CZ2003291A3

CZ2003291A3 - Duálně specifické protilátky a způsoby jejich výroby a použití

Info

Publication number: CZ2003291A3
Application number: CZ2003291A
Authority: CZ
Inventors: Albert Collinson; Tariq Ghayur; George Avgerinos; Richard Dixon; Zehra Kaymakcalan
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2003-05-14
Also published as: HUP0301002A3; BG66209B1; BR0112026A; CA2411374A1; NO20026239L; PL359995A1; US8475766B2; TWI307716B; EP2042518A3; BG107483A; PE20020132A1; EP1297142B1; MXPA02012867A; IL153567A; WO2002002773A2; UY26807A1; HK1055316A1; ECSP024409A; US20030040083A1; EP2042518A2

Description

Vynález kromě toho poskytuje způsob syntézy rekombinantní protilátky podle tohoto vynálezu kultivací hostitelské buňky podle tohoto vynálezu ve vhodném kultivačním mediu, pokud je rekombinantní protilátka podle tohoto vynálezu syntetizována.

Alternativou ke skríninku knihoven rekombinantních protilátek zobrazením fága, mohou být další způsoby, známé na tomto poli techniky pro skrínink velkých kombinačních knihoven, použité pro identifikaci duálně specifických protilátek podle tohoto vynálezu. Jedním typem alternativního expresního systému je systém, ve kterém je knihovna rekombinantních protilátek exprimována jako RNA-proteinová fuze, popsaná v PCT publikaci č. WO 98/31 700 od Szostak a Roberts a v Roberts, R.W. a Szostak, J.W. (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94:12 297 až 12 302. V tomto systému je vytvořena kovalentní fuze mezi mRNA a jí kódovaným peptidem nebo proteinem, translací in vitro syntetických mRNA, které na svém 3' konci nesou puromycin, peptidový akceptor antibiotik. Určitá mRNA může být tedy obohacena ze složité směsi mRNA (např. kombinační knihovna) na základě vlastností kódovaného peptidu nebo proteinu, např. protilátky nebo její části, jako je vazba protilátky nebo její části k duálně specifickému antigenu. Sekvence nukleové kyseliny, kódující protilátky nebo jejich části, získané skríninkem těchto knihoven, mohou být exprimovány rekombinantním způsobem, jak je popsáno shora (např. v savčích hostitelských buňkách) a kromě toho mohou být předmětem dalšího afinitního zrání buď dalšími cykly skríninku fúzí mRNA-peptid, vr kterých byly zavedeny mutace do původně vybrané sekvence (sekvencí) nebo jiným způsobem afinitního zrání rekombinantních protilátek in vitro, jak je popsáno shora.

C. Kombinační přístupy

Duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu mohou být také připraveny použitím kombinačních přístupů in vivo nebo in vitro, takovými způsoby, ve kterých je duálně specifický antigen původně vystaven protilátkovému souboru in vivo v hostitelském živočichovi, aby byla stimulována produkce protilátek, které váží duálně specifický antigen, ale v němž je provedena další selekce protilátek a/nebo zrání (t.j., zlepšení) pomocí jedné nebo více in vitro technik.

V jednom provedení tento kombinační přístup obsahuje nejprve imunizaci živočicha, jiného než člověka (např. myš, krysa, králík, koza nebo jejich transgenní verze nebo chimerní myš), duálně specifickým antigenem pro stimulaci protilátkové odpovědi vůči antigenu, následovanou přípravou a skríninkem fágové zobrazovací protilátkové knihovny pomocí imunoglobulinových sekvencí z lymfocytů, stimulovaných in vivo expozicí vůči duálně

specifickému antigenu. První krok tohoto kombinačního postupu může být proveden jak je popsáno v oddíle IIA, zatímco druhý krok tohoto postupu mlže být proveden, jak je popsáno v oddíle IIB shora. Výhodné postupy hyperimunizace živočichů, jiných než člověk, následované skríninkem in vitro fágových zobrazovacích knihoven, připravených ze stimulovaných lymfocytů, obsahují postupy, popsané u BioSite lne., viz např. PCT publikace WO 98/47 343, PCT publikace WO 91/17 271, US patent č. 5 427 908 a US patent č. 5 580 717.

V jiném provedení je v kombinačním postupu obsažena nejprve imunizace jiného než lidského živočicha (např. myš, krysa, králík, koza nebo jejich knockoutovaná a/nebo transgenní verze nebo chimerní myš) s duálně specifickým antigenem pro stimulaci protilátkové odpovědi na antigen a selekce lymfocytů, které produkují protilátky s požadovanou duální specifitou (např. skríninkem hybridomů, připravených z imunizovaných zvířat). Přestavěné protilátkové geny z vybraných klonů se potom izolují (standardními způsoby klonování, jako je reverzní transkriptáza - polymerázová řetězová reakce) a jsou předmětem afinitního zrání in vitro, čímž jsou zesíleny vazebné vlastnosti vybrané protilátky nebo protilátek. První krok tohoto postupu může proveden podle popisu v odstavci IIA shora, zatímco druhý krok tohoto postupu může být proveden, jak je popsáno v odstavci IIB shora, hlavně použitím in vitro způsobů zrání, které jsou popsány v PCT publikaci WO 97/29 131 a PCT publikaci WO 00/56 772.

V ještě jiném kombinačním způsobu jsou rekombinantní protilátky generovány z jednotlivých, izolovaných lymfocytů, použitím postupu, označovaného v této oblasti techniky jako způsob vybraných lymfocytárních protilátek (selected lymphocyte antibody method, SLAM), popsaný v US patentu č. 5 627 052, PCT publikaci WO 92/02 551 a v Babcock, J.S. et al. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci USA 93:7843 až 7848. V tomto způsobu, aplikovaném na duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu, je nejprve jiný než lidský živočich (např. myš, krysa, králík, koza nebo jejich transgenní verze nebo chimerní myš) imunizován in vivo duálně specifickým antigenem pro stimulaci protilátkové odpovědi proti tomuto antigenu a potom se jednotlivé buňky, vylučující zájmové protilátky, např. specifické vůči duálně specifickému antigenu, selektují pomocí antigen-specifického hemolytického plakového testu (např. duálně specifický antigen sám nebo strukturně příbuzné zájmové molekuly jsou připojeny k ovčím červeným krvinkám pomocí můstku, jako je biotin, čímž je umožněna identifikace jednotlivých buněk, které vylučují protilátky s vhodnou specifitou, pomocí testu hemolytických plaků). Po identifikaci buněk, vylučujících zájmové protilátky, jsou těžké a lehké řetězce variabilních oblastí cDNA uvolněny z buněk reverzní transkriptázou a PCR a tyto variabilní oblasti mohou být potom exprimovány v kontextu příslušných imunoglobulinových konstantních oblastí (např. lidské konstantní oblasti), v savčích ·» »· φ ······ » · · Φ 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 999 9999 9 • · 9 9 · 9 · * φ • ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ Φφφ φφ φφ hostitelských buňkách, jako jsou COS nebo CHO buňky. Tyto hostitelské buňky, transfektované zesílenými imunoglobulinovými sekvencemi, odvozenými od in vivo vybraných lymfocytů, mohou být poté dále analyzovány a selektovány in vitro například kontrolou transfektovaných buněk, aby byly izolovány buňky, exprimující protilátky s požadovanou duální specifitou. Tyto zesílené imunoglobulinové sekvence mohou být dále ovlivňovány in vitro, jako třeba in vitro afinitním zráním, jak je popsáno shora.

V jiném provedení obsahuje kombinační způsob následující kroky, aby byly produkovány duálně specifické protilátky. Nejprve je jiný než lidský živočich imunizován prvním antigenem a druhý, jiný než lidský živočich je imunizován druhým, odlišným antigenem, přičemž druhý antigen je výhodně strukturně podobný prvnímu antigenu, aby byla stimulována protilátková odpověď in vivo. Z protilátkových genů je sestrojena knihovna rekombinantních těžkých řetězců a knihovna rekombinantních lehkých řetězců, odvozených od prvního živočicha, jiného než člověk, případně druhého živočicha, jiného než člověk, jak je popsáno v oddíle IIB. Knihovna těžkého řetězce z živočicha, imunizovaného prvním antigenem je spojena s knihovnou lehkého řetězce živočicha, imunizovaného druhým antigenem, aby vznikla knihovna protilátek X. Podobně, knihovna těžkého řetězce z živočicha, imunizovaného druhým antigenem je spojena s knihovnou lehkého řetězce z živočicha, imunizovaného prvním antigenem, aby byla vytvořena knihovna protilátek Y. Mimoto mohou knihovny X a Y spojeny za vzniku knihovny XY. Duálně specifické protilátky, které váží první i druhý antigen, mohou být identifikovány a izolovány z knihoven X, Y a/nebo XY knihoven.

III. Charakteristiky duálně specifických protilátek

Tento vynález poskytuje duálně specifické protilátky, rovněž jako části těchto protilátek, které mohou být připraveny způsobem podle tohoto vynálezu. Těmito protilátkami, případně jejich částmi, jsou výhodně izolované protilátky. Těmito protilátkami, případně jejich částmi, jsou výhodně neutralizující protilátky. Protilátkami podle tohoto vynálezu jsou také monoklonální a rekombinantní protilátky, případně jejich části. V různých provedeních mohou protilátky nebo jejich části obsahovat sekvence aminokyselin odvozené zcela od jednotlivých živočišných druhů, jako jsou protilátky nebo jejich části zcela lidského nebo zcela myšího původu. V jiných provedeních mohou být těmito protilátkami nebo jejich částmi chimerní protilátky, protilátky s implantovanou CDR nebo jiné formy lidských protilátek.

Termín “protilátka”, jak je zde používán, označuje imunoglobulinové molekuly, složené ze čtyř polypeptidových řetězců, dvou těžkých (H) řetězců a dvou lehkých (L) řetězců, vzájemně spojených disulfidickými vazbami. Každý těžký řetězec je složen z variabilní oblasti těžkého řetězce (zkracované zde jako HCVR nebo VH) a konstantní oblasti těžkého řetězce.

♦ ·······«

Ztl 4 4 4 4 4 4 4 · 44 4 4

4444 4444 •444 44 44 ··· 4» 44

Tato konstantní oblast těžkého řetězce je složena ze tří domén, CH1, CH2 a CH3. Každý lehký řetězec je složen z variabilní oblasti lehkého řetězce (zde označované jako LCVR nebo LV) a konstantní oblasti lehkého řetězce. Konstantní oblast lehkého řetězce je tvořena jednou doménou, CL. Oblasti VH a LH mohou být dále děleny na oblasti hypervariability, které jsou nazývány oblastmi určujícími komplementaritu (complementarity determining regions, CDR), které jsou odděleny oblastmi, které jsou více konzervativnější a jsou nazývané rámcové oblasti (framework regions - FR). Každá VH a VL je složena ze tří CDR a čtyř FR, uspořádaných od N-konců k C-koncům v následujícím pořadí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Termín “antigen vážící část” protilátky (nebo jednoduše “část protilátky”), jak je zde užíván, označuje jeden nebo více fragmentů duálně specifické protilátky, které si uchovávají schopnost se specificky vázat na dva různé, ale strukturně příbuzné antigeny. Bylo zjištěno, že antigen vážící funkce protilátky může být představována fragmentem o délce celé protilátky. Příklady vážících se fragmentů, obsažených v rámci termínu “antigen vážící část” protilátky, obsahují (i) Fab fragment, což je monovalentní fragment, zahrnující VL, VH, CL a CH1 domény; (ii) F(ab')₂ fragment, což je bivalentní fragment, obsahující dva Fab fragmenty, vázané disulfidickým můstkem v oblasti čepu; (iii) Fd fragment, zahrnující VH a CH1 domény; (iv) FV fragment, zahrnující VL a VH domény jednoho ramene protilátky; (v) dAB fragment (Ward et al., (1989) Nátuře 341:544 až 546), který zahrnuje VH doménu a vi) izolovanou oblast, určující komplementaritu (CDR). Kromě toho, i když dvě domény Fv fragmentu, VH a VL, jsou kódovány oddělenými geny, mohou být použitím rekombinantních způsobů spojeny syntetickým můstkem, který umožňuje, aby byly produkovány ve formě jednoho proteinového řetězce, ve kterém VL a VH oblasti tvoří monovalentní molekuly ( známé jako jednoduché řetězce Fv (scFv); viz např. Bird et al. (1988) Science 242:423 až 426 a Huston et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879 až 5883). Tyto jednořetězcové protilátky jsou také chápány pod termínem „antigen vážící části“ protilátky. Jiné formy řetězcových protilátek, jako diaprotilátky, jsou také obsaženy v tomto termínu. Diaprotilátky jsou bivalentní, bispecifické protilátky, jejichž VH a VL domény jsou exprimovány v jednom polypeptidovém řetězci, ale důsledkem můstku, který je příliš krátký, aby dovolil párování mezi těmito dvěma doménami v rámci jednoho řetězce, se tyto domény párují s komplementárními doménami jiných řetězců a tvoří tak dvě antigen vážící místa (viz např. Holliger, P. et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444 až 6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121 až 1123.

Protilátka nebo její antigen vážící část mohou být částí větších imunoadhezních molekul, vzniklých kovalentní nebo nekovalentní asociací protilátky nebo její části s jedním nebo více jinými proteiny nebo peptidy. Příklady takových imuno adhezivní ch molekul obsahují

·· ·© použití jaderné oblasti streptavidinu pro tvorbu tetramerní scFv molekuly (Kyprianov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies andHybridomas 6:93 až 101) a použití cysteinového zbytku, markerového peptidu a C-koncového polyhistidinového tágu pro tvorbu bivalentních a biotinylovaných scFv molekul (Kyprianov, S.M. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047 až 1058). Části protilátky, jako Fab a F(ab')₂ fragmenty, mohou být připraveny z celých protilátek konvenčním způsobem, jako je papainová nebo pepsinová digesce celých protilátek. Kromě toho mohou být protilátky, části protilátek a imunoadhezivní molekuly získány standardními rekombinantními postupy.

Termín “izolovaná duálně specifická protilátka”, jak je zde používán, označuje duálně specifickou protilátku, která v podstatě neobsahuje žádné jiné protilátky, které mají odlišné antigenní specifity (např. izolovaná protilátka, která specificky váže dva rozdílné, ale strukturně příbuzné antigeny, ale je v podstatě prostá protilátek, které specificky váží jiné nepříbuzné antigeny). Kromě toho může být izolovaná duálně specifická protilátka v podstatě prosta jiného buněčného materiálu a/nebo jiných chemikálií.

Termín “neutralizující protilátka”, jak je zde použit, označuje protilátku, jejíž vazba k příslušnému antigenu má za výsledek inhibici biologické aktivity tohoto antigenu. Tato inhibice biologické aktivity antigenu může být odhadnuta měřením jednoho nebo více ukazatelů biologické aktivity tohoto antigenu pomocí vhodného in vitro nebo in vivo testu.

Termín “monoklonální protilátka”, jak je zde používán, označuje protilátku odvozenou od hybridomu (např. protilátku vylučovanou hybridomem, připraveným hybridomovou technologií, jako je standardní hybridomová technologie podle Kohler a Milstein). Duálně specifická protilátka podle tohoto vynálezu, odvozená od hybridomu, je tedy stále označována jako monoklonální protilátka, i když má antigenní specifitu proti více než jednomu jednotlivému antigenu.

Fráze “rekombinantní protilátka” označuje protilátky, které jsou připraveny, exprimovány, vytvořeny nebo izolovány rekombinantním způsobem, tak jako protilátky, exprimované použitím rekombinantního expresního vektoru, transfektovaného do hostitelské buňky, protilátky, izolované z knihovny rekombinantních kombinačních protilátek, izolované ze živočicha (např. myši), který je transgenní vůči lidským imunoglogulinovým genům (viz, např. Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. AddsRes. 20:6287 až 6295) nebo protilátka,které jsou připravené, exprimované, vytvořené nebo izolované jiným způsobem, který obsahuje napojení příslušných imunoglobulinových genových sekvencí (jako jsou sekvence lidských imunoglobulinových genů) k jiným DNA sekvencím. Příklady rekombinantních protilátek obsahují chimerní, CDR implantované a humanizované protilátky.

• fc ··· · • · · · · • · ···· fcfc

Termín “lidská protilátka” označuje protilátky, které mají variabilní a konstantní oblasti odpovídající nebo odvozené od imunoglobulinových lidských zárodečných sekvencí, jak je popsáno, např. v Kabat et al. (viz Kabat, et al. (1991) Sequeunces ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Gealth and Human Services, NIH Publication č. 91-3242). V některých provedeních jsou však takové rekombinantní lidské protilátky předmětem mutageneze in vitro nebo, pokud je použit živočich transgenní pro lidské Ig sekvence, in vivo somatické mutageneze, a aminokyselinové sekvence VH a LH oblastí rekombinantních protilátek jsou sekvencemi, které, jsou-li odvozeny a příbuzné od lidských zárodečných VH a λ/L sekvencí, nemohou existovat v rámci přirozeného souboru zárodečných lidských protilátek in vivo. V určitých provedeních jsou však tyto rekombinantní protilátky výsledkem selektivní mutageneze, zpětné mutace nebo obojí.

Termín “zpětná mutace” označuje proces, ve kterém jsou některé nebo všechny somaticky mutované aminokyseliny nahrazeny odpovídajícími zbytky zárodečné linie z homologních sekvencí zárodečných protilátkových sekvencí. Sekvence řetězců těžkého a lehkého řetězce lidské protilátky podle tohoto vynálezu jsou odděleně srovnány se sekvencemi zárodečné linie VBASE databáze, aby byly identifikovány sekvence s nejvyšší homologií. Rozdíly v lidské protilátce podle tohoto vynálezu jsou opraveny podle sekvencí zárodečné linie mutováním definovaných nukleotidových pozic, kódujících tyto různé aminokyseliny. Úloha každé aminokyseliny, identifikované jako kandidát pro zpětnou mutaci by měla být vyzkoušena na její přímou nebo nepřímou úlohu ve vazbě antigenu a jakákoliv aminokyselina, která by po mutaci měnila požadované charakteristiky lidské protilátky, by neměla být obsažena ve výsledné lidské protilátce, aby byl minimalizován počet aminokyselin, které jsou předmětem zpětné mutace těch aminokyselinových pozic, které byly nalezeny jako odlišné od nejbližší sekvence zárodečné linie, ale identické s odpovídající aminokyselinou v druhé zárodečné linii, a které mohou zůstat, za předpokladu, že tato druhá sekvence zárodečné linie je identická a kolineární se sekvencí lidské protilátky podle tohoto vynálezu v nejméně 10, výhodně v 12 aminokyselinách na obou stranách dotyčné aminokyseliny. Zpětné mutace se mohou vyskytovat ve kterémkoliv stadiu optimalizace protilátky.

Termín “chimérní protilátka” označuje protilátky, které obsahují sekvence variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce jednoho živočišného druhu a sekvence konstantní oblasti od jiného živočišného druhu, právě tak jako protilátky, které mají myší variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce, vázané na lidské konstantní oblasti.

Termín “protilátka s implantovanou CDR” označuje protilátky, které obsahují sekvence variabilních oblasti těžkého a lehkého řetězce jednoho živočišného druhu, ve kterých ·· 9· • · · ♦

• ··· • · ···· *· jsou ale sekvence jedné nebo více CDR oblastí VH a/nebo VL nahrazeny CDR sekvencemi od jiných druhů, jako v případě protilátek, které mají myší variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců, ve který je jedna nebo více myších CDR (např. CDR3), nahrazena lidskou CDR sekvencí.

Termín “humanizovaná protilátka” označuje protilátky, které obsahují sekvence variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce druhů, jiných než lidských (např. myších), ve kterých je ale nejméně část VH a/nebo VL sekvence změněna na více “lidskou”, t.j., více podobnou variabilním sekvencím lidské zárodečné linie. Jedním typem humanizované protilátky je protilátka s implantovanou CDR, ve které jsou lidské CDR sekvence zavedeny do jiných než lidských VH a VL sekvencí, aby nahradily odpovídající jiné než lidské CDR sekvence.

Jednou cestou měření kinetiky vazby protilátky je povrchová plasmonová rezonance. Termín “povrchová plazmonová rezonance”, jak je zde používán, označuje optický fenomén, který umožňuje analýzu biospecifických interakcí v reálném čase detekcí změn v koncentraci proteinu v matrici biosenzoru například použitím systému BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscaraway, NY). Další popis, viz Jónsson, U. Et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19 až 26; Jónsson, U. Et al. (1991) Biotechniques 11:620 až 627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125 až 131 a Johnnson, B., etal. (1991)Anal. Biiochem. 198:268 až 277.

Termín “K_Pff” , jak je zde použit, označuje rozpadovou rychlostní konstantu disociace protilátky z komplexu protilátka/antigen.

Termín “Kd” , jak je zde použit, označuje disociační konstantu jednotlivé interakce protilátka-antigen.

Duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu se připravují pomocí různých způsobů přípravy protilátek, které jsou popsány v odstavci II shora. Duálně specifické protilátky podle tohoto vynález mohou být směrovány proti zásadně libovolným strukturálně příbuzným antigenům, i když výhodné duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu jsou ty, které specificky váží IL-Ια a IL-Ιβ, které mohou být připraveny pomocí duálně specifických antigenů, jako jsou antigeny, popsané v příkladech 1 až 4. Jinými strukturně příbuznými antigeny, které mohou být použity v předkládaném vynálezu jsou, ale bez bez omezení na ně, členy rodiny caspázy, rodiny cytokinů, jako jsou členy rodiny IL-1 (např. ILl/IL-18), členy rodiny TNF (např. TNFa/TNFP), členy rodiny IL-6, interferony, členy rodiny TGFP, členy rodiny EGF, členy rodiny FGF, členy rodiny PDGF, členy rodiny VEGF, členy rodiny angiopoetinu, kostní morfogenní proteiny, vylučované proteázy (metalo-proteinázy) a • ·· tititi9 ♦ titi titi ti ti titititi ti • * titititi «·· ♦♦ titi rodiny receptorů cytokinu, jako jsou členy rodiny receptorů IIL-1, členy rodiny TNF receptorů, členy rodiny TGFP receptorů, členy rodiny EGF receptorů, členové rodiny receptorů FGF, členy rodiny PDGF receptorů, členy rodiny VEGF receptorů a členy rodiny receptorů angiopoetinu.

Duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu mohou vykazovat stejnou vazebnou aktivitu proti dvěma různým, ale strukturně příbuzným antigenům, ke kterým se váží nebo se může duálně specifická protilátka alternativně vázat přednostněji k jednomu ze dvou antigenů, ale nicméně stále má specifitu proti dvěma příbuzným antigenům ve srovnání s nepříbuznými antigeny. Vazebná aktivita duálně specifické protilátky proti strukturně příbuzným antigenům, rovněž jako proti nepříbuzným antigenům, může být odhadnuta pomocí standardních in vitro testů, jako jsou ELISA nebo BIAcore analýzy. Je výhodné, když poměr Ka protilátky proti strukturně nepříbuzným antigenům ke Kd protilátky proti strukturně příbuzným antigenům je nejméně 3, výhodnější, když je tento poměr nejméně 5 nebo když ještě výhodněji je tento poměr nejméně 10 nebo když ještě výhodněji je tento poměr nejméně 50,

100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 nebo 1000.

V kvantitativním vyjádření je jednou z měr rozdíl mezi vazbou pozadí a duální specifitou. Například, vazba pozadí je na nízké úrovni, např. méně než 5 %, výhodněji méně než 3 % a nejvýhodněji 0,1 až 1 %, zatímco specifická křížová reaktivita nebo duálně specifická vazba je na vyšší úrovni, např. vyšší než 1 %, výhodněji vyšší než 3 %, ještě výhodněji vyšší než 5 % a ještě výhodně vyšší než 10 %. Kromě toho je je IC50 duálně specifické protilátky vůči cílovému antigenu blízké hodnotě ED50 antigenů v daném biotestu.

Duálně specifická protilátka nebo její antigen vážící část podle tohoto vynálezu se výhodně vybere tak, aby měla požadovanou kinetiku vazby (např. vysokou afinitu, nízkou disociaci, pomalou rychlost rozpadu, silnou neutralizační aktivitu) vůči jednomu, výhodně vůči oběma antigenům, ke kterým se specificky váže. Například, duálně specifická protilátka nebo její část, může vázat jeden nebo výhodně oba strukturálně příbuzné antigeny s rychlostní konstantou koff 0,1 s'¹ nebo méně, výhodněji 1 x 10'² s'¹ nebo méně, výhodněji 1 x 10'³ s'¹ nebo méně, ještě výhodněji 1 x 10⁴ s'¹ nebo méně, ještě výhodněji 1 x 10'⁵ s¹ nebo méně, jak je určeno povrchovou plazmonovou rezonancí. Kromě toho nebo jinak, může duálně specifická protilátka nebo její část inhibovat aktivitu jednoho, výhodně obou strukturně příbuzných antigenů s hodnotou IC50 1 x 10 M nebo méně, ještě výhodněji s hodnotou IC50 1x10' M nebo méně, ještě výhodněji s hodnotou IC50 1 x 10'⁸M nebo méně, ještě výhodněji s hodnotou IC50 1 x 10'⁹M nebo méně, ještě výhodněji s hodnotou IC50 1 x 10'^I0M nebo méně, ještě výhodněji s hodnotou IC₅₀ 1 x 10'¹¹ M nebo méně. Je výhodné, když je IC50 měřeno pomocí

44 4» 4 • · · 4 4 · · · ♦ ··· *44 4

4 · · 4 ···· 4 · 44 444 •4 4444 citlivého biotestu, ve kterém by hodnoty IC50 mely být těsné k hodnotě ED50 antigenů v tomto testu.

Tento vynález rovněž poskytuje farmaceutické prostředky, obsahující duálně specifickou protilátku nebo její antigen vážící část podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu může dále obsahovat nejméně jedno doplňkové terapeutické činidlo, např. jedno nebo více doplňkových terapeutických činidel pro léčbu choroby, při které je použití duálně specifické protilátky užitečné pro zlepšení choroby. Například, pokud duálně specifická protilátka specificky váže IL-lot a IL-Ιβ, může farmaceutický prostředek dále obsahovat jedno nebo více terapeutických činidel pro léčbu chorob, na nichž se aktivita IL-1 škodlivě podílí.

Protilátky a jejich části podle tohoto vynálezu mohou být začleněny do farmaceutických prostředků, vhodných pro podání subjektu. Tyto farmaceutické prostředky většinou obsahují protilátku nebo její část podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Termín “farmaceuticky přijatelný nosič” jak je zde používán, obsahuje libovolná a všechna rozpouštědla, disperzní media, povlaky, antibakteriální a antiťungální činidla, izotonická čidla a činidla zpomalující absorpci a jim podobná, pokud jsou fyziologicky přijatelná. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů obsahují jednu nebo více látek jako, voda, fyziologický roztok, fosfátový fyziologický roztok, glukózu, glycerol, ethanol a jim podobné, rovněž jako jejich kombinace. V mnoha případech je výhodné, aby obsahovaly izotonická činidla například cukry, polyalkoholy, jako je mannitol, sorbitol nebo chlorid sodný. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou dále obsahovat menší množství pomocných substancí, jako jsou smáčecí nebo emulgační činidla, konzervace pufrů, které zvyšují poločas života účinnosti protilátky nebo části protilátky.

Protilátky a části protilátek podle tohoto vynálezu mohou být zabudovány do farmaceutických prostředků, vhodných pro parenterální podání. Je výhodné, když je protilátka nebo části protilátky připravena jako injekční roztok, obsahující 0,1 až 250 mg/ml protilátky. Tento injekční roztok může obsahovat buď kapalnou nebo lyofilizovanou lékovou formu v lékovkách z křemenného nebo hnědého skla, ampulích nebo předplněných injekčních stříkačkách. Pufr může být L-histidin (1 až 50 mM), optimálně 5 až 50 mM, při pH 5,0 až 7,0 (optimálně pH 6,0). Jiné vhodné pufry obsahují, ale bez omezení, natrium-sukcinát, natrium-citrát, natrium-fosfát nebo kalium-fosfát. Chlorid sodný může být použit pro změnu toxicity roztoku při koncentraci 0 až 300 mM (optimálně 150 mM pro kapalnou lékovou formu). Při lyofilizované lékové formě mohou být obsaženy kryoprotektanty, hlavně 0 až 10 % sacharózy (optimálně 0,5 až 1,0 %). Jinými vhodnými kryoprotektanty jsou trehalóza a laktóza.

• · · · · • · ···· ··

V lyofilizované lékové formě mohou být obsažena plnidla, hlavně 1 až 10 % mannitolu (optimálně 2 až 4 %). V kapalné i v lyofilizované lékové formě mohou být stabilizátory, hlavně 1 až 50 mM L-methioninu (optimálně 5 10 mM). Jinými vhodnými plnidly jsou glycin, arginin, v množství 0 až 0,05 % může být obsažen polysorbát-80 (optimálně 0,005 až 0,01 %). Doplňkovými povrchově aktivními látkami mohou být, ale bez omezení, polysorbát 20 a BRIJ.

Prostředky podle tohoto vynálezu mohou být v různých formách. Těmito formami jsou například kapalné, polotuhé a tuhé lékové formy, jako jsou kapalné roztoky (např. injekční a infuzní roztoky), disperze nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, lipozomy a čípky.

Výhodná léková forma závisí na zamýšleném způsobu podání a terapeutické aplikaci. Typické výhodné prostředky jsou ve formě injekčních nebo infuzních roztoků, jako jsou prostředky podobné těm, které jsou použity při pasivní imunizaci člověka jinými protilátkami. Výhodným způsobem podání je parenterální (např. intravenózní, subkutánní, intraperitoneální, intramuskulární). Ve výhodném provedení je protilátka podána intravenózní injekcí nebo infuzí.

V jiném výhodném provedení je protilátka podána intramuskulární nebo subkutánní injekcí.

Terapeutické prostředky musí být sterilní a stabilní za podmínek výroby a skladování. Prostředek musí být formulován jako roztok, mikroemulze, disperze, liposom nebo jiný požadovaná struktura, vhodná pro vysokou koncentraci léčiva. Sterilní injekční roztoky mohou být připraveny zabudováním aktivní sloučeniny (tj. protilátky nebo části protilátky) v potřebném množství ve vhodném rozpouštědle s jednou nebo dle potřeby s více shora uvedenými složkami, následovaným sterilní filtrací. Disperze jsou obecně připraveny začleněním aktivní sloučeniny do sterilního rozpouštědla, které obsahuje základní disperzní medium a jiné potřebné složky, patřící do shora uvedených. V případě sterilních, lyofilizovaných prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků jsou výhodnými způsoby přípravy vakuové sušení a sušení rozprachem, které poskytují prášek aktivní substance a libovolnou doplňkovou požadovanou složku z jejich předběžně sterilně filtrovaných roztoků. Vlastní fluidita roztoku může být udržena například použitím povlaků, jako je lecitin, udržením potřebné velikosti části v případě disperze a při použití smáčedel. Prolongovaná absorpce injektovatelných prostředků může být dosažena začleněním takového činidla do prostředku, které zpomaluje absorbci, například soli monostearátu a želatina.

Protilátky a části protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být podávány různými způsoby, známými v této oblasti techniky, i když pro mnohé terapeutické aplikace je výhodnou cestou/způsobem podání subkutánní injekce, intravenózní injekce nebo infuze. Odborník na tomto poli techniky snadno pochopí, že cesta a/nebo způsob podání se budou měnit v závislosti na požadovaných výsledcích. V určitých provedeních může být ·« ·· ·· 9 ·© ····

9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 9999 9 • · 9 · 9 · · 9 ·

9999 99 99 999 99 99 aktivní sloučenina připravena s nosičem, který chrání tuto sloučeninu před rychlým uvolněním, jako tomu je v případě formulace pro kontrolované uvolňování, včetně implantů, transdermálních náplastí a způsobu dodávky systémy mikrozapouzdření. Mohou být použity biologicky odbouratelné a kompatibilní polymery, jako je ethylen(vinyl)acetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná. Mnohé způsoby pro přípravu těchto formulaci jsou patentovány a nebo obecně známy odborníkům v této oblasti techniky. Viz, např. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Fobilnson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

V určitých provedeních mohou být protilátky nebo jejich části podány orálně například s inertním rozpouštědlem nebo asimilovatelným jedlým nosičem. Sloučenina (a jiné složky, pokud jsou třeba) mohou být také obsaženy v tvrdé nebo měkké želatinové kapsli, lisovány do tablet nebo začleněny přímo do diety subjektu. Pro orální terapeutické podání může být sloučenina obsažena v plnidlu a použita ve formě tablet, nasálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek a jim podobných. Pro podání sloučeniny podle tohoto vynálezu jiným než parenterálním podáním může být nutné sloučeninu povléci nebo podávat s materiálem, který zabrání inaktivaci sloučeniny.

Do prostředků mohou být také začleněny doplňkové aktivní sloučeniny.

V určitých provedeních může být protilátka podle tohoto vynálezu nebo její část formulována společně a/nebo podávána s jedním nebo více doplňkovými terapeutickými činidly, která jsou použitelná pro léčbu chorob, v nichž se aktivita IL-1 negativně účastní. Například duálně specifické protilátky proti IL-loc/IL-Ιβ nebo jejich části mohou být společně formulovány a/nebo podávány s jednou nebo více protilátkami, které se váží na jiné cíle (např. protilátky, které váží jiné cytokiny, nebo které váží molekuly na buněčném povrchu). Kromě toho může být jedna nebo více protilátek podle tohoto vynálezu použita v kombinaci s jedním nebo více předcházejícími terapeutickými činidly. Takovéto kombinační terapie mohou s výhodou využívat nízké dávky podávaných terapeutických činidel a tedy odstraňovat nežádoucí možné toxicity nebo komplikace, spojené s různými monoterapiemi.

IV. Použití duálně specifických protilátek

Vzhledem k jejich schopnosti vázat se na dvě různé, ale strukturně příbuzné antigeny, jsou duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich části použity pro detekci buď jednoho nebo obou antigenů (např. v biologických vzorcích, jako je sérum nebo plasma), použitím konvenčního imunologického testu, jako je ELIS A (enzyme linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay) nebo tkáňová imunohistochemie. Tento ·* ♦* ·· * ·» ···· «·«· 4 4 44 9 4 * • · · ··« · · <· • «·« 4 4 4 4944 4

4 4 4 4 4 4 4 4

9444 44 44 444 ·· ·· vynález poskytuje způsob detekce antigenu v biologickém vzorku, který obsahuje kontakt tohoto biologického vzorku s duálně specifickou protilátkou podle tohoto vynálezu nebo její částí, která specificky rozpoznává antigen a detekuje buď protilátku (nebo protilátkovou část) vázanou na antigen nebo nenavázanou protilátku (nebo její část), čímž je detekován antigen v biologickém vzorku. Protilátka je přímo nebo nepřímo označena detekovatelnou substancí, aby byla usnadněna detekce vázané nebo nevázané protilátky. Vhodnými detekovatelnými látkami jsou různé enzymy, prostetické skupiny, fluorescenční materiály, luminiscenční materiály a radioaktivní materiály. Příklady vhodných enzymů obsahují křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, β-galaktozidázu nebo acetylcholinesterázu; příklady vhodných komplexů prostetických skupin obsahují streptavidin/biotin a avidin/biotin; příklady vhodných fluorescenčních materiálů obsahují umbelliferon, fluorescein isothiokyanát, rhodamin, dichlorotriazinylaminfluorescein, dansylchlorid nebo fykoerythrin; příkladem luminiscenčního materiálu může být luminol a příklady vhodných radioaktivních materiálů jsou ¹²⁵I, ¹³¹I,³⁵S nebo 3^h.

Alternativně ke značení protilátky může být antigen (antigeny) testován v biologických tekutinách pomocí kompetice radioimunního testu, který používá antigenní standardy značené detekovatelnou látkou a neznačenou duálně specifickou protilátku, specifickou vůči tomuto antigenu (antigenům). V tomto testu se smísí biologický vzorek, značené antigenní standardy a duálně specifická protilátka a určuje se množství značeného antigenního standardu, které je navázáno na neznačenou protilátku. Toto množství antigenu v biologickém vzorku je nepřímo úměrné množství značeného antigenního standardu, vázané na neznačenou protilátku.

Ve výhodném provedení rozpoznává duálně specifická protilátka IL-Ια a IL-Ιβ a předcházející detekční způsoby jsou použity pro detekci IL-Ια a/nebo IL-Ιβ. V souhlase s tím poskytuje předkládaný vynález způsob detekce IL-Ια nebo IL-Ιβ v biologickém vzorku nebo tkáni, který obsahuje kontakt biologického vzorku nebo tkáně, u kterých očekáváme obsah IL-Ια nebo IL-Ιβ, s duálně specifickou protilátkou podle tohoto vynálezu nebo její částí a detekci IL-lot nebo IL-Ιβ v biologické tkáni nebo vzorku. Tímto biologickým vzorkem může být například vzorek in vitro, jako jsou vzorky buněk, tkání nebo tělní tekutiny (např. krev, plasma, moč, mok, atd.). kromě toho mohou být detekovány tkáně, které jsou umístěny in vivo v subjektu, např. tkáně vizualizované in vivo zobrazením tkáně (např. použitím značené protilátky).

Duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu mohou být také použity pro diagnostické účely. V jednom provedení je protilátka podle tohoto vynálezu použita

·· ·*	··	•	··		····
• · · ·	• *	··	•	•	•
• ···	♦ · ·	•	• ·	•	*
• ·	• ·		•	•	• ·
···· ··	··	···	··		··

v diagnostickém testu in vitro, jako v laboratorním testu detekce zájmového antigenu (antigenů) nebo v případě potřeby testu detekce zájmového antigenu (antigenů). Příklady dobře zavedených in vitro testů obsahují ELISA, RIA, Westernův přenos a jim podobné. V jiném provedení je protilátka podle tohoto vynálezu použita v laboratorním testu in vivo, jako je in vivo zobrazovací test. Například, může být protilátka označena detekovatelnou látkou, schopnou detekce in vivo, značená protilátka může být podána subjektu a tato značená protilátka může být detekována in vivo, čímž je umožněno zobrazení in vivo.

Duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu, které specificky rozpoznávají IL-Ια a IL-Ιβ, mohou být použity v diagnostických testech pro detekci IL-Ια a IL-Ιβ pro diagnostické účely například při různých zánětlivých chorobách a poruchách, rovněž jako při spontánní resorpci plodů. S ohledem na specifické typy nemocí a poruch mohou být duálně specifické IL-Ια a IL-Ιβ protilátky podle tohoto vynálezu použity pro diagnostické účely v kterékoliv ze zde popsaných nemocí/poruch s ohledem na terapeutická použití těchto protilátek (viz níže), jako jsou poruchy, ve kterých je aktivita IL-1 škodlivá, jak je diskutováno níže.

Duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu a jejich části jsou s výhodou schopny neutralizace, jak in vivo, tak in vitro, aktivity antigenu, ke kterému se váží. Protilátky podle tohoto vynálezu a jejich části mohou být v souhlase s tím použity pro inhibici aktivity antigenů, např. v buněčných kulturách, obsahujících antigeny nebo v lidských subjektech nebo v jiných savčích objektech, které mají antigeny, se kterými duálně specifická protilátka podle tohoto vynálezu reaguje. V jednom provedení poskytuje vynález způsob inhibice aktivity antigenu, který zahrnuje kontakt tohoto antigenu s duálně specifickou protilátkou podle tohoto vynálezu nebo její částí, takže je aktivita antigenu inhibována. Ve výhodném provedení váže duálně specifická protilátka EL-la a IL-Ιβ a tento způsob je způsobem inhibice aktivity IL-1 a a/nebo IL-Ιβ kontaktováním IL-1 a a/nebo IL-Ιβ s duálně specifickou protilátkou nebo s její částí. Aktivita IL-1 a a/nebo IL-Ιβ může být inhibována například in vitro. Například, v případě buněčných kultur, které obsahují nebo u kterých je očekávána přítomnost IL-Ια a/nebo IL-Ιβ, může být protilátka podle tohoto vynálezu nebo její část přidána do kultivačního media, aby byla inhibována aktivita IL-1 a a/nebo IL-Ιβ v kultuře. Aktivita IL-1 a a/nebo aktivita IL-Ιβ může být inhibována in vivo v subjektu.

V jiném provedení poskytuje tento vynález způsob inhibice aktivity antigenu v subjektu, který trpí chorobou, ve které se škodlivě účastní aktivita antigenu. Vynález poskytuje způsoby pro inhibování aktivity antigenu v subjektu, trpícím takovouto chorobou a tento způsob obsahuje podávání duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu nebo její části ·· ·♦ ·· · ······ ···· ···· · · · • · · · · · ··· • · · · · © · · · · · · • ···· · · φ · ···· ·· ·· ··· ·· tt subjektu, takže je aktivita antigenu v tomto subjektu inhibována. Je výhodné, když tímto antigenem je lidský antigen a subjektem je lidský subjekt. Protilátka podle tohoto vynálezu může být podána lidskému subjektu pro terapeutické účely. Kromě toho může být protilátka podle tohoto vynálezu podána jinému než lidskému savci, exprimujícímu antigen, se kterým se tato protilátka váže, pro veterinární účely nebo jako živočišnému modelu lidské choroby. S ohledem na posledně uvedené skutečnosti mohou být takové živočišné modely použitelné pro vyhodnocení terapeutické účinnosti protilátek podle tohoto vynálezu (např. testování dávek a časový průběh podávání).

Je výhodné, když duálně specifická protilátka váže EL-la a IL-Ιβ a způsob inhibice aktivity antigenu v subjektu je způsobem inhibice aktivity IL-1 v subjektu, například v subjektu, trpícím chorobou, na níž aktivita IL-1 škodlivě působí. Jak je zde používán, označuje termín “choroba, v níž je aktivita IL-1 škodlivá” choroby a jiné poruchy, ve kterých je přítomnost IL-1 (která obsahuje IL-Ια I IL-Ιβ) v subjektu, trpícím touto chorobou, nalezena jako odpovědná nebo jako podezřelá z odpovědnosti za pathoíyziologii této choroby nebo faktor, který přispívá ke zhoršení této choroby. V souhlase s tím je choroba, ve které je aktivita IL-1 škodlivá, chorobou, u které je očekáváno, že inhibice aktivity IL-1 (t.j., buď jedné nebo obou IL-1 α I IL-Ιβ) zmírní příznaky a/nebo vývoj choroby. Důkazem těchto chorob je například zvýšení koncentrace EL-1 v biologické tekutině subjektu, trpícího touto chorobou (např. zvýšení koncentrace IL-1 v séru, plasmě, synoviální tekutině, atd. subjektu), které může být detekováno, např. použitím anti-IL-1 protilátky, jak je popsáno shora.

Interleukin 1 se rozhodujícím způsobem účastní pathologie mnoha chorob, spojených s imunitními a zánětlivými prvky. Těmito chorobami jsou, ale bez omezení na ně, rheumatoidní arthritida, osteoarthritida, juvenilní chronická arthritida, lymská arthritida, psoriatická arthritida, reaktivní arthritida, spondyloarthropathie, systemický lupus erythematosus, Crohnova choroba, ulcerativní kolitida, zánětlivá střevní choroba, insulin dependentní diabetes mellitus, thyroiditis, asthma, alergické choroby, psoriasis, dermatitis skleroderma, reakce hostitel transplantát, odmítnutí transplantovaných orgánů, akutní chronická imunitní choroba spojená s orgánovou transplantací, sarcoidosis, atherosclerosis, rozesetá intravaskulární koagulace, Kawasakiho choroba, Gravesova choroba, nefrotický syndrom, chronický únavový syndrom, Wegenerova granulomatosis, Henoch-Schoenleinova purpurea, microskopická vasculitida ledvin, chronická aktivní hepatitida, uveitis, septický šok, toxický šokový syndrom, septický syndrom, kachexie, infekční choroby, parasitické choroby, AIDS, akutní transversní myelitis, Huntingtonova chorea, Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, mrtvice, primární biliární cirrhosa, hemolytická anemie, zhoubné choroby, srdeční

selhání, infarkt myokardu, Addisonova choroba, sporadická, polyglandulární deficience typu I a polyglandulární deficience typu II, Schmidtův syndrom, adultní (akutní) respirační bolestivý syndrom, alopecie, alopecia areata, seronegativní arthopathie, arthropathie, Reiterova choroba, psoriatická arthropathie, ulcerativní kolitivní arthropathie, enteropathická synovitis, arthropathie spojená s chlamydia, yersinia a salmonella, spondyloarthropathie, atheromatosní choroba/arteriosclerosis, atopické alergie, autoimmunitní bullosní choroba, pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, pemphigoid, lineární IgA choroba, autoimmuní haemolytická anaemie, Coombsova positivní haemolytická anaemie, získaná perniciosní anaemie, juvenilní perniciosní anaemie, myalgická encephalitis/Royal Free choroba, chronická mukokutánní candidiasis, artritis obřích buněk, primární sklerotizující hepatitis, kryptogenní autoimmuní hepatitis, AIDS, AIDS příbuzné choroby, hepatitis C, obecná variabilní immunodeficience (obecná variabilní hypogammaglobulinaemie), dilatovaná kardiomyopathie, ženská neplodnost, poruchy vaječníků, předčasné poruchy vaječníků, fibrotická plicní choroba, kryptogenní fibrosní alveolitis, pozánětlivá vmezeřená plicní choroba, intersticiální pneumonitida, choroba pojivových tkání spojená s vmezeřenou plicní chorobou, smíšená choroba pojivových tkání spojená s vmezeřenou plicní chorobou, systemická sklerosis spojená s plicní chorobou, rheumatoidní arthritis spojená s plicní chorobou, systemický lupus erythematosus spojený s vmezeřenou spojený s plicní chorobou, dermatomyositis/polymyositis spojený s plicní chorobou , Sjógrenova choroba spojený s plicní chorobou, ankylosní spondylitida spojená s plicní chorobou, vasculitidní difuzní plicní choroba, haemosiderosis spojená s plicní chorobou, léčivy indukovaná intersticiální plicní choroba, radiační fibrosis, bronchiolitis obliterans, chronická eosinofilní pneumonie, lymphocytární infiltrační plicní choroba, postinfekční intersticiální plicní choroba, dnová arthritis, autoimunitní hepatitis, typu-1 autoimunitní hepatitis (klasická autoimunitní nebo lupoid hepatitis), typu-2 autoimunitní hepatitis (anti-LKM protilátková hepatitis), autoimunitně zprostředkovaná hypoglykémie, typu B insulin resistence s acanthosis nigricans, hypoparathyroidismus, akutní imunní choroba spojená s orgánovou transplantací, osteoarthrosis, primární sklerotizující cholangitis, psoriasis typu 1, psoriasis typu 2, idiopathická leukopaenie, autoimunitní neutropaenie, ledvinové choroby NOS, glomerulonephritida, mikroscopická vaskulitida ledvin, lymská choroba, diskoidní lupus erythematosus, mužská idiopathická neplodnost nebo NOS, spermální autoimunita, sklerosis multiplex (všechny podtypy), sympathetická ophthalmie, pulmonarní hypertense sekundární k chorobě vazivových tkání, Goodpastureův syndrom, pulmonární manifestace polyarteritis nodosa, akutní rheumatická horečka, rheumatoid spondylitis, Stillova choroba, systemická sklerosis, Sjorgrenův syndrom, Takayasuova choroba/arteritis, autoimunitní • · · · ·· · ······ • · · · · · · · e · · gr ······ · · *

JO · ··· ··· ···· · • · · · · ·€·· ···· ·· ·· *· ·· thrombocytopaenie, idiopathická thrombocytopaenie, autoimunitní thyroidní choroba, hyperthyroidism, dnový autoimunitní hypothyroidismus (Hashimotova choroba), atrofický autoimunitní hypothyroidismus, primární myxoedem, phacogenní uveitis, primární vasculitis, vitiligo, choroby centrálního nervového systému (např. deprese, schizofrenie, Alzheimer, Parkinson, atd.), akutní a chronická bolest a lipidová nerovnováha. Lidské protilátky podle tohoto vynálezu ajejich části mohou být použity pro léčbu lidí, trpících nemocemi autoimunity, hlavně těmi, které jsou spojeny se zánětem, včetně reumatoidní spondylitis, alergie, autoimunitního diabetů, a autoimunitní uveitidy.

EL-lct/IL-Ιβ duálně specifické protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části jsou s výhodou použity pro léčbu reumatické artritidy, Crohnovy choroby, sklerosy multiplex, na inzulínu závislého diabetů a psoriázy.

IL-la/IL-Ιβ duálně specifická protilátka podle tohoto vynálezu nebo její část mohou být také podány s jedním nebo více doplňkovými terapeutickými činidly, použitelnými v léčbě autoimunitních a zánětlivých chorob.

Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být použity samy nebo v kombinaci pro léčbu těchto chorob. Je třeba si uvědomit, že protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být použity samy nebo v kombinaci s doplňkovým činidlem, např. terapeutickým činidlem, když uvedené doplňkové činidlo je vybráno vyškoleným odborníkem podle zamýšleného použití. Toto doplňkové činidlo může být například terapeutické činidlo odborně určené jako užitečné pro léčbu choroby nebo stavu, který je léčen protilátkou podle předkládaného vynálezu. Tímto doplňkovým činidlem může být také činidlo, které propůjčuje terapeutickému prostředku prospěšné vlastnost, např. činidlo, které ovlivňuje viskozitu prostředku.

Rovněž je třeba si uvědomit, že ty kombinace, které jsou obsaženy v tomto vynálezu, jsou kombinacemi použitelnými pro jejich zamýšlené použití. Dále uvedená činidla jsou myšlena jako ilustrativní a nejsou myšlena jako omezení. Kombinacemi, které jsou tohoto vynálezu, mohou být protilátky podle předkládaného vynálezu a nejméně jedno dodatečné činidlo, např. dvě nebo tři doplňková činidla, jestliže tato kombinace v takto vzniklém prostředku může splnit zamýšlený účel.

Výhodnými kombinacemi jsou nesteroidní protizánětlivá léčiva (léčivo), také označovaná jako NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drug(s)), mezi které patří léčiva podobná ibuprofenu, a COX-2 inhibitory. Jinými výhodnými kombinacemi jsou kortikosteroidy, včetně prednisolonu; dobře známé vedlejší účinky použití steroidů mohou být redukovány nebo zcela vyloučeny snížením dávky steroidů, potřebné pro léčbu pacienta, v • · « · • · · · β

« · ·

kombinaci s protilátkami anti-IL-1 podle tohoto vynálezu. Neomezující příklady terapeutických činidel proti reumatické artritidě, se kterými může být protilátka podle tohoto vynálezu nebo její část kombinována, jsou následující: cytokin supresivní protizánětlivé léčivo (léčiva) (CSAID; protilátky nebo antagonisté proti lidským cytokinům nebo růstovým faktorům, např. TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, EL-18, EMAP-II, GM-GSF, FGF a PGDF. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být kombinovány s protilátkami proti molekulám buněčného povrchu, jako jsou CD2, CD3, CD4, D8, CD25,

CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7,l), CD86 (B7,2), CD90 nebo jejich ligandy, včetně CD 154 (gp39 nebo CD40L).

Výhodné kombinace terapeutických činidel mohou interferovat na různých místech autoimunitní a následně zánětlivé kaskády; výhodnými příklady jsou včetně antagonistů TNF, jako jsou chimérické, humanizované nebo humánní TNF protilátky, D2E7, (PCT publikace č. WO 97/29 131), CA2 (Remicade™), CDP 571, CDP 870, Thalimid a rozpustné p55 nebo p75 TNF receptory, jejich deriváty, (p75TNFRgG (Enbrel™) nebo p55TNFRlgG (Lenercept) a také inhibitory TNFa konvertujícího enzymu (TÁCE); podobně IL-1 inhibitory (inhibitory interleukin-l-konvertujícíh enzymu, IL-1RA atd.), mohou být účinné ze stejného důvodu. Jiné výhodné kombinace obsahují interleukin 11. Dalšími důležitými účastníky autoimunitní odpovědi, kteří mohou paralelně účinkovat, jsou další výhodné kombinace, závislé na nebo ve shodě s funkcí IL-1; zvláště výhodnými jsou antagonisté IL-12 a/nebo IL-18, včetně protilátek IL-12 a/nebo IL-18 nebo rozpustné receptory IL-121 a/nebo IL-18 nebo proteiny vážící IL-12 a/nebo IL-18. Bylo zjištěno, že IL-12 a IL-18 mají překrývající se, ale odlišné funkce a kombinace jejich antagonistů může být nejúčinnější. Ještě další výhodnou kombinací jsou nevyčerpané anti-VD4 inhibitory. Ještě dalšími výhodnými inhibitory jsou antagonisté kostimulační dráhy (B7,l) nebo CD86 (B7,2), včetně protilátek, rozpustných receptorů nebo antagonických ligandů.

Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být rovněž kombinovány s činidly jako je methotrexát, 6-MP, azathioprin sulfasalazin, mesalazin, olsalazin chlorochinin/hydroxychlorochin, penicillamin, aurothiomalát (intramuskulárně nebo orálně), azathioprin, kochicin, kortikosteroidy (orálně, inhalačně a lokální injekcí), agonisté β-2 adrenoreceptoru (salbutamol, terbutalin, salmeteral), xanthiny (theofyllin, aminofyllin), kromoglykát, nedokromil, ketofmen, ipraropium a oxitropium, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID například ibuprofen, kortikosteroidy, jako prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adensoninu, antitrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergní činidla, činidla, která interferují se signalizací prozánětlivými · ······ ···« · • · · · · «·«· ·**« · · · · · ·» *· φ» cytokiny, tak jako TNFa nebo IL-1 (např. IRÁK, NIK, IKK, p38n nebo inhibitory MAP kinázy), inhibitory EL-1 β konvertujícího enzymu, inhibitory TNFa konvertujícího enzymu (TÁCE), inhibitory signalizace T-buněk, jako jsou inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulsalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu, rozpustné receptory cytokinu a jejich deriváty (např. rozpustné receptory p55 nebo p75 TNF a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)) sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) a protizánětlivé cytokiny (např. IL-4, IL-10, IIL-11, IL-13 aTGFp. Výhodné kombinace obsahují methotrexát nebo leflunomíd a při mírných nebo úporných případech reumatické artritidy cyklosporin.

Neomezujícími příklady terapeutických činidel pro střevní zánětlivou chorobu, se kterou může být protilátka podle tohoto vynálezu nebo její část kombinována, jsou následující: budenosid; epidermální růstový faktor; kortikosteroidy; cyklosporin, sulfalazin;

aminosalicyláty; 6-merkaptopurin; azathioprin; metronidazol; inhibitory lipoxygenázy; mesalamin; olsalazin; balsalazid; antioxidanty; inhibitory tromboxanu; antagonisté EL-1 receptorů; monoklonální protilátky anti-IL-Ιβ; monoklonální protilátky anti-IL-6; růstové faktory; inhibitory elastázy; pyridinyl-imidazolové sloučeniny; protilátky nebo antagonisté proti jiným lidským cytokinům nebo růstovým faktorům; například, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, EL-12, IL-15, IL-16, IEL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF aPGDF. Protilátky podle tohoto vynálezu mohou být kombinovány s protilátkami vůči molekulám buněčného povrchu, jako jsou CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 nebo jejich ligandům. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být rovněž kombinovány s činidly, jako methotrexát, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAED, například ibuprofen, kortikosteroidy, jako prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adensoninu, antitrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergní činidla, činidla, která interferují se signalizací prozánětlivými cytokiny, tak jako TNFa nebo IL-1 (např. IRÁK, NIK, IKK, p38n nebo inhibitory MAP kinázy), inhibitory IL1β konvertujícího enzymu, inhibitory TNFa konvertujícího enzymu (TÁCE), inhibitory signalizace T-buněk, jako jsou inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulsalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu, rozpustné receptory cytokinu a jejich deriváty (např. rozpustné receptory p55 nebo p75 TNF a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) a protizánětlivé cytokiny (např. IL-4, IL-10, IIL-11, IL-13 a ΤΟΡβ.

Výhodné příklady terapeutických činidel proti Crohnově chorobě, ve kterých může být protilátka nebo její antigen vážící část kombinována, jsou včetně následujících: TNF • ·

antagonisté například anti-TNF protilátky, D2E7 (PCT publikace č. WO 97/29 131), CA2 (Remicade™), CDP 571, TNFR-Ig konstrukty, (p75NFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)) inhibitory a inhibitory PDE4. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být kombinovány s kortikosteroidy například budenosidem a dexamethasonem. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být také kombinovány s činidly, jako je sulfalasin, kyselina 5-aminosalicylová a olsalasin a činidla, která interferují se syntézou nebo účinkem prozánětlivých cytokinů, jako jsou IL-1 například inhibitory konvertující EL-Ιβ a EL-Ira. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící část mohou být také použity s inhibitory signalizace T-buňkami například 6-merkaptopuriny, inhibitory tyrosin kinázy. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být kombinovány s IL-11.

Neomezující příklady terapeutických činidel proti sclerosis multiplex, která mohou být kombinována, obsahují následující: kortikosteroidy; prednisolon; methylprednisolon; azathioprin; cyklofosfamid; cyklosporin; methotrexát; 4-aminopyridin; tizanidin; interferon-pia (Avonex; Biogen); interferon-pib (Betaseron; Chiron/Berlex); Kopolymer 1 (Cop-1;

Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, lne.); hyperbarický kyslík; intravenózní imunoglobulin; klabrinin; protilátky nebo antagonisté jiných lidských cytokinů nebo růstových faktorů například TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, EL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PGDF. Protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich antigen vážící části mohou být kombinovány s protilátkami proti molekulám buněčného povrchu, jako jsou CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 nebo jejich ligandy. Protilátky nebo jejich antigen vážící části mohou být kombinovány s činidly, jako je methotrexát, cyklosporin, FK506, rapamycin, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID například ibuprofen, kortikosteroidy, jako prednisolon, inhibitory fosfodiesterázy, agonisté adensoninu, antitrombotická činidla, inhibitory komplementu, adrenergní činidla, činidla, která interferují se signalizací prozánětlivými cytokiny, tak jako TNFa nebo IL-1 (např. BRAK, NIK, IKK, p38n nebo inhibitory MAP kinázy), inhibitory IL-1 β konvertujícího enzymu, inhibitory TNFa konvertujícího enzymu (TÁCE), inhibitory signalizace T-buněk, jako jsou inhibitory kinázy, inhibitory metaloproteinázy, sulsalazin, azathioprin, 6-merkaptopuriny, inhibitory angiotensin konvertujícího enzymu, rozpustné receptory cytokinů a jejich deriváty (např. rozpustné receptory p55 nebo p75 TNF a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)), sEL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) a protizánětlivé cytokiny (např. IL-4, IL-10, IIL-11, IL-13 aTGFp.

• Φ «· · ·» • · · · ΦΦΦΦ · «4 9 » ··*«· · · * * < * • 9 9 9 9 9 9 9 9 •ΦμΦ.Φ 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

Výhodné příklady terapeutických činidel proti sclerosis multiplex, ve kterých může být kombinována protilátka nebo její antigen vážící část, obsahují interferon-β například ΙΕΝβΙδ a IF^la; copaxon; kortikosteroidy; inhibitory EL-1, inhibitory TNF a protilátky proti ligandům CD40 a CD80.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat „terapeuticky účinné množství“ nebo „profylakticky účinné množství“ protilátky podle tohoto vynálezu nebo její části. „Terapeuticky účinné množství“ označuje množství, které je účinné v dávkách a časové periodě, nezbytné pro dosažení požadovaného terapeutického výsledku. Terapeutické účinné množství protilátky nebo její části se může měnit v závislosti na faktorech, jako je stav choroby, věk, pohlaví a hmotnost individua a schopnost protilátky nebo její části vyvolat požadovanou odpověď v jedinci. Terapeuticky účinné množství je také množství, ve kterém jsou škodlivé nebo toxické účinky protilátky nebo její části vyváženy terapeuticky prospěšnými účinky. „Profylakticky účinné množství“ označuje množství, účinné v dávkách a časových periodách, které je nezbytné pro dosažení požadovaného profylaktického účinku. Protože profylaktická dávka je používána v subjektech před nebo časnějších stadiích nemoci, je obvykle profylaktické účinné množství menší než terapeutické účinné množství.

Dávkové režimy mají být nastaveny tak, aby bylo dosaženo optimální požadované odpovědi (např. terapeutické nebo profylaktické odpovědi). Může být například podána jednoduchá dávka, několik oddělených dávek v průběhu času nebo může být dávka úměrně snížena nebo zvýšena, jak se jeví potřeba terapeutické situace. Pro snadnost podání a uniformitu dávek je obzvláště výhodné formulovat parenterální prostředky ve formě dávkových jednotek. Dávkovou jednotkou jsou zde myšleny diskrétní jednotky, vhodné jako jednotková množství pro savčí subjekty, které mají být léčeny; každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivní sloučeniny, vypočítané tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku ve spojení s potřebným terapeutickým nosičem. Specifikace pro formy dávkových jednotek podle tohoto vynálezu jsou diktovány a přímo závislé na jedinečných charakteristikách aktivní sloučeniny a hlavním terapeutickém nebo profylaktickém účinku, který má být dosažen a na omezeních obsažených v technice použití takovéto aktivní sloučeniny pro léčbu senzitivity v jedincích.

Exemplární, neomezující rozsah terapeuticky nebo profylakticky účinného množství protilátky podle tohoto vynálezu nebo její části je 0,1 až 20 mg/kg, výhodněji 1 až 10 mg/kg. Je třeba poznamenat, že hodnoty dávek se mohou měnit s typem a s úporností stavu, který má být zlepšen. Je třeba také dále rozumět, že pro kterýkoliv jednotlivý subjekt je třeba dávkový režim nastavit na dobu podle individuální potřeby a profesionálního posouzení osoby, která podává nebo dohlíží na podávání prostředků, a že zde uvedené dávkové režimy jsou pouze příkladem a nejsou zamýšleny jako jakákoliv omezení rozsahu nebo použití patentově nárokovaných prostředků.

Předkládaný vynález je dále ilustrován na následujícíchpříkladech, které nejsou myšleny jako jakékoliov omezení. Obsahy všech citovaných referencí, včetně literárních referencí, publikovaných patentů a publikovaných patentových přihlášek, citovaných v této přihlášce, jsou tímto výslovně začleněny citací.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Sestrojení duálně specifického antigenů, založené na styčné topologické oblasti identity

V tomto příkladu byla největší styčná topologická oblast identity mezi dvěma různými, ale strukturně příbuznými proteiny, EL-Ια a IL-Ιβ, určena jako základ pro sestrojení duálně specifického antigenů pro vypěstování duálně specifických protilátek vůči IL-1 a a IL-1β. Byl použit BLAST algoritmus pro srovnání těchto dvou proteinů, který umožnil změřit tendenci jednoho zbytku nahrazovat jiný zbytek ve strukturně nebo funkčně podobných oblastech. Tato analýza umožnila identifikaci největší styčné topologické oblasti identity mezi IL-1 a a EL-Ιβ a rozšíření této oblasti s libovolným rozsahem podobnosti pro vytvoření lineárního peptidu, který slouží jako duálně specifický antigen. Tento peptid, který nejlépe odpovídá daným kriteriím, má následující aminokyselinovou sekvenci:

NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1)

Hvězdička (*) označuje identické zbytky v obou proteinech. Ostatní zbytky jsou velmi podobné, podle BLAST algoritmu. Například lysin bude často nahrazovat v homologických proteinech arginin, ale ne fenylalanin. Peptid podle SEQ ID NO: 1 je hybridem, vzniklým ze dvou různých úseků struktury, které probíhají v opačném směru, takže odpovídajícím zobrazením tohoto epitopu je:

dNdEdAdQNITDF, (kde předpona „d“ oznamuje, že daný aminokyselinový zbytek je zbytkem D aminokyseliny).

Aminokyselinová L forma tohoto peptidu i jeho verze, která je částečně substituována D « · • · · · • · · • · fc fc · · · fc aminokyselinovými zbytky, jsou syntetizovány standardními chemickými způsoby. Tento peptid je potom konjugován s proteinovým nosičem (např. KLH nebo albumin) a konjugovaný peptid je použit pro selekci protilátek způsoby in vitronebo in vivo.

Příklad 2: Sestrojení duálně specifického antigenu, založené na cyklickém peptidu, který napodobuje smyčku společné nativní struktury

V tomto příkladu byl cyklický peptid, který strukturálně napodobuje hlavní smyčku společné nativní struktury u dvou různých, ale strukturně příbuzných proteinů. IL-Ία a IL-1 β, konstruován pro použití jako duálně specifický antigen pro vypěstování duálně specifických protilátek proti EL-Ια a IL-Ιβ. Tato vybraná smyčka reprezentuje zbytky 168 až 184 od IL-lot a zbytky 160 až 176 od IL-Ιβ. Dohodnutá sekvence je:

Cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) *cbcccccccc**c*b* (SEQ ID NO: 2)

Hvězdička (*) označuje identické zbytky mezi IL-Ία a IA-Ιβ, c označuje dohodnuté zbytky, tj. zbytky, podobné IL-Ία a IL-Ιβ, které ale ve skutečnosti nejsou v této poloze přítomny ani v jednom proteinu, a b označuje, že zde není žádný dohodnutý zbytek, pokud byla zachována sekvenční identita IL-Ιβ. Tento lineární peptid je syntetizován standardními chemickými způsoby. Pro cyklizaci peptidu jsou přidány prolinové a glycinové zbytky. Tento cyklický peptid může být syntetizován použitím standardních podmínek syntézy za vysokého ředění v N,N-(dimethyl)formamidu (1 mg/ml). Prototypové reakce probíhají při teplotě místnosti za použití nadbytku spojovacího činidla, jako je benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-fosfonium-hexaflurofosfát (PyBOP; 2 moly) a hydrouhličitan sodný (10 molů).Tento peptid je konugován k proteinovému nosiči (např. KLH nebo albumin) a konjugovaný peptid je použit pro selekci protilátek způsoby in vitro nebo in vivo.

Příklad 3: Sestrojení duálně specifické protilátky založené na hybridním peptidu

V tomto příkladu byl pro použití jako duálně specifický antigen pro vypěstování duálně specifických protilátek proti IL-Ία a IL-Ιβ sestrojen hybridní peptid, který obsahuje alternující nebo překrývající se sekvence dvou různých, ale strukturně příbuzných proteinů, IL-Ία a IL-Ιβ. Aby vznikl tento hybridní peptid, byly identifikovány a spojeny alternující a překrývající se sekvence IL-Ία a EL-Ιβ, čímž byl vytvořen následující peptid:

• φ « r · · · «

TKGGQDITDFQELENQ (SEQ ID Ν0:3) bbbbbbbbbb aaaaaaaaaa

Písmena a a b označují, který protein je zdrojem daného zbytku (a = IL-Ια; b = IL-1 β). Motiv TIDF, společný oběma proteinům, byl obsažen v hybridním proteinu. Kromě toho je tento hybridní peptid zaměřen na sekvence od C-konce obou proteinů, které jsou rovněž v obou proteinech známy svou antigenitou vůči neutralizujícím protilátkám. Tento hybridní peptid je syntetizován standardními chemickými syntetickými způsoby. Tento peptid je potom konjugován na proteinový nosič (např. KLH nebo albumin) a konjugovaný peptid je použit pro selekci protilátek způsoby in vitro nebo in vivo.

Příklad 4: Tvorba duálně specifických protilátek proti EL-Ια a IL-1 β

NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1)

Cyklo-MAFLEANQNNGKISVAL(PG) (SEQ ID NO:2)

TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO:3)

Peptidy podle SEQ ID NO: 1, 2 a 3 byly konjugovány s KLH a byli imunizováni jednotliví králíci. Antisérum imunizovaných králíků proti každému z těchto tří peptidů vykazovalo dobrou protilátkovou odpověď proti peptidu, použitému jako antigen. Pouze antisérum z králíka, imunizovaného peptidem podle SEQ ID NO:3, bylo však schopno se vázat na IL-loc i IL-Ιβ protein.

Peptidem podle SEQ ID NO:3, konjugovaným s KLH a Freundovým nekompletním adjuvantem (FIA) bylo imunizováno pět myší (BA119 až BA123), jedenkrát za tři týdny, celkem třikrát, následováno dvěma provokačními intravenózními dávkami peptidem podle SEQ ID NO:3, konjugovaným s KLH. Každé myši byla odebrána krev vždy 10 dní po každé imunizaci a titr protilátek byl stanoven pomocí ELISA. Slezinné buňky od myši BA119, případně BA123, byly fúzovány s buněčnou linií myelomu P3X36Ag8,653, jak je popsáno v odstavci IIA a výsledné fúzované buňky byly očkovány po jedné do jamek v několika 96jamkových deskách použitím omezeného ředění. Ty hybridomové klony, které rostly, byly nejprve testovány na produkci IgG a IgM standardní ELISA, aby byly identifikovány klony, • 4 které produkují protilátku. Bylo izolováno celkem 945 klonů z fuze #BA123. U 335 testovaných klonů vykazovaly supernatanty při ELISA antigenní vazebnou aktivitu vůči IL-la, IL-Ιβ nebo vůči oběma.

klon	antigenní specifita (proti celé délce EL-lot a/nebo IL-Ιβ)	Izotyp
249	Pouze IL-la	IgG
19	Pouze EL-la	IgM
15	Pouze IL-1 β	IgG
2	Pouze IL-Ιβ	IgM
57	IL-la a β	IgG
13	EL-1 a a β	IgM

Odborníkům v této oblasti techniky bude jasné, že i při použití rutinních experimentů existují mnohé ekvivalenty ke specifickým provedením předkládaného vynálezu. Je záměrem, aby tyto ekvivalenty byly zahrnuty v následujících patentových nárocích.

• 9 • · 9 9

9 9 9

999

9

9999 99

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Duálně specifická protilátka nebo její antigen vážící část, která specificky váže ' interleukin-1 a a interleukin-1 β.

2. Duálně specifická protilátka podle nároku 1 nebo její antigen vážící část, která váže interleukin -la s rozpadovou Κ_οη· rychlostní konstantou o hodnotě 0,1 s'¹ nebo menší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje aktivitu interleukinu-ΐα s IC50 o hodnotě 1 χ 10'⁵ M nebo menší.

3. Duálně specifická protilátka podle nároku 1 nebo její antigen vážící část, která váže interleukin -1β s rozpadovou Kon rychlostní konstantou o hodnotě 0,1 s'¹ nebo menší, stanoveno povrchovou plazmonovou rezonancí, nebo která inhibuje aktivitu interleukinu-1 β s IC50 o hodnotě 1 x 10‘⁵ M nebo menší.

4 4 4 4

444 *4 4

4444 4*44

4444 44 44 * 4 ·* 44 44

11. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že tento antigen obsahuje aminokyselinovou sekvenci

APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLOGQDMEOOVVFSMGAYKSSKD DAKITVILGLKENLYLSCVLKDDKPTLOLESVDPKNYPKKKMF.KRFVFNKTFI NNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID NO:4).

12. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že soubor protilátek se vystaví antigenu in vivo imunizací živočicha antigenem.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se dále připraví soubor hybridomů z lymfocytů uvedeného živočicha a vybere se hybridom, který vylučuje protilátku, která specificky váže IL-Ία a IL-Ιβ.

14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedený živočich se vybere ze skupiny složené z myší, krys, králíků a koz.

15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tímto živočichem je knockoutovaná myš, deficientní na IL-la, IL-Ιβ nebo na IL-Ία i IL-Ιβ.

16. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tímto živočichem je myš, která je transgenní vůči lidským imunoglobulinovým genům, takže tato myš po antigenní stimulaci vytváří lidské protilátky.

17. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tímto živočichem je myš s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID), která byla rekonstituována s lidskými periferními krevními mononukleámími buňkami nebo lymfatickými buňkami nebo jejich prekurzory.

18. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že tímto živočichem je myš, ošetřena letálním ozářením celého těla, následovaným ochranou proti ozáření pomocí buněk kostní dřeně z SCID myši s těžkou kombinovanou imunodeficiencí, následovanou implantací funkčních lidských lymfocytů nebo jejich prekurzorů.

19. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený soubor protilátek se vystaví antigenu in vitro při skríninku knihovny rekombinantních protilátek tímto antigenem.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že tato knihovna rekombinantních protilátek je exprimována na povrchu bakteriofága.

21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že tato knihovna rekombinantních protilátek je exprimována na povrchu kvasničných buněk.

φφ · · · · · φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ · »··»· · · · · * .

φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφφ φφ φφ

22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že tato knihovna rekombinantních protilátek je exprimována na povrchu bakteriálních buněk.

23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že tato knihovna rekombinantních protilátek je exprimována jako fuze RNA-protein.

24. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že touto rekombinantní knihovnou je scFv knihovna nebo Fab knihovna.

25. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený soubor protilátek se vystaví antigenů imunizací živočicha antigenem in vivo, následovanou in vitro skríninkem knihovny rekombinantních protilátek, připravené z lymfatických buněk tohoto živočicha s antigenem.

26. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený soubor protilátek se vystaví antigenů imunizací živočicha antigenem in vivo, následovanou afinitním zráním in vitro knihovny rekombinantních protilátek, připravené z lymfatických buněk tohoto živočicha.

27. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený protilátkový soubor se vystaví antigenů imunizací živočicha antigenem in vivo, následovanou výběrem jednotlivých buněk vylučujících protilátky, které váží antigen, a získáním těžkého a lehkého řetězce variabilní oblasti cDNA z jednotlivých buněk.

28. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená duálně specifická protilátka je zcela lidského původu.

29. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedenou duálně specifickou protilátkou je chimerní protilátka.

30. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedenou duálně specifickou protilátkou je protilátka s implantovanou CDR.

31. Duálně specifická protilátka nebo její antigen vážící fragment, která specificky váže interleukin-ΐα a interleukin-ΐβ, získatelná způsobem podle nároku 4.

32. Způsob získání duálně specifické protilátky, která specificky váže dvě různé, ale strukturálně příbuzné molekuly, vyznačující se tím, že se poskytne antigen, který obsahuje společný strukturní prvek od dvou různých, ale strukturně příbuzných molekul;

vystaví se soubor protilátek tomuto antigenů a uvedený soubor protilátek se selektuje na protilátku, která specificky váže tyto dvě různé, ale strukturně příbuzné molekuly, čímž se získá duálně specifická protilátka.

ΦΦΦ · φ φ φ φ · φ φ φ φ · φ · · φ · · ···· ·* ·· φφφ φφ φφ

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedený antigen se sestrojí na základě styčné oblasti identity mezi dvěma různými, ale strukturně příbuznými molekulami.

34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedenými dvěma různými, ale strukturně příbuznými molekulami jsou proteiny a antigen je peptidem, obsahujícím aminokyselinovou sekvenci styčné topologické oblasti identity mezi těmito dvěma proteiny.

35. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedený antigen se sestrojí na základě strukturního napodobení smyčky společné nativní struktury dvou různých, ale strukturně příbuzných molekul.

36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že uvedenými dvěma různými, ale strukturně příbuznými molekulami jsou proteiny a antigen je cyklickým peptidem, který strukturně napodobuje smyčku společné nativní struktury těchto dvou proteinů.

37. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že antigen se sestrojí na základě spojení překrývajících se částí dvou různých, ale strukturně příbuzných molekul, za vzniku hybridní molekuly.

38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že uvedenýma dvěma různými, ale strukturně příbuznými molekulami jsou proteiny a antigenem je hybridní peptid získaný spojením překrývajících se aminokyselinových sekvencí těchto dvou proteinů.

39. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedený antigen je jednou ze dvou různých, ale strukturně příbuzných molekul.

40. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že se soubor protilátek vystaví antigenu in vivo imunizací živočicha tímto antigenem.

41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že se navíc připraví panel hybridomů z lymfocytů živočicha a selektuje se hybridom, který vylučuje protilátku, která se specificky váže ke dvěma různým, ale strukturně příbuzným molekulám.

42. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedený živočich se vybere ze skupiny, skládající se z myší, krys, králíků a koz.

43. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedeným živočichem je knockoutovaná myš, deficientní na endogenní verzi uvedeného antigenu.

44. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že tímto živočichem je myš, která je transgenní na lidské imunoglobulinové geny, takže tato myš po stimulaci antigenem vytváří lidské protilátky.

4

45. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedeným živočichem je myš s těžkou kombinovanou imunodeficiencí, SCID, která byla obnovena lidskými periferními mononukleárními buňkami nebo lymfatickými buňkami nebo jejich prekurzory.

46. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že že uvedeným živočichem je myš, která byla ošetřena letálním ozářením celého těla, následovaným ochranou proti ozáření ve formě buněk kostní dřeně z myši s těžkou kombinovanou imunodeficiencí, SCID, následovanou implantací funkčních lidských lymfocytů.

47. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedený soubor protilátek se vystaví antigenů in vitro skríninkem knihovny rekombinantních protilátek uvedeným antigenem.

48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že uvedená knihovna rekombinantních protilátek je exprimována na povrchu bakteriofágu.

49. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že uvedená knihovna rekombinantních protilátek je exprimována na povrchu kvasničných buněk.

50. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že uvedená knihovna rekombinantních protilátek je exprimována na povrchu bakteriálních buněk.

51. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že uvedená knihovna rekombinantních protilátek je exprimována ve formě fúzí RNA-protein.

52. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že uvedenou knihovnou rekombinantních protilátek je scFv knihovna nebo Fab knihovna.

53. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že se uvedený soubor protilátek vystaví antigenů imunizací živočicha antigenem in vivo, následovanou in vitro skríninkem knihovny rekombinantních protilátek připravené z lymfatických buněk živočicha, pomocí antigenů.

54. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že se uvedený soubor protilátek vystaví antigenů in vivo imunizací živočicha tímto antigenem, následovanou in vitro afinitním zráním knihovny rekombinantních protilátek, připravené z lymfatických buněk tohoto živočicha.

55. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že se uvedený soubor protilátek vystaví antigenů imunizací živočicha antigenem in vivo, následovanou selekcí jednotlivých buněk, vylučujících protilátky, které váží antigen a získáním těžkých a lehkých řetězců variabilní oblasti cDNA z jednotlivých buněk.

titi titi ♦ · · · ti · ti • * • titi ti titi

56. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedenou duálně specifickou protilátkou je zcela lidská protilátka.

57. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedenou duálně specifickou protilátkou je chimérická protilátka.

58. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedenou duálně specifickou protilátkou je protilátka s implantovanou CDR.

59. Duálně specifická protilátka nebo její antigen vážící část, získatelná způsobem podle nároku 32.

60. Způsob detekce IL-la nebo IL-Ιβ v biologickém vzorku nebo v tkáni, vyznačující se tím, že se biologický vzorek nebo tkáň, s předpokládaným obsahem IL-la nebo IL-Ιβ, uvede do kontaktu s duálně specifickou protilátkou nebo s její antigen vážící částí podle nároku 1 a v biologickém vzorku nebo v tkáni se detekuje IL-la nebo IL-Ιβ.

61. Způsob podle nároku 60, vyznačující se tím, že se IL-la nebo IL-Ιβ detekuje pro diagnostické účely.

62. Způsob podle nároku 60, vyznačující se tím, že uvedeným biologickým vzorkem je in vitro vzorek.

63. Způsob podle nároku 60, vyznačující se tím, že uvedená tkáň je lokalizována in vivo v subjektu a uvedený způsob zahrnuje in vivo zobrazení této tkáně.

64. Způsob inhibice aktivity IL-la nebo IL-Ιβ ,vyznačující se tím, že se IL-la nebo IL-Ιβ uvedou do kontaktu s duálně specifickou protilátkou nebo její antigen vážící částí podle nároku 1, takže se aktivita IL-la nebo IL-Ιβ inhibuje.

65. Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že se aktivita IL-la nebo IIL1β inhibuje in vitro.

66. Způsob léčby choroby, která je spojená s interleukinem-1, vyznačující se tím, že se subjektu, trpícímu chorobou, která je spojená s interleukinem-1, podává duálně specifická protilátka nebo její antigen vážící část podle nároku 1, takže se tento subjekt léčí na chorobu spojenou s interleukinem-1.

67. Způsob podle nároku 66, vyznačující se tím, že touto chorobou, která je spojena s interleukinem-1, je zánětlivá choroba.

68. Způsob podle nároku 66, vyznačující se tím, že touto chorobou, která je spojena s interleukinem-1, je autoimunitní choroba.

·'· • »♦·

9 9 9

99· 9 9

69. Způsob podle nároku 66, vyznačující se tím, že choroba, která je spojena s interleukinem-1, se vybere ze skupiny, která se skládá z reumatoidní artritidy, Crohnovy choroby, mnohočetné sklerosy, na inzulínu závislého diabetů a psoriázy.

70. Způsob přípravy knihovny protilátky nebo její antigen vážící části, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) získání knihovny A rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek, které vznikly po expozici prvnímu antigenů;

b) získání knihovny B rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek, které vznikly po expozici prvnímu antigenů;

c) získání knihovny C rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek, které vznikly po expozici druhému antigenů;

d) získání knihovny D rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek, které vznikly po expozici druhému antigenů;

e) kombinování knihovny A rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části s knihovnou D rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části, aby se získala knihovna X protilátky nebo její antigen vážící části a/nebo kombinování knihovny C rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části s knihovnou B rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části, aby se zsíkala knihovna Y protilátky nebo její antigen vážící části.

71. Způsob přípravy knihovny protilátky nebo její antigen vážící části podle nároku 70, vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky kombinování knihovny X protilátky nebo její antigen vážící části s knihovnou Y protilátky nebo její antigen vážící části, aby se získala knihovna Z protilátky nebo její antigen vážící části.

72. Knihovna X protilátky nebo její antigen vážící části, získaná způsobem podle nároku 70.

73. Knihovna Y protilátky nebo její antigen vážící části, získaná způsobem podle nároku 70.

74. Knihovna Z protilátky nebo její antigen vážící části, získaná způsobem podle nároku 71.

75. Způsob výroby duálně specifické protilátky nebo její antigen vážící části, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) získání knihovny A rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek, vzniklých expozicí prvnímu antigenů;

b) získání knihovny B rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek vzniklých expozicí prvnímu antigenů;

• 9

c) získání knihovny C rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek vzniklých expozicí druhému antigenů;

d) získání knihovny D rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části ze souboru protilátek vzniklých expozicí druhému antigenů;

e) kombinování knihovny A rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části s knihovnou D rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části, aby se získala knihovna X protilátky nebo její antigen vážící části a/nebo kombinování knihovny C rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části s knihovnou B rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části, aby se získala knihovna Y protilátky nebo její antigen vážící části a

f) selektování knihovny X protilátky nebo její antigen vážící části a/nebo knihovny Y protilátky nebo její antigen vážící části na protilátku nebo její antigen vážící část, která váže jak první, tak i druhý antigen.

76. Duálně specifická protilátka, získaná způsobem podle nároku 75.

77. Způsob výroby duálně specifické protilátky nebo její antigen vážící části, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

e) kombinování knihovny A rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části s knihovnou D rekombinantního lehkého řetězce nebo její antigen vážící části, aby se získala knihovna X protilátky nebo její antigen vážící části a/nebo kombinování knihovny C rekombinantního těžkého řetězce nebo jeho antigen vážící části s knihovnou B rekombinantního lehkého řetězce nebo jeho antigen vážící části, aby se získala knihovna Y protilátky nebo její antigen vážící části a ·· ·· ·♦ ·* · ···· · · · · ·· · • ··· · < · · · · · · • ·«·« · · · ·

...............

f) kombinování knihovny X protilátky nebo její antigen vážící části s knihovnou Y protilátky nebo její antigen vážící části, aby se získala knihovna Z protilátky nebo její antigen vážící části a

g) selektování knihovny Z protilátky nebo její antigen vážící části na protilátku nebo její antigen vážící část, která váže jak první, tak i druhý antigen.

78. Duálně specifická protilátka nebo její antigen vážící část, získaná způsobem podle nároku ΊΊ.

19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 70, 75 a 77, vyznačující se tím, že se uvedený první a druhý antigen nezávisle vybere ze skupiny, která se skládá z proteinů, polypeptidů a peptidů, za předpokladu, že tento první a druhý antigen nejsou stejné.

80. Způsob podle nároku 79, vyznačující se tím, že uvedenými proteiny, polypeptidy a peptidy jsou vylučované proteiny nebo povrchové receptory.

81. Způsob podle nároku 80, vyznačující se tím, že se vylučovaný protein vybere ze skupiny, která se skládá z EFN, TNF, interleukinu, IL-10, PF4, GRO, 9E3, EMAP-II, CSF, FGF a PDGF.

82. Způsob podle nároku 81, vyznačující se tím, že uvedeným prvním antigenem je IL-Ια a druhým antigenem je IL-Γβ.

83. Nukleotidová sekvence, kódující každý člen knihovny nebo knihoven protilátky nebo její antigen vážící části podle kteréhokoliv z nároků 72, 73 nebo 74.

84. Nukleotidová sekvence kódující duálně specifickou protilátku nebo její antigen vážící část podle kteréhokoliv z nároků 76 nebo 78.

85. Vektor, zahrnující nukleotidovou sekvenci, kódující člen knihovny nebo knihoven protilátky nebo její antigen vážící části podle kteréhokoliv z nároků 72, 73 nebo 74.

86. Vektor, zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující duálně specifickou protilátku nebo její antigen vážící část podle kteréhokoliv z nároků 76 nebo 78.

87. Hostitelská buňka, transfektovaná vektorem podle nároku 85.

88. Hostitelská buňka, transfektovaná vektorem podle nároku 86.

4 4 » 4 4 *

• · • 4 44 4 4

4. Způsob získání duálně specifické protilátky, která specificky váže interleukin-1 a a interleukin-1β, vyznačující se tím, že se:

poskytne antigen, který obsahuje společný strukturní prvek IL-Ια i IL-Ιβ; tomuto antigenu se vystaví soubor protilátek a tento soubor se selektuje na protilátku, která specificky váže IL-1 a a IL-Ιβ, čímž se získá duálně specifická protilátka.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že tento antigen se sestrojí na základě styčné topologické oblasti identity mezi IL-1 a a IL-Ιβ.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že tento antigen obsahuje aminokyselinovou sekvenci NEAQITDF (SEQ ID NO:1) nebo dNdEdAdQNITDF.

7. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že tento antigen se sestrojí na základě strukturního napodobování smyčky nativního stavu IL-1 a a IL-Ιβ.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že tímto antigenem je cyklický peptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL-(PG) (SEQ ID NO:2).

9. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že tento antigen se sestrojí na základě vzájemného spojení překrývajících se částí IL-1 a a IL-Ιβ, čímž se vytvoří hybridní molekula.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že tento antigen obsahuje aminokyselinovou sekvenci TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO:3).

·· ·· ·· • ·· «··· • · • · • · ·· • 9 9 • ··· • · · • • · 9 9 • • • · • • 9 9 9 ···· ·· ·· ··· ·· 9·

Seznam sekvencí

NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1)

Cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL(PG) (SEQ ID NO:2)

TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO:3)

AP VRSLNCTLRD S QQKSL VMMSGP YELKALHLQGQDMEQQ VVFSMGAYKS SKD DAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN NKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID NO:4)