SK1152003A3 - Dual specificity antibodies and methods of making and using - Google Patents

Dual specificity antibodies and methods of making and using Download PDF

Info

Publication number
SK1152003A3
SK1152003A3 SK115-2003A SK1152003A SK1152003A3 SK 1152003 A3 SK1152003 A3 SK 1152003A3 SK 1152003 A SK1152003 A SK 1152003A SK 1152003 A3 SK1152003 A3 SK 1152003A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antigen
antibody
library
binding portion
antibodies
Prior art date
Application number
SK115-2003A
Other languages
English (en)
Inventor
Albert Collinson
Tariq Ghayur
George Avgerinos
Richard Dixon
Zehra Kaymakcalan
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of SK1152003A3 publication Critical patent/SK1152003A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Description

Duálne špecifické protilátky a spôsoby ich výroby a použitia
Oblasť techniky
I L
Cicavčí imunitný systém obsahuje B lymfocyty, ktoré vylučujú komplexný súbor protilátok, zložený zo stoviek miliárd rôznych špecifických protilátok. Normálna imunitná odpoveď na určitý antigén obsahuje výber jednej alebo viacerých protilátok z tohto súboru, ktoré sa špecificky viažu na tento antigén, pričom úspech imunitnej odpovede je podmienený, aspoň sčasti, schopnosťou týchto protilátok špecificky rozpoznať a s konečnou platnosťou eliminovať stimulujúci antigén a ignorovať iné molekuly v okolí protilátok.
Doterajší stav techniky
Použiteľnosť protilátok, ktoré špecificky rozpoznávajú jeden konkrétny cieľový antigén, viedla k vývoju monoklonálnych protilátok. Štandardné hybridómové technológie teraz umožňujú prípravu protilátok, ktoré majú jednoduchú špecifitu voči záujmovému antigénu. Neskôr boli vyvinuté spôsoby rekombinantných protilátok, ako napríklad skríning in vitro protilátkových knižníc. Tieto spôsoby tiež umožňujú výrobu protilátok s jednoduchou špecifitou voči záujmovému antigénu.
Protilátky, ktoré sú špecifické voči jednému cieľovému antigénu, môžu, aspoň za určitých okolností, vykazovať nežiaducu krížovú reaktivitu alebo väzbu ich pozadia voči iným antigénom. Táto krížová reaktivita a väzba pozadia sú však väčšinou nepredpovedateľné (t.j. nie je možné predpovedať, ktorý antigén bude krížovo reagovať s protilátkou). Tento jav je okrem toho obvykle neodlíšiteľný od špecifickej väzby k antigénu, pretože obvykle predstavuje iba veľmi malú časť väzbovej kapacity protilátky (napr. 1 % alebo ešte menej z celkovej väzby protilátky) a je pozorovaný väčšinou iba pri vysokých koncentráciách protilátky (napr. pri lOOOnásobne alebo ešte vyššej koncentrácii, než aká je potrebná na spozorovanie špecifickej väzby protilátky). Aj keď je niekoľko an tigénov, ktoré môžu patriť do štrukturálne príbuznej skupiny proteínov, je protilátková odpoveď voči jednotlivému členu tejto rodiny vysoko špecifická. Okrem toho, že existuje niekoľko príkladov členov proteínovej rodiny (napr. členy IL-1 a TNF rodín), ktoré sa viažu k rovnakému receptoru, zložke receptora alebo štruktúrne príbuznému receptoru, monoklonálne protilátky, vypestované proti jednému členu rodiny, nevykazujú vysokú krížovú reaktivitu voči ostatným členom rodiny. Pre tento nedostatok krížovej reaktivity monoklonálnych protilátok voči ostatným členom rodiny môžu existovať dva dôvody. Po prvé, pri štandardnej výrobe hybridómu sa hľadá iba niekoľko protilátok s vysokou špecifitou/afinitou voči cieľovému antigénu a až potom sa u týchto niekoľkých vybraných protilátok kontroluje krížová reaktivita alebo väzbová schopnosť pozadia. Po druhé, aj keď sú proteíny v rodine štruktúrne príbuzné, môžu obsahovať výlučné, neprekrývajúce sa imunodominantné epitopy. Monoklonálne protilátky vypestované použitím úplnej dĺžky proteínu, nemôžu teda krížovo reagovať s inými štruktúrne príbuznými proteínmi.
Existujú tiež príklady monoklonálnych protilátok, vypestovaných proti antigénu jedného biologického druhu, ktoré sa špecificky viažu k rovnakému funkčnému antigénu u iných druhov. Napríklad protilátka voči myšiemu antigénu X môže ľahko viazať antigén X človeka. To je spôsobené tým, že obsahujú preukázateľné sekvencie a štruktúrne podobnosti, aj keď nie sú identické. Takéto druhovo krížovo reagujúce protilátky netvoria protilátky s duálnou špecifitou, pretože majú špecifitu pre rovnaký antigén, iba z rôznych druhov.
Monoklonálne protilátky, ktoré majú uskutočniteľnú duálnu alebo násobnú špecifitu, t.j. protilátky, ktoré majú skutočnú špecifitu voči dvom alebo viacerých rôznym antigénom, sú stále potrebné.
Podstata vynálezu
Tento vynález poskytuje spôsoby prípravy protilátok, ktoré majú duálnu špecifitu voči najmenej dvom štruktúrne príbuzným, ale pritom rôznym antigénom. Tento spôsob všeobecne zahrnuje poskytnutie antigénu, ktorý zahrnuje spoločnú štruktúrnu vlastnosť dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných mole kúl; vystavenie súboru protilátok tomuto antigénu a selekciu tohto súboru na protilátku, ktorá sa špecificky viaže na dve rôzne, ale štruktúrne príbuzné molekuly, čím sa získa duálne špecifická protilátka. V klinickom uskutočnení môžu rôzne členy jednej rodiny proteínov zodpovedať za rôzne príznaky chorobného procesu. Použitie duálne špecifickej protilátky podľa tohto vynálezu, ktorá viaže členy rovnakej rodiny proteínov, na blokovanie funkcií viac než jedného člena proteínovej rodiny môže byť užitočné na zmiernenie príznakov choroby alebo na prerušenie samotného chorobného procesu. Okrem toho sú takéto duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu použiteľné na detekciu štruktúrne príbuzných antigénov, na purifikáciu štruktúrne príbuzných antigénov a v diagnostických testoch obsahujúcich štruktúrne príbuzné antigény.
Vo výhodnom uskutočnení je antigén zostrojený na princípe styčnej topologickej oblasti identity medzi dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami. Týmito dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami môžu byť napríklad proteíny a antigén môže byť peptidom, obsahujúcim aminokyselinovú sekvenciu styčnej topologickej oblasti identity medzi týmito dvoma proteínmi.
V inom uskutočnení je antigén zostrojený na princípe slučky napodobňujúcej spoločné priestorové usporiadanie dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl. Takým antigénom môže byť napríklad cyklický peptid, ktorý štruktúrne napodobňuje slučku spoločného priestorového usporiadania dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínov.
V ešte inom uskutočnení je antigén zostrojený na princípe spojenia spoločných alternujúcich a/alebo prekrývajúcich sa častí dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl, za vzniku hybridnej molekuly. Antigénom môže byť napríklad hybridný peptid, vzniknutý spojením spoločných alternujúcich a/alebo prekrývajúcich sa aminokyselinových sekvencii dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínov.
V ešte ďalšom uskutočnení, môže antigén obsahovať jednu alebo dve rôzne, ale štruktúrne príbuzné molekuly a tento spôsob potom obsahuje selekciu protilátok, ktoré špecificky rozpoznávajú obe príbuzné molekuly.
Spôsobom podľa tohto vynálezu môže byť súbor protilátok vystavený pôsobeniu požadovaného antigénu buď in vivo alebo in vitro. N jednom uskutočnení vystavenie súboru antigénu napríklad obsahuje imunizáciu živočícha in vivo antigénom. Tento in vivo prístup môže ďalej obsahovať prípravu kompletu hybridómov z lymfocytov tohto živočícha a výber hybridómu, ktorý vylučuje protilátku, ktorá sa špecificky viaže ku dvom rôznym, ale štruktúrne príbuzným molekulám. Imunizovaným živočíchom môže byť napríklad myš, potkan, králik alebo koza alebo transgénne verzie ktoréhokoľvek z predchádzajúcich živočíchov, takže myš, ktorá je transgénna pre ľudské imunoglobulínové gény, pri stimulácii antigénom produkuje ľudské protilátky. Iné typy živočíchov, ktoré môžu byť imunizované, zahrnujú myši, so závažnou kombinovanou imunodeficienciou (SCID), ktoré môžu byť rekonštituované ľudskými periférnymi krvnými mononukleárnymi bunkami (hu-PBMC-SCID chimérické myši) alebo lymfatickými bunkami alebo ich prekurzormi a myši, ktoré boli ovplyvnené letálnym ožiarením celého tela, nasledovaným ochranou proti ožiareniu bunkami kostnej drene myší so závažnou kombinovanou imunodeficienciou (SCID), nasledovanou implantáciou funkčných ľudských lymfocytov (systém Trimera). Ešte ďalším typom živočíchov, ktoré môžu byť imunizované, je živočích (napr. myš), ktorého genóm bol prebudovaný (knocked out KO, napr. homológnou rekombináciou) endogénnym génom (génmi), kódujúcimi záujmový antigén (antigény), pričom pred imunizáciou záujmovým antigénom (antigénmi) uvedený KO živočích rozpoznáva tento antigén (antigény) ako cudzie.
V inom usporiadaní je súbor protilátok vystavený účinku antigénu in vitro pri skríningu knižnice rekombinantných protilátok antigénom. Táto knižnica rekombinantných protilátok môže byť napríklad exprimovaná na povrchu bakteriofága alebo na povrchu kvasničných buniek alebo na povrchu bakteriálnych buniek. V rôznych uskutočneniach je knižnica rekombinantných protilátok napríklad scFv knižnicou alebo Fab knižnicou. V ešte inom uskutočnení sú knižnice protilátok vyjadrené ako fúzie RNA s proteínom.
Iný spôsob prípravy duálne špecifických protilátok zahrnuje kombináciu prístupov in vivo a in vitro, ako je vystavenie súboru protilátok antigénu imunizáciou živočícha antigénom in vivo, nasledovanou in vitro skríningom kniž nice rekombinantných protilátok, pripravenej z lymfatických buniek živočícha, antigénom. Ďalší spôsob zahrnuje vystavenie knižnice protilátok antigénu in vivo imunizáciou živočícha týmto antigénom, nasledovanou in vitro afinitným zrením knižnice rekombinantných protilátok, pripravenej z lymfatických buniek tohto živočícha. Ešte ďalší spôsob obsahuje vystavenie knižnice protilátok antigénu in vivo imunizáciou živočícha týmto antigénom, nasledovanou selekciou buniek vylučujúcich záujmové protilátky, rekonštrukciu variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca cDNA z týchto selektovaných buniek (napr. pomocou PCR) a expresiu týchto variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca v cicavčích hostiteľských bunkách in vitro (označovanú tu ako spôsob selektovaných lymfocytárnych protilátok, selected lymphocyte antibody method alebo SLÁM), čím je umožnená ďalšia selekcia a ovplyvňovanie sekvencii génov selektovaných protilátok. Monoklonálne protilátky môžu byť okrem toho selektované pri expresii klonovaním exprimujúcich génov protilátok ťažkého a ľahkého reťazca v cicavčích bunkách a selekciou cicavčích buniek, ktoré vylučujú protilátku s potrebnou väzbovou špecifitou.
Spôsoby podľa tohto vynálezu umožňujú prípravu mnohých rôznych typov duálne špecifických protilátok, vrátane úplne ľudských protilátok, chimérických protilátok a CDR implantovaných protilátok a ich antigén viažucich častí. Tiež sú poskytnuté duálne špecifické protilátky pripravené spôsobom podľa tohto vynálezu. Výhodnou duálne špecifickou protilátkou podľa tohto vynálezu je protilátka, ktorá špecificky viaže interleukín-ΐα a interleukín-1 β. Takáto duálne špecifická protilátka môže byť použitá pri detekci IL-Ία alebo IL-Ιβ, ktorá obsahuje kontakt IL-Ία alebo IL-β s duálne špecifickou protilátkou alebo jej antigén viažucou časťou, čím sú IL-Ία alebo IL-Ιβ detegované. Pri inhibíciách aktivity IL-Ία alebo IL-Ιβ, ktoré zahrnujú kontakt IL-Ία alebo IL-Ιβ s duálne špecifickou protilátkou alebo jej antigén viažucou časťou, vedúci k inhibícii IL-Ία alebo IL-Ιβ, môže byť tiež použitá neutralizujúca duálne špecifická protilátka. Takáto duálne špecifická protilátka môže byť tiež použitá pri liečbe chorôb, spojených s interleukínom-1, zahrnujúcej podávanie duálne špecifickej protilátky alebo jej antigén viažucej časti subjektu, ktorý trpí chorobou spojenou s interleukínom-1.
V inom uskutočnení poskytuje tento vynález spôsob výroby knižnice protilátky alebo jej antigén viažucej časti realizáciou nasledujúcich krokov:
a) získanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, vzniknutých z vystavenia prvému antigénu;
b) získanie knižnice B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, vzniknutých z vystavenia prvému antigénu;
c) získanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej Časti zo súboru protilátok, vzniknutých z vystavenia druhému antigénu; d) získanie knižnice D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, vzniknutých z vystavenia druhému antigénu a e) spojenie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby bola získaná knižnica X a/alebo spojenie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby bola získaná knižnica Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti.
V inom uskutočnení predkladaného vynálezu môže bezprostredne predchádzajúci spôsob podľa tohto vynálezu obsahovať ďalej krok, ktorý spojuje knižnicu X protilátky alebo jej antigén viažucej časti s knižnicou Y, čím je získaná knižnica Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti.
V ďalšom uskutočnení je predkladaný vynález smerovaný na knižnice X, Y alebo Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti.
V inom uskutočnení umožňuje spôsob podľa predkladaného vynálezu identifikáciu duálne špecifickj protilátky alebo jej antigén viažucej časti selekciou knižníc X, Y a/alebo Z na protilátku alebo jej antigén viažucu časť, ktoré sa viažu buď na prvý alebo na druhý antigén.
V ďalšom uskutočnení je predkladaný vynález smerovaný na duálne špecifickú protilátku, ktorá je pripravená a/alebo vybraná ľubovoľným spôsobom podľa predkladaného vynálezu.
V inom uskutočnení je tento vynález tiež smerovaný na nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu každý člen knižnice X, Y a Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti, duálne špecifickú protilátku alebo jej antigén viažucu časť, vektor obsahujúci vyššie uvedené nukleotidové sekvencie a hostiteľskú bunku, transfektovanú vyššie uvedeným vektorom.
Vo výhodnom uskutočnení je prvý a druhý antigén nezávisle vybraný zo skupiny, skladajúcej sa z proteínov, polypeptidov a peptidov, zÁ predpokladu, že tieto prvé a druhé antigény nie sú totožné. V ďalšom uskutočnení sú týmito proteínmi, polypeptidmi a peptidmi sekretované proteíny alebo receptory a tento sekretovaný proteín je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z IFN, TNF, interleukínu, IP-10, PF-4, GRO, 9E3, EMAP-II, CSF, FGF a PDGF. V inom výhodnom uskutočnení je prvým antigénom IL-Ια a druhým antigénom je IL-Ιβ.
I
Tento vynález sa týka konštrukcie a použitia antigénov pre tvorbu duálne špecifických protilátok, t.j. protilátok, ktoré majú špecifitu voči najmenej dvom rôznym, ale štruktúrne príbuzným molekulám, tiež ako sa týka selekcie, prípravy a použitia takýchto duálne špecifických protilátok. Štruktúrna príbuznosť antigénov podľa tohto vynálezu sa môže týkať celého antigénu (t.j. proteínu) alebo iba určitých štruktúrne príbuzných oblastí. Tento vynález poskytuje spôsob pre získanie duálne špecifickej protilátky, ktorá sa špecificky viaže ku dvom rôznym, ale štruktúrne príbuzným molekulám, pričom tento spôsob zahrnuje:
poskytnutie antigénu, ktorý obsahuje spoločný štruktúrny prvok dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl;
vystavenie súboru protilátok tomuto antigénu a selekciu tohto súboru na protilátku, ktorá sa špecificky viaže ku dvom rôznym, ale štruktúrne príbuzným molekulám, čím sa získa duálne špecifická protilátka.
Je treba poznamenať, že zatiaľ čo tento vynález je tu opísaný na základe rozpoznávania dvoch rôznych, ale príbuzných antigénov, mal by byť chápaný tak, že termín duálne špecifická protilátka je zamýšľaný tak, aby zahrnoval protilátky, ktoré špecificky rozpoznajú ešte viac než dva rôzne, ale príbuzné antigény, teda protilátky, ktoré rozpoznajú tri, štyri, päť alebo viac štruktúrne príbuzných, ale odlišných antigénov. Okrem toho, termín rôzne, ale štruktúrne príbuzné antigény je myslený tak, aby zahrnoval antigény (napr. proteíny), ktorých celková štruktúra je príbuzná tiež s antigénmi, (napr. proteínmi), ktoré obsahujú jednu alebo viac Štruktúrne príbuzných oblastí, ale inak nie sú príbuzné. Rôznymi, ale štruktúrne príbuznými antigénmi, môžu byť teda napríklad dva proteíny, ktoré sú členmi rovnakej rodiny proteínov so spoločnou celkovou štruktúrou alebo nimi môžu byť napríklad dva proteíny, ktorých celková štruktúra nie je podobná (nie je príbuzná), ale pritom oba obsahujú štruktúrne príbuznú doménu.
Na vyvolanie vzniku protilátok podľa tohto vynálezu môžu byť použité rôzne typy antigénov a na získanie duálne špecifických protilátok podľa tohto vynálezu môžu byť použité rôzne spôsoby výroby, tak ako je diskutované ďalej v nasledujúcich podkapitolách.
I. Duálne špecifické antigény
Na prípravu duálne špecifickej protilátky podľa tohto vynálezu sú vypestované protilátky proti antigénu, ktorý je schopný vyvolať duálne špecifické protilátky. Taký typ antigénov je tu všeobecne nazývaný duálne špecifickými antigénmi. V tomto vynáleze môžu byť použité rôzne typy odlišných antigénov a zostrojenie rôznych typov duálne špecifických antigénov je opísané ďalej v nasledujúcich podkapitolách.
A. Styčné topologické oblasti
V jednom uskutočnení obsahuje duálne špecifický antigén podľa tohto vynálezu styčnú topologickú oblasť identity a/alebo podobnosti medzi dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami, voči ktorým je treba vypestovať duálne špecifické protilátky. Je výhodné, keď antigén obsahuje tú najväčšiu (t.j. najdlhšiu) styčnú topologickú oblasť identity a/alebo podobnosti medzi dvom odlišnými, ale štruktúrne príbuznými molekulami. Je výhodné, keď týmito dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami sú proteíny a tento duálne špecifický antigén obsahuje lineárny peptid, zodpovedajúci najväčšej (t.j. najdlhšej) styčnej topologickej oblasti identity a/alebo podobnosti medzi týmito dvoma proteínmi. Táto vybraná vhodná oblasť identity/podobnosti je výhodne receptorovou alebo ligandovou väzbovou oblasťou, i keď možno použiť aj iné oblasti identity/podobnosti.
Na určenie styčných topologických oblastí identity medzi dvoma molekulami (napr. proteínmi) sú tieto dve molekuly (napr. proteíny) porovnávané (napr. modelovanie homológie, štruktúrne informácie alebo podobné) a tak sú určené identické alebo podobné oblasti. Pre proteíny možno na dosiahnutie optimálneho porovnania a identifikáciu najväčšej (napr. najdlhšej) styčnej topologickej oblasti identity a/alebo podobnosti medzi týmito dvoma proteínmi použiť porovnávací algoritmus. Výhodným, neobmedzujúcim príkladom matematického algoritmu, použitého na porovnanie dvoch sekvencii, je algoritmus podľa publikácie: Karlin a Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 až 68, modifikovaný podľa Karlina a Altschula (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 až77. Takýto algoritmus je zabudovaný do programov NBLAST alebo XBLAST podľa Altschula et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 až 10. Na získanie porovnania medzier na účely porovnania môže byť využité Gapped BLAST, ako opisuje Alschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389 až 3402. Ak použijeme programy BLAST a Gapped BLAST, môžeme použiť štandardné parametre príslušných programov (napr. VBALST alebo NBLAST). Viď http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alternatívny matematický algoritmus, ktorý môže byť použitý, je ten, ktorý sa používa v programe ALIGN, opísanom Myersom a Millerom (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11 až 17.
Ak máme vybranú vhodnú oblasť identity/podobnosti, môžeme chemicky syntetizovať duálne špecifický antigén, zodpovedajúci tejto oblasti. Napríklad, pre peptidové antigény, môže byť peptidový antigén syntetizovaný štandardnými spôsobmi syntézy peptidov. V jednom uskutočnení obsahuje peptidový antigén L-aminokyseliny. V iných uskutočneniach môže byť peptidový antigén tvorený čiastočne alebo úplne D-aminokyselinami. Príklad takéhoto uskutočnenia duálne špecifického antigénu, založeného na styčnej topologickej oblasti identity/podobnosti medzi dvoma rôznymi, ale štruktúrne podobnými proteínmi, je detailne opísaný v príklade 1.
B. Cyklické peptidy, napodobňujúce štruktúrnu slučku
V inom uskutočnení obsahuje duálne špecifický antigén podľa tohto vynálezu cyklickú molekulu, výhodne cyklický peptid, ktorý štruktúrne napodobňuje hlavnú slučku spoločného priestorového usporiadania dvoch rozdielnych, ale štruktúrne príbuzných molekúl (napr. proteínov), voči ktorým majú byť vypestované duálne špecifické protilátky. Na prípravu tohto typu antigénu sú porovnávané dve príbuzné molekuly a je identifikovaná slučka spoločného priestorového usporiadania, nájdená v týchto dvoch molekulách. Na identifikáciu týchto slučiek a priestorového usporiadania možno použiť štandardné molekulárne modelovanie a kryštalografickú analýzu. Identické a podobné oblasti (napr. aminokyselinové sekvencie medzi dvoma proteínmi) sú identifikované a súhlasná sekvencia môže byť použitá na zostrojenie podobných, ale neidentických oblastí. Na základe týchto podobných a identických oblastí je zostrojená lineárna molekula, napr. lineárny peptid, ktorá môže byť cyklizovaná známymi chemickými spôsobmi, aby bol vytvorený antigén, ktorý napodobňuje kľúčovú slučku. Napríklad na konec lineárneho peptidu môže byť pridaný prolín a glycín, aby bola umožnená cyklizácia tohto peptidu. Príklad takého zostrojenia duálne špecifického antigénu, založeného na cyklickom peptide, napodobňujúcom štruktúrnu slučku, obsiahnutú vo dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínoch, je opísaný v príklade 2.
C. Hybridné molekuly
V inom uskutočnení obsahuje duálne špecifický antigén podľa tohto vynálezu hybridnú molekulu, výhodne hybridný peptid, ktorý obsahuje striedajúce sa a/alebo prekrývajúce sa oblasti dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl (napr. proteínov), voči ktorým je treba pripraviť duálne špecifické protilátky. Pri príprave tohto typu antigénu sú porovnávané štruktúry dvoch molekúl a sú identifikované prekrývajúce sa oblasti (t.j. oblasti identity), tiež ako neidentické oblasti medzi týmito dvoma molekulami. Pripraví sa hybridná molekula (napr. hybridný peptid, pokiaľ týmito dvoma príbuznými molekulami sú proteíny), ktorá výhodne obsahuje alternujúce oblasti (napr. sekvencie aminokyselín) od každej z týchto dvoch molekúl, tiež ako prekrývajúca sa oblasť, ktorá je spoločná k obom molekulám. Takýto hybrid môže byť schematicky opísaný ako: X-Y-Z, kde Y predstavuje oblasť identity alebo veľkej podobnosti medzi týmito dvom príbuznými molekulami (t.j. prekrývajúca sa oblasť), X predstavuje oblasť z jednej z príbuzných molekúl a Z predstavuje oblasť z druhej z príbuzných molekúl. Príklad zostrojenia duálne špecifického antigénu, založeného na hybridnom peptide, zloženom zo sekvencii dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínov, je detailne opísaný v príklade 3.
Iným typom hybridnej molekuly je ten, v ktorom bol peptid introdukovaný do celej dĺžky proteínu (označovaný ako cieľový protein). Peptidy sú vybrané tak, aby predstavovali funkčné oblasti dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínov, napríklad, oblasti interagujúce s receptorom. Funkčný peptid z jedného z dvoch príbuzných proteínov sa zavedie do celej dĺžky jedného z príbuzných proteínov alebo alternatívne do nepríbuzného proteínu. Napríklad, peptid IL-Ια zodpovedajúci receptoru interagujúcej oblasti IL-Ια je identifikovaný a tento funkčný peptid je zavedený do celej dĺžky IL-1 β proteínu, čím vznikne hybridná molekula IIL-la/IL-Ιβ. Podobne je identifikovaný peptid IL1β, zodpovedajúci receptoru interagujúcej oblasti IL-Ιβ a tento funkčný peptid je zavedený do celej dĺžky proteínu IL-Ια, za vzniku hybridnej molekuly ILla/IL-Ιβ. Takéto zavedenie funkčného peptidu do celej dĺžky príbuzného proteínu ukončuje funkčný peptid na jeho oboch koncoch a tým udržuje natívnu štruktúru funkčného peptidu.
V prípade hybridu IL-lot/IL-Ιβ je tento funkčný peptid výhodne inzerovaný (nahradzuje pôvodné aminokyseliny) v cieľovej oblasti, reprezentujúcej spoločné natívne štruktúry IL-Ια a IL-Ιβ. Takéto oblasti možno nájsť v celej dĺžke proteínu (napr. v N-koncovej oblasti, v strednej časti proteínu, v C-koncovej oblasti). Okrem toho môžu byť funkčné peptidy, reprezentujúce spoločné IL-lot/IL-β natívne štruktúry, tiež inzerované do irelevantného proteínu, ako je albumín alebo niektoré iné, prirodzene sa vyskytujúce proteíny. S ohľadom na to je výhodným miestom pre inzerciu taká oblasť, ktorá umožní, aby bola zachovaná požadovaná natívna štruktúra. Inzerčné miesta môžu teda byť v N-koncovej oblasti, v strednej oblasti alebo v C-koncovej oblasti. Umiestnenie tohto peptidu v ľubovoľnom, prirodzene sa vyskytujúcom cieľovom proteíne je vybrané tak, aby bolo podobné štruktúrnemu okoliu peptidu v natívnom proteíne, z ktorého je odvodený. Zatiaľ čo funkčný peptid môže byť jednoducho inzerovaný do cieľového proteínu tak, že sa pridajú aminokyseliny funkčného peptidu do cieľového proteínu, je výhodné, keď aminokyseliny funkčného peptidu nahradia časť cieľového peptidu, do ktorého je vkladaný.
Ako neobmedzujúci príklad je konštruovaná hybridná molekula na použitie ako duálne špecifický antigén na vyvolanie tvorby duálne špecifických protilátok voči IL-Ια a IL-Ιβ, pričom tento funkčný peptid, zodpovedajúci špecifickému štruktúrnemu prvku buď IL-Ια alebo IL-Ιβ je zavedený do celej dĺžky IL-Ιβ alebo IL-Ια v ekvivalentnej štruktúrnej pozícii. Vybraná hybridná molekula nahradzuje zvyšky 160 až 176 v IL-Ιβ zvyškami 168 až 184 z IL-la. Výsledná molekula má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej substituované IL-Ια sekvencie (zvyšky 168 až 184) sú podčiarknuté:
APVRSLNCTLRDSOOKSLVMSGPYELKALHLOGODMEOOWFSMGAYKSSKD DAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLOLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEI NNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID NO: 4)
Táto molekula môže byť pripravená použitím štandardných spôsobov molekulárnej biológie (ako je napr. klonovanie, polymerázová reťazová reakcia), pomocou literárne dostupných IL-Ια a IL-Ιβ cDNA sekvencií a pomocou spôsobov expresie rekombinantných proteínov. Môže byť pripravená hybridná cDNA, zavedená do vhodného expresného vektora a polypeptid môže byť exprimovaný zavedením tohto expresného vektora do vhodnej hostiteľskej bunky.
D. Peptidy založené na princípe hydrofóbnosti
V inom uskutočnení je duálne špecifický antigén podľa tohto vynálezu vybraný na základe hydrofóbneho princípu tak, aby boli vybrané peptidy, ktoré boli predpovedané ako silne antigénne. Antigénny index peptidov môže byť napríklad vypočítaný pomocou počítačového software, ktorý je opísaný v: Jameson a Wolf (CABIOS, 4(1), 181 až 186 (1988)). Oblasti zaujímavé pre väzbu protilátky môžu byť vybrané tak, aby bola maximalizovaná pravdepodobnosť antigenicity.
E. Imunizácia bunkami s transfektovaným antigénom.
V inom uskutočnení je duálne špecifická protilátka podľa tohto vynálezu pripravená imunizáciou bunkami s transfektovaným antigénom (t.j. duálne špecifické antigény podľa tohto vynálezu môžu byť bunkami s transfektovaným antigénom). Možno vytvorit bunečné línie, ktoré stabilne vylučujú tieto dva odlišné, ale štruktúrne príbuzné antigény alebo ich hybridné molekuly. Môžu byť napríklad vytvorené bunečné línie, ktoré stabilne exprimujú IL-Ια alebo IL-Ιβ alebo hybridné molekuly IL-la/IL-Ιβ (napr. SEQ ID NO: 4). Tieto záujmové molekuly môžu byť vylučované z buniek (v prípade rozpustných proteínov) alebo môžu byť vylučované na povrchu buniek (v prípade receptorov a enzýmov). Prenos génov do hostiteľských buniek, ktorý má umožniť expresiu týchto antigénov hostiteľskou bunkou, môže byť uskutočnený mnohými konvenčnými spôsobmi, vrátane, ale bez omedzenia, transfekciou, elektroporáciou, bunečnou fúziou, lipofekciou, bombardovaním časticami, mikroinjekciou alebo vírusovou infekciou. Bunečné línie, exprimujúce tieto záujmové antigény, môžu byť potom transplantované jednou alebo viacerými rôznymi cestami (intraperitoneálnou, subkutánnou, intramuskulárnou a podobne) do príslušného živočícha, aby boli produkované protilátky. Tieto bunky potom slúžia ako zdroj záujmového antigénu. Tieto bunky výhodne exprimujú úplné dĺžky proteínu. Fragmenty antigénu môžu byť však tiež exprimované. V prípade rozpustných proteínov sú proteíny výhodne exprimované bunkami. Aby bola vytvorená duálne špecifická protilátka voči extracelulárnej doméne dvoch blízko príbuzných receptorov, sú tieto receptory výhodne exprimované na bunečnom povrchu.
F. Imunizácia jednou zo štruktúrne príbuzných molekúl
V inom uskutočnení je duálne špecifický antigén jednoducho jednou z dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl, voči ktorým má byť duálne špecifická protilátka vypestovaná. Jedna z týchto príbuzných molekúl je použitá ako imunizačné činidlo a výsledný súbor protilátok je potom preskúmaný na protilátky, ktoré viažu a výhodnejšie neutralizujú obe z dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl. Môžeme napríklad imunizovať buď s IL-loc alebo s IL-Ιβ a potom preskúmať protilátky viažuce αβ alebo ešte výhodnejšie neutralizujúce αβ. Tak ako je použitý v tomto uskutočnení, je termín imunizácia, zamýšľaný tak, aby obsahoval široké poňatie ovplyvnenia súboru protilátok antigénom, ako je IL-Ια alebo IL-Ιβ, buď in vivo alebo in vitro. Toto uskutočnenie teda obsahuje imunizáciu živočícha buď s IL-Ια alebo s IL-Ιβ a skríning výsledných vzniknutých protilátok, pri ktorom sa vyberú tie protilátky, ktoré viažu IL-Ια i IL-Ιβ, tiež ako skríning knižnice rekombinantných protilátok in vitro buď s IL-Ια alebo IL-Ιβ a potom výber rekombinantných protilátok, ktoré viažu ako IL-Ια, tak i IL-Ιβ.
II. Spôsoby prípravy duálne špecifických protilátok
Aby sme pripravili duálne špecifickú protilátku podľa tohto vynálezu, je treba vystaviť súbor protilátok (buď in vivo alebo in vitro) duálne špecifickému antigénu, pripravenému, ako je opísané v predchádzajúcom oddiele a príslušná, duálne špecifická protilátka sa vyberie z tohto súboru. Dvoma základnými zložkami rozpoznania antigénu protilátkou sú štruktúrne rozpoznanie a afinitná zrelosť, založené na špecifických molekulárnych interakciách. V priebehu prirodzenej imunitnej odpovede sú ľahšie vyvíjané protilátky s nízkou afinitou, ktoré rozpoznajú štruktúrne motívy (napríklad, rozpoznanie antigénu určitými druhmi rozpoznávacích receptorov). V prirodzenej imunitnej odpovedi je toto skoro nasledované somatickými mutáciami, ktoré zvyšujú afinitu niektorých klonov. Boli vyvinuté rôzne spôsoby in vivo i in vitro, ktoré napodobňujú tento prirodzený jav. Duálne špecifické protilátky s nízkou afinitou môžu byť vytvorené ktorýmkoľvek z tu opísaných spôsobov in vivo i in vitro a duálne špecifické monoklonálne protilátky s vyššou afinitou môžu byť pripravené spôsobmi somatickej mutagenézy, opísanej na tomto mieste. Pre optimalizáciu duálne špecifických monoklonálnych protilátok s vysokou afinitou môžu byť okrem toho pripravené rovnako (izomorfné) kryštalizujúce štruktúry monoklonálnych protilátok s nízkou afinitou s požadovanými antigénmi. Tieto získané štruktúrne informácie môžu viesť k ďalšiemu zosilneniu afinity alteráciou (mutáciou) špecifických kontaktných zvyškov na monoklonálnych protilátkach, aby boli zosilnené tu opísané špecifické molekulárne interakcie.
V nasledujúcich podkapitolách sú detailne opísané spôsoby prípravy duálne špecifických protilátok, používajúcich spôsoby in vivo, spôsoby in vitro alebo ich kombináciu.
A. Spôsoby in vivo
Štandardným spôsobom prípravy protilátok in vivo je imunizácia vhodného živočíšneho subjektu antigénom, ktorému je vystavený súbor protilátok in vivo, nasledovaná získaním požadovanej protilátky alebo protilátok zo živočícha. Takýto spôsob môže byť použitý na prípravu duálne špecifických protilátok použitím duálne špecifického antigénu a výberom takých protilátok, ktoré špecificky rozpoznajú dve štruktúrne príbuzné záujmové molekuly. Duálne špecifické protilátky môžu byť pripravené imunizáciou vhodného subjektu (napríklad, králik, koza, myš alebo iné cicavce, vrátane transgénnych knock-out verzií týchto cicavcov) imunogénnym preparátom duálne špecifického antigénu. Vhodný imunogénny preparát môže obsahovať napríklad chemicky syntetizovaný alebo rekombinantne exprimovaný duálne špecifický antigén. Tento preparát môže ďalej obsahovať adjuvans, ako Freundovo úplné alebo neúplné adjuvans alebo podobnú imunostimulačnú zlúčeninu. Pokiaľ je použitý na vyvolanie tvorby protilátok, hlavne imunizáciou in vivo, môže byť okrem toho duálne špecifický antigén podľa tohto vynálezu použitý sám alebo výhodnejšie ako konjugát s nosným proteínom. Takýto spôsob zosilnenia protilátkovej odpovede je v tejto oblasti techniky dobre známy. Príklady vhodných nosných proteínov, ku ktorým môže byť duálne špecifický antigén konjugovaný, obsahujú hemokyanín morských ulitníkov (keyhole limpet hemocyanin -KLH) a albumín.
Bunky, produkujúce protilátky, môžu byť získané zo subjektu a použité na prípravu monoklonálnych protilátok štandardným spôsobom ako je spôsob hybridómu, pôvodne opísaný v: Kohler a Milstein (1975, Náture 256:495 až 497) ( viď tiež v Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539 až 46; Brown et al. (1980) J Biol Chom 255:4980 až 83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927 až 31 a Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269 až 75). Spôsob výroby hybridómov mo noklonálnej protilátky je veľmi dobre známy (viď všeobecne R.H. Kenneth v Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plénum Publishing Corp., New York (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol.Med., 54:387 až 402; M.L. Gefret et al. (1977) Somatic Celí Genet., 3:231 až 36).
I , .
Stručne povedané, usmrtená bunečná línia (väčšinou myelóm) sa fúzuje s lymfocytmi (väčšinou so splenocytmi alebo bunkami lymfatických uzlín alebo periférnymi krvnými lymfocytmi) z cicavca, imunizovaného duálne špecifickým imunogénom, ako je opísané nižšie a supernatanty kultúr výsledných hybridómových buniek sa skrínujú na hybridom, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku s duálnou špecifitou pre dve rôzne, ale štruktúrne príbuzné záujmové molekuly. Pre prípravu duálne špecifických monoklonálnych protilátok môže byť použitý ktorýkoľvek z dobre známych spôsobov, použitých pre fúzovanie lymfocytov a usmrtených bunečných línií (viď napríklad G. Galfre et al. (1977) Náture 266:550 až 52; Gefter et al. Somatic Celí Genet., citované vyššie; Lerner, Yale J. Biol. Med., citované vyššie; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citované vyššie). Odborník v tejto oblasti techniky okrem toho iste skoro zistí, že v týchto spôsoboch existuje mnoho zmien, ktoré by tiež mohli byť použiteľné. Väčšinou sú usmrtené bunečné línie (napríklad myelómové bunečné línie) odvodené od rovnakých cicavčích druhov, ako pochádzajú lymfocyty. Napríklad, myší hybridom môže byť zostrojený fúzovaním lymfocytov z myši, imunizovanej imunogénnym preparátom podľa predkladaného vynálezu, s usmrtenou bunečnou myšou líniou. Výhodnými usmrtenými myšími líniami sú bunečné línie myšieho myelómu, ktoré sú citlivé na kultivačné médium, obsahujúce hypoxantín, aminopterín a tymidín (HAT médium). Ako partner pre fúziu podľa štandardného spôsobu môže byť použitá ktorákoľvek z myších myelómových línií, napríklad myelómové línie P3-NS 1/1-Ag4-1, P3-X63-Ag8,653 alebo Sp2/O-Agl4. Tieto myelómové línie možno získať v zbierke amerických typových kultúr (Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md.). HAT senzitívne bunky myšieho myelómu sú väčšinou fúzované s myšími splenocytmi, použitím polyetylénglykolu (PEG). Hybridómové bunky, ktoré sú výsledkom fúzie, sú potom selektované s použitím HAT média, ktoré zabíja nefúzované a neproduktívne fúzované bunky myelómu (nefúzované splenocyty uhynú po niekoľkých dňoch, pretože nie sú transformované). Hybridómové bunky, produkujúce monoklonálne protilátky, ktoré špecificky rozpoznávajú dve štruktúrne príbuzné záujmové molekuly, sú identifikované pri skríningu supernatantov kultúr hybridómov na tieto protilátky napríklad, použitím štandardného ELISA testu, pre selekciu tých protilátok, ktoré špecificky viažu dve príbuzné molekuly.
I
Pre imunizáciu in vivo môžu byť v závislosti od typu požadovanej protilátky použití rôzni živočíšni hostitelia. Môže byť použitý hostiteľ, ktorý sám exprimuje endogénnu verziu tohto antigénu (antigénov) alebo, alternatívne môže byť použitý hostiteľ, u ktorého bola preukázaná deficiencia v endogénnej verzii záujmového antigénu (antigénov). Bolo napríklad ukázané, že u myší, vykazujúcich deficienciu v určitom endogénnom proteíne cestou homológnej rekombinácie v zodpovedajúcom homológnom géne (t.j. knockoutované myši), dochádza k humorálnej odpovedi na tento proteín, pokiaľ sú ním imunizované a možno ich teda použiť na prípravu monoklonálnych protilátok s vysokou afinitou k tomuto proteínu (viď, napr. Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231 až 237; Lunn, M.P. et al. (2000) J.Neurochem. 75:404 až 412).
Pre výrobu iných než ľudských protilátok (napr. proti ľudskému duálne špecifickému antigénu) sú na výrobu protilátok vhodné iné cicavce než človek, vrátane, ale bez obmedzenia, myší, potkanov, králikov a kôz (a ich knockoutovaných verzií), i keď na výrobu hybridómu sú výhodné myši. Okrem toho môže byť pre výrobu úplne ľudských protilátok proti duálne špecifickému antigénu použitý iný než ľudský hostiteľský živočích, ktorý exprimuje súbor ľudských protilátok. Takýmito živočíchmi inými než človek sú transgénne živočíchy (napr. myši), nesúce ľudské transgény imunoglobulínov, hu-PBMC-SCID myši a radiačné chiméry človek/myš, o ktorých všetkých bude pojednané podrobne nižšie.
V jednom uskutočnení teda živočích, ktorý je imunizovaný duálne špecifickým antigénom, cicavec, iný než človek, výhodne myš, ktorý je transgénny vzhľadom k ľudským imunoglobulínovým génom, vytvára po antigénnej stimulácii ľudské protilátky. U takýchto živočíchov sú obvykle transgény ťažkých a ľahkých reťazcov imunoglobulínových transgénov s konfiguráciou ľudskej zárodočnej línie zavedené do živočíchov, ktoré boli geneticky upravené tak, že ich endogénne lokusy ťažkých a ľahkých reťazcov sú neaktívne. Po antigénnej stimulácii týchto živočíchov (napr, ľudským antigénom) sú produkované protilátky, odvodené od sekvencií ľudských imunoglobulínov (t.j. ľudské protilátky) a z lymfocytov týchto živočíchov môžu byť pripravené ľudské monoklonálne protilátky pomocou štandardnej hybridómovej technológie. Ďalší opis myší transgénnych voči ľudským imunoglobulínom a ich použitie vo výrobe ľudských protilátok je napríklad v US patente č. 5 939 598, PCT publikácii č. WO 96/33 735, PCT publikácii č. WO 96/34 096, PCT publikácii č. WO 98/24 893 a PCT publikácii č. WO 99/53 049 od Abgenic Inc. a v US patentoch č. 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016, 5 770 429, 5 814 318, 5 877 397 a PCT publikácii č. WO 99/45 962 od GenPharm Inc. Viď tiež MacQuitty,
J. J. a Kay, R.M. (1992) Science 257:1 188; Taylor, .D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287 až 6295; Lonberg, N. et al. (1994) Náture 368:856 až 859; Lonberg, N. a Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65 až 93; Harding, F.A. a Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536 až 546; Fishwild, D.M. et al. (1996) Náture Biotechnology 14: 845 až 851; Mendez, M.J. et al. (1997) Náture Genetics 15:146 až 156; Green, L.L. a Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483 až 495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231:11 až 23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401 až 410; Gallo, M.L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534 až 540.
V inom uskutočnení je živočíchom, imunizovaným duálne špecifickým antigénom, myš so závažnou kombinovanou imunodeficienciou (SCID), ktorá bola rekonštituovaná ľudskými periférnymi krvnými monocytmi alebo lymfatickými bunkami alebo ich prekurzormi. U takýchto myší, nazývaných huPBMC-SCID chimérické myši, bolo zistené, že ako odpoveď na antigénnu stimuláciu produkujú ľudské imunoglobulíny. Ďalší opis týchto myší a ich použitia pri tvorbe protilátok je napríklad v Leader, K. A. et al. (1992) Immunology 76: 229 až 234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195: 360 až 375; Murphy,
W. J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8: 233 až241; Herz, U. et al. (1997) Int. Árch. Allergy Immunol. 113: 150 až 152; Albert, S. E. et al. (1997) J. Immunol. 159: 1393 až 1403 ; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41: 901 až 907; Arai, K. et al. (1998) I. Immunol. Methods 217: 79 až 85; Yoshinari,
K. a Arai, K. (1998) Hybridoma 17: 41 až 45 ; Hutchins, W. A. et al. (1999) Hybridoma 18: 121 až 129; Murphy, W. J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90: 22 až 27; Smithson, S. L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36: 113 až 124 ; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180: 268 až 277, a Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5: 35 až 45.
V inom uskutočnení je živočíchom, ktorý je imunizovaný duálne špeciI 1 fickým antigénom, myš, ktorá bola ožiarená letálnou dávkou, nasledovanou ochranou proti ožiareniu bunkami kostnej drene myši so závažnou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) a ktorej boli implantované funkčné ľudské lymfocyty. Tento typ chiméry, označovaný ako systém Trimera, bol použitý na výrobu ľudských monoklonálnych protilátok imunizáciou myši záujmovým antigénom, nasledovanou prípravou monoklonálnych protilátok pomocou štandardného hybridómu. Pre ďalší detailný popis týchto myší a ich použitia vo výrobe protilátok viď napríklad Eren, R. Et al. (1998) Immunology 93:154 až 161; Reisner, Y. A Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242 až 246; Ilan, E. Et al. (1999) Hepatology 29:553 až 562 a Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96:634 až 641.
B. Prístupy in vitro
Alternatívou k príprave duálne špecifických protilátok imunizáciou in vivo a selekciou je identifikácia a izolácia duálne špecifických protilátok podľa tohto vynálezu skríningom rekombinačnej kombinačnej knižnice imunoglobulínov (napr. zobrazovacia knižnica fágových protilátok, antibody phage display library) duálne špecifickým antigénom, čím sú izolované členy knižnice imunoglobulínov, ktoré sa viažu špecificky ku dvom štruktúrne príbuzným, ale odlišným záujmovým molekulám. Kity pre tvorbu a skríning fágových zobrazovacích knižníc sú komerčne dostupné (napr. Pharmacia Recombinant Phage Antibody Systém, č. kat. 27-9400-01 a Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, kat. č. 240 612). V niektorých uskutočneniach je fágovou zobrazovacou knižnicou scFV knižnica alebo Fab knižnica. Spôsob zobrazenia fágu pre skríning knižníc rekombinantných protilátok bol v tejto oblasti techniky rozsiahlo opísaný. Príklady spôsobov a zlúčenín obzvlášť vhodných pre použitie v tvorbe a pri skríningu zobrazovacej knižnice protilátok môžeme nájsť napríklad v McCafferty et al., medzinárodná prihláška zverejnená pod č. WO 92/01 047, US patent č. 5 969 108 a EP 589 877 (opisujúce hlavne zobrazenie scFV),
Ladner et al. US patenty č. 5 223 409, č. 5 403 484, č. 5 571 698, č. 5 837 500 a EP 436 597 (opisujúce napríklad pili fúziu); Dover et al., medzinárodná prihláška zverejnená pod č. WO 91/17 271, US patent č, 5 427 908, US patent č. 5 580 717 a EP 527 839 (opisujúce hlavne zobrazenie Fab); Winter et al., medzinárodná prihláška zverejnená pod č. WO 92/20 709 a EP 368 684 (opisujúce hlavne klonovanie sekvencií varaiabilných domén imunoglobulínov); Griffiths et al. US patent č. 5 885 793 a EP 589 877 (opisujúce hlavne izoláciu ľudských protilátok voči ľudským antigénom pomocou rekombinantných knižníc); Garrard et al., medzinárodná prihláška zverejnená pod č. WO 92/09690 (opisujúca hlavne fágové expresné spôsoby); Knappik et al., medzinárodná prihláška zverejnená pod č. WO 97/08320 (opisujúca knižnicu HuCal ľudských rekombinantných protilátok); Salfeld et al., medzinárodná prihláška zverejnená pod č. WO 97/29131, opisujúca prípravu rekombinantnej ľudskej protilátky voči ľudskému antigénu (faktor alfa ľudského nekrózneho tumoru), ako aj in vitro afinitne zrenie rekombinantnej protilátky) a Salfeld et al., predbežná prihláška US č. 60/126 603, opisujúca tiež prípravu rekombinantnej ľudskej protilátky voči ľudskému antigénu (ľudský interleukín-12), ako aj in vitro afinitne zrenie rekombinantnej protilátky).
Ďalšie opisy skríningov knižníc rekombinantných protilátok môžeme tiež nájsť vo vedeckých publikáciách, ako napríklad Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370 až 1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 až 85; Huse et al. (1989) Science 246:1275 až 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725 až 734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889 až 896; Clarkson et al. (1991) Náture 352:624 až 628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576 až 3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373 až 1377; Hbogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133 až 4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978 až 7952; McCafferty et al. Náture (1990) 348:552 až 554 a Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57 až 86.
Ako alternatíva k fágovým zobrazovacím systémom môžu byť knižnice rekombinantných protilátok exprimované na povrchu kvasničných buniek alebo bakteriálnych buniek. Spôsoby prípravy a skríningu knižníc exprimovaných na povrchu kvasničných buniek sú ďalej opísané v PCT publikácii WO 99/36 569.
Spôsoby prípravy a skríningu knižníc exprimovaných na povrchu bakteriálnych buniek sú ďalej opísané v PCT publikácii WO 98/49 286.
Akonáhle je záujmová protilátka identifikovaná z kombinačnej knižnice, sú potom nukleové kyseliny (DNA), kódujúce ľahké a ťažké reťazce tejto protilátky, izolované štandardnými spôsobmi molekulárnej biológie, ako je zosilnenie (amplifikácia) DNA pomocou PCR zo zobrazeného súboru (napr. fágu), izolovaného pri skríningu knižnice. Nukleotidové sekvencie génov ľahkých a ťažkých reťazcov protilátok, z ktorých môžu byť pripravené PCR priméry, sú v tejto oblasti techniky známe. Napríklad mnoho takých sekvencii je uverejnených v Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH publikácia č. 91-3242 a v databáze Vbase sekvencii ľudských zárodočných línií.
Protilátka alebo časť protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť pripravené expresnou rekombináciou génov imunoglobulínových ľahkých a ťažkých reťazcov v hostiteľskej bunke. Aby bola protilátka rekombinantne exprimovaná, je hostiteľská bunka transfektovaná jedným alebo viacerými rekombinantnými expresnými vektormi, nesúcimi fragmenty DNA, kódujúcimi ľahké a ťažké reťazce imunoglobulínu protilátky, tak, že v hostiteľskej bunke sú exprimované ľahké i ťažké reťazce a výhodne vylučované do média, v ktorom sú hostiteľské bunky kultivované, a z ktorého môžu byť tieto protilátky získané. Na získanie génov ťažkých a ľahkých reťazcov protilátok sú použité štandardné spôsoby rekombinantnej DNA, inkorporujúce tieto gény do expresných vektorov a zavádzajúce tieto vektory do hostiteľských buniek, tak, ako je opísané v Sambrook, Fritsch a Maniatis (editori), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (editori) Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates, (1989) a v US Patente č. 4 816 97 podľa Boss et al.
Akonáhle sú získané fragmenty DNA kódujúce segmenty VH a LV záujmovej protilátky, môžu byť ďalej upravované spôsobmi štandardnej rekombinantnej DNA, aby boli napríklad gény variabilnej oblasti konvertované na gény reťazcov úplnej dĺžky protilátky, na gény Fab fragmentov alebo na gény scFv. Pri týchto úpravách je fragment DNA, kódujúci VL alebo VH operatívne pri pojený k inému DNA fragmentu, kódujúcemu iný protein, ako konštantná oblasť protilátky alebo ohybný mostík. Termín operatívne viazaný, tak ako je používaný v tomto kontexte, značí, že tieto dva fragmenty DNA sú spojené tak, že aminokyselinové sekvencie, kódované týmito dvoma DNA fragmentárni zostávajú v rámci.
Izolovaná DNA, ktorá kóduje VH oblasť, môže byť premenená na gén úplnej dĺžky ťažkého reťazca operatívnym naviazaním DNA, kódujúcej VH, k inej molekule DNA, kódujúcej konštantné oblasti ťažkého reťazca (CH1, CH2 a CH3). Tieto sekvencie génov konštantných oblastí ľudského ťažkého reťazca sú v tejto oblasti techniky dobre známe (viď, napr. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) a DNA fragmenty, obklopujúce tieto oblasti môžu byť získané štandardným PCR zosilnením. Konštantnou oblasťou ťažkého reťazca môže byť konštantná oblasť IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM alebo IgD, ale najvýhodnejšie je konštantná oblasť IgGl alebo IgG4. Pre gén Fab fragmentu ťažkého reťazca môže byť DNA, kódujúca VH, operatívne viazaná k inej molekule DNA, kódujúcej iba CH1 konštantnú oblasť ťažkého reťazca.
Izolovaná DNA, kódujúca VL oblasť, môže byť premenená na gén úplnej dĺžky ľahkého reťazca (tiež ako gén Fab ľahkého reťazca) operatívnym naviazaním DNA, kódujúcej VL na inú molekulu DNA, kódujúcu konštantnú oblasť, CL, ľahkého reťazca. Tieto sekvencie génov konštantnej oblasti ľudského ľahkého reťazca sú v tejto oblasti techniky dobre známe (viď, napr. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) a fragmenty DNA, obklopujúce tieto oblasti možno získať štandardným PCR zosilnením. Konštantnou oblasťou ľahkého reťazca môže byť konštantná oblasť kappa alebo lambda, ale najvýhodnejšia je konštantná oblasť kappa.
Pre vytvorenie génu scFv sú DNA fragmenty, kódujúce VH a VL operatívne napojené na iné fragmenty, kódujúce ohybný mostík, napr. kódujúce aminokyselinovú sekvenciu (Gly4-Ser)3, takže VH a VL sekvencie môžu byť exprimované ako súvislý jednoreťazcový protein, s VL a VH oblasťami spojenými ohybným mostíkom (viď napríklad Bird et al. (1988) Science 242:423 až 426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 až 5883; McCafferty et al., Náture (1990) 348:552 až 554).
Pre expresiu rekombinantných protilátok alebo častí protilátok podľa tohto vynálezu môžu byť DNA, kódujúce čiastočné alebo úplné dĺžky ľahkých a ťažkých reťazcov, získané podľa opisu uvedeného vyššie, inzerované do expresných vektorov, takže tieto gény sú operatívne naviazané na sekvencie kontroly transkripcie a translácie. V tomto kontexte termín operatívne viazaný znamená, že gén protilátky je viazaný do vektora, takže transkripčné a translačné kontrolné sekvencie v rámci vektora vykonávajú ich zamýšľanú funkciu v regulácii transkripcie a translácie génu protilátky. Expresný vektor a sekvencie kontroly expresie sú vybrané tak, aby boli kompatibilné s použitou expresnou hostiteľskou bunkou. Gén ľahkého reťazca protilátky a gén ťažkého reťazca protilátky môžu byť inzertované (vsunuté) do rôznych vektorov, ale väčšinou sú inzertované do jedného expresného vektora. Tieto protilátkové gény sú inzertované do expresného vektora štandardnými spôsobmi (napr. ligáciou komplementárnych reštrikčných miest na fragmenty protilátkových génov a vektory alebo ligáciou na tupé konce, pokiaľ nie sú prítomné žiadne reštrikčné miesta). Pred inzerciou sekvencii ľahkého a ťažkého reťazca môžu už expresné vektory niesť sekvencie konštantnej oblasti protilátky. Napríklad, jedným možným spôsobom premeny sekvencii VH a VL na sekvencie úplnej dĺžky protilátkových génov je ich inzercia do expresných vektorov, ktoré už kódujú konštantné oblasti ľahkého reťazca, prípadne konštantné oblasti ťažkého reťazca, takže segment VH je operatívne viazaný k CH segmentu (segmentom) vnútri vektora a VL segment je operatívne viazaný na CL segment vnútri vektora. Okrem toho alebo alternatívne môže rekombinantný expresný vektor kódovať signálny peptid, ktorý uľahčuje vylučovanie protilátkového reťazca z hostiteľskej bunky. Gén tohto protilátkového reťazca môže byť klonovaný vo vektore, takže je tento signálny peptid viazaný v rámci amino konca génu protilátkového reťazca. Týmto signálnym peptidom môže byť imunoglobulínový signálny peptid alebo heterológny signálny peptid (t.j., signálny peptid z neimunoglobulínového proteínu).
Okrem týchto génov protilátkových reťazcov nesú expresné rekombinantné vektory podľa tohto vynálezu tiež regulačné sekvencie, ktoré kontrolujú expresiu génov protilátkových reťazcov v hostiteľskej bunke. Pod termínom regulačná sekvencia je treba rozumieť promótory, zosilňovače a iné kontrolné prvky expresie (napr. polyadenylačné signály), ktoré kontrolujú transkripciu a transláciu génov protilátkových reťazcov. Tieto regulačné sekvencie sú opísané napríklad v Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Odborníci v tejto oblasti techniky iste uznajú, že zostavenie expresného vektora bude iste závisieť od takých faktorov, ako je výber hostiteľskej bunky, ktorá má byť transformovaná, hladina požadovanej expresie proteínu atď.. Výhodné regulačné sekvencie pre expresiu v cicavčích hostiteľských bunkách obsahujú vírusové prvky, ktoré riadia vysoké hladiny expresie proteínu v cicavčích bunkách, ako sú promótory a/alebo zosilňovače, odvodené od megalovírusu (CMV) (ako je CMV promótor/zosilňovač), Simian vírusu 40 (SV40) (ako je SV40 promótor/zosilňovač), adenovírusu (napr. neskorý promótor adenovírusu (AdMLP)) a polyómu. Pre ďalší opis týchto vírusových regulačných prvkov a ich častí viď napríklad US patent č. 5 168 062 od Stinski, US patent č. 4 510 245 od Beli et al. a US patent č. 4 968 615 od Schaffner et al.
Okrem génov protilátkových reťazcov a regulačných sekvencii môžu rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu niesť doplnkové 'sekvencie, ako sú sekvencie, ktoré regulujú replikáciu vektora v hostiteľskej bunke (napr. počiatky replikácie) a gény selekčných markerov. Tieto selekčné markery uľahčujú selekciu hostiteľských buniek, do ktorých bol zavedený vektor (viď, napr. US patenty č. 4 399 216, 4 634 665 a 5 179 017, všetky od Axel et al.). Tieto selekčné markery väčšinou vnášajú rezistenciu voči určitým látkam, ako je G418, hygromycín alebo metotrexát, do hostiteľskej bunky, do ktorej bol vektor introdukovaný. Výhodné selekčné markerové gény obsahujú gén dihydrofolátreduktázy (DHFR, pre použitie v dhfr‘ hostiteľských bunkách so selekciou/zosilnením metotrexátu) a gén neo (pre selekciu G418).
Pre expresiu ťažkých a ľahkých reťazcov je expresný vektor (vektory), kódujúci ľahké a ťažké reťazce, štandardným spôsobom transfektovaný do hos titeľskej bunky. Rôzne formy termínu transfekcia sú myslené tak, aby pokrývali široké spektrum všeobecne používaných postupov pre introdukciu exogénnej DNA do prokaryontných alebo eukaryontných hostiteľských buniek, napr. elektroporáciu, precipitáciu fosforečnanom vápenatým, transfekciu DEAEdextranom a im podobné. I keď je teoreticky možné exprimovať protilátky podľa tohto vynálezu buď v prokaryontnej alebo v eukaryontnej bunke, je expresia v eukaryontnej bunke, najvýhodnejšie cicavčej hostiteľskej bunke, najvýhodnejšia, pretože také eukaryontné bunky, hlavne cicavčie bunky, sú vhodnejšie než prokaryontné bunky pre tvorbu a vylučovanie patričných natívnych a imunologický aktívnych protilátok. Bolo zistené, že expresia protilátkových génov prokaryontami je neefektívna z hľadiska dosiahnutia vysokých výťažkov aktívnej protilátky (Boss, M.A. a Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6:12 až 13.
Medzi výhodné cicavčie bunky pre expresiu rekombinantných protilátok podľa tohto vynálezu patria vaječníkové bunky čínského škrečka (Chinese Hamster ovary cells, CHO bunky) (vrátane dhfr- CHO buniek, ktoré opísali Urlaub a Chasin, (1980) Pre. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 až 4220, použité, napr. so selekčným markerom DHFR, ktorý opísali R.J. Kaufman a P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 až 621), NSO myelómové bunky, COS bunky a SP2 bunky. Pokiaľ sú do cicavčích hostiteľských buniek introdukované rekombinantné expresné vektory, kódujúce protilátkové gény, sú protilátky produkované kultiváciou buniek počas doby dostatočnej na umožnenie expresie protilátky v hostiteľských bunkách alebo, výhodnejšie, pre vylučovanie protilátky do kultivačného média, v ktorom sú hostiteľské bunky pestované. Protilátky možno z kultivačného média získať štandardnými spôsobmi purifikácie proteínov.
Hostiteľské bunky môžu byť tiež použité pre výrobu častí intaktných protilátok, ako sú Fab fragmenty alebo scFv molekuly. Je treba si uvedomiť, že zmeny vo vyššie uvedenom postupe sú tiež v zámere predkladaného vynálezu. Napríklad, môže byť žiaduce transfektovať hostiteľskú bunku s DNA, kódujúcou buď ťažký alebo ľahký reťazec (ale nie oba) protilátky podľa tohto vynálezu. Môže byť tiež použitá rekombinantná DNA na odstránenie niektorej alebo všetkej DNA, kódujúcej buď ľahký alebo ťažký reťazec alebo oba, ktoré nie sú potrebné pre väzbu záujmových antigénov. Molekuly exprimované takto oklieštenými molekulami DNA patria tiež medzi protilátky podľa tohto vynálezu. Okrem toho možno produkovať bifunkčné protilátky, v ktorých je jeden ťažký a jeden ľahký reťazec z protilátky podľa tohto vynálezu a ďalší ťažký a ľahký reťazec sú špecifické pre antigén, iný než záujmové antigény, priečnou väzbou protilátky podľa tohto vynálezu na druhú protilátku štandardnými postupmi chemického priečneho sieťovania.
Vo výhodnom systéme pre rekombinantnú expresiu protilátky alebo jej antigén viažucej časti podľa tohto vynálezu je rekombinantný expresný vektor, kódujúci ľahký i ťažký protilátkový reťazec, zavedený do dhfr- CHO buniek transfekciou sprostredkovanou fosforečnanom vápenatým. Vnútri rekombinantného expresného vektora sú gény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky operatívne viazané k CMV zosilňovacím/AdMLP promótorovým regulačným prvkom, aby riadili vysoké hladiny transkripcie týchto génov. Tento rekombinantný expresný vektor tiež nesie DHFR gén, ktorý umožňuje selekciu CHO buniek, ktoré boli transfektované vektorom, používajúcim selekciu/amplifikáciu metotrexátu. Selektované transformantné hostiteľské bunky sú kultivované, aby bola umožnená expresia ťažkých a ľahkých reťazcov protilátky. Intaktná protilátka je získaná z kultivačného média. Pre prípravu rekombinantného expresného vektora, transfekciu hostiteľskej bunky, selekciu transformantov, kultiváciu hostiteľských buniek a získanie protilátky z kultivačného média sú použité štandardné spôsoby molekulárnej biológie. Vynález okrem toho poskytuje spôsob syntézy rekombinantnej protilátky podľa tohto vynálezu kultiváciou hostiteľskej bunky podľa tohto vynálezu vo vhodnom kultivačnom médiu, pokiaľ je rekombinantná protilátka podľa tohto vynálezu syntetizovaná.
Alternatívou ku skríningu knižníc rekombinantných protilátok zobrazením fága, môžu byť ďalšie spôsoby, známe na tomto poli techniky pre skríning veľkých kombinačných knižníc, použité pre identifikáciu duálne špecifických protilátok podľa tohto vynálezu. Jedným typom alternatívneho expresného systému je systém, v ktorom je knižnica rekombinantných protilátok exprimovaná ako RNA-proteínová fúzia, opísaná v PCT prihláške zverejnenej pod č. WO 98/3 1 700 pôvodcov Szostak a Roberts a v publikácii Roberts, R.W. a Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12 297 až 12 302. V tomto systéme je vytvorená kovalentná fúzia medzi mRNA a ňou kódovaným peptidom alebo proteínom, transláciou in vitro syntetických mRNA, ktoré na svojom 3' konci nesú puromycín, peptidový akceptor antibiotík. Určitá mRNA môže byť teda obohatená zo zložitej zmesi mRNA (napr. kombinačná knižnica) na základe vlastností kódovaného peptidu alebo proteínu, napr. protilátky alebo jej časti, ako je väzba protilátky alebo jej časti k duálne špecifickému antigénu. Sekvencie nukleovej kyseliny, kódujúce protilátky alebo ich časti, získané skríningom týchto knižníc, môžu byť exprimované rekombinantným spôsobom, ako je opísané vyššie (napr. v cicavčích hostiteľských bunkách) a okrem toho môžu byť predmetom ďalšieho afinitného zrenia buď ďalšími cyklami skríningu fúzií mRNA-peptid, v ktorých boli zavedené mutácie do pôvodne vybranej sekvencie (sekvencii) alebo iným spôsobom afinitného zrenia rekombinantných protilátok in vitro, ako je opísané vyššie.
C. Kombinačné prístupy
Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť tiež pripravené použitím kombinačných prístupov in vivo alebo in vitro, takými spôsobmi, v ktorých je duálne špecifický antigén pôvodne vystavený protilátkovému súboru in vivo v hostiteľskom živočíchovi, aby bola stimulovaná produkcia protilátok, ktoré viažu duálne špecifický antigén, ale v ktorom je uskutočnená ďalšia selekcia protilátok a/alebo zrenia (t.j., zlepšenia) pomocou jednej alebo viacerých in vitro techník.
V jednom uskutočnení tento kombinačný prístup obsahuje najprv imunizáciu živočícha, iného než človeka (napr. myš, potkan, králik, koza alebo ich transgénne verzie alebo chimérická myš), duálne špecifickým antigénom pre stimuláciu protilátkovej odpovede voči antigénu, nasledovanú prípravou a skríningom fágovej zobrazovacej protilátkovej knižnice pomocou imunoglobulínových sekvencii z lymfocytov, stimulovaných in vivo expozíciou voči duálne špecifickému antigénu. Prvý krok tohto kombinačného postupu môže byť uskutočnený ako je opísané v oddiele IIA vyššie, zatiaľ čo druhý krok tohto postupu môže byť uskutočnený, ako je opísané v oddiele IIB vyššie. Výhodné postupy hyperimunizácie živočíchov, iných než človek, nasledované skríningom in vitro fágových zobrazovacích knižníc, pripravených zo stimulovaných lymfocytov, obsahujú postupy, opísané u BioSite Inc., viď napr. PCT publikácia WO 98/47 343, PCT publikácia WO 91/17 271, US patent č. 5 427 908 a US patent č. 5 580 717.
V inom uskutočnení je v kombinačnom postupe obsiahnutá najprv imuni- i
zácia iného než ľudského živočícha (napr. myš, potkan, králik, koza alebo ich knockoutovaná a/alebo transgénna verzia alebo chimérická myš) s duálne špecifickým antigénom pre stimuláciu protilátkovej odpovede na antigén a selekcia lymfocytov, ktoré produkujú protilátky s požadovanou duálnou špecifitou (napr. skríningom hybridómov, pripravených z imunizovaných zvierat). Prestavané protilátkové gény z vybraných klonov sa potom izolujú (štandardnými spôsobmi klonovania, ako je reverzná transkriptáza - polymerázová reťazová reakcia) a sú predmetem afinitného zrenia in vitro, čím sú zosilnené väzbové vlastnosti vybranej protilátky alebo protilátok. Prvý krok tohto postupu môže byť uskutočnený podľa opisu v oddiele IIA vyššie, zatiaľ čo druhý krok tohto postupu môže byť uskutočnený, ako je opísané v oddiele IIB vyššie, hlavne použitím in vitro spôsobov zrenia, ktoré sú opísané v PCT publikácii WO 97/29 131 a PCT publikácii WO 00/56 772.
V ešte inom kombinačnom spôsobe sú rekombinantné protilátky generované z jednotlivých, izolovaných lymfocytov, použitím postupu, označovaného v tejto oblasti techniky ako spôsob vybraných lymfocytárnych protilátok (selected lymphocyte antibody method, SLÁM), opísaného v US patente č. 5 627 052, PCT publikácii WO 92/02 551 a v Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:7843 až 7848. V tomto spôsobe, aplikovanom na duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu, je najprv iný než ľudský živočích (napr. myš, potkan, králik, koza alebo ich transgénna verzia alebo chimérická myš) imunizovaný in vivo duálne špecifickým antigénom pre stimuláciu protilátkovej odpovede proti tomuto antigénu a potom sa jednotlivé bunky, vylučujúce záujmové protilátky, napr. špecifické voči duálne špecifickému antigénu, selektujú pomocou antigén-špecifického hemolytického plakového testu (napr. duálne špecifický antigén samotný alebo štruktúrne príbuzné záujmové molekuly sú pripojené k ovčím červeným krvinkám pomocou mostíka, ako je biotín, čím je umožnená identifikácia jednotlivých buniek, ktoré vylučujú protilátky s vhodnou špecifitou, pomocou testu hemolytických plakov). Po identifikácii buniek, vylučujúcich záujmové protilátky, sú ťažké a ľahké reťazce variabilných oblastí cDNA uvoľnené z buniek reverznou transkriptázou a PCR a tieto variabilné oblasti môžu byť potom exprimované v kontexte príslušných imunoglobulínových konštantných oblastí (napr. ľudské konštantné oblasti), v cicavčích hostiteľských bunkách, ako sú COS alebo CHO bunky. Tieto hostiteľské bunky, transfektované zosilnenými (amplifikovanými) imunoglobulínovými sekvenciami, odvodenými od in vivo vybraných lymfocytov, môžu byť potom ďalej analyzované a selektované in vitro napríklad kontrolou transfektovaných buniek, aby boli izolované bunky, exprimujúce protilátky s požadovanou duálnou špecifitou. Tieto zosilnené imunoglobulínové sekvencie môžu byť ďalej ovplyvňované in vitro, ako napr. in vitro afinitným zrením, ako je opísané vyššie.
V inom uskutočnení obsahuje kombinačný spôsob nasledujúce kroky, aby boli produkované duálne špecifické protilátky. Najprv je iný než ľudský živočích imunizovaný prvým antigénom a druhý, iný než ľudský živočích je imunizovaný druhým, odlišným antigénom, pričom druhý antigén je výhodne štruktúrne podobný prvému antigénu, aby bola stimulovaná protilátková odpoveď in vivo. Z protilátkových génov je zostrojená knižnica rekombinantných ťažkých reťazcov a knižnica rekombinantných ľahkých reťazcov, odvodených od prvého živočícha, iného než človek, prípadne druhého živočícha, iného než človek, ako je opísané v oddiele IIB. Knižnica ťažkého reťazca zo živočícha, imunizovaného prvým antigénom je spojená s knižnicou ľahkého reťazca zo živočícha, imunizovaného druhým antigénom, aby vznikla knižnica protilátok X. Podobne, knižnica ťažkého reťazca zo živočícha, imunizovaného druhým antigénom je spojená s knižnicou ľahkého reťazca zo živočícha, imunizovaného prvým antigénom, aby bola vytvorená knižnica protilátok Y. Navyše môžu byť knižnice X a Y spojené za vzniku knižnice XY. Duálne špecifické protilátky, ktoré viažu prvý i druhý antigén, môžu byť identifikované a izolované z knižníc X, Y a/alebo XY knižníc.
III. Charakteristiky duálne špecifických protilátok
Tento vynález poskytuje duálne špecifické protilátky, ako aj časti týchto protilátok, ktoré môžu byť pripravené spôsobmi podľa tohto vynálezu. Týmito protilátkami, prípadne ich časťami, sú výhodne izolované protilátky. Týmito protilátkami, prípadne ich časťami, sú výhodne neutralizujúce protilátky. Protilátkami podľa tohto vynálezu sú tiež monoklonálne a rekombinantné protilátky, prípadne ich časti. V rôznych uskutočneniach môžu protilátky alebo ich časti obsahovať sekvencie aminokyselín odvodené úplne od jednotlivých živočíšnych druhov, ako sú protilátky alebo ich časti úplne ľudského alebo úplne myšieho pôvodu. V iných uskutočneniach môžu byť týmito protilátkami alebo ich časťami chimérické protilátky, protilátky s implantovanou CDR alebo iné formy ľudských protilátok.
Termín protilátka, ako je tu používaný, označuje imunoglobulínové molekuly, zložené zo štyroch polypeptidových reťazcov, dvoch ťažkých (H) reťazcov a dvoch ľahkých (L) reťazcov, vzájomne spojených disulfidickými väzbami. Každý ťažký reťazec je zložený z variabilnej oblasti ťažkého reťazca (skracovanej tu ako HCVR alebo VH) a konštantnej oblasti ťažkého reťazca. Táto konštantná oblasť ťažkého reťazca je zložená z troch domén, CH1, CH2 a CH3. Každý ľahký reťazec je zložený z variabilnej oblasti ľahkého reťazca (tu označovanej ako LCVR alebo LV) a konštantnej oblasti ľahkého reťazca. Konštantná oblasť ľahkého reťazca je tvorená jednou doménou, CL. Oblasti VH a LH môžu byť ďalej delené na oblasti hypervariability, ktoré sú nazývané oblasťami určujúcimi komplementaritu (complementarity determining regions, CDR), ktoré sú oddelené oblasťami, ktoré sú viac konzervatívnejšie a sú nazývané rámcové oblasti (framework regions - FR). Každá VH a VL je zložená z troch CDR a štyroch FR, usporiadaných od N-koncov k C-koncom v nasledujúcom poradí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Termín antigén viažuca časť protilátky (alebo jednoducho časť protilátky), ako je tu používaný, označuje jeden alebo viac fragmentov duálne špecifickej protilátky, ktoré si uchovávajú schopnosť špecificky sa viazať na dva rôzne, ale štruktúrne príbuzné antigény. Bolo zistené, že antigén viažuca funkcia protilátky môže byť predstavovaná fragmentom s dĺžkou celej protilátky.
Príklady viažucich sa fragmentov, obsiahnutých v rámci termínu antigén viažuca časť protilátky, obsahujú (i) Fab fragment, čo je monovalentný fragment, zahrnujúci VL, VH, CL a CH1 domény; (ii) F(ab')2 fragment, čo je bivalentný fragment, obsahujúci dva Fab fragmenty, viazané disulfidickým mostíkom v oblasti čapu; (iii) Fd fragment, zahrnujúci VH a CH1 domény; (iv) FV fragment, zahrnujúci VL a VH domény jedného ramena protilátky, (v) dAB fragment (Ward et al., (1989) Náture 341:544 až 546), ktorý zahrnuje VH doménu a vi) izolovanú oblasť, určujúcu komplementaritu (CDR). Okrem toho, i keď dve domény Fv fragmentu, VH a VL, sú kódované oddelenými génmi, môžu byť použitím rekombinantných spôsobov spojené syntetickým mostíkom, ktorý umožňuje, aby boli produkované vo forme jedného proteínového reťazca, v ktorom VL a VH oblasti tvoria monovalentné molekuly (známe ako jednoduché reI ťazce Fv (scFv); viď napr. Bird et al. (1988) Science 242:423 až 426 a Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 až 5883). Tieto jednoreťazcové protilátky sú tiež chápané pod termínom antigén viažuce časti protilátky. Iné formy reťazcových protilátok, ako diaprotilátky, sú tiež obsiahnuté v tomto termíne. Diaprotilátky sú bivalentné, bišpecifické protilátky, ktorých VH a VL domény sú exprimované v jednom polypeptidovom reťazci, ale dôsledkom mostíka, ktorý je príliš krátky, aby dovolil párovanie medzi týmito dvoma doménami v rámci jedného reťazca, sa tieto domény párujú s komplementárnymi doménami iných reťazcov a tvoria tak dve antigén viažuce miesta (viď napr. Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 až 6448; Poljak,
R. J., et al. (1994) Structure 2:1121 až 1123.
Protilátka alebo jej antigén viažuca časť môžu byť časťou väčších imunoadhéznych molekúl, vzniknutých kovalentnou alebo nekovalentnou asociáciou protilátky alebo jej časti s jedným alebo viacerými inými proteínmi alebo peptidmi. Príklady takých imunoadhezívnych molekúl obsahujú použitie jadrovej oblasti streptavidínu pre tvorbu tetramérnej scFv molekuly (Kyprianov,
S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93 až 101) a použitie cysteínového zvyšku, markerového peptidu a C-koncového polyhistidínového tágu pre tvorbu bivalentných a biotinylovaných scFv molekúl (Kyprianov, S.M. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047 až 1058). Časti protilátky, ako Fab a F(ab')2 fragmenty, môžu byť pripravené z celých protilátok konvenčným spô sobom, ako je papaínové alebo pepsínové štiepenie celých protilátok. Okrem toho môžu byť protilátky, časti protilátok a imunoadhezívne molekuly získané štandardnými rekombinantnými postupmi.
Termín izolovaná duálne špecifická protilátka, ako je tu používaný, označuje duálne špecifickú protilátku, ktorá v podstate neobsahuje žiadne iné protilátky, ktoré majú odlišné antigénne špecifity (napr. izolovaná protilátka, ktorá špecificky viaže dva rozdielne, ale štruktúrne príbuzné antigény, ale je v podstate prostá protilátok, ktoré špecificky viažu iné nepríbuzné antigény). Okrem toho môže byť izolovaná duálne špecifická protilátka v podstate prostá iného bunečného materiálu a/alebo iných chemikálií.
Termín neutralizujúca protilátka, ako je tu použitý, označuje protilátku, ktorej väzba k príslušnému antigénu má za následok inhibíciu biologickej aktivity tohto antigénu. Táto inhibícia biologickej aktivity antigénu môže byť odhadnutá meraním jedného alebo viacerých ukazovateľov biologickej aktivity tohto antigénu pomocou vhodného in vitro alebo in vivo testu.
Termín monoklonálna protilátka, ako je tu používaný, označuje protilátku odvodenú od hybridómu (napr. protilátku vylučovanú hybridómom, pripraveným hybridómovou technológiou, ako je štandardná hybridómová technológia podľa Kohlera a Milsteina). Duálne špecifická protilátka podľa tohto vynálezu, odvodená od hybridómu, je teda stále označovaná ako monoklonálna protilátka, i keď má antigénnu špecifitu proti viac než jednému jednotlivému antigénu.
Termín rekombinantná protilátka označuje protilátky, ktoré sú pripraI ' vené, exprimované, vytvorené alebo izolované rekombinantným spôsobom, tak ako protilátky, exprimované použitím rekombinantného expresného vektora, transfektovaného do hostiteľskej bunky, protilátky, izolované z knižnice rekombinantných kombinačných protilátok, izolované zo živočícha (napr. myši), ktorý je transgénny voči ľudským imunoglobulínovým génom (viď, napr. Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287 až 6295) alebo protilátky, ktoré sú pripravené, exprimované, vytvorené alebo izolované iným spôsobom, ktorý obsahuje napojenie príslušných imunoglobulínových génových sekvencií (ako sú sekvencie ľudských imunoglobulínových génov) k iným DNA sekvenciám. Príklady rekombinantných protilátok obsahujú chimérické, CDR implantované a humanizované protilátky.
Termín ľudská protilátka označuje protilátky, ktoré majú variabilné a
I konštantné oblasti zodpovedajúce alebo odvodené od imunoglobulínových ľudských zárodočných sekvencii, ako je opísané, napr. v Kabat et al. (viď Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication č. 91-3242). V niektorých uskutočneniach sú však také rekombinantné ľudské protilátky predmetom mutagenézy in vitro alebo, pokiaľ je použitý živočích transgénny pre ľudské Ig sekvencie, in vivo somatickej mutagenézy, a aminokyselinové sekvencie VH a LH oblastí rekombinantných protilátok sú sekvenciami, ktoré, ak sú odvodené a príbuzné od ľudských zárodočných VH a VL sekvencii, nemôžu existovať v rámci prirodzeného súboru zárodočných ľudských protilátok in vivo. V určitých uskutočneniach sú však tieto rekombinantné protilátky výsledkom selektívnej mutagenézy, spätnej mutácie alebo oboje.
Termín spätná mutácia označuje proces, v ktorom sú niektoré alebo všetky somaticky mutované aminokyseliny nahradené zodpovedajúcimi zvyškami zárodočnej línie z homológnych sekvencii zárodočných protilátkových sekvencii. Sekvencie reťazcov ťažkého a ľahkého reťazca ľudskej protilátky podľa tohto vynálezu sú oddelene porovnané so sekvenciami zárodočnej línie v databáze VBASE, aby boli identifikované sekvencie s najvyššou homológiou. Rozdiely v ľudskej protilátke podľa tohto vynálezu sú opravené podľa sekvencií zárodočnej línie mutovaním definovaných nukleotidových pozícií, kódujúcich tieto rôzne aminokyseliny. Úloha každej aminokyseliny, identifikovanej ako kandidát pre spätnú mutáciu by mala byť vyskúšaná na jej priamu alebo nepriamu úlohu vo väzbe antigénu a akákoľvek aminokyselina, ktorá by po mutácii menila požadované charakteristiky ľudskej protilátky, by nemala byť obsiahnutá vo výslednej ľudskej protilátke, aby bol minimalizovaný počet aminokyselín, ktoré sú predmetom spätnej mutácie tých aminokyselinových pozícií, ktoré boli nájdené ako odlišné od najbližšej sekvencie zárodočnej línie, ale identické so zodpovedajúcou aminokyselinou v druhej zárodočnej línii, a ktoré môžu zostať, za predpokladu, že táto druhá sekvencia zárodočnej línie je identická a kolineárna so sekvenciou ľudskej protilátky podľa tohto vynálezu v najmenej 10, výhodne v 12 aminokyselinách na oboch stranách dotyčnej aminokyseliny. Spätné mutácie sa môžu vyskytovať v ktoromkoľvek štádiu optimalizácie protilátky. ,
J
Termín chimérická protilátka označuje protilátky, ktoré obsahujú sekvencie variabilnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca jedného živočíšneho druhu a sekvencie konštantnej oblasti od iného živočíšneho druhu, práve tak ako protilátky, ktoré majú myšie variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca, viazané na ľudské konštantné oblasti.
Termín protilátka s implantovanou CDR označuje protilátky, ktoré obsahujú sekvencie variabilných oblasti ťažkého a ľahkého reťazca jedného živočíšneho druhu, v ktorých sú ale sekvencie jednej alebo viacerých CDR oblastí VH a/alebo VL nahradené CDR sekvenciami od iných druhov, ako v prípade protilátok, ktoré majú myšie variabilné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov, v ktorých je jedna alebo viacerých myších CDR (napr. CDR3), nahradená ľudskou CDR sekvenciou.
Termín humanizovaná protilátka označuje protilátky, ktoré obsahujú sekvencie variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca druhov, iných než ľudských (napr. myších), v ktorých je ale najmenej časť VH a/alebo VL sekvencie zmenená na viac ľudskú, t.j., viac podobnú variabilným sekvenciám ľudskej zárodočnej línie. Jedným typom humanizovanej protilátky je protilátka s implantovanou CDR, v ktorej sú ľudské CDR sekvencie zavedené do iných než ľudských VH a VL sekvencii, aby nahradili zodpovedajúce iné než ľudské CDR sekvencie.
Jednou cestou merania kinetiky väzby protilátky je povrchová plazmónová rezonancia. Termín povrchová plazmónová rezonancia, ako je tu používaný, označuje optický fenomén, ktorý umožňuje analýzu biošpecifických interakcií v reálnom čase detekciou zmien v koncentrácii proteínu v matrici biosenzora napríklad použitím systému BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švédsko and Piscaraway, NY). Ďalší popis, viď Jónsson, U. Et al. (1993) Ann.
Biol. Clin. 51:19 až 26; Jônsson, U. Et al. (1991) Biotechniques 1 1:620 až 627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125 až 131 a Johnnson, B., et al. (1991) Anál. Biiochem. 198:268 až 277.
Termín Koff , ako je tu použitý, označuje rozpadovú rýchlostnú konštantu disociácie protilátky z komplexu protilátka/antigén.
Termín Kd , ako je tu použitý, označuje disociačnú konštantu jednotlivej interakcie protilátka-antigén.
Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu sa pripravujú pomocou rôznych spôsobov prípravy protilátok, ktoré sú opísané v oddiele II vyššie. Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynález môžu byť smerované proti zásadne ľubovoľným štrukturálne príbuzným antigénom, i keď výhodné duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu sú tie, ktoré špecificky viažu IL-la a IL-Ιβ , ktoré môžu byť pripravené pomocou duálne špecifických antigénov, ako sú antigény, opísané v príkladoch 1 až 4. Inými štruktúrne príbuznými antigénmi, ktoré môžu byť použité v predkladanom vynáleze sú, ale bez bez obmedzenia na ne, členy rodiny caspázy, rodiny cytokínov, ako sú členy rodiny IL-1 (napr. IL-l/IL-18), členy rodiny TNF (napr. TNFa/TNFp), členy rodiny IL-6, interferóny, členy rodiny TGFP, členy rodiny EGF, členy rodiny FGF, členy rodiny PDGF, členy rodiny VEGF, členy rodiny angiopoetínu, kostné morfogénne proteíny, vylučované proteázy (metalo-proteinázy) a rodiny receptorov cytokínu, ako sú členy rodiny receptorov IL-1, členy rodiny TNF receptorov, členy rodiny TGF3 receptorov, členy rodiny EGF receptorov, členy rodiny receptorov FGF, členy rodiny PDGF receptorov, členy rodiny VEGF rét ceptorov a členy rodiny receptorov angiopoetínu.
Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu môžu vykazovať rovnakú väzbovú aktivitu proti dvom rôznym, ale štruktúrne príbuzným antigénom, ku ktorým sa viažu alebo sa môže duálne špecifická protilátka alternatívne viazať prednostnejšie k jednému z dvoch antigénov, avšak stále má špecifitu proti dvom príbuzným antigénom v porovnaní s nepríbuznými antigénmi. Väzbová aktivita duálne špecifickej protilátky proti štruktúrne príbuzným antigénom, tiež ako proti nepríbuzným antigénom, môže byť odhadnutá pomocou štandard ných in vitro testov, ako sú ELISA alebo BIAcore analýzy. Je výhodné, keď pomer Kd protilátky proti štruktúrne nepríbuzným antigénom ku Kd protilátky proti štruktúrne príbuzným antigénom je najmenej 3, výhodnejšie je, keď je tento pomer najmenej 5 alebo ešte výhodnejšie je, keď je tento pomer najmenej 10 alebo ešte výhodnejšie je, keď je tento pomer najmenej 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 alebo 1000.
V kvantitatívnom vyjadrení je jednou z mier rozdiel medzi väzbou pozadia a duálnou špecifitou. Napríklad, väzba pozadia je na nízkej úrovni, napr. menej než 5 %, výhodne menej než 3 % a najvýhodnejšie 0,1 až 1 %, zatiaľ čo špecifická krížová reaktivita alebo duálne špecifická väzba je na vyššej úrovni, napr. vyššej než 1 %, výhodnejšie vyššej než 3 %, ešte výhodnejšie vyššej než 5 % a ešte výhodnejšie vyššej než 10 %. Okrem toho je je IC50 duálne špecifickej protilátky voči cieľovému antigénu blízke hodnote ED50 antigénov v danom bioteste.
Duálne špecifická protilátka alebo jej antigén viažuca časť podľa tohto vynálezu sa výhodne vyberie tak, aby mala požadovanú kinetiku väzby (napr. vysokú afinitu, nízku disociáciu, pomalú rýchlosť rozpadu, silnú neutralizačnú aktivitu) voči jednému, výhodne voči obom antigénom, ku ktorým sa špecificky viaže. Napríklad, duálne špecifická protilátka alebo jej časť, môže viazať jeden alebo výhodne oba štrukturálne príbuzné antigény s rýchlostnou konštantou kOff 0,1 s’1 alebo menej, výhodnejšie 1 x 10'2 s'1 alebo menej, výhodnejšie 1 x 10'3 s’1 alebo menej, ešte výhodnejšie 1 x 10'4 s'1 alebo menej, ešte výhodnejšie 1 x 10’5 s’1 alebo menej, ako je určené povrchovou plazmónovou rezonanciou. Okrem toho alebo inak, môže duálne špecifická protilátka alebo jej časť inhibovať aktivitu jedného, výhodne oboch štruktúrne príbuzných antigénov s hodnotou IC50 1 x 10’ M alebo menej, ešte výhodnejšie s hodnotou IC50 1 x 10 M alebo menej, ešte výhodnejšie s hodnotou IC50 1 x 10'8 M alebo menej, ešte výhodnejšie s hodnotou IC50 1 x 10‘9 M alebo menej, ešte výhodnejšie s hodnotou IC50 1 x 10’10 M alebo menej, ešte výhodnejšie s hodnotou IC50 1 x 10’11 M alebo menej. Je výhodné, keď je IC50 merané pomocou citlivého biotestu, v ktorom by hodnoty IC50 mali byť tesne blízke k hodnote ED50 antigénu v tomto teste.
Tento vynález tiež poskytuje farmaceutické prostriedky, obsahujúce duálne špecifickú protilátku alebo jej antigén viažucu časť podľa tohto vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič. Farmaceutický prostriedok podľa tohto vynálezu môže ďalej obsahovať najmenej jedno doplnkové terapeutické činidlo, napr. jedno alebo viacero doplnkových terapeutických činidiel, na liečbu choroby, pri ktorej je použitie duálne špecifickej protilátky užitočné pre zlepšenie choroby. Napríklad, pokiaľ duálne špecifická protilátka špecificky viaže IL-Ια a IL-Ιβ môže farmaceutický prostriedok ďalej obsahovať jedno alebo viacero terapeutických činidiel pre liečbu chorôb, na ktorých sa aktivita IL-1 škodlivo podieľa.
Protilátky a ich časti podľa tohto vynálezu môžu byť začlenené do farmaceutických prostriedkov, vhodných pre podanie subjektu. Tieto farmaceutické prostriedky väčšinou obsahujú protilátku alebo jej časť podľa tohto vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič. Termín farmaceutický prijateľný nosič ako je tu používaný, zahrnuje ľubovoľné a všetky rozpúšťadlá, disperzné médiá, povlaky, antibakteriálne a antifungálne činidlá, izotonické činidlá a činidlá spomaľujúce absorpciu a im podobné, pokiaľ sú fyziologicky prijateľné. Príklady farmaceutický prijateľných nosičov obsahujú jednu alebo viacero látok ako sú voda, fyziologický roztok, fosfátový fyziologický roztok, glukózu, glycerol, etanol a im podobné, ako aj ich kombinácie. V mnohých prípadoch je výhodné, aby obsahovali izotonické činidlá napríklad cukry, polyalkoholy, ako je manitol, sorbitol alebo chlorid sodný. Farmaceutický prijateľné nosiče môžu ďalej obsahovať menšie množstvo pomocných substancií, ako sú zmáčacie alebo emulgačné činidlá, konzervačné prostriedky alebo pufre, ktoré zvyšujú polčas života účinnosti protilátky alebo časti protilátky.
Protilátky a časti protilátok podľa tohto vynálezu môžu byť zabudované do farmaceutických prostriedkov, vhodných na parenterálne podanie. Je výhodné, keď protilátka alebo časti protilátky sú pripravené ako injikovateľný roztok, obsahujúci 0,1 až 250 mg/ml protilátky. Tento injikovateľný roztok môže obsahovať buď kvapalnú alebo lyofilizovanú liekovú formu v liekovkach z kremenného alebo hnedého skla, ampuliach alebo predplnených injekčných striekačkách. Pufer môže byť L-histidín (1 až 50 mM), optimálne 5 až 50 mM, pri pH 5,0 až 7,0 (optimálne pH 6,0). Iné vhodné pufre obsahujú, ale bez obmedzenia, nátrium-sukcinát, nátrium-citrát, nátrium-fosfát alebo kálium-fosfát. Chlorid sodný môže byť použitý na zmenu toxicity roztoku pri koncentrácii 0 až 300 mM (optimálne 150 mM pre kvapalnú liekovú formu). Pri lyofilizovanej liekovej forme môžu byť obsiahnuté kryoprotektanty, hlavne 0 až 10 % sacharózy (optimálne 0,5 až 1,0 %). Inými vhodnými kryoprotektantami sú trehalóza a laktóza. V lyofilizovanej liekovej forme môžu byť obsiahnuté plnivá, hlavne 1 až 10 % manitolu (optimálne 2 až 4 %). V kvapalnej i v lyofilizovanej liekovej forme môžu byť stabilizátory, hlavne 1 až 50 mM L-metionínu (optimálne 5-10 mM). Inými vhodnými plnivami sú glycín, arginín, v množstve 0 až 0,05 % môže byť obsiahnutý polysorbát-80 (optimálne 0,005 až 0,01 %). Doplnkovými povrchovo aktívnymi látkami môžu byť, ale bez obmedzenia, polysorbát 20 a BRIJ.
Prostriedky podľa tohto vynálezu môžu byť v rôznych formách. Týmito formami sú napríklad kvapalné, polotuhé a tuhé liekové formy, ako sú kvapalné roztoky (napr. injekčné a infúzne roztoky), disperzie alebo suspenzie, tablety, pilulky, prášky, lipozómy a čapíky. Výhodná lieková forma závisí od zamýšľaného spôsobu podania a terapeutickej aplikácie. Typické výhodné prostriedky sú vo forme injekčných alebo infúznych roztokov, ako sú prostriedky podobné tým, ktoré sú použité pri pasívnej imunizácii človeka inými protilátkami. Výhodným spôsobom podania je parenterálne (napr. intravenózne, subkutánne, intraperitoneálne, intramuskulárne) podanie. Vo výhodnom uskutočnení je protilátka podaná intravenóznou injekciou alebo infúziou. V inom výhodnom uskutočnení je protilátka podaná intramuskulárnou alebo subkutánnou injekciou.
Terapeutické prostriedky musia byť sterilné a stabilné za podmienok výroby a skladovania. Prostriedok musí byť formulovaný ako roztok, mikroemulzia, disperzia, lipozóm alebo iná požadovaná štruktúra, vhodná pre vysokú koncentráciu liečiva. Sterilné injekčné roztoky môžu byť pripravené zabudovaním aktívnej zlúčeniny (t.j. protilátky alebo časti protilátky) v potrebnom množstve vo vhodnom rozpúšťadle s jednou alebo podľa potreby s viacerými vyššie uvedenými zložkami a nasledovnou sterilnou filtráciou. Disperzie sú všeobecne pripravené začlenením aktívnej zlúčeniny do sterilného rozpúšťadla, ktoré obsahuje základné disperzné médium a iné potrebné zložky, patriace do vyššie uvedených. V prípade sterilných, lyofilizovaných práškov na prípravu sterilných injekčných roztokov sú výhodnými spôsobmi prípravy vákuové sušenie a sušenie rozprášením, ktoré poskytujú prášok aktívnej substancie a ľubovoľnú doplnkovú požadovanú zložku z ich predbežne sterilné filtrovaných roztokov. Vlastná fluidita roztoku môže byť udržaná napríklad použitím povlakov, ako je lecitín, udržaním potrebnej veľkosti častíc v prípade disperzie a pri použití zmáčadiel. Prolongovaná absorpcia injikovateľných prostriedkov môže byť dosiahnutá začlenením takého činidla do prostriedku, ktoré spomaľuje absorbciu, napríklad soli monostearátu a želatína.
Protilátky a časti protilátok podľa predkladaného vynálezu môžu byť podávané rôznymi spôsobmi, známymi v tejto oblasti techniky, i keď pre mnohé terapeutické aplikácie je výhodnou cestou/spôsobom podania subkutánna injekcia, intravenózna injekcia alebo infúzia. Odborník na tomto poli techniky ľahko pochopí, že cesta a/alebo spôsob podania sa budú meniť v závislosti od požadovaných výsledkov. V určitých uskutočneniach môže byť aktívna zlúčenina pripravená s nosičom, ktorý chráni túto zlúčeninu pred rýchlym uvoľnením, ako to je v prípade formulácie pre kontrolované uvoľňovanie, vrátane implantátov, transdermálnych náplastí a spôsobu dodávky systémami mikrozapuzdrenia. Môžu byť použité biologicky odbúrateľné a kompatibilné polyméry, ako je etylén(vinyl)acetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagén, polyortoestery a kyselina polymliečna. Mnohé spôsoby na prípravu týchto formulácií sú patentované alebo všeobecne známe odborníkom v tejto oblasti techniky. Viď, napr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Fobilnson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
V určitých uskutočneniach môžu byť protilátky alebo ich časti podané orálne napríklad s inertným rozpúšťadlom alebo asimilovateľným jedlým nosičom. Zlúčenina (a iné zložky, pokiaľ sú treba) môžu byť tiež obsiahnuté v tvrdej alebo mäkkej želatínovej kapsule, lisované do tabliet alebo sú začlenené priamo do diéty subjektu. Pre orálne terapeutické podanie môže byť zlúčenina obsiahnutá v plnive a použitá vo forme tabliet, nazálnych tabliet, pastiliek, kapsúl, elixírov, suspenzií, sirupov, oplátok a im podobných. Na podanie zlúčeniny podľa tohto vynálezu iným než parenterálnym podaním môže byť nutné zlúčeninu povliecť alebo podávať s materiálom, ktorý zabráni inaktivácii zlúčeniny.
Do prostriedkov môžu byť tiež začlenené doplnkové aktívne zlúčeniny. V určitých uskutočneniach môže byť protilátka podľa tohto vynálezu alebo jej časť formulovaná spoločne a/alebo podávaná s jedným alebo viacerými doplnkovými terapeutickými činidlami, ktoré sú použiteľné na liečbu chorôb, v ktorých sa aktivita IL-1 negatívne zúčastňuje. Napríklad duálne špecifické protilátky proti IL-la/IL-Ιβ, alebo ich časti, môžu byť spoločne formulované a/alebo podávané s jednou alebo viacerých protilátkami, ktoré sa viažu na iné ciele (napr. protilátky, ktoré viažu iné cytokíny, alebo ktoré viažu molekuly na bunečnom povrchu). Okrem toho môže byť jedna alebo viaceré protilátky podľa tohto vynálezu použitá v kombinácii s jedným alebo viacerými predchádzajúcimi terapeutickými činidlami. Takéto kombinačné terapie môžu výhodne využívať nízke dávky podávaných terapeutických činidiel a teda odstraňovať nežiaduce možné toxicity alebo komplikácie, spojené s rôznymi monoterapiami.
IV. Použitie duálne špecifických protilátok
Vzhľadom k ich schopnosti viazať sa na dve rôzne, ale štruktúrne príbuzné antigény, sú duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich časti použité na detekciu buď jedného alebo oboch antigénov (napr. v biologických vzorkách, ako je sérum alebo plazma), použitím konvenčného imunologického testu, ako je ELISA (enzýme linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay) alebo tkanivová imunohistochémia. Tento vynález poskytuje spôsob detekcie antigénu v biologickej vzorke, ktorý zahrnuje kontakt tejo biologickej vzorky s duálne špecifickou protilátkou podľa tohto vynálezu alebo jej časťou, ktorá špecificky rozpoznáva antigén a deteguje buď protilátku (alebo protilátkovú časť) viazanú na antigén alebo nenaviazanú protilátku (alebo jej časť), čím je delegovaný antigén v biologickej vzorke. Protilátka je priamo alebo nepriamo označená detegovateľnou substanciou, aby bola uľahčená de tekcia viazanej alebo neviazanej protilátky. Vhodnými detegovateľnými látkami sú rôzne enzýmy, prostetické skupiny, fluorescenčné materiály, luminiscenčné materiály a rádioaktívne materiály. Príklady vhodných enzýmov obsahujú chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, β-galaktozidázu alebo acetylcholínesterázu; príklady vhodných komplexov prostetických skupín obsahujú streptavidín/biotín a avidín/biotín; príklady vhodných fluorescenčných materiálov obsahujú umbeliferón, fluoresceín izotiokyanát, rodamín, dichlórtriazinylaminofluoresceín, danzylchlorid alebo fykoerytrín; príkladom luminiscenčného materiálu môže byť luminol a príklady vhodných rádioaktívnych materiálov sú 125I, 131I, 35S alebo 3H.
Alternatívne ku značeniu protilátky môže byť antigén (antigény) testovaný v biologických tekutinách pomocou kompetície rádioimunitného testu, ktorý používa antigénne štandardy značené detegovateľnou látkou a neznačenú duálne špecifickú protilátku, špecifickú voči tomuto antigénu (antigénom). V tomto teste sa zmieša biologická vzorka, značené antigénne štandardy a duálne špecifická protilátka a určuje sa množstvo značeného antigénneho Štandardu, ktoré je naviazané na neznačenú protilátku. Toto množstvo antigénu v biologickej vzorke je nepriamo úmerné množstvu značeného antigénneho štandardu naviazaného na neznačenú protilátku.
Vo výhodnom uskutočnení duálne špecifická protilátka špecificky rozpoznáva IL-Ια a IL-Ιβ a predchádzajúce detekčné spôsoby sú použité na detekciu IL-Ια a/alebo IL-Ιβ. V súlade s tým predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob detekcie IL-Ια alebo IL-Ιβ v biologickej vzorke alebo tkanive, ktorý obsahuje kontakt biologickej vzorky alebo tkaniva, u ktorých očakávame obsah IL-Ια alebo IL-Ιβ, s duálne špecifickou protilátkou podľa tohto vynálezu alebo jej časťou a detekciu IL-Ια alebo IL-Ιβ v biologickom tkanive alebo vzorke. Touto biologickou vzorkou môže byť napríklad vzorka in vitro, ako sú vzorky buniek, tkanív alebo telesnej tekutiny (napr. krv, plazma, moč, sliny, atď.). Okrem toho detegované tkanivá môžu byť tkanivá, ktoré sú umiestnené in vivo v subjekte, napr. tkanivá vizualizované in vivo zobrazením tkaniva (napr. použitím značenej protilátky).
Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť tiež použité na diagnostické účely. V jednom uskutočnení je protilátka podľa tohto vynálezu použitá v diagnostickom teste in vitro, ako v laboratórnom teste detekcie záujmového antigénu (antigénov) alebo v prípade potreby testu detekcie záujmového antigénu (antigénov). Príklady dobre zavedených in vitro testov zahrnujú ELISA, RIA, Westernov prenos a im podobné. V inom uskutočnení je protilátka podľa tohto vynálezu použitá v laboratórnom teste in vivo, ako je in vivo zobrazovací test. Napríklad, môže byť protilátka označená detegovateľnou látkou, schopnou detekcie in vivo, značená protilátka môže byť podaná subjektu a táto značená protilátka môže byť detegovaná in vivo, čím je umožnené zobrazenie in vivo.
Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu, ktoré špecificky rozpoznávajú IL-Ια a IL-Ιβ, môžu byť použité v diagnostických testoch na detekciu IL-Ια a/alebo IL-Ιβ pre diagnostické účely napríklad pri rôznych zápalových chorobách a poruchách, tiež ako pri spontánnej rezorpcii plodov. S ohľadom na špecifické typy ochorení a porúch môžu byť duálne špecifické antiIL-la/IL-Ιβ protilátky podľa tohto vynálezu použité na diagnostické účely v ktorejkoľvek z tu opísaných chorôb/porúch s ohľadom na terapeutické použitie týchto protilátok (viď nižšie), ako sú poruchy, v ktorých je aktivita IL-1 škodlivá, ako je diskutované nižšie.
Duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu a ich časti sú výhodne schopné neutralizácie, ako in vivo, tak in vitro, aktivity antigénu, ku ktorému sa viažu. Protilátky podľa tohto vynálezu a ich časti môžu byť v súlade s tým použité na inhibíciu aktivity antigénov, napr. v bunečných kultúrach, obsahujúcich antigény alebo v ľudských subjektoch alebo v iných cicavčích objektoch, ktoré majú antigény, s ktorými duálne špecifická protilátka podľa tohto vynálezu reaguje. V jednom uskutočnení poskytuje vynález spôsob inhibície aktivity antigénu, ktorý zahrnuje kontakt tohto antigénu s duálne špecifickou protilátkou podľa tohto vynálezu alebo jej časťou, takže je aktivita antigénu inhibovaná. Vo výhodnom uskutočnení viaže duálne špecifická protilátka IL-Ια a IL-Ιβ a tento spôsob je spôsobom inhibície aktivity IL-Ια a/alebo IL-Ιβ kontaktovaním IL-Ια a/alebo IL-Ιβ s duálne špecifickou protilátkou alebo s jej časťou.
Aktivita IL-Ια a/alebo IL-Ιβ môže byť inhibovaná napríklad in vitro. Napríklad, v prípade bunečných kultúr, ktoré obsahujú alebo u ktorých je očakávaná prítomnosť IL-Ια a/alebo IL-Ιβ, môže byť protilátka podľa tohto vynálezu alebo jej časť pridaná do kultivačného média, aby bola inhibovaná aktivita IL-la a/alebo IL-Ιβ v kultúre. Alternatívne, aktivita IL-Ια a/alebo IL-Ιβ môže byť inhibovaná in vivo v subjekte.
V inom uskutočnení poskytuje tento vynález spôsob inhibície aktivity antigénu v subjekte, ktorý trpí chorobou, v ktorej sa škodlivo zúčastňuje aktivita antigénu. Vynález poskytuje spôsoby na inhibovanie aktivity antigénu v subjekte, trpiacom takouto chorobou a tento spôsob obsahuje podávanie duálne špecifickej protilátky podľa tohto vynálezu alebo jej časti subjektu, takže je aktivita antigénu v tomto subjekte inhibovaná. Je výhodné, keď týmto antigénom je ľudský antigén a subjektom je ľudský subjekt. Protilátka podľa tohto vynálezu môže byť podaná ľudskému subjektu na terapeutické účely. Okrem toho môže byť protilátka podľa tohto vynálezu podaná inému než ľudskému cicavcovi, exprimujúcemu antigén, s ktorým sa táto protilátka viaže, na veterinárne účely alebo ako živočíšnemu modelu ľudskej choroby. S ohľadom na posledne uvedené skutočnosti môžu byť také živočíšne modely použiteľné na vyhodnotenie terapeutickej účinnosti protilátok podľa tohto vynálezu (napr. testovanie dávok a časový priebeh podávania).
Je výhodné, keď duálne špecifická protilátka viaže IL-Ια a IL-Ιβ a spôsob inhibície aktivity antigénu v subjekte je spôsobom inhibície aktivity IL-1 v subjekte, napríklad v subjekte, trpiacom chorobou, na ktorú aktivita IL-1 škodlivo pôsobí. Ako je tu používaný, označuje termín choroba, v ktorej je aktivita IL-1 škodlivá choroby a iné poruchy, v ktorých je prítomnosť IL-1 (ktorý zahrnuje IL-Ια aj IL-Ιβ) v subjekte, trpiacom touto chorobou, zistená ako zodpovedná alebo ako podozrivá zo zodpovednosti za patofyziológiu tejto choroby alebo ako faktor, ktorý prispieva k zhoršeniu tejto choroby. V súlade s tým je choroba, v ktorej je aktivita IL-1 škodlivá, chorobou, u ktorej sa očakáva, že inhibícia aktivity IL-1 (t.j., buď jedného alebo oboch IL-Ια a IL-Ιβ) zmierni príznaky a/alebo vývoj choroby. Dôkazom týchto chorôb je napríklad zvýšenie koncentrácie IL-1 v biologickej tekutine subjektu, trpiaceho touto chorobou (napr. zvýšenie koncentrácie IL-1 v sére, plazme, synoviálnej tekutine, atď. subjektu), ktoré môže byť detegované, napr. použitím anti-IL-1 protilátky, ako je opísané vyššie.
Interleukín 1 sa rozhodujúcim spôsobom zúčastňuje v patológii mnohých chorôb, spojených s imunitnými a zápalovými prvkami. Týmito chorobami sú, ale bez obmedzenia na ne, reumatoidná artritída, osteoartritida, juvenilná chronická artritída, lymská artritída, psoriatická artritída, reaktívna artritída, spondyloartropatia, systémový lupus erythematosus, Crohnova choroba, ulceratívna kolitída, zápalová črevná choroba, inzulín dependentný diabetes mellitus, tyroiditída, astma, alergické choroby, psoriáza, dermatitída skleroderma, reakcia hostiteľ voči transplantátu, odmietnutie transplantovaných orgánov, akútna chronická imunitná choroba spojená s orgánovou transplantáciou, sarkoidóza, ateroskleróza, roztrúsená intravaskulárna koagulácia, Kawasakiho choroba, Gravesova choroba, nefrotický syndróm, chronický únavový syndróm, Wegenerova granulomatóza, Henoch-Schoenleinova purpurea, mikroskopická vaskulitída obličiek, chronická aktívna hepatitída, uveitída, septický šok, toxický šokový syndróm, septický syndróm, kachexia, infekčné choroby, parazitické choroby, AIDS, akútna transverzná myelitída, Huntingtonova chorea, Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, mŕtvica, primárna biliárna cirhóza, hemolytická anémia, zhubné choroby, zlyhanie srdca, infarkt myokardu, Addisonova choroba, sporadická, polyglandulárna deficiencia typu I a polyglandulárna deficiencia typu II, Schmidtov syndróm, (akútny) syndróm respiračnej tiesne u dospelých, alopécia, alopécia areata, séronegatívna artopatia, artropatia, Reiterova choroba, psoriatická artropatia, ulceratívna kolitická artropatia, enteropatická synovitída, artropatia spojená s chlamýdiami, yersíniami a salmonelou, spondyloartropatia, ateromatózna choroba/arterioskleróza, atopické alergie, autoimunitná bulózna choroba, obyčajný pemfigus, listovitý pemfigus, pemfigoid, lineárna IgA choroba, autoimunohemolytická anémia, Coombsova pozitívna hemolytická anémia, získaná perniciózna anémia, juvenilná perniciózna anémia, myalgická encefalitída/Royal Free Disease, chronická mukokutánna kandidiáza, artritída obrích buniek, primárna sklerotizujúca hepatitída, kryptogénna autoimunohepatitída, AIDS, AIDS príbuzné choroby, hepatitída C, všeobecná variabilná immunodeficiencia (všeobecná variabilná hypogamaglo bulinémia), dilatovaná kardiomyopatia, ženská neplodnosť, poruchy vaječníkov, predčasné poruchy vaječníkov, fibrotická pľúcna choroba, kryptogénna fibrózna alveolitída, pozápalová intersticiálna pľúcna choroba, intersticiálna pneumonitída, choroba spojivových tkanív spojená s intersticiálnou pľúcnou chorobou, zmiešaná choroba spojivových tkanív spojená s intersticiálnou pľúcnou chorobou, systémová skleróza spojená s intersticiálnou pľúcnou chorobou, reumatoidná artritída spojená s intersticiálnou pľúcnou chorobou, systémový lupus erythematosus spojený s pľúcnou chorobou, dermatomyozitída/polymyozitída spojená s pľúcnou chorobou, Sjogrenova choroba spojená s pľúcnou chorobou, ankylózna spondylitída spojená s pľúcnou chorobou, vaskulitídna difúzna pľúcna choroba, hemosideróza spojená s pľúcnou chorobou, liečivami indukovaná intersticiálna pľúcna choroba, radiačná fibróza, bronchiolitída obliterans, chronická eozinofilná pneumónia, lymfocytárna infiltračná pľúcna choroba, postinfekčná intersticiálna pľúcna choroba, dnová artritída, autoimunitná hepatitída, autoimunitná hepatitída typu-1 (klasická autoimunitná alebo lupoidná hepatitída), autoimunitná hepatitída typu-2 (anti-LKM protilátková hepatitída), autoimunitne sprostredkovaná hypoglykémia, typu B inzulínová rezistencia s acanthosis nigricans, hypoparatyroidizmus, akútna imunitná choroba spojená s orgánovou transplantáciou, osteoartróza, primárna sklerotizujúca cholangitída, psoriáza typu 1, psoriáza typu 2, idiopatická leukopénia, autoimunitná neutropénia, choroba obličiek NOS, glomerulonefritída, mikroskopická vaskulitída obličiek, lymská choroba, diskoidný lupus erythematosus, mužská neplodnosť idiopatická alebo NOS, spermálna autoimunita, skleróza multiplex (všetky podtypy), sympatetická oftalmia, pulmonárna hypertenzia sekundárna k chorobe väzivových tkanív, Goodpastureho syndróm, pulmonárna manifestácia polyarteritis nodosa, akútna reumatická horúčka, reumatoidná spondylitída, Stillova choroba, systémová skleróza, Sjorgrenov syndróm, Takayasuova choroba/arteritída, autoimunitná trombocytopénia, idiopatická trombocytopénia, autoimunitná tyroidná choroba, hypertyroidizmus, dnový autoimunitný hypotyroidizmus (Hashimotova choroba), atrofický autoimunitný hypotyroidizmus, primárny myxoedém, fakogénna uveitída, primárna vaskulitída, vitiligo, choroby centrálneho nervového systému (napr. depresia, schizofrénia, Alzheimer, Parkinson, atď.), akútna a chronická bolesť a lipidová nerovnováha. Ľudské protilátky podľa tohto vynálezu a ich časti môžu byť po užité na liečbu ľudí, trpiacich ochoreniami autoimunity, hlavne tými, ktoré sú spojené so zápalom, vrátane reumatoidnej spondylitídy, alergie, autoimunitného diabetu, a autoimunitnej uveitídy.
IL-la/IL-Ιβ duálne špecifické protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti sú výhodne použité na liečbu reumatickej artritídy, Crohnovej choroby, sklerózy multiplex, na inzulíne závislého diabetu a psoriázy.
IL-la/IL-Ιβ duálne špecifická protilátka podľa tohto vynálezu alebo jej časť môžu byť tiež podané s jedným alebo viacerými doplnkovými terapeutickými činidlami, použiteľnými v liečbe autoimunitných a zápalových chorôb.
Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť použité samotné alebo v kombinácii na liečbu týchto chorôb. Je treba si uvedomiť, že protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť použité samy alebo v kombinácii s doplnkovým činidlom, napr. terapeutickým činidlom, keď uvedené doplnkové činidlo je vybrané vyškoleným odborníkom podľa zamýšľaného použitia. Toto doplnkové činidlo môže byť napríklad terapeutické činidlo odborne určené ako užitočné na liečbu choroby alebo stavu, ktorý je liečený protilátkou podľa predkladaného vynálezu. Týmto doplnkovým činidlom môže byť tiež činidlo, ktoré prepožičiava terapeutickému prostriedku prospešnú vlastnosť, napr. činidlo, ktoré ovplyvňuje viskozitu prostriedku.
Tiež je potrebné si uvedomiť, že tie kombinácie, ktoré sú obsiahnuté v tomto vynáleze, sú kombináciami použiteľnými pre ich zamýšľané použitie. Ďalej uvedené činidlá sú myslené ako ilustratívne a nie sú myslené ako obmedzenia. Kombináciami, ktoré sú časťou tohto vynálezu, môžu byť protilátky podľa predkladaného vynálezu a najmenej jedno dodatočné činidlo, napr. dve alebo tri doplnkové činidlá, ak táto kombinácia v takto vzniknutom prostriedku môže splniť zamýšľaný účel.
Výhodnými kombináciami sú nesteroidné protizápalové liečivá (liečivo), tiež označované ako NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drug(s)), medzi ktoré patria liečivá podobné ibuprofénu, a COX-2 inhibítory. Inými výhodnými kombináciami sú kortikosteroidy, vrátane prednizolónu; dobre známe vedľajšie účinky použitia steroidov môžu byť redukované alebo úplne vylúčené znížením dávky steroidov, potrebnej na liečbu pacienta, v,kombinácii s protilátkami antiIL-1 podľa tohto vynálezu. Neobmedzujúce príklady terapeutických činidiel proti reumatickej artritíde, s ktorými môže byť protilátka podľa tohto vynálezu alebo jej časť kombinovaná, sú nasledujúce:' cytokín supresívne protizápalové liečivo (liečivá) (CSAID; protilátky alebo antagonisty proti ľudským cytokínom alebo rastovým faktorom, napr. TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-GSF, FGF a PGDF. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť kombinované s protilátkami proti molekulám bunečného povrchu, ako sú CD2, CD3, CD4, D8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 alebo ich ligandy, vrátane CD154 (gp39 alebo CD40L).
Výhodné kombinácie terapeutických činidiel môžu interferovať na rôznych miestach autoimunitnej a následne zápalovej kaskády; výhodné príklady zahrnujú antagonistov TNF, ako sú chimérické, humanizované alebo humánne TNF protilátky, D2E7, (PCT publikácia č. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, CDP 870, Talimid a rozpustné p55 alebo p75 TNF receptory, ich deriváty, (p75TNFRgG (Enbrel™) alebo p55TNFRlgG (Lenercept) a tiež inhibítory TNFa konvertujúceho enzýmu (TACE); podobne IL-1 inhibítory (inhibítory interleukín-l-konvertujúceho enzýmu, IL-1RA atd’.), môžu byť účinné z rovnakého dôvodu. Iné výhodné kombinácie obsahujú interleukín 11. Ďalšími dôležitými účastníkmi autoimunitnej odpovede, ktorí môžu paralelne účinkovať, sú ďalšie výhodné kombinácie, závislé na alebo v zhode s funkciou IL-1; zvlášť výhodnými sú antagonisty IL-12 a/alebo IL-18, vrátane protilátok IL-12 a/alebo IL-18 alebo rozpustné receptory IL-12 a/alebo IL-18 alebo proteíny viažuce IL-12 a/alebo IL-18. Bolo zistené, že IL-12 a IL-18 majú prekrývajúce sa, ale odlišné funkcie a kombinácia ich antagonistov môže byť najúčinnejšia. Ešte ďalšou výhodnou kombináciou sú nevyčerpané anti-CD4 inhibítory. Ešte ďalšie výhodné kombinácie zahrnujú antagonistov kostimulačnej dráhy CD80 (B7.1) alebo CD86 (B7.2), vrátane protilátok, rozpustných receptorov alebo antagonistických ligandov.
Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť tiež kombinované s činidlami ako je metotrexát, 6-MP, azatioprín sulfasalazín, mesalazín, olsalazín chlorochinín/hydroxychlorochín, penicilamín, aurotiomalát (intramuskulárne alebo orálne), azatioprín, kochicín, kortikosteroidy (orálne, inhalačné a lokálna injekcia), agonisty beta-2 adrenoreceptora (salbutamol, terbutalín, salmeteral), xantíny (teofylín, aminofylín), kromoglykát, nedokromil, ketofinen, ipratropium a oxitropium, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID napríklad ibuprofén, kortikosteroidy, ako prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergné činidlá, činidlá, ktoré interferujú so signalizáciou prozápalovými cytokínmi, také ako TNFa alebo IL-1 (napr. IRAK, NIK, IKK, p38 alebo inhibítory MAP kinázy), inhibítory IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu, inhibítory TNFa konvertujúceho enzýmu (TACE), inhibítory signalizácie T-buniek, ako sú inhibítory kinázy, inhibítory metaloproteinázy, sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory angiotenzín konvertujúceho enzýmu, rozpustné receptory cytokínu a ich deriváty (napr. rozpustné receptory p55 alebo p75 TNF a deriváty p75TNFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) a protizápalové cytokíny (napr. IL-4, IL-10, IIL-11, IL-13 a TGFp. Výhodné kombinácie obsahujú metotrexát alebo leflunomid a pri miernych alebo závažných prípadoch reumatickej artritídy cyklosporín.
Neobmedzujúce príklady terapeutických činidiel pre črevnú zápalovú chorobu, s ktorými môže byť protilátka podľa tohto vynálezu alebo jej časť kombinovaná, zahrnujú nasledujúce: budenozid; epidermálny rastový faktor; kortikosteroidy; cyklosporín, sulfasalazín; aminosalicyláty; 6-merkaptopurín; azatioprín; metronidazol; inhibítory lipoxygenázy; mezalamín; olsalazín; balsalazid; antioxidanty; inhibítory tromboxánu; antagonisty IL-1 receptora; monoklonálne protilátky anti-IL-Ιβ; monoklonálne protilátky anti-IL-6; rastové faktory; inhibítory elastázy; pyridinyl-imidazolové zlúčeniny; protilátky alebo antagonisty proti iným ľudským cytokínom alebo rastovým faktorom; napríklad, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IIL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PGDF. Protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť kombinované s protilátkami voči molekulám bunečného povrchu, ako sú CD2, CD3, CD4,
CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 alebo ich ligandom. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť tiež kombinované s činidlami, ako metotrexát, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID, napríklad ibuprofén, kortikosteroidy, ako prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergné činidlá, činidlá, ktoré interferujú so signalizáciou prozápalovými cytokínmi, tak ako TNFa alebo IL-1 (napr. IRAK, NIK, IKK, p38n alebo inhibítory MAP kinázy), inhibítory IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu, inhibítory TNFa konvertujúceho enzýmu (TACE), inhibítory signalizácie T-buniek, ako sú inhibítory kinázy, inhibítory metaloproteinázy, sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory angiotenzín konvertujúceho enzýmu, rozpustné receptory cytokínu a ich deriváty (napr. rozpustné receptory p55 alebo p75 TNF, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) a protizápalové cytokíny (napr. IL-4, IL-10, IL-U, IL-13 a ΤϋΡβ).
Výhodné príklady terapeutických činidiel proti Crohnovej chorobe, v ktorých môže byť protilátka alebo jej antigén viažuca časť kombinovaná, zahrnujú nasledujúce: TNF antagonisty, napríklad anti-TNF protilátky, D2E7 (PCT publikácia č. WO 97/29 131), CA2 (Remicade™), CDP 571, TNFR-Ig konštrukty, (p75NFRIgG (Enbrel™) a p55TNFRIgG (Lenercept)) inhibítory a inhibítory PDE4. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť kombinované s kortikosteroidmi napríklad budenozidom a dexametazónom. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť tiež kombinované s činidlami, ako je sulfasalazín, kyselina 5aminosalicylová a olsalazín a činidlami, ktoré interferujú so syntézou alebo účinkom prozápalových cytokínov, ako sú IL-1, napríklad inhibítormi IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu a IL-lra. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich an-
napríklad 6-merkaptopurínmi inhibítormi tyrozín kinázy. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť kombinované s IL-11.
Neobmedzujúce príklady terapeutických činidiel proti skleróze multiplex, ktoré môžu byť kombinované, zahrnujú nasledujúce: kortikosteroidy; prednizolón; metylprednizolón; azatioprín; cyklofosfamid; cyklosporín; metotrexát;
4-aminopyridín; tizanidín; interferón-pla (Avonex; Biogen); interferón-β lb (Betaseron; Chiron/Berlex); Kopolymér 1 (Cop-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); hyperbarický kyslík; intravenózny imunoglobulín; klabribín; protilátky alebo antagonisty iných ľudských cytokínov alebo rastových faktorov napríklad TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF a PGDF. Protilátky podľa tohto vynálezu alebo ich antigén viažuce časti môžu byť kombinované s protilátkami proti molekulám bunečného povrchu, ako sú CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 alebo ich ligandy. Protilátky alebo ich antigén viažuce časti môžu byť tiež kombinované s činidlami, ako je metotrexát, cyklosporín, FK506, rapamycín, mykofenolát mofetil, leflunomid, NSAID napríklad ibuprofén, kortikosteroidy, ako prednizolón, inhibítory fosfodiesterázy, agonisty adenozínu, antitrombotické činidlá, inhibítory komplementu, adrenergné činidlá, činidlá, ktoré interferujú so signalizáciou prozápalovými cytokínmi, tak ako TNFa alebo IL-1 (napr. IRAK, NIK, IKK, p38n alebo inhibítory MAP kinázy), inhibítory IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu, TACE inhibítory, inhibítory signalizácie T-buniek ako sú inhibítory kinázy, inhibítory metaloproteinázy, sulfasalazín, azatioprín, 6-merkaptopuríny, inhibítory angiotenzín konvertujúceho enzýmu, rozpustné receptory cytokínu a ich deriváty (napr. rozpustné receptory p55 alebo p75 TNF, sIL-lRI, sIL-lRII, sIL-6R) a protizápalové cytokíny (napr. IL-4, IL-10, IL-13 a ΤϋΡβ).
Výhodné príklady terapeutických činidiel proti skleróze multiplex, v ktorých môže byť kombinovaná protilátka alebo jej antigén viažuca časť, obsahujú interferón-β, napríklad ΙΡΝβΙό a ΙΡΝβ^; kopaxón; kortikosteroidy; inhibítory IL-1, inhibítory TNF a protilátky proti ligandom CD40 a CD80.
Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať terapeuticky účinné množstvo alebo profylaktický účinné množstvo protilátky podľa tohto vynálezu alebo jej časti. Terapeuticky účinné množstvo označuje množstvo, účinné v dávkach a časových periódach, ktoré je nevyhnutné na dosiahnutie požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množstvo protilátky alebo jej časti sa môže meniť v závislosti od faktorov, ako je stav choroby, vek, pohlavie a hmotnosť jedinca a schopnosť protilátky alebo jej časti vyvolať požadovanú odpoveď v jedincovi. Terapeuticky účinné množstvo je tiež množstvo, v ktorom sú škodlivé alebo toxické účinky protilátky alebo jej časti vyvážené terapeuticky prospešnými účinkami. Profylaktický účinné množstvo označuje množstvo, účinné v dávkach a časových periódach, ktoré je nevyhnutné na dosiahnutie požadovaného profylaktického účinku. Pretože profylaktická dávka je používaná v subjektoch pred chorobou alebo v skorých štádiách choroby, je obvykle profylaktický účinné množstvo menšie než terapeuticky účinné množstvo.
Dávkové režimy majú byť nastavené tak, aby sa dosiahla optimálna požadovaná odpoveď (napr. terapeutická alebo profylaktická odpoveď). Môže byť napríklad podaná jednoduchá dávka, niekoľko oddelených dávok v priebehu času alebo môže byť dávka úmerne znížená alebo zvýšená, podľa potreby terapeutickej situácie. Kvôli ľahkosti podania a jednotnosti dávok je obzvlášť výhodné formulovať parenterálne prostriedky vo forme dávkových jednotiek. Dávkovou jednotkou sú tu myslené diskrétne jednotky, vhodné ako jednotkové množstvá pre cicavčie subjekty, ktoré majú byť liečené; každá jednotka obsahuje vopred určené množstvo aktívnej zlúčeniny, vypočítané tak, aby sa dosiahol požadovaný terapeutický účinok v spojení s potrebným terapeutickým nosičom. Špecifikácie pre formy dávkových jednotiek podľa tohto vynálezu sú diktované a priamo závislé na jedinečných charakteristikách aktívnej zlúčeniny a hlavnom terapeutickom alebo profylaktickom účinku, ktorý má byť dosiahnutý a na obmedzeniach obsiahnutých v technike použitia takejto aktívnej zlúčeniny pre liečbu senzitivity u jedincov.
Exemplárny, neobmedzujúci rozsah terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva protilátky podľa tohto vynálezu alebo jej časti je 0,1 až 20 mg/kg, výhodnejšie 1 až 10 mg/kg. Je treba poznamenať, že hodnoty dávok sa môžu meniť s typom a so závažnosťou stavu, ktorý má byť zlepšený. Je treba tiež ďalej rozumieť, že pre ktorýkoľvek jednotlivý subjekt je potrebné dávkový režim nastaviť na dobu podľa individuálnej potreby a profesionálneho posúdenia osoby, ktorá podáva alebo dohliada na podávanie prostriedkov, a že tu uvedené dávkové režimy sú iba príkladom a nie sú zamýšľané ako akékoľvek obmedzenie rozsahu alebo použitia patentovo nárokovaných prostriedkov.
Predkladaný vynález je ďalej ilustrovaný na nasledujúcich príkladoch, ktoré nie sú myslené ako akékoľvek obmedzenie. Obsahy všetkých citovaných odkazov, vrátane literárnych odkazov, publikovaných patentov a publikovaných patentových prihlášok, citovaných v tejto prihláške, sú týmto výslovne začlenené citáciou. i
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Zostrojenie duálne špecifického antigénu na základe styčnej topologickej oblasti identity
V tomto príklade bola najväčšia styčná topologická oblasť identity medzi dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými proteínmi, IL-Ια a IL-Ιβ, určená ako základ pre zostrojenie duálne špecifického antigénu pre vypestovanie duálne špecifických protilátok voči IL-Ια a IL-Ιβ. Bol použitý BLAST algoritmus na porovnanie týchto dvoch proteínov, ktorý umožnil zmerať tendenciu jedného zvyšku nahradzovať iný zvyšok v štruktúrne alebo funkčne podobných oblastiach. Táto analýza umožnila identifikáciu najväčšej styčnej topologickej oblasti identity medzi IL-Ια a IL-Ιβ a rozšírenie tejto oblasti s ľubovoľným rozsahom podobnosti na vytvorenie lineárneho peptidu, ktorý slúži ako duálne špecifický antigén. Tento peptid, ktorý najlepšie zodpovedá daným kritériám, má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:
NEAQNITDF (SEQ ID NO: 1) •k + ★ 4· k
Hviezdička (*) označuje identické zvyšky v oboch proteínoch. Ostatné zvyšky sú veľmi podobné, podľa BLAST algoritmu. Napríklad lyzín bude často nahradzovať v homologických proteínoch arginín, ale nie fenylalanín. Peptid podľa SEQ ID NO: 1 je hybridom, vzniknutým z dvoch rôznych úsekov štruktúry, kto ré prebiehajú v opačnom smere, takže zodpovedajúcim zobrazením tohto epitoPU je:
dNdEdAdQNITDF , (kde predpona d oznamuje, že daný aminokyselinový zvyšok je zvyškom D aminokyseliny). Aminokyselinová L forma tohto peptidu i jeho verzia, ktorá je čiastočne substituovaná D aminokyselinovými zvyškami, sú syntetizované štandardnými chemickými spôsobmi. Tento peptid je potom konjugovaný s proteínovým nosičom (napr. KLH alebo albumín) a konjugovaný peptid je použitý na selekciu protilátok spôsobmi in vitro alebo in vivo.
Príklad 2: Zostrojenie duálne špecifického antigénu, založené na cyklickom peptide, ktorý napodobňuje slučku spoločnej natívnej štruktúry
V tomto príklade bol cyklický peptid, ktorý štrukturálne napodobňuje hlavnú slučku spoločnej natívnej štruktúry u dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínov, IL-Ια a IL-Ιβ, konštruovaný pre použitie ako duálne špecifický antigén na vypestovanie duálne špecifických protilátok proti IL-Ια a IL1β. Táto vybraná slučka reprezentuje zvyšky 168 až 184 od IL-Ια a zvyšky 160 až 176 od IL-Ιβ. Dohodnutá sekvencia je:
Cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL (PG) (SEQ ID NO: 2) * cb c c c c c c cc * * c * b *
Hviezdička (*) označuje identické zvyšky medzi IL-Ια a IL-Ιβ, c označuje dohodnuté zvyšky, t.j. zvyšky, podobné IL-Ια a IL-Ιβ, ktoré ale v skutočnosti nie sú v tejto polohe prítomné ani v jednom proteíne, a b označuje, že tu nie je žiadny dohodnutý zvyšok, takže bola zachovaná sekvenčná identita IL-Ιβ. Tento lineárny peptid je syntetizovaný štandardnými chemickými spôsobmi. Pre cyklizáciu peptidu sú pridané prolínové a glycínové zvyšky. Tento cyklický peptid môže byť syntetizovaný použitím štandardných podmienok syntézy za vysokého riedenia v Ν,Ν-dimetylformamide (1 mg/ml). Prototypové reakcie prebiehajú pri teplote miestnosti s použitím nadbytku spojovacieho činidla, ako je benzotriazol-l-yl-oxy-tris-pyrolidino-fosfónium-hexafluorofosfát (PyBOP; 2 ekv.) a hydrouhličitan sodný (10 ekv.).Tento peptid je potom konjugovaný k proteínovému nosiču (napr. KLH alebo albumín) a konjugovaný peptid je použitý na selekciu protilátok spôsobmi in vitro alebo in vivo.
Príklad 3: Zostrojenie duálne špecifického antigénu, založené na hybridnom peptide
V tomto príklade bol pre použitie ako duálne špecifický antigén pre vypestovanie duálne špecifických protilátok proti IL-Ια a IL-Ιβ zostrojený hybridný peptid, ktorý obsahuje alternujúce alebo prekrývajúce sa sekvencie dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných proteínov, IL-Ια a IL-Ιβ. Aby vznikol tento hybridný peptid, boli identifikované a spojené alternujúce a prekrývajúce sa sekvencie IL-Ια a IL-Ιβ, čím bol vytvorený nasledujúci peptid:
TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO:3) bbbbbbbbbb aaaaaaaaaa
Písmená a a b označujú, ktorý proteín je zdrojom daného zvyšku (a = IL-Ια; b = IL-Ιβ). Motív ITDF, spoločný obom proteínom, bol obsiahnutý v hybridnom proteíne. Okrem toho je tento hybridný peptid zameraný na sekvencie od C-konca oboch proteínov, ktoré sú tiež v oboch proteínoch známe svojou antigenicitou voči neutralizujúcim protilátkam. Tento hybridný peptid je syntetizovaný štandardnými chemickými syntetickými spôsobmi. Tento peptid je potom konjugovaný na proteínový nosič (napr. KLH alebo albumín) a konjugovaný peptid je použitý na selekciu protilátok spôsobmi in vitro alebo in vivo.
Príklad 4: Tvorba duálne špecifických protilátok proti IL-Ια. a IL-Ιβ
NEAQNITDF (SEQ ID NO:1)
Cyklo-MAFLRANQNNGKISVAL(PG) (SEQ ID NO:2)
TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID N0:3)
Peptidy podľa SEQ ID NO: 1, 2 a 3 boli konjugované s KLH a boli imunizované jednotlivé králiky. Antisérum imunizovaných králikov proti každému z týchto troch peptidov vykazovalo dobrú protilátkovú odpoveď proti peptidu, použitému ako antigén. Iba antisérum z králika, imunizovaného peptidom podľa SEQ ID NO:3, bolo však schopné sa viazať na IL-Ια a IL-Ιβ proteín.
Peptidom podľa SEQ ID NO:3, konjugovaným s KLH plus Freundovým nekompletným adjuvans (FIA) bolo subkutánne imunizovaných päť myší (BA119 až BA123), jedenkrát za tri týždne, celkom trikrát a následne s dvoma provokačnými intravenóznymi dávkami peptidom podľa SEQ ID NO:3, konjugovaným s KLH. Každej myši bola odobratá krv vždy 10 dní po každej imunizácii a titer protilátok bol stanovený pomocou ELISA. Slezinné bunky od myši BA119, prípadne BA123, boli fúzované s bunečnou líniou myelómu P3X36Ag8,653, ako je opísané v oddiele IIA a výsledné fúzované bunky boli očkované po jednej do jamiek v niekoľkých 96jamkových platniach s použitím obmedzeného riedenia. Tie hybridómové klony, ktoré rástli, boli najprv testované na produkciu IgG a IgM štandardnou ELISA, aby boli identifikované klony, ktoré produkujú protilátku. Bolo izolovaných celkom 945 klonov z fúzie u &BA123 myši. U 355 testovaných klonov vykazovali supernatanty pri ELISA antigénnu väzbovú aktivitu voči IL-la, IL-Ιβ, alebo voči obom IL-Ια a IL-Ιβ.
# klonov antigénna špecifita (proti celej dĺžke IL-Ια a/alebo IL-Ιβ) Izotyp
249 ibalL-lcc IgG
19 iba IL-1 a IgM
15 iba IL-1 β IgG
2 iba IL-1 β IgM
57 IL-Ια a β IgG
13 IL-1 a a β IgM
Odborníkom v tejto oblasti techniky bude jasné, že aj pri použití rutinných experimentov existujú mnohé ekvivalenty ku špecifickým uskutočneniam predkladaného vynálezu. Je zámerom, aby tieto ekvivalenty boli zahrnuté v nasledujúcich patentových nárokoch.

Claims (88)

1. Duálne špecifická protilátka alebo jej antigén viažuca časť, ktorá špecificky viaže,interleukín-ία a interleukín-ΐβ.
2. Duálne špecifická protilátka podľa nároku 1 alebo jej antigén viažuca časť, ktorá viaže interleukín -la s rozpadovou KOff rýchlostnou konštantou s hodnotou 0,1 s’1 alebo menšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje aktivitu interleukínu-la s IC50 hodnotou 1 x 10‘3 M alebo menšou.
3. Duálne špecifická protilátka podľa nároku 1 alebo jej antigén viažuca časť, ktorá viaže interleukín -1β s rozpadovou KOff rýchlostnou konštantou s hodnotou 0,1 s’1 alebo menšou, stanovené povrchovou plazmónovou rezonanciou, alebo ktorá inhibuje aktivitu interleukínu-ΐβ s IC50 hodnotou 1 x 10'5 M alebo menšou.
4. Spôsob získania duálne špecifickej protilátky, ktorá špecificky viaže interleukín-ΐα a interleukín-ΐβ, vyznačujúci sa tým, že sa poskytne antigén, ktorý obsahuje spoločný štruktúrny prvok IL-Ία i IL-Ιβ;
tomuto antigénu sa vystaví súbor protilátok a tento súbor sa selektuje na protilátku, ktorá špecificky viaže IL-Ία a IL-Ιβ, čím sa získa duálne špecifická protilátka.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že tento antigén sa zostrojí na základe styčnej topologickej oblasti identity medzi IL-Ια a IL-Ιβ.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že tento antigén obsahuje aminokyselinovú sekvenciu NEAQNITDF (SEQ ID NO:1) alebo dNdEdAdQNITDF.
7. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že tento antigén sa zostrojí na základe štruktúrneho napodobňovania slučky natívneho stavu IL-Ια a IL-Ιβ.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že týmto antigénom je cyklický peptid, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu cykloMAFLRANQNNGKISVAL(PG) (SEQ ID NO:2).
9. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že tento antigén sa zostrojí na základe vzájomného spojenia prekrývajúcich sa častí IL-Ια a IL-Ιβ, čím sa vytvorí hybridná molekula.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že tento antigén obsahuje aminokyselinovú sekvenciu TKGGQDITDFQILENQ (SEQ ID NO:3).
11. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že tento antigén obsahuje aminokyselinovú sekvenciu
APVRSLNCTLRDSOOKSLVMSGPYELKALHLOGODMEOQVVFSMGAYKSSKD DAKITVTLGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLOLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEI NNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID NO:4).
12.
Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že súbor protilátok sa vystaví antigénu in vivo imunizáciou živočícha antigénom.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej pripraví súbor hybridómov z lymfocytov uvedeného živočícha a vyberie sa hybridom, ktorý vylučuje protilátku, ktorá špecificky viaže IL-Ια a IL-Ιβ.
14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedený živočích sa vyberie zo skupiny zloženej z myší, potkanov, králikov a kôz.
15. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že týmto živočíchom je knockoutovaná myš, deficientná na IL-la, IL-Ιβ alebo na IL-Ια i IL-Ιβ.
I ' ’
16. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že týmto živočíchom je myš, ktorá je transgénna voči ľudským imunoglobulínovým génom, takže táto myš po antigénnej stimulácii vytvára ľudské protilátky.
17. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že týmto živočíchom je myš so závažnou kombinovanou imunodeficienciou (SCID), ktorá bola rekonštituovaná s ľudskými periférnymi krvnými mononukleárnymi bunkami alebo lymfatickými bunkami alebo ich prekurzormi.
18. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že týmto živočíchom je myš, ošetrená letálnym ožiarením celého tela, nasledovaným ochranou proti ožiareniu pomocou buniek kostnej drene zo SCID myši so závažnou kombinovanou imunodeficienciou, nasledovanou implantáciou funkčných ľudských lymfocytov alebo ich prekurzorov. ,
19. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedený súbor protilátok sa vystaví antigénu in vitro pri skríningu knižnice rekombinantných protilátok týmto antigénom.
20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že táto knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná na povrchu bakteriofága.
21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že táto knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná na povrchu kvasničných buniek.
22. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že táto knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná na povrchu bakteriálnych buniek.
23. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že táto knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná ako fúzie RNA-proteín.
24. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že touto knižnicou rekombinantných protilátok je scFv knižnica alebo Fab knižnica.
25. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedený súbor protilátok sa vystaví antigénu imunizáciou živočícha antigénom in vivo, nasledovanou in vitro skríningom knižnice rekombinantných protilátok, pripravenej z lymfatických buniek tohto živočícha s antigénom.
I
I
26. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedený súbor protilátok sa vystaví antigénu imunizáciou živočícha antigénom in vivo, nasledovanou afinitným zrením in vitro knižnice rekombinantných protilátok, pripravenej z lymfatických buniek tohto živočícha.
27. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedený súbor protilátok sa vystaví antigénu imunizáciou živočícha antigénom in vivo, nasledovanou výberom jednotlivých buniek vylučujúcich protilátky, ktoré viažu antigén, a získaním ťažkého a ľahkého reťazca variabilnej oblasti cDNA z jednotlivých buniek.
28. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedená duálne špecifická protilátka je úplne ľudského pôvodu.
29. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou duálne špecifickou protilátkou je chimérická protilátka.
30. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou duálne špecifickou protilátkou je protilátka s implantovanou CDR.
31. Duálne špecifická protilátka alebo jej antigén viažuca časť, ktorá špecificky viaže interleukín-ΐα a interleukín-ΐβ, získateľná spôsobom podľa nároku 4.
32. Spôsob získania duálne špecifickej protilátky, ktorá špecificky viaže dve rôzne, ale štruktúrne príbuzné molekuly, vyznačujúci sa tým, že sa poskytne antigén, ktorý obsahuje spoločný štruktúrny prvok od dvoch rôznych, ale Štruktúrne príbuzných molekúl;
vystaví sa súbor protilátok tomuto antigénu a uvedený súbor protilátok sa selektuje na protilátku, ktorá špecificky viaže tieto dve rôzne, ale štruktúrne príbuzné molekuly, čím sa získa duálne špecifická protilátka.
33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený antigén sa zostrojí na základe styčnej oblasti identity medzi dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami.
34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedenými dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami sú proteíny a antigén je peptidom, obsahujúcim aminokyselinovú sekvenciu styčnej topologickej oblasti identity medzi týmito dvoma proteínmi.
35. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený antigén sa zostrojí na základe štruktúrneho napodobnenia slučky spoločnej natívnej štruktúry dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl.
36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že uvedenými dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami sú proteiny a antigén je cyklickým peptidom, ktorý štruktúrne napodobňuje slučku spoločnej natívnej štruktúry týchto dvoch proteínov.
37. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že antigén sa zostrojí na základe spojenia prekrývajúcich sa častí dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl, za vzniku hybridnej molekuly.
38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že uvedenýma dvoma rôznymi, ale štruktúrne príbuznými molekulami sú proteiny a antigénom je hybridný peptid získaný spojením prekrývajúcich sa aminokyselinových sekvencii týchto dvoch proteínov.
39. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený antigén je jednou z dvoch rôznych, ale štruktúrne príbuzných molekúl.
40. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že sa súbor protilátok vystaví antigénu in vivo imunizáciou živočícha týmto antigénom.
41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej pripraví panel hybridómov z lymfocytov živočícha a selektuje sa hybridom, ktorý vylučuje protilátku, ktorá sa špecificky viaže ku dvom rôznym, ale štruktúrne príbuzným molekulám.
42. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že uvedený živočích sa vyberie zo skupiny, skladajúcej sa z myší, potkanov, králikov a kôz.
43. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že uvedeným živočíchom je knockoutovaná myš, deficientná na endogénnu verziu uvedeného antigénu.
44. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že týmto živočíchom je myš, ktorá je transgénna na ľudské imunoglobulínové gény, takže táto myš po stimulácii antigénom vytvára ľudské protilátky.
45. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že uvedeným živočíchom je myš so závažnou kombinovanou imunodeficienciou, SCID, ktorá bola obnovená ľudskými periférnymi krvnými mononukleárnymi bunkami alebo lymfatickými bunkami alebo ich prekurzormi.
46. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že uvedeným živočíchom je myš, ktorá bola ošetrená letálnym ožiarením celého tela, nasledovaným ochranou proti ožiareniu vo forme buniek kostnej drene z myši so závažnou kombinovanou imunodeficienciou, SCID, nasledovanou implantáciou funkčných ľudských lymfocytov.
47. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený súbor protilátok sa vystaví antigénu in vitro skríningom knižnice rekombinantných protilátok uvedeným antigénom.
48. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že uvedená knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná na povrchu bakteriofága.
49. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že uvedená knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná na povrchu kvasničných buniek.
50. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že uvedená knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná na povrchu bakteriálnych buniek.
51. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že uvedená knižnica rekombinantných protilátok je exprimovaná vo forme fúzií RNA-proteín.
52. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že uvedenou knižnicou rekombinantných protilátok je scFv knižnica alebo Fab knižnica.
53. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený súbor protilátok vystaví antigénu imunizáciou živočícha antigénom in vivo, nasledovanou in vitro skríningom knižnice rekombinantných protilátok pripravenej z lymfatických buniek živočícha, pomocou antigénu.
54. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený súbor protilátok vystaví antigénu in vivo imunizáciou živočícha týmto antigénom, nasledovanou in vitro afinitným zrením knižnice rekombinantných protilátok, pripravenej z lymfatických buniek tohto živočícha.
55. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený súbor protilátok vystaví antigénu imunizáciou živočícha antigénom in vivo, nasledovanou selekciou jednotlivých buniek, vylučujúcich protilátky, ktoré viažu antigén a získaním ťažkých a ľahkých reťazcov variabilnej oblasti cDNA z jednotlivých buniek.
56. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedenou duálne špecifickou protilátkou je úplne ľudská protilátka.
57. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedenou duálne špecifickou protilátkou je chimérická protilátka.
58. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedenou duálne špecifickou protilátkou je protilátka s implantovanou CDR.
59. Duálne špecifická protilátka alebo jej antigén viažuca časť, získateľná spôsobom podľa nároku 32.
60. Spôsob detekcie IL-Ία alebo IL-Ιβ v biologickej vzorke alebo v tkanive, vyznačujúci sa tým, že sa biologická vzorka alebo tkanivo, s predpokladaným obsahom IL-Ία alebo IL-Ιβ, uvedie do kontaktu s duálne špecifickou protilátkou alebo s jej antigén viažucou časťou podľa nároku 1 a v biologickej vzorke alebo v tkanive sa deteguje IL-Ία alebo IL-Ιβ.
61. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že sa IL-Ία alebo IL-Ιβ deteguje pre diagnostické účely.
62. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že uvedenou biologickou vzorkou je in vitro vzorka.
63. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že uvedená tkanivo je lokalizované in vivo v subjekte a uvedený spôsob zahrnuje in vivo zobrazenie tohto tkaniva.
64. Spôsob inhibície aktivity IL-Ια alebo IL-Ιβ, vyznačujúci sa tým, že sa IL-Ια alebo IL-Ιβ uvedú do kontaktu s duálne špecifickou protilátkou alebo jej antigén viažucou časťou podľa nároku 1, takže sa aktivita IL-la alebo IL-Ιβ inhibuje.
65. Spôsob podľa nároku 64, vyznačujúci sa tým, že sa aktivita IL-Ια alebo IL-Ιβ inhibuje in vitro.
66. Spôsob liečby choroby, ktorá je spojená s interleukínom-1, vyznačujúci sa tým, že sa subjektu, trpiacemu chorobou, ktorá je spojená s interleukínom-1, podáva duálne špecifická protilátka alebo jej antigén viažuca časť podľa nároku 1, takže sa tento subjekt lieči na chorobu spojenú s interleukínom-1.
67. Spôsob podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že touto chorobou, ktorá je spojená s interleukínom-1, je zápalová choroba.
68. Spôsob podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že touto chorobou, ktorá je spojená s interleukínom-1, je autoimunitná choroba.
69. Spôsob podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že choroba, ktorá je spojená s interleukínom-1, sa vyberie zo skupiny, ktorá sa skladá z reumatoidnej artritídy, Crohnovej choroby, sklerózy multiplex, diabetu závislého na inzulíne a psoriázy.
70. Spôsob prípravy knižnice protilátky alebo jej antigén viažucej časti, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
a) získanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, ktoré vznikli po expozícii prvému antigénu;
b) získanie knižnice B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, ktoré vznikli po expozícii prvému antigénu;
c) získanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, ktoré vznikli po expozícii druhému antigénu;
d) získanie knižnice D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, ktoré vznikli po expozícii druhému antigénu;
e) kombinovanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica X protilátky alebo jej antigén viažucej časti a/alebo kombinovanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti.
71. Spôsob prípravy knižnice protilátky alebo jej antigén viažucej časti podľa nároku 70, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje kroky kombinovania knižnice X protilátky alebo jej antigén viažucej časti s knižnicou Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti.
72. Knižnica X protilátky alebo jej antigén viažucej časti, získaná spôsobom podľa nároku 70.
73.
74.
Knižnica Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti, získaná spôsobom podľa nároku 70.
Knižnica Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti, získaná spôsobom podľa nároku 71.
75. Spôsob výroby duálne špecifickej protilátky alebo jej antigén viažucej časti, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
a) získanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, vzniknutých expozíciou prvému antigénu;
b) získanie knižnice B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok vzniknutých expozíciou prvému antigénu;
c) získanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok vzniknutých expozíciou druhému antigénu;
ΊΟ
d) získanie knižnice D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok vzniknutých expozíciou druhému antigénu;
e) kombinovanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica X protilátky alebo jej antigén viažucej časti a/alebo kombinovanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti a
f) selektovanie knižnice X protilátky alebo jej antigén viažucej časti a/alebo knižnice Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti na protilátku alebo jej antigén viažucu časť, ktorá viaže ako prvý, tak i druhý antigén.
76. Duálne špecifická protilátka, získaná spôsobom podľa nároku 75.
77. Spôsob výroby duálne špecifickej protilátky alebo jej antigén viažucej časti, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
a) získanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok, vzniknutých expozíciou prvému antigénu;
b) získanie knižnice B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok vzniknutých expozíciou prvému antigénu;
c) získanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok vzniknutých expozíciou druhému antigénu;
d) získanie knižnice D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti zo súboru protilátok vzniknutých expozíciou druhému antigénu;
e) kombinovanie knižnice A rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou D rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica X protilátky alebo jej antigén viažucej časti a/alebo kombinovanie knižnice C rekombinantného ťažkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti s knižnicou B rekombinantného ľahkého reťazca alebo jeho antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti a
f) kombinovanie knižnice X protilátky alebo jej antigén viažucej časti s knižnicou Y protilátky alebo jej antigén viažucej časti, aby sa získala knižnica Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti a
g) selektovanie knižnice Z protilátky alebo jej antigén viažucej časti na protilátku alebo jej antigén viažucu časť, ktorá viaže ako prvý, tak i druhý antigén.
78. Duálne špecifická protilátka alebo jej antigén viažuca časť, získaná spôsobom podľa nároku 77.
79. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 70, 75 a 77, vyznačujúci sa tým, že sa uvedený prvý a druhý antigén nezávisle vyberie zo skupiny, ktorá sa skladá z proteínov, polypeptidov a peptidov, za predpokladu, že tento prvý a druhý antigén nie sú rovnaké.
80. Spôsob podľa nároku 79, vyznačujúci sa tým, že uvedenými proteínmi, polypeptidmi a peptidmi sú vylučované proteíny alebo povrchové receptory.
81. Spôsob podľa nároku 80, vyznačujúci sa tým, že sa vylučovaný protein vyberie zo skupiny, ktorá sa skladá z IFN, TNF, interleukínu, IP-10, PF4, GRO, 9E3, EMAP-II, CSF, FGF a PDGF.
82. Spôsob podľa nároku 81, vyznačujúci sa tým, že uvedeným prvým antigénom je IL-Ία a druhým antigénom je IL-Ιβ.
83. Nukleotidová sekvencia, kódujúca každý člen knižnice alebo knižníc protilátky alebo jej antigén viažucej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 72, 73 alebo 74.
84. Nukleotidová sekvencia kódujúca duálne špecifickú protilátku alebo jej antigén viažucu časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 76 alebo 78.
85. Vektor, zahrnujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu člen knižnice alebo knižníc protilátky alebo jej antigén viažucej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 72, 73 alebo 74.
86. Vektor, zahrnujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu duálne špecifickú protilátku alebo jej antigén viažucu časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 76 alebo 78.
87. Hostiteľská bunka, transfektovaná vektorom podľa nároku 85.
88. Hostiteľská bunka, transfektovaná vektorom podľa nároku 86.
SK115-2003A 2000-06-29 2001-06-28 Dual specificity antibodies and methods of making and using SK1152003A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21537900P 2000-06-29 2000-06-29
PCT/US2001/020755 WO2002002773A2 (en) 2000-06-29 2001-06-28 Dual specificity antibodies and methods of making and using

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK1152003A3 true SK1152003A3 (en) 2003-07-01

Family

ID=22802758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK115-2003A SK1152003A3 (en) 2000-06-29 2001-06-28 Dual specificity antibodies and methods of making and using

Country Status (27)

Country Link
US (5) US7491516B2 (sk)
EP (4) EP2386575A3 (sk)
JP (2) JP4955185B2 (sk)
KR (2) KR20080074231A (sk)
CN (3) CN102120773B (sk)
AT (1) ATE420958T1 (sk)
AU (1) AU2001271636A1 (sk)
BG (1) BG66209B1 (sk)
BR (1) BR0112026A (sk)
CA (1) CA2411374C (sk)
CZ (1) CZ2003291A3 (sk)
DE (1) DE60137421D1 (sk)
EC (1) ECSP024409A (sk)
ES (1) ES2319866T3 (sk)
HK (1) HK1055316A1 (sk)
HU (1) HUP0301002A3 (sk)
IL (3) IL153567A0 (sk)
MX (1) MXPA02012867A (sk)
NO (1) NO20026239L (sk)
NZ (1) NZ523080A (sk)
PE (1) PE20020132A1 (sk)
PL (1) PL208069B1 (sk)
SK (1) SK1152003A3 (sk)
TW (2) TWI307716B (sk)
UY (1) UY26807A1 (sk)
WO (1) WO2002002773A2 (sk)
ZA (1) ZA200210109B (sk)

Families Citing this family (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0996725A1 (en) * 1997-06-27 2000-05-03 Human Genome Sciences, Inc. Human nk-3 related prostate specific gene-1
DE60137421D1 (de) * 2000-06-29 2009-03-05 Abbott Lab Antikörper mit zwei spezifizitäten und verfahren zur deren herstellung und verwendung
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE60237282D1 (de) * 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
GB0115841D0 (en) 2001-06-28 2001-08-22 Medical Res Council Ligand
US9028822B2 (en) 2002-06-28 2015-05-12 Domantis Limited Antagonists against TNFR1 and methods of use therefor
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20070104710A1 (en) * 2002-06-28 2007-05-10 Domants Limited Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US20050271660A1 (en) * 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
GB0230201D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
US20110223168A1 (en) * 2002-12-27 2011-09-15 Greg Winter Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
AU2005207003C1 (en) * 2004-01-20 2013-06-13 Humanigen, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
EP1737971B1 (en) * 2004-01-20 2017-08-16 Merus N.V. Mixtures of binding proteins
TWI439284B (zh) * 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
US7790405B2 (en) 2004-04-26 2010-09-07 Centocor, Inc. Solution phase biopanning method using engineered decoy proteins
US7514539B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
SI1747015T1 (sl) * 2004-04-26 2012-11-30 Janssen Biotech Inc Postopek biopanninga raztopinske faze z uporabo genetsko proizvedenih vabnih proteinov
CA2569240A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Drug fusion comprising a polypeptide drug and an immunoglobulin heavy chain variable domain specific for serum albumin
EP1851245B1 (en) 2005-01-26 2012-10-10 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
KR100675791B1 (ko) * 2005-02-04 2007-02-02 제주대학교 산학협력단 육상어류양식장용 자동먹이공급시스템
WO2006120230A2 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
EP1893645A1 (en) * 2005-06-23 2008-03-05 Crucell Holland B.V. Optimization of west nile virus antibodies
DK1912675T3 (en) 2005-07-25 2014-03-24 Emergent Product Dev Seattle B-cell reduction using specific and cd37-cd20-specific binding molecules
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500356A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
US8906864B2 (en) 2005-09-30 2014-12-09 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use
EP1940880A2 (en) * 2005-10-14 2008-07-09 Novo Nordisk A/S Treating diabetes using inhibitors of il-1
AU2007238677B2 (en) * 2006-04-14 2011-03-10 Novartis Ag Use of IL-I antibodies for treating ophthalmic disorders
KR101508390B1 (ko) 2006-06-06 2015-04-08 크루셀 홀란드 비.브이. 포도상구균에 대한 사멸활성을 갖는 인간결합분자 및 그것의 용도
JP2009539413A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
CA2659745A1 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 California Institute Of Technology Methods and systems for detecting and/or sorting targets
EP2471816A1 (en) * 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
RU2554747C9 (ru) * 2006-12-20 2015-10-20 Ксома (Сша) Ллс Способы лечения il-1бета-зависимых заболеваний
EP2114443A4 (en) * 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY
EP2679996A1 (en) 2007-05-31 2014-01-01 AbbVie Inc. Biomarkers predictive of the responsiveness to TNF-alfa inhibitors in autoimmune disorders
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
JP2011506614A (ja) 2007-12-17 2011-03-03 ダイアックス コーポレーション Ｍｍｐ−１４結合タンパク質を含む、骨溶解性障害を処置するための組成物および方法
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
US8008445B2 (en) 2008-03-03 2011-08-30 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins
US8013125B2 (en) * 2008-03-03 2011-09-06 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 and metalloproteinase 2 binding proteins
ES2368700T3 (es) 2008-04-11 2011-11-21 Emergent Product Development Seattle, Llc Agente inmunoterapéutico para cd37 y combinación con un agente quimioterapéutico bifuncional del mismo.
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
KR101705911B1 (ko) 2008-09-03 2017-02-10 제넨테크, 인크. 다중특이적 항체
US8377429B2 (en) * 2008-09-05 2013-02-19 Xoma Technology Ltd. Methods for improvement of beta cell function with anti-IL-1β antibodies or fragments thereof
EP2326347A4 (en) * 2008-09-12 2013-03-06 Xbiotech Inc TARGETING PATHOGENIC MONOCYTES
HUE033438T2 (en) 2008-09-26 2017-11-28 Ucb Biopharma Sprl Biological products
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
KR20110110349A (ko) * 2009-01-29 2011-10-06 아보트 러보러터리즈 Ｉｌ-1 결합 단백질
EP2810652A3 (en) 2009-03-05 2015-03-11 AbbVie Inc. IL-17 binding proteins
CA2756244A1 (en) * 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
CN101957365B (zh) * 2009-07-21 2013-08-07 卫生部北京医院 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
KR20120060877A (ko) * 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
US8398966B2 (en) * 2009-10-15 2013-03-19 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
SG181563A1 (en) 2009-12-08 2012-07-30 Abbott Gmbh & Co Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
EP2523974A4 (en) * 2010-01-12 2013-11-06 Oncomed Pharm Inc WNT BINDING AGENTS AND USES THEREOF
EP2542582A4 (en) 2010-03-02 2013-12-04 Abbvie Inc THERAPEUTIC PROTEINS LINKING TO DLL4
ES2617777T5 (es) * 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
SI2571532T1 (sl) 2010-05-14 2017-10-30 Abbvie Inc. Proteini, ki vežejo IL-1
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
BR112013003279A2 (pt) * 2010-08-13 2016-06-14 Genentech In “métodos para tratar uma doença, método para neutralizar ou bloquear a atividade de il-1ß e/ou il-18, anticorpo, usos de um anticorpo e usos de um anticorpo monoclonal”
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20130133247A (ko) 2010-12-21 2013-12-06 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ-1-알파 및 -베타 이특이적 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CN103596591B (zh) * 2011-02-08 2016-08-24 Abbvie公司 骨关节炎和疼痛的治疗
WO2012163521A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Dutalys Removal of monomeric targets
EP2726510B1 (en) 2011-05-27 2023-03-08 F. Hoffmann-La Roche AG Dual targeting
AU2012274461A1 (en) 2011-06-20 2014-01-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-erbB3 antibody
WO2013059439A2 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Dyax Corp. Combination therapy comprising an mmp-14 binding protein
RU2014121043A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Биспецифические иммуносвязывающие средства, направленные против tnf и il-17
MX2014004977A (es) 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
WO2013078135A2 (en) * 2011-11-21 2013-05-30 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
RU2482181C1 (ru) * 2011-12-07 2013-05-20 Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН Клеточная линия d11 множественной миеломы человека, используемая для гибридомной технологии
CA2855570A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
US10118958B2 (en) 2011-12-14 2018-11-06 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
KR101963230B1 (ko) 2011-12-26 2019-03-29 삼성전자주식회사 복수개의 단일 항체를 포함하는 단백질 복합체
TW201333033A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 雙可變域免疫球蛋白及其用途
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
MY176695A (en) 2012-01-27 2020-08-19 Abbvie Inc Composition and method for the diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
WO2014011955A2 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Abbvie, Inc. Il-1 binding proteins
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG10201802044RA (en) * 2012-11-01 2018-05-30 Abbvie Inc Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations
JP2016501881A (ja) 2012-12-04 2016-01-21 アッヴィ・インコーポレイテッド 血液脳関門（ｂｂｂ）を透過する二重特異性結合タンパク質
EP2938634A2 (en) 2012-12-28 2015-11-04 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins having a receptor sequence
US9856319B2 (en) 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
US9915665B2 (en) 2012-12-28 2018-03-13 Abbvie Inc. High-throughput system and method for identifying antibodies having specific antigen binding activities
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
EP2970457A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins directed against tnf
ES2753419T3 (es) 2013-06-07 2020-04-08 Univ Duke Inhibidores del factor H del complemento
CN103308697B (zh) * 2013-06-09 2014-11-26 卫生部北京医院 检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白ns3和ns5的天然双特异性抗体的试剂盒
US9879081B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof
KR20160055275A (ko) 2013-09-17 2016-05-17 유니버시티 헬스 네트워크 시스 ｒｇｍａ/네오제닌 상호작용 또는 지질 래프트에 대해 지시되는 제제 및 치료 방법에서의 이의 용도
BR112016006502A2 (pt) * 2013-09-30 2017-09-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para a produção de molécula de ligação de antígeno usando-se fago auxiliar modificado
CN105849124B (zh) 2013-12-20 2022-04-12 豪夫迈·罗氏有限公司 双重特异性抗体
WO2015191783A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Abbvie Inc. Biomarkers for inflammatory disease and methods of using same
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6655302B2 (ja) * 2015-05-29 2020-02-26 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US20170073420A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Abbvie Inc. Methods for treating relapsing forms of multiple sclerosis
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
JP6734919B2 (ja) 2015-10-02 2020-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 同時結合を測定するための細胞ベースのｆｒｅｔアッセイ法
US11219645B2 (en) 2015-11-18 2022-01-11 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
PL3365368T3 (pl) 2016-03-11 2023-08-21 Scholar Rock, Inc. Immunoglobuliny wiążące tgfbeta1 i ich zastosowanie
JP2019517480A (ja) 2016-06-01 2019-06-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 脊髄損傷及び疼痛を処置するための抗ＲＧＭａ（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａ）アンタゴニスト抗体
EP3519824A1 (en) 2016-10-03 2019-08-07 Abbott Laboratories Improved methods of assessing uch-l1 status in patient samples
WO2018129329A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Scholar Rock, Inc. ISOFORM-SPECIFIC, CONTEXT-PERMISSIVE TGFβ1 INHIBITORS AND USE THEREOF
US11016092B2 (en) 2017-03-23 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1
LT3606946T (lt) 2017-04-03 2022-10-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-1 antikūno imunokonjugatai su mutantiniu il-2 arba su il-15
KR102346336B1 (ko) 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
US10877048B2 (en) 2017-04-15 2020-12-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
US10877038B2 (en) 2017-04-28 2020-12-29 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury using early biomarkers on at least two samples from the same human subject
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
AU2018272054A1 (en) 2017-05-25 2019-09-26 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
JP7269183B2 (ja) 2017-05-30 2023-05-08 アボット・ラボラトリーズ 心臓トロポニンｉを使用する、ヒト対象における軽度外傷性脳損傷を診断及び査定する一助となるための方法
WO2019010131A1 (en) 2017-07-03 2019-01-10 Abbott Laboratories IMPROVED METHODS FOR MEASURING CARBOXY TERMINATION HYDROLASE LEVELS OF UBIQUITIN L1 IN BLOOD
GB201711208D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Iontas Ltd Ion channel inhibitors
AU2018363922A1 (en) 2017-11-08 2020-05-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody which binds to CD40 and EpCAM
BR112020010085A2 (pt) 2017-12-09 2020-10-13 Abbott Laboratories métodos para auxiliar no diagnóstico e avaliar uma lesão cerebral traumática em um indivíduo humano usando uma combinação de gfap e uch-l1
US11022617B2 (en) 2017-12-09 2021-06-01 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (TBI), using glial fibrillary acidic protein (GFAP) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1)
JP7437303B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-22 アボット・ラボラトリーズ 外傷性脳損傷を診断及び査定するための、新規のバイオマーカー及び方法
WO2020014473A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Scholar Rock, Inc. TGFβ1 INHIBITORS AND USE THEREOF
PL3677278T3 (pl) 2018-07-11 2022-02-28 Scholar Rock, Inc. Selektywne względem izoformy inhibitory tgfbeta1 i ich zastosowanie
MX2021000347A (es) 2018-07-11 2021-04-19 Scholar Rock Inc Inhibidores de tgf?1 selectivos de isoforma, de alta afinidad y usos de los mismos.
MX2021007797A (es) 2018-12-28 2021-10-26 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo biespecifico que se une al receptor de transferrina (tfr).
EP3931573A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Abbott Laboratories Methods for predicting major adverse cardiovascular events in subjects with coronary artery disease
JPWO2020230901A1 (sk) 2019-05-15 2020-11-19
JPWO2020230899A1 (sk) 2019-05-15 2020-11-19
AU2021205440A1 (en) 2020-01-11 2022-09-01 Scholar Rock,Inc. TGF-beta inhibitors and use thereof
WO2021142427A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. TGFβ INHIBITORS AND USE THEREOF
WO2021211331A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Abbott Point Of Care Inc. METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE
CN111793131A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中pf4含量的抗体对及其用途
US20220043000A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
CA3198161A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Beth MCQUISTON Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2022147147A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
AU2022279156A1 (en) 2021-05-18 2023-11-02 Abbott Laboratories Methods of evaluating brain injury in a pediatric subject
WO2022256723A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
CA3222291A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Jaime MARINO Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
WO2023288277A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Scholar Rock, Inc. Ltbp complex-specific inhibitors of tgfb1 and uses thereof
WO2023019019A2 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Abwiz Bio, Inc. Humanization, affinity maturation, and optimization methods for proteins and antibodies
WO2023034777A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
AU2022354059A1 (en) 2021-09-30 2024-03-28 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
WO2023114978A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
WO2023129942A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan
WO2023150652A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US126603A (en) 1872-05-07 Improvement in machines for sawing staves
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
FR2577377B1 (fr) * 1985-02-21 1989-06-16 Albaret Sa Procede pour eviter le patinage d'un tracteur equipe d'un relevage hydraulique avec un outil enfoui dans le sol, et equipement de tracteur pour mettre en oeuvre ce procede
US4772685A (en) * 1985-10-02 1988-09-20 Merck & Co., Inc. Immunogenic peptides of human interleukin-1 and the corresponding anti-peptide antibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DE768377T1 (de) 1988-09-02 1998-01-02 Dyax Corp Herstellung und Auswahl von Rekombinantproteinen mit verschiedenen Bindestellen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
ATE261493T1 (de) * 1992-05-22 2004-03-15 Univ Montana State Antikörper mit spezifikäten gegen mehrere adhäsionsmoleküle
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
NZ288997A (en) * 1994-06-24 1999-01-28 Immunex Corp Controlled release pharmaceutical formulation comprising polypeptide encapsulated in alginate
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
RU2270030C2 (ru) 1996-02-09 2006-02-20 Абботт Байотекнолоджи эЛтиди. СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО TNFα (ВАРИАНТЫ), ПРИМЕНЕНИЕ ВЫДЕЛЕННОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕГО ФРАГМЕНТА В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА (ВАРИАНТЫ) И ВЫДЕЛЕННОЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
WO1998047343A2 (en) 1997-04-04 1998-10-29 Biosite Diagnostics, Inc. Antibodies or binding protein libraries displayed on phage, cells, or other replicatable genetic packages
AU7171098A (en) 1997-05-01 1998-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6680380B1 (en) 1998-09-18 2004-01-20 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian interleukin-1ζ, related reagents and methods
KR101222450B1 (ko) 1999-03-25 2013-01-16 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
GB0001448D0 (en) 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
DE60137421D1 (de) 2000-06-29 2009-03-05 Abbott Lab Antikörper mit zwei spezifizitäten und verfahren zur deren herstellung und verwendung
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
TW200730539A (en) 2005-12-01 2007-08-16 Domantis Ltd Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
EP2114443A4 (en) 2006-12-29 2011-08-10 Abbott Lab IL-1A / IL-1B ANTIBODY WITH DOUBLE SPECIFICITY

Also Published As

Publication number Publication date
EP1297142B1 (en) 2009-01-14
HUP0301002A3 (en) 2005-12-28
US20140378666A1 (en) 2014-12-25
EP2386575A2 (en) 2011-11-16
US7491516B2 (en) 2009-02-17
PL359995A1 (en) 2004-09-06
PL208069B1 (pl) 2011-03-31
CA2411374C (en) 2012-10-30
EP2899210A3 (en) 2015-11-18
CN102120773B (zh) 2013-07-24
US20140155579A1 (en) 2014-06-05
CN1451043A (zh) 2003-10-22
WO2002002773A2 (en) 2002-01-10
IL153567A0 (en) 2003-07-06
BR0112026A (pt) 2003-05-20
ZA200210109B (en) 2004-03-12
IL203955A (en) 2011-09-27
JP2012031178A (ja) 2012-02-16
AU2001271636A1 (en) 2002-01-14
HUP0301002A2 (hu) 2003-07-28
CN102120773A (zh) 2011-07-13
JP4955185B2 (ja) 2012-06-20
HK1055316A1 (en) 2004-01-02
US20150175694A1 (en) 2015-06-25
TW200516083A (en) 2005-05-16
PE20020132A1 (es) 2002-03-04
US20030040083A1 (en) 2003-02-27
CA2411374A1 (en) 2002-01-10
NO20026239D0 (no) 2002-12-27
IL153567A (en) 2010-11-30
NO20026239L (no) 2003-02-27
KR20030014288A (ko) 2003-02-15
EP2042518A3 (en) 2009-04-08
CZ2003291A3 (cs) 2003-05-14
KR100919593B1 (ko) 2009-09-29
NZ523080A (en) 2004-11-26
EP2042518A2 (en) 2009-04-01
BG107483A (bg) 2003-09-30
BG66209B1 (bg) 2012-04-30
JP2004502428A (ja) 2004-01-29
DE60137421D1 (de) 2009-03-05
EP1297142A2 (en) 2003-04-02
ES2319866T3 (es) 2009-05-14
US8475766B2 (en) 2013-07-02
ECSP024409A (es) 2003-02-06
CN101525384A (zh) 2009-09-09
US20090232736A1 (en) 2009-09-17
TWI307716B (en) 2009-03-21
WO2002002773A3 (en) 2002-08-22
ATE420958T1 (de) 2009-01-15
KR20080074231A (ko) 2008-08-12
EP2386575A3 (en) 2011-11-30
MXPA02012867A (es) 2003-09-05
UY26807A1 (es) 2002-01-31
EP2899210A2 (en) 2015-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK1152003A3 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
KR100951067B1 (ko) 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고사용하는 방법
BRPI0612273B1 (pt) anticorpo de ligação a il-1 beta ou fragmento de ligação a il-1 beta do mesmo, ácido nucleico, vetor, e, composição
BRPI1014544B1 (pt) Anticorpo anti-il-17f monoclonal totalmente humano isolado e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
AU2007202323B9 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2013203432A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using
AU2012200225A1 (en) Dual specificity antibodies and methods of making and using

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application