JP6575533B2 - 蛍光ナノ粒子用希釈液、これを用いた蛍光免疫染色用キット、蛍光免疫染色用溶液、および蛍光免疫染色法、遺伝子染色法 - Google Patents
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Description
本発明者らは、これまでも蛍光ナノ粒子を用いた定量的な免疫染色法(さらには、遺伝子染色法)における精度をあげるため、特許文献1に記載されているように、ブロッキング工程でタンパク質を切片に添加する事などの鋭意工夫を行ってきた。しかし、蛍光ナノ粒子の希釈液の組成については、特に検討してはこなかった。例えば、特許文献2に記載されているように、これまでは、抗体希釈液として広く用いられている1%BSA含有PBSで蛍光ナノ粒子を希釈してきた。
− 蛍光ナノ粒子用希釈液 −
本発明の蛍光ナノ粒子用希釈液は、少なくとも、高分子量(Mw≧40,000)のタンパク質を1〜5%(W/W)と低分子量(Mw<40,000)のタンパク質を1〜3%(W/W)含有しており、この溶液を用いて蛍光ナノ粒子を分散させることで、免疫染色(または遺伝子染色)を行うための蛍光免疫染色用溶液(または遺伝子染色用溶液)を調製することができる。以下、本発明について、より詳細に説明する。
本発明の蛍光ナノ粒子用希釈液は、少なくとも、高分子量(Mw≧40,000)のタンパク質を1〜5%(W/W)および/または低分子量(Mw<40,000)のタンパク質を1〜3%(W/W)含有している。
さらに本発明においては、蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色(または遺伝子染色)を行うためのキットが規定される。このキットは少なくとも、目的生体物質用の蛍光ナノ粒子を含む免疫染色用試薬(または遺伝子染色試薬)および上記蛍光ナノ粒子用希釈液を含む。このキットは更に、必要に応じて、目的生体物質を免疫染色するためのその他の必要な試薬、部材等や、本発明に係る蛍光免疫染色(または遺伝子染色)を実施するための説明書などを含んでいてもよい。
また、本発明においては、目的生体物質用の免疫染色用試薬を上記蛍光ナノ粒子用希釈液で希釈した蛍光免疫染色用溶液(または遺伝子染色用溶液)が提供される。免疫染色用試薬(または遺伝子染色用試薬)の希釈倍率については、目的生体物質と免疫染色用試薬とのアフィニティーに応じて最適化することができる。
本発明における目的生体物質は、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質(抗原)(や遺伝子)であって、主に病理診断の観点からの定量ないし検出のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものを指す。
一次抗体には、前述したような目的生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体(IgG)を用いることができる。たとえば、EGFR(発現タンパク質)を目的生体物質とする場合は抗EGFR抗体を、HER2を目的生体物質とする場合は抗HER2抗体を用いることができる。
本発明において用いられる蛍光ナノ粒子としては、目的生体物質を1分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発することができる「蛍光物質集積ナノ粒子」が好ましい。
本発明における蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質(たとえば蛍光色素)がその中に内包されているおよび/またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。この場合、母体(たとえば樹脂)と蛍光物質は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
半導体集積ナノ粒子とは、蛍光体としての半導体ナノ粒子が、上記に記載した母体の中に内包されているおよび/またはその表面に吸着している構造を有する。半導体ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、たとえば、II−VI族化合物、III−V族化合物、またはIV族元素を含有するもの、たとえば、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geなどが挙げられる。また、半導体が母体に内包されている場合、母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記に記載した母体の中に内包されている、および/またはその表面に吸着している構造を有する。蛍光色素は特に限定されるものではなく、たとえば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、Cy(登録商標、GEヘルスケア社製)系色素分子、DY系色素分子(登録商標、DYOMICS社製)、HiLyte(登録商標、アナスペック社製)系色素分子、DyLight(登録商標、サーモサイエンティフィック社製)系色素分子、ATTO(登録商標、ATTO−TEC社製)系色素分子、MFP(登録商標、Mobitec社製)系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造(骨格)または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。また、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。
目的生体物質を蛍光標識するための免疫染色剤に含まれる蛍光ナノ粒子としては、前述したように「蛍光物質集積ナノ粒子」が好ましい。免疫染色剤は、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光体が間接的に、つまり抗原抗体反応やアビジン・ビオチン反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。
(免疫染色方法)
以下、本発明で用いる染色方法の一例について説明する。この染色方法が適用できる組織切片(本明細書において、単に「切片」ともいい、例えば病理切片等の切片も包含する用語として用いる。)の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
(1−1.脱パラフィン処理)
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
公知の方法に倣い、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mのクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMのEDTA溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50〜130℃、時間は5〜30分で行うことができる。
免疫染色工程では、生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を本発明における蛍光ナノ粒子用希釈液に分散させ、組織切片に載せ、目的とする生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる蛍光免疫染色用溶液ないしそれを調製するための蛍光ナノ粒子用希釈液およびその他の成分については前述した通りであり、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
免疫染色工程を終えた病理標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
本発明では、もしも必要であれば、明視野において細胞、組織、臓器等の形態を観察することができるようにするための、形態観察染色工程を含めることができる。形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている(これら2つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)として知られている)。形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
(5−1.観察・撮影)
観察・撮影工程では、所望の倍率における顕微鏡の同一視野において、免疫染色工程に用いられた目的生体物質を蛍光標識している蛍光体に対応した励起光に対応した励起光それぞれを病理標本に照射し、それらの蛍光体から発せられた蛍光による免疫染色像それぞれを観察・撮影する。これらの励起光の照射は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いることで照射することができる。免疫染色像の撮影は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって行うことができる。免疫染色像の撮影の際には、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる蛍光用光学フィルターを用いることで、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮影することができる。
画像処理・計測工程では、目的生体物質に関して撮影された免疫染色像について、画像処理に基づき、目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルに対応する蛍光標識シグナルを計測し、細胞膜の領域内にある前記目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルを特定する。
上述した免疫染色法以外にも蛍光ナノ粒子を用いて遺伝子を特異的に染色する方法(例;FISH法)にも、本発明を適用することができる。すなわち、本発明に係る遺伝子染色法は、前述した蛍光ナノ粒子用希釈液と、プローブと、該プローブに結合可能または結合した蛍光ナノ粒子と、を含有する遺伝子染色用溶液を用いて遺伝子を染色する方法である。
プローブは、例えば、疾病(癌等)で特異的に発現する生体分子をコードした遺伝子と特異的に結合する核酸のプローブであり、例えば、前述した目的生体物質をコードする遺伝子である。
目的遺伝子に対するプローブは、公知の方法にしたがって作製することが可能であり、市販品として入手することもできる。プローブの塩基長、塩基配列、GC含量は、ハイブリダイゼーションさせる際の条件を考慮し、適切なストリンジェンシーを有するものとなるよう調製することができる
(プローブと蛍光ナノ粒子との結合)
プローブと蛍光ナノ粒子との結合は、遺伝子染色法(例;FISH)に支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。このプローブと蛍光ナノ粒子の結合は、プローブに蛍光ナノ粒子を直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
直接結合する方法の例としては、例えば、核酸分子の5’末端のリボースC5位に結合したリン酸の水酸基または核酸分子の3’末端のリボースのC1位に結合した水酸基を公知のチオール基導入試薬によりチオール基(SH基)に置換し、マレイミドで標識された蛍光ナノ粒子を反応させて、両者を結合する方法が挙げられる。ベクターラボラトリーズ社製「5'EndTag(出願商標)Nucleic Acid Labeling System」や「3’ EndTag DNA Labeling System」のキットを用いて好適に行うことができる。
間接的に結合する方法は、生体分子(第1,2の結合基分子)同士の特異的な結合を介してプローブと蛍光ナノ粒子とを結合させる方法である。生体分子同士の結合として、例えば第1,2の生体分子の組合せとして、アビジンービオチンの結合系、ハプテン−抗ハプテン等が挙げられる。
遺伝子染色を行う場合、(i)プローブと蛍光ナノ粒子とを染色する前に結合させてコンジュゲートを作成し、当該コンジュゲートを用いて検出対象の遺伝子を染色する方法(直接法)、または、(ii)第1結合基分子(ビオチン等)で修飾されたプローブを検出対象の遺伝子(HER2遺伝子等)にハイブリダイズ(特異的に結合)させた後に(1次反応処理後に)、第2結合基分子(アビジン等)で修飾された蛍光ナノ粒子を当該プローブに特異的に動的に結合させる(2次反応処理する)方法(間接法)がある。
FISH法は、上述したような各種の手法のそれぞれにとって標準的な手順および処理条件に従って行えばよい。一般的には、組織切片を載置した検体スライドをFISH法に応じた1種類または2種類以上の試薬に、適切な温度および時間条件の下、浸漬すればよい。本発明に係るFISHの実施に必要な各種の試薬は、公知の方法にしたがって作製することが可能であり、市販品として入手することもできる。
(1)蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色を行う際に使用する蛍光ナノ粒子用希釈液が、分子量40,000以上のタンパク質を1〜5%(W/W)含有し、かつ分子量40,000未満のタンパク質を1〜3%(W/W)含有している蛍光ナノ粒子用希釈液であれば、蛍光免疫染色において、蛍光粒子を希釈する際に本発明の蛍光ナノ粒子用希釈液を用いることで、蛍光ナノ粒子の非特異的吸着が抑制され、検出時にみられるバックグラウンドノイズを低減させることが可能となり、染色画像の評価するにあたって、精度と定量性の向上を図ることができる。
(2)前記分子量40,000以上のタンパク質がBSAであれば、特に上記希釈をした際にBSA以外のタンパク質を安定化する効果を奏する観点から好ましい。
(3)前記分子量40,000未満のタンパク質がカゼインであれば、タンパク質が非特異的に吸着する部分(抗原周辺の切片部位等)に付着した分子量40000以上のタンパク質同士の隙間を埋める(塞ぐ)効果を好適に得ることができる。カゼインは、水に溶けない油性成分(疎水性成分hydrophobic)がカゼイン分子の外側に配位しており、カゼイン分子同士が集まりやすい性質があるため、上記隙間の形状・大きさに応じてカゼイン分子同士が集まって隙間を埋めるため、非特異的吸着を好適に抑制することができる。
(6) (i)上記(1)〜(5)のいずれかの蛍光ナノ粒子用希釈液、および(ii)蛍光ナノ粒子を含有する免疫染色用試薬を含む蛍光免疫染色用キットであれば、免疫染色前に上記蛍光ナノ粒子用希釈液と免疫染色用試薬を混合して蛍光免疫染色に用いるだけで、上述した非特異的吸着を抑制する効果を比較的簡便に得ることができる。
(7) (1)〜(5)のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子用希釈液および蛍光ナノ粒子を含有する蛍光免疫染色用溶液であれば、該溶液を貯留する容器や該溶液を吸排するピペットチップの内表面に対する蛍光ナノ粒子の非特異的吸着を抑制する効果が得られるので、免疫染色工程の前に蛍光ナノ粒子が不必要に浪費されることがない。
(9) 上記免疫染色工程が、目的生体物質に対して一次抗体を特異的に結合させる1次反応処理、一次抗体に対し、ビオチンが結合した二次抗体を特異的に結合させる2次反応処理、請求項1〜5に記載された蛍光ナノ粒子用希釈液により、アビジンが結合した蛍光ナノ粒子を希釈し、該希釈後の溶液でもって2次抗体を蛍光標識する処理、を順に行う工程を含む蛍光免疫染色法であれば、蛍光ナノ粒子の非特異的吸着が抑制されること以外にも、蛍光ナノ粒子に結合したアビジンの非特異的吸着も抑制される結果、アビジンービオチンの結合系を利用した蛍光標識処理を好適に行うことができる。
(10)蛍光ナノ粒子を用いたFISH法を行う際に使用する、分子量40,000以上のタンパク質を1〜5%(W/W)含有し、かつ分子量40,000未満のタンパク質を1〜3%(W/W)含有している蛍光ナノ粒子用希釈液であれば、遺伝子検出を行う場合にも蛍光ナノ粒子の非特異的吸着を抑制して、ノイズ低減や検出シグナルが強まる。
(12)前記分子量40,000未満のタンパク質がカゼインであれば、上記(3)で説明した効果が遺伝子検出においても得られる。
(13,14)前記カゼイン内のκ−カゼイン含有比率が10%(W/W)以下であれば、あるいは、α−カゼイン:β−カゼインの比率が40:60〜60:40(α−カゼインおよびβ−カゼインの合計量を100とする。)であれば、上記(4,5)で説明した効果が遺伝子検出においても得られる。
(16)上記(10)〜(14)のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子用希釈液および蛍光ナノ粒子を含有する遺伝子染色用溶液であれば、上記(7)で説明した効果が遺伝子検出においても得られる。
(17)前記遺伝子染色用溶液を使用した遺伝子染色工程を含む遺伝子染色法であれば、上記(8)で説明した効果(蛍光シグナル以外にもアイソトープのシグナルについても同様の効果)が得られる。
(18)上記遺伝子染色工程が、
検出対象の遺伝子に対して、第1結合基分子を有するプローブを特異的に結合させる1次反応処理、
上記(10)〜(14)に記載された蛍光ナノ粒子用希釈液により、第1結合基分子と特異的に結合する第2結合基分子が結合した蛍光ナノ粒子を希釈し、希釈された溶液でもって、検出対象の遺伝子に特異的に結合したプローブを蛍光標識する2次反応処理、を順に行う工程を含む遺伝子染色法であれば、蛍光ナノ粒子に結合した第2結合基分子の非特異的吸着に起因した蛍光ナノ粒子の非特異的吸着を好適に抑制することができる。
50mMTris溶液に、2次抗体として用いる抗ウサギIgG抗体50μgを溶解した。この溶液に、最終濃度3mMとなるようにDTT(ジチオトレイトール)溶液を添加、混合し、37℃で30分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」(サーモサイエンティフィック社、Cat.#89882)に通して、DTTで還元化した2次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち200μLを50mMTris溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Maleimide-PEG2-Biotin」(サーモサイエンティフィック社、製品番号21901)を、DMSOを用いて0.4mMとなるように調整した。このリンカー試薬溶液8.5μLを前記抗体溶液に添加、混合し、37℃で30分間反応させることにより、抗ウサギIgG抗体にPEG鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長300nmにおける吸光度を分光高度計(日立製「F−7000」)を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質(ビオチン修飾2次抗体)の濃度を算出した。50mMTris溶液を用いて、ビオチン修飾2次抗体の濃度を250μg/mLに調整した溶液を、ビオチン修飾2次抗体(試薬II)の溶液とした。
テキサスレッド色素分子「Sulforhodamine 101」(シグマアルドリッチ社)2.5mgを純水22.5mLに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を70℃に維持ながら20分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックMX−035」(日本カーバイド工業株式会社)1.5gを加え、さらに同一条件で5分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸100μLを加え、溶液の温度を60℃に維持しながら20分間攪拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、12,000rpmで20分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行い、上述のように平均粒子径を測定したところ、平均粒子径152nmであった。
作製例2で得られた粒子0.1mgをEtOH1.5mL中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランLS−3150(信越化学工業社製)2μLを加えて8時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
アルゴン気流下、トリ−n−オクチルホスフィンオキシド7.5gに、ステアリン酸2.9g、n−テトラデシルホスホン酸620mg、および、酸化カドミウム250mgを加え、370℃に加熱混合した。これを270℃まで放冷した後、トリブチルホスフィン2.5mLにセレン200mgを溶解させた溶液を加え、減圧乾燥し、トリ−n−オクチルホスフィンオキシドで被覆されたカドミウムセレニド(CdSe)コア半導体ナノ粒子を得た。
[作製例5]ストレプトアビジン修飾量子ドット内包メラミン樹脂ナノ粒子の作製
作製例3と同様にして、作製例4で得られたナノ粒子0.1mgから、ストレプトアビジン修飾量子ドット内包メラミン樹脂ナノ粒子を得た。
(E1)標本作製工程
乳がん組織アレイスライド(組織切片を搭載したスライドグラス)を(USBiomax社 br243)を購入し、ベンタナI−VIEWパスウェーHER2(4B5)キットを用い、ベンタナベンチマークULTRAで染色、DAB法によりHER2 3+領域(すなわち癌細胞領域)と間質細胞領域を形態学的に同定した。
(E2−1)免疫染色の1次反応処理
目的生体物質HER2に係る第1免疫染色用の1次反応処理は、BSAを1W/W%含有するPBSを用いて、抗HER2ウサギモノクローナル抗体「4B5」(ベンタナ社)を0.05nMの濃度で含有する1次反応処理液を調製した。この1次反応処理液に工程(1)で作製した標本を浸漬し、4℃で1晩反応させた。
作製例1で作製したビオチン修飾抗ウサギIgG抗体の溶液を、さらにBSAを1W/W%含有するPBSを用いて6μg/mLに希釈した2次反応処理液を調製した。1次反応処理を終えた標本をPBSで洗浄した後、この2次反応処理液に浸漬し、室温で30分間反応させた。
作製例3で作製したストレプトアビジン修飾テキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を、表1に示すように、カゼイン(組成=α‐カゼイン(シグマ社 c6780):50W/W%、β‐カゼイン(シグマ社 c6905):50W/W%)とBSAの含有率がそれぞれ異なった蛍光ナノ粒子用希釈液を用いて、0.02nMに希釈した蛍光標識反応処理液をそれぞれ調製した。2次反応処理を終えた標本をこの蛍光標識処理液に浸漬し、中性のpH環境下(pH6.9〜7.4)、室温で3時間反応させた。
免疫染色を終えた標本に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行う透徹処理を行った。最後に、標本に封入剤「エンテランニュー」(メルク社)を載せて、カバーガラスを被せる封入処理を行い、観察に用いる標本とした。
(E4−1)観察・撮影工程
この工程における励起光の照射および蛍光の発光の観察には蛍光顕微鏡「BX−53」(オリンパス株式会社)を用い、免疫染色像(400倍)の撮影には、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「DP73」(オリンパス株式会社)を用いた。
この工程における画像処理には、画像処理ソフトウェア「ImageJ」(オープンソース)を用いた。
A=間質ノイズ(輝点数(以下同じ))
500以上=×
500未満300以上=○
300未満200以上=◎
200未満=☆
B=1細胞あたりの輝点数
10未満=×
10以上=○
C=凝集輝点
3個以上=×
3個以下=○
[実験例2]
(E2−3)免疫染色の蛍光標識処理で用いた蛍光ナノ粒子を分散させる溶液に含有されるカゼインの組成を変更した以外は、実施例1と同様の手順で標本作製工程、免疫染色工程および評価工程を行い、間質ノイズ、1細胞あたりの輝点数および凝集輝点数をカウントした。結果を表2〜4に示す。なお、天然カゼインにおける各カゼインの含有比率は、α-カゼイン50%、β-カゼイン35%、κ-カゼイン13%、γ-カゼイン2%である。
[実験例3]
間質領域の同定は(E1)と同様に、ベンタナI−VIEWパスウェーHER2(4B5)キットを用いて実施した。その後、抗HER2ウサギモノクローナル抗体「4B5」に代えて抗HER3ウサギモノクローナル抗体「SP71」Abnova社を用いたこと以外は、(E2)〜(E4)同様に染色および評価を実施した。
その結果、実験例2と同様の結果を得た。
肺組織アレイスライド(組織切片を搭載したスライドグラス)を(USBiomax社 LC241b)購入し、間質細胞領域の形態学的な同定を抗PD-L1ウサギモノクローナル抗体「SP142」 Spring Bioscience(SBS)社を用いたこと以外は(E1)と同様に、実施した。その後、抗HER2ウサギモノクローナル抗体「4B5」に代えて抗PD-L1ウサギモノクローナル抗体「SP142」 Spring Bioscience(SBS)社を用いたこと、およびストレプトアビジン修飾テキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子に代えて作製例5で作成したストレプトアビジン修飾量子ドット内包メラミン樹脂ナノ粒子を用いた以外は、(E2)〜(E4)同様に染色および評価を実施した。なお、(E)においては照射する励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルター((株)オプトライン製「QD655−C」)を用いて415〜455nmに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて648〜663nmに設定した。
その結果、実験例2と同様の結果を得た。
間質細胞領域を同定する(E1)のプロセスを除いたこと以外は、実験例1と同様に実施した。すなわち、乳がん組織アレイスライド(組織切片を搭載したスライドグラス)を(USBiomax社 br243)を購入し、脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを10mMクエン酸緩衝液中(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行った。
CellBiochemBiophys.2006;45(1)59の記載の方法に従って、以下のように核酸分子を調製した。GSP社から購入したHER2−DNAクローン(約150kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP−ニックトランスレーションキット」K−015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、HER2のDNAクローン(核酸分子)のdTTPをビオチン標識dUTPで置換した。
FISHによりHER2遺伝子のコピー数を測定した。FISHは以下に示すように、脱パラフィン処理、検体スライドの前処理、酵素処理、検体の固定処理、プローブの準備、検体スライドのDNAの変性処理、ハイブリダイゼーション処理、スライドグラスの洗浄処理、およびDAPI染色処理をこの順で行うことで実施した。
HER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2−FISHコントロールスライドCode PS−09006」)を、以下の(1)〜(4)の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。(1)ヘモディー(Hemo−De)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを新しいHemo−Deに常温10分間浸漬する。同じ操作を3回繰り返す。(3)検体スライドを100%エタノールで常温で5分間浸漬し、2回洗浄し、脱水処理を行う。(4)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で乾燥させる。
DNAプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の(1)〜(6)の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。(1)検体スライドを0.2mоl/L HClで室温、20分間処理する。(2)検体スライドを精製水に3分間浸漬する。(3)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC:standard sailine citrate)に3分間浸漬する。(4)検体スライドを80℃の前処理溶液(1N NaSCN)に30分間浸漬する。(5)検体スライドを精製水に1分間浸漬する。(6)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC)に5分間浸漬し、この浸漬操作を2回繰り返す。
前処理を行った検体スライドに対して、以下の(1)〜(4)の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。(1)前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。(2)検体スライドを37℃に加温したプロテアーゼ溶液に10〜60分間浸漬する。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、25mg プロテアーゼ(2500−3000Units/mg)[ペプシン]/1M NaCl[pH2.0]50mLで37℃、60分間)で処理することが望ましい。(3)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。この操作を2回繰り返す。(4)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で2〜5分間乾燥させる。
検体の固定処理として、前処理を行った検体スライドに対して以下の(137)〜(3)の処理を行った。(1)検体スライドを10%中性緩衝ホルマリン(和光純薬社製「4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液」、製品番号163−20145)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。これと同じ操作を2回繰り返す。(3)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で2〜5分間乾燥
させる。
冷凍保存しておいた作成例6で作成したDNAプローブの溶液を室温に戻し、正確な容量を採液可能なピペッティング操作ができる程度まで溶液の粘度を十分にさげて、ボルテックスミキサー等で溶液を混和した。
検体スライド上のDNAの変性処理として、検体の固定処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(8)の処理を行った。(1)検体スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱(気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの)を37℃インキュベータ内に載置して予備加熱する。(2)変性溶液(70% ホルムアミド/SSC[150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム])のpHが常温でpH7.0〜8.0であることを確かめる。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が72℃±1℃になるまで温浴槽で加温する(72±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(3)ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、検体スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークする。(4)検体スライドを72±1℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、検体スライドのDNAを変性する。
(5)ピンセットを使って、検体スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の70%エタノール中に入れる。ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体スライドを1分間浸漬する。(6)検体スライドを70%エタノールから取り出し、85%エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体を1分間浸漬する。100%エタノールで同じ操作を2回繰り返す。(7)ペーパータオルに検体スライドグラスの下端をつけてエタノールを取り除き、ペーパータオルでスライドグラスの裏側を拭く。(8)検体スライドをドライヤーで風乾または45〜50℃のスライドウォーマーで2〜5分間乾燥させる。
上記変性処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(3)の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して上述したように調製したDNAプローブ10μL(10〜50ng)を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。(1)検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記DNAプローブを10μL添加し、すぐに、22mm×22mmのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。(2)ペーパーボンドでカバーグラスをシールする。(3)前もって加温した湿潤箱に検体スライドを入れて蓋をして37℃のインキュベータで14〜18時間ハイブリダイゼーションを行う。
上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(6)の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。(1)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液(2×SSC/0.3%NP−40)をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が72℃±1℃になるまで温浴槽で予備加熱をする(72℃±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(2)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持する。(3)ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。(4)検体スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待つ。(5)溶液から検体スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、72±1℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に2分間浸す。ここで、73℃を超える温度や処理時間として2分を超えないようにするのが望ましい。(6)コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下(締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等)で風乾する。
HER2遺伝子に結合しビオチンで標識されたDNAプローブに対して、作製例3のストレプトアビジン結合蛍光物質内包メラミンナノ粒子を以下の通りに結合させた。
DAPI染色は以下のように行った。まず、10μLのDAPI対比染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。次に、ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにDAPI染色(2μg/mLPBS)を25℃、10分間行うことで細胞核を染色し、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。DAPI (4',6−Diamidino−2−Phenylindole, Dihydrochloride) はMolecular Probes社(D1306)を使用した。
上述のようにFISHを行った検体スライドを以下のように観察した。
蛍光顕微鏡観察は、上述のようにFISHを行った切片を、蛍光顕微鏡Zeiss imager(Camera:MRmモノクロ・冷却機能付、対物レンズ×60油浸)を用いて、蛍光顕微鏡観察(600倍)を行い、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を行った。
Claims (14)
- 蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色を行う際に使用する、分子量40,000以上のタンパク質を1〜5%(W/W)含有し、かつ分子量40,000未満のタンパク質を1〜3%(W/W)含有し、前記分子量40,000以上のタンパク質がBSAであり、前記分子量40,000未満のタンパク質がカゼインである、蛍光ナノ粒子用希釈液。
- 前記カゼイン内のκ−カゼイン比率が0〜10%(W/W)である、請求項1に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液。
- 前記カゼインが含有するα−カゼイン:β−カゼインの比率が40:60〜60:40(α−カゼインおよびβ−カゼインの合計量を100とする。)である、請求項1または2に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液。
- (i)請求項1〜3のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液、および(ii)蛍光ナノ粒子を含有する免疫染色用試薬を含む、蛍光免疫染色用キット。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液および蛍光ナノ粒子を含有する蛍光免疫染色用溶液。
- 請求項5の蛍光免疫染色用溶液を使用した免疫染色工程を含む蛍光免疫染色法。
- 上記免疫染色工程が、
目的生体物質に対して一次抗体を特異的に結合させる1次反応処理、
一次抗体に対し、ビオチンが結合した二次抗体を特異的に結合させる2次反応処理、
請求項1〜3のいずれか一項に記載された蛍光ナノ粒子用希釈液により、アビジンが結合した蛍光ナノ粒子を希釈し、該希釈後の溶液でもって2次抗体を蛍光標識する処理、
を順に行う工程を含む、請求項6に記載の蛍光免疫染色法。 - 蛍光ナノ粒子を用いた遺伝子染色法を行う際に使用する、分子量40,000以上のタンパク質を1〜5%(W/W)含有し、かつ分子量40,000未満のタンパク質を1〜3%(W/W)含有し、前記分子量40,000以上のタンパク質がBSAであり、前記分子量40,000未満のタンパク質がカゼインである、蛍光ナノ粒子用希釈液。
- 前記カゼイン内のκ−カゼイン含有比率が10%(W/W)以下である、請求項8に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液。
- 前記カゼインが含有するα−カゼイン:β−カゼインの比率が40:60〜60:40(α−カゼインおよびβ−カゼインの合計量を100とする。)である、請求項8または9に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液。
- (i)請求項8〜10のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液、および(ii)蛍光ナノ粒子を含有する遺伝子染色用試薬を含む、遺伝子染色用キット。
- 請求項8〜10のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子用希釈液と、プローブと、該プローブに結合可能または結合した蛍光ナノ粒子と、を含有する遺伝子染色用溶液。
- 請求項12の遺伝子染色用溶液を使用した遺伝子染色工程を含む遺伝子染色法。
- 上記遺伝子染色工程が、
検出対象の遺伝子に対して、第1結合基分子を有するプローブを特異的に結合させる1次反応処理、
請求項8〜10のいずれか一項に記載された蛍光ナノ粒子用希釈液により、第1結合基分子と特異的に結合する第2結合基分子が結合した蛍光ナノ粒子を希釈し、希釈された溶液でもって、検出対象の遺伝子に特異的に結合したプローブを蛍光標識する2次反応処理、
を順に行う工程を含む、請求項13に記載の遺伝子染色法。
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