JP4292297B2 - 免疫組織化学的染色による抗原の検出方法 - Google Patents
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識二次抗体を用い、HRPによるFITC標識タイラマイドを沈着させ、HRP標識抗FITC抗体で標識増幅する超高感度の免疫組織化学的染色方法がキット化され、非ビオチン法のCSAIIとしてダコサイトメーション社から供給されている。さらに、標的核酸を標識するin-situ hybridization(インシトゥ・ハイブリダイゼーション)の増幅したシグナルを可視化する方法として、HRP、アルカリフォスファターゼなどの酵素反応の他に、蛍光標識(FITC等)が利用できることは知られている[例えば、特許文献3(Goldberg, et al.(ゴールドバーク等)、March 20, 2001(平成13)年3月20日、Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays(特定の結合アッセイにおける検出可能な信号増幅の為の方法及び組成物)参照)]。特許文献2のclaim 9と特許文献3にCARD反応での沈着したタイラマイドの標識に、蛍光物質を使う記載がある。
一方、本発明者は、sABC法の代わりに、一次抗体を、二次抗体とHRP等の酵素とポリマー(担体)とを含むポリマー複合体(商業的には、ChemMate EnVision、DakoCytomation)と反応させ、HRPによるビオチン化タイラマイドを沈着させ、ストレプトアビチン-HRP複合体で標識増幅を行う方法を検討したが、この方法には特有の非特異反応がもたらされることを見出した(後述の参考例1、2、実施例1等参照)
1)固定組織パラフィン切片を、キシレンとエタノールにそれぞれ3〜5回、3〜20分間浸すことでパラフィンを除き、
2)0.3〜6% 過酸化水素水メタノール溶液に5〜30分間浸し、一次の内因性ペルオキシダーゼの活性の抑制を行い、
3)0.005〜0.02Mリン酸緩衝液0.5〜1%塩化ナトリウム溶液(PBS)で洗浄し、固定組織標本切片の親水化を行い、
4)抗原に対応した抗原回復処理(一般的には、0.001〜0.02Mクエン酸緩衝液等に切片を浸し、オートクレーブで110〜140℃、1〜15分間の熱処理を行い、冷却後に、PBSに浸す。)を行い、
5)自動免疫染色装置に固定組織標本切片を配置し、
6)0.3〜6%過酸化水素水PBSに1〜15分間反応させ、二次の内因性ペルオキシダーゼの活性の抑制を行い、25〜60℃に加熱した0.01〜0.2% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween 20)を含む0.5〜1%塩化ナトリウムを加えた0.01〜0.1Mトリス緩衝液(TBS)洗浄液で1〜4回洗浄し、
7)0.1〜1%カゼイン溶液に2〜30分間反応させ、抗原特異(一次)抗体の非特異反応の抑制前処理を行い、
8)それぞれ一次抗体の至適希釈溶液と至適反応時間(13分間〜2時間)で反応させた後、25〜60℃に加熱したTBS洗浄液で2〜5回洗浄し、
9)0.1〜1%カゼイン溶液に2〜30分間反応させ、特異ポリマー試薬反応の非特異反応の抑制前処理を行い、
10)ポリマー試薬を10分間〜1時間反応させ、25〜60℃前後に加熱したTBS洗浄液で2〜5回洗浄し、
11)0.1〜1%ガゼイン溶液に2〜30分間反応させ、ビオチンないし蛍光物質で標識されたタイラマイド試薬反応の非特異反応の抑制処理を行い、
12)ビオチンないし蛍光物質で標識されたタイラマイド試薬と10〜30分間反応させ、25〜60℃前後に加熱したTBS洗浄液で2〜4回洗浄し、
13)ストレプトアビチンないし蛍光物質と特異的に反応する抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素ないし蛍光物質の複合体溶液と10分間〜1時間反応させ、25〜60℃前後に加熱したTBS洗浄液で2〜4回洗浄する。
15)ヘマトキシン等の溶液で、後対比染色を行い、水で1〜3回洗浄し、
16)自動免疫染色装置から固定組織標本切片を外し、
17)封入剤に対応した処理を行い、超高感度免疫染色を行った固定組織標本パラフィン切片を永久標本とし、光学顕微鏡下での抗原の検出となる。
<キシレン>
キシレンは、特級キシレンを用いる。
<エタノール>
エタノールは、特級エタノールを用いる。
特級過酸化水素水(30%溶液)を、特級メタノールで100倍希釈したものを用いる。
28.7gのリン酸水素第二ナトリウム・12水と3.3gのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を1Lのイオン交換水に溶解した0.1Mリン酸緩衝液に、85gの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを7.6に調整したものを10倍溶液として、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する。
2.1gのクエン酸・一水和物と2.94gクエン酸三ナトリウム・二水和物を100mlのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを6.0に調整し、イオン交換水で100mlに調節したものを10倍溶液とし、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、10倍溶液がDakoCytomation Co.やダイヤトロンから供給されている。その他に、抗原回復には、[非特許文献7]のp.114に記載されている1mM EDTA溶液 pH 8.0、などが用いられ、DakoCytomation Co.から供給されている。
特級過酸化水素水(30%溶液)を、28.7gのリン酸水素第二ナトリウム・12水と3.3gのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を1Lのイオン交換水に溶解した0.1Mリン酸緩衝液に、85gの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、10N 水酸化ナトリウム水でpHを7.6に調整したものを10倍溶液として、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する0.01Mリン酸緩衝液0.85%塩化ナトリウム溶液(PBS)で100倍に希釈する。
121.1gのトリスハイドロオキシメチルアミノメタン(シグマ社)を800mlのイオン交換水で希釈しオートクレーブで加熱溶解後に、1N塩酸でpHを7.5に調整し、イオン交換水で1Lにした1Mトリス溶液500mlと、292.2gの塩化ナトリウムを800mlのイオン交換水でオートクレーブ加熱溶解しイオン交換水で1Lにした5M塩化ナトリウム溶液360mlを、イオン交換水で20Lに希釈し、0.1%ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween 20)とした溶液。自動免疫染色装置の洗浄液タンクに入れて、35℃前後に加熱したものである。
25mgのカゼイン(シグマ社)を28.7gのリン酸水素第二ナトリウム・12水と3.3gのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を1Lのイオン交換水に溶解した0.1Mリン酸緩衝液に、85gの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、10N水酸化ナトリウム水でpHを7.6に調整したものを10倍溶液として、使用時に10倍にイオン交換水で希釈する0.01M PBSの10mlに希釈したもの。商業的には、DakoCytomation Co.から供給されている。
デキストランポリマーに直接二次抗体とHRPを結合させた試薬で、DakoCytomation Co.から商業的にダコ ChemMate EnVision試薬として供給されている。
ビオチン化タイラマイドと過酸化水素水の試薬で、DakoCytomation Co.からはダコCSA Systemの増幅試薬として、パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社からはTSA免疫組織化学染色・in situ Hybridization増感システムのキットの増幅試薬として供給されている。
ビオチンないし蛍光物質で標識されたタイラマイド試薬に対応した沈着したタイラマイドを標識する試薬。HRP標識タイラマイドであればストレプトアビチンと西洋ワサビペルオキシダーゼ等複合体溶液は、DakoCytomation Co.からはダコCSA Systemの酵素標識試薬として供給されている。パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社からはTSA免疫組織化学染色・in situ Hybridization増感システムのキットの酵素や蛍光物質標識試薬として供給されている。
酵素の発色基質溶液。商業的に、種々のものが供給されている。
上記の発色色素と区別できる色素溶液を用いた核ないし細胞質の染色で、後対比染色を行う。一般的には、ヘマトキシリン溶液が用いられる。DakoCytomation Co.から自動免疫染色装置での染色用にダコ ChemMateヘマトキシリン試薬が供給されている。
発色基質に合わせて、ジアミノベンチジンであれば、エタノール系列に浸しての脱水後に、プラスチック封入剤で封入し、長期の保存に耐える永久標本を作成する。3-アミノ-9-エチルカルバゾールでの発色では、DakoCytomation Co.から供給されるUltramount試薬で、70℃での加熱固化で永久標本を作成する。ベクター社の種々の発色基質では、冷風による乾燥後に、VectaMount封入剤で封入し乾燥固化し、永久標本を作成する。
sABC法とHRPによるCARD反応とその検出からなる超高感度免疫組織化学の方法(DAKO CSA system, DakoCytomation Co)を自動免疫染色装置で実験するが、各反応後の洗浄に、35℃加熱0.1%Tween20界面活性剤添加トリス緩衝液(TBS)洗浄液を用い、洗浄回数と洗浄効果の関係の検討を行った。その結果、sABC法の各洗浄は35℃加熱0.1%Tween20界面活性剤添加TBSによる三回の洗浄が、HRPによるCARD反応とその検出の反応後の洗浄は35℃加熱0.1%Tween20界面活性剤添加TBSによる二回の洗浄が、至適な洗浄であることが示された。
洗浄は参考例1で示した至適洗浄法で、従来の超高感度の免疫組織化学の方法を種々の臓器の固定組織パラフィン標本切片で自動免疫染色装置を使い実験した。
参考例3
セルブロック標本は、大量に培養した細胞ないし採取された細胞を試験管に集め、500rpmで10秒程、フラッシュ遠沈し、細胞集塊を作り、それに、10%緩衝ホルマリン溶液を注ぎ30分間固定し、この固定された細胞集塊を組織と同様に処理し、パラフィン包埋標本を作成した。
ダコChemMate EnVision(K5027)は、商業的に供給されているポリマー法の一つであり、自動免疫染色装置での染色を前提に供給されている。ダコEnVisionより抗原検出感度が高いとされている。
ダコEnVision+(抗マウス一次抗体用)(K4006は、商業的に供給されているポリマー法である。株式会社ニチレイ(ザイメット社)のヒストファイン・シンプル・ステイン・マルチニチレイ(ザイメット社)のヒストファイン・シンプル・ステイン・マルチ(ペルオキシダーゼ標識)(Histofine Simple Stain, MULTI(PO)、424154)は、商業的に供給されているポリマー試薬法である。
次に、ヒト扁桃組織の固定組織パラフィン標本切片を用い、0.01Mクエン酸緩衝液pH6.0に浸しオートクレーブでの熱処理による抗原回復を行い、一次抗体は抗Ki-67抗原抗体溶液でKi-67 Antigen, MIB-1(マウス単クローン抗体)(DakoCytomation Co. M7240)をダコ抗体希釈溶液での50倍に希釈した溶液を用い、sABC法とダコChemMate EnVisionを実施した。その染色像を、図4に示す。sABC法(図4の1、3、5)とダコChemMate EnVision(図4の2、4、6)は、ややsABC法が強いがほぼ同様の陽性像を示した。
ポリマー試薬反応前の非特異反応抑制処理を行い、ポリマー試薬反応後ないしCARD反応前の非特異反応処理を行わずに、超高感度免疫組織化学的染色を、ヒト扁桃固定組織パラフィン標本切片を用い、0.01Mクエン酸緩衝液pH6.0に浸しオートクレーブでの熱処理による抗原回復を行い、一次抗体は抗Ki-67抗原抗体溶液でKi-67 Antigen, MIB-1(マウス単クローン抗体)(DakoCytomation Co. M7240)をダコ抗体希釈溶液での50倍に希釈した溶液を用い、実験した。
次に、非特異反応を、さらに抑制する方法を見出すべく、種々の比較試験を行なった。
<ポリマー試薬>
ダコ・サイトメーション社のダコChemMate EnVision K5027。
<0.25%カゼイン溶液試薬>
ダコ・サイトメーション社の非特異反応ブロッキング試薬 X0909。
ダコ・サイトメーション社のダコCSA System K1500のボトル8の増幅試薬。
ダコ・サイトメーション社のダコCSA System K1500のボトル9の酵素標識試薬。
ダコ・サイトメーション社のCSA II (K1497)の増幅試薬ないしダコ・サイトメーション社のダコGenPoint system(ゲンポイント・システム)(K0618)のFITC標識タイラマイド溶液。
ダコ・サイトメーション社のダコGenPoint system (K0618)の抗FITC抗体/HRP二次酵素試薬。
上記の参考例5で確立した簡素化CSA法(simplified CSA法)は、生検、針生検標本では、非特異反応が強すぎることが判明した。一次抗体等の抗体希釈液の汚染等の問題を検討したが、この非特異反応が抗体等の希釈溶液等の汚染によるのではなく、CARD反応の非特異反応であることが示唆されたことから、参考例6でCARD反応前に非特異反応抑制処理を行う新規簡素化CSA法(new simplified CSA system(以下、nsCSAsystemともいう))を実験し、これを確認した。しかし、このCARD反応の非特異反応抑制は、ビオチン標識タイラマイド(biotinyl-tyramide)を用いる場合には、非特異反応を減じたが、FITC標識タイラマイド(FITC-tyramide)では、CARD反応によるシグナル増幅が極端に低下する傾向があった。
この検索には、連結不可能匿名化が行われた壊死性リンパ節炎を示すリンパ節のホルマリン固定パラフィン包埋標本切片を用いた。
Wash water(洗浄水): 脱イオン水による洗浄。
Protein block:ダコプロテインブロック試薬でプロテインブロックを5分間行った。新規簡素化CSA法は、ポリマー試薬法(簡素化CSA法、the Histochem J, Hasui et al, 2002)及びCARD反応前に2回追加のプロテインブロックを行った。
<結果1、新規簡素化CSA法(ビオチン標識タイラマイドを用いる場合)に於ける種々の非特異抑制剤の効果(実験1)>
図9の上から5と6段の図、5段目が壊死を認めない部分、6段目が壊死を認める部分に示す様に、0.1% Tween20を添加し、Protein blockの反応時間を15分間に延長すると、Dako Protein Blockでは特異反応も相当抑制され、3% BSA PBSでは非特異反応が非常に少なく、特異反応が一部抑制されていた。ここでは、一次抗体反応、ポリマー試薬反応、CARD反応の前の非特異抑制に、0.1%Tween20の添加と処理時間を15分延長した場合の効果を見ている。この実施例では、最終段階のDAB過酸化水素反応も自動免疫染色装置で行っている。従って、茶色の抗体の特異反応を反映する発色の消失は、特異反応抑制を意味する。CADR反応前の処理時間の延長では、CARD反応自体は同じ条件で実施されているので、標識タイラマイドの反応と理解することができる。0.25% Casein PBSとBlock Ace diluted 4 times with deionized waterでは非特異反応の抑制が出来なかった。0.25% Casein 1% BSA PBSとBlock Ace, Block Ace diluted 4 times with deionized waterでは、かなり非特異反応を抑制できたが完全ではなかった。
CSAIIはHRP-labeled antibody methodを、new simplified CSA systemはHRP- and antibody-labeled polymer methodを用いて、抗原と反応した一次抗体を標識している。
Claims (16)
- 免疫組織化学的染色方法によって固定組織標本切片中の抗原を検出するにあたり、
一次抗体を抗原と反応させる工程、
二次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼを備える複合体を、前記一次抗体と反応させる工程、および
標識タイラマイドを前記複合体と反応させる工程
を具え、
少なくとも、前記複合体と前記一次抗体との反応に先立って非特異反応をウシ血清アルブミン(BSA)によって抑制するか、または前記複合体と前記一次抗体との反応後であって前記標識タイラマイドの沈着反応に先立って非特異反応をウシ血清アルブミンまたはポリエチレングリコール(PEG)によって抑制することを特徴とする、方法。 - 前記複合体は、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび担体を備えるポリマー複合体である、請求項1記載の方法。
- 前記複合体と前記一次抗体との反応に先立って非特異反応をBSAによって抑制し、および前記複合体と前記一次抗体との反応後であって前記標識タイラマイドの沈着反応に先立って非特異反応をPEGによって抑制する、請求項1または2記載の方法。
- BSAまたはPEGを界面活性剤添加溶液として用いる、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 界面活性剤はトゥイーン(Tween)20又はトリトン(Triton)X-100である、請求項4記載の方法。
- 界面活性剤の濃度は0.01〜1%である、請求項4または5記載の方法。
- BSAの濃度は0.01〜5%である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 界面活性剤添加溶液は0.1%Tween20添加3%BSAである、請求項4〜7のいずれか1項記載の方法。
- PEGの分子量は3000以上である、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 界面活性剤添加溶液は0.1%Tween20添加3%PEGである、請求項4〜9のいずれか1項記載の方法。
- さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記加熱した洗浄液の温度は25〜60℃の範囲内である、請求項11記載の方法。
- 標識タイラマイドの標識物が可視化のための物質である、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記可視化のための物質に、ビオチンおよび蛍光物質の少なくとも1種が含まれる、請求項13記載の方法。
- 蛍光物質はフルオレスセンスイソチオシアネート(FITC)である、請求項14記載の方法。
- 反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なう、請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。
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