CN110066801B - 一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法,属于遗传工程领域。本发明以pHT质粒为载体,在枯草芽孢杆菌中,PydjO启动子表达转录调控蛋白NanR,进一步在强启动子Pveg中整合NanR识别结合序列,并关联绿色荧光蛋白GFP,在发酵培养基中添加唾液酸进行发酵验证,成功构建枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件,使其诱导表达强度达到4000a.u.,在不添加唾液酸的情况下,泄漏量为10%,为进一步优化枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法,属于遗传工程领域。
背景技术
在枯草芽孢杆菌中,可诱导激活表达的启动子元件,广泛应用于代谢工程领域。目前,枯草芽孢杆菌中常用的诱导启动子,有木糖诱导启动子Pxyl和IPTG诱导启动子Pgrac。然而,木糖诱导启动子Pxyl的诱导剂木糖可被枯草芽孢杆菌代谢消耗,IPTG诱导启动子Pgrac的诱导剂IPTG对细胞存在一定毒性的问题。以上缺陷,严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。唾液酸作为一种简单碳源,且对细胞无毒,且不会被枯草芽孢杆菌代谢消耗,是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子,可以获得基于唾液酸诱导的更合适于枯草芽孢杆菌的响应元件。然而,如何改造启动子,以响应唾液酸实现较高的诱导表达是一个值得深入研究的问题。另外,枯草芽孢杆菌缺失唾液酸天然转运途径,不能转运胞外唾液酸至胞内,这限制了唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。
发明内容
为解决上述技术问题,实现响应于唾液酸的诱导表达启动子元件,本发明以组成型启动子PydjO表达转录调控蛋白NanR,进一步通过在组成型启动子Pveg中,整合转录调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATAACAGGTATANAGNTANNNNNTNN,实现以枯草芽孢杆菌添加唾液酸后,达到较高强度的诱导表达水平和较低的泄漏表达水平。
本发明的第一个目的是提供一种诱导表达启动子元件;该元件响应的诱导底物为唾液酸,所述元件含有NanR蛋白、PydjO启动子、Pveg和NanR结合序列的质粒;所述PydjO启动子为组成型启动子,表达转录调控蛋白NanR;组成型启动子Pveg与调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATA ACAGGTATANAGNTANNNNNTNN整合;启动子PydjO和启动子Pveg的转录方向相反。
在本发明的一种实施方式中,组成型PydjO启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中,转录调控蛋白Pveg启动子的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中,转录调控蛋白NanR氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中,唾液酸转运蛋白NanT氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中,整合NanR结合位点序列的Pveg启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个目的是提供含有所述唾液酸诱导表达元件的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中,所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。
本发明的第三个目是提供一种唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述应用为促进目的蛋白的表达。
在本发明的一种实施方式中,所述应用为降低泄露表达水平。
在本发明的一种实施方式中,所述应用为筛选表达目的基因的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中,所述唾液酸诱导表达元件的激活条件为:培养环境中含有唾液酸盐;培养条件为30~37℃培养16~48h。
在本发明的一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌用于验证唾液酸诱导表达元件,在唾液酸存在条件下可激活下游基因GFP表达。
有益效果:
(1)本发明通过将转录调控蛋白NanR结合位点序列TTNANNTGGTATAACAGGTATANAGNTANNNNNTNN,整合至较强的组成型表达启动子Pveg中,获得了激活强度较高的唾液酸诱导表达启动子元件。
(2)本发明提供的唾液酸诱导表达启动子元件,其在枯草芽孢杆菌中,激活表达强度达到4000a.u.。唾液酸诱导表达启动子元件在无唾液酸存在条件下的泄漏表达水平仅为10%左右。为进一步通过基因工程,改造枯草芽孢杆菌唾液酸诱导表达启动子奠定了基础。本发明提供的唾液酸诱导表达启动子构建方法简单,便于使用,具有很好的代谢工程应用前景。
具体实施方式
具体实施方式中涉及的引物序列如下:
组成型PydjO启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
转录调控蛋白Pveg启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
转录调控蛋白NanR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;
唾液酸转运蛋白NanT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;
整合NanR结合位点序列的Pveg启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
绿色荧光蛋白GFP氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示;
唾液酸诱导表达元件质粒pHT-BbL-veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
含唾液酸诱导表达启动子元件的枯草芽孢杆菌培养条件:
发酵培养基(g/L):唾液酸5,胰蛋白胨6,酵母粉12,硫酸铵6,磷酸氢二钾12.5,磷酸二氢钾2.5,硫酸镁3。
培养条件:37℃、200rpm,条件下培养48h。
绿色荧光蛋白和菌体浓度检测方法:
Tecan酶标仪:绿色荧光蛋白检测,激发波长490nm,发射波长530nm,增益60。菌体浓度检测波长为600nm。
泄露表达量计算公式(%):x=(a-b)/c
其中,a为唾液酸诱导表达元件在未添加唾液酸盐时的荧光强度,b为枯草芽孢杆菌168菌株作为对照菌株的荧光强度,c为唾液酸诱导表达元件在添加唾液酸盐时的荧光强度。
实施例1构建基因组重组整合NanT片段
为了实现枯草芽孢杆菌转运诱导物唾液酸至胞内,将来源于大肠杆菌K12的NanT转运蛋白通过同源重组整合至枯草芽孢杆菌基因组中。以大肠杆菌K12基因组为模板,设计引物L-F:5’-GTATGTCATGATGCGTGAAGGATCAGTCGCCAAAAACACGC-3’和L-R:5’-GTTATCCGCTCAAAAAGAGGCACTCCCTAAGGGAGTGCCTCTTTTTATTGCAGTG-3’,扩增重组整合NanT片段左臂基因序列;设计引物S-F:5’-CCTTAGGGAGTGCCTCTTTTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’和S-R:5’-CACCTATCATAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’,扩增壮观霉素抗性左臂基因序列;设计引物P-F:5’-GACTGGGAAAACCCTGGCGTTATGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTA-3’和P-R:5’-GGATATTCTGGGTTGTAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’,扩增P43启动子基因序列;设计引物N-F:5’-TAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGTACTACAACCCAGAATATCCCGTGGTATCGCCATCTCAACCG-3’和N-R:5’-GGGGTTGACGACCGAGTAGTTCACCTTAACTTTTGGTTTTGACTAAATCGTTTTTGGCGCTGCCAAACGGCACG-3’,扩增唾液酸转运酶NanT基因序列;设计引物R-F:5’-TTAAGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCATTAAACCTCCATAATGATCGGCAGGATCATTGGACGGCGCTTTG-3’和R-R:5’-CCATGTCTGAGCGCCGTGTAGGAGAAAGCATTCATGACATTTTCCG-3’,扩增重组片段NanT右臂基因序列;将以上5个基因片段通过融合PCR技术,构建成重组整合NanT基因片段,命名为LSPNR。
实施例2可转运唾液酸重组枯草芽孢杆菌的构建
将重组整合NanT的基因片段LSPNR转化至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168,重组到基因组上,获得重组枯草芽孢杆菌工程菌,命名为BSnanT。
实施例3构建唾液酸响应元件工具质粒pHT-BbL-veg质粒
为了实现在不添加诱导物唾液酸时,启动子处于关闭状态,扩征来源于大肠杆菌K12的NanR蛋白为阻遏物,调控唾液酸相应元件的表达。以大肠杆菌K12基因组为模板,设计引物N-1F:5-AACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCTTATTTCTTTTTGTTGGTGGTCTGACCGAAAG-3’和N-1R:5-ACGTAAAAACAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGCCTTATGAACGCATTTGATTCGCA-3’,克隆编码转录调控蛋白的基因NanR片段;设计引物N-2F:5-GTGTACATTTCACCTCCTTTGTTTTTACGTAATACGATAAATAGGGCCAAAGGT-3’和N-2R:5-GTATTACGGAGCACTTCCCATATTATCAAGAAAGCGGGGAATTGTCCTATACC-3’,克隆PydjO启动子基因片段,设计引物N-3F:5-CCCGCTTTCTTGATAATATGGGAAGTGCTCCGTAATACGCTGACAAGAGA-3’和N-3R:5-CTTTAAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGCCCATTTTT GTCAAATAAAATTTAAATT-3’,克隆Pveg基因片段,设计引物N-4F:5-ATAACAGGTATAAAGGTATATCGTTTAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACT-3’和N-4R:5-GCGTGACGTGAATTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGCAG-3’,克隆GFP基因片段;设计引物N-5F:5-GAACTATACAAATAATTCACGTCACGCGTCCATGGAGA-3’和N-5R:5-GAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3’,克隆pHT质粒片段,共5个片段通过NEB Gibson AssemblyMaster Mix Kit进行组装,构建唾液酸响应元件工具质粒pHT-BbL-veg质粒。
实施例4构建唾液酸诱导表达元件枯草芽孢杆菌BSnanT-pHT-BbL-veg
将唾液酸响应元件工具质粒pHT-BbL-veg质粒,转化至上实施例2构建的枯草芽孢杆菌工程菌株BSnanT中,获得重组枯草芽孢杆菌工程菌,命名为BSnanT-pHT-BbL-veg。
实施例5枯草芽孢杆菌BSnanT-pHT-BbL-veg添加唾液酸诱导发酵
将按照实施例4的方法制备的菌株BSnanT-pHT-BbL-veg于37℃、200rpm下,在含有5g/L唾液酸钠的发酵培养基中培养48h。最终测定发酵液绿色荧光蛋白强度为4000a.u.,泄露表达量为10%,成功获得强诱导表达强度的唾液酸诱导表达元件。当发酵培养基中不添加唾液酸钠时,发酵48h,发酵液绿色荧光蛋白强度为240a.u.,泄漏表达量为10%。
对比例1:不同启动子对诱导表达元件调控效果的影响
应用论文Yang,S.,Du,G.,Chen,J.,Kang,Z.,2017.Characterization andapplication of endogenous phase-dependent promoters in Bacillus subtilis.Appl.Microbiol.Biotechnol.101,4151–61.公开的若干种启动子,按照实施例2的策略构建诱导表达元件,区别在于,将Pveg启动子启动子替换为Pasd启动子、Psigh启动子、Pcitz启动子和PcsbA启动子,采用实施例5所述的方法验证调控效果,结果显示以上4个启动子构建的诱导表达原件,均不能被激活表达。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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ttatcaagaa agcggggaat tgtcctatac cggtccggct gtcccgccgc cgccaagtga 60
aaagggctgg aaagacacca ttcaagcgca tgcaggtgaa gtcctgagaa tcgcggcgac 120
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<212> DNA
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tatgggaagt gctccgtaat acgctgacaa gagagaaagg gcttggaggt attgaaacaa 60
gaggagttct gagaattggt atgccttata agtccaatta acagttgaaa acctgcatag 120
gagagctatg cgggtttttt attttacata atgatacata atttaccgaa acttgcggaa 180
cataattgag gaatcataga attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg 240
ttgatataat ttaaatttta tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat aaatgtagtg 300
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Arg Lys Gly Leu Val Gln Ile Asn Asn Gly Glu Arg Ala Arg Val Ser
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Asp Phe Leu Ser His Pro Gly Gly Ile Ala His Phe Glu Gln Leu Arg
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Leu Phe Phe Glu Ser Ser Leu Val Arg Tyr Ala Ala Glu His Ala Thr
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Asp Glu Gln Ile Asp Leu Leu Ala Lys Ala Leu Glu Ile Asn Ser Gln
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Ser Leu Asp Asn Asn Ala Ala Phe Ile Arg Ser Asp Val Asp Phe His
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Ala Asn Ile Val Met Thr Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Trp Phe Cys
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Leu Cys Ala Ala Ile Phe Ile Ser Phe Met Val Gln Ser Ala Gly Lys
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<212> PRT
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50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg
65 70 75 80
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ccagaccttt gcgttttaac gctgccagcg cttcacgcac cgaaggacgc ccgacgttaa 1860
agaacgccat cagttcgcgt tcagacggta attgttcacc ttcgccaaat tcacgacggc 1920
ggatcatctg ttccagctct tcttccacca tttcggagag ttttttacgc gccagcgggc 1980
ggctacgcaa gttgcgacca attgcaggtg aagaatcttc ggtttgcgaa tcaaatgcgt 2040
tcataaggcc catgttttta cgtaatacga taaatagggc caaaggtttc ataaagaaaa 2100
aacttgcctg ctagaggcaa gtttgtcggg ttatttatgg ggatcagtta tatccatcgg 2160
tctcatcatg tcatagtctt catgctctag aatatggcaa tgccatacgt atcgtccgct 2220
gtacggaccg aatgtcgccg cgattctcag gacttcacct gcatgcgctt gaatggtgtc 2280
tttccagccc ttttcacttg gcggcggcgg gacagccgga ccggtatagg acaattcccc 2340
gctttcttga taatatggga agtgctccgt aatacgctga caagagagaa agggcttgga 2400
ggtattgaaa caagaggagt tctgagaatt ggtatgcctt ataagtccaa ttaacagttg 2460
aaaacctgca taggagagct atgcgggttt tttattttac ataatgatac ataatttacc 2520
gaaacttgcg gaacataatt gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa 2580
cgtcttatta acgttgatat aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac 2640
aatggtataa caggtataaa ggtatatcgt ttaaaggagg tgaaatgtac acatgggtaa 2700
gggagaagaa cttttcactg gagttgtccc aattcttgtt gaattagatg gtgatgttaa 2760
tgggcacaaa ttttctgtca gtggagaggg tgaaggtgat gcaacatacg gaaaacttac 2820
ccttaaattt atttgcacta ctggaaagct tcctgttcct tggccaacac ttgtcactac 2880
tcttacttat ggtgttcaat gcttttcaag atacccagat catatgaagc ggcacgactt 2940
cttcaagagc gccatgcctg agggatacgt gcaggagagg accatcttct tcaaggacga 3000
cgggaactac aagacacgtg ctgaagtcaa gtttgaggga gacaccctcg tcaacagaat 3060
cgagcttaag ggaatcgatt tcaaggagga cggaaacatc ctcggccaca agttggaata 3120
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taacttcaaa attagacaca acattgaaga tggaagcgtt caactagcag accattatca 3240
acaaaatact ccaattggcg atggccctgt ccttttacca gacaaccatt acctgtccac 3300
acaatctgcc ctttcgaaag atcccaacga aaagagagac cacatggtcc ttcttgagtt 3360
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cgtccatgga gatctttgtc tgcaactgaa aagtttatac cttacctgga acaaatggtt 3480
gaaacatacg aggctaatat cggcttatta ggaatagtcc ctgtactaat aaaatcaggt 3540
ggatcagttg atcagtatat tttggacgaa gctcggaaag aatttggaga tgacttgctt 3600
aattccacaa ttaaattaag ggaaagaata aagcgatttg atgttcaagg aatcacggaa 3660
gaagatactc atgataaaga agctctaaaa ctattcaata accttacaat ggaattgatc 3720
gaaagggtgg aaggttaatg gtacgaaaat taggggatct acctagaaag ccacaaggcg 3780
ataggtcaag cttaaagaac ccttacatgg atcttacaga ttctgaaagt aaagaaacaa 3840
cagaggttaa acaaacagaa ccaaaaagaa aaaaagcatt gttgaaaaca atgaaagttg 3900
atgtttcaat ccataataag attaaatcgc tgcacgaaat tctggcagca tccgaaggga 3960
attcatatta cttagaggat actattgaga gagctattga taagatggtt gagacattac 4020
ctgagagcca aaaaactttt tatgaatatg aattaaaaaa aagaaccaac aaaggctgag 4080
acagactcca aacgagtctg tttttttaaa aaaaatatta ggagcattga atatatatta 4140
gagaattaag aaagacatgg gaataaaaat attttaaatc cagtaaaaat atgataagat 4200
tatttcagaa tatgaagaac tctgtttgtt tttgatgaaa aaacaaacaa aaaaaatcca 4260
cctaacggaa tctcaattta actaacagcg gccaaactga gaagttaaat ttgagaaggg 4320
gaaaaggcgg atttatactt gtatttaact atctccattt taacatttta ttaaacccca 4380
tacaagtgaa aatcctcttt tacactgttc ctttaggtga tcgcggaggg acattatgag 4440
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aaataaaatc gccaggaaga gaatcaaaaa agggaaagaa gaagtttatt atgttgctga 4560
aacggaagag aagatatgga cagaagagca aataaaaaac ttttctttag acaaatttgg 4620
tacgcatata ccttacatag aaggtcatta tacaatctta aataattact tctttgattt 4680
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gactcctgtt acagttagag gctacttgaa actgcttgaa aggtacggtt ttatttggaa 4860
ggtaaacgtc cgtaataaaa ccaaggataa cacagaggaa tccccgattt ttaagattag 4920
acgtaaggtt cctttgcttt cagaagaact tttaaatgga aaccctaata ttgaaattcc 4980
agatgacgag gaagcacatg taaagaaggc tttaaaaaag gaaaaagagg gtcttccaaa 5040
ggttttgaaa aaagagcacg atgaatttgt taaaaaaatg atggatgagt cagaaacaat 5100
taatattcca gaggccttac aatatgacac aatgtatgaa gatatactca gtaaaggaga 5160
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tataatcagg gaggtatcaa tatttaatga gtactgattt aaatttattt agactggaat 5580
taataattaa cacgtagact aattaaaatt taatgaggga taaagaggat acaaaaatat 5640
taatttcaat ccctattaaa ttttaacaag ggggggatta aaatttaatt agaggtttat 5700
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tgggggaggg attaaaattt aatgacaaag aaaacaatct tttaagaaaa gcttttaaaa 5820
gataataata aaaagagctt tgcgattaag caaaactctt tactttttca ttgacattat 5880
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tttcaggaat ataaaacaca tctgaggctt gttttataaa ctcagggtcg ctaaagtcaa 6000
tgtaacgtag catatgatat ggtatagctt ccacccaagt tagcctttct gcttcttctg 6060
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caaacacttt aacatctgag tcaatgtaag cataagatgt ttttccagtc ataatttcaa 6240
tcccaaatct tttagacaga aattctggac gtaaatcttt tggtgaaaga atttttttat 6300
gtagcaatat atccgataca gcaccttcta aaagcgttgg tgaatagggc attttaccta 6360
tctcctctca ttttgtggaa taaaaatagt catattcgtc catctaccta tcctattatc 6420
gaacagttga actttttaat caaggatcag tccttttttt cattattctt aaactgtgct 6480
cttaacttta acaactcgat ttgtttttcc agatctcgag ggtaactagc ctcgccgatc 6540
ccgcaagagg cccggcagtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 6600
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 6660
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 6720
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 6780
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cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 7020
cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 7080
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caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7620
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 7680
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gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 7860
aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 7920
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tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 8040
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gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 8460
cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcatgct taagt 8515
Claims (5)
1.一种诱导表达元件,其特征在于,响应的诱导底物为唾液酸,所述元件含有转录调控蛋白NanR的编码序列、PydjO启动子、整合NanR结合位点的启动子Pveg;其中,所述PydjO启动子为组成型启动子,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,表达所述转录调控蛋白NanR,所述转录调控蛋白NanR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述整合NanR结合位点的启动子Pveg核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;并且启动子PydjO和启动子Pveg的转录方向相反。
2.含有权利要求1所述诱导表达元件的质粒,其特征在于,以pHT01为出发质粒。
3.含有权利要求1所述诱导表达元件或权利要求2所述质粒的基因工程菌,其特征在于,以枯草芽孢杆菌为宿主,编码目的蛋白的基因由启动子Pveg调控其转录。
4.权利要求1所述的诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用,其特征在于,所述应用包括促进目的蛋白的表达或筛选表达目的基因的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述诱导表达元件的激活条件为:在含有唾液酸盐的培养环境中30~37℃培养16~48h。
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