KR20120060603A - 아젤라잔틴a 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴a의 합성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자연계에서 희귀한 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하기 위한 대장균의 형질전환용 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균으로부터 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하는 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는 서열번호 5로 표시되는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자 및 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터 및 이로 형질전환된 대장균과 상기 대장균으로부터 아젤라잔틴 A를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 벡터를 이용하는 경우 자연계에서 얻기 힘든 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균 내에서 보다 높은 효율로 생산할 수 있으며, 생산된 아젤라잔틴 A는 여러 분야에 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 자연계에서 매우 희귀한 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하기 위한 대장균의 형질전환용 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균으로부터 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
카로틴노이드는 여러 미생물과 식물로부터 생산되는 자연계 색소이다. 그 구조는 매우 다양하며 항산화 효과, 포토프로텍션(photo protection), 빛-포집(light harvest), 에너지 전달, 막 유동성 조절 등 다양한 기능을 가지고 있다. 카로틴노이드는 상업적으로 식품 색소, 사료 보충제, 최근에는 기능성 식품, 화장품 원료, 약학 분야의 관심이 높아지고 있다. 현재 매우 소수의 카로틴노이드가 화학 합성이나 몇몇 자연 원료로부터의 추출을 이용하여 상업적으로 생산되고 있다. 최근의 카로틴노이드의 산업적 관심이 높아짐에 따라 다양한 구조의 카로틴노이드의 대량생산에 많은 노력과 연구가 이루어지고 있다. 흥미롭게도 최근 연구 결과에 의하면 더 복잡한 구조의 카로틴노이드가 단순한 구조에 비해 생리활성이 높은 것으로 확인되었다.
인-비트로 실험(in-vitro evolution)을 통해 CrtI와 CrtY가 작용 기능을 바꿔 대장균 내에서 새로운 구조인 테트라디하이드로라이코펜(tetradehydrolycopene)과 토룰렌(torulene)을 생산하도록 만든 예가 있었으며, 야생형과 변이된 카로틴노이드 효소를 이용하여 변이된 카로틴노이드 대사회로와 새롭게 도안된 C30 카로틴노이드 생합성 회로를 연장하여 새로운 구조의 카로틴노이드를 만들어낸 예가 있었다.
또한 조합 생합성법(combinatorial biosynthesis)을 이용하여 카로틴노이드 수정(modifying) 효소를 이종 숙주에 발현하여 새로운 구조의 카로틴노이드를 만드는 방법이 이용되어 왔는데, 이 조합 생합성법을 통한 접근은 기본적으로 여러 다른 원천의 효소들을 이종 숙주에 기능적으로 조합하는데 기초를 두고 있다. 카로틴노이드 효소들은 기질특이성이 약한 경향을 보이고, 이종 숙주에서 발현되었을 때 숨겨지거나 기대하지 않았던 역할을 수행하기도 한다. 한 가지 예로 다이아포파이토엔 디새튜라아제(diapophytoene desaturase)인 CrtN은 대장균 내에서 유비퀴논에 작용하여 새로운 구조의 물질을 만든다. 따라서 자연적으로 접근하기 힘든 새로운 구조의 물질을 만들어내는데 있어서, 조합 생합성법은 매우 강력한 방법이 될 수 있다. 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)의 경우 통상적으로 치즈 산업에 식품 염료로 사용된다. 브레비박테리움 리넨스의 경우 카로틴노이드 생합성 회로가 연구되었음에도 불구하고, 이종의 환경에서의 다운스트림(downstream) 효소들의 체계적인 기능 연구가 되어있지 않은 실정이다.
따라서, 이와 같이 기존 알려진 카로틴노이드 생합성 회로를 기초로 이를 대장균 내에서 확장 또는 추가하는 연구를 통해 재구축함으로써 자연계에서 생산이 힘든 유용한 물질을 합성할 수 있는 생합성 경로를 찾아내는 것이 필요하다.
본 발명자들은 상기와 같은 유용물질의 생합성 경로를 찾기 위해 연구, 노력한 결과 CrtU 및 CrtZ 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 이용해 대장균을 형질전환시킬 경우 일부 곰팡이균에서만 발견되던 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균 내에서 합성할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 아젤라잔틴 A를 발현시키기 위한 대장균 형질전환용 벡터를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
마지막으로 본 발명은 상기 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해,
본 발명은 서열번호 5로 표시되는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자 및 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자를 포함하는 대장균의 형질전환용 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 (a) 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 벡터를 이용하는 경우 자연계에서 얻기 힘든 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균을 통해 높은 효율로 생산할 수 있으며, 이를 통해 생산된 아젤라잔틴 A는 식품 색소, 기능성 식품, 화장품 원료 및 약학 분야 등 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 대장균 내에 구축된 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)의 카로틴노이드 생합성 회로(실선) 및 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)에서 발견되는 카로틴노이드(carotenoid) 생합성 회로(점선)를 나타낸 그림이다.
도 2는 대장균에서 생성된 베타-카로틴(β-carotene)과 그 유도체들의 HPLC분석 결과이다[(A) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUCM-UBL, (B) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUCM-UBL-P450, (C) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUC19-UBL-ZPAN, (D) pUC19-UBL-P450 벡터로 각각 형질전환시킨 경우의 결과이다; 피크1: β-carotene, 피크2: isorenieratene, 피크3: β-isorenieratene, 피크4: 7,8-dihydro-β-carotene, 피크5: zeaxanthin, 피크6: agelaxanthin A]
도 3은 아이소레니에라틴(isorenieratene), 지아잔틴(zeaxanthin) 및 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)의 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL의 벡터지도를 나타낸 그림이다.
도 5는 pUC19-UBL -ZPAN의 벡터지도를 나타낸 그림이다.
도 2는 대장균에서 생성된 베타-카로틴(β-carotene)과 그 유도체들의 HPLC분석 결과이다[(A) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUCM-UBL, (B) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUCM-UBL-P450, (C) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUC19-UBL-ZPAN, (D) pUC19-UBL-P450 벡터로 각각 형질전환시킨 경우의 결과이다; 피크1: β-carotene, 피크2: isorenieratene, 피크3: β-isorenieratene, 피크4: 7,8-dihydro-β-carotene, 피크5: zeaxanthin, 피크6: agelaxanthin A]
도 3은 아이소레니에라틴(isorenieratene), 지아잔틴(zeaxanthin) 및 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)의 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL의 벡터지도를 나타낸 그림이다.
도 5는 pUC19-UBL -ZPAN의 벡터지도를 나타낸 그림이다.
본 발명은 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A의 생합성에 관여하는 대장균 형질전환용 벡터, 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 아젤라잔틴 A의 제조방법에 관한 것이다. 이하, 이들을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 한 관점은 대장균에서 작용하는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자(서열번호 5) 및 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자(서열번호 6)를 포함하는 형질전환용 벡터에 관한 것이다.
또한 상기 벡터는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; CrtE) 유전자(서열번호 1), 파이토엔 신타제(phytoene synthase; CrtB) 유전자(서열번호 2), 파이토엔 탈포화효소(phytoene desaturase; CrtI) 유전자(서열번호 3) 및 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase; CrtYcYd) 유전자(서열번호 4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하여 구성될 수 있다. 상기 아젤라잔틴 A의 생합성 대사회로에 관여하는 유전자들은 모듈(module)화하여 사용할 수 있으며, 다양한 조합의 유전자 모듈로 제작하여 사용할 수 있다.
상기 CrtE는 파르네실 디포스페이트(Farnesyl diphosphate)를 제라닐제라닐 디포스페이트(Geranylgeranyl diphosphate)로 전환하는데 관여하는 효소이며, CrtB는 상기 제라닐제라닐 디포스페이트를 파이토엔(phytoene)으로 전환하는데 관여하는 효소이고, CrtI는 상기 파이토엔을 라이코펜(lycopene)으로 전환하는데 관여하는 효소이며, CrtYcYd는 상기 라이코펜(lycopene)을 베타-카로틴(β-carotene)으로 전환하는데 관여하는 효소이다.
본 발명의 CrtU와 CrtZ는 상기 베타-카로틴을 기질로 하여 아젤라잔틴 A와 같은 카로틴노이드를 형성하기 때문에 아젤라잔틴 A를 생합성하기 위해서는 본 발명의 CrtU와 CrtZ 효소를 반드시 포함하여야 한다.
상기 CrtU는 베타-카로틴(β-carotene)을 베타-이소레니아라틴(β-isoreniaratene)으로 전환하는데 관여하는 효소이고, CrtZ는 베타-이소레니아라틴(β-isoreniaratene)을 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)로 전환하는데 관여하는 효소이다(도 1참조).
유전자 CrtE, CrtB 및 CrtI는 특히 라이코펜을 생산하는 미생물 또는 식물 내에 존재하기 때문에 그러한 생물체의 게놈 DNA를 주형으로 하고 해당 유전자별로 그 유전자의 양 말단에 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 이용해서 PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다. 물론, 각 유전자별로 공지된 서열을 기반으로 하여 DNA 합성기 등을 이용하여 화학적으로 합성할 수도 있다. 본 발명에서 상기 유전자 CrtE, CrtB, CrtI, CrtYcYd 및 CrtU는 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 유래된 것이 바람직하다. 보통의 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase; CrtY)와는 달리 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)의 라이코펜 사이클라아제(CrtYcYd)는 헤테로다이머(heterodimer)로 존재하며, 다른 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase)와는 낮은 아미노산 서열 유사성을 보인다. 본 발명에서는 상기와 같이 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 유래한 라이코펜 사이클라아제(CrtYcYd)를 사용하여 대사 회로를 구축한 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 CrtZ는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 유래한 것을 사용한다.
유전자 출처 | 명칭 (서열번호) |
프라이머 |
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) |
CrtE (서열번호 1) |
정방향 (서열번호 7) 5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGCGGCTCCCTGGG-3` |
역방향(서열번호 8) 5`-GGAATTCTCATGCGGTGCGTGAG-3` |
||
CrtB (서열번호 2) |
정방향(서열번호 9) 5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAGCAGCTCACCTGC-3` 역방향(서열번호 10) 5`-GGAATTCTCATGCTCTGTTCTCCTTC-3` |
|
CrtI (서열번호 3) |
정방향(서열번호 11) 5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACTGAGCGCATCG-3` 역방향(서열번호 12) 5`-GGAATTCTTACTCCGTGTGTCTG-3` |
|
CrtYcYd (서열번호 4) |
정방향(서열번호 13) 5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAGCGCCTTCGAATACC-3` 역방향(서열번호 14) 5`-CCGGAATTCTCATTGGGTGTCCTTAC-3` |
|
CrtU (서열번호 5) |
정방향(서열번호 15) 5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACACAGAGACGCCGG-3` 역방향(서열번호 16) 5`-CCGGAATTCTCATCGACGTCTCCTGATG-3` |
|
판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) | CrtZ (서열번호 6) |
정방향(서열번호 17) 5`-CCGGAATTCAGGAGGATTACAAAATGCTAGTAAATAGTTTAATC-3` 역방향(서열번호 18) 5`-CATGCCATGGTTATTCGGGCGAAGACG-3` |
본 발명은 형질전환용 벡터의 한 양태로서 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 유래된 CrtE, CrtB, CrtI 및 CrtYcYd를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL를 제공하며, 또한 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)와 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 유래한 CrtU 및 CrtZ를 포함하는 pUC19-UBL-ZPAN 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 관점은 전술된 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다. 대장균 균주로는 SURE, XL1-Blue, Top10, BL21(DE3), DH5α 및 DH10B 등이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 SURE를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 대장균 균주를 본 발명의 형질전환용 벡터로 형질전환시키기 위해서는 먼저 세포막을 수용성(competent)으로 만들어야 한다. 이러한 방법은 대장균 세포를 염화칼슘(CaCl2) 용액 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 염화마그네슘(MgCl2)의 혼합 용액에 노출시킴으로써 수행할 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 화합물들은 DNA와 복합체를 형성하여 세포내로 DNA의 유입을 용이하게 해주는 역할을 한다. 또한 대장균 세포막은 전기천공에 의해서도 수용성이 될 수 있는데, 상기 전기 전류는 DNA가 세포내로 유입되도록 세포막을 파열시키는 역할을 한다.
본 발명에 따른 대장균은 아젤라잔틴 A의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자를 포함하는 형질전환 벡터로 추가로 형질전환되는 것이 바람직하다. 도 1에 나타낸 바와 같이 아젤라잔틴 A의 대사 전구체는 다양하기 때문에 상기 형질전환 벡터는 이들 중 임의의 전구체를 생산하는데 관여하여 궁극적으로는 아젤라잔틴 A의 생산을 도와줄 수 있는 임의의 유전자를 포함하는 형질전환 벡터라면 충분하다.
상기 벡터들로 형질전환된 대장균은 도 1에 나타난 여러 종류의 카로틴노이드를 생산할 수 있으며, 특히 자연계에서 매우 드물며, 일부 곰팡이균에서만 발견되는 비대칭(asymmetric) 카로틴노이드인 하기 화학식 1로 표시되는 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 합성할 수 있다.
[화학식 1]
본 발명의 또 다른 관점은 (a)상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 배양물을 얻는 단계와 (b)상기 배양물로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 배양 단계는 당업계에 공지된 대장균 배양 방법에 따라 진행될 수 있다.
본 발명에서는 한 양태로 영양배지 TB를 이용하여 약 30 ℃, 250 rpm에서 약 48 시간 동안 배양한다.
이러한 배양 과정을 통하여 얻은 배양물로부터 카로틴노이드를 분리 및 정제하기 위하여 대장균 균체만을 원심 분리한 후 여기에 유기용매를 처리하고 섞어준 다음 색이 완전히 빠질 때까지 반복적으로 추출한다. 상기 유기용매로는 아세톤, 메탄올, 헥산 등을 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 아세톤을 이용하는 것이 좋다.
상기 추출된 용액을 진공 원심 건조기를 이용해 농축하고, 농축된 용액에 에틸 아세테이트 등을 가하여 섞어 준 후, NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리한다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 물로 세척하여 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 건조기를 이용해 완전히 말리는 과정을 거침으로써 카로틴노이드를 분리할 수 있으며, 상기 카로틴노이드는 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 포함한다.
본 발명은 상기와 같이 희귀 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균 내에서 생합성할 수 있는 회로를 구축함으로써 상기 물질의 대량생산을 가능하게 한다는 특징이 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 : 형질전환용 벡터의 제조
(1) 베타-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터
pACM
-
E
BL
-
B
BL
-
I
BL
-Y
BL
의 제조
본 실시예에서 사용된 베타-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 다음 표 2와 같다.
효소명 | 유전자 | 유전자 서열 (Genbank 허가번호) |
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제 | CrtE | 서열번호 1 (AF139916) |
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 파이토엔 신타제 | CrtB | 서열번호 2 (AF139916) |
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 파이토엔 탈포화효소 | CrtI | 서열번호 3 (AF139916) |
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 라이코펜 사이클라아제 | CrtYcYd | 서열번호 4 (AF139916) |
표 2의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 및 제한 효소 | |||
유전자 | 프라이머 서열 | 제한 효소 | |
CrtE | F | 서열번호 7 | XbaI EcoRI |
R | 서열번호 8 | ||
CrtB | F | 서열번호 9 | XbaI EcoRI |
R | 서열번호 10 | ||
CrtI | F | 서열번호 11 | XbaI EcoRI |
R | 서열번호 12 | ||
CrtYcYd | F | 서열번호 13 | XbaI EcoRI |
R | 서열번호 14 |
상기 표 2의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소는 표 3과 같다. 표 2의 유전자들은 표 3에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 증폭하였다. 이들 증폭된 유전자 산물을 단백질이 지속적으로 발현되도록 프로모터 부분이 pUC19 벡터(제조사:NEB (New England Biolabs))로부터 수정된 pUCM 벡터(C. Schmidt-Dannert et al. Nature Biotechnology 2000 vol.18 750-753를 참조하여 제조)에 표 3에 열거된 제한 효소를 이용하여 제한효소 자리에 클로닝하였다. 이 상기 유전자가 각기 클로닝된 벡터로부터 프로모터 부분을 포함하여 PCR을 통해 증폭하여 증폭된 산물을 pACYC184 플라스미드(제조사: NEB (New England Biolabs))에 서브 클로닝 하였는데 순서는 CrtE, CrtB, CrtI, CrtY 순으로 서브 클로닝 하였고, 이때 사용된 제한효소 자리는 각기 표 4와 같다. 상기 과정을 통해 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL(서열번호 19) 벡터를 제조하였다.
표 2의 유전자를 서브클로닝하기 위한 프라이머 및 제한 효소 | |||
유전자 | 프라이머 서열 | 제한 효소 | |
CrtE | F | 5`-CGGGATCCCCGACTGGAAAGCG-3` | BamHI HindIII |
R | 5`-CCCAAGCTTCGGTGTGAAATACCG-3` | ||
CrtB | F | 5`-CGGGATCCCCGACTGGAAAGCG-3` | BamHI BamHI |
R | 5`-CGGGATCCCGGTGTGAAATACCG-3` | ||
CrtI | F | 5`-CCCAAGCTTCCGACTGGAAAGCG-3` | HindIII HindIII |
R | 5`-CCCAAGCTTCGGTGTGAAATACCG-3` | ||
CrtYcYd | F | 5`-ACGAGGACCCCCGACTGGAAAGCG-3` | PpuMI PpuMI |
R | 5`-ACGAGGACCCCGGTGTGAAATACCG-3` |
상기 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL 벡터는 β-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있다.
도 4은 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL의 벡터 지도를 나타내는 그림이다.
(2)
아젤라잔틴
A를 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터
pUC19
-
U
BL
-
Z
PAN
의 제조
본 발명의 아젤라잔틴 A를 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 다음 표 5와 같다.
효소명 | 유전자 | 유전자 서열 (Genbank 허가번호) |
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 베타-카로틴 디새튜라아제 | CrtU | 서열번호 5 (AF139916) |
판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) DSMZ30080 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제 | CrtZ | 서열번호 6 (D90087) |
표 5의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 및 제한 효소 | |||
유전자 | 프라이머 서열 | 제한 효소 | |
CrtU | F | 서열번호 15 | XbaI EcoRI |
R | 서열번호 16 | ||
CrtZ | F | 서열번호 17 | EcoRI NcoI |
R | 서열번호 18 |
상기 표 5의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소는 표 6과 같다. 표 5의 유전자들은 표 6에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 증폭하였다. PCR에 이용된 포워드 프라이머(forward primer; F)는 5' 말단에 제한효소자리와 최적화된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)서열(AGGAGG)과 그 뒤에 시작 코돈이 오도록 도안되었다. 증폭된 산물을 표 6에 열거된 제한 효소를 이용하여 pUC19 플라스미드(제조사 : NEB(New England Biolabs))에 각기 클로닝하였다. CrtZPAN 유전자는 pUC19-CrtZ로부터 클로닝에 사용된 제한효소로 절단한 후 클레나우(Klenow, NEB)효소를 처리해 블런트(Blunt) 말단으로 만들어 주었고, pUC19-UBL 벡터를 EcoRI 제한효소를 이용해 처리한 후 클레나우(Klenow, NEB)효소 처리하여 블런트(Blunt)말단으로 만들어 주었다. 이 벡터를 탈인산화효소(CIP(Calf Intestine Phophatase), NEB)를 처리한 후 아가로스겔로부터 겔 익스트렉션 키트(Gel extraction kit, 인트론 (주))를 이용하여 분리하였다. 이렇게 준비된 유전자와 벡터를 DNA 리가제(T4 DNA ligase, NEB)를 이용해 연결하여 pUC19-UBL-ZPAN(서열번호 20)를 제조하였다.
벡터 pUC19-UBL-ZPAN는 베타-카로틴으로부터 아젤라잔틴 A를 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있다.
도 5는 pUC19-UBL-ZPAN의 벡터 지도를 나타내는 그림이다.
실시예
2: 대장균 배양 및
카로틴노이드
생산
카로틴노이드의 생산을 위해 대장균(Escherichia coli) strain SURE(제조사: Stratagene)를 사용하였으며, 상기 실시예 1에서 제조된 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL 벡터와 pUC19-UBL-ZPAN 벡터를 각각 SURE에 도입하여 형질전환시킨 다음 배양하였다. 상기 대장균의 형질전환에는 전기천공법(electroporation)을 사용하였고, 사용한 기기는 Biorad사의 Gene pulser를 사용하여 두 개의 벡터를 동시에 형질전환시켜 발현하였다.
재조합 대장균 1 ml를 TB 50 ml 배지에 접종하고, 30 ℃에서 48 시간 동안 250 rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 형질 전환된 플라스미드(plasmid)에 항생제인 클로람페니콜(chloramphenicol) 50 μg/ml과 앰피실린(ampicillin) 100 μg/ml을 첨가하였다.
실시예
3:
카로틴노이드의
분리
카로틴노이드의 분리를 위해 상기 실시예 2에서 배양한 세포를 원심 분리 후, 아세톤(acetone) 5 ml로 색이 완전히 빠질 때 까지 반복적으로 추출하였다. 추출된 용액을 진공 원심 건조기(EZ2-Plus, Genevac)를 이용해 농축하였으며, 농축된 용액에 5 ml의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 섞어준 후, 5N NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리하였다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 3 차수로 2 번 세척하여 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 건조기를 이용해 완전히 말렸다. 완전히 마른 샘플에 500 ㎕의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 녹인 후 필터링 (0.45 um pore size GHP membrane)하여 분석에 이용하였다.
실시예
4:
카로틴노이드의
분석
카로틴노이드의 TLC분석은 헥산 : 에틸아세테이트 : 아세톤(9 : 1 : 1) 용액을 이용해 전개하였다. 10 ~ 20 ㎕의 준비된 샘플을 이용해 HPLC분석을 진행하였으며 HPLC는 80 % 아세토나이트릴(acetonitrile), 15 % 메탄올(methanol), 5 % 이소프로판올(isopropanol) 용액을 이동상으로, Zorbax eclipse XDB-C18 컬럼(4.6 X 150 mm, 5 um; Agilent Technology)을 고정상으로 하여 1 ml/min의 유속으로 분석하였다. 구조분석을 위해, HPLC retention time과 흡수 스펙트럼(spectrum), 메스 스펙트럼(mass spectrum)을 비교하여 분석하였다. 메스 스펙트럼(Mass spectrum)은 200 ~ 800 m/z 범위를 ESI(electron spray ionization) 장치를 장착한 LC/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)를 이용하여 모니터하였다.
실시예
5:
카로틴노이드의
확인
상기 실시예 4의 분석 결과, 베타-카로틴(β-carotene), 지아잔틴(zeaxanthin), 이소레니에라틴(isorenieratene)과 같은 물질들이 발견됨을 확인할 수 있었으며, 특히 CrtZ와 CrtU에 의해 비대칭(asymmetric)한 카로틴노이드(carotenoid)인 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)가 발견됨을 확인할 수 있었다(도 2 (C)의 피크 6). 아젤라잔틴 A(agelaxanthin)는 UV 스펙트럼(spectrum)이 베타-카로틴(β-carotene), 지아잔틴(zeaxanthin), 이소레니에라틴(isorenieratene)과 같으며, HPLC 분석 결과 머무름 시간(retention time)이 지아잔틴(zeaxanthin)과 이소레니에라틴(isorenieratene)의 사이에 있으며, 매스 스펙트럼 분석결과 예측한 구조와 같은 분자량을 가지고 있음을 확인함으로써 알 수 있었다(도 3).
상기 실험 결과를 통해, 자연계에서 희귀한 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 본 발명의 조합 생합성법(combinatorial biosynthesis)을 이용해 대장균 내에서 합성할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF AJOU UNIVERSITY
<120> Construction of agelaxanthin A metabolic pathway and synthesis of
agelaxanthin A through E.coli
<160> 20
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1158
<212> DNA
<213> Brevibacterium linens
<400> 1
atgcggctcc ctgggctttc agcccttggc tggtcgaaca cttcactgag ctccagccgc 60
tcattgccga acacatcgtc gaagctgaag acgatgactg actcggccac tcccatcggt 120
gacatcgcat tctcgttcga ggaccggctc gcacaagtgc tcgcggaggc acggaagcgg 180
tctcgcaccg tctctgcaca atacggacag ctctgggact cactcacaca catggccacg 240
ggcggaaagc tgatccggcc acgaatgctg ctcgacgcgc acgcggccct gggcggcaga 300
gacgaacatg ccgccgtcga cgcagcctgt gccatgcagc tgctgcacat cgccctcgtc 360
atccacgatg acgtgatcga caatgacacg atccgtcgcg gtgaagcgac gatctccggg 420
gagttcgcgt ccgaagccat gtcgcgcggc gcgctgcgac gcgatgccaa tgcgtggggc 480
atcgcaacat cgattcttgg cggtgatctc atcctcaccc tctcccattc gctcctcgcc 540
cgcctcgaca tcgaggacac caaacgacgg gccatcctcg acatcttcga tgacacagtc 600
gttgagagtg ccgccggtga acactccgat gtgtggttga gcctgcatct cgaaggggcg 660
aactctccag acgtcctggc catggtcgat cagaagaccg cagtgtattc gtttcaagca 720
ccgctgctca tcgcggccgt gctggcaggt gccgacagtg gcctcattga cgatttggcg 780
aacatctccc ggcagatcgg tgtgatctac cagctgcgcg acgatgtcct cggactgttc 840
ggtgacgaac gggagacggg gaaatccaat gtcagtgacc tccgtgaggg caaggagacc 900
ctcttgatca cgttcgctcg ctccgatccg tcctggccag aggttcacac cctcttcggg 960
gataggatgc tgagcaacgc cgatggtgat cggctgcgga aagtcatcga ggaatcagga 1020
gcactcgtgt tcgtcgaatc aatgatcacc cagcgctgcg agaacctgta tcggctcatc 1080
ggcgaggcgg ccctcccgcc agcgttgagc aaccagctga tccaactgac ctccgacgcc 1140
agctcacgca ccgcatga 1158
<210> 2
<211> 900
<212> DNA
<213> Brevibacterium linens
<400> 2
atgagcagct cacctgccta cgacgtcttc agccgaacgg cgcaacaggc agccaaggcc 60
gtcatctcga actattcgac atcgttcgga ctggctaccc ggctgctcgg accttctcac 120
cgtcatcaca tccgcaatat ctacgctctc gtccgaatcg ccgatgagat cgttgacggt 180
cttgccgccg atgcgggcct cgacacgagc gagcagcatg agatgctcga gaacttcgtc 240
gccgcgactc gcgctggact cagacatggc gtcagcgaca acctcatcat ccactccttc 300
gcccagaccg cgaacgcgac gggaatcacc ggcgatctca tcgaaccttt cttcgcctcg 360
atgagagcgg acctggaaac ccccagtgag cctttcgccc cggtccgcgg gttcgatcag 420
gacgaacacc gggcctacgt ctacggctcc gccgaggtgg tcggtctcat gtgcctcaag 480
gtcttcctgt gtggtcaatc ccgaacaccg gcccagatcg aggagctcga atacggtgcc 540
cgtcagcttg gagccgcatt ccagaacatc aacttcctcc gcgacttagc cgacgacagt 600
ctgcgacttg gccgcagcta cctcaccgct gaaacccgac tcacccagac cgagaaaagc 660
gcatgggtga cgacgattcg ccagcagctg accaacgccg acgacacgat tgcactgctg 720
ccaaaagatg ccagagccgc ggtgagaagt gccgcggcac tcttcaccgc actcaacgac 780
aagatcgcag acatccccgt cgaccgtctc tatcgggagc gtgtgcgcat cccaaacgcc 840
ctcaaagctc aactcacggc gaaagcgctg ctggccacgg cgaaggagaa cagagcatga 900
900
<210> 3
<211> 1587
<212> DNA
<213> Brevibacterium linens
<400> 3
atgactgagc gcatcggcgt catcggcgga ggtgcggcag gactggctac ggcagcactg 60
ttggcacgtg agggccacag cgtcgatctc tttgaacaga actcaactct gggcgggcgg 120
atcggttcga tcgaagaaga cggctaccga ttcgacacag gaccatcgtg gtatctgatg 180
ccggaggtct acgaacactt cttcaacctt ctcggtacga cggcggccaa cgagctcgac 240
ctgcgcacac tcgatcctgc ctacaccgtg ttcagtcccg cttcgcaggc tcggcgggaa 300
cagtcggtca cgattcctca cggcacggcc gagatcatcg acaccttcga gcgaatcgaa 360
cgcggcagcg gggccacctt ggccaaatat ctggactcgg ccaaggccac caaagactta 420
gcgatcgact acttcctgta caaccccttc acctccccga aatcgattct cagggcagag 480
ctgctcaccg cgctccccgc gctggctcgg ctgttgacca cctctctgga acgccacgcc 540
tctcgctcat tccaccatcc ggtgctgagg cagatcctcc agtacccggc catcttcctt 600
ggcaccgacc cgaggaaggc gccggccctc tatcacttga tgagtgccct cgacctcagc 660
gatggagtgc tgtacccgat gggagggttc aggaccatcg tcgatgctct gacccgactt 720
gtcgaggaat caggggtgcg agtgcgcacc gactccaccg tcacacacat atccaccgtg 780
tcagaaagtg gccgacgacg atctgccaac ggcatcgcat ggaaggatca agacggtcgc 840
gaacactttc acgactgtga catcgtcgtc tccgccgctg acctccacca cacggagacg 900
cagctcttgg gcgagggtga acgcagctac cccgagagct ggtggcagaa ggtgacaagc 960
gggccaggcg ccgtcctggt ctttctcgga gtcgaaggcg aagtcccaca gcttccccac 1020
cactcattgt tcttcaccga agactggtcg acgaacttcg acgacatctt cgggtcgcag 1080
cagaagatct cctctccggc gtcggcatat gtgtgcaaac ccagtcacac cgatccgaac 1140
gtggcgccat tcgactgcga gaatctcttc attctcatcc cggtgccggc agatgcagga 1200
ctcggggcgg ggggagacga cgggcagggg gatccgcgaa tcgagcgtgc agccgaccag 1260
gccatcgacc agatcgctga atgggccgac atccccgacc tgagagatcg gatcagattc 1320
cgccgcacat tggggccgac ggatttctcc agcaactaca attcgtggct gggagggatg 1380
ctcggaccag ctcacacctt gcgccagagc gcaatgttcc gccagcagaa tgcctccaaa 1440
aaggtggatg gactctacta cgcaggtgcg acgacggcgc cgggggtggg cgtgccgatg 1500
tgtctgatca gcgctgagct ggtcctcaaa cacattcggg gggattcgag tccgggaccg 1560
ctgccggtca cagacacacg ggagtaa 1587
<210> 4
<211> 691
<212> DNA
<213> Brevibacterium linens
<400> 4
atgagcgcct tcgaatacct gctgctgatg ggcgcctgtc tgctgattac gcttcctctc 60
gaactgctgt tctccgcccg ggtctaccgt cgcccaaagc tcctcatcgg atctctcatc 120
ccgatcatcc tcgtcttctc cctctgggac atcattgcaa ttgaccgaga ccattggacg 180
tacaaccagc agttcgtcac cggcattcac atcggcaacc tgccgctgga ggagcttgtc 240
ttcttcatag tcattccgat ctgcgccctg ctcagctacg aagcggtcgg cactgtactc 300
aaattcgtgg ccaagaagtc cggaaccagg gctggcagaa agtccgggaa ccggaaggac 360
ggaggcgatg ttgcctgaat atactgtcat gacggtggtc ggcatcgtca tcgtcatcgg 420
tcttgagatc ttcgtcttcc gcagcgggat cttccgacga ggccagtact gggcagcgct 480
ggccatctgt ctggccttcc agtgcctggt cgatgggtgg ctgaccaaac tcagtgatcc 540
catcgtcagg tacaacccgt cgcagtttct gaacgtgcgt ttcccctggg acatcccgat 600
cgaagacttc ggtttcgggt tcgccatgat cacatctgtg ctcatgctgt ggcagtggca 660
actcaaccga tcgcgtaagg acacccaatg a 691
<210> 5
<211> 1554
<212> DNA
<213> Brevibacterium linens
<400> 5
atgacacaga gacgccggcc cagagatcgc ttcgccgaga gaatccaggg cccgcaggga 60
cggccgcgac tgcttcgacc caaacgggtc accatcatcg gcgccggcat cgccggactg 120
gctgcagccg cgattttggc cgaacacggc gccgaggtca cggtcatcga gaagaccgac 180
tacctcggcg gccgagtggg cgcctggccg gtcgacgacg aacggaccat gagccgagga 240
ttccacgcct tcttccggca gtactacaac ctgcgcgacc tgctcagccg cgcagatccc 300
gaaggtgaat gcctgcggcc cgtcgacgac tacccgctca tccatcgccg aggctcgatg 360
gacacgttcg cctcaattcc ccgcaccccg ccgttcaatc tcctcggttt cgtctggcag 420
agccccacct tcccgatcag aggactccgc gacgtcgata tcgctgccgc agtcgaactc 480
atcgacgtcg agttccccgc aacgtacagc tactatgacg gcgaatctgc cgccgacttc 540
ctcgaccggt tgcgctttcc cgacgaagcc cgccatctgg cgctcgaagt cttcgcccgc 600
tccttcttcg ccgacccgac agagttctct gcgggtgagc tcgtggccat gttccacacc 660
tacttcaccg gttcagcgga agggctgctc ttcgacgtcc ccgtcgatga ctacgacaca 720
gctctatggg caccgttggg cggctacctc gagtcactgg gggtcacgat cgagacgggg 780
acgaccgtga cctcgatcga tcccaccgag tccggatgga cgaccacgac cggagaggcg 840
aacctggaaa gtgatgccgt cgtgctcgca gtcgatcctg ccgctgcccg cgatctgctc 900
agcgcaagcc atgactcgct cgtggacagc gcacccgcgg cccaacggtg gatggagacg 960
atcggctcac agaccaacgc tcccgcgttc gcagtgctgc gactgtggct cggcacgccc 1020
gtggccgacc accgaccggc cttcctgggg acaagcgggt acgacctcct tgacaacgtg 1080
tccgtacttg agcgcttcga ggccggagcc agagcgtggt ccgaatccca ccacggttcg 1140
gtcctcgaac tccacgctta tgcccttgaa ggcgattcat acgacaccga gcgtgggagg 1200
gcggacatcg ttgcgcggct tctgtcagat ctgcatcacg tctaccccga aaccgcagcc 1260
ctgaccatcg ttgaccagga gctgctcatc gaagcggact gcggtcttac tgacacccgc 1320
ccgtgggagg acaggcccga gccgtccacc ccgatccccg ggctggtggt cgccggagac 1380
tatgtgcgct gcaatacccc tgtggccttg atggaacgtg ccgccacgac tggttatctg 1440
gccgccaacc acctgctctc tacctggagg gtcgagggga cggacctgtg gtcgccaccg 1500
acccgaggcc tgcttcggcg tggagtgctc gggctcatca ggagacgtcg atga 1554
<210> 6
<211> 528
<212> DNA
<213> Pantoea ananatis
<400> 6
atgttgtgga tttggaatgc cctgatcgtt ttcgttaccg tgattggcat ggaagtgatt 60
gctgcactgg cacacaaata catcatgcac ggctggggtt ggggatggca tctttcacat 120
catgaaccgc gtaaaggtgc gtttgaagtt aacgatcttt atgccgtggt ttttgctgca 180
ttatcgatcc tgctgattta tctgggcagt acaggaatgt ggccgctcca gtggattggc 240
gcaggtatga cggcgtatgg attactctat tttatggtgc acgacgggct ggtgcatcaa 300
cgttggccat tccgctatat tccacgcaag ggctacctca aacggttgta tatggcgcac 360
cgtatgcatc acgccgtcag gggcaaagaa ggttgtgttt cttttggctt cctctatgcg 420
ccgcccctgt caaaacttca ggcgacgctc cgggaaagac atggcgctag agcgggcgct 480
gccagagatg cgcagggcgg ggaggatgag cccgcatccg ggaagtaa 528
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtE - F
<400> 7
gctctagaag gaggattaca aaatgcggct ccctggg 37
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtE - R
<400> 8
ggaattctca tgcggtgcgt gag 23
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtB - F
<400> 9
gctctagaag gaggattaca aaatgagcag ctcacctgc 39
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtB - R
<400> 10
ggaattctca tgctctgttc tccttc 26
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtI - F
<400> 11
gctctagaag gaggattaca aaatgactga gcgcatcg 38
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> prmer CrtI - R
<400> 12
ggaattctta ctccgtgtgt ctg 23
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtYcYd - F
<400> 13
gctctagaag gaggattaca aaatgagcgc cttcgaatac c 41
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtYcYd - R
<400> 14
ccggaattct cattgggtgt ccttac 26
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtU - F
<400> 15
gctctagaag gaggattaca aaatgacaca gagacgccgg 40
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtU - R
<400> 16
ccggaattct catcgacgtc tcctgatg 28
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtZ - F
<400> 17
ccggaattca ggaggattac aaaatgctag taaatagttt aatc 44
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer CrtZ - R
<400> 18
catgccatgg ttattcgggc gaagacg 27
<210> 19
<211> 9017
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pACM-EBL-BBL-IBL-YBL
<400> 19
gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60
gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120
ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180
tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240
aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300
ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360
ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420
ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480
gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540
acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600
ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660
aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720
actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780
ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840
agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900
agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttcccctg gcggctccct 960
cgtgcgctct cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg 1020
tttgtctcat tccacgcctg acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact 1080
gtatgcacga accccccgtt cagtccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 1140
agtccaaccc ggaaagacat gcaaaagcac cactggcagc agccactggt aattgattta 1200
gaggagttag tcttgaagtc atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt 1260
gactgcgctc ctccaagcca gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc 1320
gaaaaaccgc cctgcaaggc ggttttttcg ttttcagagc aagagattac gcgcagacca 1380
aaacgatctc aagaagatca tcttattaat cagataaaat atttcaagat ttcagtgcaa 1440
tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc agccccatac gatataagtt gtaattctca 1500
tgtttgacag cttatcatcg ataagcttcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 1560
aaaataccgc agcggccgcc catgggaatt cttactcccg tgtgtctgtg accggcagcg 1620
gtcccggact cgaatccccc cgaatgtgtt tgaggaccag ctcagcgctg atcagacaca 1680
tcggcacgcc cacccccggc gccgtcgtcg cacctgcgta gtagagtcca tccacctttt 1740
tggaggcatt ctgctggcgg aacattgcgc tctggcgcaa ggtgtgagct ggtccgagca 1800
tccctcccag ccacgaattg tagttgctgg agaaatccgt cggccccaat gtgcggcgga 1860
atctgatccg atctctcagg tcggggatgt cggcccattc agcgatctgg tcgatggcct 1920
ggtcggctgc acgctcgatt cgcggatccc cctgcccgtc gtctcccccc gccccgagtc 1980
ctgcatctgc cggcaccggg atgagaatga agagattctc gcagtcgaat ggcgccacgt 2040
tcggatcggt gtgactgggt ttgcacacat atgccgacgc cggagaggag atcttctgct 2100
gcgacccgaa gatgtcgtcg aagttcgtcg accagtcttc ggtgaagaac aatgagtggt 2160
ggggaagctg tgggacttcg ccttcgactc cgagaaagac caggacggcg cctggcccgc 2220
ttgtcacctt ctgccaccag ctctcggggt agctgcgttc accctcgccc aagagctgcg 2280
tctccgtgtg gtggaggtca gcggcggaga cgacgatgtc acagtcgtga aagtgttcgc 2340
gaccgtcttg atccttccat gcgatgccgt tggcagatcg tcgtcggcca ctttctgaca 2400
cggtggatat gtgtgtgacg gtggagtcgg tgcgcactcg cacccctgat tcctcgacaa 2460
gtcgggtcag agcatcgacg atggtcctga accctcccat cgggtacagc actccatcgc 2520
tgaggtcgag ggcactcatc aagtgataga gggccggcgc cttcctcggg tcggtgccaa 2580
ggaagatggc cgggtactgg aggatctgcc tcagcaccgg atggtggaat gagcgagagg 2640
cgtggcgttc cagagaggtg gtcaacagcc gagccagcgc ggggagcgcg gtgagcagct 2700
ctgccctgag aatcgatttc ggggaggtga aggggttgta caggaagtag tcgatcgcta 2760
agtctttggt ggccttggcc gagtccagat atttggccaa ggtggccccg ctgccgcgtt 2820
cgattcgctc gaaggtgtcg atgatctcgg ccgtgccgtg aggaatcgtg accgactgtt 2880
cccgccgagc ctgcgaagcg ggactgaaca cggtgtaggc aggatcgagt gtgcgcaggt 2940
cgagctcgtt ggccgccgtc gtaccgagaa ggttgaagaa gtgttcgtag acctccggca 3000
tcagatacca cgatggtcct gtgtcgaatc ggtagccgtc ttcttcgatc gaaccgatcc 3060
gcccgcccag agttgagttc tgttcaaaga gatcgacgct gtggccctca cgtgccaaca 3120
gtgctgccgt agccagtcct gccgcacctc cgccgatgac gccgatgcgc tcagtcattt 3180
tgtaatcctc cttctagacg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 3240
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 3300
ccgctttcca gtcggaagct tcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 3360
cgcagcggcc gcccatggga attctcatgc ggtgcgtgag ctggcgtcgg aggtcagttg 3420
gatcagctgg ttgctcaacg ctggcgggag ggccgcctcg ccgatgagcc gatacaggtt 3480
ctcgcagcgc tgggtgatca ttgattcgac gaacacgagt gctcctgatt cctcgatgac 3540
tttccgcagc cgatcaccat cggcgttgct cagcatccta tccccgaaga gggtgtgaac 3600
ctctggccag gacggatcgg agcgagcgaa cgtgatcaag agggtctcct tgccctcacg 3660
gaggtcactg acattggatt tccccgtctc ccgttcgtca ccgaacagtc cgaggacatc 3720
gtcgcgcagc tggtagatca caccgatctg ccgggagatg ttcgccaaat cgtcaatgag 3780
gccactgtcg gcacctgcca gcacggccgc gatgagcagc ggtgcttgaa acgaatacac 3840
tgcggtcttc tgatcgacca tggccaggac gtctggagag ttcgcccctt cgagatgcag 3900
gctcaaccac acatcggagt gttcaccggc ggcactctca acgactgtgt catcgaagat 3960
gtcgaggatg gcccgtcgtt tggtgtcctc gatgtcgagg cgggcgagga gcgaatggga 4020
gagggtgagg atgagatcac cgccaagaat cgatgttgcg atgccccacg cattggcatc 4080
gcgtcgcagc gcgccgcgcg acatggcttc ggacgcgaac tccccggaga tcgtcgcttc 4140
accgcgacgg atcgtgtcat tgtcgatcac gtcatcgtgg atgacgaggg cgatgtgcag 4200
cagctgcatg gcacaggctg cgtcgacggc ggcatgttcg tctctgccgc ccagggccgc 4260
gtgcgcgtcg agcagcattc gtggccggat cagctttccg cccgtggcca tgtgtgtgag 4320
tgagtcccag agctgtccgt attgtgcaga gacggtgcga gaccgcttcc gtgcctccgc 4380
gagcacttgt gcgagccggt cctcgaacga gaatgcgatg tcaccgatgg gagtggccga 4440
gtcagtcatc gtcttcagct tcgacgatgt gttcggcaat gagcggctgg agctcagtga 4500
agtgttcgac cagccaaggg ctgaaagccc agggagccgc attttgtaat cctccttcta 4560
gacgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 4620
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 4680
gatcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcagc ggccgcccat 4740
gggaattctc atgctctgtt ctccttcgcc gtggccagca gcgctttcgc cgtgagttga 4800
gctttgaggg cgtttgggat gcgcacacgc tcccgataga gacggtcgac ggggatgtct 4860
gcgatcttgt cgttgagtgc ggtgaagagt gccgcggcac ttctcaccgc ggctctggca 4920
tcttttggca gcagtgcaat cgtgtcgtcg gcgttggtca gctgctggcg aatcgtcgtc 4980
acccatgcgc ttttctcggt ctgggtgagt cgggtttcag cggtgaggta gctgcggcca 5040
agtcgcagac tgtcgtcggc taagtcgcgg aggaagttga tgttctggaa tgcggctcca 5100
agctgacggg caccgtattc gagctcctcg atctgggccg gtgttcggga ttgaccacac 5160
aggaagacct tgaggcacat gagaccgacc acctcggcgg agccgtagac gtaggcccgg 5220
tgttcgtcct gatcgaaccc gcggaccggg gcgaaaggct cactgggggt ttccaggtcc 5280
gctctcatcg aggcgaagaa aggttcgatg agatcgccgg tgattcccgt cgcgttcgcg 5340
gtctgggcga aggagtggat gatgaggttg tcgctgacgc catgtctgag tccagcgcga 5400
gtcgcggcga cgaagttctc gagcatctca tgctgctcgc tcgtgtcgag gcccgcatcg 5460
gcggcaagac cgtcaacgat ctcatcggcg attcggacga gagcgtagat attgcggatg 5520
tgatgacggt gagaaggtcc gagcagccgg gtagccagtc cgaacgatgt cgaatagttc 5580
gagatgacgg ccttggctgc ctgttgcgcc gttcggctga agacgtcgta ggcaggtgag 5640
ctgctcattt tgtaatcctc cttctagacg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 5700
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 5760
cgctcactgc ccgctttcca gtcggggatc ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc 5820
accggcgcca caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat 5880
cgggctcgcc acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc 5940
gtggccgggg gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg 6000
ctcaacggcc tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag 6060
cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc 6120
atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg 6180
ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc 6240
ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt 6300
cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg 6360
ctgggctacg tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc cattatgatt 6420
cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta 6480
gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag cctaacttcg 6540
atcactggac cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg 6600
ttggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt gcgtcgcggt 6660
gcatggagcc gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca 6720
ccactccaag aattggagcc aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc 6780
cttggcagaa catatccatc gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg 6840
gcagcgttgg gtcctcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcagc 6900
ggccgcccat gggaattctc attgggtgtc cttacgcgat cggttgagtt gccactgcca 6960
cagcatgagc acagatgtga tcatggcgaa cccgaaaccg aagtcttcga tcgggatgtc 7020
ccaggggaaa cgcacgttca gaaactgcga cgggttgtac ctgacgatgg gatcactgag 7080
tttggtcagc cacccatcga ccaggcactg gaaggccaga cagatggcca gcgctgccca 7140
gtactggcct cgtcggaaga tcccgctgcg gaagacgaag atctcaagac cgatgacgat 7200
gacgatgccg accaccgtca tgacagtata ttcaggcaac atcgcctccg tccttccggt 7260
tcccggactt tctgccagcc ctggttccgg acttcttggc cacgaatttg agtacagtgc 7320
cgaccgcttc gtagctgagc agggcgcaga tcggaatgac tatgaagaag acaagctcct 7380
ccagcggcag gttgccgatg tgaatgccgg tgacgaactg ctggttgtac gtccaatggt 7440
ctcggtcaat tgcaatgatg tcccagaggg agaagacgag gatgatcggg atgagagatc 7500
cgatgaggag ctttgggcga cggtagaccc gggcggagaa cagcagttcg agaggaagcg 7560
taatcagcag acaggcgccc atcagcagca ggtattcgaa ggcgctcatt ttgtaatcct 7620
ccttctagac gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 7680
ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 7740
agtcggagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg 7800
atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca 7860
tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc ccctacgtgc 7920
tgctgaagtt gcccgcaaca gagagtggaa ccaaccggtg ataccacgat actatgactg 7980
agagtcaacg ccatgagcgg cctcatttct tattctgagt tacaacagtc cgcaccgctg 8040
tccggtagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc 8100
ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc ccaacagtcc cccggccacg 8160
gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc 8220
atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat ctgtattaac gaagcgctaa 8280
ccgtttttat caggctctgg gaggcagaat aaatgatcat atcgtcaatt attacctcca 8340
cggggagagc ctgagcaaac tggcctcagg catttgagaa gcacacggtc acactgcttc 8400
cggtagtcaa taaaccggta aaccagcaat agacataagc ggctatttaa cgaccctgcc 8460
ctgaaccgac gaccgggtcg aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc 8520
acttattcag gcgtagcacc aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac 8580
gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg 8640
aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct 8700
tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg 8760
tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca 8820
ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat 8880
atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca 8940
gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg 9000
tctttcattg ccatacg 9017
<210> 20
<211> 4789
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC19-UBL-ZPAN
<400> 20
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaaggagg attacaaaat 2280
gacacagaga cgccggccca gagatcgctt cgccgagaga atccagggcc cgcagggacg 2340
gccgcgactg cttcgaccca aacgggtcac catcatcggc gccggcatcg ccggactggc 2400
tgcagccgcg attttggccg aacacggcgc cgaggtcacg gtcatcgaga agaccgacta 2460
cctcggcggc cgagtgggcg cctggccggt cgacgacgaa cggaccatga gccgaggatt 2520
ccacgccttc ttccggcagt actacaacct gcgcgacctg ctcagccgcg cagatcccga 2580
aggtgaatgc ctgcggcccg tcgacgacta cccgctcatc catcgccgag gctcgatgga 2640
cacgttcgcc tcaattcccc gcaccccgcc gttcaatctc ctcggtttcg tctggcagag 2700
ccccaccttc ccgatcagag gactccgcga cgtcgatatc gctgccgcag tcgaactcat 2760
cgacgtcgag ttccccgcaa cgtacagcta ctatgacggc gaatctgccg ccgacttcct 2820
cgaccggttg cgctttcccg acgaagcccg ccatctggcg ctcgaagtct tcgcccgctc 2880
cttcttcgcc gacccgacag agttctctgc gggtgagctc gtggccatgt tccacaccta 2940
cttcaccggt tcagcggaag ggctgctctt cgacgtcccc gtcgatgact acgacacagc 3000
tctatgggca ccgttgggcg gctacctcga gtcactgggg gtcacgatcg agacggggac 3060
gaccgtgacc tcgatcgatc ccaccgagtc cggatggacg accacgaccg gagaggcgaa 3120
cctggaaagt gatgccgtcg tgctcgcagt cgatcctgcc gctgcccgcg atctgctcag 3180
cgcaagccat gactcgctcg tggacagcgc acccgcggcc caacggtgga tggagacgat 3240
cggctcacag accaacgctc ccgcgttcgc agtgctgcga ctgtggctcg gcacgcccgt 3300
ggccgaccac cgaccggcct tcctggggac aagcgggtac gacctccttg acaacgtgtc 3360
cgtacttgag cgcttcgagg ccggagccag agcgtggtcc gaatcccacc acggttcggt 3420
cctcgaactc cacgcttatg cccttgaagg cgattcatac gacaccgagc gtgggagggc 3480
ggacatcgtt gcgcggcttc tgtcagatct gcatcacgtc taccccgaaa ccgcagccct 3540
gaccatcgtt gaccaggagc tgctcatcga agcggactgc ggtcttactg acacccgccc 3600
gtgggaggac aggcccgagc cgtccacccc gatccccggg ctggtggtcg ccggagacta 3660
tgtgcgctgc aatacccctg tggccttgat ggaacgtgcc gccacgactg gttatctggc 3720
cgccaaccac ctgctctcta cctggagggt cgaggggacg gacctgtggt cgccaccgac 3780
ccgaggcctg cttcggcgtg gagtgctcgg gctcatcagg agacgtcgat gagaattaat 3840
tcaagaagat tacaaaatgt tgtggatttg gaatgccctg atcgttttcg ttaccgtgat 3900
tggcatggaa gtgattgctg cactggcaca caaatacatc atgcacggct ggggttgggg 3960
atggcatctt tcacatcatg aaccgcgtaa aggtgcgttt gaagttaacg atctttatgc 4020
cgtggttttt gctgcattat cgatcctgct gatttatctg ggcagtacag gaatgtggcc 4080
gctccagtgg attggcgcag gtatgacggc gtatggatta ctctatttta tggtgcacga 4140
cgggctggtg catcaacgtt ggccattccg ctatattcca cgcaagggct acctcaaacg 4200
gttgtatatg gcgcaccgta tgcatcacgc cgtcaggggc aaagaaggtt gtgtttcttt 4260
tggcttcctc tatgcgccgc ccctgtcaaa acttcaggcg acgctccggg aaagacatgg 4320
cgctagagcg ggcgctgcca gagatgcgca gggcggggag gatgagcccg catccgggaa 4380
gtaaccatga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 4440
acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 4500
gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg 4560
cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt 4620
acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac 4680
gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 4740
gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcga 4789
Claims (9)
- 서열번호 5로 표시되는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자 및 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자를 포함하는 대장균의 형질전환용 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; CrtE) 유전자, 서열번호 2로 표시되는 파이토엔 신타제(phytoene synthase; CrtB) 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 파이토엔 탈포화효소(phytoene desaturase; CrtI) 유전자 및 서열번호 4로 표시되는 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase; CrtYcYd) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균의 형질전환용 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 대장균의 형질전환용 벡터.
- 제 2 항에 있어서, 상기 서열번호 4로 표시되는 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase; CrtYcYd) 유전자는 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 대장균의 형질전환용 벡터.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 선택된 어느 한 항의 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균.
- 제 5 항에 있어서, 카로틴노이드를 생산하는 것을 특징으로 하는 대장균.
- (a) 제 1 항 내지 제 4 항의 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및
(b) 상기 배양물로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계
를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법.
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KR1020100122196A KR101299567B1 (ko) | 2010-12-02 | 2010-12-02 | 아젤라잔틴a 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴a의 합성 |
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WO2023182583A1 (ko) * | 2022-03-23 | 2023-09-28 | 씨제이제일제당 (주) | 헤마토코쿠스 플루비알리스 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제를 포함하는 카로티노이드 또는 이를 전구체로 하는 물질 생산 미생물 및 이를 이용한 카로티노이드 또는 레티노이드 생산방법 |
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- 2010-12-02 KR KR1020100122196A patent/KR101299567B1/ko active IP Right Grant
Cited By (3)
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CN110423766A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-11-08 | 南京大学 | 一种番茄红素β-环化酶基因及其编码蛋白和应用 |
CN110423766B (zh) * | 2019-08-29 | 2021-06-29 | 南京大学 | 一种番茄红素β-环化酶基因及其编码蛋白和应用 |
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