JP3241237B2 - サイトメガロウイルス抗原検査法 - Google Patents
サイトメガロウイルス抗原検査法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アルカリホスファター
ゼ標識体を用いるサイトメガロウイルス抗原の検査法に
関する。
ゼ標識体を用いるサイトメガロウイルス抗原の検査法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】活動性サイトメガロウイルス（以下「Ｃ
ＭＶ」と表すことがある）感染症は、骨髄、腎、肝、心
移植および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等免疫抑
制下の患者において、極めて重篤かつ多様な合併症を引
き起こす。腎移植患者では、全体の４０〜７０％が活動
性ＣＭＶ感染症に罹患し、このうち１０〜２０％が間質
性肺炎、持続性発熱、胃腸炎などの臨床症状を呈する
（Transplant Int. 2, 147-164, 1989）。近年、こうし
た臨床症状をしめす活動性ＣＭＶ感染症の治療薬として
ガンシクロビル製剤の使用が認可され、網膜炎や腸炎に
対して著しい効果をあげている。また、骨髄移植後の肺
炎に対する治療効果は十分ではないものの、免疫グロブ
リン製剤との併用により有効性が向上するとの報告もあ
る（Bone Marrow Transplantation 9, 247-253, 199
2）。一方、ガンシクロビルには、好中球減少、血小板
減少および投与量により可逆性の中枢神経性障害を起こ
す等副作用も報告され（Ann. Intern. Med. 118, 173-1
78, 1993）、また同時に経済的見地からも適切なガンシ
クロビルの投与計画が検討される必要がある。したがっ
て、臨床の現場では移植患者における間質性肺炎、持続
性発熱等の諸症状の原因がサイトメガロウイルスである
のか、それとも他の細菌、ウイルスなのか、あるいは拒
絶反応に基づくものなのかを、いかに早期に確定診断し
得るかが重要な課題になってきている（Biotest Bullet
in 5, 63-72, 1993)。
ＭＶ」と表すことがある）感染症は、骨髄、腎、肝、心
移植および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等免疫抑
制下の患者において、極めて重篤かつ多様な合併症を引
き起こす。腎移植患者では、全体の４０〜７０％が活動
性ＣＭＶ感染症に罹患し、このうち１０〜２０％が間質
性肺炎、持続性発熱、胃腸炎などの臨床症状を呈する
（Transplant Int. 2, 147-164, 1989）。近年、こうし
た臨床症状をしめす活動性ＣＭＶ感染症の治療薬として
ガンシクロビル製剤の使用が認可され、網膜炎や腸炎に
対して著しい効果をあげている。また、骨髄移植後の肺
炎に対する治療効果は十分ではないものの、免疫グロブ
リン製剤との併用により有効性が向上するとの報告もあ
る（Bone Marrow Transplantation 9, 247-253, 199
2）。一方、ガンシクロビルには、好中球減少、血小板
減少および投与量により可逆性の中枢神経性障害を起こ
す等副作用も報告され（Ann. Intern. Med. 118, 173-1
78, 1993）、また同時に経済的見地からも適切なガンシ
クロビルの投与計画が検討される必要がある。したがっ
て、臨床の現場では移植患者における間質性肺炎、持続
性発熱等の諸症状の原因がサイトメガロウイルスである
のか、それとも他の細菌、ウイルスなのか、あるいは拒
絶反応に基づくものなのかを、いかに早期に確定診断し
得るかが重要な課題になってきている（Biotest Bullet
in 5, 63-72, 1993)。
【０００３】従来、ＣＭＶ感染症の診断には、ウイルス
分離、シェルバイアルアッセイ（ＳＶＡ）、グロブリン
クラス別抗体検査、ＰＣＲによるＤＮＡ診断等が行われ
てきた。１９８８年、Van der Bij らはＣＭＶ(AD169
株）感染繊維芽細胞を免疫原として作製したモノクロー
ナル抗体（C10, C11）が、腎移植患者白血球中に発現さ
れたサイトメガロウイルスLower matrix protein（lowe
r-matrix phosphoprotein）（以下「ｐｐ６５抗原」と
表すことがある）の検出に適していることを見いだし、
さらに、該抗原検査法が、ウイルス分離、酵素免疫測定
法（ELISA)による診断結果ならびに臨床症状とよく相関
することを報告した（J. Med. Virol. 25,179-188, 198
8、J. Infect. Dis. 166, 683-684, 1992）。以来、抗
ｐｐ６５抗体（C10 ,C11）を用いたＣＭＶ抗原検査法
は、活動性ＣＭＶ感染症の有用な指標として位置づけら
れるに至った（Transplantation 48, 991-995, 1989,
J. Infect. Dis 164, 265-270, J. Clin. Microbiol. 3
0, 2822-2825)。
分離、シェルバイアルアッセイ（ＳＶＡ）、グロブリン
クラス別抗体検査、ＰＣＲによるＤＮＡ診断等が行われ
てきた。１９８８年、Van der Bij らはＣＭＶ(AD169
株）感染繊維芽細胞を免疫原として作製したモノクロー
ナル抗体（C10, C11）が、腎移植患者白血球中に発現さ
れたサイトメガロウイルスLower matrix protein（lowe
r-matrix phosphoprotein）（以下「ｐｐ６５抗原」と
表すことがある）の検出に適していることを見いだし、
さらに、該抗原検査法が、ウイルス分離、酵素免疫測定
法（ELISA)による診断結果ならびに臨床症状とよく相関
することを報告した（J. Med. Virol. 25,179-188, 198
8、J. Infect. Dis. 166, 683-684, 1992）。以来、抗
ｐｐ６５抗体（C10 ,C11）を用いたＣＭＶ抗原検査法
は、活動性ＣＭＶ感染症の有用な指標として位置づけら
れるに至った（Transplantation 48, 991-995, 1989,
J. Infect. Dis 164, 265-270, J. Clin. Microbiol. 3
0, 2822-2825)。
【０００４】抗ｐｐ６５抗体（C10, C11）を用いたＣＭ
Ｖ抗原検査手法としては、分離した末梢血白血球をサイ
トスピンでスライドガラス上に固定した後、抗ｐｐ６５
抗体、標識化２次抗体の順に反応させ、酵素標識の場合
は発色反応の後に光学顕微鏡下で、蛍光標識の場合は蛍
光顕微鏡下で観察、判定する方法が一般的である。標識
化２次抗体としては、ペルオキシダーゼ（以下「ＰＯ
Ｄ」と表すことがある）標識化２次抗体や蛍光標識化２
次抗体が用いられてきた。しかしながら、ＰＯＤ標識で
は内因性ＰＯＤによる非特異染色が問題視され、蛍光標
識では、高価な蛍光顕微鏡やAnti-fading 試薬が必要で
ある。したがって、ＰＯＤ標識あるいは蛍光標識抗体を
用いたＣＭＶ抗原検査法は、臨床検査現場でのルーチン
検査法としては適当ではない。
Ｖ抗原検査手法としては、分離した末梢血白血球をサイ
トスピンでスライドガラス上に固定した後、抗ｐｐ６５
抗体、標識化２次抗体の順に反応させ、酵素標識の場合
は発色反応の後に光学顕微鏡下で、蛍光標識の場合は蛍
光顕微鏡下で観察、判定する方法が一般的である。標識
化２次抗体としては、ペルオキシダーゼ（以下「ＰＯ
Ｄ」と表すことがある）標識化２次抗体や蛍光標識化２
次抗体が用いられてきた。しかしながら、ＰＯＤ標識で
は内因性ＰＯＤによる非特異染色が問題視され、蛍光標
識では、高価な蛍光顕微鏡やAnti-fading 試薬が必要で
ある。したがって、ＰＯＤ標識あるいは蛍光標識抗体を
用いたＣＭＶ抗原検査法は、臨床検査現場でのルーチン
検査法としては適当ではない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、内因性のＰ
ＯＤ活性による非特異染色の影響を受けず、また蛍光顕
微鏡のような高価な機器を用いない、簡便で、正確かつ
容易に判定ができるＣＭＶ抗原検査法の提供を目的とし
てなされたものである。
ＯＤ活性による非特異染色の影響を受けず、また蛍光顕
微鏡のような高価な機器を用いない、簡便で、正確かつ
容易に判定ができるＣＭＶ抗原検査法の提供を目的とし
てなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の状況に鑑みて、本
発明者らは鋭意研究を行った結果、内因性のＰＯＤ活性
による非特異染色の影響を受けず、また蛍光顕微鏡のよ
うな高価な機器を用いない、簡便で、正確かつ容易に判
定ができるＣＭＶ抗原検査法として、１次または２次抗
体の標識物質として、アルカリホスファターゼ（以下Ａ
ＬＰと表す）を用いたＣＭＶ抗原検査法を確立するに至
った。さらに、このＣＭＶ抗原検査法を用いることによ
り活動性ＣＭＶ感染症を迅速かつ正確に捉えることが可
能となった。
発明者らは鋭意研究を行った結果、内因性のＰＯＤ活性
による非特異染色の影響を受けず、また蛍光顕微鏡のよ
うな高価な機器を用いない、簡便で、正確かつ容易に判
定ができるＣＭＶ抗原検査法として、１次または２次抗
体の標識物質として、アルカリホスファターゼ（以下Ａ
ＬＰと表す）を用いたＣＭＶ抗原検査法を確立するに至
った。さらに、このＣＭＶ抗原検査法を用いることによ
り活動性ＣＭＶ感染症を迅速かつ正確に捉えることが可
能となった。
【０００７】すなわち、本発明は、サイトメガロウイル
ス Lower matrix protein pp65を特異的に認識する抗体
（以下これを「抗ｐｐ６５抗体」と表すことがある）を
１次抗体として用いるサイトメガロウイルス抗原検査法
において、２次抗体としてＡＬＰ標識抗種特異イムノグ
ロブリン抗体を用いるか、あるいは１次抗体としてＡＬ
Ｐ標識抗ｐｐ６５抗体を用いるサイトメガロウイルス抗
原の検査法である。
ス Lower matrix protein pp65を特異的に認識する抗体
（以下これを「抗ｐｐ６５抗体」と表すことがある）を
１次抗体として用いるサイトメガロウイルス抗原検査法
において、２次抗体としてＡＬＰ標識抗種特異イムノグ
ロブリン抗体を用いるか、あるいは１次抗体としてＡＬ
Ｐ標識抗ｐｐ６５抗体を用いるサイトメガロウイルス抗
原の検査法である。
【０００８】本抗原検査で用いられる生体成分として
は、血液より分離した白血球、肺胞洗浄性（ＢＡＬ）、
鼻汁、喀痰、尿などであるが、一般的には血液から分離
した白血球が用いられる。白血球の分離は、既知のデキ
ストラン法や遠心法により実施できる。分離された白血
球は、サイトスピン法や吸着法によりスライドグラス上
に付着させることができる。このようにして作製された
検体スライドは、たとえば、アセトン、メタノール、ア
セトン／メタノールあるいはホルマリンを用いて固定
し、白血球の形態を損なうことなくスライドグラス上で
ｐｐ６５抗原を露出させることが可能である。もっとも
好ましい固定条件としては、アセトン／メタノール、−
２０〜４℃、３０秒〜１０分あるいは０．５〜５％ホル
マリン、４〜２５℃、３０秒〜２０分固定が挙げられ
る。
は、血液より分離した白血球、肺胞洗浄性（ＢＡＬ）、
鼻汁、喀痰、尿などであるが、一般的には血液から分離
した白血球が用いられる。白血球の分離は、既知のデキ
ストラン法や遠心法により実施できる。分離された白血
球は、サイトスピン法や吸着法によりスライドグラス上
に付着させることができる。このようにして作製された
検体スライドは、たとえば、アセトン、メタノール、ア
セトン／メタノールあるいはホルマリンを用いて固定
し、白血球の形態を損なうことなくスライドグラス上で
ｐｐ６５抗原を露出させることが可能である。もっとも
好ましい固定条件としては、アセトン／メタノール、−
２０〜４℃、３０秒〜１０分あるいは０．５〜５％ホル
マリン、４〜２５℃、３０秒〜２０分固定が挙げられ
る。
【０００９】本発明で、１次抗体として用いられる抗ｐ
ｐ６５抗体は、たとえば、Van derBij らの方法(J. Me
d. Viol. 25, 1988)により調製できる。得られた抗ｐｐ
６５抗体は精製することなくそのまま、あるいは既知の
精製方法、プロテインＡアフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグ
ラフィー、電気泳動などにより、精製して用いることが
出来る。免疫染色での非特異染色を防止するため、必要
に応じて抗体を（Ｆａｂ′)2あるいはＦａｂ′化して用
いても良い。得られた精製または未精製抗ｐｐ６５抗体
は、適当な緩衝液や生理食塩水で希釈して免疫染色に用
いることが出来る。用いられる緩衝液としてはトリス塩
酸緩衝液（以下ＴＢＳと表す）、マレイン酸緩衝液等が
挙げられる。上記抗体希釈液には、非特異染色を回避す
る目的で、ＢＳＡ、カゼイン、γ−グロブリン、各種動
物血清、例えば、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウサギ血清等を
ブロッキング剤として添加しても良い。また、Tween ２
０、TritonＸ−１００、ＮＰ−４０などの非イオン性、
陽イオン性また陰イオン性界面活性剤を添加しても良
い。
ｐ６５抗体は、たとえば、Van derBij らの方法(J. Me
d. Viol. 25, 1988)により調製できる。得られた抗ｐｐ
６５抗体は精製することなくそのまま、あるいは既知の
精製方法、プロテインＡアフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグ
ラフィー、電気泳動などにより、精製して用いることが
出来る。免疫染色での非特異染色を防止するため、必要
に応じて抗体を（Ｆａｂ′)2あるいはＦａｂ′化して用
いても良い。得られた精製または未精製抗ｐｐ６５抗体
は、適当な緩衝液や生理食塩水で希釈して免疫染色に用
いることが出来る。用いられる緩衝液としてはトリス塩
酸緩衝液（以下ＴＢＳと表す）、マレイン酸緩衝液等が
挙げられる。上記抗体希釈液には、非特異染色を回避す
る目的で、ＢＳＡ、カゼイン、γ−グロブリン、各種動
物血清、例えば、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウサギ血清等を
ブロッキング剤として添加しても良い。また、Tween ２
０、TritonＸ−１００、ＮＰ−４０などの非イオン性、
陽イオン性また陰イオン性界面活性剤を添加しても良
い。
【００１０】免疫染色はまず、スライド１枚当たり２０
〜１５０μl の抗ｐｐ６５抗体溶液を用い、４〜３７℃
で１０分〜４時間反応させる。反応後、検体スライドを
４℃〜室温で３０秒〜４０分洗浄して、ｐｐ６５抗原に
結合しない未反応抗体を除く。生理食塩水、ＴＢＳ、精
製水等が用いることの出来る洗浄液として挙げられる。
洗浄液には、Tween ２０、TritonＸ−１００、ＮＰ−４
０などの非イオン性、陽イオン性、または陰イオン性界
面活性剤を添加し、洗浄効率を向上し、またスライドの
乾燥防止をはかっても良い。次に、２次抗体としてＡＬ
Ｐで標識した１次抗体に対する抗体、そのカクテル抗体
又はその抗血清（抗種特異イムノグロブリン抗体）を反
応させる。例えば、１次抗体としてモノクローナル抗体
を用いた場合は抗マウスイムノグロブリン抗体（抗血
清）を、１次抗体としてウサギ抗血清を用いた場合には
抗ウサギイムノグロブリン抗体（抗血清）を用いる。Ａ
ＬＰ標識抗体、カクテル抗体、抗血清は、例えばアフィ
ニティークロマトグラフィーで精製した抗体に、ＡＬＰ
をグルタルアルデヒドを用いて結合させ、次にその溶液
をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、未反応の抗体と
ＡＬＰを除去することにより調製される。被標識抗体は
（Ｆａｂ′)2あるいはＦａｂ′化したものでもよい。こ
うして得られた本ＡＬＰ標識抗体、カクテル抗体、抗血
清は１次抗体同様、適当な緩衝液や生理食塩水で希釈し
て免疫染色に用いることが出来る。本２次抗体の反応条
件としては４〜３７℃、１０分〜４時間反応が挙げられ
る。
〜１５０μl の抗ｐｐ６５抗体溶液を用い、４〜３７℃
で１０分〜４時間反応させる。反応後、検体スライドを
４℃〜室温で３０秒〜４０分洗浄して、ｐｐ６５抗原に
結合しない未反応抗体を除く。生理食塩水、ＴＢＳ、精
製水等が用いることの出来る洗浄液として挙げられる。
洗浄液には、Tween ２０、TritonＸ−１００、ＮＰ−４
０などの非イオン性、陽イオン性、または陰イオン性界
面活性剤を添加し、洗浄効率を向上し、またスライドの
乾燥防止をはかっても良い。次に、２次抗体としてＡＬ
Ｐで標識した１次抗体に対する抗体、そのカクテル抗体
又はその抗血清（抗種特異イムノグロブリン抗体）を反
応させる。例えば、１次抗体としてモノクローナル抗体
を用いた場合は抗マウスイムノグロブリン抗体（抗血
清）を、１次抗体としてウサギ抗血清を用いた場合には
抗ウサギイムノグロブリン抗体（抗血清）を用いる。Ａ
ＬＰ標識抗体、カクテル抗体、抗血清は、例えばアフィ
ニティークロマトグラフィーで精製した抗体に、ＡＬＰ
をグルタルアルデヒドを用いて結合させ、次にその溶液
をゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、未反応の抗体と
ＡＬＰを除去することにより調製される。被標識抗体は
（Ｆａｂ′)2あるいはＦａｂ′化したものでもよい。こ
うして得られた本ＡＬＰ標識抗体、カクテル抗体、抗血
清は１次抗体同様、適当な緩衝液や生理食塩水で希釈し
て免疫染色に用いることが出来る。本２次抗体の反応条
件としては４〜３７℃、１０分〜４時間反応が挙げられ
る。
【００１１】また、上記に述べた１次抗体および２次抗
体を用いる２ステップ反応にかえて、ＡＬＰで標識した
抗ｐｐ６５抗体あるいは（Ｆａｂ′)2あるいはＦａｂ′
化した抗ｐｐ６５抗体を使用する１ステップ反応で免疫
染色することが出来る。上記ＡＬＰ標識抗体の調製法と
しては、例えば精製した抗ｐｐ６５抗体をＦａｂ′化
し、Ｆａｂ′ヒンジ部のチオール基とマレイミド化した
ＡＬＰを反応させる方法がある。マレイミド基の代わり
に、ピリジルジスルフィド基を導入しても良い。ＡＬＰ
標識化抗ｐｐ６５抗体は、適当な緩衝液や生理食塩水で
希釈して免疫染色に用いることが出来る。上記抗体希釈
液には、非特異染色を回避する目的で、ＢＳＡ、カゼイ
ン、γ−グロブリン、各種動物血清、例えば、ヤギ、ウ
マ、ヒツジ、ウサギ血清等をブロッキング剤として添加
しても良い。また、Tween ２０、TritonＸ−１００、Ｎ
Ｐ−４０などの非イオン性、陽イオン性また陰イオン性
界面活性剤を添加しても良い。反応条件としては、４〜
３７℃、１０分〜４時間反応が挙げられる。反応後、検
体スライドを洗浄して、未反応抗体を除く。洗浄液は、
生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、精製水等があげられ
る。洗浄液には、Tween２０、TritonＸ−１００、ＮＰ
−４０などの非イオン性、陽イオン性また陰イオン性界
面活性剤を添加してもよい。
体を用いる２ステップ反応にかえて、ＡＬＰで標識した
抗ｐｐ６５抗体あるいは（Ｆａｂ′)2あるいはＦａｂ′
化した抗ｐｐ６５抗体を使用する１ステップ反応で免疫
染色することが出来る。上記ＡＬＰ標識抗体の調製法と
しては、例えば精製した抗ｐｐ６５抗体をＦａｂ′化
し、Ｆａｂ′ヒンジ部のチオール基とマレイミド化した
ＡＬＰを反応させる方法がある。マレイミド基の代わり
に、ピリジルジスルフィド基を導入しても良い。ＡＬＰ
標識化抗ｐｐ６５抗体は、適当な緩衝液や生理食塩水で
希釈して免疫染色に用いることが出来る。上記抗体希釈
液には、非特異染色を回避する目的で、ＢＳＡ、カゼイ
ン、γ−グロブリン、各種動物血清、例えば、ヤギ、ウ
マ、ヒツジ、ウサギ血清等をブロッキング剤として添加
しても良い。また、Tween ２０、TritonＸ−１００、Ｎ
Ｐ−４０などの非イオン性、陽イオン性また陰イオン性
界面活性剤を添加しても良い。反応条件としては、４〜
３７℃、１０分〜４時間反応が挙げられる。反応後、検
体スライドを洗浄して、未反応抗体を除く。洗浄液は、
生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、精製水等があげられ
る。洗浄液には、Tween２０、TritonＸ−１００、ＮＰ
−４０などの非イオン性、陽イオン性また陰イオン性界
面活性剤を添加してもよい。
【００１２】次にＡＬＰの基質を加え発色反応を行う。
基質としては、一般に免疫染色で用いられるＡＬＰ用基
質であればどの様なものでもよく、例えば、ニューフク
シン発色基質、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファーストレッド発
色基質などがあげられる。ニューフクシン発色基質を用
いると、長期間退色しないため好ましく、この時の条件
としては４〜３７℃、１０分〜１時間反応が挙げられ
る。発色反応後、観察を容易にするために、ヘマトキシ
リンで対比染色を行っても良い。ＨＳＲ液、ゼラチン等
の封入剤を用いて封入し、染色されたｐｐ６５抗原を持
つ白血球を光学顕微鏡で観察しカウントすることが出来
る。
基質としては、一般に免疫染色で用いられるＡＬＰ用基
質であればどの様なものでもよく、例えば、ニューフク
シン発色基質、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファーストレッド発
色基質などがあげられる。ニューフクシン発色基質を用
いると、長期間退色しないため好ましく、この時の条件
としては４〜３７℃、１０分〜１時間反応が挙げられ
る。発色反応後、観察を容易にするために、ヘマトキシ
リンで対比染色を行っても良い。ＨＳＲ液、ゼラチン等
の封入剤を用いて封入し、染色されたｐｐ６５抗原を持
つ白血球を光学顕微鏡で観察しカウントすることが出来
る。
【００１３】上記免疫染色はまた、用手法の他、市販の
免疫染色装置を用いて半自動または自動で行うことが出
来る。この場合は、用いる１次抗体、２次抗体量を適当
に調節するとよい。
免疫染色装置を用いて半自動または自動で行うことが出
来る。この場合は、用いる１次抗体、２次抗体量を適当
に調節するとよい。
【００１４】なお、本明細書中で用いられる略号は、以
下の通りである。 ＰＣＲ：ポリメラーゼチェインリアクション、ＰＢＳ：
食塩添加リン酸緩衝液、ＴＢＳ：食塩添加トリス緩衝
液、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ：
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェイ
ト／ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン４酢酸、Ｐ
ＮＰＰ：ｐ−ニトロフェニルリン酸
下の通りである。 ＰＣＲ：ポリメラーゼチェインリアクション、ＰＢＳ：
食塩添加リン酸緩衝液、ＴＢＳ：食塩添加トリス緩衝
液、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ：
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェイ
ト／ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン４酢酸、Ｐ
ＮＰＰ：ｐ−ニトロフェニルリン酸
【００１５】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の具体
的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の
範囲を何ら制限するものではない。
明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の具体
的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の
範囲を何ら制限するものではない。
【００１６】〔実施例１〕 （１）白血球の分離と検体スライドの作製 ＥＤＴＡ採血した、活動性ＣＭＶ感染骨髄移植患者末梢
血４mlに５％デキストラン−ＰＢＳ １mlを添加し、３
７℃、１５分間保温した。上清を２００×ｇ、室温、８
分間遠心したのち、沈渣に溶血試薬（０．８３％ＮＨ4
Ｃｌ、０．１％ＫＨＣＯ3 、０．００３７％ＥＤＴＡ・
２Ｎａ）３mlを加えて懸濁し、氷上で５分間反応させ
た。生理食塩水３mlを加えて反応を停止させたのち、遠
心、生理食塩水洗浄を３回繰り返し、最終的に白血球濃
度を１．５×１０6 個/ml に調整した。同懸濁液１００
μl をサイトスピン（Shandon 社製）し（５５０rpm 、
５分）、検体スライドを作製した。室温で３０分間、風
乾したのち、冷アセトン／メタノ−ル（１：１）で９０
秒固定し、室温で１晩風乾した。
血４mlに５％デキストラン−ＰＢＳ １mlを添加し、３
７℃、１５分間保温した。上清を２００×ｇ、室温、８
分間遠心したのち、沈渣に溶血試薬（０．８３％ＮＨ4
Ｃｌ、０．１％ＫＨＣＯ3 、０．００３７％ＥＤＴＡ・
２Ｎａ）３mlを加えて懸濁し、氷上で５分間反応させ
た。生理食塩水３mlを加えて反応を停止させたのち、遠
心、生理食塩水洗浄を３回繰り返し、最終的に白血球濃
度を１．５×１０6 個/ml に調整した。同懸濁液１００
μl をサイトスピン（Shandon 社製）し（５５０rpm 、
５分）、検体スライドを作製した。室温で３０分間、風
乾したのち、冷アセトン／メタノ−ル（１：１）で９０
秒固定し、室温で１晩風乾した。
【００１７】（２）免疫染色 固定した検体スライドを０．０１％Tween ２０含有生理
食塩水（以下「ＳＴ」と表す）に２分間浸したのち、Cl
onabＣＭＶ（Biotest 、抗ｐｐ６５抗体−C10,C11カク
テル）溶液５０μl を加え、室温、１時間反応させた。
ＳＴで２回洗浄後、ＡＬＰ標識抗マウスイムノグロブリ
ン抗体溶液５０μl を加え、室温で１時間反応させた。
ＳＴで２回洗浄後、ニューフクシン基質システムを用い
て発色させた（室温、１５分）。ヘマトキシリンで対比
染色し、ＨＳＲ液（ミドリ十字社製）で封入した。光学
顕微鏡下で、核が赤〜赤紫色に染色された特徴的な陽性
細胞が白血球１．５×１０5 個あたり２４３個認められ
た。
食塩水（以下「ＳＴ」と表す）に２分間浸したのち、Cl
onabＣＭＶ（Biotest 、抗ｐｐ６５抗体−C10,C11カク
テル）溶液５０μl を加え、室温、１時間反応させた。
ＳＴで２回洗浄後、ＡＬＰ標識抗マウスイムノグロブリ
ン抗体溶液５０μl を加え、室温で１時間反応させた。
ＳＴで２回洗浄後、ニューフクシン基質システムを用い
て発色させた（室温、１５分）。ヘマトキシリンで対比
染色し、ＨＳＲ液（ミドリ十字社製）で封入した。光学
顕微鏡下で、核が赤〜赤紫色に染色された特徴的な陽性
細胞が白血球１．５×１０5 個あたり２４３個認められ
た。
【００１８】〔実施例２〕 （１）白血球の分離と検体スライドの作製 ＥＤＴＡ採血した、活動性ＣＭＶ感染骨髄移植患者末梢
血４mlに５％デキストラン−ＰＢＳ １mlを添加し、３
７℃、１５分間保温した。上清を２００×ｇ、室温、８
分間遠心したのち、沈渣に溶血試薬（０．８３％ＮＨ4
Ｃｌ、０．１％ＫＨＣＯ3 、０．００３７％ＥＤＴＡ・
２Ｎａ）３mlを加えて懸濁し、氷上で５分間反応させ
た。生理食塩水３mlを加えて反応を停止させたのち、遠
心、生理食塩水洗浄を３回繰り返し、最終的に白血球濃
度を１．５×１０6 個/ml に調整した。同懸濁液１００
μl をサイトスピン（Shandon 社製）し（５５０rpm 、
５分）、スライド標本を作製した。室温で３０分間風乾
したのち、１％ホルマリン２％シュクロースを含むＰＢ
Ｓで１０分固定し、１％牛胎児血清を含むＰＢＳで４回
洗浄した。０．５％ＮＰ−４０、１０％シュクロース、
１％牛胎児血清を含むＰＢＳで更に洗浄を行った後、１
％牛胎児血清を含むＰＢＳで４回洗浄し、最後に精製水
で１５秒洗浄し、室温で１時間風乾した。
血４mlに５％デキストラン−ＰＢＳ １mlを添加し、３
７℃、１５分間保温した。上清を２００×ｇ、室温、８
分間遠心したのち、沈渣に溶血試薬（０．８３％ＮＨ4
Ｃｌ、０．１％ＫＨＣＯ3 、０．００３７％ＥＤＴＡ・
２Ｎａ）３mlを加えて懸濁し、氷上で５分間反応させ
た。生理食塩水３mlを加えて反応を停止させたのち、遠
心、生理食塩水洗浄を３回繰り返し、最終的に白血球濃
度を１．５×１０6 個/ml に調整した。同懸濁液１００
μl をサイトスピン（Shandon 社製）し（５５０rpm 、
５分）、スライド標本を作製した。室温で３０分間風乾
したのち、１％ホルマリン２％シュクロースを含むＰＢ
Ｓで１０分固定し、１％牛胎児血清を含むＰＢＳで４回
洗浄した。０．５％ＮＰ−４０、１０％シュクロース、
１％牛胎児血清を含むＰＢＳで更に洗浄を行った後、１
％牛胎児血清を含むＰＢＳで４回洗浄し、最後に精製水
で１５秒洗浄し、室温で１時間風乾した。
【００１９】（２）免疫染色 実施例１の（２）と同様に検体スライドを免疫染色し、
光学顕微鏡下で観察した結果、白血球１．５×１０5 個
あたり２５０個の陽性細胞を認めた。
光学顕微鏡下で観察した結果、白血球１．５×１０5 個
あたり２５０個の陽性細胞を認めた。
【００２０】〔実施例３〕 （１）ＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗体Ｆａｂ′の調製 １）抗ｐｐ６５抗体（Ｆａｂ′)2の調製 抗ｐｐ６５抗体を含む培養上清４０mlに結合用緩衝液４
０mlを加え、予め平衡化しておいたプロテインＡカラム
（東ソー社製）にアプライし、つぎに結合用緩衝液で洗
浄した。溶出用緩衝液を流し、溶出液を分取した。Ultr
acent ３０で濃縮後、１×ＰＢＳで置換し、１／５０量
の５％アジ化ナトリウムを加え、４℃で保存した（収量
１．１２mg）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で精製純度
を確認した。つぎに、精製した抗体を３７℃、２４時間
ペプシン消化し、反応の終了をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ヘビ
ーチェイン相当バンドの消失）で確認した。Superose１
２でゲルろ過して抗体フラクションを回収し、Ultracen
t ３０で濃縮後，５mMＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナ
トリウム緩衝液（pH６）で置換した（収量５９３μg)。
０mlを加え、予め平衡化しておいたプロテインＡカラム
（東ソー社製）にアプライし、つぎに結合用緩衝液で洗
浄した。溶出用緩衝液を流し、溶出液を分取した。Ultr
acent ３０で濃縮後、１×ＰＢＳで置換し、１／５０量
の５％アジ化ナトリウムを加え、４℃で保存した（収量
１．１２mg）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で精製純度
を確認した。つぎに、精製した抗体を３７℃、２４時間
ペプシン消化し、反応の終了をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ヘビ
ーチェイン相当バンドの消失）で確認した。Superose１
２でゲルろ過して抗体フラクションを回収し、Ultracen
t ３０で濃縮後，５mMＥＤＴＡを含む０．１M リン酸ナ
トリウム緩衝液（pH６）で置換した（収量５９３μg)。
【００２１】２）抗ｐｐ６５抗体Ｆａｂ′の調製 抗ｐｐ６５抗体（Ｆａｂ′)2６２０μl に、０．１M ２
−メルカプトエチルアミン溶液（５mMＥＤＴＡ含有０．
１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６））（以下「ＭＥ
Ａ」と表す）６８μl を加え、３７℃、９０分、還元反
応を行った。Superose１２でゲルろ過して精製した後、
Ultracent ３０で濃縮した（収量４１５μg)。
−メルカプトエチルアミン溶液（５mMＥＤＴＡ含有０．
１M リン酸ナトリウム緩衝液（pH６））（以下「ＭＥ
Ａ」と表す）６８μl を加え、３７℃、９０分、還元反
応を行った。Superose１２でゲルろ過して精製した後、
Ultracent ３０で濃縮した（収量４１５μg)。
【００２２】３）マレイミド化ＡＬＰの調製 ＡＬＰ（１０mg/ml)０．５mlを予め平衡化しておいたＮ
ＡＰ５（ファルマシア）にアプライし、つづいて溶出液
を１ml加えて、溶出画分１mlを氷上で回収した。Ｓｕｌ
ｆｏ−ＳＭＣＣ（ピアス社製）２mgを加え、３０℃、２
時間マレイミド化反応を行った。Superose１２でゲルろ
過して、未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去した（収
量４．４mg）。
ＡＰ５（ファルマシア）にアプライし、つづいて溶出液
を１ml加えて、溶出画分１mlを氷上で回収した。Ｓｕｌ
ｆｏ−ＳＭＣＣ（ピアス社製）２mgを加え、３０℃、２
時間マレイミド化反応を行った。Superose１２でゲルろ
過して、未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去した（収
量４．４mg）。
【００２３】４）ＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗体Ｆａｂ′
の調製 抗ｐｐ６５抗体Ｆａｂ′（１．４１mg/ml)１４０μl に
マレイミド化ＡＬＰ（１１．９mg/ml)１４０μl を加
え、４℃で３日間反応させた。１０mMＭＥＡを加えて反
応を停止させた。目的とするＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗
体Ｆａｂ′の生成はポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よびウエスタンブロッティング法により確認した。上記
反応液２８０μl をSuperose１２でゲルろ過して精製
し、Ultracent ３０で濃縮、緩衝液を１×ＴＢＳ（pH
７．６）に置換した。ついで、１mM塩化マグネシウム、
０．１mM塩化亜鉛含有０．１M トリス緩衝液（pH７）で
平衡化したウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ
社製）固定化ＣＨセファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）にアプライし、同緩衝液（pH９．５）で溶出する画
分を分取した（回収量１．５ml）。目的とする標識化抗
体の溶出は、ＰＮＰＰを基質とするＡＬＰ活性測定によ
り確認した。最後に、Ultracent ３０で濃縮、緩衝液を
１×ＴＢＳに交換し、４℃で保存した（収量２０８μ
g)。
の調製 抗ｐｐ６５抗体Ｆａｂ′（１．４１mg/ml)１４０μl に
マレイミド化ＡＬＰ（１１．９mg/ml)１４０μl を加
え、４℃で３日間反応させた。１０mMＭＥＡを加えて反
応を停止させた。目的とするＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗
体Ｆａｂ′の生成はポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よびウエスタンブロッティング法により確認した。上記
反応液２８０μl をSuperose１２でゲルろ過して精製
し、Ultracent ３０で濃縮、緩衝液を１×ＴＢＳ（pH
７．６）に置換した。ついで、１mM塩化マグネシウム、
０．１mM塩化亜鉛含有０．１M トリス緩衝液（pH７）で
平衡化したウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ
社製）固定化ＣＨセファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）にアプライし、同緩衝液（pH９．５）で溶出する画
分を分取した（回収量１．５ml）。目的とする標識化抗
体の溶出は、ＰＮＰＰを基質とするＡＬＰ活性測定によ
り確認した。最後に、Ultracent ３０で濃縮、緩衝液を
１×ＴＢＳに交換し、４℃で保存した（収量２０８μ
g)。
【００２４】（２）ＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗体Ｆａ
ｂ′の性能評価 上記（１）で調製したＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗体Ｆａ
ｂ′を１％ヒト血清を含む１×ＴＢＳで希釈して、１０
μg/mlに調整した。陽性コントロールスライド、陰性コ
ントロールスライドおよび活動性ＣＭＶ感染症を発症し
た骨髄移植患者検体より調製した検体スライドに、希釈
ＡＬＰ標識化抗体液５０μl を添加し、室温で１時間反
応させた。ＳＴで２回洗浄後、ニューフクシン発色液５
０μl を添加し、室温で１５分発色反応をさせた。ＳＴ
で２回洗浄後、ヘマトキシリン溶液５０μl を加え、室
温で３分反応させた。精製水で２回洗浄し、風乾後、Ｈ
ＳＲ液（ミドリ十字社製）を用いて封入した。光学顕微
鏡下で、赤〜赤紫色の特徴的な核染色像を示す陽性細胞
数を数え、白血球１．５×１０5 あたりの陽性細胞数で
あらわした。
ｂ′の性能評価 上記（１）で調製したＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗体Ｆａ
ｂ′を１％ヒト血清を含む１×ＴＢＳで希釈して、１０
μg/mlに調整した。陽性コントロールスライド、陰性コ
ントロールスライドおよび活動性ＣＭＶ感染症を発症し
た骨髄移植患者検体より調製した検体スライドに、希釈
ＡＬＰ標識化抗体液５０μl を添加し、室温で１時間反
応させた。ＳＴで２回洗浄後、ニューフクシン発色液５
０μl を添加し、室温で１５分発色反応をさせた。ＳＴ
で２回洗浄後、ヘマトキシリン溶液５０μl を加え、室
温で３分反応させた。精製水で２回洗浄し、風乾後、Ｈ
ＳＲ液（ミドリ十字社製）を用いて封入した。光学顕微
鏡下で、赤〜赤紫色の特徴的な核染色像を示す陽性細胞
数を数え、白血球１．５×１０5 あたりの陽性細胞数で
あらわした。
【００２５】
【表１】
【００２６】〔実施例４〕 骨髄移植患者におけるＣＭＶ感染症のモニタリング 慢性骨髄性白血病のため骨髄移植が施行された患者より
採血された、移植後３５日から１２５日目までのＥＤＴ
Ａ血を用い、実施例１の方法に基づきＣＭＶ抗原検査を
実施した。その結果、移植後４９日目に白血球４．５×
１０5 個あたり１個の陽性細胞を認め、６３日目に７３
０個の陽性細胞を認めたのをピークに減少し、８４日目
に陰性化した。ＰＣＲ法によるＤＮＡ検査は、移植後４
９日目に陽転し、１１２日目に陰性化した（図２）。
採血された、移植後３５日から１２５日目までのＥＤＴ
Ａ血を用い、実施例１の方法に基づきＣＭＶ抗原検査を
実施した。その結果、移植後４９日目に白血球４．５×
１０5 個あたり１個の陽性細胞を認め、６３日目に７３
０個の陽性細胞を認めたのをピークに減少し、８４日目
に陰性化した。ＰＣＲ法によるＤＮＡ検査は、移植後４
９日目に陽転し、１１２日目に陰性化した（図２）。
【００２７】
【発明の効果】本発明のサイトメガロウイルス抗原検査
法を用いれば、非特異染色の影響を受けずに、正確かつ
迅速な検査を行うことができる。このサイトメガロウイ
ルス抗原検査法の確立により、サイトメガロウイルス感
染症に対する有用な診断試験法を提供し、またこの陽性
細胞数を追跡することにより活動性サイトメガロウイル
ス感染症治療のモニタリングが可能になった。
法を用いれば、非特異染色の影響を受けずに、正確かつ
迅速な検査を行うことができる。このサイトメガロウイ
ルス抗原検査法の確立により、サイトメガロウイルス感
染症に対する有用な診断試験法を提供し、またこの陽性
細胞数を追跡することにより活動性サイトメガロウイル
ス感染症治療のモニタリングが可能になった。
【図１】１次抗体として、抗ｐｐ６５抗体を、２次抗体
としてＡＬＰ標識化抗種特異イムノグロブリン抗体を用
いる２ステップ法によるＣＭＶ抗原検査法を表す。
としてＡＬＰ標識化抗種特異イムノグロブリン抗体を用
いる２ステップ法によるＣＭＶ抗原検査法を表す。
【図２】１次抗体として、ＡＬＰ標識化抗ｐｐ６５抗体
を用いる１ステップ法によるＣＭＶ抗原検査法を表す。
を用いる１ステップ法によるＣＭＶ抗原検査法を表す。
【図３】骨髄移植患者におけるＣＭＶ抗原検査およびＰ
ＣＲの結果を表す。
ＣＲの結果を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅井 隆善 千葉県千葉市中央区亥鼻１丁目８番１号 千葉大学医学部附属病院輸血部内 (56)参考文献 特開 昭60−252498（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−115060（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−22100（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−96861（ＪＰ，Ａ) 峰松俊夫ほか，抗サイトメガロウイル ス・ヒトモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ ’）２分画を用いた直接免疫ペルオシキ ダーゼ・・・，感染症学雑誌，日本, 1994年10月20日，68／10，1278−1284
Claims (1)
- 【請求項１】 血液から白血球を分離し、固定し、次
に、 （１）当該白血球に、サイトメガロウイルスLower matr
ix protein pp65を特異的に認識する抗体（抗ｐｐ６５
抗体）を反応させ、次いで当該抗体に対するアルカリホ
スファターゼ標識抗体を反応させて免疫染色するか、又
は （２）当該白血球に、アルカリホスファターゼで標識し
た抗ｐｐ６５抗体、又はその（Ｆａｂ′)2化物若しくは
Ｆａｂ′化物を反応させて免疫染色することを特徴とす
るサイトメガロウイルス抗原の検査法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12807295A JP3241237B2 (ja) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | サイトメガロウイルス抗原検査法 |
| US08/577,248 US5763161A (en) | 1995-05-26 | 1995-12-22 | Assay method of testing for the presence of cytomegalovirus antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12807295A JP3241237B2 (ja) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | サイトメガロウイルス抗原検査法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08320323A JPH08320323A (ja) | 1996-12-03 |
| JP3241237B2 true JP3241237B2 (ja) | 2001-12-25 |
Family
ID=14975759
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12807295A Expired - Fee Related JP3241237B2 (ja) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | サイトメガロウイルス抗原検査法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5763161A (ja) |
| JP (1) | JP3241237B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6569616B1 (en) | 1999-07-29 | 2003-05-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Human cytomegalovirus glycoprotein O as a new drug target and subunit vaccine candidate |
| CN1307423C (zh) * | 2005-01-08 | 2007-03-28 | 王明丽 | 重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒 |
| EP3232195B1 (en) * | 2014-12-12 | 2020-04-29 | Konica Minolta, Inc. | Diluent for fluorescent nano particles, kit for immunofluorescent staining which utilizes same, solution for immunofluorescent staining, immunofluorescent staining method, and gene staining method |
-
1995
- 1995-05-26 JP JP12807295A patent/JP3241237B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-22 US US08/577,248 patent/US5763161A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 峰松俊夫ほか，抗サイトメガロウイルス・ヒトモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）２分画を用いた直接免疫ペルオシキダーゼ・・・，感染症学雑誌，日本，１９９４年１０月２０日，６８／１０，１２７８−１２８４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08320323A (ja) | 1996-12-03 |
| US5763161A (en) | 1998-06-09 |
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