KR101299567B1 - 아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성 - Google Patents

아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성 Download PDF

Info

Publication number
KR101299567B1
KR101299567B1 KR1020100122196A KR20100122196A KR101299567B1 KR 101299567 B1 KR101299567 B1 KR 101299567B1 KR 1020100122196 A KR1020100122196 A KR 1020100122196A KR 20100122196 A KR20100122196 A KR 20100122196A KR 101299567 B1 KR101299567 B1 KR 101299567B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
coli
seq
vector
gene
azeaxanthin
Prior art date
Application number
KR1020100122196A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120060603A (ko
Inventor
이평천
김세혁
Original Assignee
아주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교산학협력단 filed Critical 아주대학교산학협력단
Priority to KR1020100122196A priority Critical patent/KR101299567B1/ko
Publication of KR20120060603A publication Critical patent/KR20120060603A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101299567B1 publication Critical patent/KR101299567B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13129—Beta-carotene 3-hydroxylase (1.14.13.129)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 자연계에서 희귀한 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하기 위한 대장균의 형질전환용 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균으로부터 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하는 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는 서열번호 5로 표시되는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자 및 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터 및 이로 형질전환된 대장균과 상기 대장균으로부터 아젤라잔틴 A를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 벡터를 이용하는 경우 자연계에서 얻기 힘든 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균 내에서 보다 높은 효율로 생산할 수 있으며, 생산된 아젤라잔틴 A는 여러 분야에 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.

Description

아젤라잔틴Ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴Ａ의 합성 {Construction of agelaxanthin A metabolic pathway and synthesis of agelaxanthin A through E.coli}
본 발명은 자연계에서 매우 희귀한 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하기 위한 대장균의 형질전환용 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균으로부터 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
카로틴노이드는 여러 미생물과 식물로부터 생산되는 자연계 색소이다. 그 구조는 매우 다양하며 항산화 효과, 포토프로텍션(photo protection), 빛-포집(light harvest), 에너지 전달, 막 유동성 조절 등 다양한 기능을 가지고 있다. 카로틴노이드는 상업적으로 식품 색소, 사료 보충제, 최근에는 기능성 식품, 화장품 원료, 약학 분야의 관심이 높아지고 있다. 현재 매우 소수의 카로틴노이드가 화학 합성이나 몇몇 자연 원료로부터의 추출을 이용하여 상업적으로 생산되고 있다. 최근의 카로틴노이드의 산업적 관심이 높아짐에 따라 다양한 구조의 카로틴노이드의 대량생산에 많은 노력과 연구가 이루어지고 있다. 흥미롭게도 최근 연구 결과에 의하면 더 복잡한 구조의 카로틴노이드가 단순한 구조에 비해 생리활성이 높은 것으로 확인되었다.
인-비트로 실험(in-vitro evolution)을 통해 CrtI와 CrtY가 작용 기능을 바꿔 대장균 내에서 새로운 구조인 테트라디하이드로라이코펜(tetradehydrolycopene)과 토룰렌(torulene)을 생산하도록 만든 예가 있었으며, 야생형과 변이된 카로틴노이드 효소를 이용하여 변이된 카로틴노이드 대사회로와 새롭게 도안된 C30 카로틴노이드 생합성 회로를 연장하여 새로운 구조의 카로틴노이드를 만들어낸 예가 있었다.
또한 조합 생합성법(combinatorial biosynthesis)을 이용하여 카로틴노이드 수정(modifying) 효소를 이종 숙주에 발현하여 새로운 구조의 카로틴노이드를 만드는 방법이 이용되어 왔는데, 이 조합 생합성법을 통한 접근은 기본적으로 여러 다른 원천의 효소들을 이종 숙주에 기능적으로 조합하는데 기초를 두고 있다. 카로틴노이드 효소들은 기질특이성이 약한 경향을 보이고, 이종 숙주에서 발현되었을 때 숨겨지거나 기대하지 않았던 역할을 수행하기도 한다. 한 가지 예로 다이아포파이토엔 디새튜라아제(diapophytoene desaturase)인 CrtN은 대장균 내에서 유비퀴논에 작용하여 새로운 구조의 물질을 만든다. 따라서 자연적으로 접근하기 힘든 새로운 구조의 물질을 만들어내는데 있어서, 조합 생합성법은 매우 강력한 방법이 될 수 있다. 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)의 경우 통상적으로 치즈 산업에 식품 염료로 사용된다. 브레비박테리움 리넨스의 경우 카로틴노이드 생합성 회로가 연구되었음에도 불구하고, 이종의 환경에서의 다운스트림(downstream) 효소들의 체계적인 기능 연구가 되어있지 않은 실정이다.
따라서, 이와 같이 기존 알려진 카로틴노이드 생합성 회로를 기초로 이를 대장균 내에서 확장 또는 추가하는 연구를 통해 재구축함으로써 자연계에서 생산이 힘든 유용한 물질을 합성할 수 있는 생합성 경로를 찾아내는 것이 필요하다.
본 발명자들은 상기와 같은 유용물질의 생합성 경로를 찾기 위해 연구, 노력한 결과 CrtU 및 CrtZ 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터를 이용해 대장균을 형질전환시킬 경우 일부 곰팡이균에서만 발견되던 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균 내에서 합성할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 아젤라잔틴 A를 발현시키기 위한 대장균 형질전환용 벡터를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
마지막으로 본 발명은 상기 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해,
본 발명은 서열번호 5로 표시되는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자 및 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자를 포함하는 대장균의 형질전환용 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 (a) 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 벡터를 이용하는 경우 자연계에서 얻기 힘든 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균을 통해 높은 효율로 생산할 수 있으며, 이를 통해 생산된 아젤라잔틴 A는 식품 색소, 기능성 식품, 화장품 원료 및 약학 분야 등 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 대장균 내에 구축된 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)의 카로틴노이드 생합성 회로(실선) 및 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)에서 발견되는 카로틴노이드(carotenoid) 생합성 회로(점선)를 나타낸 그림이다.
도 2는 대장균에서 생성된 베타-카로틴(β-carotene)과 그 유도체들의 HPLC분석 결과이다[(A) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUCM-UBL, (B) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUCM-UBL-P450, (C) pACM-EBL-BBL-IBL-YBL + pUC19-UBL-ZPAN, (D) pUC19-UBL-P450 벡터로 각각 형질전환시킨 경우의 결과이다; 피크1: β-carotene, 피크2: isorenieratene, 피크3: β-isorenieratene, 피크4: 7,8-dihydro-β-carotene, 피크5: zeaxanthin, 피크6: agelaxanthin A]
도 3은 아이소레니에라틴(isorenieratene), 지아잔틴(zeaxanthin) 및 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)의 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL의 벡터지도를 나타낸 그림이다.
도 5는 pUC19-UBL -ZPAN의 벡터지도를 나타낸 그림이다.
본 발명은 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A의 생합성에 관여하는 대장균 형질전환용 벡터, 상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 아젤라잔틴 A의 제조방법에 관한 것이다. 이하, 이들을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 한 관점은 대장균에서 작용하는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자(서열번호 5) 및 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자(서열번호 6)를 포함하는 형질전환용 벡터에 관한 것이다.
또한 상기 벡터는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; CrtE) 유전자(서열번호 1), 파이토엔 신타제(phytoene synthase; CrtB) 유전자(서열번호 2), 파이토엔 탈포화효소(phytoene desaturase; CrtI) 유전자(서열번호 3) 및 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase; CrtYcYd) 유전자(서열번호 4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하여 구성될 수 있다. 상기 아젤라잔틴 A의 생합성 대사회로에 관여하는 유전자들은 모듈(module)화하여 사용할 수 있으며, 다양한 조합의 유전자 모듈로 제작하여 사용할 수 있다.
상기 CrtE는 파르네실 디포스페이트(Farnesyl diphosphate)를 제라닐제라닐 디포스페이트(Geranylgeranyl diphosphate)로 전환하는데 관여하는 효소이며, CrtB는 상기 제라닐제라닐 디포스페이트를 파이토엔(phytoene)으로 전환하는데 관여하는 효소이고, CrtI는 상기 파이토엔을 라이코펜(lycopene)으로 전환하는데 관여하는 효소이며, CrtYcYd는 상기 라이코펜(lycopene)을 베타-카로틴(β-carotene)으로 전환하는데 관여하는 효소이다.
본 발명의 CrtU와 CrtZ는 상기 베타-카로틴을 기질로 하여 아젤라잔틴 A와 같은 카로틴노이드를 형성하기 때문에 아젤라잔틴 A를 생합성하기 위해서는 본 발명의 CrtU와 CrtZ 효소를 반드시 포함하여야 한다.
상기 CrtU는 베타-카로틴(β-carotene)을 베타-이소레니아라틴(β-isoreniaratene)으로 전환하는데 관여하는 효소이고, CrtZ는 베타-이소레니아라틴(β-isoreniaratene)을 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)로 전환하는데 관여하는 효소이다(도 1참조).
유전자 CrtE, CrtB 및 CrtI는 특히 라이코펜을 생산하는 미생물 또는 식물 내에 존재하기 때문에 그러한 생물체의 게놈 DNA를 주형으로 하고 해당 유전자별로 그 유전자의 양 말단에 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 이용해서 PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다. 물론, 각 유전자별로 공지된 서열을 기반으로 하여 DNA 합성기 등을 이용하여 화학적으로 합성할 수도 있다. 본 발명에서 상기 유전자 CrtE, CrtB, CrtI, CrtYcYd 및 CrtU는 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 유래된 것이 바람직하다. 보통의 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase; CrtY)와는 달리 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)의 라이코펜 사이클라아제(CrtYcYd)는 헤테로다이머(heterodimer)로 존재하며, 다른 라이코펜 사이클라아제(lycopene cyclase)와는 낮은 아미노산 서열 유사성을 보인다. 본 발명에서는 상기와 같이 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 유래한 라이코펜 사이클라아제(CrtYcYd)를 사용하여 대사 회로를 구축한 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 CrtZ는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 유래한 것을 사용한다.
유전자 출처 명칭
(서열번호)		 프라이머








브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)
CrtE
(서열번호 1)		 정방향 (서열번호 7)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGCGGCTCCCTGGG-3`
역방향(서열번호 8)
5`-GGAATTCTCATGCGGTGCGTGAG-3`

CrtB
(서열번호 2)		 정방향(서열번호 9)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAGCAGCTCACCTGC-3`
역방향(서열번호 10)
5`-GGAATTCTCATGCTCTGTTCTCCTTC-3`

CrtI
(서열번호 3)		 정방향(서열번호 11)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACTGAGCGCATCG-3`
역방향(서열번호 12)
5`-GGAATTCTTACTCCGTGTGTCTG-3`

CrtYcYd
(서열번호 4)		 정방향(서열번호 13)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAGCGCCTTCGAATACC-3`
역방향(서열번호 14)
5`-CCGGAATTCTCATTGGGTGTCCTTAC-3`

CrtU
(서열번호 5)		 정방향(서열번호 15)
5`-GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGACACAGAGACGCCGG-3`
역방향(서열번호 16)
5`-CCGGAATTCTCATCGACGTCTCCTGATG-3`
판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)
CrtZ
(서열번호 6)		 정방향(서열번호 17)
5`-CCGGAATTCAGGAGGATTACAAAATGCTAGTAAATAGTTTAATC-3`
역방향(서열번호 18)
5`-CATGCCATGGTTATTCGGGCGAAGACG-3`
본 발명은 형질전환용 벡터의 한 양태로서 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)로부터 유래된 CrtE, CrtB, CrtI 및 CrtYcYd를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL를 제공하며, 또한 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens)와 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 유래한 CrtU 및 CrtZ를 포함하는 pUC19-UBL-ZPAN 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 관점은 전술된 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다. 대장균 균주로는 SURE, XL1-Blue, Top10, BL21(DE3), DH5α 및 DH10B 등이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 SURE를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 대장균 균주를 본 발명의 형질전환용 벡터로 형질전환시키기 위해서는 먼저 세포막을 수용성(competent)으로 만들어야 한다. 이러한 방법은 대장균 세포를 염화칼슘(CaCl2) 용액 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 염화마그네슘(MgCl2)의 혼합 용액에 노출시킴으로써 수행할 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 화합물들은 DNA와 복합체를 형성하여 세포내로 DNA의 유입을 용이하게 해주는 역할을 한다. 또한 대장균 세포막은 전기천공에 의해서도 수용성이 될 수 있는데, 상기 전기 전류는 DNA가 세포내로 유입되도록 세포막을 파열시키는 역할을 한다.
본 발명에 따른 대장균은 아젤라잔틴 A의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자를 포함하는 형질전환 벡터로 추가로 형질전환되는 것이 바람직하다. 도 1에 나타낸 바와 같이 아젤라잔틴 A의 대사 전구체는 다양하기 때문에 상기 형질전환 벡터는 이들 중 임의의 전구체를 생산하는데 관여하여 궁극적으로는 아젤라잔틴 A의 생산을 도와줄 수 있는 임의의 유전자를 포함하는 형질전환 벡터라면 충분하다.
상기 벡터들로 형질전환된 대장균은 도 1에 나타난 여러 종류의 카로틴노이드를 생산할 수 있으며, 특히 자연계에서 매우 드물며, 일부 곰팡이균에서만 발견되는 비대칭(asymmetric) 카로틴노이드인 하기 화학식 1로 표시되는 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 합성할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112010079587629-pat00001
본 발명의 또 다른 관점은 (a)상기 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 배양물을 얻는 단계와 (b)상기 배양물로부터 카로틴노이드를 분리하는 단계를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 카로틴노이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 배양 단계는 당업계에 공지된 대장균 배양 방법에 따라 진행될 수 있다.
본 발명에서는 한 양태로 영양배지 TB를 이용하여 약 30 ℃, 250 rpm에서 약 48 시간 동안 배양한다.
이러한 배양 과정을 통하여 얻은 배양물로부터 카로틴노이드를 분리 및 정제하기 위하여 대장균 균체만을 원심 분리한 후 여기에 유기용매를 처리하고 섞어준 다음 색이 완전히 빠질 때까지 반복적으로 추출한다. 상기 유기용매로는 아세톤, 메탄올, 헥산 등을 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 아세톤을 이용하는 것이 좋다.
상기 추출된 용액을 진공 원심 건조기를 이용해 농축하고, 농축된 용액에 에틸 아세테이트 등을 가하여 섞어 준 후, NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리한다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 물로 세척하여 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 건조기를 이용해 완전히 말리는 과정을 거침으로써 카로틴노이드를 분리할 수 있으며, 상기 카로틴노이드는 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)를 포함한다.
본 발명은 상기와 같이 희귀 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 대장균 내에서 생합성할 수 있는 회로를 구축함으로써 상기 물질의 대량생산을 가능하게 한다는 특징이 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 형질전환용 벡터의 제조
(1) 베타-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 pACM - E BL - B BL - I BL -Y BL 의 제조
본 실시예에서 사용된 베타-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 다음 표 2와 같다.
효소명 유전자 유전자 서열 (Genbank 허가번호)
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제 CrtE 서열번호 1 (AF139916)
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 파이토엔 신타제 CrtB 서열번호 2 (AF139916)
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 파이토엔 탈포화효소 CrtI 서열번호 3 (AF139916)
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 라이코펜 사이클라아제 CrtYcYd 서열번호 4 (AF139916)
표 2의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 및 제한 효소
유전자 프라이머 서열 제한 효소
CrtE F 서열번호 7 XbaI
EcoRI
R 서열번호 8
CrtB F 서열번호 9 XbaI
EcoRI
R 서열번호 10
CrtI F 서열번호 11 XbaI
EcoRI
R 서열번호 12
CrtYcYd F 서열번호 13 XbaI
EcoRI
R 서열번호 14
상기 표 2의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소는 표 3과 같다. 표 2의 유전자들은 표 3에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 증폭하였다. 이들 증폭된 유전자 산물을 단백질이 지속적으로 발현되도록 프로모터 부분이 pUC19 벡터(제조사:NEB (New England Biolabs))로부터 수정된 pUCM 벡터(C. Schmidt-Dannert et al. Nature Biotechnology 2000 vol.18 750-753를 참조하여 제조)에 표 3에 열거된 제한 효소를 이용하여 제한효소 자리에 클로닝하였다. 이 상기 유전자가 각기 클로닝된 벡터로부터 프로모터 부분을 포함하여 PCR을 통해 증폭하여 증폭된 산물을 pACYC184 플라스미드(제조사: NEB (New England Biolabs))에 서브 클로닝 하였는데 순서는 CrtE, CrtB, CrtI, CrtY 순으로 서브 클로닝 하였고, 이때 사용된 제한효소 자리는 각기 표 4와 같다. 상기 과정을 통해 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL(서열번호 19) 벡터를 제조하였다.
표 2의 유전자를 서브클로닝하기 위한 프라이머 및 제한 효소
유전자 프라이머 서열 제한 효소
CrtE F 5`-CGGGATCCCCGACTGGAAAGCG-3` BamHI
HindIII
R 5`-CCCAAGCTTCGGTGTGAAATACCG-3`
CrtB F 5`-CGGGATCCCCGACTGGAAAGCG-3` BamHI
BamHI
R 5`-CGGGATCCCGGTGTGAAATACCG-3`
CrtI F 5`-CCCAAGCTTCCGACTGGAAAGCG-3` HindIII
HindIII
R 5`-CCCAAGCTTCGGTGTGAAATACCG-3`
CrtYcYd F 5`-ACGAGGACCCCCGACTGGAAAGCG-3` PpuMI
PpuMI
R 5`-ACGAGGACCCCGGTGTGAAATACCG-3`
상기 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL 벡터는 β-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있다.
도 4은 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL의 벡터 지도를 나타내는 그림이다.
(2) 아젤라잔틴 A를 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 pUC19 - U BL - Z PAN 의 제조
본 발명의 아젤라잔틴 A를 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 다음 표 5와 같다.
효소명 유전자 유전자 서열 (Genbank 허가번호)
브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens) DSMZ20426 유래의 베타-카로틴 디새튜라아제 CrtU 서열번호 5 (AF139916)
판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) DSMZ30080 유래의 베타-카로틴 하이드록실라제 CrtZ 서열번호 6 (D90087)
표 5의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 및 제한 효소
유전자 프라이머 서열 제한 효소
CrtU F 서열번호 15 XbaI
EcoRI
R 서열번호 16
CrtZ F 서열번호 17 EcoRI
NcoI
R 서열번호 18
상기 표 5의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소는 표 6과 같다. 표 5의 유전자들은 표 6에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 증폭하였다. PCR에 이용된 포워드 프라이머(forward primer; F)는 5' 말단에 제한효소자리와 최적화된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno)서열(AGGAGG)과 그 뒤에 시작 코돈이 오도록 도안되었다. 증폭된 산물을 표 6에 열거된 제한 효소를 이용하여 pUC19 플라스미드(제조사 : NEB(New England Biolabs))에 각기 클로닝하였다. CrtZPAN 유전자는 pUC19-CrtZ로부터 클로닝에 사용된 제한효소로 절단한 후 클레나우(Klenow, NEB)효소를 처리해 블런트(Blunt) 말단으로 만들어 주었고, pUC19-UBL 벡터를 EcoRI 제한효소를 이용해 처리한 후 클레나우(Klenow, NEB)효소 처리하여 블런트(Blunt)말단으로 만들어 주었다. 이 벡터를 탈인산화효소(CIP(Calf Intestine Phophatase), NEB)를 처리한 후 아가로스겔로부터 겔 익스트렉션 키트(Gel extraction kit, 인트론 (주))를 이용하여 분리하였다. 이렇게 준비된 유전자와 벡터를 DNA 리가제(T4 DNA ligase, NEB)를 이용해 연결하여 pUC19-UBL-ZPAN(서열번호 20)를 제조하였다.
벡터 pUC19-UBL-ZPAN는 베타-카로틴으로부터 아젤라잔틴 A를 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있다.
도 5는 pUC19-UBL-ZPAN의 벡터 지도를 나타내는 그림이다.
실시예 2: 대장균 배양 및 카로틴노이드 생산
카로틴노이드의 생산을 위해 대장균(Escherichia coli) strain SURE(제조사: Stratagene)를 사용하였으며, 상기 실시예 1에서 제조된 pACM-EBL-BBL-IBL-YBL 벡터와 pUC19-UBL-ZPAN 벡터를 각각 SURE에 도입하여 형질전환시킨 다음 배양하였다. 상기 대장균의 형질전환에는 전기천공법(electroporation)을 사용하였고, 사용한 기기는 Biorad사의 Gene pulser를 사용하여 두 개의 벡터를 동시에 형질전환시켜 발현하였다.
재조합 대장균 1 ml를 TB 50 ml 배지에 접종하고, 30 ℃에서 48 시간 동안 250 rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 형질 전환된 플라스미드(plasmid)에 항생제인 클로람페니콜(chloramphenicol) 50 μg/ml과 앰피실린(ampicillin) 100 μg/ml을 첨가하였다.
실시예 3: 카로틴노이드의 분리
카로틴노이드의 분리를 위해 상기 실시예 2에서 배양한 세포를 원심 분리 후, 아세톤(acetone) 5 ml로 색이 완전히 빠질 때 까지 반복적으로 추출하였다. 추출된 용액을 진공 원심 건조기(EZ2-Plus, Genevac)를 이용해 농축하였으며, 농축된 용액에 5 ml의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 섞어준 후, 5N NaCl 용액을 가하여 용액 층을 분리하였다. 색이 포함된 상층을 분리 후, 3 차수로 2 번 세척하여 남은 수분을 제거한 후, 진공 원심 건조기를 이용해 완전히 말렸다. 완전히 마른 샘플에 500 ㎕의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 녹인 후 필터링 (0.45 um pore size GHP membrane)하여 분석에 이용하였다.
실시예 4: 카로틴노이드의 분석
카로틴노이드의 TLC분석은 헥산 : 에틸아세테이트 : 아세톤(9 : 1 : 1) 용액을 이용해 전개하였다. 10 ~ 20 ㎕의 준비된 샘플을 이용해 HPLC분석을 진행하였으며 HPLC는 80 % 아세토나이트릴(acetonitrile), 15 % 메탄올(methanol), 5 % 이소프로판올(isopropanol) 용액을 이동상으로, Zorbax eclipse XDB-C18 컬럼(4.6 X 150 mm, 5 um; Agilent Technology)을 고정상으로 하여 1 ml/min의 유속으로 분석하였다. 구조분석을 위해, HPLC retention time과 흡수 스펙트럼(spectrum), 메스 스펙트럼(mass spectrum)을 비교하여 분석하였다. 메스 스펙트럼(Mass spectrum)은 200 ~ 800 m/z 범위를 ESI(electron spray ionization) 장치를 장착한 LC/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)를 이용하여 모니터하였다.
실시예 5: 카로틴노이드의 확인
상기 실시예 4의 분석 결과, 베타-카로틴(β-carotene), 지아잔틴(zeaxanthin), 이소레니에라틴(isorenieratene)과 같은 물질들이 발견됨을 확인할 수 있었으며, 특히 CrtZ와 CrtU에 의해 비대칭(asymmetric)한 카로틴노이드(carotenoid)인 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A)가 발견됨을 확인할 수 있었다(도 2 (C)의 피크 6). 아젤라잔틴 A(agelaxanthin)는 UV 스펙트럼(spectrum)이 베타-카로틴(β-carotene), 지아잔틴(zeaxanthin), 이소레니에라틴(isorenieratene)과 같으며, HPLC 분석 결과 머무름 시간(retention time)이 지아잔틴(zeaxanthin)과 이소레니에라틴(isorenieratene)의 사이에 있으며, 매스 스펙트럼 분석결과 예측한 구조와 같은 분자량을 가지고 있음을 확인함으로써 알 수 있었다(도 3).
상기 실험 결과를 통해, 자연계에서 희귀한 카로틴노이드인 아젤라잔틴 A를 본 발명의 조합 생합성법(combinatorial biosynthesis)을 이용해 대장균 내에서 합성할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 5로 표시되는 베타-카로틴 디새튜라아제(β-carotene desaturase; CrtU) 유전자 및 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 아젤라잔틴 A(agelaxanthin A) 생산용 대장균의 형질전환용 벡터.
    [화학식 1]
    Figure 112013001874457-pat00009

  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 6으로 표시되는 베타-카로틴 하이드록실라제(β-carotene hydroxylase; CrtZ) 유전자는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 대장균의 형질전환용 벡터.
  4. 삭제
  5. 제 1 항의 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균.
  6. 제 5 항에 있어서, 하기 화학식 1로 표시되는 아젤라잔틴 A를 생산하는 것을 특징으로 하는 대장균.
    [화학식 1]
    Figure 112013001874457-pat00002

  7. 삭제
  8. (a) 제 1 항의 형질전환용 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 배양물로부터 하기 화학식 1로 표시되는 아젤라잔틴 A를 분리하는 단계
    를 포함하는 형질전환된 대장균으로부터 아젤라잔틴 A를 생산하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112013001874457-pat00003

  9. 삭제
KR1020100122196A 2010-12-02 2010-12-02 아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성 KR101299567B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100122196A KR101299567B1 (ko) 2010-12-02 2010-12-02 아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100122196A KR101299567B1 (ko) 2010-12-02 2010-12-02 아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120060603A KR20120060603A (ko) 2012-06-12
KR101299567B1 true KR101299567B1 (ko) 2013-08-23

Family

ID=46611489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100122196A KR101299567B1 (ko) 2010-12-02 2010-12-02 아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101299567B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423766B (zh) * 2019-08-29 2021-06-29 南京大学 一种番茄红素β-环化酶基因及其编码蛋白和应用
KR20230138333A (ko) * 2022-03-23 2023-10-05 씨제이제일제당 (주) 헤마토코쿠스 플루비알리스 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제를 포함하는 카로티노이드 또는 이를 전구체로 하는 물질 생산 미생물 및 이를 이용한 카로티노이드 또는 레티노이드 생산방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100788479B1 (ko) * 2005-11-25 2007-12-24 부경대학교 산학협력단 카로티노이드 생합성 유전자를 이용한 대장균으로부터아스타잔틴의 생산

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100788479B1 (ko) * 2005-11-25 2007-12-24 부경대학교 산학협력단 카로티노이드 생합성 유전자를 이용한 대장균으로부터아스타잔틴의 생산

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number AF139916(2000.06.15.) *
GenBank Accession Number AF139916(2000.06.15.)*
GenBank Accession Number D90087(2008.08.05.) *
GenBank Accession Number D90087(2008.08.05.)*
Pyung Cheon Lee 등. Chemistry & Biology. 2003, Vol. 10, 페이지 453-462. *
Pyung Cheon Lee 등. Chemistry & Biology. 2003, Vol. 10, 페이지 453-462.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120060603A (ko) 2012-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6818239B2 (en) Processes for extracting carotenoids and for preparing feed materials
Lee et al. Biosynthesis of structurally novel carotenoids in Escherichia coli
US9963731B2 (en) Method for producing carotenoids each having 50 carbon atoms
Cataldo et al. Heterologous production of the epoxycarotenoid violaxanthin in Saccharomyces cerevisiae
DE69631924D1 (de) Fermentative Herstellung von Carotenoiden
Will Chen et al. Mass production of C 50 carotenoids by Haloferax mediterranei in using extruded rice bran and starch under optimal conductivity of brined medium
US20050003474A1 (en) Carotenoid biosynthesis
Zhang et al. Reconstruction of the carotenoid biosynthetic pathway of Cronobacter sakazakii BAA894 in Escherichia coli
CN106801028B (zh) 产高含量玉米黄素或虾青素工程菌及其应用
KR101299567B1 (ko) 아젤라잔틴ａ 대사회로의 구축 및 대장균을 통한 아젤라잔틴ａ의 합성
Watcharawipas et al. Red yeasts and their carotenogenic enzymes for microbial carotenoid production
EP1201762B1 (en) Process for producing lycopen
WO2013019051A2 (ko) 미생물로부터 레티노이드를 생산하는 방법
US11104927B2 (en) Recombinant microorganism for producing crocin and method for producing crocin using the same
Huang et al. GATA transcription factor WC2 regulates the biosynthesis of astaxanthin in yeast Xanthophyllomyces dendrorhous
KR101293076B1 (ko) 스타필로잔틴 대사회로의 완성 및 대장균을 통한 신규 구조의 스타필로잔틴 유사 카로틴노이드의 생합성
KR101701976B1 (ko) 고순도 유리형 아스타잔틴을 제조하는 방법
KR101364590B1 (ko) 스타필로잔틴 대사회로의 완성 및 대장균을 통한 신규 구조의 스타필로잔틴 유사 카로틴노이드의 생합성
KR20100001773A (ko) 2차 효소반응을 이용하여 헤마토코커스 풀루비알리스균주로부터 아스타잔틴의 추출방법
WO2022102595A1 (ja) 形質転換体並びにそれを用いるカロテノイド組成物の製造方法
KR20150141447A (ko) 베타-카로틴의 고효율 생산 방법 및 그의 용도
US20240368663A1 (en) Cell-free bioproduction of b-cryptoxanthin and zeaxanthin
Li et al. Nonnatural biosynthetic pathway for 2-hydroxylated xanthophylls with C50-carotenoid backbone
WO2023004302A2 (en) Cell-free bioproduction of b-cryptoxanthin and zeaxanthin
CN113528471A (zh) 一种从头合成黄烷酮的三功能酶及其合成方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160719

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170717

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180704

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190702

Year of fee payment: 7