JP5836958B2 - 単独標的実体の免疫化学的検出 - Google Patents

単独標的実体の免疫化学的検出 Download PDF

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Description

本発明は、単独分子、単独分子構造、単独粒子などの単独標的実体を、前記単独実体が固定化されている試料において免疫化学的可視化および定量する分野に存する。詳細には、本発明は、生物学的または化学的標的の単独ユニットを可視化および定量するための方法、詳細には、組織学的試料における生物学的標的の単独分子の免疫化学的可視化に関する。本発明の方法は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素によって媒介して検出可能な分子の別々のデポジット（沈着、deposit）を、試料の単独標的部位に形成するステップであって、単独標的部位が標的の単独ユニットを含むステップを含む。
免疫化学は、医学的診断における一般的なツールであり、また、治療用バイオマーカーを評価するために日常的である。詳細には後者は多くの場合に、その存在規模の定量的評価を必要とする。細胞および組織への抗体の施与は、これらの試薬を、固体支持体上か、溶液中に固定化された精製タンパク質に施与する場合に遭遇するような困難を上回る特有の困難をもたらす。免疫検出に影響を及ぼし得る多くの因子、特には、組織の固定および調製、抗原賦活化の所要時間および種類ならびに抗体特異性が存在する。追加的な困難は、低レベルで存在する標的を検出する可能性である。可溶性アッセイと同じく、非特異的背景レベルを上昇させることなく、シグナルを増大させることが重要となる。最も一般に調査されている手法は、シグナル増幅であり、これは、連続した複数ラウンドの酵素反応によって達成される。
ＤＡＢは、ペルオキシダーゼ活性で標識されている組織学的試料中の標的タンパク質を可視化するために広く使用されているホースラディッシュペルオキシダーゼの発色性基質である。その方法は、試料のタンパク質を標的とする抗体に結合しているＨＲＰがＤＡＢを、溶液から、標的とされたタンパク質の部位へとデポジットさせ、それによって、タンパク質を標識することを利用する。その方法は、特に高感度ではなく、したがって、相対的に豊富な標的タンパク質を検出するために適している。ＤＡＢデポジットに付随するシグナルをさらに増幅することはできない。述べるべき他の欠点は、その方法が、全ての標的部位を飽和させるために、標的特異的な抗体をむしろ多い量で要求し、比較的遅いことである。さらに、その方法は、均一な染色パターンをもたらし、これは、顕微鏡使用者には、細胞構造、例えば膜、細胞質および核の細胞内解像と均一な色として見え、このことによって、正確に染色を定量することが不可能になる。
触媒によるシグナル増幅（ＣＳＡ）（米国特許第５，８６３，７４８号；同第５，６８８，９６６号；同第５，７６７，２６７号；同第５，７２１，１５８号；同第５，５８３，００１号；同第５，１９６，３０６号；同第６，３７２，９３７号；同第６，５９３，１００号；同第６，５９３，１００号に記載）は、ビオチニル−およびフルオレシル（ｆｌｕｏｒｅｓｃｙｌ）−チラミドを採用して、ＨＲＰ標識標的タンパク質からのシグナルを増大させて、そうして、慣用の方法（即ち上記の方法）によってはさもないと検出不可能である量の少ない標的の検出を可能にした。しかしながら、特に、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）試料では、背景染色が著しく、染色の結果の解釈が困難であるために、ＣＳＡは、臨床組織病理学において組織学的試料を評価するための日常的な手法としては広く受け入れられてはいない。
最近では、ＩＨＣ試料中の量の少ない標的分子を検出することを可能にする他のＨＲＰベースの増幅方法が記載されている（ＷＯ２００９０３６７６０号、ＷＯ２０１００９４２８３号およびＷＯ２０１００９４２８４号に記載）。その方法は、ＤＡＢをＨＲＰの発色性基質としてではなく、ＨＲＰによる他の検出可能なＨＲＰ基質のデポジションを媒介する架橋剤として利用する。方法は、デポジットされたＨＲＰ基質のシグナルの著しい増幅をもたらし、このことによって、方法の感度は、ＣＳＡ方法に匹敵するものとなるが、後者の方法と比較すると、新規方法は、背景標識をもたらさないという利点を有する。この新規方法の他の利点のうち、検出手順の速度が、従来のＤＡＢまたはビオチニル−チラミド検出手順よりもかなり早いことは、述べる価値がある。しかしながら、以前の方法の問題、即ち、検出される染料の量の判断に基づくＩＨＣ試料中の標的量の判断は、解決されていない。新規方法は、非常に輪郭明瞭ではあるが、従来のＤＡＢ法またはＣＳＡ法と同様に、細胞構造の細胞内解像と同じ均一な染色である染色パターンをもたらす。この染色パターンは、試料中の染色の量に対し標的の量を直接的に概算することを可能とはしない。それというのも、これらの２つの量の間の相関は線形ではないためである。したがって、これらの方法全てによって可視化された組織学的試料中の標的の量は相対的でしかなく、正確に評価することはできない。
したがって、方法論に関する品質保証スキームは改良され、ＩＨＣ染色の標準を高めているが、染色結果の解釈に関するスキームは、変わっていない。組織が「陽性」または「陰性」であるかを評価するために変動するカットオフレベルを使用する種々のスコアリングシステムが通常は、抗原を評価するために使用される。そのような現在使用されている評価は、医学的診断において決定的に重大であり得る誤差と必然的に結びついている。
試料中に存在する個別標的分子の正確な量の評価に基づく標的発現の評価、いわゆる単独分子検出（ＳＭＤ）アプローチは、より信頼性があり、医学的診断および療法の両方に関して評価し得るであろうＩＨＣにおける新たなスコアリングシステムに至る１つの方法となり得るであろう。残念ながら、組織学的試料中の標的タンパク質の単独分子を可視化することを可能にする利用可能な技術の数は、今のところ非常に限られており、これらはむしろ面倒であり、手順が長い。
基本的に、全ての利用可能な単独タンパク質分子検出技術は、ＤＮＡをベースとする増幅システムを使用する。単独タンパク質分子検出はイムノＰＣＲの出現で初めは証明された（Ｓａｎｏ Ｔ、Ｓｍｉｔｈ ＣＬ、Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ．Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ：ｖｅｒｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２；２５８：１２０〜１２２；Ａｄｌｅｒ Ｍ、Ｗａｃｋｅｒ Ｒ、Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ＣＭ．Ａ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒｏｕｔｉｎｅ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００３；３０８：２４０〜２５０；Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ＣＭ、Ａｄｌｅｒ Ｍ、Ｗａｃｋｅｒ Ｒ．Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ：ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３：２０８〜２１６）。抗体−ＤＮＡハイブリッド構成体を使用して、ＰＣＲで達成可能な高感度検出によって、抗体の結合親和性が補足された。加えて、イムノＤＮＡコンジュゲートにつながれている長いｓｓＤＮＡオリゴマーを生じさせるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、等温技術を使用するために、イムノＤＮＡ検出ストラテジーは拡張されている（Ｇｕｓｅｖ Ｙ、Ｓｐａｒｋｏｗｓｋｉ Ｊ、Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ Ａ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｈ Ｊｒ、Ｍｏｎｔａｎｏ Ｊ、Ｂｏｇｄａｎ Ｎ、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ Ｂ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ Ｓ、Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ ＳＦ、Ｍａｌｔｚｍａｎ Ｗ、Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｖ．Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００１；１５９：６３〜６９）。
述べるべきこれらのＳＭＤ手法のいくつかの本質的な欠点は、
（ｉ）抗体−ＤＮＡハイブリッドの合成が、問題となり得るが、それというのも、タンパク質１つごとのＤＮＡコンジュゲートの位置および数の制御が常には直線的でなく、多くの場合に、抗体１つ当たりのＤＮＡタグの不均一な濃度をもたらし；増幅反応を制御するのが困難であり；増幅ステップが、温度不安定性であり；標識が安定してなく、標識は、時間経過と共に標的から拡散するはずであるなどのためである。非常に成功しているインテイン化学（または化学的結紮）を使用してのタンパク質へのオリゴヌクレオチドタグの部位特異的コンジュゲーションにおける最近の開発にもかかわらず、コンジュゲートの調製はまだ面倒なままであること；
（ｉｉ）方法のステップが、温度制御を必要とすること；
（ｉｉｉ）検出手順が、多すぎるステップを含むこと；および
（ｉｖ）検出のプロセス全体が、比較的長時間かかることである。
本発明のＳＭＤ手法は、上記の障害を克服し、試料中にある標的の単独実体を可視化および定量し、その際、前記単独実体が固定化されていることを、簡単かつ信頼可能にし得る。
本発明は、種々の試料中の様々な標的の単独実体を可視化、検出および定量するための迅速で、簡略で、かつ確実な方法であって、その際、標的が固定化されている方法を提供する。方法は、組織学的試料などの複雑な生体試料を評価するために特に有利である。
本発明の方法は、非常に幅広い動的濃度範囲の単独分子、単独分子構造、単独分子複合体、単独粒子などの標的の個別の単独実体を試料のホスト多様性で可視化することができる新規の強力なシグナル増幅システムを含む。「標的の単独実体」という用語は、「標的の単独／個別ユニット」という用語と本明細書では互換的に使用されている。
本発明の方法は、
ａ）試料において、酵素活性で標識された１つまたは複数の標的部位を形成し、その際、前記標的部位それぞれが、標的の単独ユニットを含み、前記標的部位が、試料の単独標的ユニットの全量の分別部分集団で形成されているステップと；
ｂ）検出可能な分子（本明細書では「リポーター分子」または「リポーター」とも称される）の別々のデポジットを単独標的部位それぞれに形成するステップとを含む。
一部の実施形態では、試料が本発明による標的部位を既に含んでいる場合には、上記のステップ（ａ）が余計なこともある。
他の実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数のさらなるステップ、例えば
ｃ）リポーター分子の別々のデポジットを単独標的部位で視覚的に識別可能なドットとして検出するステップを含んでよい。
一実施形態では、本発明は、固定化されている標的の個別単独ユニットを試料中で可視化する方法（方法（１））に関し、この方法は、
ａ）標的の個別ユニットの集団を含む試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の単独標的部位はそれぞれ、前記分別部分集団の個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つが酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ａ）(ａ）の試料を、
２ｍＭ未満の量のペルオキシド化合物、
（ａ）の別々の単独標的部位に付随している酵素の第１基質および
前記酵素の第２基質
を含む水溶液（ｉ）中でインキュベートするステップであって、
前記第１基質は、
（１）前記酵素と反応するとラジカルを発生させることができ、
（２）前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記第２基質の分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる
水溶性の電子リッチな有機化合物であり、
前記第２基質は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの化合物を含むコンジュゲート分子であり、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択され、
それによって、第２基質の別々のデポジットを（ａ）の別々の単独標的部位に形成し、（ａ）の前記単独標的部位を可視化するステップとを含む。
上記のとおりのステップ（ａ）および（ｂ）を含む本発明の方法は、別々のデポジットを単独標的部位で検出する１つまたは複数のステップをさらに含んでよい。
一実施形態では、上記の方法（１）は、固定化されていて、幅広い動的濃度で存在する標的の単独個別ユニットを試料中で検出および可視化するために使用することができ、この場合、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み；
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの第１分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の第１標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、前記第１分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、（ａ）の第１標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１の単独標的部位に付随している残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、標的の個別単独ユニットの第２の分別部分集団で１つまたは複数の別々の第２の標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、前記第２分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の前記試料を、第２単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第２集団および上記方法（１）のステップ（ｂ）（即ち、請求項１のステップ（ｂ））によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第１集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第２集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む。
本発明の他の実施形態では、方法（１）は、少なくとも２つの異なる固定化標的の個別ユニットを試料中で検出および可視化するために使用することができ、この場合、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第１標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第１標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第１標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第１単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、第１標的の個別単独ユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、第１単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および上記方法（１）のステップ（ｂ）（即ち、請求項１のステップ（ｂ））によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１単独標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１単独結合部位に付随している酵素の残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第２標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第２標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第２標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第２単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、第２標的の個別のユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の試料を、第２単独結合部位に付随している第１基質、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質の分子の第２集団および上記方法（１）のステップ（ｂ）（即ち、請求項１のステップ（ｂ））によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第１標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第２標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む。
本発明の他の態様は、試料中の標的を定量する方法に関し、この方法は、
ａ）本発明の方法のいずれか（上記）に従って、生体試料を処理するステップと；
ｂ）試料中の視覚的に識別可能なドットを定量するステップと；
ｃ）試料中の標的の量を評価するステップとを含む。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載されている単独標的検出および定量方法を医学的診断において、詳細には、生物学的マーカーの単独ユニットの可視化および定量が、診断の精度、治療処置の効力の推定、疾患の結果の予測、疾患の危険性の予知または治療計画に関する患者の層別化などのために必須である予診および治療用途のために使用することに関する。
他の態様では、本発明は、本発明の方法を使用して、様々な標的の個別単独ユニットを検出および定量するためのアッセイに関する。
本発明の増幅システムは、非常に強力で確固としていると同時に、柔軟で、容易に制御可能である。これは、試料を評価するための現行の検出方法、詳細には、通常の明視野または蛍光顕微鏡法を使用する検出方法の限界を大いに拡げる。詳細には、本発明の増幅システムを含む検出方法を使用すると、
（ｉ）固定化された標的の単独実体を、組織学的試料などの複雑な試料中で可視化および定量することができ；
（ｉｉ）様々なアッセイフォーマットを使用して、固定化された標的の単独実体を検出および定量することができ；
（ｉｉｉ）固定化された標的の単独実体を、１０〜２０分以内など非常に迅速に検出および定量することができるが、しかしながら、必要ならば、結果の品質を損なうことなく、可視化および検出手順をより長い期間延長または中断することができ；
（ｉｖ）典型的には背景の標識を低減するために使用されるブロッキングが、不要であり；
（ｖ）温度制御が不要であり；
（ｖｉ）固定化された標的の単独実体を、非常に幅広い動的範囲で検出および定量することができ、
（ｖｉｉ）多数の固定化された標的の単独実体を１つの手順で、試料において検出および定量することができる。
したがって、本発明のＳＭＤ可視化システムの大きな利点は、それが簡潔、迅速、確実、信頼可能、かつ柔軟であることである。このことによって、様々なアッセイを使用して、様々な標的の単独実体を様々な試料において可視化および定量することができる。追加的な利点は、方法が、市販か、または製造するのが容易である十分に定義されている化学化合物である化合物を利用することである。さらなる利点は、方法の全ての手順を、手動および自動の両方で実施することができることである。
Ｈｅｒ２（＋２）を発現する組織試料の免疫化学的染色の代表的な顕微鏡写真を示す図であり、（１）はＨｅｒ２が本発明によって可視化されている試料であり、（２）はＨｅｒ２がＷＯ２００９０３６７６０に記載される方法によって可視化されている試料である。右パネルは、方法（１）および方法（２）の染色パターンの図示である。 本発明の方法による単独分子検出のプロセスの図示である（請求項１のステップ（ｂ）および請求項２３〜２４のステップ（ｃ）を示す）。 本発明の方法による細胞中のＨｅｒ２の定量化の結果を示す図である（実施例１０を参照）：ａ．０＋Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ対照細胞系の１０×画像の単色分割。１画像につき２１ドット（黒色）を特定した；ｂ．１＋Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ対照細胞系の１０×画像の単色分割。１画像につき３６ドット（黒色）を特定した；ｃ．３＋Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ対照細胞系の１０×画像の単色分割。１画像につき２５６７ドット（黒色）を特定した；ｄ．乳癌の１０×画像の２色分割。ドットは白色、核黒色、背景灰色である；ｅ．３＋Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ対照細胞系の１０×画像の２色分割。ドットは黒色、核白色、背景灰色である。ｃと同じ試料。
試料中で固定化された標的の個別ユニットを可視化する方法
本発明の一態様は、固定化されている標的の単独個別ユニット、例えば単独標的分子、単独粒子などを試料中で可視化する方法に関する。
一実施形態では、本発明は、固定化されている標的の単独ユニットを可視化する方法に関し、前記方法は、
ａ）別々の単独標的部位それぞれが標的の単独個別ユニットを含む、１つまたは複数の別々の単独標的部位を形成するステップと；
ｂ）検出可能な分子の別々のデポジットを、（ａ）の別々の単独標的部位に形成して、それによって、前記単独標的部位を可視化するステップと、場合によって、
ｃ）別々のデポジットを、別々の単独標的部位で検出するステップとを含む。
詳細には、上記方法のステップ（ａ）、（ｂ）および、場合によって（ｃ）は、次のとおりに行うことができる：
ａ）ａ）標的の個別ユニットからなる集団を含む試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み；
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが標的の個別単独ユニットに直接結合することができる
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の単独標的部位はそれぞれ、前記分別部分集団の１つの個別単独ユニットと、そのうちの少なくとも１つが酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと、
ｂ）（ａ）の試料を、
２ｍＭ未満の量のペルオキシド化合物、
（ａ）の別々の単独標的部位に付随している酵素の第１基質および
前記酵素の第２基質
を含む水溶液（ｉ）中でインキュベートするステップであって、
前記第１基質は、
（１）前記酵素と反応するとラジカルを生じさせることができ、
（２）前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記第２基質の分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる
水溶性の電子リッチな有機化合物であり、
前記第２基質は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの化合物を含むコンジュゲート分子であり、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択され、
それによって、第２基質の別々のデポジットを（ａ）の別々の単独標的部位に形成し、（ａ）の前記単独標的部位を視覚的に識別可能なドットとして可視化するステップと、場合によって、
ｃ）第１基質の別々のデポジットを（ａ）の単独標的部位で検出し、（ａ）の単独標的部位を視覚的に識別可能なドットとして可視化し、それによって、標的の単独個別ユニットを可視化するステップとを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、
（ｂ’）（ａ）の試料を、
２ｍＭ未満の量のペルオキシド化合物および
（ａ）の標的部位に付随している酵素の第１基質
を含む水溶液（ｉｉ）中でインキュベートするサブステップであって、前記第１基質は、
（１）前記酵素と反応するとラジカルを生じさせることができ、
（２）前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記第２基質の分子を架橋させ、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる
水溶性電子リッチな有機化合物であるサブステップと、続いて、
（ｂ’’）試料（ｂ’）を、水溶液（ｉ）（上記）中でインキュベートするサブステップとを連続して含んでよい。
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、
ｃ’）（ａ）の単独標的部位に第２基質の別々のデポジットを含む（ｂ）の試料を、デポジットされた第２基質の検出可能な標識に特異的に結合することができる結合剤と共にインキュベートし、デポジットされた第２基質の１つまたは複数の分子と、前記結合剤の１つまたは複数分子とを含む複合体を形成するサブステップと、
（ｃ’’）試料（ｃ’）において、第２基質の別々のデポジットに結合している結合剤を検出して、それによって、単独標的部位を検出し、それによって、前記単独標的部位に付随している標的の個別単独ユニットを検出するサブステップとを含んでよい。
本発明の方法（上記および下記）は場合によって、１つまたは複数の追加的なステップ、例えばステップ（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に先行するステップ、例えば、ステップ（ａ）の前の、試料の内生または残りのペルオキシダーゼ活性を阻害する化合物で試料をクエンチするステップ、またはステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の間の１つまたは複数のステップ、またはステップ（ｃ）の後のステップ、例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前、その後もしくはそれらの間の１つまたは複数の洗浄ステップを含んでよい。一実施形態では、方法は、少なくとも１つの自動ステップを含んでよい。
方法の他の実施形態は、下記のセクションで検討される。
試料
「試料」という用語は、より大きな全体または群からの代表的な一部または単独アイテム、検出される標的をおそらく含有する物質または対象の量または部分、例えば、分析される標的分子、粒子、構造を含む生物学的、化学的、環境物質、例えば、生検試料、食品試料、土壌試料などの部分または量を意味する。典型的な試料は、物質または対照の残りが同様か、同様であるべきことを示す。一実施形態では、本発明の試料は、環境試料、例えば土壌試料または溢流の試料であってよい。他の実施形態では、試料は、食品試料であってよい。他の実施形態では、試料は、有機分子のライブラリの部分であってよい。他の実施形態では、試料は、戦争の試料であってよい。
一実施形態では、本発明の試料は、生体試料である。
生体試料は、
１．懸濁されている細胞および／または細胞破片を含む試料、例えば血液試料、クローニングされた細胞、体組織ホモジネートなどの懸濁液；
２．動物身体、体組織、塗沫もしくは体液の無損傷または損傷細胞を含む試料または腫瘍の試料、例えば生検試料；（これは、新鮮な組織試料または保存組織試料、例えばホルマリン固定パラフィン埋め込み組織試料であってよい）；
３．生体を含む試料、例えば、動物、植物、細菌、真菌などを含む培地の試料；
４．ウイルス粒子、その破片またはウイルス産生物を含む試料、例えば、ウイルスの核酸、タンパク質、ペプチドなどを含む身体塗沫；
５．細胞オルガネラ（複数可）を含む試料；
６．天然または組換え生物学的分子を含む試料、例えば血漿試料、条件付細胞培地など、
７．植物細胞またはその破片を含む試料によって例示され得る。
上述の生体試料の例は、説明を目的として示されており、本発明の実施形態を限定するために示されているのではない。
化学的試料の例は、化学化合物のライブラリ、例えばペプチドライブラリの試料によって説明することができるが、これらに限定されない。環境試料の例は、土壌、水または空気試料および食品試料によって説明することができるが、これらに限定されない。
本発明は、固定化された標的を含む試料（例えば、上記の例のいずれかとして）に、即ち、例えば、ある種の支持体または培地に、またはその中に付着している試料または標的の場合など、標的が本発明による検出手順の間に移動する自由を妨げられている試料、例えば、標的の運動が機械的または化学的手段によってかなり低減されているか、除去されている試料に関する。したがって、該当する標的の単独個別ユニットを含む試料を一実施形態では、検出手順の前に固体支持体に固定化することができ、例えば、固体体組織試料をガラススライド上に固定化する。本発明の固定化された標的を含む試料の例には、これらに限られないが、ガラスまたはプラスチックスライド上に固定化された体組織試料または膜もしくはＥＬＩＳＡプレートなどの上に固定化された生物学的または化学的分子を含む試料が包含される。これらの実施形態中の試料の標的は、試料内に固定化されていてよく、例えば、組織試料内に固定化されているタンパク質であるか、または固体物質の一部またはニトロセルロース膜などのゲルなどのある種の物質の表面上もしくはその中に固定化される。一実施形態では、固体支持体は、三次元構造、例えばコラーゲンまたは寒天ブロックであってよい。この実施形態では、標的、例えば分子または粒子は、構造内に固定化されていてよい。
一実施形態では、本発明は、標的を含まない試料、例えば対照試料に関する。他の実施形態では、本発明は、標的をおそらく含む試料、例えば未知の含分での試料に関する。
上述の「固体支持体」という用語は、本発明による手順の条件下で不溶性である任意の物質の一片を意味し、例えば、ニトロセルロース膜、ガラススライドなどであってよい。試料および／または標的を固定化するのに適した支持体の例には、これらに限られないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン、例えば、アミノ化またはカルボキシレート化ポリスチレンなどの合成ポリマー支持体；ポリアクリルアミド；ポリアミド；ポリビニルクロリド；ガラス；アガロース；ニトロセルロース；ナイロン；ポリビニリデンジフルオリド；表面改質ナイロンなどが包含される。本発明は、本明細書に記載の条件下で化学的に不活性である固体支持体に関し、即ち、選択される支持体は、方法による検出結果に対して何ら重大な影響を有してはならない。したがって、選択されたアッセイフォーマット、例えば、ＩＨＣ、ＥＬＩＳＡ、ブロッティングなどに合わせて、試料または標的を固定化するために適した任意のそのような不活性支持体を選択することができる。
標的
「標的」という用語は、本内容では、特に物理的および／または機能的特徴によって特徴付けられ得る試料中におそらく存在する該当する対象を意味する。本発明の内容では、「標的」という用語は、その対象の実質的に同一の実体のプール全体に関し、試料中のその対象の単独実体に関するのではないことは理解される。「実質的に同一」という用語は、本内容では、試料中の標的のプール全体の全て、または実質的に全ての単独実体が、それらを標的として認識させる１つまたは複数の特徴を有することを意味する。例えば、標的は、試料中の特定のタンパク質の全ての分子を包含する特定のタンパク質であってよく；本発明の標的の他の例は、特定の分子複合体または分子構造を含む試料の実質的に全ての対象を包含する特定の分子複合体または構造であってよく；本発明の標的の他の例は、ウイルス性粒子または細菌であってよく、その際、試料のそのウイルス性粒子またはその細菌の集団全体が、標的である。
特定の細胞種、組織、細胞構造、生理学的条件などに特徴的である形質に関連する分子、分子複合体、構造、粒子または生物体などの生物学的対象は多くの場合に、その特定の細胞種、組織、細胞構造または生理学的条件の「生物学的マーカー」と称される。そのような生物学的マーカーの非限定的例には、これらに限られないが、特定のヌクレオチド配列、タンパク質または他の生物学的分子、例えば炭水化物または脂質、染色体または膜構造、ウイルス、細菌、微生物などが包含される。本発明の一部の実施形態では、「標的」という用語は、「生物学的マーカー」という用語と互換的に使用されており、特定の細胞種、組織、生理学的状態などに特徴的な分子、分子複合体、構造または粒子に関し、その際、試験試料中の後者の生物学的マーカーのいずれかの集団全体が、標的であるとみなされる。
一実施形態では、標的は、タンパク質、例えば、細胞膜受容体または細胞質タンパク質であってよく、他の実施形態では、標的は、核酸、例えば、細胞質核酸であってよい。後で述べられた標的のいずれの誘導体も、例えば、標的タンパク質または核酸などの断片、前駆体、変異型もまた、本発明の一部の実施形態では、標的であってよい。
したがって、本発明の異なる実施形態では、標的は、生物学的もしくは化学的標的分子または粒子または分子もしくは細胞の複合体または分子もしくは細胞の構造またはウイルスまたは微生物または前記標的分子、粒子、複合体、構造、ウイルスもしくは微生物の断片であってよい。化学的および環境試料中に含有される標的には、種々の汚染物質、毒素、戦争用物質、分子ライブラリの膜、工業的有害廃棄化合物などであってよい。
詳細には、本発明は、多数の独立した実質的に同一のユニットによって試料中で表され得る標的に関し、詳細には、本発明は、標的の単独個別ユニットに関する。
「ユニット」という用語は、算出の際に統一体としてみなされ、１つの特定の機能を行うために働く標的の単独量を意味している。「個別」という用語は、ユニットが、同じ種類の他のユニットまたは環境の他の成分から分離可能であり（機能の物理的形質によって）、別々に見なし、カウントすることができることを意味する。「個別のユニット」という用語は、「単独ユニット」という用語と互換的に使用されている。「単独」という用語は本内容では、標的ユニットが、分離可能な統一体からなっているか、数において１つのみからなっているか、多くと対立するか、もしくは多くと異なる１つからなることを意味する。例えば、標的タンパク質の単独／個別ユニットは、標的タンパク質の単独で個別のタンパク質分子を、即ち、同じ種類の複数の分子のうちの１つの分子を意味する。「実質的に同一のユニット」という用語は、標的の複数の単独ユニットが、これらのユニットを標的として見なし得る１つまたは複数の形質を有することを意味する。「独立」という用語は、標的の単独ユニットが、識別可能な実体として存在していて、試料中の同じ種類の他の識別可能な実体の存在に依存していないことを意味する。
本発明は、一部の実施形態において、分子の単独部分である単独ユニットに関する。「分子の単独部分」という用語は、分子のこの部分を同じ分子の他の部分とは別にみなさせる特定の特性を有する分子の部分、例えば、標的タンパク質のタンパク分解断片、融合タンパク質の部分、標的タンパク質の特定のドメイン、核酸の特定の構造、エピトープなどに関する。
したがって、一実施形態では、本発明は、単独個別標的分子である標的の単独／個別ユニットに、即ち、試料中に存在する複数の単独個別標的分子に関するものであり得、他の実施形態では、本発明は、分子の単独個別の部分である標的の単独／個別ユニット、例えば、試料中の複数の標的分子に存在する特定の分子構造、例えばエピトープに関するものであり得る。他の実施形態では、本発明は、ウイルス性粒子のプールを試料中に存在させている複数の単独個別ウイルス性粒子に関するものであり得る。
種々の実施形態において、標的の複数の単独ユニットは、単独個別の生物学的または化学的分子、単独個別の単独粒子、単独個別の分子もしくは細胞複合体、単独個別の分子もしくは細胞構造または単独個別のウイルスまたは単独個別の微生物または前記分子、粒子、複合体、構造、ウイルスもしくは微生物の単独個別の断片によって表され得る。
好ましい一実施形態では、標的は、例えば核酸およびホルモンのポリペプチドおよび成長因子およびそれらの受容体、細胞接着分子、シグナル伝達分子、細胞周期調節分子など、例えば遺伝子、ＲＮＡおよび成長因子ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦまたはＥＧＦを包含する群のタンパク質、それらの受容体および経路関連分子、シグナル伝達経路、例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路またはＡｋｔ１／ＰＫＢ細胞生存経路または５−ＦＵ経路に関する遺伝子およびその産生物、エストロゲン受容体ＥＲおよびその遺伝子（ＥＲＳ１）など、癌に関する生物学的マーカーである。本発明の方法は、前記生物学的マーカーの簡潔で迅速な可視化および定量を可能にする。
本発明の方法は、試料中に幅広い動的範囲で存在する標的の単独個別ユニットを可視化および定量することを可能にする。標的の非常に多い量も非常に少ない量も両方とも、１つの同じ試料中で可視化および定量することができるか、またはこれらは、別々の試料中で評価することができる。例えばタンパク質標的および核酸標的または２つ以上の異なるタンパク質標的または２つ以上の異なる核酸標的など、２つ以上の異なる標的を１つまたは同じ試料中で可視化することができる。
一実施形態では、標的の単独ユニットは、試料全体に実質的に均一に分散していてよく、他の実施形態では、標的の単独ユニットは、試料の一部により豊富に、かつその他の部分にはより少ない量で存在してよい。後者の実施形態のいずれでも、本発明の方法を使用して、１つの同じ試料中で標的の単独ユニットを可視化および定量することができる。単独標的ユニットが、該当する他の標的に付随している、例えば特定の分子集合または構造で存在する一部の実施形態では、その前記特定集合または構造が、病的状態のバイオマーカーである。該当する前記の他の標的も、試料中の単独標的ユニットを可視化および定量することによって、可視化および定量することができる。
一実施形態では、本発明は、試料中に存在する単独個別標的ユニットの全数のうちの大部分または小部分など、試料中に存在する単独標的ユニットの分別部分集団に関する。「分別部分集団」という用語は、本内容では、試料中の標的の単独ユニットの全量のうちの９９％以下、例えば９０％以下、試料中の標的のユニットの全量のうちの８５％未満、例えば７５〜８０％など、試料中の標的の単独ユニットの全量のうちの７５％未満、例えば１％から５０％など、試料中の標的のユニットの全量のうち１％から２５％などである単独標的ユニットの集団全体のうちの一部を意味する。全集団のうちの５０％〜９９％に相当する分別部分集団の単独標的ユニットは、本発明では、試料中に存在する単独標的ユニットの大部分として定義される。試料中の単独標的ユニットからなる集団全体のうちの５０％未満に相当する分別部分集団は、本発明では、試料中に存在する単独標的ユニットの小部分と定義される。
一実施形態では、個別の単独標的ユニットの大部分が、本発明の別々の単独標的部位の形成に関与していてよく；他の実施形態では、個別の単独標的ユニットの小部分が、本発明の別々の単独標的部位の形成に関与していてよい。一実施形態では、標的または標的の単独ユニットが試料中にごく僅かな量で存在する場合、実質的に全ての個別単独ユニットが、本発明の別々の単独結合部位の形成に関与していることが好ましいことがある。
結合剤
本発明の方法は、標的をおそらく含む試料を、そのうちの少なくとも１つは標的の単独個別ユニットを認識し、それと特異的に結合し得る１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートするステップを含む。
「結合剤」という用語は、標的の単独ユニット、例えば標的タンパク質の個別分子に直接的に、または間接的に特異的に結合し得る分子を表している。「特異的に」という用語は、結合剤が、標的に対する特定の親和性、例えば標的分子に対する親和性または標的に結合している作用物質に対する特定の親和性、例えば標的タンパク質に結合している一次抗体に対する親和性、一次抗体とコンジュゲートされているハプテンに対する親和性などを有することを意味している。「直接的に」という用語は、標的の単独個別のユニットに対する特異的な親和性を有する結合剤が、この単独個別ユニットと相互作用して、相互作用の際、直接結合を形成する、例えば、一次抗体が、前記一次抗体を生じさせるための抗原として使用された単独個別標的分子に直接結合することを意味している。「間接的に」という用語は本内容では、標的の単独個別のユニットに対する特異的な親和性は有さないが、その単独個別のユニット、例えば一次抗体に特異的に結合し得る他の物質に対して特異的な親和性を有するか、または前記単独個別のユニットに、例えばハプテンに随伴またはリンクする物質に対して特異的な親和性を有し；後者の物質と直接的に相互作用し、前記物質と結合を形成し、それによって、その結合剤が、標的の単独ユニットに間接的に結合する結合剤に関する。
標的の単独ユニットに直接的に特異的に結合し得る結合剤は本明細書では典型的に、第１結合剤によって表される。標的の単独ユニットに間接的に特異的に結合し得る結合剤は典型的には、第２結合剤によって表される。しかしながら、本発明による検出システムは、標的の単独ユニットに間接的に結合し得るさらなる結合剤、例えば第３、第４およびそれ以上のさらなる結合剤を含んでよい。
典型的には、第１結合剤または、一部の実施形態では、第２もしくは第３結合剤を使用して試料と接触させて、標的を認識させ、それに結合させ、かつそれと共に複合体を形成させる。第２、第３およびそれ以上の結合剤を、本発明による方法のさらなるステップで使用して、例えば、検出可能な分子のデポジットを下記の標的部位で認識することができる。一部の実施形態では、第２、第３およびさらなる結合剤を使用して、標的に結合しているシグナルを増幅する。これらの結合剤はまた、柔軟性を検出システムに加えるために、例えば、標的に結合している元々のシグナルを、例えば赤色蛍光シグナルを緑色などに変化させるために有用である。
本発明の結合剤は、異なる特異的結合対のメンバーであってよい。
いくつかの異なる特異的結合対が、当分野では知られており、これらは、互いに特異的に結合し得る２つの異なる分子の対である。本発明の実施で使用するために適した特異的結合対のメンバーは、免疫または非免疫種のものであってよい。
非免疫特異的結合対には、２つの成分が互いに自然の親和性を共有しているが、抗体ではないシステムが包含される。例示的な非免疫結合対は、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、葉酸−葉酸結合タンパク質、相補的核酸、受容体−リガンドなどである。本発明にはまた、互いに共有結合を形成する非免疫結合対が包含される。例示的な共有結合対には、マレイミドおよびハロアセチル誘導体などのスルフヒドリル反応性基ならびにイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、ハロゲン化スルホニルなどのアミン反応性基ならびに３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）および３−（ジメチル−アミノ）安息香酸（ＤＭＡＢ）などのカプラー染料などが包含される。
免疫特異的結合対は、抗体−抗体系またはハプテン−抗ハプテン系によって例示することができる。一実施形態では、本発明の免疫特異的結合対は、互いに親和性を有する２つ以上の抗体分子、例えば、一次抗体は、第１結合剤を代表し、二次抗体は第２結合剤を代表する一次抗体および二次抗体対を含む抗体−抗体結合対であってよく；３つまたは４つ以上の抗体メンバーを含む抗体系を、他の実施形態で使用することができる。本発明の他の実施形態では、免疫結合対は、ハプテン−抗ハプテン系によって表され得る。そのような実施形態では、第１結合剤は、標的およびハプテンに対して親和性を有する分子、例えば、ハプテンに結合する一次抗体または核酸配列を含むコンジュゲートによって表され得、第２結合剤は、抗ハプテン抗体によって表され得る。
「ハプテン」という用語は、それに対して抗体が作られ得る単離エピトープとみなすことができる小分子を示しているが、ハプテンは単独では、動物に注射されても、免疫応答を誘発することはなく、担体（通常はタンパク質）にコンジュゲートする必要がある。ハプテンは小分子であるので、ハプテンの多数のコピーを、タンパク質、ヌクレオチド配列、デキストランなどの大きな分子、例えば、ポリマー分子に結合させることができる。ハプテンは、シグナルを増幅することが必要または有利であるアッセイフォーマットのための便利な標識分子として働くことができる。したがって、結合しているハプテンの多数のコピーが、増強された感度、例えば高いシグナル強度をもたらす。適切なハプテンの非限定的な例には、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ｍｙｃジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、チロシン、ニトロチロシンビオチンおよび染料、例えば、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ダンシル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ルシファーイエローおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５／Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ蛍光体が包含され、米国特許出願公開２００８０３０５４９７号に記載されているハプテンもまた、本発明の目的のために使用することができる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンまたはその一部を示し、それには、源、生産方法および他の特徴に関わらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドが包含される。この用語には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、単特異性、多特異性、ヒト化、単一鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異およびＣＤＲ−グラフト抗体が包含される。抗体の一部は、抗原になお結合し得る任意の断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖを包含することができる。抗体の由来は、産生方法に関わらず、ゲノム配列によって定義される。
一次抗体は、本発明の内容では、標的に、より具体的には試料の標的の単独ユニットに、例えば単独標的分子に特異的に結合する抗体結合剤、例えば全抗体分子、前記分子の断片または誘導体、例えば、抗体またはポリマー化抗体を含むコンジュゲートを指す。一部の実施形態では、一次抗体は、異なる標的の２つ（またはそれ以上）の単独個別ユニットに結合し得る二価抗体、例えば、受容体ダイマー、例えばＨｅｒ２／Ｈｅｒ３ダイマーに結合し得る抗体であってよい。この実施形態では、本発明による標的の単独ユニットは、単独Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３ダイマーであり、標的は、試料の前記ダイマー全てを包含する試料中のＨｅｒ２／ｈｅｒ３ダイマーの集団である。一次抗体は、任意の温血種、例えば哺乳動物、トリに由来してよい。
二次抗体は、本発明の内容では、抗体結合剤、例えば、全抗体分子、前記分子の断片または誘導体、例えば、一次抗体または標的部位にデポジットされたハプテンまたは一次抗体もしくは他の結合剤に直接的または間接的に結合しているハプテンに特異的に結合する抗原結合ドメインを有する抗体またはポリマー化抗体を含むコンジュゲートを指す。
三次抗体は、本発明の内容では、抗体結合剤、例えば、抗体分子全体、前記分子の断片または誘導体、例えば、二次抗体に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体もしくはポリマー化抗体を含むコンジュゲートまたは二次抗体にリンクされるハプテンまたは二次抗体もしくは標的部位にデポジットされたハプテンにコンジュゲートされているポリマーにリンクするハプテンを指す。
時には、抗体は、二次および三次抗体の両方として機能し得る。
一次抗体、二次抗体および三次抗体を包含する本発明で使用される抗体は、いずれの哺乳動物種、例えば、ラット、マウス、ヤギ、モルモット、ロバ、ウサギ、ウマ、ラマ、ラクダまたは任意のトリ種、例えば、ニワトリ、アヒルに由来してもよい。哺乳動物またはトリ種のいずれかに由来するとは、本明細書で使用される場合、特定の抗体をコードする核酸配列の少なくとも一部が、特定の哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ヤギまたはウサギまたは特定のトリ、例えば、ニワトリ、アヒルのゲノム配列に由来していることを意味する。抗体は、いずれかのアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはいずれかのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であってよい。
ある種の実施形態では、一次抗体は、生体試料の細胞によって発現される生物学的マーカー、詳細には前記の生物学的マーカーの単独個別のユニットに特異的に結合し得る抗原結合領域を含有する。マーカーは、細胞表面で、または細胞膜内で、即ち、細胞の内部で、例えば、細胞質内、小胞体内などで発現されてよい。一部の実施形態では、生物学的マーカーを、細胞から抽出することができ、したがって、これは、細胞不含培地中に、例えば水溶液中に存在するか、またはこれは、細胞培地、血漿、脳脊髄液中などに存在する溶解性分子である。対応する試料の例は、上記されている。
ある種の実施形態では、二次抗体は、一次抗体に、例えば、一次抗体の定常領域に特異的に結合する抗原結合領域を含有する。ある種の実施形態では、二次抗体は、ポリマーにコンジュゲートされていてよい。一部の実施形態では、５から１５の二次抗体などの２から２０の二次抗体が、１つのポリマーとコンジュゲートされていてよい。他の実施形態では、１つのポリマーが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の二次抗体などの１から１０の二次抗体とコンジュゲートされていてよい。
ある種の実施形態では、三次抗体は、二次抗体に、例えば、二次抗体の定常領域に、または二次抗体にリンクしているハプテンに、または二次抗体とコンジュゲートされているポリマーに特異的に結合する抗原結合領域を含有してよい。ある種の実施形態では、三次抗体は、ポリマーにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、１〜２０の三次抗体が、１つのポリマーにコンジュゲートされていてよい。他の実施形態では、１、２、３、４または５の三次抗体などの１〜５の三次抗体が、１つのポリマーとコンジュゲートされていてよい。
一部の実施形態では、結合剤の単独結合ユニットを含むポリマー、例えば、一次、二次または三次抗体の分子１つとコンジュゲートされているポリマーが、好ましいことがある。
本発明の目的のために使用することができる抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ファージディスプレイまたは代替技術を使用して製造されるキメラ、ＣＤＲグラフトおよび人工選択抗体を包含する改変抗体が包含される。
本発明の抗体結合剤は、当分野でよく知られている多数の方法のいずれかによって例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ）に従って、製造することができる。組換え抗体分子を調製するための技術は、上記の参照文献ならびにいくつかの他の参照文献、例えば、欧州特許第０６２３６７９号；欧州特許第０３６８６８４号；および欧州特許第０４３６５９７号に記載されている。抗体をコードする核酸は、ｃＤＮＡライブラリから単離することができる。抗体をコードする核酸は、ファージライブラリから単離することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２、Ｋａｎｇら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３；欧州特許第０ ５８９ ８７７ Ｂ１号を参照されたい）。抗体をコードする核酸は、既知の配列の遺伝子かき混ぜによって得ることができる（Ｍａｒｋら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９）。抗体をコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって単離することができる（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：２２６５）。本発明の方法で使用される抗体には、ヒト化免疫グロブリンが包含される（米国特許第５，５８５，０８９号、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３を参照されたい）。本発明の抗体は、その結合親和性を保つと推定されるならば、任意の可能な方法で変化させることができ、例えば、エフェクタータンパク質、毒素、標識などと融合させることができる。抗体を種々の作用物質とコンジュゲートする方法も、よく知られており、下記の本発明の例示的な実施形態に記載されている。
本発明の一実施形態では、抗体結合剤は、Ｆａｂ領域によって表される。
一実施形態では、抗体結合剤は、２つ以上の異なる抗体結合剤を含む組成物、例えば、第一抗体結合剤および第二抗体結合剤を含み、それら２つ以上の異なる抗体物質が、異なる免疫結合対である組成物であってよい。一実施形態では、組成物において、２つ以上の異なる抗体結合剤のうちの少なくとも１つは、標的に特異的に結合し得る抗体であり、他の少なくとも１つは、酵素を含む抗体である。
他の実施形態では、本発明は、相補的ヌクレオチド配列または核酸類似分子などの非免疫特異的結合対のメンバーである結合剤に関する。
核酸または核酸類似分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子を含む結合剤は、核酸標的の単独個別ユニットを可視化および定量するために有用であり得る。
本発明の目的のために結合剤として使用される核酸配列は、化学的に合成するか、または組換え細胞中で製造することができる。製造の両方の様式が、当分野でよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。一部の実施形態では、核酸結合剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ペプチド核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に通常存在するデオキシリボースまたはリボース糖主鎖が、ペプチド主鎖に置き換えられている核酸分子である。ＰＮＡを製造する方法は、当分野で知られている（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎ、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１６を参照されたい）（参照によって本明細書に組み込まれる）。他の実施形態では、結合剤は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでよい（Ｓｏｒｅｎｓｏｎら、２００３、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．７（１７）：２１３０）。
核酸結合剤は、一部の実施形態では、生体試料中の標的配列の単独ユニット、例えば単独ｍＲＮＡ配列に、ストリンジェンシーの特異的な条件下で特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴ−または少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含んでよい。「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」という用語は本明細書では、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５〜９０％相補的であるなど互いに有意に相補的であるヌクレオチド配列が、互いに結合したままであるハイブリダイゼーション条件を記載するために使用されている。相補性のパーセントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）のＮｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているとおりに決定される。
ストリンジェンシーの規定条件は、当分野で知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５版．）、セクション２、４および６（参照によって本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。加えて、規定のストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、チャプター７、９、および１１（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシー条件である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、６５〜７０℃でのハイブリダイゼーションまたは４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中、４２〜５０℃でのハイブリダイゼーション、続いて、１×ＳＳＣ中、６５〜７０℃での１回または複数回の洗浄である。追加的な試薬、例えば、ブロック剤（ＢＳＡまたはサケ精子ＤＮＡ）、洗浄剤（ＳＤＳ）、キレート化剤（ＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰなどをハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に加えることができることは理解されるであろう。
一部の実施形態では、結合剤を、中程度のストリンジェントな条件下で、試料中の標的配列にハイブリダイズしてよい。中程度のストリンジェンシーには、本明細書で使用される場合、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、通常の当業者であれば容易に決定することができる条件が包含される。例示される条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１巻、１．１０１〜１０４頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されており、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予備洗浄溶液、５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣ、４２℃でのハイブリダイゼーション条件（または５０％のホルムアミド中、４２℃でのＳｔａｒｋ溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）および６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの洗浄条件を使用することを包含する。
一部の実施形態では、結合剤を、低いストリンジェントな条件下で試料中の標的配列にハイブリダイズさせる。低ストリンジェンシー条件には、本明細書で使用される場合、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、通常の当業者であれば容易に決定することができる条件が包含され得る。低ストリンジェンシーには、例えば、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４０℃で６時間のＤＮＡの予備処置が包含され得る。ハイブリダイゼーションを、次の変更を伴う同じ溶液中で実施する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸デキストランおよび５〜２０×１０６のＣＰＭ結合剤を使用する。試料を、ハイブリダイゼーション混合物中、１８〜２０時間、４０℃でインキュベートし、次いで、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のＳＤＳを含有する溶液中、５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を、新鮮な溶液に取り替え、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。
他の実施形態では、本発明は、非抗体タンパク質に由来するペプチド配列、例えば種々のタンパク質の核酸結合ドメイン、種々の細胞および核内受容体のリガンドならびにそれらの誘導体に由来するペプチド配列であるか、またはそのようなペプチド配列を含む結合剤に関するものであり得る。そのような結合剤の一部の非限定的例は、抗体定常領域に結合し得る相補的カスケードの従来の経路のｃ１ｑタンパク質、ＭＨＣ分子、例えば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩおよび特殊ＭＨＣ、ロイシンジッパードメインを有する分子、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎ、ｍｙｃ、ＧＣＮ４などの細胞シグナル伝達経路に関与している分子などの特異的結合対を有する分子、ＳｒｃまたはＧｒｂ−２などのＳＨ１またはＳＨ２ドメインを有する分子；免疫グロブリン受容体、例えば、Ｆｃ受容体；キメラタンパク質、即ち、２つ以上の特異的結合対の形質を組み合わせるように改変されたタンパク質であってよく、例えば、ロイシンジッパーを抗体のＦｃ領域へと操作することができ、ＳＨ２ドメインを、抗体のＦｃ領域で発現されるように操作することができる。他の実施形態では、融合タンパク質を、置換可変ドメインを備えた抗体のＦｃ部分を含むように操作することができる。
結合剤はまた、大きな生物学的分子のある種の構造ユニットに特異的に結合し得る小分子であってもよい。
一部の実施形態では、結合剤は、検出可能な標識、例えば蛍光物質、ハプテン、酵素などを含んでよい。一実施形態では、本発明は、デポジットされた検出可能な分子に特異的に結合することができ、本発明の標的部位を可視化するために使用される標識された結合剤、即ち、標識された第３またはさらなる結合剤に関する。一実施形態では、本発明は、酵素標識を含む結合剤に関する。適切な酵素標識の非限定的な例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であってよい。一実施形態では、結合剤は、標識としてＨＲＰを含んでよい。他の実施形態では、結合剤は、標識としてＡＰを含んでよい。
本発明の標的部位を形成するために必要な結合剤の量は、種々の因子、例えば試料の種類、標的の種類、結合剤の種類、結合剤の結合親和性などに応じて変動し得る。共通する一般的知識を使用して、当業者であれば、適切な結合剤を選択し、いずれの特定の実施形態についても必要な量を決定することができる。一部の実施形態では、例えば、試料が豊富な量の標的を含むか、または標的が幅広い動的濃度範囲で存在する実施形態では、標的部位を形成する結合剤の量を調節して、試料中に存在する標的の全ての単独ユニットではなく、その分別部分集団が、本発明の標的部位の形成に関わっているようにすることが好ましいことがある。他の実施形態では、例えば、標的または標的の単独ユニットの非常に低い標的発現を伴う試料の場合には、標的の全てまたは実質的に全ての単独ユニットが、本発明の標的部位の形成に関わっていることが好ましいことがある。後者の実施形態では、試料の個別単独ユニットの実質的に大部分との結合部位の形成を確実にするであろう、即ち、存在する標的の単独ユニットの実質的に大部分が、標的部位の形成に関わっているであろう量で、結合剤を使用することが好ましいことがある。
酵素
本発明では、標的の１つまたは複数の個別のユニットを含む試料
本発明では酵素を含む少なくとも１つの結合剤は直接的または間接的に、標的の単独ユニットに結合し、前記ユニットと共に複合体を形成する。
本発明による酵素は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素である（「オキシドレダクターゼ」または「本発明の酵素」と本明細書では互換的に称される）。
「オキシドレダクターゼ活性を有する酵素」という用語は、一方の分子（還元体、また、水素または電子供与体とも称される）から他方の分子（酸化体、また、水素または電子受容体とも称される）へと電子の移動を触媒する、酵素のＥＣ番号分類においてＥＣ１として分類される酵素を意味する。一部の好ましい実施形態では、本発明は、Ｅ１．１０．（フェノールオキシダーゼ）およびＥ１．１１．（ペルオキシダーゼ）として分類されているオキシドレダクターゼに関する。
好ましい一実施形態では、本発明は、フェノールオキシダーゼ、詳細には、銅含有オキシダーゼ酵素、ラッカーゼ（Ｅ １．１０．３．２）のファミリーに関する。ラッカーゼは、フェノールおよび同様の分子に作用して、一電子の酸化を行う。ラッカーゼは、天然に生じるフェノールのファミリーであるリグノールの酸化カップリングを促進することによって、リグニンの形成の際に役割を果たす。本発明の目的に適したラッカーゼは例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＬＥおよびＬｅｏｎａｒｄ ＴＪ（Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ａｓ ａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｒｕｄｅ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ １９７６、６８：２７７〜２８５）またはＫｕｎａｍｎｅｎｉ Ａ、Ｐｌｏｕ ＦＪ、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ Ａ、Ａｌｃａｌｄｅ Ｍ．（Ｌａｃｃａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ａ ｐａｔｅｎｔ ｒｅｖｉｅｗ．Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８、２（１）：１０〜２４）またはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｃｏｕｔｏ Ｓ、Ｔｏｃａ Ｈｅｒｒｅｒａ ＪＬ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ．２００６、２４（５）：５００〜１３．）によって記載されている酵素であってよい。
「ラッカーゼ」という用語は、本明細書では、本発明のフェノールオキシダーゼ活性を有する酵素を示すために使用されているが、しかしながら、ラッカーゼが、本発明の目的に適したフェノールオキシダーゼの多くの実施形態の１つであることは理解される。
他の好ましい実施形態では、本発明は、下式の反応を触媒するペルオキシダーゼ酵素活性に関する：
ＲＯＯＲ’＋電子供与体（２ｅ−）＋２Ｈ＋ → ＲＯＨ＋Ｒ’ＯＨ
本発明の好ましい一実施形態では、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。本発明の他の実施形態では、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＰ）である。
一部のペルオキシダーゼでは、最適な基質は、過酸化水素であり、一部の他のものは、有機ペルオキシドなどの有機ヒドロペルオキシドでより高い活性を有する。電子供与体の性質は、酵素の構造に非常に依存しており、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、電子供与体および受容体の両方として様々な有機化合物を使用することができる。ＨＲＰは、アクセス可能な活性部位を有し、多くの化合物は、反応の部位に到達し得る。
酵素活性、即ちオキシジレダクターゼ（ｏｘｉｄｉｒｅｄｕｃｔａｓｅ）活性、例えばフェノールオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ活性は、結合剤の分子に直接的または間接的にリンクする酵素の全長分子か、または酵素活性と合成されている酵素の断片、例えば酵素分子の全長の５１％から９９．９％もしくは５１％未満、例えば４０％、３０％未満によって表され得る。
本発明の結合剤は、１つまたは複数の酵素部分と直接的または間接的にコンジュゲートされていてよい（「部分」という用語は、本内容では、オキシドレダクターゼ活性を示し得る酵素の分子の一部を意味し、これには、酵素分子の全体または実質的に全体と、オキシドレダクターゼ酵素活性を示し得る前記分子の一部との両方を包含する）。第１および／または第２結合剤の両方またはいずれかの分子は、オキシドレダクターゼの１つまたは複数の官能的に活性な部分とコンジュゲートされていてよい。一実施形態では、第１結合剤の少なくとも１つの分子は、オキシドレダクターゼ活性を示し得る１つまたは複数の酵素部分とコンジュゲートされていてよく；他の実施形態では、第２結合剤の少なくとも１つの分子は、１つまたは複数のそのような部分とコンジュゲートされていてよい。第３およびさらなる結合剤の分子もまた、オキシドレダクターゼとコンジュゲートされていてよい。「直接的にコンジュゲートされている」という用語は、酵素部分が、化学的結合を介して結合剤の分子にリンクしていることを意味する。「間接的にコンジュゲートされている」という用語は、酵素の部分が、一方で結合剤との化学的結合および他方で酵素との化学的結合を有するリンキング分子を介して結合剤の分子にリンクしていることを意味する。生物学的分子およびリンカー分子をコンジュゲートする方法は、当分野でよく知られており、下記に例示されている。
一実施形態では、オキシドレダクターゼの部分は、ＨＲＰの部分、例えばＨＲＰ分子全体、ＨＲＰ酵素活性を示し得るその断片であり、これはまた、酵素活性を有するＨＲＰの部分を含む組換えタンパク質などであってもよい。他の実施形態では、オキシドレダクターゼの部分は、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＰ）の部分であってよい。他の実施形態では、オキシドレダクターゼの部分は、ラッカーゼの部分であってよい。
オキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む結合剤の非限定的例は、１つまたは複数のＨＲＰの部分とコンジュゲートされている抗体分子またはその誘導体、例えばＦａｂおよびＨＲＰとコンジュゲートされている核酸結合剤であってよい。そのような結合剤は、単独標的ユニット、例えば単独標的分子に直接的に、または間接的に結合して、それによって、複合体を形成していてよく、その際、単独のそのような複合体は、標的の単独個別のユニットと、結合剤のうちの１つまたは複数がオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤とを含む。
一実施形態では、結合剤は、結合剤に直接的にリンクしている１つまたは２つ以上のペルオキシダーゼの部分を含むコンジュゲート、例えば、１つまたは複数のＨＲＰの部分と直接的にコンジュゲートされている抗体分子である。他の実施形態では、結合剤は、ペルオキシダーゼ活性を有する２つ以上の酵素、例えば、結合剤に間接的にリンクしている２つ以上のＨＲＰの部分を含むコンジュゲート、例えば、１つまたは複数の抗体の分子と、主鎖ポリマーに独立に結合している１つまたは複数のＨＲＰ部分、即ちペルオキシダーゼ活性を有する酵素とが、結合剤に、即ち抗体に間接的にリンクしているコンジュゲートであってよい。
結合剤の分子１つ当たりのＨＲＰの数は、結合剤１つ当たり１酵素部分から、結合剤１つ当たり２０〜５０、またはさらに多くまで変動してよい。一部の実施形態では、ＨＲＰ部分の数が、１結合剤当たり少なくとも２、好ましくは２から２０〜２５酵素部分、例えば４、５、６、７、８、９、１０などの３から２０の間である結合剤を使用することが好ましいことがある。意外にも、結合剤１つ当たりの酵素部分の数が１つより多い、好ましくは結合剤１つ当たり２つより多い、結合剤１つ当たり３つより多い結合剤を使用することが判明した。一部の実施形態では、結合剤１つ当たり４つを超える酵素部分、好ましくは結合剤１つ当たり５から２０、例えば、５から１５を含む結合剤を使用することが好ましいことがある。４つを超える酵素部分を有する結合剤は、サイズが実質的に同一のドットとして可視化し得る標的部位を形成するために有利である。一部の実施形態では、そのような結合分子のプールの酵素を含む結合剤分子がそれぞれ、ほぼ同じ数の酵素部分、例えば、プールの結合剤１つ当たり４〜６、結合剤分子１つ当たり酵素部分５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０など、例えば、抗体分子１つ当たり、例えば、一次または二次抗体分子１つ当たりＨＲＰ部分５〜６または６〜７を含むことがさらに好ましいことがある。多数のＨＲＰ部分を含む後に述べた結合剤構成体は、例示である。述べられている効果を達成するために、結合剤は、上記で検討された本発明のオキシドレダクターゼ活性を有する任意の酵素の多数の部分を含んでよい。結合剤はまた、種々のオキシドレダクターゼ酵素の多数の部分の組合せを含んでもよい。
一部の他の実施形態では、１つまたは２つ以上の酵素、例えばＨＲＰの部分とコンジュゲートされている結合剤、例えば単独抗体分子または抗体の単離Ｆａｂ領域の比較的に小さいコンジュゲート分子が好ましいことがある。そのような結合剤は、比較的コンパクトな分子であり、このことは、標的中または試料中に「隠れている」か、またはマスクされている標的の個別ユニットを検出するためには有利であり得、例えば、個別の単独標的分子は、周囲の他の分子によってマスクされていることがあり、単独標的構造は、標的分子中に隠れ得るか、または単独ウイルス性粒子は、細胞を含む複雑な生体試料においては達することが困難であることがある。
一部の他の実施形態では、結合剤および数十から数百の酵素部分を含む大きなコンジュゲートが好ましいことがある。そのような結合剤は、例えば、非常に迅速な標的検出が重要であるか、または個別の標的部位当たり大きなデポジットを得ることが望ましい場合において有利であることがある。
オキシドレダクターゼ活性、例えばペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む結合剤に（直接的または間接的に）結合している標的の単独ユニットは、本発明の単独標的部位を構成する。
一実施形態では、本発明の単独標的部位は、標的の単独標的ユニットと、少なくとも１つの一次抗体またはその誘導体と、ペルオキシダーゼ活性を有する１つまたは２つ以上の酵素、例えばＨＲＰとコンジュゲートされている少なくとも１つの二次抗体またはその誘導体とを含む。
他の実施形態では、単独標的部位は、標的の単独ユニットと、ハプテンとコンジュゲートされている少なくとも１つの一次抗体分子と、ペルオキシダーゼ活性を有する１つまたは２つ以上の酵素、例えばＨＲＰとコンジュゲートされているハプテンに対する抗体とを含んでよい。
他の実施形態では、標的部位は、標的の単独ユニットと、標的に特異的な１つまたは複数の第１核酸／核酸類似体結合剤と、第１核酸／核酸類似体結合剤に特異的な１つまたは複数の第２核酸／核酸類似体結合剤とを含んでよい。
上記の実施形態は、非限定的である。本発明は他の実施形態では、上記で検討された任意の標的の単独ユニットと、本発明の標的部位を作る上記で検討された任意の結合剤との任意の組合せに関し得る。
本発明の単独標的部位は一実施形態では、本発明の酵素活性で標識されている、即ち、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素と直接的にもしくは間接的にコンジュゲートされている標的の単独ユニット、またはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む組換え融合分子の単独ユニットを含む固体支持体の単独部位であってよい。一実施形態では、オキシドレダクターゼ酵素は、それ自体が標的であることもあり、対応して、標的部位は、この実施形態では、固定化されたオキシドレダクターゼ酵素の部分、例えば固体支持体上、またはその中に固定化されているＨＲＰまたはラッカーゼなどのオキシドレダクターゼ酵素の単独ユニットをまさに含むことがある。
酵素基質
１つまたは複数の結合剤とインキュベーションし、上記の本発明の標的部位を形成した後に、本発明による１つまたは複数の単独標的部位を含む試料を、水溶液（ｉ）中でインキュベートする。本発明による水溶液（ｉ）は、本発明の単独標的部位に付随している酵素の第１基質を含み、その際、前記第１基質は、（１）酵素と反応すると安定なラジカルを発生させることができ；かつ（２）酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記酵素の第２基質の分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる水溶性の電子リッチな有機化合物である。本発明による水溶液（ｉ）はまた、本発明の単独標的部位に付随している酵素の第２基質も含み、その際、前記第２基質は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの化合物を含むコンジュゲート分子であり、その際、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択される。
第１基質
本発明の単独標的部位に付随している酵素の第１基質（後記では「第１基質」とも称される）は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質である。この基質は、（１）水溶性の電子リッチな有機化合物であり、（２）前記酵素と反応すると安定なラジカルを発生させることができ、かつ（３）（前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で）前記酵素の第２基質の水溶性分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる。
「水溶性」という用語は、第１基質の分子が、水および水含有溶液に溶解することを意味する。「電子リッチな化合物」という用語は、本内容では、交互の単独および多数の結合を有する化合物を包含する、結合ｐ軌道の共役系を含む有機化合物を意味する。孤立対およびラジカルは、この系の一部であってよい。化合物は、環式、非環式または両方であってよい。「コンジュゲートされている」とは、間に存在するシグマ結合を超えた一方のｐ軌道と他方との重なりが存在することを意味する（より大きな原子では、ｄ軌道が関与していてよい）。共役系は、間にある単結合を橋かけする重なったｐ軌道の領域を有する。これによって、隣接して並ぶｐ軌道全てにわたるパイ電子の非局在化が可能となり、このことは一般に、分子の全体エネルギーを下げ、安定性を高め得る。共役系のパイ電子は、単結合または原子に属さず、むしろ、原子団に属する。
本発明のオキシドレダクターゼ活性を有する酵素の群には、多大な数の基質を利用することができる多様な酵素が包含される。これらの基質のうち、本発明の基質は、本発明のオキシドレダクターゼ活性を有する酵素と反応すると、ラジカル、好ましくは安定なラジカルを発生させることができる共役パイ系を含む水溶性で有機のエレクトロンリッチな有機化合物である化合物である。「安定なラジカル」という用語は、本内容では、本発明の条件下で、例えば水溶液（ｉ）中で、第１基質のラジカルが、少なくとも２０秒、好ましくは約１分から約１５分またはそれより長く、例えば２、３、４または５分、５から１０分の間などの寿命を有することを意味する。さらに、本発明の第１基質の群をなしている化合物のラジカルは、本発明の第２基質の水溶性分子を架橋させて、それによって、前記水溶性分子を水不溶性ポリマー生成物に変換することができる。
詳細には、一実施形態では、本発明は、第２結合はいずれも二重結合である連続する炭素原子の群を含む水溶性で有機の電子リッチな化合物、好ましくは、少なくとも３つの（Ｃ−Ｃ＝）の繰り返しからなる鎖を含む化合物または芳香環構造を含む化合物の群によって表される第１基質に関する。
一実施形態では、第１基質は、式（Ｉ）の構造を含む化合物によって表され得る：
Figure 0005836958
 ［式中、
Ｒ１は、アリールまたはビニルであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｎ−（Ｘ）２、Ｏ−（Ｘ）２（ここで、Ｘはアルキル、ビニルまたはアリールまたはＨである）であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同時にＨであることはなく、
ここで、
Ｈは水素であり；
Ｏは酸素である］。
本発明のオキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質としての能力を有する上式の化合物の非限定的例は、３’３’−ジアミノベンジジン、フェルラ酸、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸およびその誘導体であってよい。
好ましい一実施形態では、本発明は、第１基質としての３’３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）に関する。
本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素、即ちホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびペルオキシド化合物、即ち過酸化水素の存在下で第２基質の分子を架橋させ得る安定なラジカルを形成させ、第２基質の架橋分子をばらばらに、単独標的部位にデポジットさせるために、ＤＡＢの能力を利用する。
他の好ましい実施形態では、本発明は、第１基質としてのフェルラ酸に関する。
フェルラ酸もまた、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素、即ちホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびペルオキシド化合物、即ち、過酸化水素の存在下で本発明の第２基質の分子を架橋させ、前記第２基質をばらばらに、本発明の単独標的部位にデポジットさせることができる。
一部の他の好ましい実施形態では、本発明は、３’３’−ジアミノベンジジン、フェルラ酸の誘導体に関するものであり得る。「誘導体」という用語は、本内容では、３’３’−ジアミノベンジジン、フェルラ酸に由来する化合物、またはそれらの分子の中の１個の原子が、他の原子または原子団で置き換えられると３’３’−ジアミノベンジジン、フェルラ酸から生じると想像し得る化合物を意味する。本発明は、上記で検討された本発明の第１基質についての要件を満たす３’３’−ジアミノベンジジン、フェルラ酸の誘導体に関する。
水性培地（ｉ）および／または水性培地（ｉｉ）中での第１基質の量は、第１基質を代表する化合物の構造に応じて、約０．０５ｍＭから約２ｍＭで変動してよい。一般に、Ｒ１がビニルまたはビニル誘導体である式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１がアリールまたはその誘導体である化合物よりも多い量で使用する。したがって、ＤＡＢは、水溶液（ｉｉ）中でのその量が１ｍＭ未満、好ましくは０．０５ｍＭから０．０８ｍＭの間などの０．０５ｍＭから１ｍＭの範囲内、例えば、約０．０７ｍＭ、即ち、０．０６６ｍＭから０．０７４ｍＭまたは０．０８ｍＭから０．１ｍＭの間、例えば、約０．０９ｍＭまたは０．１ｍＭから０．３ｍＭの間、例えば約０．１５ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．２５ｍＭまたは０．３ｍＭから０．６ｍＭの間、例えば約０．３５ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．４５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．５５ｍＭまたは０．６ｍＭから１ｍＭの間、例えば約０．７ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約０．８ｍＭ、０．８ｍＭから１ｍＭの間である場合に、本発明による第１基質として働く。後者の量でＤＡＢが存在する場合、直径約１マイクロメートル、１．５マイクロメートル、２マイクロメートル以上、例えば約３または４マイクロメートルなどの０．４マイクロメートルよりも大きな第２基質の別々の丸形のデポジットを形成することができることが、意外にも発見された。第２基質のそのようなデポジットを生じさせるために、第１基質としてのフェルラ酸は、水性培地（ｉｉ）中に、例えば、約１．５ｍＭなどの約１ｍＭから約２ｍＭの間の量で存在してよい。
第２基質
本発明では、本発明の酵素の第２基質（本明細書では「第２基質」とも称される）は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの化合物を含むコンジュゲート分子であり、その際、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択される。
一部の好ましい実施形態では、本発明は、次の形質を共有する第２基質としての大きな群のコンジュゲート分子に関する：
１．コンジュゲート分子は、本発明の酵素の基質として、好ましくはＨＲＰの基質として、かつ１つまたは複数の標識として働くことができる２つ以上の物質を含み、基質および標識が一緒に、水溶性リンカー化合物（後記では「リンカー」と称する）を介してリンクしている水溶性分子である；
２．酵素基質部分は、コンジュゲート分子において前記分子のある部分に「濃縮」されていて、標識は、前記分子の他の部分に「濃縮されており、その際、標識（複数可）は、約３０個以上の連続的に相互接続している原子によって、基質から離されている、即ち約２．５ｎｍ以上、好ましくは３ｎｍより大きく分離されている；
３．酵素基質は、２．５ｎｍ未満の距離によって互いに分離されている、例えば、３０個未満の相互接続している炭素、窒素、硫黄および／または酸素原子などの炭素またはヘテロ原子によって、好ましくは５〜２０個以下の原子によって、コンジュゲートの分子内で分離されている；
４．リンカーは、少なくとも３０個の連続的に接続している原子を含む化合物である；
５．コンジュゲートは、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の環境下にない場合、ペルオキシド化合物および本発明の第１基質を含有する水溶液（ｉｉ）から沈殿しない。
６．コンジュゲートは、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の存在下で、かつ環境中に前記酵素の第１基質がない場合、ペルオキシド化合物を含有する水溶液（ｉｉ）から沈殿しない。
７．コンジュゲートは、環境中に前記酵素が存在する場合、ペルオキシド化合物および本発明のオキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質を含有する水溶液（ｉｉ）から沈殿する。
第２基質のデポジットは、視覚的手段によって直接的に検出可能であり得る。それというのも、これらは、一部の実施形態では、発色性、蛍光または発光標識を含み得るためである。他の実施形態では、沈殿した第２基質を、デポジションの後のステップにおいて「染色」して、可視化することができる。いずれの場合にも、第２基質のデポジットは、周囲の中での本発明の単独標的部位の存在を観察者に「レポート」するであろう。したがって、本発明の第２基質の分子は、本明細書では「リポーター」分子と互換的に称される。
第２基質分子の非限定的実施形態は、下記および実施例に詳述されている。
一実施形態では、本発明は、
（ｉ）１つまたは複数の検出可能な物質（互換的に「標識」と称される）
（ｉｉ）本発明の酵素の基質として働くことができる少なくとも２つの物質および
（ｉｉ）リンカー
（ここで、
前記リンカーは、少なくとも２つの分岐点を含有する少なくとも３０個の連続的に接続している原子からなる少なくとも１つの直鎖を含む化合物であり、ここで、前記分岐点は、少なくとも３０個の連続的に接続している原子の分子距離によって分離されており；
標識（ｉ）およびオキシドレダクターゼ基質部分（ｉｉ）は、リンカーに、少なくとも３０個の連続的に接続している原子の距離によって分離されているその２つの分岐点の所で付着しており、かつ
任意の２つの隣接する酵素基質は、３０個未満の連続して相互に結合している原子である分子距離によって互いに分離されている）
を含む水溶性コンジュゲート分子である第２基質に関する。
「検出可能な物質」という用語は、物質が、視覚的手段によって検出される検出可能な発色性、蛍光、発光または放射性シグナルを放出し得るか、またはその特異的結合対、例えば抗体、核酸配列、核酸配列類似配列、ハプテン、抗原、受容体、受容体リガンド、酵素などを使用して検出することができることを意味する。
一部の実施形態では、本発明の水溶性コンジュゲート分子は加えて、その形質を増強し得る、例えば、標識またはその酵素基質としてのその能力を改良し得るか、またはその水溶解性を増大／低減し得る部分を含むことができる。
一実施形態では、本発明のコンジュゲート分子は、式（ＩＩ）：
（Ｙ）ｎ−Ｌ−（Ｚ）ｍ
［式中、
Ｙは、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質として働くことができる部分であり；
Ｚは、検出可能な標識であり；
Ｌは、リンカー化合物であり
ここで、
ｎは、２から１５０の整数であり、
ｍは、１から１５０の整数である］
の化合物の群から選択することができる。
好ましい一実施形態では、Ｙは、下式（ｉｉ）：
Figure 0005836958
 ［式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり；
Ｒ２は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２または−ＳＨであり；
Ｒ４は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ５は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ６は、−ＣＯＮ（Ｘ）２またはＣＯ−Ｘであり、
ここで、
Ｈは水素であり；
Ｏは酸素であり、
Ｓは硫黄であり、
Ｎは窒素であり、
Ｘは、Ｈ、アルキルまたはアリールである］
の化合物から選択される。
一実施形態では、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質として働くことができる化合物のうちの少なくとも１つは、式（ｉｉ）の化合物である。
一実施形態では、コンジュゲート分子中の、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質として働くことができる化合物のうちの少なくとも２つは、式（ｉｉ）の化合物である。
一実施形態では、コンジュゲート分子中の、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質として働くことができる化合物のうちの少なくとも２つは、同一の式（ｉｉ）の化合物である。
一実施形態では、コンジュゲート分子中の、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質として働くことができる化合物のうちの少なくとも２つは、異なる式（ｉｉ）の化合物である。
一実施形態では、コンジュゲート分子中の、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質として働くことができる化合物は全て、式（ＩＩ）によって定義される。一実施形態では、これらは、同一の化合物であり、他の実施形態では、コンジュゲート分子は、式（ＩＩ）によって定義される異なる化合物の任意の組合せを含む。
好ましい一実施形態では、Ｙはケイ皮酸の残基であってよく；他の好ましい実施形態では、Ｙはフェルラ酸の残基であってよい。他の好ましい実施形態では、Ｙはコーヒー酸の残基であってよく；他の好ましい実施形態では、Ｙは、アミノケイ皮酸の残基であってよい。他の好ましい実施形態では、Ｙは、シナピン酸の残基であってよい。他の好ましい実施形態では、Ｙは、フェルラ酸、ケイ皮酸、コーヒー酸、アミノケイ皮酸またはシナピン酸の誘導体であってよい。
好ましくは、式（ＩＩ）によって定義される残基Ｙは、基Ｒ６を介して、リンカーＬに接続している。
好ましい一実施形態では、コンジュゲートは、２から４つの同一の残基Ｙを含む。他の好ましい実施形態では、コンジュゲートは、２から４つの異なる残基Ｙの組合せを含む。好ましい一実施形態では、２から４つの残基Ｙは、式（ＩＩ）によって定義される化合物である。
好ましい一実施形態では、コンジュゲートは、２から４つのフェルラ酸残基またはその誘導体の残基を含んでよく、他の実施形態では、コンジュゲートは、２から４つのケイ皮酸残基またはその誘導体の残基を含んでよく；他の実施形態では、コンジュゲートは、２から４つのコーヒー酸残基またはその誘導体の残基を含んでよく；他の実施形態では、コンジュゲートは、２から４つのアミノケイ皮酸残基を含んでよく；他の実施形態では、コンジュゲートは、２から４つのシナピン酸残基またはその誘導体の残基を含んでよい。後者の化合物の２つから４つの誘導体は、同じ化合物であってよいか、または異なる化合物であってよい。
好ましい一実施形態では、コンジュゲート分子は、２つの式（ＩＩ）のＹ化合物または２つのその誘導体、例えば２つのフェルラ酸残基または２つのケイ皮酸残基または２つのアミノケイ皮酸残基または２つのカフェイン酸残基または２つのシナピン酸残基と、１つまたは複数の検出可能な標識とを含んでよく；他の実施形態では、コンジュゲートは、３つのフェルラ酸、ケイ皮酸、コーヒー酸、アミノケイ皮酸、シナピン酸などの３つの式（ＩＩ）の分子または３つのその誘導体と、１つまたは複数の検出可能な標識とを含んでよく；他の実施形態では、コンジュゲートは、４つの式（ＩＩ）の化合物または４つのその誘導体、例えば４つのフェルラ酸、ケイ皮酸、コーヒー酸、アミノケイ皮酸、シナピン酸または４つの後者の誘導体と、１つまたは複数の検出可能な標識とを含んでよい。
一部の実施形態では、Ｙ化合物の数は、例えば５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜５０、５０〜１００または１００〜１５０の化合物など、４つより多くてよい。そのようなコンジュゲート分子の非限定的例は、実施例に記載されている。一部の好ましい実施形態では、そのようなコンジュゲートは、少なくとも３０個の連続的に接続している原子、例えば３０〜１５０個の原子からなる１つより多い直鎖を含んでよく、ここで、２つから４つのＹ化合物が、直鎖それぞれに、鎖の第１および同じ分岐点で付着しており、そのような直鎖のうちのいくつかは、他の水溶性リンカー分子、例えばデキストランに、前記直鎖の第２（他の）分岐点を介してリンクしている。
好ましい一実施形態では、コンジュゲート分子は、２つもしくは４つの異なる式（ＩＩ）の化合物の組合せまたは２つもしくは４つのその誘導体の組合せ、例えば、２つのフェルラ酸残基および１つのケイ皮酸残基、２つのシナピン酸残基および２つのコーヒー酸残基などを含んでよい。
好ましい一実施形態では、Ｙは、アミノ酸チロシンの残基またはその誘導体の残基であってよい。コンジュゲートは、２から４つ以上のそのような残基を含んでよい。
一実施形態では、コンジュゲート分子は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質の組合せを含んでよく、その際、前記基質のうちの少なくとも１つはチロシンである。一実施形態では、コンジュゲート分子は、少なくとも１つのチロシン残基と、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物またはその誘導体とを含み、他の少なくとも１つは、式（ＩＩ）の化合物、その誘導体、例えば１つのチロシン残基およびシナピン酸またはその誘導体の２つの残基である。
一部の実施形態では、コンジュゲートが４から６の残基Ｙを含むことが好ましいことがあり、ここで、Ｙは、任意の化合物または上記のとおりの任意の化合物の組合せによって表される。
本発明では、Ｙ化合物は、コンジュゲート分子中において、群として位置しており、好ましくは、１群当たり２から４つのＹ化合物として群になっている（即ち、４つより多いＹ化合物を含むコンジュゲートは、２つから４つのＹ化合物からなる複数の群を含んでよく、ここで、前記群は、コンジュゲート分子において、原子団によって、例えば３０個以上の接続している原子に対応する分子距離によって分離されている）。好ましくは、そのような群中の２つから４つのＹ化合物は、５〜１５個以下、例えば５〜１０、６〜１２、７〜１３、８〜１４、９〜１５個などの相互に接続している原子である２つの隣接するＹ残基の間に距離をもたらすスペーサー化合物を介して一緒に連結している。例えば、２から４つのＹ化合物は、２から４つのアミノ酸残基、例えば、リジン、セリン、システインなどの残基を含むペプチド鎖を構成するアミノ酸に付着していてよく、ここで、Ｙ化合物は、ペプチドのアミノ酸残基の反応性基に、例えば、リジン残基のイプシロンアミノ基に付着している。２つから４つの化合物Ｙはまた、いくつかの分岐点を含む他の短いポリマーを介して互いに接続していてもよく、ここで、これらの分岐点の間の分子距離は、３〜７個の原子以下、好ましくは３〜５個の原子からなる鎖に対応し、Ｙ化合物は、直接的、間接的に前記分岐点にリンクしていてよい。２から４つの化合物Ｙはまた、一緒に群になって、任意の２から４つのＹ化合物を付着させ得る２から４つの反応性基を有する非ポリマー分子にコンジュゲートされていてよい。Ｙ化合物がそのような群になっている位置は後記では、コンジュゲート分子の「Ｙヘッド」と称される。
好ましい一実施形態では、Ｙヘッドは、短いポリマー、例えば、短いＰＮＡ分子または短いペプチドを介してリンクしている２から４つのＹ−残基を含み、ここで、ペプチドは好ましくは、リジン、セリングルタメートおよび／またはシステイン残基を含む。しかしながら、少なくとも２つのＹ−残基とコンジュゲートし得る１５個以下の原子を含む任意の他のポリマーまたは非ポリマー水溶性分子およびリンカーＬが、適し得る。
一実施形態では、２から４つの化合物Ｙを含む１つのＹヘッドは、２つ以上の下式（ＩＩＩ）
Figure 0005836958
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、ＮＨおよびＯから選択され、Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、ＣＨ２ＯＣＨ２および（ＣＨ２ＯＣＨ２）２から選択され、ここで、連続的に繰り返すエチルオキシ基は３つ以下である］の繰り返しを含むポリマーにリンクしていてよい。生じたコンジュゲートは、１つ（またはそれ以上）の検出可能な標識とさらにコンジュゲートされていてよいか、または１つまたは複数のそのようなコンジュゲートの付着を可能にする１つまたは複数の反応性基を含む他の水溶性分子とコンジュゲートされていてよい。そのような水溶性分子の１つの非限定的例は、デキストランポリマーであってよい。
コンジュゲート分子においてＹ化合物の間隔が近いことは、本発明の第２基質としてのコンジュゲートの機能的能力に影響を及ぼし、即ち、コンジュゲートは、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素が環境中に存在しない場合には、ペルオキシド化合物および３，３’−ジアミノベンゼジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）を含有する水溶液中に溶けたままであるが、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素が環境中に存在する場合には、そのような溶液から迅速かつ効率的に沈殿する（１つのみのＹ化合物を含むか、またはＹヘッドの形態でコンジュゲート分子において「濃縮」されていない、即ち、２つの隣接するＹ残基の間の分子間隔が、上記で検討された距離よりも大きい複数のＹ化合物を含むコンジュゲートと比較して。そのような化合物は、本発明の単独標的部位に別々のデポジットを効率的に形成しない）。
コンジュゲート分子の検出可能な標識は、視覚的に検出することができる任意の物質、例えば、蛍光または発光物質であってよいか、またはいくつかの検出手段を使用することによって検出することができる任意の物質、例えば、放射性標識、特異的結合対のメンバー、例えば、核酸配列、ハプテンなどであってよい。
任意の蛍光、発光、生体発光または放射性分子を、標識として使用することができる。それらの多くは、市販されており、例えば、蛍光染色液Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（分子プローブ）およびＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。蛍光標識の他の非限定的な例は、次の分子であってよい：５−（および６）−カルボキシフルオレセイン、５−または６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡＭＣＡ、ＰｅｒＣＰ、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）アロフィコエリトリン（ＡＰＣ）、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コーティングされたＣｄＳｅナノ微結晶、ルテニウム誘導体、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタンおよびピリドピリダジン、水素、炭素、硫黄、ヨウ化物、コバルト、セレン、トリチウムまたはリンの放射性同位体。
一部の実施形態では、検出可能な標識は、酵素であってよい。適切な酵素標識の非限定的例は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であってよい。
他の実施形態では、検出可能な標識は、特異的結合対のメンバー、例えばハプテンであってよい。適切なハプテンの非限定的例として、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシギニン（ｄｉｇｏｘｉｇｉｎｉｎ）、フルオレセイン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、ニトロチロシン、アセチルアミノフルレン（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｆｌｕｒｅｎｅ）、水銀トリントロフォノール（ｍｅｒｃｕｒｙ ｔｒｉｎｔｒｏｐｈｏｎｏｌ）、エストラジオール、ブロモデオキシウリジン、ジメチルアミノナフタレンスルホネート（ダンシル）、アミノ酸チロシン、セリンなどを挙げることができる。適切な特異的結合対の例としてまた、ビオチン、ストレプトアビジン、相補的天然および非天然オリゴヌクレオチド配列、亜鉛フィンガー結合ドメイン対なども挙げることができる。他の例は、上記で検討されている。
好ましい一実施形態では、標識はハプテンである。他の好ましい実施形態では、標識は蛍光物質である。他の好ましい実施形態では、標識は、特異的結合対のメンバーである。他の実施形態では、他の標識が好ましいことがある。
コンジュゲート分子（上記のいずれかとして）１つ当たりの検出可能な標識の数は変動してよい。一部の実施形態では、標識の数は、コンジュゲート分子１つ当たり１から３つ、例えば、１、２または３つの標識であってよい。一部の他の実施形態では、コンジュゲートはさらに、コンジュゲート分子１つ当たり４つから１５０までの標識を含んでよい。
好ましい一実施形態では、コンジュゲート（上記のいずれかとして）は、１つの検出可能な標識を含む。好ましい一実施形態では、コンジュゲート分子は、１つのＹヘッド（上記で検討したいずれかとして）および１つの標識を含んでよい。
本発明では、コンジュゲート分子において、検出可能な物質（単独標識またはその複数）は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質である化合物から、例えばＹヘッドから、２．５ｎｍ超の分子距離によって分離されている、例えば少なくとも３０個の連続する原子、例えば３０〜１５０個以上の連続する原子によって分離されている。コンジュゲートが、接続している原子からなる１つの鎖をＹヘッドと１つ（以上の）標識との間のリンカーとして含む実施形態では、Ｙヘッドおよび標識（複数可）は、少なくとも３０個の原子のぶん互いに離れて位置する分岐点で、例えば、３０個の接続している原子からなる鎖の向かい合わせの末端で、前記鎖に連結している。
一部の実施形態では、コンジュゲートが１つより多い標識を含む場合、標識が群になって、標識の間に、少なくとも３０個の連続的に接続している原子（「スペーサー」と称される）、好ましくは６０個以上の連続している原子、例えば９０個の連続的に互いに接続している原子からなる鎖に対応する分子距離が存在するようになっていることが好ましい。標識の間のスペーサーは親水性化合物であることが好ましい。次いで、後者の標識群は、コンジュゲート分子において、前記標識と、酵素基質部分とを上記の通りリンクさせるリンカー化合物に付着している、即ち、Ｙヘッドに最も近接して位置する群の標識は、Ｙヘッドの酵素基質のいずれからも、少なくとも３０個の互いに接続している原子によって、即ち、少なくとも２．５ｎｍの距離によって離されている。コンジュゲート分子における多数の標識のそのような配置は、後記では、「Ｚテール」と称される。
好ましくは、Ｚテールの標識間の少なくとも３０個の連続する原子からなるスペーサーは、下式（ＩＩＩ）：
Figure 0005836958
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、ＮＨおよびＯから選択され、Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、ＣＨ２ＯＣＨ２および（ＣＨ２ＯＣＨ２）２から選択され、ここで、連続的に繰り返すエチルオキシ基は３つ以下である］
の２つ以上の繰り返しを含むポリマー化合物である。
上記スペーサーに付着し、それによって分離されている多数の標識は、１つのＹヘッドまたは複数のＹヘッドと、任意の適切なリンカー、例えば多数の結合を可能にする水溶性ポリマー、例えばデキストランを介してコンジュゲートされていてよい。一部の実施形態では、複数のＹヘッドが、そのようなポリマーを介して、複数のＺテールとコンジュゲートされていてよい。
一実施形態では、本発明のコンジュゲート分子の多数の標識は、同じ検出可能な物質であってよく、他の実施形態では、標識は、異なる検出可能な物質であってよい。
標識のＺテール配置は、（１）多数の疎水性標識を含むコンジュゲートが水溶液中で良好に溶解性なままであり、かつ（２）結合剤が、デポジットされたコンジュゲートを検出するために使用される場合に、標識が、結合剤により良好にアクセス可能であるという利点を有する。
オキシドレダクターゼ基質と標識との間（例えば、ＹヘッドとＺテールとの間）のリンカーＬは、本発明では、３０〜１５０個以上の原子、例えば３０、４５、６０、９０、１５０、３００、５００個以上の原子などの少なくとも３０個の連続する原子からなる鎖を含む分子である。好ましい一実施形態では、好ましくは、Ｌは、１５０個の連続する原子を含む。一部の実施形態では、リンカー分子は、接続している炭素原子２個ごとに、酸素または窒素の原子が後に続く原子からなる直鎖を含む。
好ましい一実施形態では、Ｌは、単独直鎖ポリマー分子であってよく；他の好ましい実施形態では、Ｌは、一緒にコンジュゲートされているいくつかの異なるポリマーを含んでよいコンジュゲート分子であってよい。
好ましい一実施形態では、Ｌは、例えば、下記を含むリンカーまたはポリエチレングリコールなど、２個の連続する炭素原子の後に、酸素または窒素から選択されるヘテロ原子が続く原子の鎖を含む直鎖ポリマーである。
他の好ましい実施形態では、リンカーは、下式（ＩＩＩ）：
Figure 0005836958
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、ＮＨおよびＯから選択され、Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、ＣＨ２ＯＣＨ２および（ＣＨ２ＯＣＨ２）２から選択され、ここで、連続的に繰り返すエチルオキシ基は３つ以下である］
の２つ以上の繰り返しを含む化合物である。
好ましくは、Ｌは、Ｒ１およびＲ２の両方がＮＨであり、Ｒ３がＣＨ２ＯＣＨ２である上式の少なくとも２つの繰り返しを含む。好ましくは、Ｌは、下式（ＩＶ）：
Figure 0005836958
 ［式中、ｎは１から１０の整数であり、（Ｂ）は、分岐点である］
の１つ以上の繰り返しを含む。この式のＬ分子およびその合成は、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０１５１６８号に詳細に記載されている。
「分岐点」という用語は、分岐、例えば、同じポリマーまたは他の分子の側鎖が付着していてよいポリマー分子における点を意味する。分岐点は、化合物ＹおよびＺが、それを介して、Ｌに直接的に、または間接的にコンジュゲートし得る原子、原子団または官能基であってよい。
リンカーＬとして使用し得る非常に多様なポリマー分子が存在する。例には、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトンおよびシクロデキストリンなどの多糖；プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ジェラン、Ｏ−エチルアミノグアラン、６−Ｏ−カルボキシメチルキチンおよびＮ−カルボキシメチルキトサンなどのキチンおよびキトサン；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、６−アミノ−６−デオキシセルロースおよびＯ−エチルアミンセルロースなどの誘導体化セロロシック（ｃｅｌｌｏｌｏｓｉｃ）；ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギネートおよびアガロース；フィコールおよびカルボキシメチル化フィコールなどの合成多糖；ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（マレイン酸無水物）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（エチル−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアルコール−コ−ビニルクロロアセテート）、アミノ化ポリ（ビニルアルコール）およびそれらのコブロックポリマーを包含するビニルポリマー；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールまたはポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）含有ポリマー主鎖を包含する直鎖、くし形または多分岐ポリマーおよび分岐ＰＡＭＡＭデンドリマーを包含するデンドリマー；ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリウレタン、ポリ（エチレンイミン）、プルリオールを包含するポリアミノ酸；アルブミン、免疫グロブリンおよびウイルス様タンパク質（ＶＬＰ）およびポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドデンドリマー構成体を包含するタンパク質；混合ポリマー、即ち、１つまたは複数のポリマーの先行例からなるポリマー、コブロックポリマーおよびランダムコポリマーが包含される。
選択されたポリマーの特性を、性能を最適化するために改質することができ、例えば、長さまたは分岐を最適化することができる。さらに、様々な置換基を持つように、ポリマーを化学的に改質することができる。置換基をさらに化学的に保護および／または活性化させて、ポリマーをさらに誘導体化することができる。
好ましい一実施形態では、オキシドレダクターゼ基質と標識との間のリンカー化合物は、デキストランポリマーまたはデキストランポリマーを含むコンジュゲート分子である。
ポリマーを種々の化学的物質、例えば標識とコンジュゲートする方法は、当分野でよく知られており、本発明のコンジュゲートを製造するために使用することができる。例えば、ポリマーをビニルスルホンで活性化させ、検出可能な標識および式（ＩＩ）の分子と混合して、ポリマーコンジュゲートを形成することができる。他の実施形態では、アルデヒドを使用して、ポリマー、例えばデキストランを活性化させ、次いでこれを、検出可能な標識および式（ＩＩ）の分子と混合することができる。ポリマーコンジュゲートを調製するさらに他の方法は、成分を一緒にカップリングするためのいわゆる化学的選択的カップリングスキームを使用することにより、例えば、分子をチオール反応性マレイミド基で誘導体化し、その後、チオール改質されたポリマー主鎖に共有カップリングさせることができる。一部の他の実施形態では、式（Ｉ）の分子および検出可能な標識を、リンク化合物を介してポリマーに付着させることができる。この方法の例には、グルタル酸ジアルデヒド、ヘキサンジイソシアネート、ジメチルアピミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｐｉｍｉｄａｔｅ）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどのホモ二官能性リンカー化合物、例えばＮ−ガンマ−マレイミドビチロールオキシ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｙｔｙｒｏｌｏｘｙ）スクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性交差結合剤および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カボジイミド（ｃａｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）などのゼロレングス交差結合剤の使用が包含される。
１つまたは複数の式（ＩＩＩ）の繰り返し（後記では「Ｌ３０」と称される）を含むポリマーを誘導体化する方法は、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０１５１６８号に詳細に記載されている。
２つのＬ３０繰り返しを含むポリマー（Ｌ６０と称される）、３つのＬ３０繰り返しを含むポリマー（Ｌ９０と称される）、５つのＬ３０繰り返しを含むポリマー（Ｌ１５０と称される）などの様々な数の式（ＩＩＩ）の繰り返しを含むポリマーであるリンカーを含む例示的なコンジュゲートは、実施例に記載されている。
水性培地（ｉｉ）中の第２基質の量は、約１０−１０Ｍから約１０−４Ｍで変動してよく、例えば、コンジュゲート（上記のいずれか）が放射性標識を含む場合には、適用可能な量は、約１０−１０Ｍから約１０−６Ｍまで、コンジュゲートが、蛍光標識または特異的結合対のメンバーである標識を含む場合には、約１０−９Ｍから約１０−４Ｍまでであってよい。
インキュベーション培地
一実施形態では、標的の単独ユニットを含む試料を、本発明による可視化手順の間に、種々の水性培地（本明細書では一括して「インキュベーション培地」と称される）中でインキュベートする。
「インキュベーション培地」という用語は、本内容では、望ましい反応結果を達成するために、一定期間（本明細書では「インキュベーション時間」と称される）の間、試料が維持される水溶液を意味する。
インキュベーション培地中で試料を維持／インキュベートする時間、即ちインキュベート時間は、インキュベーションの後に達成されることが望まれている技術的効果に応じて変動してよい。種々の実施形態において、インキュベーションを、約３秒から約３分まで、例えば約１０秒、２０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分以上、例えば１〜２時間、一晩続けてよい。一実施形態では、インキュベート時間は方法の全てのステップで、同じ期間を有してよく、即ちどのインキュベートも、５から１０分など続けてよい。結合剤を含む水溶液（本明細書中、後記では「結合剤溶液」と称される）中の他の試料では、１〜３分続けてよく、水性培地（ｉ）および／または水溶液（ｉｉ）培地中でのインキュベーションは、１０分続けてよい。
インキュベーションは、標的、結合剤などの種類に応じて、様々な温度で行うことができる。本発明による手順は、実質的に温度とは独立しており、約＋４℃から約＋４０℃までの温度で行うことができるが、しかしながら、所望の場合には、温度を、インキュベーション期間を延長または短縮するために使用することができ、例えば、より低い温度を使用すると、インキュベート時間を延長することができ、逆に、より高い温度を使用すると、インキュベーションの時間を短縮することができる。
インキュベーション培地の組成の非限定的実施形態は、下記で検討される。
結合剤培地
本発明の方法のステップ（ａ）では、試料を、上記のとおりの１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートする。したがって、一実施形態では、本発明は、例えば、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む結合剤などの結合剤を含む水溶液に関する。この培地は、本明細書では、「結合剤培地」と称される。
そのような培地中で試料をインキュベートすることによって達成されるべき所望の技術的効果の１つは、本発明による標的部位の形成である。したがって、結合剤培地は、選択された結合剤が溶解性であり、単独標的ユニットに結合し得る水性培地である。基本的に、結合剤培地は、４から９までの範囲のｐＨを有する１つまたは複数の結合剤の緩衝水溶液である。一部の実施形態では、結合剤培地は、有機または無機塩を含んでよい。無機塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムから選択することができる。有機塩は、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウムまたはイミダゾール塩、例えばイミダゾール塩酸塩などから選択することができる。
結合剤培地中での塩の量は、約１０−３Ｍから飽和まで、例えば約２０ｍＭから約２００ｍＭまで、または約５０ｍＭから約５００ｍＭまでの範囲であってよい。好ましい一実施形態では、培地は、塩を約１０ｍＭから５００ｍＭまでの量で含んでよい。他の好ましい実施形態では、培地は、塩を含まなくてよい。
上述のとおり、典型的には、結合剤培地のｐＨ値は、ｐＨ３．５からｐＨ９．５の間、例えば、ｐＨ５からｐＨ７の間、ｐＨ５．５からｐＨ６．５の間またはｐＨ６．５から７．５の間またはｐＨ７からｐＨ８の間またはｐＨ７．５からｐＨ８．５の間またはｐＨ８からｐＨ９の間など、約４から約９まで変動してよい。適切な緩衝能力を有する任意の緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびイミダゾール緩衝液を使用することができる。他の適切な緩衝液は、Ｇｏｏｄ，ＮＥ．ら（１９６６）Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（２）、４６７〜４７７に見出すことができる。培地のｐＨ値は、結合剤を標的に結合させるために決定的であることがある；これを、結合剤および標的の性質に応じて、最適化することができる。
一部の実施形態では、結合剤培地は、有機改質剤（「有機改質剤」という用語は、任意の非水溶媒を意味する）、例えば、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、モノ−およびジエチレングリコール、スルホラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコールなどを含んでよい。有機改質剤の量は、約１％から約２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）まで変動してよいか、または一部の実施形態では、２０％より多くてよい。
一部の実施形態では、結合剤培地は、洗浄剤、例えばポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチフェニルエーテル（ｉｓｏｏｃｔｙｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ）（ＮＰ−４０））または界面活性剤（例えばモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ）をベースとする界面活性剤またはブロックコポリマーをベースとする界面活性剤（プルロニックなど）から選択される）などを含んでよい。洗浄剤の量は、約０．００１％から約５％／ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）まで変動してよい。
一部の実施形態では、結合剤培地は、結合剤安定化剤、例えばウシ血清アルブミンまたはデキストランを含んでよい。安定化剤の量は、０．０１％から２０％（ｗ／ｖ）まで変動してよい。
一部の実施形態では、結合剤培地は、イオンキレート化剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレンジアミンヒドロキシルフェニル酢酸タイプのキレート化剤（ＥＤＨＰＡ）など）を含んでよい。キレート化剤の量は、約１０−９Ｍから約１０−６Ｍまで変動してよい。
一部の実施形態では、結合剤培地は、非特異的結合部位、即ち、標的を含まない固体支持体の部位を飽和させるための１つまたは複数のブロック剤を含んでよい。種々の実施形態に適したブロック剤のいくつかの非限定的例は、デンハート液、ウシ血清アルブミン、脱脂乳などであってよい。
上記で検討されたとおり、本発明は、非常に多様な種類の標的、結合剤およびアッセイフォーマットを企図しており、したがって、結合剤培地の組成は変動してよく、当分野の知識を使用して、特定の実施形態ごとに調節すべきである。結合剤培地の一部の非限定的例は、実施例において記載されている。
一実施形態では、試料が、低濃度範囲で存在する標的を含む場合、結合剤と標的との相互作用を促進するために、その内容（例えばｐＨ、塩濃度など）およびインキュベーション条件（例えば、インキュベーション期間、温度）が最適化されている結合剤培地中で、比較的多い量の結合剤を使用することが好ましいことがある。そのような最適化は、標的の最大数の単独ユニットを結合剤と結合させ、最大数の別々の単独標的部位を形成することを保証するためである。この実施形態では、試料中での標的の僅かな発現によって、重大な数の単独標的部位同士の重なりは予期されない。
一実施形態では、試料が、低濃度範囲で存在する標的を含む場合、結合剤と標的との相互作用を促進するために、その内容（例えばｐＨ、塩濃度など）およびインキュベーション条件（例えば、インキュベーション期間、温度）が最適化されている結合剤培地中で、比較的多い量の結合剤を使用することが好ましいことがある。そのような最適化は、標的の最大数の単独ユニットを結合剤と結合させ、最大数の別々の標的部位を形成することを保証するためである。この実施形態では、試料中での標的の僅かな発現によって、重大な数の単独標的部位同士の重なりは予期されない。
好ましい一実施形態では、試料中に存在する全てまたは実質的に大部分の利用可能な単独標的ユニットに結合し、それらと共に別々の単独標的部位を形成するように、結合培地中の結合剤の量を調節する。
他の実施形態では、標的が試料中で豊富に発現される場合には、培地中の１つまたは複数の結合剤、例えば、第１、第２および／または第３結合剤の量を、結合剤が試料中の単独ユニットの分別部分集団のみと別々の単独標的部位を形成し得るように調節すべきである。別法では、そのような実施形態では、ｐＨ、塩含有率などの結合剤培地の組成または温度などのインキュベーション条件を調節して、それらが、単独標的部位の形成に関与している１つまたは複数の結合剤の標的結合能力に影響を及ぼし、したがって、結合剤が、試料中に存在する標的の単独ユニットの分別部分集団とのみ標的部位を形成するようにすることができる。
したがって、一実施形態では、豊富に、または幅広い動的濃度範囲で発現される標的を含む試料を、結合剤培地中、結合剤が単独標的ユニットの分別部分集団の集団と共に別々の単独標的部位を形成し得る条件下でインキュベートする。「分別部分集団」という用語は本内容では、試料中の標的の単独ユニットの全量に対して９９％以下、例えば、９０％以下、試料中の標的のユニットの全量に対して８５％未満、例えば７５〜８０％など、試料中の標的の単独ユニットの全量に対して７５％未満、例えば、１％から５０％までなど、試料中の標的のユニットの全量に対して１％から２５％などである集団全体のうちの割合と定義される。一実施形態では、インキュベーション条件を調節して、結合剤が、試料中に存在する標的の単独ユニットの全量に対して、約０．１％から約１％までなどの１％未満である単独標的ユニットの分別部分集団と共に別々の単独標的部位を形成するようにしてよい。
水溶液（ｉ）
結合剤培地中でのインキュベーションの後に、試料を、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質および、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質およびペルオキシド化合物を含む水溶液（ｉ）でインキュベートする。
場合によって、水溶液（ｉ）中でインキュベートする前に、試料を、第２基質を含まない水溶液（ｉ）である水溶液（ｉｉ）中でインキュベートすることができる。
したがって、一実施形態では、本発明は、水溶液（ｉ）であるインキュベーション培地に関し、他の実施形態では、本発明は、水溶液（ｉｉ）であるインキュベーション培地に関する。
水溶液（ｉ）および水溶液（ｉｉ）は両方とも、適切な緩衝能力を備えた水性緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびイミダゾール緩衝液であってよい。他の適切な緩衝液は、Ｇｏｏｄ，ＮＥ．ら（１９６６）Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（２）、４６７〜４７７に見出すことができる。インキュベーションの技術的効果、即ち、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質の別々のデポジットを別々の本発明の単独標的部位に形成することを達成するために、溶液のｐＨ値を調節することができ、例えば、約４から約９までの範囲のｐＨに調節することができる。しかしながら、水溶液（ｉ）および（ｉｉ）のｐＨは、インキュベーション技術的効果について、あまり重要ではない。
水溶液（ｉ）および水溶液（ｉｉ）は両方とも、有機または無機塩をさらに含んでよい。
無機塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどから選択することができる。
有機塩は、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウムまたはイミダゾール塩、例えばイミダゾール塩酸塩などから選択することができる。
水溶液（ｉ）および水溶液（ｉｉ）中での塩の量は、約１０−３Ｍから飽和まで、例えば約２０ｍＭから約２００ｍＭまで、または約５０ｍＭから約５００ｍＭまでの範囲であってよい。好ましい一実施形態では、培地は、塩を約１０ｍＭから５００ｍＭまでの量で含んでよい。他の好ましい実施形態では、培地は、塩を含まなくてよい。
水溶液（ｉ）および水溶液（ｉｉ）は両方とも、異なる実施形態では、
（ｉ）有機改質剤および／または
（ｉｉ）酵素促進剤および／または
（ｉｉｉ）鉄キレート化剤および／または
（ｉｖ）洗浄剤および／または
（ｖ）抗菌剤
をさらに含んでよい。
有機改質剤は、培地中に、約１％から約２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）までの量で存在してよいが、しかしながら、一部の実施形態では、より高い濃度の有機改質剤が必要なことがある。有機改質剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってよい。他の例には、これらに限られないが、主にＣ１〜Ｃ４、即ち低級アルコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、モノ−およびジエチレングリコール、スルホラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群から選択される有機改質剤が包含される。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ２０００またはプロピレングリコールを使用することが有利であることがある。これらの場合、培地中のポリエチレングリコールの量は、約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）まで、例えば、５〜１０％（ｖ／ｖ）など、約１％（ｖ／ｖ）から約１５％までで変動してよい。
「酵素促進剤」という用語は、ペルオキシダーゼの触媒活性を増強する任意の化合物を意味する。そのような酵素促進剤は、主にフェニルボロン酸誘導体およびニッケルまたはカルシウムなどの二価金属イオンからなる群から選択することができる。酵素促進剤の量は、約１０−７から約１０−３Ｍまでで変動してよい。
鉄キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレンジアミンヒドロキシルフェニル酢酸タイプのキレート化剤（ＥＤＨＰＡ）であってよい。鉄キレート化剤の濃度は、約１０−９Ｍから約１０−６Ｍまでで変動してよい。
洗浄剤は、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチフェニルエーテル（ＮＰ−４０））から選択することができ、界面活性剤は、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ）をベースとする界面活性剤またはブロックコポリマーをベースとする界面活性剤（プルロニックなど）から選択することができる。洗浄剤の濃度は、約０．００１％から約５％まで変動してよい。
水溶液（ｉ）の必須の成分は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質、前記酵素の第２基質およびペルオキシド化合物である。
第１基質および第２基質の実施形態は、上記で詳細に検討されている。
好ましい一実施形態では、第１基質は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）またはその誘導体であってよい。他の好ましい実施形態では、第１基質は、フェルラ酸またはその誘導体であってよい。
水溶液（ｉ）中の第１基質の量は、第１基質として選択された化合物に応じて変動してよい（上記の検討を参照されたい）。例えば、ＤＡＢが第１基質として選択されている実施形態では、水溶液（ｉｉ）および水溶液（ｉｉ）中でのＤＡＢの量は、１．４ｍＭ未満、好ましくは１．２ｍＭ未満、好ましくは１ｍＭ未満、約０．００５ｍＭから約０．５ｍＭまでなど、例えば、約０．３ｍＭまたは約０．２ｍＭ、約０．１５ｍＭなどである。フェルラ酸が第１基質として使用されている実施形態では、前記化合物の量は、２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、例えば約１．５ｍＭである。「約」という用語は本内容では、＋／−０．０５〜０．５ｍＭを意味する。
水溶液（ｉ）は、約１０−１０Ｍから約１０−４Ｍまでなどの様々な量の酵素の第２基質を含んでよい。例えば、第２基質（上記のいずれかとして）が放射性標識を含む実施形態では、適用可能な量は、約１０−１０Ｍから約１０−６Ｍまでの範囲であってよい。例えば、第２基質が、蛍光標識または特異的結合対のメンバーである標識を含む他の実施形態では、量は、約１０−９Ｍから約１０−４Ｍまでの範囲であってよい。
一実施形態では、水溶液（ｉ）は、第２基質の同一のコンジュゲート分子の集団を含んでよい。他の実施形態では、水溶液（ｉ）は、第２基質の異なるコンジュゲート分子の集団を含んでよい。
本発明の好ましいペルオキシド化合物は過酸化水素であるが、しかしながら、他のペルオキシド化合物もまた、異なる実施形態では使用することができ、例えば一部の実施形態では、これは好ましくは、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ジｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、過酢酸などの有機ペルオキシドであってよいか、または一部の実施形態では、これは、過酸化水素尿素付加物などの過酸化水素の付加物であってよい。
水溶液（ｉ）および水溶液（ｉｉ）中のペルオキシド化合物の量は、５ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは０．１ｍＭから５ｍＭの範囲、例えば０．１ｍＭから１ｍＭの間、１ｍＭから２ｍＭの間、２ｍＭから３ｍＭの間または３ｍＭから４ｍＭの間、好ましくは、約１ｍＭから約２ｍＭまでの範囲、約１．５ｍＭなどであってよい。「約」という用語は本内容では、＋／−０．０５〜０．５ｍＭを意味する。
オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質、前記酵素の第２基質およびペルオキシド化合物を含む水溶液（ｉ）は、本明細書では、「デポジション培地」と称される。
水溶液（ｉｉ）は、水溶液（ｉ）と同じ化合物を同じ量で含んでよいが、但し、水溶液（ｉｉ）は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質を含まない。
一部の実施形態では、単独標的部位を含む試料を、初めに水溶液（ｉｉ）中で、次に水性培地（ｉ）中でインキュベートすることができる。
他の実施形態では、単独標的部位を含む試料を、水溶液（ｉｉ）中で予備インキュベーションすることなく、水溶液（ｉ）中でインキュベートする。
本発明では、デポジション培地は、安定な溶液であり、即ち、溶解された化合物の沈殿は、少なくとも５時間などの比較的長時間、生じない。培地の貯蔵寿命を延長するために、培地を＋２０℃未満、例えば＋４〜＋１０℃の温度で貯蔵し、かつ／または培地に抗菌剤を加えることが有用なことがある。抗菌化合物は、そのような目的のために一般に使用されている任意の抗菌化合物、例えばアジ化ナトリウム、Ｐｒｏｃｌｉｎ（商標）またはＢｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標）であってよい。
検出培地
一実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の後に、第２基質の別々の単独デポジットを単独標的部位で検出することを含む１つまたは複数のステップを含む方法に関し、例えば、第２基質の別々のデポジットを含む試料を、第２基質のデポジットされた分子の検出可能な標識に特異的に結合し得る結合剤を含むインキュベーション培地中でインキュベートすることができる。
第２基質のデポジットされた分子の検出可能な標識に特異的に結合し得る結合剤を含むインキュベーション培地は典型的には、上記で検討された結合剤培地と同様または同じ組成を有する。
デポジットされた第２基質の検出可能な標識に結合する結合剤は、一実施形態では、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスホターゼ（ＡＰ）を含んでよい。そのような結合剤は、酵素の発色性基質を用いる標準的な可視化系、例えば、酵素基質溶液または呈色溶液を使用して、検出することができる。この種の培地は、可視化のために利用可能な手段に応じて、かつデポジットの検出可能な標識の性質に関して共通する当分野の一般的な知識に従って選択されるべき当分野で知られている任意の適切な培地であってよい。そのような検出の非限定的例は、実施例に記載されている。
別法では、結合剤がＨＲＰを含む場合、本発明の可視化方法は、前記結合剤に結合している第２基質の別々のデポジットを含む試料を、上記のデポジション培地中でインキュベートするさらなるステップを含んでよい。そのようなさらなるステップは、デポジットされた第２基質に随伴するシグナルが弱いか、または一次デポジットのサイズが比較的小さい一部の実施形態において有利であることがある。追加的なデポジションステップによって、デポジットに随伴するシグナルをさらに増幅することができ、これはまた、検出可能なデポジットのサイズを単独標的部位で増大させることができる。さらに、そのステップによってまた、検出可能なシグナルの特徴を改質する、例えばシグナルのスペクトル特性を変化させることができ、例えば、赤色シグナルとして検出可能な当初の標識を、緑色シグナルとして検出可能な標識に置換することができるが、それは、当初デポジションのために使用される赤色標識を含むコンジュゲート分子（方法のステップ（ｂ）で）の代わりに、この追加的なデポジションのための前記緑色標識を含むコンジュゲート分子を使用することによる。しかしながら、そのような本発明の方法の柔軟性は、余分な複雑さを、検出の追加的なステップにおいて使用される試薬に加えることはなく、それというのも、方法のステップ（ａ）および（ｂ）（上記で検討されている）のインキュベーション培地の全ての実施形態を、これらの追加的なステップにおいて実質的な変更を伴うことなく、成功裏に使用することができるためである。
一実施形態では、本発明は、洗浄培地、即ち、インキュベーションの技術的効果が実施された後に、試料から、残りの化合物（インキュベーション培地の）を除去するための培地に関する。本発明の方法は、典型的には、上記の培地中で試料をインキュベーションするステップの後に、例えばステップ（ａ）と（ｂ）との間などに、１つまたは複数の洗浄ステップを含んでよい。典型的には、洗浄培地は、洗浄ステップに先行するステップにおいて、試料をインキュベートするために使用されていたのと同じ培地であるが、インキュベーション培地の必須化合物は含まない、即ち、結合剤、酵素の基質などは含まない。
一実施形態では、本発明は、内生オキシドレダクターゼ活性をクエンチするための培地に関する。この種の培地は、当分野でその目的のために常套的に使用されているそのような種類の任意の培地、例えば、過酸化水素溶液であってよい。この培地は、方法のステップ（ａ）の前に使用することができる。これはまた、ステップ（ｂ）の後、およびデポジットされた第２基質を検出する追加的なステップの前に使用することができる。手順のこの段階でのこの培地の適用は、試料中の残りのオキシドレダクターゼ活性をクエンチするために使用することができる。
第２基質の別々のデポジット
意外にも、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質および比較的に僅かな量のオキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質、ＤＡＢおよび過酸化水素などのペルオキシド化合物からなる特殊なコンジュゲート分子を含むデポジション培地の特定の条件を使用すると、前記コンジュゲート分子の別々のデポジットを本発明の単独標的部位に形成することができ、これは、通常の顕微鏡光学を使用して直接的に観察するか、または識別可能なドットとして可視化することができる識別可能な物理的形質、即ち、直径で０．４マイクロメートル超の丸形デポジットを有することが見出されている。同様の増幅システム（検出可能なコンジュゲート分子のＨＲＰ−ＤＡＢ媒介されるデポジションを用いる。詳細については、ＷＯ２００９０３６７６０号、ＷＯ２０１００９４２８３号およびＷＯ２０１００９４２８４号を参照されたい）を使用すると、従来のＨＲＰ−ＤＡＢ ＩＨＣ染色を改良することが可能であり、その際、標的染色の均一な色パターンが、より輪郭明瞭となって、それによって、細胞構造、例えば膜、細胞質および核の細胞内解像が改良される。本可視化システムは代わりに、１つの単独ドットが、１つの個別標的分子などの１つの個別の標的ユニットに対応する標的染色のドット化パターンをもたらし、それによって、単独標的分子などの個別の単独標的ユニットの細胞内解像を可能にする。
本発明の方法によって生じる本発明の検出可能なコンジュゲート分子のデポジットは、三次元的であり、実質的に球形を有し、これは二次元フィールドでは、例えば顕微鏡フィールドでは、識別可能な実質的に円形のドットとして観察される。したがって、「円形ドット」（本明細書では、「ドット」および「識別可能なドット」という用語と互換的に使用される）は本内容では、二次元フィールドでは識別可能な実質的に円形のドットとして観察される本発明の検出可能なコンジュゲート分子の球形デポジットを示している。「識別可能な」という用語は本内容では、本発明のドットが、眼または考えにおいて区別可能であることを意味する。「実質的に円形」という用語は、本発明の識別可能なドットが、約０．６５またはそれ未満の偏心を有することを意味する。本発明によるドットは、約０．４ミクロンまたはそれより大きい直径を有する。「約」という用語は本内容では、＋／−０．０５〜０．５ｍＭを意味する。比較すると、従来のＤＡＢ−ＨＲＰ方法によるＤＡＢ染色のデポジットまたはＷＯ２００９０３６７６０号、ＷＯ２０１００９４２８３号およびＷＯ２０１００９４２８４号の方法によって得られる標的部位での染色の単独デポジットまたはＣＡＲＤ方法によるビオチニル−およびフルオレシルチラミドデポジットの「ドット」は、通常の顕微鏡光学素子（倍率４倍または１０倍の明視野または蛍光光学など）の解像限界未満、即ち、０．１ミクロン未満のサイズを有する。したがって、後者の方法によって可視化された個別の単独標的ユニットを、低倍率顕微鏡フィールド（４倍または１０倍など）で直接観察することは不可能である。本明細書に記載の方法は、本発明の検出可能なコンジュゲート分子の単独デポジットを単独標的部位で検出および可視化することを可能にし、それによって、低倍率光学素子を使用して、試料中の標的の固定化された単独ユニットを観察することを可能にする。
（オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の）「第２基質の１つの単独デポジット」または（本発明の）「検出可能なコンジュゲート分子の１つの単独デポジット」という用語は、第２基質の多数のコンジュゲート分子の単独集積に関する。本発明では、本発明の第２基質の１つの識別可能なデポジットは、約１０００から１００００００までのコンジュゲート分子またはそれ以上を含んでよい。
上記で検討されたとおり、単独標的部位にデポジットされた第２基質は、視覚的に同定可能な分子、例えば視覚的に検出可能な標識、例えば蛍光標識を含む分子を含んでよい。したがって、一実施形態では、そのような第２基質のデポジットのドットを、顕微鏡使用者は、デポジットが形成した直後に慣用の蛍光顕微鏡を使用することによって検出することができる。標準的な顕微鏡光学素子によって直接的には観察することができない標識、例えば、特異的結合対のメンバーを含むリポーター分子のデポジットは、少なくとも１つの追加的なステップ、検出ステップ、例えば上記の追加的なステップ（ｃ）を使用して、本発明に従って可視化すべきである。
ドットの数、そのサイズおよび外観を制御することができる。例えば、異なる実施形態では、特定のサイズおよび特定の外観（例えば特定の色）のドットを生じさせることができる。
一実施形態では、種々の数の酵素部分（「酵素部分」または「酵素」という用語は本内容では、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素を意味する）、例えば結合剤１つ当たり種々の数のＨＲＰを含む本発明の標的部位の形成に関与する結合剤を使用することによって、デポジットのサイズおよびドットサイズを変動させることができる。他の実施形態では、ドットサイズは、デポジションプロセスの期間によって制御することができる。他の実施形態では、デポジション培地における第１および／または第２基質またはペルオキシド化合物の量などのデポジション培地の内容によって、ドットサイズを調節することができる。
したがって、一実施形態では、標的部位を形成するために使用される結合剤の分子１つ当たりの酵素ユニットの数で、ドットのサイズに影響を及ぼすことができる。ドットサイズは、１つまたは複数の結合剤および標的の１つの単独ユニットを含む複合体１つ当たりの酵素部分の数に直接相関し得ることが見出されている：標的部位を形成するために使用される結合剤が分子１つ当たりより多い数の酵素部分を含む場合には（その他は同じデポジション条件下で（即ち、同じインキュベーション時間、デポジション培地の同じ組成）、同じではあるが、分子１つ当たりより少ない数の酵素部分を含む結合剤を用いた場合に得られるドットと比較して、より大きなドットが観察される。
本発明の条件下で１つの単独デポジットに対応する可視のドットを生じさせるためには、標的部位が、単独、即ち１つの酵素部分を含むことで、例えば標的部位の形成に関与している結合剤が、単独ＨＲＰ部分を含むことで十分であるが；しかしながら、２つ以上の酵素部分が、同じ標的部位に存在する実施形態では、この標的部位に随伴するドットは、第１の場合のドットよりも大きい。したがって、一実施形態では、１つの単独標的部位に随伴する結合剤は、ＨＲＰの１つの単独部分を含んでよく、他の実施形態では、結合剤は、２つ以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＨＲＰ部分を含んでよい。一実施形態では、結合剤１つ当たりの酵素部分の数は、少なくとも２つ、好ましくは３から１０、４から８などの部分である。
意外にも、酵素部分の数が結合剤の分子１つ当たり少なくとも２つである、本発明の標的部位の形成に関与している結合剤を使用すると、その他は同じ条件下で、即ち、可視化手順の同じ条件下で、ほぼ同じサイズのドットを生じさせることができることが見出された。したがって、一実施形態では、本発明は、固定化された標的を含む試料を、結合剤のうちの少なくとも１つは少なくとも２つのオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートする方法に関する。したがって、標的の個別ユニットは、この実施形態では、個別の実質的に同一のドットとして、即ち、同じサイズのドットとして可視化される。一実施形態では、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む結合剤の分子のプールは、不均一であってよく、その際、前記分子は、例えば２から１０の間の分子、１１から２０の間の分子など、１分子当たり種々の数の酵素部分を含む。他の実施形態では、本発明は、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む結合剤の分子のプールのうちのいずれの分子も、結合剤分子１つ当たり１〜３、２〜４〜、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２などの酵素部分など、結合剤の分子１つ当たり実質的に同一の数の酵素部分を含む方法に関する。
他の実施形態では、ドットのサイズを、デポジション培地における第１基質の量によって、例えばＤＡＢの量によって調節する。デポジットされたリポーター（ドット１つ当たり）が１０００分子以上である大きなドット、即ち、直径が０．４ミクロン以上または１ミクロン以上または２または３ミクロン以上、４もしくは５ミクロンなどであるドットは、デポジション培地におけるＤＡＢの量（その他は、可視化手順の同じ条件で、即ち、同じ結合剤、同じリポーター、同じ量のリポーター、ペルオキシドの同じ濃度、同じインキュベーション時間など）が、約０．０１ｍＭから約１ｍＭまでの範囲、例えば、０．０５ｍＭから０．７５ｍＭの間、約０．０７５ｍＭから約０．５ｍＭまでなど、約０．１ｍＭなど、例えば０．１５ｍＭ、または約０．３ｍＭ、例えば０．２８ｍＭなどである場合に、形成することができる。より小さいサイズ、即ち０．４ミクロン未満のドットは、デポジション培地においてＤＡＢのより多い量および少ない量の両方を使用すると、観察することができる。
本発明のコンジュゲート分子の組成および構造は、本発明の第２基質（上記で検討）としてデポジットされる前記分子の能力に影響を及ぼし、したがって、これらは、デポジットのサイズおよびドットの見かけのサイズに影響を及ぼす。さらに、コンジュゲートの標識は、ドットの外観に影響を及ぼし得る。例えば、コンジュゲート分子が蛍光標識を含む実施形態では、標識の蛍光基の性質は、ドットの外観に影響を及ぼし、例えば、同一の条件下で、リサミン（赤色蛍光基）を含むコンジュゲートは、フルオレセイン（緑色蛍光基）を含む同様のコンジュゲートよりも強いドットをもたらす。さらに、デポジション培地においてより多い量の第２基質は、他は同じ条件下で、より大きなデポジットの形成をもたらし得る。
ドットのサイズはまた、第２基質をデポジションするために使用される時間によって調節することができる。デポジション培地中でのインキュベーション時間が長いほど、より多い量のコンジュゲート分子を単独標的部位にデポジットさせることができ、それによって、単独デポジットのサイズ、続いて、単独ドットのサイズを大きくすることができる。他は同じ条件で、即ち、同じ結合剤、同じ培地などで、インキュベーション時間を３０秒から１０分へと延長すると、酵素は、直径約５マイクロメートルの単独ドットとして観察することができるデポジットを生じ得る。しかしながら、さらにインキュベーション期間のさらなる延長は、単独デポジットのサイズを増大させない。しかしながら、デポジション培地中でのインキュベーション時間が長いほど、単独デポジットのサイズは低下せず、望ましい場合には、より長いインキュベーション時間、例えば、２０または３０分以上を使用することができる。したがって、異なる実施形態では、方法のデポジションステップの期間は、約３０秒から約２０分まで、例えば１、２、３、４、５、１０または１５分など、変動してよく、一実施形態では、インキュベーション時間は、約３０秒であってよく、他の実施形態では、時間は、約２分であってよい。一実施形態では、コンジュゲート分子を５〜１０分の間デポジットさせることが好ましい。
デポジション培地中のペルオキシド化合物の量もまた、リポーターデポジットのサイズ、したがって、ドットサイズを調節するための因子として使用することができる。直径５マイクロメートルまでの単独ドットを得るためには、デポジション培地中での、例えば、過酸化水素などのペルオキシド化合物の量は、２ｍＭ未満であるべきであり、好ましくは、その量は、１．５ｍＭを超えない。ペルオキシド化合物の量がより多いと、より小さいサイズのドットが形成される。
上記で検討された因子は全て、本内容では「一次因子」と称される。それというのも、これらは、第２基質の当初、即ち一次デポジットの形成に影響を及ぼすためである。上述のとおり、例えば、第２基質のコンジュゲート分子が蛍光標識を含む場合には、そのような一次デポジットは、デポジションが生じた直後に観察することができる。他の実施形態では、例えば、コンジュゲートが特異的結合対のメンバー、例えばハプテンである標識を含む場合、一次デポジットは、直接観察することはできないが、しかしながら、これらは、デポジションステップの後の１つまたは複数の検出ステップ（本内容では「二次可視化手順」と称される）で可視化することができる。二次可視化手順のいくつかの因子もまた、視覚的サイズおよびドットとしてのデポジットの外観に影響を及ぼすことができ、それらによって、本発明の可視化システムの柔軟性が増す。したがって、これらの因子は、「二次因子」と称される。
特異的結合対のメンバーである標識を含むリポーター分子のデポジットは、デポジションステップに直接または間接に続く次の検出ステップ（ｃ’）および（ｃ”）を行うと可視化することができる：
（ｃ'）単独標的部位に第２基質の別々のデポジットを含む試料を、デポジットされた第２基質の検出可能な標識に直接的または間接的に結合し得る１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、それによって、デポジットされたリポーターと前記少なくとも１つの結合剤とを含む複合体を形成するステップであって、結合剤の少なくとも１つは、放射性、蛍光または発光物質、特異的結合対のメンバーまたは酵素から選択される１種または複数の検出可能な標識を含むステップ、
（ｃ’’）試料中で、検出可能な標識を含む結合剤を検出して、それによって、１つまたは複数のリポーターデポジットを１つまたは複数の個別の標的部位で可視化し、かつそれによって、標的の１つまたは複数の個別ユニットを試料中で可視化するステップ。
「間接的に」という用語は、本内容では、１つまたは複数の場合によるステップ、例えば、洗浄ステップが、ステップ（ｂ）と（ｃ’）との間に存在してよいことを意味する。
発色性または蛍光基質、例えば、ＨＲＰまたはアルカリホスホターゼ（ＡＰ）を利用し得る多数の酵素部分（検出可能な標識として）を含む結合剤を認識するリポーターを使用することによって、デポジットを「染色」し、識別可能な視覚的に検出可能なドットを生じさせることができる。この場合、ある種のサイズの識別可能で視覚的に検出可能なドットを生じさせることによって、単独デポジットの元のサイズを、「大きく」または「小さく」することができる。一実施形態では、ＨＲＰまたは他のオキシドレダクターゼ酵素で標識された結合剤およびデポジションの最適な条件（上記で検討）を使用して、デポジションのステップを、１回または複数回繰り返して、それによって、単独標的部位での検出可能なデポジットのサイズを、繰り返すたびに大きくすることができる。他の実施形態では、ＨＲＰまたは他のオキシドレダクターゼ酵素で標識された結合剤およびデポジションの最適以下の条件（上記で検討）を使用して、デポジションステップを繰り返して、より小さいサイズ、したがって、対応する検出可能なドットのより小さいサイズのデポジットを得ることができる。一実施形態では、一次デポジションのために使用されたコンジュゲート分子とは異なる、例えば、フルオレセイン標識の代わりに、他の標識、例えばリサミン標識を含むコンジュゲート分子を第２基質として使用して、デポジションステップを繰り返すことができる。他の実施形態では、デポジション時間またはデポジション培地条件を最適化して、より小さな、またはより大きな二次デポジットを一次単独標的部位に生じさせることができる。
したがって、本発明の可視化方法は、柔軟で強力な増幅システムを含む。二重の調節システムは、一部の実施形態では、例えば、大きな一次デポジットをより小さなサイズのドットとして可視化することが望ましい実施形態では、特に有利であり得る特別な柔軟性をもたらす。より小さなサイズのドットによって、より正確な標的ユニットを試料中で位置決定することができ、また、標的のより広い動的範囲を検出することができる。
上記の二重調節はまた、２つ以上の異なる標的を検出すべき実施形態において、または標的が試料中に広い動的濃度範囲で存在する実施形態において、または一次デポジットが弱い検出可能なシグナルをもたらす実施形態などにおいて、望ましいことがある。幅広い動的濃度範囲で試料中に存在する、即ち、試料において、標的濃度の勾配が存在する標的の可視化および定量は、困難であることがある。範囲の下限では、ドットに関連している標的部位の数が、試料全体にわたる標的の存在についての統計的に有効な情報をもたらすには不十分であることがある一方で、同定範囲の上限では、標的の単独ユニットの可視化は、互いに分離して視覚的に識別することができないいくつかの重なったドットが存在することによって、困難であることがある。大きな一次デポジットに対応してドットの見かけのサイズを小さくするために上記の一次および／または二次因子を使用することで、これらの問題を克服し、幅広い動的範囲で試料中に存在する標的を可視化および定量することができる。
第２基質の一次デポジットを検出する方法は、試料の種類、デポジットされた分子の特徴などに応じて、異なってよい。当分野の任意の適切な方法を使用することができ、例えば組織学的試料では、デポジットを、任意の標準的なＩＨＣ染色液を使用することによって検出することができ、例えばＨＲＰ−ＤＡＢ染色、ＥＬＩＳＡ可視化またはイムノブロット染色などを他の実施形態で使用することができる。
試料中の標的の個別ユニットを検出する方法の実施形態
下記は、本発明の方法の実施形態の非限定的な例である。
組織学的試料中の生物学的マーカーの単独標的分子を検出する方法
一実施形態では、本発明の方法は、組織学的試料中の生物学的マーカーの単独分子などの単独標的分子を可視化するために使用することができ、この際、前記方法は、
ａ）生物学的マーカーの１つまたは複数の単独分子をおそらく含む試料を、結合剤のうちの少なくとも１つは前記生物学的マーカーの１つの個別の分子に直接結合することができ、結合剤のうちの少なくとも１つはペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、それによって、１つまたは複数の標的部位を形成し、その際、単独標的部位はそれぞれ、生物学的マーカーの１つの単独分子と、結合剤のうちの少なくとも１つがペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤とからなる複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の１つまたは複数の標的部位をおそらく含む試料を、
ｉ）３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）
（ｉｉ）ペルオキシド化合物
（ここで、ＤＡＢの量は、約０．１ｍＭから約１ｍＭまでであり、ペルオキシド化合物の量は、約０．５ｍＭから約２ｍＭまでである）および
（ｉｉｉ）下式：
（Ｙ）ｎ−Ｌ−（Ｚ）ｍ
［式中、
Ｙは、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素の基質であり、
Ｚは、検出可能な標識であり；
Ｌは、リンカーであり、
ｎは、２から１５０までの整数であり、ｍは、１から１５０までの整数である］
によって定義される化合物の群から選択される
１つまたは複数のコンジュゲート分子の集団
を含む水溶液中でインキュベートして、それによって、前記リポーター分子の１つまたは複数の別々のデポジットを（ａ）の単独標的部位に形成し；試料中の前記単独標的部位を、識別可能な単独ドットとして可視化するステップと、場合によって、
ｃ）別々のデポジットを単独標的部位で識別可能な単独ドットとして可視化して；
それによって、試料中の生物学的マーカーの１つまたは複数の単独分子を可視化するステップとを含む。
結合剤、コンジュゲート分子、インキュベーション培地（例えばステップ（ｂ）の水溶液）、可視化手段などの実施形態は、上記で検討されている）。
ＨＲＰの代わりに、上記で検討されたオキシドレダクターゼファミリーの他の酵素および第１基質としてＤＡＢ以外の他の化合物を使用してよいことは理解される。さらに、本発明の第２基質として適した他の化合物を、上記で定義された式（Ｙ）ｎ−Ｌ−（Ｚ）ｍの化合物の代わりに使用することができる。
一実施形態では、上記の方法は、上記で検討された任意のさらなるステップを含んでよい。一実施形態では、方法は、ステップａ、ｂまたはｃのいずれかの後に１つまたは複数のステップを含んでよい。他の実施形態では、方法は、ステップａ、ｂまたはｃのいずれかの前に１つまたは複数のステップを含んでよい。方法は、自動ステップの少なくとも１つを含んでよいか、または少なくとも１つの自動ステップをさらに含んでよい。
一部の実施形態では、例えば、生物学的マーカーが試料中で豊富に発現されるか、または幅広い動的濃度範囲で発現される場合には、結合剤が単独標的分子の分別部分集団と標的部位を形成し得る条件下で、試料を、単独標的部位の形成に関与している１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートすることが好ましいことがある。そのような条件の実施形態は、上記で検討されている。
他の実施形態では、例えば生物学的マーカーが低発現標的である場合には、生物学的マーカーの実質的に全ての単独分子が、標的部位の形成に関与していることが好ましいことがある。これらの実施形態では、最適な条件下、即ち、結合剤が利用可能な標的ユニットの全てと共に標的部位を形成し得る条件下で、試料を１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートすることが好ましい。
一実施形態では、標的は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）または対応する核酸、詳細には、Ｈｅｒ２受容体またはそれをコードする核酸である。
疾患の生物学的マーカーとして当分野で知られている任意のタンパク質または他の生物学的分子、構造または分子複合体が、本発明の範囲内に包含される。詳細には、本発明は、癌の生物学的マーカーに関する。
１つの試料中で少なくとも２つの異なる固定化された標的の単独ユニットを検出する方法
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、１つの同じ試料中の２つ以上の異なる標的の単独ユニット、例えば、２つ以上の異なる生物学的マーカーの単独分子を検出および可視化することができる。
試料中、例えば組織学的試料中で少なくとも２つの異なる固定化された標的の単独ユニットを可視化および検出する方法は、本発明では、
試料を、第１標的に結合し得る１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートするステップであって、その際、
試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第１標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第１標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第１標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第１単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、第１標的の個別単独ユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、第１単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および上記方法（１）のステップ（ｂ）（即ち、請求項１のステップ（ｂ））によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１単独標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１単独結合部位に付随している酵素の残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第２標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第２標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第２標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第２単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、第２標的の個別のユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の試料を、第２単独結合部位に付随している第１基質、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質の分子の第２集団および上記方法（１）のステップ（ｂ）（即ち、請求項１のステップ（ｂ））によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第１標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第２標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む。
上記方法の標的は一実施形態では、異なる生物学的マーカー、例えば異なる生物学的分子である。一実施形態では、標的は、異なる核酸配列または異なるタンパク質分子である。一実施形態では、第１標的は、核酸配列でよく、第２標的は、タンパク質分子、例えば、Ｈｅｒ２受容体およびＨｅｒ２関連核酸配列であってよい。
一実施形態では、標的のうちの少なくとも１つは、生物学的マーカーであってよく、他の少なくとも１つは、参照マーカーであってよく、例えば、一方の標的はＨｅｒ２受容体（生物学的マーカー）であり、他の標的は、サイトケラチン（参照マーカー）である。生物学的マーカーおよび参照マーカーの選択は、試料に依存しており、詳細には、疾患または他の生理学的状態の生物学的および参照マーカーが関係している実施形態では、関連先行技術において蓄積された知識に従って行うことができる。
上記の方法は、上記で検討された任意のさらなるステップを含んでよい。一実施形態では、方法は、ステップａ、ｂまたはｃのいずれかの後に１つまたは複数のステップを含んでよい。他の実施形態では、方法は、ステップａ、ｂまたはｃの前に１つまたは複数のステップを含んでよい。方法は、少なくとも１つの自動ステップを含んでよいか、少なくとも１つの自動ステップをさらに含んでよい。
一実施形態では、試料は、組織学的試料である。
一実施形態では、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素はＨＲＰである。一実施形態では、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質はＤＡＢである。ＨＲＰおよびＤＡＢに関する実施形態は、上記の検討のいずれかであってよい。他の実施形態では、酵素は、他のオキシドレダクターゼ酵素からが好ましく、例えば上記の検討から選択することができる。他の実施形態では、第１基質は、第１基質として適した任意の他の化合物からが好ましく、例えば上記の検討から選択することができる。
異なる標的の単独ユニットを検出するために使用される集団の任意の第２基質の分子は例えば、上記のコンジュゲート化合物であってよい。一部の例示的な化合物はまた、実施例部分にも記載されている。第１集団のコンジュゲート分子および第２集団のコンジュゲート分子は、それらが含む異なる検出可能な標識によって異なる。他の実施形態では、第１集団の分子および第２集団のリポーター分子は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素のための基質として働き得る化合物の組成によってもさらに異なってよい。他の実施形態では、分子は、他の形質、例えば、コンジュゲート分子の構造、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質と標識との間のリンカーの長さ、検出可能な標識の数によってさらに異なってよい。
第２基質の分子をデポジションさせるステップ、即ち、ステップ（ｂ）および／または（ｅ）は、上記の任意の実施形態に従って行うことができ、例えば、試料を、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質およびペルオキシド化合物を有する溶液中で第１予備インキュベートし、次いで、第１基質、第２基質およびペルオキシド化合物の組合せを含む溶液中でインキュベートすることができる。
一実施形態では、少なくとも２つの標的のうちの少なくとも１つは、試料中に、幅広い動的濃度範囲で存在する。
１つの試料中で少なくとも２つの標的を可視化する非限定的例は、生物学的マーカーおよび参照マーカーの可視化であってよい。
幅広い動的濃度範囲で試料中に存在する固定化された標的の単独ユニットを検出する方法
試料中に幅広い動的濃度範囲で存在する標的の単独ユニットの検出および可視化は、その範囲の下限では、試料全体でのノイズおよび偽のデポジットのレベルと比較して非常に僅かな実際のリポーターデポジットの形成によって、統計的に妥当な情報を得るには困難であることがある一方で、範囲の上限では、単独ユニットの可視化が、視覚的に分離することができないドットの重なりが存在することによって、限られてしまうことがある。したがって、２つの異なるリポーターをデポジションさせる少なくとも２つの別々のステップを利用することが有利なことがあり、その際、第１リポーターの分子は、標的のユニットが豊富に存在する試料のエリアに位置している第１標的部位にデポジットさせ、第２リポーターの分子は、標的が少なく存在するエリアに位置している第２標的部位でデポジットさせる。
したがって、試料中で幅広い濃度範囲で存在する標的の単独ユニットを検出および可視化する方法は、本発明では、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み；
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの第１分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の第１標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、前記第１分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、（ａ）の第１標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１の単独標的部位に付随している残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、標的の個別単独ユニットの第２の分別部分集団で１つまたは複数の別々の第２の標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、前記第２分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の前記試料を、第２単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第２集団および上記方法（１）のステップ（ｂ）（即ち、請求項１のステップ（ｂ））によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第１集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第２集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む。
一実施形態では、（ａ）および（ｄ）の結合剤は、同じ結合剤であってよい。一実施形態では、標的の第１分別部分集団で単独標的部位を形成するためにステップ（ａ）で使用される結合剤の量が、ステップ（ｄ）で標的の第２分別部分集団で単独標的部位を形成するために使用される結合剤の量よりも少ないことが好ましいことがある。
他の実施形態では、（ａ）および（ｄ）の結合剤は、異なる結合剤、例えば２つの異なる抗体結合剤、２つの異なる核酸結合剤、結合剤（ａ）としての抗体および結合剤（ｂ）としての核酸、標的に対して異なる親和性を有する２つの標的特異的抗体などであってよい。
一実施形態では、第１集団のリポーター分子および第２集団のリポーター分子は、それらが含む異なる検出可能な標識によって異なる。他の実施形態では、第１集団の分子および第２集団のリポーター分子は、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素のための基質として働くことができる化合物の組成によって異なる。他の実施形態では、分子は、他の形質、例えば、コンジュゲート分子の構造、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質と標識との間のリンカーの長さ、検出可能な標識の数などによって異なってよい。
固定化された標的の試料中での定量
一態様では、本発明は、固定化された標的を試料中で定量する方法に関する。本発明の標的の単独ユニットを可視化および検出する方法（上記）は、そのような標的の相対量を試料中で、詳細には組織学的試料中で定量的評価するために使用することができる。
固定化された標的を試料中で定量的評価するための方法、例えば、生物学的マーカーの発現を試料中で定量的評価するための方法は、一実施形態では、
ａ）試料を、
（ｉ）請求項１（上記セクションの試料中で固定化された標的の単独ユニットを可視化する方法または上記セクションの組織学的試料中で生物学的マーカーの単独標的分子を検出する方法で検討されているとおり；
（ｉｉ）請求項３６（上記セクションの試料中で幅広い動的濃度範囲で存在する固定化された標的の単独ユニットを検出する方法で検討されているとおり）；または
（ｉｉｉ）請求項４０（上記セクションの１つの試料中で少なくとも２つの異なる固定化された標的の単独ユニットを検出する方法で検討されているとおり）などの本発明の方法のいずれかに従って処理するステップと；
ｂ）識別可能なドットを試料中で定量するステップと；
ｃ）標的の量を試料中で評価するステップとを含んでよい。
処理された試料中での本発明の識別可能なドットの定量は、ドットの異なる形質を考慮して手動で、または自動で行うことができ、例えば、ドットは、眼に対して区別可能であるか、別々と考えられるので、これらはカウントすることができ、その際、カウントされるドットの数は、試料中でのマーカーの発現レベルを示し、ドットに特徴的な色を使用して、１つの試料中での２つの異なる標的に結合するドットを区別およびカウントすることなどができる。本発明の方法によって可視化された単独標的ユニットを含む試料のイメージを処理するためのソフトウェアを使用すると、異なる形質、例えば、ドット色特性、単独ドットまたは試料全体に随伴するシグナルの強度、試料内でのドットの相対分布などに基づき標的発現を評価することが可能である。
一実施形態では、カウントを手動で、即ち、試料の顕微鏡フィールドを観察している顕微鏡使用者または試料のデジタルイメージを分析する観察者が行うことができる。カウントはまた、細胞イメージを処理する分野で開発された任意の利用可能なソフトウェア、例えば、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアを使用して自動で行うこともできる。試料中のＨｅｒ２の例示的な定量を実施例に記載する。
一実施形態では、試料中の標的の量を、何ら参照を伴うことなく、例えば標的の相対量または標的の単独ユニットの相対量として、試料中で評価することができる。他の実施形態では、標的の量を、参照マーカーを考慮して、例えば、試料の特定の生物学的分子または細胞構造当たりで比較して、試料体積と比較して、試料面積と比較してなどで評価することができる。
上記のとおりの方法は、複雑な組織学的試料において標的を定量的評価するために特に有利である。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、組織化学的試料での標的の定量的評価に関する。
本発明の方法を使用すると、組織学的試料中の標的を、参照マーカーを何ら使用することなく定量することができ、例えば、特定の体組織の試料をその特定の組織の試料が本発明による同じ可視化手順を使用して処理されていると仮定すると、標的に対応するドットの数などの参照を使用することによって特徴付けることができる。一実施形態では、標的を、毎回の生物学的標的の染色および染色結果の定量当たりの試料体積、試料面積（即ち、顕微鏡フィールドの面積または試料のデジタルイメージの面積）に対して定量することができる。
診断用途
生物学的マーカー、即ち、その発現が診断的、予診的または治療的値を有するマーカーの発現の推定は、医学的診断を成すか、もしくは確認するために、または治療的処置の結果を予測するために、または疾患の展開をモニタリングするために常套的に使用されている。そのような評価が、組織学的試料としてのそのような複雑な試料の分析に基づく場合には、これは相対値を有する。それというのも、分析結果は、試料の品質、検出方法の感度、発現レベルのバリエーションなどに著しく依存しており、したがって、同じ患者の同じ組織の一連の組織学的試料における生物学的マーカーの発現の評価は、非常に異なる結果をもたらし、誤った仮定および診断を導き、結果として、有効でない療法を導くことがある。本明細書に記載の方法に従って、患者試料中での前記マーカーの単独分子の含有率を推測することに基づき、診断および治療的マーカーの発現を評価すると、より信頼可能な評価および誤りのない医学的診断を、さらに個人化標的対象療法を得ることができる。
したがって、一実施形態では、本発明の方法は、患者において疾患を診断するために使用することができ、その際、前記診断は、患者から得られた生体試料を本発明の方法のいずれかに従って処理するステップを含む。
他の実施形態では、本発明の方法は、治療的処置の効力を患者において推測するために使用することができ、その際、前記推測は、本発明の方法のいずれかに従って処理されている患者試料を分析することを含む。
他の実施形態では、本発明の方法は、医学的予診を得るために、例えば、患者において疾患が発生する危険性を予診するために、または疾患からの回復の見込みもしくは失敗を予診するために使用することができ、その際、前記予診の方法は、患者から得られた生体試料を本発明の方法のいずれかに従って処理および分析するステップを含む。
他の実施形態では、本発明の方法は、治療計画に関して患者を層別するために使用することができ、その際、前記層別は、本発明の方法のいずれかに従って処理されている患者の試料を分析することを含む。
方法はまた、疾患、例えば、疾患の進行または改善をモニタリングするために使用することができるか、または新薬のスクリーニングのプロセスにおいても、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイなどにおいて新薬の治療可能性を推測するために使用することができる。
本発明の可視化方法は、様々なアッセイフォーマットで使用することができ、典型的には、後者の用途で、例えば、フローサイトメトリー（ＦＣ）、ＥＬＩＳＡ、組織化学（ＩＨＣおよびＩＳＨの両方）、ブロッティングなどのために使用される。例えば一実施形態では、生体試料は、細胞の懸濁液であってよい。懸濁液中の細胞の標的生物学的分子または標的構造を、ＦＣ、ＥＬＩＳＡ、ＩＨＣまたはＩＳＨを使用して検出することができる。ＥＬＩＳＡ、ＩＨＣまたはＩＳＨを、検出のために使用する場合、懸濁液の細胞を、固体支持体、例えば、プレート（ＥＬＩＳＡ）またはスライド（ＩＨＣ）に付着させるべきである。他の実施形態では、生体試料は、体組織の試料、例えば、固定化およびパラフィン包埋された腫瘍試料の切片であってよい。そのような試料の細胞の標的分子または構造を典型的には、ＩＨＣまたはＩＳＨを使用して検出する。
ＩＨＣおよびＩＳＨアッセイフォーマットは通常、標的分子の可視化に先立つ一連の処理ステップを必要とし、それらは顕微鏡検査または顕微鏡写真の作成に適した固体支持体、例えば、ガラススライドまたは他の平坦な支持体にマウントされている組織切片上で、疾患状態のある種の形態学的インジケーターを選択的に染色することによって強調するか、または生物学的マーカーを検出するために行うことができる。したがって、例えば、ＩＨＣでは、試料を初めに固体から採取し、次いで、固定し、その後に初めて、これを、該当する生物学的マーカーに特異的に結合する抗体に曝露する。試料処理ステップはまた、本発明による可視化手順の前に他のステップを包含してよく、例えば、これは、組織のカッティングおよびトリミング、固定化、脱水、パラフィン浸潤、薄い切片へのカッティング、ガラススライドへのマウント、焼き付け、脱パラフィン、再水和、抗原回収、ブロッキングステップなどのステップを伴ってよく、洗浄ステップを、適切な緩衝液または溶媒、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、蒸留水を用いて行うことができる。洗浄緩衝液は場合によって、洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含有してよい。これらの手順は全て、実験室ではよく知られている常套的な手順である。
組織学的試料の２つのカテゴリー：（１）一般にはアルデヒドベースの固定剤で固定されていない新鮮な組織および／または細胞を含む標本および（２）固定および包埋組織検体の標本、多くの場合に保存材料の両方を、本発明の方法を使用して処理することができる。
組織検体を固定および包埋する多くの方法、例えば、アルコール固定およびホルマリン固定およびその後のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）が知られている。
再現可能で、生きているかのように、細胞および組織を保存するためには、固定剤が必要である。このことを達成するために、組織ブロック、切片または塗沫を、固定液に浸漬するか、または塗沫の場合には、乾燥させる。固定剤は、細胞および組織を安定化させ、それによって、それらを、処理および染色技術の硬直から保護する。
任意の適切な固定剤、例えば、エタノール、酢酸、ピクリン酸、２−プロパノール、テトラヒドロクロリド二水和物、アセトイン（モノマーおよびダイマーの混合物）、アクロレイン、クロトンアルデヒド（ｃｉｓ＋ｔｒａｎｓ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、重クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウム、四酸化オスミウム、パラホルムアルデヒド、塩化第二水銀、トリレン−２，４−ジイソシアネート、トリクロロ酢酸、タングステン酸を使用することができる。他の例には、ホルマリン（ホルムアルデヒド水溶液）および中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）、グルタルアルデヒド、アクロレイン、カルボジイミド、イミデート、ベンゾエキノン（ｂｅｎｚｏｅｑｕｉｎｏｎｅ）、オスミウム酸および四酸化オスミウムが包含される。
新鮮な生検検体、細胞標本（接触標本および血液塗沫を包含）、凍結切片および免疫組織化学的分析のための組織は、エタノール、酢酸、メタノールおよび／またはアセトンを包含する有機溶媒中に一般に固定されている。
固定組織における特異的な認識を容易にするために、多くの場合に、標的、即ち、該当する生物学的マーカーを、検体の予備処置を介して賦活化または曝露させて、大部分の標的の反応性を高めることが必要である。この手順は、「抗原賦活化」、「標的賦活化」または「エピトープ賦活化」、「標的曝露」または「抗原曝露」と称される。抗原賦活化（抗原曝露）の広範な概観は、Ｓｈｉら、１９９７、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、４５（３）：３２７に見出すことができる。
抗原賦活化には、特異的検出試薬と相互作用する標的の可能性が最大化される様々な方法が包含される。最も一般的な技術は、適切な緩衝液中でタンパク質分解酵素（例えば、プロテイナーゼ、プロナーゼ、ペプシン、パパイン、トリプシンまたはノイラミニダーゼ）を用いる酵素消化またはＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、尿素、グリシン−ＨＣｌもしくはホウ酸を通常は含有する適切にｐＨ安定化された緩衝液中でマイクロ波照射、水浴、スチーマー、通常の炉、オートクレーブもしくは圧力鍋中での加熱を使用する熱誘発エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）である。洗浄剤をＨＩＥＲ緩衝液に加えて、エピトープ賦活化を増大させることができるか、または希釈培地および／またはすすぎ緩衝液に加えて、非特異的結合を低下させることができる。
抗原賦活化緩衝液は最も多くの場合に水性であるが、水の沸点を超える沸点を有する溶媒を包含する他の溶媒を含有してもよい。このことによって、標準圧力、１００℃超での組織の処理が可能になる。
加えて、所望の場合には、試薬をインキュベートする前またはその間での真空および超音波の適用または切片の凍結および解凍を包含する種々の物理的方法によって、シグナル対ノイズ比を高めることができる。
内生ビオチン結合部位または内生酵素活性（例えば、ホスファターゼ、カタラーゼまたはペルオキシダーゼ）を、検出手順における予備検出ステップとして除去することができ、例えば、内生ビオチンおよびペルオキシダーゼ活性を、ペルオキシドで処理することによって除去することができる。内生ホスファターゼ活性は、レバミゾールでの処理によって除去することができる。内生ホスファターゼおよびエステラーゼは、加熱によって破壊することができる。当分野で知られているそのような予備処置の他の方法も、使用することができる。
本発明の方法を使用する場合には、非特異的結合部位のブロックは必要ないが、しかしながら、所望の場合には、例えば、不活性タンパク質などを用いる当分野の標準的なアプローチを使用して、ブロッキングを行うことができ、ウマ血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびオバルブミン、ウシ胎児血清もしくは他の血清またはＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｓａｐｏｎｉｎ、ＢｒｉｊもしくはＰｌｕｒｏｎｉｃなどの洗浄剤を使用することができる。特異的試薬の未標識の標的非特異的バージョンを用いて、組織または細胞中の非特異的結合部位をブロックすることもまた、使用することができる。
試料をまた、フリーフローティング技術を使用して調製し、標的分子を検出することができる。この方法では、組織切片を、適切な容器内、例えば、微量遠心管内で、懸濁液またはフリーフローティング中で種々の試薬および洗浄緩衝液と接触させる。
染色手順の間に、例えば、「フィッシングフック様」デバイス、スパチュラまたはガラスリングを使用して、組織切片を異なる試薬および緩衝液を有する管から管へと移動させることができる。異なる試薬および緩衝液はまた、穏やかなデカンテーションまたは真空吸引によって変えることができる。別法では、次の染色ステップのための管に再び移す前に、組織切片を有する容器をＣｏｒｎｉｎｇ「Ｎｅｔｗｅｌｌ」（Ｃｏｒｎｉｎｇ，）などの特殊な染色ネットにあけて、組織切片を洗浄することができる。
例えば、固定、抗原賦活化、洗浄、ブロック試薬、免疫特異的試薬と一緒のインキュベーションおよびオキシドレダクターゼ媒介デポジションを包含する全てのステップを、組織切片が自由にフローティングしているか、ネット上に留められている間に行う。リポーターのデポジションの後に、組織切片をスライド上にマウントし、リポーターを検出し、スライドをカバースリップでカバーし、その後、例えば、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡によって分析する。
一部の実施形態では、方法の手順（ａ）の後の免疫特異的試薬との厳密なインキュベーションの後に、組織切片をスライドにマウントすることができる。次いで、残りの検出プロセスを、スライドにマウントされた組織切片で行う。
本発明の方法を使用するアッセイはいずれも、１つまたは複数の自動ステップを含んでよい。一実施形態では、アッセイは、手動の検出を含んでよく、他の実施形態では、アッセイは、全て自動化されていてよく、他の実施形態では、アッセイは、半自動検出のために調節されていてよい。
以下は、開示される発明の非限定作業例である。
略記号
ＭＢＨＡ ４−メチルベンズヒドリルアミン
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリドン
ＨＡＴＵ ２−（１ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；メテナミニウム
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＦＭＳＡ トリフルオロメチルスルホン酸
Ｆｌｕ フルオレセイン
Ｄｅｘ デキストラン
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ｅｑｕｉ． 等量
Ｌ３０ １，１０，１６，２５−テトラアザ−４，７，１３，１９，２２，２８−ヘキサオキサ−１１，１５，２６，３０−テトラオキソ−トリアコンタン
Ｌ６０、Ｌ９０、Ｌ１２０、Ｌ１５０ ２、３、４または５つのＬ３０反復を含むＬ３０の異なる重合体
ＣＩＺ ２−クロロＺ＝２クロロベンジルオキシカルボニル
ＦＩＴＣ フルオレセイン（Flourescein）イソチオシアネート
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＧａＭ ヤギ抗マウス抗体
ＤＮＰ ２，４ジニトロ−フルオロベンゼン（ジニトロフェニル）
ＡＣｉｍ ４−アミノ−ケイ皮酸
ＬＰＲ パーマネントレッド液（Ｄａｋｏ Ｋ０５４０）
Ｓｉｎ シナピン酸（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシケイ皮酸）
Ｃａｆ コーヒー酸（３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）
ＰＮＡ−Ｘ 中心窒素に結合している異なる置換基を含むペプチド核酸オリゴマー（Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン）
Ａ アデニン−９酢酸、
Ｃ シトシン−１−酢酸、
Ｄ ２，６−ジアミノプリン−９酢酸、
Ｇ グアニン（guanuine）−９−酢酸、
Ｇｓ ６−チオグアニン（thuioguanine）−９−酢酸、
Ｐ ２−ピリミジノン−１酢酸、
Ｔ チミン−１−酢酸、
Ｕｓ ２−チオウラシル−１−酢酸。
Ｄｐｒ ２，３ジアミノプロピオン（propioninc）酸、
Ｐｈｅ フェニルアラニン、
Ｔｙｒ チロシン、
Ｔｒｐ トリプトファン、
Ｌｙｓ リジン、
Ｃｙｓ システイン、
ｂｅｔａａｌａ ベータアラニン、Ｎ，Ｎジ酢酸
ＦＦＰＥ ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋
ＳＭＤ 単独分子検出
架橋剤 オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第一の基質
リポーター ペルオキシダーゼ（peorxidase）活性を有する酵素の第二の基質
第二の基質分子
Figure 0005836958
Figure 0005836958
Figure 0005836958
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異なるコンジュゲートおよびそれらの中間化合物は、おおよそ複雑性の高い順序でそれらの合成方法によって表の３欄に類別されている。
１．固相化学だけ。
２．固相、次に１溶液相ステップ。
３．固相、次に２溶液相ステップ。
４．固相、次に２溶液相ステップ
５．固相、次に４溶液相ステップ。
６．アミノおよびｂｅｔａａｌａ無水物中間体間の溶液相結合。
７．１置換基のデキストランコンジュゲート。
８．２置換基のデキストランコンジュゲート。
１．この群には、４つの天然塩基およびさらに４つの非天然塩基の三フルオレセイン標識ＰＮＡ五量体から調製される８つのコンジュゲートが含まれる。（Ｄ１８００７〜Ｄ１８０１４）。５〜６個のチロシンおよび３つのフルオレセインを有する４つのチロシンコンジュゲート、Ｄ１８０４４、Ｄ１８０４９、Ｄ１８１３７、およびフルオレセイン標識の代わりに３つのＤＮＰを有するＤ１８１３８がある。Ｄ１８１２８およびＤ１８１３２は５つのチロシンおよび３つのフルオレセインを各々有し、このようにそれらは潜在的コンジュゲートであるが、それらはさらなるデキストラン結合のためにＮ末端シスチン残基も含み、それらは「中間体」の群に分類される。中間体には、重要なシステイン（Ｄ１７１２７）およびベータアラニン（alnine）（Ｄ１７１２６）三フルオレセインリンカー、ならびに７つのチロシン（Ｄ１８０８４）または３つのフルオレセイン（Ｄ１８０８５）を有するジアミノプロピオン酸リンカーがさらに含まれる。最後に、対照として用いられる小さな二フルオレセインリンカー（Ｄ１７１６１）も固相合成単独で調製した。全てのこれらの化合物の合成手法は単純である。Ｂｏｃ保護単量体は市販されているか自家調製し、コンジュゲートおよび中間体は、直線固相合成と、その後の６：２：１：１のＴＦＭＳＡ：ＴＦＡ：ｍ−クレゾール：チオアニソールの混合物による樹脂からの切断によって調製される。最良の結果のために、結果として生じる全ての単量体の二重結合が用いられる。固相の上でのＦｍｏｃ脱保護に続いて、リジン側鎖（およびＮ末端、Ｄ１７１６１）にフルオレセインが導入される。フルオレセイン標識（ＮＭＰに０．２Ｍ、３×２０分間）のために、ＨＡＴＵ活性カルボキシフルオレセイン（混合異性体）を用いた。ＤＮＰ標識化は、２，４−ジニトロ−フルオロ−ベンゼン（ＤＩＰＥＡを含むＮＭＰに０．５Ｍ、２×１０分間）で達成された。
２．この群には、遊離のＮ末端アミノ基および遊離のリジン側鎖アミノ基を運ぶ中間体の固相合成に続いて、溶液相でケイ皮酸誘導体によって標識される多数のコンジュゲートが含まれる。樹脂からの切断に続いて遊離のイプシロン−Ｎ−アミノ基を与えるリジン残基を導入するために、アルファ−Ｎ−Ｂｏｃ−（イプシロン−Ｎ−２−Ｃｌ−Ｚ）−リジンを用いた。溶液相標識は、基本的に固相法の拡張であり、相対的高分子量中間体をＴＦＡまたはＮＭＰ溶液からジエチルエーテルによってほとんど定量的に沈殿させることができることを利用する。
３．合成の観点からは、この群の中間体は、さらにより高い程度の複雑性を表す。１および２の場合のように固相合成および溶液相標識と、次に続く溶液相Ｆｍｏｃ脱保護のさらなるステップ。Ｂｏｃ−Ｌ３０リンカーをＢｏｃ−２ＣｌＺおよびＢｏｃ−Ｆｍｏｃ−リジンと組み合わせることによる、保護された（Ｆｍｏｃ）リジン側鎖ならびに遊離のＮ末端および他のリジン側鎖遊離アミノ基（樹脂切断の間のＮ末端Ｂｏｃおよび２−ＣｌＺリジン残基から）の組合せを有する中間体。これらの中間体は、２の場合のように溶液中でフェルラ酸によって標識することができる。しかし、エチレンジアミンによる洗浄ステップの前に、５％エタノールアミンによる追加の５分間のステップが用いられる。この追加の洗浄ステップは、エチレンジアミンによるＦｍｏｃ脱保護の前にアミノ反応性種を不活性化する。この追加のステップなしでは、エチレンジアミンはそれがＨＡＴＵ活性化フェルラ酸を不活性化するよりも速くＦｍｏｃ基を脱保護し、Ｆｍｏｃで「保護された」アミノ基はフェルラ酸で標識されるようになる。遊離アミノ基を有するこの群は、Ｄ１７１２０（６つのフェルラ酸）、Ｄ１７０９３（ＰＮＡ骨格に結合している５つのフェルラ酸）、Ｄ１７１３８（フェルラ酸間のＬ９０リンカー）、Ｄ１７１３９（３つの近接した対の６つのフェルラ酸）、Ｄ１７１０４（フェルラ酸間のグリシンスペーサー）、Ｄ１７１９２（フェルラ酸の代わりに６つの７−ヒドロキシクマリンを有する）、Ｄ１８０１９（最も近接したフェルラ酸と遊離アミノ基の間の伸長したＬ２７０リンカー）、Ｄ１８０８０（Ｌ９０スペーシングを有する３つの遊離アミノ基）を含む。
４．６つのフェルラ酸および３つの遊離アミノ基を有する中間体Ｄ１８０８０から、さらなる溶液相標識によって２つのコンジュゲートが調製された。３つのテキサスレッドＸを有するＤ１８０８１および３つの７−ヒドロキシクマリンを有するＤ１８０９６。コンジュゲートを２つの異なる置換基によってどのように溶液中で標識することができるかを、これは説明する。この利点は、最終標識の前に中間体Ｄ１８０８０を精製することができるということであり、テキサスレッドなどの不安定であるか高価な標識を用いるときの利点である。
５．Ｄ１７１５２の合成は、溶液中のリンカーに適用することができる固相合成化学の範囲、続く、低分子量反応物および溶媒を除去するためのジエチルエーテルによる反復沈殿を例示する。固相でＮＨ２−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−（Ｌ３０−Ｌｙｓ（ＮＨ２））４−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を調製し、樹脂から切断した。Ｂｏｃ−Ｌ３０リンカーを、次に溶液中で６つの遊離アミノ基に結合した。中間体を沈殿させ、ＴＦＡ中の５％ｍ−クレゾールに２回溶解した。次に、今はＬ３０拡張アミノ基で２の場合のようにフェルラ酸標識を実施し、その後３の場合のようにエタノールアミンおよびエチレンジアミン洗浄が、最後に１の場合のように３回のＴＦＡ沈殿が続いた。
６．アミノ置換中間体と「ｂｅｔａａｌａ無水物」活性化中間体との間で断片結合を実行した。３つのフルオレセインを有するＤ１７１２６は、Ｎ末端ベータアラニン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸をさらに運ぶ。１０分間の活性化（８８：１０：２のＮＭＰ：ジイソプロピルカルボジイミド：ピリジン）によって、アミノ基への結合のために用いることができる環式の「ｂｅｔａａｌａ無水物」が形成される。これは、Ｄ１７１２０からＤ１７１３４（Ｌ３０スペーシングを有する６つのフェルラ酸）を、Ｄ１７１３９からＤ１７１４８（Ｌ３０スペーシングを有する３つの対の６つのフェルラ酸）を、Ｄ１７１５２からＤ１７１５６（６つのＬ３０拡張フェルラ酸）を、およびＤ１７１９２からＤ１８００３（６つの７−ヒドロキシクマリンを有する）を与えた。そのような断片結合の利点は、中間体を結合の前にＨＰＬＣ精製することができ、大きく複雑であるが、全く純粋なコンジュゲートを与えることである。別の利点は、一連の関連するが異なるコンジュゲートを調製するために、Ｄ１７１２６のような単一の中間体を用いることができることである。
７．単一の置換基を有するデキストランコンジュゲートには、対照フルオレセインのみのコンジュゲートＤ１７１３２、Ｄ１８１３０およびＤ１８０８８（全てシステイン結合によるＤ１７１２７からのＤｅｘ７０コンジュゲート）、Ｄ１７１６２（Ｄ１７１２７からのｄｅｘ２７０コンジュゲート）ならびにＤ１８０８６（ジアミノプロピオン酸を経るより非効率な結合によりＤ１８０８５から）が含まれる。フルオレセインのみのコンジュゲートが作用しないことを実証するための対照として、これらは用いられた。コンジュゲートは、複数の中間体コンジュゲートをデキストランに結合することによってもこのように調製された。これらには、Ｄ１８１３３（Ｌ３０スペーシングチロシン−フルオレセインコンジュゲートＤ１８１３２を有するｄｅｘ７０）およびＤ１８１３０（チロシン−フルオレセインコンジュゲートＤ１８１２８を有するｄｅｘ７０）が含まれる。単一のコンジュゲートをＨＲＰ基質および標識の両方に結合させる利点は、２つの置換基の間の一定の比が保証されることである。
８．２つの異なる置換基を有するデキストランコンジュゲートには、全て６つのフェルラ酸リンカーＤ１８０７４および三フルオレセインリンカーＤ１７１２７（またはリンカーの複製）を有するｄｅｘ７０である、Ｄ１７１３０、Ｄ１８０７７、Ｄ１８０７９、Ｄ１８０９０、Ｄ１８１２２およびＤ２１００８が含まれる。約１００個のフェルラ酸および７０個のフルオレセインを有するＤ１７１３０、Ｄ１８０７７、Ｄ１８０７９およびＤ２１００８の間に良い再現性があったが、Ｄ１８１２２はさらなる過剰のフルオレセインリンカーに結合し、各々約１００個のフェルラ酸およびフルオレセインを有するコンジュゲートを与えた。Ｄ１７１２８はＤ１７１３０に似ているが、用いたフェルラ酸リンカー（Ｄ１７０９３）はリジン側鎖ではなくＰＮＡ骨格に結合するフェルラ酸を有する。コンジュゲートＤ１８０３１もＤ１７１２７を有するが、Ｌ２７０拡張フェルラ酸リンカーＤ１８０１９を有する。このコンジュゲートは、ＨＲＰ酵素がフェルラ酸により容易に接近できるようにする試みであった。
選択された化合物の合成手順の例
Ｄ１９１８５：Ｂｏｃ−（Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ））３−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）は、固相で調製される。Ｆｍｏｃ基を除去し、その後前記のようにフルオレセイン標識が続く。中間体ＮＨ２−（（Ｌｙｓ（ＮＨ２））３−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）は、樹脂切断から生じる。それをジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに溶解し、沈殿させ、次にＮＭＰに溶解し、ＤＩＰＥＡで塩基性にする。この溶液を、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡで活性化したＮＭＰ中の０．２Ｍフェルラ酸の等量と混合する。１０分後、標識は完了し、粗生成物はエチレンジアミンの添加によって１０％の濃度まで５分間さらに「洗浄」される。ジエチルエーテルによる沈殿の後、生成物をさらにＴＦＡに溶解し、ジエチルエーテルで３回沈殿させて低分子量破片を除去する。エチレンジアミンによる「洗浄」の前に、質量分光法は２種類の付加物（およびその組合せ）を示す：余分のフェルラ酸（他のフェルラ酸およびフルオレセイン上のフェノールエステル）を示している＋（１７６）ｎ、および＋９８（同様に保護されていないフェノール基の上のＮ，Ｎ’−テトラメチルウロニウム付加物）。これらはエチレンジアミン処理によって完全に除去され、活性エステルおよびフェルラ酸オリゴマーは同様に分解される。
Ｄ１９１８５の合成を図１に例示する。
以下のフルオレセイン−フェルラ酸コンジュゲートがこのスキームによって作製された：Ｄ１７１５７、Ｄ１７１５８、Ｄ１９１１２、Ｄ１９１８５、Ｄ１８０１５、Ｄ２００８６、Ｄ２０１１８、Ｄ２０１２０、Ｄ１９０３７およびＤ１８１５７（これらのコンジュゲートのいくつかの詳細な合成が下に記載される）。他の標識を有するフェルラ酸コンジュゲートには、以下のものが含まれる：Ｄ１９０４８（リサミン標識）；Ｄ１９０５９、Ｄ１８１４１およびＤ１９０４０（ＤＮＰ標識）。フェルラ酸の代わりにシナピン酸とのコンジュゲートは同じ方法論によって調製され、フルオレセイン標識を有する０３２８−０１８およびＤ２１０２８ならびにＤＮＰ標識Ｄ２１０４８を含む。Ｄ２１０２０は３つのコーヒー酸およびフルオレセインを有し、Ｄ１８１４６は６つの４−アミノ−ケイ皮酸および３つのフルオレセインを有し、両方ともに同じ手法によって調製される。
Ｄ１７１５８ ＭＢＨＡ樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤＤＥ）で１５０マイクロモル／ｇの負荷に下方負荷された。２００ｍｇ樹脂をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで脱Ｆｍｏｃし、次にＢｏｃ−Ｌ３０−ＯＨ（ＮＭＰ中の０．２６Ｍの１．５ｍＬ、０．９等量のＨＡＴＵ、２等量のＤＩＰＥＡで２分間前活性化）と２０分間結合させた。ｉｖＤＤＥ基をＮＭＰ中の５％ヒドラジンで除去し、リジン側鎖をカルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）（ＮＭＰ中の０．２Ｍの１．５ｍＬ、０．９等量のＨＡＴＵ、２等量のＤＩＰＥＡで２分間前活性化）で２×２０分間標識した。樹脂を、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン、ＮＭＰ、ＤＣＭ、次にＤＣＭで処理した。中間体生成物Ｈ−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−ＮＨ２をＴＦＡ：ＴＦＭＳＡ：ｍクレゾール（７：２：１、１．５ｍｌで１時間）で樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＮＭＰに再懸濁させ、ジエチルエーテルで再び沈殿させた。１００μＬのＤＩＰＥＡでそれを塩基性にし、０．９等量のＨＡＴＵおよび２等量のＤＩＰＥＡで前活性化した０．５ｍＬの０．３Ｍフェルラ酸に直接的に溶解した。２５分後、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、４５０μＬのＮＭＰおよび５０μＬのエチレンジアミンに溶解した。５分後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、１５％アセトニトリル水溶液（８ｍＬ）に溶解し、１００μＬのＴＦＡで酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製にかけた。
Ｄ１７１５７ ＭＢＨＡ樹脂は、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）で１００マイクロモル／ｇの負荷に下方負荷された。１００ｍｇの樹脂を、Ｂｏｃ−Ｌ３０−ＯＨによる５結合サイクルにかけた（ａ．１の場合のようにＢｏｃ−Ｌ３０−ＯＨとの結合。ｂ．１：１のＮＭＰ：ピリジン中の２％酢酸無水物による２分間のキャッピング。ｃ．ＴＦＡ中の５％ｍクレゾールによる２×５分間の脱Ｂｃ）。１の場合のように、リジン側鎖を脱Ｆｍｏｃし、カルボキシフルオレセインで標識した。中間体生成物Ｈ−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−ＮＨ２を樹脂から切断し、フェルラ酸でＮ末端標識し、１．１の場合のように精製した。
Ｄ１６１２７ 標準の固相化学でＢｏｃ−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を０．５ｇのＭＢＨＡ樹脂の上で調製した（１．１および１．２のように）。ＮＭＰ中の２０％ピペリジンでＦｍｏｃ基をリジン側鎖から除去し、化合物を反復カルボキシフルオレセイン標識にかけた（３×３０分間）。ＴＦＡによるＢｏｃ基の除去後、固相上でＮ末端をベータアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ｂｅｔａａｌａ）ｔｅｒｔ−ブチルエステルで標識した。樹脂からの切断およびＨＰＬＣ精製の後、ｂｅｔａａｌａ−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−ＮＨ２を単離した。
Ｄ１７１２７ １．３に記載される手法を用いてＢｏｃ−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）樹脂を調製し、フルオレセインで標識した。Ｂｏｃ基の除去後、Ｎ末端をＮ−Ｂｏｃ−Ｓ（４−メトキシベンジル）−Ｃｙｓ−ＯＨで標識した。化合物はカラムから切断し、ＨＰＬＣによって精製した。
Ｄ１８０７４／Ｄ１７１２８ ＭＢＨＡ樹脂にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）（２サイクル）、Ｂｏｃ−Ｌ３０−ＯＨ（５サイクル）およびＢｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−ＯＨを順番に結合した。２ＣｌＺ基を除去するために、１０％チオアニソールスカベンジャーの存在下で中間生成物を樹脂から切断した。１．１の場合のように、Ｎ末端および５つの脱保護されたリジン側鎖をフェルラ酸で標識した（２×３０分間）。次に、精製の前に、Ｃ末端リジン残基のＮの上のＦｍｏｃ基を、ＮＭＰ中の１０％エチレンジアミンで除去した。
Ｄ１７１３４ ｂｅｔａａｌａ−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−ＮＨ２（Ｄ１６１２６）（上の１．４を参照）５００ｎｍｏｌを８８μＬのＮＭＰおよび２μＬのピリジンに溶解し、１０分間の１０μＬのジイソプロピルカルボジイミドとの反応によって環状無水物に変換した。無水物をジエチルエーテルで沈殿させ、２５０ｎｍｏｌのＦｅｒ−（Ｆｅｒ−Ｌ３０）５−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ＮＨ２を含む１００μＬのＮＭＰにペレットを溶解した。２０分後、５μＬのエチレンジアミンを加え、５分後に生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、酸性化し、ＨＰＬＣで精製した。
Ｄ１８０４４ Ａｃ−（Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｌ３０）６−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を、ＭＢＨＡ樹脂の上で調製した。固相の上で、Ｆｍｏｃ基を除去し、リジン側鎖をカルボキシフルオレセインで標識した。樹脂からの切断の後、生成物をＨＰＬＣで精製した。
Ｄ１７１４０ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ６０−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ６０−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を、ＭＢＨＡ樹脂の上で調製した。樹脂からの切断の後、中間体生成物Ｈ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ６０−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ６０−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を沈殿によって単離し、１．１の場合のようにフェルラ酸で標識した。最終生成物をＨＰＬＣによって単離した。
Ｄ１８０９０ ジビニルスルホン１０ｎｍｏｌで活性化したデキストランＭＷ７０ｋＤａを、Ｆｅｒ−（Ｆｅｒ−Ｌ３０）５−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ＮＨ２（Ｄ１８０７４）と反応させた（上の１．４を参照）。５００ｎｍｏｌ、総量３００μＬの０．１６ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．５、４０℃で３０分間。わずかな沈殿が観察された後、さらなる１００μＬの水を加え、反応をさらに３０分間進行させた。さらなる２００μＬの０．１５Ｍ ＮａＨＣＯ３を、５００ｎｍｏｌのＨ−Ｃｙｓ−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−ＮＨ２（Ｄ１７１２７）と一緒に加えた（上の１．５を参照）。４０℃で１時間の後、３０分間の５０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって反応混合液を抑え、溶液を濾過し、生成物は、１０ｍＭのＣＨＥＳを含む２０％ＥｔＯＨ水溶液ｐＨ９．０および０．１ＭのＮａＣｌによってｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の上でＦＰＬＣによって精製した。溶出した生成物は、約５６個のフルオレセインおよび１１３個のフェルラ酸残基を含むデキストランコンジュゲートであった。
Ｄ１９１１２ 固相ＭＢＨＡ樹脂の上で、標準の固相Ｂｏｃ化学を用いてＢｏｃ−Ｌｙｓ（２Ｃｌｚ）−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を調製した。ＮＭＰ中の２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去し（２×５分間）、遊離アミノ基をカルボキシフルオレセインで標識した（０．９等量のＨＡＴＵおよび１等量のＮＭＰ中のＤＩＰＥＡによって２０分間で３回活性化した０．２Ｍカルボキシフルオレセイン）。樹脂を、２×５分間、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンで次に処理した。樹脂からの切断は、ＴＦＡ：ＴＦＭＳＡ：ｍ−クレゾール：チオアニソール（６：２：１：１）混合液で１時間実施し、中間体生成物Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）を生じた。この生成物をＴＦＡに溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＮＭＰに次に溶解し、ジエチルエーテルで再び沈殿させた。次に、０．９等量のＨＡＴＵおよび２等量のジイソプロピルエチルアミンで活性化した０．３Ｍフェルラ酸に沈殿物を溶解した。１０分間の反応の後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、ＮＭＰ中の１０％エチレンジアミンに次に２分間溶解した。最終生成物をジエチルエーテルで次に沈殿させ、３０％アセトニトリル水溶液に溶解し、Ｃ１８カラムの上でＨＰＬＣにより精製した。
Ｄ１９１８５、Ｄ２００６８およびＤ２０１７１は、さらなるＬｙｓ（Ｆｅｒ）基の導入により、Ｄ１９１１２と同じ方法で調製した。
Ｄ２１０２０ Ｃａｆ−Ｌｙｓ（Ｃａｆ）−Ｌｙｓ（Ｃａｆ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）を、Ｄ１９１８５のように調製した。固相合成の後、コーヒー酸標識を溶液で実施した。
０３２８−０１８ Ｓｉｎ−Ｌｙｓ（Ｓｉｎ）−Ｌｙｓ（Ｓｉｎ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）を、Ｄ１９１８５のように調製した。固相合成の後、シナピン酸標識を溶液で実施した。
Ｄ２０１１８は、Ｌ６０リンカーを用いてＤ１９１１２と同じ方法で調製された。
Ｄ２００８６は、Ｌ３０リンカーを用いてＤ１９１１２と同じ方法で調製された。
Ｄ２０１２０は、Ｌ３０リンカーを用い、さらにグルタミン酸残基を用いてＤ１９１１２と同じ方法で調製された。グルタミン酸残基を組み込むために、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ベンジル）を固相合成のために用いた。
Ｄ１９０４８ ０．５ｇのＭＢＨＡ樹脂の上で、Ｂｏｃ−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を調製した。Ｆｍｏｃ基を除去し、８０μＬのＤＩＰＥＡを添加した２ｍＬのＮＭＰ中の１００ｍｇを用いて、リジン側鎖アミノ基をリサミン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ製品番号Ｌ２０、ローダミンＢスルホニルクロリド）により１０分間で３回標識した。Ｂｏｃ基を次にＴＦＡで除去し、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）をＮ末端に結合した。中間体生成物Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（リサミン）を、ＴＦＡ：ＴＦＭＳＡ：ｍ−クレゾール：チオアニソール（６：２：１：１）で樹脂から切断し、Ｄ１９１１２について記載されているようにフェルラ酸で標識して、Ｆｅｒ−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（リサミン）を与えた。生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、リサミンの異なる異性体を表す２つの別々のピークに分けた。第一の異性体は塩基性水溶液でほとんど無色となり、放棄された。第二の異性体は塩基性水溶液で色および蛍光を保持し、収集された。
Ｄ１９０５９はＤ１９１１２と同じ方法で調製されたが、５０μＬのＤＩＰＥＡを添加した１．５ｍＬのＮＭＰ中の１００ｍｇの２，４−ジニトロフルオロベンゼンを用いて、ジニトロフェニルによって固相の上でＣ末端リジン側鎖アミノ基で２０分間で２回標識した。
Ｄ１８１２６：Ｆｅｒ−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ３０−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ１２０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）−Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）＝Ｆｅｒ−（Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ３０）５−（Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ））３。この拡張コンジュゲートは、Ｄ１９１１２と同じ経路によって調製された。Ｂｏｃ−（Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ３０）５−（Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ））３は、固相の上で調製された。Ｄ１９１１２の場合のように３つのＦｍｏｃ基をＮＭＰ中のピペリジンで除去し、３つのカルボキシフルオレセインを導入した。中間体生成物ＮＨ２−（Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ３０）５−（Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ））３を樹脂から切断し、Ｎ末端および５つの遊離リジン側鎖でフェルラ酸によって標識し、ＮＭＰ中の１０％エチレンジアミンで洗浄し、ＴＦＡから沈殿させ、ＨＰＬＣで精製した。
Ｄ１８１４６ ＡＣｉｍ−（Ｌｙｓ（ＡＣｉｍ）Ｌ３０）５−（Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ））３は、Ｄ１８１２６と同じリジン−リンカー骨格の上で調製された。固相からの切断の後、中間体のフルオレセイン標識リンカーをＮＭＰに溶解し、ＤＩＰＥＡで塩基性にした。ＮＭＰ中の０．１Ｍの４−アミノ−ケイ皮酸を０．９等量のＨＡＴＵおよび３等量のＤＩＰＥＡで３０秒間活性化し、リンカーに加えた。１０％の最終濃度までのエチレンジアミンの添加によって、２分後に反応を抑えた。沈殿の後、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
Ｄ１８０７４ Ｆｅｒ（Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ３０）５−Ｌｙｓ（ＮＨ２）。６つのフェルラ酸および遊離リジン側鎖アミノ基を有するこの中間体リンカーは、Ｃ末端Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いる固相化学と、続くＢｏｃ−Ｌ３０リンカーおよびＢｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）との交互結合によって調製された。樹脂からの切断に続いて、Ｄ１９１１２について記載されている通りに、中間体生成物ＮＨ２（Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｌ３０）５−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を溶液中でフェルラ酸によって標識した。１０％エチレンジアミンによる最終処理では、Ｆｍｏｃ基も除去された。このホモフェルラ酸オリゴマーは、デキストランコンジュゲートＤ２１００８の調製で用いられた。
Ｄ１８１１８ ＮＨ２−Ｃｙｓ−（Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｌｕ））。この中間体三フルオレセインリンカーは、リジンを導入するためにＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を用いて固相の上で直接的に調製され、リジンはＦｍｏｃの除去の後にカルボキシフルオレセインで標識された。Ｂｏｃ（Ｓ−ｐ−メトキシベンジル）システインを用いて、Ｎ末端システインを導入した。
Ｄ１８０４４ 固相の上で、Ｆｅｒ−（Ｔｙｒ−Ｌ３０）５−（Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ））３をＤ１８１２６のように調製した。チロシンを導入するために、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｏ−２ＢｒＺチロシンを用いた。樹脂からの切断の後、生成物をＨＰＬＣで精製した。
Ｄ２１００８ Ｄ１８０７４およびＤ１８１１８とのＤｅｘ７０コンジュゲート。１４０μＬの水の中の１０ｎｍｏｌのビニルスルホン活性化７０ｋＤａデキストランを、さらなる２００μＬの水および６０μＬの０．８Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．５と混合した。５００ｎｍｏｌの凍結乾燥Ｄ１８０７４を溶解するために、この混合液を用いた。反応混合液を４０℃で６０分間維持し、次に２５０μＬの水に溶解したさらなる５００ｎｍｏｌのＤ１８１１８を、さらなる５０μＬの０．８Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．５と一緒に反応混合液に加えた。４０℃でのさらなる６０分間の反応の後、０．８Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．５中の０．１６５ｍＭシステインの７０μＬの添加によって反応を停止した。１０ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、２０％エタノール水溶液中の１００ｍＭ ＮａＣｌを溶出剤として用いて、コンジュゲートをｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の上で精製した。これは、コンジュゲートを含む第一のピーク、続いてコンジュゲートしていないリンカーをもたらした。８１％のフルオレセインおよびフェルラ酸の全回収率に基づき、およびデキストランコンジュゲートの同じ回収率（８１％）を仮定して、１デキストランにつき１１１個のフェルラ酸および８３個のフルオレセインの比が計算され、（Ｄ１８０７４）１８．５−Ｄｅｘ７０−（Ｄ１８１１８）２７．７に対応する。
Ｄ１９０５９ ０．１ｇのＭＢＨＡ樹脂の上で、標準の固相化学により、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を調製した。Ｆｍｏｃ保護リジン側鎖をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで脱保護し（２×５分間）、１．５ｍｌのＮＭＰおよび５０μＬのＤＩＰＥＡに溶解した１５０ｍｇの２−４−ジニトロフルオロベンゼンによって２×２０分間標識した。樹脂を、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン、ＮＭＰおよびＤＣＭで処理した。
中間体生成物をＴＦＡ：ＴＦＭＳＡ：チオアニソール：ｍクレゾール（６：２：１：１、１．５ｍＬで１時間）で樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＮＭＰに再懸濁させ、ジエチルエーテルで再び沈殿させた。１００μＬのＤＩＰＥＡでそれを塩基性にし、０．９等量のＨＡＴＵおよび２等量のＤＩＰＥＡで前活性化した０．５ｍＬの０．３Ｍフェルラ酸に直接的に溶解した。１０分後、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、９００μＬのＮＭＰおよび１００μＬのエチレンジアミンに再溶解した。２分後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁し、ジエチルエーテルで沈殿させ、２２％アセトニトリル水溶液（８．２ｍＬ）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
収量８μｍｏｌ、ＭＳ観察値３５８２（Ｍ＋Ｎａ）、Ｆｅｒ−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（ＤＮＰ）の計算値３５５８．７８４。
Ｄ１９１１２ １ｇのＭＢＨＡ樹脂の上で、標準の固相化学により、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）を調製した。Ｆｍｏｃ保護リジン側鎖をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで脱保護し（２×５分間）、反復カルボキシフルオレセイン標識（ＮＭＰ中の０．２Ｍの３ｍＬ、０．９等量ＨＡＴＵ、１等量ＤＩＰＥＡで２分間前活性化した）を３×２０分間受けさせた。樹脂をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで処理し、次にＮＭＰ、ＤＣＭおよびＴＦＡで洗浄した。中間体生成物をＴＦＡ：ＴＦＭＳＡ：チオアニソール：ｍクレゾール（６：２：１：１、３ｍＬで１時間）で樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＮＭＰに再懸濁させ、ジエチルエーテルで再び沈殿させた。２００μＬのＤＩＰＥＡでそれを塩基性にし、０．９等量のＨＡＴＵおよび２等量のＤＩＰＥＡで前活性化した２ｍＬの０．３Ｍフェルラ酸に直接的に溶解した。１０分後、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、１３５０μＬのＮＭＰに再溶解し、１５０μＬのエチレンジアミンを加えた。２分後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁し、ジエチルエーテルで沈殿させ、２５％アセトニトリル水溶液（２４ｍＬ）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
収量１９μｍｏｌ、ＭＳ観察値３７４９、Ｆｅｒ−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌｙｓ（Ｆｅｒ）−Ｌ１５０−Ｌｙｓ（Ｆｌｕ）の計算値３７５０．９９８。
Ｄ１９１８５ Ｄ１９１８５は、固相合成と、その後の溶液中でのフェルラ酸による標識によって、Ｄ１９１１２に類似して調製された。ＭＳ観察値４０５４。
Ｄ１９０３７ Ｄ１９０３７は、固相合成と、その後の溶液中でのフェルラ酸による標識によって、Ｄ１９１１２に類似して調製された。ＭＳ観察値３４４７。
Ｄ１８１２６ ＭＢＨＡ樹脂の上で、標準固相化学によって、Ｂｏｃ−（Ｌｙｓ（２ＣｌＺ）−Ｌ３０）５Ｌ９０−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌ９０Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ））を調製した。Ｆｍｏｃ保護リジン側鎖をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで脱保護し（２×５分間）、反復カルボキシフルオレセイン標識（ＮＭＰ中の０．２Ｍの３ｍＬ、０．９等量ＨＡＴＵ、１等量ＤＩＰＥＡで２分間前活性化した）を３×２０分間受けさせた。樹脂をＮＭＰ中の２０％ピペリジンで処理し、次にＮＭＰ、ＤＣＭおよびＴＦＡで洗浄した。中間体生成物をＴＦＡ：ＴＦＭＳＡ：チオアニソール：ｍクレゾール（６：２：１：１、３ｍＬで１時間）で樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、ＮＭＰに再懸濁させ、ジエチルエーテルで再び沈殿させた。２００μＬのＤＩＰＥＡでそれを塩基性にし、０．９等量のＨＡＴＵおよび２等量のＤＩＰＥＡで前活性化した２ｍＬの０．３Ｍフェルラ酸に直接的に溶解した。１０分後、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、１３５０μＬのＮＭＰに再溶解し、１５０μＬのエチレンジアミンを加えた。２分後、生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、ＴＦＡに再懸濁し、ジエチルエーテルで沈殿させ、２５％アセトニトリル水溶液（２４ｍＬ）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
収量２μｍｏｌ、ＭＳ観察値１０６６６。
結合（biding）剤
ヤギ抗マウス−Ｄｅｘ７０−ＨＲＰ（Ｄ１８０３３／Ｄ１８１７５）
１３．７ｎｍｏｌのジビニルスルホン活性化７０ｋＤＡ ＭＷデキストランを、３０℃で３時間、６００μＬ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中の６０２ｎｍｏｌのＨＲＰと反応させた。次に、１０５μＬの水の中の４１．１ｎｍｏｌのヤギ−抗マウスＦ（ａｂ）２抗体を加え、反応をさらなる１６時間連続させた。反応混合液を３０分間の７０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２中で生成物をｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の上で精製した。溶出した（eluded）生成物は、ヤギ抗マウス（ＧａＭ）およびＨＲＰを含むデキストランコンジュゲートであった（８ＨＲＰおよび１，３抗体ｐｒコンジュゲート；比ｄｅｘ／ＧａＭ／ＨＲＰ＝１／１．１／７．５）。
抗ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ７０−ＨＲＰ（Ｄ１８０５８／Ｄ１８１４４）
１０ｎｍｏｌのジビニルスルホン活性化７０ｋＤＡ ＭＷデキストランおよび４４０ｎｍｏｌのＨＲＰを、３０℃で３時間、４００μＬ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中で反応させた。次に、８０μＬの水の中の３０ｎｍｏｌの抗マウスＦ（ａｂ）２抗体を加え、反応を４０℃でさらなる９０時間連続させた。反応混合液を３０分間の５０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２中で生成物をｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の上で精製した。溶出した生成物は、抗ＦＩＴＣおよびＨＲＰを有するデキストランのコンジュゲートであった（１コンジュゲートにつき９ＨＲＰおよび１．５．抗体；Ｄｅｘ／抗ＦＩＴＣ／ＨＲＰ比＝１／２／９）。
ウサギ抗ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）１−ＨＲＰコンジュゲート（Ｄ１９１４２／Ｄ１９１５４）
ポリクローナルのウサギ抗ＦＩＴＣ ＩｇＧ抗体をペプシンによって３７℃で４時間消化し、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の上で精製してペプシンおよびＦｃ断片を除去した。
Ｆ（ａｂ’）２断片を、０．２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０中の５ｍＭ ＥＤＴＡでさらに透析した。２５ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで、溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａスピンカラムで濃縮した。６．０ｍＬの前記溶液（１５０ｍｇのＦ（ａｂ’）２）に、４８７μＬの５０ｍｇ／ｍＬ ＤＴＴ水溶液および４２３μＬの５６ｍＭ ２−メルカプトエタノール水溶液を加えた。反応混合液を室温で４０分間静かに撹拌し、直後に０．２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０中の５ｍＭ ＥＤＴＡによってＰＤ−１０カラムの上で精製した。８．０ｍＬの緩衝液で１１８ｍｇのＦ（ａｂ’）１が回収された。
ＨＲＰ（Ｓｅｒｖａｃ）２５０ｍｇを２．５ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍのリン酸カリウムｐＨ８に溶解し、同じ緩衝液で透析した。透析の後、酵素溶液を４０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮、調整した。３．２１ｍＬ、１２８．６ｍｇのＨＲＰ溶液に８６０μＬの１５ｍｇ／ｍＬ ＳＭＣＣを加え、室温の暗所で３０分間反応を進行させた。ＳＭＣＣ活性化ＨＲＰ酵素は、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５Ｍのリン酸カリウムｐＨ８によってＰＤ−１０カラムの上で精製された。７．９ｍＬで１２６．９ｍｇが回収された。
８．０ｍＬのＦ（ａｂ’）１に、ＳＭＣＣ活性化ＨＲＰ溶液の６．２５ｍＬを加え、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍリン酸カリウムｐＨ８で全容量を４３．８ｍＬに調整した。抗体断片と酵素との間の反応は、室温の暗所で２１０分間実施した。次に、室温で１５分間の３４３μＬの２５ｍｇ／ｍＬシステアミン水溶液の添加によって反応を抑え、反応混合液は精製までの間、一晩冷温保存した。試料を８ｍＬまで濃縮し、４つの部分に分けてｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに加え、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７．６で溶出した。生成物は第一のピークに溶出し、未反応の抗体および酵素のピークが続いた。１００ｍｇのコンジュゲートがいくつかの分画で単離された。２８０ｎｍ／４０３ｎｍでのＵＶ測定は、０．８から１．２の間の抗体酵素分配比を示した。
ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）１−ＨＲＰ（Ｄ１９１５０／Ｄ１９１４７）
ＤＴＴおよびメルカプトエタノールによるＦ（ａｂ’）２の還元およびＳＭＣＣ活性化ＨＲＰへの結合によって、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）１−ＨＲＰをウサギ抗ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）１−ＨＲＰのように調製した。ウサギ抗ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）１−ＨＲＰと同様に、１２等量のＳＭＣＣをＨＲＰ活性化のために用い、Ｆ（ａｂ’）１とＨＲＰとの間の１：１のモル分配比を用いた。
ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）１−ＨＲＰ（ＡＭＭ ２７９．１６８）
ＤＴＴおよびメルカプトエタノールによるＦ（ａｂ’）２の還元およびＳＭＣＣ活性化ＨＲＰへの結合によって、ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）１−ＨＲＰをウサギ抗ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）１−ＨＲＰのように調製した。ウサギ抗ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）１−ＨＲＰと同様に、１２等量のＳＭＣＣをＨＲＰ活性化のために用い、Ｆ（ａｂ’）１とＨＲＰとの間の１：１のモル分配比を用いた。
結合剤ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）１−ＨＲＰコンジュゲート（Ｄ１９１５０）
これは、Ｄ１９１４２と同じ手法によって調製された（ＦＩＴＣの代わりにＧａＭで）。
結合剤ウサギ抗ＤＮＰ Ｆ（ａｂ’）１−ＨＲＰコンジュゲート（Ｄ１９０５３）
この結合剤は、ポリクローナルウサギ抗ＤＮＰ抗体を用いてＤ１９１４２と同じ手法によって調製された。
結合剤ウサギ抗ＦＩＴＣ Ｆ（ａｂ’）１−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Ｄ２００３６）
Ｄ１９１４２について記載されている通りに、ウサギ抗ＦＩＴＣをペプシンで消化し、Ｆ（ａｂ）１に還元した。４．２３ｍＬ緩衝液中の４４．９ｍｇの断片化抗体を、コンジュゲーションのために用いた。２．８ｍＬ緩衝液（２５ｍＭホウ酸塩、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ８．２）中のアルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ＭＷ１４０．０００）５６ｍｇを、１０７μＬのＤＭＳＯに溶解させた１．６ｍｇのＳＭＣＣ（酵素に対して１２等量）と室温の暗所で２５分間反応させた。０．１Ｍトリス、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ８．２の緩衝液を用いて、この活性化酵素系溶液をゲル濾過した。５５．３ｍｇの酵素が７ｍＬの容量で単離された。断片化抗体および活性化酵素を直ちに混合し、さらなる２．４７ｍＬの０．１Ｍトリス、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ８．２を加えた。混合液を室温で１５０分間反応させ、次に１１．２ｍｇのシステアミンの１５分間の添加によって抑えた。０．１Ｍトリス、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの上で生成物は精製され、単一の幅広いピークとして溶出した。リポーターＤ１９１８５をデポジットさせるためにＤ１９１５０を用い、続いて異なる分画、および最後にパーマネントレッド液を色素原として用い、ＩＨＣアッセイで個々の分画をＡＰ活性およびＦＩＴＣ結合について試験した。分画を含む全ての主要な生成物は同等の性能を発揮するので、プールした。
ＨＲＰとコンジュゲートしたＤｅｘ７０とコンジュゲートした結合剤ヤギ抗マウス抗体（Ｄ２００５２）
１１ｎｍｏｌの７０ｋＤＡ ＭＷデキストランを、３０℃で３時間、３１６μＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中の４８４ｎｍｏｌのＨＲＰと反応させた。その後、１６９μＬの水の中の６６ｎｍｏｌのヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２をデキストラン−ＨＲＰコンジュゲートに加え、１時間反応させた。反応混合液を３０分間の７０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２）中で生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ３００（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ）の上で精製した。溶出した生成物は、ヤギ抗マウス（ＧａＭ）およびＨＲＰを含むデキストランコンジュゲートであった。高分子量最適化精製と組み合わせた比較的短いコンジュゲーション時間の使用は、コンジュゲートサイズに基づき１５の分画に最終コンジュゲート生成物を分離することを可能にした。個々の生成物分画、ならびにコンジュゲートしていない抗体およびＨＲＰを含有する分画の測定は、８１％のコンジュゲート回収を示し、８．９１ｎｍｏｌのデキストランに対応した。総合すると、コンジュゲート分画（溶出液の分画７から２２まで）は、平均で８．１個のＨＲＰ／デキストランおよび０．８８個の抗体／デキストランに対応する７２．３ｎｍｏｌのＨＲＰおよび７．９ｎｍｏｌの抗体を含有していた。分画７〜８は最初のピークを生成し、続いて次第に消えていった（分画１８〜２２）幅広いピーク（分画９〜１７）が続いた。
ＨＲＰとコンジュゲートしたＤｅｘ７０とコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（Ｄ２０１６８）
このコンジュゲートは、Ｄ２００５２と正確に同じ方法で生成された。均一な数のＨＲＰを有する生成物を得るために、分画９および１０だけを収集して一緒にプールした。
ＨＲＰとコンジュゲートしたＤｅｘ１５０とコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（Ｄ２００６０）
この結合剤はＤ２００５２のように調製されたが、より大きな分子量（１５０ｋＤａ）のデキストランが用いられた。精製の間、大多数のコンジュゲートが最初の４分画で単一のピークで溶出した。計算は、平均でデキストラン１分子につき１６．５個のＨＲＰおよび１．８個の抗体を示した。
ＨＲＰとコンジュゲートしたＤｅｘ１５０とコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（Ｌ３４８．１２１）
５．１３ｎｍｏｌの１５０ｋＤＡ ＭＷデキストランを、４０℃で３時間、３００μＬの緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中の４８４ｎｍｏｌのＨＲＰと反応させた。その後、１６９μＬの水の中の６６ｎｍｏｌのヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２をデキストラン−ＨＲＰコンジュゲートに加え、４０℃でさらなる１時間反応させた。反応混合液を３０分間の７０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２）中で生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ３００（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ）の上で精製した。溶出した生成物は、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２およびＨＲＰを含むデキストランコンジュゲートであった。生成物はコンジュゲートサイズに基づき３つの分画に分けられた：最大のコンジュゲートを含有する第一の分画（８〜１１）、より小さなコンジュゲートを含む次第に消える分画、およびコンジュゲートしていないタンパク質。個々の生成物分画、ならびにコンジュゲートしていない抗体およびＨＲＰを含有する分画の測定は、８７％の総コンジュゲート回収を示した。組み込まれたＨＲＰとデキストランとの間の直接比例関係の仮定は、分画８〜１１が１デキストランにつき２０．６個のＨＲＰおよび２．３２個の抗体を含有し、分画１０〜１１が１デキストランにつき１０．９個のＨＲＰおよび０．９６個の抗体を含有することを示した。分画８〜１１だけを実験のために用いた。より大きなデキストランコンジュゲートの使用がどのようにより多くのＨＲＰの組込みを可能にするかを、このコンジュゲートは例証する。
ＨＲＰとコンジュゲートしたＤｅｘ７０とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体（Ｌ３４８．１１１、分画１０〜１１）
１１ｎｍｏｌの７０ｋＤＡ ＭＷデキストランを、４０℃で３時間、３１６μＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中の４８４ｎｍｏｌのＨＲＰと反応させた。その後、１９６μＬの水の中の４４ｎｍｏｌのヤギ抗ウサギをデキストラン−ＨＲＰコンジュゲートに加え、４０℃でさらなる１時間反応させた。反応混合液を３０分間の７０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２）中で生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ３００（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ）の上で精製した。溶出した生成物は、ヤギ抗ウサギ（ＧａＲ）およびＨＲＰを含むデキストランコンジュゲートであった。生成物は、コンジュゲートサイズに基づき４分画に分けた：おそらくいくつかの架橋コンジュゲートを含有する、生成物を含有する最初の２つの分画（分画８〜９）が第一のピークとして溶出し、次に分画１０〜１１（均一で大きなコンジュゲート）および分画１２〜２１（より小さな変動コンジュゲート）に分けられた幅広い肩部分、ならびに最後に分画２２〜４２のコンジュゲートしていない酵素および抗体が続いた。個々の生成物分画、ならびにコンジュゲートしていない抗体およびＨＲＰを含有する分画の測定は、８７％の総コンジュゲート回収を示した。組み込まれたＨＲＰとデキストランとの間の直接比例関係の仮定は、分画１０〜１１が１デキストランにつき１０．９個のＨＲＰおよび０．９６個の抗体を含有することを示した。これらの２分画だけを実験のために用いた。
ＨＲＰとコンジュゲートしたＤｅｘ７０とコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体（Ｄ２１１００、分画９〜１０）
４．６ｎｍｏｌの７０ｋＤＡ ＭＷデキストランを、３０℃で３時間、１２５μＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中の２０２ｎｍｏｌのＨＲＰと反応させた。その後、４８９μＬの水の中の１８ｎｍｏｌの抗Ｈｅｒ２をデキストラン−ＨＲＰコンジュゲートに加え、３０℃でさらなる２１時間反応させた。反応混合液を３０分間の７０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２）中で生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ３００（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ）の上で精製した。溶出した生成物は、抗Ｈｅｒ２およびＨＲＰを含むデキストランコンジュゲートであった。コンジュゲートサイズに基づき４分画に生成物を分けた：おそらくいくつかの架橋コンジュゲートを含有する、生成物を含有する最初の２つの分画（分画７〜８）が第一のピークとして溶出し、次に分画９〜１０（均一で大きなコンジュゲート）および分画１１〜１９（より小さな変動コンジュゲート）に分けられた幅広い肩部分、ならびに最後に分画２０〜４１のコンジュゲートしていない酵素および抗体が続いた。個々の生成物分画、ならびにコンジュゲートしていない抗体およびＨＲＰを含有する分画の測定は、６８％の総コンジュゲート回収を示した。組み込まれたＨＲＰとデキストランとの間の直接比例関係の仮定は、分画９〜１０が１デキストランにつき９．１個のＨＲＰおよび０．６個の抗体を含有することを示した。これらの２分画だけを実験のために用いた。
ＨＲＰとコンジュゲートしているＤｅｘ７０とコンジュゲートしている抗ＦＩＴＣ抗体（ＡＭＭ３５３−０２２分画８〜１１）
１１ｎｍｏｌの７０ｋＤＡ ＭＷデキストランを、４０℃で３時間、３１６μＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中の４８４ｎｍｏｌのＨＲＰと反応させた。その後、１９６μＬの水の中の６６ｎｍｏｌの抗ＦＩＴＣをデキストラン−ＨＲＰコンジュゲートに加え、４０℃でさらなる１時間反応させた。反応混合液を３０分間の７０μＬの０．１６５Ｍシステインの添加によって抑え、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２）中で生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ３００（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ）の上で精製した。溶出した生成物は、抗ＦＩＴＣおよびＨＲＰを含むデキストランコンジュゲートであった。コンジュゲートサイズに基づき、３分画に生成物を分けた：生成物を含有する最初の分画（８〜１１）は第一のピークとして溶出し、次に幅広い肩部分（より小さい変動コンジュゲート、分画１２〜２７）、ならびに最後に分画２８〜４５のコンジュゲートしていない酵素および抗体が続いた。個々の生成物分画、ならびにコンジュゲートしていない抗体およびＨＲＰを含有する分画の測定は、９０％の総コンジュゲート回収を示した。組み込まれたＨＲＰとデキストランとの間の直接比例関係の仮定は、分画１０〜１１が１デキストランにつき１１．７個のＨＲＰおよび０．８０個の抗体を含有することを示した。これらの２分画だけを実験のために用いた。
他の試薬
抗サイトケラチンモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ Ｍ３５１５）
インキュベーション培地（ａ）（ＡＢＣＰＴ緩衝液）：０．１％の４−アミノアンチプリン、０．２％Ｐｒｏｃｌｉｎｅ、２％ＢＳＡ、０．２％カゼイン、２％ＰＥＧ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２。
インキュベーション培地（ｂ）：５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、０．００５％（１．５ｍＭ）過酸化水素、
ＤＡＢ色素原溶液（Ｄａｋｏ Ｋ３４６５）
ＬＰＲ色素原溶液（Ｄａｋｏ Ｋ０６４０）
ヘマトキシリン対比染色（Ｄａｋｏ Ｓ３３０１）
洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ Ｓ３３０６）
標的賦活化溶液（Ｄａｋｏ Ｓ１６９９）
インキュベーション培地中のリポーター、ＤＡＢおよびＨ２Ｏ２の量またはインキュベーション時間の関数としてのドットサイズ
一般手法：
ホルマリン固定パラフィン包埋組織で、染色実験を実行した。前処置として、キシレンの２浴（各々５分間）、９６％エタノールの２浴、７０％エタノールの２浴（各々２分間）でスライドを脱パラフィンした。スライドは、次に電子レンジ内の標的賦活化溶液（Ｄａｋｏ Ｓ １６９９）中で１０分間沸騰させた。スライドを冷却させ、内因性ペルオキシダーゼ活性を１０％過酸化水素で２分間抑えた。
実験１
全てのスライドを、ＨＥＲ２タンパク質のＣ末端に対する実験用モノクローナルマウス抗体とインキュベートした「クローン６Ｃ２」。以下のプロトコルを用いた：クローン６Ｃ２、５５ｐｉｃｏＭと３分間のインキュベーション、洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ Ｓ３３０６）による洗浄、次にＧａＭ／ＨＲＰ（Ｄ２００５２、分画８）と３７０ｐｉｃｏＭの濃度で３分間のインキュベーション、次に洗浄。次に、表１に詳述されるように、スライドをデポジションステップ、リポーター結合剤ステップ（全てのリポーター、Ｄ１９１１２、Ｄ２００６８、Ｄ２００８６、Ｄ２０１１８、Ｄ２０１２０を濃度１０μＭで用いた）、およびＬＰＲ色素原による染色ステップにかけた。各ステップの間で洗浄ステップを用いた。
Figure 0005836958
Figure 0005836958
Figure 0005836958
実験２
全てのスライドを実施例１の場合のように処理し、次に、表２に詳述されるようにデポジション、リポーター結合剤および色素原染色にかけた。
Figure 0005836958
Figure 0005836958
実験３
全てのスライドを実施例１の場合のように処理し、次に、表３に詳述されるようにデポジション、リポーター結合剤および色素原染色にかけた。
Figure 0005836958
Figure 0005836958
実験１〜３の結果
実験１（表１、スライド１〜５）および３（表３、スライド１〜５）は、他は同じ条件（同じ濃度の同じ結合剤、同じリポーター、ＤＡＢ、リポーターおよびＨ２Ｏ２の同じ濃度、同じインキュベーション時間）で、ドットサイズは、手順の最終、検出段階での色素原のデポジション時間、即ちリポーターデポジットを染色するパーマネントレッド液（ＬＰＲ）色素原のデポジション時間に依存することを実証する。最大のドットはＬＰＲの１０分間の沈殿で生成され、ドットのサイズは沈殿時間の短縮に伴って縮小した。しかし、１分間の沈殿（スライド５）でさえ、小さいが明らかなドットを観察するのに十分であった。
実験１（表１：スライド１およびスライド６〜９）および実験３（表３：スライド１およびスライド６〜１１）は、リポーター、ＤＡＢおよびＨ２Ｏ２を含有する培地での、標的、即ちＨｅｒ２受容体の複合体を含有する試料の、ＨＲＰ標識結合剤、即ちＤ２００５２、分画８とのインキュベーションの持続時間によって、したがって培地からリポーターをデポジットさせるために用いられた時間によってドットサイズが変動することを証明する（他の条件が一定の場合、即ち検出ステップ上の同じリポーター、同じ結合剤、同じ検出剤、ＤＡＢ、Ｈ２Ｏ２リポーター、結合剤および検出染色剤の同じ濃度、染色剤のデポジションの同じ持続時間）。最大のドットは、１０分間の沈殿で生成された。時間を１５分間または２０分間にさらに増加させることはより大きなドットに結びつかなかったが、バックグラウンド染色の有意な増加につながった。ドットサイズは、沈殿時間を１０分間から１分間に短縮するに従って縮小した。
実験１（表１：スライド１および１６〜１９）および３（表３；スライド１および１８〜２２）は、ＤＡＢおよびリポーターを含有するデポジション培地中のＨ２Ｏ２の濃度を変更することによって、ドットサイズを変更することができることを証明する。過酸化水素の濃度が１．５ｍＭであるとき、最大のドットが生成される。過酸化水素が存在しない場合、ドットは生成されない（表３：スライド１８）。過酸化水素のより低い濃度およびより高い濃度は、ドットのサイズを縮小する。５８．８ｍＭで、ドットはほとんど区別できなくなる。
実験１（表１：スライド１および１０〜１５）および実験３（表３：スライド１および１２〜１７）で示すように、ドットサイズはＤＡＢおよびリポーターを含有するデポジション培地中のＤＡＢ濃度に対応して変動する。ＤＡＢが０．１４ｍＭから０．２８ｍＭの濃度域で存在するとき、最大のドットが生成される。ＤＡＢが存在しない場合、ドットは生成されない。ＤＡＢ濃度を０．０７ｍＭに低下させることは、０．１４ｍＭでよりも小さく、より散在性であるドットにつながり、より高い濃度のＤＡＢも同様であり、２．０９ｍＭのＤＡＢでは、非常に小さなドットが生成される。
リポーター分子中のフェルラ酸残基の数（３対４の残基数）は、ドットサイズに対して軽微な影響を及ぼす。異なるリポーターで、ドットサイズはわずかに変動しただけである。実験１（表１：スライド２０〜２４）に示すように、４つのフェルラ酸部分をもつＤ２００６８リポーターは、３つの部分を有するリポーターより若干大きなドットを生成したが、同時に、バックグラウンド染色のレベルも増加した。最良の信号対雑音は、３つのフェルラ酸部分を含むＤ１９１１２で得られた。
ドットサイズはリポーターの濃度と一緒に変動する。実験２（表２：スライド１〜６）は、５μＭから２０μＭの範囲で、リポーターＤ１９１１２が（他は同じ条件で）サイズがわずかに異なるだけであるデポジットを形成することを証明する。１０および２０μＭは５μＭより若干大きなドットを生成するが、バックグラウンド染色も同様に増加する。５μＭより下では、ドットサイズは有意に低下する。しかし、１μＭでさえ、小さなドットはなお十分に可視的である。
デポジットしたリポーター、即ちＤ２００３６に結合することが可能な結合剤の濃度は、わずかにドットサイズに影響するだけであった（実験２の表２：スライド７〜１２に示す）。抗Ｆｌｕ−ＡＰコンジュゲート抗体（Ｄ２００３６）の濃度が５０ｎＭであったとき、最大のドットが得られた（他は同じ条件で）。１００ｎＭおよび５０ｎＭ未満の濃度は、それほど大きなサイズのドットを生成しなかった。非常に低い濃度（６または３ｎＭ）では、非常に小さいがなお識別可能なドットが生成された。
リポーター濃度、リポーター結合剤の濃度、および検出染色（即ち検出ステップ上のＬＰＲ染色）の沈殿時間によってサイズが調節、特に縮小されたドットは、特徴的な強度勾配を示し、中心が最も強く染色され、周辺が散在性であり、これらのドットに全体的に散在性の表情を与えた。
沈殿ステップで高いＤＡＢ濃度、高い過酸化水素濃度または時間短縮によってサイズが調節、特に縮小されたドットは縮れた表情を有し、均一な強度および鋭い輪郭を有する。
オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第二の基質の構造の関数としてのドットサイズ：異なるコンジュゲート分子を試験する
全てのスライドを、実施例１の場合のように前処理した。次に、以下のプロトコルに従わせた：抗サイトケラチンＤａｋｏ Ｍ３５１５ ２ｎＭと３分間のインキュベーション、洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ Ｓ３３０６）による洗浄、次にＧａＭ／ＨＲＰ（Ｄ２０１６８、分画９＋１０）と１００ｐｉｃｏＭの濃度で３分間のインキュベーション。次に、スライドを異なるリポーターと、しかし他は同一の条件で（５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、ＤＡＢ ０．１４ｍＭ、Ｈ２Ｏ２ １．５ｍＭ）１０分間デポジションステップにかけた。これに、リポーター結合剤ステップＤ２００３６、２０ｎＭで１０分間、およびＬＰＲ色素原による１０分間の染色ステップが続いた。各ステップの間で洗浄ステップを用いた。以下のリポーターをこれらの条件の下で試験した。
Ｄ１９１１２、Ｄ１８０４４、Ｄ１８１１２６、Ｄ１８１４６、Ｄ２０１７１、Ｄ２１０１６、０３２８−０１４（全て５μＭ）。デキストランリポーターコンジュゲートＤ２１００８は、５０ｎＭおよび２５０ｎＭで試験された。実験１で試験されたリポーターと合わせて、これは以下の結論に導く。リポーターの性質は、リポーターデポジションがどれだけ効率的に起こるかに重大な影響を及ぼす。意外にも、Ｄ２０１７１（１つのフルオレセイン、４つのフェルラ酸）およびＤ１９１１２（１つのフルオレセイン、３つのフェルラ酸）などの比較的小さなリポーターは、Ｄ１８１２６（３つのフルオレセイン、６つのフェルラ酸）または大きなデキストランコンジュゲートＤ２１００８（８３個のフルオレセインおよび１１１個のフェルラ酸）などのより大きな分子よりも効率的であることが判明した。デキストランコンジュゲートの場合には、これは試料への浸透が劣っていることに帰することができる。この大きなコンジュゲートを用いた場合に組織型および固定がドットサイズに影響を及ぼしたという事実が、この考えを裏付ける。
比較的小さい（抗体−酵素コンジュゲートに対して）分子であるＤ１８１２６の場合には、浸透不良は劣っている性能を十分に説明しないようである。より良好にデポジション機構を説明するために、いくつかの対照実験が実行された。デポジション培地にＤＡＢが存在しない場合、ドットは形成されなかった。しかし、ＤＡＢだけでデポジション反応を実行し、次にＤＡＢを添加せずにＤ２０１７１によるデポジション反応が続いた場合には、非常に小さなドットが生じた。機構の一部が、試料の、その後リポーターの支えの役目を果たすＤＡＢ重合体による、ＨＲＰによって促進されるコーティングであることをこの知見は強く示唆する。
デポジションステップに続いて沸騰ＣＨＥＳ緩衝液での１０分間の洗浄ステップで、別の実験が実施された。これはバックグラウンドを低減するために実施されたが、この非常にストリンジェントな洗浄はドットサイズの有意な低下にもつながった。ほとんどのデポジットしたリポーターは試料に共有結合で架橋せずに不溶性デポジットとして沈殿し、他のリポーターを真に固定化されているとみなすことができることを、これは証明する。この知見は、２つのさらなる機構を示す。ＤＡＢとリポーターとの間の溶液相反応は、リポーターと試料との間の真の共有結合性架橋と一緒に沈殿する低下した溶解性の付加物をもたらす。それらを不溶性にするためにＤＡＢとのいくつかの反応を必要とするので、大きなリポーターは沈殿する可能性がより低く、より小さなリポーターはＤＡＢとの単一または少数の反応によって不溶性にされるようである。
短縮されたリンカー長を有するリポーター、Ｄ２００８６（Ｌ３０）およびＤ２０１１８（Ｌ６０）は、Ｄ１９１１２（Ｌ１５０）とほとんど同じくらいの大きさのドットを与えたが、これらの短くなったリポーターは若干より多くのバックグラウンドも生成した。このわずかに低下した信号（ドットサイズ）対雑音は、フルオレセインハプテンのより強い粘着性および減少した接近性をもたらす低下した溶解性のためのようである。このように、長く伸びたリンカーはリポーター性能を強化する。
極めて重要な因子は、リポーター中の反応性基の性質である。ＤＡＢの不在下でリポーターをデポジットさせることができるという事実は、ＤＡＢコーティングステップの後ならば、ＨＲＰが触媒するリポーターの急激な形成が役割を果たすことを実証する。同様に、フェルラ酸を有するリポーターＤ１８１２６が４−アミノケイ皮酸を有する類似したリポーターＤ１８１４６よりも大きいドットを生じるという事実、およびチロシン残基を有する同様に類似したＤ１８０４４がドットを全く生成しない事実は、リポーター中の反応性基の重要性を示す。Ｄ１９１１２に構造上類似するが、フェルラ酸の代わりにそれぞれコーヒー酸およびシナピン酸を有するリポーターＤ２１０２０および０３２８−０１４は、いくぶん小さなドット（Ｄ２１０２０）またはＤ１９１１２よりわずかに大きい（０３２８−０１４）ドットを与える。フェルラ酸、コーヒー酸およびシナピン酸は全て非常に良いＨＲＰ基質であり、ＨＲＰによるリポーターの急激な活性化はリンカーデポジションへの可能性のある主要な寄与因子である。
結論として、多くの因子は、効率的なリポーターの作製に寄与する。相対的に小さいサイズは、水溶性リンカーの伸長をなお伸ばした。ＤＡＢとの反応の結果有意に低下した、平衡した全体的な水溶性。良いＨＲＰ基質である２個以上のフェノールまたは芳香族アミンの存在は、優れたリポーターを作製する。３〜４個のフェルラ酸誘導体が好ましく、３個のシナピン酸誘導体が最も好ましい。即ち、試験した全ての中で、リポーター０３２８−０１４の性能が最も良かった。
下の表は、異なる構造（異なるＹ頭部、Ｙ頭部とＺ尾部との間の異なる分子距離、同じＺ尾部（１つのＦｌｕ））を有する例示的なコンジュゲート分子を用いたいくつかのＳＭＤ染色の結果を要約する。
Figure 0005836958
★相対的ドットサイズは、最適条件下でのミクロンで表す最大ドット直径にほぼ対応する：高ｐＨでの組織の標的回収、室温で１０分間の沈殿反応中の１０μＭリポーター、１．６ｍＭ過酸化水素及び０．２８ｍＭのＤＡＢ、２０ｎＭの抗ＦＩＴＣ−ＡＰによる１０分間のリポーター認識、続いて１０分間のＬＰＲ。相対スコアは、異なる組織試料及び対照細胞系の上での異なる条件（標的回収及びリポーター濃度）の下でのいくつかの実験から判断され、定性的である。
ＨＲＰ標識結合剤の量および結合剤当たりのＨＲＰの部分の数の関数としてのドットサイズ
電子レンジで１０分間の沸騰によって１０個のスライドを脱パラフィンし、Ｄａｋｏ標的賦活化培地（Ｄａｋｏ Ｓ２７６３）で標的を賦活化した。１００ｎＭ抗サイトケラチンマウス抗体（Ｄａｋｏ Ｍ３５１５）を抗マウス二次抗体−ＨＲＰコンジュゲートの異なるモル等量数と予備混合し、３０分後、混合液を表４に記載の最終濃度まで希釈した。
Figure 0005836958
全てのスライドを、同じプロトコルによる免疫染色にかけた。
１．一次抗体／二次抗体−ＨＲＰ混合物；３分間インキュベーション
２．５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、０．００５％過酸化水素、１４０μＭ ＤＡＢ、５μＭ Ｄ１９１１２；８分間インキュベーション
３．抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ、Ｄ２０１５４、１００ｎＭ；５分間インキュベーション
４．ＤＡＢ色素原溶液；Ｄａｋｏ Ｋ３４６８；２分間インキュベーション
５．ヘマトキシリン対比染色；１分間インキュベーション
ステップ１および３では、０．１％の４−アミノアンチプリン、０．２％Ｐｒｏｃｌｉｎｅ、２％ＢＳＡ、０．２％カゼイン、２％ＰＥＧ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２。希釈剤として（ＡＢＣＰＴ緩衝液）を用いた。
全てのスライドは、褐色から黒色のドットのように見えるサイトケラチン特異的点状染色を示した。ドット数およびそれらのサイズは、スライド１〜３を通して増加した。スライド３〜５の上では、ドット数は事実上不変であったが、ドットのサイズはスライド３から５にかけて増加した。スライド６は、より少ないが一般により大きなサイズのドットを有した。最大のドットはスライド７〜１０で観察されたが、サイズは、プレミックス中の同等二次的ＨＲＰコンジュゲートの数と一緒にわずかだけ増加した。二次的ＨＲＰコンジュゲートの数の増加に伴ってドット数は減少し、過剰な二次的コンジュゲートとの予備混合はより大きなアセンブリーおよびより遅い標的結合につながることを裏付けた。
結合剤当たりのＨＲＰの数の関数としてのドットサイズ
Ｄ２００５２の分画（７，８，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１）を１００ｐＭの全体のＨＲＰ濃度までＡＢＣＰＴ緩衝液で希釈し、ドットサイズを各分画について調査した。分画のプールも分析し、試験に含まれたＤ１９１５０（Ｆ（ａｂ）１−ＨＲＰ１）も同様であった。
以下のプロトコルが用いられた：
１．抗サイトケラチン（Ｄａｋｏ ３５１５）１ｎＭ；１分間
２．Ｄ２００５２（１００ｐＭ ＨＲＰ）／Ｄ１９１５０の分画；１分間
３．５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、０．００５％過酸化水素、１４０μＭ ＤＡＢ、１０μＭ Ｄ１９１１２；８分間
４．抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ、Ｄ１９１５４ １００ｎＭ；５分間
５．ＤＡＢ色素原溶液；５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、０．２％過酸化水素、５．６ｍＭ ＤＡＢ；１分間
６．ヘマトキシリン対比染色；１分間
結果：分画７および８は、以下の分画より有意に少ないドットを生成した。これらは最大のドットでもあったが、分画９〜１２は、ほとんど同じ大きさの有意により多くのドットを生成した。分画１３〜２２は、サイズの小さくなるドットを生成した。１分子につき単一のＨＲＰ酵素を有するＤ１９１５０は、Ｄ２００５２の分画のいずれよりも非常に多くのドットを生成し、ドットは非常により小さくもあった。各分画は比較的均一なサイズのドットを生成したが、全ての分画のプールは非常に不定のサイズのドットを生成した。
より大きなｄｅｘ１５０コンジュゲートであるＤ２００７５の分画１〜４の試験は、上の実験５に記載されている通りに実施された。生成されたドットは、Ｄ２００５２の分画７および８のドットに似ている。即ち、ほとんどドットは生成されなかったが、それらはＤ１２０５２の分画９〜１２によって生成されたものより有意に大きくなかった。
結論
実験４〜６から、１結合剤分子当たりのＨＲＰの数と類似した状況下で生成されたドットのサイズとの間に強力な相関があると、我々は結論する。予備混合またはコンジュゲーションを通して得られたかどうかに関係なく、結合剤の各分子中のＨＲＰの数の増加は、より大きなドットにつながる。しかし、この影響は、約１０個のＨＲＰ／分子当たりで横ばい状態になるようである。より大きなデキストランコンジュゲートは、より大きなものを生成しない。ドット数は、逆の相関を示す。より大きな分子、特に非常に大きなものは、より少数のドットを生成する。これは、各抗体分子に結合している酵素の質量から生じる立体障害、および大きな分子の一般により遅い拡散速度の結果であり得るだろう。しかし、実験４、スライド１〜３は、おそらくいくつかの単独酵素分子が急速な酵素阻害のために可視ドットの生成に失敗するので、単一の酵素部分を含む結合剤分子が、１分子につき２、３の酵素を有するものより少数の、下向きの不定のドットを生成することも示す。実験４〜６はリポーターデポジットの検出段階で非常に短い色素原沈殿時間を全て利用し、それらが見られたかもしれないものより小さく見えるようにドットを導く。リポーターデポジットの検出の間の最後の色素原沈殿時間が視覚的ドットサイズに影響を及ぼすことができることを、実験１〜３（上記）は示す。影響を最小にするために、この時間を短く保ち、酵素量の影響を強調した。
蛍光二重染色法
４つのスライドを、実施例１に記載のように前処理した。
Ｄ２０１６８分画９〜１０を、ＡＢＣＰＴ結合剤緩衝液中で抗サイトケラチン（ＤａｋｏＭ３５１５）の等モル量と５分間予備混合し、両試薬とも１００ｎＭ濃度であった。この予備混合ステップの後、ＡＢＣＰＴ結合剤緩衝液中の２０ｐＭ溶液を調製した、「２０ｐＭ混合液」。
スライド１を２０ｐＭ混合液で１分間処理し、洗浄し（Ｄａｋｏ洗浄緩衝液、Ｓ３００６）、次にデポジション培地中の２０μＭのＤ２０１７１および０．２８ｍＭのＤＡＢで１分間処理して洗浄した。
スライド２を２０ｐＭ混合液で１分間処理し、洗浄し（Ｄａｋｏ洗浄緩衝液、Ｓ３００６）、次にデポジション培地中の５μＭのＤ１９０４８および０．２８ｍＭのＤＡＢで１分間処理して洗浄した。
スライド３を２０ｐＭ混合液で１分間処理し、洗浄し（Ｄａｋｏ洗浄緩衝液、Ｓ３００６）、次にデポジション培地中の２０μＭのＤ２０１７１＋５μＭのＤ１９０４８および０．２８ｍＭのＤＡＢで１分間処理して洗浄した。
スライド４を２０ｐＭ混合液で１分間処理し、洗浄し（Ｄａｋｏ洗浄緩衝液、Ｓ３００６）、次にデポジション培地中の２０μＭのＤ２０１７１および０．２８ｍＭのＤＡＢで１分間処理して洗浄した。スライドを３Ｍの過酸化水素で１分間処理し、次に２０ｐＭ混合液で１分間再び処理し、洗浄し（Ｄａｋｏ洗浄緩衝液、Ｓ３００６）、次にデポジション培地中の５μＭのＤ１９０４８および０．２８ｍＭのＤＡＢで１分間処理した。
最後に全てのスライドを水で洗浄し、エタノールで脱水し、蛍光封入剤（Ｄａｋｏ Ｋ５３３１）で封入した。
結果。スライド１は、サイトケラチン陽性組織で蛍光性の丸い緑色のドットを与えた。スライド２は、サイトケラチン陽性組織で蛍光性の丸い赤色のドットを与えた。スライド３は、サイトケラチン陽性組織で、ＦＩＴＣフィルターを通して見たときに緑色、ＴＲＩＴＣフィルターで見たときに赤色、二重フィルターでは黄色であった蛍光性の丸いドットを与えた。二重フィルターを通すと、緑色および赤色のドットは観察されなかった。スライド４は、サイトケラチン陽性組織で、二重フィルターを通して見たときに蛍光性の丸い緑色および赤色のドットの混合物を与えた。高いサイトケラチン発現の組織では、緑色および赤色のドットの黄色の重複部が多少あった。スライド４上で観察された赤色および緑色のドットの混合物と合わせたドットの丸みは、各ドットが単一の分子によって生成されるとの結論に我々を導く。スライド１および２だけに基づくと、用いた結合剤の極めて低い濃度にもかかわらず、観察されたドットは単独分子に由来しないと主張することができた。むしろ、ドットは、結合剤のいくつかの結合分子を各々有する、高いサイトケラチン濃度の細胞下クラスターと関連したものであり得るであろう。しかし、これがその場合であるとしても、スライド４は、スライド４の上でどれだけ多くの結合剤分子がインキュベーションステップの各々で各クラスターに結合していたかによって、様々な色のドットを、または、スライド３のように複数の分子が各クラスターに結合していた場合には、黄色のドットを示すと予想されるであろう。
この実施例は、２つの異なるリポーターの同時デポジションの価値も例示する。
２つの異なる共存標的の色素原二重染色法
スライドを、実施例１の場合のように前処理した。この実験のために、異なるＨＥＲ２状態（Ｄａｋｏｓ Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔにより０＋から３＋であると評価された）を有する乳房組織の組織マイクロアレイを、試験材料として用いた。ＨＥＲ２タンパク質のＣ末端に対する実験用モノクローナルマウス抗体を用いた、「クローン６Ｃ２」。以下のプロトコルが用いられた：
１．ＡＢＣＰＴ結合剤緩衝液中の、実施例７の場合のようにＤ２０１６８分画９〜１０と予備混合された１０ｐＭの抗サイトケラチン；３分間
２．０．４５μＭのＤＡＢを含むデポジション緩衝液中の５μＭのＤ１９０５９；８分
３．３Ｍ過酸化水素、３分間
４．ＡＢＣＰＴ結合剤緩衝液（ａ）中の、実施例７の場合のようにＤ２０１６８分画９〜１０と予備混合された１５ｐＭの「クローン６Ｃ」、３分間
５．０．４５μＭのＤＡＢを含むデポジション緩衝液（ｂ）中の５μＭのＤ１９１１２；８分間
６．ＡＢＣＰＴ緩衝液中の２５ｎＭのＤ２００３６（抗ＦＩＴＣ−ＡＰ）＋２５ｎＭのＤ１９０５３（抗ＦＩＴＣ−ＡＰ）を１０分間
７．パーマネントレッド液、Ｄａｋｏ Ｋ０６４０、６分間
８．５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、５．８ｍＭ過酸化水素中の青い色素原４００ｍｇ／Ｌ；６分間
結果：このプロトコルは赤色（Ｈｅｒ２）および青色（サイトケラチン）のドットを乳房組織の上で生成し、二重染色にもかかわらず非常にかすかな青色バックグラウンドを生成したに過ぎない。光学顕微鏡写真が異なる組織で得られ、画像は標準のカラープリンターを用いて印刷された。これは、１画像につき数百のドットの手動カウントを可能にした。ＨｅｒｃｅｐｔｅｓｔによってＨＥＲ２陰性（０＋）と評価されていた組織は、赤色ドットの９倍多くの青色ドットを示した。強いＨＥＲ２陽性（３＋）と評価されていた組織は、青色ドットの３倍を超えて多くの赤色ドットを示した。即ち、青色ドットに対する赤色ドットの配分比は、０＋組織よりも３＋組織について約３０倍高かった。１＋および２＋と評価された組織は、中間の配分比を示した。
低い存在度のｍＲＮＡ標的（tagets）の染色
異なる組織試料を有するブロックのＦＦＰＥ切片を有するスライドは、キシレン浸漬（emersion）（２×５分間）、続く９６％エタノール（２×２分間）および７０％エタノール（２×２分間）への浸漬によって脱パラフィンした。
スライドを脱イオン水で洗浄し、標的賦活化溶液、２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン（ethanesuphonic）酸）ｐＨ６．５５に移し、５分間電子レンジで沸騰させた。１５分間の冷却の後、スライドを洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ Ｓ３００６）で２回リンスし、３７℃で２分間ペプシン消化にかけ、次に洗浄緩衝液で２回リンスした。
スライドを脱水した、７０％エタノールで１分間、８５％エタノールで１分間、９６％エタノールで１分間。ＦＩＴＣ標識抗カッパｍＲＮＡプローブ（Ｄａｋｏ Ｙ５２０２、即時使用可）をスライドに塗布し、それらにカバースリップをかけた。スライドを８２℃で５分間変性させ、その後４５℃で１時間のハイブリダイゼーションが続いた。ストリンジェント洗浄緩衝液（ＤａｋｏキットＫ５２０１から）中で、スライドを６５℃で１０分間ストリンジェント洗浄した。
次に、スライドを以下のＳＭＤプロトコルにかけた：
ペルオキシダーゼブロック、Ｄａｋｏ Ｓ２０２３により２分間
３分間の洗浄
抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ、ＡＭＭ３５３．０２２、インキュベーション培地１で２０分間。
５つの異なる濃度を用いた（１０、２０、４０、８０、１６０ｐｉｃｏＭ）
３分間の洗浄
インキュベーション培地２中のリポーターＤ２１０４７、５μＭ、ＤＡＢ ０．１４ｍＭ、過酸化水素１．５ｍＭで１０分間
３分間の洗浄
インキュベーション培地１中の抗ＦＩＴＣ−アルカリ性ホスファターゼ（Ｄ２００３６）２０ｎＭで１０分間。
３分間の洗浄
パーマネントレッド液、Ｄａｋｏ Ｋ０６４０、１０分間
２分間の洗浄
ヘマトキシリン（水で６倍に希釈したＤａｋｏ Ｓ３３０９）で対比染色、２分間
脱イオン水による洗浄
Ｄａｋｏ Ｆａｉｒｍｏｕｎｔ、Ｓ３０２５による封入。
結果：全てのスライドは、約３ミクロンの直径の明らかに異なる赤色ドットを示した。ドットは全ての種類の組織に存在し、ドット数は抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰの濃度の増加に伴って増加した。高い濃度（８０および１６０ｐｉｃｏＭ）では、カッパ陽性細胞は、各々何十もの合体ドットで染色されたので、扁桃および結腸組織で明らかに特定することができた。複数の合体ドットは、他の組織でも、または扁桃もしくは結腸のカッパ陰性細胞でも観察されなかった。利点を有するこの技術を、ｍＲＮＡなどの低い存在度の標的の場合にどのように定性的方法で用いることもできるかについて、これは例示する。
第一の基質としてのフェルラ酸
対照細胞系のブロックのＦＦＰＥ切片を有するスライドは、キシレン浸漬（２×５分間）、続く９６％エタノール（２×２分間）および７０％エタノール（２×２分間）への浸漬によって脱パラフィンした。
スライドを脱イオン水で洗浄し、標的賦活化溶液、Ｄａｋｏ ｐＨ９、Ｓ２３６７へ移し、１０分間電子レンジで沸騰させた。
スライドを次に以下のＳＭＤプロトコルにかけた：
ペルオキシダーゼブロック、Ｄａｋｏ Ｓ２０２３により５分間
２分間の洗浄
インキュベーション培地１で１：５０に希釈した抗サイトケラチンＤａｋｏ Ｍ３５１５で５分間。
２分間の洗浄
インキュベーション培地１中の１ｐｉｃｏＭヤギ抗マウス、Ｌ３４８．１２１で５分間
３分間の洗浄
様々な濃度のフェルラ酸（５２ｍＭ、１６ｍＭ、５．２ｍＭ、１．６ｍＭ、０．５２ｍＭ）または０．１４ｍＭのＤＡＢを含むインキュベーション培地２中のリポーターＤ２１０４７、２０μＭ、過酸化水素１．５ｍＭで１０分間
９分間の洗浄
インキュベーション培地１中の抗ＦＩＴＣ−アルカリ性ホスファターゼ（Ｄ２００３６）２０ｎＭで１０分間
９分間の洗浄
パーマネントレッド液、Ｄａｋｏ Ｋ０６４０、１０分間
２分間の洗浄
脱イオン水による洗浄
Ｄａｋｏ Ｆａｉｒｍｏｕｎｔ、Ｓ３０２５による封入。
結果。
非常に効率的なリポーターデポジションを保証するために、多くの（２０個）ＨＲＰ酵素／分子を有する結合剤、高ｐＨの標的賦活化条件（良い組織接近性を保証するために）を用いてプロトコルを最適化し、効率的なリポーター、Ｄ２１０４７を比較的高い量で用いた。これらの条件下で、０．１４ｍＭのＤＡＢを有する対照スライドは、直径が最高４ミクロンのドットを生成した。フェルラ酸（架橋剤として）の場合には、濃度１．６ｍＭが最適であった。２ミクロンまでのドットが生成された。フェルラ酸のより低い濃度およびより高い濃度はより小さなドットを生じ、最も高い濃度、５２ｍＭでは、ドットが観察されなかった。フェルラ酸またはＤＡＢなしでインキュベートされたスライドでは、ドットは観察されなかった。
理論に縛られないが、ＤＡＢと同様に、フェルラ酸は、ＤＡＢより効率的ではなく、異なる最適濃度を有するとはいえ、第二の基質の分子を架橋する能力を有することが示唆された。
架橋剤の存在下での４ミクロンまでのドットの生成、およびそれのないとき（他は同じインキュベーション条件下で）のドットの非生成は、直接的な酵素リポーター活性化がデポジション反応で軽微な役割だけを演ずることを示唆する。ＤＡＢおよびフェルラ酸の両方は、ＨＲＰおよび過酸化物の存在下でホモ重合を経ることができる。大きなドット（４ミクロン）の存在は、ＨＲＰ活性を有する部位から最高数ミクロン離れてリポーターをデポジットさせることができることを示し、デポジションの可能な機構は、一部の架橋剤分子がＨＲＰと反応して対応するラジカルを生成すること、これらが架橋剤分子との、およびリポーター分子とのラジカル連鎖反応を誘発して、広範囲な非局在化によって十分に安定化されるオリゴマーラジカルを生成することであることを示唆する。これは、ラジカルが酵素から拡散し、最高１０分間（デポジションが起こる前に）デポジション培地中にとどまることを可能にする。ＤＡＢおよびフェルラ酸の両方で観察された最適濃度は、そのような機構を支持する。高い架橋剤濃度では、架橋剤／リポーターオリゴマーは、酵素活性部位の近くで速やかに不溶性化してデポジットすることができる。低過ぎる架橋剤濃度では、オリゴマー化は大きな不溶性オリゴマーを生成するには不十分である。
試料中のＨｅｒ２の定量化
試験材料
試験材料として、Ｈｅｒ２を発現するホルマリン固定パラフィン包埋細胞系ｓｋ４５（＋０系）、ｄｆ４５（＋１系）、ｄｆ２３（＋３系）のペレットの連続切片を用いた。あらゆる細胞系が存在する切片を提供するために、パラフィンの単一のブロックに細胞系のペレットを包埋した。
試験材料の前処理：
３つの細胞系を含有するブロックのＦＦＰＥ切片を有するスライド（「スライド」とも呼ばれる）は、キシレン浸漬（２×５分間）、続く９６％エタノール（２×２分間）および７０％エタノール（２×２分間）への浸漬によって脱パラフィンされた。次に、スライドを脱イオン水で洗浄し、標的賦活化溶液、１０倍希釈された（抗サイトケラチンにより、実施例１および２）高ｐＨ溶液（Ｄａｋｏ Ｓ２３７５）、または低ｐＨ溶液（Ｄａｋｏ Ｓ１７００）（下の実施例１０．３〜１０．８を参照）へ移した。スライドを次に電子レンジで沸騰するまで加熱して（約５分間）、１０分間静かに沸騰させた。その後、スライドを最低２０分間冷却させ、１０倍希釈の洗浄緩衝液（Ｄａｋｏ Ｓ３００６）へ次に移した。
一次抗体：
抗Ｈｅｒ２抗体は、モノクローナルのウサギ抗体（Ｄａｋｏクローン２５−１１−３）であった。濃縮された溶液中の計算された総タンパク濃度および（１５０ｋＤａ／モル）の抗体の分子量に基づいて希釈溶液を作製した。
コンジュゲート：結合剤およびリポーター
Ｌ３４８．１１１、分画１０〜１１
Ｄ２１１００、分画９〜１０
ＡＭＭ ３５３−０２２、分画８〜１１
Ｄ２１０４７
（詳細については、上の説明を参照のこと）
インキュベーション培地
溶液（ａ）：０．１％の４−アミノアンチプリン、０．２％Ｐｒｏｃｌｉｎｅ、２％ＢＳＡ、０．２％カゼイン、２％ＰＥＧ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２（ＡＢＣＰＴ緩衝液）
溶液（ｂ）：５０ｍＭイミダゾールＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ノニデットＰ４０、０．１％塩化ベンザルコニウム、０．００５％（１．５ｍＭ）過酸化水素
機器
Ｄａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｃｌａｓｓｉｃ。この機器は、試薬およびインキュベーション時間を自由に使用し設定することができる、完全にオープンで、自由にプログラム可能な自動化ＩＨＣ機器である。この機器は、４つの基本的作用を実行する
１．試薬吸引。
２．水平に置いたスライドから洗浄緩衝液を吹き飛ばす。
３．スライドの上へ試薬を一定量置く。（一吸いおよび一吐きとして知られる。）
４．洗浄緩衝液で洗い流すことによって、スライドを洗浄する。
単一のスライドのための一般的なプログラムは、下のプロトコル１に記載される。全てのＳＭＤ実験のために、最初のペルオキシダーゼブロックおよびドット形成ステップは、一定にしておいた。
プロトコル
ペルオキシダーゼブロック、Ｄａｋｏ Ｓ２０２３で５分間
洗浄
（ａ）標的部位の形成：
一次抗体、溶液（ａ）に１００ｐＭ
洗浄
ＨＲＰ標識二次抗体、実施例に記載
洗浄
（ｂ）標的部位でのリポーターデポジットの形成
溶液（ｂ）中の０．２８ｍＭのＤＡＢおよび５μＭリポーター（Ｄ２１０４７）による１０分間の試料（ａ）のインキュベーション
洗浄
（ｃ）単独標的部位でのリポーターデポジットの検出
抗ＦＩＴＣ−ＡＰ、１０分間、インキュベーション培地１に２０ｎＭのＤ２００３６
洗浄
ＬＰＲ、１０分間、Ｄａｋｏ Ｋ０６４０
洗浄
（ｄ）ヘマトキシリン対比染色
ヘマトキシリン、５分間
脱イオン水による洗浄
（ｆ）封入
自動化プロトコルにさらなる洗浄を導入することができる。洗浄ステップ時間を最低限に減らすことによって、自動化スケジューラは全体のプロトコル時間を最低限に保つ。しかし、洗浄ステップ時間は、機器のローディングに依存する。単一のスライドが染色されるようにプログラムされる場合、単一の洗浄ステップは２０秒間に短縮することができるだろうが、４８個のスライドの全装填は洗浄時間を相当増加させる。この時間変動を最小限にしておくために、実行のたびに平均で１０個のスライドを染色した。したがって、洗浄ステップ時間は、１ステップにつき約２分間保たれた。リポーターデポジションおよび抗ＦＩＴＣ−ＡＰとのデポジットのインキュベーションに続く複数の洗浄は、最小限のＬＰＲバックグラウンド染色を保証する。大量の増幅（標的に結合している単一の抗体−デキストラン−ＨＲＰ分子に由来する各赤色ドットは、平均で１００，０００，０００，０００個のＬＰＲ分子を含むと推定される）にもかかわらず、実質的にいかなるバックグラウンドも検出することができない。
ドットのカウントは、ＳＭＤ染色スライドおよびそれらの画像の目視検査によってまず手動で実施された。自動化された画像分析は、フリーウェアＪＭｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ ｖｓ．１．２７を用いて実施された。例示的な実施形態では、記載されるように生成されたＬＰＲ赤色ドット、およびヘマトキシリン染色核は、自動的にカウントされた。自動化されたカウントは、目視検査および手動カウントによって検証された。分割および関心領域抽出は、色、飽和、強度、（ＨＳＩ）色空間で色だけに基づくことができ、即ち強度および飽和は０〜２５５のフルレンジに設定された。ドット色は、１８８（バイオレット）〜２５５および０〜１６（オレンジ）に、核色は７６（緑色）から１６３（青色）に設定された。ドット−核コントラストは、ＤＰ５０ ５．５ＭｐｉｘｅｌカメラおよびＣｅｌｌＤ画像捕捉ソフトウェアを備えたオリンパスＢＸ５１顕微鏡で実施された画像捕捉の間の、赤色（１．２）、中間緑色（１．０）の過剰曝露によって、および青色（０．５６）の曝露の下で増強された。図３は、細胞の処理された画像、およびドットカウントの結果を示す。
以下に、本願（特願２０１２−５３４５４０号）の出願当初の特許請求の範囲を示す。
［請求項１］
固定化されている標的の単独個別ユニットを試料中で可視化する方法であって、
ａ）標的の個別ユニットの集団を含む試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の単独標的部位はそれぞれ、前記分別部分集団の個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つが酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｃ）（ａ）の試料を、
２ｍＭ未満の量のペルオキシド化合物、
（ａ）の別々の単独標的部位に付随している酵素の第１基質および
前記酵素の第２基質
を含む水溶液（ｉ）中でインキュベートするステップであって、
前記第１基質は、
（３）前記酵素と反応するとラジカルを発生させることができ、
（４）前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記第２基質の分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる水溶性の電子リッチな化合物であり、
前記第２基質は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの化合物を含むコンジュゲート分子であり、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択され、
それによって、第２基質の別々のデポジットを（ａ）の別々の単独標的部位に形成し、（ａ）の前記単独標的部位を可視化するステップとを含む方法。
［請求項２］
１つまたは複数の結合剤が、特異的結合対のメンバーである、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
標的部位が、試料中に存在する標的の単独個別ユニットの少数で形成されている、請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］
標的部位が、試料中に存在する標的の単独個別ユニットの大多数で形成されている、請求項１または２に記載の方法。
［請求項５］
酵素が、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
［請求項６］
酵素が、ペルオキシダーゼまたはフェノールオキシダーゼ活性を有する、請求項５に記載の方法。
［請求項７］
酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼもしくはラッカーゼまたは前記酵素の機能的類似体である、請求項６に記載の方法。
［請求項８］
オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質が、式（Ｉ）：
Figure 0005836958
 ［式中、
Ｒ１は、アリールまたはビニルであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｎ−（Ｘ） ２ 、Ｏ−（Ｘ） ２ （ここで、Ｘはアルキル、ビニルまたはアリールまたはＨである）であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同時にＨであることはなく、
ここで、
Ｈは水素であり；
Ｏは酸素である］
の構造を含む化合物である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
［請求項９］
化合物が、３，３’−ジアミノベンジジンまたはその誘導体である、請求項１または７に記載の方法。
［請求項１０］
化合物が、フェルラ酸またはその誘導体である、請求項１または７に記載の方法。
［請求項１１］
３，３’−ジアミノベンジジンまたはその誘導体の量が、１ｍＭ未満である、請求項９に記載の方法。
［請求項１２］
コンジュゲート分子が、式（ＩＩ）：
Figure 0005836958
 ［式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ） ２ または−Ｓ−Ｘであり；
Ｒ２は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ） ２ または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ ２ または−ＳＨであり；
Ｒ４は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ） ２ または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ５は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ） ２ または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ６は、−ＣＯＮ（Ｘ） ２ またはＣＯ−Ｘであり、
ここで、
Ｈは水素であり；
Ｏは酸素であり、
Ｓは硫黄であり、
Ｎは窒素であり、
Ｘは、Ｈ、アルキルまたはアリールである］
によって定義される、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質としての少なくとも１つの化合物を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
［請求項１３］
少なくとも２つの化合物が、式（ＩＩ）によって定義される、請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］
式（ＩＩ）によって定義される少なくとも２つの化合物が、同一の化合物である、請求項１３に記載の方法。
［請求項１５］
式（ＩＩ）によって定義される少なくとも２つの化合物が、異なる化合物である、請求項１３に記載の方法。
［請求項１６］
化合物が、ケイ皮酸、フェルラ酸、コーヒー酸、アミノケイ皮酸もしくはシナピン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
［請求項１７］
コンジュゲートが、少なくとも１つのチロシン残基を酵素の基質として含む、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
［請求項１８］
コンジュゲートにおいて、単独標的部位に付随している酵素の基質として働くことができる少なくとも２つの化合物がいずれも、コンジュゲート分子内において互いに、３０個以下の連続的に接続している原子によって分離されており、検出可能な標識は、前記基質のいずれからも、３０個以上の連続的に接続している原子によって分離されている、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
［請求項１９］
コンジュゲート分子において標識を、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素のいずれの基質からも分離する少なくとも３０個の連続的に接続している原子が、下式（ＩＩＩ）：
Figure 0005836958
 ［式中、Ｒ １ およびＲ ２ は、ＮＨおよびＯから選択され、Ｒ ３ は、メチル、エチル、プロピル、ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ および（ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ） ２ から選択され、ここで、連続的に繰り返すエチルオキシ基は３つ以下である］
の２〜１０個の繰り返しを含む、請求項１８に記載の方法。
［請求項２０］
第２基質が、同一のコンジュゲート分子の集団または異なるコンジュゲート分子の集団によって表され、コンジュゲート分子は、請求項１２から１９のいずれかに記載のいずれかと同様である、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
［請求項２１］
ステップ（ｂ）に先行して、水溶液（ｉ）の第２基質を含まないものである水溶液（ｉｉ）中で試料をインキュベートするステップ（ｂ’）を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
［請求項２２］
少なくとも１つの洗浄ステップを含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
［請求項２３］
（ｂ）の単独標的部位が検出される、ステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
［請求項２４］
ステップ（ｃ）が、
ｃ'）（ａ）の別々の単独標的部位に第２基質の別々のデポジットを含む（ｂ）の試料を、デポジットされた第２基質の検出可能な標識に特異的に結合することができる結合剤と共にインキュベートし、デポジットされた第２基質の１つまたは複数の分子と、前記結合剤の１つまたは複数の分子とを含む複合体を形成するサブステップと、
（ｃ''）試料（ｃ’）において、第２基質の別々のデポジットに結合している結合剤を検出して、それによって、単独標的部位を検出し、それによって、前記単独標的部位に付随している標的の個別単独ユニットを検出するサブステップとを含む、請求項２３に記載の方法。
［請求項２５］
結合剤が、酵素を含む、請求項２４に記載の方法。
［請求項２６］
結合剤が、発色性、蛍光、発光もしくは放射性物質または特異的結合対のメンバーから選択される検出可能な標識を含む、請求項２４に記載の方法。
［請求項２７］
単独標的部位にある第２基質の単独で別々のデポジットが、円形の形状を有し、二次元フィールドにおいて視覚的に別々のドットとして同定される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
［請求項２８］
別々のドットが、約０．４マイクロメートルまたは０．４マイクロメートル超の直径を有するドットである、請求項２７に記載の方法。
［請求項２９］
標的が、生物学的または化学的標的分子、粒子、分子もしくは細胞複合体、分子もしくは細胞構造、ウイルスもしくは微生物または前記標的分子、粒子、複合体、構造、ウイルスもしくは微生物の断片から選択される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
［請求項３０］
標的が、生物学的マーカーである、請求項２９に記載の方法。
［請求項３１］
標的の個別ユニットが、個別の生物学的または化学的単独分子、個別の単独粒子、個別の単独分子もしくは細胞複合体、個別の単独分子もしくは細胞構造または個別の単独ウイルスもしくは微生物または前記分子、粒子、複合体、構造、ウイルスもしくは微生物の個別の単独断片から選択される、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
［請求項３２］
試料が、生物学的、化学的または環境試料である、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
［請求項３３］
試料が組織学的試料である、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
［請求項３４］
標的が、タンパク質もしくは核酸分子またはそれらの断片もしくは誘導体である、請求項２９から３３のいずれかに記載の方法。
［請求項３５］
タンパク質が、細胞膜受容体または細胞質タンパク質または細胞質核酸である、請求項３４に記載の方法。
［請求項３６］
固定化されていて、試料中で幅広い動的濃度範囲を示している標的の個別単独ユニットを試料中で検出する方法であって、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み；
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの第１分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の第１標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、前記第１分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、（ａ）の第１標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１の単独標的部位に付随している残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、標的の個別単独ユニットの第２の分別部分集団で１つまたは複数の別々の第２の標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、前記第２分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の前記試料を、第２単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第２集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第１集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第２集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む方法。
［請求項３７］
ステップ（ａ）およびステップ（ｄ）の結合剤が、同じ結合剤である、請求項３６に記載の方法。
［請求項３８］
（ａ）および（ｄ）の結合剤が、異なる結合剤である、請求項３６に記載の方法。
［請求項３９］
第１集団の第２基質の分子および第２集団の第２基質の分子が、異なるコンジュゲート分子である、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
［請求項４０］
試料中に存在する少なくとも２種の異なる固定化標的の個別単独ユニットを可視化および検出する方法であって、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第１標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第１標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第１標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第１単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、第１標的の個別単独ユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、第１単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１単独標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１単独結合部位に付随している酵素の残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第２標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第２標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第２標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第２単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、第２標的の個別のユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の試料を、第２単独結合部位に付随している第１基質、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質の分子の第２集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第１標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第２標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む方法。
［請求項４１］
少なくとも２種の標的が、異なる生物学的分子である、請求項４０に記載の方法。
［請求項４２］
標的の少なくとも２種が、異なる核酸配列または異なるタンパク質である、請求項４０に記載の方法。
［請求項４３］
標的の少なくとも１つが核酸であり、他の少なくとも１つがタンパク質である、請求項４０に記載の方法。
［請求項４４］
第１集団の第２基質分子および第２集団の第２基質が、異なる第２基質分子である、請求項４０から４３のいずれかに記載の方法。
［請求項４５］
第２基質分子が、請求項１２から１９のいずれかに記載の化合物から選択され、第１基質分子が、請求項８から１０のいずれかに記載の化合物から選択される、請求項３６から４４のいずれかに記載の方法。
［請求項４６］
少なくとも１つの追加的なステップを含む、請求項３６から４４のいずれかに記載の方法。
［請求項４７］
試料が、組織学的試料である、請求項３６から４６のいずれかに記載の方法。
［請求項４８］
定義されたステップのいずれかに先立つ１つまたは複数のステップを含む、請求項１から４７のいずれかに記載の方法。
［請求項４９］
定義されたステップのいずれかに続く１つまたは複数のステップを含む、請求項１から４８のいずれかに記載の方法。
［請求項５０］
ステップのうちの少なくとも１つが自動化されているか、または少なくとも１つの自動化ステップをさらに含む、請求項１から４９のいずれかに記載の方法。
［請求項５１］
固定化標的を試料中で定量的評価する方法であって、
ｄ）請求項１から５０のいずれかに記載の方法によって、試料を処理するステップと；
ｅ）試料中の視覚的に識別可能なドットを定量するステップと；
ｆ）試料中の標的の量を評価するステップとを含む方法。
［請求項５２］
識別可能なドットを手動または自動で定量する、請求項５１に記載の方法。
［請求項５３］
標的の量を、参照マーカー、試料体積または試料面積当たりの標的の量として相対的に評価する、請求項５１または５２に記載の方法。
［請求項５４］
患者において疾患を診断する方法であって、患者から得られた生体試料を、請求項１から５３のいずれかに記載の方法に従って処理するステップを含む方法。
［請求項５５］
患者における治療処置の効力を推定する方法であって、患者から得られた生体試料を、請求項１から５３のいずれかに記載の方法に従って処理するステップを含む方法。
［請求項５６］
患者において疾患が発生する危険性または疾患からの回復の見込みもしくは失敗を予測する方法であって、患者から得られた生体試料を、請求項１から５３のいずれかに記載の方法に従って処理するステップを含む方法。
［請求項５７］
請求項１から５３のいずれかに記載の方法に従って、標的の単独ユニットを検出するステップを含むアッセイ。

Claims (32)

  1. 固定化されている標的の単独個別ユニットを試料中で可視化する方法であって、
    （ａ）標的の個別ユニットの集団を含む試料を、
    （１）結合剤のうちの少なくとも１つがオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含み、
    （２）結合剤のうちの少なくとも１つが標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
    １つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
    標的の個別単独ユニットの分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の単独標的部位はそれぞれ、前記分別部分集団の個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つが酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
    （ｂ）（ａ）の試料を、
    ０．１ｍＭから５ｍＭ未満の範囲の量のペルオキシド化合物、
    （ａ）の別々の単独標的部位に付随している酵素の第１基質および
    前記酵素の第２基質
    を含む水溶液（ｉ）中でインキュベートするステップであって、
    前記第１基質は、
    （３）前記酵素と反応するとラジカルを発生させることができ、
    （４）前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記第２基質の分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができ、
    少なくとも３つの（Ｃ−Ｃ＝）の繰り返しからなる鎖または芳香環構造を含む、水溶性で有機の電子リッチな化合物であって、
    式（Ｉ）：
    Figure 0005836958
     ［式中、
    Ｒ１は、アリールまたはビニルであり、
    Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｎ−（Ｘ） ２ 、Ｏ−（Ｘ）（ここで、Ｘはアルキル、ビニルまたはアリールまたはＨである）であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同時にＨであることはなく、
    ここで、
    Ｈは水素であり；
    Ｏは酸素である］
    の構造を有する化合物であり、
    前記第２基質は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの残基を含むコンジュゲート分子であり、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択され、
    それによって、第２基質の別々のデポジットを（ａ）の別々の単独標的部位に形成し、
    （ｃ）（ａ）の前記単独標的部位を可視化するステップとを含む、
    方法。
  2. １つまたは複数の結合剤が、特異的結合対のメンバーである、請求項１に記載の方法。
  3. 酵素が、ペルオキシダーゼまたはフェノールオキシダーゼ活性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 第１基質が、３，３’−ジアミノベンジジンまたはその誘導体、またはフェルラ酸またはその誘導体である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. コンジュゲート分子が、式（ｉｉ）：
    Figure 0005836958
     ［式中、
    Ｒ１は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり；
    Ｒ２は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
    Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２または−ＳＨであり；
    Ｒ４は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
    Ｒ５は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
    Ｒ６は、−ＣＯＮ（Ｘ）２またはＣＯＯ−Ｘであり、
    ここで、
    Ｈは水素であり；
    Ｏは酸素であり、
    Ｓは硫黄であり、
    Ｎは窒素であり、
    Ｘは、Ｈ、アルキルまたはアリールである］
    によって定義される、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質としての少なくとも１つの残基を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 少なくとも２つの残基が、式（ｉｉ）によって定義される、請求項５に記載の方法。
  7. 式（ｉｉ）によって定義される少なくとも２つの残基が、同一又は異なる残基である、請求項６に記載の方法。
  8. 少なくとも１つまたは少なくとも２つの残基が、ケイ皮酸、フェルラ酸、コーヒー酸、アミノケイ皮酸もしくはシナピン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
  9. コンジュゲート分子が、少なくとも１つのチロシン残基を酵素の基質としてさらに含む、請求項５から８のいずれかに記載の方法。
  10. コンジュゲート分子において、単独標的部位に付随している酵素の基質として働くことができる少なくとも２つの残基がいずれも、コンジュゲート分子内において互いに、３０個以下の連続的に接続している原子によって分離されており、検出可能な標識は、前記基質のいずれからも、３０個以上の連続的に接続している原子によって分離されている、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 第２基質が、同一のコンジュゲート分子の集団または異なるコンジュゲート分子の集団によって表され、コンジュゲート分子は、請求項５から１０のいずれかに記載のいずれかと同様である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. （ｂ）の単独標的部位が検出される、ステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  13. ステップ（ｃ）が、
    （ｃ'）（ａ）の別々の単独標的部位に第２基質の別々のデポジットを含む（ｂ）の試料を、デポジットされた第２基質の検出可能な標識に特異的に結合することができる結合剤と共にインキュベートし、デポジットされた第２基質の１つまたは複数の分子と、前記結合剤の１つまたは複数の分子とを含む複合体を形成するサブステップと、
    （ｃ''）試料（ｃ’）において、第２基質の別々のデポジットに結合している結合剤を検出して、それによって、単独標的部位を検出し、それによって、前記単独標的部位に付随している標的の個別単独ユニットを検出するサブステップとを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 結合剤が、酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 結合剤が、発色性、蛍光、発光もしくは放射性物質または特異的結合対のメンバーから選択される検出可能な標識を含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 単独標的部位にある第２基質の単独で別々のデポジットが、円形の形状を有し、二次元フィールドにおいて視覚的に別々のドットとして同定される、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 標的が、生物学的または化学的標的分子、粒子、分子もしくは細胞複合体、分子もしくは細胞構造、ウイルスもしくは微生物または前記標的分子、粒子、複合体、構造、ウイルスもしくは微生物の断片から選択される、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 標的が、生物学的マーカーである、請求項１７に記載の方法。
  19. 固定化されていて、試料中で幅広い動的濃度範囲を示している標的の個別単独ユニットを試料中で検出する方法であって、
    （ａ）試料を、
    （１）結合剤のうちの少なくとも１つがオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含み；
    （２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
    １つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
    標的の個別単独ユニットの第１分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の第１標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、前記第１分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
    （ｂ）（ａ）の試料を、（ａ）の第１標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１標的部位に形成するステップと；
    （ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１の単独標的部位に付随している残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
    （ｄ）試料（ｃ）を、
    （１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
    （２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別ユニットに直接結合することができる、
    １つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
    それによって、標的の個別単独ユニットの第２の分別部分集団で１つまたは複数の別々の第２の標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、前記第２分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
    （ｅ）（ｄ）の前記試料を、第２単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第２集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
    （ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第１集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
    （ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第２集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む方法。
  20. ステップ（ａ）およびステップ（ｄ）の結合剤が、同じ又は異なる結合剤である、請求項１９に記載の方法。
  21. 第１集団の第２基質の分子および第２集団の第２基質の分子が、異なるコンジュゲート分子である、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 試料中に存在する少なくとも２種の異なる固定化標的の個別単独ユニットを可視化および検出する方法であって、
    （ａ）試料を、
    （１）結合剤のうちの少なくとも１つがオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含み、
    （２）結合剤のうちの少なくとも１つが第１標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
    第１標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
    それによって、第１標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第１単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、第１標的の個別単独ユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
    （ｂ）（ａ）の試料を、第１単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１単独標的部位に形成するステップと；
    （ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１単独結合部位に付随している酵素の残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
    （ｄ）試料（ｃ）を、
    （１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
    （２）結合剤のうちの少なくとも１つが第２標的の個別ユニットに直接結合することができる、
    第２標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
    それによって、第２標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第２単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、第２標的の個別のユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
    （ｅ）（ｄ）の試料を、第２単独結合部位に付随しているオキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質の分子の第２集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
    （ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第１標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
    （ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第２標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む方法。
  23. 少なくとも２種の標的が、異なる生物学的分子である、請求項２２に記載の方法。
  24. 第１集団の第２基質分子および第２集団の第２基質分子が、異なる第２基質分子である、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 第２基質分子が、請求項５から１０のいずれかに記載の残基を含み、第１基質分子が、請求項４に記載の化合物から選択される、請求項１９から２４のいずれかに記載の方法。
  26. 試料が、組織学的試料である、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
  27. 定義されたステップのいずれかの前または後に、１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
  28. ステップのうちの少なくとも１つが自動化されているか、または少なくとも１つの自動化ステップをさらに含む、請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
  29. 固定化標的を試料中で定量的評価する方法であって、
    ａ）請求項１から２８のいずれかに記載の方法によって、試料を処理するステップと；
    ｂ）試料中の視覚的に識別可能なドットを定量するステップと；
    ｃ）試料中の標的の量を評価するステップとを含む方法。
  30. 識別可能なドットを手動または自動で定量する、請求項２９に記載の方法。
  31. 標的の量を、参照マーカー、試料体積または試料面積当たりの標的の量として相対的に評価する、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 請求項１から３１のいずれかに記載の方法に従って、標的の単独ユニットを検出するステップを含むアッセイ。
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