KR20130098089A - 인터루킨-6와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인터루킨-6과 결합하여 그의 활성을 저해할 수 있는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 IL-6의 수용체(IL-6Ra)보다도 높은 친화력으로 IL-6에 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있으므로, IL-6 관련 질환의 예방 또는 치료용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 인터루킨-6와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 인터루킨-6와 결합하여 그의 활성을 저해할 수 있는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
생체 내에 존재하는 다양한 물질 중에서, 단백질은 생명 현상의 유지 및 기능을 수행하는 거대 분자로서 넓은 범위의 생물학적 역할을 담당하고 있다. 이런 역할을 수행하기 위해서는 우선 단백질-단백질 간 상호작용이 이루어져야 하며, 이는 모든 생명현상의 기초라고 할 수 있다. 만약 단백질 상호작용이 제대로 조절되어지지 않게 되면 체내의 항상성은 망가지게 되어 결과적으로 다양한 질병을 일으키게 된다. 따라서 단백질 상호작용을 인위적으로 조절함으로써 질병을 치료하기 위한 다양한 방법이 연구 및 개발되어 왔으며 실제로 치료 목적에 사용가능한 다양한 의약품들이 성공적으로 개발되어 왔다.
항체는 면역반응의 중요단백질로 항원과의 특이적 상호작용을 통해 생물학적 기능을 수행한다. 이런 특이적인 결합력은 기존의 저분자 화학제재와 달리 부작용 없이 높은 치료효과를 가능하게 한다. 따라서, 많은 연구기관과 제약회사들은 다양한 선별기술을 활용하여 잘 알려진 치료제 표적에 대해 결합력을 갖는 항체들을 개발하기 위한 연구를 활발히 진행하고 있다. 최근 수십 년간 개발된 치료용 항체들은 다양한 질병 치료에 높은 효능과 더불어 낮은 부작용을 보여줌으로서 전체 치료제 시장에서 상당한 성공을 이루었으며, 지속적으로 전체 치료제 시장에서 높은 성장세를 유지하고 있다. 또한, 치료용 목적만이 아닌 생체물질의 분리정제 및 분자 의학적 진단기술 등 다양한 분야에서 폭 넓게 이용되고 있다. 하지만, 이런 장점에도 불구하고 큰 분자량으로 인한 낮은 조직 침투력, 복잡한 생산 공정으로 인한 높은 제품단가, 그리고 기존의 특허에 의한 진입장벽 등의 문제점으로 인해 항체를 이용한 새로운 치료제 개발은 별다른 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다. 이러한 한계를 극복하고자, 여러 연구단에서는 항체를 대체할 새로운 단백질 골격에 대한 연구가 활발히 수행되고 있다. 그 결과, 리피바디(Repebody)라는 단백질이 개발되었다. 상기 Repebody는 LRR(Leucine-rich repeat) 구조를 갖는 인터날린의 N-말단과 상기 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩타이드를 의미하는데, 상기 Repebody는 대장균에서 수용성 단량체 형태로 대량 발현되기 때문에 생산 단가를 낮출 수 있고, 높은 물리화학적 안정성을 지니고 있어 단백질의 변형이 용이하다. 또한, 연구 개발되지 않은 신규 단백질 골격이기 때문에 기존 특허로부터 자유롭다는 장점을 가지고 있다.
본 발명자들은 상기 Repebody를 이용하여 폐혈증에 관련된 표적 단백질인 MD-2(Myeloid differentiation protein-2)에 대한 특이적인 결합 단백질(Specific binding protein)을 성공적으로 제조하고, 세포 기반의 검출방법으로 생물학적인 저해효과가 있음을 검증하였으나, 이에 대한 응용연구는 아직 시작단계에 불과하여, 추가적인 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 Repebody를 다양한 단백질에 대한 결합력을 갖는 범용적인 결합 단백질 골격으로 개발하기 위해 예의 노력한 결과, Repebody의 구조적 특징인 모듈성과 전체구조분석을 통해 구축한 무작위한 돌연변이 라이브러리를 바탕으로 인터루킨-6에 대해 결합력을 갖는 신규한 단백질을 선별하고, 반복 모듈 기반의 친화력 증대방식을 통해 결합력을 향상시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인터루킨-6과 효과적으로 결합하여 그의 활성을 저해할 수 있는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 9 및 11 내지 21중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 인터루킨-6(IL-6)와 효과적으로 결합하여 그의 활성을 저해할 수 있는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 용어 "인터루킨-6(IL-6)"는 B세포의 항체생산세포로의 최종 분화를 유도하는 B세포자극인자2(BSF-2)로 분리한 분자량이 210,000인 당단백질로서, T림프구, B림프구, 대식세포, 섬유아세포 등 여러 세포에서 생산되는 사이토카인의 일종을 의미하는데, 면역응답, 조혈계와 신경계세포의 증식 및 분화, 급성 반응, 다양한 세포의 성장과 분화 등에 관여한다.
본 발명자들은 IL-6와 효과적으로 결합하여 그의 활성을 저해할 수 있는 신규한 폴리펩타이드를 개발하기 위하여, 인터날린 B(Internalin B) 단백질의 Ｎ-말단, 가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR) 의 LRR (Leucine-rich repeat) 단백질 부분이 융합된, 폴리펩타이드의 반복 모듈을 무작위적으로 포함하는 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리에 포함된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되거나 또는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
또한, 상기 라이브러리는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 파지미드의 형태가 될 수 있다. 본 발명의 용어 "파지미드"란, 대장균을 숙주로 하는 바이러스인 파지로 부터 유래된 원형의 폴리뉴클레오티드 분자를 의미하는데, 번식과 증식에 필요한 단백질 및 표면 단백질이 서열이 포함되어 있다. 재조합 파지미드는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 파지미드는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있고, 주로 원하는 단백질을 파지의 표면 단백질과 융합하여 파지 표면에 표지하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 파지미드의 프로모터는 주로 유도성이며, 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 파지미드는 상기 라이브러리를 구성하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드르를 발현 및 분비하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열인 MalEss, DsbAss 또는 PelBss를 포함하고, 파지의 표면에 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위한 히스티딘-태그와 파지 표면으로의 발현을 위한 M13 파지의 표면 단백질의 일종인 gp3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명자들은 상기 파지미드를 포함하는 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 IL-6에 대한 결합력이 우수한 Repebody 형태의 신규한 폴리펩타이드(서열번호 3 내지 6)를 선발하였다. 그러나, 이들 선발된 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 IL-6의 수용체(IL-6Ra) 보다도 IL-6에 대한 결합력이 낮은 수준을 나타내었기 때문에, 상기 선발된 폴리펩타이드를 돌연변이 시켜서 IL-6에 대한 결합력이 향상된 돌연변이체를 제작하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 선발된 폴리펩타이드 중에서 가장 결합력이 우수한 서열번호 5의 폴리펩타이드를 대상으로 네 개의 아미노산 잔기를 돌연변이 시킨 두 번째 라이브러리를 구축하고(도 8), 상기 두 번째 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 IL-6에 대한 결합력이 우수한 Repebody 형태의 신규한 폴리펩타이드(서열번호 8 내지 10)을 2차 선발하였으며(도 9), 상기 2차 선발된 폴리펩타이드 중에서 가장 결합력이 우수한 서열번호 9의 폴리펩타이드를 대상으로 동일한 돌연변이를 수행하여 세 번째 라이브러리를 구축하고(도 11), 상기 세 번째 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 IL-6에 대한 결합력이 우수한 Repebody 형태의 신규한 폴리펩타이드(서열번호 11 내지 21)을 2차 선발하였다(표 1).
본 발명의 용어 "인터날린 B 단백질"이란, 리스테리아 (Listeria) 균주에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 다른 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 다른 LRR 패밀리 단백질들과는 다른 유형의 N-말단 구조 때문에 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복 모듈의 접힘(folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 더욱 안정적인 구조를 포함하므로, 미생물에서 표적 단백질의 안정적인 발현을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping motif) 및 인터날린 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단은 제한 없이 포함되나, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE" 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN"을 포함할 수 있다. 상기 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.
본 발명의 용어 "가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR)"란, 먹장어와 칠성 장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 먹장어와 칠성 장어에서 면역 기능을 수행하는 단백질로서 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩타이드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하므로, 이를 기반으로 한 신규한 단백질 치료제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "LRR(Leucine rich repeat) 단백질"이란, 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 쓰레오닌을, x는 임의의 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖는 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것 뿐 아니라, 컨센서스 디자인 (Consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "Repebody"란, LRR 구조를 갖는 상기 인터날린의 N-말단과 상기 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리 폴리펩타이드이다. Repebody 단백질은 구조상 오목한 지역 (Concave) 와 볼록한 지역 (Convex) 으로 나누어 질 수 있다(도 4). 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. Repebody 단백질은 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리학적 성질을 향상 시킨 모든 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.
다른 하나의 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 9 및 11 내지 21중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "형질전환체"란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또 다른 하나의 실시양태로서, 본 발명은 (ⅰ) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 배양된 형질전환체 또는 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 생산방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 자연계에 존재하는 IL-6의 수용체(IL-6Ra)보다도 높은 친화력으로 IL-6에 결합하여 그의 활성을 억제할 수 있으므로, IL-6 관련 질환의 예방 또는 치료용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 모듈을 기반으로 수행한 겹침 중합효소 연쇄 반응의 전체적인 개략도이다. 각 노란색 부분은 가변적인 반복 모듈 (Variable repeat module)로 총 4개가 폴리펩타이드 상 위치한다. 붉게 표시된 선형막대는 실험에 사용된 프라이머이며 상기 프라이머에서의 녹색부분은 NNK 동의코돈이 포함되는 오목한 지역의 서열을 의미한다.
도 2는 두 개의 다른 신호서열을 통해서 Repebody가 주변세포질에 발현됨을 SDS-PAGE를 통해서 확인한 실험결과를 나타내는 도면이다. 이때, E는 용출액의 번호이며 가운데 27KDa는 사용된 표준마커 (Standard marker) 에서의 위치를 의미한다.
도 3은 본 발명의 파지미드 pBEL118M을 이용하여 Repebody를 파지의 표면에 발현됨을 확인하기 위한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 도면으로서, mM단위는 프로모터 유도에 사용되는 IPTG의 농도를 의미한다.
도 4는 Repebody의 전체 단백질 구조를 나타내는 개략도로서, 생체 분자를 인식하는 Concave와 구조 유지에 중요한 Convex지역으로 구분되어진다.
도 5는 무작위적인 라이브러리를 구축하고자 하는 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
도 6은 효소면역측정법을 통해 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는가에 대한 여부를 확인한 실험결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 폴리펩타이드의 인터루킨-6에 대한 결합력을 등온열량측정기로 확인한 실험결과를 나타내는 도면 및 도표이다.
도 8은 두 번째 라이브러리를 구축하는 방법을 나타내는 개략도이다. 이때, 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다.
도 9는 두 번째 라이브러리를 바탕으로 선별된 결합후보들의 측정된 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 10은 세 번째 라이브러리를 구축하는 방법을 나타내는 개략도이다. 이때, 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다.
도 2는 두 개의 다른 신호서열을 통해서 Repebody가 주변세포질에 발현됨을 SDS-PAGE를 통해서 확인한 실험결과를 나타내는 도면이다. 이때, E는 용출액의 번호이며 가운데 27KDa는 사용된 표준마커 (Standard marker) 에서의 위치를 의미한다.
도 3은 본 발명의 파지미드 pBEL118M을 이용하여 Repebody를 파지의 표면에 발현됨을 확인하기 위한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 도면으로서, mM단위는 프로모터 유도에 사용되는 IPTG의 농도를 의미한다.
도 4는 Repebody의 전체 단백질 구조를 나타내는 개략도로서, 생체 분자를 인식하는 Concave와 구조 유지에 중요한 Convex지역으로 구분되어진다.
도 5는 무작위적인 라이브러리를 구축하고자 하는 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
도 6은 효소면역측정법을 통해 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는가에 대한 여부를 확인한 실험결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 폴리펩타이드의 인터루킨-6에 대한 결합력을 등온열량측정기로 확인한 실험결과를 나타내는 도면 및 도표이다.
도 8은 두 번째 라이브러리를 구축하는 방법을 나타내는 개략도이다. 이때, 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다.
도 9는 두 번째 라이브러리를 바탕으로 선별된 결합후보들의 측정된 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 10은 세 번째 라이브러리를 구축하는 방법을 나타내는 개략도이다. 이때, 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않으며 다양한 응용 및 수정이 가능하다.
실시예
1: 무작위적인
Repebody
라이브러리 선별을 위한
phagemid
설계
발명의 구성요소로서 Repebody로 이름 붙인 단백질 골격을 사용하였다. 상기 골격은 인터날린 B 단백질의 Ｎ-말단, VLR 단백질의 C-말단을 포함하는 LRR 부분이 융합된 수용성 폴리펩타이드로 서열번호 7과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
실시예
1-1: 신호 서열을 이용한 주변세포질에서의
Repebody
발현
Repebody가 파지 디스플레이에 적용가능한지를 알아보기 위해서는 숙주로 사용될 대장균의 주변세포질 발현(Periplasmic expression) 확인과 파지의 표면 입자에 단백질이 제대로 발현되었는지를 확인해야 한다. 이를 위하여, pMAL-c2x(NEB, USA) 벡터를 이용하여 구별되는 신호 폴리펩타이드인 MalE 와 DsbA 신호서열을 개시코돈 바로 뒤에 삽입한 두 개의 재조합 벡터를 제작하였다. 그런 다음, 상기 신호서열과 종결코돈 사이에 Repebody와 히스티틴-태그가 융합된 DNA를 삽입하여 최종 벡터를 완성하였다. 완성된 두개의 벡터를 대장균 XL1-blue 균주에 도입하여 형질전환체를 제작하고, 상기 형질전환체를 흡광도(OD600)가 0.5에 도달할 때 까지 배양한 다음, 0.1mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 단백질의 발현을 유도한 다음, 다시 30℃에서 16시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 원심분리하여 균체를 수득하고, 상기 균체에 초음파를 처리하여 수용성 단백질 분획을 수득하였다.
수득한 수용성 단백질 분획을 Ni-NTA(Nickel-nitrilotriacetic acid) 레진에 적용하여 정제한 후, SDS-PAGE 분석을 통해서 생산된 Repebody의 주변세포질에서의 발현양을 확인하였다(도 2). 도 2는 두 개의 다른 신호서열을 통해서 Repebody가 주변세포질에 발현됨을 SDS-PAGE를 통해서 확인한 실험결과를 나타내는 도면으로서, E는 용출액의 번호이며 가운데 27KDa는 사용된 표준마커 (Standard marker) 에서의 위치를 의미한다. 도 2에서 보듯이, DsbA 신호서열에 비해 MalE 신호서열이 좀 더 높은 주변세포질 발현율을 나타냄을 확인하였다.
실시예
1-2: 파지 표면에서의
Repebody
발현을 위한
파지미드
제작
상기 실시예 1-1에서 최종 결정한 MalE 신호서열을 바탕으로 파지미드를 설계하였다. 파지미드는 pTV118N(Takara, Japan)을 기본으로 하여, 개시코돈 바로 뒤에 MalE 신호서열을 삽입하였으며 이어 Repebody와 히스티딘-태그가 융합된 DNA를 추가하도록 제작하였다. 아울러, 여러 파지 표면 단백질 중에서 비교적 크기가 큰 단백질을 표지할 수 있는 gp3를 이용했으며 C-말단을 엠버코돈 (Amber codon)을 뒤에 두었으며 최종적으로 두 개의 연속적인 종결코돈을 삽입하여 pBEL118M으로 명명되는 파지미드를 완성하였다. 상기 파지미드는 XL1-Blue에 도입하여 형질전환체를 제작하였고, 상기 제작된 형질전환체는 0.5mM IPTG를 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 배양하고, 이를 원심분리하여 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 폴리에틸렌글리콜 침강법에 적용하여 파지를 정제하였다.
상기 파지를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과, 상기 파지의 표면에 Repebody가 발현됨을 확인하였다(도 3). 도 3은 본 발명의 파지미드 pBEL118M을 이용하여 Repebody를 파지의 표면에 발현됨을 확인하기 위한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 도면으로서, mM단위는 프로모터 유도에 사용되는 IPTG의 농도를 의미한다.
실시예
2: 단백질 구조 기반의
Repebody
라이브러리 구축
Repebody는 자연계에 존재하는 LRR 단백질들과 마찬가지로 보존된 류신 서열을 갖는 반복 단위체(Repeat unit)가 연속적으로 연결되어 전체 단백질 구조를 유지하는 모듈성과 전체 구조의 모양의 곡률로 인한 오목한 지역(Concave region)과 볼록한 지역(Convex region)으로 구별되는 구조적 특징을 갖는다(도 4). 도 4는 Repebody의 전체 단백질 구조를 나타내는 개략도로서, 생체 분자를 인식하는 Concave와 구조 유지에 중요한 Convex지역으로 구분된다. 상기 오목한 지역에는 항체의 상보성결정지역(complementarity determining region, CDR) 처럼 초가변영역(Hypervariable region)이 위치하여, 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 또한, 볼록한 지역은 잘 보존되어 있는 서열을 바탕으로 LRR의 전체구조의 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 Repebody의 단백질 구조를 분석하여 하기의 같은 방식으로 무작위적인 라이브러리를 설계하였다.
구체적으로, 설계되지 않은 카르복시말단의 고리구조(C-term loop)에 의한 입체 장해(Steric hinderance)에서 벗어나기 위해 아민기말단 방향에 위치한 연속적인 두개의 변이 모듈(LRRV module 1 과 2)의 오목한 지역에 위치하는 여섯 아미노산 잔기 91, 93, 94, 115, 117, 그리고 118번을 선택하였다(도 5). 도 5는 무작위적인 라이브러리를 구축하고자 하는 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
그런 다음, 상기 선택한 아미노산을 NNK 동의코돈(Degenerate codon)으로 치환하고, 나머지 볼록한 지역의 염기서열을 잠재성 돌연변이(Silent mutation)를 포함하도록 구성하여, 라이브러리를 구축하기 위한 돌연변이 유발 프라이머(Mutagenic primer)를 합성하였다.
이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄 반응(Overlap PCR) 을 수행하며 라이브러리 DNA를 수득하고(도 1), 상기 파지미드 pBEL118M에 삽입하여 최종적인 라이브러리 파지미드를 확보하였다. 도 1은 모듈을 기반으로 수행한 겹침 중합효소 연쇄 반응의 전체적인 개략도이다. 각 노란색 부분은 가변적인 반복 모듈 (Variable repeat module)로 총 4개가 폴리펩타이드 상 위치한다. 붉게 표시된 선형막대는 실험에 사용된 프라이머이며 상기 프라이머에서의 녹색부분은 NNK 동의코돈이 포함되는 오목한 지역의 서열을 의미한다.
상기 확보된 라이브러리를 전기천공법(electroporation)으로 대장균 XL1-Blue에 도입하여 형질전환체를 수득함으로써, 1.8x108수준의 합성적 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.
실시예
3: 파지 디스플레이를 이용한
IL
-6 특이적 결합 단백질 선별
실시예
3-1:
Repebody
라이브러리 파지의 정제 및
패닝
과정을 통한 인터루킨-6와 결합하는
폴리펩타이드
선별
상기 실시예 2에서 구축한 라이브러리를 실시예 1-1의 방법으로 배양하고, Repebody가 표면에 발현된 파지를 실시예 1-2의 방법으로 선별하여 정제하였다. IL-6와 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, IL-6를 면역튜브(Immuno-tube)에 100㎍/㎖의 농도로 가하고, 4℃에서 12시간동안 코팅하였다. 상기 코팅된 면역튜브를 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA와 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS 용액(TPBSA)으로 4℃에서 2시간동안 블로킹(Blocking) 하였다. 그런 다음, 상기 정제된 파지를 1012cfu/ml의 농도로 상기 코팅된 면역튜브에 가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS 용액(TPBS)으로 총 2분간 5번씩 및 PBS로 2번 세척하였다. 마지막으로, 1ml 0.2M Gly-HCl(pH2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 10분간 반응시킴으로써, IL-6와 결합할 수 있는 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다. 상기 용출액에 60㎕의 1.0M Tris-HCl(pH9.1)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 10ml 대장균 XL1-Blue 용액(OD600 = 0.5)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝(Bio-panning) 과정을 4회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 각 패닝 과정을 통해 IL-6와 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 IL-6와 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가함을 의미하는 것으로 분석되었다.
실시예
3-2: 선별된
Repebody
의
IL
-6에 대한 특이적인
결합여부
확인 및 서열 분석
상기 실시예 3-1의 방법을 통하여 선별된 파지를 IL-6와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 ELISA를 수행함으로써, BSA 대비 IL-6의 흡광도(OD450)가 10배 이상 높은 84개의 Repebody 후보들을 선별하고, 이들 각각의 아미노산 서열을 확인한 후, 공통서열(Consensus sequence)을 확인하기 위해서 WebLogo를 수행하였다. 그 결과, 상기 선별된 파지에서 발현되는 IL-6와 특이적으로 결합하는 단백질의 아미노산 서열 중에서 돌연변이의 빈도가 높은 잔기가 존재함을 확인하였다. 즉, 91번 아미노산인 이소류신이 트립토판, 발린 또는 트레오닌으로 치환되고, 93번 아미노산인 트레오닌이 아르기닌 또는 글루탐산으로 치환되며, 94번 아미노산인 글리신이 알라닌, 세린 또는 프롤린으로 치환되고, 115번 아미노산인 발린이 발린(침묵돌연변이), 세린, 알라닌 또는 아스파라긴으로 치환되며, 117번 아미노산인 발린이 리신 또는 트립토판으로 치환되고, 118번 아미노산인 글루탐산이 아르기닌, 리신 또는 류신으로 치환됨을 확인하였다.
상기 결과는 IL-6와 결합하는데 중요한 역할을 수행하는 잔기가 존재함을 의미하는 것으로 분석되었다.
실시예
4:
Repebody
의 결합력 증가를 위한 모듈 기반 친화력 증대 방법 수행
실시예
4-1: 인터루킨-6에 대한 특이적인 결합
Repebody
의 특성 분석
상기 실시예 3-2에서 수행한 ELISA 결과를 바탕으로 앞에서 얻어진 Repebody 후보들 중에 IL-6에 대한 흡광도가 가장 좋게 나타난 4종의 후보(Repebody-B3(서열번호 3), Repebody-C8(서열번호 4), Repebody-D3(서열번호 5) 및 Repebody-F11(서열번호 6))를 대상으로 하여, IL-6, 라이소자임(Lysozyme), BSA 및 라이소자임을 코팅한 플레이트를 이용한 파지 ELISA를 수행하였다(도 6).도 6은 효소면역측정법을 통해 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는가에 대한 여부를 확인한 실험결과를 나타내는 도면이다. 상기 도 6에서 보듯이, 상기 4종의 후보는 IL-6에 대한 표적 특이성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
한편, IL-6에 대한 상기 4종의 후보의 해리상수(Dissociation constant)를 측정하였다. 구체적으로, PBS에 0.2mM(6mg/ml)로 용해된 Repebody와 PBS에 0.02mM(0.5mg/ml)로 용해된 IL-6를 사용하고, 등온열량측정기(Isothermal titration calorimetry, ITC)를 이용하여, 상온에서 IL-6에 대한 상기 4종의 후보의 해리상수를 측정하였다(도 7). 도 7은 본 발명의 폴리펩타이드의 인터루킨-6에 대한 결합력을 등온열량측정기로 확인한 실험결과를 나타내는 도면 및 도표이다. 상기 도 7에서 보듯이, 상기 4종의 후보 중에서 IL-6에 대한 Repebody-D3의 해리상수(KD)는 17nM이고, Repebody-B3의 해리상수(KD)는 48nM이며, Repebody-C8의 해리상수(KD)는 89nM이고, Repebody-F11의 해리상수(KD)는 117nM임을 확인하였다. 따라서, 상기 4종의 후보 중에서 Repebody-D3가 가장 효과적으로 IL-6에 결합할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
4-2: 모듈을 이용한 추가적인 라이브러리 구축 및 결합력 증가 확인
상기 실시예 4-1의 결과에서 가장 효과적으로 IL-6에 결합할 수 있는 것으로 확인된 Repebody-D3의 IL-6에 대한 해리상수는 17nM이지만, 자연계에 존재하는 IL-6의 수용체(IL-6Ra)의 IL-6에 대한 해리상수는 9nM이기 때문에, 저해자로서 기능하기 위하여는 9nM 보다 더 낮은 해리상수를 확보해야 하므로, 본 발명의 Repebody 후보로는 IL-6의 활성을 충분히 억제할 수 없을 것으로 예상되었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, Repebody의 모듈성을 이용하여 IL-6에 대한 결합력이 향상된 돌연변이체를 개발하고자 하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 구축한 라이브러리 지역에 인접한 모듈(LRRV module 3)을 선택하여 상기 실시예 2와 동일한 방식으로 오목한 지역의 네 개의 잔기를 돌연변이 시켰다(도 8). 도 8은 두 번째 라이브러리를 구축하는 방법을 나타내는 개략도이다. 이때, 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다. 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다. 다시 총 네 번의 패닝과정을 거쳐서 결합력이 증대된 3개의 후보(Repebody-D3E5(서열번호 8), Repebody-D3E8(서열번호 9) 및 Repebody-D3E10(서열번호 10))를 확보하였으며, ITC를 통해서 해리상수를 측정한 결과 2~13nM 수준으로 결합력이 증가되었음을 확인하였다(도 9). 도 9는 두 번째 라이브러리를 바탕으로 선별된 결합후보들의 측정된 결합력을 나타낸 그래프이다.
한편, 더욱 향상된 결합력을 나타내는 돌연변이체를 개발하기 위하여, 인터날린 방향의 인접한 모듈(LRR2)에 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여 세 번째 라이브러리를 구축하였다(도 10). 도 10은 세 번째 라이브러리를 구축하는 방법을 나타내는 개략도이다. 이때, 노란색 잔기는 기존의 라이브러리가 구축된 잔기를 녹색 아미노산은 새롭게 구축되는 라이브러리의 해당 위치를 나타낸다. 상기 세 번째 라이브러리를 대상으로 파지 디스플레이를 이용하여 향상된 결합력을 갖는 후보들을 선별하였고 400pM 수준의 해리상수를 갖는 후보를 최종적으로 확보하였다(표 1).
| Repebody | 서열 번호 |
변이위치 | Kapp(106M) | KD(10-9M) | Fold | |||
| 67 | 69 | 71 | 72 | |||||
| D3E8 D3E8B2 D3E8B3 D3E8B4 D3E8B8 D3E8C4 D3E8C7 D3E8C9 D3E8C11 D3E8H2 D3E8H3 D3E8H5 |
9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 |
Y Y Y Y Y K Y Y Y Y M V |
A T T T T T T A S L I M |
G V Q T R V I S I R R R |
G Q S N N S T S N S S S |
2.35 4.90 6.11 3.24 3.06 14.6 4.47 10.7 1.88 5.58 4.05 5.12 |
2.47 1.18 0.949 1.04 1.90 0.397 1.30 0.542 3.09 1.43 1.79 1.13 |
1.0 2.1 2.6 1.4 1.3 6.2 1.9 4.6 0.8 2.4 1.7 2.2 |
이러한 결과는 Repebody는 기존의 항체와는 달리 반복 단백질만이 갖는 고유한 특성인 모듈성을 이용하여 라이브러리를 합리적으로 설계할 수 있으며 순차적으로 인접한 모듈을 바탕으로 라이브러리를 구축함으로서 효과적으로 표적 단백질에 대한 결합력을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Novel polypeptide binding with interleukin-6
<130> PA110903/KR
<160> 21
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Repebody-Library
<400> 1
gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60
acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120
aacagtattg accagatcat tgcgaataac tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180
tatctgccga atgttcgtta cctggccctg ggtggcaaca aactgcatga catctcggca 240
ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg nnkctgnnkn nkaaccaact gcagagcctg 300
ccgaacggcg tgtttgataa actgacgaac ctgaaagaac tgnnkctgnn knnkaatcaa 360
ctgcagtctc tgccggatgg tgtgttcgac aaactgacca acctgacgta cctgaatctg 420
gctcacaacc aactgcagag tctgccgaaa ggcgtgtttg acaaactgac caatctgacg 480
gaactggatc tgtcctataa ccaactgcag tcactgccgg aaggtgtttt cgacaaactg 540
acccagctga aagatctgcg cctgtaccag aatcagctga aatcggtccc ggacggcgtg 600
tttgatcgtc tgaccagcct gcagtatatc tggctgcatg ataacccgtg ggattgcacc 660
tgtccgggta ttcgctacct gtctgaatgg atcaataaac acagtggcgt tgtccgtaac 720
tccgcgggtt cagttgcccc ggattcggcg aaatgctccg gcagcggtaa accggtgcgt 780
agcattattt gcccgacc 798
<210> 2
<211> 4615
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBEL118N
<400> 2
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 60
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 120
cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 180
gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 240
gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 300
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag accatggcca tgaaaataaa 360
aacaggtgca cgcatcctcg cattatccgc attaacgacg atgatgtttt ccgcctcggc 420
tctcgccgaa ttcgaaacca ttaccgtgag caccccgatc aaacagattt ttccggatga 480
cgcgttcgcc gaaacgatca aagcaaacct gaagaaaaag agcgttaccg atgctgtcac 540
gcaaaatgaa ctgaacagta ttgaccagat cattgcgaat aactccgata tcaaatcagt 600
gcaaggcatt cagtatctgc cgaatgttcg ttacctggcc ctgggtggca acaaactgca 660
tgacatctcg gcactgaaag aactgaccaa tctgacgtat ctgnnkctgn nknnkaacca 720
actgcagagc ctgccgaacg gcgtgtttga taaactgacg aacctgaaag aactgnnkct 780
gnnknnkaat caactgcagt ctctgccgga tggtgtgttc gacaaactga ccaacctgac 840
gtacctgaat ctggctcaca accaactgca gagtctgccg aaaggcgtgt ttgacaaact 900
gaccaatctg acggaactgg atctgtccta taaccaactg cagtcactgc cggaaggtgt 960
tttcgacaaa ctgacccagc tgaaagatct gcgcctgtac cagaatcagc tgaaatcggt 1020
cccggacggc gtgtttgatc gtctgaccag cctgcagtat atctggctgc atgataaccc 1080
gtgggattgc acctgtccgg gtattcgcta cctgtctgaa tggatcaata aacacagtgg 1140
cgttgtccgt aactccgcgg gttcagttgc cccggattcg gcgaaatgct ccggcagcgg 1200
taaaccggtg cgtagcatta tttgcccgac ctcgagcacc accaccacca ccactagggc 1260
ggcggctctg gtggtggttc tggtggcggc tctgagggtg gtggctctga gggtggcggt 1320
tctgagggtg gcggctctga gggaggcggt tccggtggtg gctctggttc cggtgatttt 1380
gattatgaaa agatggcaaa cgctaataag ggggctatga ccgaaaatgc cgatgaaaac 1440
gcgctacagt ctgacgctaa aggcaaactt gattctgtcg ctactgatta cggtgctgct 1500
atcgatggtt tcattggtga cgtttccggc cttgctaatg gtaatggtgc tactggtgat 1560
tttgctggct ctaattccca aatggctcaa gtcggtgacg gtgataattc acctttaatg 1620
aataatttcc gtcaatattt accttccctc cctcaatcgg ttgaatgtcg cccttttgtc 1680
tttggcgctg gtaaaccata tgaattttct attgattgtg acaaaataaa cttattccgt 1740
ggtgtctttg cgtttctttt atatgttgcc acctttatgt atgtattttc tacgtttgct 1800
aacatactgc gtaataagga gtcttagtaa ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc 1860
aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 1920
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 1980
caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgtc taagaaacca 2040
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 2100
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 2160
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 2220
ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 2280
aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat 2340
tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagcccgaga 2400
tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca 2460
acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccca 2520
aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc 2580
cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag 2640
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Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr
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Claims (8)
- 인터날린 B 단백질의 N-말단, VRL(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VRL 단백질의 C-말단이 융합된, 인터루킨-6 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 9 또는 11 내지 21 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 인터루킨-6 단백질에 결합하여 그의 활성을 저해하는 것인 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서,
상기 VRL 단백질의 변형된 반복모듈은 하기의 반복 모듈 패턴을 포함하는 것인 폴리펩티드:
LxxLxxLxLxxN
상기 패턴에서,
L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판이고;
N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌이며 및
x는 친수성 아미노산이다.
- 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
- 제6항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
- (ⅰ) 제7항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 배양된 형질전환체 또는 배양물로부터 제1항의 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 생산방법.
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