JP5798926B2 - 配列解析によって病態をモニターする方法 - Google Patents

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Description

相互参照
本出願は2008年11月7日に出願した米国特許出願第61/112,693号の恩典を主張し、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
免疫系は、先天性免疫系および適応免疫系を含む。先天性免疫系は、外来病原体を認識するために一般的方法を使用する細胞および機構を含む。先天性免疫に関与する細胞には、好中球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好塩基球、好酸球、肥満細胞、および樹状細胞が含まれる。これらの細胞は、食作用、および侵入病原体を殺傷する多くの化学物質の放出を行う。加えて、これらの細胞は、補体カスケードおよび炎症を含む先天性免疫防御機構に関与する。最終的に、これらの細胞の一部は、適応免疫系において役割を果たす抗原提示過程に関与する。
適応免疫系は、それらの標的上の特異的特徴を攻撃するように進化してきた。特定の標的に対して1つの反応が生じると、宿主にその「記憶」が提供されて、次にそれが出現した場合に、宿主はより強力な反応を開始する。通常、いかなるタンパク質または多糖も、標的細胞上の特異的エピトープを認識する適応免疫応答細胞のいくつかのサブセットまたはそれらの産物の標的となり得る。適応免疫応答は、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の2つの型に分類され、B細胞およびT細胞がそれぞれこれらの応答において特異的役割を果たす。
自己免疫疾患は、自己標的に対する適応免疫系のいくつかの要素の認識を含むため、診断および予後診断を支援するために適応免疫系の局面が調べられてきた。標準的な免疫技法を用いて、循環自己抗体を探すことにより体液性免疫系が調べられてきた。いくつかの疾患に関して、抗核、抗dsDNA、およびリウマチ因子のような自己抗体が同定された。これらの抗体はそれ自体病原性がないと考えられ、またそれらが体内で認識する標的はインビトロで試験される標的と必ずしも同じではないが、それらのレベルを測定することは診断に役立ち、場合によっては何らかの予後診断および治療の意義を有する。
自己免疫疾患における適応免疫系を研究するための別の方法論は、適応免疫細胞の多様性の解析に基づいている。適応免疫細胞が活性化されると、それらのクローン増殖が生じる。このクローン増殖の証拠は通常、血液RNAまたはDNAからの、抗原認識領域をコードする核酸配列の部分の増幅によって達成される。例えば、T細胞受容体のβ鎖(抗体重鎖と類似している)の特定のVセグメントを有する配列を増幅するためのPCRプライマーを用いて、特定のVセグメントに結合しているJセグメントまたはJおよびDセグメントを増幅する。多様な細胞集団が存在する場合には、わずかにサイズの異なる単位複製配列の分布を有する断片が増幅されると予測されるが、クローン増殖では特定のサイズが濃縮され、よってゲル上でバンドのようにより強く可視化される。スペクトラタイピングと称される技法では、VセグメントのそれぞれをJおよびDセグメントと共に増幅して、これらの単位複製配列のいずれかがクローン増殖を示すかどうかを評価する。
スペクトラタイピングアプローチの1つの問題は、多くの異なる配列が同じ長さを有し得、そのため識別できないということである。したがって、劇的なクローン増殖のみがこの技法によって識別され得る。自己免疫疾患および自己免疫疾患状態、ならびに免疫系が中心的役割を果たすその他の疾患を診断する、およびそれらの予後診断を支援する方法を改善する必要がある。
免疫系をプロファイルする上でのさらなる特異性は、ヒトの健康に及ぼすその影響をよりよく予測できるようにするのに大変有用であるものの、疾患過程に関与する特異的T細胞およびB細胞の特定の配列が以前に観察されていない場合でさえ、それらの同定を可能にする方法が開発されたならば、より優れた有用性がもたらされる。免疫系の膨大な多様性は、潜在的に有用な細胞の莫大な蓄えを免疫系に提供するばかりでなく、予測目的にこのレパートリーを使用しようと試みる課題を研究者に提示する。ある抗原を標的とする任意の単一の配列は、所与の個体において疾患過程に関与し得るおよび/または相関し得る膨大な数のうちの1つである。所与の個体における多くの細胞のいずれが疾患過程に関与しているのかを同定する方法は、ヒトの健康にとって非常に価値がある。
1つの局面において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該細胞からゲノムDNAの個々の分子を空間的に単離する段階、ゲノムDNAの空間的に単離された個々の該分子を配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の局面において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該細胞からゲノムDNAの個々の分子を空間的に単離する段階、ゲノムDNAの個々の該分子を増幅する段階、該増幅DNAを配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の局面において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該細胞からゲノムDNAを増幅する段階、該増幅DNAの個々の分子を空間的に単離する段階、増幅DNAの空間的に単離された個々の該分子を配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の局面において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該細胞からゲノムDNAを増幅する段階、該増幅DNAの個々の分子を空間的に単離する段階、該増幅DNA分子を再増幅する段階、該再増幅DNA分子を配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の局面において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNAの配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該細胞からRNAを逆転写してcDNAを形成する段階、該cDNAの個々の分子を空間的に単離する段階、任意で、cDNAの空間的に単離された個々の該分子を再増幅する段階、該cDNAおよび/または再増幅cDNAを配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の局面において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該試料中の個々の細胞を空間的に単離する段階、該細胞から核酸の個々の分子を配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
1つの態様において、前記の増幅および/または再増幅段階は、PCR、多重PCR、TMA、NASBA、またはLAMPを含む。別の態様において、前記の空間的に単離する段階は、細菌を形質転換するために用いられるベクターに前記DNAもしくはcDNAをサブクローニングすること、固体支持体上で前記DNAもしくはcDNAを二次元に分離すること、ミセルを有する溶液中で前記DNAもしくはcDNAを三次元に分離すること、または微小反応チャンバーを用いて分子を分離することを含む。別の態様において、前記の増幅および/または再増幅段階は、サブクローニングしたDNAもしくはcDNAを保有する細菌の増殖、スライド上でのDNAもしくはcDNAの増幅、またはビーズ上でのDNAもしくはcDNAの増幅による。
別の態様において、前記の配列決定段階はジデオキシ配列決定を含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、可逆的終結標識ヌクレオチドを用いた合成による配列決定を含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、ヌクレオチド取り込み時のピロリン酸放出の検出を含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへのアレル特異的ハイブリダイゼーションを含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへのアレル特異的ハイブリダイゼーションと、それに続く該プローブの連結とを用いた合成による配列決定を含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、重合工程中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリングを含む。
別の態様において、前記の組換えDNA配列は、T細胞受容体遺伝子および/または免疫グロブリン遺伝子を含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、免疫グロブリン遺伝子および/またはT細胞受容体遺伝子の完全クローン配列のサブセットを配列決定することを含む。
別の態様において、完全クローン配列の前記サブセットは、免疫グロブリン遺伝子もしくはT細胞受容体遺伝子のV-D結合部、D-J結合部、免疫グロブリン遺伝子もしくはT細胞受容体遺伝子の完全な可変領域、抗原認識領域、または相補性決定領域3(CDR3)を含む。別の態様において、前記T細胞受容体遺伝子はT細胞受容体β遺伝子を含む。別の態様において、前記免疫グロブリン遺伝子は免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む。別の態様において、前記の増幅または再増幅段階は、Vセグメントと相補的な複数のプライマー、およびCセグメントと相補的な1つのプライマーを含む。別の態様において、前記の増幅または再増幅段階は、Vセグメントと相補的な複数のプライマー、およびCセグメントと相補的な複数のプライマーを含む。
別の態様において、Vセグメントと相補的な前記の複数のプライマーは、各Vセグメントに対する少なくとも3種の異なるプライマーを含み、Cセグメントと相補的な複数のプライマーは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、または少なくとも6種のプライマーを含む。
別の態様において、前記T細胞またはB細胞は、全T細胞およびB細胞のサブセットである。別の態様において、T細胞の該サブセットは、CD4+、CD8+細胞、またはCD27高細胞である。別の態様において、前記試料は、少なくとも100,000個、少なくとも500,000個、少なくとも750,000個、または少なくとも1,000,000個のT細胞を含む。
別の態様において、前記の配列決定段階は、1回の実行当たり少なくとも1000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも10,000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも100,000件の読み取り、または1回の実行当たり少なくとも1,000,000件の読み取りを含む。別の態様において、前記の配列決定段階は、1回の読み取り当たり約30 bp、約40 bp、約50 bp、約60 bp、約70 bp、約80 bp、約90 bp、約100 bp、約110 bp、または約120 bpを作成することを含む。
別の態様では、対象が自己免疫疾患の再燃(flare)状態にある時点で、前記試料を採取する。別の態様では、全身性エリテマトーデスを有するかまたはそれを有する疑いのある対象から前記試料を採取する。
別の局面では、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定するための方法であって、疾患の第1状態に関連する少なくとも1つの対象由来の試料から空間的に単離された個々の分子を核酸配列決定することにより、1つまたは複数のクローン型プロファイルを作成する段階、およびその1つまたは複数のクローン型プロファイルに基づいて、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階を含む前記方法を提供する。
1つの態様において、前記の少なくとも1つの試料は、疾患に罹患した組織に由来する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型の決定は、少なくとも2つの試料からのクローン型プロファイルを比較する段階を含む。
別の態様において、疾患の第1状態は疾患のピーク状態である。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在しない。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において高い。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において低い。
別の態様において、前記試料はT細胞および/またはB細胞を含む。別の態様において、該T細胞および/またはB細胞は、T細胞および/またはB細胞のサブセットを含む。別の態様において、T細胞および/またはB細胞の該サブセットは、マーカーとの相互作用によって濃縮される。別の態様において、該マーカーは、T細胞および/またはB細胞のサブセット上の細胞表面マーカーである。別の態様において、T細胞および/またはB細胞の該サブセットは、疾患において特異的に存在する抗原と相互作用する。
別の態様において、疾患は全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である。
別の局面において、疾患を有する対象に由来する任意の試料における1つまたは複数の相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発するための方法であって、a) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、b) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、c) b)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階を含む前記方法を提供する。
1つの態様では、疾患に罹患した1つまたは複数の組織から1組の試料を採取する。
別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型の同定は、少なくとも2つの試料からのクローン型プロファイルを比較する段階を含む。
別の態様において、前記機能的データは、T細胞および/もしくはB細胞表面上のマーカーの結合能、またはT細胞もしくはB細胞による抗原との相互作用を含む。
別の態様において、前記配列パラメータは、核酸配列および予測されるアミノ酸配列を含む。
別の態様において、試料は、疾患のピーク段階にある1つまたは複数の個体に由来する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において高レベルである。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において低レベルである。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在しない。別の態様において、疾患は全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である。
別の態様において、個体の1つまたは複数の相関クローン型を発見するための方法であって、個体由来の試料からのクローン型プロファイルをアルゴリズムに入力する段階、およびアルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階を含む前記方法を提供する。1つの態様において、アルゴリズムは、a) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、b) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、c) b)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階によって開発された、疾患を有する対象に由来する任意の試料における1つまたは複数の相関クローン型を予測し得るアルゴリズムである。
1つの態様では、疾患のピーク状態において前記試料を採取する。別の態様では、疾患に罹患した組織から試料を採取する。
別の局面において、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成するための方法であって、1組の因子を用いて相関クローン型のレベルを疾患活動性スコアに統合するアルゴリズムを開発する段階、疾患活動性スコアを、疾患状態に関する臨床データと比較する段階、および臨床データと疾患活動性スコアとの相関を最大化するために因子を最適化する段階を含む前記方法を提供する。
1つの態様において、個体の疾患状態をモニターするための方法であって、a) 個体由来の試料からのクローン型プロファイルを決定する段階、b) 1組の因子を用いて相関クローン型のレベルを疾患活動性スコアに統合するアルゴリズムを開発する段階と、疾患活動性スコアを、疾患状態に関する臨床データと比較する段階と、臨床データと疾患活動性スコアとの相関を最大化するために因子を最適化する段階とによって作成される、疾患活動性を算出するアルゴリズムに、a)からのクローン型プロファイル情報を入力する段階、ならびにc) 疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを用いて、個体の疾患状態を予測するスコアを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の態様において、個体の疾患状態をモニターするための方法は、個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階、および1つまたは複数の相関クローン型の情報をアルゴリズムに入力する段階をさらに含む。
別の態様において、前記の個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階は、a) 疾患の第1状態に関連する少なくとも1つの対象由来の試料から空間的に単離された個々の分子を核酸配列決定することにより、1つまたは複数のクローン型プロファイルを作成すること、およびb) その1つまたは複数のクローン型プロファイルに基づいて、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定することを含む。
別の態様において、前記の個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階は、a) i) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、ii) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、iii) ii)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階によって開発された、1つまたは複数のクローン型を予測し得るアルゴリズムに、個体由来の試料からのクローン型プロファイルを入力すること、ならびにc) 1つまたは複数のクローン型を予測し得るアルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を決定することを含む。
別の態様において、疾患は全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である。
[本発明1001]
以下の段階を含む、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法：
(a) T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階；
(b) 該細胞からゲノムDNAの個々の分子を空間的に単離する段階；
(c) ゲノムDNAの空間的に単離された個々の該分子を配列決定する段階；
(d) 該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階。
[本発明1002]
以下の段階を含む、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法：
(a) T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階；
(b) 該細胞からゲノムDNAの個々の分子を空間的に単離する段階；
(c) ゲノムDNAの個々の該分子を増幅する段階；
(d) 該増幅DNAを配列決定する段階；ならびに
(e) 該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階。
[本発明1003]
以下の段階を含む、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法：
(a) T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階；
(b) 該細胞からゲノムDNAを増幅する段階；
(c) 該増幅DNAの個々の分子を空間的に単離する段階；
(d) 増幅DNAの空間的に単離された個々の該分子を配列決定する段階；ならびに
(e) 該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階。
[本発明1004]
以下の段階を含む、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法：
(a) T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階；
(b) 該細胞からゲノムDNAを増幅する段階；
(c) 該増幅DNAの個々の分子を空間的に単離する段階；
(d) 該増幅DNA分子を再増幅する段階；
(e) 該再増幅DNA分子を配列決定する段階；ならびに
(f) 該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階。
[本発明1005]
以下の段階を含む、T細胞および/またはB細胞における組換えDNAの配列のプロファイルを決定するための方法：
(a) T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階；
(b) 該細胞由来のRNAを逆転写してcDNAを形成する段階；
(c) 該cDNAの個々の分子を空間的に単離する段階；
(d) 任意で、cDNAの空間的に単離された個々の該分子を再増幅する段階；
(e) 該cDNAおよび/または再増幅cDNAを配列決定する段階；ならびに
(f) 該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階。
[本発明1006]
以下の段階を含む、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法：
(a) T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階；
(b) 該試料中の個々の細胞を空間的に単離する段階；
(c) 該細胞由来の核酸の個々の分子を配列決定する段階；ならびに
(d) 該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階。
[本発明1007]
増幅および/または再増幅段階が、PCR、多重PCR、TMA、NASBA、またはLAMPを含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
空間的に単離する段階が、細菌を形質転換するために用いられるベクターに前記DNAもしくはcDNAをサブクローニングすること、固体支持体上で前記DNAもしくはcDNAを二次元に分離すること、ミセルを有する溶液中で前記DNAもしくはcDNAを三次元に分離すること、または微小反応チャンバーを用いて分子を分離することを含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
増幅および/または再増幅段階が、サブクローニングしたDNAもしくはcDNAを保有する細菌の増殖、スライド上でのDNAもしくはcDNAの増幅、またはビーズ上でのDNAもしくはcDNAの増幅によるものである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1010]
配列決定段階がジデオキシ配列決定を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1011]
配列決定段階が、可逆的終結標識ヌクレオチドを用いた合成による配列決定を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1012]
配列決定段階が、ヌクレオチド取り込み時のピロリン酸放出の検出を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1013]
配列決定段階が、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへのアレル特異的ハイブリダイゼーションを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1014]
配列決定段階が、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへのアレル特異的ハイブリダイゼーションとそれに続く該プローブの連結とを用いた合成による配列決定を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1015]
配列決定段階が、重合工程中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリングを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1016]
組換えDNA配列がT細胞受容体遺伝子および/または免疫グロブリン遺伝子を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1017]
配列決定段階が、免疫グロブリン遺伝子および/またはT細胞受容体遺伝子の完全クローン配列のサブセットを配列決定することを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1018]
完全クローン配列のサブセットが、免疫グロブリン遺伝子もしくはT細胞受容体遺伝子のV-D結合部、D-J結合部、免疫グロブリン遺伝子もしくはT細胞受容体遺伝子の完全な可変領域、抗原認識領域、または相補性決定領域3(CDR3)を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
T細胞受容体遺伝子がT細胞受容体β遺伝子を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
免疫グロブリン遺伝子が免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む、本発明1017の方法。
[本発明1021]
増幅または再増幅段階が、Vセグメントと相補的な複数のプライマー、およびCセグメントと相補的な1つのプライマーを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1022]
増幅または再増幅段階が、Vセグメントと相補的な複数のプライマー、およびCセグメントと相補的な複数のプライマーを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1023]
Vセグメントと相補的な複数のプライマーが、各Vセグメントに対する少なくとも3種の異なるプライマーを含み、Cセグメントと相補的な複数のプライマーが、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、または少なくとも6種のプライマーを含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
T細胞および/またはB細胞が全T細胞および/またはB細胞のサブセットである、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1025]
T細胞のサブセットがCD4+細胞、CD8+細胞、またはCD27 高 細胞である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
試料が、少なくとも100,000個、少なくとも500,000個、少なくとも750,000個、または少なくとも1,000,000個のT細胞を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1027]
配列決定段階が、1回の実行当たり少なくとも1000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも10,000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも100,000件の読み取り、または1回の実行当たり少なくとも1,000,000件の読み取りを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1028]
配列決定段階が、1回の読み取り当たり約30 bp、約40 bp、約50 bp、約60 bp、約70 bp、約80 bp、約90 bp、約100 bp、約110 bp、または約120 bpを作成することを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1029]
対象が自己免疫疾患の再燃(flare)状態にある時点で試料を採取する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1030]
全身性エリテマトーデスを有するかまたはそれを有する疑いのある対象から試料を採取する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1031]
以下の段階を含む、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定するための方法：
(a) 疾患の第1状態に関連する少なくとも1つの対象由来の試料から空間的に単離された個々の分子を核酸配列決定することにより、1つまたは複数のクローン型プロファイルを作成する段階、および
(b) その1つまたは複数のクローン型プロファイルに基づいて、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階。
[本発明1032]
少なくとも1つの試料が、疾患に罹患した組織に由来する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
1つまたは複数の相関クローン型の決定が、少なくとも2つの試料からのクローン型プロファイルを比較することを含む、本発明1031の方法。
[本発明1034]
疾患の第1状態が、疾患のピーク状態である、本発明1031の方法。
[本発明1035]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において存在する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において存在しない、本発明1034の方法。
[本発明1037]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において高い、本発明1034の方法。
[本発明1038]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において低い、本発明1034の方法。
[本発明1039]
試料がT細胞および/またはB細胞を含む、本発明1031の方法。
[本発明1040]
T細胞および/またはB細胞がT細胞および/またはB細胞のサブセットを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
T細胞および/またはB細胞のサブセットが、マーカーとの相互作用によって濃縮される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
マーカーが、T細胞および/またはB細胞のサブセット上の細胞表面マーカーである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
T細胞および/またはB細胞のサブセットが、疾患において特異的に存在する抗原と相互作用する、本発明1039の方法。
[本発明1044]
疾患が全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である、本発明1031の方法。
[本発明1045]
以下の段階を含む、疾患を有する対象に由来する任意の試料における1つまたは複数の相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発するための方法：
(a) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、
(b) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、
(c) (b)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階。
[本発明1046]
疾患に罹患した1つまたは複数の組織から1組の試料を採取する、本発明1045の方法。
[本発明1047]
1つまたは複数の相関クローン型の同定が、少なくとも2つの試料からのクローン型プロファイルを比較することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1048]
機能的データが、T細胞および/もしくはB細胞表面上のマーカーの結合能、またはT細胞もしくはB細胞による抗原との相互作用を含む、本発明1045の方法。
[本発明1049]
配列パラメータが、核酸配列および予測されるアミノ酸配列を含む、本発明1045の方法。
[本発明1050]
試料が、疾患のピーク状態にある1つまたは複数の個体に由来する、本発明1045の方法。
[本発明1051]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において存在する、本発明1050の方法。
[本発明1052]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において高レベルである、本発明1050の方法。
[本発明1053]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において低レベルである、本発明1050の方法。
[本発明1054]
1つまたは複数の相関クローン型が、疾患のピーク状態において存在しない、本発明1050の方法。
[本発明1055]
疾患が全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である、本発明1045の方法。
[本発明1056]
以下の段階を含む、個体の1つまたは複数の相関クローン型を発見するための方法：
(a) 個体由来の試料からのクローン型プロファイルを、本発明1045のアルゴリズムに入力する段階、および
(b) アルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階。
[本発明1057]
疾患のピーク状態において試料を採取する、本発明1056の方法。
[本発明1058]
疾患に罹患した組織から試料を採取する、本発明1056の方法。
[本発明1059]
以下の段階を含む、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成するための方法：
(a) 1組の因子を用いて相関クローン型のレベルを疾患活動性スコアに統合するアルゴリズムを開発する段階、
(b) 疾患活動性スコアを、疾患状態に関する臨床データと比較する段階、および
(c) 臨床データと疾患活動性スコアとの相関を最大化するために因子を最適化する段階。
[本発明1060]
以下の段階を含む、個体の疾患状態をモニターするための方法：
(a) 個体由来の試料からのクローン型プロファイルを決定する段階、
(b) 本発明1059において作成された疾患活動性を算出するアルゴリズムに、(a)からのクローン型プロファイル情報を入力する段階、および
(c) 疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを用いて、個体の疾患状態を予測するスコアを作成する段階。
[本発明1061]
個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階、および1つまたは複数の相関クローン型の情報をアルゴリズムに入力する段階をさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階が、
(a) 疾患の第1状態に関連する少なくとも1つの対象由来の試料から空間的に単離された個々の分子を核酸配列決定することにより、1つまたは複数のクローン型プロファイルを作成すること、および
(b) その1つまたは複数のクローン型プロファイルに基づいて、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定すること
を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階が、
(a) (i) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階と、
(ii) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階と、
(iii) (ii)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階と
によって開発された、1つまたは複数のクローン型を予測し得るアルゴリズムに、個体由来の試料からのクローン型プロファイルを入力すること、ならびに
(b) 1つまたは複数のクローン型を予測し得るアルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を決定すること
を含む、本発明1061の方法。
[本発明1064]
疾患が全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である、本発明1061の方法。
参照による組込み
本明細書において引用した出版物、特許、および特許出願はすべて、個々の出版物、特許、また特許出願が詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な態様を記載している以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
クローン型プロファイルを決定するための、提供する本発明の方法の態様の流れ図である。 TCRβ遺伝子を増幅するためのPCRスキームを示す。 図2のスキームを用いて増幅された、配列決定されるべきPCR産物を図示する。 アイソタイプ配列を増幅するためのPCRスキームを図示する。 アイソタイプ配列を増幅するためのPCRスキームを図示する。 多重増幅の再現性を図示する。 多重増幅が最小限の増幅の偏りを有することを図示する。 IgH配列の多重増幅物のアガロースゲル電気泳動を図示する。 Accuprime、およびインプット(input)鋳型としての500 ngのRNAに相当するcDNAを用いた2つの二つ組試料における各クローン型の頻度のlog10を示す。 インプット鋳型としての500 ngのRNAに相当するcDNA、およびAccuprime(X軸)または高忠実度Taq(Y軸)を用いた、各クローン型の頻度のlog10を示す。 インプット鋳型としての50 ngのRNAに相当するcDNA、およびAccuprime(X軸)または高忠実度Taq(Y軸)を用いた、各クローン型の頻度のlog10を示す。発見研究によってアルゴリズムを決定するための流れ図を図示する。 増幅反応中に、2つの配列を連結して1つの単位複製配列を形成するためのスキームの1つの態様を図示する。たとえそれらが他の試料に由来する配列のプールと混合されたとしても、同じ試料(例えば、細胞)中のこれら2つの配列の存在に関する情報はその後保存され得る。 2つの配列を連結するための増幅スキームの別の態様を図示する。 2つの配列を連結するための増幅スキームの別の態様を図示する。 PCRによって2つの配列を連結する反応を多重化するためのスキームを図示する。 PCRによって2つの配列を連結する反応を多重化するためのスキームを図示する。 3つの配列を共に連結するためのスキームを図示する。 3つの配列を共に連結するためのスキームを図示する。 3つの配列を共に連結するためのスキームを図示する。 3つの配列を共に連結するためのスキームを図示する。 較正試験を用いて相関クローン型を発見するための流れ図を図示する。 集団研究を用いて相関クローン型を発見するための流れ図を図示する。 集団研究および較正試験を用いて相関クローン型を発見するための流れ図を図示する。 試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを図示する。 Immune Loadを算出するためのモニタリングアルゴリズムを作成するための流れ図を図示する。 較正試験なしでモニタリング試験を行うための流れ図を図示する。 較正試験を用いてモニタリング試験を行うための流れ図を図示する。
発明の詳細な説明
概要
概して、提供する本発明は、免疫系をプロファイルするために適応免疫細胞のレパートリーをモニターするという課題に、核酸配列決定技法を適用する方法を含む。作成された免疫系のプロファイルは、疾患および障害の診断、ならびに疾患および障害の状態の診断に用いることができる。提供する本発明の免疫プロファイリングの方法は、疾患および障害をモニターするのに、ならびに疾患および障害の治療を評価するのに用いることができる。提供する本発明の方法を適用することができるこれらの疾患および障害には、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症(MS)、関節リウマチ(RA)、および強直性脊椎炎を含む自己免疫疾患が含まれる。提供する本発明の方法は、移植片拒絶反応および免疫老化の診断、モニタリング、および治療に適用することができる。さらに、提供する本発明の免疫プロファイリングの方法は、癌および感染症を含む、免疫系に関連するその他の疾患を診断する、モニターする、および治療するのに用いることができる。
個々の増幅分子を配列決定することで、異なる配列を識別することができ、したがって配列決定はクローン増殖における量的変化を検出するための感度を有する。概して、提供する本発明の1つの態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定する方法を提供する。本方法は、対象から試料を単離する段階、1ラウンドまたは複数ラウンドの核酸増幅、個々の核酸を空間的に単離する段階、および核酸を配列決定する段階を含む段階を含み得る。核酸はDNAまたはRNAであってよい。T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列はクローン型と称され得る。
1つの局面において、対象または個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する方法を提供する。別の局面において、疾患を有する対象に由来する任意の試料における1つまたは複数の相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する方法を提供する。別の局面において、対象に由来する任意の試料における1つまたは複数の相対的クローン型を予測し得るアルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を発見する方法を提供する。別の局面において、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成する方法を提供する。別の局面において、個体の疾患状態をモニターする方法を提供する。
I. クローン型プロファイルを決定する方法
A. 概要
提供する本発明の方法を用いて、対象由来の試料における組換えDNA配列またはクローン型のプロファイルを作成することができる。
1つの態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該細胞からゲノムDNAの個々の分子を単離する段階、ゲノムDNAの単離された個々の分子を配列決定する段階、ならびに試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、細胞からゲノムDNAの個々の分子を単離する段階、ゲノムDNAの個々の分子を増幅する段階、増幅DNAを配列決定する段階、ならびに試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、細胞からゲノムDNAを増幅する段階、増幅DNAの個々の分子を単離する段階、増幅DNAの単離された個々の分子を配列決定する段階、ならびに試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNA配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、細胞からゲノムDNAを増幅する段階、増幅DNAの個々の分子を単離する段階、増幅DNA分子を再増幅する段階、再増幅DNA分子を配列決定する段階、ならびに試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNAの配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該試料からRNAを単離する段階、該細胞からRNAを逆転写してcDNAを形成する段階、該cDNAの個々の分子を単離する段階、任意で、該cDNAを再増幅する段階、該cDNAまたは再増幅DNAの単離された個々の該分子を配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
別の態様において、T細胞および/またはB細胞における組換えDNAの配列のプロファイルを決定するための方法であって、T細胞および/またはB細胞を含む対象由来の試料を採取する段階、該試料からRNAの個々の分子を単離する段階、RNAの個々の分子を配列決定する段階、ならびに該試料からの異なる配列についてそれらのレベルを測定して、組換えDNA配列のプロファイルを作成する段階を含む前記方法を提供する。
B. 対象および試料
1. 対象
提供する本発明の方法は、対象または個体(例えば、患者)由来の試料を使用することができる。対象は、例えば自己免疫疾患患者などの患者であってよい。対象は、感染症患者または癌患者であってよい。対象は、例えばヒトなどの哺乳動物であってよい。対象は男性または女性であってよい。対象は、乳児、小児、または成人であってよい。
2. 試料
提供する本発明の方法において用いられる試料には、例えば、胎児を取り囲む羊水、房水、胆汁、血液および血漿、耳垢(cerumen)(耳垢(earwax))、カウパー液または射精前液、乳糜、糜粥、腟液(female ejaculate)、間質液、リンパ液、月経血、母乳、粘液(鼻汁および痰を含む)、胸水、膿汁、唾液、皮脂(sebum)(皮脂(skin oil))、精液、血清、汗、涙、尿、腟液(vaginal lubrication)、嘔吐物、分泌液(water)、糞便を含む対象由来の体液、脳および脊髄を取り囲む脳脊髄液、骨関節を取り囲む滑液、細胞内の液体である細胞内液、および眼球内の液体である硝子体液を含む体内液が含まれ得る。1つの態様において、試料は血液試料である。血液試料は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0 mLであってよい。対象が多発性硬化症を有する場合、試料は脳脊髄液(CSF)であってよく、対象が関節リウマチを有する場合、試料は滑液であってよく、および対象が全身性ループスを有する場合、試料は皮膚(またはその他の器官)生検標本であってよい。1つの態様では、病状を反映する可能性が最も高い利用可能な体液/組織からクローン型を同定し、その後、例えば血液のような別の体液から該クローン型のレベルをモニターすることができる。
疾患が非活動性である時点で、試料を解析することができる。
試料は、医療提供者、例えば内科医、医師助手、看護師、獣医師、皮膚科医、リウマチ専門医、歯科医、救急医療士、または外科医によって採取され得る。試料は、研究技術者によって採取され得る。対象から2つ以上の試料を採取することができる。
試料は、例えば皮膚生検標本といった生検標本であってよい。生検標本は、例えば脳、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、または骨髄に由来し得る。対象から試料を単離するために、当業者によって用いられる任意の生検技法を用いることができる。例えば、生検は、全身麻酔を用いた開放生検であってよい。生検は、開放生検よりも小さな切開を行う閉鎖生検であってよい。生検は、組織の一部を除去するコア生検または切開生検であってよい。生検は、病変全体を除去することを試みる切除生検であってよい。生検は、針を用いて組織または液体の試料を採取する細針吸引生検であってよい。
試料は免疫細胞を含み得る。免疫細胞には、T細胞および/またはB細胞が含まれ得る。T細胞(Tリンパ球)には、例えばT細胞受容体を発現する細胞が含まれる。T細胞には、ヘルパーT細胞(エフェクターT細胞またはTh細胞)、細胞傷害性T細胞(CTL)、記憶T細胞、および調節性T細胞が含まれる。試料は、いくつかの適用(例えば、関連T細胞を規定するための較正試験)においては単一細胞を含んでよく、またはより一般的には少なくとも1,000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも250,000個、少なくとも500,000個、少なくとも750,000個、もしくは少なくとも1,000,000個のT細胞を含んでよい。
B細胞には、例えば形質B細胞、記憶B細胞、B1細胞、B2細胞、辺縁帯B細胞、および濾胞性B細胞が含まれる。B細胞は免疫グロブリン(抗体、B細胞受容体)を発現し得る。試料は、いくつかの適用(例えば、関連B細胞を規定するための較正試験)においては単一細胞を含んでよく、またはより一般的には少なくとも1,000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも250,000個、少なくとも500,000個、少なくとも750,000個、もしくは少なくとも1,000,000個のB細胞を含んでよい。
試料は、例えばDNA(例えば、ゲノムDNAまたはミトコンドリアDNA)またはRNA(例えば、メッセンジャーRNAまたはミクロRNA)といった核酸を含み得る。核酸は、無細胞DNAまたはRNAであってよい。提供する本発明の方法において、解析することができる対象由来のRNAまたはDNAの量は、例えば、いくつかの適用(例えば、較正試験)においては単一細胞程度を含み、また6 pg〜60 ugのDNAおよびおよそ1 pg〜10 ugのRNAの範囲に換算される1千万個ほどの細胞またはそれ以上を含む。
C. 核酸を単離する、増幅する、および再増幅するための手段
1. TCR遺伝子およびBCR遺伝子の特徴
それぞれ個々の適応免疫細胞のDNAおよびそれらの関連RNA転写産物中に特定できる組換えが存在するため、提供する本発明の方法においてRNAまたはDNAのいずれかを配列決定することができる。T細胞またはB細胞由来の組換え配列は、クローン型とも称され得る。DNAまたはRNAは、T細胞受容体(TCR)遺伝子、または抗体をコードする免疫グロブリン(Ig)遺伝子の配列に相当し得る。例えば、DNAおよびRNAは、TCRのα、β、γ、またはδ鎖をコードする配列に相当し得る。大多数のT細胞において、TCRはα鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体である。TCRα鎖はVJ組換えによって生成され、β鎖受容体はV(D)J組換えによって生成される。TCRβ鎖に関して、ヒトではVセグメント48個、Dセグメント2個、およびJセグメント13個が存在する。2つの結合部のそれぞれにおいて、いくつかの塩基が欠失され、また他の塩基が付加され得る(NヌクレオチドおよびPヌクレオチドと称される)。少数のT細胞では、TCRはγ鎖およびδデルタ鎖からなる。TCRγ鎖はVJ組換えによって生成され、TCRδ鎖はV(D)J組換えによって生成される(Kenneth Murphy, Paul Travers, and Mark Walport, Janeway's Immunology 7th edition, Garland Science, 2007、全体として参照により本明細書に組み入れられる)。
提供する本発明の方法において解析するDNAおよびRNAは、定常領域(α、δ、ε、γ、またはμ)を有する重鎖免疫グロブリン(IgH)、または定常領域λもしくはκを有する軽鎖免疫グロブリン(IgKまたはIgL)をコードする配列に相当し得る。各抗体は、同一の軽鎖2つおよび同一の重鎖2つを有する。各鎖は、定常領域(C)および可変領域から構成される。重鎖の場合、可変領域は可変(V)、多様性(D)、および連結(J)セグメントから構成される。これらのセグメントの各型をコードするいくつかの異なる配列がゲノム中に存在する。B細胞の発達中に特異的なVDJ組換え事象が起こり、その細胞は特異的な重鎖を生成するようになる。軽鎖における多様性は、D領域が存在しないためにVJ組換えしか存在しないことを除いて、同様の様式で生成される。組換え部位の近傍で体細胞突然変異が起こり、いくつかのヌクレオチドが付加または欠失され、B細胞によって生成される重鎖および軽鎖の多様性がさらに増加する。B細胞によって生成される抗体の考えられ得る多様性は、次いで、異なる重鎖と軽鎖の産物である。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原認識(または結合)領域または部位を形成するのに寄与する。いくつかのエピトープに対して特異的な応答が開始された後に起こり得る体細胞超突然変異の過程が、この多様性に付加される。この過程では、特異的エピトープを認識し得るB細胞において突然変異が起こり、特異的エピトープにさらに強力に結合し得る、抗体におけるより大きな多様性が生じる。これらの因子がすべて、B細胞によって生成される抗体の大きな多様性に寄与する。何十億もの、およびおそらくは1兆を超える異なる抗体が生成され得る。T細胞の多様性を生じるための基本前提は、B細胞によって抗体を生成するための基本前提と類似している。T細胞およびB細胞活性化の要素は、外来エピトープに対するそれらの結合である。特定の細胞が活性化されると、同じ型の細胞がさらに産生されて、クローン増殖が生じる。
相補性決定領域(CDR)または超可変領域とは、抗原を補完し得る抗原受容体(例えば、T細胞受容体および免疫グロブリン)の可変ドメイン内の配列である。各抗原受容体の鎖は、3つのCDR(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む。T細胞を構成する2つのポリペプチド(αおよびβ)および免疫グロブリンを構成する2つのポリペプチド(IgHおよびIgKまたはIgL)は、3つのCDRの形成に寄与する。
TCRβによってコードされるCDR1およびCDR2の部分は、47個の機能的Vセグメントのうちの1つの中に存在する。CDRの多様性の大部分はCDR3に見出され、その多様性はTリンパ球の発達中に体細胞組換え事象によって生成される。
個体間および個体内に、BCRの大きな多様性が存在する。BCRは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする2つの遺伝子IgHおよびIgK(またはIgL)から構成される。抗原およびMHC分子と結合する3つの相補性決定領域(CDR)配列が、IgHおよびIgK(またはIgL)の中で最も大きな多様性を有する。IgHによってコードされるCDR1およびCDR2の部分は、44個の機能的Vセグメントのうちの1つの中に存在する。ナイーブB細胞における多様性の大部分は、Bリンパ球の発達中の体細胞組換え事象を通したCDR3の生成において出現する。組換えにより、V、D、およびJセグメントのそれぞれを1つ有する分子が生成され得る。ヒトでは、Vセグメント44個、Dセグメント27個、およびJセグメント6個が存在する；したがって、理論的に7,000を超える組み合わせの可能性がある。ごく一部のBCR(〜5%)において、2つのDセグメントが見出される。さらに、2つの結合部のそれぞれにおいて、いくつかの塩基が欠失され、また他の塩基が付加され得て(NヌクレオチドおよびPヌクレオチドと称される)、大きな度合いの多様性が生じる。B細胞活性化の後、体細胞超突然変異を介した親和性成熟の過程が起こる。この過程において、活性化B細胞の子孫細胞は、CDR領域内により高い突然変異濃度を有して、遺伝子全体にわたって特有の体細胞突然変異を蓄積し、抗原に対してより高い親和性を有する抗体の生成をもたらす。したがって、体細胞超突然変異後の配列を増幅するために、多重プライマーを使用することができる。体細胞超突然変異に加えて、活性化B細胞はアイソタイプスイッチの過程を経る。同じ可変セグメントを有する抗体が、定常セグメントに応じて異なる形態(アイソタイプ)を有し得る。すべてのナイーブB細胞がIgM(またはIgD)を発現するのに対して、活性化B細胞は主にIgGを発現し、IgM、IgA、およびIgEもまた発現する。IgM(および/またはIgD)からIgG、IgA、またはIgEへのこの発現スイッチは組換え事象を介して起こり、1つの細胞が特定のアイソタイプの産生を専門にするようになる。IgM、IgD、およびIgEそれぞれに対しては1つのセグメントが存在し、IgAに対しては2つのセグメントが存在し、IgGに対しては4つのセグメントが存在する。
2. 増幅反応
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、細胞の収集物から関連領域を増幅することができる。転写媒介増幅法(TMA)を用いて、標的核酸からRNA単位複製配列を生成することができる。細胞はそれぞれ独自の特徴を保有するため、各細胞に由来する核酸を個別に解析することができる。
C領域にアニールする少なくとも1つのプライマー、および1つまたは複数のVセグメントにアニールし得る1つまたは複数のプライマーを用いた多重反応において、TCRβまたは免疫グロブリン配列を核酸から増幅することができる(図2および図4)。多重反応においてVセグメントにアニールするプライマーの数は、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61, 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80であってよい。多重反応においてVセグメントにアニールするプライマーの数は、例えば10〜60、20〜50、30〜50、40〜50、20〜40、30〜40、または35〜40であってよい。プライマーは異なるVセグメントにアニールし得る。IgH遺伝子に関しては、Vセグメントにおける体細胞突然変異の可能性のために、例えば1つのVセグメント当たり1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのプライマーといったように、各Vセグメントにアニールする複数のプライマーを使用することができる。多重反応においてCセグメントにアニールするプライマーの数には、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15が含まれ得る。多重反応においてCセグメントにアニールするプライマーの数は、1〜10、2〜9、3〜8、4〜7、3〜8、または3〜6であってよい。TCRまたは免疫グロブリン遺伝子の増幅は、実施例3および/または実施例4に記載した通りに行うことができる。
増幅すべき領域には、完全クローン配列、または免疫グロブリン遺伝子もしくはT細胞受容体遺伝子のV-D結合部、D-J結合部、免疫グロブリン遺伝子もしくはT細胞受容体遺伝子の完全な可変領域、抗原認識領域、もしくは例えば相補性決定領域3(CDR3)といったCDRを含むクローン配列のサブセットが含まれ得る。
一次および二次増幅段階を用いて、TCRまたは免疫グロブリン配列を増幅することができる。異なる増幅段階はそれぞれ、異なるプライマーを含み得る。異なるプライマーは、免疫遺伝子配列中に本来存在しない配列を導入し得る。例えば、増幅手順は、増幅されたTCRまたは免疫グロブリン配列の5'および/または3'末端に1つまたは複数のタグを付加し得る(図3)。タグは、増幅DNAのその後の配列決定を容易にする配列であってよい。タグは、固体支持体への増幅配列の結合を容易にする配列であってよい。
増幅のための他の方法は、V領域におけるいかなるプライマーも使用しなくてよい。代わりに、Cセグメント由来の特異的プライマーを使用することができ、反対側(5')に汎用プライマーを配置することができる。汎用プライマーは、十分に記載されている鎖スイッチの方法を含む様々な方法を介して、cDNA合成中に付加することができる。同様に、汎用プライマーは、連結を含む様々な方法を介してcDNA作製後に付加することができる。
提供する本発明の方法において用いることができる、核酸を増幅する他の手段には、例えば、逆転写PCR、リアルタイムPCR、定量的リアルタイムPCR、デジタルPCR(dPCR)、デジタルエマルジョンPCR(dePCR)、クローンPCR、増幅断片長多型PCR(AFLP PCR)、アレル特異的PCR、アセンブリーPCR、非対称PCR(選択した鎖に対して非常に過剰なプライマーを使用する)、コロニーPCR、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ホットスタートPCR、逆PCR(IPCR)、インサイチューPCR、ロングPCR(約5キロベースよりも大きなDNAの伸長)、多重PCR、ネステッドPCR(2対以上のプライマーを使用する)、単一細胞PCR、タッチダウンPCR、ループ媒介等温PCR(LAMP)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)が含まれる。他の増幅スキームには、リガーゼ連鎖反応、分枝DNA増幅、ローリングサークル増幅、サークル-サークル増幅、SPIA増幅、捕捉および連結による標的増幅(TACL)増幅、およびRACE増幅が含まれる。
試料中のRNAにおける情報を、逆転写を用いることによってcDNAに変換することができる。逆転写反応では、ポリAプライマー、ランダムプライマー、および/または遺伝子特異的プライマーを用いることができる。
ゲノムからDNAを増幅した後(またはRNAを逆転写することによって、cDNAの形態で核酸を増幅した後)、個々の核酸分子を単離し、任意で再増幅し、次に個々に配列決定することができる。
提供する本発明の方法において増幅に用いることができるポリメラーゼには、例えばTaqポリメラーゼ、AccuPrimeポリメラーゼ、またはPfuが含まれる。使用すべきポリメラーゼの選択は、忠実度または効率が好ましいかどうかに基づき得る。
1つの態様では、試料中の個々の細胞を単離する。各単離細胞に由来する2つまたはそれ以上の配列を共に連結することができる。例えば、個々の細胞に由来するTCRαおよびTCRβ遺伝子またはIgHおよびIgK遺伝子からの配列を、例えば増幅スキーム(図9〜13)または連結スキームによって連結することができる。単離細胞の連結されたTCRαおよびTCRβ配列またはIgHおよびIgK配列を、任意に再増幅することができる。連結された増幅産物を、増幅後に任意に再度プールすることができる。
3. 個々の核酸を単離する手段
プールから核酸を単離する方法には、核酸をDNAベクターにサブクローニングし、細菌を形質転換すること(細菌クローニング)、固体基質(例えば、スライドガラス)上での二次元での分子の空間的分離、ミセルを有する溶液中での三次元での核酸の空間的分離(例えば、ビーズなどの固体表面上に分子を固定化するかまたは固定化せずに、油エマルジョンを用いて達成され得る)、または例えばマイクロ流体もしくはナノ流体チップといった微小反応チャンバーを用いることが含まれる。所与の容積、空間領域、ビーズ、または反応チャンバー中に平均して単一の分子が存在することを確実にするために、希釈を用いることができる。
増幅可能な物質の機能的な量を判断するために、初期段階でリアルタイムPCR、ピコグリーン染色、ナノ流体電気泳動(例えば、LabChip)、またはUV吸収測定を用いることができる。
核酸を再増幅する方法には、核酸で形質転換して単離されたコロニーの細菌増殖、スライド上での増幅(例えば、PCRコロニー(ポロニー))、およびビーズ上での増幅が含まれる。核酸を増幅および再増幅するために同じ方法を用いることができ、または核酸を増幅および再増幅するために異なる方法を用いることもできる。
特定の態様において、サブクローニング段階は、増幅または連結段階を介してDNAまたはRNAに共通プライマーを付着させることを含む。このプライマーは次に、クローンを増幅するために、および配列決定用のプライマーのハイブリダイゼーションの認識配列として用いられる(図2)。
他の態様では、細胞のサブセットから核酸を解析する。例えば細胞表面マーカーを用いることによって細胞を分離する方法を使用することができる。例えば、細胞選別フローサイトメトリー、流動選別、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気細胞選別(MACS；例えば、抗体コーティング磁気粒子を使用する)などのビーズに基づく分離、サイズに基づく分離(例えば、篩、障害物のアレイ、フィルター)、マイクロ流体デバイスでの選別、抗体に基づく分離、沈降、親和性吸着、親和性抽出、または密度勾配遠心分離により、細胞を単離することができる。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより、細胞を精製することができる。選別は、細胞のサイズ、形態、または細胞内もしくは細胞外マーカーに基づき得る。腫瘍細胞を単離または選別する方法は、例えば、Nagrath S. et al. (2007) Nature 450:1235-1239；米国特許第6008002号、第7232653号、および第7332288号；PCT公開第WO2008157220A1号；ならびに米国特許出願第US20080138805A1号および第US20090186065号；ならびにRosenberg R. et al. (2002) Cytometry 49:150-158に記載されており、これらはそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられる。
細胞のサブセットは、T細胞および/またはB細胞のサブセットであってよい。T細胞のサブセットは、CD4+、CD8+、またはCD27高細胞であってよい。
蛍光活性化細胞選別(FACS)は、細胞を選別するために光散乱および蛍光特性を使用する。例えば蛍光色素と結合している核酸プローブまたは抗体を用いて、細胞に蛍光特性を付与することができる。細胞懸濁液は、流動液体の液流を形成し得る。細胞の液流は、1液滴当たり細胞およそ1個を含む液滴を形成する。液流が液滴を形成する前に、各細胞の蛍光特性を測定する。蛍光強度を測定する前に帯電リングを荷電し、液流から液滴が離れた時点で逆の電荷を液滴に加える。荷電した液滴は2枚の高電圧偏向板を通過し、偏向板は液滴をそれらの電荷に基づいて異なる容器に差し向ける。液流に電荷を直接加えることができ、離れた液滴は液流と同じ符号の電荷を保持する。その後液滴は、液滴が離れた後に中性に戻る。
FACSでは、直接または間接免疫蛍光法を用いることができる。直接免疫蛍光法では、抗体が蛍光色素に直接結合している。間接免疫蛍光法では、一次抗体は標識されておらず、二次抗体が蛍光色素に結合している。
1つの態様では、試料から個々の細胞を単離することができる。細胞内の2つ以上の遺伝子からの配列情報を共に連結することができる。例えば、試料は自己免疫疾患患者に由来してよく、試料から空間的に単離された細胞に由来するTCRαおよびTCRβ遺伝子からの配列情報を、例えば増幅スキームまたは連結スキームによって物理的に連結することができる。連結されたTCRαおよびTCRβ配列を、任意に増幅する、および/または他の細胞由来の連結配列と共にプールすることができる。連結される配列は、あるいはIgHとIgKまたはIgHとIgLの配列であってもよい。
C. 配列決定技法
提供する本発明の方法において、当業者に公知である、核酸を配列決定するための任意の技法を用いることができる。DNA配列決定技法には、標識ターミネーターまたはプライマーおよび平板またはキャピラリーでのゲル分離を用いた古典的ジデオキシ配列決定反応(サンガー法)、可逆的終結標識ヌクレオチドを用いた合成による配列決定、ピロシーケンシング、454配列決定、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへのアレル特異的ハイブリダイゼーション、標識クローンのライブラリーへのアレル特異的ハイブリダイゼーションとそれに続く連結とを用いた合成による配列決定、重合工程中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ポロニー配列決定、およびSOLiD配列決定が含まれる。分離された分子の配列決定は、ポリメラーゼもしくはリガーゼを用いた連続的なまたは単一の伸長反応によって、およびプローブのライブラリーとの単一のまたは連続的な差次的ハイブリダイゼーションによって、ごく最近実証された。これらの反応は、1億を超える配列を並行して行う最新の商業的応用における実証を含め、多くのクローン配列において並行して行われた。したがって、これらの配列決定アプローチを、T細胞受容体(TCR)および/またはB細胞受容体(BCR)のレパートリーを調べるために用いることができる。
提供する本発明の方法において用いられる配列決定技法は、1回の実行当たり少なくとも1000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも10,000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも100,000件の読み取り、1回の実行当たり少なくとも500,000件の読み取り、または1回の実行当たり少なくとも1,000,000件の読み取りを作成し得る。
提供する本発明の方法において用いられる配列決定技法は、1回の読み取り当たり約30 bp、約40 bp、約50 bp、約60 bp、約70 bp、約80 bp、約90 bp、約100 bp、約110 bp、約120 bp、1回の読み取り当たり約150 bp、約200 bp、約250 bp、約300 bp、約350 bp、約400 bp、約450 bp、約500 bp、約550 bp、または約600 bpを作成し得る。
提供する本発明の方法において用いられる配列決定技法は、1回の読み取り当たり約30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、または600 bpを作成し得る。
1. True Single Molecule配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得る配列決定技法には、例えば、Helicos True Single Molecule配列決定(tSMS)(Harris T.D. et al. (2008) Science 320:106-109)が含まれる。tSMS技法では、DNA試料をおよそ100〜200ヌクレオチドの鎖に切断し、各DNA鎖の3'末端にポリA配列を付加する。蛍光標識アデノシンヌクレオチドの付加により、各鎖を標識する。次に、フローセル表面に固定化された何百万ものオリゴT捕捉部位を含むフローセルに対して、このDNA鎖をハイブリダイズさせる。鋳型は、鋳型約1億個/cm2の密度であってよい。次にフローセルを例えばHeliScope(商標)シーケンサーなどの装置に取り込むと、レーザーがフローセルの表面を照射し、各鋳型の位置が明らかになる。CCDカメラが、フローセル表面上の鋳型の位置を位置づけ得る。次に鋳型の蛍光標識を切断し、洗浄除去する。DNAポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチドを導入することにより、配列決定反応が開始する。オリゴT核酸はプライマーとして働く。ポリメラーゼは、鋳型の指示する様式でプライマーに標識ヌクレオチドを取り込む。ポリメラーゼおよび取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。フローセル表面を画像化することにより、蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを指示した鋳型を検出する。画像化した後、切断段階により蛍光標識を除去し、所望の読み取り長が達成されるまで、他の蛍光標識ヌクレオチドを用いてこの過程を繰り返す。各ヌクレオチド付加段階と共に配列情報を回収する。
2. 454配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得るDNA配列決定技法の別の例は、454配列決定(Roche)(Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380)である。454配列決定は2段階を含む。第1段階では、DNAをおよそ300〜800塩基対の断片に剪断し、断片を平滑末端化する。次に、断片の末端にオリゴヌクレオチドアダプターを連結させる。アダプターは、断片の増幅および配列決定用のプライマーとして働く。例えば5'-ビオチンタグを含むアダプターBを用いて、DNA捕捉ビーズ、例えばストレプトアビジンコーティングビーズに断片を付着させることができる。ビーズに付着している断片を、油-水エマルジョンの液滴内でPCR増幅する。結果は、各ビーズ上のクローン増幅されたDNA断片の複数コピーである。第2段階では、このビーズをウェル(ピコリットルサイズ)中に捕捉する。各DNA断片においてピロシーケンシングを並行して行う。1つまたは複数のヌクレオチドを添加すると光シグナルが生じ、これを配列決定装置においてCCDカメラで記録する。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。
ピロシーケンシングは、ヌクレオチドの付加に際して放出されるピロリン酸(PPi)を使用する。PPiは、アデノシン5'ホスホ硫酸の存在下で、ATPスルフリラーゼによりATPに変換される。ルシフェラーゼはATPを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応によって、検出および解析される光が生じる。
3. SOLiD配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得るDNA配列決定技法の別の例は、SOLiD技術(Applied Biosystems)である。SOLiD配列決定では、ゲノムDNAを断片に剪断し、断片の5'および3'末端にアダプターを付着させて、断片ライブラリーを作製する。あるいは、断片の5'および3'末端にアダプターを連結し、断片を環状化し、環状化断片を消化して内部アダプターを生成し、得られた断片の5'および3'末端にアダプターを付着させてメイトペアライブラリーを生成することによって、内部アダプターを導入することができる。次に、ビーズ、プライマー、鋳型、およびPCR成分を含むマイクロリアクター中で、クローンビーズ集団を調製する。PCR後、鋳型を変性させ、伸長した鋳型を伴うビーズを分離するようビーズを濃縮する。選択されたビーズ上の鋳型を、スライドガラスへの結合を可能にする3'修飾に供する。
特異的フルオロフォアによって同定される中央決定塩基(または塩基対)を伴う部分的ランダムオリゴヌクレオチドの連続的なハイブリダイゼーションおよび連結によって、配列が決定され得る。色を記録した後、連結されたオリゴヌクレオチドを切断および除去し、次にこの過程を繰り返す。
4. SOLEXA配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得る配列決定技法の別の例は、SOLEXA技術(Illumina)である。SOLEXA配列決定は、折りたたみPCRおよびアンカープライマーを用いた固体表面上でのDNAの増幅に基づいている。ゲノムDNAを断片化し、断片の5'および3'末端にアダプターを付加する。フローセルチャネルの表面に付着しているDNA断片を伸長させ、架橋増幅する。断片は二本鎖になり、この二本鎖分子を変性させる。固相増幅およびそれに続く変性を複数サイクル行うことで、フローセルの各チャネルにおける、同じ鋳型のおよそ1,000コピーの一本鎖DNA分子のクラスターが数百万個生成され得る。プライマー、DNAポリメラーゼ、および4種のフルオロフォア標識された可逆的終結ヌクレオチドを用いて、連続的配列決定を行う。ヌクレオチドの取り込み後、レーザーを用いてフルオロフォアを励起させ、画像を取り込み、第1塩基の独自性を記録する。それぞれ取り込まれた塩基から3'ターミネーターおよびフルオロフォアを除去し、取り込み、検出、および同定段階を繰り返す。
5. SMRT配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得る配列決定技法の別の例には、Pacific Biosciencesの1分子リアルタイム(SMRT(商標))技術が含まれる。SMRTでは、4種のDNA塩基はそれぞれ4種の異なる蛍光色素の1つに付着している。これらの色素はホスホ結合している。単一のDNAポリメラーゼを1分子の鋳型一本鎖DNAと共に、ゼロモード導波路(ZMW)の底に固定化する。ZMWとは、(マイクロ秒で)ZMWの外側に迅速に拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、DNAポリメラーゼによる単一ヌクレオチドの取り込みの観察を可能にする限局構造である。ヌクレオチドを伸長鎖に取り込むには、数ミリ秒を要する。この間に、蛍光標識が励起され、蛍光シグナルを生成し、蛍光タグが切断される。色素に対応する蛍光の検出により、どの塩基が取り込まれたが示される。この過程を繰り返す。
6. ナノポア配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得る配列決定技法の別の例は、ナノポア配列決定(Soni GV and Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001)である。ナノポアとは、直径1ナノメートル程度の細孔である。伝導性流体中でのナノポアの浸漬、およびそれを介した電位の印加により、ナノポアを通したイオンの伝導に起因してわずかな電流が生じる。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに感受性がある。DNA分子がナノポアを通過する際、DNA分子上の各ヌクレオチドは異なる程度にナノポアを塞ぐ。したがって、DNA分子がナノポアを通過する際にナノポアを通過する電流の変化は、DNA配列の読み取りを表す。
7. 化学感受性電界効果トランジスタアレイ配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得る配列決定技法の別の例は、(例えば、米国特許出願公開第20090026082号に記載されているように)DNAを配列決定するために化学感受性電界効果トランジスタ(chemFET)アレイを使用することを含む。この技法の一例では、DNA分子を反応チャンバーに入れることができ、ポリメラーゼに結合している配列決定プライマーに鋳型分子をハイブリダイズさせることができる。配列決定プライマーの3'末端における新たな核酸鎖への1つまたは複数の三リン酸の取り込みを、chemFETによって電流の変化により検出することができる。アレイは複数のchemFETセンサーを有し得る。別の例では、単一の核酸をビーズに付着させることができ、ビーズ上で核酸を増幅することができ、各チャンバーがchemFETセンサーを有しているchemFETアレイ上の個々の反応チャンバーに個々のビーズを移すことができ、核酸を配列決定することができる。
8. 電子顕微鏡を用いた配列決定
提供する本発明の方法において用いられ得る配列決定技法の別の例は、電子顕微鏡を使用することを含む(Moudrianakis E.N. and Beer M. Proc Natl Acad Sci U S A. 1965 Mar;53:564-71)。この技法の一例では、電子顕微鏡を用いて識別可能な金属標識を使用して、個々のDNA分子を標識する。次に、これらの分子を平面上に広げ、電子顕微鏡を用いて画像化して配列を測定する。
本明細書に記載した配列決定技法のいずれか1つを、提供する本発明の方法において用いることができる。
D. TCRおよびBCRレパートリーを配列決定する方法
単一分子から生じるか、または単一分子由来の増幅物から生じる配列を読むことができる。固体表面上で、または水/油エマルジョン内の微小な区画内で、何百万という単一分子の独立した増幅を並行して行うことができる。各区画内に1分子が入るように、配列決定すべきDNA試料を十分に希釈する、および/または分散させることができる。この希釈に続いてDNA増幅を行って、元のDNA配列のコピーを作製し、すべて同じ配列を有する分子の「クラスター」を生成することができる。次に、これらのクラスターを配列決定することができる。1回の実行で、何百万もの読み取りが作成され得る。増幅配列の所与の鎖の5'末端から開始する配列が作成され得る、および/または相補的配列の5'末端から開始する配列が作成され得る。好ましい態様では、両鎖から配列が作成される、すなわち対をなす末端読み取り(paired end read)が作成される。
次に、元のDNA配列内の特定の配列の蔓延を、どれだけのクラスターがその配列を保有するかを数えることによって測定することができる。元の試料中に配列がより蔓延していれば、より多くの区画およびより多くのクラスターがその特定の配列を含むことになる。
測定されたDNA配列の頻度が元の試料におけるDNA配列の頻度と一致することを確実にするための方法を、増幅スキームにおいて用いることができる。その方法は、PCRプライマー濃度が各サイクルにおいて各ハイブリダイゼーション反応を飽和まで駆動するのに十分高いことを確実にする段階、異なる配列の差次的増幅を最小限に抑えるように個々のプライマー濃度を調整する段階等を含む。
アルゴリズムを用いて、シーケンサーによって作成されたどの配列がDNA配列に由来するのかを判定することができる。増幅によって、および/または配列決定によって導入されたエラーを含む、個々に測定された配列(読み取り)を互いに対して補ってもよい。アルゴリズムを用いて読み取りを組み合わせて、出発材料におけるDNA配列の頻度をより正確に決定することができる。
DNAまたはRNAを含む血液試料から元々増幅されたIgHおよび/またはTCRβの100万件の配列決定読み取りまたはそれ以上を得ることができる。特定のIgHまたはTCRβ配列の読み取りの数は、血液試料における特定のクローン型の頻度に関連する。したがって、クローン型のそれぞれの量を決定することができる。特定の患者の病原性クローン型が判明している場合には、この配列決定アプローチを通してそれらのレベルを正確に測定することができる。
提供する本発明の特定の態様では、1つまたは複数の対象に由来する免疫細胞のTCRおよびBCR領域に由来する、ゲノムDNAまたは逆転写RNAの表現を含むDNA分子の収集物を抽出し、対象における配列の存在および頻度を検出できるように、上記の配列決定技法の1つまたは複数を用いて、各分子が配列決定され得るような方法で任意に増幅する。
免疫グロブリン遺伝子またはT細胞受容体遺伝子の様々な領域を配列決定することができる。いくつかの態様では、可変領域の完全配列を配列決定して、クローン型を同定および定量することができる。
完全クローン配列の特有のサブセットを配列決定することができる。いくつかの態様では、VDおよびDJ結合部を含むヌクレオチドを配列決定して、クローン型を一意的に同定および定量する。他の態様において、配列決定され得る断片は完全な可変領域である。さらに別の態様では、抗原認識領域または相補性決定領域3(CDR3)を配列決定する。完全なCDR3または完全な可変領域を含む断片を増幅して、V、D、およびJセグメントの部分を含むCDR3の配列決定を可能にすることができる。
免疫グロブリン遺伝子またはT細胞受容体遺伝子を配列決定するために、増幅産物上の1つまたは複数のタグを用いることができる。配列決定反応において、タグにアニールする1つまたは複数のプライマーを用いることができる。増幅分子の異なる部分を個別の反応で配列決定することができ、配列決定の結果をつなぎ合わせて、分子の部分的なまたは完全な配列を作成することができる。
1つの態様では、CDR3のみを増幅および配列決定する。CDR3の増幅および配列決定は、1つまたは複数のVセグメント配列に特異的なプライマー(および、Cセグメント内の単位複製配列の反対側における1つまたは複数のプライマー)を用いることによって達成することができる。Vセグメントのそれぞれのプライマーを1つまたは複数の増幅反応において使用して、配列の完全なレパートリーの増幅をもたらすことができる。配列のこのレパートリーを次に混合し、増幅を伴うかまたは伴わずに分離に供し、記載した配列決定技法のいずれかを用いて配列決定することができる。様々なVプライマーによる増幅を個別のチューブで行う場合、異なるVセグメントを保有する分子の数はPCR飽和のために「正規化」され得る。例えば、仮に1つの特定のVセグメントが1種または数種のクローン増殖を有して、その表現が他のセグメントよりも多くもたらされるとした場合、各セグメントのPCR反応は飽和または飽和近くまで駆動され得るために、この情報は消去されるかまたは減少する可能性がある。各Vセグメントがどれほど存在するかを定量するために、リアルタイムPCRを用いることができる。完全なCDR3を配列決定することができ、または配列CDR3のサブセットを配列決定することもできる。
1つの態様では、クローン型のサブセットのみを解析する。これは、クローン型のサブセットに特異的なプライマー、例えばVセグメントに特異的なプライマーで増幅することによって達成することができる。完全な結合性を提供する長い連続した読み取りを伴う配列決定によって、特有のクローン型を同定することができる。いくつかの態様において、関心対象の配列がいくつか存在する場合には、結合部の1つのみにわたる短い読み取り長が、特定のクローン型に特有ではなく、複数のクローン型の中で共有される縮重タグを作製し得る。例えば、V/J結合部にわたる配列決定は、Dセグメントにかかわらず同じV/Jを有する全配列を1つのクローン型としてひとまとめにすることができる。全セグメントの完全な結合性に関する情報により、例えば同じVおよびJセグメントを共有し得るが、異なるDセグメントに結合している配列を識別することが可能になる。
VおよびDのみが存在する場合にも(例えば、抗体の軽鎖またはTCRのαサブユニット)、同様の解析を行うことができる。TCRおよびBCRの完全な多様性は、両方のサブユニットを統合している。しかしながら、両サブユニットの配列において解析を行うことが可能である。
クローン型プロファイルを作成する際には、配列決定によって、および/または増幅によって生じるエラーを考慮することができる。例えば、実施例5を参照されたい。
最初の増幅は、DNAまたはRNA(例えば、cDNAに変換後)から行うことができる。
II. 相関クローン型、疾患活動性スコアを決定する方法、およびその一方または両方を決定するためのアルゴリズム
A. 相関クローン型 対 非相関クローン型
T細胞およびB細胞受容体配列の膨大なレパートリーのために、特定のヒト健康転帰と相関する個々の細胞を見出す上で課題が生じる。多くの場合、関心対象となるクローン型の配列は、調べる個体に特有である。本発明の方法は、a) 相関クローン型(そのレベルが疾患と相関するクローン型であってよい)とb) 非相関クローン型(そのレベルが疾患と相関しないクローン型であってよい)を識別するための手段を提供する。1つの態様において、相関クローン型は、疾患と正または負の相関のいずれかを示し得る。別の態様において、疾患のピーク状態において存在するが、疾患の非ピーク状態では存在しないクローン型は、相関クローン型であり得る(疾患と正の相関)。別の態様において、疾患の非ピーク状態よりも疾患のピーク状態(または段階)においてより豊富な(すなわち、より高レベルの分子で存在する)クローン型は、相関クローン型であり得る(疾患と正の相関)。別の態様において、疾患のピーク状態において存在しないが、疾患の非ピーク中に存在するクローン型は、相関クローン型であり得る(疾患と負の相関)。別の態様において、疾患の非ピーク状態よりもピーク状態においてより少ないクローン型は、相関クローン型であり得る(疾患と負の相関)。別の態様において、個体の相関クローン型はアルゴリズムによって決定される。
B. 集団研究を行わずに較正試験を用いた、相関および非相関クローン型の発見
本発明のこの態様では、疾患状態と関連性があるいくつかの試料中に存在するクローン型を調べることによって、相関クローン型を同定する(例えば、図14を参照されたい)。この状態は、疾患のピーク状態にある試料由来の血液(例えば、急性再燃中のMSまたはループス患者由来の血液試料)、またはその個体の疾患に関与するT細胞およびB細胞が濃縮されたと推測される罹患組織であってよい。これらの組織の例は、腎臓炎症を有するループス患者の腎臓生検標本、再燃中のMS患者におけるCSF、関節リウマチ患者の滑液、または癌患者由来の腫瘍試料であってよい。これらの例のすべてにおいて、組織は、(必ずしも原因因子であるわけではないが)疾患に関連する関連T細胞およびB細胞を含む可能性が高い。この方法を用いて疾患に関連するクローン型を同定する場合、クローン型が、その試料中にそれらが検出された個体にのみ関連することは、特筆すべきことである。結果として、疾患を有する任意の所与の個体において相関クローン型を同定するのにこの方法を用いるためには、特定の較正試験が必要となる。
1つの態様において、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定する方法を提供する。本方法は、a) 疾患の第1状態に関連する少なくとも1つの対象由来の試料から空間的に単離された個々の分子を核酸配列決定することにより、1つまたは複数のクローン型プロファイルを作成する段階、およびb) その1つまたは複数のクローン型プロファイルに基づいて、対象における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階を含み得る。
1つの態様において、少なくとも1つの試料は、疾患に罹患した組織に由来する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型の決定は、少なくとも2つの試料からのクローン型プロファイルを比較する段階を含む。別の態様において、疾患の第1状態は疾患のピーク状態である。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在する。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在しない。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において高い。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において低い。別の態様において、試料はT細胞および/またはB細胞を含む。別の態様において、T細胞および/またはB細胞は、T細胞および/またはB細胞のサブセットを含む。別の態様において、T細胞および/またはB細胞のサブセットは、マーカーとの相互作用によって濃縮される。別の態様において、マーカーは、T細胞および/またはB細胞のサブセット上の細胞表面マーカーである。別の態様において、T細胞および/またはB細胞のサブセットは、疾患において特異的に存在する抗原と相互作用する。
1つの態様において、疾患は自己免疫疾患である。別の態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、または強直性脊椎炎である。
C. 集団研究を用いた、相関および非相関クローン型の発見
1つの態様において、集団研究を用いて相関クローン型を同定する方法を提供する(例えば、図15を参照されたい)。集団研究の有用性は、疾患状態転帰が判明している個体において確認された相関クローン型に関する特異的情報を一般化して、較正試験を行う必要なしに、そのような相関クローン型が将来の対象すべてにおいて同定され得るようにすることを可能にする点である。特定の1組の相関クローン型の知識を用いて、将来の対象において相関するであろうクローン型の適した特質(パラメータ)に関する規則を抽出することができる。
1つの態様において、提供する本発明は、疾患を有する患者および任意には健常対照に由来する、異なる時点における、および疾患を有する患者の場合には、臨床データによって特徴づけられる疾患経過の異なる(かつ判明している)状態における試料の研究において、免疫細胞レパートリーを配列決定することによって、相関および非相関クローン型を同定する段階を含む方法を包含する。疾患は、例えば自己免疫疾患であってよい。そのレベルが、これらの異なる状態にある疾患の尺度と相関するクローン型を用いて、全個体において疾患と相関しないものを除外して、疾患と相関するより大きな1組の配列の独自性を予測するアルゴリズムを開発することができる。較正試験の場合とは異なり、相関配列は発見研究において存在する必要はなく、これらの配列に基づいて予測することができる。例えば、相関配列は、発見研究において同定されたクローン型のDNA配列と同じアミノ酸配列をコードするTCR遺伝子DNA配列であってよい。さらに、1つまたは複数の相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを用いて、任意の個体に由来する試料における、かつ所与の個体に決して特有ではないクローン型を同定することができ、したがって、その個体に存在するクローン型の予備知識をもたずに、新たな試料において相関クローン型を予測することが可能になる。
1つの局面において、疾患を有する対象に由来する任意の試料における1つまたは複数のクローン型を予測するアルゴリズムを開発するための方法であって、a) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、b) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、c) b)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階を含む前記方法を提供する。
1つの態様では、疾患に罹患した1つまたは複数の組織から1組の試料を採取する。
別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階は、少なくとも2つの試料からのクローン型プロファイルを比較することを含む。別の態様において、機能的データは、T細胞および/もしくはB細胞におけるマーカーの結合能、またはT細胞もしくはB細胞による抗原との相互作用を含む。別の態様において、前記配列パラメータは、核酸配列および予測されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、試料は、疾患のピーク段階にある1つまたは複数の個体に由来する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在する。別の態様において、前記の1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において高レベルである。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において低レベルである。別の態様において、1つまたは複数の相関クローン型は、疾患のピーク状態において存在しない。
1つの態様において、疾患は自己免疫疾患である。別の態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、または強直性脊椎炎である。
別の態様において、個体の1つまたは複数の相関クローン型を発見するための方法であって、a) 個体由来の試料からのクローン型プロファイルをアルゴリズムに入力する段階、およびb) アルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階を含む前記方法を提供する。アルゴリズムは、a) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、b) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、c) b)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階によって開発されたアルゴリズムであってよい。
D. 較正試験と集団研究を併用した、相関および非相関クローン型の発見
本発明の1つの態様では、較正試験と集団研究を併用することによって、相関クローン型を同定する(例えば、図17を参照されたい)。本態様では、集団研究は、任意の試料におけるクローン型の予測を可能にするアルゴリズムをもたらすのではなく、集団研究によって、特定の較正クローン型プロファイルが作成された対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測するためのアルゴリズムの開発が可能になる(例えば、図16を参照されたい)。この例は、アルゴリズムを較正するために用いられた臨床的再燃状態中の血液検査を最初に受けた後の疾患の任意の段階における血液試料から測定されたクローン型プロファイルに基づいて、ループス患者における相関クローン型を予測するアルゴリズムの開発であってよい。
本態様において、提供する本発明は、疾患患者および任意には健常対照に由来する、異なる時点における、および疾患を有する患者の場合には、臨床データによって特徴づけられる疾患経過の異なる(かつ判明している)状態における試料の研究において、免疫細胞レパートリーを配列決定することによって、相関および非相関クローン型を同定する方法を包含する。次に、第1状態と第2状態において異なる頻度(またはレベル)で見出されるクローン型を用いて、第1疾患状態における各個体のレパートリー中に見出される配列のいずれが、その個体において疾患と相関しないものを除外して、各個体において後の状態における疾患と相関するかを予測するアルゴリズムを開発する。較正試験のみの場合とは異なり、相関配列は、疾患状態間で異なることが見出された全配列のサブセットであってよい。相関クローン型は較正試料中に見出されず、それらが将来の試料中に出現する場合に、アルゴリズムに基づいて相関的であると予測されることも可能である。例として、較正試料中に見出されるクローン型と同じアミノ酸配列をコードするクローン型は、集団研究から得られるアルゴリズムに基づいて、相関クローン型であると予測され得る。前の態様とは異なり、特定の疾患状態にある、相関クローン型を予測すべき個体において作成されたクローン型プロファイルである較正クローン型プロファイルに基づいて、相関クローン型を予測するためのアルゴリズムを開発する。本態様では、特定の較正クローン型プロファイルが測定されて初めて、特定の個体における相関クローン型を作成するために、アルゴリズムを用いることができる。特定の対象においてこの較正プロファイルが測定された後、その個体におけるクローン型プロファイルの測定に基づいて、その後のすべての相関クローン型が予測され得る。
別の態様において、個体の1つまたは複数の相関クローン型を発見するための方法であって、a) 個体由来の試料からのクローン型プロファイルをアルゴリズムに入力する段階、およびb) アルゴリズムを用いて、個体の1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階を含む前記方法を提供する。アルゴリズムは、a) 疾患に関連する1組の試料から複数のクローン型プロファイルを作成する段階、b) その1組の試料から1つまたは複数の相関クローン型を同定する段階、c) b)において同定された1つまたは複数の相関クローン型からの配列パラメータおよび/または機能的データを用いて、疾患を有する対象に由来する任意の試料における相関クローン型を予測し得るアルゴリズムを開発する段階によって開発されたアルゴリズムであってよい。1つの態様では、疾患のピーク状態において試料を採取する。別の態様では、疾患に罹患した組織から試料を採取する。
E. 相関クローン型を予測するために用いられ得る配列関連パラメータ
集団研究を行うために、訓練セットを用いて、相関クローン型と相関しないクローン型を識別し得る様々なパラメータを試験することにより、相関クローン型の特徴を理解することができる。これらのパラメータには、用いられる配列または特異的なV、D、およびJセグメントが含まれる。1つの態様では、特定の疾患のクローン型が関連エピトープを認識する可能性が高く、よって配列類似性を有し得る場合のように、特異的なVセグメントがいくつかの疾患と相関する可能性がより高いことが示される。さらなる態様に含まれる他のパラメータには、同定される体細胞超突然変異の程度、ならびに症状発現のピーク時におけるクローン型のレベルおよび疾患が比較的非活動性である場合のそのレベルが含まれる。相関クローン型を予測し得る他のパラメータには、非限定的に、1) VまたはJ領域、組み合わせVJ、DJ領域内の短い配列を含む配列モチーフ；2) クローン型の配列長；3) 絶対レベル(分子100万個当たりのクローン数)または順位レベルを含むクローン型のレベル；4) 他のクローン型とのアミノ酸および核酸配列類似性：サイレント変化を有するもの(同じアミノ酸をコードするヌクレオチドの違い)または保存的アミノ酸変化を有するものを含む、他の高度に関連したクローン型の頻度；5) BCRに関して、クローン型における体細胞突然変異のレベル、および/またはいくつかの生殖系列クローン型と体細胞突然変異によって異なる別個のクローン型の数；6) その関連タンパク質が類似の3次元構造を有するクローン型が含まれる。
F. 相関クローン型の決定を精緻化するための機能的データ
さらなる態様は、相関クローン型の同定を支援するために機能的データを使用する。例えば、相関クローン型を含む細胞において濃縮されるある種のマーカーを含むT細胞および/またはB細胞を、FACSまたはMACSのような標準的な方法を通じて捕捉することができる。別の態様において、マーカーは細胞表面マーカーである。別の態様において、病理に関連する抗原または罹患組織に対するT細胞および/またはB細胞反応性は、クローン型の病理学的関連性の優れた証拠である。
別の態様では、候補クローン型の配列を合成し、それを完全なTCRまたはBCRの状況に置き、関連する反応性を評価することができる。あるいは、様々な配列の増幅断片を、ファージ、リボソーム、またはRNAディスプレイ技法へのインプットとして用いることができる。これらの技法は、関連する反応性を有する配列を選択することができる。選択前後の配列決定結果を比較することで、反応性を有し、よって病的である可能性が高いクローンを同定することができる。別の態様では、特定のディスプレイ技法(例えば、ファージ、リボソーム、またはRNAディスプレイ)をアレイ形式で用いることができる。TCRまたはBCRに由来する個々の配列(例えば、CDR3配列)を保有する個々の分子(またはこれら個々の分子の増幅物)を、ファージ、リボソーム、またはRNAのいずれかとして配置することができる。次に、特異的抗原を調べて、それらと結合するペプチドをコードする配列を同定することができる。疾患に関連するペプチド結合抗原は、病的である可能性が高い。
G. Immune Loadアルゴリズムの作成
アルゴリズムを用いて、Immune Loadを計算することができる(例えば、図18を参照されたい)。Immune Loadを用いて、臨床決定を下すことができる。実験(例えば、疾患の第1状態にある対象に由来する試料、および疾患の第2状態にある対象に由来する試料を含む実験)からのデータを用いて、相関および非相関クローン型のレベルに関する情報を単一のスコア(Immune Load)に統合するアルゴリズムを開発することができる。次に、Immune Loadと臨床データとの相関を最大化するために、このアルゴリズムのパラメータを調整することができる。例えば、臨床データは、疾患重症度の臨床的尺度(例えば、多発性硬化症患者に関するMRIにおける病変の程度)であってよい。
Immune Loadアルゴリズムの作成において用いられる相関クローン型は、上記のように較正試験、集合研究、または較正試験および集合研究を用いて作成することができる。
相関クローン型の統合において考慮され得る因子のいくつかは、相関クローン型の数、それらのレベル、それらの変化率(速度)、および速度の変化率(加速度)である。評価すべき他の因子には、症状発現ピーク時および非活動性疾患状態時におけるクローン型のレベルが含まれる。
1つの態様において、作成されるImmune Loadは自己免疫疾患に関連する。そのようなLoadは、AutoImm Loadと称され得る。
1つの局面において、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成するための方法であって、a) 1組の因子を用いて相関クローン型のレベルを疾患活動性スコアに統合するアルゴリズムを開発する段階、b) 疾患活動性スコアを、疾患状態に関する臨床データと比較する段階、およびc) 臨床データと疾患活動性スコアとの相関を最大化するために因子を最適化する段階を含む前記方法を提供する。
H. Loadアルゴリズムを用いた疾患のモニタリング
1. 較正試験なしでの疾患のモニタリング
本発明の1つの態様では、集団研究を用いて、クローン型およびImmune Loadアルゴリズムを決定する(例えば、図19を参照されたい)。最初に個々の患者を較正する必要なしに、Immune Loadを直接用いることができる。患者が任意の疾患状態にある場合に、この試験を行うことができる。この試験を用いて、上記で開発したアルゴリズムに基づいて、特異的な相関および非相関クローン型を作成することができる。次に、集団研究において作成された第2のアルゴリズムを用いて、Immune Loadを算出することができる。次に、このスコアを臨床的に用いることができる。
別の局面において、個体の疾患状態をモニターするための方法であって、a) 対象由来の試料からのクローン型プロファイルを決定する段階、b) a)からのクローン型プロファイル情報をアルゴリズムに入力する段階、およびc) アルゴリズムを用いて、個体の疾患状態を予測するスコアを作成する段階を含む前記方法を提供する。アルゴリズムは、a) 1組の因子を用いて相関クローン型のレベルを疾患活動性スコアに統合するアルゴリズムを開発する段階、b) 疾患活動性スコアを、疾患状態に関する臨床データと比較する段階、およびc) 臨床データと疾患活動性スコアとの相関を最大化するために因子を最適化する段階によって作成されたアルゴリズムであってよい。
2. 較正試験を用いた疾患のモニタリング
提供する本発明の1つの態様では、較正試験、または較正試験および集団研究を用いて、クローン型およびImmune Loadアルゴリズムを決定する(例えば、図20を参照されたい)。最初に較正試験を行うことによって、診療所においてImmune Loadを用いることができる。患者が、Immune Loadアルゴリズムにおいて用いられる相関および非相関クローン型を作成した研究において用いられた第1状態と類似した状態にある場合に、この試験を行うことができる。例えば、自己免疫疾患の再燃状態が、Immune Loadアルゴリズムが導き出された方法であるならば、この状態はそれであってよい。次に、この較正試験を用いて、その後の疾患モニタリング試験において用いるべき特異的な相関および非相関クローン型を作成することができる。この患者の治療における後の時点で、患者に対して別の試験を行い、発見研究において作成されたアルゴリズム、およびこの患者の特異的較正試験において作成されたクローン型レベルのリストを用いて、Immune Loadを算出することができる。次に、このImmune Loadスコアを臨床的に用いることができる。
別の局面において、個体の疾患状態をモニターするための方法であって、a) 対象由来の試料からのクローン型プロファイルを決定する段階、b) a)からのクローン型プロファイル情報をアルゴリズムに入力する段階、およびc) アルゴリズムを用いて、個体の疾患状態を予測するスコアを作成する段階を含む前記方法を提供する。アルゴリズムは、a) 1組の因子を用いて相関クローン型のレベルを疾患活動性スコアに統合するアルゴリズムを開発する段階、b) 疾患活動性スコアを、疾患状態に関する臨床データと比較する段階、およびc) 臨床データと疾患活動性スコアとの相関を最大化するために因子を最適化する段階によって作成されたアルゴリズムであってよい。別の態様において、本方法は、提供する本発明の方法のいずれかによって、個体における1つまたは複数の相関クローン型を決定する段階、および1つまたは複数の相関クローン型の情報をアルゴリズムに入力する段階をさらに含み得る。
1つの態様において、疾患は自己免疫疾患である。別の態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、または強直性脊椎炎である。
3. Immune Loadの使用に関連する他の因子
同じImmune Loadでも、異なる患者に対しては異なることを意味し得る。一例としては、患者の完全な臨床像を考慮する必要がある。試験の観点から、臨床決定を下す際には、Immune Loadのレベルに加えて、速度(経時的なImmune Loadの変化率)および加速(経時的な速度の変化率)を考慮する場合がある。例えば、AutoImm Loadスコアが増加している場合(高速度)、これは自己免疫疾患における初期の再燃を予測し得る。
Loadスコア、例えばAutoImm Loadスコアに組み込むことができる付加的な検査には、例えば、赤血球沈降速度(ESR)、C反応性タンパク質(CRP)レベル、抗ds DNA、他の自己抗体価、補体レベル、尿タンパクレベル、尿タンパク/クレアチニン比、クレアチニンレベル、血中尿素窒素(BUN)レベル、血小板レベル、WBC数、ヘマトクリット(Hct)、Hb、検尿結果が含まれる。組み込むことができる、SLEに関連する他の検査には、例えば、CD27レベル、CD27++細胞レベル、INF応答遺伝子(Baechler, EC et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 2610-2615)、およびケモカインスコア(Bauer JW et al. (2009) Arthritis Rheum. 60:3098-3107)が含まれる。ループスに関連しない他の検査には、例えば、甲状腺刺激ホルモン(TSH)検査、トリヨードチロニン(T3)検査、チロキシン(T4)検査、肝機能検査(LFT)、他の自己抗体、カルプロテクチン検査、ラクトフェリン検査、および滑液分析が含まれる。さらなる検査には、例えばMRI、CTスキャン、X線、および超音波を含む画像検査が含まれ得る。
III. 疾患状態の決定
免疫系はヒトの健康にとって非常に重要であるため、免疫応答を測定する能力は医学において広い応用性がある。本発明は、基礎疾患状態が免疫系によって媒介される場合に、これを理解するために免疫系を使用する能力を教示する。これによって、免疫プロファイルを使用する非常に強力な一連の診断的および予後診断的適用は、多種多様な臨床転帰のリスクを伝え、医師をより効率的に介入させることが可能になる。
A. 自己免疫疾患の治療における免疫プロファイリングの有用性
対象における自己免疫疾患を診断および治療するために、提供する本発明の方法を用いることができる。自己免疫疾患は、通常の過程を回避して、自己免疫を付与し、身体の組織上の何らかの標的を攻撃する適応免疫細胞を含む。自己免疫疾患には、例えば、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、皮膚筋炎、1型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、多発性硬化症、重症筋無力症、神経性筋強直症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、および血管炎症候群が含まれる。これらの自己免疫疾患の段階は、提供する本発明の方法を用いて診断することができる。自己免疫疾患の段階に基づいて、対象に治療を示唆することができる。
自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患を有する疑いのある対象に関する臨床情報を用いて、疾患状態(またはAutoImm load)を決定することができる。臨床情報を用いて、疾患状態と相関するクローン型プロファイルのパターンを同定することができる。臨床情報には、例えば、身長、体重、眼色、年齢、性別、民族、血圧、LDLコレステロールレベル、HDLコレステロールレベル、家族歴、および分子マーカー情報が含まれ得る。
臨床情報には、1つまたは複数の自己免疫疾患の症状が含まれ得る。自己免疫性肝炎に関して、症状には、疲労、肝肥大、黄疸、掻痒、皮疹、関節痛、腹部不快感、クモ状血管腫、嘔気、嘔吐、食欲不振、暗色尿、蒼白、または灰色便が含まれ得る。皮膚筋炎(DM)に関して、症状には、筋力低下、嚥下障害、筋肉痛、疲労、体重減少、および微熱に伴うかまたはこれらに先行する発疹(顔、首、肩、上胸部、肘、膝、指関節、および背中における斑状の青紫色の変色)が含まれ得る。グレーブス病に関して、症状には、エネルギー消費の増加による体重減少、食欲、心拍数、および血圧の上昇、ならびに振戦、神経過敏、および発汗が含まれ得る。橋本甲状腺炎に関して、症状には、精神機能および身体的低下、寒がり、体重増加、皮膚の荒れ、甲状腺腫が含まれ得る。混合性結合組織病(MCTD)に関して、症状には、全身性エリテマトーデス(SLE)、強皮症、および多発性筋炎の特徴が含まれ得る。水疱性類天疱瘡(BP)に関して、症状には、弱掻痒性のみみず腫れから重篤な水疱および感染まで、口腔または食道の水疱が含まれ得る。天疱瘡に関して、症状には、皮膚および粘膜の水疱形成が含まれ得る。悪性貧血に関して、症状には、息切れ、疲労、蒼白、頻拍、食欲不振、下痢、手および足の刺痛およびしびれ、口の痛み、ならびに不安定歩行が含まれ得る。多発性筋炎(PM)に関して、症状には筋力低下、嚥下障害、および筋肉痛が含まれ得る。原発性胆汁性肝硬変(PBC)に関して、症状には疲労および掻痒が含まれ得る。強皮症(全身性硬化症)に関して、症状には、指または手の腫脹およびむくみ、皮膚の肥厚、指の皮膚潰瘍、手の関節硬直、疼痛、咽頭痛、および下痢が含まれ得る。シェーグレン症候群に関して、症状には、眼および口の乾燥、頸腺腫脹、嚥下または会話困難、味覚または嗅覚異常、口渇、および舌潰瘍が含まれ得る。全身性エリテマトーデス(SLE)に関して、症状には、発熱、体重減少、脱毛、口および鼻の痛み、倦怠感、疲労、精神疾患の発作および症状、RAに類似した関節炎、鼻および頬における蝶形紅斑、手および足の冷え症が含まれ得る。血管炎症候群、例えばウェゲナー肉芽腫症、特発性半月体形成性糸球体腎炎(ICGN)、顕微鏡的多発動脈炎(MPA)、肺腎症候群(PRS)に関して、症状には、疲労、脱力感、発熱、関節痛、腹痛、腎障害、および神経障害が含まれ得る。臨床情報は、1つの時点または複数の時点における1つまたは複数の対象に由来し得る。
臨床情報は、自己免疫疾患を有する対象の、対象が受けた1つまたは複数の治療に対する反応に関する情報を含み得る。
以下に、AutoImm Loadの臨床的有用性を特定の自己免疫疾患に関して論じる。本発明の別の態様は、より優れた感度および特異度を有する試験を可能にするために、免疫プロファイリング試験と、これらの疾患において疾患活動性を検出するために既に用いられている他のマーカーの併用を意図する。AutoImm Loadの計算において、または疾患状態を決定するために、他の分子識別子またはマーカーを用いることができる。分子識別子には、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質、ならびに核酸またはタンパク質の発現プロファイルが含まれ得る。分子識別子は、ヒトまたは非ヒト起源(例えば、細菌)のものであってよい。識別子またはマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、染色体マイクロアレイ解析(CMA)、発現プロファイリング、DNAマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムRNA発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ゲノム配列決定、コピー数(CNV)解析、小ヌクレオチド多型(SNP)解析、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、PCR、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、SDS-PAGE、ゲル電気泳動、およびノーザンブロッティングを含む技法によって測定することができる。
全身性エリテマトーデスに関して、マーカーには、赤血球沈降速度(ESR)のレベル、C反応性タンパク質(CRP)レベル、抗ds DNA、他の自己抗体価、補体レベル、尿タンパクレベル、尿タンパク/クレアチニン比、クレアチニンレベル、血中尿素窒素(BUN)レベル、血小板レベル、WBC数、ヘマトクリット(Hct)、Hb、および検尿結果が含まれ得る。組み込むことができる、例えばSLEに関連する他の検査には、例えば、CD27レベル、CD27++細胞レベル、INF応答遺伝子、およびケモカインスコアが含まれる。
1. 全身性エリテマトーデス(SLE)
全身性エリテマトーデス(SLEまたはループス)の状態または段階を決定するために、提供する本発明の方法を用いることができる。SLEは、若年成人(主に女性)が罹患することの多い重篤な自己免疫病態である。これは、皮膚、関節、腎臓、肺、心臓、および中枢神経系を含む多くの器官を侵し、頻繁に障害および場合によっては死を引き起こし得る炎症過程によって特徴づけられる。本疾患は、再燃期およびそれに続く寛解の休止期を特徴とする、非常に予測不可能な経過をたどる。それにもかかわらず、SLEと診断された患者はリウマチ専門医による診察を定期的に受け、様々な深刻な薬物による治療を受ける。これらの薬物には、プレドニゾンなどのステロイド剤、およびCellcept(ミコフェノール酸モフェチル)などの他の免疫抑制剤が含まれる。これらの薬物は器官の損傷を軽減し得るものの、それらは感染症および不妊のリスクを含む重大な副作用を含む。症状のいくつか(例えば、疼痛および疲労)に関して信頼性がないこと、および疾患経過が予測できないことから、薬物用量を目的に合わせることは難しく、結果として一部の患者には過剰治療を招き、他の患者には過少治療を招くことになる。結果として、SLEの治療は、臨床医に重要な臨床的課題をもたらす。
SLEの活動性を評価するために臨床医が用いることのできるいくつかの標準的方法が存在する。疾患の臨床症状を観察することによって、疾患の状態を測定することができる。これらの方法には、検査結果(例えば、尿タンパク/クレアチニン比、抗ds DNA抗体、および血球数)に加えて、徴候(例えば、皮疹)および症状(例えば、関節痛および疲労)の評価が含まれる。しかしながら、これらの臨床マーカーは疾患状態の遅行指標であってよく、したがって患者は、治療の数週間または数カ月後に初めて反応し得る。さらに、症例によっては、症状を正確に評価することは困難であり得る(例えば、疼痛および疲労)。炎症の他のマーカー、例えば抗ds DNA抗体、補体レベル(例えば、C3)、C反応性タンパク質(CRP)、および赤血球沈降速度(ESR)は通常、特異度および/または感度が欠如している。腎生検などの侵襲的な方法は、日常的な使用には実用的でない。結果として臨床医は、疾患状態の完全な測定なしに、患者の検査をかなり頻繁に行う。臨床症状および臨床検査評価は、全身性エリテマトーデス疾患活動性指標(SLEDAI)および医師による全般的評価(PGA)などの測定に組み込まれる。これらの測定は臨床診療において日常的には行われず、いくつかの臨床的状況において不十分である場合が多い。
SLEの治療的介入を行う際のAutoImm Loadの有用性の具体例を、AutoImm Loadを決定する特定の実現研究と共に実施例の項においてより詳細に考察する。
2. 多発性硬化症(MS)
提供する本発明の方法はまた、多発性硬化症(MS)の状態または段階を決定するために用いることもできる。MSは、脳および脊髄(中枢神経系)を侵す疾患である。それぞれの発作の部位および重症度が異なり得るため、症状は様々である。症状発現は数日間、数週間、または数カ月間持続し得る。これらの症状発現は、症状が軽減されるかまたは現れない(寛解)期間と交互に起こる。この疾患は再発する(return)(再発する(relapse))のが一般的である。しかしながら、疾患は寛解期なしに悪化し続ける場合もある。
脳または脊髄のいかなる部位の神経も損傷を受け得るため、多発性硬化症患者は身体の多くの部位に症状を有し得る。筋肉症状には、例えば、平衡感覚の喪失、任意の部位におけるしびれまたは知覚異常、筋痙攣による疼痛、上下肢の痛み、上下肢の運動障害、歩行障害、協調および微細運動の障害、不明瞭または理解不能発語、1つまたは複数の上下肢における振戦、筋肉群の制御不能な痙攣(筋痙縮)、ならびに1つまたは複数の上下肢における脱力が含まれる。
眼症状には、例えば、複視、眼の不快感、制御不能な急速眼球運動、および視力喪失(通常は一度に一方の眼に起こる)が含まれる。
その他の脳および神経症状には、例えば、注意持続時間の低下、判断力の低下、記憶力の低下、鬱または悲しみの感情、眩暈および平衡障害、顔面痛、聴力喪失、ならびに疲労が含まれる。
腸および膀胱症状には、例えば、便秘、排尿開始困難、頻尿、便漏出、強い尿意切迫、および尿漏出(失禁)が含まれる。
現時点で、多発性硬化症に対する公知の治療法はない。しかしながら、疾患を遅らせる治療法が存在する。治療の目的は、症状を抑制し、患者が正常な生活の質を維持するのを助けることである。
多発性硬化症の進行を遅らせるために用いられる薬物には、例えば、インターフェロン(Avonex、Betaseron、またはRebif)、モノクローナル抗体(Tysabri)、酢酸グラチラマー(Copaxone)、ミトキサントロン(Novantrone)、メトトレキサート、アザチオプリン(Imuran)、シクロホスファミド(Cytoxan)、およびナタリズマブ(Tysabri)を含む、免疫系の制御を助けるための免疫調節剤が含まれ得る。発作の重症度を軽減するために、ステロイド剤を用いることができる。
症状を抑制するための薬物には、例えば、例えばLioresal(バクロフェン)、チザニジン(Zanaflex)、またはベンゾジアゼピンなどの筋痙攣を軽減するための薬物、排尿障害を軽減するためのコリン作動性薬物、気分もしくは行動症状のための抗鬱剤、および疲労のためのアマンタジンが含まれ得る。
MSは男性よりも女性に多く発症する。この障害は最も一般的には20〜40歳で始まるが、いかなる年齢においても見られ得る。MSは、神経細胞を取り囲む保護被覆であるミエリン鞘への損傷によって起こる。この神経被覆が損傷を受けると、神経インパルスは減速するかまたは停止する。MSは進行性疾患であり、神経損傷(神経変性)が時間の経過に伴い悪化することを意味している。MSが悪化する速さは人によって異なる。神経損傷は炎症によって引き起こされる。身体自身の免疫細胞が神経系を攻撃した場合に、炎症が起こる。炎症の症状発現の反復は、脳および脊髄の任意の部位に沿って起こり得る。何が炎症を誘発するのかは、研究者にもわかっていない。最も一般的な理論は、ウイルスもしくは遺伝的欠陥、またはそれらの組み合わせを指摘している。MSは、他の地域よりも北欧、北米、オーストラリア南部、およびニュージーランドにおいて起こる可能性が高い。地理学的研究から、環境因子が関与している可能性があることが示される。MSの家族歴を有する人、およびMSの発生率がより高い地理的地域に居住している人は、本疾患のリスクがより高い。
MSの症状は、多くの他の神経系障害の症状を模倣し得る。本疾患は、他の病態を除外することによって診断される。再発寛解型と称されるMSの形態を有する人は、症状が軽減されるかまたは現れない期間によって分離される、少なくとも2回の発作の病歴を有し得る。医療提供者は、2回の異なる時点で、中枢神経系の2つの異なる部位の機能に低下(異常反射など)が認められる場合に、MSを疑ってよい。神経学的診察によって、身体の1つの部位における、または身体の多くの部位に広がる神経機能の低下が示され得る。
多発性硬化症を診断するための検査には、例えば、CSFオリゴクローナルバンド形成を含む脳脊髄液検査、頭部MRIスキャン、腰椎穿刺(脊椎穿刺)、神経機能検査(誘発電位検査)、および脊椎MRIが含まれる。
他の自己免疫疾患と同様に、MSは、急性再燃および寛解期を伴う予測不可能な経過をたどる。治療法が増加しており、それぞれ重篤なもの(体重増加および鬱)から生命を脅かすもの(汎血球減少症およびPML感染)まで様々な副作用を伴い、異なる患者において有効性が様々であり、かつ高コストである。同時に、MS疾患活動性の高度に正確でかつ特異的な日常検査が欠如していることで、効果的に投与する治療法の課題は複雑化する。臨床症状発現は、治療を行わなくても長期(早期疾患では最大数年まで)に分離され得る。加えて、利用可能な薬物は再発の可能性を下げるが、それらを完全に防ぐわけではない。したがって、疾患活動性は評価が困難であり、よって、再発の回数または重症度の軽減を測定することによる、特定の治療法が所与の患者において有効性を示しているかどうかを測定するために用いられ得る疾患活動性の不適切な短期的尺度が存在する。疾患活動性をモニターするために利用可能な唯一の他の検査は、ガドリニウムなどの造影剤の助けを借りて明らかになる病変の状態を追跡するための脳MRIである。しかしながら、そのような画像法は脳損傷の統合図を提供するにすぎず、特異性および時間分解能を欠いている。1年よりも短い時間尺度で疾患経過を追跡するためにMRI画像法を使用する試みは、コスト、特異性の欠如、および過度の造影剤曝露の危険性を考えると実用的でない。結果として、患者は、医師が投薬および/または付加療法の切り換えの修正をできるようにする有効なフィードバックなしに、長期にわたって多大な費用をかけて治療を受ける場合が多い。
3. 関節リウマチ(RA)
関節リウマチ患者の疾患状態を測定するために、本方法を用いることができる。関節リウマチ(RA)は、多くの組織および器官を侵し得るが主に関節を攻撃して、関節軟骨の破壊および関節の強直へと進行する場合の多い炎症性滑膜炎を引き起こす慢性全身性炎症障害である。関節リウマチはまた、肺、心膜、胸膜、および強膜における広汎性炎症、ならびにまた最も一般的には皮下の皮下組織における結節性病変を生じ得る。関節リウマチの原因は不明であるが、自己免疫がその慢性化および進行において重要な役割を果たす。
世界人口の約1%が関節リウマチに罹患しており、女性の方が男性の3倍多い。発症は40〜50歳において最も頻繁であるが、いかなる年齢の人も罹患し得る。これは身体障害性でかつ痛みを伴う病態であってよく、この病態は機能および運動性の実質的な喪失を招き得る。RAは主に症状および徴候で診断されるが、血液検査(特に、リウマチ因子と称される検査)およびX線によっても診断され得る。診断および長期管理は、典型的には、関節および結合組織の疾患の専門家であるリウマチ専門医によって行われる。
様々な治療が利用可能である。非薬理学的治療には、理学療法、整形術、および作業療法が含まれる。症状を抑制するために、ステロイド剤を含む鎮痛薬(痛み止め)および抗炎症薬を用いることができる一方、根底にある免疫過程を阻害または停止する、および長期的損傷を防ぐために、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)を用いることができる。最近では、生物製剤の新しい群によって治療選択肢が増加した。
RAが臨床的に疑われる場合には、リウマチ因子(RF、特異的抗体)の存在に関する検査など、免疫学的検査を行うことができる。RFが陰性であってもRAは除外されず、この関節炎は血清陰性と称される。これは患者の約15%に当てはまる。疾病の1年目は、リウマチ因子は陰性である可能性が高く、一部の個体は時間に伴い血清陽性状態へと転換していく。RFは、例えばシェーグレン症候群といった他の疾病および健常人集団のおよそ10%においても認められ、よってこの検査は非常に特異的というわけではない。
このように特異度が低いために、いわゆる抗シトルリン化タンパク質抗体(ACPA)の存在について試験する新たな血清学的検査が開発された。RFと同様に、これらの検査も全RA症例のある割合(67%)においてのみ陽性であるが、RAが存在しなければめったに陽性とはならず、特異度は約95%となる。RFと同様に、臨床疾患の発症の前でさえ、ACPAが多くの症例において存在するという証拠が存在する。
ACPAに関する最も一般的な検査は、抗CCP(環状シトルリン化ペプチド)検査および抗MCVアッセイ(変異シトルリン化ビメンチンに対する抗体)である。最近になって、RAの早期発見のための血清学的ポイント・オブ・ケア検査(POCT)が開発された。このアッセイは、関節リウマチの診断のためにリウマチ因子と抗MCVの検出を併用し、感度72%および特異度99.7%を示す。
同様に、エリテマトーデスなどの関節炎の他の原因を考慮に入れるために、いくつかの他の血液検査を行うことができる。赤血球沈降速度(ESR)、C反応性タンパク質、全血球数、腎機能、肝臓酵素、およびその他の免疫学的検査(例えば、抗核抗体/ANA)は、すべてこの段階で行われる。フェリチンレベルの上昇は、模倣RAであるヘモクロマトーシスを明らかにすることができ、または血清陰性で通常若年性のリウマチの異型であるスティル病の徴候であり得る。
疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)という用語は、元々はESRならびにヘモグロビンおよび自己抗体レベルなどの生物学的尺度に影響を及ぼす薬物を意味したが、現在では通常、骨および軟骨への損傷率を軽減する薬物を意味するために用いられる。DMARDは、永続的な症状寛解をもたらし、かつ進行を遅らせるかまたは停止することが見出された。そのような損傷は通常は不可逆的であるため、このことは意義深い。抗炎症薬および鎮痛薬は疼痛および硬直を改善するが、関節損傷を妨げず、また疾患の進行を遅らせることもない。
関節に対する永久的な損傷が疾患のごく初期に起こるこという認識が、リウマチ専門医の中で増加している。以前は、単に抗炎症薬で治療を開始し、臨床的におよびX線を用いて進行を評価するというのが一般的であった。関節損傷が起こり始めるという証拠が存在したならば、次により強力なDMARDを処方する。超音波およびMRIは、関節を画像化するより感度の高い方法であり、関節損傷が以前に考えられていたよりもより多くの患者においてはるかに早く起こることを実証した。正常なX線写真を有する人は、X線が実証することのできなかった、超音波によって検出可能な侵食を有する場合が多い。現在の目的は、損傷が起こる前に治療をすることである。
DMARDを早く開始することが構造的関節損傷を防ぐのに有益であることの他の理由が存在し得る。疾患の最も初期の段階から、関節には、様々な正のフィードバックループを含み得る方法で相互にシグナルを送りあう免疫系の細胞が浸潤している(単回副腎皮質ステロイド注射が長期にわたり特定の関節における滑膜炎を食い止め得ることが長い間観察されてきた)。効果的なDMARD(メトトレキサートなど)でこの過程をできるだけ早く中断することで、その後何年間もの間、RAからの転帰が改善するようである。症状の発症後わずか2、3カ月間治療が遅れることで、長期的により悪い転帰が起こり得る。したがって、患者が治療に最も反応し、得るものが最大である早期関節炎において、最も効果的な治療法を確立することに相当な関心がもたれている。
関節炎を治療するために用いられる従来の低分子量薬には、例えば化学合成DMARD：アザチオプリン、シクロスポリン(シクロスポリンA)、D-ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキサート(MTX)、ミノサイクリン、およびスルファサラジン(SSZ)が含まれる。細胞毒性薬にはシクロホスファミドが含まれる。
最もよく見られる有害事象は、肝臓および骨髄毒性(MTX、SSZ、レフルノミド、アザチオプリン、金化合物、D-ペニシラミン)、腎毒性(シクロスポリンA、非経口金塩、D-ペニシラミン)、間質性肺炎(MTX)、アレルギー性皮膚反応(金化合物、SSZ)、自己免疫(D-ペニシラミン、SSZ、ミノサイクリン)、および感染症(アザチオプリン、シクロスポリンA)に関する。ヒドロキシクロロキンは眼毒性を引き起こす恐れがあるが、これは稀であり、またヒドロキシクロロキンは骨髄にも肝臓にも影響を及ぼさないため、これは毒性の最も少ないDMARDと見なされる場合が多い。残念ながらヒドロキシクロロキンはそれほど強力ではなく、それ自体で症状を抑制するには通常不十分である。
遺伝子工学により生物剤(生物製剤)が産生され得、これには例えば、腫瘍壊死因子α(TNFα)遮断薬‐エタネルセプト(Enbrel)、インフリキシマブ(Remicade)、アダリムマブ(Humira)、インターロイキン1(IL-1)遮断薬‐アナキンラ(Kineret)、B細胞に対するモノクローナル抗体‐リツキシマブ(Rituxan)、T細胞共刺激遮断薬‐アバタセプト(Orencia)、インターロイキン6(IL-6)遮断薬‐トシリズマブ(抗IL-6受容体抗体)(RoActemra、Actemra)が含まれる。
抗炎症薬には、例えば、グルココルチコイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID、大部分は鎮痛薬としても作用する)が含まれる。鎮痛薬には、例えば、パラセタモール(米国およびカナダではアセトアミノフェン)、アヘン剤、ジプロクアロン、および局所リドカインが含まれる。
RA治療の課題は、本疾患が、困難な障害を引き起こし得る長期慢性疾患であり、それに対してそれぞれが重大な欠点を有する広範な治療が存在するという事実にある。DMARDの多くは、重症感染症、癌、またはさらには自己免疫疾患のリスク増加を含む重大な副作用に患者を曝す。さらに、生物学的に誘導された薬物は非常に高価であり、患者は頻繁に注射を受ける。
患者に治療を開始する医師は、多くの可能な選択肢に直面する。患者が治療を開始したならば、臨床所見自体が現れる前に、選択されたその治療に患者が反応しているかどうかを理解するために、迅速なフィードバックを得ることが望ましい。画像法は感度が悪くかつ高価であり、CRPなどの多くの血液マーカーは十分な感度を欠いている。医師による疾患状態の迅速な決定を可能にする試験によって、医師は治療を、患者をさらなる関節損傷から救い、また利用可能な高価な治療法をより効果的に用いたより効果的な治療に、素早く調整できるようになる。
治療を開始してから急性再燃を全く経験したことのない患者は、実際には、臨床的にそれ自体現れていない、関節に対する進行中の炎症性損傷をなお経験している恐れがある。医師によるこの状態とバックグラウンドの識別を可能にする試験によって、進行中の関節損傷が経験されていない状態に患者を近づけようと試みるために、治療を調整できるようになる。
MS患者の管理においてどのようにAutoImm Loadを用いることができるかの具体例を、本文書の実施例の項においてより詳細に記載する。
4. 強直性脊椎炎
強直性脊椎炎の疾患活動性を検出するために、本方法を用いることができる。強直性脊椎炎(AS、ギリシャ語からankylos、曲がった；spondylos、脊椎)は、以前は脊椎関節炎の一形態であるベヒテレフ病、ベヒテレフ症候群、およびマリー・シュトリュンペル病として知られていたもので、慢性炎症性関節炎でありかつ自己免疫疾患である。これは主に脊椎の関節および骨盤の仙腸関節を侵し、脊椎の最終的な融合を引き起こす。これは、強い遺伝的素因を伴う脊椎関節症の群の1メンバーである。完全な融合により、竹様脊椎として知られる状態である、脊椎の完全な強直が生じる。
典型的な患者は18〜30歳の若年男性であり、疾患の症状が最初に出現する時点で、脊椎の下部または場合によっては脊椎全体に慢性疼痛および硬直を伴い、仙腸関節からの臀部のいずれか一方または大腿後部への関連痛を伴う場合も多い。約3:1の比率で男性が女性よりも多く罹患し、本疾患は通常、女性よりも男性においてより痛みを伴う経過をたどる。症例の40%において、強直性脊椎炎は、充血、眼痛、視力喪失、飛蚊症、および羞明を引き起こす眼の炎症(虹彩毛様体炎およびブドウ膜炎)を伴う。よく見られる別の症状は、全身の疲労および場合により嘔気である。それほど多くはないが、大動脈炎、肺尖部線維症、および仙骨神経根鞘の拡張症も起こり得る。すべての血清反応陰性脊椎関節症と同様に、爪の剥がれ(爪甲離床症)が起こり得る。
ASを診断するための直接的な検査は存在しない。特徴的な脊椎変化および仙腸関節炎を示す臨床検査および脊椎のX線検査が、主な診断ツールである。X線診断の欠点は、単純フィルムX線においてX線で明らかな変化が起こるまでに、ASの徴候および症状は通常8〜10年もの長い期間にわたって確立されてきたという点であり、このことは、適切な治療を導入できるまでに10年もの遅れがあるということを意味する。早期診断のための選択肢は、仙腸関節の断層撮影および磁気共鳴画像化であるが、これらの検査の信頼性はいまだ明らかではない。ショーバーテストは、検査中に行われる腰椎の屈曲の有用な臨床測定である。
急性炎症期中、AS患者は場合によって、C反応性タンパク質(CRP)の血中濃度の上昇および赤血球沈降速度(ESR)の上昇を示すが、CRPおよびESR率が上昇せずにASを有する人が多くの存在し、よって正常なCRPおよびESR結果は必ずしも、人が実際に有する炎症の量と一致するとは限らない。場合によって、ASを有する人は正常レベルの結果を有するが、体内に相当量の炎症を抱えている。
強直性脊椎炎(AS、ギリシャ語からankylos、曲がった；spondylos、脊椎)は、以前は脊椎関節炎の一形態であるベヒテレフ病、ベヒテレフ症候群、およびマリー・シュトリュンペル病として知られていたもので、慢性炎症性関節炎でありかつ自己免疫疾患である。これは主に脊椎の関節および骨盤の仙腸関節を侵し、脊椎の最終的な融合を引き起こす。
これは、強い遺伝的素因を伴う脊椎関節症の群の1メンバーである。完全な融合により、竹様脊椎として知られる状態である、脊椎の完全な強直が生じる。
強直性脊椎炎を治療するために用いられる3つの主要な型の薬物が存在する：1) 炎症および疼痛を軽減する、イブプロフェン、フェニルブタゾン、インドメタシン、ナプロキセン、およびCOX-2阻害薬などのNSAIDを含む抗炎症薬。オピオイド鎮痛薬もまた、特に持続放出製剤において、ASに罹患している人に通常見られる慢性疼痛の型を緩和するのに非常に効果的であることが臨床的証拠によって判明している。2) 免疫抑制を通じて免疫系反応を低下させるために用いられる、シクロスポリン、メトトレキサート、スルファサラジン、および副腎皮質ステロイドなどのDMARD。3) エタネルセプト、インフリキシマブ、およびアダリムマブなどのTNFα遮断薬(アンタゴニスト)(生物製剤としても知られる)は、他の自己免疫疾患と同様に、ASの治療に適応され、ASにおける有効な免疫抑制剤である。
TNFα遮断薬は、臨床症例の大多数においてASの進行を遅らせ、多くの患者の炎症および疼痛を取り除くわけではないが、多くの患者でそれらが著しく軽減されることを助ける、最も有望な治療であることが示された。それらはまた、関節の関節炎のみならず、ASに付随する脊椎関節炎の治療においても非常に効果的であることが示された。多くの場合に高コストであることのほかに、欠点は、これらの薬物が感染症のリスクを高めるという事実である。このため、TNFα遮断薬のいずれのプロトコールも、治療開始前の(マントゥーまたはヒーフのような)結核の検査を含む。反復感染、反復する咽頭痛でさえ起こった場合には、関与する免疫抑制のために治療を一時中断し得る。TNF薬物治療を受けている人は、ウイルス(風邪またはインフルエンザなど)を保有しているかもしくはその可能性がある、または細菌もしくは真菌感染症を有する可能性のある他人への曝露を制限するように助言される。
ASは、健常人集団でよく見られる症状を生じる。例えば、激しい背部痛を訴える患者はAS再燃をきたしている必要はなく、むしろ単に日常的な背部痛を有している可能性がある。医師は、疾患の状態への非常に正確な見解をもたずに、潜在的に重度の副作用を伴う高価な薬物を用いて、これらの症状を治療するかどうかに関して決断を迫られる。CRPおよびESRは、疾患状態の非常に正確な見解を提供するわけではない。同時に、未治療疾患の経過は衰弱性の長期脊椎損傷を招き得る。この状況は困難な臨床的課題をもたらし、著しい過剰治療が用いられる。疾患活動性を反映する客観的尺度を利用できることは、AS患者の管理に非常に役立ち得る。
B. 癌の検出における免疫プロファイリングの有用性
癌のリスクを測定するために、これらの方法を用いることができる。癌は先進工業国における死亡原因の第1位になった。したがって、癌の治療方法は必要性が高い。新規低分子薬および腫瘍を標的化する抗体の開発を含む、癌治療の多くのアプローチが試みられている。
提唱されている1組の方法は免疫療法である。腫瘍監視は、免疫系の細胞の機能の1つである。免疫系によって認識される腫瘍抗原のカテゴリーがいくつか存在する。第1のカテゴリーは、腫瘍における体細胞突然変異(点突然変異または転座)によって新たに生じる抗原からなる。別のカテゴリーは、MHC分子を発現しない雄性生殖細胞においてのみ発現するタンパク質に由来する抗原からなる。多くの腫瘍における遺伝子発現の調節不全によって、これらの抗原のいくつかは発現できるようになり得る。第3のカテゴリーは、特定の組織でのみ発現するタンパク質に由来する抗原を含む。第4のカテゴリーは、腫瘍組織において顕著に過剰発現する抗原を含む。最後に第5のカテゴリーは、異常な翻訳後修飾によって生じる抗原を含む。
腫瘍の特性の1つは、免疫系による効果的な排除を回避するそれらの能力である。腫瘍において獲得された新たな突然変異によって、腫瘍は平衡相(腫瘍は完全には排除されないが、その増殖が調べられている)から、免疫系による効果的な制御なしに腫瘍が増殖する回避相に移行できるようになると考えられている。免疫系を回避するために腫瘍が使用する多くの機構が存在する。これらの機構には、特異的抗原性ペプチド、またはT細胞を活性化し得る共刺激分子の欠如が含まれる。他の機構には、T細胞を阻害する因子の腫瘍による分泌、および腫瘍をリンパ球から分離する物理的障壁を構築することによる腫瘍誘導性の特権部位の構築が含まれる。癌を治療するための戦略として、腫瘍とより良く戦うように免疫系を誘導することが、多種多様な方法で研究され、試験されている。1つのアプローチは養子T細胞治療である。このアプローチは、腫瘍に浸潤する、および/または特定の腫瘍抗原に対して反応する細胞の単離を通して、腫瘍抗原を標的化するT細胞を同定することに焦点を置いている。これらのT細胞は、IL-2および/または抗原提示細胞を使用するような、それらの有効性を高める条件において、インビトロで増殖させることができる。次に、拡大した細胞を患者の血液に注入して戻す。別のアプローチは、腫瘍特異的TCRを含むレトロウイルスの使用である。これらのレトロウイルスを患者において特殊な細胞に注入することができるが、この細胞は後にレトロウイルスを分泌し、レトロウイルスはT細胞に感染できるようになり、その後T細胞は腫瘍特異的TCRの発現を開始する。最後に一般的なアプローチはワクチン接種の使用である。この治療アプローチの前提は、腫瘍抗原の1つまたは複数で患者を免疫すると、腫瘍と戦う免疫系の能力が促進されるということである。免疫化は、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)のようなアジュバントを使用して行われる場合が多い。このアプローチは、HPV-16およびHPV-18によって誘導される子宮頸癌を予防する能力によって明白であるように、ウイルス誘発性癌の予防において成功している。しかしながら、これは他の腫瘍の治療ではそれほど成功していない。
癌による死亡率の改善の多くは、例えば乳癌および子宮頸癌の死亡率の低下をもたらす、より優れた早期発見法が利用できることによって起こった。腫瘍の変異性のために、その早期治療は、それらが後に検出される場合よりもはるかに効果的である。伝統的に、癌検出マーカーの探索は通常、癌において高発現し、かつ正常組織において低レベルであるかまたは存在しないマーカーの探索を含む。これによって、PSAのようないくつかの腫瘍マーカーが同定された。癌の早期発見に関する1つの問題は、バイオマーカーの検出が最も困難である場合、すなわち腫瘍が非常に小さい場合に、癌検出の最大の価値が生まれるということである。したがって、小さな腫瘍を有する患者と有さない患者を識別し得る効果的な癌検出バイオマーカーを得るためには、腫瘍と正常組織とのサイズの大きな違いに起因して、腫瘍と正常組織との間で発現がとてつもなく異なっている必要がある。さらに、非侵襲的技法を用いて検出ができるように、マーカーは血液またはその他の体液に効率的に「溢流する」必要がある。
本発明は、免疫細胞応答を用いた癌検出の新規機構を教示する。この観点から、検出は、腫瘍自体により産生されるマーカーの検出によって達成されるのではなく、腫瘍に対する免疫系応答によって達成される。具体的には、TCRおよび/またはBCRのプロファイルが、身体が腫瘍への応答を開始しているか否かの洞察を提供し得る。これは、現在のバイオマーカーに関する問題のいくつかを改善し得る。第一に、免疫応答は、検出するのがより容易となり得る増幅シグナルである。第二に、リンパ球は血液を規則的に通過し、よって関連バイオマーカーは、従来の腫瘍バイオマーカーよりも末梢血において容易に存在し、検出可能であると考えられる。最後に、正常組織によって生成される「バックグラウンド」バイオマーカー物質の問題が大きく軽減される。T細胞および/またはB細胞の多様性が大きいことから、特にDNA配列決定のハイスループット法が最近利用可能であることで、感度および特異度の高い関連バイオマーカーを検出する方法が提供される。癌を検出するために癌に対する免疫系応答を使用するアプローチは、免疫療法の裏付けによって本分野に築かれた基礎を活用する。しかしながら、2つの適用のリスクはおそらく全く異なる。癌に対する免疫応答をその検出に用いることは、腫瘍の治療において特定のクローン型が効果的であることを必要とせず、むしろそれが腫瘍に対する免疫応答と関連していることを必要とする。
本発明の別の態様は、より優れた感度および特異度を有する試験を可能にするために、免疫プロファイリング試験と、癌の検出のために既に用いられている他のマーカーの併用を意図する。Loadアルゴリズムの計算において、または疾患状態を決定するために、他の分子識別子またはマーカーを用いることができる。分子識別子には、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質、ならびに核酸またはタンパク質の発現プロファイルが含まれ得る。分子識別子は、ヒトまたは非ヒト起源(例えば、細菌)のものであってよい。識別子またはマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、染色体マイクロアレイ解析(CMA)、発現プロファイリング、DNAマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムRNA発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ゲノム配列決定、コピー数(CNV)解析、小ヌクレオチド多型(SNP)解析、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、PCR、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、SDS-PAGE、ゲル電気泳動、およびノーザンブロッティングを含む技法によって測定することができる。
C. 移植医療における免疫プロファイリングの有用性
移植臓器の免疫拒絶反応を検出するために、これらの方法を用いることができる。臓器移植は医療の不可欠な部分になっており、米国では年間25,000件を超える固形臓器(腎臓、肝臓、心臓、膵臓、および肺)移植および15,000件を超える骨髄移植が行われている。これらは一般に、三次医療センターで行われる複雑な手技である。移植拒絶反応のリスクを最小限に抑えるために、患者は多くの場合に長期にわたって免疫抑制の状態に置かれ、癌および感染症のリスクに曝される。さらに、多くの移植片は急性的にまたは移植の何年も後に拒絶される。これらの問題にもかかわらず、臓器不全患者にはほかに選択肢がほとんどないため、臓器移植は依然として不可欠な治療様式である。
固形臓器移植拒絶反応は、主に移植臓器に対する適応免疫系の応答によって起こる。これは、移植片内に、宿主の免疫系によって認識される同種抗原が存在するためである。拒絶反応は3つの異なる段階で起こり得る。1つ目は移植の数分以内に起こる超急性期であり、予め形成された抗体が移植片に対する応答を開始する。2つめは、移植後の最初の数週間または数カ月以内に起こる急性拒絶反応である。最後は、移植の何年も後に起こり得る慢性拒絶反応である。これらのリスクを考えて、ドナーとレシピエントの間の免疫原性の違いを最小限に抑えるよう注意が払われている。例えば、超急性拒絶反応のリスクは、ドナーとレシピエントのABO亜型を一致させた場合、およびドナーとレシピエントを交差適合(レシピエントが、ドナーの白血球と反応する抗体を有するかどうかを判定する)について検査した場合に、大幅に低下する。急性拒絶反応を軽減するためには、同様に主要組織適合性(MHC)に関する注意深い適合が行われる。しかしながら、MHC分子が非常に多型的であることを考えると、完全な一致の同定を見出すことは非常に難しい。一卵性双生児は完全なMHC適合を有する。同様に、兄弟姉妹の1/4は完全なMHC一致を有すると予測される。臨床検査において検出された同じアレルを有する非血縁個体は、日常的臨床診療において検査されないその他の多型部位のために、違いがある場合が多い。しかしながら、兄弟姉妹からの完全なMHC適合があったとしても、副組織適合抗原が存在するために拒絶反応の重大なリスクはなお存在し、実際に急性拒絶反応は非常によく見られ、移植片の半分超で起こっている。
MHC遺伝子座のより積極的な検査および同定、ならびに副組織適合抗原の適合によって、移植片拒絶反応および場合によっては生存率が著しく改善されると推測する人もいる可能性がある。これは事実かもしれないが、利用可能なドナー臓器の数が限定されているために、より積極的な検査によって各患者に用いられるべき適切な移植片の同定が大幅に遅れる恐れがあるという理由で、この課題は非実用的である。したがって、移植分野で起こった進展の多くは、拒絶反応を防ぐおよび治療するために、免疫抑制剤を使用することにあった。現在、この目的のために、アザチオプリン、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸、シロリムス、ムロモナブ-CD3、モノクローナル抗CD25抗体、モノクローナル抗CD20抗体、およびカルシニューリン阻害薬を含む多くの薬物が使用されている。
骨髄移植は、白血病およびリンパ腫の治療において最も頻繁に用いられる。典型的にレシピエントは、移植の前に腫瘍量を減少させるために放射線および/または化学療法の積極的なレジメンを受ける。移植片対宿主病(GVHD)と称される逆の拒絶反応において、ドナー由来の成熟T細胞は宿主組織のいくつかを攻撃し得る。これは多くの場合、発疹、下痢、および肝疾患により明らかになる。MHCの注意深い適合により、この問題を改善することができるが、取り除くことはできない。1つの解決法は、最終的にGVHDの原因となる成熟T細胞をインビトロにおいてドナー骨髄から枯渇させることである。これに関連する1つの問題は、GVHDを引き起こすのと同じ現象が、ドナーT細胞が残存する癌細胞を攻撃する移植片対白血病効果を介する骨髄移植の治療効果の一部に関与し得ることである。加えて、ドナーT細胞の枯渇は、患者を免疫不全となるリスクに曝し得る。したがって、これらのアプローチを検討する場合には、リスクと利益のバランスをとらなければならない。したがって患者は、GVHDを予防するおよび治療するために、免疫抑制剤による治療を受ける場合が多い。
骨髄、まして固形臓器の移植の現在の管理は、強力な免疫抑制剤による治療に大きく依存している。しかしながら、これらの薬物が重大なリスクを有することを考えて、これらはリスクと利益のバランスをとる様式で用いられる。しかしながら、特定の時点における特定の患者に対するリスクが十分に理解されないことを考慮して、患者は、平均的な患者に関してリスクと利益のバランスがとられた用量を用いて治療を受ける。将来の拒絶反応事象を予測し得る試験は、患者がそれらを必要とする適切な時点で患者に治療を合わせるのに潜在的に非常に役立ち得る。これによって、拒絶反応および願わくは移植片生着の割合が改善されつつ、一部の患者に対する免疫抑制用量が減少し得る。
本発明の別の態様は、より優れた感度および特異度を有する試験を可能にするために、免疫プロファイリング試験と、移植拒絶反応の検出のために既に用いられている他のマーカーの併用を意図する。Loadアルゴリズムの計算において、または疾患状態を決定するために、他の分子識別子またはマーカーを用いることができる。分子識別子には、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質、ならびに核酸またはタンパク質の発現プロファイルが含まれ得る。分子識別子は、ヒトまたは非ヒト起源(例えば、細菌)のものであってよい。識別子またはマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、染色体マイクロアレイ解析(CMA)、発現プロファイリング、DNAマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムRNA発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ゲノム配列決定、コピー数(CNV)解析、小ヌクレオチド多型(SNP)解析、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、PCR、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、SDS-PAGE、ゲル電気泳動、およびノーザンブロッティングを含む技法によって測定することができる。
D. 感染症の治療における免疫プロファイリングの有用性
これらの方法は、特に感染症が活動状態および潜伏状態で存在し得る場合の、感染症の治療を導く上で有用性を有する。過去一世紀にわたる感染症の治療に対する抗生物質の出現は、平均余命に大きな影響を及ぼした。過去10年の間、分子診断技法は、感染症の診断および管理において急増する役割を果たしてきた。核酸増幅によって提供される優れた感度および特異度により、これらの技法の適用はその数が増加し得た。適用の多くは、感染性病原体の存在または非存在の診断的評価に用いられる。例えば、性感染症の検査は多くの場合、核酸増幅技法を使用する分子検査によって行われる。別の一連の適用は、感染性病原体が既に診断された患者における感染の「量」の評価を含む。この例は、エイズと既に診断された患者におけるHIVウイルス量の評価である。この検査は、医師が患者の疾患がいずれの状態であるかを判定するのを助け、ひいては用いられる治療レジメンの有効性についての助言を提供し得る。
場合によっては、感染性病原体のみならず、感染性病原体に対する免疫応答のレベルを考慮することは役立つ。感染に対する免疫応答が臨床診療において日常的に用いられる一例は、B型肝炎においてである。B型肝炎検査の1つの局面は、核酸増幅アッセイによるB型肝炎抗原の検出を通して感染性病原体を検出することに依存する。加えて、日常的な臨床診療では、B型肝炎ウイルスを標的化する様々な抗体の存在に関して検査することが一般的である。抗HBc IgMの存在は通常は急性感染設定において起こり、抗HBc IgGの出現は感染が慢性であることを示す。同様に、抗HBs抗体の出現は感染の除去を示唆する。
本発明の1つの態様では、感染に対する免疫応答を評価する値を、分子検査の感度および特異度と共に利用する。これは、感染性病原体が体内に潜伏したままである慢性である感染症にとって特に有用である。感染に対する免疫応答を評価するために、TCRおよび/またはBCRのプロファイルを用いることができる。配列決定を用いてTCRおよび/またはBCRのプロファイルを得ることができ、高感度および高特異度を有する特定のクローン型の検出が可能になる。疾患と相関する特異的クローン型を決定するために、いくつかのアプローチが考え出される。
本発明の別の態様は、より優れた感度および特異度を有する試験を可能にするために、免疫プロファイリング試験と、感染性病原体の検出のために既に用いられている他のマーカーの併用を意図する。Loadアルゴリズムの計算において、または疾患状態を決定するために、他の分子識別子またはマーカーを用いることができる。分子識別子には、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質、ならびに核酸またはタンパク質の発現プロファイルが含まれ得る。分子識別子は、ヒトまたは非ヒト起源(例えば、細菌)のものであってよい。識別子またはマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、染色体マイクロアレイ解析(CMA)、発現プロファイリング、DNAマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムRNA発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ゲノム配列決定、コピー数(CNV)解析、小ヌクレオチド多型(SNP)解析、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、PCR、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、SDS-PAGE、ゲル電気泳動、およびノーザンブロッティングを含む技法によって測定することができる。
E. 高齢患者の治療における免疫プロファイリングの有用性
これらの方法は、高齢者における免疫系の状態をモニターする上で有用性を有する。高齢者は、感染に応答する能力、およびワクチンに対して効果的な応答を生じる能力(Weinberger et al., 2008)に影響する、免疫老化と称される免疫系の衰えを被る。これは、高齢者では肺炎による死亡率が高いこと(Office for National Statistics, 2005)、ならびにクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などの院内感染への高齢者の感受性(Health Protection Agency, 2008)から明らかである。さらに、免疫系の能力の低下は、高齢者における癌罹患率の増加を説明すると考えられている。加えて、免疫老化は、アルツハイマー病および心疾患のような、炎症過程の重要な構成要素を伴う高齢者がかかる他の主要な疾患に寄与し得る。老年医学科の医師がワクチン接種、感染症の積極的治療、および入院に関する臨床決定を下す際に、どの個体がこれらの致命的な転帰のリスクが最も高いかを予測する能力は、老年医学科の医師にとって有用である。
先天性免疫系および適応免疫系の多くの局面は、免疫老化で変化する。T細胞は応答性を失い、マクロファージでは抗原提示能が低下し、かつサイトカイン分泌が変化し、ナチュラルキラー細胞では毒性が低下し、濾胞樹状細胞は抗原を効率的に提示することができず、また好中球は食作用能を失う。ナイーブT細胞およびB細胞のより小さなプールが存在し、記憶およびエフェクタープールは増加し、それによってT細胞およびB細胞レパートリーの多様性が減少し、ひいては新たな抗原に対して応答する適応免疫系の能力が低下する。特に、サイトメガロウイルス(CMV)と関連するT細胞レパートリーが大幅に増加し、全T細胞レパートリーの45%もがそれに向けられる。これらの増殖が100歳以上の人ではそれほど顕著でないことが指摘されている。
研究から、免疫マーカーが高齢者の生存期間を予測し得ることが示唆された。B細胞レパートリーの多様性の程度は、少なくとも1つの集団において高齢者の生存期間を予測することが示された。TCRおよびBCR多様性におけるこれらの全体的な違いは、臨床転帰を予測することが示されたにもかかわらず、これらのマーカーは特異性を欠いている。レパートリーデータ―をより深く解析することによって、顕著により高い予測精度が提供され得る。例えば、CMVに応答性であるものの増殖は、他の増殖とは異なる意義を有し得る。
本発明の1つの態様では、数年間にわたり病歴を追跡されている高齢患者の縦断的コホートから、末梢血に見出されるT細胞およびB細胞に由来するRNAを回収することができる。これらのコホートのそれぞれにおいて、それらの病歴のいくつかの時点で、TCRαおよびTCRβ遺伝子ならびにIgH、IgK、およびIgL遺伝子を増幅することができる。長期生存期間を有する患者のプロファイルを、短期生存期間を有する患者と比較する。最初に、多様性の全体的な大きさを得ることができる。これは、同定された異なるクローン型の数のみならず、それらの多様性も含む。例えば、V、D、Jセグメント使用は2つの群で同じであるか、または1つの群はその使用がより制限されているか？ 例えば、2つの試料は同じ数の独立したクローン型を有し得るが、2つの試料の一方のクローン型はVセグメントの多くを網羅していない。この試料は、クローン型がすべてのVセグメントに分布している他方の試料と比較して、新たな抗原に対する応答において多用途性が低いと予測するのが理論的である。
全体的な多様性に加えて、長期生存期間を有した患者において増殖したクローン型が、短期生存期間を有した患者におけるクローン型と比較して、いくつかの配列パラメータに基づいて識別され得るかどうかを判定する。このアプローチは、特定の抗原に応答するクローン型を調べることによって補われ得る。例えば、入手可能な証拠を考えると、CMV応答性クローン型の同定は予測力を有し得る。1組の高齢患者および健常患者から、発見研究においてCMV反応性であるT細胞クローン型の捕捉を行うことができる。これらのクローン型の配列を調べて、それらを他のクローン型と識別するパラメータを同定することができる。上記の縦断的コホートと共にCMVクローン型のこの予測アルゴリズムを用いて、この情報を付加することが、長期生存する患者を長期生存しない患者から予測する能力を高めるかどうかを評価することができる。
本発明の別の態様は、より優れた感度および特異度を有する試験を可能にするために、免疫プロファイリング試験と、高齢者集団における健康の検出のために既に用いられている他のマーカーの併用を意図する。Loadアルゴリズムの計算において、または疾患状態を決定するために、他の分子識別子またはマーカーを用いることができる。分子識別子には、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質、ならびに核酸またはタンパク質の発現プロファイルが含まれ得る。分子識別子は、ヒトまたは非ヒト起源(例えば、細菌)のものであってよい。識別子またはマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、染色体マイクロアレイ解析(CMA)、発現プロファイリング、DNAマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムRNA発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ゲノム配列決定、コピー数(CNV)解析、小ヌクレオチド多型(SNP)解析、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、PCR、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、SDS-PAGE、ゲル電気泳動、およびノーザンブロッティングを含む技法によって測定することができる。
F. ワクチンの投与における免疫プロファイリングの有用性
これらの方法は、ワクチンの投与における有用性を有する。ワクチン接種の使用は、多くの生物の感染率の大幅な低下をもたらした。米国で年間30,000件を超える死亡例があり、健康に重大な影響を与え続けている1つの感染症はインフルエンザである。株が急速に突然変異するため、インフルエンザワクチン接種は毎年行わなければならない。本疾患の重症後遺症の大部分は高齢者で起こる。残念なことに、高齢者は免疫老化を被り、ワクチン接種に対する応答が不十分となる場合が多い。
ワクチン接種に対して応答する患者と応答しない患者を識別するために、発見研究を行うことが必要である。この集団において、インフルエンザワクチン接種を受けインフルエンザ転帰(すなわち、患者が後に感染から防御されたかまたはされなかったか)が判明している患者のコホートについて、ワクチン接種の前および(1つまたは複数の設定時間における)後の血液試料を利用することができる。これらの試料からTCRおよび/またはBCR配列を得ることができる。各患者においてワクチン接種後に濃縮されるクローン型を決定する。相関クローン型と他のクローン型を識別するために、次に、ワクチン接種に応答した患者において濃縮されたクローン型を、対照セットのクローン型(例えば、同じ1組の患者におけるクローン型の残り)と比較する。次に、これらのクローン型を予測するためのアルゴリズムを用いて、ワクチン接種に応答しなかった患者間で相関クローン型を予測する。応答しなかった患者は、応答したが低レベルであった患者と同じ型のクローン型を生じる可能性がある。あるいは、非応答者は異なるクラスのクローン型を生じる可能性がある。非応答者において同定される相関クローン型の数によって、これら2つの可能性が識別され得る。
次に、同定された相関クローン型を用いて、免疫の可能性を予測するためのスコアを作成するためのアルゴリズムを構築する。ワクチン応答者および非応答者のプロファイルからのデータを使用して、このアルゴリズムを作成する。次にこのアルゴリズムを用いて、免疫後に得られた試料に由来する予測された相関クローン型を使用して、次の患者において免疫の可能性を予測することができる。予測は、発見研究においてやはり作成されていた別のアルゴリズムの適用を通して行われる。これは任意に、相関クローン型の検索を、免疫後に濃縮されたものに限定するための前較正からのデータによって支援され(または置き換えられ)得る。
本発明の別の態様は、より優れた感度および特異度を有する試験を可能にするために、免疫プロファイリング試験と、ワクチン接種に対する応答の検出のために既に用いられている他のマーカーの併用を意図する。Loadアルゴリズムの計算において、または疾患状態を決定するために、他の分子識別子またはマーカーを用いることができる。分子識別子には、核酸、タンパク質、炭水化物、および脂質、ならびに核酸またはタンパク質の発現プロファイルが含まれ得る。分子識別子は、ヒトまたは非ヒト起源(例えば、細菌)のものであってよい。識別子またはマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、染色体マイクロアレイ解析(CMA)、発現プロファイリング、DNAマイクロアレイ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、全ゲノムRNA発現アレイ、ペプチドマイクロアレイ、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ゲノム配列決定、コピー数(CNV)解析、小ヌクレオチド多型(SNP)解析、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、PCR、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、SDS-PAGE、ゲル電気泳動、およびノーザンブロッティングを含む技法によって測定することができる。
G. 免疫過敏症(アレルギー)のモニタリングにおける免疫プロファイリングの有用性
適応免疫系は、病原体に関連する抗原に応答するように進化してきた。自己免疫疾患の場合と同様に、免疫系は場合により誤った標的を有し得る。自己免疫疾患では免疫系が自己抗原を標的するのに対して、過敏症反応では、免疫系は薬物、埃、および食物のような無害な刺激に対して応答を開始する。過敏症は非常によく見られ、米国人口の50%もが環境刺激に対するアレルギーを有し、これは機構によって引き起こされる。過敏症は4つの型に分類される。I型過敏症は即時型過敏症であり、IgEによって媒介される。II型は、細胞表面結合型抗原に結合するIgG抗体に起因する場合が多い。例えば、細胞の表面に結合する無害な薬物によって、たまたま抗薬物IgGを有する患者では、細胞がこれらの抗体の標的となり得る。III型は、組織上の抗原抗体複合体の沈着によって起こる。これは例えば、抗原の量が多く、結果として効率的に除去され得ず、代わりに血管壁に沈着する小さな免疫複合体が生じる場合に起こる。IV型過敏症は、T細胞によって媒介される遅延型過敏症である。I型およびIV型が、ヒトの健康に対して最も高い影響を及ぼす。
I型過敏症反応では、患者は、無害な抗原(アレルゲン)に対して、それに対するIgE抗体を産生することにより感作される。後にそのアレルゲンに曝露されると、肥満細胞および好塩基球などのIgE結合細胞の活性化が誘導される。ひとたびこれらの細胞が活性化されると、蓄えられた化学物質を分泌し、かつサイトカイン、ロイコトリエン、およびプロスタグランジンを合成することによる炎症過程の誘導を通して、アレルギー反応が起こる。アレルゲンの用量および侵入経路により、アレルギー性鼻炎の症状からアナフィラキシーにおける生命を脅かす循環虚脱にまで及び得るアレルギー反応の大きさが決まる。多くの場合、急性I型反応の後に、結果として生じた病的過程の多くにおいて役割を果たす別の後期が続く。Tヘルパー細胞および他の炎症細胞が動員される後期は、本質的にIV型過敏症反応である。いくつかのI型アレルギー反応には、季節性鼻結膜炎(花粉症)、食物アレルギー、薬剤性アナフィラキシー、アトピー性皮膚炎(湿疹)、および喘息が含まれる。これらは、有病率の上昇を伴う非常によく見られる病態であり、著しいコストならびに罹患率および死亡率をもたらす。例えば喘息は、米国人口の〜7%が罹患し、年間〜4,000件の死亡例を引き起こす慢性疾患である。これらの疾患のいくつかは、いくつかの関連局面を有する。例えば、アトピー性皮膚炎患者は、喘息を有するリスクが著しく増加している。食物アレルギーは嘔吐および下痢を引き起こし得るが、またかなりの数の患者においてアナフィラキシーをもたらし得る‐米国では、30,000件の症例で年間〜200件の死亡例が生じる。アレルギー性鼻炎の症状を引き起こす、鼻の粘膜下肥満細胞を活性化する同じアレルゲンのいくつかはまた、下気道の肥満細胞を活性化し、喘息の典型的な症状である気管支狭窄を引き起こし得る。いくつかのIV型過敏症反応は、接触性皮膚炎(例えば、ツタウルシ)、慢性鼻炎、慢性喘息、およびセリアック病である。セリアック病は、非IgE媒介性の食物アレルギーによって起こる慢性疾患である。これは、コムギおよび他の食物中に存在する成分であるグルテンに対するアレルギー反応によって起こる小腸の疾患である。95%を超えるセリアック病患者は、特異的なMHCクラスIIアレル、HLA-DQ2を有する。
過敏症反応の治療は異なるが、それらは多くの場合に、急性治療および長期的な管理または予防の2つの局面を有した。これらの病態のいくつかは生命を脅かすものであり得(アナフィラキシーおよび急性喘息)、速やかな医学的処置を含む。長期的管理は一般に、特異的アレルゲンを回避しようと試みることを含む。これは、アレルゲンが明らかに同定され得る場合(例えば、ナッツに対するアレルギー)に効果的であると考えられるが、花粉または埃のようにアレルゲンが環境中に広く存在する場合にはこれは困難であり得る。したがって、薬物による長期的な治療はこれらの疾患のいくつか(例えば、喘息およびアレルギー性鼻炎)に利用されることが多い。治療管理の有効性のレベルは、患者がアレルゲンに再度曝露される場合に最終的に試験される。したがって、一部の患者は過剰治療または過少治療に供され得る。疾患活動性、および患者が過敏症反応を開始する傾向の程度を評価する試験が利用できることが理想的である。そのような試験によって、個々の患者の必要性に対して治療を合わせることが可能になる。
実施例1
自己免疫疾患を有する対象における組換えDNAの配列決定
自己免疫疾患患者から血液試料を採取する。抗体コーティング磁気ビーズを用いて、血液試料からCD4+細胞およびCD8+細胞を単離する。PCRを用いて、T細胞受容体β遺伝子の完全な可変領域を増幅する。増幅断片をベクターにサブクローニングし、細菌に形質転換してDNA断片を単離する。細菌を増殖させてDNAを増幅し、ジデオキシ配列決定を用いてT細胞受容体β遺伝子の可変領域を配列決定して、クローン型を同定する。配列決定情報を用いて該患者のクローン型プロファイルを作成する。同様の方法を図1に示す。
実施例2
自己免疫疾患の状態の決定
多発性硬化症の症状発現ピークを有する患者から、脳脊髄液(CSF)および血液の試料を採取する。CSFおよび血液からCD4+細胞を単離し、T細胞受容体β遺伝子のCDR3をPCRにより増幅する。増幅断片をベクターにサブクローニングし、細菌に形質転換してDNA断片を単離する。細菌を増殖させてDNAを増幅し、ジデオキシ配列決定を用いてT細胞受容体β遺伝子の可変領域を配列決定して、クローン型を同定する。配列決定情報を用いて、該患者のクローン型プロファイルを作成する。
前記患者が多発性硬化症の比較的非活動性状態にある時点で、別の血液試料を採取する。上記と同じ手順を繰り返して、クローン型プロファイルを作成する。ピークの症状発現時に高く、かつ非活動性状態において有意に減少するものとして、病的クローン型を同定する。後の状態において、該患者から別の血液試料を採取する。この時点で、T細胞受容体β遺伝子CDR3領域の断片のみを増幅し、次に配列決定する。このサブセットは病的クローン型を含む。様々なクローン型のレベルを測定して、該患者の疾患状態を評価する。
実施例3
TCRβレパートリー解析：増幅および配列決定の戦略
TCRレパートリーの増幅を調べるため、TCRβ鎖を解析する。解析は、TCRβ配列の増幅、配列決定、および解析を含む。1つのプライマー
Figure 0005798926
は、Cβ1およびCβ2における共通配列に相補的であり、全48種のVセグメントを増幅することができる34種のVプライマー(表1)が存在する。Cβ1またはCβ2は、J/C結合部から10位および14位の位置において互いに異なる。Cβ1およびCβ2のプライマーは16 bpの位置で終了し、Cβ1またはCβ2に対する優先性を有さないはずである。
全48種のVセグメント、および国際免疫遺伝学(ImMunoGeneTics)情報システム(http://imgt.cines.fr/)によって定義されるそれらの全公表アレルを増幅するために、34種のVプライマーを、BIOMED-2グループによって発表された元のプライマーセットから修正する。
BIOMED-2プライマーは、リンパ球増殖性疾患におけるクローン性を同定するために多重で用いられている。
（表１）様々なVファミリーに相補的なプライマー配列
Figure 0005798926
増幅へのプライマーの使用を、34種の合成配列を用いて試験した。合成配列は、片側にオリゴヌクレオチドのうち1つの配列を含み、反対側にCプライマーの相補体を含んだ。2つのプライマー間に、制限酵素部位Cla Iに相当する6 bpが存在した。全合成配列を適切なプライマーを用いて増幅し、Cla I消化により、増幅産物が合成配列の増幅の結果であり、プライマー二量体の形成によるものではないことが実証された。
Illumina Genome Analyzerは、最適な配列決定プラットフォームである。各レーンにおいて、〜1,500万件の読み取りを行うことができる。1レーン当たりヒト試料12例およびマウス試料96例が実行され、1つの試料の読み取りを別のものと識別するために配列タグが用いられる。図2に図示するように、2段階の増幅スクリーニングを行うことができる。図2Aに示すように、一次PCRは、3'末端がJ/C結合部から16塩基であり、Cβ1およびCβ2の2つのアレルに完全に相補的である20 bpプライマーを片側において使用する。二次PCRでは、鋳型の同じ側において、J/C結合部に最も近い10塩基の配列をその3'末端において有し、J/C結合部から15〜31位の配列を有する17 bpがそれに続き、P5配列がそれに続くプライマーを使用する。このプライマーはC10-17-P5と称される。P5はクラスター形成において役割を果たす。一次PCRから作製された鋳型にC10-17-P5プライマーがアニールすると、J/C結合部に最も近い10塩基およびJ/C結合部から15〜31位の塩基の配列にプライマーがハイブリダイズするために、鋳型において4 bpループ(11〜14位)が生じる。11〜14位のループ形成により、Cβ1またはCβ2を保有する鋳型の差次的増幅が排除される。最終的に、J/C結合部に最も近い10塩基およびJ/C結合部から15〜31位の塩基の配列に相補的なプライマー(このプライマーはC'と称される)を用いて、配列決定を行う。すべての増幅物質が、クラスター形成において効率的に使用され得る無傷の末端を有することを確実にするために、C10-17-P5プライマーをHPLC精製することができる。
図2Bにおいて、Vプライマー上のオーバーハングの長さは14 bpであると示される。一次PCRは、より短いオーバーハングによって支援され得る。一方で二次PCRのためには、二次PCRがこの配列からプライミングされるために、一次PCRで使用するVプライマーにおけるオーバーハングは可能な限り長いことが有利であり得る。二次PCRにおいてプライミングが非常に非効率的であると、最終データの表示に限界が生じる恐れがある。
効率的な二次PCRを支持するオーバーハングの最小サイズを調べた。2 bp段階で10〜30のオーバーハングサイズを有する、(2つの異なるVセグメント用の)2系列のVプライマーを作製した。適切な合成配列を使用して、それらの系列における各プライマーを用いて一次PCRを行い、増幅されたものすべてを示すためにゲル電気泳動を行った。二次PCR増幅の効率を測定するために、異なる一次PCR反応によるPCR産物を鋳型として用いて、ならびにRead2-タグ1-P7およびRead2-タグ2-P7をプライマーとして用いて、SYBRグリーンリアルタイムPCRを行った。全4系列のリアルタイムデータ(2つの異なるVセグメントでの2件の一次PCR、および2つの異なるタグを含む異なるプライマーを用いた2件の二次PCR)を用いて、一貫した状況が明らかになった。10〜14 bpのオーバーハングサイズにおいて、効率の改善が認められた。しかしながら、14 bpを超えるオーバーハングでは、効率の改善はほとんど認められなかった。プライマーが高濃度であるために、その融解温度よりもはるかに高い温度で14 bpが鋳型をプライミングするのに十分となるため、オーバーハングが14 bpほど小さくなった場合に効率は高いままであった。同時に、鋳型はすべてがcDNAなのではなく、全分子が14 bpオーバーハングを有する複雑度の低いPCR産物であったため、特異性が維持された。
図2Bに図示するように、一次PCRは、鋳型の反対側にアニールし、5'尾部上に共通の14 bpオーバーハングを含む34種の異なるVプライマーを使用する。14 bpは、Illumina配列決定プライマーの1つ(Read 2プライマーと称される)の部分配列である。同じ側における二次増幅プライマーは、P7配列、タグ、およびRead 2プライマー配列を含む(このプライマーはRead2_タグX_P7と称される)。P7配列はクラスター形成に用いられる。Read 2およびその相補体は、それぞれVセグメントおよびタグの配列決定に用いられる。1〜96番のタグを伴う一連の96種のこれらプライマーを作製した(以下を参照されたい)。すべての増幅物質が、クラスター形成において効率的に使用され得る無傷の末端を有することを確実にするために、これらのプライマーをHPLC精製することができる。
上記のように、二次プライマーであるC-10-17-P5(図2A)は、一次PCRで作製された鋳型と中断された相同性を有する。このプライマーを使用する増幅の効率を検証した。CsegP5と称されるC-10-17-P5に代わる代替プライマーは、一次Cプライマー、およびP5を保有する5'尾部と完全な相補性を有する。一次PCR鋳型の増幅におけるC-10-17-P5およびCsegP5の使用の効率を、リアルタイムPCRを行うことにより比較した。数回の反復において、C-10-17-P5プライマーを使用するPCRが、CsegP5プライマーを使用するPCRと比較して効率にほとんど差がないことが見出された。
図2に図示した2段階増幅によって生じる分子は、図3に示すようなIlluminaシーケンサーで典型的に用いられる構造を有する。分子の最も外側の部分にアニールする2つのプライマー、IlluminaプライマーP5
Figure 0005798926
および
P7
Figure 0005798926
は、分子の固相増幅(クラスター形成)に用いられる。1分子当たり3件の配列読み取りを行う。100 bpの第1の読み取りは、Illumina配列決定過程に適している融解温度を有するC'プライマーを用いて行う。第2の読み取りは6 bp長のみであり、単に試料タグを同定する目的のためである。これは、Illuminaタグプライマー
Figure 0005798926
を用いて作成される。最後の読み取りは、配列
Figure 0005798926
を有するIlluminaプライマーであるRead 2プライマーである。このプライマーを用いて、一次PCR Vプライマー配列から開始する、Vセグメントにおける100 bpの読み取りが作成される。
それぞれセット中の他のすべてのタグと少なくとも2つの違いで異なる、同じ配列決定レーンで実行される異なる試料を識別するための一連の6 bp配列タグを設計した。2つの違いにより、仮に配列決定エラーが存在する場合に、誤った試料に対する読み取りの誤割り当てが妨げられる。タグが許容するギャップ、およびひいては配列決定による1つの欠失または挿入エラーを比較するために行われる整列化によっても、読み取りは誤った試料に割り当てられることはない。タグの選択におけるさらなる特徴は、単一塩基の連続(4つのAまたはTおよび3つのGまたはC)を制限すること、およびIlluminaプライマーとの類似性がないことである。その前提で全部で143種のタグが作製され、そのうちの96種を使用する。
血液試料から得られたcDNAを使用して、全34種の異なるプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。異なるプライマーに関して、異なるCt値が得られた。各PCR産物をゲル電気泳動により泳動したところ、単一バンドが示された。加えて、全34種のプライマーをプールし、PCRを行ったところ、この場合もやはり単一のPCRバンドが得られた。
増幅の最適化
多重増幅はすべてのVセグメントを使用することができる。異なる配列の増幅における1つの問題は、異なる配列の相対的な増幅効率、および最終増幅物質において、異なる配列の最初の相対量が保存されることである。相対的な増幅効率は、異なるプライマー配列の異なる効率と、同じプライマーを使用する異なる配列の増幅の異なる効率に細分される。効率の差は、異なるプライマー配列に起因し得る。異なるVセグメントプライマーによって増幅される配列の相対存在量を維持する増幅を得るように、反応を最適化する。プライマーのいくつかは関連しており、よってプライマーの多くは「クロストーク」して、それと完全に一致しない鋳型を増幅する場合がある。どのプライマーがそれを増幅するかにかかわらず、同様の様式で各鋳型が増幅され得るように、条件を最適化することができる。換言すれば、2つの鋳型が存在する場合、1,000倍の増幅後に両方の鋳型はおよそ1,000倍増幅され得、鋳型の一方に関して、クロストークのために、増幅産物の半分が異なるプライマーを保有することは問題ではない。配列決定データのその後の解析において、プライマー配列は解析から除去され、よって鋳型が同等に増幅される限り、どのプライマーが増幅に用いられるかは問題ではない。
各鋳型の量はcDNA内で不明であるため、34件の一重PCR反応を用いて、cDNAから一連の標準物質を作製した。これらの各反応における産物は、1つのVプライマーを伴う複数の配列を含んだ。異なる産物を注意深く定量して、同じ濃度の一連の標準物質を作製した。全34種のプライマーのプールを使用し、プライマーのプールおよび鋳型としての各標準物配列を使用して、34件のリアルタイムPCRを行った。理想的には、全34種類の標準物質は、リアルタイムPCRによって等しい増幅効率を示す。これは、クロストークの存在により、どのプライマーが増幅を実行しているかが不明であるにもかかわらず、各配列が同等に増幅されることを示唆する。この最適化は、増幅産物に取り込まれる実際のプライマーにかかわらず、同等の増幅を有するという目的と一致する。全体のプライマープール濃度が上昇したことで、増幅効率の増大から予測されるように、ダイナミックレンジは有意に減少した。さらに、平均よりも効率的に増幅するようであった鋳型に関しては、プール中のそれらと完全に一致するプライマーの濃度を減少させた。逆に、非効率的に増幅された鋳型に関しては、それらと完全に一致するプライマーの濃度を増加させた。この最適化により、全鋳型が平均増幅の2倍以内で増幅されることが実証された。
理想的には、異なるプライマーによる差次的増幅を最小限に抑えるために、一次PCRは少ないサイクル数を有する。二次増幅は一対のプライマーを用いて行われ、したがって差次的増幅の問題は最小である。一次PCRの1%を二次PCRに直接供する。2つの増幅間で用いられる35サイクル(100倍の希釈段階なしでの〜28サイクルと同等である)は、サイクルの中断が一次の1サイクルおよび二次の34サイクルであるか、または一次の25サイクルおよび二次の10サイクルであるかにかかわらず、強力な増幅を示すのに十分であった。理想的には、一次PCRにおいて1サイクルのみを行うことで、増幅の偏りが減少し得るにもかかわらず、他の考慮事項が存在する。この1つの局面は代表制である。これは、開始インプット量が、最終的に得られる読み取りの数を超えない場合に、一因となる。例えば、1,000,000件の読み取りが得られ、それが1,000,000個のインプット分子から開始する場合には、100,000個の分子からの代表物のみを二次増幅に供することで、元の試料中の異なる種の相対存在量を推測する精度は低下する。2段階間での100倍希釈は、一次PCR増幅が100個を有意に超える分子を生じない限り、代表が減少することを意味する。これは最小8サイクル(256倍)、しかしより十分には10サイクル(〜1,000倍)に換算される。これの代案は、一次PCRの1%超を二次PCRに供することであるが、一次PCRにおいて用いられるプライマーが高濃度であるために、大きな希釈係数を用いて、これらのプライマーが増幅に干渉せず、かつ配列間の増幅の偏りを悪化させないことを確実にすることができる。別の代案は、一次PCRからプライマーを除去して、そのより小さな希釈を可能にするために、精製または酵素段階を付加することである。この例では、一次PCRは10サイクルであり、二次PCRは25サイクルである。
高忠実度酵素の試験
エラーを最小限に抑えるために、より高い忠実度を有する酵素を用いることができる。アッセイは、Taqポリメラーゼを用いて最適化した。AccuprimeおよびTaq高忠実度の使用を検証するために、Taqポリメラーゼ、Accuprime、またはTaq高忠実度を用いて、プライマーのプールでcDNAを増幅した。次に、各増幅物質を、34種のVプライマーのそれぞれおよび1種のCプライマーを用いた34件のリアルタイムPCRの鋳型として使用した。鋳型の相対量を定量した。Accuprime、Taq高忠実度、およびTaqにおける各鋳型の濃度間で高い相関(r2＞0.95)が認められ、これらの高忠実度酵素の使用が検証された。
増幅条件の検証
cDNAバックグラウンドのない標準鋳型においてプライマーのプールを用いて、最適化を行った。目的は、cDNA混合物においてこれらの結果の確証を得ることであった。再現性を示すために、2つ組でcDNAを増幅するためのオリゴのプールを使用した。2件の増幅のそれぞれにおいて、34種の産物のそれぞれを定量した。図5に示すように、再現性は良好であった。
図5では、プールしたTCRβプライマーおよびCプライマー、ならびに鋳型としての1つのcDNA試料を用いて、2件の一次PCR反応を行った。34種のVプライマーのそれぞれ(および1種のCプライマー)で増幅可能である鋳型の増幅物質のそれぞれの相対存在量を、リアルタイムPCRを用いて評価した。2つの増幅産物のそれぞれを鋳型として用いて、各反応においてCプライマーおよびVプライマーのうちの1つを使用して、34件の異なるリアルタイムPCR反応を行った。リアルタイムPCRによって測定された相対存在量は、2つの試料間ですべてのVプライマーを用いて再現性が高く、多重増幅の再現性が高いことが示された。1つ目の多重増幅産物を鋳型として使用するリアルタイムPCR増幅のそれぞれのサイクル数(Ct値)をX軸に示し、2つ目の多重増幅産物を鋳型として使用するリアルタイムPCR増幅のそれぞれのサイクル数(Ct値)をY軸に示す。
増幅の偏りを評価するために、同様の技法を使用することができる。オリゴのプールを用いて、cDNAを鋳型として用いて増幅することができる。次に、(Cセグメントプライマーと共に)34種の異なるプライマーのそれぞれによって増幅された鋳型の量を、リアルタイムPCRを用いて定量することができ、その量を、cDNAから同じプライマーを用いて増幅された量と比較することができる。しかしながら、増幅産物とcDNA中の内部配列間の相対存在量が同じであったとしても、クロストークが存在するために、この読み出しを用いて大きな差が検出され得る。この問題を緩和するために、Cセグメントプライマーと共に用いた場合に、Vセグメントプライマーの内部の配列を増幅し得る12種のオリゴを設計した。最適化が適切に行われたのであれば、これらの内部配列の濃度は、cDNAと増幅産物の間でほとんど変化しないはずである。これを図6に示す。
図6では、プールしたTCRβプライマーおよびCプライマーを用いて、cDNA試料を多重増幅の鋳型として使用した。Cプライマー、および最初の増幅に用いられたVプライマーの下流にあるプライマー(内部プライマーと称される)、ならびに鋳型としての多重増幅物質からの物質を使用して、異なる配列の相対存在量を評価した。同様にリアルタイムPCRを用いて、cDNA中のこれらと同じ配列の相対存在量を評価した。多重増幅に大きなが偏りがあるのであれば、増幅物質における相対存在量はcDNAにおける相対存在量と非常に異なり得る。図6に見られ得るように、高い相関が認められ、多重増幅における最小の増幅の偏りが実証された。内部プライマー、ならびに鋳型としてのcDNAおよび多重増幅産物を用いたリアルタイムPCR増幅のそれぞれのサイクル数(Ct値)を、それぞれX軸およびY軸に示す。
TCRβの配列決定
プールしたオリゴ、および鋳型としての1つのcDNA試料を用いた6件の多重増幅を使用した。各増幅のうち3件はAccuprimeを用いて行い、別の3件は高忠実度Taqを用いて行った。各酵素を用いた2件の増幅は、初期RNA 500 ngに相当するcDNAを使用し、各酵素を用いた1件の増幅は10分の1のcDNAを使用した。6件の増幅のそれぞれについて、一次および二次PCRを行い、Illuminaプラットフォームおよび上記のスキームを用いて増幅物質を配列決定した。両側から100 bp配列を得た。下記と同じ概念を用いて、データの一次解析を行った。
アッセイの再現性を評価するために、2つ組の実験においてクローン型レベルが一貫しているかどうかを判定した。図8A〜Cに示すように、同じ酵素および開始インプットcDNA量を使用した場合に、高い相関が得られる(2つの比較はそれぞれr2＝0.944を有した)。異なる酵素を用いた場合には、相関は悪化し(4つの可能な組み合わせの相関中央値r2＝0.931)、より少量のインプットcDNA(わずか50 ng RNAに相当する)を増幅するために2つの酵素を使用した場合には、相関はわずかに減少した(r2＝0.924)。
図8では、各試料中の同じ配列を同定した。配列決定エラーに対処するために、配列の一次解析の項に記載した一般的アプローチを用いて、いくつかのクローン型を合体させてより大きなクローン型を形成した。次に、各試料においてクローン型のカウントを計算した。クローン型を1つの試料中に存在するが他の試料中には存在しない別のクローン型と合体させるアルゴリズムに起因する可能性が高いが、クローン型の一部(図中に表示せず)は、1つの試料中に存在するが、別の試料中には存在しなかった。次に、その試料に対して得られた読み取りの総数で除したそのカウント数として、試料におけるクローン型の頻度を計算する。例えば、1,000,000件の読み取りを有する試料において、クローン型に関して1,000カウントが認められる場合、その頻度は0.1%と計算される。図8Aは、Accuprime、およびインプット鋳型としての500 ngのRNAに相当するcDNAを用いた2つ組の2種類の試料における、各クローン型の頻度のlog10を示す。これら2つ組の間の相関(r2)は0.944である。図8Bは、インプット鋳型としての500 ngのRNAに相当するcDNA、およびAccuprime(X軸)または高忠実度Taq(Y軸)を用いた、各クローン型の頻度のlog10を示す。相関中央値r2＝0.931を有する、この組み合わせでの4つの比較が存在する。図に示した1つはr2＝0.929を有する。図8Cは、インプット鋳型としての50 ngのRNAに相当するcDNA、およびAccuprime(X軸)または高忠実度Taq(Y軸)を用いた、各クローン型の頻度のlog10を示す。認められた相関はr2＝0.924である。
これらの結果はアッセイの再現性を検証し、異なる酵素を比較した場合に再現性が悪化するという予想と一致する。より少ない量のインプットcDNAを使用した場合にさらなる低下が認められ、インプット材料における代表が少ないほど、血液中の異なるクローン型の相対存在量の反映における精度がより悪くなることが示される。加えて、相関の低下のいくらかは、より少ないインプットに必要とされる付加的な増幅(10倍)に起因する可能性があるが、増幅の再現性が高いという証拠を考えると、これは軽微な影響である可能性が高い。
実施例4
IgHレパートリー解析：増幅および配列決定の戦略
TCRβとIgHにおけるCDR3の増幅の1つの違いは、IgHにおける体細胞突然変異の可能性のために、IgHの調査において、各V配列に対して複数のプライマーを使用する点である。各Vセグメントに対して3つの異なるプライマーを使用する。プライマーは、最も高い体細胞突然変異を有するCDRを回避する領域に存在する。3つの異なる増幅反応を行う。各反応において、各Vセグメントは3つのプライマーのうちの1つによって増幅され、すべて同じCセグメントプライマーを使用する。各反応におけるプライマーは、V-D結合部からおよそ同じ距離である。Vセグメントの最後の位置を0とすると、プライマーの第1セット(A)はおよそ-255の位置に3'末端を有し、第2セット(B)はおよそ-160の位置に3'末端を有し、第3セット(C)はおよそ-30の位置に3'末端を有する。いくつかのVセグメント間の相同性を考えると、全48種のVセグメントおよび多くの公知のアレル(国際免疫遺伝学情報システムhttp://imgt.cines.fr/によって定義される)を増幅するために、A、B、およびCフレームそれぞれにおいて23種、33種、および32種のプライマーが必要である。プライマーのリストを表2、3、および4に示す。
（表２）フレームAプライマー
Figure 0005798926
（表３）フレームBのプライマー
Figure 0005798926
（表４）フレームCのプライマー
Figure 0005798926
Cセグメント側では、それらの間で1塩基の違いを有する2つの配列
Figure 0005798926
が、IgGの4つのセグメントおよび複数の公知のアレルを網羅する。TCRβ遺伝子の2段階のPCRと類似したスキームを用いる。V側では、各Vプライマー上の同じ5' 14 bpオーバーハングを使用する。二次PCRにおいて、V側では同じRead2-タグX-P7プライマーを使用する。C側では、TCRβ増幅で使用した戦略と類似の戦略を用いて、異なるIgGセグメントおよびそれらの公知のアレル間の変異を回避する。プライマー配列
Figure 0005798926
は、図4に示す通り、3〜19位および21〜28位に由来し、異なるIgGアレルの少なくとも1つにおいて異なる塩基を有する20位を飛ばしたCセグメントの配列、ならびにクラスターの形成に用いられ得るP5の配列を含む。
3つのフレームにおけるプライマーはすべて、cDNAから単一バンドを増幅するのに成功した。同様に、一次PCRにおいてプライマーの3つのプールを使用する一次および二次PCR戦略も、図7に示すように単一バンドを示した。
図7では、3つのフレームに相当するプライマーの3つのプールを使用する多重PCRを、cDNAを鋳型として用いて行った。一次および二次PCRの後、産物をアガロースゲル上で泳動した。Aは、フレームAのオリゴのプールによるPCR産物を示す。同様に、BおよびCはプールBおよびCの産物を示す。Mはマーカーレーンである。全3種のプールを用いて、適切なサイズを有する単一バンドが得られた。
最終的には、単一試料に由来する3つの異なる反応物を次に等モル比で混合し、配列決定に供する。配列決定は、2つのIlluminaプライマーを用いて両方向から行う。両側から100 bpを配列決定する。D＋Jセグメントを包含する最大の生殖系列配列は、TCRよりもBCRで〜30 bp長い。したがって、結合部におけるヌクレオチドの除去および付加(NヌクレオチドおよびPヌクレオチド)の最終結果によって、IgHおよびTCRβに関して同様の分布が生じるとすると、Cセグメント後の平均して90 bp、および最大で120 bpの配列が、Vセグメントの3'に到達するのに十分であると予測される。したがってほとんどの場合、Cプライマーからの配列はVセグメントに到達するのに十分である。Illuminaアダプターの1つからの配列決定により、用いられたVセグメントが同定され、かつVセグメント内の体細胞超突然変異が同定されるはずである。配列が3つの増幅反応のいずれに由来するかに応じて、Vセグメントの異なる部分が配列決定される。異なる増幅反応に由来する異なる読み取りから、BCRの完全配列を整列させることができる。完全なCDR3配列を示す一方の末端からの配列決定反応により、異なる読み取りの正確な整列化は著しく容易になる。
実施例5
ヒト配列データの一次解析
各患者試料について、それぞれが100 bpの対をなす末端読み取りであるおよそ100万件の高品質読み取りが得られる。これら100万件の読み取りは、100万個の細胞またはそれ以上から得られた100万個またはそれ以上のRNA分子に由来して、独立していると想定される。低品質の読み取りは排除する。
〜1%のエラー率が予測される。エラーは、逆転写酵素、PCR中または配列決定中の増幅のいずれかに起因し得る。PCR段階にはエラー防止酵素を使用し、よってPCRエラー率は0.1%未満であるため、配列決定エラー(〜1%)がエラーの主な原因である。PCRおよび逆転写酵素エラーの関連性は、障害がある状況で大きく拡大する。障害は、例えば、100,000個を超えるRNA分子から開始するか、または異なる分子操作段階の1つが、分子100,000個の有効な集団を作製するのに非効率的である場合に起こり得る。これらの状況では、PCRまたは逆転写酵素のために起こった同じエラーが多くのクラスター中に出現し得る。
TCRβおよびIgHについてデータを得る。IgHにおける体細胞超突然変異および増幅戦略における違いを考えると、TCRβとIgHの一次解析はいくらか異なる。
TCRβ
一方の末端において、配列決定用のC'セグメントプライマーを使用する。配列決定されるVセグメントの長さは、付加されたN＋Pヌクレオチドの長さに依存する。付加されるヌクレオチドの平均数を考えると、約40ヌクレオチドのVセグメントが配列決定される。他方の末端では、Illumina配列決定プライマーP7を使用する。20 bpのVプライマー配列、およびそれに続く80 bpのVセグメント配列が得られる。
読み取りを(異なる公知のアレルを含む)生殖系列Vセグメントと整列させて、各読み取りに対してVセグメントを割り当てる。実質的にいずれのVセグメントとも一致しない読み取りは、さらなる解析読み取りから廃棄する。実質的な一致とは、5つ以下のエラーが存在するものと定義する。1%のランダムなエラー率を考えると、このスキームではエラーのために＜1%の読み取りが廃棄されることが予測される。残りの配列を、最も高い一致を有するVセグメントに割り当てる。同じファミリーのVセグメントを増幅するプライマーは、それらの間で1個または2、3個の塩基の違いを有して高度に関連している場合が多い。これらのプライマーは「クロストーク」して、他のファミリーメンバーを増幅し得る。したがって、配列決定の読み取りの始め(プライマー)は、読み取りの残りの部分が属するVセグメントとは異なるVセグメントに対するものであり得る。このような場合は許容され、これはエラーとして数えない。
Vセグメントの末端からCセグメントの始めまでの配列を評価する。この配列は、DJ領域と称される。この配列は平均60塩基であり、ごく一部では90塩基ほどの大きさである。Cセグメントに近接した末端は保存されている可能性が高いため、ほとんどの場合にJセグメントを割り当てることができる可能性が高い。一方、Dセグメントのサイズが小さいこと(15〜16 bp)、ならびにその末端の両方において起こるトリミングおよび付加を考えると、Dセグメントは割り当てが難しいと考えられる。Jセグメントが割り当てられた場合、DおよびCセグメントを予測することが可能であることに留意すべきである。そのセグメントの割り当て後、DJ領域の配列を明確にする。2つの理由から、エラーによりこの解析は、CおよびVセグメントの整列化に関するよりも複雑化する。第一に、DJ整列化におけるエラーは、整列させる2つの読み取りのどちらにも起こり得、データベース配列に対する単一の読み取りの整列化のエラー率が効率的に倍増する。
加えて、CまたはV整列化における1塩基の違いは容易にエラーに起因し得(これまでに記載されていないV生殖系列アレルの稀な場合を除く)、Vセグメントに対して1塩基の違いを有する配列は、そのVセグメントの配列を有するように割り当てられ得る。一方、2つのDJ領域読み取り間の1塩基の違いは、エラーによるものであるのか、または2つのクローン型間の真の配列の違いによるものなのかは明らかではない。2つの可能性が存在する：読み取りは同じクローン型に属するがエラーを有する、または2つもしくはそれ以上の異なるクローン型が存在する。クローン型は、それらが頻繁に観察される、またはそれらがかなり多くの塩基において異なるという理由で、配列決定エラーによるそれらの出現の確率が低い場合に異なると指定される。
PCRエラーは、PCRの初期のサイクルで変異したいくつかの塩基において濃縮されることが予測される。配列決定エラーは、エラーが何らかの系統的バイアスを有する可能性が高いため、それが全くランダムであるにしても多くの塩基に分布すると予測される。いくつかの塩基はより高い割合、およそ5%(平均の5倍)で配列決定エラーを有すると想定される。これらの仮定を前提とすると、配列決定エラーはエラーの主要な型となる。PCRエラーと、高度に関連したクローン型の発生を識別することは、解析において役割を果たす。2つまたはそれ以上の高度に関連したクローン型が存在することを決定することの生物学的意義を踏まえて、そのような判定の作成に対して保守的なアプローチをとる。2つ以上のクローン型が存在することを高信頼度(およそ99.9%)で確実にするために、十分な数のマイナーなクローン型の検出を考慮する。100コピー/1,000,000で存在するクローン型の例では、マイナーな変種はそれに関して14回またはそれ以上検出されて、独立したクローン型として指定される。同様に、1,000コピー/1,000,000で存在するクローン型に関しては、マイナーな変種は74回またはそれ以上検出されて、独立したクローン型として指定され得る。このアルゴリズムは、配列決定された各塩基と共に得られる塩基の品質スコアを用いることにより、強化され得る。品質スコアとエラー率の関係が上記で検証されたならば、全塩基に対して保守的な5%エラー率を使用する代わりに、品質スコアを用いて、独立したクローン型と見なすために存在が必要とされる読み取りの数を決定することができる。全読み取りにおける特定の塩基の品質スコア中央値を用いることができ、またはより厳密には、各読み取りにおける特定の塩基の品質スコアを考えてエラーである可能性を計算することができ、次にその確率を組み合わせて(独立を仮定して)、その塩基に対して配列決定エラーの起こり得る数を推定することができる。結果として、異なる品質スコアを有する異なる塩基に対して、配列決定エラーの仮定を拒絶する異なる閾値が存在する。例えば、1,000コピー/1,000,000で存在するクローン型に関しては、エラーの確率が0.01および0.05であるとすると、マイナーな変種はそれぞれ22回および74回検出された場合に、独立と指定される。
エラーによるとするには高頻度で出現するクローン型を、異なるまたは独立として指定した後、かなり多くの塩基での違いに起因して、クローン型を独立として指定することを可能にする基準を考慮する。0.1%未満の割合で、2つの読み取りはそれらの間で60 bp中に5個以上のエラーを有すると予測される。したがって、これを、2つのクローンを独立または異なると見なすためのカットオフとして使用する。使用するアルゴリズムは以下の通りである。最も大きなカウント数を有するクローン型(クローン型1)に注目し、同じVセグメントを有し、かつDJ領域においてそれと4個以下の塩基の違いを有する任意の他のクローン型が存在するかどうかを判定する。そのようなクローン型が2つ以上同定された場合には、これらのクローン型の最大のものを初めに評価する。上記の規則を適用して、クローン型を独立したクローン型として指定するか、または主要なクローン型と同じとして指定するかを決定する。それが独立したクローン型として指定されない場合には、次いでそれがクローン型1の配列を有するようにそれを数える。この課題の最後に、全クローン型の配列およびカウントを得る。このアプローチにより、クローン型が独立していない場合に独立として指定されないことが確実にされる。しかしながら、いくつかの真に独立したクローン型が、同じであると誤分類される場合がある(主要なクローン型と少数の違いを有して、低頻度である)。この種のエラーは、2つのクローン型が独立していない場合に独立と見なされる場合よりも被害ははるかに少ない。
IgH
Cセグメント末端の配列決定には、Illuminaプライマーを使用する。配列決定されるべき最初の塩基はCセグメントプライマーであり、Cセグメントの0〜2塩基がそれに続き、次にDJ領域が続く。プライマー配列は、特定の読み取りがどのアイソタイプに属するかを同定する。すべてまたは大部分のDJ配列は、Cセグメント側からの読み取りを通して得られ得る。DJ領域は平均80 bpであると予測される。したがって、100 bpの読み取りは、Cセグメントプライマーおよび平均DJ領域を包含する。DJ領域によっては120 bpほどの大きさである場合もあり、それらの完全な読み取りは、(同じIgH中に2つのDセグメントが認められる場合を抜きにして)V領域からの配列決定データを含み得る。
Cセグメントから得られたDJ領域の配列を最初に考慮する。特有の各配列の数を数える。TCRβに関して論じたように、関連配列のいくつかはおそらくは同じクローン型に由来するが、いくつかの配列決定およびPCRエラーを有する。2つのクローン型を異なると指定するためには、その違いがPCRエラーを通して生じた可能性が非常に低いかどうかを判定する。マイナーなクローン型の独立した観察の最低限数、または2つのクローン型間の違いの最低限数を必要とする、上記と同じスキームを使用する。＜0.1%のクローン型が異なると誤分類されることを確実にするために、TCRβに関して記載したのと同じ規則を使用する。
Illuminaプライマーを用いて、V領域からの配列決定を行う。各Vセグメントに対して3つの異なるプライマーが存在する。プライマーは、およそ-200、およそ-100、およびおよそ-30に位置する。配列決定される最初の塩基はVプライマー配列であり、Vセグメント塩基のさらなる部分がそれに続く。特定のVセグメントの3つのプライミングフレームのうちの1つに対して、特定の読み取りが割り当てられる。プライマーは変化し得ない公知の配列を有するため、プライマー配列を調べることによって最初に割り当てを行う。同じファミリーのプライマーは、場合により、同じファミリー内の高度に関連した配列を増幅するいくらかの「クロストーク」を有し得る。プライマーを用いて、ファミリーを割り当てる。配列決定読み取りのものと最も類似しているそのファミリーのV配列を同定することにより、ファミリー内のセグメント間の特定のVセグメントを決定する。IgH中のVセグメントは、抗体親和性成熟過程において体細胞突然変異を有することができ、したがってTCRβよりも高い比率の生殖系列配列との違いが許容される。VDJ領域に26個以上の突然変異(〜10%)を有する抗体が認められた。読み取りがこれに対して＞85%の相同性を有する限り、最も近い配列を有するVセグメントのフレームワークに読み取りを割り当てる。関連クローン型を、上記と同じスキームを用いて独立であることについて評価する。具体的には、エラーでなく体細胞突然変異に起因して異なると見なされるべきクローン型については、クローン型が異ならない場合に、0.1%未満のクローン型が異なると誤分類されることを確実にするために、それらは十分に頻出するか、またはそれらの間で十分な変化を有するかのいずれかが必要である。
(VD結合部に最も近い)3番目のフレームワークを有すると決定される読み取りに関しては、対をなす末端読み取り間の重複配列を決定する。重複を決定するために、Vセグメントと整列しない塩基を第1読み取りの相補体と整列させる。3番目のフレームワークのプライマーは、結合部から〜30 bp離れている。したがって、Vが無傷である場合には、およそ50 bpの配列を用いてVD結合部に到達することができ(20 bpプライマー＋30 bp)、100 bpの読み取りにより結合部後の50 bpを読むことが可能になる。V中のいくつかの塩基の欠失により、結合部後のさらに長い読み取りが可能になるため、これはVD結合部後に読まれる塩基の最小予測数である。最も長いDJ領域に関してさえも、対をなす読み取りからの配列間に10 bpの重複が存在すると予測される。最も長いDJ領域は120 bpであると予測され、そのうちの80 bpはCセグメントから読まれると予測され、50 bpはV領域の逆方向から読まれると予測され、対をなす読み取り間に10 bpの重複がもたらされる。
Cプライマーから同じ配列を読むが、同じVセグメントの異なるフレームワークを有するクローン型は、同じクローン型における統合(consolidation)の候補となる。Vセグメントの異なるフレームワークから得られた配列間に重複が存在する場合には、そのクローン型が独立しているのか、または独立していないのかの判定を、上記と同じ規則を用いて行う。
上記解析の結果として、各クローン型の読み取りの数を数えることができる。体細胞突然変異によってのみ互いに異なる、同じファミリーに由来するクローン型が同定される。これらの体細胞突然変異は、1つのみのフレーム、2つ以上のフレームから読まれるVセグメント中の、またはDJ領域内の配列に限定され得る。
実施例6
SLE患者試料におけるTCRおよびIgHレパートリー解析
第一に、患者において疾患活動性と相関するクローン型が存在するかどうかを試験する。第二に、疾患と相関するクローン型と相関しないクローン型を識別する一連の配列特徴および/または細胞表面マーカーを明らかにする。第三に、短期(例えば、3カ月)転帰との相関など、クローン型解析が臨床的に有用な情報を提供する程度を測定する。
1. 疾患と相関するクローン型の存在
2つの主要な課題が存在する：相関クローン型を同定すること、およびそれらのレベルから疾患活動性を測定すること。臨床設定において、各患者について2段階でこれらの課題を行うことができる：
1) 較正試験を行い、特定の患者について相関クローン型の独自性を決定することができる。これは、相関クローン型レベルが最高レベルに達し得る症状発現のピーク時の各患者について、IgHおよびTCRβ RNA(または単一細胞に由来する連結されたTCRα-TCRβ配列)を配列決定することにより行うことができる。
2) モニタリング試験を行い、較正試験後の時点で相関クローン型のレベルを測定することができる。これは、IgHおよびTCRβ RNAを配列決定し、同じ患者の較正試料において同定された特異的相関クローン型のレベルを測定することにより行うことができる。相関クローン型のレベルを用いて、これらの時点の疾患活動性を計算する。
上記のような増幅、配列決定、および一次解析開発を使用して、患者試料を評価する。具体的には、1年間の経過観察期間およびこの期間中の連続的な血液試料を有する1組の全身性エリテマトーデス(SLE)患者を評価する。これらの患者は、1年間にわたり3カ月ごとにJohns Hopkins Medical SchoolのDr. Michele Petriによる診察を受け、全身性エリテマトーデス疾患活動性指標(SLEDAI)、医師による全般的評価(PGA)、ならびにC3(補体3)および抗ds DNAレベルを含む複数の臨床検査を含む疾患活動性の臨床的尺度が、全患者のすべての来診について利用可能である。患者に投与される薬物には、プレドニゾン、プラキニル、NSAID、NSAIDType、アセチルサリチル酸(ASA)用量、プラビックス、利尿薬、ACE阻害薬またはアンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)、Caチャネル遮断薬、Triam、およびsolumedrolが含まれる。経過観察中に少なくとも1度、SLEDAIでの3点の変化またはPGAでの1点の変化によって規定される疾患活動性の顕著な変化を有した患者を調べる。全体として、これらの基準に当てはまる患者181名(全部で815例の血液試料を伴う)が存在する。これらの全血液試料に由来するRNAを、上記のプライマーを用いた多重PCRに供して、IgHおよびTCRβ中のCDR3を包含する配列を増幅する。全増幅物質を(100万件の読み取りまで)配列決定し、異なるクローン型の存在量を測定する。
臨床データ、配列決定を用いて、そのレベルが疾患活動性と相関するクローン型と相関しないクローン型を識別する特徴を同定する。次に、血液IgHおよびTCRβプロファイルを用いて疾患活動性を決定するアルゴリズムを開発する。
2. 相関クローン型の特徴の同定
疾患に関連するクローン型は疾患活動性が高い時点で増加すると予測される。しかしながら、疾患活動性が高い時点で濃縮されたすべてのクローン型が、必ずしも疾患と相関するわけではない。例えば、特定の患者では、疾患活動性が高い時点で濃縮されたクローン型が10種存在し得るが、5種のみが疾患と相関する。これらの関連クローン型を同定するために、疾患と明らかに相関するクローン型のサブセット、および疾患と明らかに相関しない別のセットを調べる。クローン型のこれら2つのクラスを識別する特徴を調べる。
この実験設計において、患者は全員、1年の経過観察中に疾患活動性の顕著な変化を少なくとも1回有する。各患者において疾患活動性のピーク時に得られたIgHおよびTCRクローン型を解析する。最も高いレベルを有するクローン型の中から、相関および非相関クローン型のセットを選択する。したがって、第1段階は、高レベルであるクローン型を明らかにすることである。解析に入れるクローン型を選択するための特定の基準は、クローン型の頻度順位とクローン型のレベル(100万個当たりのクローン型読み取りの数)の組み合わせ、およびクローン型が低頻度クローン型の分布に属さないという証拠を含む。
高度蔓延クローン型(HPC)と称される、各患者試料に由来するクローン型のこのセットをさらに解析する。これらクローン型のそれぞれのレベルと臨床的尺度との相関を評価する。SLEDAIスコアとクローン型レベルとの相関を計算する。各患者について、SLEDAIと各HPCのレベルとの相関を評価するために用いることができる調査点が4〜5つ存在する。得られたこれらの相関の分布を調べる。HPCの大部分はSLEDAIと低い相関を有することが予測される。高い相関の末端において、ランダムに生じると予測されるものを超えるものが存在するかどうかを調べる。例えば、4つおよび5つのデータ点を用いると、相関レベル(r2)の〜2.5%および〜0.6%が偶然に＞0.9となることが予測される。r2＞0.9を有するHPCがより高い比率であることにより、疾患と相関するクローン型の存在が示される。相関クローン型の数とランダム期待値との比較に加えて、ある患者によるSLEDAIスコアと別の患者による個々のHPCのレベルとの相関を算出する並べ替え解析を行う。この並べ替えから作成される相関の分布を、「バックグラウンド」相関として用いることができる。(その妥当性を確実にするために、異なる患者間のSLEDAI間に相関がほとんどないことを確認する)。例えばr2＞0.9といった高い相関の末端における過剰な相関により、疾患と相関するクローン型の存在が示される。相関クローン型のセットとして、最も高い相関クローン型を選択する。偶然に設定閾値よりも高い相関を有するHPCの数は公知であるため(ランダムの仮定を用いた計算によるか、または上記の並べ替え解析を通じて)、10%の誤発見率を有する、すなわち相関クローン型セットの10%が偶然に相関するような方法で、相関クローン型を規定するための閾値を設定することができる。SLEDAIスコアと相関をほとんど有さない1組のHPCを選択する。それらは非相関クローン型のセットとして役立つ。これら2組のクローン型をさらに解析して、それらを識別し得る特徴を同定することができる。次に新たな試料中でこれらの特徴を探して、これらの試料において疾患活動性と相関する可能性が高いクローン型を同定することができる。次いでこれらのクローン型の血液レベルを追跡して、疾患活動性を決定することができる。
疾患活動性が変化する前にクローン型レベルが変化し得るという前提から、1つの厄介な問題が生じる。したがって、SLEDAIと高度に相関するHPCのみを調べようと試みることにより、SLEDAIよりも早く変化する臨床的に有用なクローン型が排除され得るという可能性がある。改良SLEDAI(MSLEDAI)スコアと相関するクローン型の別のセットを選択する。MSLEDAIは、顕著な変化の直前の調査点を除いて、すべての調査点においてSLEDAIと同様である。そのようなデータ点では、MSLEDAIスコアはその点と次の調査点のSLEDAIスコア間の平均値である。SLEDAIの前に変化するクローン型は、SLEDAIよりもMSLEDAIとより良好な相関を示す可能性が高い。ランダムまたは並べ替えにより作成された期待値によって予測されるよりも過剰な、MSLEDAIと高い相関を有するHPCの数を計算することは、情報価値がある。
次に、相関クローン型と相関しないクローン型を識別する特徴を同定する。SLEDAIまたはMSLEDAIと相関するクローン型に関して厳密な様式で解析を行う。いずれの場合にも、目的は、特徴のこれらセットがこの分類を正確に反復して、次の試料セットにおいて相関クローン型の同定を可能にすることである。各患者は相関クローン型の特有のセットを有すると予測されるが、訓練研究を設計して、(高疾患活動性時の)較正試料から相関クローン型を予測する規則を作成する。2つの一般的な型のパラメータを試験することができる：配列決定データ自体から得られるもの、および追加実験を使用し得るもの。追加実験は、異なる細胞表面マーカーまたは他のマーカーを有する異なる細胞の評価を含み得る。以下は、調べられるパラメータのいくつかの型である：
1) 配列モチーフ：モチーフは、相関するクローン型と関連する特異的なVもしくはJ領域、組み合わせVJ、またはDJ領域内の短い配列であってよい。
2) クローン型のサイズ。
3) レベル：絶対レベル(100万個当たりの読み取りの数)または順位レベル。
4) 他のクローン型との類似性：サイレント変化(同じアミノ酸をコードするヌクレオチドの違い)を有するもの、または保存的アミノ酸変化を有するもののような、他の高度に関連したクローン型の存在。
5) BCRに関して、クローン型における体細胞突然変異のレベル、および/またはいくつかの生殖系列クローン型と体細胞突然変異によって異なる別個のクローン型の数。
これらのパラメータをそれぞれ、相関クローン型との関連について個々に調べる。0.05(多重試験に関して未修正)の閾値を設定して、相関クローン型の予測に寄与する可能性が低い因子を排除する。多重パラメータであるため、多くの試験を行って、偶然に複数の正の結果が生じる。しかしながら、この段階の主要目的は、パラメータにフィルターをかけてより小さなセットにすることである。次に正のパラメータのセットを用いて、2組のクローン型を分類するためのアルゴリズムを作成する。2組のクローン型を分類するために異なるパラメータを用いた機械学習アルゴリズムを使用する。過剰適合のリスクを最小限に抑えるために、交差検定技法を使用する。このアルゴリズムを用いて、各クローン型は、それが相関クローン型である可能性に相当するスコアを得る。次に、それよりも上に相関的として、およびそれよりも下に非相関的としてクローン型を分類するための閾値を設定する。交差検定技法により、分類の精度を推定することができる；例えば、クローン型を同等の群に入れ、1つの群を除いたすべてのクローン型をアルゴリズムに用いる。次に最終群(試験群)中のクローン型を、残りのクローン型を用いて得られたアルゴリズムを使用して分類する。これを群の数と同じ回数繰り返し、各繰り返しにおいて、1つを除くすべての群を訓練に使用し、1つの群を分類する。異なる繰り返しにおける異なる分類の平均精度から、アルゴリズムの精度を推定することができる。これらすべての繰り返しにおいて、厳密なアルゴリズムはわずかに異なることに留意すべきである。分類の精度は、最終的なアルゴリズムではなく、1つを除くすべてのクローン型からの訓練データを用いて作成された一連の関連アルゴリズムに関するものであるため、分類の精度は推定である。
最終的に、2つの異なる相関クローン型セットにおいて訓練された2つのアルゴリズムが作成される：一方はSLEDAIとの相関であり、他方はMSLEDAIとの相関である。たとえ訓練セット中のクローン型が異なっているとしても、これらのクローン型が実際に2つの異なる集団に由来するかどうかに応じて、結果として得られるアルゴリズムは非常に異なる場合もあれば、そうでない場合もある。アルゴリズムを比較する。加えて、これらのアルゴリズムを用いて、最初に訓練セット中に存在しなかった相関クローン型を同定する。2つのアルゴリズムにおいて同定されたクローン型を比較するが、2つの訓練セット中の最初のクローン型が同じ集団に由来したのであれば、同定されたクローン型は非常に類似している可能性が高い。アルゴリズムの結果が非常に類似していた場合を除き、両方のアルゴリズムを実行して、ループス疾患活動性を測定するための相関クローン型を同定する。
疾患と相関するクローン型を同定する際の配列決定の力に、他の実験アプローチを付加することができる。相関クローン型は、いくつかの細胞表面マーカーまたは他のマーカーを有する細胞内に濃縮され得る。例えば、高レベルのCD27を有するB細胞が活動性ループス患者において知られており、よって細胞のCD27集団中に相関クローン型が濃縮され得る可能性がある。これが真実であると裏付けられれば、高レベルのCD27を有する細胞の濃縮を行うことにより、相関クローン型の予測を改善することができる。具体的には、血液試料中の全B細胞に由来する、およびCD27が高いB細胞に由来するIgH配列で配列決定反応を行うことができる。相関クローン型は、全血液試料中よりも、CD27が高い集団中により高頻度で存在すると予測される。
3. ループス疾患活動性を決定するためのIgHおよびTCRβプロファイルの使用
上記の項では、相関クローン型の特徴を同定するためのクローン型に基づく解析を記載した。加えて、その解析では、全HPCの一部のみを用いて、クローン型を相関的または非相関的として明らかに指定した。この項では、AutoImm(AI)スコアと称される疾患活動性の尺度を計算することを目的とした、患者レベルでの解析を記載する。上記の項を通して開発されたアルゴリズムを適用して、全HPCの中から相関クローン型を同定する。これらの相関HPCのレベルを測定する。相関クローン型のレベルを、TCRクローン型の総数に対して、および疾患と相関しないと予測されるHPCに対して正規化することができる。異なる時点におけるこれらの相関クローン型のレベルを用いて、これらの異なる時点のAIスコアを計算する。
2つ以上の相関クローン型を有する患者では、これらの異なるクローン型のレベルに関する情報を組み合わせる。加えて、IgHおよびTCRβクローン型からのデータを組み込む。組み合わせを作成するために異なるアルゴリズムを試みる。例えば、相関クローン型レベルの平均値、中央値、合計、および最も高い相関クローン型レベルを検討する。クローン型レベルは、その単純なリニア読み取りカウント(linear read count)、その対数、またはいくつかの他の換算であってよい。それは潜在的に、相関クローン型と非相関クローン型の違いであってよい。さらに、荷重平均の方法を使用することもできる。荷重は、クローン型が相関している可能性に基づき得る。
どのモデルが最適であるかを評価するために、すべてのモデルを評価して、AIスコアとSLEDAIスコアとの間で最も高い相関を生じるものを同定する。この解析のために、全患者による全調査点から得られた全データにわたり、SLEDAIスコアとAIスコアの相関を行う。過剰適合の程度を推定および改善するために、交差検定技法を使用する。測定された相関のレベルは、AIスコアとSLEDAIスコアの「横断的」関係を反映する。SLEDAIに加えて、C3および抗ds DNA抗体レベル、ならびに腎臓徴候を有する患者については尿タンパク/血清クレアチニン、および血清学的障害を有する患者については血球数のような、他の臨床的尺度との相関を調べる。相関は、患者の高疾患活動性および低疾患活動性への分類に起因してよく、必ずしも患者内でAIがSLEDAIスコアと相関していることの反映とは限らない。これを実証するために、「縦断的」評価を行う。
4. 縦断的解析
縦断的解析では、2つの一般的疑問を評価する：ある調査点のAIスコアは同時点の疾患活動性を予測するか、およびある調査点のAIスコアは、例えば3カ月後の次の調査点といった、後の時点の疾患活動性を予測するか。
同じ調査点におけるAIスコアとSLEDAIスコアの関係を2つの方法で評価する。最初に各患者においてAIとSLEDAIとの相関を算出し、次に患者相関レベル平均値および中央値を計算する。上記の横断的解析で認められた相関が、高疾患活動性患者と低疾患活動性患者の分類に起因し、個々の患者内の疾患活動性の変化に起因しないのであれば、個々の患者における縦断的相関は低い可能性がある。患者相関レベル中央値が高いことにより、AIが、個々の患者レベルでSLEDAIスコアを反映することが示唆される。AIスコアとSLEDAIスコアとの相関に加えて、AIと、C3および抗ds DNA抗体レベル、ならびに腎臓徴候を有する患者については尿タンパク/血清クレアチニン、および血清学的障害を有する患者については血球数のような、他の関連尺度との相関を評価する。
AIスコアが個々の患者において疾患活動性変化を測定する能力を実証するための別の方法は、同じ患者における高疾患活動性と低疾患活動性の状態の識別におけるその精度を測定することによる。181名の患者それぞれについて、SLEDAIが最高レベルである点(高疾患活動性点に換えてHDAPと称される)および最低レベルである点(低疾患活動性点に換えてLDAPと称される)の2つの調査点を選択する。全HDAPのAIの分布と全LDAPのAIの分布を比較し、それらが異なるp値を計算する。加えて、各患者においてHDAPにおけるAIがLDAPよりも高い頻度を評価する。個々の患者においてAIが疾患活動性と共に変化しない場合には、わずか50%の割合で、HDAPにおけるAIがLDAPにおけるAIよりも高いことが予測される。HDAPにおけるAIがLDAPにおけるAIよりも有意な違い(すなわち、起こり得るAIの変動を上回る)で高い割合を測定する、別の解析を行う。AIの変動を測定するために、全患者による全調査点を使用し、SLEDAI値の異なる瓶におけるAIの標準偏差(および相対標準偏差)を計算することができる。これにより全患者にわたる相対標準偏差(AI-RSDall)がもたらされるが、この値はSLEDAIに依存する場合もあれば、そうでない場合もある(すなわち、AI-RSDallは異なるSLEDAI値において異なり得る)。HDAPにおけるAIが、AI-RSDallの特定数(例えば、2)の差をつけて、LDAPにおけるAIよりも高い患者の割合を計算することができる。何名かの患者において計算されたAIがSLEDAスコアから予測されるよりも一貫して高い(または低い)という、いくらかの系統的バイアスが存在し得る。したがって、AI-RSDallは、患者内のAIの固有の変動と、類似のSLEDAIを有する患者に関するAIの系統的な違いの組み合わせである。AIの固有の変動は、患者内の類似のSLEDAI値(＜2点の差)を有する調査点間でAIスコアの標準偏差(および相対標準偏差)を算出することにより、患者内で計算することができる。相対標準偏差の全患者間の中央値を計算することができる(AI-RSDpt-med)。次に、HDAPにおけるAIが、AI-RSDpt-medの特定数(例えば、2)の差をつけて、LDAPにおけるAIよりも高い患者の割合を評価することができる。
AIが実際に個々の患者内でSLEDAIと共に変動することが実証された後、AIが3カ月後の次の調査点におけるSLEDAIを予測し得るかどうかを評価する。そのことを評価するために、時点0のAIスコアと＋3カ月の時点のSLEDAIとの間の相関レベルを定量することができる。患者レベルで相関を計算することができ、次に患者相関中央値を得ることができる。AIが近い将来の疾患活動性を予測する能力を実証するための別の方法は、3カ月先の疾患活動性の予測におけるAIの感度および特異度を評価することである。臨床的に、現在の管理で良好である患者とそうでない患者を識別することができる。特定の時点の患者の状態を2つのクラスのうちの1つに分類する：管理不良(PC)、3カ月中に高疾患活動性(SLEDAI＞6点)および/または再燃(SLEDAI増加3点)を有する患者が含まれる、ならびに管理良好(GC)、3カ月中に低または中程度疾患活動性(SLEDAI＜6)および/または疾患活動性の有意な軽減(SLEDAI減少3点)を有する患者が含まれる。次にAIの異なる閾値を用いて、分類感度を評価することができ、また特異度を得ることができる。3カ月早く患者の状態(PCまたはGC)を予測する際のAIの性能を記載するROC曲線を作成することができる。この試験によって得られた性能を、SLEDAI、抗ds DNA、およびC3レベルを含む標準的な臨床的尺度の性能と比較する。
AIが3カ月後のSLEDAIスコアの変化を予測する能力を評価するための解析もまた行う。全患者の全調査点からのデータを用いて、AIスコアとSLEDAIスコアの関係をプロットして、上記で論じたように「横断的」相関レベルを同定することができる。これにより、同じ調査点におけるSLEDAIとAIの関係が決まる。この関係は、AIスコアが与えられる場合にSLEDAIスコアの予測を可能にする(逆もまた同様)式と適合する。AIが再燃を予測するのであれば、ある調査点1におけるSLEDAIの変化に先行して、時点0でAIが変化する。したがって再燃が時点0と1の間で起こる場合、時点0のAIスコア(AImeasと称される)は、調査点0のSLEDAIが与えられる場合に予測されるスコア(AIexpと称される)よりも高い。一方、調査点0と調査点1の間で疾患活動性に変化がない場合には、時点0のAIスコアは、調査点0のSLEDAIが与えられる場合に予測されるスコアと非常に類似している。AImeasとAIexpの差をAImeasで除すことにより、相対的AI変化(Rel-AI-diff)を計算することができる。Rel-AI-diffの異なる閾値を用いて、3カ月後のSLEDAIの有意な変化を予測する上でのAIの感度および特異度を評価することができる。閾値は二方向性であってよく、特定の調査点におけるRel-AI-diffが特定閾値よりも高い場合には再燃が予測され、同様にそれが特定閾値の負数よりも低い場合には、SLEDAIの有意な減少が予測される。一方、調査点におけるRel-AI-diffが閾値とその負数の間にある場合には、疾患活動性の有意な変化は予測されない。Rel-AI-diffの多くの異なる閾値を用いて、感度と偽陽性の取引を示すROC曲線を作成することができる。SLEDAI、抗ds DNA、およびC3レベルを含む標準的な臨床的尺度を用いて、同様のROC曲線を作成することができる。
異なるSLEDAI値においてAIの変動が異なる場合には、上記の解析を精緻化する。上記の項では、AI-RSDallおよびAI-RSDpt-medの計算を記載し、それらが異なるSLEDAI値において変化するかどうかの評価について言及した。それらが変化する場合には、上記の通りにROC解析を行うことができるが、Rel-AI-diffの異なる閾値を用いる代わりに、AI-RSDallおよびAI-RSDpt-medの異なる閾値を使用する。この試験によって得られた性能と、SLEDAI、抗ds DNA、およびC3レベルを含む標準的な臨床的尺度の性能を比較する。
上記の解析では、時点0のAIスコアから時点1のSLEDAIを予測する試みを行う。時点0の絶対レベルに加えて、時点-1から0までのAIの変化は、時点1のSLEDAIの予測において情報価値がある可能性が高い。例えば、調査点-1においてX-1というAIスコアを有する患者がいて、時点0においてAIスコアが、X-1よりもかなり高い新たな値X0まで増加すると考えてみる。この患者は、AIが調査点-1および0においてX0で安定している患者よりも、時点1における再燃の可能性がより高い。AIの変化または速度のこの概念を取り入れて、改良AI(MAI)スコアを作成する。時点0のMAIを作成するには、時点-1および時点0のAIスコアが必要であり、よって患者ごとに1つのデータ点はそれに付随するMAIを有さない。MAIを得るために、AIの算出に速度を取り込むための特定の式を最適化する。この最適化は、MAIと3カ月後のSLEDAIとの相関の最大化によって行うことができる。交差検定設計を用いて、過剰適合の程度を評価および制御する。全試料のデータ点について相関を行うことができるだけでなく、患者レベルでも相関を行うことができ、全患者間の相関中央値を評価することができる。後者のアプローチにより、低すぎるまたは高すぎるAIスコアの系統的バイアスを有する何名かの患者の問題が改善される。MAIを用いて、AIについて言及したのと同じ型のROC解析を行い、3カ月後のSLEDAIを予測するその能力を評価することができる。まず、AIについて記載したのと同様に解析を行って、時点0のMAIが時点1のPC状態とGC状態を識別する能力を示すことができる。加えて、時点0と1の間の有意な疾患活動性変化(SLEDAI変化3点)を予測する時点0のMAIの能力を評価するために、AIについて記載したのと類似の解析を行うことができる。この後者の解析では、Rel-AI-diff、AI-RSDall、またはAI-RSDpt-medの異なる閾値を用いることができる。MAIの性能をAIの性能と比較して、速度因子の付加が有用であるかどうかを判定する。
記載した研究の1つの厄介な問題は、研究の経過観察期間中に異なる患者に対して治療の変更が行われることである。これは、疾患活動性の予測を複雑にする可能性が高い。例えば、時点0において同じAIスコアを有する患者が2名いて、それらの患者のうち一方が同時点で薬物を減量したと考えてみる。この患者が時点1で疾患活動性の上昇を有する可能性は、時点0で薬物を変更しなかった患者よりも高い可能性がある。これは、AIの性能の過小評価を招く可能性が高い。これを緩和する1つの方法は、顕著な薬物変更を伴う点をすべて研究から排除することである。別の方法は、患者が薬物を変更したかどうかを含めるようにAIスコアを修正し、薬物修正AIを作成することである。このようにして、2名の患者による上記の例において、薬物変更を伴う一方の患者はより高い薬物修正AIを有する。
5. 他の予測マーカーとの統合
疾患活動性マーカーの予測能を最大化することができる。したがって、他のマーカーと統合したTCR/BCRレパートリー情報の予測能を試験する。これらのマーカーには、抗ds DNAおよびC3レベルのような、診療所で用いられる標準的なマーカーが含まれる。これには、公表されている他のマーカーもまた含まれる。例えば一連のケモカインは、用いられる患者と同じ1組の患者を使用して、いくらかの予測能を有することが既に示されている。この一連のものにより、TCRおよびBCRレパートリーの予測能が増大するかどうかを評価する。第1段階は、AIスコアとさらなる尺度を統合して、拡大AI(EAI)スコアを作成することである。統合を行うための様々な方法を評価することができ、EAIと3カ月後のSLEDAIとの相関の最大化により、これを最適化することができる。交差検定設計を用いて、過剰適合の程度を評価および制御する。EAIを用いて、GCとPCを識別する、および疾患活動性の変化を予測するその能力によって、3カ月後の疾患活動性を予測する能力を評価する。疾患活動性および疾患活動性の変化の測定における性能を、上記のようにROC解析を通して表すことができる。
6. 検証
試験する変数の数は、試料数と比較して多い。これは、最初は有望であるが、後の研究において検証され得ない結果を伴う過剰適合に結びつき得る。過剰適合のある程度の限度を得るために、訓練において交差検定アプローチを用いる。しかしながら、独立した1組の試料における検証は後の研究に関与する。これはこの提唱の要素ではないが、この指標は臨床的に適用可能であり得る。上記で得られたデータを用いて、AI、MAI、またはEAIが検証されるかどうか、および関心対象の尺度を計算するための特定の方法を決定することができる。検証には1つの特定のアルゴリズムを使用する。加えて、1つまたは複数の特定の終点を規定する。3カ月後のGCとPCを識別する能力においてAIの感度および特異度を評価して、AIが疾患活動性を予測する能力を評価することができる。別の例では、特定のRel-AI-diff閾値を用いて、3カ月内の有意な疾患活動性変化を予測するAIの感度および特異度を評価することができる。
実施例7
薬物治療に対するSLE患者の反応の測定
提供する本発明の方法を用いて、薬物治療に対するSLE患者の反応を測定する。重篤な副作用を伴う高価な薬物を投与されているSLE患者がその薬物に反応しているかどうかの判定は、患者ケアにおいて、およびまたそのようなケアの管理を費用効率的にする上で役割を果たす。疾患活動性の多くの臨床的指標は治療に対して、不正確に、かつ最長数カ月という時間差の後に反応する。この期間に、疾患は進行する可能性があり、副作用によって治療に複雑さが加わる可能性がある。薬物反応を即座に理解することにより、患者はより効果的な治療により迅速に切り替えることができるようになる。
本実施例において、ループスと以前に診断された35歳のアフリカ系アメリカ人女性は、かかりつけのリウマチ専門医を受診する。患者の疾患状態は、C3、抗ds DNA抗体レベル、血球数、および検尿を含む臨床検査に加えて、総合的臨床的評価を通して、3カ月ごとに評価を受ける。ある来診時に、患者は皮膚病変および疲労を訴え、検尿からタンパク尿および/または細胞性円柱の証拠が示される。リウマチ専門医はこの患者に、腎臓の炎症状態を評価するために腎生検を受けるよう腎臓専門医を紹介し、腎機能の障害の程度を評価するために、血清クレアチニンおよび24時間尿タンパク/クレアチニン比を指示する。腎生検からびまん性ループス腎炎の証拠が示され、尿タンパク/クレアチニン検査からネフローゼ症候群の証拠が明らかになる(尿タンパク/クレアチニン比3.6)。この情報に基づいて、急性ループス腎炎との診断が下され、患者は薬物治療の過程を開始する。この時点では、選択され得る可能な薬物がいくつか存在する。重症例では場合により、メトトレキサート、アザチオプリン(Imuran)、シクロホスファミド(cytoxan)などの薬物が処方されるが、多くの場合にミコフェノール酸モフェチル(Cellcept)などの免疫調節剤が用いられる。リツキシマブ(Rituxan)もまた、第2選択または第3選択として用いられる場合がある。急性症状を抑えるために、これらの薬物の1つが、プレドニゾンまたはメチルプレドニゾロンなどの全身性ステロイド剤と併用される場合が多い。ここでは、60 mgのプレドニゾンと共に、1日当たり150 mgのミコフェノール酸モフェチルが処方される。長期的な骨粗鬆症、高血糖、体重増加、および他のクッシング症候群のリスクを含むステロイド剤の多くの副作用を考慮して、臨床像が許容する場合には、患者のプレドニゾン用量を〜6週間かけて漸減する。
判断する最初の疑問は、患者が治療に反応しているかどうか、および結果としてステロイド剤の用量を適切に減量することができるかということである。したがって、この期間中、患者の血清クレアチニンならびに尿タンパクおよびクレアチニンを追跡して、患者が薬物に反応していることを確実にする。頻繁に腎生検を行い、炎症性損傷が回復しているかどうかを検出することができる；しかしながら、腎生検の日常的な使用はあまりにも大きなリスクを伴い、侵襲性が高すぎて実用的ではない。炎症状態を評価するために用いられている血液に基づく現在のマーカーは、信頼するには基礎疾患との良好な相関が十分ではないという点で、この決定を下すにはあまり役に立たず、高用量のステロイド剤に付随する副作用増強のリスクに曝すことになる。血清および尿機能マーカーは、炎症状態の改善を検出するのにいくらか遅れを有する可能性があり、よってこれらのマーカーが決定的な変化を示す前にステロイド剤が漸減され、ひいては腎再燃の期間が長引く可能性がある。より感度の高いマーカーによって情報提供されるより緩徐な漸減は、これらの症例において、再燃期間を短縮して、腎組織に対するさらなる損傷を防ぐことができたはずである。ステロイド剤のおよそ10 mgの維持用量への減量後、患者は、尿中タンパク質のレベルの持続的な上昇、および2という高い尿タンパク/クレアチニン比を示す可能性があり、医師はここでCellceptから別の薬物に切り替えるかどうかを決定しなければならない。これに対する賛成論は腎機能の喪失の継続的な証拠であるが、炎症腎臓状態の正確な尺度はなく、疾患自体は寛解期にあり、それにもかかわらずタンパク尿のこのような持続的なレベルを生じるいくらかのレベルの不可逆的な腎臓損傷をもたらしたのかどうかを知ることは難しいと考えられる。ここで再度、血液に基づく既存のマーカーは情報価値が不十分であり、さらなる腎生検は実用的でない。この決定は、疾患状態の血液に基づく正確な測定によって大いに支援される。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して疾患活動性を測定することにより、治療に対する反応を評価するのにこの状況において非常に役立つ。上記の研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発する。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定する。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行う。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、腎生検標本または皮膚生検標本)を用いて、較正試験を実施する。治療に対する反応を評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定する。これを用いて、治療決定を下す。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、治療に対する反応を評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例8
SLE患者に対する治療を漸減または中止するのに適した時点の決定
提供する本発明の方法を用いて、SLE患者に対する治療を漸減または中止するのに適した時点を決定することができる。疾患活動性の臨床的尺度によって示され得る時間差に加えて、さらなる困難はこれらの測定の感度の欠如にある。治療があまりにも早く漸減される場合、無症候性疾患はそれでもなお疾患の再度の再燃を招き得る。この結果として、免疫抑制治療の過程は典型的に、平均的な患者にとって再度の再燃のリスクが低いことを確実にするために、平均的な患者に必要な期間よりもはるかに長く、さらになお分布の末尾にとって十分長くあり得る期間行われる。したがって、副作用およびコストをもたらす顕著な過剰治療が大部分の患者において行われ、一方で一部の患者の過少治療が行われて、潜在的に予防可能な再度の再燃が起こる。再度の再燃のリスクを予測する、無症候性活動性を測定し得る方法により、設計による過剰治療に依存する代わりにそのような尺度に基づいて、治療を漸減できるようになる。
本実施例において、実施例7による患者はプレドニゾンおよびミコフェノール酸モフェチルを6カ月間使用し、尿タンパク/クレアチニン比が0.5のレベルまで回復する。このレベルは健常個体において予測される基線レベルを依然として超えているが、このレベルが、可逆的でないいくらかの腎臓損傷によるものではないということは明らかではない。炎症の他の臨床的尺度は正常であり、患者は他の症状を何ら報告していない。同時に、患者は、薬物に対して起こり得る副作用として中程度のレベルの嘔気および体重上昇を経験しており、この薬物は加えて重篤な長期副作用がある。医師は困難な決断に直面する：腎臓炎症の再発およびさらなる長期の不可逆的腎損損傷の可能性をもたらし得る、Cellceptおよび/またはステロイド剤をあまりにも早く漸減することの不安と、薬物に起因して起こり得る有害反応をはかりにかける。ここで再度、腎生検を行う必要のない疾患状態の明白な評価は、この決定を下す上で役割を果たす。ステロイド剤の度重なる試行を通して、ステロイド剤を減量する試みが推奨され、これによって同じ臨床的ジレンマの再発が起こる。実際に、患者が寛解期にあり、かつ患者がステロイド剤および免疫調節剤を使用している場合には常に、この問題が生じる。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して疾患活動性を測定することにより、治療を漸減するかどうかを評価するのにこの状況において非常に役立つ。上記の研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発する。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定する。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行う。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、腎生検標本または皮膚生検標本)を用いて、較正試験を実施することができる。疾患活動性のレベルを評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定することができる。これを用いて、治療決定を下し、および患者が任意の検出可能な疾患活動性を有するかどうかを評価する。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、治療に対する反応を評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例9
SLE患者における再燃の予測
SLE患者の治療における1つの課題は、何の兆候もなく再燃が起こり、そのため疾患を予防的に治療しようという医師の努力が打ち砕かれるという事実によって表される。再燃が起こるのを待ってから治療を開始することで、患者は潜在的に破壊的な臨床症状に曝され、高額でかつ不便な入院が必要となりかねず、それ自体副作用を伴う積極的治療介入を必要としつつ、起こるべき長期の器官損傷が生じ得る。なおさらに望ましいパラダイムは、無症候期に再燃が検出され、その時に先を見越して著しい苦痛を取り除く治療が患者に施され得、結果として入院費用が安くなり、最終的に患者にとってより良好な長期予後が可能となる治療パラダイムである。
実施例7による患者は上記の急性再燃から回復しつつあり、プラキニルおよび低用量5 mgのプレドニゾンを除くすべての治療を漸減されている。それにもかかわらず、この患者は別の炎症症状発現を有するリスクが依然として高い。結果として、この患者は、患者の臨床症状および臨床検査の追跡を継続するリウマチ専門医にかかり続ける。残念なことに、患者が再燃およびそれ自体の連続した反復の臨床症状を実際に呈すまで、これらの症状および検査から差し迫った再燃の初期兆候は提供されない。その後1〜3カ月以内に臨床的に検出可能な段階に達し得る再燃の明白な徴候を検出するために、上昇する無症候性活動性の高度に特異的なマーカーを、患者の日常的な臨床的評価に含めることができる。治療をより早く開始することで、再燃の重症度は軽減される可能性があり、また現在の場合よりも器官損傷の期間が短いか、または使用ステロイド剤の少ない治療の達成が可能となり得る。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して疾患活動性を測定することにより、初期再燃の可能性を評価するのにこの状況において非常に役立つ。このスコア自体を、またはこのスコアの増加率(速度)もしくは加速度を用いて、再燃への進行の可能性を評価することができる。上記の研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発することができる。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定することができる。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行うことができる。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、腎生検標本または皮膚生検標本)を用いて、較正試験を実施することができる。治療に対する反応を評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定することができる。これを用いて、治療決定を下すことができる。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、再燃リスクを評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例10
SLE患者の自覚症状を評価するための客観的尺度
SLEは多くの器官を侵し、健常集団において非常によく見られるものを含む多くの潜在的症状を生じる。例えば、SLE患者が頭痛を訴える場合、頭痛はCNSループスの徴候である可能性があり、または一般的頭痛に起因し得る。同様に、SLE患者がある期間にわたり疲労悪化を訴えた場合、この疲労悪化は患者の疾患の憎悪に起因する可能性があり、または鬱もしくは他の原因に起因し得る。疾患活動性を反映する客観的尺度を利用できることは、SLE患者の管理に非常に役立ち得る。
実施例7による患者は、リウマチ専門医に頭痛、疲労、および集中力の欠如の主訴を示す。患者の頭痛は再発性であり、Motrin治療によって一時的に良くなるにすぎない。患者のSLEはその他の点では良好に管理されている。患者の生活における関連する心理社会的ストレス要因には、患者が離婚を経験中であることが含まれる。医師は、SLEに非特異的であり、一般集団においてよく見られる症状を伴うSLE患者に直面する場合に、ジレンマに陥る。患者はCNSループスを患っているのか？ または患者は、鬱のような、患者の症状の他の一般的な原因に苦しんでいる可能性があるのか？ 現在の臨床検査は、現時点でこれらの可能性を識別するために信頼すべき感度および特異度を欠いている。SLE疾患活動性を測定するための信頼性のある試験を日常的に使用して、2つの可能性の識別を支援することができる。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して、疾患活動性を客観的に評価するのにこの状況において非常に役立つ。上記の研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発する。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定する。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行う。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、腎生検標本または皮膚生検標本)を用いて、較正試験を実施する。客観的疾患活動性を評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定することができる。これを用いて、治療決定を下す。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、客観的疾患活動性を評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例11
MS患者の薬物治療に対する反応の測定
上記のように、MS治療における主要課題の1つは、患者が薬物治療にいかに良好に反応するか、および患者が薬物治療に反応するかどうかを測定することである。進行期および後期疾患中には、疾患によって起こった身体障害の程度を測定する総合障害度評価スコア(EDSS)などの臨床的評価が存在する。しかしながら、これらの評価は早期疾患または再発/寛解型疾患では有用ではない。疾患進行を評価するために再発周囲の臨床的パラメータを用いることができるが、患者は再発間に数年を費やすことができ、その期間中に臨床的評価から証拠はほとんど収集され得ないため、これらは荒くかつ遅行的な指標である。最後に、脳病変を調べるために、ガドリニウム増強MRIのような脳画像診断を用いることができる。MS患者は典型的に、年1回の頻度でMRIなどを受ける。しかしながら、そのような画像は特異性を欠いている。さらに、総合的な脳損傷の尺度として、それらは現在の疾患活動性の優れた尺度ではなく、病歴および脳に及ぼすその影響を反映する。
MSの現在の臨床治療パラダイムが、再発寛解型疾患と診断された患者は、進行性疾患の発症を遅らせるために持続的な治療を受けるべきであるというものであることは事実である一方で、MSを治療するための承認薬のレパートリーが増加することで、生物学的フィードバックの欠如がますます問題となる。MS治療における実質的投資が実を結び始めているため、MSを治療するための承認薬の上記リストは長くなり続けている。これらの薬物はそれぞれ重篤な副作用があり、投与するのに非常に高価であり、1年の治療につき30,000ドル〜100,000ドルを要する。良好に管理がなされない患者は、衰弱性であり、入院および長期ケアを含む高額な医療介入をもたらす進行性疾患により早く移行する。したがって、患者は、治療初期に最適な治療を受けることが良しとされ得る。
臨床的有用性の例
患者プロファイル：30歳の女性が、痛みを伴う単眼視力障害で来院する。患者は、神経学的評価、およびクローン性T細胞が存在するかどうかを評価するために用いられる脳脊髄液を採取するための腰椎穿刺を受ける。患者はまた、脳MRIを指示される。これらの検査に基づいて、MSとの診断が下される。患者は、1日おきに自己皮下投与すべき、1回の注射当たり250 mcgのBetaseronを処方される。6カ月後の経過観察来院時に、患者は鬱および体重増加を訴える。さらなる神経学的事象は医師に報告されていない。医師は現在、臨床的ジレンマに直面している。医師は、行われていた通りに治療を維持すべきか？ 新たな治療を使用すべきか？ 医師は、コストが発生し、かつ患者をさらなる造影剤曝露に曝すMRIを指示すべきか？ 医師は、次回予定されているMRIから新たな病変が示されるまで待つべきか？ 医師は、再燃が再発するかどうかを認めるまで待つべきか？ これらの決断はすべて、疾患が活動性であるかまたはそうでないかの明白な尺度から恩恵を受ける。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して疾患活動性を測定することにより、治療に対する反応を評価するのにこの状況において非常に役立つ。上記の研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発する。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定する。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行う。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、CSF)を用いて、較正試験を実施することができる。治療に対する反応を評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定することができる。これを用いて、治療決定を下すことができる。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、治療に対する反応を評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例12
MS再燃の予測
すべての自己免疫疾患と同様に、再燃の改善が治療の主要目的である。再燃は患者を衰弱させ、かつ治療するのに高価であるばかりでなく、各再燃が長期の非可逆的疾患進行に寄与するということがますます信じられている。初期再燃を管理するために、IVメチルプレドニゾロンまたは経口プレドニゾンなどのいくつかの治療を用いることができる。そのような薬物は重大な副作用があり、したがって活動性再燃の証拠なしには処方されない。より短くかつ損傷の少ない再燃を引き起こし得るこの種の先を見越した再燃治療の情報を提供するために、その後の臨床的再燃と相関した無症候性活動性の上昇の尺度を用いることができる。加えて、非常に重篤でかつ致命的な副作用のリスクを伴う、再燃の軽減に関して高い臨床的有効性を実証する治療が存在する。1つのそのような薬物は、臨床転帰の改善をもたらし、かつPMLなどの致死的脳感染症のリスクを増大させることが示されているTysabriである。これらのリスクにより、そのような薬物の価値は、他の薬物がもはや進行の制御を提供しない場合の最終治療にまで下がり、また長期的治療としてのこれらの薬物の価値は制限された。そのような薬物は、致死的副作用のリスクを最小限に抑えつつ急性再燃期を制御するよう、ステロイド剤と同様の様式で使用することができるため、再燃状態が初期である時点で予測ができる試験は、そのような薬物の有用性を増大させることができる。
臨床的有用性の例
実施例11による患者はBetaseronを3年間使用しており、1週間持続する臨床的再燃を報告する。年末の患者のMRIから、顕著な新たな病変が示される(複数の分離した様々なサイズの卵形の垂直方向T2WおよびFLAIR高信号病変(斑)、脳梁-中隔界面を含む、両側性の脳室周囲および皮質下白質領域を侵している、T1W画像における等低信号およびT2W画像における高信号の出現)。医師は、次の12カ月の過程にわたり患者が再燃のリスクが高いことを懸念する。臨床的ジレンマが起こる。医師は、付加的な治療を介入するために、さらなる臨床症状を待つか？ 医師は治療を切り替えるべきか？ もしそうするのであれば、copaxoneなどの別のクラスの注射剤を使用すべきか、またはTysabriなどの新たなクラスの治療を使用すべきか？ ステロイド剤を処方すべきか？ これらの臨床決定を下すのを助けるために、無症候性疾患活動性をモニターし、疾患が増大する時期、および再燃が起こる可能性が高い時期を示し得る試験を用いることができる。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して疾患活動性を測定することにより、再燃のリスクを評価するのにこの状況において非常に役立つ。本発明に記載した研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発することができる。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定することができる。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行うことができる。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、CSF)を用いて、較正試験を実施することができる。再燃のリスクを評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定することができる。これを用いて、治療決定を下すことができる。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、再燃リスクを評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例13
MSの治療遵守のモニタリング
疾患の早期には臨床症状は比較的稀であるため、患者と患者の医師との接触はそれほど頻繁ではない。同時に、処方されている治療は、痛みのある反応および副作用を引き起こし得る自己注射を伴い、患者にとって高価でありかつ不便である。結果として、かなりの程度の治療レジメンの不遵守が認められ、患者と医師との接触が日常的ではないために、この不遵守を医師がモニターすることは難しい。無症候性疾患の状態を測定することができる試験により、医師および患者の両方が、基礎疾患がどれほど良好に制御されているかを日常的に見ることが可能になる。そのような方法は、治療を続行するようにHIV患者を効果的に動機づける点で、そのような患者において非常に効果的であることが判明している。3カ月ごとに行われる血液検査により、医師が、患者を診察し、疾患の状態を測定することが可能になる。
AutoImm Loadは、単独でまたは疾患活動性の他のマーカーと併用して疾患活動性を測定することにより、治療の遵守を評価するのにこの状況において非常に役立つ。本明細書に記載する研究を用いて、AutoImm Loadのためのアルゴリズムを開発する。較正試験を用いて、AutoImm Loadを算出するために用いられる相関クローン型を測定する。この較正試験は、例えば治療の開始時のようなピーク疾患活動性の時点の患者に由来する血液を用いて行う。血液を用いて、または代わりに罹患組織(例えば、CSF)を用いて、較正試験を実施することができる。治療の遵守を評価すべき後の時点で、血液試料を採取し、較正試験と共に用いて、AutoImm Loadを測定する。これを用いて、治療決定を下し、および患者をより良好な遵守により良く導く。相関クローン型が集団研究に由来する場合には、較正試験の必要はなく、治療決定の情報を提供するためにAutoImm Loadを測定するには、治療の遵守を評価すべき時点の血液検査で十分である。
実施例14
マウスTCRβおよびIgH配列の増幅
ヒトに関して開発したのと同様の、マウスTCRβおよびIgHの増幅および配列決定スキームを開発する。異なる配列の増幅効率の違いを最小限に抑えるための同様の方法、ならびに添加物(spike)および5' RACE技法を用いた上記と同様の検証技法を適用する。cDNAの最小インプット量を、ヒト試料について記載したのと同様の方法論において決定する。マウスとヒトの増幅スキームにおける1つの違いは、マウスにおけるTCRβの2つのCセグメントが、J/C結合部に最も近い50 bp中に多型を全く有さないという点である。したがってスキームでは、第1段階増幅用のプライマーを25〜50位に配置し、第2段階増幅に関してはプライマーを1〜25位に配置し、このプライマーは、後者のプライマーがP5配列を含むように5'尾部を有する。異なる配列によって特異性が向上し、これは、多型のために塩基が「ループアウト」する必要がないことを除いて、ヒトにおいて用いられる戦略と類似している。
実施例15
マウス配列データの一次解析
マウスデータの解析に使用する解析枠組みは、ヒトデータに関して上記したものと類似している。1つの違いは、マウス試料をヒト試料よりも浅く配列決定する点である。マウス由来の血液試料は100μlであると予測される。100μlの血液中には〜100 K個のリンパ球が存在し、よって100 K件よりもはるかに高い深さまで配列決定することによって、精度が著しく向上することはない。したがって、各マウス試料について100 K件の読み取りのみを得る。読み取り数がヒトよりもマウスで少ないにもかかわらず、マウス総血中リンパ球のより多くの画分を試料採取する。総マウスリンパ球数は、ヒトのものよりも3桁超少ないと予測される。同様に、100μlの血液は、10 mlのヒト血液を用いて得られる試料採取(0.2%)と比較した場合に、マウス血液中のリンパ球のより良好な試料採取(〜10%)を提供する。
実施例16
マウスSLEモデルにおけるIgHおよびTCRレパートリー解析
SLEのマウスモデルを用いて、TCR/BCRレパートリーと疾患活動性の関係を研究する。マウスモデルは、NZM2410由来のsle1およびsle3遺伝子座を有するB6である。これらのB6.sle1.sle3(BSS)マウスは、自然発症様式でSLE様腎炎を発症する。3つの型のコホートを研究する。すべての調査点について、血液BUN、クレアチニン、および抗核自己抗体、尿タンパク、およびクレアチニンレベルを得る。血液TCR/BCRレパートリーから作成されたスコアが、腎疾患のこれらの測定された指標と良好に相関するかどうかを判定する。第1コホートは記載したヒトコホートと類似しており、この場合、腎機能評価を伴って縦断的血液試料を採取する。具体的には、BSSマウス7匹を8カ月目まで月単位で追跡する。最終的に、これらのマウスを屠殺し、血液に加えて脾臓および腎組織を解析する。対照として、B6マウス5匹を同様の様式で評価する。第2コホートは横断的であり、この場合、動物の異なるコホートを特定の時点で屠殺し、脾臓、腎臓、および血液試料をその時点で解析する。具体的には、BSSマウス5匹を毎月屠殺し、血液、脾臓、および腎組織を解析する。対照として、B6対照マウス2匹を同じ様式で評価する。最後に、第3コホートを疾患の発症後にステロイド剤で処置し、その後定期的に、腎炎評価および血液試料を得る。具体的には、4カ月齢の時点で、疾患を有するマウス20匹をステロイド剤で処置した後、次の4カ月間週2回の頻度で、TCR/BCRレパートリー解析および腎機能評価のために血液を採取する。対照としてBSSマウス5匹をプラセボで処置し、同様の様式で追跡する。すべての調査点(すなわち、異なる時点、および同じ時点の異なる組織)から、TCRおよびBCRレパートリー解析を行う。解析は、上記の通り、2段階PCR、配列決定処理、および一次データ解析を含む。
実施例17
マウスSLEと相関するクローン型の同定および動態
最初に、腎機能と相関する1組のクローン型を同定する。腎機能の尺度として、尿タンパク/クレアチニン比、血清クレアチニン、またはBUNレベルを使用することができる。第1および第3コホートにおいて、各HPCクローン型の血液レベルと3つの尺度のそれぞれとの相関を評価することができる。ヒトにおいて記載したのと同様の様式で、ランダム期待値(または並べ替え検定)を超えて1つ、2つ、または全3つの腎機能尺度との高い相関を有するクローン型の数の大きな増加が存在するかどうかを評価することができる。ランダム期待値を考慮して、その閾値を上回る相関レベルを有するクローン型の10%のみが、偶然に認められる相関レベルを有すると予測される(10%偽発見)相関閾値を選択する。これらのクローン型に注目し、このセットを「相関クローン型」と定義する。
相関クローン型を同定するためのこの統計的方法に加えて、クローン型は、腎組織中の特定のクローン型の濃縮という「機能的」方法によって、疾患に関連して同定することも可能である。機能的方法により、疾患に関連している可能性のある1組のクローン型をコホート2において同定することができ、これらは機能的同定相関クローン型と称される。相関クローン型の「統計的」定義と「機能的」定義との重複の程度を評価することができる。コホート1および3は、最終時点で採取された腎臓試料を有する。これらの腎臓試料中に濃縮されたクローン型が血液中に存在し、腎機能と高い相関を有するクローン型の中にあるかどうかを評価することができる。
次に、(統計的および機能的に同定された)相関クローン型の動態を評価することができる。例えば、コホート2からのデータを用いて、3つの区画：腎臓、血液、および脾臓において、それらのレベルの上昇または低下(もしあれば)の時間的経過を評価する。
統計的に同定される相関クローン型では、相関クローン型のサブセットは腎機能とのそれらの相関によって同定される。腎機能データを知らずに、相関クローン型を同定することができる。換言すれば、相関クローン型と疾患と無関係のクローン型を識別する特徴を理解することができる。そうするために、腎機能と低い相関を有する1組のクローン型を対照非相関クローン型として同定する。
疾患と相関するクローン型の特徴
相関的および非相関的という2組のクローン型の同定後、これら2組を識別する特徴を探索する。統計的および機能的に同定された相関クローン型を用いて、個別解析および複合解析を行う。例えばクローン型のレベル、特定の配列モチーフの存在、および他の関連クローン型の配列など、ヒトにおいて調べたのと同じ種類の特徴を評価する。ヒト研究について記載した通り、過剰適合の大きなリスクが存在し、よって、交差検定技法、または別個の訓練および試験セットを使用する必要がある。
マウス実験の1つの有用性は、相関クローン型が細胞の特定のサブセット中に濃縮されるかどうかの評価を可能にする細胞が利用できることである。相関クローン型がいくつかの細胞サブタイプ中に濃縮されるかどうかを調べる；リンパ球の完全なセット、および相関クローン型が濃縮される特定のサブタイプから配列決定を行うことができ、濃縮のこの基準を、相関クローン型と他の疾患非関連クローン型を識別するための追加の特徴として使用することができる。どの細胞サブタイプクローン型が濃縮されるのかを知るために、1対のアプローチをとる：仮説駆動および仮説なし。1つ目は、1組の試料において、T細胞またはB細胞上の多くの候補表面マーカーを試すというものである。例えば、1つの候補は、活性化T細胞を選択するためのT細胞上のCD69である。B細胞に関しては、研究から、活動性SLEにおけるCD27高細胞の増加が示されており、したがってこれは、相関クローン型の濃縮を有し得る細胞のマーカーの優れた候補である。これらの実験のそれぞれにおいて、特定の細胞型をFACSによって精製する。次に、リンパ球の完全な補完物に由来するcDNAについて、および異なる試料の収集物からFACSによって精製されたリンパ球に由来するcDNAについて、配列決定反応を行う。相関クローン型および非相関クローン型の2つのセットが、FACS精製サブセットと比較して、リンパ球の完全な補完物中に異なる割合で存在するかどうかを評価する。大きな違いを有するマーカーは、相関クローン型を同定するのに有用であり得る。これらのマーカーを有する細胞のサブセット中のクローン型の濃縮を、相関クローン型を検出するための配列パラメータに加えて使用する。
仮説なしアプローチでは、相関クローン型を有する細胞と他の細胞とで差次的に発現するマーカーを探索する。特定のTCRクローン型が疾患と明らかに相関している2、3の例を選択し、同じVセグメントを有するクローン型が大部分であることを表す、そのクローン型が高度に濃縮される例を選択する。特定のVセグメントに対する抗体(全Vセグメントに対する抗体が市販されている)を用いてFACSを行い、相関クローン型を保有する細胞が高度に濃縮されている集団を選択する。これらの細胞からRNAを調製することができ、アレイ実験を行うことにより、全遺伝子の発現を調べることができる。対照として、リンパ球由来の全RNA、および/または別の非関連Vセグメントを保有するFACS精製細胞に由来するRNAを用いることができる。相関クローン型を有するFACS精製Vセグメントから得られた試料と対照を最大限に識別するマーカーを探索することができる。2つの集団を識別する表面マーカー(表面タンパク質を用いてFACSを行うことがはるかに簡便だからである)を含むマーカーを見出すことができる。何匹かのマウスの試料から一貫したRNAマーカーが認められる場合には、これをタンパク質レベルで検証する。同じ試料を用いて、FACSアッセイにおいてマーカータンパク質に対する抗体を使用して、マーカータンパク質を保有する細胞を精製する。2種類以上のマーカーを試験して、それらのうちの1つが検証される機会を高めてもよい。精製細胞に由来するTCRおよび/またはBCRを配列決定する。RNAの結果がタンパク質レベルで保たれる場合には、相関クローン型が細胞の精製サブセット中に濃縮されるはずである。RNAの結果がタンパク質レベルでなお保たれることを検証した後、この結果を他の試料において検証する。アレイ解析に供さなかった試料を、マーカータンパク質に対する抗体を用いたFACS解析に供する。精製細胞のTCRおよび/またはBCRを配列決定する。相関クローン型が、特定のマーカーに対する抗体を用いて精製された細胞中に濃縮されるかどうかを評価する。これにより、相関クローン型の同定におけるマーカーの有用性が検証される。
実施例18
疾患活動性を測定するためのIgHおよびTCRβレパートリーの使用
上記による相関クローン型のためのアルゴリズムを適用して、コホート1および3の全試料において、それらの配列および/マーカーによって相関クローン型を同定することができる。各患者における相関クローン型のレベルを用いて、腎機能の尺度と相関するAIスコアを作成することができる。上記のように、過剰適合リスクが存在し、交差検定技法ならびに/または別個の訓練および試験セットを使用する必要がある。AIと腎機能尺度との相関を、横断的様式(全マウスのすべての調査点)で評価することができる。AIスコアが個々のマウスにおいて変化するかどうかという疑問もまた、腎機能が変化する場合に評価することができる。これは、ヒトにおいて記載したのと同様の様式で、同じ動物における高い腎機能と低い腎機能からのAIを比較することによって評価することができる。
実施例19
同じ細胞に由来する配列の連結
2つの配列を同じ細胞から増幅することができ、増幅中にこれらを連結して1つの単位複製配列を形成することができる。たとえ連結された配列が他の試料に由来する配列のプールと混合されたとしても、同じ細胞中のこれら2つの配列の存在に関する情報はその後保存され得る。
この連結スキームの有用性の例は、TCRの多様性の評価に関してである。TCRの多様性は、TCRαおよびTCRβのそれぞれの多様性から生じる。加えて、細胞におけるTCRαとTCRβの組み合わせが多様性を著しく増大させる。しかしながら、複数のT細胞を有する試料から核酸を抽出する場合、TCRβと同じ細胞中にどのTCRαが存在するかという情報は失われる。この情報の保存を可能にする方法をここに示す。この方法は、異なる区画中に細胞を分離する段階、最初は別個の単位複製配列を共有結合する様式で所望の配列を増幅する段階、および任意に後の解析のために全増幅配列を混合する段階を含む。各細胞を区画中に配置するために、いくつかの方法が考えられ得る。例えば、1つの方法は、PCRにおいて用いられ得る微小液滴またはミセルエマルジョン中に細胞を配置することである。これらの液滴は、指示された様式で満たすことができ、または大部分の液滴が最大限でも単一の細胞を含むといった方法でランダムに満たすことができる。また、細胞選別を用いて、PCR容器中に単一細胞を配置することもできる。次に、各液滴中で核酸の増幅を行うことができる。
スキーム1
図9に図示する通り、プライマー1およびプライマー2を用いて配列1を増幅することができる。プライマー2は、ゲノム配列と相補的でない5'オーバーハング配列を保有する(図9A、細線)。同様に、プライマー3およびプライマー4を用いて配列2を増幅することができる(図9A)。プライマー3は、プライマー2のオーバーハング配列と相補的な5'オーバーハング配列を保有する(図9A、点線)。この図では、2つの相補的配列を表す2つのオーバーハング(または2つの連結配列)を細線で描いている；一方の配列は実線として示され、その相補体は点線として示される。他の相補的配列は、同じ単色を有するように描いてある：配列1および2に関してそれぞれ黒色および灰色。
プライマー1〜4での増幅後、2つの増幅産物はそれぞれ一方の末端に連結配列を有し、2つの産物を互いにアニールすることができ、鎖を伸長して完全な二本鎖分子を形成することができる(図9B)。この分子は今や互いに連結された配列1および2を有し、次にプライマー1および4で増幅することができる(図9C)。
全4種のプライマーを同時に反応中に入れて、配列の連結および増幅を達成することができる。低濃度のプライマー2および3を添加することが有益であると考えられる。低濃度のプライマー2および3によって、2つの個々の配列単位複製配列が反応の初期に飽和に達し、連結された単位複製配列が、反応の後期にPCR反応物を占有することが可能になることが確実になる。これによって、個々の配列単位複製配列と比較して、高濃度の連結された単位複製配列を有する最終反応物が生じる。
スキーム1(a)
スキーム1(a)はスキーム1の変形であり、この場合、連結配列はプライマー2配列と同一である(図10)。プライマー1、およびプライマー上にオーバーハング配列のないプライマー2を用いて、配列1を増幅することができる(図10A)。プライマー3は、プライマー2と相補的な5'オーバーハング配列を保有する(図10A)。プライマー3およびプライマー4を用いて配列2を増幅し、配列1と相補的な連結配列を創出することができる(図10A)。他の相補的配列は、同じ色を有するように描いてある：配列1および2に関してそれぞれ黒色および灰色。
プライマー1〜4での増幅後、2つの増幅産物をプライマー2配列を介して互いにアニールすることができ、鎖を伸長して完全な二本鎖分子を形成することができる(図10B)。この分子は今や互いに連結された配列1および2を有し、次にプライマー1および4で増幅することができる(図10C)。
スキーム2
図11に示すスキーム2は、最終的な増幅がゲノムと相補的でない配列を用いて達成されることを除いて、スキーム1と同様のスキームである。このアプローチの1つの利点は、オフターゲット増幅のない増幅に理想的であるようにプライミング配列を選択することができる点である。これは、増幅されるべきゲノム配列と相補的なプライマーが理想的でない場合に役立ち得る。増幅のためにゲノムと相補的でないプライマーを用いることにより、低濃度のプライマー1〜4を使用し、オフターゲット増幅を最小限に抑えることができる。また、同数のプライマー相互作用を引き起こすことなく2対以上のプライマーを使用する多重化スキームに、スキーム2を適合化することもできる。連結されるべき配列の各対は、高濃度である必要のない独自の4つのプライマーを有する。1対の増幅プライマーは、連結された配列の対をすべて増幅することができる(図11C)。
プライマー1およびプライマー2を用いて、配列1を増幅することができる(図11A)。プライマー1および2は、ゲノム配列と相補的でない異なるオーバーハング配列をそれらの5'末端上に保有する(図11A、それぞれ点線および細線)。同様に、プライマー3およびプライマー4を用いて配列2を増幅することができる(図11A)。プライマー3および4は、ゲノム配列と相補的でない異なるオーバーハング配列をそれらの5'末端上に保有する(図11A)。プライマー1および4上のオーバーハングを「Amp 1」(点線)および「Amp 2」(波線)と表示するが、これらは最終的に増幅に用いられる、ゲノムと相補的でない配列である(図11A)。スキーム1と同様に、プライマー2(細線)および3(細/破線)のオーバーハングは、互いに相補的な連結配列である。他の相補的配列は、同じ色を有するように描いてある：配列1および2に関してそれぞれ黒色および灰色。
プライマー1〜4での増幅後、2つの増幅産物はそれぞれ一方の末端に連結配列を有し、2つの産物を互いにアニールすることができ、鎖を伸長して完全な二本鎖分子を形成することができる(図11B)。この分子は今や互いに連結された配列1および2を有し、次にプライマー5および6で増幅することができる(図11C)。
任意に、プライマー1〜4を最初に使用することができ、2つの配列の連結後に、プライマー5および6を添加することができる。より好ましい態様では、最初の段階で全プライマーを添加する。さらにより好ましい態様では、最初に全プライマーが存在し、プライマー1〜4の濃度は5および6の濃度よりも低い。これにより、完全な連結および増幅が1段階で起こり得る。低濃度のプライマー2および3によって、2つの個々の配列単位複製配列が反応の初期に飽和に達し、連結された単位複製配列が、反応の後期にPCRを占有することが可能になることが確実になる。これによって、個々の配列単位複製配列と比較して、高濃度の連結された単位複製配列を有する最終反応物が生じる。さらに、低濃度のプライマー1〜4によって、これらのプライマーがプライマー5および6よりも低品質である場合に起こり得る任意のオフターゲット増幅が最小限に抑えられる。
増幅にプライマー5および6を使用することで、より効率的な多重化が可能になる(図12)。1対のプライマー(プライマー5および6)を用いて、連結された配列をすべて増幅することができる。連結配列は、異なる適用に対して異なる方法で設計することができる。図12に図示する例は、連結させるべき2対の配列に関するものであるが、このスキームは10、100、または1000対の配列にまでさらに拡大することができる。連結させるべき1組の遺伝子対(例えば、TCRαとTCRβおよびIgHとIgK)が存在する場合、各対の連結配列は異なり得る。この例では、太点線(TCRαおよびTCRβ)または細点線(IgHおよびIgK)によって示されるように、TCRαおよびβの連結配列はIgHおよびIgKの連結配列と異なる(図12A)。この例における増幅配列はすべて同じ色で示してある。連結された全配列のための増幅プライマーは、図11に示したのと同じプライマー：5および6である。他の適用では、特異的な対形成が存在しない場合には、同じ連結配列を使用することができる。
3つ以上の配列を連結できることもまた考えられる。例えば、3つまたはそれ以上の配列を共に連結することができる(図13A〜13D)。3つの配列を連結した分子を創出するために、産物のうちの1つは、その両端に、それぞれ1つの産物と連結する2つの異なる連結配列を有し得る(図13A)。示した例では、配列2は2つの連結配列を有する。プライマー3の連結配列により、プライマー2の連結配列を介して配列1への連結が可能になる(連結配列相補対LS1)。同様に、プライマー4の連結配列により、プライマー5の連結配列を介して配列3への連結が可能になる(連結配列相補対2、LS2)(図13A)。別のサイクルでは、配列2の全体が、配列1および配列3を連結するための連結配列になる。プライマー1および6に相補的なAmp1およびAmp2配列により、連結された配列1〜3を有する分子の形成後の増幅が可能になる。
実施例20
結腸癌患者における転移性再発のモニタリング
治療可能な段階で検出される多くの癌は、患者に対する転移性腫瘍再発の継続的なリスクをなお伴う。そのような再発は、後期にかつ治療不可能な段階で検出される場合が多く、患者に致命的であり得る。そのような状況の一例は、再発結腸癌である。ますます積極的になる結腸癌スクリーニングプログラムにもかかわらず、結腸癌は米国において最もよく見られる悪性腫瘍の1つである。1年におよそ150,000名の患者が、重篤であるが治療可能な病期(病期IIおよび病期III)の結腸癌と診断される。これらの患者は、腫瘍切除とその後の化学療法の過程による治療を受ける。これらの治療は一般的に有効であるが、それにもかかわらず、これらの患者が、治療後何年かのうちに原発腫瘍の転移性再発を有するというかなりの可能性がある。例えば、病期IIIの患者の50%は手術の5年以内に再発を有する。これらの再発は(例えば、結腸または肝臓における)孤発性である場合もあれば、多発性である場合もある。いずれの場合にも、しかし特にそれらが孤発性である場合に、早期でのそれらの検出は、成功的治療(手術および/または化学療法)の機会を最大にするのに役割を果たし得る。
現在、治療後監視で用いられる2つの検査が存在する。腹部および胸部のCTスキャンは、これらの画像上で可視的な腫瘍を同定するために用いられる。典型的に、これらのスキャンは、治療後最初の5年間は6〜12カ月の間隔で行われる。これらのスキャンは早期悪性腫瘍を明らかにすることができるが、これらの臨床的有効性は議論されている。これらのスキャンの欠点には、これらが患者を相当量の放射線に曝露し、それ自体がさらなる腫瘍および著しい費用を招き得ることが含まれる。血液に基づく別の検査は、いくらかの価値があることが示されている：CEA検査。この抗体検査は、一部の結腸腫瘍に特異的である血清中のタンパク質のレベルを測定する。CEA検査の欠点は、その感度の欠如である(CTスキャンが陽性である患者の＜60%が、CEA検査で陽性である)。
本発明のこの態様では、切除された原発腫瘍から得られたリンパ球を用いて、早期癌再発の血液に基づく検査に感度を付加するために使用することができる免疫プロファイルを開発する。切除腫瘍中に見出されるリンパ球のTCR(および/またはBCR)を、増幅し配列決定することができる。腫瘍試料中に濃縮されるクローン型は、腫瘍に対する免疫応答に関連する可能性が高い。患者からのその後の採血液を用いて、これらのクローン型のレベルを評価することができる。これらのクローン型のレベルの上昇は、腫瘍再発に対する免疫応答を示し得る。この場合、免疫応答の検出は、腫瘍マーカー自体の検出よりも感度が高い可能性がある。
較正試験を用いた癌再発の検出のための発見研究
発見研究を行って、血液TCR(および/またはBCR)のプロファイルが与えられる場合に、再発の検出の可能性を決定することができることが考えられる。転帰が判明している患者の切除腫瘍試料および経過観察血液試料の試料を、この研究に用いることができる。これらの全試料からTCR(および/またはBCR)を配列決定することができる。相関クローン型の候補は、腫瘍試料からのTCR(および/またはBCR)データ中に存在するものである。この訓練研究において判明している転帰を考慮すれば、標準的な交差検定技法を用いて、異なるクローン型のレベルが与えられる場合にスコア(再発リスク)を作成するモデルを考案することができる。したがって、切除腫瘍(較正点)におけるクローン型の測定、および再発の監視中の後の時点における同じ患者の血液中に見出されるクローン型からのデータによって、新たな患者においてこの再発スコアを算出することができる。腫瘍データを使用することで、この解析で考慮する血液中に存在するクローン型の数が大幅に減少し得る。
較正試験および集団研究を用いた癌再発の検出のための発見研究
腫瘍標本中に濃縮されるすべてのクローン型が、腫瘍に対する免疫応答に関連するとは限らない可能性が高い。有利な炎症状態のために局所的に拡大したリンパ球がいくらか存在する可能性がある。本発明の別の態様では、同じ試料を用いて発見研究を行うことができるが、この研究は「相関」クローン型と「非相関」クローン型を識別するパラメータを同定するために用いられる。これらのパラメータには、1) 配列モチーフ：モチーフは、相関するクローン型と関連する特異的なVもしくはJ領域、組み合わせVJ、またはDJ領域内の短い配列であってよい；2) クローン型のサイズ；3) レベル：絶対レベル(100万個当たりの読み取りの数)または順位レベル；4) 他のクローン型との類似性：サイレント変化(同じアミノ酸をコードするヌクレオチドの違い)を有するもの、または保存的アミノ酸変化を有するもののような、他の高度に関連したクローン型の存在；5) BCRに関して、クローン型における体細胞突然変異のレベル、および/またはいくつかの生殖系列クローン型と体細胞突然変異によって異なる別個のクローン型の数。6) 特定のマーカーを保有する細胞の存在が含まれ得る。次にこの研究により、所与の腫瘍試料中に存在するクローン型の特定のセットが与えられる場合に、血液中でどのクローン型が癌再発と関連している可能性が高いかを予測し得るアルゴリズムがもたらされる。次にこれらのクローン型を用いて、上記と同じ様式で再発リスクのスコアを開発することができる。
集団研究を用いた癌再発の検出のための発見研究
本発明の別の態様では、切除腫瘍において測定されたクローン型を用いて、まだ見られていない試料における相関クローン型を予測するモデルを作成する。このモデルはまた、上記と類似した様式で再発リスクスコアを作成するために用いることもできる。このモデルでは、再発監視を受けている新たな患者において切除癌組織中のクローン型を測定する必要はなく、所与の血液試料におけるクローン型を単に測定することによって再発リスクを評価することができる。
集団研究を用いた原発性結腸癌の検出のための発見研究
延長として、同じ方法論を用いて原発癌の検出を達成することができることが考えられる。原発癌であるため、関連クローン型を濃縮するために用いることができる切除された腫瘍が存在しない。しかしながら、腫瘍切除データが存在する場合でさえ、関連クローン型を同定し、最終的に癌検出の可能性のスコアを作成するためには、付加的な配列および他のパラメータを使用する必要があると考えられる。したがって、拡張して、アルゴリズムが十分に予測的である場合には、切除腫瘍からのデータなしで血液(または他の体液)から癌を検出することができる。本発明のこの態様では、原発癌の診断に先立って、患者由来の血液試料を用いた発見研究が利用できることが必要である。上記と類似の様式で、パラメータ(配列およびその他)を同定して、腫瘍に対する免疫系応答に相関するクローン型を予測することができる。次にモデルを用いて、結腸癌の進行リスクを予測する癌リスクスコアを作成することができる。次にこのアルゴリズムを新たな患者の血液試料に適用して、原発性結腸癌のリスクを測定することができる。
実施例21
心臓移植患者における拒絶反応のモニタリング
臓器の供給が非常に限られているため、心臓移植は比較的珍しい手技である。世界中で毎年3,500件の心臓移植が行われている。各手技は非常に高価であり、使用される臓器は値段のつけようがない。結果として、これらの臓器を受け取る患者には極めて積極的に治療がなされる。免疫抑制剤による介入が有効であり得る時点で、提供された臓器に対する免疫反応の状態を測定する目的で、患者は臓器の炎症を測定するために定期的な心臓生検を受ける。これらの検査に基づいて、免疫抑制剤の積極的な過程が行われ得る。これらの手技にはいくつかの限界がある。侵襲的な外科的手技であるため、それらは患者に対するリスクがある。さらにそれらは高価であり、低頻度の間隔でのみ行われ得る。一連の試験遺伝子11種の発現のプロファイリングに基づいた血液に基づく検査(Allomap)は、臓器拒絶反応の検出において非常に感度が高いことが示されているが、生検の代替として用いるには十分な感度が欠如しており、むしろいつ生検を行うべきかを決定するために用いられる。本発明の1つの態様では、TCR(および/またはBCR)プロファイルを用いて、「拒絶反応」の状態を評価し、特定の時間枠内で拒絶反応の可能性を予測する拒絶リスクスコアを作成する。発見研究を行って、血液TCR(および/またはBCR)のプロファイルが与えられる場合に、拒絶反応の可能性を決定することができることが考えられる。診療所でこれを用いて、用いられている免疫抑制療法の情報を与えることができる。
集団研究を用いた相関クローン型の発見
本発明のこの態様では、臨床転帰が判明している、血液試料のある移植後患者の集団を使用することができる。これらの全試料からTCR(および/またはBCR)を配列決定することができ、個々のクローン型と拒絶反応転帰との相関を使用して、相関クローン型と非相関クローン型を識別することができる。続いて、それら2つのクラスのクローン型を識別するパラメータを導き出すことができる。これらのパラメータには、1) 配列モチーフ：モチーフは、相関するクローン型と関連する特異的なVもしくはJ領域、組み合わせVJ、またはDJ領域内の短い配列であってよい；2) クローン型のサイズ；3) レベル：絶対レベル(100万個当たりの読み取りの数)または順位レベル；4) 他のクローン型との類似性：サイレント変化(同じアミノ酸をコードするヌクレオチドの違い)を有するもの、または保存的アミノ酸変化を有するもののような、他の高度に関連したクローン型の存在；5) BCRに関して、クローン型における体細胞突然変異のレベル、および/またはいくつかの生殖系列クローン型と体細胞突然変異によって異なる別個のクローン型の数。6) 特定のマーカーを保有する細胞の存在が含まれ得る。研究試料が移植片の生検試料を有する場合、特にそれが活発な拒絶反応の状態にある場合には、相関および非相関クローン型を規定するための代替のまたは追加の方法が生じる。その時点では、相関クローン型の大幅な濃縮が存在することが予測される。これらと他のクローン型を識別するためのパラメータを、上記の通りに同定することができる。
次に血液試料からのプロファイルデータを用いて、拒絶反応の可能性を予測する。この訓練研究において判明している転帰を考慮すれば、標準的な交差検定技法を用いて、異なるクローン型のレベルが与えられる場合に拒絶反応リスクスコアを作成するモデルを考案することができる。特定の時点でのTCR(および/またはBCR)の新たな血液試料におけるプロファイルが与えられる場合に、拒絶反応の可能性に関連する拒絶反応リスクスコアを作成することができる。
較正試験を用いた相関クローン型の発見
別の態様では、各患者に対して較正試験を用いて、相関クローン型を同定する方法を実行することができる。本方法は、移植後に採取された最初の生検試料を含む。移植後移植片の生検材料が存在することで、生検試料からTCRを解析して、この試料中に蔓延しているクローン型によって定義される相関クローン型を同定する可能性が提供される。次にクローン型のこのセットを血液中で追跡することができ、拒絶反応の可能性についてスコアを作成する。拒絶反応の可能性を概算する拒絶反応リスクスコアを作成するために、利用可能な臨床データおよび相関クローン型のレベルを使用する、上記したものと類似の発見研究を通して、拒絶反応リスクスコアを作成するためのアルゴリズムを導き出す。
この態様では、移植後の最初の生検に由来する材料を用いて特定の較正試験を行うが、さらなる生検は血液試料の使用によって置き換えることができ、そのクローン型をこの較正試験と共に用いて、拒絶反応リスクスコアを測定することができる。
移植片生検標本に加えて、別の較正点として、移植前の血液試料を使用することもできる。この試料中に蔓延しているクローン型は、拒絶反応に関連している可能性は低く、むしろ患者が遭遇した以前の抗原の履歴を表している。したがって移植後の血液試料を考慮する場合には、クローン型の決定において、移植前に存在したクローン型を差し引くことができる。次にこれらのクローン型を用いて、拒絶反応リスクのモデルを作成することができる。
本態様では、2つの較正試験を使用することができる：1つは移植前のもの、および1つは移植後の生検によるもの。次にこれらの較正を血液検査に由来するクローン型と共に用いて、拒絶反応リスクを測定することができる。
較正試験および集団研究を用いた相関クローン型の発見
別の態様では、上記のアプローチの併用により相関クローン型の同定を達成することができる。具体的には、これは、相関クローン型を予測するためのアルゴリズムを作成するための集団研究を用いることによって達成することができる。加えて、これは、移植片生検標本および/または移植前血液試料を使用する、同じ患者からの較正データを通して達成することができる。より好ましい態様では、両アプローチ：集団構築アルゴリズムおよび個々の較正を使用して、相関クローン型を最も正確に同定する。次に、訓練セットとしての集団研究の使用を通して、これらのクローン型のレベルを用いて拒絶反応リスクスコアを作成して、拒絶反応の可能性を予測する。
本態様では、2つの較正試験を使用することができる：1つは移植前のもの、および1つは移植後の生検によるもの。次にこれらの較正を血液検査に由来するクローン型と共に用いて、拒絶反応リスクを測定することができる。
相関クローン型を予測するためのアルゴリズムを作成するための集団研究という同じ概念を用いて、非常に類似した様式で、GVHDの予測を行うことができる。また、移植前のドナー試料から「負」の較正を作成することができる。アルゴリズムおよび較正の両方を用いたアプローチは、相関クローン型をより良好に予測する可能性が高い。相関クローン型のレベルが与えられる場合に、GVHDの可能性のスコアを計算するためのアルゴリズムを、上記のような様式で集団研究を用いて作成することができる。次いで、患者の次のセットにおいてGVHDの可能性を予測するために、このアルゴリズムを使用することができる。
実施例22
ナタリズマブで治療したMS患者におけるPML感染症のモニタリング
本発明の1つの態様は、MS患者における無症候性進行性多巣性白質脳症(PML)を検出するために、TCRおよび/またはBCRプロファイルを使用する。PMLは、ミエリンを合成するオリゴデンドロサイトの死滅を介して急速進行性脱髄性疾患を引き起こす場合の多い、重症でありかつ多くの場合に致命的な疾患である。これは、集団の大部分に潜伏期として存在するJCウイルスによって起こる。免疫抑制集団(例えば、エイズ)の一部では、ウイルスが再活性化されて、この重症疾患の発症を招く。加えて、移植後患者のような、薬物の使用を通して免疫抑制されている一部の患者もまた、PMLを発症し得る。いくつかの特定の薬物は、特定の患者集団におけるPMLのリスクと関連づけられている。例えば、ナタリズマブ(Tysabri)は、多発性硬化症(MS)患者の中でのPMLの10症例を超える発症と関連づけられ、しばらくの間販売が中止された。ナタリズマブは、多発性硬化症用の他のFDA認可薬物よりも効果的であることが十分に認められるが、その使用はPML発症の恐れによって制限されている。PMLが疑われたら、患者における薬物の濃度を下げるために、プラスマフェレーシスを行うことができる。MSとPMLの症状間の重複は、場合によってPMLの検出を遅らせ得る。無症候性PMLの早期検出が緊急に必要とされる。
一部の患者がPMLを発症した集団による血液試料から、これらのクローン型を識別することができる。この集団を用いて、PMLの後の発症と相関するクローン型を同定することができる。これらのクローン型が使用できることで、これらと他のクローン型を識別するパラメータを同定するためのアルゴリズムを作成することができる。
集団研究を用いた相関クローン型の発見
この場合には、アルゴリズムを作成して、PMLの出現に関連するクローン型を予測する。アルゴリズムは、疾患と相関すると見なされる1組のクローン型において訓練することができる。本発明のこの態様では、その一部が次にPMLを発症する、JCウイルスによる潜伏感染を有する患者の集団による、発見研究における血液(または他の体液)試料を使用することができる。これらの全試料からTCR(および/またはBCR)を配列決定することができ、個々のクローン型と感染病原体再活性化転帰との相関を使用して、相関クローン型と非相関クローン型を識別することができる。それら2つのクラスのクローン型を識別するパラメータを同定することができる。これらのパラメータには、1) 配列モチーフ：モチーフは、相関するクローン型と関連する特異的なVもしくはJ領域、組み合わせVJ、またはDJ領域内の短い配列であってよい；2) クローン型のサイズ；3) レベル：絶対レベル(100万個当たりの読み取りの数)または順位レベル；4) 他のクローン型との類似性：サイレント変化(同じアミノ酸をコードするヌクレオチドの違い)を有するもの、または保存的アミノ酸変化を有するもののような、他の高度に関連したクローン型の存在；5) BCRに関して、クローン型における体細胞突然変異のレベル、および/またはいくつかの生殖系列クローン型と体細胞突然変異によって異なる別個のクローン型の数。6) 特定のマーカーを保有する細胞の存在が含まれ得る。同じ感染病原体に対する免疫応答を開始している1組の患者から、相関および非相関クローン型を規定するための代替のまたは追加の方法が生じる。これらの患者において濃縮されたクローン型(特に、免疫応答前よりも顕著に高いレベルにあるクローン型)を相関的と見なすことができ、それらと他のクローン型を識別するパラメータを同定することができる。
同様に、活動性PMLを有する患者の試料から、またはインビトロ研究から相関クローン型を同定して、JCウイルス抗原に応答するクローン型を同定することもできる。応答するクローン型は、健常であるかまたは感染病原体に感染している可能性のある1名または複数名の対象に由来してよい。これらのクローン型を相関的と見なすことができ、それらと他のクローン型を識別するパラメータを同定することができる。
次に発見研究における試料からのプロファイルデータを用いて、再活性化の可能性を予測する。この訓練研究において判明している転帰を考慮すれば、標準的な交差検定技法を用いて、異なるクローン型のレベルが与えられる場合にPMLリスクスコアを作成するモデルを考案することができる。そのようにして、特定の時点でのTCR(および/またはBCR)の血液試料におけるプロファイルが与えられる場合に、再活性化の可能性に関連するスコアを作成することができる。このアルゴリズムを新たな患者からのデータと共に使用して、患者の相関クローン型を予測すること、および再活性化の可能性に関するPMLリスクスコアを作成することができる。
非常によく似た様式で、他の感染関連転帰を調べることができる。例えば、潜伏感染の再活性化に加えて、感染の排除を評価することもできる。さらに、TCRおよび/またはBCRレパートリーが与えられる場合に、特定の感染病原体に対する免疫を有する可能性を評価することができる。
実施例23
潜伏感染の再活性化のモニタリング
別の態様では、後に潜伏および再活性化が続く急性感染期を有する感染症をモニターするために、TCRおよびBCRプロファイリングを使用することができる。そのような疾患の例には、B型肝炎およびC型肝炎ならびにヘルペスウイルスが含まれる。早期での感染症の予測が望ましい。
較正試験を用いた相関クローン型の発見
別の態様では、各患者に対して較正試験を用いて、相関クローン型を同定する方法を実行することができる。患者が感染病原体に対して免疫応答を開始した前の時点の、同じ患者に由来する生体試料の存在は、相関クローン型を同定するのに役立ち得る。次にクローン型のこのセットを血液中で追跡することができ、再活性化の可能性について再活性化リスクスコアを作成する。再活性化の可能性を概算する再活性化リスクスコアを作成するために、利用可能な臨床データおよび相関クローン型のカウントを使用する、上記したものと類似の発見研究を通して、スコアを作成するためのアルゴリズムを導き出す。このスコアを使用するために、急性感染期中に臨床診療において新たな患者から採取された試料。このデータを潜伏期中に採取する後の試料と共に使用して、臨床目的で再活性化リスクを測定する。
較正試験および集団研究を用いた相関クローン型の発見
別の態様では、上記のアプローチの併用により相関クローン型の同定を達成することができる。具体的には、これは、相関クローン型を予測するためのアルゴリズムを作成するための集団研究を用いることによって達成することができる。相関クローン型は、感染症の転帰が判明している患者、および/もしくは感染病原体に対する積極的な免疫応答を有する1組の患者の集団研究から、ならびに/または感染病原体と反応するクローン型を同定するためのインビトロ実験から得ることができる。加えて、これは、関連感染病原体に対する積極的な免疫応答の時点でのより古いデータ点を使用する、同じ患者からの較正データを通して達成することができる。より好ましい態様では、両アプローチ：集団構築アルゴリズムおよび個々の較正を使用して、相関クローン型を最も正確に同定する。次に、訓練セットとしての集団研究の使用を通して、これらのクローン型のレベルを用いて再活性化リスクスコアを作成して、再活性化の可能性を予測する。このスコアを使用するために、急性感染期中に診療所において新たな患者から採取された試料をプロファイルする。このデータを潜伏期中に採取する後の試料と共に使用して、臨床目的で再活性化リスクを測定する。感染病原体の排除およびそれに対する免疫を調べるために、類似の構造を使用することができる。
実施例24
免疫療法中のアレルギー反応のモニタリング
アレルギー性鼻炎は、米国人口の〜11%が罹患しているよく見られる病態である。これは典型的に、花粉または埃に対するアレルギーである。曝露を排除することは難しく、これは油断のない努力を伴う。慢性鼻炎に用いられる最も一般的な治療は、充血除去薬、抗ヒスタミン薬、および鼻用ステロイド剤である。重症例では、免疫療法が行われる。免疫療法の目的は、患者を脱感作することである。まず多くの潜在的アレルゲンによる負荷を行って、患者が反応する特異的アレルゲンを同定する。次に、維持用量が達成されるまで、数カ月〜数年の期間にわたって漸増量のアレルゲンを患者に注射し、その後数年間治療を継続する。典型的に、患者は3〜6カ月以内に症状の改善を感じることができ、それは12〜18カ月ほどと遅くなる場合もあるが、大部分の患者は治療から恩恵を受けることがないか、または再発する。緩徐な用量増加の1つの理由は、十分に脱感作される前に患者が高用量のアレルゲンを投与される場合のアナフィラキシーのリスクである。
本発明の1つの態様では、TCR(および/またはBCR)プロファイルを使用して、アレルギー性鼻炎における疾患の状態を評価し、患者が関連アレルゲンに曝露された場合にアレルギー反応を開始する傾向がどれほどあるのかを予測するアレルギースコアを作成する。発見研究を行って、血液TCR(および/またはBCR)のプロファイルが与えられる場合に、アレルギー反応の可能性を決定することができることが考えられる。免疫療法処置の調整において、これを使用することができる。考えられ得る臨床決定は、治療が無効であると見なされる場合にそれを中断すること、注射レジメンを継続すること、または維持用量により速く到達するように治療を加速させることであってよい。
集団研究を用いた相関クローン型の発見
本発明のこの態様では、臨床転帰が判明している、血液試料のある、免疫療法中のアレルギー性鼻炎患者の集団を使用することができる。これらの全試料からTCR(および/またはBCR)を配列決定することができ、個々のクローン型とアレルギー転帰との相関を使用して、相関クローン型と非相関クローン型を識別することができる。続いて、それら2つのクラスのクローン型を識別するパラメータを導き出すことができる。これらのパラメータには、1) 配列モチーフ：モチーフは、相関するクローン型と関連する特異的なVもしくはJ領域、組み合わせVJ、またはDJ領域内の短い配列であってよい；2) クローン型のサイズ；3) レベル：絶対レベル(100万個当たりの読み取りの数)または順位レベル；4) 他のクローン型との類似性：サイレント変化(同じアミノ酸をコードするヌクレオチドの違い)を有するもの、または保存的アミノ酸変化を有するもののような、他の高度に関連したクローン型の存在；5) BCRに関して、クローン型における体細胞突然変異のレベル、および/またはいくつかの生殖系列クローン型と体細胞突然変異によって異なる別個のクローン型の数。6) 特定のマーカーを保有する細胞の存在が含まれ得る。相関および非相関クローン型を規定するための代替のまたは追加の方法は、特異的アレルゲンに対して陽性である患者由来の陽性アレルギー検査材料の生検標本を使用する。アレルゲンの注射部位において、相関クローン型の大幅な濃縮が存在することが予測される。これらと他のクローン型を識別するためのパラメータを、先述の通りに同定することができる。
次に血液試料からのプロファイルデータを用いて、アレルギー状態を予測する。この訓練研究において判明している転帰を考慮すれば、標準的な交差検定技法を用いて、異なるクローン型のレベルが与えられる場合にアレルギースコアを作成するモデルを考案することができる。特定の時点でのTCR(および/またはBCR)の新たな血液試料におけるプロファイルが与えられる場合に、アレルギースコアを作成して、この患者がアレルギー反応を開始する傾向の程度を評価することができる。
較正試験を用いた相関クローン型の発見
別の態様では、各患者に対して較正試験を用いて、相関クローン型を同定する方法を実行することができる。本方法は、患者から採取された、陽性アレルゲン反応を有する部位からの生検試料を含む。これは、患者が反応している特異的アレルゲンを決定するために行われた最初のアレルギー検査に由来してよく、または任意のさらなる治療注射の部位からの試料であってもよい。いくらかの症状発現が広がっている症例では、適切なクローン型が追跡されていることを確実にするために、これを2回以上行うことができる。これらの生検試料由来のTCRおよび/またはBCRを用いて、この試料中に蔓延しているクローン型によって定義される相関クローン型を同定することができる。次にクローン型のこのセットを血液中で追跡することができ、アレルギー反応の可能性についてスコアを作成する。アレルギー状態を評価するアレルギースコアを作成するために、利用可能な臨床データおよび相関クローン型のレベルを使用する、上記したものと類似の発見研究を通して、アレルギースコアを作成するためのアルゴリズムを導き出す。
較正試験および集団研究を用いた相関クローン型の発見
別の態様では、上記のアプローチの併用により相関クローン型の同定を達成することができる。具体的には、これは、相関クローン型を予測するためのアルゴリズムを作成するための集団研究を用いることによって達成することができる。加えて、これは、陽性アレルギー反応を有する部位からの生検標本を使用する、同じ患者からの較正データを通して達成することができる。より好ましい態様では、両アプローチ：集団構築アルゴリズムおよび個々の較正を使用して、相関クローン型を最も正確に同定する。次に、訓練セットとしての集団研究の使用を通して、これらのクローン型のレベルを用いてアレルギースコアを作成して、アレルギーの状態を予測する。
本発明の好ましい態様を本明細書に示し説明してきたが、そのような態様が一例として提供されるに過ぎないことは当業者には明白であろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置き換えが当業者に想起されるであろう。本発明を実施する際に、本明細書に記載された本発明の態様の様々な代替が使用され得ることを理解されたい。特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これら特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによって包含されることが意図される。

Claims (6)

  1. 以下の段階を含む、個体のT細胞受容体(TCR)および/またはB細胞受容体(BCR)のレパートリーをモニターする方法：
    (a) T細胞および/またはB細胞を含む個体から採取した試料の該細胞から核酸分子を増幅する段階であって、該核酸分子が、T細胞受容体遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域3(CDR3)の配列を含む、段階；
    (b) 個々の増幅核酸分子を空間的に単離する段階；
    (c) 該空間的に単離された個々の増幅核酸分子を可逆的終結標識ヌクレオチドを用いた合成によって配列決定して、それぞれCDR3配列の少なくとも30bpを含む少なくとも10,000件の配列読み取りを提供する段階；ならびに
    (d) 該試料中のCDR3配列のレベルからT細胞受容体および/またはB細胞受容体のレパートリーをモニターする段階。
  2. 配列の読み込みが99.9%の信頼度と異なる場合に配列の読み取りを異なるクローン型に合体させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 各CDR3配列が、Vセグメントを含み、増幅段階が、各Vセグメントに特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応における増幅段階を含む、請求項2記載の方法。
  4. 各試料が、少なくとも10,000個のB細胞または少なくとも10,000個のT細胞を含む、請求項1記載の方法。
  5. 試料が血液である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 各試料が、少なくとも10,000個のB細胞または少なくとも10,000個のT細胞を含み、配列決定する段階が、少なくとも100,000件の配列読み取りを提供する、請求項1記載の方法。
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