RU2112245C1 - Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины рифт в сыворотках животных - Google Patents
Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины рифт в сыворотках животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2112245C1 RU2112245C1 RU96112671A RU96112671A RU2112245C1 RU 2112245 C1 RU2112245 C1 RU 2112245C1 RU 96112671 A RU96112671 A RU 96112671A RU 96112671 A RU96112671 A RU 96112671A RU 2112245 C1 RU2112245 C1 RU 2112245C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biotin
- streptavidin
- galactosidase
- fever virus
- valley fever
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/12011—Bunyaviridae
- C12N2760/12211—Phlebovirus, e.g. Rift Valley fever virus
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области вирусологии и предназначено для лабораторной диагностики ЛДР. Способ позволяет обнаружить антитела к вирусу в сыворотках овец путем сорбции специфического антитела на полистирол микротитрационных пластинах. Для диагностики применяют комплекс, включающий антиовечий IgY-биотин+стрептавидин+биотин-β-галактозидазу при соотношении стрептавидин и биотинилированного фермента 2 : 1 или 1 : 1 соответственно. При этом чувствительность реакции повышается в 125 - 625 раз. Набор включает емкости, содержащие специфический антиген; контрольную и специфическую сыворотки; конъюгаты: антиовечий IgY-биотин, биотин-β-галактозидазу; стрептавидин. 2 с. п. ф-лы, 2 табл.
Description
Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины Рифт в сыворотках животных.
Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу и набору для обнаружения антител (AT) к вирусу лихорадки долины Рифт (ЛДР) и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и предприятиях биологической промышленности для наработки наборов.
Известно использование иммуноферментного метода (ИФМ) для обнаружения AT (Iahrling P.B. et al., 1985, Ionan A. et al., 1989, Morvan I. et al., 1991).
В доступной литературе не встречали использование авидин-биотинового комплекса для обнаружения AT к вирусу ЛДР. Предложенный Iahrling P.B. et al. (1985) ИФМ для обнаружения AT предусматривает сорбцию на полистирол микротитрационных пластин специфических IgG и только после этого специфический антиген (АГ), вслед за которым поэтапно сорбируют исследуемые образцы сывороток и антивидовые IgG, меченные щелочной фосфатазой.
Цель изобретения - повышение чувствительности способа и набора для обнаружения AT к вирусу ЛДР в сыворотках крови овец.
Предлагаемый способ позволяет обнаруживать AT к вирусу ЛДР в сыворотках крови путем применения комплекса: антиовечьи IgG + стрептавидин + биотин-бета-галактозидаза при соотношении стрептавидина и биотинилированного фермента 2 мкг/мл соответственно, благодаря этому чувствительность реакции повышается в 125-625 раз.
Предлагаемый набор включает емкости, содержащие специфический антиген; контрольную и специфическую сыворотки; конъюгаты: антиовечий IgG-биотин, биотин-бета-галактозидазу; стрептавидин.
Пример конкретного выполнения. Для обнаружения специфических AT к вирусу ЛДР отбирают исследуемые образцы крови (сывороток) овец. Сенсибилизацию пластин (планшетов) специфическим АГ осуществляют внесением его рабочей дозы в лунки микротитрационных пластин и инкубацией при +37oC в течение 2 ч или 18 ч при +4oC.
Контрольные сыворотки (отрицательные и положительные), исследуемые образцы сывороток вносят в лунки микротитрационных пластин, предварительно сенсибилизированные рабочей дозой АГ и отмытые 0,1 М фосфатно-буферным раствором pH 7,4, с 0,05%-ным твин-20 инкубируют при -37oC 1-2 ч или при температуре +4oC в течение ночи, далее ведут этапы сорбции при +37oC по 60 мин антиовечьего биотинилированного IgG и стрептавидина+биотин-бета-галактозидазы с отмывкой лунок пластин от несвязавшихся препаратов между этапами. Оптимальное соотношение количеств стрептавидина и биотинилированной бета-галактозидазы подбирают эмпирически (табл. 1). Данные табл. 1 показывают, что минимальные количества стрептавидина и биотинилированной бета-галактозидазы, позволяющие достичь максимальной чувствительности метода при минимальном фоне, равны 2:1 или 1:1 соответственно.
Реакция по обнаружению AT заканчивается внесением в лунки пластин хромогенного субстрата ортонитрофенил-бета-Д-галактопиранозида (ОНФГ) или флуорогенного субстрата 4-метилумбеллиферил-бета-Д-галактопиранозида (4-МУГ) и учетом реакции через 30 мин визуально или автоматически.
Проведена сравнительная оценка результатов тестирования сывороток овец ИФМ на основе стрептавидин-биотинового комплекса (СБК) и известного ранее метода ингибирования (табл. 2). Данные табл. 2 показывают, что предлагаемый метод в 125-625 раз чувствительнее метода ингибирования.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность метода в 125-625 раз и может быть промышленно применен.
При конструировании набора нарабатывают следующие диагностические препараты.
Специфический антиген (АГ) получают на перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС). Сформировавшийся монослой клеток заражают традиционным методом, разведение 10 - 3 - 10 - 4. Спустя 48-72 ч после заражения, когда цитопатогенный эффект достигает 80%, вирусную суспензию замораживают (-60oC). Далее оттаивают и осветляют от обломков клеток, подвергают дифференциальному центрифугированию, 100-кратному концентрированию и инактивации бета-пропиолактоном.
Специфическую сыворотку получают из крови овец, иммунизированных вакцинным штаммом вируса ЛДР.
Контрольную сыворотку получают из крови клинически здоровой овцы.
Антивидовой IgG-биотин получают путем конъюгирования (смешивания) антиовечьих иммуноглобулинов (IgG), выделенных путем трехкратного высаливания сульфатом аммония гамма-фракции глобулинов из гипериммунной антиовечьей, сыворотки и последующей гель-фильрацией на ультрагеле АсА-34, и биотин-N-гидроксисукцинимид эфира в соотношении 67:1.
Конъюгат биотин-бета-галактозидаза получают путем конъюгирования (сшивки) фермента бета-галактозидаза (из E.coli) активностью большей или равной 600 ед/мг и биотин-N-гидриксисукцинимид эфира в соотношении 8:1.
Биотинилированные конъюгаты получают в течение 4 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После этого конъюгаты диализуют против 0,1М ФБР pH 7,2, добавляют консервант, стабилизатор.
Стрептавидин коммерческий (Streptomyces avidinii) с биотин-связывающей активностью А ≥ 15,7 ед/мг белка.
Конъюгаты антивидовые IgG-биотин, биотин-бета-галактозидаза и стрептавидин входят в состав стрептавидин биотинового комплекса.
Наработанные диагностические препараты фасуют в ампулы по 0,5 мл, лиофилизируют.
Предлагаемый набор укомплектован шестью емкостями и может быть промышленно применен в необходимых случаях.
Claims (2)
1. Способ обнаружения антител к вирусу лихорадки долины Рифт в сыворотках животных, включающий постановку реакции и учет твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что проводят твердофазный иммуноферментный анализ на основе стрептавидин-биотинового комплекса, исследуемые сыворотки овец вносят в лунки микротитрационных пластин, предварительно сенсибилизированные рабочей дозой специфического антигена, и сорбируют, далее инкубацию проводят с конъюгатами в виде стрептавидинбиотинового комплекса, включающего антиовечьи IgG - биотин + стрептавидин + биотин-β-галактозидазу в соотношении стрептавидина и биотин-β-галактозидазы 2 : 1 или 1 : 1.
2. Набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины Рифт, содержащий специфический антиген вируса лихорадки долины Рифт, контрольную сыворотку от клинически здоровой овцы, специфическую сыворотку к вирусу ЛДР, глобулиновый конъюгат, отличающийся тем, что набор содержит конъюгат в виде комплекса антиовечьего биотинилированного IgG, стрептавидина и биотинилированной β-галактозидазы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96112671A RU2112245C1 (ru) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины рифт в сыворотках животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96112671A RU2112245C1 (ru) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины рифт в сыворотках животных |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2112245C1 true RU2112245C1 (ru) | 1998-05-27 |
| RU96112671A RU96112671A (ru) | 1998-09-20 |
Family
ID=20182330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96112671A RU2112245C1 (ru) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины рифт в сыворотках животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2112245C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2457255C2 (ru) * | 2010-06-01 | 2012-07-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | Синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа |
| CN107478838A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-15 | 贵州省人民医院 | 一种检测人及动物血清抗rvf病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
-
1996
- 1996-06-21 RU RU96112671A patent/RU2112245C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Morvan et al. Rift Valley fever on the east coast of Madagascar. Res. Virol. 1991, v. 142, N 6, p. 475 - 482. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2457255C2 (ru) * | 2010-06-01 | 2012-07-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | Синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа |
| CN107478838A (zh) * | 2017-09-25 | 2017-12-15 | 贵州省人民医院 | 一种检测人及动物血清抗rvf病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Salonen et al. | Rheumatoid factor in acute viral infections: interference with determination of IgM, IgG, and IgA antibodies in an enzyme immunoassay | |
| US4347311A (en) | Enzyme immunoassay for determining antigen specific antibodies and test kit for carrying out this assay | |
| US4322495A (en) | Immunoassay | |
| US4434227A (en) | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies | |
| US4588680A (en) | Assay for viruses | |
| JP2001505778A (ja) | ＨＩＶ感染の初期の検出のための未変性の（ｎｏｎ―ｄｅｎｔｕｒｅｄ）ＨＩＶ抗原を使用する新規のＥＩＡ試験 | |
| EP0248534A3 (en) | Method of detecting aids virus infection | |
| Wardley et al. | A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay for the detection of African swine fever virus antigen and antibody | |
| Collins et al. | A competition ELISA for the detection of antibodies to rabbit haemorrhagic disease virus | |
| US4753893A (en) | Method and article for detection of immune complexes | |
| RU2112245C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения антител к вирусу лихорадки долины рифт в сыворотках животных | |
| US20080206790A1 (en) | Assay for determining the presence or amount of newly synthesized antibodies | |
| JPH0743384B2 (ja) | アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 | |
| US4382076A (en) | Hepatitis A antibody assay | |
| US5856202A (en) | Method for determining antistreptolysin O antibody | |
| US6872396B2 (en) | Specificity in the detection of anti-rubella IGM antibodies | |
| JPH09127114A (ja) | 免疫学的測定用安定化ＩｇＭ試薬 | |
| JP3487642B2 (ja) | Ｈａｖ抗原及びその抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法 | |
| WO1990010232A1 (en) | Composition containing labeled streptococcal antibody, test kit and assay using same | |
| RU2122210C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения вируса лихорадки долины рифт в биологическом материале | |
| CN115627264B (zh) | 一种抗马尔尼菲甘露聚糖蛋白杂交瘤细胞株及其应用 | |
| WO1995034812A1 (fr) | Procede de dosage d'un anticorps d'une immunoglobuline m specifique et reactif approprie | |
| US7026133B2 (en) | Method and composition for the diagnosis of equine infectious anemia virus disease by using the recombinant capsid protein virus (p26) | |
| US5763161A (en) | Assay method of testing for the presence of cytomegalovirus antigen | |
| AU645970B2 (en) | A method for the determination of antibodies against organisms causing infectious diseases in body fluids, agents for this purpose and the use thereof in this method |