o termo “instruções” pode incluir o endereço de um site de internet que fornece as instruções.

[00294] Também fornecido é um kit para analisar uma amostra teste para RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma). O kit compreende ao menos um componente para analisar a amostra de teste para RGMc e instruções para analisar a amostra de teste para RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma). O ao menos um componente inclui ao menos uma composição compreendendo um anticorpo isolado que especificamente se liga à RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma). O anticorpo pode possuir (i) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, (ii) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:5 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6, (iii) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8, (iv) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:9 e uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10, (vi) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:13 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:16, (r) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:22, (s) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:24, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:26, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28, (t) uma cadeia pesada variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34. O anticorpo é opcionalmente detectavelmente marcado.

[00295] Opcionalmente, o anticorpo pode possuir um domínio ou região selecionados a partir das sequências fornecidas na Tabela 2. Por exemplo, o anticorpo pode possuir (a) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:37, (b) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38, (c) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:39, (d) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:40, (e) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:41, (f) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42, (g) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:43, (h) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44, (i) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:45, (j) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46, (k) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:47, (l) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:48, (m) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:49, (n) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50, (o) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:51, (p) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:52, (q) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:53, (r) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54, (s) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55, (t) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:56, (u) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, (v) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58, (w) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:59, (x) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:60, (y) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:61, (z) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:62, (aa) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:63, (bb) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64, (cc) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65, (dd) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66, (ee) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:67, (ff) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:68, (gg) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:69, (hh) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:70, (ii) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:71, (jj) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:72, (kk) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:73, (ll) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:74, (mm) uma região variável de domínio pesado compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:75, (nn) uma região variável de domínio leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:76, (oo) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79, (pp) uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82, ou (qq) uma cadeia pesada variável compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:78, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:79 e uma cadeia leve variável compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:80, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:81, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82. O anticorpo é opcionalmente detectavelmente marcado.

[00296] Por exemplo, o kit pode compreender instruções para analisar uma amostra de teste para RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma) através de imunoensaio, por exemplo, imunoensaio de micropartículas quimioluminescentes. As instruções podem ser na forma de papel ou na forma legível no computador, tais como um CD, DVD, ou os similares. O anticorpo pode ser um anticorpo de captura de RGMc e/ ou um anticorpo de detecção de RGMc. Alternativamente ou adicionalmente, o kit pode compreender um calibrador ou controle, por exemplo, purificado, e opcionalmente liofilizado, RGMc (tais como peptídeo de RGMc associada à membrana, peptídeo de RGMc solúvel, fragmentos de peptídeo de RGMc associada à membrana, fragmentos de RGMc solúvel, variantes de RGMc (associada à membrana ou RGMc solúvel) ou quaisquer combinações da mesma), e/ ou ao menos um contêiner (por exemplo, tubo, placas de microtitulação ou tiras, os quais podem ser já revestidos com um anticorpo monoclonal anti-RGMc) para conduzir o ensaio e/ ou um tampão, tais como um tampão de ensaio ou um tampão de lavagem, qualquer um dos quais pode ser fornecido como uma solução concentrada, uma solução de substrato para o marcador detectável (por exemplo, um marcador enzimático), ou uma solução de parada. Preferivelmente, o kit compreende todos os componentes, por exemplo, reagente, padrões, tampões, diluentes, etc., os quais são necessários para realizar o ensaio. As instruções também podem incluir instruções para gerar uma curva padrão ou um padrão de referência com propósito de quantificar a RGMc.

[00297] Quaisquer anticorpos, os quais são fornecidos no kit, tais como anticorpos recombinantes específicos para RGMc, podem incorporar um marcador detectável, tais como um fluoróforo, porção radioativa, enzima, marcador de biotina/avidina, cromóforo, marcador quimioluminescente, ou os similares, ou o kit pode incluir reagentes para marcar os anticorpos ou reagentes para detectar os anticorpos (por exemplo, anticorpos de detecção) e/ ou para marcar os analitos ou reagentes para detectar o analito. Os anticorpos, calibradores e/ ou controles podem ser fornecidos em contêineres separados ou pré preparados dentro de um formato apropriado de ensaio, por exemplo, dentro de placas de microtitulação.

[00298] Opcionalmente, o kit inclui componentes de controle de qualidade (por exemplo, painéis de sensibilidade, calibradores, e controles positivos). A preparação de reagentes de controle de qualidade é bem conhecida na técnica e é descrita em folhas de inserção para uma variedade de produtos imunodiagnósticos. Membros de painéis de sensitividade opcionalmente são usados para estabelecer características de desempenho de ensaio, e ainda opcionalmente são indicadores úteis da integridade dos reagentes do kit de imunoensaio, e dos ensaios de padronização.

[00299] O kit pode também opcionalmente incluir outros reagentes requeridos para conduzir um ensaio de diagnóstico ou facilitar avaliações de controle de qualidade, tais como tampões, enzimas, enzimas cofatores, substratos, reagentes de detecção, e os similares. Outros componentes, tais como tampões e soluções para o isolamento e/ ou tratamento de uma amostra de teste (por exemplo, reagentes de pré tratamento), também podem ser incluídos no kit. O kit pode adicionalmente incluir um ou mais outros controles. Um ou mais dos componentes do kit podem ser liofilizados, em cujo caso o kit pode ainda compreender reagentes adequados para a reconstituição dos componentes liofilizados.

[00300] Os vários componentes do kit são opcionalmente fornecidos em contêineres adequados conforme o necessário, por exemplo, uma placa de microtitulação. O kit pode ainda incluir contêineres para segurar ou armazenar uma amostra (por exemplo, um contêiner ou cartucho para uma amostra de plasma, soro, ou urina). Sempre que necessário, o kit pode também opcionalmente conter vasos de reação, vasos de mistura, e outros componentes que facilita a preparação de reagentes ou da amostra de teste. O kit pode também incluir um ou mais instrumentos para ajudar com a obtenção de uma amostra de teste, tais como uma seringa, pipeta, fórceps, colher de medida, e os similares.

[00301] Se o marcador detectável é ao menos um composto de composto de acridínio, o kit pode compreender ao menos um acridínio- 9-carboxamida, ao menos um éster aril de acridínio- 9-carboxilato, ou qualquer combinação dos mesmos. Se o marcador detectável é ao menos um composto de acridínio, o kit pode também compreender uma fonte de peróxido de hidrogênio, tais como um tampão, solução e/ ou ao menos uma solução básica. Se desejado, o kit pode conter uma fase sólida, tais como uma partícula magnética, conta, tudo de teste, placa de microtitulação, cuvete, membrana, molécula de andaime, película, papel de filtro, disco ou chip.

[00302] Se desejado, o kit pode ainda compreender um ou mais componentes, sozinho ou em combinação adicional com instruções, para analisar a amostra de teste para outro analito, o qual pode ser um biomarcador, tal como um biomarcador de um distúrbio relacionado ao ferro, tal como deficiência de ferro ou sobrecarga de ferro. Exemplos de outros analitos incluem, mas não estão limitados a, hepcidina, neogenin, fator de diferenciação do crescimento 15 (GDF-15), lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL), interleucina (IL-6), e/ ou BMP-6, assim como outros analitos e biomarcadores aqui discutidos. Pode ser preferido que um ou mais componentes para analisar uma amostra de teste para hepcidina habilita a determinação de presença, quantidade ou concentração de hepcidina-25. Uma amostra, tal como uma amostra de soro, amostra de plasma, ou uma amostra de urina, podem ser analisadas para hepcidina-25 usando TOF-MS e um padrão interno.

a. Adaptação do Kit e Método

[00303] O kit (ou componentes do mesmo), assim como o método de determinar a concentração de RGMc em uma amostra de teste através de um imunoensaio conforme descrito aqui, pode ser adaptado para uso em uma variedade de sistemas automatizados e semiautomatizados (incluindo aqueles em que a fase sólida compreende uma micropartícula), conforme descrito, por exemplo, na U.S. Patent Nos. 5.089.424 e 5.006.309, e conforme vendida comercialmente, por exemplo, pelo Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois, EUA) como ARCHITECT®.

[00304] Algumas das diferenças entre um sistema automatizado ou semiautomatizado conforme comparado a um sistema não automatizado (por exemplo, ELISA) inclui o substrato ao qual o primeiro parceiro de ligação específico (por exemplo, anticorpo de analito ou anticorpo de captura) é anexado (o qual pode impactar a formação sanduíche e a reatividade do analito), e a duração e o tempo da captura, detecção e/ou qualquer etapa de lavagem opcional. Enquanto um formato não automatizado tal como um ELISA pode exigir um tempo de incubação relativamente mais longo com a amostra e o reagente de captura (por exemplo, cerca de 2 horas), um formato automatizado ou semiautomatizado (por exemplo, ARCHITECT® e qualquer plataforma sucessora, do Abbott Laboratories) pode possuir um tempo de incubação relativamente mais curto (por exemplo, aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT®). Similarmente, enquanto um formato não automatizado tal como um ELISA pode incubar um anticorpo de detecção tal como um reagente conjugado por um tempo de incubação relativamente mais longo (por exemplo, cerca de 2 horas), um formato automatizado ou semiautomatizado (por exemplo, ARCHITECT® e qualquer plataforma sucessora) pode possuir um tempo de incubação relativamente mais curto (por exemplo, aproximadamente 4 minutos para o ARCHITECT® e qualquer plataforma sucessora).

[00305] Outras plataformas disponíveis a partir do Abbott Laboratories incluem, mas não estão limitadas a, AxSYM®, IMx® (veja, por exemplo, U.S. Pat. No. 5.294.404, a qual está aqui incorporada por referência em sua totalidade), PRISM®, EIA (conta), e QuantumTM II, assim como também outras plataformas. Adicionalmente, os ensaios, kits e componentes do kit pode ser empregado em outros formatos, por exemplo, em outros sistemas de ensaio de ponto de cuidado, portátil, ou eletroquímico. A presente descoberta é, por exemplo, aplicável ao comercial ponto de cuidado da Abbott ((i-STAT®, Abbott Laboratories) sistema de imunoensaio eletroquímico que desempenha imunoensaios sanduíche. Imunossensores e seus métodos de manufatura e operação em dispositivos de teste de uso único são descritos, por exemplo, nas U.S. Patent No. 5.063.081, U.S. Pat. App. Pub. No. 2003/0170881, U.S. Pat. App. Pub. No. 2004/0018577, U.S. Pat. App. Pub. No. 2005/0054078, e U.S. Pat. App. Pub. No.2006/0160164, as quais estão incorporadas em suas totalidades por referência por seus ensinamentos a respeito do mesmo.

[00306] Em particular, com respeito à adaptação de um ensaio para o sistema de I-STAT®, a seguinte configuração é preferida. Um chip de silicone microfabricado é manufaturado com um par de eletrodos de trabalho amperométrico de ouro e um eletrodo de referência de cloreto de prata em prata. Em um dos eletrodos de trabalho, contas de poliestireno (0,2 mm de diâmetro) com anticorpo de captura imobilizado são aderidos a um revestimento de polímero de álcool polivinílico modelado sobre o eletrodo. Esse chip é montado dentro de um cartucho de I-STAT® com um formato de fluidos adequado para imunoensaio. Em uma porção da parede da câmara retentora de amostra do cartucho há uma camada compreendendo o anticorpo de detecção marcado com fosfatase alcalina (ou outro marcador). Dentro da bolsa de fluido do cartucho está um reagente aquoso que inclui fosfato de p-aminofenol.

[00307] Em operação, uma amostra suspeita de conter RGMc é adicionada na câmara de suporte do cartucho de teste e o cartucho é inserido no leitor de I-STAT®. Após o segundo anticorpo (anticorpo de detecção) ter se dissolvido dentro da amostra, um elemento de bomba dentro do cartucho força a amostra em um conduíte contendo o chip. Aqui é oscilado para promover a formação do sanduíche entre o primeiro anticorpo de captura, a RGMc, e o segundo anticorpo de detecção marcado. Na penúltima etapa do ensaio, o fluído é forçado para fora da bolsa e dentro do conduíte para lavar a amostra fora do chip e dentro de uma câmara de resíduos. Na etapa final do ensaio, o marcador de fosfatase alcalina reage com o fosfato de p-aminofenol para clivar o grupo de fosfato e permitir o p-aminofenol liberado para ser eletroquimicamente oxidado no eletrodo de trabalho. Baseado na medida atual, o leitor é apto para calcular a quantidade de analito de RGMc na amostra por meios de um algoritmo incorporado e uma curva de calibração determinada de fábrica.

[00308] É ainda mais evidente que os métodos e kits conforme aqui descritos necessariamente englobam outros reagentes e métodos para a realização do imunoensaio. Por exemplo, englobados estão vários tampões tais como são conhecidos na técnica e/ ou os quais podem ser prontamente preparados ou otimizados para serem empregados, por exemplo, para lavagem, conforme um diluente conjugado, e/ ou como um diluente calibrador. Um diluente conjugado exemplar é o diluente conjugado ARCHITECT® empregado em certos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, EUA) e contendo ácido 2-morfolinoetanosulfônico monohidratado (MÊS), um sal, um bloqueador de proteína, um agente antimicrobial, e um detergente. Um exemplar diluente calibrador é o diluente calibrador humano ARCHITECT® empregado em certos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, EUA), o qual compreende um tampão contendo MÊS, outro sal, um bloqueador de proteína, e um agente antimicrobial. Adicionalmente, conforme descrito na U.S. Patent Application No. 61/142.048 depositada em 31 de dezembro de 2008, geração de sinal aumentado pode ser obtido, por exemplo, em um formato de cartucho de I-STAT®, usando uma sequência de ácido nucleico ligado ao anticorpo de sinal como um amplificador de sinal.

[00309] A presente invenção possui múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes. Será prontamente aparente para aqueles com habilidades na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos aqui descritos são obvias e podem ser feitas usando equivalentes adequados sem sair do âmbito da presente descoberta ou as modalidades aqui descobertas. Tendo agora descrito a presente descoberta em detalhes, a mesma será mais claramente entendível por referência aos seguintes exemplos, os quais são incluídos por propósitos de ilustração apenas e não pretendendo limitar o escopo da invenção reivindicada. As descobertas de todas as referências de periódicos, patentes dos EUA e publicações aqui referidas estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades na mesma extensão conforme se cada publicação individual foi especificamente e individualmente indicada para ser incorporada aqui por referência. Os termos e expressões, os quais foram empregados, são usados como termos de descrição e não de limitação. Neste respeito, onde certos termos são definidos sob “Definições” e são definidos de outra forma, descritos, ou discutidos em outro lugar nas “Descrições Detalhadas”, todas essas definições, descrições, e discussões são pretendidas para serem atribuídas a tais termos. Também não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções dos mesmos. Além disso, enquanto subtítulos, por exemplo, “Definições”, são usados na “Descrição Detalhada”, tal uso é somente para facilidade de referência e não é pretendido limitar qualquer descoberta feita em uma seção para aquela seção apenas; de preferência, qualquer descoberta feita sob um subtítulo é pretendida para constituir uma descoberta sob cada e todos os outros subtítulos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 MATURAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTICORPOS E MÉTODO PARA DETERMINAR CARACTERÍSTICAS DE LIGAÇÃO

[00310] Alinhamento de sequência mostra que o anticorpo de RGMa h5F9.23 compartilha a mais alta identidade para linhas germinativas humanas VH3-23/JH3 e A17/Jk2 (veja figuras do documento de design de maturação de afinidade). Para aumentar a afinidade do h5F9.23 à RGMA, resíduos de CDR hipermutados foram identificados a partir de outras sequências de anticorpos humanos no banco de dados de IgBLAST que também compartilhou alta identidade para linhas germinativas VH3- 23 e A17. Os resíduos correspondentes de CDR de h5F9.23 foram então submetidos à mutagênese limitada através de PCR com iniciadores possuindo baixa degeneração nessas posições para criar duas bibliotecas de anticorpo no formato de scFv adequadas para exposição de superfície.

[00311] A primeira biblioteca conteve mutações nos resíduos 31, 35, 50, 52, 52a, 53, 55, 56, 95, 96, 97 e 102 nos VH CDR1, 2 e 3 (numeração de Kabat); e a segunda biblioteca nos resíduos 27c, 27d, 30, 34, 50, 53, 89, 91, 93, 94, 96 e 97 nos três VL CDRs. Para adicionalmente aumentar a identidade de hMAK195 para as sequências estruturais da linha germinativa humana, uma degeneração binária nas posições de VH 37 (V/I), 48 (V/I), 49 (S/G), foi introduzida na primeira biblioteca. Também, uma degeneração binária nas posições de VL 4 (M/L), e 46 (R/L) foi introduzida na segunda biblioteca.

[00312] Essas bibliotecas de h5G9.23 foram exibidas sobre superfícies de células para serem selecionadas contra uma baixa concentração de RGMA biotinilada por magnéticos e então seleção de célula de fluorescência ativada. A seleção para taxa de associação, taxa de desligamento aumentadas ou ambas foram realizadas e sequências de proteínas de anticorpo de clones de h5F9.23 de afinidade modulada foram recuperados para conversão a partir scFv de volta para o formato IgG para adicional caracterização. Esses são os anticorpos h5G9.23 de afinidade maturada. Veja a Tabela 1.

[00313] Onze clones h5F9.23 de afinidade maturada foram expressos em células 293-6E. O nível de expressão foi registrado e anticorpos foram purificados por coluna de afinidade de Proteína. O anticorpo de afinidade maturada H5F9 apresentou boa propriedade química física em análises SEC e MS.

[00314] As características de ligação dos anticorpos de afinidade maturada h5f9.23 de afinidade maturada foram avaliados em h RGMa ELISA indireto. Esse é um ELISA de captura de Fc anti-humano. Resumidamente, dilua o Fc anti-h em tampão de bicarbonato de sódio molar (pH 9,4) de 0,2 a 0,5 µg/ml, revista a 100 ul por poço e incube a placa a temperatura ambiente por 2 horas. Adicione 200 µl de leite seco não gordo de 5% em PBS a cada poço e o bloqueie a temperatura ambiente por uma hora. Após a placa de lavagem, adicione 100 µl de anticorpos individuais diluídos de 0,2 µg/ml a cada poço em duplicado. Incube por 1 hora a temperatura ambiente e então lave a placa. 100 µl de 1 a 6 hRGMa de biotina diluída serialmente a partir de 10 nM a 0,001 nM foi adicionada a cada poço, em seguida a placa foi incubada a temperatura ambiente por uma hora. Após lavagem, 1:10000 de SA-HRP diluída foi de 120 µl por poço, incubado a temperatura ambiente por 15 minutos. Finalmente, após lavar a placa, 120 µl de substrato de TMB de Invitrogen ((CAT#00-2023 Lot#425820A) foi adicionado a cada poço, esperando de 5-10 minutos para a cor se desenvolver. Pare a reação com 60 µl de 2N de ácido sulfúrico. Prossiga para ler a placa a 450 nm e colete os dados para fazer a análise dos dados. Nós fomos capazes de ranquear a ligação dos anticorpos h5F9.23 de afinidade maturada à RGMc humana neste formato de ELISA. A ligação de RGMc humana foi avaliada em RGMc direta de RGMc humana devido ao formato da RGMc humana. Os dados concluem que os anticorpos de h5F9.23 AM aumentaram a ligação de RGMc e RGMa humana em referência ao anticorpo parental h5F9.23.

EXEMPLO 2 DADOS DE LIGAÇÃO COMPETITIVA

[00315] Com respeito à Tabela 3 “(a)MSD” corresponde ao uso de hRGMa- Fc biotinilada complexada com estreptavidina-Sulfo-Tag, e incubação com células a temperatura ambiente. “bHCS” corresponde ao uso de hRGMa-Fc complexada com anticorpo anti-Fc marcado com Cy3, e incubação com células a 37°C. Tabela 4

EXEMPLO 3 5F9.23 HUMANIZADA AFETA O METABOLISMO DE FERRO EM CAMUNDONGOS SAUDÁVEIS

[00316] Vários ensaios foram realizados para entender os efeitos de h5F9.23 no metabolismo de ferro em camundongos. 5 camundongos Sprague-Dawley fêmeas por dosagem foram tratados intravenosamente (IV) com h5F9.23 uma vez semanalmente com 0, 20, 60 ou 200 mg/kg/semana por um período de quatro semanas. Os animais foram sacrificados 7 dias após o último tratamento. Sangue para avaliação de patologia clínica incluindo parâmetros de metabolismo de ferro (nomeadamente ferro sérico livre, transferrina saturada, capacidade de ligação ao ferro não saturado (UIBC)) foi retirado e órgãos (fígado, baço, cérebro, pâncreas, coração, rins) foram fixados para examinação histopatológica. Especificamente, os parâmetros de metabolismo de ferro (nomeadamente, ferro sérico livre, transferrina saturada, capacidade de ligação ao ferro não saturado (UIBC)) foram determinados usando ensaios colorimétricos comercialmente disponíveis do RANDOX Lab, Ltd. Crumlin, RU (para a capacidade de ligação ao ferro total e de ferro). UIBC foi calculada com os ions de parâmetros medidos e TIBC. Ferritina foi determinada usando um ensaio imunoturbimétrico interno adaptado para um sistema de Cobas (Roche Diagnostics GmBH, Alemanha).

[00317] Os camundongos toleraram o tratamento com h5F9 sem qualquer mudança de comportamento animal, sinais clínicos, consumo de comida, peso dos órgãos e do corpo, hematologia, coagulação do sangue e química clínica. Níveis de ferro sérico (Fig. 3) e saturação de transferrina (Figuras 4 e 5) foram dosados aumentados dependentemente e a capacidade de ligação ao ferro não saturado (UIBC) foi dosada decrescida dependentemente (Fig. 6).

[00318] h5F9.23 leva a uma acumulação periportal dependente de dose de ferro no fígado de camundongos tratados uma vez por semana através de injeção iv de 0, 20, 60 ou 200 mg/kg. Após quatro tratamentos semanais com 200 mg/kg de h5F9, grânulos de ferro em hepatócitos acumulam e podem ser demonstrados usando coloração azul prussiano (Compare Figs. 7 e 8). Em contraste, a armazenagem de ferro de macrófagos no baço (Fig. 9, Controle) é reduzida após 4 tratamentos semanais com 200 mg/kg 5F9. Veja a Fig. 10.

[00319] No baço, macrófagos carregados de ferro são localizados na polpa vermelha entre os folículos linfáticos (Fig. 9). Em contraste, os macrófagos no baço de animais tratados com 200 mg/kg/semana apresentaram reduzida ou não acumulação de ferro indicativa para um aumento de liberação de ferro no sangue como um resultado da ligação à RGMc (Fig. 10).

EXEMPLO 4 CARACTERIZAÇÃO DE MABS DE AFINIDADE MATURADA H5F9.23 ATRAVÉS DE ENSAIO BMP REPÓRTER DE MEDIADO POR RGMc

[00320] A RGMc regula a hepcidina de hormônio de regulação de ferro através da via de sinalização BMP/Smad1/5/8. Como um co-receptor para BMPs, RGMc ligada à membrana aumenta a sinalização de BMP. Para testar se a Abs de afinidade maturada h5F9.23 bloqueia a sinalização BMP/Smad, um ensaio de repórter de BMP de RGMc mediada foi desenvolvido.

[00321] Uma construção de repórter de luciferase (luc) responsiva de BMP foi construída ao clonar um elemento responsivo de BMP (BRE) (Korchynskyi et al, 2002) para um montante de um gene de luc em um vetor repórter básico pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro] (Promega). Em um ensaio de repórter de BMP RGMc,

[00322] Células 293HEK foram transfectadas transitoriamente com o repórter BRE-luc e um vetor expressando hRGMc em um prato de 10cm, e 24 h depois divididas em uma placa de 96 poços a uma densidade de célula de 105 por poço. Após 24 h de incubação, as células foram esfomeadas de soro em MEM com 1% FBS por 6 h, seguido pela adição de Ab de teste diluída serialmente. Em seguida, 16 h de incubação, as células foram lisadas e medidas para atividade de luc usando sistema de ensaio de luciferase Promega.

[00323] Os resultados são mostrados na Fig. 11. O Abs de afinidade por maturação h5F9.23 (AM. 4, 8, 9, 11) apresentaram potência muito aumentada em bloquear a atividade de hRGMc com IC50 variando a partir de 0,3 a 1,4 nM, conforme comparado a h5F9.23 com IC50 de 17 nM. Os dados de potência correlacionam com os dados de afinidade (veja a Tabela 5). A afinidade de Abs de afinidade por maturação h5F9.23 em direção à RGMa humana, RGMa de camundongos, e RGMc humana foram determinadas pela análise BIAcore (Tabela 5). Abs de teste foram capturados para a superfície de um chip de CM5 via anti-hIgG Fc Ab, e antígenos diluídos serialmente foram injetados. Taxas de associação e dissociação foram monitoradas por 5 e 10 minutos respectivamente. Sensorgramas foram ajustados através de análise global usando o programa de computador BIAevaluation 4.0.1 para um modelo de ligação de Langmuir de 1:1. As constantes de dissociação de equilíbrio (KD) foram calculadas a partir de constantes de taxas quinéticas (taxa de desligamento kd e taxa de associação ka): KD=kd/ka.

EXEMPLO 5 USO DE ANTICORPOS SELETIVOS RGM A/C E RGM C NO TRATAMENTO DE ANEMIA DE DOENÇA CRÔNICA EM MACACOS

[00324] Os macacos cino fêmeas foram administrados intravenosamente com 20 mg/kg, 60 mg/kg, 200 mg/kg ou subcutaneamente com 60 mg/kg de anticorpo humanizado 5F9.23 (que foi discutido anteriormente aqui no U.S. Patent Publication No. 2010/0028340, conteúdos dos quais estão incorporados aqui para referência), uma vez por semana por um período de 4 semanas. No dia 22, o soro de sangue do primata foi coletado a 0,5 horas, 4 horas, 24 horas e após a aplicação do anticorpo (4a dose). Os níveis de hepcidina forma medidos usando um método de espectrometria de massa de tempo de voo como descrito em Kroot, J.J.C, et al., Clinical Chemistry, 57: 12: 1650-1669 (2011) e Kroot, J.J.C., et al., American Journal of Hematology, 87: 977-983 (2012). Como mostrado na figura 12, o anticorpo humanizado 5F9.23 (h5F9.23) diminui os níveis de hepcidina no sangue de uma maneira dose dependente.

EXEMPLO 6 USO DOS ANTICORPOS SELETIVOS RGM A/C E RGM C NO TRATAMENTO DE ANEMIA DE DOENÇA CRÔNICA EM RATOS

[00325] Os ratos Sprague Dawley fêmeas foram administrados intravenosamente com 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ou 20 mg/kg de h5F9.AM8, uma vez por semana por um período de 4 semanas. Após um período de tratamento de 4 semanas, o soro foi coletado e os parâmetros de ferro (nomeados, livre de soro férrico, transferrina saturada, capacidade de ligação ao ferro insaturado) forma determinados. Especificamente, os parâmetros de metabolismo de ferro (nomeado, livre de soro de ferro, transferrina saturada, capacidade de ligação ao ferro insaturado (UIBC)) forma determinados usando ensaios colorimétricos disponíveis comercialmente pela RANDOX Lab, Ltd. Crumlin, UK (para da capacidade de ligação ao ferro total e ferro). UIBC foi calculada com os parâmetros de medida de ferro e TIBC. A transferrina foi determinada usando um ensaio imunoturbimétrico em camundongo adaptado para um sistema cobas (Roche Diagnostics GmBH, Alemanha). O anticorpo AM8 aumentou os níveis de ferro livre e diminuiu a capacidade de ligação ao ferro insaturado (UIBC), como mostrado na figura 13A e Fig. 13B.

EXEMPLO 7 USO DE ANTICORPOS SELETIVOS RGM A/C E RGM C NO TRATAMENTO DE ANEMIA DE DOENÇA CRÔNICA EM RATOS

[00326] Os ratos Sprague Dawley fêmeas foram administrados intravenosamente com 0,02 mg/kg, 0,2 mg/kg, 2,0 mg/kg ou 20 mg/kg de h5F9.AM8, uma vez por semana por um período de 4 semanas. Após um período de tratamento de 4 semanas, o soro foi coletado e os parâmetros de ferro (ferro de soro, transferrina e UIBC) foram determinadas usando ensaios colorimétricos disponíveis comercialmente a partir da Roche Diagnostics GmbH, Alemanha (para o ferro e UIBC). A transferrina foi determinada usando um ensaio imunoturbimétrico no sistema cobas (Roche Diagnostics GmBH, Alemanha). O anticorpo AM8 aumentou os níveis de ferro livre e diminuiu a capacidade de ligação do ferro insaturado (UIBC), como mostrado na figura 14A e na figura 14B começando em 0,2 mg/kg/por semana. Em 0,02 mg/kg/por semana, nenhum efeito foi observado.

EXEMPLO 8 USO DE ANTICORPOS SELETIVOS RGM A/C E RGM C NO TRATAMENTO DE ANEMIA DE DOENÇA CRÔNICA (ACD) EM RATOS

[00327] Neste exemplo, um modelo de rato com artrite como descrito por Theurl et al. (Theurl et al. Blood, 118: 4977-94 (2011)), conteúdos dos quais estão incorporados aqui para referência, forma usados. Os ratos Lewis fêmeas, de 8-10 semanas de vida, (obtidos a partir de Charles River Laboratories, Alemanha, Sulzfeld), mantidos em uma dieta de roedores padrão (nomeada, 180 mg ferro/kg, C1000 de Altromina, Lage, Alemanha) receberam uma injeção intraparental de fragmentos de peptidoglicano polissacarídeo (PG-APS) (adaptado de Theurl et al., supra). Os ratos tiveram livre acesso a comida e água e foram hospedados de acordo com as regras institucionais e governamentais com um ciclo claro escuro de 12 horas e uma temperatura de 20°C ± 1°C. Os ratos Lewis fêmeas foram inoculados no dia 0 com uma injeção única interparental do grupo A Streptococcal Peptidoglicano- Polissacarídeo (PGAPS) (Lee Laboratories, Grayson, GA) suspenso em 0,85% salina com uma dose total de 15µg rhamnose/g peso corporal. Após três semanas a administração de PG-APS, os animais foram testados para o desenvolvimento de anemia e aleatório nos grupos com níveis de hemoglobina similares. Os ratos que desenvolveram anemia (nomeados, exibiram mais do que 2 g/dL gota da faixa de linha de base) foram designados como ratos ACD anêmicos.

[00328] Para experimentos com tratamento a longo prazo, os ratos ACD foram injetados no dia 21 dias após a administração de PG-APS com (a) um dos dois anticorpos de controle, nomeados tanto a (i) anticorpo monoclonal humanizado que foi seletivo para RGM A quanto o (ii) anticorpo de controle de isótipo (hIgG) humano IgG; (b) 20 mg/kg intravenosamente por 28 dias (n=10) de um dos: (i) anticorpo humanizado 5F9.23 (h5F9.23; descrito no U.S. Patent Publication 2010/0028340, o conteúdo dos quais estão qui incorporados para referência); (ii) anticorpo humanizado 5F923.AM8 (h5F923.AM8) que é um anticorpo monoclonal de afinidade maturada humanizado que é seletivo para ambos RGM A e RGM C; (iii) anticorpo monoclonal de camundongo 1A-2989 que é seletivamente para RGM C e é descrito no U.S. Application No. 61/570,499, depositado em 14 de dezembro de 2011 e o U.S. Application No. 61/578,122 depositado em 20 de dezembro de 2011 conteúdos dos quais estão aqui incorporados para referência; e (c) 2 mg/kg intraperitonealmente, todo o segundo dia, dorsomorfina (n=8), um inibidor de molécula pequena dos receptores BMP I e II.

[00329] Durante todo o período de tratamento, um total de 500 µl de sangue foi coletado semanalmente por punção das veias da calda para completar a contagem da análise de ferro no sangue (CBC) e no soro. A análise CBC foi realizada usando um contador de sangue animal Vet-ABC (Scil Animal Care Company, Viernheim, Alemanha) o ferro do soro foi determinado usando um ensaio colorimétrico disponível comercialmente (Cobas system; Roche Diagnostics Deutschland GmbH).

[00330] Após 28 dias de tratamento (49 dias após a indução de ACD), todos os ratos foram sacrificados e os tecidos foram colhidos para necropsia, histopatologia, expressão de gene e análise de proteína. Como mostrado na figura Fig. 15, h5F923.AM8 e 1A-2989 melhoraram a anemia em taxas de ACD no dia 30 aumentando o nível de hemoglobina. A dorsomorfina estava inativa.

[00331] Em um segundo conjunto de experimentos, o anticorpo de controle hIgG, h5F9.23 e h5F923.AM8 e foram testados em ratos ACD anêmicos (obtidos pela Charles River Laboratories, Alemanha, Sulzfeld). Os ratos forma classificados como anêmicos, quando o nível de hemoglobina caiu par mais de 2 g/dL no dia 24 como determinado usando técnicas de ensaio com hepcidina conhecidos na arte tal como aquelas descritas em Kroot, J.J.C, et al., Clinical Chemistry, 57: 12: 1650-1669 (2011) e Kroot. J.J.C., et al., American Journal of Hematology, 87: 977-983 (2012). Começando com 20 mg/kg de tratamento de anticorpo intravenosamente uma vez por semana por 28 semanas, os níveis de hemoglobina foram analisados nos dias 41 e 47 e 51. Como mostrado na figura 16A, o anticorpo de controle hIgG não muda significantemente o baixo nível de hemoglobina dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51. A figura 16B mostra que um anticorpo monoclonal humanizado que foi selecionado para RGM A, chamando anti-RGMa 1, não muda significantemente o baixo nível de hemoglobina dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51. A figura 16C mostra que o anticorpo h5F9.AM8 aumenta significantemente o baixo nível de hemoglobina (D24) dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51. A figura 16D mostra que o anticorpo h5F9.23, aumenta o baixo nível de hemoglobina (dia 24 (D24) dos ratos anêmicos nos dias 41, 47 e 51.

Claims (37)

1. Anticorpo monoclonal isolado anti-Molécula de Orientação Repulsiva c (RGMc) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região determinante de complementariedade (CDR) 1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.

2. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 6.

3. Anticorpo monoclonal anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável de cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 5.

4. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc é um anticorpo humanizado.

5. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc é um anticorpo de afinidade maturada.

6. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc compreende um domínio constante de imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo um domínio constante de IgG humana.

7. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio constante de IgG humana é um isotipo de IgG1 humana.

8. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc compreende ainda um agente selecionado dentre o grupo consistindo em: uma molécula de imunoadesão, um agente de imagem, e um agente terapêutico; em que o agente de imagem é selecionado dentre o grupo consistindo em um marcador radioativo, uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador magnético e biotina; e em que o marcador radioativo é selecionado dentre o grupo consistindo em 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho e153Sm.

9. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador luminescente é um marcador bioluminescente.

10. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso na inibição da atividade da Molécula de Orientação Repulsiva c (RGMc) em um indivíduo em necessidade do mesmo.

11. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é identificado como tendo uma doença relacionada ao metabolismo do ferro.

12. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a inibição da atividade de RGMc resulta na diminuição da expressão de hepcidina no indivíduo.

13. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de hepcidina sérica maior do que o de um controle normal.

14. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de hepcidina sérica maior do que 300 mg/l antes de receber o anticorpo.

15. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de hemoglobina sérica menor do que 15,5 g/dl antes de receber o anticorpo.

16. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem uma saturação de transferrina menor do que 25% antes de receber o anticorpo.

17. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem uma capacidade de ligação ao ferro total menor do que 50% antes de receber o anticorpo.

18. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de ferro sérico menor do que 60 µg/dl antes de receber o anticorpo.

19. Anticorpo monoclonal isolado anti-RGMc, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença relacionada ao metabolismo do ferro é Anemia de Doença Crônica (ACD) ou anemia de doença renal crônica.

20. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal anti-RGMc, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Uso do anticorpo monoclonal anti-RGMc, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença do metabolismo do ferro em um indivíduo em necessidade do mesmo.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença de metabolismo do ferro é selecionada dentre o grupo consistindo em: Anemia de Doença Crônica (ACD), anemia por deficiência de ferro refratária ao ferro, anemia de doença renal crônica, resistência a agentes estimulantes da eritropoiese e ß-talassemia.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento inibe a atividade da Molécula de Orientação Repulsiva c (RGMc) em um indivíduo.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a inibição da atividade de RGMc resulta na diminuição da expressão de hepcidina no indivíduo.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de hepcidina sérica maior do que o de um controle normal.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de hepcidina sérica maior do que 300 mg/l antes de receber o anticorpo.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de hemoglobina menor do que 15,5 g/dl antes de receber o anticorpo.

28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem uma saturação de transferrina menor do que 25% antes de receber o anticorpo.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem uma capacidade de ligação ao ferro total menor do que 50% antes de receber o anticorpo.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um nível de ferro sérico menor do que 60 µg/dl antes de receber o anticorpo.

31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença relacionada ao metabolismo do ferro é Anemia de Doença Crônica (ACD) ou anemia de doença renal crônica.

32. Método para determinar se um indivíduo tem um distúrbio relacionado ao ferro CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: (a) medir o nível de RGMc associada à membrana ou solúvel em uma amostra isolada do indivíduo; e (b) comparar o nível de RGMc na amostra com um controle normal, em que um nível alterado de RGMc indica que o indivíduo tem uma doença relacionada ao ferro, e em que o nível de RGMc é medido usando o anticorpo monoclonal anti-RGMc, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que antes da etapa (a) o indivíduo é identificado com um distúrbio selecionado dentre o grupo consistindo em câncer, infecção aguda, infecção crônica, doença autoimune, doença hepática e doença renal crônica.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é selecionada dentre o grupo consistindo em uma amostra de sangue e uma amostra de soro.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que um nível diminuído de RGMc associada à membrana quando comparado ao nível de RGMc associada à membrana em um controle normal indica que o indivíduo tem um distúrbio relacionado ao ferro associado à sobrecarga de ferro, em que um nível elevado de RGMc associada à membrana quando comparado ao nível de RGMc associada à membrana em um controle normal indica que o indivíduo tem um distúrbio relacionado ao ferro associado à deficiência de ferro, em que um nível diminuído de RGMc solúvel quando comparado ao nível de RGMc solúvel em um controle normal indica que o indivíduo tem um distúrbio relacionado ao ferro associado à deficiência de ferro, e em que um nível elevado de RGMc solúvel quando comparado ao nível de RGMc solúvel em um controle normal indica que o indivíduo tem um distúrbio relacionado ao ferro associado à sobrecarga de ferro.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda analisar uma amostra de teste para a presença, quantidade ou concentração de hepicidina, em que ambas: (i) a amostra de teste analisada para hepicidina é a mesma amostra de teste analisada para RGMc ou (ii) a amostra de teste analisada para hepicidina é uma amostra de teste diferente da amostra de teste analisada para RGMc, mas a fonte da amostra de teste analisada para hepicidina e a fonte da amostra de teste analisada para RGMc são as mesmas, ao que a presença, a quantidade ou a concentração de hepicidina em uma amostra de teste é determinada, em que a amostra de teste é, ou as amostras de teste são, analisadas para RGMc e hepicidina simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.

37. Kit para analisar uma amostra de teste para RGMc ou um fragmento da mesma CARACTERIZADO pelo fato de que o kit compreende pelo menos um componente para analisar a amostra de teste para RGMc ou um fragmento da mesma e instruções para analisar a amostra de teste para RGMc ou um fragmento da mesma, em que o pelo menos um componente inclui pelo menos uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal anti-RGMc, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.