CN102713626B - 单个靶实体的免疫化学检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫化学地可视化和定量样品中的单个靶实体，如单个分子、单个分子结构、单个粒子等，其中所述单个实体被固定。具体而言，本发明涉及了用于可视化和定量生物靶或化学靶的单个单元的方法，尤其涉及免疫化学可视化组织学样品中的生物靶的单个分子。本发明的方法包括由具有氧化还原酶活性的酶所介导在样品的单个靶位点处形成可检测分子的离散沉积物的步骤，其中单个靶位点包含单个靶单位。本发明还涉及包括本发明可视化和定量方法的测定法。该方法应用报道分子沉积技术(CARD)和至少两种不同的底物，其中一种是水溶性偶联物，其包含能够作为酶的底物的两种化合物和可检测标记物。

Description

单个靶实体的免疫化学检测

发明领域

本发明属于免疫化学可视化和定量样品中单个靶实体如单个分子、单个分子结构、单个粒子等的领域，其中所述单个靶实体被固定化。具体地，本发明涉及用于可视化和定量生物靶或化学靶的单个单元的方法，尤其涉及免疫化学可视化组织学样品中生物靶的单个分子。本发明的方法包括由具有氧化还原酶活性的酶介导在样品的单个靶位点处形成可检测分子离散沉积物的步骤，其中单个靶位点包括单个靶单位。

发明背景

免疫化学是医学诊断中的常用工具并且它也常用于评估治疗性生物标记。尤其，后者经常要求定量评价治疗性生物标记存在的程度。抗体应用于细胞和组织存在特殊困难，这些困难超过了这些试剂应用于固体支持物上固定或溶液中的纯化蛋白时所遭遇的那些困难。。存在可能影响免疫检测的很多因素，它们当中包括组织固定及产生、抗原修复的持续时间与类型以及和抗体特异性。另一个困难是检测低水平存在的靶的能力。与可溶性测定法一样，这是一个增加信号而不增加非特异性本底水平的问题。最常探索的方法是信号放大，这通过连续轮次的酶促反应来实现。

DAB是辣根过氧化物酶(HRP)的生色底物，其广泛用于以过氧化物酶活性标记的组织学样品中靶蛋白的可视化。该方法利用与靶向样品中蛋白质的抗体连接的HRP使DAB从溶液中沉积到靶定蛋白的位点，并且从而标记所述蛋白质。该方法不是特别灵敏，因而适合检测相对丰富的靶蛋白。与DAB沉积物相关的信号不能进一步放大。其它要说明的缺点是该方法需要量相当大的靶特异性抗体来饱和全部靶位点，并且该方法相对慢的。另外，该方法产生均匀的染色模式，对于显微分析人员来说细胞结构的细胞内解析，例如细胞膜、细胞质和细胞核是均匀的颜色，因而不能准确进行染色定量。

催化信号放大法(CSA)(在US5,863,748、5,688,966、5,767,267、5,721,158、5,583,001、5,196,306、6,372,937、6,593,100、US6,593,100中描述)应用生物素-酪胺酰胺和荧光素-酪胺酰胺(fluorescyl-tyramide)来增加来自HRP标记靶蛋白的信号，并且因而允许检测到本来通过传统方法(即上述方法)不可检测的低丰度靶。然而，由于强烈的本底染色以及难以解释染色结果，特别是对于荧光原位杂交(FISH)和免疫组化(IHC)样品，临床组织病理学中从来没有广泛地接受CSA作为评价组织学样品的例行方法。

最近，已经描述了另外一种基于HRP放大的方法，所述方法允许检测IHC样品中的低丰度靶分子(在WO2009036760、WO2010094283和WO2010094284中描述)。该方法没有使用DAB作为HRP的生色底物，而是作为介导HRP沉积其它可检测性HRP底物的交联剂。该方法引起沉积的HRP底物的信号强烈放大，这使得该方法的灵敏度与CSA法可比，不过与CSA法相比，这新方法有利地不引起本底标记。在该方法的其它优点中，值得提到的是检测过程的速度比传统DAB或生物素-酪胺酰胺检测过程快得多。然而，仍未解决先前方法的问题，即基于评估检测到的染色的量来评估IHC样品中靶的量。这种新方法提供了这样的染色模式，其非常清晰，但是胞内结构分辨率与传统DAB法或CSA法相同的均匀染色。该染色模式不允许将样品中染色的量直接约计为样品中靶的量，因为这两种量之间的相关性不是线性的。因此，组织学样品中由全部这些方法可视化的靶量仅可以相对而非精确地评估。

因此，当已经改进方法学的质量保证计划并且提出了IHC染色的标准时，与解释染色结果相关的计划却未改变。采用不同临界水平(cut-off level)评估组织是“阳性”或“阴性”的不同评分体系常常用来评估抗原。这种目前使用的评估不可避免地伴随对医学诊断可能非常重要的误差。

基于评价样品中存在的单个靶分子的精确量评估靶表达，即所谓的单分子检测法(SMD)法，可能是通向IHC中新评分体系的方向，这种新评分体系对于医学诊断和治疗会将更可靠和可重复。不幸的是，允许组织学样品中的靶蛋白单分子可视化的可用技术的数目现在是非常有限的，并且它们仍是相当费力和冗长的方法。

基本上，全部可用的蛋白质单分子检测技术均采用基于DNA的放大体系。蛋白质单分子检测法首次以免疫-PCR展示(Sano T，Smith CL，Cantor CR.免疫-PCR：借助特异性抗体-DNA偶联物的非常敏感的抗原检测法(Immuno-PCR：very sensitive antigen detection by means ofspecific antibody-DNA conjugates)，Science1992；258：120–122；Adler M，Wacker R，Niemeyer CM.用于日常超灵敏定量蛋白质的实时免疫-PCR测定法(A real-time immuno-PCRassay for routine ultrasensitive quantification of proteins)，Biochem Biophys Res Commun2003；308：240–250；Niemeyer CM，Adler M，Wacker R.免疫-PCR：借助核酸扩增的高灵敏度蛋白质检测法(Immuno-PCR：high sensitivity detection of proteins by nucleic酸amplification)，Trends Biotechnol2005；23：208–216)。使用抗体-DNA杂合结构物，抗体的亲合力由PCR可实现的敏感检测来补偿。此外，免疫-DNA检测策略被扩展至使用滚环扩增法(RCA)，一种产生与免疫-DNA偶联物系留(tethered)的长ssDNA低聚物的等温技术(Gusev Y，Sparkowski J，Raghunathan A，Ferguson H Jr，Montano J，Bogdan N，Schweitzer B，WiltshireS，Kingsmore SF，Maltzman W，Wheeler V.滚环扩增法：一种提高免疫组织化学和流式细胞术灵敏度的新方法(Rolling circle amplification:a new approach to increase sensitivity forimmunohistochemistry and flow cytometry)，Am J Pathol2001；159：63–69)。

所提到的这些SMD方法的一些明显缺点如下：

(i)抗体-DNA杂合体的合成可能是问题，因为控制DNA偶联物的位置和每个蛋白质的DNA偶联物的数目并不总是直接明了的，经常导致不均匀的DNA标签/抗体比例；扩增反应难以控制；扩增步骤对温度敏感；标记是不稳定的，标记物会随着时间推移从靶弥散等。尽管在采用内蛋白子化学(intein chemistry)(或化学连接)将寡核苷酸标签位点特异地与蛋白质缀合方面的最新进展已经十分成功，但偶联物产生仍是费力的；

(ii)所述方法的步骤需要控制温度；

(iii)检测过程包括太多步骤；和

(iv)整个检测过程占用相对长的时间。

本发明的SMD方法克服上述障碍，并且使得样品中的单个靶实体可视化和量化，其中所述单个实体是在样品中固定的并且可靠的。

发明简述

本发明提供快速、简单且稳健的方法，它们用于不同样品中各种单个靶实体的可视化、检测和定量，其中所述靶是固定的。所述方法特别有利于评价复杂生物样品，如组织学样品。

本发明的方法包括一种新颖强大的信号放大系统，该系统可以使得大量的样品中处于非常宽的动态浓度范围的独自单个靶实体，诸如单个分子、单个分子结构、单个分子复合体(complex)、单个粒子等可视化。术语“单个靶实体”在此与术语“单个/独自靶单位”可互换使用。

本发明的方法包括如下步骤：

a)在样品中形成一个或更多个用酶活性标记的靶位点，其中，所述靶位的每一者包含单个靶单位，其中，所述靶位点通过样品的单个靶单位的总量的部分亚群体来形成；和

b)在每个单个靶位点处形成可检测分子(也称为“报道分子”或“报告子”)的离散沉积物。

在一些实施方式中，由于样品可能已经包含本发明的靶位点，所以上述步骤(a)可能是多余的。

在其它实施方式中，本发明的方法可以包括一个或更多个其它步骤，例如

c)将单个靶位点处报道分子的离散沉积物检测为可视清晰点。

在一个实施方式中，本发明涉及一种样品中的独自单个靶单位可视化方法(方法(1))，其中所述靶被固定，包括：

a)用一种或多种结合剂来孵育含有大量靶的独自单位的样品，其中，

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个靶单位直接结合，

并形成一个或更多个离散单个靶位点，即独自单个靶单位的部分亚群体，其中每一单个离散单个靶位点包括所述部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；

a)在水溶液(i)中孵育(a)的样品，所述水溶液(i)含有量少于2mM的过氧化物化合物，

与(a)的离散单个靶位点结合的酶的第一底物，以及，

所述酶的第二底物，

其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述有机化合物

(1)能够与所述酶反应时产生自由基；且

(2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，

并且，其中所述第二底物是一种偶联物分子，该偶联物分子含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质和特定特异性结合对的一个成员，

从而在(a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且可视化(a)的所述单个靶位点。

包括上述步骤(a)和(b)的本发明方法可以进一步包括检测在单个靶位点处的离散沉积物的一个或更多个步骤。

在一个实施方式中，上述方法(1)可以用于检测和可视化样品中的固定靶的单个独自单位的，其中所述靶以宽泛的动态浓度范围存在，所述方法包括如下步骤：

a)将样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个靶单位直接结合，

并且用独自单个靶单位的第一部分亚群体形成一个或更多个离散的第一靶位点，其中每一单个的离散的第一靶位点包括独自单个单位的所述第一部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有具有氧化还原酶活性的酶；

b)根据权利要求1的步骤(b)所述将(a)的样品与结合于(a)的第一靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体、和过氧化物化合物孵育，从而在(a)的第一靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；

c)将(b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述的量足以猝灭与(a)的第一单个靶位点结合的酶的残余活性；

d)将样品(c)与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与独自的靶单位直接结合，

从而用独自单个靶单位的第二部分亚群体形成一个或更多个离散的第二靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有独自单个单位的所述第二部分亚群体的一个独自单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；

e)根据上述方法(1)的步骤(b)(即权利要求1的步骤(b))所述将(d)的样品与结合于第二单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点处形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；

f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第一可视清晰点，从而检测靶的第一群体的一个或更多个独自单个单位；

g)在样品中进行检测，以在第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物作为第二可视清晰点，从而检测靶的第二群体的一个或更多个独自单个单位。

在本发明的另一实施方式中，方法(1)可以用于检测和可视化样品中至少两种不同的固定靶的独自单位，所述方法包括以下步骤：

a)将样品与能够结合第一靶的一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与第一独自单个靶单位直接结合，

从而，用第一独自单个靶单位形成一个或更多个离散的第一单个靶位点，其中每一单个离散的第一靶位点含有第一靶的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；

b)根据上述方法(1)的步骤(b)(即权利要求1的步骤(b))所述将(a)的样品与结合于第一单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和过氧化物化合物孵育，从而在(a)的第一单个靶位点形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；

c)将(b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述的量足以猝灭与(a)的第一单个结合位点结合的酶的残余活性；

d)将样品(c)与能够同第二靶结合的一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与第二独自的靶单位直接结合，

从而用第二靶独自单个单位来形成一个或更多个离散的第二单个靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有第二靶的一个独自单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有该酶；

e)根据上述方法(1)的步骤(b)(即权利要求1的步骤(b))所述将(d)的样品与结合于第二单个结合位点的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；

f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第一可视清晰点，从而检测第一靶的一个或更多个独自单个单位；

g)在样品中将第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物检测作第二可视清晰点，从而检测第二靶的一个或更多个独自单个单位。

本发明的另一方面涉及用于定量样品中靶的方法，包括

a)根据本发明的任一方法(如上述)处理生物样品；

b)定量样品中的可视清晰点；

c)评价样品中靶的量。

本发明的另一方面涉及将本文所述的单个靶检测和定量法在医疗诊断中的用途，特别用于这样的预测性和治疗性应用，其中，生物标记的单个单位的可视化和定量对于诊断的精确性、评估治疗性疗法的功效、预测疾病后果、疾病风险预后或将患者针对治疗学方案分类(stratification)等是必需的。

本发明的另一方面涉及了使用本发明方法检测和定量各种独自单个靶单位的测定法。

非常强大和稳健的本发明放大系统同时是灵活和易控制的。其极大地扩展了目前检测方法的限值，尤其是使用常规亮视野或荧光显微镜评价样品的检测方法。特别是，使用包括本发明放大系统的检测方法时，

(i)可以可视化和定量复杂样品(如组织学样品)中固定靶的单个实体；

(ii)可以使用各种分析模式检测和定量固定靶的单个实体；

(iii)可以非常快速地检测和定量固定靶的单个实体，如在10-20min内，然而，如果需要，可视化和检测过程可以延长或长时间中断而不有损于结果的质量；

(iv)不需要通常用来降低本底标记的封闭；

(v)不需要温度控制；

(vi)可在非常宽泛的动态范围内检测和定量固定靶的单个实体，

(vii)可以在一个过程中检测和定量样品中的多种固定靶的单个实体。

因此，本发明的SMD可视化系统的巨大优点是，它简单、快速、稳健、可靠和灵活。它允许使用多种测定法可视化和定量多种样品中的多种单个靶实体。额外的优点是，该方法使用了这样的化合物，它们是市售和易于产生的充分定义的化学化合物。另一优点是，本方法的全部过程可以手工和自动地实施。

附图简述

图1显示表示为Her2(+2)的组织样品的免疫化学染色的典型显微镜照片，其中(1)是其中Her2根据本发明可视化的样品，(2)是其中Her2根据WO2009036760中所述方法可视化的样品。右侧小图是方法(1)和方法(2)的染色图案的示意图。

图2是根据本发明方法(显示根据权利要求1所述的步骤(b)和根据权利要求23-24所述的步骤(c))的单分子检测过程的示意图。

图3显示根据本发明方法(参见实施例10)定量细胞中的Her2化的结果：a.0+Herceptest对照细胞系的10倍图像的单色分割，每图识别21点(黑色)；b.1+Herceptest对照细胞系的10倍图像的单色分割：每图识别36点(黑色)；c.3+Herceptest对照细胞系的10倍图像的单色分割：每图识别2567点(黑色)；d.乳癌的10倍图像的双色分割，点是白色，核是黑色，本底是灰色；e.3+Herceptest对照细胞系的10倍图像的双色分割，点是黑色，核是白色，本底是灰色，样品同c。

本发明的具体实施方式

使样品中固定靶的独自单位可视化的方法

本发明的一个方面涉及样品中是靶，例如单个靶分子、单个粒子等的单个独自的单位的可视化方法，其中，靶的单个独自的单位被固定。

本发明的一个实施方式涉及被固定的单个靶单位可视化方法，所述方法包括如下步骤：

a)形成一个或更多个离散单个靶位点，这里，每个离散的单个靶位点含有单个独自靶单位；

b)在(a)的离散单个靶位点处形成可检测分子的离散沉积物，从而显现所述单个靶位点，并且，任选地，

c)检测在离散单个靶位点处的离散沉积物。

特别地，上述方法的步骤(a)、(b)以及可选择的(c)可以如下进行：

a)a)将含有独自靶单位的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个靶单位直接结合，

并且形成靶的一个或更多个离散的单个靶位点，即独自单个单位的部分亚群体，其中每一单个的离散单个靶位点含有所述部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有该酶；

b)将(a)的样品在水溶液(i)中孵育，所述水溶液(i)含有量少于2mM的过氧化物化合物，

与(a)的离散单个靶位点结合的酶的第一底物，以及，

所述酶的第二底物，

其中，所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述富电子有机化合物是

1)能够与所述酶反应时产生自由基；并且

2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子产生，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，

并且，其中所述第二底物是偶联物分子，其含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质以及和特异性结合对的成员，

从而在(a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并使(a)的所述单个靶位点作为可视清晰点而可视化，

并且，任选地，

c)检测在(a)的单个靶位点处的第一底物的离散沉积物，并使(a)的单个靶位点作为可视清晰点而可视化，从而使单个独自的靶单位可视化。

在一些实施方式中，步骤(b)可以含有以下的分步骤：

(b’)将(a)的样品在水溶液(ii)中孵育，所述水溶液(ii)含有

过氧化物化合物，和

与(a)的靶位点结合的酶的第一底物，

其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述富电子有机化合物

(1)能够与所述酶反应时产生自由基，并且

(2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物；

其中过氧化物化合物的量少于2mM；

并且，然后，

(b″)将样品(b’)在水溶液(i)中(如上述)孵育。

在一些实施方式中，步骤(c)可以含有以下分步骤：

c’)在(a)的单个靶位点处包含第二底物的离散沉积物的(b)样品与能够同沉积的第二底物的可检测标记物特异性结合的结合剂孵育，并形成含有沉积的第二底物的一个或更多个分子和所述结合剂的一个或多个分子的复合物，

(c″)在样品(c’)中检测与第二底物的离散沉积物结合的结合剂，从而检测到单个靶位点并从而检测到与所述单个靶位点结合的独自单个靶单位。

本发明的方法(如上文和如下文所述)可以任选地包括一个或更多个额外步骤，例如，在步骤(a)、(b)或(c)之前的步骤，例如步骤(a)之前的用抑制样品的内源性或残余过氧化物酶活性的化合物猝灭样品的步骤，或在步骤(a)、(b)和/或(c)之间的一个或更多个步骤，或步骤(c)之后的步骤，例如在步骤(a)、(b)和(c)之前、之后或之间的一个或更多个洗涤步骤。在一个实施方式中，本方法可以包括至少一个自动步骤。

在以下部分中讨论本方法的其它实施方式。

样品

术语“样品”意指来自较大整体或集合的代表性部分或单个单元(item)、某个量或部分的疑似包含待检测靶的物质或目标物，例如，某个部分或量的含有待分析靶分子、粒子、结构的生物、化学、环境材料，例如，活组织检查样品、食物样品、土壤样品等。常见的样品显示物质或目标物的其余部分是什么或应当是是什么。在一个实施方式中，本发明的样品可以是环境样品，例如，土壤样品或溢出物样品。在另一实施方式中，样品可以是食物样品。在另一实施方式中，样品可以是有机分子文库的一部分。在另一实施方式中，样品可以是战剂样品。

在一个实施方式中本发明的样品是生物样品。

生物样品可由以下所示例：

1.含有悬浮细胞和/或细胞碎片的样品，例如血样、克隆细胞悬液、体组织均质物等；

2.含有动物体的完整或受损细胞、体组织、抹片或流体或肿瘤样品，例如活组织检查样品；它可以是新鲜组织样品或保存的组织样品，例如福尔马林固定石蜡包埋组织样品；

3.含有活生物的样品，例如含有动物、植物、细菌、真菌等的培养基的样品；

4.含有病毒颗粒、其碎片或病毒产物的样品，例如，含有病毒核酸、蛋白质、肽等的体抹片；

5.含有细胞器的样品；

6.含有天然或重组生物分子的样品，例如血浆样品、条件细胞培养基等。

7.含有织物细胞或其碎片的样品。

上述提及的生物样品的例子出于说明目的给出，但不限制本发明的实施方式。

化学样品的例子可以由但不限于化学化合的文库的样品(例如肽文库)说明。环境样品的例子可由但不限于土壤样品、水样品或空气样品和食物样品说明。

本发明涉及含有固定靶的样品(例如上述例子中的任一种)，即涉及其中根据本发明检测方法防止靶自由移动的样品，例如，其中通过机械或化学手段大幅度减少或消除靶运动的样品，例如，在样品或靶与特定支持物或介质或在其内部连接的情况下。因此，在一个实施方式中，含有目的靶的单个独自单位的样品在检测方法前可以固定到固体支持物之上，例如，固态体组织样品固定在玻璃载片上。含有本发明固定靶的样品的例子包括但不限于固定在玻璃或塑料载片上的体组织样品，或包括但不限于含有固定在膜或ELISA板上的生物分子或化学分子的样品等。在这些实施方式中，样品的靶可以固定在样品内部，例如在组织样品内部固定的蛋白质，或固定在表面上或特定材料内部，例如固体材料或凝胶(如硝化纤维素膜等)的一部分。在一个实施方式中，固体支持物可以是三维结构，例如胶原或琼脂块。在这个实施方式中，靶例如分子或粒子可以固定在该结构内部。

在一个实施方式中，本发明涉及不含有靶的样品，例如，对照样品。在另一实施方式中，本发明涉及推测含有靶的样品，例如，具有未知内容物的样品。

上文提到的术语“固体支持物”意指在本发明方法的条件下不溶解的任何材料片，例如，它可以是硝化纤维素膜、玻璃载片等。适合于固定样品和/或靶的支持物的例子包括但不限于合成聚合物支持物；如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯等例如氨化或羧化的聚苯乙烯；聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；琼脂糖；硝化纤维素；尼龙；聚偏二氟乙烯；表面改性尼龙等。本发明涉及在本文所述条件下为化学惰性的固体支持物，即所选择的支持物不会对本方法的检测结果产生任何显著影响。因此，可以选择适于固定符合所选择分析模式(例如，IHC、ELISA、印迹法(blotting)等)的样品或靶的任何这种惰性支持物。

靶

术语“靶”在本文中意指推测在样品中存在的可以通过特定物理和/或功能特性表征的目的目标物。应当理解，在本发明的语境下，术语“靶”涉及该目标物的基本上相同实体的整体库(pool)，而不涉及样品中该目标物的单个实体。本文中的术语“基本上相同”意指样品中靶的总库的全部或基本上全部单个实体具有使它们可识别为靶的一个或更多个特性。例如，靶是样品中的特定蛋白质，包括这种特定蛋白的全部分子；本发明靶的另一例子是特定的分子复合物或分子结构，包括样品中含有这种特定分子复合物或分子结构的基本上全部目标物；本发明的靶的另一例子是病毒颗粒或细菌，其中，样品的这种病毒颗粒或这种细菌的总群体是靶。

与表征特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件相关的生物目标物，如分子、分子复合物、结构、粒子或生物经常称作这种特定细胞类型、组织、细胞结构或生理条件的“生物标记”。此类生物标记的非限定例子包括但不限于特定核苷酸序列、蛋白质或其它生物分子，例如糖类或脂类、染色体或膜结构、病毒、细菌、微生物等。在本发明的一些实施方式中，术语“靶”与术语“生物标记”互换使用，并涉及表征特定细胞类型、组织、生理条件等的分子、分子复合物、结构或粒子，其中，测试样品中后一类生物标记的任一者的总群体均视为靶。

在一个实施方式中，靶可以是蛋白质，例如，细胞膜受体或胞质蛋白，在另一实施方式中，靶可以是核酸，例如胞质核酸。任何稍后体到的靶的衍生物，例如靶蛋白或靶核酸等的片段、前体、突变体在本发明的一些实施方式中也可以是靶。

因此，在本发明的不同实施方式中，靶可以是生物学或化学靶分子，或粒子，或分子复合物或细胞复合物，或分子结构或细胞结构，或病毒，或微生物，或所述靶分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物的片段。化学样品和环境样品中所包含的靶可以是不同的污染物、毒素、战剂、分子库成员、工业有毒废弃化合物等。

特别地，本发明涉及可以由样品中多个独立的基本上相同单位代表的靶，特别地，本发明涉及单个独自的靶单位。

术语“单位(unit)”意指在计算时视作整体并且起到执行一项特定功能作用的靶的单个量。术语“独自的(individual)”意指某个单位与同类的其它单位或环境的其它成分可分开(通过功能的物理特性)并且可以单独地看待和和计数。术语“独自单位”与术语“单个单位”互换使用。术语“单个”在本文中意指靶单位由单独的整体构成，在数量方面仅由一个构成，由与众多相对或相反的一个构成。例如，靶蛋白的单个/独自单位意指该靶蛋白的单个独自的蛋白质分子，即同类多个分子的一个分子。术语“基本上相同单位”意指靶的多个单个单位具有使得这些单位被视作靶的一个或更多个特性。术语“独立的”意指单个靶单位作为独特实体存在，并且不依靠样品中同类其它独特实体的存在。

本发明的一些实施方式涉及作为分子的单个部分的单个单位。术语“分子的单个部分”意指分子的具有特殊特性的部分，所述特性允许将分子的这个部分与相同分子的其它部分区别看待，例如，靶蛋白的蛋白酶解片段、融合蛋白的部分、靶蛋白的特定结构域、核酸的特定结构、表位等。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及作为单个独自靶分子的单个/独自靶单位，即，涉及样品中存在的多个单个独自靶分子，在另一实施方式中，本发明涉及作为分子的单个独自部分的单个/独自靶单位，例如，在样品中多个靶分子中存在的特定分子结构，例如，表位。在另一实施方式中，本发明可以涉及构成样品中存在的病毒颗粒库的多个单个独自的病毒颗粒。

在不同实施方式中，靶的多个单个单位可以由单个独自的生物分子或化学分子、单个独自的单个粒子、单个独自的分子复合物或细胞复合物、单个独自的分子结构或细胞结构、或单个独自的病毒或单个独自的微生物、或所述分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物单个独自的片段代表。

在一个优选的实施方式中，靶是与癌相关的生物标记，例如激素和生长因子及其受体、细胞黏附分子、信号转导分子、细胞周期调控分子等的核酸和多肽，例如，包括生长因子PDGF、VEGF、TGF、HGF或EGF、它们的受体和与途径相关的分子的基因、RNA和蛋白、与信号转导途径(例如JAK/STAT途径或Akt1/PKB细胞生存途径或5-FU途径)相关的基因及其产物、雌激素受体ER及其基因(ERS1)等。本发明的方法允许简单且快速地可视化和定量所述生物标记。

本发明的方法样品中可以允许可视化和定量以宽泛动态范围存在的单个独自的靶单位。在一个或同样的样品中，非常高数量的靶和非常低数量的靶均可以在一个和同样的品中可视化或定量，或它们可以在独立的样品中评价。两种或更多种不同的靶可以在一个或相同的样品中可视化，例如蛋白靶和核酸靶，或两种或更多种不同的蛋白靶，或两种或更多种不同的核酸靶等。

在一个实施方式中，单个靶单位可以基本上均匀地遍及整个样品分布，在其它实施方式中，单个靶单位可以在样品的一个部分中更丰富，而在其余部分中较不丰富。在后述全部实施方式中，单个靶单位可以通过使用本发明的方法，在一个和同样的样品中可视化和定量。在一些实施方式中，其中单个靶单位与另一个目的靶结合，例如存在于作为某个病理状况的生物标记的特定分子共生体(association)或结构中，所述的其它目的靶也可以通过可视化和定量该样品中的单个靶单位而可视化和定量。

在一个实施方式中，本发明涉及样品中的单个靶单位的部分亚群体，如存在于样品中的单个独自靶单位的总数(total number)的多数(majority)或少数(minority)。术语“部分亚群体”本文中意指单个靶单位的总群体(population)的一部分，其等于或少于99％，例如等于或少于样品中单个靶单位的总量(total quantity)的90％，如少于85％，例如，样品中单个靶单位的总量的75-80％，如少于75％，例如，样品中单个靶单位的总量的1％至50％，如，样品中单个靶单位的总量的1％至25％等。根据本发明，将总群体的50％-99％所代表的单个靶单位的部分亚群体定义为样品中存在的单个靶单位的多数。将样品中由少于单个靶单位的总群体的50％所代表的部分亚群体定义为样品中存在的单个靶单位的少数。

在一个实施方式中，独自单个靶单位的多数可以参与本发明的离散单个靶位点的形成；在另一实施方式中，独自单个靶单位的少数可以参与本发明的离散单个靶位点的形成。在一个实施方式中，当靶或单个靶单位以非常低的数量在样品中存在时，可以优选基本上全部独自单个单位参与本发明的离散单个结合位点的形成。

结合剂

本发明方法包含一个步骤，其中将推测含有靶的样品与一种或多种结合剂孵育，所述结合剂的至少一种能够识别并且特异性结合单个独自的靶单位。

术语“结合剂”意指能够直接或间接与单个靶单位例如靶蛋白的独自分子特异性结合。术语“特异性地”意指结合剂对靶具有特殊亲合力，例如对靶分子的亲合力，或对结合至靶的试剂的特殊亲合力，例如对结合至靶蛋白的一级抗体的亲合力，对与一级抗体偶联的半抗原的亲合力等。术语“直接”意指对单个独自靶单位具有特异性亲合力的结合剂相互作用并且一旦相互作用时则与这个单个独自单位形成直接结合，例如，一级抗体与曾用作产生所述一级抗体的抗原的单个独自靶分子直接结合。术语“间接”在本文中涉及结合剂，其中所述结合剂对单个独自靶单位没有特异性亲合力，但所述结合剂对能够与这个单个独自单位特异性结合的另一种物质(例如一级抗体)具有特异性亲合力，或所述结合剂对与所述单个独自单位结合或连接的物质(例如对半抗原)具有特异性亲合力；所述结合剂与后一种物质直接相互作用并且与所述物质形成结合，从而该结合剂变得与单个靶单位间接结合。

在本文，能够与单个靶单位直接特异性结合的结合剂一般由第一结合剂表示。能够与单个靶单位间接特异性结合的结合剂一般由第二结合剂表示。然而，本发明的检测系统可进一步含有可以与单个靶单位间接结合的其它结合剂，例如第三、第四和其它结合剂。

通常，第一结合剂，或在一些实施方式中，第二或第三结合剂，用来与样品接触以识别靶，与靶结合并且与其形成复合物。第二、第三和其它结合剂可以用于本发明方法的其它步骤中，例如用于在下述靶位点处识别可检测分子的沉积物。一些实施方式中，第二第三和其它结合剂用来放大与靶结合的信号。这些结合剂还用于增加检测系统的灵活性，例如用来改变与靶结合的初始信号，例如将红色荧光信号改变为绿色等。

本发明的结合剂可以是不同特异性结合对的成员。

本领域中已知众多不同的特异性结合对，它们是能够相互特异性结合的成对的两种不同分子。适用于实施本发明的特异性结合对的成员可以是免疫型或非免疫型的。

非免疫特异性结合对包括其中两种组分相互共有天然亲合力，但不是抗体的系统。示例的非免疫结合对是生物素-亲和素或生物素-链酶亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、互补性核酸、受体-配体等。本发明也包括彼此形成共价键的非免疫结合对。示例的共价结合对包括巯基反应基团(如马来酰亚胺)和卤乙酰基衍生物和胺反应基团如异硫氰酸酯、琥珀酸酯、磺酰卤，以及如3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)的偶合染料等。

免疫特异性结合对可以例举为抗体-抗体系统或半抗原-抗半抗原系统。在一个实施方式中，本发明的免疫特异性结合对可以是含有彼此具有亲合力的两个或更多个抗体分子的抗体-抗体结合对，例如一级抗体和二级抗体对，其中一级抗体表示第一结合剂且二级抗体表示第二结合剂；含有3个或4个或更多个抗体成员的抗体系统可以用于另一实施方式中。在本发明的其它实施方式中，免疫结合对可以由半抗原-抗半抗原系统代表。在此类实施方式中，第一结合剂可以由含有对靶和半抗原具有亲合力的分子的偶联物(例如与半抗原连接的一级抗体或核酸序列)代表，并且第二结合剂可以由抗半抗原抗体代表。

术语“半抗原”意指小分子，其中可以将所述小分子视作可以产生抗体的孤立表位，尽管如果注入动物中，半抗原单独不会引起免疫反应，它必须与载体(通常是蛋白质)偶联。由于半抗原是小分子，故半抗原的多个副本可以连接至大分子，例如聚合物分子，如蛋白质、核苷酸序列、葡聚糖等。在信号放大是必需或有利的情况下，半抗原可以充当测定模式的便利标记物分子。因此，结合的多个半抗原副本提供了增强的灵敏度，例如增加的信号强度。合适半抗原的非限定例子包括荧光素(FITC)、2,4-二硝基酚(DNP)、myc洋地黄毒苷(DIG)、酪氨酸、硝基酪氨酸素、生物素和染料，例如四甲基罗丹明、得克萨斯红，丹磺酰、Alexa Fluor488、BODIPY FL、萤光黄和AlexaFluor405/Cascade Blue荧光团。US20080305497中所述的半抗原也可以用于本发明的目的。

如本文中所用，术语“抗体”意指免疫球蛋白或其部分，并且包括含有抗原结合位点的任何多肽，无论其来源、产生方法和其它特征是什么。该术语包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人性化抗体、单链、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和CDR-移植抗体。抗体的部分可以包括仍结合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab’)₂、Fv、scFv。抗体的起源由基因组序列限定，无论产生方法是什么。

在本发明的文字中，一级抗体意指特异性与靶结合，尤其与样品的单个靶单位特异性结合上，例如与单个靶分子结合的抗体结合剂，例如完整抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的偶联物或聚合抗体。在一些实施方式中，一级抗体可以是能够与不同靶的两个(或更多)单个独自单位结合的二价抗体，例如能够与受体二聚物例如Her2/Her3二聚物结合的抗体。在这个实施方式中，本发明的单个靶单位是单个Her2/Her3二聚物，并且该靶是样品中的Her2/her3二聚物的群体，其包括该样品的全部所述二聚物。一级抗体可以源自任何温血物种，例如哺乳动物、鸟类。

在本发明的语境中，二级抗体意指具有下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如，含有抗体的偶联物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与一级抗体或在靶位点处沉积的半抗原，或与一级抗体或其它结合剂直接或间接连接的半抗原特异性结合。

在本发明的语境中，三级抗体意指具有下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如，含有抗体的偶联物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与二级抗体或连接至二级抗体的半抗原或连接至聚合物(其与二级抗体偶联)的半抗原或在靶位点处沉积的半抗原特异性结合。

有时，抗体可以同时充当二级抗体和三级抗体。

本发明中使用的抗体，包括一级抗体二级抗体和三级抗体，可以可以源自任何温血物种，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、羊驼(lama)、骆驼或任何鸟类物种，例如鸡、鸭。如本文中所用，源自任何温血物种或鸟类物种，意指编码源自特定哺乳动物(例如大鼠、小鼠、山羊或兔)或特定鸟(例如鸡、鸭)的基因组序列中的特定抗体的核酸序列的至少部分。抗体可以是任意同种型(isotype)，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或任何亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

在某些实施方式中，一级抗体包含能够与生物标记特异性结合，尤其与所述生物标记的单个独自单位结合的抗原结合区，其中所述生物标记由生物样品的细胞表达。所述标记可以表达在细胞表面上或细胞膜内部，即在细胞内部，例如细胞质内部、内质网内部等。在一些实施方式中，生物标记可以从细胞提取，并且它因此存在于无细胞的介质中，例如水溶液中，或它是存在于细胞培养基、血浆、脑脊液等中的可溶性分子。相应样品的例子如上所述。

在某些实施方式中，二级抗体包含与一级抗体(例如与一级抗体的恒定区结合)特异性结合的抗原结合区。在某些实施方式中，二级抗体可以偶联至聚合物。在一些实施方式中，2-20个二级抗体，如5-15个二级抗体可以与聚合物偶联。在其它实施方式中，聚合物可以与1-10个二级抗体偶联，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个二级抗体。

在某些实施方式中，三级抗体可包含与二级抗体的抗原结合区(例如与二级抗体的恒定区)或与连接到二级抗体的半抗原或与偶联于二级抗体的聚合物特异性结合。在某些实施方式中，三级抗体与聚合物偶联。在一些实施方式中，1-20个三级抗体可以与聚合物偶联。在其它实施方式中，1-5个三级抗体，如1、2、3、4或5个三级抗体可以与聚合物偶联。

在一些实施方式中，可以优选含有结合剂的单个结合单位的聚合物，例如与一个分子的一级、二级或三级抗体偶联的聚合物。

可以用于本发明目的的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR移植抗体和使用噬菌体展示法或替代技术产生的人工选择抗体。

本发明的抗体结合剂可以通过本领域公知的多种方法中任一种方法产生，例如，根据Harlow和Lane，Antibodies:a Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，(1988)(Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY)。用于产生重组抗体分子的技术在上述文献和许多其它文献中描述，例如EP0623679、EP0368684和EP0436597。编码抗体的核酸可以从cDNA库分离。编码抗体的核酸可以从噬菌体文库分离(参见例如McCafferty等人.1990，Nature348：552，Kang等人.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4363；EP0589877B1)，编码抗体的核酸可以通过已知序列的基因改组来获得(Mark等人1992，Bio/Technol.10：779)。编码抗体的核酸可以通过体内重组来分离(Waterhouse等人1993，Nucl.Acid.Res.21：2265)。本发明方法中所用的抗体包括人源化免疫球蛋白(参见U.S.5，585，089，Jones等人1986，Nature332：323)。本发明的抗体可以以任何可能方式改变，只要它们仍保持结合亲合力，例如它们可以与效应蛋白、毒素、标记物等融合。将抗体与不同试剂偶联的方法是本领域公知的并且在本发明下文的示例性实施方式中描述。

在本发明的一个实施方式中，抗体结合剂由Fab区代表。

在一个实施方式中，抗体结合剂可以是含有两种或多种不同抗体结合剂的组合物，例如是含有第一抗体结合剂和第二抗体结合剂的组合物，其中两种或多种不同的抗体试剂是不同的免疫结合对。在一个实施方式中，组合物中的至少两种或多种不同抗体结合剂是一种能够与靶特异性结合的抗体并且至少一种另外的抗体是含有酶的抗体。

在另一实施方式中，本发明涉及作为非免疫特异性结合对(如互补性核苷酸序列或核酸类似物分子)的成员的结合剂。

含有核酸或核酸类似物分子(例如DNA分子、RNA分子、PNA分子)的结合剂，可以用于可视化和定量核酸靶的单个独自单位。

可以化学地合成或在重组细胞中产生用作本发明目的的结合剂的核酸序列。两种产生模式均是本领域公知的(参见例如Sambrook等(1989)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册，第二版)，Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方式中，核酸结合剂可以含有肽核酸(PNA)。肽核酸是其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核糖或核糖主链被肽主链替换的核酸分子。产生PNA的方法是本领域已知的(参见例如Nielson，2001，Current Opinion inBiotechnology12：16)(因而通过引用的方式并入)。在其它实施方式中，结合剂可以含有锁核酸(LNA)(Sorenson等2003，Chem.Commun.7(17)：2130)。

在一些实施方式中，核酸结合剂可以含有在特定严格性条件下与生物样品中靶序列的单个单位(例如单个mRNA序列)特异性杂交的至少一个寡核苷酸序列或至少一个多核苷酸序列。术语“在严格条件下杂交”在本文中用来描述杂交条件，在所述杂交条件下，彼此明显互补，如至少70％、至少80％、至少85-90％互补的核苷酸序列仍维持彼此结合。互补百分比如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res，25：3389-3402(因而通过引用的方式并入)所述那样确定。

指定的严格性条件是本领域已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，Inc.(Ausubel等人1995编著)的第2、4和6部分(因而通过引用的方式并入)中找到。此外，指定的严格性条件在ambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版.Cold Spring Harbor Press，第7、9和11章(因而通过引用的方式并入)中描述。在一些实施方式中，杂交条件是高严格性条件。高严格性杂交条件的一个例子是在65-70℃在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交或在42-50℃在4X SSC加50％甲酰胺中杂交，然后在at65-70℃在1X SSC中洗涤一次或多次。可以将其它试剂添加至杂交缓冲液和/或洗涤缓冲液中，例如封闭剂(BSA或鲑鱼精DNA)、去垢剂(SDS)、螯合剂(EDTA)、Ficoll、PVP等。

在一些实施方式中，结合剂可以在中等严格性条件下与样品中的靶序列杂交。如本文中所用，中等严格性包括可以由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度轻易确定的条件。例举的条件在Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版第1卷，第1.101-104页，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(因而通过引用的方式并入)中描述，并包括使用5XSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗涤溶液，杂交条件为50％甲酰胺、6X SSC、42℃(或其它类似的杂交溶液，如Stark's溶液，42℃，在50％甲酰胺中)，并且洗涤条件为60℃、0.5X SSC、0.1％SDS。

在一些实施方式中，结合剂在低严格性条件下与样品中的靶序列杂交。如本文中所用，低严格条件包括可以由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度轻易确定的条件。低严格条件可包括，例如，将DNA在40℃在包含35％甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中预处理6小时。杂交在相同的溶液中进行，同时作出如下改变：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑鱼精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x10⁶CPM结合剂。样品在40℃在杂交混合液中孵育18-20小时，然后在55℃于含有2x SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。将洗涤溶液更换为新鲜溶液并且在60℃孵育额外1.5小时。

在其它实施方式中，本发明可以涉及作为肽序列或含有肽序列的结合剂，其中所述肽序列源自非抗体蛋白质，例如，源自不同蛋白的核酸结合结构域、不同细胞受体和核受体的配体及其衍生物中的肽序列。此类结合剂的一些非限定例子可以是补体级联经典途径的c1q蛋白(其可以与抗体恒定区结合)、MHC分子(例如，MHC I类、MHC II类和非传统MHC)、具有特异性结合配体的分子(如参与胞内信号转导途径的分子，如具有亮氨酸拉链结构域的分子，例如，fos/jun，myc，GCN4)、具有SH1或SH2结构域的分子(如Src或Grb-2)、免疫球蛋白受体(例如Fc受体)、嵌合蛋白(即经工程化以组合两种或多种特异性结合配偶物之特性的蛋白质，例如，可以将亮氨酸拉链工程化至抗体的Fc区中，可以将SH2结构域工程化以在抗体的Fc区中表达)。在其它实施方式中，可以工程化融合蛋白，其包含带有置换的可变结构域的抗体Fc部分。

结合剂也可以是可以与大生物分子的特定结构单位特异性结合的小分子。

在一些实施方式中，结合剂可以含有可检测标记物，例如荧光物质、半抗原、酶等。在一个实施方式中，本发明涉及能够与沉积的可检测分子特异性结合并且并用于可视化本发明靶位点的标记的结合剂，即标记的第三或其它结合剂。在一个实施方式中，本发明涉及含有酶标记物的结合剂。适合的酶标记物的非限定例子可以是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、蔗糖酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)。在一个实施方式中，结合剂可以含有HRP作为标记物。在另一实施方式中，结合剂可以含有AP作为标记物。

对于形成本发明靶位点所必需的结合剂的量可以取决于其它因素，例如样品种类、靶种类、结合剂种类、结合剂的结合亲合力等。使用公知常识，本领域技术人员可以选择合适的结合剂并且确定每一特定实施方式所需要的量。在一些实施方式中，可以优选的是，调节形成靶位点的结合剂的量，从而并非全部存在于样品中的单个靶单位而是其部分亚群体参与本发明靶位点的形成，例如在样品以丰沛量含有靶或靶以宽泛动态浓度范围存在时的实施方式中。在其它实施方式中，可以优选全部靶或基本上全部的单个单位参与本发明靶位点的形成，例如在具有十分低的靶或单个靶单位表达的样品情况下。在以下实施方式中，可以优选以这样的量使用结合剂，其中所述的量将确保用样品的的基本上多数的独自单个单位形成结合位点，即，基本上多数的存在的单个靶单位将参与靶位点的形成。

酶

根据本发明，样品含有一个或更多个独自靶单位。根据本发明，包含酶的至少一种结合剂直接或间接结合单个靶单位并且与所述单位形成的复合物。

根据本发明的酶是具有氧化还原酶活性的酶(在本文中互换称作“氧化还原酶”或“本发明的酶”)。术语“具有氧化还原酶活性的酶”意指按EC(酶分类编号)分类为EC1的酶，所述酶催化电子从一个分子(还原剂，也称为氢或电子供体)转移至另一分子(氧化剂，也称为氢或电子受体)。在一些优选的实施方式中，本发明涉及分类为E1.10.(酚氧化酶)和E1.11.(过氧化物酶)的氧化还原酶。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及酚氧化酶，特别涉及含铜氧化酶漆酶(Laccase)(E1.10.3.2)家族。漆酶作用于酚和类似分子，进行单电子氧化。漆酶在木质素的形成中通过促进木质醇(一个天然存在的酚类家族)的氧化偶联发挥作用。适合于本发明目的的漆酶可以是例如在Phillips LE和Leonard TJ(联苯胺作为测量裂褶菌粗制无细胞提取物中酚氧化酶活性的底物(Benzidineas a Substrate for Measuring Phenoloxidase Activity in Crude Cell-Free Extracts ofSchizophyllum commune)，Mycologia1976，68：277-285)，或Kunamneni A，Plou FJ，Ballesteros A，Alcalde M.(漆酶及其应用：专利综述(Laccases and their applications:a patentreview)，Recent Pat Biotechnol.2008，2(1)：10-24)，或Rodríguez Couto S，Toca HerreraJL(漆酶的工业和生物技术应用：综述(Industrial and biotechnological applications of laccases:a review)，Biotechnol Adv.2006，24(5)：500-13.)中描述的酶。

本文中，术语“漆酶”用来指本发明的具有酚氧化酶活性的酶，然而，应当理解，漆酶只是适合于本发明目的的酚氧化酶的许多实施方式中的一种。

在另一优选实施方式中，本发明涉及催化以下形式反应的过氧化物酶酶活：

ROOR'+电子供体(2e )+2H⁺→ROH+R'OH

在本发明的一个优选的实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是辣根过氧化物酶(HRP)。在本发明的另一实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是大豆过氧化物酶(SP)。

对于一些过氧化物酶，最佳底物是过氧化氢，其它过氧化物酶在采用有机过氧化氢(如有机过氧化物)时更活跃。电子供体的性质十分依赖于酶的结构，例如辣根过氧化物酶(HRP)可以使用多种有机化合物既作为电子供体，又作为受体。HRP具有可接触的活性部位，并且许多化合物可以抵达这个反应位点。

酶活性，即氧化还原酶活性，例如酚氧化酶或过氧化物酶活性，可以由与结合剂分子直接或间接连接的酶的全长分子或合并有酶活性的酶片段(例如酶分子的全尺寸的51％至99.9％，或少于51％，例如40％，30％或更少)代表。

本发明的结合剂可以直接或间接与一个或更多个酶部分偶联(本文中的术语“部分(moiety)”意指具有氧化还原酶活性的酶分子的部分，它包括完整或基本上完整的酶分子以及所述分子的具有氧化还原酶活性的部分)。第一和/或第二结合剂中二者或任一的分子可以与氧化还原酶的一个或几个功能活性部分偶联。在一个实施方式中，第一结合剂的至少一个分子可以与具有氧化还原酶活性的一个或更多个酶促部分偶联；在另一实施方式中，第二结合剂的至少一个分子可以与一个或更多个这样的部分偶联。第三和其它结合剂的分子也可以与氧化还原酶偶联。术语“直接偶联”意指酶部分通过化学键连接到结合剂分子上。术语“间接偶联”意指酶的部分通过连接分子连接到结合剂分子上，其中所述连接分子具有与结合的一个化学键以及与酶结合的另一化学键。偶联生物分子和交联剂分子的方法是本领域熟知的并且在下文例示。

在一个实施方式中，氧化还原酶部分是HRP的部分，例如完整HRP分子、其具有HRP酶活性的片段，也可以是含有具有酶活性的HRP部分的重组蛋白等。在另一实施方式中氧化还原酶的部分可以是大豆过氧化物酶(SP)的部分。在另一实施方式中，氧化还原酶的部分可以是漆酶的部分。

含有具有氧化还原酶活性的酶的结合剂的非限定例子可以是与一个或更多个HRP部分偶联的抗体分子或其衍生物，例如Fab，以及与HRP偶联的核酸结合剂。此类结合剂直接或间接与单个靶单位(例如单个靶分子)结合并且因而形成复合物，其中单个这样的复合物含有单个独自的靶单位以及一个或更多个结合剂(其中所结合剂的一个或更多个含有具有氧化还原酶活性的酶)。

在一个实施方式中，结合剂是含有一个、两个或更多个过氧化物酶部分的偶联物，其中所述部分直接连接于结合剂，例如直接与一个或更多个HRP部分偶联的抗体分子。在另一实施方式中，结合剂可以是含有间接连接于结合剂的具有过氧化物酶活性的两种或更多种酶(例如两个或更多个HRP部分)的偶联物，例如，这样的偶联物，其中一个或更多个抗体分子与和一个或更多个HRP部分独立地连接于主链聚合物，即具有过氧化物酶活性的酶间接与结合剂即与到抗体连接。

每个结合剂分子的HRP数目可以变动，从每个结合剂1个酶部分至每个结合剂20-50个酶部分或甚至更高。在一些实施方式中，优选使用这样的结合剂，其中HRP部分的数目是每个结合剂至少2个，优选地2-25个酶部分，例如在3和20个之间，如4、5、6、7、8、9、10个等。已经惊奇地发现，使用的结合剂中，每个结合剂的酶部分的数量超过1，每个结合剂优选超过2，优选每个结合剂超过3。在一些实施方式中，优选使用这样的结合剂，其含有每个结合剂超过4个酶部分，优选5和20个之间，例如从5到15个酶部分。具有超过4个酶部分的结合剂有利于形成这样的靶位点，其可以可视化为大小上基本上相同的点。在一些实施方式中，甚至可以优选的是，含有此类结合分子库的酶的每个结合剂分子含有大约相同数目的酶部分，例如库中的每个结合剂含有4-6个，每个结合剂分子5-7、6-8、7-9、8-10个等酶部分，例如每个抗体分子(例如每个一级抗体分子或每个二级抗体分子)5-6或6-7个HRP部分。含有多个HRP部分的下述结合剂架构建体是示例性的。为了获得所提到的效果，结合剂可以含有上文讨论的具有氧化还原酶活性的本发明任何酶的多个部分。结合剂还可以含有不同氧化还原酶的多个部分的组合。

在一些其它实施方式中，可以优选结合剂的相对小的偶联物分子，例如，与酶(例如HRP)的一个或两个或更多部分偶联的单个抗体分子或抗体的分离Fab区。此类结合剂是相对紧凑的分子并且这可能有利于检测在靶或样品中被“隐藏”或掩蔽的独自靶单位，例如独自的单个靶分子可能被被周围的其它分子掩蔽，单个靶结构可能隐藏在靶分子内，或单个病毒颗粒能在含有细胞的复杂生物样品中难以接触。

在一些其它实施方式中，可以优选含有一个结合剂和数十至数百个酶部分的巨大偶联物。此类结合剂可能例如在关注于非常快速的靶检测或或需要获得每个独自靶位点巨大沉积物的情况下是有利的。

与包含具有氧化还原酶活性(例如过氧化物酶活性)的酶的结合剂(直接或间接)结合的单个靶单位构成本发明的单个靶位点。

在一个实施方式中，本发明的单个靶位点含有靶的单个靶单位、至少一个一级抗体或其衍生物以及至少一个二级抗体或其衍生物，其与一个、两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶(例如HRP)偶联。

在另一实施方式中，单个靶位点可以含有单个靶单位、与半抗原偶联的至少一个一级抗体分子和与一个、两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶(例如HRP)偶联的针对所述半抗原的抗体。

在另一实施方式中，靶位点可以含有单个靶单位、一个或多个对该靶特异的第一核酸/核酸类似物结合剂以及一个或多个对第一核酸/核酸类似物结合剂特异的第二核酸/核酸类似物结合剂结合剂。

上述实施方式是非限性的。在其它实施方式中，本发明可以涉及上述讨论的单个任意靶单位与上述讨论的任意结合剂的任意组合，其形成本发明的靶位点。

在一个实施方式中，本发明的单个靶位点可以是固体支持物的单个位点，其含有用本发明的酶活性标记、即与具有氧化还原酶活性的酶直接或间接偶联的单个靶单位，或是含有具有氧化还原酶活性的酶的重组融合分子的单个单位。在一个实施方式中，氧化还原酶可以是靶本身。相应地，该实施方式中的靶位点可以仅含有氧化还原酶酶的一个单个单位，如固定的氧化还原酶部分，例如固定在固体支持物之上或内部的HRP或漆酶。

酶底物

在与一种或多种结合剂孵育并形成上述的本发明靶位点之后，含有一个或更多个本发明单个靶位点的样品在水溶液(i)中孵育。本发明的水溶液(i)含有与本发明的单个靶位点结合的酶的第一底物，其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，其(1)能够与该酶反应时产生稳定自由基，并且(2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述酶的第二底物分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物。本发明的水溶液(i)也含有与本发明的单个靶位点结合的酶的第二底物，其中所述第二底物是偶联物分子，该分子含有能够作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质或特异性结合对的成员。

第一底物

与本发明的单个靶位点结合的酶的第一底物(以后也称为“第一底物”)是具有氧化还原酶活性的酶的底物。该底物(1)是水溶性富电子有机化合物，(2)能够与所述酶反应时产生自由基，(3)能够交联所述酶的第二底物的水溶性分子(在所述酶和过氧化物化合物存下)，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物。

术语“水溶性”意指第一底物的分子能够在水中和含水溶液中溶解。术语“富电子化合物”本文中意指含有连接的p-轨道的共轭系统的有机化合物，包括具有交替单键和多键的化合物。孤对电子和自由基可以是该系统的部分。该化合物可以是环状、非环状或二者。“共轭”意指一个p-轨道与另一个穿过居间性σ键重叠(在较大的原子中可能涉及d-轨道)。一个共轭系统具有桥接居间单键的重叠p-轨道区域。这些p-轨道造成π电子跨越相邻对齐的p-轨道离域，这通常可以降低分子的整体能量并提高稳定性。共轭系统的π电子不属于单键或原子，而属于一组原子。

具有氧化还原酶活性的本发明酶包括可以利用巨大数目底物的多样酶。在这些底物中，本发明的底物是这样的化合物，它们是含有偶联π系统的水溶性有机富电子有机化合物，所述水溶性有机富电子有机化合物能够与具有氧化还原酶活性的本发明酶反应时产生自由基，优选地是稳定的自由基。术语“稳定的自由基”在本文中意指在本发明的条件下，例如在水溶液(i)中，第一底物的自由基具有至少20秒、优选约1分钟至约15分钟，或长于例如2、3、4或5分钟，在5和10分钟之间等的寿命。另外，构成本发明第一底物组的化合物的自由基能够交联本发明的第二底物的水溶性分子，从而将所述水溶性分子转化成水不溶性聚合产物。

特别地，在一个实施方式中，本发明涉及由水溶性有机富电子化合物、含有一系列至少三个(C-C＝)重复的化合物或含有芳香环结构的化合物代表的第一底物，其中所述水溶性有机富电子化合物具有一种相互连接的碳原子，其中每隔两个键优选地是双键。

在一个实施方式中，第一底物可以有含有式(I)结构的化合物代表：

其中

R1是芳基或乙烯基，

R2、R3和R4独立地为H、N-(X)₂、O-(X)₂，其中X是烷基、乙烯基或芳基或H，其中R2、R3和R4不同时为H，

其中，

H是氢；

O是氧。

具有如具有氧化还原酶活性的本发明酶的第一底物那样能力的上述式的化合物的非限定例子可以是3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸、α-氰基-4-羟基-肉桂酸及其衍生物。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及作为第一底物的3’3’-二氨基联苯胺(DAB)。

本发明利用DAB形成稳定自由基的能力，所述稳定自由基可以在具有氧化还原酶活性的酶(即辣根过氧化物酶(HRP))和过氧化物化合物(即过氧化氢)存在下交联第二底物的分子，并在单个靶位点处离散地沉积交联的第二底物分子。

在另一优选实施方式中，本发明涉及作为第一底物的阿魏酸。

阿魏酸也能够在具有氧化还原酶活性的酶(即辣根过氧化物酶(HRP))和过氧化物化合物(即过氧化氢)存在下交联第二底物的分子，并在单个靶位点处离散地沉积所述第二底物。

在一些其它实施方式中，本发明涉及3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸的衍生物。在本文中，术语“衍生物”意指衍生自3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸的化合物或意指如果阿魏酸分子中的一个原子被另一原子或原子团替换，可以设想从3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸产生的化合物。本发明涉及了满足上述所讨论的本发明第一底物条件的3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸的衍生物。

第一底物在水介质(i)和/或水介质(ii)中的量可以是约0.05mM至约2mM，取决于代表第一底物的化合物的结构。通常，R1为乙烯基或乙烯基衍生物的式(I)化合物比其中R1是芳基或其衍生物的化合物以更高的量使用。因此，当DAB在水溶液(ii)中的量少于1mM，优选地在0.05mM至1mM的范围内，如0.05mM和0.08mM之间，例如约0.07mM，即从0.066mM至0.074mM，或0.08mM至0.1mM之间，例如约0.09mM，或0.1mM和0.3mM，例如约0.15mM，约0.2mM，约0.25mM，或0.3mM和0.6mM之间，例如约0.35mM，约0.4mM，约0.45mM，约0.5mM，约0.55mM，或0.6mM和1mM之间，例如约0.7mM，约0.75mM，约0.8mM，0.8mM和1mM之间时，DAB作为本发明的第一底物。惊奇地发现，当DAB以靠后的量存在时，可以形成第二底物的离散圆形沉积物，其直径大于0.4微米，约1微米、1.5微米、2微米或更大，例如约3或4微米。为了产生这样的第二底物沉积物，作为第一底物的阿魏酸可以在水介质(ii)中以约1mM和约2mM之间，如例如约1.5mM的量存在。

第二底物

根据本发明，本发明酶的第二底物(这里也称为“第二底物”)是偶联物分子，其含有能够作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质或特异性结合对的成员。

在一些优选的实施方式中，本发明涉及一大组偶联物分子作为第二底物，它们共有以下特性：

1.所述偶联物分子是水溶性分子，其含有能够作为本发明的酶的底物的两种或更多物质，优选地作为HRP的底物，和一种或多种标记物，其中所述底物和标记物通过水溶性交联剂化合物(以后称为“交联剂”)连接到一起；

2.酶底物部分“浓集”在所述分子的一部分中的所述偶联物分子内，并且标记物“浓集”在所述分子的另一部分中，其中该标记物与底物相距大约30个或更多个连续互连的原子，即分隔大约2.5nm或更多，优选多于3nm；

3.酶底物彼此以少于2.5nm的距离分隔，例如在偶联物分子中以少于30个或更少互连的碳或杂原子(如碳、氮、硫和/或氧原子)，优选地不超过5-20个原子分隔；

4.交联剂是含有至少30个连续互连原子的化合物；

5.在环境中不存在具有氧化还原酶活性的酶时，偶联物不从包含过氧化物化合物和本发明第一底物的水溶液(ii)中沉淀；

6.在环境中存在具有氧化还原酶活性的酶但不含有所述酶的第一底物时，偶联物不从包含过氧化物化合物的水溶液(ii)中沉淀；.

7.在环境中存在所述酶的情况下，偶联物从包含过氧化物化合物和具有氧化还原酶活性的本发明酶的第一底物的水溶液(ii)沉淀。

第二底物的沉积物可以通过目视手段可直接检测，因为在一些实施方式中，它们可以含有生色性、荧光性或发光性标记物。在其它实施方式中，沉淀的第二底物可以在沉积可可见到之后的步骤中“染色”。在两种情况下，第二底物的沉积物将向观察者“报告”本发明的单个靶位点存在于环境中。本发明的第二底物的分子因此可互换地称为“报告子”。

下文以及实施例中将详细说明第二底物分子的非限定性实施方式。

在一个实施方式中，本发明涉及第二底物，其是含有以下物质的水溶性偶联物分子：

(i)一种或多种可检测物质(可互换地称为“标记物”)

(ii)能够作为本发明的酶的底物的至少两种物质，以及

(iii)交联剂

其中

所述交联剂是含有至少一条由至少30个连续互连原子组成的直链的化合物，所述直链含有至少两个分支点，其中所述分支点分隔至少30个连续相接原子的分子距离；

其中

标记物(i)和氧化还原酶底物的部分(ii)与交联剂在其两个分支点处连接，其中所述所述分支点分隔至少30个连续相接原子的距离，并且

其中

任何两个相邻的酶底物彼此分隔少于30个连续互连原子的分子距离。

术语“可检测物质”意指该物质能够释放待通过视觉手段检测的可检测生色、荧光、发光或放射信号，或它可以利用其特异性结合配偶物检测，例如抗体、核酸序列、核序列类似物序列、半抗原、抗原、受体、受体配体、酶等。

在一些实施方式中，本发明的水溶性偶联物分子可以另外含有可增强其特性的部分，例如改善其作为标记物或酶底物的能力，或提高/降低其水溶解性。

在一个实施方式中，本发明的偶联物分子可以选自一组式(II)的化合物：

(Y)n-L-(Z)m，

其中

Y是能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的部分；

Z是可检测标记物；

L是交联剂化合物；

其中，

n是从2至150的整数，m是从1至150的整数。

在一个优选的实施方式中，Y选自以下式(II)的化合物：

其中

R1是–H、–O-X、N(X)₂或-S-X；

R2是–H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R3是–H、-OH、-NH₂或-SH；

R4是–H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R5是–H、-O-X、N(X)₂或-S-X，

R6是-CON(X)₂或CO-X，

其中

H是氢；

O是氧；

S是硫；

N是氮；和

X是H、烷基或芳基。

在一个实施方式中，能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少之一是式(ii)的化合物。

在一个实施方式中，能够在偶联物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少两者是式(ii)的化合物。

在一个实施方式中，能够在偶联物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少两者是相同的式(ii)化合物。

在一个实施方式中，能够在偶联物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少两者是不同的式(ii)化合物。

在一个实施方式中，能够在偶联物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的全部化合物由式(II)定义。在一个实施方式中，这些是相同的化合物，在另一实施方式中，偶联物分子含有由式(II)定义的不同化合物的任意组合。

在一个优选的实施方式中，Y可以是肉桂酸的残基；在其它的优选实施方式中，Y可以是阿魏酸的残基。在其它的优选实施方式中，Y可以是咖啡酸的残基；在其它的优选实施方式中，Y可以是氨基肉桂酸的残基。在其它的优选实施方式中，Y可以是芥子酸(sinappinic acid)的残基。在其它的优选实施方式中，Y可以是阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸的衍生物。

优选地，由式(II)定义的残基Y通过基团R6连接到交联剂L。

在一个优选的实施方式中，偶联物含有2至4个相同的残基Y。在其它优选的实施方式中，偶联物含有2至4个不同的残基的组合。在一个优选的实施方式中，2至4个残基Y是由式(II)定义的化合物。

在一个优选的实施方式中，偶联物可以含有2至4个阿魏酸的残基或其衍生物的残基，在另一实施方式中，偶联物可以含有2至4个肉桂酸的残基或其衍生物的残基；在另一实施方式中，偶联物可以含有2至4个咖啡酸的残基或其衍生物的残基；在另一实施方式中，偶联物可以含有2至4个氨基肉桂酸的残基；在另一实施方式中，偶联物可以含有2至4个芥子酸的残基或其衍生物的残基。后者化合物的2至4个衍生物可以是相同的化合物或可以是不同的化合物。

在一个优选的实施方式中，偶联物分子可以含有两个式(II)的Y化合物，或其两个衍生物，例如两个阿魏酸残基，或两个肉桂酸残基，或两个氨基肉桂酸残基，或两个咖啡酸残基，或两个芥子酸残基等，以及一个或多个可检测标记物；在另一实施方式中，偶联物可以含有三个式(II)的分子或其三个衍生物，如三个阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸、芥子酸等，以及一个或更多个可检测标记物；在另一实施方式中，偶联物可以含有4个式(II)的化合物或其4个衍生物，例如4个阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸、芥子酸或后者的4个衍生物，以及一个或多个可检测标记物。

在一些实施方式中，Y化合物的数目可以大于4，例如如5-10、10-15、15-20、20-50、50-100或100-150个化合物。此类偶联物分子的非限定例子在实施例中描述。在一些优选的实施方式中，此类偶联物可以含有多于一条至少30个连续连接原子的直链，例如30-150个原子，其中2至4个Y化合物与每条直链在该链的第一和相同分支点处连接，，并且此类直链中的几条通过所述直链的第二(另一个)分支点与另一个水溶性交联剂分子(例如葡聚糖)连接。

在一个优选的实施方式中，偶联物分子可以含有2个或4个不同的式(II)化合物的组合，或其2个或4个衍生物的组合，例如2个阿魏酸残基和一个肉桂酸残基，2个芥子酸残基和2个咖啡酸残基等。

在一个优选的实施方式中，Y可以是氨基酸酪氨酸的残基或其衍生物的残基。偶联物可以含有2至4或更多此类残基。

在一个实施方式中，偶联物分子可以含有具有氧化还原酶活性的酶的底物的组合，其中所述底物至少之一是酪氨酸。在一个实施方式中，偶联物分子含有至少一个酪氨酸残基和至少一个式(II)的化合物，或其衍生物，以及至少另一个是式(II)的化合物，或其衍生物，例如一个酪氨酸残基和两个芥子酸残基或其衍生物。

在一些实施方式中，可以优选所述偶联物含有4至6个Y残基，其中Y由上述讨论的任意化合物或任意化合物的组合代表。

根据本发明，Y化合物位于偶联物分子中作为一个组，优选归组为每组2至4个Y化合物(即含有多于4个Y化合物的偶联物可以含有几组2至4个Y化合物，其中所述组在偶联物分子中由一组原子分隔，例如，由对应于30个或更多个连接原子的分子距离分隔)。优选地，此类组中的2至4个Y化合物经间隔化合物连接在一起，所述的间隔化合物在两个相邻的Y残基之间提供不长于5-15个互连例如5-10、6-12、7-13、8-14、9-15个等原子的距离。例如，2-4个Y化合物可以与构成含有2至4个氨基酸残基(例如赖氨酸、丝氨酸、半胱氨残基酸等)的肽链的氨基酸连接，其中所述Y化合物与肽的氨基酸残基的反应性基团连接，例如与赖氨酸残基的ε-氨基连接。2至4个化合物Y还可以通过含有多个分支点的其它短聚合物彼此连接，其中这些分支点之间的分子距离对应于不超过3-7个原子，优选地3-5个原子的链，其中Y化合物可以与所述分支点直接或间接连接。2至4个化合物Y还可以归并在一起与非聚合物分子偶联，其中所述非聚合物分子具有允许连接任何2至4个Y化合物的2至4个反应基团。Y化合物的这种归组定位在下文中称为偶联物分子的“Y-头(Y-head)”。

在一个优选的实施方式中，Y-头含有2至4个经短聚合物(例如短PNA分子或短肽)连接的Y残基，其中所述肽优选含有赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸和/或半胱氨酸残基。然而，含有15个或更少原子的任何其它聚合或非聚合水溶性分子可以与至少2个Y残基偶联，并且交联剂L可以是合适的。

在一个实施方式中，含有2至4个化合物Y的一个Y-头可以与含有2个或多个以下式(III)重复的聚合物连接

其中R₁和R₂选自NH和O，并且R₃选自甲基、乙基、丙基、CH₂OCH₂和(CH₂OCH₂)₂，并且，其中不超过3个连续重复的乙氧基。所得到的偶联物还可以与一个(或更多)可检测标记物偶联，或它可以与含有一个或更多个反应基团的另一个水溶性分子偶联，所述反应基团允许连接一个或几个此类偶联物。这种水溶性分子的一个非限定例子可以是葡聚糖聚合物。

在偶联物分子中Y化合物的紧密间距对作为本发明第二底物的偶联物的功能能力具有影响，即，偶联物在环境中不存在具有氧化还原酶活性的酶时仍可溶解于包含过氧化物化合物和3,3’-二氨基联苯胺(DAB)的水溶液中，但当具有氧化还原酶活性的酶在该环境环境中存在时从此类溶液中快速且有效沉淀(与仅含有一个Y化合物或含有几个Y化合物的偶联物相比，其中所述几个Y化合物在偶联物分子中未以Y-头形式“浓集”，即2个相邻Y残基间的分子间距大于上述讨论的距离。此类化合物不能在本发明的单个靶位点处有效形成离散的沉积物)。

偶联物分子的可检测标记物可以是可视觉检测的任何物质，例如荧光性或发光性物质，或是可通过使用一些检测手段检测的任何物质，例如，放射性标记物、特异性结合对的成员，例如核酸序列、半抗原等。

任何荧光性、发光性、生物发光性或放射性分子可以用作标记物。它们中的许多是商业获得的，例如荧光染色剂Alexa Fluors(Molecular Probes)和DyLight Fluors(Thermo Fisher Scientific)。荧光标记物的其它非限定例子可以是以下分子：5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-酰胺基己酸、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、PerCP，R-藻红蛋白(RPE)、别藻蓝蛋白(allophycoerythrin，APC)、德克萨斯红、普林斯顿红、绿荧光蛋白(GFP)包覆的CdSe纳米微晶、钌衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1,2-二氧环己烷(dioxetane)和吡啶并哒嗪(pyridopyridazine)、放射性氢同位素、碳、硫、碘、钴、硒、氚或磷。

在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶。适合的酶标记物的非限定例子可以是碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)。

在其它实施方式中，可检测标记物可以是特异性结合对的成员，例如半抗原。作为适合的半抗原的非限定例子，可以提到2,4-二硝基酚(DNP)、洋地黄毒苷、荧光素、德克萨斯红、四甲基罗丹明、硝基酪氨酸、乙酰氨基芴(acetylaminoflurene)、苦味酸汞(mercury trintrophonol)，雌二醇，溴脱氧尿苷(bromodeoxy uridine)、二甲氨基萘磺酸酯(1-二甲氨基萘-5-磺酰)、氨基酸酪氨酸、丝氨酸等。作为适合的特异性结合对，也可以提到生物素、链霉素、互补性天然和天自然寡核酸序列，锌指结合结构域对等。其它例子在以上叙述。

在一个优选的实施方式中，标记物是半抗原。在其它的优选实施方式中，标记物是荧光体物质。在其它的优选实施方式中，标记物是特异性结合对的成员。在其它实施方式中，可以优选其它标记物。

每个偶联物分子(如上所述中的任何一种)的可检测标记物数目可以变动。在一些实施方式中，标记物的数目可以是1至3，例如每个偶联物分子1、2或3个标记物。在一些其它实施方式中，偶联物可以含有每个偶联物分子4至150个的更多标记物。

在一个优选的实施方式中，偶联物(如上所述中的任何一种)含有一种可检测标记物。在一个优选的实施方式中，偶联物分子可以含有一个Y-头(如上所述中的任何一种)和一种标记物。

根据本发明，在偶联物分子中，可检测物质(单个标记物或多个)与作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物，例如与Y-头相隔超过2.5nm的分子距离，例如被至少30个连续原子，例如30-150个或更多连续原子的链隔开。在其中所述偶联物含有一条相连原子的链作为Y-头和1个(或更多)标记物之间L交联剂的实施方式中，Y-头和标记物与所述链在彼此相隔至少30个原子的分支点处，例如在30个连接原子的链的相对端连接。

在一些实施方式中，当偶联物含有超过1个标记物时，优选标记物成组，从而在标记物之间存在分子距离，其对应至少30个连续连接原子的链(称为“间隔体”)，优选地60个或更多个连续相连原子的链，例如90个连续互连原子的链。优选标记物之间的间隔体是亲水化合物。后续的标记物组然后与偶联物分子中以上述方式连接所述标记物和酶底物部分的交联剂化合物连接，即，该组中位于最靠近Y-头的标记物距离Y-头的任何酶底物至少30个互连原子，即，至少2.5nm距离。多个标记物在偶联物分子中的这种排列下文称为“Z-尾”。

优选地，在Z-尾的标记物之间的至少30个连续原子的间隔体是含有2个或更多个下式(III)重复的聚合化合物。

其中R₁和R₂选自NH和O，R₃选自甲基、乙基、丙基、CH₂OCH₂和(CH₂OCH₂)₂，其中没有超过3个连续重复的乙氧基。

与上述间隔体连接并由其分隔的多个标记物可以经任何合适的交联剂(例如允许多重连接的水溶性聚合物例如葡聚糖)与一个Y-头或几个Y-头偶联。在一些实施方式中，几个Y-头可以经此类聚合物与几个Z-尾偶联。

在一个实施方式中，本发明偶联物分子的多个标记物可以是相同的可检测物质，在另一实施方式中，所述标记物可以是不同的可检测物质。

标记物的Z-尾设置具有在以下方面的优势：(1)包含多个疏水标记物的偶联物在水溶液中保持良好溶解性，并且(2)当结合剂用来检测沉积的偶联物时，标记物更好地为结合剂接近。

根据本发明，在氧化还原酶的底物和标记物之间的交联剂L(例如Y-头和Z-尾之间)是这样的分子，其含有至少30个连续原子，如30-150个原子或更多，例如30、45、60、90、150、300、500个原子或更多的链。在一个优选的实施方式中，优选地，L含有150个连续原子。在一些实施方式中，交联剂分子含有原子直链，其中每两个相连的碳原子之后跟随氧或氮原子。

在一个优选的实施方式中，L可以是单个线性聚合物分子；在其它的优选实施方式中，L可以是可以含有偶联在一起的几个不同聚合物的偶联物分子。

在一个优选的实施方式中，L是含有原子链的线性聚合物，其中两个连续的碳原子之后跟随选自氧或氮的杂原子，例如如含有如下所述或聚乙二醇等的交联剂。

在另一个的优选实施方式中，交联剂是含有两个或更多下式(III)重复的化合物

其中R₁和R₂选自NH和O，R₃选自甲基、乙基、丙基、CH₂OCH₂和(CH₂OCH₂)₂，其中不超过3个连续的重复的乙氧基。

优选地，L含有至少两个上述式的重复，其中R1和R₂为NH并且R₃是CH₂OCH₂。优选地，L含有一个或更多个下式(IV)的重复

其中n是从1至10的整数，(B)是分支点。该式的分子及其合成在WO2007/015168中详述，所述专利因而通过引用的方式并入。

术语“分支点”意指聚合物分子中的一个点，在该点上可以连接分支(例如同样的聚合物的支链)或其它分子。该分支点可以是化合物Y和Z可经其与L直接或间接偶联的原子、原子团或官能团。

存在种类繁多的可以用作交联剂L的聚合物分子。例子包括多糖，如葡聚糖、羧基甲基葡聚糖、葡聚糖聚醛、羧基甲基葡聚糖内酯和环糊精；支链淀粉(pullulan)、裂裥菌素(schizophyllan)、硬葡聚糖(scleroglucan)、黄原胶、胶凝糖、O-乙基氨基半乳甘露聚糖、壳多糖和壳聚糖，如6-O-羧基甲基壳多糖和N-羧基甲基壳聚糖；衍生化纤维素、如羧甲基纤维素、羧基基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、6-氨基-6-脱氧纤维素和O-乙基胺纤维素；羟化淀粉、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉、角叉胶、藻酸盐和琼脂糖；合成多糖，如聚蔗糖和羧甲基化聚蔗糖；乙烯基聚合物，包括聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(马来酸酐)、聚(丙烯酰胺)、聚(乙基-共聚-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯醇-共-氯乙酸乙烯酯)、氨化聚(乙烯醇)及其嵌段共聚合物；含有聚合物主链的聚乙二醇或聚丙二醇或聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)，包括线性、梳形或超支化聚合物和树状物，包括分枝的PAMAM-树状聚合物；聚氨基酸，包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氨酯、聚(乙烯亚胺，pluriol；蛋白质，包括白蛋白、免疫球蛋白和病毒样蛋白(VLP)和多核苷酸、DNA、PNA、LNA、寡糖核酸和寡糖核酸树状物结构；混合聚合物，即由前述聚合物、共嵌段共聚合物和无规共聚合物的例子中一种或更多种构成的聚合物。

可以调节所选择的聚合物的特性以实现最佳性能，例如长度或分支可最优化。进而，聚合物可以化学地改性来携带各种取代基。取代基可以进一步被化学保护和/或活化，从而允许聚合物进一步衍生化。

在一个优选的实施方式中中，氧化还原酶底物和标记物之间的交联剂化合物是葡聚糖聚合物或含有葡聚糖聚合物的偶联物分子。

聚合物与不同化学物质(例如标记物)偶联的方法是本领域所熟知的并且可用于产生本发明的偶联物。例如，聚合物可以用乙烯砜(vinylsulfon)活化并与可检测标记物和式(II)的分子混合，以形成聚合偶联物。在其它实施方式中，醛可以用来活化聚合物，例如葡聚糖，然后与可检测标记物和式(II)的分子混合。产生聚合偶联物的又一种方法是使用所谓“化学选择性偶合路线(chemoselective coupling scheme)”以将诸组分偶合在一起，例如，分子可以用硫醇反应性马来酰亚胺基衍生化，然后与硫醇修饰的聚合主链共价偶合。在一些其它实施方式中，式(I)的分子和可检测标记物可以经连接化合物与聚合物连接。该方法的例子包括使用同型双官能性交联剂化合物，如戊二醛、己烷二异氰酸酯、二甲基乙二酰亚胺(dimethylapimidate)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、异型双官能性交联剂(cross binder)，例如N-γ-马来酰亚胺丁酰氧琥珀酰亚胺酯(N-γ-maleimidobytyroloxysuccinimide ester)，和零长度交联剂，如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺。

使含有一个或更多个式(III)(以后称为“L30”)重复的聚合物衍生化的方法在WO2007/015168中详述，所述专利因而通过引用的方式并入。

实施例中描述了含有交联剂的示例性偶联物，其中所述交联剂是含有各种数目的式(III)重复的聚合物，如含有2个L30重复(称为L60)的聚合物、如含有三个L30重复(称为L90)的聚合物、如含有5个L30重复(称为L150)的聚合物。

第二底物在水介质(ii)中的量可以从约10^-10M至约10^-4M变动，例如，在偶联物(如上述的任何一种)含有放射性标记物的情况下，可用的量可以是约10^-10M至约10^-6M，并且在偶联物含有荧光标记物或作为特异性结合对之成员的标记物时，则是约10^-9M至约10^-4M。

孵育介质

在一个实施方式中，含有单个靶单位的样品在本发明可视化方法期间在不同的水介质(这里总称为“孵育介质”)中孵育。

本文中，术语”孵育介质”意指其中在特定的时间期间(这里称为“孵育时间”)保持样品以实现所希望反应结果的水溶液。

在孵育介质中保持/孵育样品的时间，即孵育时间，可以根据孵育后所希望达到的技术效果变动。在不同的实施方式中，孵育可以持续大约3秒至大约3分钟，例如约10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟或更长，例如1-2小时、整夜。在一个实施方式中，在本方法全部步骤的孵育时间可以是相同的持续时间，即，每一孵育可以持续5至10分钟等。在含有结合剂的水溶液(以后称为“结合剂溶液”)中的另一样品可以持续1-3分钟，在水介质(i)和/或水溶液(ii)介质中的孵育可以持续10分钟。

孵育可以在各种温度下进行，这取决于靶、结合剂等的类型。本发明的方法基本上与温度不相关并且可在约+4℃至约+40℃的温度进行，然而，如果需要，温度可以用来延长或缩短孵育的持续时间，例如低温可以用来延长孵育时间，相反，高温可以用来缩短孵育时间。

以下讨论孵育介质的组成的非限定性实施方式。

结合剂介质

在本发明方法的步骤(a)，样品与一种或多种上述的结合剂孵育。相应地，在一个实施方式中，本发明涉及含有结合剂(例如含有具有氧化还原酶活性的酶的结合剂)的水溶液。在这里，该介质称为“结合剂介质”。

一种待因样品在此类介质中孵育而实现的想要的技术效果是形成本发明的靶位点。相应地，结合剂介质是水介质，其中所选择的结合剂是可溶性的，并且能够与单个靶单位结合。基本上，结合剂介质是一种或多种结合剂的缓冲水溶液，其具有4至9范围内的pH值。在一些实施方式中，结合剂介质可以含有有机或无机盐。无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵。有机盐可以选自例如醋酸钠、醋酸铵或咪唑盐，例如咪唑盐酸盐等。

盐在结合剂介质中的量可以是大约10^-3M至饱和，例如大约20mM至大约200mM，或大约50mM至大约500mM。在一个优选的实施方式中，介质可以按大约10mM至500mM的量含有盐。在其它的优选实施方式中，介质可以不含盐。

如上所述，一般，结合剂介质的pH值可以是约4至约9，如pH3.5和pH9.5之间，例如pH5和pH7之间，pH5.5和pH6.5之间或pH6.5和7.5之间，或pH7和pH8之间，或pH7.5和pH8.5之间，或pH8和pH9。可以使用具有合适缓冲容量的任何缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)和咪唑缓冲液。其它的合适缓冲液可见于Good，NE.等(1966)，生物研究中的氢离子缓冲液(Hydrogen ion buffers for biological research)，Biochem.5(2)，467-477。介质的pH值对于结合剂与靶结合是重要的；它可以根据结合剂和靶的性质优化。

在一些实施方式中，结合剂介质可以含有有机改性剂(术语“有机改性剂”意指任何非水溶剂)，例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇和二乙二醇、环丁砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。有机改性剂的量可以从约1％至约20％(v/v或w/v)改变，或在一些实施方式中，高于20％。

在一些实施方式中，结合剂介质可以含有去垢剂，例如聚二乙醇-对-异辛基苯醚(NP-40)或表面活性剂(例如选自基于聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween)的表面活性剂，或基于嵌段共聚物(pluronic等)的表面活性剂等。去垢剂的量可以从约0.001％至约5％(v/v或w/v)变动。

在一些实施方式中，结合剂介质可以含有结合剂稳定剂，例如牛血清白蛋白或葡聚糖。稳定剂的量可以从0.01％至20％(w/v)变动。

在一些实施方式中，结合剂介质可以含有离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟苯乙酸型螯合剂(EDHPA)等)。螯合剂的量可以从约10^-9M至约10^-6M变动。

在一些实施方式中，结合剂介质可以含有一种或更多种封闭剂用于饱和非特异性结合位点，即不含有靶的固体支持物位点。适合不同的实施方式的封闭剂的非限定例子可以是Denhard溶液、牛血清白蛋白、脱脂乳等。

如上所述，本发明构思了种类庞杂的靶、结合剂和分析模式种类，相应地，结合剂介质的组成可以变动并且应当利用本领域的知识，针对每个具体实施方式进行调整。结合剂介质的一些非限定例子在实施例中描述。

在一个实施方式中，当样品含有以低浓度范围存在的靶时，可优选使用结合剂介质中相对高量的结合剂，其中优化所述结合剂介质的内容(例如pH、盐浓度等)和孵育条件(例如孵育的持续时间、温度)以促进结合剂和靶之间的相互作用。这种优化旨在保证最大数目的单个靶单位与结合剂结合并形成最大数目离散的单个靶位点。在这个实施方式中，由于靶在样品中低表达，不期望单个靶位点之间明显数目的重叠。

在一个实施方式中，当样品含有以低浓度范围存在的靶时，可优选使用结合剂介质中相对高量的结合剂，其中优化所述结合剂介质内容(例如pH、盐浓度等)和孵育条件(例如孵育的持续时间、温度)优化以促进结合剂和靶之间是相互作用。这种优化旨在保证最大数目的单个靶单位与结合剂结合并形成最大数目离散的单个靶位点。在这个实施方式中，由于靶在样品中低表达，不期望单个靶位点之明显数目的重叠。

在一个优选的实施方式中，调节结合剂在结合剂介质中的数目来结合样品中存在的全部或基本上多数的可及单个靶单位，并与之形成离散的单个靶位点。

在另一实施方式中，当靶在样品中大量表达时，将调节一种或多种结合剂(例如第一、第二和/或第三结合剂)在介质中的量，从而使结合剂仅与样品中单个单位的部分亚群体能形成离散的单个靶位点。或者，在此类实施方式中，可以调节结合剂介质的组成如pH、盐含量等，或孵育条件如温度等，从而它们影响靶结合参与形成单个靶位点的一种或多种结合剂的能力，并且结合剂因此仅与样品中存在的单个靶单位的部分亚群体形成靶位点。

因此，在一个实施方式中，含有大量表达或处于宽泛的动态浓度范围内的靶的样品在下述条件下于结合剂介质中孵育，在所述条件中结合剂能够与单个靶单位的部分亚群体群体形成离散的单个靶位点。本文中术语“部分亚群体”定义为等于或少于99％的总群体的部分。例如等于或少于样品中单个靶单位的总量的90％，如少于85％，例如样品中单个靶单位的总量的75-80％，如少于75％，例如样品中单个靶单位的总量的1％至50％，如样品中单个靶单位的总量的1％至25％等。在一个实施方式中，可以调节孵育条件，从而使结合剂与单个靶单位的部分亚群体形成离散单个靶位点，其中所述的部分亚群体少于样品中单个靶单位的总量的1％，如约0.1％至约1％。

水溶液(i)

在结合剂介质中孵育之后，样品在水溶液(i)中孵育，其中所述水溶液(i)含有具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物以及过氧化物化合物。

任选地，在水溶液(i)中孵育之前，样品可以在水溶液(ii)中孵育，其中所述水溶液(ii)是缺乏第二底物的水溶液(i)。

相应地，在一个实施方式中，本发明涉及作为水溶液(i)的孵育介质，在另一实施方式中，本发明涉及作为水溶(ii)的孵育介质。

水溶液(i)和水溶液(ii)均可以是具有合适缓冲容量的水缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液(PBS)和咪唑缓冲液。其它合适的缓冲液可以在Good，NE.等(1966)，生物研究中的氢离子缓冲液(Hydrogen ionbuffers for biological research)，Biochem.5(2)，467-477中找到。溶液的pH值可以调节以实现孵育的技术效果，即在本发明的离散单个靶位点处形成具有氧化还原酶活性的酶的第二底物的离散沉积物，例如调节至约4至约9的pH范围，然而，水溶液(i)和(ii)的pH对于孵育的技术效果是不重要的。

水溶液(i)和水溶液(ii)均可以还含有有机盐或无机盐。

无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵等。

有机盐可以选自例如醋酸钠、醋酸铵或咪唑盐，例如咪唑盐酸盐等。

盐在水溶液(i)和水溶液(ii)中的量可以从大约10^-3M至饱和变动，例如大约20mM至大约200mM，或大约50mM至大约500mM。在一个优选的实施方式中，介质可以按大约10mM至500mM的量含有盐。在其它的优选实施方式中，介质可以不含盐。

在不同的实施方式中，水溶液(i)和水溶液(ii)都可进一步含有：

(i)有机改性剂和/或

(ii)酶增强剂，和/或

(iii)铁螯合剂，和/或

(iv)去垢剂，和/或

(v)抗微生物剂

有机改性剂可以在介质中以约1％至约20％(v/v或w/v)的量存在，然而，在一些实施方式中，可能需要更高浓度的有机改性剂。有机改性剂可以是例如聚乙二醇(PEG)。其它例子包括但不限于选自基本上由C1-C4醇即低级醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇和二乙二醇、环丁砜，N,N-二甲基甲酰胺(DMF))组成的组中的有机改性剂。在一些实施方式中，可以有利地使用聚乙二醇(PEG)，例如PEG2000，或丙二醇。聚乙二醇在介质中的量在这些情况下可以从约0.1％(v/v)至约20％(v/v)变动，例如约1％(v/v)至约15％，如5-10％(v/v)。

术语“酶增强剂”意指增强过氧化物酶催化活性的任何化合物。此类酶增强剂可以选自基本由苯硼酸衍生物和二价金属离子(如镍或钙)组成的组。酶增强剂的量可以从约10^-7至约10^-3M变动。

铁螯合剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二胺羟苯乙酸型螯合剂(EDHPA)。铁螯合剂的浓度可以从约10^-9至约10^-6M变动。

去垢剂可以选自聚乙二醇-p-异辛基苯基醚(NP-40)、选自基于聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween)的表面活性剂中的表面活性剂，或基于嵌段共聚物(pluronic等)的表面活性剂。去垢剂的浓度可以从约0.001％至约5％变动。

水溶液(i)的基本组分是具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、所述酶的第二底物和过氧化物化合物。

上文详细讨论了第一底物和第二底物的实施方式。

在一个优选的实施方式中，第一底物可以是3,3′-二氨基联苯胺(DAB)或其衍生物。在另一个的优选实施方式中，第一底物可以是阿魏酸或其衍生物。

水溶液(i)中第一底物的量可以根据选择作为第一底物(参见上述讨论)的化合物来变动。例如，在选择DAB作为第一底物时的实施方式中，DAB在水溶液(i)和水溶液(ii)中的量少于1.4mM，优选地少于1.2mM，优选地少于1mM，如约0.005mM至约0.5mM，例如约0.3mM，或约0.2mM，如约0.15mM等。在使用阿魏酸作为第一底物时的实施方式中，所述化合物的量少于2.5mM，优选地少于2mM，例如约1.5.mM。术语“约”在本文中意指+/-0.05-0.5mM。

水溶液(i)可以含有各种量的酶的第二底物，如约10^-10M至约10^-4M。例如，在第二底物(如上讨论的任何一种)含有放射性标记物时的实施方式中，适用的量可以是约10^-10M至约10^-6M范围。在其它实施方式中，例如，此时第二底物含有荧光性标记物或标记物是特异性结合对的成员，该量可以是约10^-9M至约10^-4M范围。

在一个实施方式中，水溶液(i)可以含有第二底物的相同偶联物分子的群体。在另一实施方式中，水溶液(i)可以含有第二底物的不同偶联物分子的群体。

本发明的优选的过氧化物化合物是过氧化氢，然而，在不同的实施方式中也可以使用其它的过氧化物化合物，例如在一些实施方式中，可以优选有机过氧化物，如例如叔丁基过氧化物、二叔丁基过氧化物、过乙酸等，或在一些实施方式中，它可以是过氧化氢的加合物，如过氧化氢脲加合物。

过氧化物化合物在水溶液(i)和水溶液(ii)中的量可以不高于5mM，优选地少于5mM，优选地在0.1mM至5mM范围，例如在0.1mM和1mM之间，在1mM和2mM之间，在2mM和3mM之间，或在3mM和4mM之间，优选在约1mM至约2mM之间的范围，如约1.5mM。术语“约”在本文中意指+/-0.05-0.5mM。

本文中，含有具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、所述酶的第二底物和过氧化物化合物的水溶液(i)称为“沉积介质”。

水溶液(ii)可以按与水溶液(i)相同的量含有相同的化合物，除了水溶液(ii)不含有具有氧化还原酶活性的酶的第二底物之外。

在一些实施方式中，含有单个靶位点的样品可以首先在水溶液(ii)中孵育，然后再在水介质(i)中孵育。

在另一实施方式中，含有单个靶位点的样品在水溶液(i)中孵育，不在水溶液(ii)中预孵育。

根据本发明，沉积介质是稳定溶液，即在相对长的时间段内溶解的化合物不沉淀，如至少5小时。为了延长介质的保质期，可以采用将介质保存在低于+20℃的温度，例如在+4-+10℃和/或添加抗微生物化合物至介质。抗微生物化合物可以是通常用于此目的的任何抗微生物化合物，例如叠氮化钠、Proclin^TM或

检测介质

在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其包括在步骤(b)之后的一个或更多个以下步骤，它们包括检测在单个靶位点处的第二底物的离散单个沉积物，例如含有第二底物的离散沉积物的样品可以在孵育介质中孵育，其中所述孵育介质含有能够与第二底物的沉积分子的可检测标记物特异性结合的结合剂。

含有能够与第二底物沉积分子的可检测标记物特异性结合的结合剂的孵育介质一般具有与上述讨论的结合剂介质相似或相同的组成。

在一个实施方式中，与沉积的第二底物的可检测标记物结合的结合剂可以含有酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。此类结合剂可以使用标准可视化系统来检测，所述的标准可视化系统应用所述酶的生色底物，例如酶底物溶液或显色溶液。这类介质可以是本领域已知的任何适合介质，所述介质将根据可用于可视化的手段并遵循涉及沉积物的可检测标记物的性质的本领域公知常识普来选择。这种检测的非限定例子在实施例中描述。

可替代地，在结合剂含有HRP的情况下，本发明的可视化方法可以含有样品孵育的又一步骤，其中所述样品含有与上述沉积介质中的所述结合剂结合的第二底物的离散沉积物。这个又一步骤可以在一些实施方式中是有利的，此时与沉积的第二底物相关的信号可能弱或初级沉积物的尺寸相对小。额外的沉积步骤允许进一步放大与所述沉积物相关的信号，并且它也可以增加单个靶位点处的可检测沉积物的尺寸。进而，该步骤还允许调整可检测信号的特征，例如改变信号的频谱特性，例如，可检测为红色信号的初始标记物可以通过下述方式替换为可检测为绿色信号的标记物：使用含有用于这个额外沉积过程的所述绿色标记物的偶联物分子，而非含有用于初始沉积过程(在该方法的步骤(b)使用)的红色标记物的偶联物分子。不过，本发明方法的这种灵活性并未对用于额外检测步骤的试剂增加额外复杂性，因为本方法的步骤(a)和(b)(如上讨论)的孵育介质的全部实施方式均可以成功地使用，而没有实质修改这些附加步骤。

在一个实施方式中，本发明涉及洗涤介质，即孵育的技术效果已经发生后用于从样品中去除(孵育介质的)剩余化合物的介质。本发明的方法可以含有一个或更多个洗涤步骤，一般在介质中孵育样品的上述步骤之后，例如在步骤(a)和(b)之间等。一般地，洗涤介质将是在洗涤步骤之前的步骤中已经用于孵育样品的相同介质，但是没有该孵育介质的基本化合物，即没有结合剂、酶的底物等。

在一个实施方式中，本发明涉及用于猝灭内源氧化还原酶活性的介质。这类介质可以是本领域中用于此目的的这类任何介质，例如过氧化氢溶液。该介质可以在本方法的步骤(a)之前使用。它也可以在步骤(b)之后和检测沉积的第二底物的额外步骤之前使用。该介质在所述方法的这个阶段的应用可以用于猝灭样品中残余的氧化还原酶活性。

第二底物的离散沉积物

惊奇地发现，使用沉积介质的特定条件，所述沉积介质含有具有氧化还原酶活性的酶的第二底物的特定偶联物分子和相对低量的具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、过氧化物化合物(如DAB和过氧化氢)，可以在本发明的单个靶位点处形成所述偶联物分子的离散沉积物，其具有明显的物理特性，即直径大于0.4微米的圆形沉积物，这可以通过使用常规显微镜光学直接观察或可视化为清晰点。通过使用相似的放大系统(所述放大系统应用HRP-DAB介导的可检测偶联物分子沉积法，详见WO2009036760、WO2010094283和WO2010094284)，已经可以改善传统的HRP-DABIHC染色，在于靶染色的均质颜色图案已经变得更明晰，从而改善细胞结构(例如细胞膜、细胞质和细胞核)的胞内分辨率。取而代之，本发明的可视化系统提供靶染色的点状图案，其中一个单点对应一个独自的靶单位，如一个独自的靶分子，因而产生独自单个靶单位如单个靶分子的胞内分辨率。

由本发明方法产生的本发明可检测偶联物分子的沉积是三维的，并且基本上是球形，其在二维视野中，例如显微视野中，被观察为清晰的基本上圆的点。因此，术语“圆点”(这里可与术语“点”和“清晰点”互换)”在本文中意指本发明的可检测偶联物分子的球形沉积物，在二维视野中被观察为清晰的基本上的圆点。术语“清晰的”在本文中意指本发明的点是肉眼或心力可区分为离散的。术语“基本上的圆”意指本发明的清晰点具有大约或少于0.65的偏心率。本发明点具有大约或大于0.4微米的直径。术语“大约”在本文中意指+/-0.05-0.5微米。相比之下，用传统DAB-HRP方法获得的DAB着色剂沉积物的点，或由WO2009036760、WO2010094283和WO2010094284的方法在靶位点处获得的着色剂的单个沉积物，或通过CARD方法获得的生物素-酪胺酰胺沉积物和荧光素基-酪酰胺(fluorescyl-tyramide)沉积物具有在常规显微光学系统(如亮视野或荧光光学系统的4x或10x放大率)的分辨率限值以下的尺寸，即，少于0.1微米。相应地，不可能在低放大率显微视野(如4x或10x)下在直接观察由后者方法可视化的独自单个靶单位。本文描述的方法允许在单个靶位点处检测和可视化本发明的可检测偶联物分子的单个沉积，并且因而使用低放大率光学系统观察到样品中固定的单个靶单位。

术语(具有氧化还原酶活性的酶)的“第二底物的一个单个沉积”或(本发明的)“可检测偶联物分子的一个单个沉积”涉及第二底物的多个偶联物分子的单个累积。根据本发明，本发明第二底物的一个清晰沉积物可以含有约1000个和多至1000000个偶联物分子或更多。

如上所述，在单个靶位点处沉积的第二底物可以含有视觉上可识别的分子，例如含有视觉上可检测的标记物，例如荧光标记物。相应地，在一个实施方式中，第二底物的沉积点可以在该沉积物已经形成后由显微技术人员使用常规荧光显微直筒检测。含有标准显微光学系统不可直接观测的标记物(例如特异性结合对的成员)的报道分子的沉积物将根据本发明，使用至少一个额外检测步骤(例如如上所述的额外步骤(c))可视化。

可以控制点的数目、它们的尺寸和视觉外观。例如，在不同的实施方式中，可以产生特定尺寸和特定外观(例如特定颜色)的点。

在一个实施方式中，沉积物的尺寸和点的尺寸可以通过使用参与形成本发明靶位点(其含有不同数目的酶部分，本文中术语“酶部分”或“酶”意指具有氧化还原酶活性的酶)的结合剂来改变，例如每个结合剂的HRP数目。在另一实施方式中，点的尺寸可以通过沉积过程的持续时间控制。在另一实施方式中，点的尺寸可以由沉积介质的内容调节，如沉积介质中第一和/或第二底物或过氧化物化合物的量。

因此，在一个实施方式中，每个用于形成靶位点的结合剂分子的酶单位数目可以影响点的尺寸。发现点的尺寸可以与每个复合物(含有一种或多种结合剂和靶的一个单个单位)的酶部分数目直接相关：与使用相同但每个分子含有较少酶部分的结合剂所获得的点相比，用于形成靶位点的结合剂每个分子中含有更大数目的酶部分时，观察到更大的点(在其它都相同的沉积条件(即，相同的孵育时间，相同的沉积介质组成)下，

为了在本发明条件下产生对应于一个单个沉积的可视点，靶位点含有单个即一个酶部分就足够，例如参与形成靶位点的结合剂含有单个HRP部分；然而，在相同靶位点处存在两个或多个酶部分时的实施方式中，与该靶位点相结合的点大于第一种情况下的点。相应地，在一个实施方式中，与一个单个靶位点结合的结合剂可以含有一个单个的HRP部分，在另一实施方式中，结合剂可以含有两个或更多个例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个HRP部分。在一个实施方式中，每个结合剂的酶部分数目是至少2个，优选地3至10个，如4至8个部分。

惊奇地发现，使用其中每个分子的酶部分数目是至少2的参与形成本发明靶位点的结合剂，可以在其它相同的条件下，即可视化方法的相同条件下，能够产生大体相等大小的点。相应地，在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中含有固定靶的样品与一种或多种结合剂孵育，其中所述结合剂之至少一含有具有氧化还原酶活性的至少两种酶。因此，在这个实施方式中，独自的靶单位可以可视化为独自的基本上相同的点，即具有相同尺寸的点。在一个实施方式中，含有具有过氧化物酶活性的酶的结合剂的分子库可以是不均一的，在于所述分子中含每个分子不同数目的酶部分，如例如2和10个之间的分子，11和20个之间的分子等。在另一实施方式中，本发明涉及这样的方法，其中含有具有过氧化物酶活性的酶的结合剂的分子库中的每个分子含有每个结合剂分子基本上相同数目的酶部分，如每个结合剂分子1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12个等酶部分。

在另一实施方式中，点的尺寸由沉积介质中第一底物的量(例如由DAB的量)调节。可以形成大的点，即其直径等于或大于0.4微米，或等于或大于1微米，或等于或大于2或3微米，如4或5微米的点，其中沉积的报告子(每个点)的量不少于1000个分子，此时沉积介质中DAB的量(可视化方法的其它条件相同，即相同的结合剂、相同的报告子、相同数目的报告子、相同浓度的过氧化物、相同的孵育时间等)处于约0.01mM至约1mM范围内，例如0.05mM和0.75mM之间，如约0.075mM至约0.5mM之间，如约0.1mM，例如0.15mM，或约0.3mM，例如0.28mM等。当使用沉积介质中更高和更低的量的DAB时，可以观察到更小尺寸即小于0.4微米的点。

本发明偶联物分子的组分和结构影响所述分子待沉积为本发明第二底物(如上所述)的能力，并从而影响沉积物的尺寸和点的表观尺寸。另外，偶联物的标记物可以影响点的外观。例如，在偶联物分子含有荧光标记物时的实施方式中，标记物的荧光团的性质会影响点的外观，例如在相同条件下，含有丽丝胺(红色荧光团)的偶联物产生比含有荧光素(绿色荧光团)的偶联物更致密的点。另外，沉积介质中较高量的第二底物，在其它相同的条件下，可以导致较大沉积物的形成。

点的尺寸也可通过用于沉积第二底物的时间来调节。在沉积介质中较长的孵育时间允许在单个靶位点处沉积更大的量的的偶联物分子，从而增加单个沉积物的尺寸以及随后的单个点的尺寸。孵育时间从30秒增加到10分钟，在其它相同的条件下，即相同的结合剂、相同的介质等，可以允许酶产生可作为直径约5微米的点被观察到的沉积物。然而，进一步增加孵育时间没有增加单个沉积物的尺寸。然而，在沉积介质中较长时间的孵育不降低单个沉积的尺寸，并且，如果需要，可以使用较长的孵育时间，例如至多到20分钟或30分钟或更长。因此，在不同的实施方式中，本方法的沉积步骤的持续时间可以从约30秒至约20分钟变动，例如1、2、3、4、5、10或15钟等。在一个实施方式中，孵育时间可以是约30秒，在另一实施方式中，该时间可以是约2分钟。在一个实施方式中，优选偶联物分子在5-10分钟期间内沉积。

沉积介质中过氧化物化合物的量也可以用作调节报告子沉积物的尺寸和相应地调节点尺寸的因素。为了获得直径至多到5微米的单个点，沉积介质中过氧化物化合物(如例如过氧化氢)的量应当少于2mM，该量优选地不超过1.5mM。更高的量的过氧化物化合物导致形成更少尺寸的点。

上文讨论的全部因素在本文中称为“初级因素”，因为影响第二底物的初始即初级沉积物的形成。如上所述，此类初级沉积可以在沉积发生后立刻观察到，例如在第二底物的偶联物分子含有荧光标记物的情况下。在其它实施方式中，初级沉积物不是直接可观察的，然而，它们可以在沉积步骤之后的一个或更多个检测步骤(本文中称为“二级可视化方法”)中可视化，例如在偶联物含有作为特异性结合对的成员的标记物(例如半抗原)的情况下。次级可视化方法的几个因素也可以影响作为点的沉积物的可视尺寸和外观，从而增加本发明可视化系统的灵活性。这些因素相应地被称为“次级因素”。

含有作为特异性结合对的成员的标记物的报道分子的沉积物可以通过进行直接或间接衔接于沉积步骤之后的以下检测步骤(c’)和(c″)来可视化：

(c’)单个靶位点处含有第二底物的离散沉积物的样品与一种或多种能够与沉积的第二底物的可检测标记物直接或间接结合的结合剂孵育，其中所述结合剂的至少一种含有一个或更多个选自放射性、荧光性或发光性物质、特异性结合对的成员或酶中的可检测标记物，从而形成含有沉积的报告子和所述至少一种结合剂的复合物，

(c″)检测该样品中含有可检测标记物的结合剂，从而使沉积在一个或更多个独自的靶位点处的一个或更多个报告子可视化，并从而使样品中一个或更多个独自的的靶单位可视化。

本文中的术语“间接”意指在步骤(b)和(c’)之间可以存在一个或更多个可选步骤，例如洗涤步骤。通过使用识别结合剂的报告子，所述结合剂含有多个可以利用生色底物或荧光底物的酶部分(例如HRP或碱性磷酸酶(AP))(作为可检测标记物)，可以使沉积物“染色”并产生清晰的视觉可检测的点。在这种情况下，单个沉积物的原始尺寸可以通过产生定特尺寸的视觉可检测的清晰点“增加”或“减少”。在一个实施方式中，使用由HRP或其它氧化还原酶标记的结合剂以及沉积的最优条件(如上所述)，沉积步骤可以重复一次或多次，从而在每一重复后增加在单个靶位点处的可检测沉积物的尺寸。在另一实施方式中，使用由HRP或其它氧化还原酶标记结合剂以及沉积的次优条件(如上所述)，可以重复沉积步骤以产生较小尺寸的沉积物，相应地，较小尺寸的相应的可检测点。在一个实施方式中，可以使用下述偶联物分子作为第二底物来重复沉积步骤，其中所述偶联物分子与初级沉积中所用的偶联物分子不同，例如含有其它标记物，例如丽丝胺标记物，而非荧光素标记物。在其它实施方式中，可以优化沉积时间或沉积介质条件以在初级单个靶位点处产生较小或较大的次级沉积物。

因此，本发明的可视化方法包括灵活和强大的放大系统。双重调节(double regulation)系统提供额外的灵活性，这可以在一些实施方式中具有特别优势，例如在需要将大的初级级沉积物可视化为较小尺寸的点时的实施方式中。较小尺寸的点可以允许样品中更精准的靶单位定位，并且还可以允许检测更大的靶动态范围。

在需要检测两种或更多种不同靶时的实施方式中，或在靶以宽泛的动态浓度范围在样品中存在时的实施方式，或在初级沉积物产生微弱可检测信号时的实施方式等中，上述的双重调节也可以是受欢迎的。可视化和定量在样品中以宽泛的动态浓度范围存在的靶(即在样品中存在靶浓度梯度)可能是挑战性的。在该范围的最低端，靶位点相关的点数目可能不足以提供关于该靶在整个样品范围内存在的统计有效信息，而在该动态范围的最高端，单个靶单位的可视化可能因存在不能视觉上彼此独立区分的许多重叠点而受到挑战。使用上述初级和/或次级因素来降低与巨大初级沉积物相对应的点的表观尺寸可以允许克服这些问题并且可视化和定量在样品中以宽泛的动态范围存在的靶。

检测第二底物的初级沉积物的方法可以根据样品的类型、沉积的分子的特性等而不同。可以使用本领域中任何合适的方法，例如在组织学样品中，可以使用任何标准IHC染色法，例如HRP-DAB染色法检测沉积物，可以在其它实施方式等中使用ELISA可视化法或免疫印迹染色法。

检测样品中独自靶单位的方法的实施方式

以下是本发明方法的实施方式的非限定例子。

检测组织学样品中生物标记的单个靶分子的方法

在一个实施方式中，本发明的方法可以用于可视化单个靶分子，如组织学样品中生物标记的单个分子，其中所述方法含有以下步骤：

a)将推测含有生物标记的一个或更多个单个分子的样品与一种或多种结合剂孵育，其中所述结合剂的至少一种能够与所述生物标记的独自的分子直接结合，并且，其中所述结合剂的至少一种含有具有过氧化物酶活性的酶，从而形成一个或更多个靶位点，每一个单个靶位点含有生物标记的一个单个分子和一种或多种结合剂的复合物，其中所述结合剂的至少一种含有具有过氧化物酶活性的酶；

b)将推测含有一个或更多个(a)的靶位点的样品在水溶液中孵育，所述水溶液含有：

i)3,3’-二氨基联苯胺(DAB),

(ii)过氧化物化合物，

其中DAB的量是约0.1mM至约1mM，过氧化物化合物的量是约0.5mM至约2mM，

以及

(iii)偶联物分子的一个或更多个群体，其中所述偶联物分子选自由下述式定义的一组化合物：

(Y)n-L-(Z)m，

其中

Y是具有过氧化物酶活性的酶的底物，

Z是可检测标记物，

L是交联剂，以及

n是从2到150的整数，m是从1到150的整数，

从而在(a)的单个靶位点处形成所述报道分子的一个或更多个离散沉积物；并且，使样品中的所述单个靶位点可视化为清晰的单个点，并且，任选地，

c)使离散沉积物在单个靶位点处可视化为清晰的单个点；

从而使样品中的生物标记的一个或更多个单个分子可视化。

结合剂、偶联物分子、孵育介质(例如步骤(b)的水溶液)、可视化手段等的实施方式，如上讨论。

应当理解，可以使用以上讨论的氧化还原酶家族的另一种酶作为HRP的替代和除DAB之外的化合物作为第一底物。另外，可以使用适合作为本发明第二底物的其它化合物替代由上述式(Y)n-L-(Z)m定义的化合物。

在一个实施方式中，上述方法可以包括以上讨论的任何其它步骤。在一个实施方式中，该方法可以包括在任何步骤a、b或c之后的一个或更多个步骤。在另一个实施方式中，该方法可包括在任何步骤a、b或c之前的一个或更多个步骤。该方法可包括至少一个自动步骤，或还包括至少一个自动步骤。

在一些实施方式中，例如当生物标记在样品中大量表达时，或以宽泛的动态浓度范围表达时，可以优选，该样品与一种或多种结合剂孵育，其中所述结合剂在它们能够与单个靶分子的部分亚群体形成靶位点的条件下参与单个靶位点的形成。此类条件的实施方式如上讨论。

在其它实施方式中，例如，生物标记是低表达靶时，可以优选生物标记的基本上全部单个分子参与靶位点的形成。在这些实施方式中，优选将样品与一种或多种结合剂在最优条件下即在结合剂能够与全部可用靶单位形成靶位点的条件下孵育。

在一个实施方式中，靶是表皮生长因子受体(EGFR)或对应的核酸，特别是Her2受体或其编码核酸。

本领域已知作为疾病的生物标记的任何蛋白或其它生物分子、结构或分子复合物包括在本发明的范围内。特别地，本发明涉及癌的生物标记。

检测一种样品中至少两个不同固定靶的单个单位的方法

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于检测和可视化两个或更多不同的单个靶单位，例如一种和相同样品中两种或更多种不同生物标记的单个分子。

根据本发明，用于检测和可视化样品(例如组织学样品)中至少两种不同固定靶的单个单位的方法包括

将样品与一种或多种能结合第一靶的结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与第一靶的独自单个单位直接结合，

从而，与第一靶的独自单个单位形成一个或更多个离散的第一单个靶位点，其中每一单个离散的第一靶位点含有第一靶的独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有该酶；

b)根据上述方法(1)的步骤(b)(即权利要求1的步骤(b))所述将(a)的样品与结合于第一单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和过氧化物化合物孵育，从而在(a)的第一单个靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；

c)将(b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述量足以猝灭与(a)的第一单个结合位点结合的酶的残余活性；

d)将样品(c)与能够结合于第二靶的一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与第二靶的独自单位直接结合，

从而，与第二靶的独自单个单位形成一个或更多个离散的第二单个靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有第二靶的一个独自单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有该酶；

e)根据上述方法(1)的步骤(b)(即权利要求1的步骤(b))所述将(d)的样品与与结合于第二单个结合位点的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点处形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；

f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第一可视清晰点，从而检测到第一靶的一个或更多个独自单个单位；

g)在样品中将第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第二可视清晰点，从而检测到第二靶的一个或更多个独自单个单位。

在一个实施方式中，以上方法中的靶是不同的生物标记，例如不同的生物分子。在一个实施方式中，该靶是不同的核酸序列或不同的蛋白质分子。在一个实施方式中，第一靶可以是核序列并且第二靶可以是蛋白质分子，例如Her2受体和Her2相关的核酸序列。

在一个实施方式中，所述靶至少之一可以是生物标记并且至少另一种可以是参照标记，例如一种靶是Her2受体(生物标记)且另一种靶是细胞角蛋白(参照标记)。生物标记和参照标记的选择取决于样品，并根据相关现有技术中积累的知识来进行，特别在涉及疾病或其它生理状况的生物和参照标记时的实施方式中。

上述方法可以包括上文讨论的任何其它步骤。在一个实施方式中，该方法可以在任何步骤a、b或c之后包括一个或更多个步骤。在另一实施方式中，该方法可以在任何步骤a、b或c之前包括一个或更多个步骤。该方法可以包括至少一个自动步骤，或还包括含有至少一个自动步骤。

在一个实施方式中，样品是组织学样品。

在一个实施方式中，具有氧化还原酶活性的酶是HRP。在一个实施方式中，具有氧化还原酶活性的酶的第一底物是DAB。与HRP和DAB相关的实施方式可以是上文讨论的任何实施方式。在其它实施方式中，可以优选来自其它任何氧化还原酶的酶，例如选自上文讨论的酶。在其它实施方式中，第一底物可以从其它任何适合作为第一底物的化合物中优选，例如选自上文讨论的化合物。

用于检测不同的单个靶单位的任何群体的第二底物分子可以是例如上述的偶联物化合物。一些示例性化合物也在实施例部分中描述。第一群体的偶联物分子和第二群体的偶联物分子因它们所含的不同可检测标记物而不同。在另一实施方式中，第一群体的分子和第二群体的报道分子还可以因化合物的组分而不同，其中所述的化合物能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物。在其它实施方式中，所述分子还可以因其它特性而不同，例如偶联物分子的结构、具有氧化还原酶活性的酶的底物和标记物之间的交联剂的长度、可检测标记物的数目等。

第二底物分子的沉积步骤，即步骤(b)和/或(e)，可以根据上述的任何实施方式进行，例如，样品可以首先在含有具有氧化还原酶活性的酶的第一底物和过氧化物化合物的溶液中预孵育，并且然后在含有第一底物、第二底物和过氧化物化合物的组合的溶液中孵育。

在一个实施方式中，至少两种靶中至少一者以宽泛的动态浓度范围存在于样品中。

使一种样品中至少两种靶可视化的非限定例子可以是生物标记和参照标记的可视化。

检测以宽泛的动态浓度范围在样品中存在的固定靶的单个单位的方法

检测和可视化在样品中以宽泛的浓度范围存在的单个靶单位可以在该范围的最低端处是有挑战性的，原因是与噪音水平和遍及整个样品的假沉积物相比，形成非常少的提供统计有效信息的实际报告子沉积物，而在该范围的最高端，单个单位的可视化可以受不能在视觉上分开的重叠点的存在限制。相应地，可能有利的是，应用沉积两种不同报告子的至少两个独立步骤，其中第一报告子分子在位于靶单位大量存在的样品区域内的第一靶位点出沉积，且第二报告子的分子在位于靶少量存在的区域内的第二靶位点处沉积。

因此，根据本发明，用于检测和可视化样品中单个靶单位的方法(其中，靶存在于宽泛的浓度范围)包括：

a)将样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与所述靶的独自单个单位直接结合，

并与独自单个靶单位的第一部分亚群体形成一个或更多个离散的第一靶位点，其中每一单个离散的第一靶位点含有独自单个单位的所述第一部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中的至少一者含有具有氧化还原酶活性的酶；

b)根据权利要求1的步骤(b)所述将(a)的样品与同(a)的第一靶位点结合的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和过氧化物化合物孵育，从而在(a)的第一靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；

c)将(b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述量足以猝灭同(a)的第一单个靶位点结合的酶的残余活性；

d)将样品(c)与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与所述独自的靶单位直接结合，

从而与独自单个靶单位的第二部分亚群体形成一个或更多个离散的第二靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有独自单个单位的所述第二部分亚群体的一个独自单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有酶；

e)根据上述方法(1)的步骤(b)(即权利要求1的步骤(b))所述将(d)的样品与同第二单个靶位点相结合的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点处形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；

f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第一可视清晰点，从而检测到靶的第一群体的一个或更多个独自单个单位；

g)在样品中将第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第二可视清晰点，从而检测靶到的第二群体的一个或更多个独自单个单位。

在一个实施方式中，(a)和(d)的结合剂可以是相同的结合剂。在一个实施方式中，可以优选，步骤(a)中用于与靶的第一部分亚群体形成单个靶位点的结合剂的量少于步骤(d)中用于与靶的第二部分亚群体形成单个靶位点的结合剂的量。

在另一实施方式中，(a)和(d)的结合剂可以是不同的结合剂，例如两种不同的抗体结合剂、两种不同的核酸结合剂，抗体作为结合剂(a)并且核酸作为结合剂(b)、对靶具有不同亲合力的两种靶特异性抗体等。

在一个实施方式中，第一群体的报道分子和第二群体的报道分子因其含有的不同可检测标记物而不同。在另一实施方式中，第一群体的分子和第二群体的报道分子因化合物的组成而不同，其中所述化合物能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物。在其它实施方式中，所述分子可因其它特性而不同，例如偶联物分子的结构、具有氧化还原酶活性的酶的底物和标记物之间的交联剂的长度、可检测标记物的数目等。

样品中固定靶的定量

在一个方面，本发明涉及将样品中固定的靶定量的方法。可视化和检测本发明的单个靶单位的方法(上述)可以用于定量评价样品中、尤其组织学样品中此类靶的相对量。

在一个实施方式中，用于定量评价样品中固定靶(例如定量评价样品中生物标记表达)的方法可以包括：

a)根据本发明的一种方法处理样品，如

(i)权利要求1的方法(如以上文在使样品中固定靶的独自单位可视化的方法部分或检测组织学样品中生物标记的单个靶分子的方法部分所讨论；

(ii)权利要求36的方法(如上文在检测以宽泛的动态浓度范围在样品中存在的固定靶的单个单位的方法部分所讨论)；或

(iii)权利要求40的方法(如上文在检测一种样品中至少两种不同的固定靶的单个单位的方法部分所讨论的)；

b)定量样品中的清晰点；以及

c)评价样品中靶的量。

处理样品中本发明清晰点的定量可以在考虑到点的不同特性时，手工或自动地进行，例如因为点是对肉眼和精力可区分为离散，故可以将它们计数，其中计数的点的数目将指示样品中标记的表达水平，点的颜色特性可以用来区别和计数与一种样品中两种不同靶相关的点等。使用软件处理包含由本发明方法可视化的单个靶单位的样品的图像，可以基于不同特性，例如点的颜色特性、与单个点或与整个样品相关的信号的强度，点在样品中的相对分布等，作出靶表达的评价。

在一个实施方式中，计数可以手工地进行，即，由显微分析人员观察样品的显微视野，或由观察人员分析样品的数字图像。计数也可以使用本领域所开发的用于细胞图像处理的任何可用软件，例如CellProfiler软件，自动地进行。在实施例中描述样品中Her2的示例性定量。

在一个实施方式中，靶在样品中的量可以在没有任何参照下进行评价，例如评价为为样品中靶的相对量或单个靶单位的相对量。在另一实施方式中，靶的量可以在考虑参照标记时评价，例如相对于样品中每个特定生物分子或细胞结构、相对于每样品体积、相对于每样品面积等。

如上所述的方法特别有利于定量评价复杂组织学样品中的靶。相应地，在一个优选的实施方式中，本发明涉及定量评价组织化学样品中的靶。

使用本发明的方法，可以将组织学样品中的靶定量而无需使用任何参照标记，例如，特定体组织的样品可以通过使用这种参照如与靶对应的点数目进行表征，假定通过使用本发明的可视化方法正在处理这种特定组织的样品。在一个实施方式中，靶可以每次相对于样品体积、样品面积(即显微视野的面积或样品的数字图像的面积)来定量，根据生物靶的染色和染色结果的定量化。

诊断应用

评估生物标记(即，其表达具有诊断、病情预断或治疗学价值的标记)的表达日常用于作出或确认医学诊断或或用于预测治疗性疗法的结果，或用于监视疾病的发展。当这种评价基于分析复杂样品如组织学样品时，它具有相对价值，因为分析的结果强烈依赖于样品的定量、检测方法的灵敏度、表达水平的变化等，并且因而，评价相同患者的相同组织的一系列组织学样品中生物标记的表达可能产生非常不同的结果，并导致错误的假设和诊断，以及，作为结果，导致无效治疗。基于根据本文所述方法评估患者样品中所述标记的单个分子的含量而评价诊断性和治疗性标记的表达，可以提供更可靠的评价和无误差的医学诊断，并且进而提供靶导向的个性化疗法。

相应地，在一个实施方式中，本发明的方法可以用于诊断患者中的疾病，其中所述诊断包括根据本发明的任何方法处理从患者获得的生物样品的步骤。

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于评价治疗性疗法在患者中的功效，其中所述评价包括分析已经根据本发明的任何方法处理的患者样品。

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于提供医学预后，例如预测患者中疾病发展的风险后，或预测从疾病中康复或不能康复的可能性，其中，所述预后方法包括根据本发明的任何方法处理和分析从患者获得的生物样品的步骤。

在另一实施方式中，本发明的方法可以用于将患者针对治疗方案分类(stratification)，其中所述分类包括分析已经根据本发明的任何方法处理的患者样品。

该方法还可以用于监视疾病，例如疾病进展或改善，或还可以用于新药筛选过程，例如用于活体测定法中评估新药的治疗潜力等。

本发明的可视化方法可以在一般地用于以下应用(例如，流式细胞术(FC)、ELISA、组织化学(IHC和ISH)、印迹法等)的各种分析模式中使用。例如，在一个实施方式中，生物样品可以是细胞悬液。可以使用FC、ELISA、IHC或ISH，检测处于悬浮的细胞的靶生物分子或靶结构。当ELISA、IHC或ISH用于检测时，悬液的细胞将连接至固体支持，例如平板(ELISA)或载片(IHC)。在另一实施方式中，生物样品可以是体组织的样品，例如固定和石蜡包埋的肿瘤样品的切片。此类样品中细胞的靶分子或结构将一般地使用IHC或ISH来检测。

IHC和ISH模式通常在靶分子可视化之前需要一系列处理步骤，所述步骤可以对封装在用于显微检查或产生光学显微照片的合适固体支持物(例如，玻璃载片或其它平面支持物)上的组织切片进行，以通过选择性着染疾病状态的微生物学指示物或选择性检测生物标记来凸显。因此，例如在IHC中，样品首先从个体取得，然后固定并，并且随后使其仅暴露于与目的生物标记特异性结合的抗体。样品处理步骤还可以在根据本发明的可视化方法之前包括其它步骤，例如，它可以包括以下步骤：切割和修剪组织、固定、脱水、石蜡浸渍、切割成薄切片、封装到玻璃载片上、烘烤、脱蜡、再水化、抗原修复、封闭步骤等。可以用合适的缓冲液或溶剂例如磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS)、蒸馏水进行洗涤步骤。洗涤缓冲液可以任选地包含去垢剂，例如Tween20。所有这些流程均是实验室中熟知的常规流程。

两类组织学样品：(1)含有新鲜组织和/或细胞的制备物，一般不用基于醛的固定剂固定和(2)固定和包埋组织样本的制备物，通常是保藏的材料，均可以使用本发明方法处理。

固定和包埋组织样本的许多方法是已知的，例如，酒精固定和福尔马林固定以及随后石蜡包埋(FFPE)。

需要固定剂以按照可重复和和接近真实的方式保存细胞和组织。为了实现这一目的，将组织块、切片或抹片浸入固定液，或在抹片的情况下，进行干燥。固定剂稳定细胞和组织，从而保护其不受处理和染色技术的严苛影响。

可以使用任何合适的固定剂，例如乙醇、醋酸、苦味酸、2-丙醇、四盐酸盐二水合物、乙偶姻(单聚物和二聚物的混合物)、丙烯醛、巴豆醛(顺式和反式)、甲醛、戊二醛、乙二醛、重铬酸钾、高锰酸钾、四氧化锇、多聚甲醛、升汞、甲苯-2,4-二异氰酸酯、三氯乙酸、钨酸。其它例子包括福尔马林(甲醛水溶液)和中性缓冲福尔马林(NBF)、戊二醛、丙烯醛、碳化二亚胺、亚胺、苯醌、锇酸和四氧化锇。

新鲜活组织检查样本、细胞制片(包括触片和血液抹片)、用于免疫组织化学分析的冷冻切片和组织通常在有机溶剂中固定，所述有机溶剂包括乙醇、乙酸、甲醇和/或丙酮。

为了促进固定的组织中的特异性识别，经常需要通过样本的预处理修复或暴露靶，即目的生物标记，以增加多数靶的反应活性。这一流程称为“抗原修复”、“靶修复”或“表位修复”、“靶暴露”或“抗原暴露”。关于抗原修复(抗原暴露)的广泛的综述可以在Shi等人，1997，J Histochem Cytochem，45(3)：327中找到。

抗原修复包括使与特定检测试剂相互作用的靶的可用性最大化的多种方法。最常见的技术是在合适的缓冲液中用蛋白水解酶(例如蛋白酶、链蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或神经氨酸酶)的酶促消化，或使用微波辐射、水浴中加热、汽蒸器、常规烤箱、高压釜或加压蒸煮器在通常包含EDTA、EGTA、Tris-HCl、柠檬酸、尿素、甘氨酸-HCl或硼酸的合适pH稳定缓冲液中的热诱导表位修复(HIER)。可添加去垢剂至HIER缓冲液以增加表位修复，或添加至稀释介质和/或淋洗缓冲液以降低非特异性结合。

抗原修复缓冲液最常是含水的，不过也可包含其它溶剂，包括沸点高于水的溶剂。这允许在常压在高于100℃处理组织。

相应地，如果需要，可以通过不同的物理方法提高信噪比，包括使用真空和超声波，或在试剂孵育之前或期间冷冻和融化切片。

作为检测方法中的预检测步骤，可以内源除去生物素结合位点或内源酶活性(例如磷酸酶、过氧化氢酶或过氧化物酶)，例如，可以通过用过氧化物处理来除去内源生物素和过氧化物酶活性。可以通过用左旋咪唑处理除去内源磷酸活性。可以通过加热法破坏内源磷酸酶和酯酶。也可使用本领域已知的其它此类预处理方法。

在使用本发明的方法时，不需要封闭非特异性结合位点，然而，如果需要，可以使用本领域的标准方法进行封闭，例如用惰性蛋白质，如马血清白蛋白(HSA)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白、胎牛血清或其它血清，或可以使用去垢剂如Tween20、Triton X-100、Saponin、Brij或Pluronics。也可以使用特异性试剂的未标记和非靶特异性形式封闭组织或细胞中的非特异性结合位点。

也可使用自由漂浮技术制备样品和检测靶分子。在这种方法中，使组织切片在适容器(例如微量离心管)中以悬浮或自由漂浮状态与不同试剂和洗涤缓冲液接触。

使用例如“鱼钩状”装置、刮片(spatula)或玻璃环，可以将组织切片在染色程序期间在具有不同试剂和缓冲液的管与管之间转移。不同的试剂和缓冲液也可通过柔和滗析或真空抽吸更换。或者，可以将具有组织切片的容器倒空至专用染色网，如Corning“Netwells”(Corning)，并且将组织切片洗涤，随后转移回该管用于下一染色步骤。

在组织切片自由漂浮或托在网上进行，进行全部步骤，包括例如固定、抗原修复、洗涤、与封闭试剂孵育、免疫特异性试剂和氧化还原酶介导沉积。在报告子沉积后，将组织切片封装于载片上，检测报告子，载片用盖玻片覆盖，随后通过例如光学显微镜或荧光显微镜分析。

在一些实施方式中，按照本方法的流程(a)与免疫特异性试剂进行关键孵育后，将组织切片封装于载片上。对载片封装的组织切片进行其余的检测方法。

应用本发明方法的任何测定法可以包括一个或更多个自动步骤。在一个实施方式中，测定法可以包括手工检测，在另一实施方式中，测定法可以是全自动的，在另一实施方式中，测定法可以调节成半自动检测。

实施例

以下是公开的本发明的非限定性有效实施例。

简写

MBHA   4-甲基二苯甲基胺

NMP    N-甲基吡咯烷酮

HATU   2-(1氢-7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3四甲基脲鎓

        六氟磷酸盐；亚甲铵(methenamminium)

DIPEA  二异丙基乙胺(DiIsopropyl EthylAmine)

DCM    二氯甲烷

TFA   三氟乙酸

TFMSA 三氟甲基磺酸

Flu   荧光素

Dex   葡聚糖

HPLC  高效液相色谱法

equi.  当量

L30 1,10,16,25-四氮杂-4,7,13,19,22,28-六氧杂-11,15,26,30-四氧代-三十烷

L60，L90，L120，L150 不同的L30聚合物，含有2、3、4或5个L30重复

CIZ  2-氯Z＝2氯苄氧羰基

FITC  异硫氰酸荧光素

HRP  辣根过氧化物酶

GaM  羊抗小鼠抗体

DNP  2,4二硝基-氟苯(二硝基苯)

ACim  4-氨基-肉桂酸

LPR  液态永固红(Dako K0540)

Sin  芥子酸(4-羟基-3,5-二甲氧基二甲氧基肉桂酸)

Caf  咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸)

PNA-X 肽核酸低聚物(N-(2-氨基乙基)-甘氨酸)，含有与中心氮偶合的不同取代基

A  腺嘌呤-9-乙酸，

C  胞嘧啶-1-乙酸，

D  2,6-二氨基嘌呤-9-乙酸，

G  鸟嘌呤-9-乙酸，

Gs  6-硫鸟嘌呤9-乙酸，

P  2-嘧啶酮-1乙酸，

T  胸腺嘧啶-1-乙酸，

Us  2-硫脲嘧啶-1-乙酸，

Dpr  2,3二氨基-丙酸，

Phe  苯丙氨酸，

Tyr  酪氨酸，

Trp  色氨酸，

Lys  赖氨酸，

Cys  半胱氨酸，

betaala β丙氨酸，N,N二乙酸

FFPE  甲醛固定石蜡包埋

SMD  单个分子检测

交联剂 连体具有氧化还原酶活性的酶第一底物

报告子 具有过氧化物活性酶的第二底物

第二底物分子

表1：偶联物分子、其合成中的中间产物和对照构建体

不同的偶联物和其中间体化合物在本表的第三列中根据其合成方法大体按照复杂程度增加的顺序分类：

1.仅固相化学。

2.固相，然后一个溶液相步骤。

3.固相，然后两个溶液相步骤。

4.固相，然后两个溶液相步骤。

5.固相，后四个溶液相步骤。

6.在氨基和β丙氨酸酐中间体之间偶合的溶液相。

7.具有一个取代基的葡聚糖偶联物。

8.具有两个取代基的葡聚糖偶联物。

1.这一组包括从4种天然碱基和其它4种非天然碱的三荧光素标记的PNA-五聚体中制备的8个偶联物。(D18007-D18014)。存在具有5-6个酪氨酸和3个荧光素的4种酪氨酸偶联物：D18044、D18049、D18137和D18138，3个DNP替代了荧光素标记物。D18128和D18132各具有5个酪氨酸和3个荧光素，并且因而它们是有潜力的偶联物，尽管它们也包括用于进一步葡聚糖偶合的N端胱氨酸残基，从而使它们归入“中间体”组中。中间体进一步包括重要的半胱氨酸(D17127)和β丙氨酸(D17126)三荧光素交联剂，以及具有7个酪氨酸(D18084)或3个荧光素(D18085)的二氨基-丙酸交联剂。最终，用作对照的二荧光素小交联剂(D17161)也仅通过固相合成法制备。全部这些化合物背后的合成策略均简单：Boc-保护的单体是市售或自行制备，偶联物和中间体通过线性固相合成法制备，然后从树脂上由6:2:1:1的TFMSA:TFA:间-甲酚:硫代苯甲醚的混合物切下。为了最好的结果，使用全部单体的双偶合法。在固相上Fmoc-脱保护后，在赖氨酸侧链(和N-端，D17161)上引入荧光素。HATU活化的羧基-荧光素(混合的异构体)用于荧光素标记(在NMP中0.2M，持续3x20分钟)。用2,4-二硝基-氟-苯(在具有DIPEA的NMP中0.5M持续2x10分钟)进行DNP标记。

2.这一组包括在固相合成携带自由N-端氨基和自由赖氨酸侧链氨基的中间体后，在溶液相中用肉桂酸衍生物标记的大量偶联物。α-N-Boc-(ε--N-2-Cl-Z)-赖氨酸用来引入赖氨酸残基，从树脂上切下之后提供自由ε--N-氨基。溶液相标记法基本上是固相技术的延伸，其利用以下事实：相对高分子量的中间体可以从TFA或NMP溶液中用二乙醚几乎定量地沉淀。

3.从合成的观点考虑，这一组中间体代表更高程度的复杂性。固相合成和溶液相标记如1和2那样进行，然后进行溶液相Fmoc-脱保护的额外步骤。通过将Boc-L30交联剂与Boc-2ClZ和Boc-Fmoc-赖氨酸结合，中间体与保护的(Fmoc)赖氨酸侧链和自由N-端和其它赖氨酸侧链自由氨基组合在一起(在树脂切割期间从N-端Boc和2-ClZ赖氨酸残基)。这些中间体可以如2中那样用阿魏酸在溶液中标记。然而，在用乙二胺的清洗步骤之前，进行5％乙醇胺的额外5分钟清洗步骤。这一额外清洗步骤在用乙二胺的Fmoc脱保护之前失活氨基反应性种类。在没有这个额外步骤时，乙二胺对Fmoc-基团的脱保护快于它使HATU活化的阿魏酸失活，并且，Fmoc“保护的”氨基变成被阿魏酸标记。具有自由氨基的这个组包括D17120(6个阿魏酸)D17093(与PNA主链结合的5个阿魏酸)、D17138(阿魏酸之间的L90-交联剂)D17139(处于三个密切对子的6个阿魏酸)、D17104(阿魏酸之间的甘氨酸间隔体)D17192(具有替代阿魏酸的6个7-羟基香豆素)、D18019(在最接近的阿魏酸和自由氨基之间延伸的L270交联剂)、D18080(具有L90间隔的3个自由氨基)。

4.从具有6个阿魏酸和3个自由氨基的中间体D18080，通过进一步溶液相标记，制备了2种偶联物。D18081具有3个得克萨斯红-X，D18096具有3个7-羟基香豆素。这说明了如何在溶液中用两种不同的取代基标记偶联物。优点在于中间体D18080可以在最终标记之前纯化，一个在使用不稳定或昂贵的标记物如德克萨斯红时的优点。

5.D17152的合成显示固相合成化学的程度，所述的固相合成化学可以适用于溶液中交联剂，之后用二乙醚反复沉淀以去除低分子量反应物和溶剂：在固相上制备NH2-Lys(NH2)-(L30-Lys(NH2))4-L30-Lys(Fmoc)并从树脂上切下。Boc-L30交联剂随后在溶液中与6个自由氨基偶合。该中间体在TFA的5％间-甲酚中沉淀和溶解两次。然后，对目前的L30延伸的氨基如2那样进行阿魏酸标记，然后，如3中那样用乙醇胺和乙二胺清洗并最终如1中那样进行3次TFA沉淀。

6.在氨基取代的中间体和“β丙氨酸酐”活化的中间体之间进行片段偶合。具有3个荧光素的D17126还携带N-端β丙氨酸-N,N-二乙酸。通过活化(NMP:二异丙基碳化二亚胺:吡啶；88:10:2)10分钟，形成可用于偶合至氨基的环状“β丙氨酸酐”。这导致从D17120形成D17134(具有L30间隔的6个阿魏酸)，从D17139形成D17148(带有L30间隔的处于3对的6个阿魏酸)，从D17152形成D17156(6个L30延伸的阿魏酸)以及从D17192形成D18003(具有6个7-羟基香豆素)。此类片段偶合的优点在于中间体在偶合前被HPLC纯化，形成巨大和复杂、却相当纯的偶联物。另一优点在于单个中间体如D17126可以用于产生一系列相关但不同的偶联物。

7.具有单个取代基的葡聚糖偶联物包括仅有荧光素的对照D17132、D18130和D18088(均是经半胱氨酸偶合来自D17127的Dex70偶联物)、D17162(来自D17127的dex270偶联物)和D18086(来自D18085、通过二氨基丙酸的更低效偶合)。这些偶联物用作对照，以证明仅有荧光素的偶联物不起作用。通过将多个中间体偶联物偶合到葡聚糖，也以这种方式产生偶联物。这些偶联物包括D18133(具有L30间隔的酪氨酸-荧光素的dex70偶联物D18132)和D18130(具有酪氨酸-荧光素dex70偶联物D18128)。将单个偶联物与HRP底物和标记物同时偶合的优点在于确保两种取代基之间的固定比例。

8.具有两种不同取代基的葡聚糖偶联物包括D17130、D18077、D18079、D18090、D18122和D21008，这些偶联物均是具有6个阿魏酸交联剂D18074和三荧光素交联剂D17127(或交联剂的复制物)的dex70。在具有约100个阿魏酸和70个荧光素的D17130、D18077、D18079和D21008之间存在良好的重复性，而D18122以进一步过量的荧光素交联剂偶合以产生具有约100个阿魏酸和100个荧光素的偶联物。D17128近似于D17130，但所用的阿魏酸交联剂(D17093)具有与PNA主链而不与赖氨酸侧链相连的阿魏酸。偶联物D18031也近似于D17127，但具有L270延伸的阿魏酸交联剂D18019。此类偶联物是使阿魏酸更易于接近HRP酶的一项尝试。

所选择的化合物合成程序的实施例

D19185：在固相上制备Boc-(Lys(2-Cl-Z))3-L150-Lys(Fmoc)。去除Fmoc基，然后如上所述进行荧光素标记。从树脂上切下后得到中间体NH2-((Lys(NH2))3-L150-Lys(Flu)。将它用二乙醚沉淀，在TFA中溶解，沉淀，随后在NMP中溶解，并用DIPEA调成碱性。该溶液与NMP中被HATU和DIPEA活化的等体积0.2M阿魏酸混合。10分钟后完成标记，并且通过添加乙二胺至10％的浓度，进一步“清洗”粗产物5分钟。用二乙醚沉淀后，产物进一步在TFA中溶解并用二乙醚沉淀，计三次，以除去低分子量碎片。在用乙二胺“清洗”前，质谱显示两种加合物(及其组合)：+(176)n表明额外的阿魏酸(以其它阿魏酸和荧光素的酚酯)和+98(N,N’-四甲基脲鎓加合物，同样地在脱保护的酚基上)。它们都通过乙二胺处理彻底除去，并且将活性酯和阿魏酸低聚物同样分解。

D19185的合成示于图1中。

以下荧光素-阿魏酸偶联物根据这一方案制得：D17157、D17158、D19112、D19185、D18015、D20086、D20118、D20120、D19037和D18157(在下文描述这些偶联物中一些的详细合成)。具有其它标记物的阿魏酸偶联物包括：D19048(用丽丝胺标记)、D19059、D18141和D19040(用DNP标记)。以芥子酸替代阿魏酸的偶联物也通过相同的方法制备，并且包括具有荧光素标记物的0328-018和D21028以及用DNP标记的D21048。D21020具有3个咖啡酸和荧光素，D18146具有6个4-氨基-肉桂酸和3个荧光素，并且它们均通过相同的方法制备。

D17158MBHA树脂用Fmoc-Lys(ivDDE)沉降(download)至载量150微摩尔/g。200mg树脂用NMP中的20％哌啶去Fmoc化，随后用Boc-L30-OH(NMP中0.26M，1.5mL，用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化2分钟)进行一次20分钟偶合。ivDDE基团用NMP中的5％肼去除，并且赖氨酸侧链用羧基荧光素(Flu)(NMP中0.2M，1.5mL，用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化2分钟)标记2x20分钟。树脂用NMP中的20％哌啶、NMP、DCM以及DCM处理。中间产物H-L30-Lys(Flu)-NH₂用TFA：TFMSA：间甲酚(7：2：1，1.5ml，1小时)将从树脂切下，用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，二乙醚沉淀，重悬于NMP中，并再次用二乙醚沉淀。此中间产物用100微升DIPEA调节为碱性并直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的0.5mL，0.3M阿魏酸中。25分钟后，粗产物用二乙醚沉淀，溶解于450微升NMP和50微升乙二胺中。5分钟后，用二乙醚沉淀产物，溶解于水中的15％乙腈(8mL)，并用100微升TFA酸化，并且进行RP-HPLC纯化。

D17157MBHA树脂用Boc-Lys(Fmoc)沉降至载量100微摩尔/g。树脂用Boc-L30-OH进行5次偶合循环(a.如1所述与Boc-L30-OH偶合。b.用NMP：吡啶1：1中的2％乙酸酐进行加帽2分钟。c.用TFA中的5％间甲酚去Bc化，2x5分钟)。如1中那样，将赖氨酸侧链去Fmoc化并且以羧基荧光素标记。将中间产物H-L150-Lys(Flu)-NH₂从树脂切下，并且用阿魏酸标记进行N-端标记，并如1.1中那样纯化。

D16127在0.5g MBHA树脂上用标准固相化学(如1.1.和1.2中所述)制备Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)。用NMP中的20％哌啶从赖氨酸侧链除去Fmoc基团，并且将所述化合物进行反复羧基荧光素标记(3x30分钟)。在用TFA去除Boc基团后，N-端在固相上用β丙氨酸-N,N-二乙酸(βala)叔丁基酯标记。在树脂上切割和HPLC纯化后，将βala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH₂分离。

D17127使用在1.3中描述的流程制备和标记Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)树脂。去除Boc基团后，N-端用N-Boc-S(4-甲氧苄基)-Cys-OH标记。将化合物从柱上切下并且通过HPLC纯化。

D18074/D17128将Boc-Lys(Fmoc)(2个循环)，Boc-L30-OH(5个循环)和Boc-Lys(2ClZ)-OH依次偶合至MBHA树脂。将中间产物在10％硫代苯甲醚清除剂存在下从树脂切下，以去除2ClZ-基团。将N-端和5个脱保护的赖氨酸侧链如1.1中那样用阿魏酸标记(2x30分钟)。然后，在纯化前，C-端赖氨酸残基的N上的Fmoc基团用NMP中的10％乙二胺除去。

D17134500nmol的βala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16126)(参见上述1.4)溶解于88微升NMP和2微升吡啶中，通过与10微升二异丙基碳化二亚胺反应10分钟而转化为环酐。将该酐用二乙醚沉淀，并且将沉淀物溶解于含有250nmol的Fer-(Fer-L30)₅-Lys(NH₂)-NH₂的100微升NMP中。20分钟后，加入5微升乙二胺，并且5分钟后，产物用二乙醚沉淀，酸化和HPLC纯化。

D18044在MBHA树脂上制备Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)₆-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上，去除Fmoc基团，用羧基荧光素标记赖氨酸侧链。从树脂上切下后，产物经HPLC纯化。

D17140在MBHA树脂上产生Boc-Lys(2ClZ)-L60-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L60-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L30-Lys(Fmoc)。从树脂上切下后，中间产物H-Lys(NH₂)-L60-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L60-Lys(NH₂)-Lys(NH₂)-L30-Lys(Fmoc)通过沉淀法分离，用阿魏酸如1.1中那样标记。终产物由HPLC分离。

D18090用二乙烯砜活化的10nmol葡聚糖MW70kDa在40C在总体积300微升的0.16M NaHCO₃pH9.5中，与Fer-(Fer-L30)₅-Lys(NH₂)-NH₂(D18074)(参见(参见上述1.4)500nmol反应30分钟。在观察到少量沉淀后，再加入100微升水，并且允许反应继续30分钟。进而随500nmol的H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D17127)(参见上述1.5)一起添加200微升0.15M NaHCO₃。在40C上1小时后，反应混合物通过添加50微升0.165M半胱氨酸被猝灭30分钟，将过滤溶液，并且产物通过FPLC在superdex200上用含有10mM CHES，pH9.0，和0.1MNaCl的水溶液中的20％EtOH进行纯化。洗脱的产物是含有约56个荧光素和113个阿魏酸残基的葡聚糖偶联物。

D19112在固相MBHA树脂上，使用固相Boc化学产生Boc-Lys(2Clz)-Lys(2ClZ)-L150-Lys(Fmoc)。用NMP中的20％哌啶去除Fmoc基团(2x5分钟)，用羧基荧光素(0.2M羧基荧光素，用0.9当量HATU和1当量DIPEA在NMP中进行3次活化，20分钟)标记自由氨基。用在NMP中的20％哌啶处理树脂2x5分钟。在TFA：TFMSA：间-甲酚：硫代苯甲醚(6：2：1：1)混合物中进行从树脂上的切割1小时，得到中间产物H2N-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L150-Lys(Flu)。该产物溶解于TFA中，用二乙醚沉淀，然后溶解于NMP中，再度用二乙醚沉淀。然后，沉淀物溶解于用0.9当量HATU和2当量的二异丙基乙基胺活化的0.3M阿魏酸中。反应10分钟后，产物用二乙醚沉淀，然后溶解于NMP中的10％乙二胺中2分钟。终产物用二乙醚沉淀，溶解于水中的30％乙腈，在C18柱上进行HPLC纯化。

D19185，D20068和D20171以与D19112相同的方法制备，同时引入另一个Lys(Fer)基团。

D21020：Caf-Lys(Caf)-Lys(Caf)-L150-Lys(Flu)如D19185那样制备。在固相合成后，咖啡酸标记过程在溶液中进行。

0328-018：Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)如D19185那样制备Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)，在固相合成后，芥子酸标记在溶液中进行。

D20118：如D19112同样的方法制备，使用L60交联剂。

D20086：如D19112同样的方法制备，使用L30交联剂。

D20120：如D19112同样方法制备，使用L30交联剂，并且，另外的谷氨酸残基。用Boc-Glu(O-苄基)进行固相合成来构成谷氨酸残基。

D19048：在0.5g MBHA树脂上制备Boc-L₁₅₀-Lys(Fmoc)。去除Fmoc基团，用丽丝胺(MolecularProbes产nr.L20，罗丹明B磺酰氯)标记赖氨酸侧链氨基3次10分钟，使用2mL NMP中的100mg并添加80微升的DIPEA。用TFA去除Boc基团，并将Boc-Lys(2ClZ)偶合到N端基。如D19112中所述那样，中间产物H₂N-Lys(NH₂)-L150-Lys(丽丝胺)用TFA：TFMSA：间-甲酚：硫代苯甲醚(6：2：1：1)将从树脂切割，并用阿魏酸标记，得到Fer-Lys(Fer)-L150-Lys(丽丝胺)。由RP-HPLC纯化产物，分成两个分开的峰表示丽丝胺的不同异构体。第一异构体在碱性水溶液中转化成几乎无色，并被排出。保留的第二异构体在碱性水溶液中有色且荧光性，并且被收集。

D19059：如D19112同样制备，但用二硝基苯在固相上在C-端赖氨酸侧链氨基上标记2次20分钟，使用1.5mL NMP中的100mg2,4-二硝基氟苯并添加50微升DIPEA。

D18126：

Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L120-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)＝Fer-(Lys(Fer)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3.该延伸的偶联物通过与D19112同样的路径来制备，如：Boc-(Lys(2ClZ)-L30)5-(L90-Lys(Fmoc))3在固相上制备。3个Fmoc基团用NMP中的哌啶去除，如D19112中那样引入3个羧基荧光素。从树脂上切下后中间产物NH2-(Lys(NH2)-L30)5-(L90-Lys(Flu))3，用阿魏酸在N-端和5个自由赖氨酸侧链上标记，用NMP中的10％乙二胺洗涤，从TFA中沉淀并HPLC纯化。

D18146：在如D18126同样的赖氨酸-交联剂主链上制备ACim-(Lys(ACim)L30)5-(L90-Lys(Flu))3。从固相上切割后，中间体荧光素标记的交联剂溶解于NMP并由DIPEA碱性化。用0.9当量HATU和3当量DIPEA活化NMP中的0.1M4-氨基-肉桂酸30秒，并添加到交联剂。2分钟后通过添加乙二胺而反应被猝灭，最终浓度为10％。沉淀后产物由RP-HPLC纯化。

D18074：Fer(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH2)。该中间体交联剂具有6个阿魏酸和自由赖氨酸侧链氨基，由固相化学制备，使用C端基Boc-Lys(Fmoc)，然后，与Boc-L30交联剂和Boc-Lys(2ClZ)交替偶合。在从树脂切割后，如对D19112所述那样，在溶液中用阿魏酸标记中间产物NH2(Lys(NH2)-L30)5-Lys(Fmoc)。在用10％乙二胺的最终处理中，Fmoc基团也被去除。该同基阿魏酸低聚物用于葡聚糖偶联物D21008的制备。

D18118：NH2-Cys-(L90Lys(Flu))。该中间体三-荧光素交联剂直接在固相上制备，使用Boc-Lys(Fmoc)来引入赖氨酸，在去除Fmoc后用羧基荧光素标记。用Boc(S-p-甲氧基苄基)半胱氨酸引入N-端半胱氨酸。

D18044：在固相上如D18126来制备Fer-(Tyr-L30)5-(L90-Lys(Flu))3。用N-Boc-O-2BrZ酪氨酸来引入酪氨酸。在从树脂去除后，产物被HPLC纯化。

D21008：Dex70与D18074和D18118偶联。在140微升水中的10nmol乙烯基砜活化的70kDa葡聚糖进一步与200微升水和60微升0.8M碳酸氢钠混合，pH9.5。该混合物被用来溶解500nmol自由干燥的D18074。反应混合物在40C保持60分钟，然后反应混合物中进一步添加溶解于250微升水的500nmmol D18118并进一步添加50微升0.8M碳酸氢钠，pH9.5。在40C额外反应60分钟后，通过添加0.8M碳酸氢钠pH9.5中的70微升0.165mM半胱氨酸终止反应。偶联物在superdex200上纯化，使用10mM CHES pH9.0，以水中20％乙醇中的100mM NaCl为洗脱剂。这产生包含偶联物的第一峰，随后是未偶联的交联剂。基于荧光素和阿魏酸的总收率81％，并对葡聚糖偶联物假定相同的收率(81％)，计算出每个葡聚糖的111个阿魏酸和83荧光素的比例，这对应于(D18074)_18.5-Dex70-(D18118)_27.7。

D19059：在0.1g MBHA树脂上用标准固相化学制备Boc-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L₁₅₀-Lys(Fmoc)。使Fmoc保护的赖氨酸侧链用NMP中的20％哌啶去保护(2x5分钟)，并用溶解于1.5ml NMP150mg2-4-二硝基-氟苯1.5mL和50μL DIPEA标记2x20分钟。树脂用NMP中的20％哌啶、NMP和DCM处理。

该中间产物用TFA：TFMSA：硫代苯甲醚：间-甲酚(6：2：1：1，1.5mL，1小时)从树脂切割，用二乙醚沉淀，在TFA中重悬，用二乙醚析，在NMP中重悬，并再次用二乙醚沉淀。该中间产物用100μL DIPEA调成碱性并直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的0.5mL，0.3M阿魏酸。10分钟后，产物用二乙醚沉淀粗，再溶解于900μLNMP和100μL乙二胺中。2分钟后，产物用二乙醚沉淀，重悬在TFA中，用二乙醚沉淀，溶解于水中的22％乙腈(8.2mL)并进行RP-HPLC纯化。

产率为8μmol，发现MS为3582(M+Na)，计算值3558，对Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L₁₅₀-Lys(DNP)为784

D19112：在1g MBHA树脂上用标准固相化学来制备Boc-Lys(2ClZ)-Lys(2ClZ)-L₁₅₀-Lys(Fmoc)。用NMP中20％哌啶将Fmoc保护的赖氨酸侧链去保护(2x5分钟)，并进行重复的羧基荧光素标记(3mL，NMP中0.2M，用0.9当量HATU、1当量DIPEA预活化2分钟)3x20分钟。树脂用NMP中20％哌啶来处理，然后用NMP、DCM和TFA洗涤。中间产物用TFA：TFMSA：硫代苯甲醚：间-甲酚(6：2：1：1，3mL，1小时)从树脂切割，用二乙醚沉淀，在TFA中重悬，用二乙醚沉淀，在NMP中重悬，并再度用二乙醚沉淀。该中间产物用200μL DIPEA调成碱性并直接溶解到用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的2mL、0.3M阿魏酸中。10分钟后，粗产物用二乙醚沉淀，再溶解于1350μL NMP并添加150μL乙二胺。2分钟后，产物用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，溶解于水中25％乙腈(24mL)并进行RP-HPLC纯化。

产率为19μmol，发现MS为3749，计算为3750，对Fer-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L₁₅₀-Lys(Flu)998

D19185：通过固相合成与D19112相似地产生D19185，之后用阿魏酸在溶液中标记。发现MS为4054

D19037：通过固相合成与D19112相似地制备19037，之后用阿魏酸在溶液中标记。发现MS为3447

D18126：在MBHA树脂上用标准固相化学来制备Boc-(Lys(2ClZ)-L₃₀)₅L₉₀-Lys(Fmoc)-L₉₀Lys(Fmoc)-L₉₀Lys(Fmoc))。用NMP中20％哌啶将Fmoc保护的赖氨酸侧链去保护(2x5分钟)，并进行重复的羧基荧光素标记(3mL，NMP中0.2M，用0.9当量HATU、1当量DIPEA预活化2分钟)3x20分钟。树脂用NMP中20％哌啶处理，然后用NMP、DCM和TFA洗涤。中间产物用TFA：TFMSA：硫代苯甲醚：间-甲酚(6：2：1：1，3mL，1小时)从树脂上切下后，用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，在NMP中重悬，并再度用二乙醚沉淀。该中间产物用200μL DIPEA调成碱性，并直接溶解于用0.9当量HATU和2当量DIPEA预活化的2mL、0.3M阿魏酸中。10分钟后，粗产物用二乙醚沉淀，再溶解于1350μL NMP并添加150μL乙二胺。2分钟后，产物用二乙醚沉淀，重悬于TFA中，用二乙醚沉淀，溶解于水中25％乙腈(24mL)中并进行RP-HPLC纯化。

产率为2μmol，发现MS为10666，

结合剂

羊抗小鼠-Dex70-HRP(D18033/D18175)

二乙烯基砜活化的13.7nmol70kDA MW葡聚糖和602nmol HRP在30C在600微升缓冲液(100mM NaCl，25mM NaHCO₃，pH9.5)中反应3小时。然后添加105微升水中的41.1nmol羊抗小鼠F(ab)₂抗体，反应再继续进行16小时。该反应混合物通过添加70微升0.165M半胱氨酸猝灭30分钟，并且产物在superdex200上在100mM NaCl、10mM HEPES pH7.2中纯化。洗脱的产物是含有羊抗小鼠(GaM)和HRP(每个偶联物8个HRP和1.3个抗体；dex/GaM/HRP的比例＝1/1.1/7.5)的葡聚糖偶联物。

抗-FITC-Dex70-HRP(D18058/D18144)

l二乙烯基砜活化的10nmo70kDA MW葡聚糖和440nmol HRP在30C在400微升缓冲液(100mMNaCl，25mM NaHCO₃，pH9.5)中反应3小时。然后，添加80微升水中30nmol抗-鼠F(ab)₂抗体，反应在40C再继续90分钟。反应混合物通过添加50微升0.165M半胱氨酸猝灭30分钟，并在superdex200上在100mM NaCl、10mM HEPES pH7.2中纯化产物。洗脱的产物是具有抗-FITC和HRP(每个偶联物9个HRP和1.5个抗体；Dex/抗FITC/HRP比例＝1/2/9)的葡聚糖偶联物，

兔-抗-FITC F(ab’) ₁ -HRP偶联物(D19142/D19154)

多克隆兔-抗_FITC IgG抗体用胃蛋白酶在37C消化4小时，并在superdex200上纯化以去除胃蛋白酶和Fc片段。

用0.2M磷酸钠中的5mM EDTA、pH6.0进一步透析F(ab’)₂片段。该溶液用Amicon Ultra离心柱浓缩至蛋白质浓度25g/L。在6.0mL所述溶液(150mg F(ab’)₂)中添加水中的487微升50mg/mL DTT和423微升56mM2-巯基乙醇。将反应混合物在室温缓慢搅拌40分钟，然后立刻在PD-10柱上用0.2M磷酸钠中的5mM EDTA pH6.0进行纯化。在8.0mL缓冲液中回收118mg F(ab’)₁。

250mg HRP(Servac)溶解于2.5mL、0.15m NaCL、0.05M磷酸钾，pH8，并用相同缓冲液透析。透析后，浓缩酶溶液并调整浓度为40mg/mL。在3.21mL、128.6mg HRP溶液中添加860微升15mg/mL SMCC，反应在黑暗下在室温进行30分钟。用0.15m NaCL、0.05M磷酸钾、pH8在PD-10柱上纯化SMCC活化的HRP酶。在7.9mL中回收126.9mg。

在8.0mL F(ab’)₁中添加6.25mL SMCC活化的HRP溶液，用0.15m NaCL、0.05M磷酸钾pH8调节到总体积为43.8mL。抗体片段和酶之间的反应在黑暗下在室温进行210分钟。反应通过添加水中343微升25mg/mL半胱胺在室温猝灭15分钟，反应混合物存放在低温过夜等待纯化。样品浓缩到8mL，并分为4部分，应用到superdex200柱并用150mM NaCL、50mM Tris，pH7.6洗脱。第一峰中的洗脱产物，之后是未反应的抗体和酶的峰。偶联物100mg分成几个部分。在280nm/403nm的UV-测试表明0.8和1.2之间的抗体酶定量。

羊抗小鼠F(ab’) ₁ -HRP(D19150/D19147)

如兔-抗-FITC F(ab’)₁-HRP同样制备羊抗小鼠F(ab’)₁-HRP，通过F(ab’)₂与DTT和巯基乙醇的还原并偶合至SMCC活化的HRP。如同兔-抗-FITC F(ab’)₁-HRP，12当量SMCC用于HRP活化，并使用F(ab’)₁和HRP之间1：1摩尔比例。

羊抗兔F(ab’) ₁ -HRP(AMM279.168)

如兔-抗-FITC F(ab’)₁-HRP同样制备羊抗兔F(ab’)₁-HRP，通过F(ab’)₂与DTT和巯基乙醇的还原并偶合至SMCC活化的HRP。如同兔-抗-FITC F(ab’)₁-HRP，12当量SMCC用于HRP活化，并使用F(ab’)₁和HRP之间1：1摩尔比例。

结合剂羊抗小鼠F(ab’) ₁ -HRP偶联物(D19150)

用与D19142相同程序制备(用GaM代替FITC)。

结合剂兔-抗-DNP F(ab’) ₁ -HRP偶联物(D19053)

用与D19142相同程序制备该结合剂，使用多克隆的兔抗DNP抗体。

结合剂兔-抗-FITC F(ab’) ₁ -碱性磷酸酶偶联物(D20036)

如对D19142所述那样，将兔-抗-FITC用胃蛋白酶消化并还原成F(ab)1。将4.23mL缓冲液中的44.9mg片段抗体用于偶联。2.8mL缓冲液(25mM硼酸盐、200mM NaCl、5mM MgCl2，0.2mMZnCl2，pH8.2)中56mg碱性磷酸酶(Boehringer，MW140.000)与溶解于107微升DMSO的1.6mgSMCC(相对于酶12当量)在黑暗下在室温反应25分钟。活化的酶溶液用具有0.1M TRIS、0.2MNaCl、5mM MgCl2、0.2mM ZnCl2、pH8.2的缓冲液进行凝胶过滤。分离出55.3mg酶，体积7mL。将片段化的抗体和活化的酶立即混合在一起，并添加2.47mL0.1M TRIS、0.2M NaCl、5mMMgCl2、0.2mM ZnCl2，pH8.2。允许混合物在室温反应150分钟，然后通过添加11.2mg半胱胺猝灭15分钟。产物在Superdex200柱上用0.1M TRISl、5mM MgCl2、0.2mM ZnCl2、pH7.2纯化，洗脱为单个宽泛的峰。分析各个级分的AP活性，用D19150将FITC连接到IHC测定法来沉积报告子D19185，之后不同的部分和最终的液态永固红作为生色剂。包含主要产物的各级分表现同样好，并合并(pooled).

与偶联于HRP的Dex70偶联的结合剂羊抗小鼠抗体(D20052)

11nmol70kDA MW葡聚糖在30C与316微升缓冲液A(100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5)中的484nmol HRP反应3小时。然后，将169微升水中的66nmol羊抗小鼠-F(ab)₂添加到葡聚糖-HRP偶联物，并反应1小时。通过添加70微升0.165M半胱氨酸将反应混合物猝灭30分钟，产物在缓冲液B(100mM NaCl、10mM HEPES pH7.2)中在Sephacryl300(GE Medical)上纯化。洗脱产物是含有羊抗小鼠(GaM)和HRP的葡聚糖偶联物。相对短的偶联时间连同高分子量优化纯化法的使用允许最终偶联物产物基于偶联物尺寸分成15个级分。对各个产物级分以及包含未偶联的抗体和HRP的级分进行测量，显示偶联物收率为81％，这对应于8.91nmol葡聚糖。总计，偶联物级分(洗脱物的第7至第22级分)包含72.3nmol HRP和7.9nmol抗体，其对应于平均8.1HRPs/葡聚糖和0.88抗体/葡聚糖。第7-8级分产生初始峰，然后宽峰(第9-17级分)，渐渐减弱(第18-22级分)。

与偶联于HRP的Dex70偶联的羊抗小鼠抗体(D20168)

与D20052完全相同方法产生该偶联物。获得的产物具有均匀的HRP数目，仅收集第9和第10级分并合并在一起。

与偶联于HRP的Dex-150偶联的羊抗小鼠抗体(D20060)

如D20052制备该结合剂，尽管使用较大分子量(150kDa)的葡聚糖。在纯化期间，最主要的偶联物在单个峰中在头4个级分中洗脱。计算显示平均每个葡聚糖分子16.5个HRP和1.8个抗体。

与偶联于HRP的Dex-150偶联的羊抗小鼠抗体(L348.121)

5.13nmol150kDA MW葡聚糖在40C与300微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5)中的484nmol HRP反应3小时。然后，将69微升水中的66nmol羊-抗-鼠F(ab)2添加到葡聚糖-HRP偶联物并在40C再反应1小时。反应混合物通过添加70微升0.165M半胱氨酸猝灭30分钟，产物在缓冲液B(100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2)中在Sephacryl300(GE Medical)上纯化。稀释产物是含有羊抗小鼠F(ab)₂和HRP的葡聚糖偶联物。产物基于偶联物尺寸分成3类级分：包含最大偶联物的第一类级分(第8-第11)，具有较小偶联物的拖尾级分和未偶联的蛋白质。测量各个产物级分以及包含未偶联的抗体和HRP的级分，表明总偶联物收率为87％。假定掺入的HRP和葡聚糖之间成正比例，表明第8-11级分包含每个葡聚糖20.6个HRP和2.32个抗体。第10-11级分包含每个葡聚糖10.9个HRP和0.96个抗体。仅有第8-11级分用于试验。

这种偶联物例示了较大葡聚糖偶联物的怎样掺入更多的HRP。

与偶联于HRP的Dex70偶联的羊抗-兔抗(L348.111，第10-11级分)

11nmol70kDA MW葡聚糖在40C与316微升缓冲液A(100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5)中的484nmol HRP反应3小时。然后将196微升水中的44nmol羊-抗-兔添加到葡聚糖-HRP偶联物并在40C再反应1小时。反应混合物通过添加70微升0.165M半胱氨酸猝灭30分钟，产物在缓冲液B(100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2)中在Sephacryl300(GE Medical)上纯化。洗脱的产物是含有羊-抗-兔(GaR)和HRP的葡聚糖偶联物。将产物根据偶联物尺寸分成4类级分：包含作为第一峰洗脱的产物的前两类级分(第8-9级分)，假定包含一些交联的偶联物，之后是分成第10-11级分(同质的大偶联物)和第12-21级分(较小的可变偶联物)的宽肩峰，并且最后是第22-42级分中未偶联的酶和抗体。测量各个产物级分以及包含未偶联的抗体和HRP的级分，显示总偶联物收率为87％。假定掺入的HRP和葡聚糖之间成正比例，表明第10-11级分包含每个葡聚糖10.9个HRP和0.96个抗体。仅这两个级分用于试验。

与偶联于HRP的Dex70偶联的抗-HER2-抗体(D21100，第9-10级分)

4.6nmol70kDA MW葡聚糖在30C与125微升缓冲液A(100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5)中的202nmol HRP反应3小时。然后，将489微升水中的18nmol抗Her2添加到葡聚糖-HRP偶联物中，并使混合物在30C再反应21小时。反应混合物通过添加70微升0.165M半胱氨酸猝灭30分钟，产物在缓冲液B(100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2)中在Sephacryl300(GE Medical)上纯化。洗脱的产物为含有抗Her2和HRP的葡聚糖偶联物。根据偶联物尺寸将产物分为4个级分：包含作为第一峰洗脱的产物的前两类级分(第7-8级分)，假定包含一些交联的偶联物，之后是分成第9-10级分(同质的大偶联物)和第11-19级分(较小的可变偶联物)的宽肩峰，并且最后是第20-41级分中未偶联的酶和抗体。测量各个产物级分以及包含未偶联的抗体和HRP的级分，显示总偶联物收率为68％。假定掺入的HRP和葡聚糖之间成正比例，表明第9-10级分包含每个葡聚糖9.1个HRP和0.6个抗体。仅这两个级分用于试验。

与偶联于HRP的Dex70偶联的抗FITC抗体(AMM353-022，第8-11级分)

11nmol70kDA MW葡聚糖在40C与316微升缓冲液A(100mM NaCl、25mM NaHCO₃，pH9.5)中的484nmol HRP反应3小时。然后将196微升中的66nmol抗FITC添加到葡聚糖-HRP偶联物并使反应在40C再进行1小时。反应混合物通过添加70微升0.165M半胱氨酸猝灭30分钟，产物在缓冲液B(100mM NaCl、10mM HEPES，pH7.2)中在Sephacryl300(GE Medical)上纯化。洗脱的产物为含有抗FITC和HRP的葡聚糖偶联物。产物根据偶联物尺寸分为3类级分：包含作为第一峰洗脱的产物的第一类级分(第8-11级分)，随后是宽肩峰(较小的可变偶联物，第12-27级分)和最后在第28-45级分中未偶联的酶和抗体。测量各个产物级分以及包含未偶联的抗体和HRP的级分，显示总偶联物收率为90％。假定掺入的HRP和葡聚糖之间成正比例，表明第10-11级分包含每个葡聚糖11.7个HRP和0.80个抗体。仅这两个级分用于试验。

其它试剂

抗-细胞角蛋白单克隆抗体(Dako M3515)

孵育介质(a)(ABCPT-缓冲液)：0.1％4-氨基抗嘌呤，0.2％Procline2％BSA，0.2％酪蛋白，2％PEG，0.1％Tween20，0.1M NaCL，10mM HEPES，pH7.2.

孵育介质(b)：50mM咪唑HCl pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％，

苯扎氯铵，0.005％(1.5mM)过氧化氢，

DAB色原溶液(Dako K3465)

LPR色原溶液(Dako K0640)

苏木精复染剂(Dako S3301)

洗涤缓冲液(Dako S3306)

靶修复溶液(Dako S1699)

实施例1：点尺寸作为在孵育介质中报告子、DAB和H₂O₂的量或孵育时间的函数

一般流程：

对福尔马林固定石蜡包埋组织进行染色实验。作为预处理，载片在2次二甲苯浴(每次5分钟)、两次96％乙醇浴、2次70％乙醇浴(每次2分钟)进行脱石蜡。载片随后在微波炉中在靶修复溶液(Dako S1699)中煮沸10分钟。使载片冷却，用10％过氧化氢猝灭内源过氧化物酶活性2分钟。

实验1

将全部载片与针对HER2蛋白C-端的实验性单克隆小鼠抗体“克隆6C2”孵育。使用操作方案：与克隆6C2、55picoM孵育3分钟，用洗涤缓冲液(Dako S3306)洗涤，然后用GaM/HRP(D20052第8级分)以浓度370picoM孵育3分钟，然后洗涤。然后，如表1中详述，载片经历沉积步骤、报告子结合剂步骤(全部报告子D19112、D20068、D20086、D20118、D20120均以浓度10μM使用)和采用LPR色原的染色步骤。在每个步骤之间使用洗涤步骤。

表1

实验2

全部载片如实施例1中那样处理，然后进行沉积，报告子结合剂和色原染色剂如表2中详述。

表2

实验3

全部载片如实施例1中那样处理，然后进行沉积，报告子结合剂和色原染色剂如表3中详述。

表3

实验1-3的结果。

实验1(表1，载片1-5)和实验3(表3，载片1-5)显示，在其它条件相同时(相同浓度的相同结合剂、相同报告子、相同DAB、报告子和H₂O₂浓度、相同孵育时间)，点尺寸取决于在该方法最终检测阶段上色原的沉积时间，即着染报告子沉积物的液态永固红(LPR)色原的沉积时间。最大的点随LPR沉淀10分钟产生，点的尺寸随沉淀时间减少而降低。然而，即使沉积1分钟(载片5)也足以观察到小但可区分的点。

实验1(表1：载片1和载片6-9)和实验3(表3：载片1和载片6-11)显示，点尺寸根据在含有报告子、DAB和H₂O₂的介质中包含靶(即Her2受体)复合物的样品与HRP-标记的结合剂(即D20052，第8级分)孵育的持续而变动，因此取决于用于从介质沉积报告子的时间(当其它条件固定时，即，相同报告子、相同结合剂、相同检测剂、相同浓度的DAB、H₂O₂报告子、结合剂和检测染色剂、检测步骤中沉积染色剂的相同持续时间)。最大的点随10分钟沉淀产生。进一步增加时间至15或20分钟不产生更大的点，但导致本底染色显著增加。随着沉淀时间从10分钟降低到1分钟，点尺寸降低。

实验1(表1：载片1和16-19)和实验3(表3；载片1和18-22)显示，点尺寸可以因变动H₂O₂在包含DAB和报告子的沉积介质中的浓度而变动。当过氧化氢浓度为1.5mM时，产生最大的点。在没有过氧化氢的情况下，无点产生(表3：载片18)。过氧化氢的较低和较高浓度缩减点的尺寸。在58.8mM，点变得几乎不可区分。

如实验1(表1：载片1和10-15)和实验3(表3：载片1和12-17)所示，点尺寸作为包含DAB和报告子的沉积介质中DAB浓度的函数变动。当DAB以0.14mM至0.28mM的浓度范围存在时，产生最大的点。在没有DAB的情况下，无点产生。降低DAB浓度至0.07mM导致比0.14mM时更小且更弥散的点，同样DAB的较高浓度也一样：在2.09mM DAB，产生非常小的点。

报道分子中阿魏酸残基(3或4个残基)的数目对点尺寸具有微小影响：点尺寸仅随不同的报告子略微改变。如实验1(表1：载片20-24)，具有4个阿魏酸部分的D20068报告子比具有3个部分的报告子产生稍大的点，但同时本底染色的水平也增加。用含有3个阿魏酸部分的D19112获得了最好的信噪比。

点尺寸随报告子的浓度而变动。实验2(表2：载片1-6)显示，在5microM至20microM的范围，报告子D19112(其它条件相同)形成在尺寸仅稍稍不同的沉积物：10和20microM产生比5microM略大的点，但本底染色也增加。低于5microM，点尺寸显著缩减；但即使在1microM上，小点依然充分可视。

能够与沉积的报告子即D20036结合的结合剂的浓度仅稍微影响点尺寸(实验2表2所示：载片7-12)。当抗-Flu-AP偶联抗体(D20036)的浓度为50nM时，获得最大点(其它条件相同)。100nM和低于50nM不能产生大尺寸的点。在非常低的浓度(6或3nM)，产生非常小但仍可区分的点。

其尺寸因报告子浓度、报告子结合剂浓度和检测染色剂的沉淀时间(即检测步骤中LPR染色剂)受到调节，尤其被缩减的点显示出特征性强度梯度，即在中心最强烈着染并在边缘弥散，从而给予这些点总体上弥散的外观。

其尺寸因高DAB浓度、高过氧化氢浓度或沉淀步骤时间缩短受到调节，尤其被缩减的点具有清晰的外观，强度均匀和边缘鲜明。

实施例2.点尺寸作为具有氧化还原酶活性的酶的第二底物的结构的函数：测试不同的偶联物分子

全部载片如实施例1中那样预处理。并且随后，进行如下操作方案：与抗细胞角蛋白Dako M35152nM孵育3分钟，用洗涤缓冲液(Dako S3306)洗涤，然后用GaM/HRP(D20168第9+10级分)以浓度100picoM孵育3分钟。在其它都相同的条件下(50mM咪唑HCl pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％，苯扎氯铵，DAB0.14mM，H₂O₂1.5mM)，载片经历采用不同报告子的沉积步骤10分钟。之后是报告子结合剂步骤(D20036，20nM，10分钟)和采用LPR色原的10分钟染色步骤。在每一步骤之间使用洗涤步骤。报告子在这些条件下测试：

D19112、D18044、D181126、D18146、D20171、D21016、0328-014(均为5microM)。葡聚糖报告子偶联物D21008以50nM和250nM测试。与实验1中测试的报告子组合时，这导致如下结论：报告子的特性决定性地影响报告子沉积发生的效率如何。惊奇地，相对小的报告子，如D20171(1个荧光素，4个阿魏酸)和D19112(1个荧光素，3个阿魏酸)比更大的分子，如D18126(3个荧光素，6个阿魏酸)或大型葡聚糖偶联物D21008(83个荧光素和111个阿魏酸)更有效率。在葡聚糖偶联物的情况下，这可以归咎于在样品中的渗透性差。使用大偶联物时组织类型和固定影响点尺寸的事实支持这个观点。

在D18126(其是(相对于抗体-酶偶联物)相对小的分子)的情况下，缺乏渗透性似乎不足以解释不良性能。开展许多对照实验以更好地阐明沉积机理：在沉积介质中不存在DAB时，无点形成。然而，如果沉积反应仅用DAB进行，然后是具有D20171而不添加DAB的沉积反应，则非常小的点产生。这个研究结果有力地表明，该机理的部分是HRP驱动用DAB聚合物包覆样品，所述DAB聚合物随后作为报告子的锚定点(anchor)。实施另一项实验，其具有在沸腾CHES缓冲液中的10分钟洗涤步骤，然后是一个沉积步骤。如此进行以降低本底，但是这种非常严苛的洗涤也导致点尺寸显著降低。这表明，大多沉积的报告子没有与样品共价交联，而作为不溶性沉积物沉淀，而其它报告子可以认为确实被固定。这一个研究结果指示了两种其他机理；DAB和报告子之间的溶液相反应导致溶解性降低的加合物，所述加合物与报告子和样品之间的真实共价交联作用组合而沉淀。似乎大的报告子更不可能沉淀，因为它将需要与DAB几次反应以使得这些报告子不溶，而较小报告子因与DAB单次或少数反应而变得不溶。

具有缩短的交联剂长度的报告子，D20086(L30)和D20118(L60)，产生与D19112(L150)几乎一样大的点，尽管这些缩短的报告子也产生略多的本底。这种略微降低的信(点尺寸)噪比倾向降低溶解性，从而产生荧光素半抗原的更多粘性和降低的可及性。因此，长的交联剂段增强报告子的性能。

特别重要的因素是报告子中反应基团的特性。如果接续一个DAB包覆步骤，则报告子可以在DAB不存在时沉积，这个事实表明，HRP催化的报告子自由基形成起到作用。同样，具有阿魏酸的报告子D18126比具有4-氨基肉桂酸的较小报告子D18146产生较大点的事实，以及同样相似的具有酪氨酸残基的D18044根本不产生点的事实，显示了报告子中反应性基团的重要性。结构方面与D19112相似但分别用咖啡酸和芥子酸替代阿魏酸的报告子D21020和0328-014()比D19112形成或多或少小的点(D21020)或较之稍大的点(0328-014)。阿魏酸、咖啡酸酸和芥子酸都是非常好的HRP底物，且报告子的HRP自由基活化似乎对交联剂沉积作出主要贡献。

总之，许多因素对产生有效报告子作出贡献：相对小尺寸然而延长的水溶性交联剂段。与DAB反应时，整体平衡的水溶性显著降低。作为良好HRP底物的两种或更多酚或芳香胺的存在产生良好的报告子。优选3-4个阿魏酸的衍生物，最优选3个芥子酸的衍生物；即在全部测试的报告子中，报告子0328-014表现最好。

下表汇总了使用具有不同结构(不同的Y-头、Y-头和Z-尾之间不同的分子距离、相同Z-尾(一个Flu))的示例性偶联物分子的几个SMD染色的例子：

*相对点尺寸大体对应于以下的最佳条件下以微米为单位的最大点直径：高pH下组织的靶修复，10microM报告子，1.6mM过氧化氢和0.28mM DAB在室温沉淀反应10分钟，报告子用20nM抗FITC-AP识别10分钟，随后是10分钟LPR。相对分值已经从不同条件(靶修复和报告子浓度)下在不同组织样品和对照细胞系上的几个实验中判定并且是定性的。

实施例3：点尺寸作为HRP-标记的结合剂的量和每个结合剂的HRP部分数目的函数

将10个载片脱石蜡，并将靶在靶修复介质(Dako S2763)中通过在微波炉中煮沸10分钟进行修复。100nM抗-细胞角蛋白小鼠抗体(Dako M3515)与不同摩尔当量数的抗-鼠二级抗体-HRP偶联物预混合，并且30分钟后，将混合物稀释如表4中所述的最终浓度：

表4

载片编号	二级-HRP偶联物	当量，二级-HRP	抗体终浓度
				1	D19150(1HRP)	0.5	20pM
2	D19150(1HRP)	1	20pM
				3	D19150(1HRP)	2	20pM
4	D19150(1HRP)	4	20pM
				5	D19150(1HRP)	8	20pM
6	D19150(1HRP)	16	20pM
				7	D20052第8级分(10HRP)	1	200pM
8	D20052第8级分(10HRP)	2	200pM
				9	D20052第8级分(10HRP)	3	200pM
10	D20052第8级分(10HRP)	4	200pM

全部载片根据相同方案进行免疫染色：

1.一级抗体/二级抗体-HRP混合物；3分钟孵育

2.50mM咪唑HCl pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％苯扎氯铵，0.005％过氧化氢，140microM DAB，5microM D19112；8分钟孵育

3.抗FITC-HRP，D20154，100nM；5分钟孵育

4.DAB色原溶液；Dako K3468；2分钟孵育

5.苏木精复染剂；1分钟孵育

在步骤1和3，使用0.1％4-氨基抗嘌呤，0.2％Procline2％BSA，0.2％酪蛋白，2％PEG，0.1％Tween20，0.1M NaCL，10mM HEPES，pH7.2.(ABCPT-缓冲液)作为稀释剂。

全部载片均显示看上去像棕色到黑色的细胞角蛋白特异性点状染色。从载片1-3，点的数目和它们的尺寸增加。在载片3-5上，点的数目保持基本不变，但点的尺寸从载片3至5增加。载片6具有较少但通常较大尺寸的点。在载片7-10上，观察到最大尺寸的点，尽管尺寸随预混物中二级HRP偶联物的当量数仅勉强增加。点的数目随着二级HRP偶联物增加而降低，这支持以下观点：与过量二级偶联物的预混合导致更大的装配物和较慢的靶结合。

实施例4：点尺寸作为每个结合剂的HRP数目的函数

将D20052级分(第7、8、9、11、13、15、17、19、21)在ABCPT缓冲液中稀释至总HRP浓度100pM，并且对每一级分评估点尺寸。还分析各级分的库，同样，测试中也包括D19150(F(ab)1-HRP1)。

使用如下方案：

1.抗细胞角蛋白(Dako3515)1nM；1分钟

2.D20052(100pM HRP)/D19150的部分；1分钟

3.50mM咪唑HCl pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％苯扎氯铵，0.005％过氧化氢，140microMDAB，10microM D19112；8分钟.

4.抗FITC-HRP，D19154100nM；5分钟

5.DAB色原溶液；50mM咪唑HCl pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％苯扎氯铵，0.2％过氧化氢，5.6mM DAB；1分钟

6.苏木精复染剂；1分钟

结果：第7和8级分比后续级分产生显著更少的点。这些点也是最大的点，然而第9-12级分产生显著更多的几乎为大尺寸的点。第13-22级分产生尺寸缩减的点。每分子具有单个HRP酶的D19150比D20052的任何级分产生更多的点，所述点也小得多。每一级分产生尺寸相对均匀的点，同时，所有级分的库产生尺寸高度变异的点。

实施例5

如上文实验5中所述，测试D20075的部分1-4，较大dex150偶联物进行测试。产生的点与D20052的第7和8级分的点类似；即产生少量的点，尽管它们不明显大于由D12052的第9-12级分所产生的点。

结论

从实验4-6，我们得出结论，在相似的环境下，每个结合剂分子的HRP数目与产生的点的尺寸之间存在强烈的相关性。独立地增加每个结合剂分子中HRP的数目，无论通过预混或偶联，均导致较大的点。然而，这种影响似乎稳定在约10个HRP/分子左右：更大的葡聚糖偶联物不产生更大的点。点的数目显示反相关性：较大分子，尤其非常大的分子，产生较少的点。这可能是源自与每一抗体分子结合的酶物质的位阻以及一般大分子扩散速度较慢的结果。然而，实验4，载片1-3，也表明，含有单个酶部分的结合剂分子比每个分子具有较少酶的那些结合剂产生较少且变异性递减的点，假定，原因在于一些单个的酶分子由于酶快速抑制作用而不能产生可视的点。实验4-6在检测报告子沉积物的阶段都采用非常短的色原沉淀时间，从而导致点看上去比它们本来看到时更小。实验1-3(上文)显示在检测报告子沉积物期间的最终色原沉淀时间可能影响可见点的尺寸。为了将这种影响最小化，已经将这段时间维持为短以凸显酶量的影响。

实施例6.荧光体双重染色

如实施例1中所述，预处理4个载片。

D20168第9-10部分与等摩尔量的抗细胞角蛋白(Dako M3515)在ABCPT结合剂缓冲液中预混5分钟，两种试剂都是100nM浓度。在这个预混步骤后，制备了ABCPT结合剂缓冲液中的20pM溶液“20pM mix”。

理载片1用20pM mix处1分钟，洗涤(Dako洗涤缓冲液，S3006)，然后用20microM D20171和沉积介质中的0.28mM DAB处理1分钟并洗涤。

理载片2用20pM mix处1分钟，洗涤(Dako洗涤缓冲液，S3006)，然后用5microM D19048和沉积介质中的0.28mM DAB处理1分钟并洗涤。

载片3用20pM mix处理1分钟，洗涤(Dako洗涤缓冲液，S3006)，然后用20microM D20171+5microM D19048和沉积介质中的0.28mM DAB处理1分钟并洗涤。

载片4用20pM mix处理1分钟，洗涤(Dako洗涤缓冲液，S3006)，然后用20microM D20171和沉积介质中的0.28mM DAB处理1分钟并洗涤。该载片用3M过氧化氢处理1分钟，洗涤，然后再用20pM mix处理载片1分钟，洗涤(Dako洗涤缓冲液，S3006)，然后再用5microM D19048和沉积介质中的0.28mM DAB处理1分钟。

全部载片最终用水洗涤，在乙醇中脱水并用荧光封装介质(Dako K5331)封装。

结果：载片1在细胞角蛋白阳性组织中给出的绿荧光圆点。载片2在细胞角蛋白阳性组织中给出红荧光圆点。载片3在细胞角蛋白阳性组织中给出荧光圆点，所述荧光圆点通过FITC滤光镜观察时为绿色，在TRITC滤光镜中观察时为红色，在双重滤光镜中观察时为黄色。通过双重滤光镜，没有观察到绿色点或红色点。当通过双重滤光镜观察时，载片4在细胞角蛋白阳性组织中给出绿荧光圆点和绿荧光圆点的混合物。在细胞角蛋白高表达的组织中，存在绿色点和红色点的一些黄色重叠。点的圆圆度连同载片4上观察到的红色点和绿点混合物引导我们得出结论：每一点由单个分子产生。仅根据载片1和2，可以讨论，观察的点没有衍生自单个分子，尽管结合剂浓度极低的。甚至，所述点可能与高细胞角蛋白浓度的亚细胞簇集物(sub cellular clusters)相关，每一簇集物具有几个结合的结合剂分子。然而如果情况是这样，载片4预期显示各种色调的点，这取决于每个孵育步骤中多少个结合剂分子与载片4上的每个簇集物结合，或者，在多个分子与每个簇集物结合的情况下，显示如载片3上那样的黄色点。

本实施例也显示了两种不同的报告子同时沉积的值。

实施例7两种不同共定位靶的生色性双重染色

载片如实施例1中那样预处理。为了这次实验，采用具有不同HER2状态(用Dakos Herceptest评估为从0+到3+)的乳腺组织的组织微阵列作为试验材料。采用针对HER2蛋白C-端的实验性单克隆小鼠抗体“克隆6C2”。采用如下方案：

1.如实施例7中，在ABCP结合剂缓冲液中，10pM抗细胞角蛋白与D20168第9-10级分预混合3分钟。

2.在沉积缓冲液中5microM D19059和0.45microM DAB；8分钟。.

3.3M过氧化氢，3分钟。

4.如实施例7中，在ABCP结合剂缓冲液(a)中，15pM“克隆6C”与D20168第9-10级分预混合，3分钟。

5.在沉积缓冲液(b)中，5microM D19112和0.45microM DAB；8分钟。

6.在ABCPT缓冲液中，25nM D20036(抗FITC-AP)+25nM D19053(抗FITC-AP)，10分钟。.

7.液态永固红，Dako K0640，6分钟。

8.蓝色色原400mg/L，在50mM咪唑HCl中，pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％苯扎氯铵，5.8mM过氧化氢；6分钟。

结果：这个方案在乳腺组织上产生红色点(Her2)和蓝色点(细胞角蛋白)，并且尽管是双重染色，仅有非常浅的蓝色本底。需要对不同的组织进行显微拍摄，并图像用标准彩色打印机打印。这允许手工计数每张画面中的数百个红色点。已经由Herceptest评估为HER2阴性(0+)的组织显示蓝色点9倍于红色点。评估为HER2强阳性(3+)的组织显示红色点3倍于蓝色点；即对于3+组织，红色点对蓝色点的比例较0+组织高约30倍。评估为1+和2+的组织显示中间的比例。

实施例8.低丰度mRNA靶的染色

通过在二甲苯(2x5分钟)中，然后在96％乙醇(2x2分钟)和70％乙醇(2x2分钟)中浸渍，将具有不同组织样品块的FFPE切片的载片脱石蜡。

载片用去离子水洗涤并转移到靶修复溶液，20mM MES(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸)pH6.55，并在微波炉中煮沸5分钟。冷却15分钟后，载片用洗涤缓冲液(Dako S3006)淋洗两次，在37C用胃蛋白酶消化2分钟，然后用洗涤缓冲液淋洗两次。

将载片脱水，70％乙醇1分钟，85％乙醇1分钟，96％乙醇1分钟。FITC标记的抗Kappa mRNA探针(Dako Y5202，即用型)施加于载片，并且将它们加上盖玻片。载片在82C变性5分钟，然后在45C杂交1小时。载片在65C用严格洗涤缓冲液(来自Dako kit K5201)严苛洗涤10分钟。

然后载片经历如下SMD方案：

过氧化物酶阻断，2分钟，用Dako S2023

洗涤3分钟

抗FITC-HRP，AMM353.022，20分钟，在孵育介质1中。使用5个不同浓度(10，20，40，80，160picoM)

洗涤3分钟

报告子D21047，5microM，DAB0.14mM，过氧化氢1.5mM，在孵育介质2中，10分钟。

洗涤3分钟

抗FITC-碱性磷酸酶(D20036)20nM，10分钟，在孵育介质1中。

洗涤3分钟

液态永固红，Dako K0640，10分钟

洗涤2分钟

用苏木精(Dako S3309用水稀释6倍)复染，2分钟.

用去离子水洗涤

用Dako Fairmount，S3025封装。

结果：全部载片均显示直径约3微米的清晰红色点。点存在于全部类型的组织中，且点的数目随抗FITC-HRP的浓度增加而增加。在高浓度(80和160picoM)，Kappa阳性细胞可以在扁桃体和结肠组织中清楚地辨识为每个Kappa阳性细胞被数十个汇合的点着染。没有在其它组织中观察到多个汇合的点，也没在扁桃体或结肠中的Kappa阴性细胞中观察到。这表明在低丰度靶如mRNA的情况下，可以如何以定性方式使用具有优势的这项技术。

实施例9.阿魏酸作为第一底物

通过在二甲苯(2x5分钟)，然后在96％乙醇(2x2分钟)和70％乙醇(2x2分钟)中浸渍,将具有对照细胞系块的FFPE切片的载片进行脱石蜡。

载片用去离子水洗涤并转移到靶修复溶液，Dako pH9，S2367，并在微波炉中煮沸10分钟。

然后载片经历如下SMD方案：

过氧化物酶阻断，5分钟，用Dako S2023

洗涤2分钟

抗细胞角蛋白Dako M3515，在孵育介质1中稀释1:50，5分钟.

洗涤2分钟

1picoM羊抗小鼠，L348.121，在孵育介质1中，5分钟.

洗涤3分钟

报告子D21047，20microM，过氧化氢1.5mM，在孵育介质2中，10分钟，具有不同浓度的阿魏酸(52mM，16mM，5.2mM，1.6mM，0.52mM)或0.14mM DAB

洗涤9分钟

抗FITC-碱性磷酸酶(D20036)20nM，10分钟，在孵育介质1中。

洗涤9分钟

液态永固红，Dako K0640，10分钟

洗涤2分钟

用去离子水洗涤

用Dako Fairmount，S3025封装。

结果

为了确保进行非常有效的报告子沉积，通过以下方式优化该方案：使用具有许多(20)HRP酶/分子，高pH靶修复条件(以确保良好的组织可及性)和使用相对高的量的有效报告子D21047。在这些条件下，具有0.14mM DAB的对照载片产生直径至多到4微米的点。对于阿魏酸(作为交联剂)，浓度1.6mM是最佳的：产生至多到2微米的点。更高和更低浓度的阿魏酸产生较小的点，在最高浓度52mM，没有观察到点。在无阿魏酸或DAB时孵育的载片中没有观察到点。

不受理论约束，我们提出如DAB，阿魏酸具有作为第二底物的交联分子的能力，尽管它比DAB效率低且具有不同的最佳浓度。

在交联剂存在下，产生至多到4微米的点，并且在无交联剂时，没有点产生(在孵育的其它条件相同时)，这表明直接的酶促报告子活化在沉积反应中仅起到次要作用。DAB和阿魏酸可以在HRP和过氧化物存在下发生均聚合。巨大点(4微米)的存在表明报告子可以在距离具有HRP活性的位点至多几个微米处沉积并且表明，一种可能的沉积机理是一些交联剂分子与HRP反应并产生相应的自由基，这些自由基触发了与交联分子和与报道分子的自由基链反应并产生因广泛离域而稳定的低聚自由基。这允许所述自由基从酶弥散开并且停留在在沉积介质中至多到10分钟(在沉积发生之前)。观察到的DAB和阿魏酸的最佳浓度支持这个机理。在高交联剂浓度时，交联剂/报告子的低聚物可以快速变得不溶并靠近酶活性的位点沉积。在很低的交联剂浓度，寡聚化不足以产生巨大的不溶性低聚物。

实施例10样品中Her2的定量。

试验材料

作为试验材料，使用福尔马林固定石蜡包埋的表达Her2的细胞系sk45(+0系)、df45(+1系)、df23(+3系)团块的连续切片。将细胞系的团块包埋于单个石蜡块中以提供其中存在每个细胞系的切片。

试验材料的预处理：

通过在二甲苯(2x5分钟)，然后在96％乙醇(2x2分钟)和70％乙醇(2x2分钟)中浸渍，将具有含有三种细胞系的团块的FFPE切片的载片(以下称为“载片”)脱石蜡。然后，载片用去离子水洗涤并转移至靶修复溶液，即，高pH溶液(Dako S2375)、稀释的10x(具有抗细胞角蛋白的实施例1和2)或低pH溶液(Dako S1700)(参见以下实施例10.3-10.8)。然后，载片在微波炉中加热至沸腾(约5分钟)并缓慢煮沸10分钟。然后，将载片冷却20分钟并转移到稀释的10x洗涤缓冲液(DakoS3006)。

一级抗体：

抗-Her2抗体是单克隆兔抗体(Dako clone25-11-3)。稀释基于浓缩溶液中计算的总蛋白浓度和抗体分子量(150kDa/mol)进行。

偶联物：结合剂和报告子

L348.111，第10-11级分

D21100，第9-10级分

AMM353-022第8-11级分

D21047

(详见上述)：

孵育介质

溶液(a)：0.1％4-氨基抗嘌呤，0.2％Procline2％BSA，0.2％酪蛋白，2％PEG，0.1％Tween20，0.1MNaCL，10mM HEPES，pH7.2.(ABCPT-缓冲液)

溶液(b)：50mM咪唑HCl pH7.5，0.1％Nonidet P40，0.1％，苯扎氯铵，0.005％(1.5mM)过氧化氢，

仪器。

Dako经典自动染色器。该仪器是其中可以根据需要使用试剂和孵育时间的完全开放和可自由编程的自动化IHC装置。该仪器执行四种基本动作

1.吸入试剂。

2.吹干水平放置的载片的洗涤缓冲液

3.分配试剂到载片上(称作吸和吐)

4.通过用洗涤缓冲液冲洗来洗涤载片。

下文在方案1中描述用于单个载片的常见程序。对于全部SMD实验，初始的过氧化物酶阻断步骤和点形成步骤保持不变：

步骤

过氧化物酶阻断，5分钟，在Dako S2023中

洗涤

(a)形成靶位点：

一级抗体，100pM，在溶液(a)中

洗涤

HRP-标记的二级抗体，如实施例中所述。

洗涤。

(b)在靶位点处形成报告子沉积物

样品(a)与溶液(b)中的0.28mM DAB和5μM报告子(D21047)孵育10分钟。

洗涤

c)在单个靶位点处报告子沉积的检测

抗-FITC-AP，10分钟，20nM D20036in孵育介质1

洗涤

LPR，10分钟，Dako K0640

洗涤

d)苏木素复染

苏木素，5分钟

去离子水洗涤

f)封装

可以将额外的洗涤液引入自动化方案。自动化的调度器将通过缩减洗涤步骤的持续时间至最短而保持整个操作方案时间为最短；然而，洗涤步骤的持续时间取决于仪器的负荷。如果计划将单张载片染色，则单个洗涤步骤可以缩短至20秒，而48张载片全负荷会显著增加洗涤时间。为了保持这一时间变量最短，在每一轮着染平均10张载片。相应地，洗涤步骤持续时间每一步骤保持大约2分钟。在报告子沉积和沉积物与抗-FITC-AP孵育后的多次洗涤确保了最小的LPR本底染色。尽管巨量放大(据估计从与靶结合的单个抗体-葡聚糖-HRP分子中衍生的每个红色点平均含有1000亿个LPR分子)，但是没有视觉地检测到本底。

最初，通过视检SMD染色的载片和其图像，手工地进行点计数。可以使用freeware JMicrovisionvs.1.27进行自动化图像分析。在例示性实施方式中，自动计数如所述产生的LPR红色点和苏木素染色的细胞核。通过视检和手工计数验证自动计数。分割和目标提取可以仅基于色调、饱和度、强度的(HSI)色彩空间中的色调，即强度及饱和度均设置为整个0-255范围。将点色调设置成188(紫)-255和0-16(橙)，将胞核色调设置成76(绿)至163(蓝)。通过图像采集期间使红色(1.2)、中性绿(1.0)过度曝光和蓝色(0.56)欠曝光而增强点-胞核反差，其中所述的图像采集在配有DP50550万像素相机和CellD图像采集软件的Olympus BX51显微镜上进行。图3显示处理的细胞图像以及点计数的结果。

Claims (55)

1.一种用于使样品中单个靶单位可视化的方法，其中所述靶被固定，包括

a)将含有单个靶单位的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与单个靶单位直接结合，

并且，用单个靶单位的部分亚群体形成一个或更多个离散的单个靶位点，其中每一单个的离散单个靶位点含有所述部分亚群体的一个单个靶单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

b)将a)的样品在水溶液(i)中孵育，所述水溶液(i)含有量少于2mM的过氧化物化合物，

与a)的离散单个靶位点结合的所述酶的第一底物，以及，

所述酶的第二底物，

其中所述第一底物是水溶性富电子化合物，其

(3)能够与所述酶反应时产生自由基；并且

(4)能够在所述酶和过氧化物化合物存在时交联所述第二底物分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，

其中具有氧化还原酶活性的酶的所述第一底物是含有式(I)结构的化合物

式(I)：

其中，

R₁是芳基或乙烯基，

R₂、R₃和R₄独立地是-H、-N-(X)₂、-O-(X)₂，其中X是烷基、乙烯基或芳基，或-H，并且其中R₂、R₃和R₄不同时为-H，

其中，

H是氢；

O是氧，

其中，所述第二底物是偶联物分子，其含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自发光性、放射性或生色性物质以及特异性结合对的成员，

从而在a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且使所述a)的单个靶位点可视化，

其中所述偶联物分子含有至少一种由式(II)定义的化合物作为具有氧化还原酶活性的酶的底物：

式(II)：

其中，

R₁是–H、–O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₂是–H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₃是–H、-OH、-NH₂或-SH，

R₄是-H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₅是–H、-O-X、-N(X)₂或-S-X，

R₆是-CON(X)₂或-CO-X，

其中，

H是氢，

O是氧，

S是硫，

N是氮，并且

X是-H、烷基或芳基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发光性物质为荧光性物质。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有氧化还原酶活性的酶为过氧化物酶或酚氧化酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种结合剂是特异性结合对的成员。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述靶位点用样品中存在的少数单个靶单位形成。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述靶位点用样品中存在的多数单个靶单位形成。

7.根据权利要求3所述的方法，其中酶是辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶或漆酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中式(I)的化合物是3,3’-二氨基联苯胺或其衍生物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中式(I)的化合物是阿魏酸或其衍生物。

10.根据权利要求8所述的方法，其中3,3’-二氨基联苯胺或其衍生物的量少于1mM。

11.根据权利要求1所述的方法，其中至少两种化合物由式(II)所定义。

12.根据权利要求11所述的方法，其中由式(II)所定义的至少两种化合物是相同的化合物。

13.根据权利要求11所述的方法，其中由式(II)所定义的至少两种化合物是不同的化合物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中由式(II)所定义的化合物选自肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸或它们的衍生物。

15.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中偶联物含有至少一个酪氨酸残基作为酶的底物。

16.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中偶联物中，能够作为与单个靶位点结合的酶的底物的至少两种化合物中，每一种彼此在偶联物分子中由30个或少于30个连续连接的原子分隔，并且可检测标记物被由30个或多于30个连续连接的原子与任何所述底物分隔。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在偶联物分子中将标记物与具有氧化还原酶活性的酶的任何底物分隔的至少30个连续连接的原子含有下式(III)的2到10个重复

其中R₁和R₂选自-NH和-O，R₃选自甲基、乙基、丙基、-CH₂OCH₂和-(CH₂OCH₂)₂，且其中没有超过3个连续重复的乙氧基。

18.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中第二底物由相同偶联物分子的群体或不同偶联物分子的群体表示，其中所述偶联物分子是根据权利要求1和11-17任一项中所定义的任一种。

19.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤b)前的步骤b’)，其中将样品在水溶液(ii)中孵育，所述水溶液(ii)是不含有第二底物的水溶液(i)。

20.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少一个洗涤步骤。

21.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，进一步包括步骤c)，其中检测b)的单个靶位点。

22.根据权利要求21的方法，其中步骤c)包括分步骤：

c’)将在a)的离散单个靶位点处含有第二底物的离散沉积物的b)的样品与能够特异性结合沉积的第二底物的可检测标记物的结合剂孵育，并形成含有沉积的第二底物的一个或更多个分子和所述结合剂的一个或多个分子的复合物，

c”)检测在c’)的样品中与第二底物的离散沉积物结合的结合剂，并且从而检测与所述单个靶位点结合的单个靶单位。

23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤c)中所述结合剂含有酶。

24.根据权利要求22所述的方法，其中步骤c)中所述结合剂含有可检测标记物，可检测标记物选自生色性、发光性或放射性物质或特异性结合对的成员。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述发光性物质为荧光性物质。

26.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中在单个靶位点处的第二底物的单个离散沉积物具有圆形，并且在二维视野中鉴定为可视清晰点。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述清晰点是直径为或大于0.4微米的点。

28.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述靶选自生物学或化学分子、粒子、分子复合物或细胞复合物、分子结构或细胞结构、病毒或微生物、或所述分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物的片段。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述靶是生物标记物。

30.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中单个的靶单位选自独自的单个生物学分子或化学分子、独自的单个粒子、独自的单个分子复合物或细胞复合物、独自的单个分子结构或细胞结构、或独自的单个病毒或微生物，或所述分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物的独自单个片段。

31.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述样品是生物、化学或环境的样品。

32.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述样品是组织学样品。

33.根据权利要求28所述的方法，其中所述靶是蛋白或核酸分子，或其片段或衍生物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述靶是细胞膜受体或胞质蛋白或胞质核酸。

35.一种用于检测样品中固定靶的单个单位的方法，其中所述靶以宽泛的动态浓度范围存在于样品中，包括

a)将所述样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与所述单个靶单位直接结合，

并且，用单个靶单位的第一部分亚群体形成一个或更多个离散的第一靶位点，其中每一单个离散的第一靶位点含有单个单位的所述第一部分亚群体的一个单个靶单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

b)根据权利要求1的步骤b)所述将a)的样品与结合于a)的第一靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和过氧化物化合物进行孵育，从而在a)的第一靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；

c)将b)的样品与一定量过氧化氢溶液孵育，所述量足以淬灭与a)的第一单个靶位点结合的酶的残余活性；

d)将c)的样品与一种或多种结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与所述单个的靶单位直接结合，

从而，用单个靶单位的第二部分亚群体形成一个或更多个离散的第二靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有单个单位的所述第二部分亚群体的一个单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

e)根据权利要求1的步骤b)所述将d)的样品与结合于第二单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化合物进行孵育，从而在d)的第二靶位点形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；

f)检测样品中第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物作为第一可视清晰点，从而检测到所述靶的第一群体的一个或更多个的单个单位；

g)检测样品中第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物作为第二可视清晰点，从而检测到所述靶的第二群体的一个或更多个的单个单位。

36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤a)中所述具有氧化还原酶活性的酶为过氧化物酶或酚氧化酶。

37.根据权利要求35所述的方法，其中步骤a)和步骤d)的结合剂是相同的结合剂。

38.根据权利要求35所述的方法，其中步骤a)和步骤d)的结合剂是不同的结合剂。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中第一群体的第二底物的分子和第二群体的第二底物的分子是不同的偶联物分子。

40.一种用于样品中至少两种不同的固定靶的单个单位的可视化和检测方法，包括

a)将所述样品与一种或多种能够与第一靶结合的结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与第一单个靶单位直接结合，

从而，用第一单个靶单位形成一个或更多个离散的第一单个靶位点，其中每一单个离散的第一靶位点含有第一靶的一个单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

b)根据权利要求1的步骤b)所述将a)的样品与结合于第一单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和过氧化物化合物进行孵育，从而在a)的第一单个靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；

c)将b)的样品与一定量过氧化氢溶液孵育，所述量足以淬灭与a)的第一单个靶位点结合的酶的残余活性；

d)c)的样品与一种或多种能够与第二靶结合的结合剂孵育，其中

(1)所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

(2)所述结合剂的至少一种能够与第二单个靶单位直接与结合，

从而，用第二单个靶单位形成一个或更多个离散的第二单个靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有第二靶的一个单个单位和一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有具有氧化还原酶活性的酶；

e)根据权利要求1的步骤b)所述将d)的样品与结合于第二单个靶位点的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化合物进行孵育，从而在d)的第二靶位点形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；

f)检测样品中第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物作为第一可视清晰点，从而检测到第一靶的一个或更多个的单个单位；

g)检测样品中第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物作为第二可视清晰点，从而检测到第二靶的一个或更多个的单个单位。

41.根据权利要求40所述的方法，其中步骤a)中所述具有氧化还原酶活性的酶为过氧化物酶或酚氧化酶。

42.根据权利要求40所述的方法，其中至少两种不同的固定靶是不同的生物分子。

43.根据权利要求40所述的方法，其中所述靶的至少两者是不同的核酸或不同的蛋白质。

44.根据权利要求40所述的方法，其中所述靶的至少一种是核酸并且至少另一种是蛋白质。

45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中第一群体的第二底物分子和第二群体的第二底物是不同的第二底物分子。

46.根据权利要求35-38和40-44中任一项所述的方法，其中第二底物分子含有权利要求1中式(II)所定义的化合物，且第一底物分子选自权利要求1中式(I)所定义的化合物。

47.根据权利要求35-38和40-44中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少一个额外步骤。

48.根据权利要求35-38和40-44中任一项所述的方法，其中样品是组织学样品。

49.根据权利要求1-4、35-38和40-44中任一项所述的方法，在所限定的任何步骤前含有一个或更多步骤。

50.根据权利要求1-4、35-38和40-44中任一项所述的方法，其中该方法在所限定的任何步骤之后含有一个或更多步骤。

51.根据权利要求1-4、35-38和40-44中任一项所述的方法，其中至少一个步骤是自动的，或其中该方法进一步包括至少一个自动步骤。

52.一种用于定量评价样品中固定靶的方法，包括

a)根据上述权利要求中任一项所述的方法处理样品；

b)定量样品中的可视清晰点；以及

c)评价样品中靶的量。

53.根据权利要求52所述的方法，其中手工或自动定量所述清晰点。

54.根据权利要求52或53所述的方法，其中将所述靶的量相对地评价为每一参照标记、样品体积或样品面积的靶量。

55.一种测定法，包括根据权利要求1-54中任一项的方法检测单个靶单位的步骤。