CN108586571B - 一种新抗霉素衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体是一种新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株发酵产生的新结构的新霉素衍生物及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过基因敲除新抗霉素生物合成基因簇中的natE基因，获得该菌株。该菌株可定向积累两个新的组分NAT‑H和NAT‑I，而不再产生新抗霉素NAT‑A和NAT‑F组分，而且新组分的产量与原有组分产量相当，并且对八种肿瘤细胞均具有显著的抑制活性，并且对大部分细胞系的抑制活性优于对照药物Cisplatin。

Description

一种新抗霉素衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体地说，是一种新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株发酵产生的新结构的新抗霉素衍生物，以及它们的制备方法及应用。

背景技术

新抗霉素(neoantimycin，NAT)是新型抗肿瘤和抗真菌缩酚肽类天然产物，其分子骨架为十五元环四重内酯，并有一个3-N-甲酰氨基水杨酸酰基(3-formamidosalicylicacid,FSA)、两个烷基和一个苄基侧链。从链霉菌发酵产物中先后发现了以下十二个新抗霉素类似物，其结构差别主要在于分子母环C1位的羟基化或酮基化修饰、烷基侧链的大小、水杨酸酰基是否有氮取代或N-甲酰化修饰。

其中，起初发现新抗霉素化合物SW-163A和SW-163B具有免疫抑制和抗真菌活性(Takahashi,K.et al,SW-163A and B,novel immunosuppressants produced byStreptomyces sp.，J Antibiot(Tokyo).2001,54,867-873)，随后发现其结构类似物prunustatin A、JBIR-04和JBIR-05对肿瘤细胞靶点蛋白GRP78(葡萄糖调节蛋白)的表达有负调控作用(Umeda,Y.et al,Absolute structure of prunustatin A,a novelGRP78molecular chaperone down-regulator，Org Lett.2007,9,4239-4242；Izumikawa,M.et al,Novel GRP78 molecular chaperone expression down-regulators JBIR-04and-05 isolated from Streptomyces violaceoniger，J Antibiot(Tokyo).2007,60,640-644)，最近又发现新抗霉素类化合物NAT-A、NAT-F、NAT-G和NAT-H对癌变关键靶点KRAS的胞膜定位和结肠癌细胞株SW620的多重耐药性均有显著抑制作用(Salim,A.A.et al,Rare Streptomyces N-formyl amino-salicylamides inhibit oncogenic K-Ras，OrgLett.2014,16,5036-5039)。

新抗霉素生物合成是由非核糖体多肽合酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)和聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)多功能大蛋白通过装配线模式负责完成的。我们从土壤来源链霉菌S.conglobatus中发现了新抗霉素生物合成基因簇。负责新抗霉素内酯环分子骨架合成的NRPS-PKS包含五个碳链延伸步骤，依次加载FSA起始单位、苏氨酸、3-甲基-2-酮基丁酸、2-酮基苯丙酸、2-甲基丙二酸、3-甲基-2-酮基戊酸(Li,X.et al,Chemical variation from the neoantimycin depsipeptide assembly line，BioorgMed Chem Lett.2013,23,5123-5127)。以链霉菌S.conglobatus产生的新抗霉素NAT-A和NAT-F为例，生物合成途径推理如图1所示。其中，新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因natE(SEQ ID NO.6)负责还原C1位酮基为羟基，从而导致NAT-H和NAT-I分别转化为NAT-A和NAT-F。其中虽然NAT-H已经有文献报道，但是NAT-I的结构属于推测的，现有技术中无法得到，其结构表征以及是否具有抗肿瘤活性或其他药效也属于未知的。而敲除新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因natE后，链霉菌S.conglobatus是否就不产生NAT-A和NAT-F而直接得到NAT-H和NAT-I，也没有文献报道。

发明内容

发明人根据新抗霉素的生物合成途径推测，在新抗霉素产生菌株缺失酮基还原酶基因natE的情况下，该生物合成途径的最后还原步骤将不能完成，进而将不能产生含C1位羟基的新抗霉素组分，而仅能积累含C1位酮基的新抗霉素衍生物。据此，本发明通过敲除新抗霉素生物合成基因簇中的natE基因获得基因缺失菌株(简称突变株)，命名为RJ8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(简称CGMCC)，保藏日期2018年3月28日，保藏编号CGMCC No：15522。HPLC-MS检测发酵产物发现突变株RJ8定向积累两个新的组分，而不再产生新抗霉素NAT-A和NAT-F组分，而且新组分的产量与原有组分产量相当。从突变株RJ8发酵产物中分离两个新组分并进行结构鉴定，发现分别为已知化合物新抗霉素NAT-H和新结构衍生物NAT-I。突变株RJ8产生的新抗霉素NAT-H和NAT-I对八种肿瘤细胞均具有显著的抑制活性，并且对大部分细胞系的抑制活性优于对照药物Cisplatin。

本发明的第一目的在于，提供一种新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株，命名为RJ8，保藏于CGMCC，保藏日期2018年3月28日，保藏编号CGMCC No：15522。

本发明的第二目的在于，提供一种构建突变株RJ8的方法，其特征在于，其包括步骤：

a)构建携带同源重组片段的质粒，用于敲除新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因natE；

b)将步骤a构建的质粒转入携带结合转移辅助质粒的中转宿主菌；

c)将步骤b获得的中转宿主菌和目标宿主菌链霉菌S.conglobatus混合培养，筛选出发生同源重组后产生的新抗霉素生物合成途径natE基因缺失菌株。

本发明的一较佳实施例中，所述的方法步骤a具体为：

以链霉菌S.conglobatus基因组DNA为模板，以n7-L-F(SEQ ID NO.1)和n7-L-R(SEQ ID NO.2)为引物通过PCR扩增得到1105bp的同源重组左臂PCR片段(SEQ ID NO.7)，以n7-R-F(SEQ ID NO.3)和n7-R-R(SEQ ID NO.4)为引物通过PCR扩增得到1089bp的同源重组右臂PCR片段(SEQ ID NO.8)，。

以具有大肠杆菌和链霉菌双亲接合转移功能的质粒pRJ2为载体，经过限制性内切酶XbaI和EcoRI处理后，经凝胶电泳回收7758bp的载体片段如SEQ ID NO.5所示。

通过Gibson组装连接两个PCR片段和载体片段，然后转入大肠杆菌E.coli DH10B或E.coli DH5a或E.coli JM109，并经筛选获得目标克隆pRJ28。

进一步的，步骤b中，所述的中转宿主菌为携带结合转移辅助质粒pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567或其它缺少DNA甲基化修饰系统的大肠杆菌。从大肠杆菌E.coliDH10B或E.coli DH5a或E.coli JM109中提取质粒pRJ28，并转入含质粒pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567或其它缺少DNA甲基化修饰系统的大肠杆菌。

进一步的，步骤c中，混合培养包括步骤：

(c1)挑取步骤b得到的含有质粒pRJ28和pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567单菌落接种进行培养，然后收集菌体备用；

(c2)将链霉菌S.conglobatus进行预培养，收集萌发孢子；

(c3)将链霉菌S.conglobatus萌发孢子和含有质粒pRJ28和pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567菌体混合培养；选取潮霉素敏感的菌株进行PCR测序验证，确认新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株。

更进一步的，步骤c1中，培养选用LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)，并加入抗生素终浓度为：安卡青霉素100μg/L，氯霉素25μg/L，卡那霉素50μg/L。

更进一步的，步骤c2具体为：将链霉菌S.conglobatus接种在SFM固体平板培养基(2％大豆粉，2％D-甘露醇，2％琼脂)上，27～32℃培养4～6天后用棉棒收集孢子，并悬浮孢子于无抗生素的LB培养基中，50℃热激8～12min，冰浴2～3min，然后37℃，220rpm摇床培养2.5～3.5h，再通过12000rpm离心收集预萌发孢子，然后用无抗生素的LB培养基重悬孢子。

更进一步的，步骤c3具体为：将链霉菌S.conglobatus萌发孢子和步骤b制得的大肠杆菌混合于LB培养基中，均匀涂布在SFM平板上，27～32℃培养23h后用进行覆盖，覆盖液为含18～22μg/L萘啶酮酸和45～55μg/L潮霉素的水溶液；待平板晾干后至于27～32℃培养4～6天后可见结合转移子，挑取单菌落于SFM平板进行复证，27～32℃培养4～5天后，取孢子在无抗生素的SFM平板上进行松弛培养，27～32℃培养4～6天后再次转接无抗生素的SFM平板；然后取孢子悬浮于无菌水，在SFM平板上制备单菌落；挑取单菌落做含潮霉素45～55μg/L和不含抗生素的对照SFM平板培养筛选，选取潮霉素敏感的菌株进行PCR测序验证，最终获得natE基因缺失的突变株RJ8。

本发明的第三目的在于，提供一种上述突变株RJ8产生的新抗霉素衍生物，其结构式如下：

本发明的第四目的在于，提供一种制备下列两种新抗霉素衍生物的方法，

其特征在于，所述的新抗霉素衍生物由上述的基因缺失菌株发酵得到。

本发明的第五目的在于，提供上述的突变株RJ8在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第六目的在于，提供上述的新结构的新抗霉素衍生物(NAT-I)的在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述抗肿瘤药物可用于预防和/或治疗黑色素瘤、结肠癌、宫颈癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌和胶质瘤中的一种或多种。

本发明优点在于：

本发明根据对新抗霉素生物合成途径的推论，通过基因敲除新抗霉素生物合成基因簇中的natE基因，获得突变株RJ8。HPLC-MS检测发酵产物发现突变株RJ8定向积累两个新的组分，而不再产生新抗霉素NAT-A和NAT-F组分，而且新组分的产量与原有组分产量相当。从突变株RJ8发酵产物中分离两个新组分并进行结构鉴定，发现分别为已知化合物NAT-H和新结构衍生物NAT-I。突变株RJ8产生的新抗霉素NAT-H和NAT-I对八种肿瘤细胞均具有显著的抑制活性，并且对大部分细胞系的抑制活性优于对照药物Cisplatin。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏日期：2018年3月28日

保藏编号：CGMCC No：15522

分类命名：Streptomyces conglobatus

附图说明

图1为突变株RJ8的构建原理过程的示意图；

图2为突变株RJ8和野生型菌株WT的发酵产物的HPLC-MS谱图。

图3为新抗霉素NAT-A的生物合成机制图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1突变株RJ8的构建

突变株RJ8的构建原理过程如图1所示，本发明通过携带同源重组片段的质粒与宿主菌(WT)染色体目标区域发生同源重组双交换后获得natE基因缺失的突变株RJ8。

具体通过以下步骤实现：

a)natE基因敲除质粒的构建

以链霉菌S.conglobatus基因组DNA为模板，通过PCR扩增分别得到1105bp同源重组左臂PCR片段(SEQ ID NO.7)和1089bp的同源重组右臂PCR片段(SEQ ID NO.8)，左臂片段与pRJ2的XbaI剪切端重叠25个碱基(ATCCCCGGGGACCTGCAGGTCGACT)；右臂片段与pRJ2的EcoRI剪切端重叠26个碱基(TATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAG)。其中左臂PCR片段的引物为n7-L-F(SEQ ID NO.1)和n7-L-R(SEQ ID NO.2)，右臂PCR片段的引物为n7-R-F(SEQ IDNO.3)和n7-R-R(SEQ ID NO.4)。

载体为经过限制性内切酶XbaI和EcoRI处理过的质粒pRJ2，经凝胶电泳回收7758bp载体片段。

通过Gibson assembly(Gibson,D.G.et al,Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nat.Methods.2009,6,343–345)的方法连接两个PCR片段和载体片段，然后转入大肠杆菌E.coli DH10B，获得目标克隆质粒pRJ28，并经测序确认。

b)向大肠杆菌(中转宿主菌)转入基因敲除质粒pRJ28

把步骤a构建的质粒pRJ28转入携带结合转移辅助质粒pUZ8002的大肠杆菌E.coliET12567(Mazodier,P.et al,Intergeneric conjugation between Escherichia coliand Streptomyces species,J Bacteriol.1989,171,3583-3585)，得到pRJ28+pUZ8002/E.coli ET12567。

c)将步骤b获得的菌株和目标宿主菌链霉菌S.conglobatus混合培养，筛选出发生同源重组而产生的突变株RJ8。具体步骤包括：

(c1)挑取步骤b获得的菌株单菌落接种LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl),该培养基含有抗生素终浓度为：安卡青霉素100μg/L,氯霉素25μg/L，卡那霉素50μg/L。培养条件为37℃,摇床转速220rpm，4h，至菌液浓度OD600测定值为1.0左右，取3mL菌液通过6000rpm离心30S后去上清，然后用1mL LB培养基重悬菌体后再次离心收集菌体，如此反复3次菌体备用。

(c2)将链霉菌S.conglobatus接种在SFM固体平板培养基(2％大豆粉，2％D-甘露醇，2％琼脂)上，30℃培养5天后用棉棒收集孢子，并悬浮孢子与5mL的LB培养基中，50℃热激10min，冰浴2min，然后37℃,220rpm摇床培养3h，再通过12000rpm离心1min收集预萌发孢子，然后用1mL的LB培养基重悬孢子，离心收集孢子。

(c3)将步骤c2收集的链霉菌S.conglobatus萌发孢子和步骤c1收集的大肠杆菌pRJ28+pUZ8002/E.coli ET12567混合于150μL LB培养基中，均匀涂布在SFM平板上。30℃培养23h后用进行覆盖，覆盖液为含20μg/L萘啶酮酸和50μg/L潮霉素的1mL水溶液。待平板晾干后至于30℃培养5天后可见结合转移子，挑取单菌落于SFM平板(含抗生素终浓度为萘啶酮酸20μg/L、潮霉素50μg/L)进行复证，30℃培养4天后，取孢子在无抗生素的SFM平板上进行松弛培养，30℃培养5天后再次转接无抗生素的SFM平板。然后取孢子悬浮于无菌水，在SFM平板上制备单菌落。挑取单菌落做含潮霉素50μg/L和不含抗生素的对照SFM平板培养筛选，最终选取潮霉素敏感的菌株进行PCR验证。

PCR验证引物为：nat7D-T-F(SEQ ID NO.9)和1NL-R(SEQ ID NO.10)，同时以野生型菌株做对比验证。PCR产物的测序结果显示，野生型菌株的PCR片段大小为488bp(SEQ IDNO.11)，而选取的潮霉素敏感的菌株的PCR片段大小为437bp(SEQ ID NO.12)，获得natE基因51bp(SEQ ID NO.13)缺失突变，即为目标突变株RJ8。

实施例2

选取大肠杆菌E.coli DH5a或E.coli JM109作为宿主菌，构建包含同源重组片段的质粒pRJ28(构建过程见实施例1a)。选取无DNA甲基化修饰系统的大肠杆菌E.coliJTU007(A Non-Restricting and Non-Methylating Escherichia coli Strain for DNACloning and High-Throughput Conjugation to Streptomyces coelicolor,CurrMicrobiol(2012)64,185–190)，把质粒pRJ28转入含质粒pUZ8002的E.coli JTU007得到pRJ28+pUZ8002/E.coli JTU007。把pRJ28+pUZ8002/E.coli JTU007转入链霉菌S.conglobatus并筛选突变株RJ8(筛选过程见实施例1c)。

实施例3

通过设计同源重组片段在基因natE内部所处的位置，可实现对基因natE内部不同区域的缺失突变。例如，保留“实施例1a”所描述的同源重组左臂不变，仅调整同源重组右臂在natE内部的位置，可实现缺失突变基因natE内部1074bp(SEQ ID NO.14)的区域。该同源重组右臂为1206bp(SEQ ID NO.15)的PCR产物，PCR引物为R-F(SEQ ID NO.16)和R-R(SEQID NO.17)。其余步骤与“实施例1”相同。

上述三个实施例中所涉及序列如表1所示：

表1 DNA序列表

实施例4突变株RJ8发酵产物的分析及提取

(一)突变株RJ8的发酵产物的分析

从SFM平板上挑取培养4天后的突变株RJ8菌体接种10mL TSBY种子培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％CaCO₃，5mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2％(v/v)anti-foam)，50mL装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养3天。取该种子液按1/10(v/v)接种50mL SGCC二级种子培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％CaCO₃，5mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2％(v/v)anti-foam)，250mL装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养5天。取20mL发酵液加入等体积乙酸乙酯，40℃超声萃取30min，取有机相减压蒸干，加入1mL甲醇溶解，离心去沉淀后取20μL上样HPLC-MS检测。如图2所示，HPLC-MS检测发酵产物发现突变株RJ8定向积累两个新的组分，而不再产生新抗霉素NAT-A和NAT-F组分，新组分的产量与野生型菌株WT的发酵的新抗霉素NAT-A和NAT-F产量相当。

(二)突变株RJ8发酵和新抗霉素产物的提取。

(1)突变株RJ8发酵

从SFM平板上挑取培养4天后的突变株RJ8菌体接种50mL TSBY种子培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％CaCO₃，5mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2％(v/v)anti-foam)，250mL装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养3天。取该种子液按1/10(v/v)接种100mL SGCC二级种子培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％CaCO₃，5mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2％(v/v)anti-foam)，500mL装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养3天。取二级种子液按1/10(v/v)接种100mLSGC发酵培养基(3％大豆粉，5％葡萄糖，0.5％CaCO₃，5mg/L CoCl₂·6H₂O，0.2％(v/v)，500mL装有弹簧的三角瓶，30℃，220rpm摇瓶培养6天后，共获得发酵液10L。

(2)新抗霉素提取分离

给发酵液中加入0.1％(v/v)的甲酸，用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，乙酸乙酯萃取物经40℃减压浓缩后得浸膏8.1g。用300ml甲醇重溶该浸膏，将滤纸过滤去渣，用100ml正己烷通过分液滤斗去除油状物两次。甲醇溶液经浓缩后，通过拌样加载正向硅胶柱(Sillica gel，200-300目)，减压过柱，洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，洗脱溶剂配比梯度为50/1至0/1(v/v)，获得6个馏分B1-B6，通过HPLC-MS检测新抗霉素NAT-H和NAT-I，发现馏分B1(2.5g干重)含有目标分子。进一步把目标馏分加载ODS柱，洗脱溶剂梯度为乙腈30％-100％，获得14个馏分(B1A-B1N)。取目标馏分B1J(干重1.2g)再次上样硅胶柱，洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇(8/1/0至0/0/1,v/v/v)，共获得10个馏分B1J1-B1J10，取目标馏分B1J7(1.0g干重)用制备型HPLC，反向ODS柱(YMC-Park C18,20×250mm,5μm)进行最终分离。分离条件为：8mL/min，85％乙腈(含0.1％甲酸)。最终获得400mg新抗霉素NAT-H(淡黄色无定型)和三个其它馏分B1J7P1-B1J7P3。使用半制备柱(Waters Xbridge C18,10×250mm)对B1J7P3馏分进行分离，液相流速3mL/min，流动相70％乙腈(含0.1％甲酸)，获得62mg新抗霉素NAT-I(淡黄色无定型)。

化合物结构解析

称取5-10mg新抗霉素NAT-H或NAT-I纯品，用0.5mL DMSO-d₆溶解，用Aglient DD2600MHz NMR核磁共振仪采集核磁数据。经¹H-和¹³C-NMR数据分析确定化合物结构，使用高分辨质谱(HR-ESI-MS)分析确定化合物分子式。

通过¹H和¹³C NMR(表2)的比较分析，证实NAT-H的化学结构与文献报道相同，NAT-I和NAT-H的结构差别仅在后者多一个C-32位甲基(图3)。对比NAT-I和NAT-H的¹³C NMR数据，发现NAT-I不含有NAT-H具有的C-32亚甲基信号δ_C 24.0。此外，NAT-I没有NAT-H所具有的H-35(δ_H 0.83)和C-35(δ_C 10.4)位移信号(表2，3)。高分辨质谱检测NAT-I和NAT-H的[M+H]⁺荷质比分别为683.2829(计算值683.2816，误差1.90)和697.2987(计算值697.2972，误差2.15)，即NAT-I比NAT-H少一个亚甲基的分子量。

表2.化合物NAT-H的¹H和¹³C NMR

^aSalim,A.A.et al.,Rare Streptomyces N-formyl amino-salicylamidesinhibit oncogenic K-Ras.Org Lett.2014,16,5036-5039

^b表示重叠数值

^c表示特征峰文献中未列出，而本发明中测得

表3.化合物NAT-I的¹H和¹³C NMR

(3)突变株RJ8发酵产物的抗肿瘤细胞活性检测

通过CCK8assay(Dojindo,Tokyo,Japan)试剂盒检测肿瘤细胞活力。细胞培养过程如下：种子细胞通过96孔板培养，培养基中加入浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100μg/mL的链霉素，接种细胞浓度为每孔3×10³个细胞，37℃，5％CO₂，培养24h，然后以0.3-10000nM的浓度加入检测化合物(包括突变株RJ8发酵产生的新抗霉素NAT-H和NAT-I，以及对照药物Cisplatin)，培养72h后每孔加入10μL的WST-CCK8试剂，37℃继续温育0.5-4h，最后通过酶标仪(spectra MAX190,Molecular Devices,USA)在450nm波长检测细胞活力。测试结果见表4。

表4抑制肿瘤细胞IC₅₀数值(nM)

由表4可知，突变株RJ8产生的新抗霉素NAT-H和NAT-I对八种肿瘤细胞均具有显著的抑制活性，并且对大部分细胞系的抑制活性优于对照药物Cisplatin。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种新抗霉素衍生物及其制备方法与应用

<130> 权利要求书、说明书

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

atccccgggg acctgcaggt cgacttcgtc gggcatttca gcga 44

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ttgaaggtgg tgacggtgtg cccgaggatc agcagcctca tgccgcct 48

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

aggcggcatg aggctgctga tcctcgggca caccgtcacc accttcaac 49

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

atcacgaggc cctttcgtct tcaagtcatg acactcggct tcctccggga 50

<210> 5

<211> 7758

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 60

ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 120

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 180

atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 240

attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 300

gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 360

agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 420

aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 480

cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 540

cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 600

actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 660

cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 720

ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 780

ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 840

gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 900

gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 960

ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 1020

cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 1080

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 1140

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1200

cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1260

cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1320

gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1380

aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1440

cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1500

tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1560

acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1620

ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1680

ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1740

tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1800

tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1860

ctggcctttt gctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 1920

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 1980

gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgctga cttccgcgtt 2040

tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag accattcatg ttgttgctca ggtcgcagac 2100

gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca 2160

gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc ctcaacgaca ggagcacgat catgcgcacc 2220

cgtcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 2280

agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 2340

taagctgcaa taaacaagtt cccgcacgat cagcgtcccg ccgaccagga gcagtgcggc 2400

cagcactgcc gctaacgcct ggtcctggtc ccggtcctgg tggtgcatca gtcctccccg 2460

tgatcacttc ggcacccacc gtagtgatca cccccgacag cggatcaagg ggtttgcggg 2520

tcccggtcgg cgccgggcgg gggaggcagg agccgccgac gctgcctctg ggacgggccg 2580

gacggcaggg ggaccggcgg ccgggcgagc tgcagccggg ggtccggcag ggccggagcg 2640

ggcggaaccg tgctctgacc tgcggcccga gtttcgtcac gtgacggaat ggaaggctgc 2700

tgcatttcgt cacgtgacgt atctcggcga gcgactgccg acgccacggc ggacacgatc 2760

gcctcgcgct ggcgccgggc ctcgtacgcc cgctggcggc aggagcggcg gcagtagtcc 2820

cggctccggc cgacgccgga ttgcttgatc tccgagccgc accaggcgca gagcttcgcg 2880

ccgtcggcgt ccctgggggt ggtggtgctc atggccgacg accgtacgcg gcacgtctcg 2940

tagcgaggcg agtcgggcgc gaggtaccgc ctgcacgaag tgccggcggg gccgaccccg 3000

ggcgagtaat cccaggatta ctcccgcggc ttcgaccccg gccgccgtcg ccgcgtacgt 3060

caccgacccc cgccgtacgt caccgggatg acgtacggcg ggggggagcg agttagtgcg 3120

aagtgggccc acttgcgagc cgggcgatgt gccgggcggc ccgctcctgg cggtcgtcgg 3180

cgtcgtcgtc ctggtcgtcg tcctgctctc gccgtcggcg tgcagttgct tcctcgcggc 3240

gctgggcgag ggcggcgagc atgtcggcgt acgcctcggc cacctccccc gccgtgagca 3300

ccaccactgt gtcggccgcg tcggccagcg ccaggacctc ccgcacccgt tcgcccacgg 3360

ccgccgaatc ctcgttgccg tccttgcctt cggcggcccg ggtcgcctcg aggtcgaggg 3420

cgcggcgggt gaccgcgtgc catccgtcct cggtcacggc gaccccggcc cgcagctccc 3480

cgccgtcggc gtcggccgcc aggagcagat cgaggtcgtc ggcctcggtg tcgccgccgt 3540

cgagcccgag catctgccgc aggtagcggg tccattcgat ggcccggcgt ccccgggttg 3600

cccgctcgta ctcgtgccag cgcgagaggt tccactccag cgagccgacc ccggcggcgt 3660

cgtcctcggt catgccgccg gtcaggtccc cgatccgtcc gaggagttcg aacggggcga 3720

cgttcccgcc ggtcgccgtc ttgaggtcgg cgcgggcgag ttcgagggcg ggcgccttcc 3780

cgtcctgggt cttggcgatg tactcggcga ggtcgttggc gtcgcgctcg gtctccagcc 3840

gcttgaagtc gacgccgtgc cggtcgtcgg gcgtgaaggc ggggttgacc ttgcgcaggg 3900

cggcggtcca cacggaccgc cagtgcccct gccactcgtc gagcgcggcg ccggtcggct 3960

cgaaggtggc gacgatctgc ttcgcggacc gctccccctc ggtccggccg ccgaccagga 4020

cgatcgcgtg gatgtgcggg tgccagccgt tgatctgccc cacggtgact tcggtcgcgc 4080

ggatcatgcc gacgtacccg atccggtctc ggatgccctc gcggtcggcg gcccggtgcc 4140

cgtccttggc ccggcgtccg gcccacgtgc cgcccgtgat cagtcgctgg taggcgcccg 4200

gccgccgggg gctgtccggc gtcttccggg tgccctggag ggcgtccatg aggtccgcga 4260

gccggtccgt gtgcccatgg cgggccgtga aggtgaccag gtaggcggtc cccccgcgct 4320

tgatccactc gaccacggcg gcggtgatct cctcggcccg cttgtgccgg atcgtggcgg 4380

cgcagaccgg gcagagccag atccgcccgc accgcatcag gcccaggacc acggacgttc 4440

cggccgccgt ctgggcgacg atcacgccgg aggcagggtc catcagggcg cggccgcagc 4500

ccttgcacgc ggcgtccccg ctgatccgcc acagcgtccg gcggcggctg taccgggcgg 4560

ctttccgcag tcgggcagcg tcgctccgcg acgtgcttcc tacttccgag aggctgtcgc 4620

ctctcgggct ctccccatcc accccgtccg gagaaaccgc aggtcggagg ggtgcgggaa 4680

actctgttgt ttctttccca aggtgttcgc ttttgcctcg ggcggcatct cgcgtcacac 4740

gcgcgatcgc ccgcttcgct gccatccggc agcggtctga gcagtagata cgcggccgtt 4800

tgcccggtgt gtgggcaatt gcggtcccgc agtggcagcg gggcccggcg ggccgatctg 4860

gcaatgcctc ggcatcgctc cgtactctgg gcacgagcaa cgttcctgtc tcgcccggct 4920

aaggggcgcg agtctgggag cggacgggtc ggaggtgcga agtccggccc gttgctcttt 4980

ggtctggtgg gaatcctggc accaatcggg ccagaggttc cctccgccac tcccgacgcc 5040

ccttggggct ggtgtgactt ggagggccga agagagcccc gccggtgatc cggcggggct 5100

ttgacgtgcg gtcagtgcgt gtgtcggcga gcgatggcca cgaggccctg gaagccgagc 5160

ggtccggcga agtcggccca gtcgcaaccg ggctcagcgc agtgggcgga ccagccaccg 5220

ccgttgtggg tcctggacca ggttcacggt cccctcggtc aggcgtccgt cgaagtcggt 5280

catggtcggt ctcctggtgg gtgggggcgg ggcgccagca cgaagtgccg gcgccccgcg 5340

ggggttggtc gggtcaggcg ccgaaccggc gggcggcggc ggcgaccagg ccgtcggcgg 5400

cggccatggc gcggtcgcgg tcggtggtga gggcggtgcg gtcggcggcg gcccagtcct 5460

gctctcacgc aacgtctacg tggacgctca gggcgacacg atcgaggtcg gggagtccgt 5520

cgctccggcg ggccgctggc gcgtccaccg ggactgatca aggcgaatac ttcatatggc 5580

gtacaccgtc gcctcggtcg gcccgtagag attggcgatc ccgaccgcag caccaccgag 5640

aacgtccccg acgtggccga ccagcccgtc atcgtcaacg cctgatccgc ggtgcggaca 5700

ggccgtgtcg cgaccggccg tgcggaatta agccggcccg taccctgtga atagaggtcc 5760

gctgtgacac aagaatccct gttacttctc gaccgtattg attcggatga ttcctacgcg 5820

agcctgcgga acgaccagga gttctgggag ccgctggccc gccgagccct ggaggagctc 5880

gggctgccgg tgccgccggt gctgcgggtg cccggcgaga gcaccaaccc cgtactggtc 5940

ggcgagcccg gcccggtgat caagctgttc ggcgagcact ggtgcggtcc ggagagcctc 6000

gcgtcggagt cggaggcgta cgcggtcctg gcggacgccc cggtgccggt gccccgcctc 6060

ctcggccgcg gcgagctgcg gcccggcacc ggagcctggc cgtggcccta cctggtgatg 6120

agccggatga ccggcaccac ctggcggtcc gcgatggacg gcacgaccga ccggaacgcg 6180

ctgctcgccc tggcccgcga actcggccgg gtgctcggcc ggctgcacag ggtgccgctg 6240

accgggaaca ccgtgctcac cccccattcc gaggtcttcc cggaactgct gcgggaacgc 6300

cgcgcggcga ccgtcgagga ccaccgcggg tggggctacc tctcgccccg gctgctggac 6360

cgcctggagg actggctgcc ggacgtggac acgctgctgg ccggccgcga accccggttc 6420

gtccacggcg acctgcacgg gaccaacatc ttcgtggacc tggccgcgac cgaggtcacc 6480

gggatcgtcg acttcaccga cgtctatgcg ggagactccc gctacagcct ggtgcaactg 6540

catctcaacg ccttccgggg cgaccgcgag atcctggccg cgctgctcga cggggcgcag 6600

tggaagcgga ccgaggactt cgcccgcgaa ctgctcgcct tcaccttcct gcacgacttc 6660

gaggtgttcg aggagacccc gctggatctc tccggcttca ccgatccgga ggaactggcg 6720

cagttcctct gggggccgcc ggacaccgcc cccggcgcct gacgccccgg gtgaagagcc 6780

ccgtcgggcg gtgcctgacg gggcttctca gttctcatga gcggagaacg agatgacgtt 6840

ggaggggcaa ggtcgcgctg attgctgggg caacacgtgg agcggatcgg ggattgtctt 6900

tcttcagctc gctgatgata tgctgacgct caagcttgca tgcctgcagg tcgacggatc 6960

ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 7020

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 7080

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 7140

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 7200

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 7260

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 7320

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 7380

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc 7440

gacctgggcc gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg 7500

cggttcggtg atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag 7560

cttggcaagg tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg 7620

ctaaaacggc cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa 7680

gagcgacttc gcggagctgg tgaagtacat caccgacgag caaggcaaga ccgatccccg 7740

gggacctgca ggtcgact 7758

<210> 6

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

atgaggctgc tgatcctcgg cggcaccgcc ttcctcggcc gcgccttcgc cgccgaggcg 60

ctcgctgcgg ggcacaccgt caccaccttc aaccggggcc gcaccggggc ggacgtaccc 120

ggtgtcgagg ccgtgcgcgg cgaccgcacg gtggccgccg acctgtccgc gctggtggcg 180

ggccggcact gggacgcggt cgtcgacacc tgcggctacg tcccggaggt ggtgggcgcc 240

tcggcggcgg cgctgtccgg gcacgccggg gcgtatgtgt tcgtctccag cgtcgccgcc 300

taccggcgca gcggcccgtt cgagccgctg gacggtgacg agagcgctcc cctgcacgac 360

tgcccggacg acgcgggccc cggcggcggg ccgtacggcg tgctcaaggc gggctgcgaa 420

cgcgccgtcc ggcggcactt cgccggccgg acgcagatgc tgcgcccggg cgcggtggtc 480

ggcccgcacg aggacaccgg gctgagccgc tactggctgg gccggttcgc cggcggcggg 540

ccggtgctgg ccccgggcaa cccccgggcc ccgctgccac tggtcgacgc gcgggacgtg 600

gcacgcttcg gcctgctcct ggccggcggc ggcgccggga gcggagcgtg gaacgtggcc 660

gggccgcggg gcctggacta cggtgcctgg ctggccgcct gccgggaggc caccggcggc 720

ggcgaaccgg tgtgggtgcc cgacgacttc ctgctcgcgc agggtctgcg gccgtggctg 780

gacctgccgt tgtgggcgcc cggggccacc ccggagcggt ccgtgtgggg gttctccacc 840

gagcgggccc gggccgccgg gctcgtctgc cgcccggcgc cggagaccgc cgccgacacc 900

tggcgctggc tgcgcccgct ggccgccgta ccgcagcgcg cggaccagcc cgccccggcg 960

ctggaccggg cccgggagct ggccgtgctc gacgcgtggg cgacggcccg ccccgcggcc 1020

gtggcgacgg accccggcgg ccacggaggg accggcggcc ccgagcggac cccgcacccc 1080

cgtcccggag gaagccgagt gtcatga 1107

<210> 7

<211> 1105

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

atccccgggg acctgcaggt cgacttcgtc gggcatttca gcgaagcgcc gggcacgtcg 60

gcgttcggga cggcggagcg cccggagttc gaacacccca cggtggcggg gctcgcggcg 120

cacctggagg ggcggtcggc gggctcgtcc ccgttcgccc cgcacctgcc gctgcggccc 180

ggggggagcg ccactcccct gttctgcttc caccccggcg gaggcatctg ctggcccttc 240

gccccgctcc tggcgcacct ggacgcgacg gtcccggtcc acggcgtgca gtcaccgggc 300

ctcaccgatc cgtcggcgct gccggcctcc atcgaggaga tggccgacga ctacacgcgg 360

cggatccggg agctgcgccc gtccgggccg tacgcgctgc tcggctggtc gctcggcggg 420

ttcgtcgccc acgccgtggc cggacggctc cagcgggcgg gcgagcacgt cgcgctcctc 480

gccgtgctgg acagcttccc gctgcaccag gacgacctcg cgtccctgcc cgccccggag 540

gagctggagg gcatcctgct gggcctgctg ctggacggcg cgggggtgcc tcccgcttcc 600

ggggcggcgc cgccggaccg ggccgccgcc gtggccgcgc tgcgcggcag cggcagcgcc 660

ctggccggca tcgacgaggc gcagctgggc cgcatggtgg acgtcatgcg gcacaacacc 720

gggctgatcg ccgggcacac gcccggcacg gtcgagggcg acctgctggt cttcaccgcg 780

cgccgcagcc acgcggcgga cgcgccgccg cccgccgcga gctggcggcc gcacgtgacc 840

ggcgaggtga ccgatctcct gctggactgt ctccaccagg agatgctgcg ccccgagcag 900

attccgttca tcgccgcgcc cctcaacgcc cggctcgcac cgggtgcccc gggtgacggc 960

gcacactccg gctgggaagg acgatcctcg tgaccccgaa cccctgtgac cgggaagacg 1020

cggcaggcgc cgcctaccgg ggcccggccg cccggggagg cggcatgagg ctgctgatcc 1080

tcgggcacac cgtcaccacc ttcaa 1105

<210> 8

<211> 1088

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

aggcggcatg aggctgctga tcctcgggca caccgtcacc accttcaacc ggggccgcac 60

cggggcggac gtacccggtg tcgaggccgt gcgcggcgac cgcacggtgg ccgccgacct 120

gtccgcgctg gtggcgggcc ggcactggga cgcggtcgtc gacacctgcg gctacgtccc 180

ggaggtggtg ggcgcctcgg cggcggcgct gtccgggcac gccggggcgt atgtgttcgt 240

ctccagcgtc gccgcctacc ggcgcagcgg cccgttcgag ccgctggacg gtgacgagag 300

cgctcccctg cacgactgcc cggacgacgc gggccccggc ggcgggccgt acggcgtgct 360

caaggcgggc tgcgaacgcg ccgtccggcg gcacttcgcc ggccggacgc agatgctgcg 420

cccgggcgcg gtggtcggcc cgcacgagga caccgggctg agccgctact ggctgggccg 480

gttcgccggc ggcgggccgg tgctggcccc gggcaacccc cgggccccgc tgccactggt 540

cgacgcgcgg gacgtggcac gcttcggcct gctcctggcc ggcggcggcg ccgggagcgg 600

agcgtggaac gtggccgggc cgcggggcct ggactacggt gcctggctgg ccgcctgccg 660

ggaggccacc ggcggcggcg aaccggtgtg ggtgcccgac gacttcctgc tcgcgcaggg 720

tctgcggccg tggctggacc tgccgttgtg ggcgcccggg gccaccccgg agcggtccgt 780

gtgggggttc tccaccgagc gggcccgggc cgccgggctc gtctgccgcc cggcgccgga 840

gaccgccgcc gacacctggc gctggctgcg cccgctggcc gccgtaccgc agcgcgcgga 900

ccagcccgcc ccggcgctgg accgggcccg ggagctggcc gtgctcgacg cgtgggcgac 960

ggcccgcccc gcggccgtgg cgacggaccc cggcggccac ggagggaccg gcggccccga 1020

gcggaccccg cacccccgtc ccggaggaag ccgagtgtca tgacttgaag acgaaagggc 1080

ctcgtgat 1088

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

tctccaccag gagatgctg 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

acgctggaga cgaacacata c 21

<210> 11

<211> 488

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

tctccaccag gagatgctgc gccccgagca gattccgttc atcgccgcgc ccctcaacgc 60

ccggctcgca ccgggtgccc cgggtgacgg cgcacactcc ggctgggaag gacgatcctc 120

gtgaccccga acccctgtga ccgggaagac gcggcaggcg ccgcctaccg gggcccggcc 180

gcccggggag gcggcatgag gctgctgatc ctcggcggca ccgccttcct cggccgcgcc 240

ttcgccgccg aggcgctcgc tgcggggcac accgtcacca ccttcaaccg gggccgcacc 300

ggggcggacg tacccggtgt cgaggccgtg cgcggcgacc gcacggtggc cgccgacctg 360

tccgcgctgg tggcgggccg gcactgggac gcggtcgtcg acacctgcgg ctacgtcccg 420

gaggtggtgg gcgcctcggc ggcggcgctg tccgggcacg ccggggcgta tgtgttcgtc 480

tccagcgt 488

<210> 12

<211> 437

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

tctccaccag gagatgctgc gccccgagca gattccgttc atcgccgcgc ccctcaacgc 60

ccggctcgca ccgggtgccc cgggtgacgg cgcacactcc ggctgggaag gacgatcctc 120

gtgaccccga acccctgtga ccgggaagac gcggcaggcg ccgcctaccg gggcccggcc 180

gcccggggag gcggcatgag gctgctgatc ctcgggcaca ccgtcaccac cttcaaccgg 240

ggccgcaccg gggcggacgt acccggtgtc gaggccgtgc gcggcgaccg cacggtggcc 300

gccgacctgt ccgcgctggt ggcgggccgg cactgggacg cggtcgtcga cacctgcggc 360

tacgtcccgg aggtggtggg cgcctcggcg gcggcgctgt ccgggcacgc cggggcgtat 420

gtgttcgtct ccagcgt 437

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

ggcggcaccg ccttcctcgg ccgcgccttc gccgccgagg cgctcgctgc g 51

<210> 14

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

ggcggcaccg ccttcctcgg ccgcgccttc gccgccgagg cgctcgctgc ggggcacacc 60

gtcaccacct tcaaccgggg ccgcaccggg gcggacgtac ccggtgtcga ggccgtgcgc 120

ggcgaccgca cggtggccgc cgacctgtcc gcgctggtgg cgggccggca ctgggacgcg 180

gtcgtcgaca cctgcggcta cgtcccggag gtggtgggcg cctcggcggc ggcgctgtcc 240

gggcacgccg gggcgtatgt gttcgtctcc agcgtcgccg cctaccggcg cagcggcccg 300

ttcgagccgc tggacggtga cgagagcgct cccctgcacg actgcccgga cgacgcgggc 360

cccggcggcg ggccgtacgg cgtgctcaag gcgggctgcg aacgcgccgt ccggcggcac 420

ttcgccggcc ggacgcagat gctgcgcccg ggcgcggtgg tcggcccgca cgaggacacc 480

gggctgagcc gctactggct gggccggttc gccggcggcg ggccggtgct ggccccgggc 540

aacccccggg ccccgctgcc actggtcgac gcgcgggacg tggcacgctt cggcctgctc 600

ctggccggcg gcggcgccgg gagcggagcg tggaacgtgg ccgggccgcg gggcctggac 660

tacggtgcct ggctggccgc ctgccgggag gccaccggcg gcggcgaacc ggtgtgggtg 720

cccgacgact tcctgctcgc gcagggtctg cggccgtggc tggacctgcc gttgtgggcg 780

cccggggcca ccccggagcg gtccgtgtgg gggttctcca ccgagcgggc ccgggccgcc 840

gggctcgtct gccgcccggc gccggagacc gccgccgaca cctggcgctg gctgcgcccg 900

ctggccgccg taccgcagcg cgcggaccag cccgccccgg cgctggaccg ggcccgggag 960

ctggccgtgc tcgacgcgtg ggcgacggcc cgccccgcgg ccgtggcgac ggaccccggc 1020

ggccacggag ggaccggcgg ccccgagcgg accccgcacc cccgtcccgg agga 1074

<210> 15

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

gcatgaggct gctgatcctc agccgagtgt catgagccac ctgtccgtga tccgtccccg 60

gcccgtggac gcgccgtcgc tgcggctgtt cgtcctgcac cacgcgggcg cttcccacgt 120

cccctaccgt ccctgggccg cccacctgcc ggcggcctgg gagctgtgcc tggtccaggc 180

gccgggccgg ggcggccggc ccggcccgct ccgcgagacg gccgccggcc tggccggggc 240

gtatctggac gacatccggc cctggaccga ccggccgtac gcgctgttcg ggcacagcat 300

gggcgccgtc gccggctatg agctgaccct cgcgctgcgg gaccgcgggg tgccgctgcc 360

ccggtggctg ggcctgtcgg ccgtcagccc gcccgagcac cacccgcgtg cggagccccg 420

cttcgacctg ccccgggagg aactgcgcgc ggcggtggcc gccatgggcg gcacccagcg 480

cgaggtgctg gaggacccgg agatgtggga gctgatcgag cccgtcatgc gcgccgacct 540

gcgcgtggcg gagtgctggg agccccggcg cggcaccggc ccgctgccgg tgccgctgac 600

ggtcttcgcc ggggacgccg acgtgatcgc gcccgcgcac ctgatgcaca cctgggccgc 660

gcggagcgag cgcttctgcg gggcccaggt gctgagcggc ggtcacttct acttccagcc 720

cgacccggcg gagctggtcg gccggatcgt ctcggcgatc cgctcggtga ccccggccgt 780

ccaggcgaac acccccggtc ccgccgggag cacgccgatc cgcaacacct gaccgggccc 840

ctcccgccgc ccccgccggt gccgggcgag gaagccgccc ggcaccggtg tggccgagat 900

gcccagcagt gtggtgggtg cccggccggc gggcagcagg gcgccgtacg ccttgaacgc 960

cgcctccttg gccgagaaga gggcgaagag gcgggcctcg gccgccgccg caccgccggc 1020

ggcgcgcacc cagctctcct cgccggggtc cagcacgaga tgcgcggccg cgagcggcag 1080

gccgcgcagt tccaggtcgc agccgagcgc gcggcagcgg gacgccgggg cggccagggc 1140

cacggccagg ccgccggagt ggctgatgga gacggtggtc cttgaagacg aaagggcctc 1200

gtgata 1206

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

gcatgaggct gctgatcctc agccgagtgt catgagccac ctgtccgtg 49

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 17

tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagacca ccgtctccat cagccactc 49

Claims (4)

1.一种制备化学结构式如下的两种新抗霉素衍生物的方法，

其特征在于，所述的新抗霉素衍生物由新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株发酵得到，该菌株的保藏编号为CGMCC No：15522，该菌株为链霉菌，分类命名：Streptomyces conglobatus。

2.一种制备化学结构式如下的两种新抗霉素衍生物的方法，

其特征在于，所述的新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株的构建包括步骤：

a)从链霉菌S.conglobatus基因组DNA中PCR扩增获得两个DNA同源重组片段，并克隆在具有大肠杆菌和链霉菌双亲接合转移功能的质粒上，用于缺失新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因；

b)将步骤a构建的质粒转入携带结合转移辅助质粒的中转宿主菌；

c)将步骤b获得的中转宿主菌和目标宿主菌链霉菌S.conglobatus混合培养，筛选出发生同源重组后产生的新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失的突变菌株；

步骤a具体为：

以链霉菌S.conglobatus基因组DNA为模板，以n7-L-F即SEQ ID NO.1和n7-L-R即SEQID NO.2为引物通过PCR扩增得到1105bp的同源重组左臂PCR片段，以n7-R-F即SEQ ID NO.3和n7-R-R即SEQ ID NO.4为引物通过PCR扩增得到1089bp的同源重组右臂PCR片段；

以具有大肠杆菌和链霉菌双亲接合转移功能的质粒pRJ2为载体，经过限制性内切酶XbaI和EcoRI处理后，经凝胶电泳回收7758bp的载体片段如SEQ ID NO.5所示；

通过Gibson组装连接两个PCR片段和载体片段，然后连接反应体系转入大肠杆菌E.coli DH10B或E.coli DH5a或E.coli JM109，并经筛选获得目标克隆pRJ28。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b中，所述的中转宿主菌为携带结合转移辅助质粒pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567或缺少DNA甲基化修饰系统的大肠杆菌；从大肠杆菌E.coli DH10B或E.coli DH5a或E.coli JM109中提取质粒pRJ28，并转入含质粒pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567或其它缺少DNA甲基化修饰系统的大肠杆菌。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c中混合培养包括步骤：

(c1)挑取步骤b得到的含有质粒pRJ28和pUZ8002的大肠杆菌E.coli ET12567单菌落接种进行培养，然后收集菌体备用；

(c2)将链霉菌S.conglobatus进行预培养，收集萌发孢子；

(c3)将链霉菌S.conglobatus萌发孢子和含有质粒pRJ28和pUZ8002的大肠杆菌E.coliET12567菌体混合培养；选取潮霉素敏感的菌株进行PCR测序验证，确认新抗霉素生物合成途径酮基还原酶基因缺失菌株。

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