CN108348780A - 用作用于环磷酰胺和异环磷酰胺的免疫分析的免疫原和分析缀合物的环磷酰胺类似物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及结合至小分子比如环磷酰胺、异环磷酰胺和其类似物的抗体，和用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在和/或量化其量的免疫分析。举例而言，这样的免疫分析可用于环境测试。

Description

用作用于环磷酰胺和异环磷酰胺的免疫分析的免疫原和分析 缀合物的环磷酰胺类似物
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月10日提交的美国临时申请号62/216,943的权益，其全部内容在此通过引用被并入。
技术领域
本申请涉及结合至小分子比如环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)和其类似物的抗体的领域，和用于测定样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在和/或量化其量的免疫学分析的领域。举例而言，这样的抗体和/或免疫学分析可以被用于环境测试。
背景技术
环磷酰胺是氮芥烷化剂的前药，其中双(2-氯乙基)氨基的反应性被减弱。在体内氧化之后，六元环打开，增强了氮芥的反应性，其然后用于交联DNA。环磷酰胺具有严重的和威胁生命的副作用，包括急性髓性白血病、膀胱癌、出血性膀胱炎和永久性不孕，尤其是在较高剂量下。异环磷酰胺也是在癌症的治疗中使用的氮芥烷化剂。异环磷酰胺可以引起脑病，影响外周神经，并且干扰儿童的神经发育。
迄今为止，不存在用于检测环磷酰胺或异环磷酰胺的商业免疫分析试剂盒。另外，不存在针对环磷酰胺或异环磷酰胺的商业可得的抗体。因此，对于发展用于这些细胞毒素剂的免疫分析存在需要。
发明内容
本申请的实施方式涉及环磷酰胺类似物的家族，这些环磷酰胺类似物可以被用作用于生成识别环磷酰胺和/或异环磷酰胺的抗体的免疫原。这些环磷酰胺类似物也可以被用于生成可以在用于检测环磷酰胺和/或异环磷酰胺的免疫分析中使用的分析缀合物。类似物的每种包含官能团，其目的是缀合但是维持六元环作为用于抗体生成和药物识别的重要表位。
本申请的一些实施方式涉及环磷酰胺类似物，其包括式(I)或(II)的结构：
其中R1a选自氢或-(CH2)m-X；R2a是-(CH2)n-Y；R1b是-(CH2)m-X；R2b和R2b’的每个独立地选自-(CH2)k-Z；每个R3a、R4a、R5a、R3b、R4b和R5b独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、5-10元杂环基(heterocyclyl)、芳基、芳烷基、5-10元杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基、芳氧基、卤代(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷氧基、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基和氧(＝O)；X是选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；Y是独立地选自卤素、羟基、胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；Z选自卤素或羟基；并且每个m、n和k独立地是2至10的整数。
在式(I)的化合物的一些实施方式中，R1a是氢并且R2a是-(CH2)n-Y，其中Y选自能够与运载体蛋白形成缀合物的官能团，例如胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺。在一些这样的实施方式中，Y选自硫醇或羧酸。在一些这样的实施方式中，n是整数2。
在式(I)的化合物的一些可选实施方式中，R1a是-(CH2)m-X，其中X选自能够与运载体蛋白形成缀合物的官能团，例如胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺。在一些这样的实施方式中，X选自硫醇或羧酸。在一些这样的实施方式中，R2a是-(CH2)n-Y，其中Y选自卤素(例如，氯)或羟基。在一些这样的实施方式中，m是整数3并且n是整数2。
在式(II)的化合物的一些实施方式中，R1b是-(CH2)m-X，其中X选自能够与运载体蛋白形成缀合物的官能团，例如胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺。在一些这样的实施方式中，X选自硫醇或羧酸。在一些这样的实施方式中，每个R2b和R2b’是-(CH2)k-Z并且Z选自卤素(例如，氯)或羟基。在一些这样的实施方式中，m是整数2。在一些实施方式中，至少一个k是整数2。在一些进一步实施方式中，两个k均是整数2。
在一些实施方式中，式(I)的R3a、R4a、R5a的至少一个和式(II)的R3b、R4b、R5b的至少一个是氢。在一些进一步实施方式中，式(I)的R3a、R4a、R5a和式(II)的R3b、R4b、R5b中每个都是氢。
本申请的一些实施方式涉及包括如本文描述的环磷酰胺类似物的免疫原，该环磷酰胺类似物通过该类似物化合物的官能团X或Y共价地结合至免疫原性聚合物或运载体。在一些实施方式中，免疫原性聚合物或运载体选自免疫活性蛋白质或多肽。
本申请的一些实施方式涉及基本上选择性地结合至环磷酰胺、异环磷酰胺、或环磷酰胺和异环磷酰胺的抗体。在一些实施方式中，抗体由本文描述的免疫原产生。同样，在一些实施方式中，抗体结合至环磷酰胺、异环磷酰胺、或环磷酰胺和异环磷酰胺，并且进一步结合至式(I)的化合物，其中运载体共价地结合至X或Y，并且其中运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。在一些实施方式中，抗体结合至环磷酰胺、异环磷酰胺、或环磷酰胺和异环磷酰胺，并且进一步结合至式(II)的化合物，其中运载体共价地结合至X，其中运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。在一些实施方式中，抗体结合至环磷酰胺并且运载体包括KLH。在一些实施方式中，抗体结合至异环磷酰胺并且运载体包括KLH。在一些实施方式中，抗体包括单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体结合至环磷酰胺和异环磷酰胺，并且运载体包括KLH。在一些实施方式中，抗体包括多克隆抗体。
本申请的一些实施方式涉及用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的免疫分析，包括分析缀合物，其中该分析缀合物包括如本文描述的环磷酰胺类似物，该环磷酰胺类似物通过该类似物化合物的官能团X或Y共价地结合至运载体。在一些实施方式中，运载体选自蛋白质或多肽。在一些实施方式中，运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。
本申请的一些实施方式涉及包括用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的试剂的试剂盒，试剂的一种为通过如本文描述的环磷酰胺类似物化合物的官能团X或Y共价地结合至该环磷酰胺类似物的运载体的缀合物。在一些实施方式中，运载体选自蛋白质或多肽。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括如本文描述的抗体。在一些实施方式中，抗体结合至如本文描述的环磷酰胺和/或异环磷酰胺。
在一些实施方式中，如本文描述的环磷酰胺类似物进一步包括共价地结合至X的运载体，其中该运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。在一些实施方式中，如本文描述的环磷酰胺类似物进一步包括共价地结合至Y的运载体，其中该运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。
本申请的一些实施方式涉及特异性地结合至如本文描述的环磷酰胺类似物的抗体，例如如此环磷酰胺类似物：其进一步包括共价地结合至X的运载体，和/或进一步包括结合至如本文描述的Y的运载体。在一些实施方式中，抗体结合至具有如下解离常数(Kd)的环状环磷酰胺：其在数值上小于1/10的式(III)的非环状环磷酰胺的解离常数。在一些实施方式中，抗体结合至具有如下解离常数(Kd)的环状环磷酰胺：其在数值上小于1/1000的式(III)的非环状环磷酰胺的解离常数。在一些实施方式中，抗体包括单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体包括多克隆抗体。
本申请的一些实施方式涉及制造特异性地结合至环磷酰胺的抗体的方法。方法可以包括给宿主生物体施用如本文描述的免疫原或式(I)的化合物(其中运载体共价地结合至X或Y，其中运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒)，或式(II)的化合物(其中运载体共价地结合至X，其中运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒)。在一些实施方式中，运载体包括KLH。方法可以包括从宿主生物体分离抗体生成细胞或者抗体。方法可以包括筛选对环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体或者来自宿主生物体的抗体。在一些实施方式中，宿主生物体包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、驴或山羊。在一些实施方式中，运载体包括KLH。在一些实施方式中，抗体生成细胞被分离，并且筛选对环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体，并且特异性地结合至环磷酰胺的抗体是单克隆的。在一些实施方式中，方法进一步包括由分离的抗体生成细胞构建杂交瘤。在一些实施方式中，方法进一步包括通过噬菌体展示从分离的抗体生成细胞筛选核酸。在一些实施方式中，方法进一步包括筛选与式(III)的非环状代谢物相比特异性地结合至环磷酰胺的抗体。在一些实施方式中，筛选对环磷酰胺具有亲和力的来自宿主生物体的抗体，并且特异性地结合至环磷酰胺的抗体是多克隆的。
本申请的一些实施方式涉及制造特异性地结合至异环磷酰胺的抗体的方法。方法可以包括给宿主生物体施用如本文描述的免疫原或式(I)的化合物(其中运载体共价地结合至X或Y，其中运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒)，或式(II)的化合物(其中运载体共价地结合至X，其中运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒)。在一些实施方式中，运载体包括KLH。方法可以包括从宿主生物体分离抗体生成细胞或者抗体。方法可以包括筛选对异环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体或者来自宿主生物体的抗体。在一些实施方式中，宿主生物体包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、驴或山羊。在一些实施方式中，运载体包括KLH。在一些实施方式中，抗体生成细胞被分离，并且筛选对异环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体，并且特异性地结合至异环磷酰胺的抗体是单克隆的。在一些实施方式中，方法进一步包括由分离的抗体生成细胞构建杂交瘤。在一些实施方式中，方法进一步包括通过噬菌体展示从分离的抗体生成细胞筛选核酸。在一些实施方式中，方法进一步包括筛选与式(III)的非环状代谢物相比特异性地结合至异环磷酰胺的抗体。在一些实施方式中，筛选对异环磷酰胺具有亲和力的来自宿主生物体的抗体，并且特异性地结合至异环磷酰胺的抗体是多克隆的。
具体实施方式
定义
除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物通过引用以其全部被并入，除非另有规定。如果对于本文中的某个术语存在多个定义，则以该段中的那些为准，除非另有规定。如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a,an)”和“该(the)”包括复数个参考对象，除非上下文另有明确规定。除非另有指示，采用质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。“或”或“和”的使用意思是“和/或”，除非另有规定。而且，术语“包括(including)”以及其它形式比如“包括(include,includes,included)”的使用是非限制性的。如在说明书中所使用的，无论在连接词中或在权利要求的主体中，术语“包括(comprise,comprising)”将被解释为具有开放式含义。即，这些术语将被解释为与短语“具有至少”或“包括至少”同义。当在方法的背景下使用时，术语“包括(comprising)”意思是该方法包含至少阐述的步骤，但是可以包含另外的步骤。当在化合物、组合物或设备的背景下使用时，术语“包括(comprising)”意思是该化合物、组合物或设备包括至少阐述的特征或成分，但是还可以包含另外的特征或成分。
本文使用的章节标题仅出于组织目的并且不被解释为限制描述的主题。
如本文所使用，“胺”或“氨基”指的是“-NRARB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。非限制性实例包括游离氨基(例如-NH2)。
如本文所使用，术语“卤素”或“卤代”意思是元素周期表的第7列的放射稳定的原子中任一种，例如，氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是优选的。
如本文所使用，“羧酸”指的是“-(C＝O)-OH”基团。
如本文所使用，“酰肼”指的是“-(C＝O)-NH-NH2”基团。
如本文所使用，“肼”指的是“-NH-NH2”基团。
如本文所使用，“肟”指的是“-RC＝N-OH”基团，其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环。
如本文所使用，“硫醇”指的是“-SH”基团。
如本文所使用，“烷基”指的是完全饱和的(即，不含双键或三键)的直链或分支烃链。烷基可以具有1至20个碳原子(无论何时其在本文中出现时，数值范围比如“1至20”指的是该给定范围中的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意思是烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，多至并包括20个碳原子，尽管本定义也覆盖其中没有规定数值范围时出现的术语“烷基”)。烷基也可以是具有1至9个碳原子的中等大小烷基。烷基也可以是具有1至4个碳原子的低级烷基。烷基可以被指定为“C1-4烷基”或类似指定。仅举例而言，“C1-4烷基”指示在烷基链中存在一至四个碳原子，即，烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
如本文所使用，“烷氧基”指的是式–OR，其中R是如上面所限定的烷基，比如“C1-9烷氧基”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。
如本文所使用，“烷硫基”指的是式–SR，其中R是如上面所限定的烷基，比如“C1-9烷硫基”等，包括但不限于甲基巯基、乙基巯基、正丙基巯基、1-甲基乙基巯基(异丙基巯基)、正丁基巯基、异丁基巯基、仲丁基巯基、叔丁基巯基等。
如本文所使用，“烯基”指的是含有一个或多个双键的直链或分支烃链。烯基可以具有2至20个碳原子，尽管本定义也覆盖其中没有规定数值范围时出现的术语“烯基”。烯基也可以是具有2至9个碳原子的中等大小烯基。烯基也可以是具有2至4个碳原子的低级烯基。烯基可以被指定为“C2-4烯基”或类似指定。仅举例而言，“C2-4烯基”指示在烯基链中存在两个至四个碳原子，即，烯基链选自乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2,-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基。典型的烯基包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、和己烯基等。
如本文所使用，“炔基”指的是含有一个或多个三键的直链或分支烃链。炔基可以具有2至20个碳原子，尽管本定义也覆盖其中没有规定数值范围时出现的术语“炔基”。炔基也可以是具有2至9个碳原子的中等大小炔基。炔基也可以是具有2至4个碳原子的低级炔基。炔基可以被指定为“C2-4炔基”或类似指定。仅举例而言，“C2-4炔基”指示在炔基链中存在两个至四个碳原子，即，炔基链选自乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基。典型的炔基包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、和己炔基等。
如本文所使用，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳环或环体系(即，共享两个相邻碳原子的两个或多个稠环)。当芳基是环体系时，体系中的每个环是芳香的。芳基可以具有6至18个碳原子，尽管本定义也覆盖其中没有规定数值范围时出现的术语“芳基”。在一些实施方式中，芳基具有6至10个碳原子。芳基可以被指定为“C6-10芳基”、“C6或C10芳基”或类似指定。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。
如本文所使用，“芳氧基”和“芳硫基”指的是RO-和RS-，其中R是如上面所限定的芳基，比如“C6-10芳氧基”或“C6-10芳硫基”等，包括但不限于苯氧基。
“芳烷基”或“芳基烷基”是经由亚烷基作为取代基连接的芳基，比如“C7-14芳烷基”等，包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基和萘基烷基。在一些情况下，亚烷基是低级亚烷基(即，C1-4亚烷基)。
如本文所使用，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或多个杂原子——即除了碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫——的芳环或环体系(即，共享两个相邻原子的两个或多个稠环)。当杂芳基是环体系时，体系中的每个环是芳香的。杂芳基可以具有5-18个环原子数(即，组成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)，尽管本定义也覆盖其中没有规定数值范围时出现的术语“杂芳基”。在一些实施方式中，杂芳基具有5至10个环原子数或5至7个环原子数。杂芳基可以被指定为“5-7元杂芳基”、“5-10元杂芳基”或类似指定。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、2,3-二氮杂萘基、吡咯基、唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。
如本文所使用，“环烷基”意思是完全饱和的碳环基环或环体系。实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所使用，“杂环基”意思是在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳族环状环或环体系。杂环基可以以稠合、桥接或螺接方式接合在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是环体系中的至少一个环不是芳香性的。杂原子(一个或多个)可以存在于环体系中的非芳族或芳族环中。杂环基可以具有3至20个环原子数(即，组成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)，尽管本定义也覆盖其中没有规定数值范围时出现的术语“杂环基”。杂环基也可以是具有3至10个环原子数的中等大小杂环基。杂环基也可以是具有3至6个环原子数的杂环基。杂环基可以被指定为“3-6元杂环基”或类似指定。在优选的六元单环杂环基中，杂原子(一个或多个)选自O、N或S中的一至三种，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子(一个或多个)选自一种或两种杂原子，其选自O、N或S。杂环基环的实例包括但不限于氮杂基(azepinyl)、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基(dioxolanyl)、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基(oxiranyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、哌啶基、哌嗪基、二氧哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基(pyrrolidionyl)、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二英基(dioxinyl)、1,3-二烷基(dioxanyl)、1,4-二英基、1,4-二烷基、1,3-氧硫杂环己烷基(oxathianyl)、1,4-氧硫杂环己二烯基(oxathiinyl)、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-嗪基、三烷基(trioxanyl)、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基(dioxolyl)、1,3-二氧戊环基、1,3-二硫醇基、1,3-二硫杂环戊烷基(dithiolanyl)、异唑啉基(isoxazolinyl)、异唑烷基(isoxazolidinyl)、唑啉基、唑烷基、唑烷酮基(oxazolidinonyl)、噻唑啉基、四氢噻唑基、1,3-氧硫杂环戊烷基(oxathiolanyl)、吲哚啉基、异吲哚啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基(benzimidazolidinyl)和四氢喹啉。
如本文所使用，“酰基”指的是–C(＝O)R，其中R是氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。非限制性实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。
“O-羧基”基团指的是“-OC(＝O)R”基团，其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“C-羧基”基团指的是“-C(＝O)OR”基团，其中R选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。非限制性实例包括羧基(即，-C(＝O)OH)。
“氰基”基团指的是“-CN”基团。
“S-亚磺酰氨基”基团指的是“-SO2NRARB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“N-亚磺酰氨基”基团指的是“-N(RA)SO2RB”基团，其中RA和Rb每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“O-氨基甲酰”基团指的是“-OC(＝O)NRARB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“N-氨基甲酰”基团指的是“-N(RA)OC(＝O)RB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“O-硫代氨基甲酰”基团指的是“-OC(＝S)NRARB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“N-硫代氨基甲酰”基团指的是“-N(RA)OC(＝S)RB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“C-酰氨基”基团指的是“-C(＝O)NRARB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“N-酰氨基”基团指的是“-N(RA)C(＝O)RB”基团，其中RA和RB每个独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文所限定的。
“氨基烷基”基团指的是经由亚烷基连接的氨基。
“烷氧基烷基”基团指的是经由亚烷基连接的烷氧基，比如“C2-8烷氧基烷基”等。
在本文公开的化合物具有至少一个手性中心的地方，它们可以作为单独对映异构体和非对映异构体存在，或者作为这种异构体的混合物存在，包括外消旋体。单独异构体的分离或单独异构体的选择性合成通过应用对于本领域的从业者熟知的各种方法来完成。除非另有指定，所有这种异构体和其混合物包含在本文公开的化合物的范围中。
术语“免疫原”和“免疫原性”指的是能够诱发、产生或生成生物体中免疫应答的物质。
术语“缀合物”指的是由将两部分接合在一起形成的任何物质。根据本文中的一些实施方式的有代表性的缀合物包括通过将小分子比如式(I)或(II)的化合物与大分子比如运载体或聚胺聚合物特别是蛋白质接合在一起形成的那些。在缀合物中，小分子可以在大分子上的一个或多个活性位点处结合。
“半抗原”是部分或不完全抗原。它们是无蛋白质的物质，大多数是低分子量物质，其不能够刺激抗体形成，但是其与抗体反应。后者通过将半抗原结合至高分子量免疫原性运载体并且然后将此结合的产物即免疫原注入人或动物对象来形成。
术语“抗体”指的是抗原的特异性蛋白结合配偶体并且是任何物质，或一组物质，其对抗原具有排斥其它物质的特异性结合亲和力。通用术语抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段。
如本文所使用，“免疫原性运载体”是免疫原性物质，通常是蛋白质，其可以与半抗原接合，从而使得这些半抗原衍生物能够诱导免疫应答并且诱发产生可以与这些半抗原特异性地结合的抗体。在免疫原性运载体中，物质包括蛋白质、糖蛋白、聚氨基-多糖复合物、颗粒和核酸，其被识别为外来的并且从而诱发来自宿主的免疫学应答。聚氨基-多糖可以使用用于此制备的任何已知的常规手段由多糖制备。
再者，各种蛋白质类型可以被采用为聚(氨基酸)免疫原性运载体。这些类型包括白蛋白、血清蛋白、脂蛋白等。示例性蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)等。可选地，可以利用合成的聚(氨基酸)。在一些实施方式中，KLH被用作免疫原性运载体。
免疫原性运载体也可以包括聚氨基-多糖，其是由单糖的重复缩合构建的高分子量聚合物。多糖的实例是淀粉、糖原、纤维素、糖胶比如阿拉伯树胶、琼脂等。多糖也可以包含聚氨基酸残基和/或脂质残基。
免疫原性运载体也可以是单独的聚(核酸)或者缀合至上面提及的聚(氨基酸)或多糖中的一种的聚(核酸)。
免疫原性运载体也可以包括固体颗粒。颗粒通常是至少大约0.02微米(μm)并且不超过大约100μm，并且直径通常是大约0.05μm至10μm。
环磷酰胺类似物
本申请的一些实施方式涉及环磷酰胺类似物，其包括式(I)或(II)的结构：
其中R1a选自氢或-(CH2)m-X；
R2a是-(CH2)n-Y；
R1b是-(CH2)m-X；
R2b和R2b’的每个独立地选自-(CH2)k-Z；
每个R3a、R4a、R5a、R3b、R4b和R5b独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、5-10元杂环基、芳基、芳烷基、5-10元杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基、芳氧基、卤代(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷氧基、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基和氧(＝O)；
X是选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；
Y是独立地选自卤素、羟基、胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；
Z选自卤素或羟基；并且
每个m、n和k独立地是2至10的整数。
在式(I)的化合物的一些实施方式中，R1a是氢并且R2a是-(CH2)n-Y。在一些这样的实施方式中，Y是选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团。在一个实施方式中，Y是硫醇。在另一个实施方式中，Y是羧酸。
在式(I)的化合物的一些实施方式中，R1a是-(CH2)m-X并且X选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺。在一个实施方式中，X是硫醇。在另一个实施方式中，X是羧酸。在一些这样的实施方式中，R2a是-(CH2)n-Y并且Y选自氯或羟基。
在式(II)的化合物的一些实施方式中，R1b是-(CH2)m-X并且X是选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团。在一个实施方式中，Y是硫醇。在另一个实施方式中，Y是羧酸。在一些这样的实施方式中，每个R2b和R2b’是-(CH2)k-Z并且Z选自氯或羟基。
在式(I)或(II)的化合物的一些实施方式中，m是整数2。在一些其它实施方式中，m是整数3。
在式(I)或(II)的化合物的一些实施方式中，n是整数2。
在式(I)或(II)的化合物的一些实施方式中，k是整数2。
在式(I)或(II)的化合物的一些实施方式中，连接基团-(CH2)m-、-(CH2)n-、-(CH2)k-中的每个可以任选地被取代。可选地，一个或多个碳原子可以被一个或多个杂原子比如O、S或N代替。
在式(I)或(II)的化合物的一些实施方式中，R3a、R4a、R5a、R3b、R4b和R5b中的至少一个是氢。在一些优选的实施方式中，R3a、R4a、R5a、R3b、R4b和R5b中的每个是氢并且式(I)和(II)由(Ia)和(IIa)表示：
抗体
一些实施方式包括抗体和/或制造抗体的方法。如本文所使用，“抗体”指的是全尺寸抗体，和除非另有规定，其抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以被形成为根据本文中实施方式的各种蛋白质形式。如本文所使用的抗体的抗原结合片段或“抗体片段”包括含有抗原结合位点的完整抗体的一部分或完整抗体的可变区。一些抗体片段不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3和H4，取决于抗体同种型)，或其部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；微抗体(minibody)；双抗体；任何抗体片段(其在本文中指的是“单链抗体片段”或“单链多肽”)，其是具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的多肽，非限制性地包括(1)单链Fv(scFv)分子，(2)单链多肽，其包含仅一个轻链可变结构域，或者含有轻链可变结构域的三个CDR的其片段，没有相关重链部分，和(3)单链多肽，其包含仅一个重链可变区，或含有重链可变区的三个CDR的其片段，没有相关轻链部分；和由抗体片段形成的多特异性或多价结构，例如双特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，抗体是鼠科抗体。在一些实施方式中，抗体是兔抗体。在一些实施方式中，抗体是大鼠抗体。在一些实施方式中，抗体是山羊抗体。在一些实施方式中，抗体是豚鼠抗体。在一些实施方式中，抗体是驴抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，抗体是人抗体。
抗体可以在体内、离体和/或体外条件下产生。例如，在美国专利号6,156,878中已经描述了抗体的一般结构，为了抗体结构的其公开内容和出于所有目的，该专利在此通过引用被并入。天然存在的抗体或免疫球蛋白通常是四个共价结合的肽链的四聚体。例如，IgG抗体具有两个轻链和两个重链。每个轻链共价地结合至重链。反过来，每个重链共价地连接至另一个以形成“Y”构型，其也被称为免疫球蛋白构型。这些分子的片段，或甚至单独的重或轻链可以结合抗原。抗体、抗体的片段和单独链也在本文中被称为免疫球蛋白。
正常的天然存在的抗体重或轻链具有N-端(NH2)可变(V)区和C-端(--COOH)恒定(C)区。重链可变区被称为VH(包括，例如，Vγ)，并且轻链可变区被称为VL(包括Vκ或Vλ)。可变区是结合至抗体的同源抗原的分子的部分，而Fc区(C区的第二和第三结构域)决定抗体的效应功能(例如，补体固定)。全长免疫球蛋白或抗体“轻链”(通常大约25kDa，大约214个氨基酸)由N-端处的可变区基因(通常大约110个氨基酸)和COOH-端处的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白或抗体“重链”(通常大约50kDa，大约446个氨基酸)类似地由可变区基因(通常编码大约116个氨基酸)和恒定区基因的一个例如γ(编码大约330个氨基酸)编码。通常，“VL”将包括由VL和/或JL(J或接合区)基因片段编码的轻链的部分，并且“VH”将包括由VH和/或DH(D或多变区)和JH基因片段编码的重链的部分。一般地参见，Roitt等人,Immunology(2d ed.1989),Chapter 6和Paul,Fundamental Immunology(Raven Press,2ded.,1989)(其每个出于所有目的通过引用被并入)。
免疫球蛋白轻或重链可变区由“框架”区(“FR”，其在本文中也可以被称为“FWR”)构成，该“框架”区由也被称为互补决定区或CDR的三个高变区中断。CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序地编号。从N-端至C-端，轻链和重链二者均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链的结构域在本文中可以被称为HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3和HFR4。轻链的结构域在本文中可以被称为LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LHFR3、LCDR3和LFR4。框架区和CDR的范围已经被限定(参见Kabat等人(1987),"Sequencesof Proteins of Immunological Interest,"U.S.Department of Health and HumanServices；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)(其每个出于所有目的通过引用被并入本文)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区——其是组成的轻和重链的结合框架区——用作在三维空间中定位和对齐CDR。CDR主要负责结合至抗原的表位。
重链分子的恒定区——其也被称为CH——决定抗体的同种型。抗体被称为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，这取决于重链同种型。分别在重链恒定区的μ、δ、γ、α和ε区段中编码同种型。此外，存在许多γ亚型。存在两种类型的轻链，κ和λ。这些亚型的决定簇通常存在于轻链的恒定区中，通常也被称为CL，并且具体地Cκ或Cλ。
重链同种型可以决定抗体的不同效应功能，比如调理作用或补体固定。此外，重链同种型决定抗体的分泌型。分泌的IgG、IgD和IgE同种型通常以单一单位或单体形式发现。分泌的IgM同种型以五聚体形式发现；分泌的IgA可以以单体和二聚体形式发现。在一些实施方式中，如本文描述的抗体，例如单克隆抗体，具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM同种型。
如本文所使用，术语“特异性地”、“选择性地”等——包括这些源术语的变化——指的是与抗体被暴露至的至少一种其它物质相比，抗体以较高程度结合至指定表位。例如，在一些实施方式中，抗体可以特异性地结合至环磷酰胺或异环磷酰胺，但是不结合至其非环状代谢物。在一些实施方式中，抗体选择性地结合至如本文所描述的环磷酰胺或异环磷酰胺，其中Kd在数值上小于大约10-6M(其中较低的Kd表示较紧的结合)，例如，小于大约10- 6M、5×10-7M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、5×10-13M或10-13M，包括在列举值的任何两个之间的范围，例如，10-6M至10-13M、10-6M至5×10-13M、10-7M至10-13M、10-7M至5×10-13M、10-8M至10-13M、10-8M至5×10-13M、10-9M至10-13M或10-9M至5×10-13M。在一些实施方式中，抗体结合至环磷酰胺或异环磷酰胺，其中Kd在数值上小于如本文所描述的大约10-6M，并且也结合至如本文描述的式(I)或式(II)的缀合物。在一些实施方式中，抗体特异性地结合至环磷酰胺，其中Kd在数值上小于大约10-6M，例如小于大约10-6M、5×10-7M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、5×10-13M或10-13M，包括在列举值的任何两个之间的范围，并且也结合至如本文描述的式(I)或式(II)的缀合物，其中Kd在数值上小于大约10-6M。
在一些实施方式中，与环磷酰胺的非环状代谢物相比，抗体以较强的解离系数(Kd)特异性地结合至环磷酰胺，其中环磷酰胺的Kd在数值上小于1/10的环磷酰胺的非环状代谢物的Kd，例如小于1/10、1/20、1/50、1/100、1/500、1/1000、1/5000、1/10000、1/50000或1/100000，包括在列举值的任何两个之间的范围。在优选的实施方式中，环磷酰胺的非环状代谢物具有式(III)：
在一些实施方式中，抗体进一步结合至式(I)的化合物，其包括共价地结合至如本文描述的Y的运载体。在一些实施方式中，抗体进一步结合至式(I)的化合物，其包括共价地结合至如本文描述的X的运载体。在一些进一步实施方式中，抗体进一步结合至式(II)的化合物，其包括共价地结合至如本文描述的X的运载体。
在一些实施方式中，与环磷酰胺的非环状代谢物相比，抗体以较强的解离系数(Kd)特异性地结合至异环磷酰胺，其中异环磷酰胺的Kd在数值上小于大约1/10的环磷酰胺的非环状代谢物的Kd，例如小于1/10、1/20、1/50、1/100、1/500、1/1000、1/5000、1/10000、1/50000或1/100000，包括在列举值的任何两个之间的范围，并且其中环磷酰胺的非环状代谢物具有式(III)。在一些实施方式中，抗体进一步结合至式(I)的化合物，其包括共价地结合至如本文描述的Y的运载体。在一些实施方式中，抗体进一步结合至式(I)的化合物，其包括共价地结合至如本文描述的X的运载体。在一些实施方式中，抗体进一步结合至式(II)的化合物，其包括共价地结合至如本文描述的X的运载体。
免疫原/分析缀合物
如上面所讨论的，式(I)或(II)的环磷酰胺类似物的X或Y的官能团可以共价地结合至免疫原性聚合物运载体以形成免疫原。可选地，这些官能团可以共价地结合至相同聚合物或运载体以形成缀合物，除了这些聚合物或运载体不需要产生免疫原需要的免疫学应答。在一个实施方式中，X或Y是羧酸基团或其活性酯，其可以与运载体蛋白的氨基结合。在另一个实施方式中，X或Y是硫醇基团。在一些实施方式中，聚合物运载体通过酰胺键共价地结合至式(I)或式(II)的环磷酰胺类似物。可以通过使羧基与离去基团试剂(例如，N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、对硝基苯酚等)反应活化X或Y的羧酸部分来形成酰胺键。可以使用活化试剂比如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺等。羧基的活化形式然后可以与包含聚合物运载体例如多肽的缓冲溶液反应。可选地，可以通过使X或Y的胺部分与聚合物运载体的活化羧酸部分反应形成酰胺键。
在一些实施方式中，聚合物运载体通过硫醚(–S–)键共价地结合至式(I)或式(II)的环磷酰胺类似物。可以通过使X或Y的硫醇部分与聚合物运载体的活化或修饰胺基团——例如，包含马来酰亚胺或碘乙酰胺部分的那些——交联形成硫醚键。可选地，可以通过使X或Y的硫醇部分与聚合物运载体的活化或修饰羧酸基团反应以形成硫醚来形成硫醚键。可以在反应中使用典型的偶联剂比如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)。在一些实施方式中，多肽运载体经由马来酰亚胺化学试剂共价地结合至式(I)或式(II)的环磷酰胺类似物，其中运载体的一个或多个赖氨酸残基转化为巯基反应性马来酰亚胺基团，并且多肽运载体在巯基(-SH)基团处结合至环磷酰胺类似物。
由式(I)的环磷酰胺类似物制备的非限制性示例性免疫原或缀合物在下面图解：
其中，参照式(I)或(Ia)，R1a是氢，并且Y(参照R2a)是与运载体蛋白缀合的硫醇或羧酸；或
其中，参照式(I)或(Ia)，X(参照R1a)是与运载体蛋白缀合的硫醇或羧酸，并且R2a是-(CH2)2R(其中R对应于在式(I)或(Ia)的R2a的限定中的Y，并且R可以选自氯或羟基)。
而且，由式(II)的环磷酰胺类似物制备的非限制性示例性免疫原或缀合物在下面图解：
其中，参照式(II)或(IIa)，X(参照R1b)是与运载体蛋白缀合的硫醇或羧酸，并且每个R2b和R2b’独立地是-(CH2)2R(其中R对应于在式(II)或(IIa)的R2b和R2b’的限定中的Z，并且R可以选自氯或羟基)。
在一些实施方式中，式(I)的化合物缀合至运载体，该运载体包括、由下列组成或基本上由下列组成：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒(比如缀合至运载体的化合物在本文中也可以被称为“缀合物”，包括该源术语的变化)。运载体可以共价地结合至如本文所描述的Y或X中的任一个。在一些实施方式中，式(I)的化合物缀合至包括KLH、由KLH组成或基本上由KLH组成的运载体。
在一些实施方式中，式(II)的化合物缀合至运载体，该运载体包括、由下列组成或基本上由下列组成：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒(比如缀合至运载体的化合物在本文中也可以被称为“缀合物”，包括该源术语的变化)。运载体可以共价地结合至X。在一些实施方式中，式(II)的化合物缀合至包括KLH、由KLH组成或基本上由KLH组成的运载体。
在一些实施方式中，具有式(I)或(II)的化合物的运载体的缀合物，单独或与由免疫原——其由与式(I)或(II)的化合物缀合的免疫原性蛋白质形成——生成的抗体组合，可以被用作用于测定样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的免疫分析试剂。
此外，本申请的分析成分可以被提供在试剂盒中。试剂盒也可以包含额外的试剂和/或添加剂，比如可以包含辅助试剂，例如稳定剂、缓冲剂等。各个试剂的相对量可以广泛地改变以提供充分地优化分析的灵敏度的试剂在溶液中的浓度。试剂可以被提供在溶液中或者作为干粉——通常是冻干的——提供，包括如此赋形剂：其在解离时将提供具有用于执行分析的适合浓度的试剂溶液。
制造抗体的方法
在一些实施方式中，描述了制造结合至环磷酰胺或异环磷酰胺的抗体的方法。该方法可以包括提供免疫原，其包括缀合至如本文描述的运载体的式(I)或式(II)的化合物。该方法可以包括利用免疫原免疫宿主生物体。该方法可以包括从宿主生物体分离抗体生成细胞。该方法可以包括从抗体的宿主生物体筛选抗体生成细胞，抗体特异性地结合至式(I)或式(II)的化合物，例如环磷酰胺或异环磷酰胺。
适合的抗体可以使用各种不同技术产生。在一些实施方式中，非人宿主，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、驴、马或骆驼利用抗原比如本文描述的缀合的环磷酰胺或异环磷酰胺免疫。在一些实施方式中，宿主生物体包括其内源免疫球蛋白基因。在一些实施方式中，宿主生物体被基因修饰从而包括不同生物体例如人的一个或多个免疫球蛋白基因。在一些实施方式中，宿主生物体被基因修饰从而包括一个或多个人免疫球蛋白基因，并且进一步不具有任何实质的宿主免疫球蛋白基因活性(例如，如果宿主已经使其免疫球蛋白基因缺失、转录沉默、突变或以其它方式失活)。在一些实施方式中，如本文描述的，以静脉内、皮下或肌肉内的至少一种递送抗原。在一些实施方式中，在给药方案中递送抗原。
在一些实施方式中，例如当单克隆抗体是感兴趣的时，利用如本文描述的免疫原免疫宿主动物，并且抗体生成细胞可以从宿主动物重新获得、无限增殖并筛选特异性地结合至环磷酰胺或异环磷酰胺的抗体(参见，Harlow&Lane,Antibodies,A LaboratoryManual Second Edition(C.S.H.P.NY,2014)，其在此通过引用以其全部被并入。通常，抗体生成细胞包括B细胞，尽管另一种类型的抗体生成细胞V细胞也已经在WO 2010/002883(其在此通过引用以其全部被并入)中描述，并且在一些实施方式中也被预期为适合的抗体生成细胞。在一些实施方式中，免疫原包括缀合至运载体的式(I)的化合物，该运载体包括、由下列组成或基本上由下列组成：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。运载体可以共价地结合至Y。在一些实施方式中，式(I)的化合物缀合至包括KLH、由KLH组成或基本上由KLH组成的运载体，并且共价地结合至Y。在一些实施方式中，式(I)的化合物缀合至包括KLH、由KLH组成或基本上由KLH组成的运载体，并且共价地结合至X。在一些实施方式中，免疫原包括缀合至运载体的式(II)的化合物，该运载体包括、由下列组成或基本上由下列组成：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。运载体可以共价地结合至X。在一些实施方式中，式(II)的化合物缀合至包括KLH、由KLH组成或基本上由KLH组成的运载体，并且共价地结合至Y。在一些实施方式中，利用化合物的一次或多次额外的施用加强宿主生物体，例如，至少1、2、3、4或5次额外的施用，包括在列举值的任何两个之间的范围。
抗体生成细胞可以从宿主生物体被收获并且使用常规方式例如流式细胞术或荧光活化细胞分选(FACSTM)技术被分离。在一些实施方式中，分离的抗体生成细胞是无限增殖的，如本文描述的，例如使用杂交瘤技术。在一些实施方式中，编码抗体的核酸分离自抗体生成细胞，并且筛选对环磷酰胺和/或异环磷酰胺具有适合亲和力的抗体。
在一些实施方式中，抗体生成宿主细胞使用杂交瘤技术是无限增殖的。杂交瘤技术在本领域中是熟知的。宿主动物通常被注射抗原，并且在一段时间之后，制造抗体的细胞可以通常从脾脏分离。制造抗体的细胞可以与骨髓瘤(或其它无限增殖的细胞)细胞融合以提供融合细胞，其被称为杂交瘤。杂交瘤可以与制造抗体的未融合细胞和骨髓瘤细胞分离。特异性杂交瘤可以被分离和测试以确认分离的杂交瘤产生对在免疫步骤中使用的抗原特异的抗体。如此产生的杂交瘤将制造母源抗体的细胞生产特异性单一抗体的能力与其母源骨髓瘤(或其它无限增殖的)细胞在体外作为细胞培养物或在体内作为肿瘤——在注入动物的腹膜腔之后——连续生长和分化的能力结合。杂交瘤细胞株可以被例如用于生产单克隆抗体。无限增殖的抗体生成细胞可以被筛选特异性地结合至如本文描述的环磷酰胺或异环磷酰胺的抗体。例如，来自无限增殖的抗体生成细胞的上清液可以被筛选结合至环磷酰胺或异环磷酰胺的抗体的存在。在一些实施方式中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选上清液。例如，环磷酰胺或异环磷酰胺可以被固定在底物上，被利用来自无限增殖的抗体生成细胞的上清液培育，该底物的上清液可以被洗涤，并且可以例如使用二次分析检测结合至固定的环磷酰胺或异环磷酰胺的抗体的存在。在一些实施方式中，使用无洗涤分析筛选上清液。例如，环磷酰胺或异环磷酰胺可以例如使用与上清液接触的FRET对的第一荧光团被直接或间接标记，并且结合至环磷酰胺或异环磷酰胺的抗体的存在可以在溶液中被检测，例如使用包括标记——比如FRET对的第二荧光团——的二次抗体(以检测二次抗体与环磷酰胺或异环磷酰胺的接近度)。在一些实施方式中，进一步筛选与其非环状代谢物——例如式(III)的环磷酰胺的非环状代谢物——相比对环磷酰胺或异环磷酰胺具有优越亲和力的抗体(举例而言，优越亲和力可以被认为与非环状代谢物的Kd相比，在数值上小于大约1/10的对环磷酰胺或异环磷酰胺的亲和力)。
根据一些实施方式的另一种途径是从抗体生成细胞分离核酸序列，比如DNA序列或RNA序列，并且然后筛选对如本文描述的环磷酰胺或异环磷酰胺具有适合的结合特性的抗体。在一些实施方式中，克隆核酸，并且然后筛选核酸的克隆体，所述核酸编码对如本文描述的环磷酰胺或异环磷酰胺具有适合的结合特性的抗体。用于筛选人B细胞核酸的实例方案在Huse等人,Science 246:1275-1281(1989)中描述，其在此通过引用被并入。在一些实施方式中，使用噬菌体展示技术鉴定感兴趣的核酸。参见，例如，Dower等人,WO 91/17271和McCafferty等人,WO 92/01047。噬菌体展示技术也可以被用于诱变以前显示为对环磷酰胺或异环磷酰胺具有亲和力的抗体的可变区(或其部分比如CDR)，和筛选具有更大结合亲和力的抗体。在一些实施方式中，对核酸进行测序。
分离的编码感兴趣的期望抗体的寡核苷酸可以在表达体系中被表达，例如细胞表达体系或无细胞体系。示例性细胞表达体系包括酵母(例如，哺乳动物细胞、大肠杆菌、昆虫细胞、酵母属、毕赤酵母属)，其被转化有包含编码抗体的核苷酸序列的重组酵母表达载体；昆虫细胞体系，其被包含编码抗体的序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染；植物细胞体系，其被重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或被转化有包含编码抗体的核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)；哺乳动物细胞体系(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3)，其包埋含有源自哺乳动物的基因组或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)的重组表达构建体。示例性无细胞体系包括大肠杆菌提取物和酵母提取物。提取物可以是溶菌产物。提取物可以被纯化，例如，以富集核糖体和/或以去除不期望的材料比如碎片或宿主基因组DNA。无细胞体系中编码抗体的核酸可以包括质粒DNA、线性DNA或RNA。
在一些实施方式中，例如当多克隆抗体是感兴趣的时，利用如本文描述的免疫原免疫宿主动物，并且获得宿主动物的血清，并且针对环磷酰胺或异环磷酰胺的多克隆抗体例如使用亲和色谱法被亲和纯化。例如，在亲和色谱法中，感兴趣的抗原比如环磷酰胺或异环磷酰胺可以结合至柱中的底物，并且血清可以穿过柱，使得具有对环磷酰胺或异环磷酰胺的亲和力的抗体在柱中被固定。柱可以被洗涤一次或多次以去除非特异性抗体和其它物质，并且然后对环磷酰胺或异环磷酰胺具有亲和力的抗体可以从柱被洗脱(参见，例如，Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual Second Edition(C.S.H.P.NY,2014)。
除了上述条款之外，本文提出了许多选择：
选择1包括包含式(I)或(II)的结构的化合物：
其中R1a选自氢或-(CH2)m-X；R2a是-(CH2)n-Y；R1b是-(CH2)m-X；每个R2b和R2b’独立地选自-(CH2)k-Z；每个R3a、R4a、R5a、R3b、R4b和R5b独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、5-10元杂环基、芳基、芳烷基、5-10元杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基、芳氧基、卤代(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷氧基、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基和氧(＝O)；X是选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；Y是独立地选自卤素、羟基、胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；Z选自卤素或羟基；并且每个m、n和k独立地是2至10的整数。选择2包括选择1的化合物，其中R1a是氢。选择3包括选择2的化合物，其中Y选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺。选择4包括选择1的化合物，其中R1a是-(CH2)m-X。选择5包括选择4的化合物，其中Y选自氯或羟基。选择6包括选择1的化合物，其中每个R2b和R2b’是-(CH2)k-Z并且Z选自氯或羟基。选择7包括选择1至6中任一项的化合物，其中m是整数2。选择8包括选择1至6中任一项的化合物，其中m是整数3。选择9包括选择1至8中任一项的化合物，其中每个n和k是整数2。选择10包括选择1至9中任一项的化合物，其中每个R3a、R4a、R5a、R3b、R4b、R5b是氢。选择11包括包含选择1至10中任一项的化合物的免疫原，该化合物通过该化合物的官能团X或Y共价地结合至免疫原性聚合物或运载体。选择12包括选择11的免疫原，其中免疫原性聚合物或运载体选自免疫活性蛋白质或多肽。选择13包括基本上选择性地结合至环磷酰胺和/或异环磷酰胺的抗体。选择14包括选择13的抗体，其中所述抗体源自选择11或12的免疫原。
选择15包括用于检测样品中环磷酰胺或异环磷酰胺的存在的免疫分析，包括分析缀合物，其中所述分析缀合物包括选择1至10中任一项的化合物，其通过该化合物的官能团X或Y共价地结合至运载体。选择16包括选择15的免疫分析，其中运载体选自蛋白质或多肽。
选择17包括用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的免疫分析，其包括选择13或14的抗体。
选择18包括用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的试剂盒，其包括试剂，试剂中的一种为通过选择1至10中任一项的化合物的官能团X或Y共价地结合至该化合物的运载体的缀合物。选择19包括选择18的试剂盒，其中该运载体选自蛋白质或多肽。选择20包括选择18或19的试剂盒，进一步包括选择13或14的抗体。选择21包括选择1-10中任一项的化合物，进一步包括共价地结合至X的运载体，其中该运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。
选择22包括选择1-10或21中任一项的化合物，进一步包括共价地结合至Y的运载体，其中该运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。
选择23包括特异性地结合至选择21-22中任一项的化合物的抗体。选择24包括选择23的抗体，其中抗体结合至具有如下解离常数(Kd)的环状环磷酰胺：其在数值上小于1/10的式(III)的非环状环磷酰胺的解离常数。选择25包括选择24的抗体，其中抗体结合至具有如下解离常数(Kd)的环状环磷酰胺：其在数值上小于1/1000的式(III)的非环状环磷酰胺的解离常数。选择26包括选择23-25中任一项的抗体，其中抗体包括单克隆抗体。选择27包括选择23-25中任一项的抗体，其中抗体包括多克隆抗体。
选择28包括制造特异性地结合至环磷酰胺的抗体的方法，该方法包括：给宿主生物体施用选择11-12中任一项的免疫原或选择21-22中任一项的化合物；从宿主生物体分离抗体生成细胞或者抗体；和筛选对环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体或者来自宿主生物体的抗体。选择29包括选择28的方法，其中宿主生物体包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、驴或山羊。选择30包括选择28-29中任一项的方法，其中运载体包括KLH。选择31包括选择28-29中任一项的方法，其中抗体生成细胞被分离，其中筛选对环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的抗体是单克隆的。选择32包括选择31的方法，进一步包括由分离的抗体生成细胞构建杂交瘤。选择33包括选择31或32的方法，进一步包括通过噬菌体展示从分离的抗体生成细胞筛选核酸。选择34包括选择28-33中任一项的方法，进一步包括筛选与式(III)的非环状代谢物相比特异性地结合至环磷酰胺的抗体。选择35包括选择31-34中任一项的方法，进一步包括在宿主细胞中表达编码抗体的核酸。选择36包括选择28-29中任一项的方法，其中筛选对环磷酰胺具有亲和力的来自宿主生物体的抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的抗体是多克隆的。
选择37包括制造特异性地结合至异环磷酰胺的抗体的方法，该方法包括：给宿主生物体施用选择11-12中任一项的免疫原或选择21-22中任一项的化合物；从宿主生物体分离抗体生成细胞或者抗体；和筛选对异环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体或者来自宿主生物体的抗体。选择38包括选择37的方法，其中宿主生物体包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、驴或山羊。选择39包括选择37-38中任一项的方法，其中运载体包括KLH。选择40包括选择37-39中任一项的方法，其中抗体生成细胞是分离的，其中筛选对异环磷酰胺具有亲和力的源自抗体生成细胞的抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的抗体是单克隆的。选择41包括选择40的方法，进一步包括由分离的抗体生成细胞构建杂交瘤。选择42包括选择40或41的方法，进一步包括通过噬菌体展示从分离的抗体生成细胞筛选核酸。选择43包括选择37-42中任一项的方法，进一步包括筛选与式(III)的非环状代谢物相比特异性地结合至环磷酰胺的抗体。选择44包括选择40-43中任一项的方法，进一步包括在宿主细胞中表达编码抗体的核酸。选择45包括选择37-39中任一项的方法，其中筛选对环磷酰胺具有亲和力的来自宿主生物体的抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的抗体是多克隆的。
实施例I
合成式(II)的化合物，其中X共价地结合至KLH，以制备如下面所示的缀合物：
其中蛋白质是KLH。具体而言，马来酰亚胺活化的KLH蛋白质共价地结合至R1b的硫醇基团以形成在其中“蛋白质”包括KLH的式(IV)中示出的缀合物。
通过肌肉内注射将缀合物注入BALB/c小鼠宿主，并且培育5天，然后通过第二次施用该缀合物加强小鼠宿主。从小鼠宿主获得B细胞，并且将B细胞克隆体与骨髓瘤细胞融合以构建杂交瘤。培养杂交瘤，并且收集上清液。使用ELISA分析筛选上清液以鉴定对异环磷酰胺具有亲和力的杂交瘤。扩展那些杂交瘤，并且对编码抗体可变区的DNA进行测序以获得对环磷酰胺具有亲和力的单克隆抗体的可变区序列。构建单克隆抗体，并进一步筛选与式(III)的非环状代谢物相比对环磷酰胺的特异性。
实施例II
式(I)的化合物，其中Y经由硫醇选择性偶联反应共价地结合至人血清白蛋白，以制备如下面所示的缀合物：
其中蛋白质是人血清白蛋白。
通过肌肉内注射将缀合物注入兔宿主，并且培育7天，然后通过第二次施用该缀合物加强兔宿主。然后收集来自兔的免疫血清。为了特异性结合至异环磷酰胺的免疫球蛋白，使用亲和色谱法——其中异环磷酰胺被固定在固定相上——亲和纯化血清。洗涤柱，然后从柱洗脱对异环磷酰胺具有亲和力的抗体，从而获得对异环磷酰胺具有亲和力的多克隆抗体。

Claims (45)

1.一种化合物，其包括式(I)或(II)的结构：
其中R1a选自氢或-(CH2)m-X；
R2a是-(CH2)n-Y；
R1b是-(CH2)m-X；
每个R2b和R2b’独立地选自-(CH2)k-Z；
每个R3a、R4a、R5a、R3b、R4b和R5b独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、5-10元杂环基、芳基、芳烷基、5-10元杂芳基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基、芳氧基、卤代(C1-C6)烷基、卤代(C1-C6)烷氧基、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基和氧(＝O)；
X是选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；
Y是独立地选自卤素、羟基、胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺的官能团；
Z选自卤素或羟基；并且
每个m、n和k独立地是2至10的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1a是氢。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中Y选自胺、硫醇、羧酸、酰肼、肼、肟或羟胺。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1a是-(CH2)m-X。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中Y选自氯或羟基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中每个R2b和R2b’是-(CH2)k-Z并且Z选自氯或羟基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中m是整数2。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中m是整数3。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中每个n和k是整数2。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中每个R3a、R4a、R5a、R3b、R4b、R5b是氢。
11.一种免疫原，其包括权利要求1-10中任一项所述的化合物，所述化合物通过所述化合物的官能团X或Y共价地结合至免疫原性聚合物或运载体。
12.根据权利要求11所述的免疫原，其中所述免疫原性聚合物或运载体选自免疫活性蛋白质或多肽。
13.一种抗体，其基本上选择性地结合至环磷酰胺和/或异环磷酰胺。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体源自权利要求11或12所述的免疫原。
15.一种用于检测样品中环磷酰胺或异环磷酰胺的存在的免疫分析，包括分析缀合物，其中所述分析缀合物包括权利要求1-10中任一项所述的化合物，所述化合物通过所述化合物的官能团X或Y共价地结合至运载体。
16.根据权利要求15所述的免疫分析，其中所述运载体选自蛋白质或多肽。
17.一种用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的免疫分析，包括权利要求13或14所述的抗体。
18.一种用于检测样品中环磷酰胺和/或异环磷酰胺的存在的试剂盒，其包括试剂，试剂的一种为通过权利要求1-10中任一项所述的化合物的官能团X或Y共价地结合至所述化合物的运载体的缀合物。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述运载体选自蛋白质或多肽。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，进一步包括权利要求13或14所述的抗体。
21.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物，进一步包括共价地结合至X的运载体，其中所述运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。
22.根据权利要求1-10或21中任一项所述的化合物，进一步包括共价地结合至Y的运载体，其中所述运载体包括下列的至少一种：白蛋白或其片段、血清蛋白、脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、蛋卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、合成的聚(氨基酸)、聚氨基-多糖、聚核酸、聚氨基酸、多糖或固体颗粒。
23.一种抗体，其特异性地结合至权利要求21-22中任一项所述的化合物。
24.根据权利要求23所述的抗体，其中所述抗体结合至具有如下解离常数(Kd)的环状环磷酰胺：其在数值上小于1/10的式(III)的非环状环磷酰胺的解离常数
25.根据权利要求24所述的抗体，其中所述抗体结合至具有如下解离常数(Kd)的环状环磷酰胺：其在数值上小于1/1000的式(III)的非环状环磷酰胺的解离常数。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括单克隆抗体。
27.根据权利要求23-25中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括多克隆抗体。
28.一种制造特异性地结合至环磷酰胺的抗体的方法，所述方法包括：
给宿主生物体施用权利要求11-12中任一项所述的免疫原或权利要求21-22中任一项所述的化合物；
从所述宿主生物体分离抗体生成细胞或者抗体；和
筛选对环磷酰胺具有亲和力的源自所述抗体生成细胞的抗体或者来自所述宿主生物体的抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述宿主生物体包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、驴或山羊。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述运载体包括KLH。
31.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞被分离，其中筛选对环磷酰胺具有亲和力的源自所述抗体生成细胞的抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的抗体是单克隆的。
32.根据权利要求31所述的方法，进一步包括由分离的抗体生成细胞构建杂交瘤。
33.根据权利要求31或32所述的方法，进一步包括通过噬菌体展示从分离的抗体生成细胞筛选核酸。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，进一步包括筛选与式(III)的非环状代谢物相比特异性地结合至环磷酰胺的抗体。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，进一步包括在宿主细胞中表达编码所述抗体的核酸。
36.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中筛选对环磷酰胺具有亲和力的来自所述宿主生物体的所述抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的所述抗体是多克隆的。
37.一种制造特异性地结合至异环磷酰胺的抗体的方法，所述方法包括：
给宿主生物体施用权利要求11-12中任一项所述的免疫原或权利要求21-22中任一项所述的化合物；
从所述宿主生物体分离抗体生成细胞或者抗体；和
筛选对异环磷酰胺具有亲和力的源自所述抗体生成细胞的抗体或者来自所述宿主生物体的抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述宿主生物体包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、驴或山羊。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其中所述运载体包括KLH。
40.根据权利要求选择37-39中任一项所述的方法，其中所述抗体生成细胞被分离，其中筛选对异环磷酰胺具有亲和力的源自所述抗体生成细胞的抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的所述抗体是单克隆的。
41.根据权利要求40所述的方法，进一步包括由分离的抗体生成细胞构建杂交瘤。
42.根据权利要求40或41所述的方法，进一步包括通过噬菌体展示从分离的抗体生成细胞筛选核酸。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的方法，进一步包括筛选与式(III)的非环状代谢物相比特异性地结合至环磷酰胺的抗体。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，进一步包括在宿主细胞中表达编码所述抗体的核酸。
45.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中筛选对环磷酰胺具有亲和力的来自所述宿主生物体的所述抗体，并且其中特异性地结合至环磷酰胺的所述抗体是多克隆的。
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