JP6694712B2 - Ｃｄ２６９（ｂｃｍａ）に対する抗体 - Google Patents

Ｃｄ２６９（ｂｃｍａ）に対する抗体 Download PDF

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Description

本発明は、CD269(BCMA)に結合する抗体若しくは抗体断片に関し、それによって、CD269とその天然型リガンド(BAFFとAPRIL)間の相互作用を遮断し、及び多発性骨髄腫と自己免疫疾患のようなプラスマ細胞を媒介とした疾患の治療でのそれらの使用に関する。
B細胞成熟抗原(BCMA)は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)のメンバー17である。その天然型リガンドは、液性免疫、B細胞発生及びホメオスタシスの種々様相の調節に終局的に関係する(さらなるリガンドとの相互作用によって)、B細胞活性化因子(BAFF; BLyS若しくはTALL-1、TNFSF13Bと呼ばれた)及び増殖誘導リガンド(APRIL、TNFSF13、CD256)(マッカイら(2003)Annu Rev Immunol 21:231-264)である。BAFFへの親和性は低いマイクロモルの範囲にあるが、APRILは、BCMAにほぼ100倍強く結合する(Bossenら(2006)Semin Immunol 18:263-275)。BCMAの発現は、プラスマ芽細胞及びプラスマ細胞上で主になされ、B細胞系列に制限されるが、ナイーブB細胞、胚中心B細胞及びメモリーB細胞では欠如する(Darceら(2007)J Immunol 179:7276-7286;ベンソンら(2008)J Immunol180:3655-3659;グッドら(2009)J Immunol 182:890-901)。
BCMA発現は、骨髄において、長命の固着性のプラスマ細胞の生存にとって重要である(オコーナーら(2004)J Exp Med199:91-98)。従って、BCMA欠陥のあるマウスは骨髄で減少したプラスマ細胞数を示し、脾臓中のプラスマ細胞のレベルには影響がない(Peperzakら(2013)Nat Immunol[Epub 2013 Feb 03、10.1038/ni.2527])。プラスマ細胞への成熟B細胞の分化は、BCMAノックアウトマウスにおいて正常におこる(Schiemannら(2001)Science 293:2111-2114;Xuら(2001)Mol Cell Biol21:4067-4074)。BCMAへのBAFF若しくはAPRILの結合は、NF-κB活性化を引き起こし(Hatzoglouら(2000)J Immunol 165:1322-1330)、それはBcl-xL若しくはBcl-2及びMcl-1のような抗アポトーシス性Bcl-2メンバーのアップレギュレーションを引き起こす(Peperzak et al. (2013) Nat Immunol [Epub 2013 Feb 03, 10.1038/ni.2527])。
BCMAは悪性プラスマ細胞上で、例えば、骨髄のB細胞非ホジキンリンパ腫である多発性骨髄腫(MM)で、及びプラスマ細胞障害のすべての事例の約4%を構成し、MMよりアグレッシブなプラスマ細胞性白血病(PCL)で、高度に発現される。MMとPCLに加えて、BCMAは、ホジキンリンパ腫患者のホジキンとリードシュテルンベルク細胞上で検出された(チウら(2007)Blood 109:729-739)。プラスマ細胞でのその機能に似て、BCMAに結合するリガンドは、BCMAを発現する多発性骨髄腫細胞の成長及び生存を調整することが示された(ノバックら(2004)Blood 103:689-694)。BCMAを経るBAFFとAPRILのシグナリングは悪性プラスマ細胞の生存促進性因子と見なされ; 従って、BCMA陽性の腫瘍細胞の喪失及び／又はリガンド受容体相互作用の遮断は、多発性骨髄腫及び自己抗体依存の自己免疫疾患の治療の結果を改善するだろう。
今日、多発性骨髄腫の治療に利用可能な様々なアプローチがある(ラープら(2009)Lancet 374:324-339)。化学療法は、多くの患者において、多発性骨髄腫の部分的なコントロールのみを可能にし; ほんのまれに、化学療法は完全寛解にもたらす。したがって、コンビネーション・アプローチにおいて、デキサメタゾンまたはプレドニゾンのような副腎皮質ステロイドの補足投与を一般に含み、しばしば適用される。しかしながら、副腎皮質ステロイドは、骨密度低下のような副作用によって悩まされる。幹細胞移植が、自身の幹細胞(自己由来)を使用し、又は近親者若しくは適合したドナー(同種異型)からの細胞を使用して提案された。多発性骨髄腫で行なわれたほとんどの移植は自己由来のタイプである。このような移植は、治癒的ではないが、選択された患者の延命効果を示した(スズキ(2013)Jpn J Clin Oncol 43:116-124)。
一方、サリドマイド及びその誘導体が、治療において最近適用されたが、最適以下の成功率及び高いコストであった。より最近、プロテアソーム抑制剤bortezomib(PS-341)が、再発性の手におえないMMの治療のために承認されており、多数の臨床試験で単独で若しくは有望な臨床の結果に帰着する確立している薬と併用使用された(Richardosnら(2003)New Engl J Med348:2609-2617;カプーアら(2012)Semin Hematol 49:228-242)。治療のアプローチはしばしば組み合わせられ、そのような併用治療のためのコストは相応して高く、また、成功率はいまだ改良に多くの余地を残す。多数の薬剤が同時に使用される場合、治療オプションのコンビネーションは、さらに副作用の蓄積により理想的ではない。プラスマ細胞疾患の治療のための新しいアプローチは、特に多発性骨髄腫で必要である。
特異的にプラスマ細胞を標的にすることは、自己免疫疾患の治療のための大きな利益をもたらす。自己反応性抗体が疾患病理学上重大である、全身性紅斑狼瘡(SLE)及びリューマチ関節炎(RA)のような自己免疫疾患状態への伝統的治療法は、症状の重症度及び患者の状況に依存する(スコットら(2010)Lancet 376:1094-1108、D'Cruzら(2007)Lancet 369:587-596)。一般に、疾病の穏やかな対象には、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)若しくは疾患修正性抗リューマチ薬(DMARD)でまず処置される。活発な疾病による器官機能障害をふくむSLEのより厳しい対象には、シクロフォスファミドのような強い免疫抑制物質、循環する細胞をターゲットとする細胞障害性薬との併用でステロイド処置がなされる。
極最近、Belimumab（サイトカイニンBAFFを標的とする抗体で、BAFFは自己免疫疾患の患者の血清で高いレベルで見つかる）が、SLEでの使用について食品医薬品局(FDA)によって承認を受けた。しかしながら、新しく形成されたB細胞のみが、ヒトにおける生存についてBAFFに依存し、メモリーB細胞及びプラスマ細胞は、選択的なBAFF阻害を受けにくいものであった(ヤコービら(2010)Arthritis Rheum 62:201-210)。
慢性関節リウマチについては、TNF抑制剤が、Abatacept、Rituximab及びTocilizumab他に続く、最初に許可された生物学的薬剤であった: それらは、関節炎及び死滅に関係する重要な炎症性のパスウェイを抑制するが、相対的な免疫抑制により高い感染リスクをもたらした(チャンら(2010)Nat Rev Immunol 10:301-316及びカイザー(2011)Curr Rheumatol Rev7:77-87)。
これらの生物製剤の承認にもかかわらず、RAとSLEに苦しむ患者は、しばしば、自己免疫のマーカーの持続的存在をしめし、それは、Rituximab及び高投与量グルココルチコイド及びシクロフォスファミド治療によるCD20媒介とした臓器切除（アブレーション）(ablation)に抵抗する骨髄中の長命性の固着性プラスマ細胞の存在におそらく関係する。SLEでの現在の戦略は、移植関連死の危険は重大な懸念のままであるが、免疫アブレーション(ablation)及び自己由来の幹細胞移植による免疫系のリセットを含む(Fargeら(2010)Haematologica 95:284-292)。
Bortezomibのようなプロテアソーム抑制剤の使用は、プラスマ細胞喪失の代替戦略かもしれない: タンパク質合成の高い割合及び制限のある蛋白質分解キャパシティーのために、プラスマ細胞はプロテアソーム抑制剤に超過敏である。Bortezomibは、再発性多発性骨髄腫の治療のために最近承認され、また、ループス様疾患をもつマウスにおける最近の研究は、Bortezomibがプラスマ細胞を喪失し、ループス様疾患をもつマウスを腎炎から保護することを示した(Neubertら(2008)Nat Med 14:748-755) 。しかしながら、プロテアソーム抑制剤は、特異的にプラスマ細胞に作用せず、また、末梢神経障害のような副作用の発生率は高い(ArAStu-Kapurら(2011)ClinCancer Res17:2734-2743)。
治療用抗体は、それらの標的への結合に関するいくつかのメカニズムによって作用されうる。その結合は、シグナル形質導入の引き金となり、それはプログラム化された細胞死に導きうる(チャベズ−ギャランら(2009)Cell Mol Immunol 6:15-25)。さらに、それは、受容体若しくはリガンドに結合することにより、そのリガンドでの受容体の相互作用をブロックしうる。この遮断は、もし、生存にとって重要なシグナルに影響あるなら、アポトーシスを引き起こしうる(チウら(2007)Blood 109:729-739)。細胞喪失に関して、2つの主なエフェクター・メカニズムが知られている。1番目は標的細胞への補体依存性の細胞障害(CDC)である。そして、3つの異なるパスウェイが知られている。しかしながら、抗体の場合は、CDCのための重要なパスウェイは、IgG若しくはIgMの定常ドメインへのC1qの結合を通じて始められる古典的なパスウェイである(ワングとウェイナーの(2008)Exper Opin Biol Ther8:759-768)。
第2のメカニズムは抗体依存性細胞障害活性(ADCC)と呼ばれる。このエフェクター機能は、抗体のそれぞれのアイソタイプのFc受容体を発現する免疫細胞の動員によって特徴づけられる。ADCCは、IgG分子と単独で若しくは免疫複合体として結合されうる、Fcガンマ受容体(FcγR)の活性化により大部分は媒介される。Fcガンマ受容体(FcγR)を活性化する、マウスは3つ(FcγRI、FcγRIII及びFcγRIV)及びヒトは5つ(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA及びFcγRIIIB)を提示する。
これらの受容体は、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞のような自然の免疫細胞上で発現され、したがって、自然のものを適応性のある免疫系とリンクさせる。細胞タイプに依存して、抗体標識化標的細胞の認識には、FcgR担持細胞のいくつかの行動様式がある。顆粒球は、一般に血管作動性の細胞障害性物質若しくは化学誘引物質を遊離するが、さらに、食細胞運動ができる。単球とマクロファージは、食細胞運動、酸化的バースト、細胞障害活性若しくはナチュラルキラー細胞がグランザイムとパフォリンを遊離する炎症誘発性サイトカイニンの遊離に応答し、そして、標的細胞及びそれらのFasリガンド上でFasとの相互作用によってもまた細胞死を引き起こしうる(Nimmerjahn and Ravetch (2008) Nat Rev Immunol8:34-47; Wang and Weiner (2008) Expert Opin Biol Ther 8:759-768; Chavez-Galan et al. (2009) Cell Mol Immunol 6:15-25)。
CD269(BCMA)を結合する抗体及び様々なB細胞関連医学的疾患の治療でのそれらの使用は、当該技術分野で既知である。ライアンら(Molecular Cancer Therapeutics, 2007 6(11), 3009)は、BCMAタンパク質のアミノ酸5〜54のペプチドを使用して、ラットでのワクチン化によって得られた抗BCMA抗体について記述する。そこに記述された抗体は、BCMAを結合し、APRIL依存性NF-KB活性化をブロックし、ADCCを引き起こす。抗体の特異的エピトープに関する詳細は開示されていない。
WO 2012/163805は、キメラ化及びヒト化抗体のような、BCMA結合蛋白質について記述し、BAFF及び／又はAPRILのBCMAとの相互作用をブロックするそれらの使用、及び多発性骨髄腫のようなプラスマ細胞悪性腫瘍の処置でのそれらの可能性ある使用を開示する。そこに開示された抗体は、BCMAタンパク質のアミノ酸4〜53の組み換えペプチドを使用して、マウスでのワクチン化によって得られた。WO2010/104949は、さらにBCMAの細胞外ドメインを好適に結合する様々な抗体、及びB細胞関連疾病状態と疾患の処置における使用を開示した。抗体の特異的エピトープに関する詳細は開示されていない。
WO 2002/066516は、BCMAとTACIの両方に結合する二価抗体を開示し、自己免疫疾患及びB細胞癌の治療でのそれらの潜在的な使用を開示する。BCMAの不確定な細胞外ドメインは、抗体の抗BCMA部分を生成するために使用される。WO 2012/066058は、BCMAとCD3の両方を結合する二価抗体を示し、また、B細胞関連疾患の治療でのそれらの潜在的な使用を開示した。抗体の結合特性及び特異的エピトープに関する詳細は、いずれでも開示されていない。
WO 2012/143498は、抗BCMA抗体の使用を含む多発性骨髄腫患者の層別化のための方法を開示する。好ましい抗体は、「ヴィッキー-1」(GeneTexからのIgG1サブタイプ)、及び「マブ193」(R&DシステムズからのIgG2aサブタイプ)として知られる。抗体の結合特性及び特異的エピトープに関する詳細は、いずれでも開示されていない。
先行技術に照らし、本願発明の解決すべき技術的課題は、多発性骨髄腫と自己免疫疾患のような病原性プラスマ細胞に関連した疾患を治療するのにふさわしい医薬の提供である。この課題は、独立請求項の態様によって解決される。本発明の好ましい実施態様は、従属請求項によって提供される。したがって、本発明の目的は、CD269(BCMA)、特にCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに結合する、単離された抗体若しくは抗体断片を提供することである。
本発明は、CD269(BCMA)を結合する単離された抗体又は抗体断片に関し、該抗体はCD269(BCMA)の残基13〜32(アミノ酸13〜32はSEQ ID NO.14に示される)の1つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
残基13〜32のアミノ酸配列は、SEQ ID No.14に示される。CD269のN-末端配列は、SEQ ID NO.13に示される。CD269の細胞外ドメインはSEQ ID No.12として示される。
SEQ ID No.12によるCD269の細胞外ドメインを含む抗原は、本発明の抗体の結合特異性を生み出すためにワクチン化において使用された。全CD269タンパク質又は膜結合型若しくは細胞内ドメインを含むその断片は、抗体生成中の抗原がCD269の隠れた若しくは細胞内ドメインに結合する抗体を生産するので、このような物質を治療適用のために不利化若しくは適さなくする。それゆえ、本発明の抗体はCD269の細胞外部分にそれらが結合することにより特徴とされる。細胞外ドメイン内の特異的なエピトープは、さらに本発明の好ましい新規で予期しない特徴的特色を提供する。
本発明の一つの実施態様によって調製されたFab断片は、精製されたBCMAの細胞外ドメインとの複合体によって結晶化され、該複合体構造が明らかにされた。構造分析は、本発明の抗体のエピトープの詳細情報を明らかにし、その生物学的関連性を明らかにした。当該ドメインが、BAFFとAPRIL(CD269の2つの自然なリガンド)の結合部位との重要なオーバーラップを示すので、本発明の抗体によるCD269(BCMA)細胞外ドメインの残基13〜32の1つ以上のアミノ酸を含むエピトープとの結合は、有利な特性である。当該技術分野で現在までに開示された抗CD269抗体は、BAFFとAPRILの結合部位とのこのような包括的なオーバーラップを示すことを開示していない。
ある一つの実施態様において、本発明の単離された抗体若しくは抗体断片は、該抗体がCD269(BCMA)のアミノ酸13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27若しくは32の1つ以上を含むエピトープに結合するということで特徴付けられる。別の具体化態様では、本発明の単離された抗体若しくは抗体断片は、抗体がCD269(BCMA)のアミノ酸13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27及び32から成るエピトープに結合するという点で特徴づけられる。本発明で提供される結晶構造データによって同定されるように、これらの残基は本発明の抗体と直接に相互作用するアミノ酸を表わす。これらの残基の番号付けは、CD269のN-末端配列を提供する、SEQ ID No.13に関しておこなわれた。
本発明の一つの実施態様において、単離された抗体若しくは抗体断片は、CD269(BCMA)への抗体の結合が、BAFF-CD269及び／又はAPRIL-CD269相互作用を遮断するという点で特徴を有する。
本発明の抗体 (例えばJ22.9-xi)の、CD269の細胞外ドメインへの結合は、BAFF-CD269相互作用を遮断する。APRILとBAFFの結合部位が本発明の抗体に対するの同じ位置にエピトープを位置付することから、CD269へのJ22.9-xiの結合は、APRIL-CD269相互作用をもブロックする。BAFF/APRIL-CD269相互作用は、細胞の抗アポトーシス性と成長シグナルをそれぞれ引き起こすと思われる(Mackay, Schneider et al. (2003) Annu RevImmunol 21:231-264; Bossen and Schneider (2006) Semin Immunol 18:263-275).。
その結晶構造が明らかにされ、それらの相互作用サイトがマップ化され、APRIL及びBAFFの結合部位と本発明の抗体に対する特異的エピトープの比較によって、自然なリガンドと本発明の抗体の結合部位における包括的なオーバーラップを明らかにした。これは、本発明の有益で予期しない態様を表わし、BAFF-CD269及び／又はAPRIL-CD269相互作用の信頼できて有効な遮断を可能にする。
本発明はここに記述される単離された抗体若しくは抗体断片に関し、該抗体は、CD269(BCMA)の残基13、15、17、18、19、22、26、27、30、31、32、33、34、35の１以上のアミノ酸を含む、特にアミノ酸13、15、17、18、19、22、26、27、32を含むエピトープへの結合により、APRIL-CD269相互作用を遮断させる。これらのアミノ酸は、CD269におけるAPRILの結合部位、及びここに記述される抗体及びAPRILの両方を結合する、CD269のオーバーラップする残基にそれぞれ相当する。
本発明は、別の実施態様において、ここに記述される単離された抗体若しくは抗体断片に関係し、該抗体は、CD269(BCMA)の残基13、15、16、17、18、19、22、25、26、27、29、30、31、32、34、35の1つ以上のアミノ酸、特にアミノ酸13、15、16、17、18、19、22、26、27、32を含むエピトープへの結合によりBAFF-CD269相互作用を遮断する。これらのアミノ酸は、CD269におけるBAFFの結合部位に相当し、及びここに記述される抗体とBAFFの両方とを結合する、CD269のオーバーラップする残基にそれぞれ相当する。
CD269を結合する抗体は、当該技術分野で、CD269とのAPRIL-若しくはBAFF-相互作用を潜在的に遮断することが記述されていたが、そのような抗体の特定のエピトープに関して何らの開示は提供されていなかった。以前に記述された抗体が、エピトープに、本発明の抗体のような、包括的なオーバーラップをもって、結合することは想定できない。たとえ、CD269とのAPRIL-若しくはBAFF-相互作用が遮断されることが示されていたとしても、これは、潜在的に、実質的に異なるエピトープに結合することによりおこりそしてAPRIL若しくはBAFFのドッキングの後の立体障害をおこすものであった。先行文献の抗体によって引き起こされたCD269とのAPRIL-若しくはBAFF-相互作用の遮断の程度は、先行文献には記述されていない。
本発明の抗体は、効果的で信頼できる遮断を可能にし、それは潜在的に当該技術分野で記述された抗体に比較して改善された技術的効果を表わす。生体外でのブロッキング分析は、例えばヒトBCMA細胞外ドメイン及び組み換えBAFF若しくはAPRILで、BAFF及び／又はAPRIL遮断の決定及び比較が行ないうる。
好ましい具体的態様において、エピトープ特異性は、ここに記述の抗体によって示された高い親和性との組み合わせで、新規及び予期しない技術的な効果を表わす。本質において、BAFFとAPRILの結合部位のオーバーラップとの組み合わせでJ22.9の例外的に高い親和性は、自然なリガンドの結合の単なる「遮断」若しくは「ブロッキング」のみを提供するのではなく; むしろ本発明の抗体の極めて高い親和性が、本発明の抗体が存在する場合に、天然型リガンドが、それらのBCMA標的への結合によって、実質的に完全に若しくはほとんど完全に排除されることを保証する。
以下の実施例において示すように、ここに記述される抗体の親和性は、先行技術で試みられた同様のアプローチより驚くほど高くそして比較においてよりよい。pM範囲(下記に示した)でのKdは、一般的知識で期待できない顕著な親和性が、共通的に認められる。
別の観点で、本発明の抗体若しくは抗体断片は高い親和性をもってCD269に結合し、例えば、Biacoreのような表面プラズモン共鳴によって測定された時、抗体は、20nM以下の親和性、15nM以下の親和性、5nM以下の親和性、1000 pM以下の親和性、500pM以下の親和性、又は100pM以下、800pM以下、若しくは例えば54pMの親和性で、ヒトCD269に結合する。一層の具体化態様では、Biacoreのような表面プラズモン共鳴によって測定された時、約1pMと約500pMの間、約10pMと約200pMの間、若しくは、約20pMと100pMの間で、該抗体はヒトCD269に結合する。本発明の一つの実施態様では、抗体は、およそ50pM の親和性をもってCD269に結合する。
抗体の配列及び構造の好適な実施態様
本発明の一つの実施態様において、単離された抗体若しくは抗体断片は、それが、キメラ化、ヒト化、部分的ヒト化、二価特異性、若しくは単一鎖抗体、若しくはそれらのコンビネーションであるという点で特徴をもつ。
本発明の実施態様で示した抗体は、ヒト定常ドメイン及びマウスに由来したCD269特異性をもつVH及びVLドメインを含み、主としてキメラ化、部分的ヒト化抗体に関係する。しかしながら、本発明は、さらにヒト化配列、特に好適なVL及びVH結合領域に関し、それはここに記述される適切なリガンド親和性を維持する。
一つの実施態様において、抗体若しくはその断片は、抗体が、マウス抗体から得られるVL及びVHドメインを含むキメラ抗体であり、該VL及びVHドメインはここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに結合されうる配列を含み、VL及びVHドメインがヒトCL及びCHドメインに、それぞれ、融合される。
一つの実施態様において、抗体若しくはその断片は、VL及びVHドメインが、ヒトIgカッパ及びIgG1定常ドメインにそれぞれ融合されるという点で特徴をもつ。
ここに開示する特別な配列、特に、結合に関与するVL及びVH領域のCDR領域は、実験例で示したように、特異的で強い結合性を示したということは実際驚くべきことであった。当業者技術で既知のCD269結合の特性をもつ大多数の抗体は、悪い結合特性を示した; それはより少ない特異性をもち及び／又は抗原エピトープとのより弱い相互作用を示す。
VHドメインに関する好ましい具体的態様
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VHドメインを含み、ここで、該VHドメインは、少なくとも80%、好適には90％のCDR xH1 (SEQ ID No. 57; X8YWMS), CDR xH2(SEQ ID No. 58; EINPDSSTINYAPSLKX11) 及び/又は CDR H3 (SEQID No. 3; SLYYDYGDAMDYW)(ここでX8はR若しくはD及びX11はD若しくはGである)との配列同一性をもつ少なくとも一つのCDR領域を含み、そして、該抗体若しくはその断片は、特にここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。ここに提供した一般的な配列式、特に可変残基X8及びX11によって決定された配列バリアントは、本発明のキメラ化、マウス及び/又はヒト化配列のユニタリー表現に関係し、特にここに記述のマウス・キメラ抗体に関係がある。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VHドメインを含み、ここで、該VHドメインは少なくとも80%、好適には90％のCDR H1 (SEQ ID No. 1; RYWMS), CDR H2 (SEQ ID No. 2; EINPDSSTINYAPSLKD)及び/又は CDR H3 (SEQ ID No. 3; SLYYDYGDAMDYW)との配列同一性をもつ少なくとも一つのCDR領域を含み、該抗体若しくはその断片はここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、少なくともCDR H1の残基W33とS5、CDR H2の残基E1、及びCDR H3の残基L1 、Y2及びY3が修飾されていない点で特徴づけられる。これらの残基は、J22.9-xiのVH配列の残基W33、S35、E50、L99、Y100、及びY101に相当する。重鎖CDR領域のこれらの残基は、直接エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列において維持されるべきである。これらの特別な残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VHドメインを含み、該VHドメインはCDR H1 (SEQ ID No. 1; RYWMS), CDR H2 (SEQ ID No. 2; EINPDSSTINYAPSLKD)及び CDR H3 (SEQID No. 3; SLYYDYGDAMDYW)の複数のCDR領域を含む。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VHドメインを含み、該VHドメインはSEQ ID No. 60の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性を含み；SEQ ID No. 60：(X1VQLX2X3SGGGLVQPGGSLX4LSCAASGX5X6FX7X8YWMSWVRX9APGKGLEWX10GEINPDSSTINYAPSLKX11X12FX13ISRDNAKNTLYLQMX14X15X16RX17EDTAX18YYCASLYYDYGDAMDYWGQGTX19VTVSS)(ここで X1: Q, E; X2:Q, V; X3: Q, E; X4: K, R; X5: I, F; X6: D, T; X7: S, D; X8: R, D; X9: R, Q;X10: I, V; X11: D, G; X12: K, R; X13: I, T; X14: S, N; X15: K, S; X16: V, L;X17: S, A; X18: L, V; X19: S, L) 及び、ここで該抗体若しくはその断片は、ここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。ここに提供した一般的な配列式、特にSEQ ID No. 60のVH配列の可変残基X1〜X19によって決定された配列バリアントは、本発明のキメラ化、マウス及び/又はヒト化配列のユニタリ表現に関係し、特にここに記述のマウス・キメラ抗体に関係がある。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VHドメインを含み、該VHドメインは、SEQ ID No. 7の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性を含み；SEQ ID No. 7 ：(QVQLQQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFSRYWMSWVRRAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTSVTVSS)及び、ここで該抗体若しくはその断片は、ここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No. 60 若しくは 7のVH配列の少なくとも残基W33、S35、W47、E50、L99、Y100、Y101及びA106が修飾されていないということに特徴付けられる。重鎖のこれらの残基は、エピトープとの相互作用に直接関係し、抗体配列で維持されるべきである。これらの特別な残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの好適な実施態様において、単離された抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No.7によるVHドメインを含む。
VLドメインの好適な実施態様
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VLドメインを含み、該VLドメインは、少なくとも80%、好適には90％のCDR L1 (SEQ ID No. 4; KASQSVDSNVA), CDR xL2 (SEQ IDNo. 59; SX14X15LRFS) 及び/又は CDR L3 (SEQ ID No. 6;QQYNNYPLTFG) （ここでX14はA若しくはD及びX15はS若しくはDである)への配列同一性をもつ少なくとも一つのCDR領域を含み、そして、該抗体若しくはその断片は、特にここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。ここに提供した一般的な配列式、特に可変残基X14及びX15によって決定された配列バリアントは、本発明のキメラ化、マウス及び/又はヒト化配列のユニタリー表現に関係し、特にここに記述のマウス・キメラ抗体に関係がある。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、VLドメインを含み、該VLドメインはCDR L1 (SEQ ID No. 4; KASQSVDSNVA), CDR L2 (SEQ ID No.5; SASLRFS) 及び/又は CDR L3 (SEQ ID No. 6; QQYNNYPLTFG)への少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性をもつ少なくとも一つのCDR領域を含み、該抗体若しくはその断片はここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、CDR L1の残基S8、N9、A11、CDR L2の残基S1、S3、L4、F6及びCDR L3の残基Q1 、Y3、Y6、L8が修飾されていない点で特徴づけられる。これらの残基は、J22.9-xiのVL配列の残基S31, N32, A34, S50, S52, L53, F55, Q89, Y91, Y94 及び L96に相当する。軽鎖CDR領域のこれらの残基は、直接エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列において維持されるべきである。これらの特別な残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片はVLドメインを含み、該VLドメインは、CDR L1 (SEQ ID No. 4; KASQSVDSNVA), CDR L2 (SEQ ID No.5; SASLRFS) 及び CDR L3 (SEQID No. 6; QQYNNYPLTFG)の複数のCDR領域を含む。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片はVLドメインを含み、該VLドメインはSEQ ID No. 61の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性を含み；SEQ ID No. 61：(DIVMTQSX1X2X3X4X5X6SVGDX7VX8X9TCKASQSVDSNVAWYQQKPX10QX11PKX12LIX13SX14X15LRFSGVPARFX16GSGSGTDFTLTISX17LQSEDX18AX19YX20CQQYNNYPLTFGAGTKLELKR)(ここで X1: Q, P; X2:R, A; X3: F, T; X4: M, L; X5: T, S; X6: T, V; X7: R, E; X8: S, T; X9: V, L;X10: R, G; X11: S, A; X12: A, L; X13: F, Y; X14: A, D; X15: S, D; X16: T, S;X17: N, S; X18: L, F; X19: E, V; X20: F, Y)及び、ここで該抗体若しくはその断片は、ここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。ここに提供した一般的な配列式、特にSEQ ID No. 61のVL配列の可変残基X1〜X20によって決定された配列バリアントは、本発明のキメラ化、マウス及び/又はヒト化配列のユニタリー表現に関係し、特にここに記述のマウス・キメラ抗体に関係がある。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片はVLドメインを含み、該VLドメインは、SEQ ID No. 8の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性を含み；SEQ ID No.8：(DIVMTQSQRFMTTSVGDRVSVTCKASQSVDSNVAWYQQKPRQSPKALIFSASLRFSGVPARFTGSGSGTDFTLTISNLQSEDLAEYFCQQYNNYPLTFGAGTKLELKR)、該抗体若しくはその断片はここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、少なくともSEQ ID No.61若しくは8の残基S31、N32、A34、Y36、F49、S50、S52、L53、F55、G66、S67、Q89、Y91、Y94 及びL96が修飾されていないという点で特徴をもつ。軽鎖のこれらの残基は、直接エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列において維持されるべきである。これらの特別な残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No.8によるVLドメインを含む。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No.7によるVHドメインとSEQ ID No.8によるVLドメインを含む。
ヒト化抗体バリアントについての好適な態様
本発明の実施例で示した抗体は、ヒト定常ドメイン、及びマウスに由来したCD269特異性を持つVH 及びVLドメインを含み、キメラ化若しくは部分的ヒト化抗体に関係する。しかしながら、本発明は、さらにヒト化配列、特に好適なVL及びVH結合領域に関し、それはここに記述される適切なリガンド親和性を維持する。それゆえ、本発明は、キメラ化、ヒト化、部分的ヒト化、二価特異性、若しくは単一鎖抗体、若しくはそれらのコンビネーションであるここに記載の単離された抗体若しくは抗体断片に関係する。
ここに詳細に記述するように、J22.9-xiの本発明の好ましい実施態様の配列は、ヒト被験者への投与のためにより多くの互換性をもつ薬剤を提供するためにヒト化された。J22.9-xiの様々なヒト化された配列バリアントが生成され、CD269(BCMA)への結合親和性及び特異性に関してテストされた。結合性についての分析からの最初の結果は、ヒト化された配列がキメラ化試薬J22.9-xiの所望の結合特性を維持することを実証した。
ヒト化hVHドメインについての好適な態様
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、ヒト化若しくは部分的にヒト化されたVHドメインを含み、ここで、該VHドメインは、少なくとも80%、好適には90％のCDR hH1 (SEQ ID No. 15; DYWMS), CDR hH2 (SEQ ID No.16; EINPDSSTINYAPSLKG) 及び/又は CDR hH3 (SEQID No. 3; SLYYDYGDAMDYW)の配列への配列同一性をもつ、少なくとも一つのCDR領域を含み、そして、該抗体若しくはその断片は、特にここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、少なくともCDR hH1の残基W3とS5、CDR hH2の残基E1、CDR hH3の残基S1、L2及びY3が修飾されていないということに特徴をもつ。これらの残基は、J22.9-xiのヒト化された形式のVH配列の残基W33、S35、E50、L99、Y100及びY101に相当する。重鎖CDR領域のこれらの残基は、直接、エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列で維持されるべきである。これらの特に残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られていたルーチン手段によって行なわれうる。配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、ヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVHドメインを含み、ここで、該VHドメインはCDR hH1(SEQ ID No.15; DYWMS)、CDR hH2(SEQ ID No.16;EINPDSSTINYAPSLKG)及びCDR hH3(SEQ ID No.3; SLYYDYGDAMDYW)のCDR領域を含む。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、ヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVHドメインを含み、該VHドメインは、SEQ ID No. 18〜25の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性を含み、及び、該抗体若しくはその断片は、ここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No.18〜25による配列の、少なくとも、残基W33、S35、W47、E50、L99、Y100及びY101が修飾されていないことで特徴がある。重鎖のこれらの残基は、直接に、エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列で維持されるべきである。これらの特に残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。したがって、配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No.18〜25のうちの1つの配列によるヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVHドメインを含む。
ヒト化されたhVLドメインについての好適な実施態様
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、ヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVLドメインを含み、該VLドメインはCDR hL1 (SEQ ID No. 4; KASQSVDSNVA), CDR hL2 (SEQ ID No. 17; SDDLRFS) 及び/又は CDR hL3 (SEQ ID No. 6; QQYNNYPLTFG)の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性をもつ、少なくとも一つのCDR hL1（好適には３つ全て）を含み、及び、該抗体若しくはその断片は、ここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、少なくとも、CDR hL1の残基S8、N9、A11、CDR hL2の残基S1、L4、F6、及びCDR hL3の残基Q1、Y3、Y6、L8が修飾されていないという特徴をもつ。これらの残基は、J22.9-xiのVL配列のヒト化された形式の、残基S31、N32、A34、S50、L53、F55、Q89、Y91、Y94、及びL96に相当する。軽鎖CDR領域のこれらの残基は、直接に、エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列で維持されるべきである。これらの特に残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。したがって、配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、ヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVLドメインを含み、ここで該VLドメインはCDR hL1(SEQ ID NO.4; KASQSVDSNVA)、CDR hL2(SEQ ID No.17; SDDLRFS)及びCDR hL3(SEQ ID No.6;QQYNNYPLTFG)のCDR領域を含む。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、ヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVLドメインを含み、該VLドメインは、SEQ ID NO.26〜56の配列と少なくとも80%、好ましくは90%の配列同一性をもち、該抗体若しくはその断片は、ここに記述されるCD269(BCMA)の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。
一つの好適な実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ IDNo.26〜56による配列の、少なくとも残基S31、N32、A34、Y36、F49、S50、L53、F55、G66、S67、Q89、Y91、Y94、及びL96が修飾されていない特徴をもつ。軽鎖のこれらの残基は、直接に、エピトープとの相互作用に関係し、抗体配列で維持されるべきである。これらの特に残基の外側のアミノ酸の修飾は、当業者に知られるルーチン手段によって行なわれうる。したがって、配列バリアント（それらはリストされた特定の配列に少なくとも80%の配列同一性を示し、好適にはエピトープとの相互作用のサイトでの配列の修飾がなく、所望の結合特異性を維持する）は本発明に包含される。
一つの実施態様において、本発明の抗体若しくは抗体断片は、SEQ ID No.26〜56のうちの1つの配列によるヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVLドメインを含む。
本発明のさらに好適な実施態様
さらなる実施態様において、ここに記述される抗体若しくは抗体断片が、SEQ ID No.１〜8及び15〜61のアミノ酸配列への修飾が存在し、それが保存的置換であるという特徴をもつ。
さらなる実施態様において、ここに記述される抗体若しくは抗体断片が、SEQ ID No.１〜8及び15〜61のアミノ酸配列への修飾が存在し、それがアラニン置換であるという特徴をもつ。
したがって、本発明は、ここに提供される、例えばCDR H1(xxWxS)、CDRH2(Exxxxxxxxxxxxxxx)、CDR H3(LYYxxxxxxxxx)、CDR L1(xxxxxxxSNxAx)、CDR L2(SxSLxFx)及び／又はCDR L3(QxYxxYxLxxx)のようなCDR領域の配列バリアントに関し、ここで、Xは所定のアミノ酸、好適には保存的置換若しくはアラニン置換である。
一つの実施態様において、本発明は、CD269標的との直接的相互作用をする1つ以上のアミノ酸及び/又は水相互作用を経て相互作用する一つ以上のアミノ酸によって定義されたアミノ酸配列を含む(表1〜6を参照) 、抗体若しくは抗体断片に関する。エピトープへのここに記述される抗体の結合に関与する多くの水相互作用は、尋常でない驚くべき結合の様相を表わす。特に、ここに記述の特定のエピトープに向けられた抗体の高い親和性は、抗体とエピトープ間の結合表面に関与する多くの水相互作用との組み合わせで、本発明の驚くべき予期しない効果を達成する。
それゆえ、本発明は、抗体若しくは抗体断片に関し、それは以下に記述されるアミノ酸配列を含み；SEQ ID No. 1〜8若しくは15〜61による配列で、該配列は、軽鎖のSer31、Ser31、Asn32、Tyr36、Ser50、Ser52、Gly66、Gln89、Tyr91及び／又はTyr94、及び/又は重鎖のTrp33、Ser35、Trp47、Glu50、Leu99及び／又はTyr101を含むグループから選ばれ、表6による水架橋によって標的エピトープと相互作用表面に関係する特異的アミノ酸残基の存在によって特徴づけられる。
本発明の抗体は、ここに記述される抗体との水架橋によって相互作用に関与するエピトープのアミノ酸残基によってさらに特徴づけられる。関連する態様は表6に明示される。したがって、本発明は、一つの実施態様において、軽鎖の残基Ser31が水分子によってCD269のThr32と相互作用するということで特徴づけられる。本発明の抗体の結合特性のこのような記述は、表6に示される各相互作用について説明される。
さらに、ここに記述の抗体の配列バリアントは本発明に包含され、それは「水架橋」相互作用に関与する一つ以上の残基が、水架橋の費やし(at the expence of)で該配列へ直接側鎖相互作用に置き換えるために修飾される。例えば、変異若しくは変更が、相互作用の親和性に実質的に影響することなしに、アミノ酸配列において、相互作用表面から水を移し(displacing)うる。
本発明は、ここに記述されるアミノ酸配列順序を含む抗体または抗体断片に関し、該配列はSEQ IDNo. 1〜8若しくは15〜61であり、その配列は、軽鎖のSer31、Ser31、Asn32、Tyr36、Ser50、Ser52、Gly66、Gln89、Tyr91及び／又はTyr94、及び/又は重鎖のTrp33、Ser35、Trp47、Glu50、Leu99及び／又はTyr101を含むグループから選ばれ、表6による水架橋による標的エピトープと相互作用表面に関係する特定のアミノ酸残基の存在によって特徴づけられる。このような位置におけるバリエーションは、何らかの所定のアミノ酸置換、好適には、エピトープ親和性及び特異性に関し同様の結合特性を維持し、相互作用から水を効果的に移す(displace)アミノ酸置換に関係がある。
本発明の別の実施態様において、本発明の抗体のCDR配列は修飾され得、結果として、表1及び2にて特定されたもの以外のアミノ酸は修飾されうる。直接的結合の役割あるアミノ酸の維持はここに記述される結合特異性に結びつく。アミノ酸は修飾されるが標的エピトープとは直接的には相互作用しない、抗体バリアントは、本発明の範囲に包含される。
本発明の一つの実施態様は、SEQ ID No. 1〜3の修飾された配列に関し、それによって、各配列は、位置Trp33、Glu50、Leu99、Tyr100、Tyr101及び／又はAla106で、配列変更を示さない。
本発明の一つの実施態様は、SEQ ID No.4〜6の修飾された配列に関係し、それによって、各配列は、位置Ser31、Asn32、Ala34、Tyr36、Phe49、Ser50、Ser52、Leu53、Ser67、Phe55、Gln89、Tyr91、Tyr94及び／又はLeu96で配列変更を示さない。
記述されるCDRの修飾配列は、いくつかの具体化態様で、SEQ ID No.1〜6に80%以上の配列同一性を示し、結合残基が維持される場合、CDRの配列若しくは重鎖及び／又は軽鎖それら自身の全配列において、80%の配列同一性というのは、機能の維持に必ずしも必要ではない。
本発明の一つの実施態様において、単離された抗体若しくは抗体断片は、抗体がグリコシル化され、好適には、N結合型糖鎖を含み、好適には重鎖のAsn297でグリコシル化されるという特徴をもつ。
抗体のグリコシル化とは、抗体への炭水化物か多糖類の接着を指す。N結合多糖類は、アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素に接着される。標的タンパク質に接着された炭水化物鎖は様々な機能に役立つ。例えば、もしそれらが最初に糖鎖形成しなければ、いくつかのタンパク質は正確には折り畳まれない。さらに、タンパク質中のアスパラギンのアミド窒素でリンクした多糖は、いくつかの分泌された糖タンパク質の安定性に寄与する。このケースでの糖鎖形成は適当なフォールデイングのためのような厳密な要求ではないが、もし非糖鎖形成タンパク質であることはより速い分解をもたらす。
本発明の実施例で実証されるように、ここに示した抗体の脱グリコシル化は、抗体の糖鎖形成したものと比較して治療効果の減少をもたらす。糖鎖形成は抗体の活性の維持において重要な役割を果たすことは驚きであった。したがって、糖鎖形成は、予期しない技術的な利点に関連した本発明の好ましい実施態様を提供する。
J22.9-xiN-多糖類(脱グリコシル化)で処置された動物の全腫瘍荷(overall tumor load)は、アイソタイプ・コントロール抗体（isoAb）で処置された動物と著しい差異はないが、これらのマウスの寿命はisoAb処置グループと比較して、実質的に延長した。J22.9-xiN-多糖類が、ADCCまたはCDCを引き起こすことができないことを示されたので、この結果は、BCMAへのJ22.9-xiの結合のみが腫瘍成長を妨害することを示す。これは、受容体とその天然型リガンド(APRILとBAFF)間の相互作用のブロッキングによることは合理的に想定される。ここに記述された本発明の抗体のこの様相は、驚くべき技術的効果を示し、それは先行技術の抗体に由来するものでは存在しなかった。
J22.9-xiN-多糖類(脱グリコシル化)は、ADCCまたはCDCの下流の影響なしで、潜在的な、治療効果を評価するために、その標的エピトープへの抗体の結合を可能にする実験におけるコントロール試料と考えられる。したがって、本発明の抗体は、好適には糖鎖形成を伴う抗体は、細胞障害性に導く自然なリガンドによる結合の遮断(若しくは重大な遮断)を可能にするような効果的なエピトープ結合をもつ。本発明の抗体の、この特性は、当該技術分野で記述された同様の抗体においては一切記述されていない。
本発明の使用と機能的様相
本発明の抗体は、ここに記述のエピトープに結合することを示し、CDCとADCCの誘導に加えて、このエピトープの自然なリガンドの相互作用をブロックすることを示した。抗体依存性の細胞介在性細胞障害(ADCC)は、所望の治療効果を生成する本発明の抗体によって誘導された1つの機能要素である。ADCCは細胞を媒介とした免疫防御のメカニズムであり、それによって、その細胞膜表面抗原は特異抗体によって結合され、免疫系のエフェクター細胞は積極的に標的細胞を溶解する。本発明の抗体のCD269発現細胞への結合後、ADCCは誘導されうる。古典的ADCCは、ナチュラル・キラー(NK)細胞によって媒介され; マクロファージ、好中球及びエオシン好性細胞は、又、ADCCを媒介されうる。ADCCは、先行技術である抗体反応への依存による適応的免疫反応の一部である。マウスの実験は、ADCCがここに記述される治療用抗体の重要な作用機序であることを示す。
本発明の好ましい実施態様は、病原性B細胞の存在に関連した医学的疾患の治療の薬剤として使用のための、ここに記述される単離された抗体若しくは抗体断片に関係する。
本発明の一つの実施態様において、医学的疾患は、CD269関連疾患、好適には病原性B細胞に関係する、それは好適にはプラスマ細胞及び／又はメモリB細胞の疾患である。
プラスマ細胞の疾患は、プラスマ細胞の癌、例えば多発性骨髄腫、形質細胞種、ワンデンシュトレーム型マクログロブリン血症、形質細胞性白血病等でありうる。プラスマ細胞の疾患はホジキン病のようなBリンパ細胞の癌でありうる。
本発明の一つの実施態様において、医学的疾患は、炎症性の自己免疫疾患、例えば全身性紅斑狼瘡若しくはリューマチ関節炎のような自己反応性のプラスマ細胞及び/又は自己反応性のメモリB細胞に関連した自己免疫疾患である。
本発明は、さらに、そのような治療を必要とする対象への治療上有効な量の抗体の投与を含む、ここに示される医学的疾患の治療法を包含する。
本発明のさらなる様相は、ここに記述される抗体若しくは抗体断片を含む抗体医薬結合体(ADC)に関係する。抗CD269抗体医薬結合体「抗CD269 ADC」は、ある治療薬に結合した抗CD269抗体若しくはその断片と定義できる。具体化態様では、ADCは抗CD269抗体(例えば、J22.9-xi、若しくは誘導体、若しくはその断片、例えばそれのキメラ化若しくはヒト化された形式を含む)を含む。
癌または自己免疫疾患のような、CD269を発現する症状の対象に投与された時、ADC若しくはここに記述されるADC誘導体は、臨床的にCD269を発現する細胞で有益な効果をもたらす。一つの実施態様において、抗CD269抗体若しくはその誘導体は、細胞障害性薬に結合し、得られたADC若しくはADC誘導体が、CD269発現癌細胞に、好適には該細胞によって取り込まれたとき若しくは吸収されたとき、細胞障害活性を及ぼす。
抗CD269 ADC若しくはADC誘導体は、好適には吸収され、CD269を発現する細胞内に蓄積する。ここでADC若しくはADC誘導体は治療効果(例えば細胞障害活性)を発揮する。抗体若しくは抗体誘導体への結合に特にふさわしい分子は、化学療法剤、プロドラッグ転換酵素、放射性同位体若しくは合成物、又は毒素である。例えば、抗CD269抗体若しくはその誘導体は、化学療法剤若しくは毒素（例えば、例えば細胞増殖抑制性若しくは細胞破壊性薬剤)のような細胞障害性薬に結合される。
本発明の別の態様は、次のグループから選ばれる、好適に単離された核酸分子に関係する:
a) ヌクレオチド配列を含む核酸分子
― 単離された抗体若しくは抗体断片をコードする、
― SEQ ID No.1〜8若しくは15〜61による配列から成るグループから選択したアミノ酸配列をコードする、
― VH2(SEQ ID No. 9)の配列または配列断片を含む、
― VL2(SEQ ID No.10)の配列または配列断片を含む;
b) a)によるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子;
c) 少なくとも80%、好適には90%、より好適には95％のa)若しくはb)によるヌクレオチド配列への配列同一性を含む、a)若しくはb)によるヌクレオチド配列と機能的に、相似/等価であるために十分な配列同一性を持っているヌクレオチド配列含む核酸分子;
d) 遺伝コードの結果として、a)からc）によるヌクレオチド配列へ縮重させられた核酸分子;
及び
e）a)からd)によるヌクレオチド配列による核酸分子であって、欠失、付加、置換、転置、転換及び／又は挿入によって修飾され、a)からd)によるヌクレオチド配列と機能的に相似/等価である。
本発明のさらなる様相は、ここに記述される抗体または抗体断片を生むことができ、及び/又は、ここに記述される核酸分子を含む、細菌細胞または哺乳類細胞、好適にはハイブリドーマ細胞若しくは細胞株のような宿主細胞に関係がある。
本発明のさらなる様相は、ここに記述される単離された抗体若しくは抗体断片、ここに記述される核酸分子若しくは薬学的に許容される担体と共に、ここに記述される宿主細胞を含む薬学的組成物に関係する。
本発明の付加的な及び驚くべき様相は、ここに示される抗体の改善された安定性である。当該抗体は、結合親和性の損失のなしに適切な条件のもと長期間容易に保存されうる。適切なテストは、-80若しくは4℃での保存後の活性のメンテナンスに関して行なわれ、それは両方の上記温度で保存の後に活性の維持と抗体の予測できない安定性を実証した(図3c)。
本発明の抗体の生産は、固有的に困難で、所謂ルーチン方法によって達成可能ではない。図7に示されるように、ハイブリドーマJ22.9は、時間が経つにつれ抗BCMA抗体を生産する/分泌するキャパシティーを失った(図7)。これにより、重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、PCRを使用し増幅され、続いて、ヒト定常IgG1及びK 軽鎖遺伝子の5'末端でクローン化された。これらの2つのプラスミドを担持する293-6E細胞の共トランスフェクションにより、キメラ化J22.9-xi抗体は最終的に生産された。したがって、ルーチン方法は修正なしで適用されることができなかった。よって、ここに記述される抗体の生産は、それ自体で発明性のある課題の解決を示し、過度の努力及び困難な技術的な功績を達成した。
ここに記述される抗体の利点は、実施例において実証されるミエローマ細胞の効果的な全身での消失である。先行技術に示された抗体は、系統だった方法で所望の抗プラスマ細胞効果を示すことは実証されていない。先行技術の抗体に関し行なわれた研究は、ミエローマ細胞の皮下注射そしてその後単離された細胞塊の処置というものであった。本発明は、実施例に示されるように、その静脈内投与の後に癌性多発性ミエローマ細胞の全身的消失を可能にする抗体を提供する。標的細胞の効果的な消失は、本発明の抗体の有益な特性に加えて、先行技術では実証されていない技術的な効果を表わすものである。
ここに使用される、用語「抗体」は、一般に、免疫グロブリン遺伝子若しくは免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされた1つ以上のポリペプチドから成るタンパク質を指す。用語「抗体」が使用される場合、用語「抗体断片」も引用されると考えうる。認識された免疫グロブリン遺伝子は、種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子と同様に、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパかラムダのいずれかとして分類される。
重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ若しくはイプシロンとして分類され、それは次には免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD及びIgEをそれぞれ定義する。基礎的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体か二量体を含むと知られる。四量体はそれぞれ、同一の2ペアのポリペプチド鎖からなり、各ペアは、1つの「軽鎖」(L)(約25 kD)及び1つの「重鎖」(H)鎖(約50-70 kD)からなる。各鎖のN-末端は、抗原認識の主要な役割を担う、約100〜110若しくはより多くのアミノ酸の可変領域を特定する。
「可変軽鎖」及び「可変重鎖」という用語は、軽鎖と重鎖のこれらの可変領域をそれぞれ指す。選択的に、抗体若しくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質に化学的に結合でき、又は他のタンパク質との融合タンパク質として発現されうる。
本発明の抗体は、哺乳類、特にヒトのタンパク質標的に対して結合することが意図される。タンパク質という用語の使用は、タンパク質のマウス若しくはヒトバージョンのいずれかに相当しうる。
用語“特異的結合“は、当業者の知識をもとに理解され、それによって当業者は、結合及び結合特異性をテストするために使用されうる様々な実験の手続きを明白に認識している。ある交差反応若しくは自然的結合は、多くの蛋白質間相互作用において避けられず; これは、抗体とエピトープの間の結合の「特異性」を落とすことではない。用語「direct against」“~に対して指向“は、又、抗体とエピトープの間の相互作用を理解する際に用語「特異性」を考慮する場合に適用可能である。
本発明の抗体は、それらがオリジナルの結合特性を保持すれば、制限されることなく、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化若しくはキメラ抗体、単一の可変断片(ssFv)、単一ドメイン抗体(ナノボディーからのVHH断片のような)、単一鎖断片(scFv)、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab発現ライブラリーによって生産される断片、抗イディオタイプ抗体及びエピトープ結合性断片又は上記のいずれかの組み合わせを含む。
さらに、ミニ抗体、及び2価抗体、3価抗体、4価抗体及び5価抗体のような多価抗体も、本発明の方法で使用されうる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のクラス(つまりIgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)若しくは免疫グロブリン分子のサブクラスになりえる。したがって、用語抗体はさらに、ここに使用されたように、抗体全体の修飾よって生産されるか、若しくは新たに組み換えDNA法を用いて合成された、抗体若しくは抗体断片を含む。
本発明の抗体の1つ以上のCDR若しくは該抗体に由来した1つ以上のCDRを含むヒト化抗体は、当業者に既知のどんな方法も使用して作ることができる。例えば、一般的な4ステップは、モノクローナル抗体をヒト化するために使用されうる。これらは次のとおりである:
(1) 出発抗体軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されたアミノ酸配列を決定すること、(2) ヒト化抗体を設計する、つまり、ヒト化プロセス中に使うべき抗体フレームワーク領域を決定すること、(3) 実際のヒト化方法論/技術及び (4) ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば、U.S. Pat. Nos.4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762;5,585,089; 6,180,370; 5,225,539; 6,548,640.を参照。
用語ヒト化抗体は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも1つの部分が、ヒト免疫グロブリン配列由来若しくは調節することを意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体のヒト化、キメラ化若しくは部分的ヒト化バージョンは、H及びL鎖をコードするマウス及び/又はヒトゲノムDNA配列から又はH及びL鎖をコードするｃDNAクローンから出発して、組み換えDNA技術によって調製される。マウス抗体のヒト化形式は、非ヒト抗体のCDR領域をヒト定常領域に組み換えDNA技術によってつなぐことで生成される(Queen et al., 1989; WO 90/07861)。若しくは、本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体でありうる。ヒト抗体はファージディスプレー方法を使用して、例えば得ることができる(WO 91/17271; WO 92/01047)。
ヒト化抗体は、さらに、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそれらの断片（例えば、Fv, Fab, Fab', F(ab')2若しくは抗体の他の抗原結合サブ配列）である非ヒト（例えば、マウス、ラクダ、ラマ、サメ）抗体の形態をも意味する。大部分において、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性及びキャパシティーをもつマウス、ラット若しくはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって、レシピーエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が取り替えられるヒト免疫グロブリン(レシピーエント抗体)である。
ヒト若しくはヒト化抗体は、ヒトによって作られた及び/又はここに記述された若しくは当業者に既知のヒト抗体を作る技術のいずれかを使い作られた抗体のそれらに相当するアミノ酸配列もつ抗体を意味する。ヒト抗体は、競合的結合実験によって、若しくは特別なマウス抗体としての同じエピトープ特異性を持っていることによって選択されうる。そのような抗体は、マウス抗体の有用な機能特性を特に共有する。ヒトポリクローナル抗体も、免疫原で免疫された人間から血清の形で提供されうる。選択的に、そのようなポリクローナル抗体は、親和性試薬として、原繊維性のアミロイド及び/又は非原繊維性のポリペプチド又はそれの断片を使用して、アフィニティー精製によって濃縮されうる。モノクローナル抗体は、WO 99/60846に記述された技術による血清から得ることができる。
本発明による、親和性試薬、抗体若しくはその断片は、ペグ化されうる。ペグ化は、本発明の抗体へのポリエチレングリコール(PEG)ポリマ鎖の共有結合を指す。ペグ化は、標的分子とPEGの反応性誘導体のインキュベーションによってルーチン的に達成されうる。抗体へのペグ化は、免疫性及び抗原性の減少に導く宿主の免疫系から薬剤を潜在的に覆うか、若しくは腎によるクリアランスの減少によりその循環時間を延長することができる薬剤の流体力学のサイズを増加させることができる。
抗体の可変領域は、単独で若しくはコンビネーションで、抗体軽鎖の可変領域若しくは抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、超可変領域として知られている3つの相補性決定領域(CDR)によって結合している4つのフレームワーク領域(FR)から成る。各鎖のCDRは、FRによって共に隣接して保持され、他方の鎖からのCDRで、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための少なくとも2つの技術がある: (1) クロス種配列可変性に基づいたアプローチ(i.e., Kabat et al. Sequences of Proteins ofImmunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.));及び (2) 抗原抗体複合体に関する結晶学的な研究に基づいたアプローチ(Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)。ここに使用されるように、CDRは、一方のアプローチ、若しくは両方のアプローチのコンビネーションによって定義されたCDRを指す。
ある実施態様において、本発明は抗体を提供し、それは、本発明の抗体の1つのCDR、少なくとも2、少なくとも3若しくはそれ以上のCDRに実質的に同一である、少なくとも1つのCDR、少なくとも2つ、少なくとも3つの若しくはそれ以上のCDRを含む。他の具体的態様は、本発明の抗体の若しくは本発明の抗体に由来する、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ若しくは6 つのCDRと実質的に同一である、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、若しくは6 つのCDRをもつ抗体を含む。いくつかの具体態様では、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、若しくは6 つのCDRは、少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99％で本発明の抗体の少なくとも1つ、2つの若しくは3 CDRと同一性をもつ。本発明の目的のためには、当該抗体と比較して、活性の程度は変わりうる(より大きいかもしれないかより劣っているかもしれない)が、結合特異性及び／又は全体的な活性が一般に保持されるということが理解される。
抗体の半減期及び細胞障害性能は、主として異なるFcガンマ受容体とFcドメインの相互作用に依存する。抗体半減期の場合には、新生児期のFc受容体(FcRn)が主な役割を果たす。この受容体は、いくつかの細胞で、及びそれらのリサイクリングエンドゾームへ血清蛋白質を取得できる単球及び管内皮細胞のような組織上で発現される。核内体（エンドゾーム）では、pHは、およそ6に減少し、このような条件で抗体はFcRnに結合できる。生理学的pHが受容体への結合を遮断する血液へ再びリリースされるまで、この相互作用は崩壊から抗体を保護する(Roopenian and Akilesh (2007) Nat RevImmunol 7:715-725)。pH 6でのFcRnへの抗体の親和性が高いほど、その抗体の半減期は大きい。この相互作用を安定させると知られていたFc断片変異は、Prestaで要約される(2008, Curr Opin Immunol 20:460-470)。
抗体依存性細胞障害(ADCC)は、又、活性Fcガンマ受容体(Fc R)へのFcドメインの結合を強化することにより改善されるうる。これもPrestaで要約されるようにFcガンマドメインでの変異によって達成されうる(2008, Curr Opin Immunol 20:460-470)。
ADCCを変更する別の方法は、Asn297における、各IgGに存在する糖部分の操作である。糖分子の末端からシアル酸の脱フコシル化と除去は、抗体の細胞障害能の可能性を増加させることが知られる(Anthony and Ravetch(2010) J Clin Immunol 30 Suppl 1:S9-14)。
請求項の核酸、タンパク質及び抗体の配列バリアントであって、例えば、請求項の％配列同一性によって定義され、本発明の当該特性を維持するものは、本発明の範囲内に含まれる。そのようなバリアントは、代替配列を示し、提供された特定の配列が、機能的なアナログ或いは機能的に類似として知られるように、標的特異性のような同じ結合特性を実質的に維持する。配列アラインメントを実行する場合、配列同一性は、同一のヌクレオチド若しくはアミノ酸のパーセンテージに関係がある。
遺伝的コードの縮重の結果として、ここに記述されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があるということは、当業者には容易に理解できるだろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然型遺伝子のヌクレオチド配列に最小の相同性若しくは配列同一性を担持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差により変わるポリヌクレオチドは、本発明によって特異的に考慮される。記述された配列同一性下でおこる配列における欠失、置換及び他の変更も、本発明に包含される。
タンパク質修飾、それらは置換によって生じるかもしれない、も本発明の範囲内に含まれる。ここに定義される置換は、タンパク質のアミノ酸配列になされた修飾であり、それによって、一つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸の同じ数で置き換えられ、できれば著しくタンパク質の機能を変更せずに、元のタンパク質からは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を生産する。付加のように、置換は、自然かもしれないし若しくは人工的でありうる。タンパク質の機能の実質的変更なしに、アミノ酸置換がなされうることは、当業者に周知である。修飾が「保存的な」アミノ酸置換に関係のある場合、このことは特に真実であり、それは、同様の特性をもつ別のアミノ酸への置換である。そのような「保存された」アミノ酸は、サイズ、荷電、極性及び立体構造が、タンパク質の構造及び機能に重大な影響を与えることなし置換されうる、天然若しくは合成アミノ酸でありうる。頻繁に、多くのアミノ酸が、タンパク質の機能に有害に影響することなく、保存的なアミノ酸によって置換されうる。
一般に、無極性のアミノ酸Gly、Ala、Val、Ile及びLeu; 無極性の芳香族アミノ酸Phe、Trp及びTyl; 中性極性のアミノ酸Ser、Thr、Cys、Gln、Asn及びMet; 陽荷電アミノ酸Lys、Arg及びHis; 陰荷電アミノ酸Asp及びGluは、保存的なアミノ酸のグループである。このリストは網羅的ではない。例えば、たとえそれらが異なるグループに属しても、Ala、Gly、Ser及び時々Cysが互いに置換されうることは周知である。
置換バリアントは、抗体分子に少なくとも一つの除去されたアミノ酸残基をもち、その位置に異なる残基が挿入される。置換による突然変異生成に最も大きく興味のあるサイトは、高頻度可変性領域を含み、しかし、FR変更も可能性がある。もし、そのような置換が生物活性の変化をもたらすなら、そのとき、より実質的な変化（表１に典型的な置換が例示され、若しくはアミノ酸クラスへの参照で以下にさらに記述される）が導入され、該物質を選別されうる。
可能性あるアミノ酸置換:
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、選択的置換によって遂行され、それは、(a)例えば、シート状若しくはヘリカル立体配置のような、置換領域におけるポリペプチドバックボーン構造、(b)標的サイトにおける分子の荷電若しくは疎水性、又は(c)側鎖のバルク特性を維持しながら、それらの効果を大きく変えるものである。
保存的アミノ酸置換は自然に発生するアミノ酸に制限されず、さらに合成のアミノ酸を含む。一般に使用される合成アミノ酸は、様々な鎖長のオメガアミノ酸及び及び中性の無極性のアナログであるシクロヘキシルアラニンである; 中性の無極性のアナログであるシトルリン及びメチオニンスルフォキシド、芳香性の中性のアナログであるフェニルグリシン; 陰荷電アナログであるシステイン酸、及び陽性荷電のアミノ酸アナログであるオルニチンが例示される。自然に発生するアミノ酸のように、このリストは、網羅的なものではなく当該技術分野において周知の置換の単なる例示である。
本発明の抗体は、本発明の抗体をコードする配列を含む発現ベクターを担持する宿主細胞のトランスフェクションによって生産されうる。発現ベクター若しくは組み換えのプラスミドは、宿主における複製と発現、及び/又は分泌形、を制御できる通例的な調節制御配列を抗体のこれらコード化配列と共同作動的に設定することによって生産される。制御配列は、プロモータ配列、例えばCMVプロモータ、及びシグナル配列を含み、それは他の既知抗体から由来しうる。同様に、第2の発現ベクターは、相補的な抗体軽鎖若しくは重鎖をコードするDNA塩基配列を担持して生産されうる。ある具体化態様では、この第２の発現ベクターは、コード化配列と選択できるマーカーが考慮される限りを除き、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることをありえる範囲で確実にするために、第1のものと同一である。互換的に、抗体の重鎖及び軽鎖のコード配列は、単一のベクター上に存在しうる。
選択された宿主細胞は、組み換え若しくは合成の軽鎖と重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作成するために、第1と第2のベクター(若しくは単に単一のベクターによってトランスフェクトされた)の両方で、慣例的技術によって共トランスフェクトされる。その後、本発明の遺伝子操作された抗体を生産するために、トランスフェクトされた細胞は、従来技術によって培養される。両組み換え重鎖及び／又は軽鎖の組み合わせを含む抗体は、ELISAまたはRIAのような適切な分析によって培養液から選択される。同様の従来技術は他の抗体を構築するために使用されうる。
本発明の組成物の構築と方法で使用されたクローニング及びサブクローニング工程のための適当なベクターは、当該技術分野に属する1つによって選択されうる。例えば、クローニング・ベクターの慣例的なpUCシリーズは使用されうる。ベクター(pUC19)は、市販で入手可能である。そのようなベクターの要素、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などは、選ばれた宿主での組み換えDNAの産物の発現及び／又は分泌を指向して使用される商用若しくは天然物から得る又は既知の手続きによって合成されるうる。哺乳類、細菌、昆虫、酵母及び真菌発現のために、当該技術分野で知られた莫大なタイプの他の適当な発現ベクターが、この目的のために選択されうる。
本発明は、さらに、本発明の抗体のコード化配列を含んでいる組み換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞株を包含する。さらに、クローニング及びこれらのクローニング・ベクターの他の操作に役立つ宿主細胞もまた周知技術である。
本発明の抗体の発現のための適当な宿主細胞若しくは細胞株は、NS0、Sp2/0、CHO(例えばDG44)、COS、HEK、繊維芽細胞細胞(例えば3T3)及びミエローマ細胞のような哺乳類細胞を含み、例えば、それはCHO若しくはミエローマ細胞で発現されうる。ヒト細胞は使用でき、それにより、分子をヒト糖鎖形成パターンで修飾されることを可能にする。若しくは、他の原核生物株若しくは真核細胞株は使用できる。適当な哺乳類の宿主細胞の選択、形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び製品生産と精製の方法は、当業者に既知である。
本発明によって、結合しそしてヒトCD269活性を中和する本発明の抗CD269抗体を生産する方法が提供され、それは次の工程を含む；抗体の重鎖をコードする第1のベクターの提供; 抗体の軽鎖をコードする第2のベクターの提供; 該第1と第2ベクターで哺乳類宿主細胞(例えばCHO)の形質転換; 培養培地への宿主細胞からの抗体の分泌をもたらす条件下でステップ(c)の宿主細胞の培養; ステップ(d)の分泌された抗体の回収。一旦発現されたならば、抗体はここに記述される方法を使用して、所望の結合特性について評価されうる。
本発明は、化学療法剤、薬、成長阻害剤、毒素(例えばタンパク質毒素、バクテリア、菌類、植物若しくは動物起源、又はそれらの断片)のような一つ以上の細胞障害性薬、又は放射性同位体(つまり放射性結合体)に結合した抗体、これらに限定されない、を含み、ここに記述の本発明の抗体を含む免疫結合体（抗体-医薬結合体若しくはSADCとして互換的にリファーされる）を包含する。本発明の抗CD269抗体-医薬結合体のために、タンパク質特に抗体へ治療薬を結合させる技術は広く周知である。 (参照, e.g., Arnon et al.,"Monoclonal antibody For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,"in Monoclonal antibody And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., " antibody For DrugDelivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,"in Monoclonal antibody '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis,Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled AntibodyIn Cancer Therapy," in Monoclonal antibody For Cancer Detection AndTherapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1995); and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.See also, e.g., PCT publication WO 89/12624.)
典型的に、ADC若しくはADC誘導体は、治療薬と抗CD269抗体若しくはその誘導体間のリンカー領域を含む。以前から知られるように、典型的な具体化態様では、リンカーは細胞内条件下で開裂され、そのリンカーの開裂は、細胞内の環境へ抗体から治療薬を放出する。例えば、いくつかの具体化態様では、リンカーは、細胞内環境(例えばリソソーム若しくは核内体若しくは小窩内で)に存在する、開裂剤によって開裂される。リンカーは、リソソーム若しくはエンドソームのプロテアーゼ、これに限定されないが、を含む細胞内ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ酵素によって開裂されるぺプチジルリンカーでありうる。他の具体化態様では、開裂リンカーはpH感受性であり、つまり、あるpH値での加水分解に感受性がある。典型的には、pH感受性のリンカーは酸性条件下で加水分解できる。さらに他の具体化態様では、リンカーは還元条件下で開裂する(例えば二硫化物リンカー)。様々な二硫化物リンカーは、当該技術分野で知られる(例示のために参照 Wawrzynczak etal., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapyof Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. See also U.S. Patent No.4,880,935.)。
典型的に、リンカーは、細胞外環境では実質的に感受性はない。他方、全く別異な具体化態様で、リンカーは細胞内移行を促進する。ある具体化態様では、治療薬に結合した時、例えばADC若しくはADC誘導体のリンカー−治療薬剤分子の状態で、リンカーは細胞内移行を促進する。また他の具体化態様では、リンカーは、治療薬と抗CD269抗体若しくはその誘導体両方に結合するとき、例えばADC若しくはADC誘導体の状態で、細胞内移行を促進する。本発明の組成物と方法において使用されうる様々なリンカーは以下に記述され、その開示はこれら参照により本発明に組み込まれる；WO 2004010957 タイトル "Drug Conjugates and TheirUse for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease"出願日July 31, 2003, 及び U.S. Provisional Application No. 60/400,403, タイトル"Drug Conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune diseaseor an infectious disease", 出願日July 31, 2002。
ある具体化態様において、免疫結合体はここに記述される抗体を含み、これらに限定されずに、抗体及び化学療法剤若しくは他の毒素を含む。使用されうる酵素的に活性な毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、菌体外毒素A鎖(緑膿菌からの)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン A鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ダイアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPII及びPAP-S)、ニガウリ抑制剤、クルシン、クロチン、サボンソウ抑制剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンズ（diphtheria A chain, nonbinding active fragments ofdiphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin Achain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordiiproteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, andPAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalisinhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and thetricothecenes）を含む。様々な放射性核種は放射性結合体抗体の生産に利用可能である。
本発明の抗体若しくはその断片は、1つ以上の毒素を結合でき、それは、制限されず、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシノイド(maytansinoids)、ドラスタチン（dolastatins）、アウレスタチン(aurostatins)、トリコセセン(trichothecene)及びCC1065、そして毒素活性をもつこれら毒素の誘導体を含む。適切な細胞障害性薬は、制限されないが、以下を含む；ドバリン‐バリン‐ドライソロイニン‐ドラプロイン‐フェニルアラニン（dovaline-valine-dolaisoleunine-dolaproine-phenylalanine）(MMAF)、モノメチルアウリスタチンE(monomethyl auristatin E) (MMAE) 同様に MMAEエステル型を含むアウリスタチン(auristatin) 及び, DNA小溝結合剤(DNA minor groove binding agent), DNA小溝アルキル化剤(DNA minor groove alkylating agent), エンジイン (enediyne), レクシトロプシン(lexitropsin),ドゥオカルマイシン(duocarmycin) ,パクリタクセル(paclitaxel) 及び ドセタクセル(docetaxel)を含むタキサン(taxane),ピューロマイシン(puromycin),ドラスタチン(dolastatin),メイタンシノイド(maytansinoid), 及びビンカアルカロイドMMAE (vinca alkaloidMMAE)。特異的な細胞障害性薬は以下を含む；トポテカン(topotecan),モルフォリノドキソルビシン (morpholino-doxorubicin), リゾキシン(rhizoxin), シアノモルフォリノドキソルビシン(cyanomorpholino-doxorubicin), ドラスタチン-10(dolastatin-10), エキノマイシン(echinomycin), コムブレレタットスタチン(combretatstatin),カリケアマイシン(chalicheamicin), メイタンシン(maytansine), DM-1 , DM-4, ネトロプシン(netropsin)。他の適切な細胞障害性薬は以下を含む；アウリタチン(auristatin), ビンカアルカロイド(vinca alkaloid),ポドフィルトキシン (podophyllotoxin),タキサン(taxane),バッカチン誘導体(baccatin derivative),クリプトフィシン(cryptophysin),メイタンシノイド(maytansinoid),コンブレタスタチン(combretastatin), 若しくはドラスタチン(dolastatin)のような抗チュブリン剤(anti-tubulinagent)。抗チュブリン剤は以下を含む；ジメチルバリン-バリン-ドライソロイシン-ドラプロリン-フェニルアラニン-ｐ-フェニレン化-イアミン(AFP) (dimethylvaline-valine-dolaisoleuine-dolaproine-phenylalanine-p-phenylened-iamine)(AFP),MMAF, MMAE, アウリタチンE(auristatin E),ビンクリスチン(vincristine),ビンブラスチン(vinblastine),ビンデシン(vindesine), ビノレルビン(vinorelbine), VP-16,カンプトテシン (camptothecin), パクリタクセル(paclitaxel),ドセタクセル (docetaxel), エポチロンA(epothilone A), エポチロンB(epothilone B), ノコダゾール(nocodazole),コルヒチン (colchicines), コルシミド(colcimid), エストラムスチン(estramustine), セマドチン(cemadotin), ディスコデルモライド(discodermolide), メイタンシン(maytansine), DM-1 , DM-4 若しくはエレウセロビン (eleutherobin)。
いくつかの具体化態様において、免疫結合体は、ドラスチン（dolostatin）若しくはドラスチンのペプチドアナログ及び誘導体アウリスタチン（auristatins)を含む(U.S. Pat. Nos. 5,635,483; 5,780,588)。ドラスチンとアウリスタチンは、微小管力学、GTP加水分解及び核とセルラーディビジョン（nuclear and cellular division）に影響することを示され((Woyke et al. (2001 ) Antimicrob. Agents andChemother. 45(12):3580-3584)、及び抗癌 (U.S. Pat. No. 5,663,149) と抗菌活性 (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother.42:2961-2965)を持つことを示された。ドラスチン若しくはアウリスタチン (それはドラスチンのペンタペプチド誘導体である)薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のN(アミノ)末端若しくはC(カルボキシル)末端を経て抗体に接着されうる(WO 02/088172)。典型的なアウリスタチンの具体化態様は、「タイトル：リガンドへの結合ができるMonomethylvaline化合物」（US7498298）に記述される、N-末端結合モノメチルアウリスタチン薬剤部分DE及びDFを含む。ここに使用される、略語「MMAE」はモノメチルアウリスタチン Eを指す。ここに使用される、略語「MMAF」はドーバル-バリン-ドライソロイシン-ドラプロイン-フェニルアラニン(doval -valine-dolaisoleuine-dolaproine-phenylalanine)を指す。
典型的に、ペプチドに基づいた薬剤部分は、2つ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片の間のペプチド結合の形成により調製されうる。そのようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野において周知の液相合成方法によって調製されうる(参照 E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides," volume 1 , pp76-136, 1965, Academic Press)。
メイタンシノイド(Maytansinoids)は、本発明による抗体若しくはその断片に結合された活性薬剤として使用されうる。メイタンシノイドはチューブリン重合を禁じることにより作用するマイトトティク（mitototic）な抑制剤である。メイタンシン(Maytansine)は、東アフリカの潅木Maytenus serrataから最初に単離された(USP3896111)。続いて、ある微生物がメイタンシノール(maytansinol)及びC-3メイタンシノール(C-3 maytansinol)エステルのようなメイタンシノイドをさらに生産することが発見された(USP4151042)。高い細胞障害性メイタンシノイド薬はActinosynnemaのような微生物の発酵によって生産されたアンサミトシン(ansamitocin)前駆体から調製されうる。
抗体-メイタンシノイド結合体は、抗体若しくはメイタンシノイド分子のいずれかの生物活性を著しくは消失させずに、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に結合することにより調製されている。参照USP5208020。抗体分子あたり結合した平均3〜4のメイタンシノイド分子は、毒素/抗体の1つの分子でさえ無修飾抗体の使用を超えた細胞障害性を増強すると予想されるが、抗体の機能や溶解性に負に作用せず、標的細胞への細胞障害活性を増強する効果を示した。メイタンシノイドは当該技術分野において周知で、既知の技術によって合成されうるか、自然源から単離されうる。
抗生物質のカリケアマイシン(calicheamicin)ファミリーの選択された化合物は、本発明による抗体若しくはその断片に結合される活性薬剤として使用されうる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはpM以下(subpicomolar)の濃度で二本鎖DNA破損をおこしうる。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製については、以下を参照；USP5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296。抗体が結合されうる別の抗腫瘍薬は、抗葉酸剤であるQFAである。カリケアマイシンとQFAの両方は細胞内の作用点を持っており、容易に原形質膜を通過しない。したがって、抗体を媒介とした中和によるこれらの薬剤の細胞への取得はそれらの細胞障害性効果を非常に増強する。
抗体に結合されうる他の抗腫瘍物質は、BCNU、streptozoicin、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシルを含み、USP5053394 & 5770710に記述された総括的に既知のLL-E33288複合体、同様にエスペラミシン(esperamicins)（US5877296）がある。本発明は、核酸分解活性をもつ化合物(例えばデオキシリボヌクレアーゼのような、リボヌクレアーゼ若しくはDNAエンドヌクレアーゼ; デオキシリボヌクレアーゼ)と抗体の間で形成された免疫結合体をさらに包含する。腫瘍の選択的な破壊のために、抗体は高放射能原子を含みうる。
本発明において、薬学的に許容可能な担体は、本発明の抗体の生物活性の有効性に対し不利益な意味で著しくは干渉しないあらゆる無毒な物質でありうる。明らかに、担体の特性は投与ルートに依存する。そのような組成物は、活性物質と担体に加えて、希釈剤、増量剤、塩類、バッファー、安定剤、溶解剤、及び当該技術分野において周知の他の材料を含みうる。薬学的に許容可能な賦形剤及び担体溶液は当該技術分野の当業者に周知である。例えば経口、非経口、静脈内、鼻腔内、筋肉内投与及び剤型を含み、処置法における多様性において、ここに記述の特別な組成物を使うための適当な投与量及び処置法が対象とされる。
有効成分(抗体若しくは抗体断片)を含む、医薬組成物として既知の医薬は、経口、例えば、錠剤、トローチ、トローチ菓子、水溶性若しくは油懸濁剤、分散パウダー、又は顆粒、乳剤、硬若しくは軟カプ細胞剤、又はシロップ若しくはエリキシルのような適当な剤型でありうる。経口の使用を意図した組成物は、製薬組成物の製造用の当該技術分野で既知の任意の方法によって調製されうる。また、そのような組成物は、薬学的にエレガントで快い製剤を提供するために甘味剤、香料、着色剤及び保存剤から成るグループから選ばれた1以上の剤を含有しうる。錠剤は、錠剤の製造にふさわしい、無毒な薬学的に許容可能な賦形剤との混合で有効成分を含みうる。
これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトーゼ、リン酸カルシウム若しくはリン酸ナトリウムのような不活性な希釈剤; 顆粒化剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸; 結合剤、例えば澱粉、ゼラチン、又はアカシア、及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石、を含む。錠剤は被覆なしでありうる。若しくは、胃腸管中の分解及び吸収を遅らせて、かつそのためにより長い期間にわたる持続された作用を提供するために、それらは、既知の技術によって被覆されうる。例えば、モノステアリン酸グリセリン若しくはグリセリルジステアレートのような時間遅延材料は使用されうる。さらに、それらは被覆に使われうる。本発明は、さらに局所適用、経口摂取、吸入若しくは皮膚、皮下、静脈内の注入のための製薬組成物をも対象とする。当業者は、特定適用フォームに必要な担体と添加物を認識している。
本発明の治療上有効な量の活性物質(抗体若しくは抗体断片)が、静脈投与、経皮投与、皮下注射によって投与される時、活性物質は、発熱性物質の夾雑なしの、非経口的に許容可能な水溶液の形態でありうる。
本発明は、さらにここに示される医学的疾患を持っている被験者の治療にここに記述される治療上適切な量の抗体の投与に関する。ここに使用されるように、用語「治療上有効な量」は、患者の利益を示すのに十分な、製薬組成物若しくは方法の各活性成分の総量を意味する。本発明の製薬組成物の活性物質の量は、治療されている条件の性質及び厳しさ、及び患者が受けた先の治療の性質に依存する。最適な治療効果が患者のために得られるまで、より多量の服用量で投与され得、また、そのポイントで、投薬はさらには増加されない。
pH、等張性、安定性などに関し、非経口的に許容可能な溶液の製剤は、当該技術分野で周知である。静脈内投与、経皮投与、若しくは、皮下注射のために好ましい製薬組成物は、活性物質に加えて、生食、リンゲル、ブドウ糖、ブドウ糖及び生食、乳酸加リンゲル液又は当業者に知られているような他の媒体のような等張液を含んでいる。本発明の製薬組成物は、さらに安定剤、防腐剤、バッファー、酸化防止剤若しくは当該技術分野で既知の他の添加物をも含みうる。
明らかに、投与された抗体の投与量は、当該技術分野において周知の多数の要因に依存する、例えば抗体の化学的性質及び薬学的剤型、及び投与時間及び投与ルートと同様に患者の体重、体表面、年齢及び性別などが例示される。大人にとって、投与量が、典型的例示として１日当たり0.001μｇと１ｇの間、好適には１日当たり0.1μgと100mgの間、より好ましくは1日当たり5μgと10mgの間がある。持続注入では、投与量は、Kg体重当たり1分間の典型的例示として0.01μｇと100ｍｇの間、好適には1μgと10mgの間である。
本発明の別の態様において、以下に例示される疾病の処置にここに記述される本発明の抗体の使用が示される；B細胞媒介若しくはプラスマ細胞媒介疾患、抗体媒介疾患、多発性骨髄腫(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、非分泌性多発性骨髄腫(Non-secretory multiple myeloma)、くすぶり状態の多発性骨髄腫(Smoldering multiple myeloma)、未決定の意味をもつモノクローナル高γグロブリン血症, (MGUS)(Monoclonal gammopathy of undetermined significance)、孤立性形質細胞腫(骨、骨髄外)、リンパ形質細胞性リンパ腫(Lymphoplasmacytc lymphoma)(LPL)、ワルデンストレームマクログロブリン血症、形質細胞性白血病、原発性アミロイドーシス(AL)、H鎖病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、POEMS症候群/骨硬化性のミエローマ、タイプI&IIクリオグロブリン血症、軽鎖堆積物疾患、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、急性糸球体腎炎、天疱瘡及び天疱瘡様の障害、また後天性表皮水疱症(Epidermolysis bullosa acquisita);若しくは任意の非ホジキンリンパ腫B細胞白血病若しくはBCMA発現をするホジキンリンパ腫(HL)、又は、患者が、当該方法が該患者にここに記述される治療上有効な量の抗体を投与するステップを含む組換え型タンパク質置換え療法で抗体を中和する何らかの疾患。
B細胞障害は、B細胞発生/免疫グロブリン産生(免疫不全)の欠損と過度の（抑制されない）増殖(リンパ腫、白血病)という疾患に分類されうる。ここに使用されるように、B細胞疾患は両方のタイプを指し、また、抗体でB細胞疾患を治療する方法が提供される。
本発明の一つの態様で、疾患は、多発性骨髄腫である。
ここに記述される疾患及び病気の治療のための薬剤の製造におけるここに記述される抗体の使用も本発明は提供する。
例えば、本発明の一つの様相の実施態様例で、BCMAとリガンドBAFF及びAPRIL間の相互作用の制御(阻害若しくはブロッキングのように)に反応する疾患及び病気の治療若しくは予防処置に使用のためにここに記述される抗体の使用も、本発明は提供する。
本発明の一実施態様において、単離された抗体若しくは抗体断片は、ホジキンリンパ腫のようなBリンパ細胞癌の治療での使用を本発明は意図する。
本発明の一実施態様において、単離された抗体若しくは抗体断片は、炎症に関係する医学的疾患、好適には炎症性のコンポーネントでの自己免疫疾患、のような自己免疫疾患の治療での使用を本発明は意図し、自己免疫疾患は、以下を例示する；高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結節性多発性動脈炎、皮膚結節性多発性動脈炎、肝炎に関連する動脈炎、ベーチェット症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群、微視的な多発性血管炎、結合織病の脈管炎、Hennoch-Schonlein紫斑病、クリオグロブリン血症脈管炎、皮膚の白血球崩壊性の血管炎、熱帯大動脈炎、サーコイドーシス、Cogan症候群、ウィスコットアルドリッチ症候群、癩腫の動脈炎、CNSの主要な血管炎、閉塞性血栓性血管炎、腫瘍随伴性の動脈炎、蕁麻疹、Dego疾患、骨髄異形成症候群、 持続性隆起性紅斑、高グロブリン血症D、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、歯膜炎、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、アミロイドーシス、クロン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫の筋炎、糖尿病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、組織球症、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、歯膜炎、慢性副鼻腔炎、乾癬、乾癬性関節炎、微視的な大腸炎、肺線維症、糸球体腎炎、ホイップル病、若年性慢性関節リウマチ、結節性紅斑、耳炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、紅斑性狼瘡、再生不良性貧血、骨骨髄線維症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、木村の疾患、全身性硬化症、慢性大動脈周囲炎、慢性前立腺炎、特発性肺線維症、慢性肉芽腫症、特発性無弛緩症、ブレオマイシン誘導肺炎症、シタラビン誘導肺炎症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ球減少症、シャガス病、慢性自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎、グレーベス病（バセドー氏病）、自己免疫性多腺性症候群、自己免疫性アディソン症候群、尋常性天疱瘡、落葉状天ざ瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛、白斑、抗リン脂質症候群、重症筋無力症、スティッフマン症候群、グッドパスチャーの症候群、交感性眼炎、毛包炎、シャープ症候群及び／又は特に花粉症、歯膜炎、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、好適には、慢性関節リウマチ若しくは多発性硬化症中のエヴァンスの症候群（Takayasu Arteritis, Giant-cell arteritis, familialMediterranean fever, Kawasaki disease, Polyarteritis nodosa, cutanousPolyarteritis nodosa, Hepatitis-associated arteritis, Behcet’s syndrome,Wegener’s granulomatosis, Churg-Strauss syndrome, microscopic polyangiitis,Vasculitis of connective tissue diseases, Hennoch-Schönlein purpura,Cryoglobulinemic vasculitis, Cutaneous leukocytoclastic angiitis, Tropicalaortitis, Sarcoidosis, Cogan’s syndrome, Wiskott-Aldrich Syndrome, Lepromatousarteritis, Primary angiitis of the CNS, Thromboangiitis obliterans,Paraneoplastic ateritis, Urticaria, Dego’s disease, Myelodysplastic syndrome,Eythema elevatum diutinum, Hyperimmunoglobulin D, Allergic Rhinitis, Asthmabronchiale, chronic obstructive pulmonary disease, periodontitis, RheumatoidArthritis, atherosclerosis, Amyloidosis, Morbus Chron, Colitis ulcerosa, AutoimmuneMyositis, Diabetes mellitus, Multiple sclerosis, Guillain-Barre Syndrome,histiocytosis, Osteoarthritis, atopic dermatitis, periodontitis, chronicrhinosinusitis, Psoriasis, psoriatic arthritis, Microscopic colitis, Pulmonaryfibrosis, glomerulonephritis, Whipple's disease, Still's disease, erythemanodosum, otitis, cryoglobulinemia, Sjogren's syndrome, Lupus erythematosus,aplastic anemia, Osteomyelofibrosis, chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy, Kimura's disease, systemic sclerosis, chronic periaortitis,chronic prostatitis, idiopathic pulmonary fibrosis, chronic granulomatousdisease, Idiopathic achalasia, bleomycin-induced lung inflammation,cytarabine-induced lung inflammation, Autoimmunthrombocytopenia,Autoimmunneutropenia, Autoimmunhemolytic anemia, Autoimmunlymphocytopenia,Chagas' disease, chronic autoimmune thyroiditis, autoimmune hepatitis,Hashimoto’s Thyroiditis, atropic thyroiditis, Graves disase, Autoimmunepolyglandular syndrome, Autoimmune Addison Syndrome, Pemphigus vulgaris,Pemphigus foliaceus, Dermatitis herpetiformis, Autoimmune alopecia, Vitiligo,Antiphospholipid syndrome, Myasthenia gravis, Stiff-man syndrome, Goodpasture’ssyndrome, Sympathetic ophthalmia, Folliculitis, Sharp syndrome and/or Evanssyndrome, in particular hay fever, periodontitis, atherosclerosis, rheumatoidarthritis, preferably rheumatoid arthritis or multiple sclerosis）。
キメラ抗体配列に関係する発明の好適な配列:
CD269(BCMA)に関係する本発明の好適な配列:
ヒト化抗体配列に関係する本発明の好適な配列:
キメラ化、マウス及び／又はヒト化配列についての統一された一般式に関係する本発明の好適な配列:
ヒト定常ドメインに関係する本発明の好適な配列:
本発明はここに示した実施例と図によって例示することで実証される。ここに提供される図は、本発明の特別な代表的実施例を表わし、本発明の範囲を制限することは意図されていない。図は、1つ以上の制限しない具体化態様の技術的サポートを補強する、可能で、潜在的に好適な具体化態様のさらなる記述の提供と見なされる。
J22.9-xiの生体外での特性。 CD269(BCMA)とJ22.9-xi Fab:CD269複合体の構造 同上 J22.9-xiの生体外細胞障害性。 異種移植されたNSGマウスでのJ22.9-xiの効能。 同上 同上 同上 定着腫瘍の治療。 疾患の初期相の腫瘍治療。 同上 ハイブリドーマJ22.9の不安定性。 J22.9-xiによるキメラ抗体の配列の要約。 同上 J22.9-xiのヒト化配列の要約。 同上 同上 同上
図面の詳細な説明
図1: J22.9-xiの生体外での特性。
CD269陽性MM.1S細胞を使用して、(a)ELISA及び(b)フローサイトメトリーによる、BCMAへのJ22.9-xiの濃度依存的結合を示す。（c）BCMAへのJ22.9-xiの結合親和性が、BCMAの示された濃度で表面プラズモン共鳴測定によって決定された。 (d) J22.9-xiは、マイクロタイタープレート上に吸着されたBAFFとBCMAの間の相互作用をブロックする。
図2:
(a) CD269(BCMA)認識表面。
BAFF/APRIL及びJ22.9-xiの結合エピトープ残基を示すCD269(BCMA)の細胞外ドメインの3つの表示（View）。
最上部で CD269(BCMA)の結合表面に関する直接的な表示（View）:軽い灰色の陰影は、それらの結晶構造から同定されるBAFF及びAPRILの結合エピトープを含む全ての残基を示す。黒い残基(球体として示される)はBAFF、APRIL若しくはJ22.9-xiのどれとも接触しない; J22.9-xi結合に関与するエピトープ残基の部分集合（subset）は、曲面表現で示される; 残る球体として示される軽い灰色残基は、両BAFFとAPRILエピトープの一部であるが、J22.9-xiへの直接的な接触をしない。中間及び最下部の図は、最上部図と同じ表示だが、各々、視点に向かって及び視点から離れて90°回転したものである。
(b) J22.9-xi Fab:CD269複合体についての2つの表示（view）。
J22.9-xiは、ライトグレーの色づけされた重鎖とダークグレイの色づけされた軽鎖の曲面表現で示される。CD269(BCMA)は、J22.9-xiに結合する抗原ポケットをリボン表現で示される。左（下）に、Fab:CD269複合体の完全表示、右（上）では、複合体を、その結合ポケットを示すために、視点方向へ傾けた。
図3: J22.9-xiの生体外細胞障害性。
(a) ヒトPMBCが20:1の比率でMM.1S-Luc細胞と混合され、４時間J22.9-xiの提示した濃度で培養された。オープンシンボルは、ドナー1及び2からのPBMCでインキュベートされた時、Nグリカン(N-glycans)無しでのJ22.9-xiの細胞障害活性を示す。誤差範囲はSEMを示す。
(b) 脱グリコシル化（Deglycosylation）は、MM.1S細胞へのJ22.9-xi結合に影響しない。
(c) 4℃若しくは80℃で、3週間J22.9-xi保存は細胞障害性に影響しない。
図4: 異種移植されたNSGマウスでのJ22.9-xiの効能。
(a) J22.9-xi若しくはコントロール抗体の200μｇ週２度投与、及び未処理コントロールマウスでの腫瘍成長経過。
(b) 日6と41の間での全腫瘍荷((a)の曲線下面積(AUC))。プロットは、SEM(**P<0.01及び***P<0.001、t-検定)での平均値である。
(c) J22.9-xi及びアイソタイプ・コントロール・マウスの全体としての生存率。P値はログランク(Mantel-Cox)テストを使用して計算された。
(d-1) 治療抗体の無投与グループでのMM.1S-Luc細胞の検出。図の右端下部の、数(日41、41、44、40)は、特定のマウスが死んだ腫瘍細胞注入後の日を示す。
(d-2) 日21及び28での各グループについてのMM.1S-Luc細胞の検出。背部表示。
(e) J22.9-xi濃度と腫瘍成長の関係。
(f) 日6と42の間での総腫瘍負荷(load) ((e)のAUC)。SEM(**P<0.01及び***P<0.001、t-検定)での平均値。
(g) 実験経過の概観。
図5: 確立している腫瘍の治療。
(a) J22.9-xi若しくはコントロール抗体の２週ごとの200μｇ投与及び未処理マウスでの腫瘍成長経過。
(b) 日8と48の間での総腫瘍荷(load)((a)のAUC)。プロットは、SEM(*P<0.05及び**P<0.01、t-検定)での平均値である。
(c) J22.9-xi及びアイソタイプ・コントロール・マウスの全体生存率。P値は、ログ-ランク(Mantel-Cox)テストを使用して計算された。実験経過の概観は図5dで提供される。
図6: 疾患の初期相の腫瘍治療。
(a) J22.9-xi の2μg、20μg若しくは200μg又はアイソタイプ・コントロール抗体若しくはNグリカンのないJ22.9-xiで処理された時の腫瘍成長コース及び腫瘍なしのケース。
(b) 日9と44の間での全腫瘍荷((a)のAUC)。SEM(*P<0.05及び**P<0.01、t-検定)での平均値である。
(c) 抗体処理及びコントロール異種移植SCID-Beigeマウスの生存。P値はログ-ランク(Mantel-Cox)テストを使用して計算された。実験経過の概観は図6dで提供される。
図7: ハイブリドーマJ22.9の不安定性。
ハイブリドーマJ22.9の上澄みが、1日目で、BCMA被覆マイクロタイタープレート上でELISAによるBCMAへの結合性に関する陽性テストがなされた。示した時間ポイントでの後の分析は、上澄みの結合能力の減少を示した。培地は、日7、14及び21で交換された。
図8: J22.9-xiによるキメラ抗体の配列の要約。
図9: J22.9-xiのヒト化配列の要約(黒:ヒト配列のために変更されたアミノ酸、下線:CDR領域)。
本発明は、ここに示した実施例によって実証される。ここに提供される実施例は、本発明の特徴的な実施態様を例示するもので、本発明の範囲を制限することは意図していない。実施例は、1つ以上の制限のない具体化態様の技術的サポートを増強するもので、可能で、潜在的に好適な具体化態様の一層の記述の提供に過ぎないと見なされうる。
J22.9-xiとBCMA相互作用の結合・ブロッキング特性
本発明の新規なキメラ抗体(J22.9-xi)は、ヒトCD269(BCMA、TNFRSF17)の細胞外ドメインに結合する。これは、ヒト多発性骨髄腫細胞株MM.1SでELISA及びフローサイトメトリーによってはじめて確認された(図1a、b)。BCMAへのJ22.9-xiの親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して決定された。平均Kdは図1cに示されるように54 pMである。
BCMAは、そのリガンドBAFF及び／又はAPRILとの相互作用によって生体内で多発性骨髄腫及びプラスマ細胞の生存にとって重要なシグナルをトリガーする（導き出す）ことが知られる(Mackay F et al.(2003) Annu Rev Immunol 21:231-264)。したがって、生体外でのブロッキング分析をヒトBCMAの細胞外ドメイン及び組み換えBAFFを使い行なった。BCMAへのJ22.9-xiの結合は、明白に、受容体とそのリガンドBAFFの間の相互作用をブロックした。J22.9-xiの代わりにアイソタイプ・コントロール抗体の使用では、BCMAに結合する組み換えBAFFは影響されなかった(図1d)。
J22.9-xi-Fab-BCMA複合体の結晶構造は、BCMAとの広範囲な結合表面を明らかにする。
J22.9-xiから調製されたFab断片が、精製された46アミノ酸残基のBCMA細胞外ドメインとの複合体化で結晶化され、そしてその複合体は1.9オングストローム解像度で分析された。高品位電子密度がBCMAの残基6〜41について観察可能で、主として抗体の軽鎖と共に、J22.9-xiとの広範囲な相互作用を示す(図2B)。このインターフェース(それは740.4平方オングストロームを埋め、BCMA残基の3分の1を含んでいる)は、保存されたDxLモチーフ〔Gordon N Cら(2003)、BAFF/BlysS受容体 3は、高度に焦点化したリガンド結合部位をコードする最小のTNFの受容体様モジュールを含む〕を含む、APRIL及びsTALL1(BAFFとしても知られている)とのBMCA複合体の結晶構造において観察された同一のエピトープの16残基のうちの12をカバーする。文献Biochemistry 42(20): 5977-83, and Patel DR, et al. (2004), Engineering an APRIL-specific B Cell Maturation Antigen. JBC 279(16): 16727-35)は、BAFFとの生体外分析で見られたブロッキング効果の明瞭な論理的証明を提供する(図2A)。
付加的に、J22.9-xiとの相互作用は、さらにBCMA（残基であって、BAFFとAPRILによってカバーされた結合エピトープの一部ではない）でのAla20及びPro23との直接的側鎖接触、及び幾ばくかの水媒介水素結合を含む。3つの構造すべてでのBCMAの概括的な立体構造は、J22.9-xi及びsTALL1複合体間での1.5オングストローム、J22.9-xi及びAPRIL複合体の間での1.4オングストロームのC-α rmsdと、非常に類似している; J22.9-xi BCMA結合エピトープ（残基13-30）のためのそれぞれのC-αrmsdsは、0.98及び0.88オングストロームである。そのコアにDxLモチーフを持つ同じBCMAエピトープの認識に関わらず、インターフェースを含む相互作用のコレクション(collection)の現状のように、J22.9-xiの結合部位はsTALL1とAPRILのものとは非常に異なる。
図2B、表1及び2で見られるように、J22.9-xiからの19アミノ酸〔重鎖からの6(表1)、軽鎖からの13(表2)〕は、CD269の細胞外ドメインからの12の残基へ直接リンケージを形成する。
表 1: J22.9-xiの重鎖とBCMAの間のアミノ酸相互作用リスト。
これらの相互作用リストはソフトウェアPDBsum(ラスコースキーR A(2009))を使用して生成された。
表 2: J22.9-xiの軽鎖とBCMAの間のアミノ酸相互作用リスト。
これらの相互作用リストはソフトウェアPDBsum(ラスコースキーR A(2009))を使用して生成された。
表 3: CD269:APRIL 及び CD269:BAFF結合に関与する残基の相互作用リスト (J22.9によって直接コンタクトを受けてない残基が下線で示される)。
これらの相互作用リストは、ソフトウェアPDBsum(ラスコースキーR A(2009))を使用して生成された。
表 4: J22.9、APRIL及び／又はBAFF、の直接のコンタクトによって結合されたCD269標的の残基。
J22.9によってのみ直接コンタクトされたCD269標的の残基は下線で示される(20と23)。J22.9によって直接コンタクトされないCD269標的の残基は、太字(APRILのために、30、31、33、34、35; BAFFのために、25、29、30、31、34、35)で示される。
表 5:結晶構造データ用のデータ収集と精密化統計(分子の置換):
表 6: J22.9水相互作用(J22.9-xi: H2O:CD269)。
表6中のデータはソフトウェアLigPlot(ウォーレス及びラスコースキー(欧州生物情報研究所))を使用して生成された。
(sc=側鎖H-結合;mc=主鎖H-結合)
J22.9-xiの強い細胞障害性効果は、脱グルコシル化後強く減少する。
ルシフェラーゼ形質導入MM.1S-Luc細胞株を使用して、ルシフェラーゼに基づいた細胞障害性分析法が確立された。この分析では、生物発光が、死細胞によってリリースされたルシフェラーゼはミディアム中のATPの不足により機能することができないので、生細胞からのみ検出される。健康なドナーからのPBMCが、単離され、1対20の比率でMM.1S-Luc細胞と混合した。4時間後、生物発光が測定された。4つの刺激されていないドナーPBMC調製物を選択し、J22.9-xiの生体外細胞障害性が決定された。細胞障害性能は、異なるドナーからのPBMC間でわずかに異なった。インキュベーションの4時間以内に、細胞溶解は125ng/mlのJ22.9-xi濃度で18〜35%に達した。J22.9-xi濃度を1ug/mlに増加させることは、56%まで細胞溶解を増加させた(図3a)。PNGase FによるJ22.9-xi(J22.9-xiN-グリカン)の脱グルコシル化後、細胞障害活性は8%未満に落ちたが、BCMA陽性MM.1S細胞へのJ22.9-xiN-グリカンの結合では、変化がなかった(図3a、b)。
J22.9-xiは、異種移植されたマウスでの腫瘍量を減少させ、生存を延長させる。
機能的なB、T及びNK細胞群を欠くNOD scid共通γ鎖ノックアウト（NSG）マウスが使われた。これらのマウスは、1*107 MM.1S-Luc細胞が静脈内注入され、6週以内に後ろ足麻痺をおこした(図4d-1)。最初の徴候が現われる日が、殺処分の日である。
尾静脈への1x107 MM.1S-Lucの注入後、マウスは、3つのグループに任意に分割した。最初のグループ(n=2)は、実験の終了まで処理を受けなかった。しかし、第2 (n=5)及び第3 (n=6)のグループは、各々、アイソタイプ・コントロール若しくはJ22.9-xi抗体の200μgの注入を週2度受けた。抗体は、腫瘍細胞注入の日に始めて、6週間、腹腔内 (i.p.)に投与された。腫瘍成長は、IVISスペクトルを使用して、週に一度モニターされた。生物発光はルシフェリンのi.p.注入の3分後に測定された。
腫瘍成長の同様の経緯が、治療していないグループとコントロール抗体処置グループの両方で見られ、また、J22.9-xiで処理されたグループは、著しくより少ない腫瘍量を示し、この効果は、日6の最初の測定ポイントで既に始まっていた(図4a)。さらに、このグループは、モニタリング全期間中、より少量の全体としての腫瘍荷（overall tumor load）を示した(図4b)。アイソタイプ・コントロールで治療された動物は、細胞注入後、46日という中間の生存期間であった。J22.9-xi処置を受けたマウスは、平均26日より長く生存した。これは、コントロール抗体で処置を受けたマウスと比較して、55%の延長した生存期間に相当する(図4c)。背骨と鼠径リンパ節への腫瘍細胞の大量の浸食は、治療されていないマウス、及び細胞注入後日28までアイソタイプ・コントロール抗体の処置を受けたマウスで見られた(図4d-2)。
マウスへの抗体200μg投与は、およそ10mg/kg体重の投与量に相当する。より低用量でJ22.9-xiの効能をテストするために、MM.1S-Luc-異種移植マウスを4つのグループに分割した。最初のグループ(n=7)は、週2度、コントロール抗体の200μg処置を受け、またグループ2と3(各n=3)及び4(n=9)は、各々、週2度2μg、20μg若しくは200μgの処置を週2度受けた。上述のように、注入とモニタリングが行なわれた。
腫瘍は、対照群マウスで予想通りに劇的に成長したが、劇的な制限された腫瘍成長が、J22.9-xi の20μg若しくは200μgの処置を受けたグループで観察された (図4e、f)。実験のスケジュール概観は、図4gに示される。
確立した腫瘍の成長が、J22.9-xi処理の間の5週間阻止された。
治療的投与は、腫瘍細胞注入後5日まで抗体処理のスタートを遅らせることにより調整された。異種移植されたマウスは、2つのグループ(n=6)に分割された。動物は、アイソタイプ・コントロール若しくはJ22.9-xi抗体の１注入当たり200μg投与を、週二度受けた。最初の測定は、細胞注入後、日8で行われた。J22.9-xi(n=5)の処置を受けたグループで、日35まで測定可能な腫瘍由来の生物発光がなく、アイソタイプ・コントロール抗体(n=6)の処置を受けた動物では腫瘍細胞量の安定した増加が見られた(図5a、b)。アイソタイプコントロール群からのマウスは、細胞注入後、平均56日生存した。しかし、J22.9-xi処置を受けた全てのマウスは、日77でまだ生きている(図5c)。実験スケジュールの概観は、図5dで提供される。
J22.9-xiによる集中的初期相処理は、7週間、腫瘍成長を阻害した。
腫瘍成長に関する治療タイミングの効果をさらに評価するために、異なる抗体が、腫瘍細胞注入の日からスタートし5日間連続して投与された。i.v. 細胞注入に続き、動物は、5つのグループに任意に分割された。グループ1(n=5)は、注入(i.p.)あたり、アイソタイプ・コントロール抗体の200μgで処置され、グループ2(n=6)は、J22.9-xi-N-グリカン抗体の200μg/注入を受けた。グループ3(n=4)、グループ4(n=5)、及びグループ5(n=5)のマウスは、各々、J22.9-xi抗体の一注入当たり200μg、20μg及び2μgを受けた。生物発光測定は、細胞注入後日9で始めた。日44まで、腫瘍由来生物発光は、完全J22.9-xi抗体の処置を受たグループのいずれでも見られなかった。
J22.9-xi-N-グリカンで処置された動物における腫瘍成長は減速されたが、全体としての腫瘍細胞量は、アイソタイプ・コントロール抗体処置を受けた動物とは実質的に異ならなかった(図6a、b)。J22.9-xi-N-グリカン(脱グリコシル化)で処置された動物の全体としての腫瘍細胞量は、実質的に異なっていない (図6b)が、これらのマウスの寿命はアイソタイプ・コントロール抗体（isoAb）処置されたグループ(図6c)と比較して、実質的に増加した。J22.9-xi-N-グリカンは、ADCCまたはCDCを誘導することができないことを示されたので、この結果は、BCMAへのJ22.9-xiの結合のみが、腫瘍成長を阻害することを示す。これは、受容体とその天然型リガンド(APRILとBAFF)間の相互作用のブロッキングによると考えることは合理的と思われる。実験のスケジュールの概観は図6dで示される。
J22.9-xiのヒト化。
J22.9-xi抗体は、配列アラインメント及び結晶構造から得られたデータに基づいてヒト化された。可変領域の配列は、IgBLAST(NCBI)を使用して、それぞれのヒト同族体に調整された。各候補化された変異は、それぞれ、変更の前に構造の外観試験によって評価した。BCMAへの変異体の結合は、フローサイトメトリーを使用してテストした。親和性は、表面プラズモン共鳴(ProteOnTM XPR36; Bio-rad)を使用して測定した。ヒト化配列の結合特性の初期評価は、J22.9-xi結合のために記述されるのと同じエピトープへのそれらの特異性及び親和性に関して有望な結果を示した。
方法
細胞株及び培養
ヒト多発性骨髄腫細胞株MM.1S(Greenstein et al(2003)Exp Hematol 31:271-282)は、B.Dorken教授(MDC、Berlin、Germany)から得られた。腫瘍細胞増殖の生体内モニタリングのために、ルシフェラーゼとGFPが、レンチウイルスベクター・システムViraPower(Invitrogen)のpFUベクターへクローン化された。形質導入された細胞のGFP発現を経て、モノクローナル細胞株が蛍光活性化単一細胞ソートを使用して単離された。細胞株は、10%のウシ胎仔血清、100ユニット/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(全てPAAから)を含んでいる、フェノールレッドのない、RPMI-1640培地において培養された。
The National Research Council of Canadaから購入されたHEK293-6E細胞は、7.5mM L-グルタミン(PAA)、0.1%Pluronic F -68(Invitrogen)及び25 μg/ml G418(Invitrogen)が補われた、フリースタイルF17培地(Invitrogen)で保持された。細胞は、5%CO2雰囲気下で、110rpm及び37℃で、エルレンマイヤーフラスコ(コーニング)において成長させた。
抗体生産及び精製
BCMA結合抗体を得るため、標準ハイブリドーマ技術が使用された。4BL/6野生型マウスが、不完全なフロイントアジュバントとC-末端にグルタチオンS転移酵素(GST)が融合したヒトBCMA細胞外ドメインの30μgで、6回免疫された。細胞融合後検査期間を経て、J22.9ハイブリドーマは、抗BCMA抗体を分泌することを示した。
ハイブリドーマの不安定性によって、ハイブリドーマJ22.9の軽鎖及び重鎖の可変ドメインが、各々、増幅され、ヒトカッパ若しくはIgG定常ドメイン遺伝子の上流に、クローン化された。キメラ化J22.9-xi抗体は、各々、軽鎖と重鎖をコードする1:2 DNAプラスミド混合物と293-6E細胞の一時的な共形質移入によって生産された。要約すると: 293-6E細胞は、無血清フリースタイルF17培地に1.7×106細胞/mlで再懸濁され、そして1μg/mlの終濃度でポリエチレンイミンを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、細胞は、1%のtryptone N1(オルガノTechnie)を含むトランスフェクション・ボリュームのフリースタイルF17培地の100%で育てた。日7で、細胞が遠心分離によって回収され、そして、ろ過された(0.45μm)培養培地は、3.5mlのプロテインA Sepharoseカラム(BioRad)を通過処理された。カラムは、10mlの燐酸緩衝液(PBS)で洗浄され、抗体は、20mM酢酸ナトリウム、150mM NaCl、pH 3.5の添加によって溶出された。2mlの画分が、中和のために、100μl 1M HEPES、pH 7.5を含むチューブへ直接集められた。全長IgGの最終回収率はおよそ40mg/l 培養であった。
ハイブリドーマJ22.9は、抗BCMA抗体を生産する/分泌するキャパシティーを失った(図8)ので、重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、PCRを使用し増幅され、続いて、各々、ヒト定常IgG1及びK 軽鎖遺伝子の5'末端でクローン化された。これらの2つのプラスミドでの293-6E細胞の共トランスフェクションにより、キメラ化J22.9-xi抗体が生産された。したがって、本発明の抗体の生産は、固有的に困難で、所謂ルーチン方法によっては達成可能ではなかった。
J22.9-xi重鎖及び任意のキメラカッパ軽鎖を含むアイソタイプ・コントロール抗体が、J22.9-xi抗体と並列に生産された。この抗体は、BCMAに結合することができないことが、ELISAとフローサイトメトリーによって示された。
J22.9-xiの重鎖のAsn297で、N-結合オリゴ糖鎖が、N-グリコシダーゼF(PNGase F)(NEB)を使い酵素的に除去された。10mgのJ22.9-xiが、500μl PBS(pH 7.4)中で15,000ユニットのPNGase Fで37℃ 36時間インキュベートされ、その後、無菌PBSへバッファー交換された。
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)によるJ22.9-xiの結合及びブロッキング能の決定。
マイクロタイタープレートが、ヒトBCMAの細胞外ドメインの10μg/mlで被覆された。被覆されたBCMAは、1から1000ngの領域で、J22.9-xi とアイソタイプ・コントロールの連続希釈で検出された。被覆BCMAへのJ22.9-xi若しくはアイソタイプ・コントロール抗体の結合は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヒト2次抗体で検出された(Jackson ImmunoResearch, 109-035-098, 1:5,000希釈)。
ブロッキング実験のために、His-tag(Biomol)に融合された1mg/mlのヒト組み換えBAFFが、抗体に続いて適用され、洗浄され、そしてマウス抗His-tag(AbDSerotec、AD1.1.10、1:5,000稀釈、HRP-結合)抗体を使い検出した。すべてのELISAは、BD OptEIA試薬A及びB(BDバイオサイエンス)を使用し展開し、450nm及び570nmで、マイクロプレート分光光度計(BioTek)で測定された。
フローサイトメトリー分析。
細胞表面抗原検出実験のために、内生の抗体(J22.9-xi及びアイソタイプ・コントロール)及び市販のマウス抗His-tag(AbD Serotec、AD1.1.10、1:100稀釈、アレクサ・フルーアー488-結合)及びヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch、109-116-098、稀釈1:400、PE結合)抗体及びHis-tag(Biomol)に融合されたヒト組み換えのBAFFが使用された。実験は、FACSCalibur若しくはFACSCanto IIフロー血球計(BDBioscience)で行なわれた。データは、Flowjoソフトウェア・バージョン7.6(TreeStar社)で分析された。
FabとFab:BCMA複合体の生成。
(Fab)2断片はペプシンとのインキュベーションによって全長J22.9-xi IgGから生成された。J22.9-xiは、50mM酢酸ナトリウムpH 3.5中へ、PD-10緩衝液交換カラムを通過させ、そして、ミリグラムJ22.9-xi当たり、30μgのペプシンが添加された。2.5時間・37℃でのインキュベーションは、完全に断片結晶化可能な(Fc)領域を消化するのに十分であった。また、ペプシンは、PBS(pH 7.2)へのPD-10カラムを経ての交換によって不活性化された。個々のFabsへの(Fab)2断片の還元は、5mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)存在下2-メルカプトエチルアミン(50 mM)の添加によってPBS中でなされた。37℃・90分のインキュベーション後、還元システインは、新鮮PBSへのバッファー交換に続く、30分間の500μMヨードアセトアミドでのアルキル化によってブロックされた。Fab断片は、精製BCMAの1.5モル濃度同等物と結合され、そして該複合体はSuperdex75 16/60カラムでの分子篩クロマトグラフィーによって単離された。分画は、4-12%SDSポリアクリルアミドゲルで分析され、両FabとBCMAを含む分画はプールされ、結晶化のために濃縮された。
Fab:BCMA複合体の結晶化。
濃縮複合体は、飽和を確実にするために純粋BCMAの0.5モル濃度相当物で補充され、結晶化スクリーニングを受けた。当初のFab:BCMA結晶化条件は、グリフィンのピペッティングロボット(200nlドロップ)を使用し、96-wellシッティングフォーマット・プレート上で、商用スクリーン(Qiagen)から同定され、懸滴(2-3μl)で24-wellプレートにおいて最適化した。複合体は8mg/mlまで濃縮され、20℃で、21%PEG 3350、0.1MビストリスpH 6.5及び5mM CuCl2において結晶化された。結晶が、薄いプレートのクラスタとして3日後に現われ、およそ7日以内にその終サイズ(0.2 〜0.3mm)に達した。クラスタは単離され、
また、個々のプレートは、凍結保護物質として20%グリセリン母液中で液体窒素によって瞬間冷凍された。完全な回析データは、HelmoltzZentrumベルリンのBESSYシンクロトロンで単結晶から集められた。構造は、探索モデルとして、Efalizumab(3EO9)の構造から、実験相を使用して、分子置換によって1.9オングストロームの解像度で解析された。データ処理はプログラムのccp4総合パッケージソフトで行なわれ、構造精密化はフェニックス(Adams P D, et al.(2010), Acta Cryst. D66: 213-221)及び数学的モデル構成及びCoot (Emsley et al,Acta Crystallographica Section D - Biological Crystallography, 2010,66:486-501)を使う評価を使用して行なわれた。イメージは、PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schredinger, LLC)を使用して作られた。
生体外細胞障害性分析。
この分析において、J22.9-xiの細胞障害効果が、生物発光リーダで、残存する生細胞の発効を測定して決定された。概括していえば: 新鮮に得られたヒトフィルタ処理バフィーコート(FBC)が、160mlの溶出バッファー(5mM Na2-EDTA及び2.5[w/v]シュークロースを含むPBS(pH 7.4))を使い、重力によって逆流された。単核細胞は、フィコール勾配遠心分離によって溶出された細胞から単離された。細胞分裂間期からの単核細胞が得られ、溶出バッファーで2度洗われた。赤血球溶解後、PBMCは、再度洗われ、1*107細胞/mlへ、RPMI/10% FCS w/oフェノールレッドでの稀釈によって調節された。50μl RPMIに存在する5*104 MM.1S-Luc細胞が、マイクロプレートに蒔かれた。
100μl PBMCの添加10分前、MM.1S-Luc細胞は、J22.9-xi若しくは200μlのサンプル・ボリュームにおけるアイソタイプ・コントロール抗体連続希釈で培養された。標的細胞、抗体及びエフェクター細胞の添加後、マイクロプレートは室温(RT)で2分間遠心分離機にかけられ(300x g)、5%CO2 ・37℃で保存した。コントロールウェルは、完全溶解のために抗体の代わりに1%トリトンXで処理された。4時間のインキュベーション後に、25μlのルシフェリン(250ng/ml)を含むPBSが、各ウェルに適用され、そして、生細胞の生物発光が生物発光リーダ(Tecan)で測定された。特異的細胞障害性が次の式によって計算された:
100 −〔値(J22.9-xi)−値 (全溶解)〕/〔値(アイソタイプ・コントロール)−値 (全溶解) 〕* 10。
生体内実験。
NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl Tg(CSF2)2Ygy Tg(IL3)1Ygy
ジャクソン研究所からのTg(KITLG)3YgyJGckRolyJマウス(NSG)及びCharles River Deutschland (Sulzfeld, Germany)からのCB17.Cg-Prkdcscid Lystbg/Crlマウスが使用された。実験は、8-14週令の間のマウスで行なわれた。動物実験はすべて、特定病原体除去条件の下で、組織と国のガイドラインによって行なわれた。疾患の初期相の腫瘍処置と定着腫瘍の処置に関係する実験実施例において、CB17.Cg-Prkdcscid Lystbg/Crlマウスが使用された。ここに言及された2つのマウス群の発現型は非常に類似している。該動物は、機能的なB-、T-及びNK-細胞を持たない。本発明の治療用抗体のより一層の有望な効果を示し、わずかに遅い腫瘍成長が、CB17.Cgマウスで観察された。
多発性骨髄腫の異種移植片モデルは、日0に尾静脈に1*107 MM.1S-Luc細胞の静脈注射によってもたらされた。このモデルでは、治療していない動物は6週以内に後ろ足麻痺をおこした。この徴候の出現が、実験の終端を意味する。
効能研究のために、抗体が、日0に始まり、週二度若しくは5日間連続で腹腔内に(i.p.)投与された。J22.9-xi抗体は、注入当たり、2μg、20μg若しくは200μgの投与量で与えられ、アイソタイプ・コントロール抗体は、200μg/注入で使用された。MM.1S-Luc細胞の生物発光はIVISスペクトル(Caliper LifeSciences)を使用し150μgルシフェリンのi.p.注入後に測定された。測定は、週1回行われた。各時点で、3匹の治療していないコントロール・マウスもルシフェリンを投与された。これらの動物の全フラックス値は、各測定から引かれるか、若しくはグラフで示される。
定着腫瘍を処置するために、抗体療法が、MM.1S-Luc細胞の注入5日後に始められた。200μgのJ22.9-xi若しくはアイソタイプ・コントロール抗体が、週二度6週間投与された。
なお、更なる実験は、本発明の好ましい実施例が、驚くべきそして予測できない効果を提供し、それによって本発明の非自明性を確実にする。
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Claims (17)

  1. VHドメイン及びVLドメインを含む単離された抗体若しくは抗体断片であって、該VHドメインが、CDR H1(SEQID No.1; RYWMS)、CDR H2(SEQ IDNo.2; EINPDSSTINYAPSLKD)及びCDRH3(SEQ ID No.3; SLYYDYGDAMDYW)のCDR領域を含み、及び該VLドメインが、CDR L1 (SEQ ID No. 4;KASQSVDSNVA),CDR L2(SEQ ID No. 5; SASLRFS) 及び CDR L3 (SEQ ID No. 6;QQYNNYPLTFG)のCDR領域を含み、単離された抗体若しくは抗体断片がCD269(BCMA)に結合する、単離された抗体若しくは抗体断片。
  2. SEQ ID No.7のVHドメイン及びSEQ ID No.8のVLドメインを含む請求項１に記載の単離された抗体若しくは抗体断片。
  3. ヒト化された若しくは部分的にヒト化されたVHドメイン及びVLドメインを含む単離された抗体若しくは抗体断片であって、該VHドメインが、CDR hH1(SEQ ID No.15; DYWMS), CDRhH2 (SEQ ID No. 16; EINPDSSTINYAPSLKG) 及び CDR hH3 (SEQID No. 3; SLYYDYGDAMDYW)のCDR領域を含み、及び該VLドメインは、CDR hL1(SEQ ID No.4; KASQSVDSNVA),CDR hL2 (SEQ ID No. 17; SDDLRFS) 及び CDR hL3 (SEQ ID No.6; QQYNNYPLTFG)のCDR領域を含み、単離された抗体若しくは抗体断片がCD269(BCMA)に結合する、単離された抗体若しくは抗体断片。
  4. SEQ ID No.18〜25のいずれか一つの配列のヒト化若しくは部分的にヒト化されたVHドメイン、及びSEQ IDNo.26〜56のうちのいずれか一つの配列のヒト化若しくは部分的にヒト化されたVLドメインを含む、請求項３に記載の単離された抗体若しくは抗体断片。
  5. 単離された抗体若しくは抗体断片が、CD269(BCMA)のアミノ酸残基13、15、16、17、18、19、20、22、23、26、27及び32からなるエピトープに結合する、請求項１〜４のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片。
  6. CD269(BCMA)に結合する抗体は、BAFF-CD269及び／又はAPRIL-CD269相互作用を遮断する、請求項１〜５のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片。
  7. 該抗体が、グリコシル化されてなる、請求項１〜６のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片。
  8. グリコシル化された抗体の多糖が、重鎖のAsn297でN結合オリゴ糖鎖である、請求項７に記載の単離された抗体若しくは抗体断片。
  9. 請求項１〜８のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片を含む、病原性のB細胞の存在に関連した医学的疾患の治療用薬剤。
  10. 病原性のB細胞の存在に関連した医学的疾患が、プラスマ細胞の癌又はBリンパ細胞の癌である、請求項９に記載の薬剤。
  11. プラスマ細胞の癌が、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、若しくはプラスマ細胞白血病、及びBリンパ細胞の癌が、ホジキン病である、請求項１０に記載の薬剤。
  12. 病原性のB細胞の存在に関連した医学的疾患の治療用薬剤であって、病原性のB細胞の存在に関連した医学的疾患が、自己反応性プラスマ細胞及び／又は自己反応性メモリーB細胞と関連のある自己免疫疾患である、請求項１〜８のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片を含む薬剤。
  13. 病原性のB細胞の存在に関連した医学的疾患が、炎症性の自己免疫疾患、全身性紅斑狼瘡（SLE）、又はリューマチ関節炎である、請求項１２に記載の薬剤。
  14. 治療薬に結合された請求項１〜８のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片を含む抗体-医薬結合体（ADC）。
  15. 請求項１〜８のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  16. 請求項１〜８のいずれか一に記載の抗体若しくは抗体断片を生産できる及び／又は請求項１５に記載の核酸分子を含む、細菌細胞若しくは哺乳類細胞である宿主細胞。
  17. 薬学的に許容可能な担体と共に、請求項１〜８のいずれか一に記載の単離された抗体若しくは抗体断片を含む薬学的組成物。
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