PT1603941E - Inibidores de hsp90 extracelular - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "INIBIDORES DE HSP90 EXTRACELULAR"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os tumores malignos libertam células, que migram para novos tecidos e criam tumores secundários. O processo de geração de tumores secundários é denominado metástase e é um processo complexo em que células tumorais colonizam locais distantes do tumor primário. Liotta ((1986) Câncer Res. 46, 1-7) propôs uma hipótese de três etapas para o processo de metástase: A primeira etapa é ligação da célula tumoral via receptores de superfície celular. A célula tumoral ancorada a seguir secreta enzimas hidrolíticas ou induz as células hospedeiras a secretar enzimas, que podem degradar a matriz localmente. A lise da matriz muito provavelmente ocorre numa região altamente localizada próxima da superfície da célula tumoral. A terceira etapa consiste na locomoção da célula tumoral para a região da matriz modificada por proteólise. Assim, a invasão da matriz não ocorre meramente devido à pressão de um crescimento passivo, mas requer mecanismos bioquímicos activos. A degradação do tecido normal circundante é uma característica central de invasividade de tumores malignos. 0 processo de formação de metástase depende da invasividade de células tumorais. Seria, portanto, útil desenvolver fármacos, que inibem a invasividade e, com isso, prevenir a metástase de tumores primários.

Recentemente, a investigação tem sido centrada em identificar proteínas específicas envolvidas em metástase, que podem ser utilizadas como uma base para um melhor diagnóstico ou estratégias terapêuticas melhoradas. Uma proteína que foi identificada como uma molécula chaperona molecular e que é essencial para a estabilidade e a função de diversas proteínas oncogénicas é a proteína de choque 2 térmico 90 (Hsp90). Este nome é um termo genérico utilizado para descrever duas isoformas denominadas Hsp90 α e β. Descreve-se a estrutura e a função das isoformas de Hsp90 em Csermely et al.: Pharmacol. Ther. Vol. 79, 1998, No. 2, The 90-kDa Molecular Chaperone Family: Structure, Function, and Clinicai Applications. A Comprehensive Review, p. 131, p. 146. A Hsp90 é uma das mais abundantes chaperonas no citosol de células eucarióticas e constitui aproximadamente 1-2% de todas as proteínas na célula. As funções intracelulares de Hsp90 incluem a estabilização de proteínas (receptores esteróides) e a maturação de proteínas tal como quinases e outras proteínas de sinalização. A Hsp90 foi implicada, no entanto, numa ampla variedade de funções incluindo a estabilidade evolutiva de proteínas mutadas, rearranjos citoesqueléticos, transporte nuclear, proliferação celular e apoptose, degradação de proteínas, apresentação de antigénios e reconhecimento de lipopolissacáridos. Sendo muito abundante na célula, a Hsp90 tem também sido associada a muitas doenças, de cancro a doença auto-imune e a doença cardiovascular. Por exemplo, um anticorpo monoclonal para o epitopo LKVIRK imunodominante de Hsp90 mostrou actividade terapêutica num tratamento contra infecção fúngica e foi utilizado num ensaio clinico pela firma Neutec sob o nome comercial Mycogrip®.

Mostrou-se também que a Hsp90 é secretada pelas células em resposta ao stress (Liao et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 189-96), mas nenhuma função foi associada a esta secreção.

Enquanto a Hsp90 tem funções bem estabelecidas intracelularmente, há pouca informação sobre a sua ocorrência extracelular e a sua função. Descobriu-se que a Hsp90 é uma apresentadora peptidica antigénica efectiva a receptores em células apresentadoras de antigénio. Descobriu-se também que é uma das quatro proteínas 3 associadas em jangadas lipídicas na superfície extracelular de células, que se ligam ao lipopolisacárido e iniciam as respostas intracelulares (Triantafilou et al. (2002) Trends in Immunology 23, 301-4). A Hsp90 foi também encontrada sobre-expressa na superfície de algumas células tumorais: linhas de células de microcitomas, melanoma e hepatoma (Ferrarini et al. (1992) Int. J. Câncer 51, 613-19). Hipotetizou-se que a expressão de Hsp90 na superfície destas linhas celulares está ligada à apresentação de antigénios, mas uma evidência clara não está ainda disponível. A Hsp90 está também a ser avaliada actualmente como um alvo intracelular no desenvolvimento de fármacos anti-cancro, devido ao seu envolvimento na regulação de diversas vias de sinalização que são de importância na condução do fenótipo de um tumor. A inibição da função de Hsp90 mostrou causar a degradação selectiva da proteína de sinalização envolvida na proliferação celular, regulação do ciclo celular e apoptose. Diversos antibióticos conhecidos (por exemplo, geldanamicina, radicicol, e coumermicina Al) mostraram recentemente ser inibidores de Hsp90 e são descritos no documento WO 00/53169. Propõe-se neste documento um método de inibição da ligação de uma proteína chaperona com seu cliente, em que o método propõe colocar em contacto uma proteína chaperona com coumarina ou um derivado de coumarina. No entanto, o ensinamento do documento WO 00/53169 é direccionado meramente à inibição da proteína Hsp90 intracelular.

Os inibidores tais como o análogo de geldanamicina 17-AAG estão já a ser testados em ensaios clínicos, mas existem preocupações sobre a toxicidade que resulta da inibição não específica da proteína poder ocorrer em todos os compartimentos celulares (Dunn (2002) J. Natl. Câncer Inst 94, 1194-5). Além disso, o facto de ainda não se compreender a interacção de Hsp90 com proteínas-cliente em 4 vários processos de sinalização celular suporta riscos potenciais de inibição de Hsp90 intracelular com inibidores tóxicos. A determinação do papel fisiológico de uma proteína é um pré-requisito para decidir se a interferência com esta função da proteína poderia ser um caminho possível para o tratamento da doença ou não. Deve-se manter em mente que num contexto fisiológico, isto é, numa célula tumoral de ocorrência natural de um paciente, a Hsp90 actua junto com outras proteínas, que podem modular e interferir uma com as outras. É a interacção funcional entre a Hsp90 e proteínas com as quais interactua que determina seu papel fisiológico. Há também relatos de que a Hsp90 actua como uma chaperona molecular para o transporte de proteínas transmembranares no núcleo (Schlatter et al. (2002) Biochem. J. 362, 675-84), e foi implicada no efluxo de fármacos em leucemia, células de carcinoma do pulmão e do ovário (Rapa et al (2002) Oncol. Res. 12, 113-9 e Rapa, et al (2000) Anticancer Drug Des 15, 127-34). A presente invenção demonstra pela primeira vez que a inibição de Hsp90 extracelular leva a uma redução da invasividade das células tumorais. A presente invenção mostra um novo caminho para inibir a Hsp90 extracelular por meio do qual podem se prevenir os efeitos secundários associados com o ataque da Hsp90 intracelular. A presente invenção também mostra uma inter-relação entre a inibição de Hsp90 e a secreção de metaloproteinases da matriz (MMPs) . As MMPs actuam na invasão por meio da digestão da matriz extracelular circundante para permitir que as células migrem através de tecidos densos. Os resultados mostraram que a Hsp90 é crítica para a invasão de células de cancro por meio do aumento de secreção ou actividade de MMPs, quando é sobre-expressa em células de fibrosarcoma. Mostrou-se ainda que a invasão dependente da 5

Hsp90 pode ser inibida por meio da utilização das moléculas da invenção. A presente invenção refere-se à utilização de moléculas que interferem com a função de Hsp90 extracelular em células tumorais para o tratamento de cancros específicos. Proporcionam-se compostos, composições e métodos que são úteis para reduzir ou inibir a invasividade e/ou o potencial metastático de células tumorais específicas. Além disso, proporciona-se um método que permite determinar se uma célula tumoral depende da Hsp90 extracelular funcional para a sua invasividade e/ou o potencial metastático.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é como foi definido em e pelas reivindicações apensas. A presente invenção refere-se a moléculas, que podem se ligar especificamente à Hsp90 extracelular. Além disso, as moléculas da invenção podem ser marcadas com grupos detectáveis, se for desejado, ou podem ser parte de um bioconjugado. A invenção ainda se refere a composições farmacêuticas que compreendem um inibidor de Hsp90 extracelular.

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam inibidores de Hsp90 extracelular, se os inibidores são seleccionados de um grupo que compreende polipéptidos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo bem como a vectores que compreendem tal ácido nucleico e a células hospedeiras que compreendem tal vector.

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se à utilização de moléculas que inibem a função da Hsp90 extracelular para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou a prevenção da invasão e/ou do potencial metastático de células de cancro. 6

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção da invasão e/ou do potencial metastático de células num paciente, em que o método compreende administrar a uma pessoa em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efectiva das moléculas, e/ou da composição farmacêutica de acordo com a invenção.

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a um método para determinar a dependência da invasividade de célula de cancro na funcionalidade de Hsp90 extracelular.

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a um método para a identificação de moléculas úteis para inibir a invasividade de uma célula de cancro, em particular a identificação de tais ligandos que se ligam a Hsp90.

Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se à utilização de classes de moléculas para reduzir a actividade de metaloproteinase de matriz (MMP).

DEFINIÇÕES

As seguintes definições, como são utilizadas no presente documento, serão aplicadas a menos que se indique de outro modo.

Um "polipéptido" como é utilizado no presente documento é uma molécula que compreende mais de 10, preferentemente mais de 20, o mais preferente mais de 30, e menos de 10000, mais preferentemente menos de 2500, o mais preferente menos de 1000 aminoácidos. Também se abrangem polipéptidos que contêm aminoácidos modificados ou não naturais.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina", como são utilizados no presente documento referem-se a qualquer agente de ligação imunológica, incluindo anticorpos monoclonais e policlonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, os anticorpos são designados 7 a uma de cinco grandes classes: IgA, IgD, IgG, IgG, e IgM. Diversas destas são ainda divididas em subclasses ou isotipos, tais como igGl, IgG2, IgG3, lgG4, e similares.

Os anticorpos podem ser também seleccionados de imunoglobulinas modificadas, por exemplo, anticorpos produzidos quimicamente ou recombinantemente, anticorpos enxertados com CDR ou anticorpos humanizados, anticorpos mutagenizados direccionados ao local que exibem identidade substancial de sequência de aminoácidos nas suas regiões CDR, em particular na sua região CDR3, aos fragmentos de anticorpo correspondentes da invenção e retêm substancialmente a mesma afinidade para a ligação a Hsp90 como os fragmentos de anticorpo correspondentes.

As CDRs (região determinante de complementaridade) de um anticorpo são as partes destas moléculas que determinam a sua especificidade e fazem contacto com ligandos específicos. As CDRs são as partes mais variáveis da molécula e contribuem para a diversidade destas moléculas. A identidade substancial de sequência de aminoácidos como foi utilizada no presente documento significa que pelo menos 70%, preferentemente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, mais preferentemente todos excepto 5, ainda mais preferentemente todos excepto 3 e mesmo ainda mais preferentemente todos excepto 1 dos aminoácidos de duas sequências de aminoácidos alinhadas, em particular de CDRs alinhadas, são idênticos. O termo "fragmento de anticorpo" é utilizado para referir-se a qualquer fragmento de uma molécula semelhante a anticorpo que tem uma região de ligação de antigénio, e este termo inclui fragmentos de anticorpo tais como scFv, dsFv, Fab', Fab, F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio único (DABs), diacorpos, e similares. As técnicas para preparar e utilizar várias construções à base de anticorpos e fragmentos são bem conhecidas na técnica (veja-se Kabat et 8 al. (1991) J. Immunol. 147, 1709-19), incorporadas especificamente no presente documento por referência.

Os fragmentos de anticorpo "scFv' compreendem os domínios vh e vl de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa cadeia polipeptídica única.

Geralmente, o polipéptido scFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios vh e vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antigénio.

Um fragmento "Fv" é o menor fragmento de anticorpo que retém um local de ligação ao antigénio intacto.

Um "dsFv" é um Fv estabilizado por dissulfeto.

Um fragmento "Fab", é um fragmento de ligação ao antigénio, que contém cadeias leves completas emparelhadas com os domínios VH e CHI da cadeia pesada.

Um fragmento "Fab'", é um fragmento F(ab')2 reduzido.

Um fragmento "F(ab')2", é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça.

Um "anticorpo de domínio único (DAB)" é um anticorpo com somente uma (ao invés de duas) cadeia proteica derivada de somente um dos domínios da estrutura do anticorpo. Os Dabs exploram o achado de que, para alguns anticorpos, metade da molécula de anticorpo liga-se ao seu antigénio alvo quase tão bem quanto a molécula completa (Davies et al. (1996) Protein Eng. 9: 531-537.

Os "diacorpos" são anticorpos bivalentes ou biespecíficos em que os domínios VH e vl são expressos em uma cadeia polipeptídica única, mas utilizando um ligante que é pequeno demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, deste modo forçando os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio (Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 6444-6448). 9 0 termo "bioconjugado" como é utilizado no presente documento significa que um inibidor de Hsp90 extracelular é covalentemente ou não covalentemente ligado e/ou acoplado a ou com, respectivamente, outra proteina, uma matriz sólida (por exemplo, como uma pérola), consigo mesma para formar multimeros, um agente citotóxico que acentue mais a toxicidade a células alvo, um agente citostático, um pró-fármaco, ou uma molécula efectora, que é capaz de modificar a célula que expressa Hsp90 ou de recrutar células imune.

Os termos "marcador" ou "marcado" referem-se a uma etiqueta detectável ou a incorporação de tal, respectivamente, por exemplo, por meio da incorporação de um aminoácido fluoróforo-, cromóforo- ou radiomarcado ou a união de um fluoróforo-, cromóforo- ou radiomarcador a um ligando ou a união de fracções que podem ser detectadas por uma segunda molécula marcada que contém uma etiqueta fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada por um método óptico ou um colorimétrico. Um exemplo para tal sistema de detecção em duas etapas é o sistema biotina-avidina bem conhecido. Vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteinas são conhecidos na técnica (por exemplo, veja-se Lobl et al. (1988) Anal. Biochem., 170, 502-511) e podem ser aplicados para classes de moléculas diferentes.

Um "epitopo" inclui qualquer determinante proteico capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina ou um fragmento de anticorpo. Os determinantes epitópicos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente activa de moléculas tais como aminoácidos expostos, aminoaçúcares, ou outras cadeias laterais de hidratos de carbono e normalmente têm características estruturais em três dimensões específicas, bem como características de carga específicas. "Tratar tumores metastáticos" ou "tratar micro-metástases", como são utilizados no presente documento 10 significam que a metástase do tumor é estabilizada, prevenida, atrasada, ou inibida pela molécula da invenção, ou como um único medicamento ou em combinação com outros medicamentos. Doença estável ou "Sem mudança" (NC) é uma descrição para o curso da doença sem mudança das metástases ou com uma redução de menos de 50% ou um aumento de menos de 25% ao longo de pelo menos 4 semanas. A prevenção pode ser, por exemplo, que nenhuma nova metástase seja detectada após iniciar-se o tratamento. Isto pode levar a uma mediana de duas a três vezes e/ou uma %-taxa de sobrevivência em anos de pacientes tratados em comparação com pacientes não tratados. Um atraso pode significar um período de pelo menos 8 semanas, 3 meses, 6 meses ou mesmo um ano em que nenhuma nova metástase é detectada após iniciar-se o tratamento. A inibição pode significar que o tamanho médio ou o número total de novas metástases é pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mesmo 90% inferior num grupo tratado com a molécula da invenção em comparação com um grupo não tratado. O número, tamanho e a prevalência de metástases podem ser detectados por um médico com habilidade no campo da oncologia seguindo geralmente a prática aceitada e os procedimentos de diagnóstico para a detecção de metástases, por exemplo, como foi delineado em Harrisons Principies of Internai Medicine 15a ed 2001 Mc Graw Hill. "Tumores metástaticos" como são utilizados no presente documento incluem tanto tumores num local primário capazes de metastatizar como tumores metastatizados num local secundário. "Uma micro-metástase" é uma acumulação de células tumorais com um tamanho menor que 2 mm, que se pode detectar normalmente somente por métodos histológicos. "Invasividade" como é utilizado no presente documento é a capacidade de uma célula de migrar através de uma camada de outras células ou de migrar através da matriz 11 extracelular. A invasividade pode ser avaliada por meio do ensaio em Matrigel descrito nos Exemplos. A invasão mede-se como a percentagem de células que alcançam a superfície inferior do filtro durante um certo período de incubação. "Potencial metastático" como é utilizado no presente documento é a capacidade de uma célula tumoral de formar um novo tumor num local distante de cujo tumor primário a célula tumoral foi derivada (uma metástase). "Quantidades terapeuticamente efectivas" são quantidades que eliminam ou reduzem a carga tumoral do paciente, ou que previnem, atrasam ou inibem a metástase. A dosagem dependerá de muitos parâmetros, incluindo a natureza do tumor, histórico do paciente, estado do paciente, a possível co-utilização de agentes citotóxicos, e métodos de administração. Os métodos de administração incluem a injecção (por exemplo, parentérica, subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, etc), para a qual se proporciona a molécula que inibe a função da Hsp90 extracelular num portador farmaceuticamente aceitável não tóxico. Em geral, portadores adequados e diluentes são seleccionados de modo a não prejudicar significativamente a actividade biológica do agente de ligação (por exemplo, especificidade, afinidade ou estabilidade de ligação), tal como água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, albumina de soro humano a 5%, óleos fixados, etiloleato, ou lipossomas.). Os portadores aceitáveis podem incluir sais biocompatíveis, inertes ou bioabsorvíveis, agentes de tamponamento, oligo-ou polissacáridos, polímeros, composto viscoelástico tal como ácido hialurônico, agentes de melhoramento da viscosidade, conservantes, e similares. Além disso, a composição farmacêutica ou formulação pode também incluir outros portadores, adjuvantes, ou estabilizantes não tóxicos, não terapêuticos, não imunogénicos e similares. As dosagens típicas podem variar desde aproximadamente 0,01 12 até aproximadamente 20 mg/kg, ou mais em particular desde aproximadamente 1 até aproximadamente 10 mg/kg.

Os métodos terapêuticos que empregam moléculas que inibem a função de Hsp90 podem ser combinados com quimioterapia, cirurgia, e terapêutica com radiação, dependendo do tipo do tumor, estado do paciente, outros temas de saúde, e uma variedade de factores. As moléculas que inibem a função de Hsp90 podem também ser utilizadas como o único medicamento efectivo de uma composição terapêutica.

Uma "molécula que inibe a Hsp90 extracelular", é uma molécula que resulta na inibição da actividade biológica de Hsp90 extracelular. Esta inibição da actividade biológica de Hsp90 extracelular pode ser avaliada pela medição de um ou mais indicadores da actividade biológica de Hsp90 extracelular, tal como invasividade dependente de Hsp90. Estes indicadores de actividade biológica de Hsp90 podem ser avaliados por meio de um ou mais de diversos ensaios in vitro ou in vivo (veja-se Exemplos). Preferentemente, a capacidade de uma molécula de inibir a actividade de Hsp90 é avaliada por meio da inibição da invasividade induzida por Hsp90 de células humanas invasivas, em particular as células utilizadas nos Exemplos.

Uma "molécula que inibe a função da Hsp90 extracelular" não é uma molécula que é um inibidor geral de função de proteína, como uma protease, como um agente desnaturante, por exemplo, ureia ou cloridrato de guanidínio, como átomos de metal pesado ou como moléculas pequenas (por exemplo, aldeídos ou isocianatos) que reagem covalentemente e não especificamente com biomoléculas (lípidos, proteínas, açúcares). A inibição é entendida como uma diminuição na função, quando em comparação a um controlo negativo com as mesmas condições experimentais, mas sem a molécula da invenção. Adicionalmente, no caso de um polipéptido, em particular um anticorpo ou fragmento de 13 anticorpo da invenção, considera-se que o polipéptido inibe a função biológica de Hsp90 extracelular se o mesmo reduz a invasividade de células de cancro numa experiência como descrita nos Exemplos em mais de 30%, preferentemente mais de 60%, quando o dito fragmento de anticorpo está presente a uma concentração de 1 nM a 50 μΜ, preferentemente ao redor de 20 μΜ.

Adicionalmente, em relação aos inibidores de Hsp90 extracelular, tal inibidor está abrangido pela presente invenção se o mesmo reduz a invasividade de células de cancro invasivas numa experiência como descrita nos Exemplos em mais de 30%, preferentemente em mais de 60%, quando presente a uma concentração de 10 nM a 100 μΜ, preferentemente ao redor de 1 μΜ. "Hsp90 extracelular" como é utilizada no presente documento é Hsp90 que é debilmente associada à membrana celular e o exterior da célula e não é para ser entendido que abranja a Hsp90 isolada. Isto pode incluir a inserção de Hsp90 na membrana por modificações pós-traducionais ou integração fisica de modo a expô-la à face extracelular da célula ou secreção de Hsp90 ao espaço extracelular. O termo "inibidor" de Hsp90 extracelular é qualquer entidade, que se liga a Hsp90 extracelular e diminui sua função, especialmente em relação às propriedades das células tais como invasividade e/ou o potencial metastático. Tal entidade pode ser uma molécula pequena iónica ou não iónica, orgânica ou não orgânica (isto é, preferentemente que tenha um peso molecular de menos de 1500 Da), macromoléculas de ocorrência natural ou não natural, um polipéptido que pode ser modificado, em particular com fracções de açúcar de ocorrência natural ou não natural ou de outra forma quimicamente modificado, um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal, fragmentos de anticorpo etc. 14 0 termo "um" não é para interpretar-se que signifique "um" e pode também significar "um e/ou mais de um", se não for indicado de outro modo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A fim de que a invenção descrita no presente documento possa ser entendida mais completamente, a seguinte descrição detalhada é proporcionada. A presente invenção refere-se a inibidores, que podem se ligar especificamente a Hsp90 extracelular e mais em particular podem inibir a função de Hsp90 relacionada à invasividade e/ou ao potencial metastático de células de cancro. 0 inibidor de Hsp90 extracelular é incapaz preferentemente ou essencialmente de entrar na célula ou é modificado de tal maneira que a modificação essencialmente proibe sua absorção celular. A modificação dos inibidores da presente invenção pode ser alcançada por meio da conjugação dos inibidores a macromoléculas de ocorrência natural tais como polipéptidos, açúcares ou a um artificialmente feito, polímeros biologicamente compatíveis.

Preferentemente, o inibidor é um bioconjugado com, respectivamente, outra proteína, uma matriz sólida (por exemplo, como uma pérola), consigo mesma para formar multímeros, um agente citotóxico que acentue mais a toxicidade a células alvo, um agente citostático, um pró-fármaco, ou uma molécula efectora, que é capaz de modificar a célula que expressa Hsp90 ou de recrutar células imune.

Os inibidores para inibir a Hsp90 extracelular podem ser, assim, inibidores já conhecidos de Hsp90 (intracelular) tal como geldanamicina e seus análogos tais como 17 AAG, radicicol, coumarina, antibióticos tais como novobiocina ou inibidores de Hsp90 à base de purina tais como PU3, quando são utilizados para inibir a Hsp90 extracelular. No entanto, prefere-se que os inibidores 15 conhecidos sejam modificados tal que a absorção celular seja essencialmente proibida de modo que se elimina quaisquer efeitos secundários associados à possível toxicidade dos inibidores de Hsp90 (intracelular).

Uma lista de agentes citotóxicos inclui, mas não é limitada a, daunorrubicina, taxol, adriamicina, metotrexato, 5 fu, vinblastina, actinomicina D, etoposido, cisplatina, doxorrubicina, genisteína, e inibidores de ribossoma (por exemplo, tricosantina), ou várias toxinas bacterianas (por exemplo, exotoxina de Pseudomonas; proteina A de Staphylococcus aureus) . 0 inibidor é preferentemente seleccionado de um grupo que compreende polipéptidos, anticorpos, fragmentos de anticorpo, coumarina e/ou inibidores de Hsp90 à base de purina e seus análogos.

Os bioconjugados que compreendem os polipéptidos, em particular o fragmento de anticorpo ou anticorpo da invenção, junto com umas fracções citotóxicas são feitos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteina bifuncional. Alguns exemplos de tais reagentes são 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo (SPDP), derivados bifuncionais de imidoésteres tais um adipimidato de dimetilo HC1, ésteres activos tais como suberato de disuccinimidil, aldeidos tais como glutaraldeido, bisazido compostos tais como his (R-azidobenzoil) hexanediamina, derivados de bisdiazónio tais como bis-(R-diazóniobenzoil)etilenodiamina, diisocianatos tais como 2,β-diisocianato de tolileno, e compostos de flúor bis-activados tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno. Os métodos úteis para a produção de bioconjugados são descritos em detalhe em March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 5a Edição, Wiley-Interscience; ou Bioconjugate Techniques, Ed. Greg Hermanson, Academic Press. 16 0 polipéptido da invenção é um anticorpo, numa forma de realização preferida um anticorpo derivado de um fragmento de anticorpo scFv, em outra forma de realização preferida um anticorpo monoclonal ou policlonal, em particular um anticorpo monoclonal humano.

Os anticorpos anti-Hsp90 humana que se ligam a Hsp90 extracelular podem ser seleccionados de imunoglobulinas modificadas, por exemplo, anticorpos produzidos quimicamente ou recombinantemente ou anticorpos humanizados, anticorpos mutagenizados direccionados ao local, que exibem identidade substancial de sequência de aminoácidos nas suas regiões CDR, em particular na sua região CDR3, aos fragmentos de anticorpo correspondentes da invenção e retêm substancialmente a mesma afinidade para a ligação a Hsp90 como os fragmentos de anticorpo correspondentes.

Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-Hsp90 humana é seleccionado do grupo que consiste em IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, em particular IgG e IgM, mais em particular IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4.

Noutra forma de realização preferida da invenção, o inibidor da invenção é em particular um fragmento de anticorpo.

Preferentemente, o inibidor da invenção é um fragmento de anticorpo, em particular um scFv, dsFv, Fab', Fab, F(ab')2, Fv, anticorpo de domínio único ou diacorpo, mais em particular um scFv, dsFv, Fv, anticorpo de dominio único ou diacorpo, ainda mais em particular um scFv, anticorpo de dominio único ou diacorpo e ainda mesmo mais preferentemente um scFv.

Noutra forma de realização, o fragmento de anticorpo da invenção reconhece especificamente um ou mais epitopos de Hsp90, ou epitopos de variantes conservadas de Hsp90, ou fragmentos peptidicos da Hsp90. 17

Como um exemplo, uma forma de aumentar a actividade biológica das moléculas da invenção é utilizar as moléculas (ou ligandos) em combinação com CALI (Inactivação por Luz/Laser assistida por Cromóforo). 0 principio de CALI (Inactivação por Luz/Laser assistida por Cromóforo) baseia-se na iniciação local de uma reacção fotoquimica que leva à geração de espécies reactivas de vida curta, que por sua vez selectivamente modificam a molécula alvo e causam sua inactivação funcional. Os ligandos altamente específicos, mas não inibidores (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo, moléculas pequenas) são marcados com um fluoróforo adequado (por exemplo, isocianato de fluoresceína). Após a formação do complexo entre a molécula alvo (por exemplo, proteínas) e o ligando, o complexo é irradiado com luz laser ou luz branca para excitar o cromóforo ou fluoróforo, respectivamente. A excitação desencadeia uma reacção fotoquimica que inicia a geração de espécies reactivas de vida curta (por exemplo, radicais hidroxi ou espécies de oxigénio altamente reactivas). Estas espécies reactivas modificam a proteína dentro de um raio pequeno ao redor do seu local de geração. A distância que uma espécie reactiva pode percorrer é muito curta devido a sua existência curta. Portanto, as modificações de resíduos de aminoácidos dentro da proteína ocorrem em proximidade imediata ao local de ligação do ligando. 0 efeito de dano é restrito a um raio de 15-40Ã, que é bem abaixo da distância média de duas proteínas dentro de uma célula, que é aproximadamente 80Â, (assumindo uma concentração de proteína citosólica média de 300 mg/ml e um tamanho de proteína médio de 50 kDa) assegurando uma resolução espacial alta do processo. Este princípio é mostrado na Figura 12. Em casos onde o local de ligação do ligando está próximo ou dentro de um domínio funcional importante da proteína, estas modificações induzidas levaram a 18 inactivação permanente da proteína. A inactivação funcional da proteína é medida num ensaio de leitura apropriado e avaliada no contexto de funções fisiológicas relevantes da doença como invasão celular, adesão celular, sinalização celular ou apoptose. A inactivação de proteínas com a CALI mostrou-se ser muito específica à respectiva proteína. Linden et al mostrou que p-galactosidase poderia ser eficientemente inactivada com um anticorpo anti^-galactosidase marcado com verde malaquita mesmo na presença de fosfatase alcalina na mesma solução. A β-galactosidase foi inactivada em 95% após 10 min de irradiação por laser enquanto alcalina não foi afectada de modo algum (Linden et al. (1992) Biophys. J. 61, 956-962). Jay também demonstrou que um anticorpo marcado com corante ligado a um único epítopo de uma proteína foi suficiente para inactivar a acetilcolinesterase (Jay (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 5454-58) .

Henning et al. descreveu que CALI foi utilizada com sucesso contra um arranjo diverso de proteínas (Henning et al. Drug Discovery 62-71). Estas proteínas incluem proteínas de membrana (por exemplo, α-, β-, ε-cadeias de receptor de células T, βΐ integrinas, efrina A5 ou receptor FAS), moléculas de transdução de sinal (por exemplo, Calicineurina, ciclofilina A ou PKC), proteínas do citoesqueleto (por exemplo, Actina, ezrina ou cinesina) ou factores transcrição. Henning et al. descreveu ainda que a CALI pode ser utilizada para a identificação de novas proteínas como alvos de fármacos e ao mesmo tempo em que a elucidação de sua função no contexto biológico de interesse (Henning et al. (2002) Current Drug Discovery, Maio de 2002, 17-19) .

Diversos exemplos de aplicação de CALI mostram que esta técnica é capaz de converter ligandos específicos, mas não inibidores em reagentes de bloqueamento. Portanto, 19 estes ligandos podem ser utilizados para modular a acção de ligandos inibidores. A CALI pode também ser utilizada para acentuar mais o efeito inibidor de um ligando que já tem um efeito inibidor por si mesmo. A parte experimental mostra Exemplos onde a CALI é integrada num ensaio de invasão ou um de adesão. A modificação quimica da molécula pode ser a adição de cromóforos ou fluoróforos. Um cromóforo é essa parte de uma molécula que possui actividade óptica alta devido a electrões móveis que interagem com a luz. Os cromóforos são denominados fluoróforos, se absorvem a luz no intervalo visível do espectro. Alguns exemplos de cromóforos são, por exemplo, derivados de fluoresceina, derivados de rodamina, derivados de coumarina, derivados de porfirina, derivados de ftalocianina, derivados de naftalocianinas, derivados de eosina, derivados de trifenilmetano ou derivados de acridina. Uma lista de cromóforos e derivados úteis para modificar quimicamente as biomoléculas é divulgada em The Sigma Aldrich Handbooks of Stains and Dyes, Ed., F.J. Green (1990) ISBN No. 0-941633-22-5.

Em outro aspecto da presente invenção, o inibidor é marcado com um marcador detectável. Em particular, os exemplos para marcadores detectáveis são radioisótopos, cromóforos, fluoróforos ou enzimas. A expressão de um antigénio de Hsp90 associado a cancro pode ser detectada por meio da utilização de um bioconjugado ou um polipéptido da invenção, em particular um anticorpo ou um fragmento de anticorpo da invenção. Uma amostra é tomada do sujeito, por exemplo, um espécime de biópsia tomado do tecido suspeito de ter um tumor. Geralmente, a amostra é tratada antes de um ensaio ser realizado. Os ensaios, que podem ser empregados incluem ELISA, RIA, EIA, análise de Western Blot, coloração imunohistológica e similares. Dependendo do ensaio utilizado, os antigénios ou os anticorpos podem ser 20 marcados por uma enzima, um fluoróforo ou um radioisótopo. (Veja-se, por exemplo, Coligan et al. (1994) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque, Nova Iorque; e Frye et al. (1987) Oncogene 4, 1153-1157.)

Em outra forma de realização o polipéptido modificado ou o bioconjugado liga-se a Hsp90 extracelular humana e reduz a invasividade e/ou o potencial metastático de células de cancro. Um método para medir um grau da invasividade de células de cancro humanas é dado nos Exemplos. A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende quantidades efectivas de um inibidor de Hsp90 extracelular em particular para reduzir a invasividade e/ou o potencial metastático de células de cancro. Preferentemente, o inibidor é incapaz essencialmente de entrar em uma célula ou é modificado de tal maneira que a absorção celular do inibidor seja essencialmente proibida. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ ou o tratamento de cancro ou metástase. A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende quantidades efectivas de pelo menos um inibidor, em particular um anticorpo ou um fragmento de anticorpo e a utilização do anticorpo ou um fragmento de anticorpo para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento de cancro ou metástase.

Em outra forma de realização, a presente invenção abrange um kit de diagnóstico. Tal kit compreende pelo menos um bioconjugado e/ou pelo menos um inibidor ou uma versão marcada destes, e consiste adicionalmente nos reagentes e materiais necessários para levar a cabo um ensaio de competição padrão ou tipo sanduíche. O dito kit de diagnóstico pode ser utilizado para a determinação do 21 potencial invasivo de amostras biológicas, em particular de certos tipos de célula de cancro. Um kit compreenderá tipicamente ainda um recipiente.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para rastrear ou testar a invasão e/ou o comportamento metastático das células ex vivo, que compreende as etapas de: a) colocar em contacto a célula com um ou mais inibidores de Hsp90 sob as condições que proíbem essencialmente uma captação celular do dito inibidor de Hsp90; b) analisar a migração de células tratadas de acordo com a etapa a); c) comparar a migração das células tratadas de acordo com a etapa a) com as células não tratadas e opcionalmente d) determinar a percentagem de migração das células tratadas de acordo com a etapa a) com células não tratadas.

Numa forma de realização preferida deste aspecto da presente invenção, o rastreio é realizado tal que as células são colocadas em contacto com uma matriz semelhante a gel sob as condições adequadas para o crescimento das células e a etapa b) compreende, assim, analisar a migração das células através da matriz. 0 termo "matriz semelhante a gel" como é utilizado no presente documento é entendido que seja uma substância semi-sólida com um conteúdo em água de pelo menos 90%, que permite a cultura de células de cancro em contacto com a matriz e permite a migração de células de cancro invasivas através de uma prancha da dita "matriz semelhante a gel" de 0,1 mm a 1 mm, preferentemente de 0,3 mm de espessura, mas não a migração de células não invasivas. Os Exemplos para tal "matriz semelhante a gel" são substâncias que se assemelham à matriz extracelular em composição de proteína 22 e hidrato de carbono, em particular o "Matrigel" comercialmente disponível. Em particular a "matriz semelhante a gel" compreende uma das proteínas seleccionadas do grupo que consiste nas proteínas colagénio tipo IV, fibronectina e laminina. Mais em particular a matriz semelhante a gel compreende as proteínas colagénio tipo IV, fibronectina e laminina. Mais preferível a matriz semelhante a gel compreende as proteínas colagénio tipo IV, laminina, entactina, nidogénio e proteoglicanas heparan sulfato ou colagénio tipo IV, fibronectina, laminina, nidogénio, entactina, e vitronectina. A divulgação proporciona ainda um método de identificação de um inibidor que se liga especificamente a Hsp90, por meio do rastreio de uma biblioteca de Aldus, em que estes inibidores são capazes de inibir a invasividade, a adesividade e/ou o potencial metastático relacionado a Hsp90 de células de cancro. 0 dito método compreende as etapas de: a) colocar em contacto uma biblioteca de unidades de apresentação de ligando amplificável (ALDU) com uma célula de cancro, por exemplo, uma célula de sarcoma; b) separar a dita célula de cancro e as ALDUS ligadas à mesma de ALDUS não ligadas à dita célula de cancro; c) amplificar as ALDUS ligadas à dita célula de cancro; d) identificar uma ALDU ou um ligando derivado de uma ALDU após a etapa c), que afecta a dita actividade biológica de Hsp90 por meio de um ensaio de rastreio funcional; e) identificar uma ALDU ou um ligando derivado de uma ALDU após a etapa d) capaz de ligar-se a Hsp90 f) determinar a identidade química do ligando. A ordem preferida - mas não a única possível - das etapas é a, b, c, d, e e opcionalmente f. 23

Como são utilizados no presente documento as "unidades de apresentação de ligando amplificáveis" (ALDUS) são moléculas ou colecções de moléculas com função dupla: podem ligar-se a uma célula alvo via um ligando; e portam associadas fisicamente ao ligando uma informação sobre sua identidade, que permite que as unidades individuais sejam identificadas e amplificadas. Os Exemplos de ALDUS são oligonucleótidos, em particular ARNs, úteis para o processo de selecção-amplificação (SELEX), fagos de bibliotecas de apresentação em fagos, vírus de bibliotecas de apresentação de vírus, ribossomas de técnicas de apresentação em ribossomas, mas também pérolas individualizadas que portam uma molécula ou ligando identificável, em particular entidades químicas, por exemplo, moléculas pequenas ligadas a pérolas, que são reconhecíveis por etiquetas químicas inertes. As preferidas são tais ALDUS, que compreendem um ácido nucleico como o componente identificável. Tais ALDUS podem ser amplificadas in vitro, por exemplo, por meio de métodos de amplificação de ácidos nucleicos como RT-PCR, PCR, LCR e similares, ou podem ser amplificadas in vivo, por exemplo, um fago individual pode infectar uma bactéria e dar, após diversos ciclos de infecção, milhões de progénies virtualmente idênticas. Uma biblioteca de ALDUS é uma colecção de ALDUS similares, mas em geral não idênticas, por exemplo, fagos de uma biblioteca de fagos que apresentam scFvs diferentes no contexto de uma superfície de fago de outro modo idêntica.

Um ligando "derivado de uma ALDU" como mencionado no presente documento é um ligando, que foi apresentado por tal ALDU, que foi seleccionado pela ligação à superfície de uma célula alvo. Como um exemplo, se a ALDU é um fago de uma biblioteca de fagos que apresentam scFvs o "ligando derivado de uma ALDU" neste caso é um polipéptido, no presente documento um scFv. Como outro exemplo, no caso de apresentação ribossomal o ligando "derivado de uma ALDU" é 24 o polipéptido, que foi apresentado pelo complexo que compreende o ribossoma, o ARN e o polipéptido. 0 método vantajosamente combina uma etapa de rastreio baseada na ligação à superfície de uma célula de cancro com uma etapa de rastreio baseada em um ensaio funcional. Portanto, uma biblioteca de ALDUS é trazida em contacto com uma célula de cancro de tal maneira que aquelas ALDUS da biblioteca com especificidade para um antigénio de superfície da célula de cancro pode ligar-se a estruturas associadas à superfície de, por exemplo, a célula de cancro. Por exemplo, os fagos de uma biblioteca de fagos que apresentam anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser permitidos que se liguem a células de cancro cultivadas ou, como outro exemplo, o ARN de uma biblioteca de oligonucleótidos de ARN pode ser permitido que se ligue a tais células de cancro. A identidade de ALDUS que representam o anticorpo ou o fragmento de anticorpo obtido com a etapa d) pode ser determinada por, por exemplo, o Sequenciação do ADN que codifica o anticorpo ou o fragmento de anticorpo, ou, no caso de uma biblioteca comercial com fagos graduados ou numerados, por meio da determinação da posição na graduação ou o número do fago. A posição na graduação ou o número pode então revelar a identidade do anticorpo ou o fragmento de anticorpo representado por a ALDU.

Um "ligando" como é utilizado no presente documento é uma molécula apresentável por uma unidade de apresentação de ligando amplificável (ALDU). Um ligando pode ser qualquer entidade que se liga a Hsp90 extracelular e inibe a sua função. Um ligando é essa parte de uma ALDU através da qual a ALDU pode ligar-se a um alvo.

Um ligando "que se liga especificamente a Hsp90 extracelular" como é mencionado no presente documento pode ser um ligando, que se liga a Hsp90 sob as condições de tamponamento dadas nos Exemplos. A constante de dissociação 25 entre o ligando e a Hsp90 pode ser medida, por exemplo, pela utilização do assim chamado sistema BIACORE (veja-se, por exemplo, Fivash et al. Curr Opin Biotechnol. (1998) 9, 97-101) e "que se liga especif icamente" pode então ser entendido que signifique que a constante de dissociação entre o ligando e a Hsp90 é inferior a 10 μΜ, preferentemente inferior a 1 μΜ, mais preferentemente inferior a 500, 400, 300. 200, 100, 50, 20 nM, o mais preferente desde 0,1 nM até 20 nM se medido sob condições padrão, por exemplo, a 20°C, pressão ambiente e num tampão adequado, por exemplo, 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA a um pH global de 7,0.

Como se utiliza no presente documento "colocar em contacto" dois componentes significa permitir que os dois componentes se associem fisicamente um ao outro e se liguem um ao outro. "Separar" como é utilizado no presente documento significa a separação física de dois ou mais componentes, por exemplo, uma célula com uma ALDU ligada à mesma pode ser separada de uma ALDU livre por meio de centrifugação, em que a célula com a ALDU ligada à mesma é precipitada e a ALDU livre está ainda no sobrenadante. "Amplificar" como é utilizado no presente documento é qualquer processo que aumenta o número de ALDUS ou ligandos derivados de ALDUS por pelo menos um factor de dois, preferentemente por um factor de 10, 100, 1.000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000 ou mesmo um bilhão. Por exemplo, um único fago pode ser amplificado infectando uma bactéria e a bactéria identificada então produz diversas cópias dos fagos infectantes em sua maior parte idênticas, ou uma molécula de ADN pode ser amplificada pelo processo de PCR para dar 104 ou mais moléculas de ADN filhas em sua maior parte idênticas. "Identificar" como é utilizado no presente documento significa localizar ou reconhecer um componente individual, 26 por exemplo, uma ALDU, com propriedades especiais e isolar o dito componente individual. "Determinar a identidade química de um ligando" como é utilizado no presente documento significa determinar a composição estrutural de um ligando. Por exemplo, se a biblioteca de ALDU é uma biblioteca de fagos que apresenta scFvs, então "determinar a identidade química de um ligando" significaria determinar a sequência do polipéptido de scFv, por exemplo, por meio do Sequenciação da região que codifica o scFv do fago a partir do qual foi derivado. "Um ensaio de rastreio" como é utilizado no presente documento é enfocado na detecção de um componente individual, por exemplo, uma ALDU, com propriedades especiais entre outros componentes individuais similares com propriedades ligeiramente diferentes. A fim de qualificar um ensaio de rastreio pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou mesmo 100 componentes individuais precisam ser testados num certo ensaio funcional para encontrar um componente individual/componentes individuais com a função desejada detectada entre os mesmos.

Na etapa de separação (b.) de acordo com a presente invenção, a célula de cancro e as ALDUS ligadas à mesma são separadas das ALDUS não ligadas, a fim de seleccionar aquelas ALDUS com especificidade para a célula de cancro. A separação pode ser alcançada, por exemplo, por meio da retirada da solução, em que a etapa de colocar em contacto foi realizada a partir de células de cancro cultivadas crescidas adesivamente num balão de cultura e junto com a solução as ALDUS não ligadas; ou, como outro exemplo, as células de cancro com ARNs de uma biblioteca de SELEX ligados à mesma podem ser precipitadas por meio de centrifugação, enquanto os ARNs não ligados permanecem no sobrenadante como parte da solução, em que a etapa de contracção foi realizada. Alternativamente, a separação 27 pode ser alcançada por meio de centrifugação, centrifugação por densidade, filtração, triagem por FACS, imunoprecipitação ou imobilização sobre um suporte sólido. Por exemplo, uma aldu ligada a uma célula de cancro pode ser separada das ALDUS não ligadas por meio da utilização do facto de que o complexo de uma ALDU ligada a um alvo tem propriedades bioquímicas diferentes em comparação a uma ALDU não ligada. Aquelas propriedades bioquímicas mudadas podem ser o tamanho, ligação específica, densidade de carga, densidade ou similares. A filtração pode separar as ALDUS ligadas das ALDUS não ligadas, por exemplo, se o tamanho do filtro é tal que ALDUS ligadas à célula de cancro são retidas pelos poros do filtro, enquanto as ALDUS não ligadas podem passar através dos poros do filtro. A filtração pelo tamanho é, portanto, útil se o alvo é grande, como a célula de cancro, e a ALDU é pequena, por exemplo, um fago, um vírus, um ácido nucleico ou um ribossoma que apresenta um ligando. A centrifugação por densidade separa as biomoléculas de acordo com as suas densidades. A centrifugação por densidade pode ser aplicada se a densidade de uma ALDU ligada a um alvo é diferente da de uma ALDU não ligada. Por exemplo, a centrifugação por densidade pode ser aplicada se uma ALDU é densa, por exemplo, um ribossoma que apresenta um ligando, e o alvo não é tão denso, como uma célula de sarcoma ou veículos derivados da membrana de uma célula de cancro. FACS pode separar o complexo de ALDU ligado a uma célula de cancro de ALDUS não ligadas com base na fluorescência do alvo. FACS pode ser realizado por meio da marcação da célula de cancro com um corante fluorescente e então passar a célula de cancro marcada em meio de suspensão através de um bico de gotejamento estreito de modo que cada célula de cancro está numa gota pequena e separada. Um sistema detector à base de laser é com 28 frequência utilizada uma carga eléctrica para excitar o corante fluorescente e as gotas com, por exemplo, as células de cancro de fluorescência positiva. As gotas carregadas e não carregadas podem então ser separadas uma vez que passem por placas de carga e podem ser colhidas em dois tubos diferentes. Neste sentido, as gotas pequenas que contêm ALDUS que são ligadas a uma célula de cancro são separadas da solução padrão que contêm ALDUS não ligadas. A imobilização da célula de cancro sobre suporte sólido pode ser realizada a fim de separar ALDUS ligadas à célula de cancro imobilizadas de ALDUS não ligadas. A imobilização da célula de cancro sobre suporte sólido é com frequência realizada por meio da utilização de um suporte sólido de superfície activada ou ligação específica da superfície de suporte sólido com a célula de cancro utilizando, por exemplo, as biomoléculas com propriedades de ligação específica dirigidas à célula de cancro. A fim de separar as ALDUS que são ligadas à célula de cancro imobilizadas de ALDUS não ligadas, a célula de cancro imobilizada é separada da solução padrão que contêm ALDUS não ligadas. A separação de ALDUS ligadas às células imobilizadas de cancro da solução padrão que contêm ALDUS não ligadas pode ser realizada por meio da retirada da solução padrão que contêm as ALDUS não ligadas das células de cancro imobilizadas. Por exemplo, se a célula de cancro é imobilizada sobre, por exemplo, o poço de uma placa de microtitulação plástica via interacções covalentes então a solução padrão que contém as ALDUS não ligadas pode ser separada por meio da retirada da solução e lavagem dos poços com solução de lavagem.

Na etapa de amplificação (c.) de acordo com o método da presente invenção as ALDUS ligadas ao alvo são amplificadas, a fim de obter concentrações suficientemente altas das ALDUS de modo que sejam úteis para serem 29 aplicadas num rastreio funcional. Esta etapa de amplificar utiliza a propriedade intrínseca de ALDUS de serem amplificáveis. Por exemplo, os fagos que apresentam, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que foram separados dos fagos não ligados na etapa b), mas são ainda ligados à célula de cancro, podem ser amplificados por primeiro recuperar os fagos ligados, por exemplo, por meio da eluição dos fagos das células de cancro e então utilizando o eluato de fago recuperado para infectar bactérias, por exemplo, Escherichia coli. A amplificação dos fagos em Escherichia coli então leva a um aumento significativo no número de fagos total, mas de tal modo, que a concentração daqueles fagos individuais, que foram capazes de ligar-se às células de cancro, seja aumentado dramaticamente. De acordo com uma forma de realização preferida, a etapa de amplificação é idealizada por meio da eluição da ALDU ligada a uma célula de cancro, ou por meio da lise de uma célula de cancro sob condições onde a ALDU permaneça amplificável, e subsequente amplificação. As ALDUS ligadas a uma célula de cancro pode ser eluída das células de cancro primeiro, por exemplo, utilizando soluções com pH baixo e/ou sal alto, como foi demonstrado nos Exemplos, e subsequentemente amplificadas, por exemplo, tal que os fagos eluídos são utilizados para infectar Escherichia coli a fim de produzir grandes números de progénie de fagos. No entanto, a etapa de eluição do alvo, enquanto possa ser conveniente, não é necessária, como, por exemplo, no caso de bibliotecas de fagos mesmo os fagos ainda ligados a uma célula de cancro, são capazes de infectar Escherichia coli e assim capazes de produzir grandes números de progénie idêntica, e assim são amplificáveis mesmo quando ainda estejam ligados à célula de cancro. Em consequência, os fagos não precisam necessariamente de ser retirados da célula alvo, uma vez 30 que um fago ainda ligado a uma célula alvo pode infectar bactérias adicionadas e assim serem amplificados.

Como outro exemplo, o ARNm de uma biblioteca de apresentação ribossomal, que é associado à superfície de uma célula de cancro por meio de sua união a um ribossoma que apresenta o polipéptido que corresponde ao ARNm pode ser directamente utilizado para RT-PCR, sem a necessidade de retirar a ALDU intacta do alvo antes de amplificar o alvo. Assim, uma etapa em que a ALDU ligada a um alvo é recuperada do alvo antes de amplificar a ALDU é uma etapa opcional.

Amplificar a ALDU pode também consistir em determinar a identidade química do ligando de tais ALDUS, que são ligadas à célula de cancro e então amplificar os ligandos. Isto é, por exemplo, que no caso de uma biblioteca de fagos, que apresenta um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, o ADN que codifica aqueles ligandos pode ser clonado de fagos, que são ligados à célula de cancro, por exemplo, por PCR, e o ligando, por exemplo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo, pode então ser produzido recombinantemente para dar quantidades suficientes do ligando que serão úteis para um ensaio de rastreio funcional. De certo modo, não é a própria ALDU que é amplificada, mas o ligando apresentado pela ALDU. Isto, no entanto, está dentro do escopo da invenção, uma vez que o objectivo da etapa de amplificação é a geração de uma concentração de ligando suficientemente alta para ser útil para um ensaio de rastreio funcional e isto pode ser alcançado por meio da amplificação do ligando ou da ALDU que apresenta o mesmo.

Na etapa de identificação (d.) de acordo com o método da presente invenção, uma ALDU ou um ligando derivado de uma ALDU, que foi ligado a uma célula de cancro é identificado com base nos seus efeitos em uma função biológica de Hsp90 a ser testada num ensaio de rastreio 31 funcional. Para tal ensaio de rastreio funcional, as ALDUS ou ligandos derivados destas são individualizados vantajosamente, tal que um sinal ou um padrão do ensaio de rastreio funcional é relatável a uma ALDU individual ou um tipo de ligando individual. Isto pode ser feito, por exemplo, preenchendo poços separados de uma placa multi-poços com ligandos individuais cada e realizar então um ensaio para uma função biológica desejada de Hsp90 naqueles poços individuais.

Em outro exemplo, os fagos que foram ligados a uma célula de cancro, e foram separados de fagos não ligados, pode ser individualizado por meio da infecção de bactérias e da colocação em placas das bactérias infectadas em, por exemplo, ágar macio, de modo que se formam placas individuais, que representam clones de fagos individuais. Aquelas placas individuais podem ser testadas então por seus efeitos num ensaio de rastreio biológico para a função de Hsp90. Em tal ensaio, uma placa individual com um efeito no ensaio de rastreio funcional para a função de Hsp90 é identificável. 0 ligando apresentado pelos fagos da placa pode então ser identificado, por exemplo, pelo Sequenciação do ARN do fago de uma placa isolada, que representam um clone de um único fago, seleccionado inicialmente pela sua capacidade de ligar-se à célula de cancro. Assim, naqueles casos onde uma ALDU por si mesma é utilizada no ensaio de rastreio funcional, a identidade do ligando apresentado pela ALDU pode ser determinada, se for desejado.

Numa forma de realização preferida, o ligando é capaz de inibir um função biológica de Hsp90. Por exemplo, a função biológica de Hsp90 pode ser a invasão, ou a adesão.

Em outra forma de realização, utiliza-se a aldu ou o ligando derivado de uma ALDU para o ensaio de rastreio funcional como na etapa d) do método de acordo com a invenção de identificação de um ligando não modificado de acordo com a invenção. 32

Em ainda outra forma de realização da invenção, as ALDUS ou os ligandos derivados de uma ALDU que são utilizados para o ensaio de rastreio funcional de acordo com a etapa d) do método de identificação de um ligando de acordo com a invenção são quimicamente modificados para aumentar sua actividade biológica ou dotar a ALDU ou o ligando com actividade biológica. Como um exemplo, uma forma de aumentar a actividade biológica de uma ALDU ou um ligando ou para dotar a ALDU ou o ligando com actividade biológica é utilizar a ALDU ou o ligando em combinação com Inactivação por Laser assistido por Cromóforo (CALI) como descrito anteriormente. A CALI pode também ser utilizada para acentuar mais o efeito inibidor de um ligando que tem já um efeito neutralizante e inibidor por si mesmo.

Este torna também claro que a natureza do ligando apresentado na ALDU não é critica para identificar moléculas adequadas, é mais a capacidade da ALDU de ser identificável e amplificável, que tem influência num rastreio bem sucedido para moléculas que inibem Hsp90 de acordo com a invenção.

No entanto, como foi explicado antes, a amplificação da ALDU pode ser alcançada por meio do aumento do número de uma ALDU individual, mas também por meio do aumento do número de um ligando apresentado por uma ALDU individual. Uma vez que isto pode em principio também ser alcançado por uma pérola individual que apresenta uma substância química pequena em bibliotecas químicas combinatoriais (veja-se Ohlmeyer et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei USA 90, 10922-26; Liu et al. J. Am. Chem. Soc. (2002) 124, 7678-80; Liang et al Science (1996) 274, 1520-2) tais bibliotecas de formato de pérolas são também bibliotecas de ALDUS. As moléculas pequenas podem ser sintetizadas em pérolas de micro-esferas, que podem ser indexadas com etiquetas químicas inertes. Durante cada etapa do esquema sintético uma molécula etiqueta que codifica o número de etapa e o 33 reagente químico utilizado nesta etapa é unido à pérola. Este arranjo de etiquetas pode então ser utilizado como um código binário para registar o histórico de reacção de cada pérola. 0 composto identificado pode ser então facilmente sintetizado numa escala maior.

Uma ALDU utilizada no presente documento é uma ALDU biológica por meio do qual a informação sobre a sua identidade é armazenada como um ácido nucleico, por exemplo, ARN ou ADN. Numa forma de realização preferida, a ALDU é seleccionada do grupo que consiste em vírus úteis para apresentação em vírus, fagos úteis para apresentação em fagos, bactérias úteis para apresentação em bactérias, ribossomas úteis para apresentação em ribossomas, leveduras úteis para apresentação em leveduras e oligonucleótidos úteis para selecção e amplificação.

Os fagos úteis para a apresentação em fagos podem ser todos os fagos que podem ser obtidos a partir de cultura e que são amenos a técnicas de engenharia genética e são capazes de apresentar um ligando externo sobre sua superfície. A apresentação em fagos foi divulgada em Smith et al. (1985) Science, 228, 1315-17, a apresentação em fagos de um anticorpo foi divulgada no documento WO 91/17271.

As bactérias úteis para a apresentação em bactérias são bactérias, que podem ser mantidas em cultura, que são amenas a técnicas de engenharia genética e que são capazes de apresentar um ligando sobre sua superfície. Os Exemplos de bactérias úteis para a apresentação em bactérias são divulgados em Dougherty et al., (1999) Protein Eng. 12,613-21; e Wester-lund-Wickstrom B. (2000) Int. J. Met. Microbiol. 290, 223-30.

Os ribossomas úteis para apresentação em ribossomas foram divulgados em Shaffizel et al., (1999) J. Immunol. Methods 231, 119-35; e Willson et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 3750-5. 34

Os oligonucleótidos úteis para a selecção/amplificação (Selex) foram divulgados em Tuerk e Gold (1990) Science 249, 505-10, e Tuerk et ai., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6988-92.

No entanto, também eucariotas inferiores que podem ser cultivados e são amenos para técnicas de engenharia genética e, assim, capazes de apresentar um ligando externo sobre a sua superfície são úteis como ALDUS, por exemplo, levedura geneticamente modificada, como foi divulgado em Boder e Wittrup (2000) Methods Enzymol. 328, 430-44. O método de identificação de um ligando da invenção compreende como a etapa de identificação d) uma separação espacial das diferentes ALDUS de um grupo de ALDUs e então o rastreio das ALDUS separadas espacialmente de seus efeitos sobre uma função biológica de Hsp90 de tal maneira que o resultado obtido pode ser designado a uma ALDU individual. A separação espacial das diferentes ALDUS de um grupo de ALDUS pode ser feita, por exemplo, enchendo poços de separação de uma placa multi-poços com ligandos individuais cada e utilizando então aquelas placas multi-poços num ensaio de rastreio funcional. Se, por exemplo, num poço a função biológica de Hsp90 é inibida, então um ligando que inibe a dita função biológica de Hsp90 é identificado, uma vez que o experimentador conhece a identidade de cada ligando que pôs em cada poço individual.

Além disso, o método de identificação de um ligando de acordo com a invenção pode compreender a etapa de determinar a identidade do ligando, em que esta etapa de determinação é alcançada pelo Sequenciação do ADN de uma ALDU identificada, tomando uma impressão digital genética por PCR do ácido nucleico de uma aldu identificada ou também, no caso de um ligando derivado de uma ALDU, por espectrometria de massa de tal ligando. A obtenção da impressão digital genética por PCR de, por exemplo, fagos é divulgada em Marks et ai. (U. Mol. Biol. (1991) 222, 581- 35 97) . A análise por espectrometria de massa de um ligando, por exemplo, um polipéptido, é divulgada em Shevchenko et al. ((1996) Anal. Chem. 68, 850-58) ou Spengler et al ((1992) Rapid. Commun. Mass. Spectrum. 6, 105-8.) O método de identificação de um ligando de acordo com a invenção pode compreender ainda pelo menos uma etapa adicional de rastreio de Aldus, por exemplo, em que o rastreio é baseado em propriedades bioquímicas das ALDUS. Tal etapa de rastreio adicional pode compreender um método seleccionado do grupo que consiste em citometria de fluxo, ELISA, imunoprecipitação, ensaios de ligação, experiências imunohistoquimicas, estudos de afinidade, imunotransferências e arranjos de proteínas. As propriedades bioquímicas podem ser determinadas pelo tamanho, a forma, a densidade, a densidade de carga, a hidrofobicidade, ou a especificidade de ligação de uma ALDU ou o ligando derivado de uma ALDU. As propriedades bioquímicas da ALDU ou o ligando derivado de uma ALDU formam a base da aplicabilidade dos métodos mencionados anteriormente para rastrear as ALDUS. A citometria de fluxo é normalmente realizada pela marcação de células com um corante fluorescente e passagem então daquelas células marcadas em meio de suspensão através de um bico de gotejamento estreito de modo que cada célula está numa gota pequena e separada. Um sistema detector à base de laser é com frequência utilizado para excitar o corante fluorescente e gotas com, por exemplo, células fluorescência-positiva são registadas. O método de identificação de um ligando da invenção pode compreender ainda uma etapa de selecção subtractiva. Uma etapa de selecção subtractiva é uma etapa, que retira as ALDUS com uma propriedade indesejada. Por exemplo, uma etapa de selecção subtractiva pode ser afectada por meio da retirada das ALDUS capazes de ligar-se a uma célula de controlo, se a propriedade de ligação a uma célula de 36 controlo é indesejada. Por meio de exemplo, se um quer seleccionar as ALDUS específicas para as células de cancro um poderia primeiro seleccionar aquelas ALDUS que se ligam a células de cancro, eluir as ALDUS ligadas, por exemplo, fagos, e então retirar aquelas ALDUS, que são capazes de ligar-se a células de não cancro, por exemplo, por meio de colocar em contacto o grupo de ALDUS eluídas com células de não cancro e retirar aquelas ALDUS ligadas às células de não cancro. As ALDUS restantes no sobrenadante são então ALDUS específicas para células de cancro e podem então ser utilizadas em ensaios de rastreio funcional de acordo com o método de identificação de um ligando da invenção.

Na etapa e) o grupo de ALDUS, por exemplo, fagos, é enriquecido em ALDUS que se ligam a Hsp90. Aquelas ALDUS que se ligam a Hsp90 podem finalmente ser identificadas na etapa f) por numerosos métodos conhecidos na técnica.

Além disso, o método anterior compreende ao invés das etapas e) e f) as etapas adicionais de: e) colocar em contacto ALDUS, por exemplo, fagos isolados com Hsp90 recombinante; f) lavar a dita Hsp90 com um detergente de tamponamento e/ou solução com sal alto; e g) eluir as ALDUS, por exemplo, fagos ligados a Hsp90; e h) determinar a identidade do ligando, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo representado pelo dito ALDU eluído, por exemplo, um fago. 0 "detergente" utilizado pode ser uma solução detergente, preferentemente tamponada, e pode ser Tween numa concentração de 0,001 - 0,5%, em particular de 0,01 -0,1%. "Sal alto" como é utilizado no presente documento significa uma solução com sal alto, preferentemente tamponada, e tem uma força iónica de 10 mM - 1 M, em particular de 20 - 500 mM, mais em particular de 50 - 350 mM, ainda mesmo mais preferentemente de 80 - 250 mM. Aniões 37 típicos úteis são, por exemplo, cloreto, citrato, fosfato, fosfato de hidrogeno ou borato. Catiões típicos úteis são, por exemplo, sódio, potássio, lítio, cálcio ou magnésio. A solução tamponada no parágrafo anterior tipicamente tem um pH de 7-8. Por exemplo, DMEM ou PBS, em particular com 1-20%, mais em particular 5-15%, ainda mesmo mais preferentemente aproximadamente 10% de FCS, podem ser utilizados como tampões. O isolamento de células com fagos ligados às mesmas é efectuado por centrifugação suave a valores de g desde 200 até 300 durante 3 a 20 minutos, em particular 5 a 10 minutos. A eluição de fagos ligados, tanto a células como a Hsp90 imobilizada, é efectuada por uma lavagem com 2-100 mM, em particular 4-50 mM, mais em particular 5-20 mM, ainda mesmo mais preferentemente ao redor de 10 mM de glicina a um pH de desde 0 até 2,5, em particular desde 1 até 2,5, mais em particular desde 1,5 até 2,5.

Além disso todos os inibidores de Hsp90 extracelular podem ser utilizados de acordo com a presente invenção para modular e reduzir especialmente a actividade e/ou reduzir a secreção de metaloproteinase de matriz (MMP).

Os seguintes exemplos, incluindo experiências conduzidas e resultados alcançados, proporcionam-se para propósitos ilustrativos somente e não são para serem

interpretados como limitativos à presente invenção. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a invasão de células HT-1080 coradas aatravés de um filtro de 8 pm revestido com Matrigel (fotografia da esquerda). A fotografia da direita mostra a invasão de

células HS-27 coradas como um controlo. A fluorescência foi quantificada após seis horas de incubação a 37°C. Os dados apresentados são a média de n = 3 poços +/-DP. 38 38 A Figura 2 A Figura 3 A Figura 4 mostra o efeito inibidor de mAb 1.5.1 sobre a invasão de células HT-1080. A invasão foi determinada num ensaio de quimiotaxia com uma câmara de migração celular revestida com Matrigel após irradiação com luz (com CALI). A invasão de células HT-1080 na ausência de qualquer molécula inibidora foi utilizada como um controlo (barra da esquerda). mAb 1.5.1 inibiu a invasão de células HT-1080 em aproximadamente 35% (valor de p < 0,001). mostra o efeito inibidor de scFvl sobre a invasão de células HT-1080. A invasão foi determinada num ensaio de quimiotaxia com uma câmara de migração celular revestida com Matrigel após irradiação com luz (com CALI). A invasão de células HT-1080 na ausência de qualquer molécula inibidora foi utilizada como um controlo (barras da esquerda). scFvl inibiu a invasão de células HT-1080 em aproximadamente 46% (valor de p < 0,05). mostra uma correlação da inibição de invasão com a concentração de anticorpo. Os anticorpos específicos para Hsp90, a Hsp90a, a Hsp90p, (todas Stress- gen), alfa-actinina-4 (Martin R. Pollak, Children's Hospital, Boston, MA) e mAb 1.5.1 foram marcados com FITC e testados no ensaio de invasão após irradiação com luz a 3 concentrações (10 μρ/πΛ, 20 μρ/mL, e 40 μρ/mL) . O controlo positivo βΐ-integrina (Chemicon, 20 μρ/mL) e controlo negativo (0, sem anticorpo) são também mostrados. mAb 1.5.1, anticorpos Hsp90, e Hsp90a todos demonstraram inibição dependente da concentração de invasão, enquanto Hsp90P e alfa-actinina-4 não. Cada 39 barra é normalizada para controlo escuro e representa a média ± e.p.m. de pelo menos 2 experiências em triplicata. A Figura 5 mostra o resultado de experiências de imunoprecipitação. mAb 1.5.1 ou um anticorpo anti-Hsp90 (Stressgen n° SPA-830) foi incubado com lisados de células HT-1080. Os imunocomplexos foram separados por meio de SDS-PAGE e submetidos a imunotransferência com mAb 1.5.1 ou o anticorpo anti-Hsp90. A mesma banda especifica é reconhecida por ambos os anticorpos, indicando que ambos os anticorpos se ligam a mesma proteína. A Figura 6 mostra co-imunocitoquimica de Hsp90 e mAb 1.5.1. 0 primeiro painel mostra a localização de Hsp90a/p (Affinity Bioreagents n° PA3012 & PA3-013) próxima a borda anterior de células HT-1080. 0 segundo painel mostra a mesma localização próxima a borda anterior utilizando mAb 1.5.1. A co-localização de proteína completa pode ser vista quando as imagens são sobrepostas (fotografia da direita). Isto demonstra que mAb 1.5.1 e Hsp90 reconhecem a mesma proteina. As imagens foram colhidas (Zeiss Axiovert 10 utilizando uma lente Neofluar de abertura numérica 40-x/0,75) utilizando conjuntos de filtro de excitação a 546 e 480 e conjuntos de filtro de emissão a 590 e 535 para rodamina (vermelho, a Hsp90a/p) e FITC (verde, mAb 1.5.1). Barras de escala em imagens representam 10 μιη. A Figura 6.1 Imunocitoquimica de superfície em células HT-1080 utilizando anticorpos contra βΐ-integrina (c), e Hsp90a (e) mostram 40 colorações de superfície distintas. Os controlos negativos [ratinho secundário sozinho (a) e coelho secundário sozinho (b) ], a-actinina-4 (d), e Hsp90P (f) mostram coloração de superfície não detectável. As imagens foram visualizadas utilizando um Olympus BH-3, e colhidas utilizando uma câmara digital SPOT (Digital Instrument). A Figura 6.2 Imunocitoquímica de superfície em células de adenocarcinoma MD-MDA231 utilizando anticorpos contra βΐ-integrina (c), e Hsp90a (e) mostram colorações de superfície distintas. Os controlos negativos [ratinho secundário sozinho (a) e coelho secundário sozinho (b)], a-actinina-4 (d), e Ηορ90β (f) mostram coloração de superfície não detectável. As imagens foram visualizadas utilizando um Olympus BH-3, e colhidas utilizando uma câmara digital SPOT (Digital Instruments). A Figura 6.3 Imunotransferência de meios condicionados com HT-1080 com anticorpos específicos Hsp90a e Ηορ90β mostra a localização extracelular de Hsp90a, mas não Ηορ90β. A Hsp90a está presente em meios condicionados livres de soro de células HT-1080, mas ΗερθΟβ está ausente. A Figura 7 mostra uma experiência de biotinilação de proteína de superfície que foi realizado com células HT-1080 vivas como foi descrito anteriormente. Tanto as proteínas de superfície biotiniladas como as proteínas intracelulares não biotiniladas foram separadas por meio de SDS-PAGE. Os anticorpos Hsp90 e alfa-actinina-4 foram utilizados para 41 41 A Figura 8 A Figura 9 A Figura 10 A Figura 11 análise de imunotransferência. A Hsp90 mostra tanto localização em superfície (S) como intracelular (IC), mas a alfa-actinina é encontrada somente no conjunto intracelular, mostra um resultado de análise de FACS. A actividade de ligação de scFvl a células HT-1080 (linha em negrito) e a células HS-27 (linha fina) como controlo é ilustrada, mostra correspondências de péptidos a partir de análise de espectrometria de massas. Fragmentos de péptido tripnizados a partir da imunoprecipitação de mAb 1.5.1 foram executadas num Survevor HPLC e espectrómetro de massas LCO Deca Ion Trap (ThermoFinnigan) com um 75 μΜ coluna C18 de nano-spray (New Objectives). Os PMF (fragmentos de massa de péptidos) obtidos foram utilizados para pesquisar todas entradas para a espécie Homo sapiens nas bases de dados NCBI e Swiss-Prot. Os péptidos correspondentes cobrem 24% (172/732 resíduos) de Hsp90a e 33% (241/724 residuos) de Hsp90p. mostra o efeito dependente de concentração de novobiocina sobre a invasão de células HT-1080. As células HT-1080 foram pré-tratadas durante 1 hora com novobiocina ou ácido nalidixico e um ensaio de invasão foi realizado. Novobiocina mostra uma inibição dependente da dose de invasão (p á 0,01 a > 0,05 mM por ANOVA) . O ácido nalidixico não tem efeito sobre a invasão. A viabilidade de células neste ensaio não foi afectada (dados não mostrados). Cada ponto de dados é normalizado ao controlo sem fármaco e representa a média 42 42 A Figura 12 A Figura 13 A Figura 14 A Figura 15 A Figura 16 A Figura 17 A Figura 18

le.p.m. de 2 experiências em triplicata. mostra que a secreção de MMP é diminuida após a adição de novobiocina. 40.000 células HT-1080 foram tratadas durante 6 horas com novobiocina ou ácido nalidixico (como um controlo) nas concentrações dadas. A actividade de MMP foi diminuída em >75% na concentração mais alta de novobiocina testada e não foi vista redução de actividade de enzima com ácido nalidixico. Duas bandas (A e B) correspondem a MMP não identificadas. (Imagem invertida para clareza.) mostra o principio da Inactivação por laser/luz assistida por cromóforo (CALI) mostra o mapa de vector do vector de apresentação de scFv pXPlO e sequência correspondente mostra o mapa de vector do vector de expressão de scFv pXP14 e sequência correspondente mostra as sequências para os iniciadores de construção para uma biblioteca de ratinho, mostra as sequências de aminoácido (SEQ ID NO.: 1) (região CDR3 está sublinhada) e sequência de nucleótidos (SEQ ID NO.: 2) de scFvl mostra que um anticorpo anti-Hsp90a co-imunoprecipita MMP 2 a partir de meios condicionados com HT-1080. Proteínas Imunoprecipitadas foram submetidas a imunotransferência com anti-MMP2 ou Hsp90a. Inibição de Hsp90 inibe a secreção de MMP2. mostra o conteúdo de MMP2 em meios condicionados após tratamento com geldanamicina (GA). As células HT-1080 foram 43 tratadas com 20 μΜ de geldanamicina (GA) em meios livres de soro e ensaiadas por meio de zimografia. A actividade de MMP2 (gelatinase de 72 kDa) foi diminuída em -35% após tratamento com GA. O conteúdo de proteina total foi visualizado por meio de coloração com prata para assegurar o carregamento igual. A Figura 19 mostra uma correlação entre o conteúdo de MMP2 e o conteúdo de Hsp90a. As células HT-1080 foram tratadas com pérolas de agarose conjugadas com geldanamicina (pérolas de GA) ou pérolas de controlo (pérolas) ou deixadas sem tratar (0). Meios condicionados foram submetidos a imunotransferência para MMP2 ou Hsp90a. Os niveis de MMP2 activa foram diminuídos em 80%, e os niveis pró-MMP2 foram diminuídos em 15% após o tratamento com pérola de GA. A Figura 20 mostra a diminuição de invasividade de células tumorais após tratamento com diferentes quantidades de pérolas de agarose conjugadas com geldanamicina (pérolas de GA) . As células HT-1080 foram tratadas ou sem pérolas, 5% ou 10% (v/v) de pérolas de GA ou pérolas de controlo e ensaiadas para invasividade. As células tratadas com pérola de GA mostram uma redução de 45%, enquanto que células tratadas somente com pérola de controlo mostram uma redução de 15% em invasividade (p < 0,01, teste de t) . Cada ponto de dados é normalizado ao não tratamento de controlo e representa a média ± erro padrão de dois ensaios em triplicata. 44

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais (por exemplo, mAb 1.5.1)

Ratinhos foram imunizados com células fixas ou lisadas HT-1080 duas vezes ao longo de três meses. Para fixação, as células HT-1080 confluentes (lxlO7/ balão 75 cm2) foram lavadas uma vez com pbs, retiradas então com PBS e raspagem. As células foram ressuspensas utilizando pipeta, centrifugadas durante 5 minutos a 220Xg, e fixas com 10 mL de paraformaldeido a 2% durante 10 minutos a 4°C. As células foram lavadas com PBS, então ressuspensas em 1 ml de PBS. As células lisadas foram geradas por meio de tripsinização das células HT-1080 confluentes, lavando uma vez com PBS, precipitando então durante 1 minuto a 12000xg. As células foram então lisadas em tampão de lise (0,67 Triton-X-100 em Tris-HCl 0,33 M, pH 7,5) à temperatura ambiente durante 5 minutos. O lisado foi então centrifugado durante 5 minutos a 12000xg. Triton-X-100 foi retirado pela adição do lisado a colunas de PD-10 e eluindo proteína com 3,5 ml de PBS. Proteína foi quantificada utilizando Micro-BCA kit (Pierce), e 150 μρ/ηιΐ-,/^^ηΙιο foi utilizado para imunização. A geração de hibridomas foi realizada como descrito anteriormente (Harlow e Lane, 1988) .

Os sobrenadantes de hibridoma em primeiro lugar foram rastreados pela fixação de uma monocamada confluente de células HT-1080 (40.000 por poço de uma placa de fundo fino transparente de 96 poços) em paraformaldeido a 4%/PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente e então permeabilizando em Triton-X-100 a 0,2% durante 5 minutos. Seguindo incubação com sobrenadante de hibridoma não diluído, realizou-se três lavagens de 5 min com albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Um anticorpo secundário anti-ratinho de coelho marcado com FITC foi adicionado durante 1 hora à 45 temperatura ambiente. As mesmas lavagens com BSA a 1%/PBS foram repetidas e um anticorpo terciário anti-ratinho de cabra marcado com FITC foi adicionado durante 1 hora à temperatura ambiente. Após uma série final de lavagens, as células foram armazenadas em PBS a 4°C até a formação de imagens. As imagens foram colhidas (Zeiss Axiovert 10 utilizando um Neofluar 40X/ lente de abertura numérica 0,75) utilizando conjunto de filtro de excitação a 480 e conjunto de filtro de emissão a 535 para FITC. As células foram pontuadas para coloração em comparação como controlos positivos (integrina anti-βΐ, Chemicon n° MAB1963 e anti-gelsolina, Sigma n° G4896) e controlos negativos (sem anticorpo primário).

Os hibridomas que testaram positivo para ligação a HT-1080 foram então testados para expressão em superfície por imunocitoquímica de superfície. Para imunocitoquímica de proteína de superfície, uma monocamada confluente de células HT-1030 (40.000 por poço de uma placa de fundo fino transparente de 96 poços) foi incubada com sobrenadante de hibridoma durante 1 hora a 37°C/5% de C02. Após três lavagens durante 5 min com albumina de soro bovino a 0,1%. (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram fixas em paraformaldeído a 2% durante 2 min. Outra série de lavagens com BSA a 1%/PBS foi realizada, e um anticorpo secundário anti-ratinho de coelho marcado com FITC foi adicionado durante 1 hora à temperatura ambiente. As mesmas lavagens foram repetidas e um anticorpo terciário anti-ratinho de cabra marcado com FITC foi adicionado durante 1 hora à temperatura ambiente. Após uma série final de lavagens, as células foram armazenadas em PBS a 4°C até a formação de imagens. A coloração de superfície foi visualizada por microscopia num Zeiss Axiovert 10 utilizando um Neofluar 40X/ lente de abertura numérica 0,75. As imagens foram colhidas utilizando conjunto de filtro de excitação a 480 e conjunto de filtro de emissão a 46 535 para FITC. As células foram pontuadas pela coloração de superfície em comparação a um controlo positivo (integrina anti-βΐ, Chemicon n° MAB1963 e anti-gelsolina, Sigma n° G4896) e controlos negativos (sem anticorpo primário).

Exemplo 2: Construção de uma biblioteca imune

Dois ratinhos balb/c foram cada um imunizado intradermicamente com 2 x 107 células HT-1080 fixas com paraformaldeído (linha celular de fibrosarcoma humano; ATCC, CCL-121). Seguindo a primeira imunização, as injecções foram repetidas duas vezes num período de 39 dias, os ratinhos foram sacrificados e os baços foram isolados e congelados em azoto líquido. 0 arn total foi isolado utilizando o RNeasy Midi Kit (QIAGEN n° 75142) como descrito pelo fabricante utilizando a metade de cada preparação de baço. A concentração de ARN e pureza foi determinada por um gel desnaturante de formaldeído e medição fotométrica. ADNc foi sintetizado utilizando 8,9 μg de ARN preparado recentemente e 10 pmol de uma mistura de iniciadores IgGl-c, IgG2a-c, IgG2b-c, lgG3-c, VLL-c, VLK-c) utilizando o Superscript™ II Kit (GibcoBRL Life Technologies n° 18064-014). Estes iniciadores hibridam ao ARN que codifica os genes de cadeia pesada (VH) e os genes de cadeia leve (VL) de igG da família kapa e lambda. Os genes de VH foram amplificados por PCR a partir de 1 μΐ de ADNc utilizando 36 combinações individuais de 9 iniciadores directos (M-VHl, M-VH2, M-VH3, M-VH4, M-VH5, M-VH6, M-VH7, M-VH8, M-VH9) e 4 iniciadores reversos (M-JH1, M-JH2, M-JH3, M-JH4) sem locais de restrição. Os genes de VL foram amplificados por PCR com uma mistura de iniciadores (M-VKl, M-VK2, M-VK3, M-VK4, M-VLl, M-JK1, M-JK2, M-JK3, M-JL1) sem locais de restrição. Os produtos de PCR foram purificados em gel (QIAquick Gel Extracção Kit, #28706) e re-amplificados utilizando combinações individuais de 9 47 iniciadores directos (MVHl Sfil MVH2 Sfil MVH3 Sfil, MVH4 Sfil, MVH5 Sfil, MVH6 Sfil, MVH7 Sfil, MVH8 Sfil, MVH9 Sfil) e 4 iniciadores reversos (M-JHl Sall, M-JH2 Sall, M-JH3 Sall, M-JH4 Sall) com locais de restrição para vh e uma mistura de iniciadores (M-VKl ApaLl, M-VK2 ApaLl, M-VK3 ApaLl, M-VK4 ApaLl, M-VLl ApaLl, M-JK1 Notl, M-JK2 Notl, AM-JK3 Notl, M-JLl Notl) com locais de restrição para vl. Os produtos de PCR foram purificados em gel (QlAquick Gel Extraction Kit, n° 28706) e clonados no vector de apresentação de fago pXPlO utilizando os locais de restrição Sfil/Sall para VH e ApaLl/Notl para VL. A mistura de ligação foi transfectada em E. colí TG-1 por meio de electroporação que resulta num tamanho de biblioteca de 107 clones independente (fagos) que expressam diferentes fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv).

Exemplo 3: Selecção e Rastreio de scFv (Selecção em células fixas)

Fv de cadeia única foram seleccionados de uma biblioteca de apresentação de fago gerada a partir de ratinhos imunizados com células HT-1080 fixas. A biblioteca foi gerada utilizando o vector de apresentação de fago pXPlO.

Fagos que expressam scFv com alta afinidade a células tumorais foram seleccionados como segue: células HT-1080 foram colhidas com EDTA a 0,05%, fixas com paraformaldeido, diluídas a lxlO7 células/ml em PBS e imobilizadas sobre poços de uma placa de reticulação por UV de 96 poços (Corning Costar) . Os poços da placa de reticulação por UV foram bloqueados com 5% de Leite em pó magro (n° 70166, Fluka) em PBS (MPBS). 1012 ufc (unidades formadoras de colónias) de biblioteca de fago/ 106 células foram pré-bloqueadas durante 1 hora a 25°C com MPBS e subsequentemente incubado durante 1,5 hora à temperatura ambiente (RT) com as células. Os poços da placa de 48 reticulação por UV foram lavados seis vezes com PBS + Tween-20 a 0,05% seguido por seis lavagens com PBS. Os fagos ligados foram eluídos pela adição de 10 mM de Glicina pH 2,2, e neutralizados com 1 M de Tris /HC1 pH 7,4. Tipicamente, entre 103 e 106 ufc foram eluídas na Ia série de selecção, assim a diversidade do repertório enriquecido é diminuída em comparação com o repertório original. O eluato que contém o repertório enriquecido foi amplificado infectando E. coli em crescimento exponencial TG 1. Fagomídeo que contém E. coli foi seleccionado e propagado por crescimento durante a noite (o/n) a 30°C em placas de agar LB complementadas com 100 μρ/πιΐ de ampicilina e 1% de glicose. Seguindo esta etapa, o repertório enriquecido pode ou ser amplificado como um grupo policlonal e utilizado para outras séries de selecção de uma maneira repetitiva até a convergência às propriedades desejadas serem alcançadas ou ser espacialmente separado e rastreado num nível de clone único. Partículas de fago para a seguinte série de selecção foram produzidas pela superinfecção de culturas em crescimento exponencial da série de selecção anterior com fago ajudante VCS-M13 (Stratagene, La Jolla, CA) e crescendo as culturas durante a noite a 20°C em 2xTY complementadas com 100 μρ/ιηΐ de ampicilina (amp) e 50 μρ/ιηΐ de kanamicina (kan) . Fago pronto de selecção foram precipitados com 0,5 M de NaCl/4% de PEG-6000 a partir do sobrenadante bacteriano limpo e ressuspensos em PBS. Uma série de selecção foi realizada, seguido por rastreio num nível de clone único como descrito no Exemplo 4.

Exemplo 4: Selecção e Rastreio de scFv (Rastreio em células fixas)

Para o rastreio, os genes que codificam os scFv seleccionados, contidos no vector de apresentação de fago, foram re-clonados ao vector de expressão pXPl4. Este vector dirige a expressão de scFv em fusão com uma etiqueta Strep 49 e etiqueta E e não contém um gene-3 de fago filamentoso. 0 vector de expressão que contém E. coli TG1 a partir de colónias únicas foi crescido em poços individuais de uma placa de microtitulação de modo que cada poço contém somente um clone scFv. As bactérias foram crescidas a 30°C em 2xTY complementadas com 100 μρ/ιηΐ de ampicilina e 0,1% de glicose em placas de microtitulação de 96 poços (n° 9297, TPP) até um D06oo de 0,7. A expressão foi induzida com IPTG a uma concentração final de 0,5 mM e continuou a 25°C durante a noite. Fv de cadeia única que contém lisados limpos foram preparados pela adição de lisozima de ovo de galinha (n° L-6876, Sigma) a uma concentração final de 50 μg/ml durante 1 hora a 25°C e centrifugação durante 15 minutos a 3000 x g. Antes do rastreio com elisa, os lisados limpos foram bloqueados pela adição de um volume igual de DMEM + FCS a 10% durante 1 hora. Para o rastreio com ELISA, células HT-1080 foram colhidas com EDTA a 0,05%, fixas com paraformaldeido, diluídas a lxlO7 células/ml em PBS e imobilizadas sobre poços de uma placa de reticulação por UV de 96 poços (Corning Costar). Os poços da placa de reticulação por UV foram bloqueados com MPBS e o scFv que continha lisados limpos bloqueados foram adicionado durante 1,5 horas a 25°C. As placas foram lavadas 2x com PBS + Tween-20 a 0,1% e lx com PBS, incubadas com etiqueta a-E conjugada com HRP (n° 27-9413-01, Pharmacia Biotech; diluídas 1:5000 em MPBS com Tween-20 a 0,1%) durante 1 hora, lavadas 3x com PBS + Tween-20 a 0,1% e 3x com PBS, desenvolvidas com POD (n° 1 484 281, Roche) e sinais lidos a 370 nm.

Os clones positivos foram retestados contra células ht-1080 e fibroblastos humanos Hs-27 de controlo (ATCC CRL-1634) utilizando o procedimento de rastreio ELISA descrito anteriormente e conservados em estoque de glicerol. Num rastreio típico, clones 2760 (30x92) foram rastreados para a ligação a células HT-1080 com 5% de positivos definidos 50 como clones dando um sinal subtraído de fundo > 0,1. 155 clones positivos foram retestados para ligação específica a células HT-1080 em comparação às células Hs-27 de controlo com 28% positivos definidos como clones dando um sinal subtraído de fundo em HT-1080 de pelo menos duas vezes o valor do sinal em células Hs-27 de controlo.

Exemplo 5: Sequenciação e expressão em larga escala O Sequenciação de scFvl e seus genes foi realizado por Sequiserve GmbH, Vaterstetten, Alemanha utilizando o iniciador pXP2 Seq2 (5'-CCCCACGCGGTTC-CAGC-3' e pXP2 Seql (5TACCTATTGCCTACGGC-3'. A sequência de aminoácidos e a sequência de nucleótidos são mostradas nas Figuras.

Clones únicos identificados por Sequenciação foram retirados por vapor do estoque de glicerol sobre placas de agar LB/Amp (100 μg/ml)/l% de glicose e incubados o/n a 30°C. 10 ml de meio LB/Amp/Glu (1%) foram inoculados com uma colónia única e crescida o/n a 30°C e agitando a 200 rpm. Na manhã seguinte, as culturas de durante a noite foram colocadas em gelo até a inoculação de 1 L de meio 2xTY complementado com 100 μρ/ιηΐ de ampicilina e 0,1% de glicose em balões Erlenmeyer de 2 L. As culturas foram crescidas a 25°C agitando até que um D06oo 0,5 - 0,6 fosse alcançado e então foram induzidas com concentração final de IPTG 0,1 mM. Ampicilina fresca foi adicionada a 50 μg/ml e incubação continuou a 22°C o/n agitando. De manhã as culturas foram centrifugadas a 5000 x g durante 15 minutos a 4°C, os sobrenadantes foram descartados e os precipitados ressuspensos cuidadosamente em gelo com uma pipeta em 10 ml tampão de PBS-0,5 de M Na pré-arrefecido que contém inibidores de protease completos (n° 1697498, Roche). Após ressuspensão ser completada, suspensões bacterianas foram transferidas para 20 ml tubos de centrífuga Oakridge e lisozima de ovo de galinha (n° L-6876, Sigma) adicionado a uma concentração final de 50 μg/ml durante 1 hora em gelo. 51

As bactérias lisadas foram centrifugadas a 20000 x g durante 15 minutos a 4°C e os sobrenadantes (o lisado) transferidas para um tubo de plástico de 15 ml. Para purificação por afinidade os lisados foram carregados com 1 ml/min sobre 1 ml de colunas StrepTactin (n° 2-1505-010, IBA) equilibradas com 10 volumes de coluna (CV) de tampão PBS-0,5 M Na via um sistema de purificação de proteina paralelo. Após uma lavagem com 10 CV com PBS a eluição foi feita com 5 CV de PBS/5 MM Destiobiotina (n° D-1411, Sigma) e fracções de 1 ml colhidas. As fracções foram medidas a UV280, as fracções que continham proteína foram agrupadas e concentradas com dispositivos de filtro por ultracentrifugação Amicon 10.000 MWCO (n° UFC801024, Mil-lipore) a 4700 x g. As scFv concentradas foram verificadas em géis 12% Bis-Tris de SDS-PAGE corados com Coomassie Blue para pureza e congeladas em aliquotas com 20% de glicerol a -80 °C.

Exemplo 6: Análise de FACS para ligação específica de célula tumoral

Para testar a habilidade de scFv anti HT-1080 purificado para ligar especificamente a células alvo, foi realizado uma análise de triagem de célula activada por fluorescência (FACS) utilizando células HT-1080 (ATCC CCL-121) e células Hs-27 (106 células/ml) como linha celular de controlo (veja-se as Figuras). As células foram incubadas com 10 μρ/ηιΐ de scFv puro em CellWash (BD (Becton, Dickinson and Company) n° 349524) durante 20 min a 4°C, lavadas, e scFv unidos foram detectados com um mab anti etiqueta E marcado com FITC secundário (Amersham n° 27-9412-01). Amostras foram lavadas e analisadas num Becton Dickinson FACSscan. A Figura 8 mostra a intensidade de fluorescência log (FLl-H; eixo x) versus os números relativos de célula (contagens; eixo y) para células que reagem com scFvl. A linha fina representa a linha celular 52 de controlo (HS-27) e a linha em negrito as células H-1080. scFvl especificamente cora as linhas de células tumorais com até sinal 10 vezes mais alto em comparação com a linha celular de controlo.

Exenqplo 7: Marcação de scFv com FITC scFv foram marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Molecular Probes, Eugene, USA n° F1906) pelos seguintes métodos: Alíquotas de uma solução 10 Mg/ml de FITC em dimetilssulfóxido seco foram adicionadas a 100 μg de scFvl dissolvidas em PBS/0,5 M de Na-HC03, pH 9,5 numa razão de 30:1 (FITC:scFvl). A amostra foi incubada durante duas horas à temperatura ambiente com agitação, FITC livre foi separado utilizando colunas de dessalinização (2 Micro Spin G-25, Pharmacia 27-5325-01). A razão de marcação foi determinada via espectrometria de massas e via UV/VIS espectroscopia, por meio do qual a concentração de proteína foi calculada a 280 nm e a concentração de FITC a 494 nm.

Exemplo 7.1: Marcação de mAb 1.5.1 com FITC

Uma solução preparada recentemente de 10 Mg/mL de FITC (Molecular Probes, Eugene, USA n° F1906) em dimetilssulfóxido seco foi adicionada numa razão 1:5 com anticorpo mAb 1.5.1 purificado (T-gel Absorbant, Pierce Biotechnology n° 20500). Um volume igual de 0,5 M de NaHC03, pH 9,5 foi adicionado à reacção, e a reacção foi incubada com agitação durante duas horas à temperatura ambiente. FITC Livre foi separado utilizando uma coluna de dessalinização (PD-10, Amersham n° 17-0851-01). A razão foi determinada calculando a concentração de FITC por meio de espectroscopia vis a 494 nm e supondo recuperação completa de proteína a partir da marcação.

Exemplo 8: Ensaio de invasão para identificação de fragmentos de anticorpo inibidores 53 0 sistema ChemoTx® (Neuro Probe Inc. n° 106-8, Gaithersburg) é utilizado como uma câmara de quimiotaxia/migração celular descartável num formato de 96 poços com um filtro de policarbonato com sulcos gravados de 8 |im e tamanho de poro, 5,7 mm diâmetro/local. 13,3 μΐ de 0,3 Mg/ml de Matrigel (Matrigel é uma preparação de membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de ratinho Engelbret-Holm-Swarm (EHS), um tumor rico em proteínas de matriz extracelular. Seu componente principal é laminina, seguido por colagénio IV, proteoglicana de heparan sulfato, entactina e nidogénio. Também contém factor de crescimento de fibroblasto TGF-β, activador do plasminogénio tecidual, e outros factores de crescimento que ocorrem naturalmente no tumor EHS) (Becton Dickenson, BD n° 356234) diluídas em Dulbeccos PBS (Gibco n° 14040-091) aplicam-se no filtro de membrana da placa de 96 poços na fila B-H e na fila A 1,2 μρ/1οο3ΐ de colagénio S tipo I (Roche n° 10982929) diluem-se em 0,05 M de HC1 (Sigma n° 945-50) e incubam-se durante a noite a 20°C num dessecador para gelificação. As células HT-1080 são crescidas a 70-80% de confluência em DMEM complementado com GlutamaxI (862 Mg/1 (Gibco n° 31966-021) com FCS a 10% (Gibco n° 10270106) . As células são lavadas 2x com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% (Sigma n° A-7030) então marcadas in situ com Bisbenzimida H 33342 (Sigma n° B-2261) são diluídas 1:100 em DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% durante 15 min a 37°C, 7,5% C02. AS células são lavadas 2x com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0 , 1% e são carregadas com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% durante 15 min a 37°C, 7,5% co2 para a recuperação. Após lavar 2x com PBS c/s Ca2+, Mg2+ (Gibco, 10010-015), as células são desunidas com 0,5 mm de EDTA (Sigma n° E8008), são colhidas com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 MM de Hepes (Gibco n° 15630-056), são lavadas 2x com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 MM de Hepes, são suspensos em Dulbeccos PBS/ BSA a 0,1%/10 MM de Hepes e são diluídas 54 a 6,7 x 106 células/ml com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 MM de Hepes. 6,7 x 106 células/ml são incubadas 1:1 com 40 μς/ΓηΙ de um controlo scFv como um controlo negativo para a inibição de invasão e com scFv especifico para HT-1080 durante 1 h em gelo. Após a diluição a 6,7 x 105 células/ml com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1%, as células HT-1080 e diluições scFv/célula HT-1080 são pipetadas em triplicata sobre a câmara de quimiotaxia (fila B-H) a uma densidade de 3,4 x 104 células/poço e são incubadas durante 6 h a 37°C, 7,5% C02. DMEM/GlutamaxI com 5% FCS é utilizado como um quimioatractivo na câmara inferior. Uma curva padrão desde lxlO4 até 4xl04 células/local é realizada em colagénio S tipo I revestido fila A da câmara de quimiotaxia. DMEM/Glutamaxi/BSA a 0,1% é utilizado na câmara inferior (células não são migratórias) . Após a raspagem das células não migratórias da parte superior da membrana (excepto a curva Padrão na fila A) a fluorescência de células, que migraram através da membrana (não migraram no caso da curva Padrão), é medida no leitor de microplacas Fluostar Galaxy (bMG) utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão de 370/460 nm.

Exemplo 9: Ensaio de invasão para identificação de alvo com CALl

Este Exemplo é em geral idêntico ao Exemplo 8, excepto para a utilização de ScFv marcado com FITC (veja-se Exemplo 7 para marcação) e a integração do processo CALl dentro do ensaio de invasão. O sistema ChemoTx® (Neuro Probe Inc. n° 106-8, Gaithersburg) foi utilizado como uma câmara de quimiotaxia/migração celular descartável num formato de 96 poços com um filtro de policarbonato com sulcos gravados de 8 (In e tamanho de poro, 5,7 mm diâmetro/local. 13,3 μΐ de 0,3 mg/ml de Matrigel (veja-se Exemplo 8) diluídos em Dulbeccos PBS (Gibco n° 14040-091) foram 55 aplicados no filtro de membrana da placa de 96 poços na fila B-H e na fila A 1,2 μρ/1οο3ΐ de colagénio S tipo I (Roche n° 10982929) diluiram-se em 0,05 M de HC1 (Sigma n° 945-50) e incubaram-se durante a noite a 20°C num dessecador para gelificação. As células HT-1080 foram crescidas a 70-80% de confluência em DMEM complementado com Glutamaxl (862 Mg/1 (Gibco n° 31966-021) com FCS a 10% (Gibco n° 10270106). As células foram lavadas 2x com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% (Sigma n° A-7030) então marcadas ín situ com Bisbenzimida H 33342 (Sigma n° B-2261) e foram diluídas 1:100 em DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% durante 15 min a 37°C, 7,5% C02. As células foram lavadas 2x com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% e carregadas com DMEM/Glutamaxl/BSA a 0,1% durante 15 min a 37°C, 7,5% C02 para a recuperação. Após lavar 2x com PBS c/s Ca2+, Mg2+ (Gibco, 10010-015), as células foram desunidas com 0,5 MM de EDTA (Sigma n° E8008), colhidas com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 MM de Hepes (Gibco n° 15630-056), lavadas 2x com Dulbeccos PBS/ BSA a 0,1%/10 MM de Hepes, suspensos em Dulbeccos PBS/ BSA a 0,1%/10 MM de Hepes e diluídas a 6,7 x 106 células/ml com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 MM de Hepes. 6.7 x 106 células/ml foram incubadas 1:1 com 40 \Lq/ml de anticorpo monoclonal anti-integrina beta marcado com FITC (JB 1, Chemicon n° MAB1963) como um controlo para a inibição de invasão após CALI e com ScFv marcado com FITC específico para HT-1080 durante 1 h em gelo. I,3xl05 células ΗΤ-1080/poço ou scFv/célula HT-1080 ou diluição de Ab foram pipetadas em triplicata em duas placas de 96 poços de óptica especial de fundo plano ultra-fina preta (Costar n° 3615). Uma placa foi mantida em gelo no escuro enquanto a outra placa foi irradiada num bloco de gelo com laser de onda contínua a 488 nm (0,5 W, 30 seg) . Após a diluição a 6.7 x 105 células/ml com DMEM/GlutamaxI/ BSA a 0,1%, as células HT-1080 e diluições scFv/célula HT-1080 foram pipetadas em triplicata (triplicata não irradiada além da 56 triplicata irradiada) sobre a câmara de quimiotaxia (fila B-H) a uma densidade de 3,4 x 104 células/poço e incubadas durante 6 h a 37°C, 7,5% de C02. DMEM/GlutamaxI com 5% de FCS foi utilizado como um quimioatractivo na câmara inferior. Uma curva padrão desde lxlO4 até 4xl04 células/local foi realizada em colagénio S tipo I revestido fila A da câmara de quimiotaxia. DMEM/Glutamaxl/BSA a 0,1% de foi utilizado na câmara inferior (células foram não migratórias). Após a raspagem das células não migratórias da parte superior da membrana (excepto a curva Padrão na fila A) a fluorescência de células, que migraram através da membrana (não migraram no caso da curva Padrão), foi medida no leitor de microplacas Fluostar Galaxy (bMG) utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão de 370/460 nm. Numa experiência geral, um valor de 45000 correspondeu a 100% das células migradas. O fenótipo de invasão de células HT-1080 foi avaliado pela comparação de sua capacidade relativa de invadir matriz extracelular tumoral (Matrigel) utilizando o sistema de cultura Transwell descrito anteriormente. scFvl mostrou após CALI um efeito inibidor de 46% sobre a invasão das células HT-1080. O resultado do ensaio de invasão com CALI é mostrado na Figura 3. A Figura 3 mostra que CALI converte scFvl num fragmento de anticorpo inibidor.

Exemplo 9.1: Ensaio de invasão com anticorpos (por exemplo, mAb 1.5.1) para identificação de alvo com CALI O sistema ChemoTx® (Neuro Probe Inc. n° 106-8, Gaithersburg) foi utilizado como uma câmara de quimiotaxia/migração celular descartável num formato de 96 poços com um filtro de policarbonato com sulcos gravados de 8 (lm e tamanho de poro, 5,7 mm diâmetro/ local. 13,3 μΐ de 0,3 Mg/ml de Matrigel (veja-se Exemplo 8) diluídos em Dulbeccos PBS frio (Gibco n° 14040-091) foram aplicados no filtro de membrana da placa de 96 poços na 57 fila B-H e na fila A 0,3 μς/1οο3ΐ de colagénio de ratinho, tipo IV (Becton-Dickenson n° 354233) diluíram-se em 0,05 M DE HCL (Sigma n° 945-50) e incubaram-se durante a noite a 20°C num dessecador para gelificação, as células HT-1080 foram crescidas a 70-80% de confluência em DMEM complementado com aminoácidos não essenciais MEM (IX, Gibco n° 11140050) e Penicilina/Estreptomicina (IX, Gibco n° 15140122) com 10% de FBS (Hyclone n° SH30070,03). As células foram lavadas lx com DMEM/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/MEM aminoácidos /Penicilina-Estreptomicina (BSA, Sigma n° A-7030) então marcadas in situ com 3 μΜ de Célula Tracker Orange (Molecular Probes n° C-2927) em DMEM/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina durante 15 min a 37°C, 7,5% de C02. As células foram lavadas lx com DMEM/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/ Penicilina-Estreptomicina durante 15 min a 37°C, 7,5% de C02 para a recuperação. Após lavar lx com Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS) c/s Ca2+, Mg2+ (Gibco n° 14170112), as células foram desunidas com Versene (Gibco n° 15040066), colhidas com HBSS/ aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina (HBSS, Gibco +14025092), lavadas 2x com HBSS/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina, suspensos em HBSS/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina e diluídas a 8 x 106 células/ml com HBSS/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina. 8 x 106 células/ml foram incubadas 1:1 com 40 μρ/ml de anticorpo monoclonal anti-integrina beta marcado com FITC (JB1, Chemicon n° MAB1963) como um controlo para a inibição de invasão após CALI e com mAbs durante 1 h em gelo. 3xl05 células HT-1080/ poço ou célula HT-1080/ mAbs foram pipetadas em triplicata em duas placas limpas de 96 poços 58 (Costar n° 3370) . Uma placa foi mantida em gelo no escuro enquanto a outra placa foi irradiada em bloco de gelo com 300 W de luz com filtro azul (Roscolux, n° 69, Brilliant Blue) durante uma hora. Após a diluição a 8 x 105 células/ml com DMEM/aminoácidos não essenciais MEM /BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina, as células HT-1080 e diluições de mAbs/células HT-1080 foram pipetadas em triplicata (triplicata não irradiada além da triplicata irradiada) sobre a câmara de quimiotaxia (fila B-H) a uma densidade de 4 x 104 células/poço e incubadas durante 6 h a 37°C, 7,5% de CO2, DMEM com 5% de FCS foi utilizado como um quimioatractivo na câmara inferior. Uma curva padrão desde lxlO4 até 4xl04 células/local foi realizada em colagénio de ratinho iv revestido fila A da câmara de quimiotaxia. DMEM/aminoácidos não essenciais MEM/BSA a 0,1%/aminoácidos MEM/Penicilina-Estreptomicina foi utilizado na câmara inferior (as células não foram migratórias). Após a raspagem das células não migratórias da parte superior da membrana (excepto a curva Padrão na fila A) a fluorescência de células, que migraram através da membrana (não migraram no caso da curva Padrão), foi medida no leitor de placa de fluorescência Tecan Spectrafluor Plus (excitação: 544, emissão: 590 nm) . Um controlo positivo que reconhece a integrina βΐ (dados não mostrados) e mAb 1.5.1 ambos mostraram uma redução significativa (p < 0,01, teste de t não pareado) da invasão após a exposição à luz (dados mostrados na Figura 2). O controlo negativo (não anticorpo) não mostrou redução. Cada barra é normalizada ao controlo negativo e representa a média + s.e.m. de duas experiências em triplicata.

Exemplo 10: Ensaio de adesão célula-matriz

As placas de 96 poços (TPP n° 9296) (cultura de célula tratada) foram revestidas na Fila B-H com colagénio S tipo I 1 μg/poço (Roche n° 10982929) em Dulbeccos PBS (Gibco n° 59 14040-091) e na fila A poço 10-12 foram revestidas com 2% BSA (Sigma n° A-7030)/Dulbeccos PBS a 4°C durante a noite. A placa foi lavada com Dulbeccos PBS, fila bloqueada B-H e fila A poço 10-12 com 2% BSA/ Dulbeccos PBS durante lha 37°C e lavadas de novo com Dulbeccos PBS. As células HT-1080 foram crescidas a 70-80% de confluência em DMEM complementado com GlutamaxI (862 mg/1 (Gibco n° 31966-021) com FCS a 10% (Gibco n° 10270106). As células foram lavadas 2x com DMEM/ GlutamaxI/BSA a 0,1% (Sigma n° A-7030) então marcadas in situ com Bisbenzimida H 33342 (Sigma n° B-2261) foram diluídas 1:100 em DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% durante 15 min a 37°C, 7,5% de C02. As células foram lavadas 2x com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% e carregadas com DMEM/GlutamaxI/ BSA a 0,1% durante 15 min a 37°C, 7,5% de C02 para a recuperação. Após lavar 2x com PBS c/s Ca2+, Mg2+ (Gibco, 10010-015), as células foram desunidas com 0,5 mM de EDTA (Sigma n° ES008), colhidas com Dulbeccos PBS/0,1 % BSA/10 MM de Hepes (Gibco n° 15630-056), lavadas 2x com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 MM de Hepes, suspensas em Dulbeccos PBS/BSA a 0,1 % /10 MM de Hepes e diluídas a 6,7 x 106 células/ml com Dulbeccos PBS/BSA a 0,1%/10 mM de Hepes. 6,7 x 106 células/ml foram incubadas 1:1 com 40 pg/ml de anticorpo monoclonal anti-integrina beta marcado com FITC (JBl, Chemicon n° MAB1963) como um controlo para a inibição de adesão após CALI e com scFv marcado com FITC específico para HT-1080 durante 1 h em gelo. I,3xl05 células HT-1080/ poço ou scFv/célula HT-1080 ou diluição de Ab foram pipetadas em triplicata em duas placas de 96 poços de óptica especial de fundo plano ultra-fina preta (Costar n° 3615). Uma placa foi mantida em gelo no escuro enquanto a outra placa foi irradiada num bloco de gelo com laser de onda contínua a 488 nm (0,5 W, 30 seg) . Após a diluição a 6,7 x 105 células/ml com DMEM/ GlutamaxI/BSA a 0,1%, as células HT-1080 e diluições de scFv/célula HT-1080 foram pipetadas em triplicata (triplicata não irradiada além da 60 triplicata irradiada) sobre a placa revestida e bloqueada. Na fila A poço 10-12, 6,7 x 105 células/ml com DMEM/GlutamaxI/BSA a 0,1% foram pipetadas como um controlo de fundo. A placa foi incubada durante lha 37°C, 7,5% de CO2 e lavada 2x com Dulbeccos PBS, onde as células não aderentes foram eliminadas na lavagem. Na fila A poço 1-9 uma curva padrão desde lxlO4 até 4xl04 células/poço foi realizada, em todos os outros poços 50 μΐ de Dulbeccos PBS foram pipetados. A fluorescência de células, que aderiram ao Colagénio S tipo 1 (não aderiram no caso da curva Padrão), foi medida no leitor de micro-placas Fluostar Galaxy (bMG) utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão de 370/460 nm. scFvl inibiu a adesão de células HT-1080 ao Colagénio S tipo 1 em 50%. (Dados não mostrados).

Exemplo 11: Imunoprecipitação

Para a imunoprecipitação de mAbs, as monocamadas confluentes de células HT-1080 foram lisadas utilizando 1 MM Tris-Cl, pH 8,0 que contém um cocktail de inibidores de protease (Bohrenger Mannheim) durante 15 minutos a 4°C. As células foram lisadas em seguida utilizando um homogeneizador dounce durante 5 minutos. Os lisados foram pré-adsorvidos durante 1 hora a 4°C com fluido ascitico em agarose-IgG (Sigma) anti-ratinho do clone do hibridoma alvo (10 μίν 1 mg de extracto de célula) incubaram-se durante a noite a 4°C. Os complexos anticorpo-proteina foram isolados utilizando pérolas igG-agarose anti-ratinho durante 1 hora a 4°C. As proteínas imunoprecipitadas foram analisadas por meio de SDS-PAGE e coloração Coomassie, e os imunoprecipitados de mAb foram analisadas adicionalmente por immunoblots com as ascites alvo.

Para as imunoprecipitações de scFv, scFvs específicos para HT-1080 foram acoplados a StrepTactin Sepharose (50 μρ/50 μΐ de resina) e as scFv-pérolas lavadas 61 adicionadas aos lisados limpos (1 mg de proteina total) durante 2-3 h a 4°C. Os complexos scFv-alvo foram eluidos com 50 μΐ 10 mM de D-destiobiotina em PBS 0,1% Tween 20. As proteínas imunoprecipitadas foram analisadas por meio de SDS-PAGE e coloração com prata.

Exemplo 12: Identificação de proteina via espectroscopia de massa

Para a identificação de mAb alvo, as bandas coradas com coomassie dos imunoprecipitados separados por meio de SDS-PAGE foram em seguida submetidas a digestão em gel. Os fragmentos de péptido tripnizados foram executados num Surveyor HPLC e espectrómetro de massas LCQ Deca Ion Trap (ThermoFinnigan) com um 75 μΜ nanospray coluna C18 (New Objectives). Os pmf (fragmentos de massa peptidica) obtidos foram utilizados para pesquisar todas as entradas para a espécie Homo sapíens nos bancos de dados NCBI e SwissProt.

Para a identificação de scFv alvo, as bandas coradas foram cortadas e submetidas a digestão em gel com tripsina. Os fragmentos peptidicos foram extraídos das peças de gel, dessalinizados em ZipTip μ018 e os eluidos péptidos manchados num Teflon-revestido MALDI alvo (Applied Biosystems). As amostras foram analisadas num espectrómetro de massas STR-DE Voyager MALDI (Applied Biosystems) e as massas peptídicas obtidas foram utilizadas para a identificação de proteína via PMF (impressão digital genética da massa peptidica), pesquisar todas as entradas para a espécie Homo sapiens no banco de dados NCBI e SwissProt .

Exemplo 13: Imunocitoquímica

Para a imunocitoquímica de proteína de superfície, uma monocamada confluente de células HT-1080 (40.000 por poço de uma placa de fundo fino claro de 96 poços) foram incubadas com sobrenadante do hibridoma durante 1 hora a 37°C/7% de CO2. Após três lavagens de 5 minutos com 62 albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram fixas em paraformaldeido a 2% durante 2 minutos. Outra série de lavagens com BSA a 0,1%/pbs foi realizada e um Anticorpo secundário anti-ratinho de coelho com FITC foi adicionado durante 1 hora à temperatura ambiente. As mesmas lavagens foram repetidas e um anticorpo terciário anti-coelho de cabra com FITC foi adicionado durante 1 hora à temperatura ambiente. Após uma série final de lavagens, as células foram armazenadas em PBS a 4°C até a formação de imagens. A coloração de superfície foi visualizada por microscopia num Zeiss Axiovert 10 utilizando uma lente Neofluar 40X/0,75 de abertura numérica. As imagens foram colhidas utilizando o conjunto de filtro de excitação a 480 e o conjunto de filtro de emissão a 535 para FITC. Os resultados são mostrados na Figuras 6, 6.1 e 6.2.

Exemplo 14: Biotinilação de superfícies celulares A biotinilação de proteínas da superfície celular foi realizada como foi descrito em Hanwell et al (J Biol Chem 277: 9772). O grupo biotinilado de superfície e o grupo não biotinilado intracelular foram separados num gel SDS-PAGE, e transferidos por Imunotransferência com anti-Hsp90 (Stressgen n° SPA-830) ou alfa-actinina-4 (Martin A. Pollak, Children's Hospital, Boston, MA). Os resultados são mostrados na Figura 7. A Hsp90 mostra tanto a localização superficial (S) como intracelular (IC), mas a alfa-actinina é encontrada somente no grupo intracelular. O mAb 1.5.1 também mostra localização superficial e intracelular (dados não mostrados).

Exemplo 15: Dependência de concentração de Novobiocina ou Ácido nalidíxico sobre a invasão de células HT-1080 8xl06 de células ΗΤ-1080/mL foram pré-tratadas durante 1 hora com novobiocina ou ácido nalidíxico nas 63 concentrações mostradas e um ensaio de invasão foi realizado como foi descrito no Exemplo 9.1. A novobiocina mostra uma inibição dependente da dose de invasão (p < 0,01 a >0,5 mM) . O ácido nalidixico não tem efeito sobre a invasão. A viabilidade de células tratadas com novobiocina neste ensaio não foi afectada (dados não mostrados). Cada ponto de dados é normalizado ao controlo sem fármaco e representa a média + s.e.m. de 2 experiências em triplicata. Os resultados são mostrados na Figura 10.

Exemplo 16: Inibição de secreção de mmp 40.000 células HT-1080 foram tratadas durante 6 horas com novobiocina ou ácido nalidixico nas concentrações dadas. Os meios condicionados de células tratadas foram separados utilizando um gel SDS-PAGE que contém 10 mg/mL de gelatina. O SDS foi retirado do gel utilizando 2,5% Triton-X-100 durante 30 minutos à temperatura ambiente. As proteínas foram permitidas que digiram a gelatina em tampão digestão (0,1M Tris-Cl2, pH 8,0, 5 MM CaCl2, 0,04% NaN3) durante 48 horas a 37°C. Os géis foram corados com coomassie e secos para densitometria. Os géis paralelos foram corados com prata para mostrar o carregamento igual de proteína (dados não mostrados). A actividade de MMP foi diminuída em >75% na concentração mais alta de novobiocina testada e nenhuma redução de actividade de enzima foi vista com ácido nalidixico. Os resultados são mostrados na Figura 11.

Exemplo 17: Acoplamento covalente de novobiocina a sepharose e inibição de actividade de MMP

Este exemplo demonstra a inibição da função de Hsp90 na superfície de células HT-1080. Mostrou-se que o tratamento de células HT-1080 de fibrosarcoma com novobiocina, um antibiótico coumarina, reduz a capacidade da célula de invadir uma barreira de membrana basal e 64 também reduz significativamente a actividade/ secreção de metaloproteinase de matriz (MMP). Uma vez que a experiência é realizada numa escala de tempo curta (6 horas), depleção significativa de Hsp90 intracelular alvos pode não ocorrer. 0 acoplamento covalente de novobiocina a um portador macromolecular como sepharose proibiu a absorção celular de novobiocina e consequentemente qualquer inibição intracelular de Hsp90. Marcu et al descreveu um protocolo para a conjugação de novobiocina a sepharose (Marcu et al. (2000) J Natl Câncer Inst 92, 242-8; Staudenbauer e Orr (1981) Nucleic Acid Res. 9, 3589-603). Neste procedimento Sepharose 6B activada por epoxi (Sigma Chemical Co) é primeiro lavada e inchada com água destilada. As pérolas inchadas são lavadas em seguida com um tampão de acoplamento (0,3M de carbonato de sódio, pH 9,5). A novobiocina é conjugada formalmente às pérolas por meio de incubação com as pérolas inchadas em tampão de acoplamento durante 20 horas a 37°C. A novobiocina não conjugada é retirada por lavagem utilizando o tampão de acoplamento, e os grupos activos epoxi não ligados restantes são bloqueados com 1M etanolamina durante 12 horas a 30°C. A lavagem extensiva das pérolas utilizando 0,5 M de NaCl em tampão de acoplamento, água destilada, 0,5 M de NaCl em 0,1 M de acetato de sódio (pH 4,0) é feita para retirar qualquer excesso de novobiocina e etanolamina. As pérolas novobiocina-sepharose são então equilibradas em 25 mM de HEPES (pH 8,0) com 1 mM de EDTA, 10% de etilenoglicol, e 200 mM de KC1 a 4°C no escuro.

Antes de proceder à experiência de gelatinase, a ligação eficiente do conjugado novobiocina-sepharose a Hsp90 é demonstrada por meio de um ensaio de ligação in vitro. As células HT-1080 são lisadas em TNESV (1% Nonidet P-40, 2 MM de EDTA, e 100 MM de NaCl, e 1 MM ortovanato de sódio) com inibidores de protease (comprimido. Boehringer Mannheim). 300 μg deste lisado são incubados com 100 μυ do 65 conjugado novobiocina-sepharose durante 1 hora a 4°C. Após a lavagem extensiva com TNESV, as proteínas unidas às pérolas são eluídas com 2x SDS-PAGE tampão de carga (125 MM Tris-HCl pH 6,8, 10% 2-mercaptoetanol, 10 SDS, 10% glicerol, e traço de bromofenol azul) e fervura durante 5 minutos. As proteínas são executadas em géis 10% SDS-PAGE. Estes géis são corados com prata ou transferidas a nitrocelulose para Imunotransferência com um anticorpo anti-Hsp90 (AC88, Stressgen, Inc.).

Para o ensaio de gelatinase, células HT-1080 aderentes são primeiro retiradas gentilmente das caixas de cultura de tecido com Versene. 5xl04 células em DMEM livre de soro são combinadas com 0,1 pL, 1 pL ou 10 pL do conjugado novobiocina-sepharose e incubadas à temperatura ambiente durante uma hora em tubos eppendorf siliconizados com agitação suave. As amostras de controlo que contêm pérolas de sepharose não conjugada a novobiocina são feitas em paralelo. Após esta incubação, as células são transferidas a uma placa de 96 poços de cultura de tecido tratada e incubadas adicionalmente durante 6 horas a 37°C/5% de C02. Os meios condicionados destas amostras são combinadas então com tampão de carga 2x SDS-PAGE (sem 2-mercaptoetanol). Estas amostras são executadas num gel 10% SDS-PAGE que contém 10 Mg/mL de gelatina. O SDS é então retirado do gel por meio de incubação com 2,5% de Triton-A-100 durante 30 minutos à temperatura ambiente. As proteínas são permitidas que digiram a gelatina em tampão de digestão (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 5 MM CaCl2, 0,04% NaN3) durante 48 horas a 38°C. Os géis serão corados com coomassie e secos para densitometria. Os géis paralelos são corados com prata para mostrar o carregamento igual de proteína. A actividade de MMP diminui com o aumento das quantidades de novobiocina-sepharose . 66

Exemplo 18: inibição de actividade de MMP por geldanamicina e geldanamicina imobilizada (pérolas de GA)

Pode mostrar-se que a metaloproteinase de matriz MMP2 co-imunoprecipitou com Hsp90a a partir de meios condicionados com HT-1080 (A Figura 17) . Então, aplicámos-se um inibidor conhecido de Hsp90, geldanamicina, a células HT-1080 para testar se a inibição de Hsp90 reduziu a actividade de MMP2. As células HT-1080 foram tratadas com 20 μΜ de geldanamicina (GA) em meios livres de soro e MMP2 secretada foi determinada por zimografia. A actividade de MMP2 (72 kDa gelatinase) diminuiu em -35%; p<0,01 após o tratamento com GA. O conteúdo de proteína total em meios condicionados foi visualizado por meio de coloração com prata para assegurar o carregamento igual. (Veja-se a Figura 18). A geldanamicina é um inibidor de Hsp90 permeante das células bem conhecido. O tratamento com 10 μΜ de geldanamicina (GA) durante 1 hora causou uma diminuição significativa de -35% (p < 0,05, teste de t) da invasão de células HT-1080 que foi eliminada quando MMP2 activada (100 ng) foi adicionada. (Dados não mostrados). Devido à sua permeabilidade celular, a geldanamicina não discrimina entre a localização intracelular e extracelular de Hsp90. A fim de mostrar o papel extracelular de Hsp90 na invasão de células tumorais, a geldanamicina foi imobilizada em pérolas de agarose (pérolas de GA) para impedir que a geldamicina atravessasse a membrana plasmática. (Veja-se whitesell et al, Proc Natl Acad Sei USA 91, 8324-8 (1994)) para detalhes da experiência). Após o tratamento de células HT-1080 com as pérolas de GA, uma redução de 80% de MMP2 activa foi vista em meios condicionados, mas somente uma redução de 15% de pró-MMP2 (Figura 19). As células HT-1080 tratadas com as pérolas de GA mostraram uma redução significativa de 45% de invasividade (p<0,01, teste de t) utilizando um ensaio de invasão in vitro (veja-se Exemplo 67 8). As pérolas não tratadas também inibiram a invasão a uma extensão limitada (<15%), provavelmente devido a um bloqueamento físico dos poros pelas pérolas. (Veja-se Figura 20). Todos estes resultados juntos sugerem um mecanismo onde a Hsp90a extracelular que se liga a pró-MMP2 assiste na activação da protease, levando a um fenótipo invasivo. A inibição de Hsp90a leva a uma redução de MMP-2 activa e uma invasividade reduzida de células tumorais. 68

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0053169 A [0005] • WO 9117271 A [0109]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Liotta. Câncer Res., 1986, vol. 46, 1-7 [0001] • Csermely et al. Pharmacol. Ther., 1998, vol. 79 (2 [0002] • Liao et al. J. Biol. Chem., 2000, vol. 275, 189-96 [0003] • Triantafilou et al. Trends in Immunology, 2002, vol. 23, 301-4 [0004] • Ferrarini et al. Int. J. Câncer, 1992, vol. 51, 613-19 [0004] • Dunn. J. Natl. Câncer inst, 2002, vol. 94, 1194-5 [0006] • Schlatter et al. Biochem. J., 2002, vol. 362, 675-84 [0005] • Rappa et al. Oncol. Res., 2002, vol. 12, 113-9 [000S] • Rappa et al. Anticancer Drug Des, 2000, vol. 15, 127-34 [000S] • Kabat et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 1709-19 [0026] • Davies et al. Protein Eng., 1996, vol. 9, 531-537 [0033] • Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0034] • Lobl et al. Anal. Biochem., 1988, vol. 170, 502-511 [0036] • Harrisons Principies of Internai Medicine. Mc Graw Hill, 2001 [0038] 69 • March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure. Wiley-Interscience [0056] • Bioconjugate Techniques. Academic Press [0056] • Linden et al. Biophys. j., 1992, vol. 61, 956-962 [0065] • Jay. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1988, vol. 85, 5454-58 [0065] • Henning et al. Drug Discovery, 62-71 [0066] • Henning et al. Current Drug Discovery, Maio 2002, 17-19 [0066] • The Sigma Aldrich Handbooks of Stains and Dyes. 1990 [0068] • Coligan et al. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons Inc, 1994 [0070] • Frye et al. Oncogene, 1987, vol. 4, 1153-1157 [0070] • Fivash et al. Curr Opin Biotechnol., 1998, vol. 9, 97-101 [0085] • Ohlmeyer et al. Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1993, vol. 90, 10922-26 [0107] • Liu et al. J. Am. Chem. Soc., 2002, vol. 124, 7678-80 [0107] • Liang et al. Science, 1996, vol. 274, 1520-2 [0107] • Smith et al. Science, 1985, vol. 228, 1315-17 [0109]

Dougherty et al. Protein Eng., 1999, vol. 12, 613-21 0110] • Wickstrom B. Int. J. Meth. Microbiol., 2000, vol. 290, 223-30 [0110] • Shaffizel et al. J. Immunol. Methods, 1999, vol. 231, 119-35 [0111] • Willson et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001, vol. 98, 3750-5 [0111] • Tuerk; Gold. Science, 1990, vol. 249, 505-10 [0112] • Tuerk et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, vol. 89, 6988-92 [0112] • Boder ; Wittrup. Methods Enzymol., 2000, vol. 328, 430-44 [0113] 70 • Marks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-97 [0115] • Shevchenko et al. Anal. Chem., 1996, vol. 68, 850-58 [0115] • Spengler et al. Rapid. Commun. Mass. Spectrum., 1992, vol. 6, 105-8 [0115] • Hanwell. J Biol Chem, vol. 277, 9772 [0156] • Marcu et al. J Natl Câncer Inst, 2000, vol. 92, 242-8 [0160] • Staudenbauer ; Orr. Nucleic Acids Res., 1981, vol. 9, 3589-603 [0160] • Whitesell et al. Proc Natl Acad Sei USA, 1994, vol. 91, 8324-8 [0164]

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um inibidor de Hsp90 extracelular humana seleccionado a partir de anticorpos e fragmentos de anticorpo que se liga a Hsp90 extracelular humana, para utilização num método de prevenção e/ou de tratamento de cancro ou metástase. 2. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor trata ou previne a invasão e/ou o potencial metastático de células de cancro. 3. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é um anticorpo. 4. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é um anticorpo monoclonal. 5. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é um fragmento de anticorpo. 6. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é um fragmento de anticorpo seleccionado á partir de scFv, ds-Fv, Fab', Fab, F(ab')2^ Fv, anticorpo de domínio único e diacorpo {diabody). 7. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é marcado com um marcador detectável. 8. 0 inibidor de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor reduz a actividade e/ou a secreção de metaloproteinases da matriz (MMP).

9. Utilização de um inibidor de Hsp90 extracelular humana para a preparação de uma composição farmacêutica para a 2 prevenção e/ou o tratamento de cancro ou metástase, em que o inibidor é seleccionado a partir de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a Hsp90 extracelular humana.

10. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor trata ou previne a invasão e/ou o potencial metastático de células de cancro.

11. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor é um anticorpo.

12. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor é um anticorpo monoclonal.

13. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor é um fragmento de anticorpo.

14. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor é um fragmento de anticorpo seleccionado a partir de scFv, dsFv, Fab', Fab, F(ab')2, Fv, anticorpo de domínio único e diacorpo (diabody).

15. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor é marcado com um marcador detectável.

16. A utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o inibidor reduz a actividade e/ou a secreção de metaloproteinases da matriz (MMP).

17. Uma molécula de ácido nucleico que codifica um inibidor de Hsp90 extracelular humana para utilização num método de prevenção e/ou de tratamento de cancro ou metástase, em que o inibidor é um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo que se liga a Hsp90 extracelular humana. 3

18. Utilização, para determinar o potencial invasivo de amostras biológicas, de um kit que compreende um inibidor de acordo com o definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e recipientes de teste adequados.

19. A utilização de acordo com a reivindicação 18, em que a amostra biológica inclui um cancro.

20. A utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o inibidor é marcado.

21. Um método para rastrear ou testar a invasão e/ou comportamento metastático de células ex vivo, que compreende as etapas de: a) colocar em contacto as células com um ou mais inibidores de Hsp90 humana sob as condições que impedem uma captação celular do dito inibidor de Hsp90, em que o dito inibidor de Hsp90 humana é um anticorpo ou fragmento de anticorpo; b) analisar a migração de células tratadas de acordo com a etapa a): c) comparar a migração das células de acordo com a etapa a) com células não tratadas: e d) determinar opcionalmente a percentagem de migração em comparação com células não tratadas.

22. O método de acordo com a reivindicação 21, em que a etapa a) compreende ainda a etapa de colocar em contacto as células com uma matriz semelhante a gel sob as condições adequadas para o crescimento das células e a etapa b) compreende a etapa de analisar a migração das células através da matriz semelhante a gel. 4

23. Uma composição farmacêutica para utilização num método de prevenção e/ou de tratamento de cancro ou metástase, sendo que a composição compreende um inibidor de acordo com o definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8. 1/30

m »**< h

μ-( ο00ο

:"ίνΓ,''ί

2/30

ií> ο οο ο [%] OBSeAUj Fig. 2 3/30

Fig. 3

~1 ---i —i- -—η r O O O O O O co CO CV! 120 [%] OgSBAU) 4/30 Ο) Φ C

Ο Ο Ο Ο Ο 04 C ! CO I I I oesBAU! ap eôuepnuj ap % 5/30

6/30

7/30

Fig. 6.1 8/30

μ vê ώ te 9/30 , χ - 1 > ¢- 7-^ΐ 7'%- Λ''Λ "Τ; Vir ϋ „ ‘r ’. /> : · t_*4/ ζι, ^¾¾¾ -¾^^¾. ΐί ,ζ~ 'r - "ΙΑ 5¾^¾ -'l Í -' £Ώ,-: Ν z-"--é^. *;i -r·;;/:;. „ cy - ./-^¾Γ --CL' ‘ -$?’&!y/J- Λ , „<: - .'

r» jY^J ^--”·* -.. ÍO vòώ K t -σ>Λ3> Nr * ? -r-v m Λ ,Γ-4τ*ί--"Λ * -j’' t?”, -£ ^-“^'““í-v-í ’Ό-ν -'? r^rv^“- < > o ¢-/3¾¾¾^ ^ _ι Λ *. V ^ ^ SJ «L* >-·· < °" ~' \r * o 3> **·. s - —· ,^-ϊρ -<r;- M; , V J»''*r "·*,^,:r 19^3 ,-w' ,* , , ,-UJ , , jg 0 . -, ,, , - - ·. '·£ S ’ ’ to ο CO g 10/30

"st" I ¢0 c o 05 03 sza.cç

f"oi) *r-j £Q 11/30 >7Γ

00 ds •r-i suaBejuoo 12/30 ω c ω Clco wo EoX (Cx a. tc *·> c «I Ό Φ φ XS rí ® O tf> 5- (0 0.00 Q o O <n λ: , O óO O "t" X w o> CM C0 Φ X O) i» O 53 tB O Ss ^ c (Jl Φ CO Ό co in .. o o> O if) Λ |CD Cl ^ Z » H- ffi (0 +-«3 (0 s*· c roE p .c — m fl> ω co -~-J3 « Π5 K o »o xs „ Γ· Ό) Ό cn to 04 T” CO O) Λ (D to 15 φ E « Q. t0 7- S Q vÇ o~ 5Í> CO 0.1 II Cl 05 <D CO MT <30o Hs. <o O 05 05 τ— ;n O g o 'C8 o cΈ CB 03 Ό Γ* c Φ 03 to •M O O o O O. 's oN tn to 04 II CM CO f-. “-w CM h- r* ÍÇ C Φ M-t 2 α 03 xj « <$ ir tf) 3 </) t: <B ® E g © o O o. a*““í o E 5 x to wo o x Amm3 to φ X cf* ÍO w co il CM <f CD CM CO 00 c fc**M Φ O0| Q j±;o CD JaS o O X 0 *1 to © X tf) O X! «3 "D Φ XJ 0) tf) £0 N- O) Μ" LO CD CO r·- K CM (fí o *p o “COo ç ε cfl CD "PEω P) Π5 tf* ~ 8 P) O CL «Γ· CO Chdb .1-1tu . c to © v~ XI 5« rr~ O CD I CM CL CD X CO <*- .. KJ Ο) Τ3 5 MJ) '«T C «5 & tD ~ to S w* tf) ST* Dí” Λ § ffi CD ti CO 05 ..co il 13/30

oeseAUj % 14/30

UiaBeuiaajed ep ojaquod 11 *3h 15/30

ΖΪ ’sIá -3516/30

-35 icia i '51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 901 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 de nucleótidos pXPlOO GACGAAAGGG cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata CTGCTTTCCC GGAGCACTAT GCGGATAAAA ATATCCAATT ACAGTACTAT ATAATGGTTT CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG TATTACCAAA GAATCTGCAG TCCACCGTCA AAAGCCCCTT TACACÔCGCC AACCCCTATT TGTTTATTTT TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TTGGGGATAA ACAAATAAAA AGATTTATGT AAGTTTATÂC ATAGGCGAGT TGAGACAATA ACCCTGATM ATGCTTCAAT AATATTGAAA ÂAGGAAGAGT ACTCTGTTAT TGGGACTATT TACGAAGTTA TTATAACTTT TTCCTTCTCA ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TACTCATAAG TTGTAAAGGC ACAGCGGGAA TAAGGGAAAA AACGCCGTAA TTGCCTTCC! GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG AACGGAAGGA CAAAAACGAG TGGGTCTTTG CÓACCACTTT CATTTTCTAC CTGAAGATCA GTTGGGTGCT CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC GACTTCTAGT caacccacga gctcacccaa tgtagcttga cctagag-ttg AGCGGTAAGA TCC7TGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGA? TCGCCATTCT AGGAACTCTC AAAAGCGGGG CTTCTTGCAA MGGTTACTA GAGCACTTTT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CTCGTGAAAA TTTCAAGACG ATACACCGCG CCATAATAGG GCATAACTGC CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC ACTATTCTCA GAATGACWG GGCCCGTTCT CGTTGAGCCA GCGGCGTATG TGATAAGAGT CTTACTGAAC GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG GCATGACAGT CAACTCATGA GTGGTCAGTG TCTTTTCGTA GAATGCCTAC CGTACTGTCA AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCA7AACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA TTCTCTTAAT ACGTCACGAC GGTATTGGTA CTCACTATTG TGACGCCGGf ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG TGAATGAAGA CTGTTGCTAG CCTCCTGGCT TCCTCGATTG GCGAAAAAAC CACAACATGG GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGC? GTGTTGTACC CCCTAGTACA TTGAGCGGAA CTAGCAACCC TTGGCCTCGA GMIGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA CTTACTTCGG TATGGTTTGC TGCTCGCACT GTGGTGCTAC GGACATCGTT TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACTCTAGCT ACCGTTGTTG CAACGCGTTT GATAATTGAC CGCTTGATGA ATGAGATCGA TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC AGGGCCGTTG TTAATTATCT GACCTACCTC CGCCTATTTC AACGTCCTGG ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG TGAAGACGCG AGCCGGGAAG GCCGACCGAC CAAATAACGA CTATTTAGAC G.AGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGA? CTCGGCCACT CGCACCCAGA GCGCCATAGT AACGTCGTGA CCCCGGTCTA GGTAAGCCCT CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC CCATTCGGGA GGGCATAGCA TCAATAGATG TGCTGCCCCT CAGTCCGTTG TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA ATACCTACTT GCTTTATCTG TCTAGCGACT CTATCCACGG AGTGACTAAT AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTíACT CATATATACT TTAGAT1'GAT TCGTAACCAT TGACAGTCTG GTTCAAATGA GTATATATGA AATCTMCTA TTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA AATTTTGAAG ΪΑΑΑΑΑΤΤΑΆ ATTTTCCTAG ATCCACTTCT AGGAAAAACT TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGà GTTTTCGTTC CACTGAGCGT ATTAGAGTAC TGGTTTTAGG GAATTGCACT CMAAGCAAG GTGACTCGCA CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG GTCTGGGGCA TCTTTTCTAG TTTCCTAGAA GAACTCTAGG AAAAAAAGAC CGCGTAATCT GCTGCTTGCA MCAAAAAAA CaACCGCTAC CAGCGGTGGT GCGCATTAGA CGACGAACGT TTGTTTTTTT GGTGGCGATG GTCGCCACCA 7TGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT ITTTCCGAAG GTAACTGGCT AACAAACGGC CTAGTTCTCG ATGGTTGAGA AAAAGGCTTC CATTGACCGA TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTXA 1351 18/30 agtcgtctcg cgtctatggt ttatgacagg aagatcacat csgcatcaat .1401 GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT CCGGTGGTGA AGTTCTTGAG ACATCGTGGC GGATGTAÍGG ÃGCGAGACGA 1451 AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG TTAGGACAAT G6TCACCGAC GACGGTCACC GCTATTCAGC ACAGAATGGC 1501 GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCÃGCG GTCGGGCTGA CCAACCTGAG TTCTGCTATC AATGGCCTAT TCCGCGTCGC CAGCCCGACT 1551 ACGGGG6GTT CGTGCATACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA TGCCCCCCAA GCACGTATGT CGGGTCGAAC CTCGCTTGCT GGATGTGGCT 1601 ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCTATGAGA MGCGCCACG CTTCCCGAAG TGACTCTATG GATGTCGCAC TCGATACTC? TTCGCGGTGC GAAGGGCTTC 1651 GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CCTCTTTCCG CCTGTCCATA GGCCATTCGC CGTCCCAGCC TTGTCCTCTC 1701 CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGGC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT GCGTGCTGCC TCGAAGGTCC CCCTTTGCGG ACCÃTAGAAA TATCAGGACA 1751 CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GCCCAAAGCG GTGGAGACTG AACTCGCAGC TAAAAACACT ACGAGCAGTC 1801 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CCCCCGCCTC GGATACCTTT TTGCGGTCGT TGCGCCGGM AAATGCCAAG 1851 CTGGCCTTTT GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTGCTG CGTTATCCCC GACCGGAAAA CGACCGGAAA ACGAGTGTAC AAGAAAGGAC GCAATAGGGG 1901 TGATTCTGTG GATAACCGTA TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC ACTAAGACAC CTATTGGCAT AATGGCGGAA ACTCACTCGA CTATGGCGAG 1951 GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAG? CAGTGAGCGA 6GAAGCGGAA CGGCGTCGGC TTGCTGGCTC GCGTCGCTCA GTCACTCGCT CCTTCGCCTT 2001 GAGCGCCCM TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA CTCGCGGGTT ATGCGTTTGG CGGAGAGGGG CGCGCAACCG GCTMGTAAT 2051 ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA TACGTCGACC GTGCTGTCCA AAGGGCTGAC CTTTCGCCCG TCACTCGCGT 2101 ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT AGGCACCCCA GGCTTTACAC TGCGTTAATT ACACTCAATC GAGTGAGTM TCCGTGGGGT CCGAAATGTG 2151 TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT AAATACGAAG GCCGAGCATA CAACACACCT TAACACTCGC CTATTGTTAA 2201 TCACACAGGA MCAGCTATG ACCATGATTA CGCCAAGCTT TGGAGCCTTT AGTGTGTCCT TTGTCGATAC TGGTACTAAT GCGGTTCGAA acctcggam 2251 TTTTTGGAGA TTTTCMCGT GAAAAAATTA TTATTCGCAA TTCCTTTAGT AAAAACCTCT AAAAGTTGCA CTTTTTTAAT AATAAGCGTT AAGGAAATCA 2301 TGTTCCTTTC TATGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCCAGGTC CAGTCGACAG ACAAGGAAAG ATACGCCGGG TCGGCCGGTA CCGGGTCCAG GTCAGCTGTC 2351 GTGGAGGCGG TTCAGGCGGA GGTGGCTCTG GCGGTGGCGG AAGTGCACTC CACCTCCGCC AAGTCCGCCT CCACCGAGAC CGCCACCGCC TTCACGTGAG 2401 ATCAAACGGC GGCCGCAGGT GCGCCGGTGC CGTATCCGGA TCCGCTGGAA TAGTTTGCCG CCGGCGTCCA CGCGGCCACG GCATAGGCCS AGGCGACCTT 2451 CCGCGTGCCG CATAGGCTGG CGGCGGCTCT GGTGGTGGTT CTGGTGGCGG GGCGCACGGC GTATCCGACC GCCGCCGAGA CCACCACCAft GACCACCGCC 2501 CTCTGAGGGT GGCGGCTCTG AGGGTGGCGG TTCTGAGGGT GGCGGCTCTG GAGACTCCCA CCGCCGAGAC TCCCACCGCC AAGACTCCCA CCGCCGAGAC 2551 AGGGTGGCGG TTCCGGTGGC GGCTCCGGTT CCGGTGATTT TGATTATGAA TCCCACCGCC AAGGCCACCG CCGAGGCCAA GGCCACTAAA ACTAATACTT 2601 AAAATGGCAA ACGCTAATAA GGGGGCTATG ACCGAAAATG CCGATGAARA TTTTACCGTT TGCGATTATT CCCCCGATAC TGGCTTTTAC GGCTACTTTT 2651 CGCGCTACAG TCTGACGCTA MGGCAMCT TGATTCTGTC GCTACTGATT GC6CGATGTC AGACTGCGAT TTCCGTTTGA ACTAAGACAG CGATGACTAA 2701 ACGGTGCTGC TATCGATGGT TTCATTGGTG ACGTTTCCGG CCTTGCTAAT TGCCACGACG ATAGCTACCA AAGTAACCAC TGCAAAGGCC GGAACGATTA 2751 GGTAATGGTG CTACTGGTGA TTTTGCTGGC TCTAATTCCC AAATGGCTCA 19/30 CCATTACCAC GATGACCACT 2801 AGTCGGTGAC GGTSATAATT TCAGCCACTG CCACTATTM 2851 TACCTTCTTT GCCTCAGTCG ATGGAAGAAA CGGAGTCAGC 2901 GGTAAACCAT ATGAATTTTC CCATTTGGTA TACOTAAAAG 2951 TGGTGTCTTT GCGTTTCTTT ACCACAGAAA CGCAAAGAAA 3001 CGACGTTTGC TAACATACTG GCTGCAAACG ATTGTATGAC 3051 GGCCGTCGTT TTACAACGTC CCGGCAGCAA AATGTTGCAG 3101 TTAATCGCCT TGCAGCACAT AATTAGCGGA ACGTCGTGTA 3151 GAGGCCCGCA CCGATCGCCC CTCCGGGCGT GGCTAGCGGG 3201 ATGGCGCCTG ATGCGGTATT TACCGCGGAC TACGCCATAA 3251 ACCGCATACG TCAAAGCMC TGGCGTATGC AGTTTCGTTG 3301 GCCCGGCGGG TGTGGTGGTT CGGGCCGCCC ACACCACCAA 3351 GCCCTAGCCC CCGCTCCTTT CGGGATCGGG GGCGAGGAAA 34 01 CGCCGGCTTT CCCCGTCMG GCGGCCGAAA GGGGCAGTTC 3451 GATTTAGTGC TTTACGGCA.C CTAAATCACG AAATGCCGTG 3501 GGTTCACGTA GT6GGCCATC CCAAGTGCAT CACCCGGTAG 3551 GTTCGAGTCC ACGT7CTTTA CAAGCTCAGG TGCAAGAAAT 3601 TACTCAACCC TATCTCGGGC ATGAGTTGGG ATAGAGCCCG 3651 ATTTCGGCCT ATTGGTTAAA TAAAGCCGGA TAACCAATTT 3701 GAATTTTAAC AAAATATTAA CTTAAAATTG TTTTATAATT 3751 CAATCTGCTC TGATGCCGCA GTTAGACGAG ACTÃCGGCGT 3801 CCCGCTGACG CGCCCTGACG GGGCGACTGC GCGGGACTGC 3851 ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG TGTTCGACAC TGGCAGAGGC 3901 CATCACCGM ACGCGCGA GTAGTGGCTT TGCGCGCT AAAACGACCG AGATTAAGGG TTTACCGAGT CACCTTTAAT GAATAAXTTC CGTCAATATT GTGGAMTTA CTTATTAAAG GCAGTTATAA GTTGAATGTC GCCCTTATGT CTTTGGCGCT CAACTTACAG CGGGAATACA GAAACCGCGA TATTGATTGT GACAAAATAA ACTTATTCCG ATAACTAACA CTGTTTTATT TGAATAAGGC TATATGTTGC cacctttatg tatgtatttt ATATACMCG GTGGAAATAC ATACATAAAA CGTAATAAGG AGTCTTAATA AGAATTCACT GCATTATTCC TCAGAATTAT TCTTAAGTGA GTGACFGGGA AMCCCTGGC GTTACCCAAC CACTGACCCT TTTGGGACCG CMTGGGTTG CCCCCTTTCG CCAGCTGGCG TAATAGCGAA GGGGGAAAGC GGTCGACCGC ATTATCGCTT 1TCCCAACAG TTGCGCAGCC TGAATGGCGA AAGGGTTGTC AACGCGTCGG ACTTACCGCT TTCiCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC AAGAGGAATG CGTAGACACG CCATAAAGTG CATAGTACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA GTATCATGCG CGGGACATCG CCGCGTAATT ACGCGCAGCG TGACCGCTAC ACTTGCCAGC TGCGCGTCGC ACTGGCGATG TGAACGGTCG CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC TCGCCACGTT GCGAAAGAAG GGAAGGAAAG AGCGGTGCAA CTCTAMTCG GGGGCTCCCT TTAGGGTTCC GAGATTTAGC CCCCGAGGGA AATCCCAAGG CTCGACCCCA AAMACTTGA TTTGGGTGAT GAGCTGGGGT TTTTTGAACT AMCCCACTA GCCCTGATAG ÃCGGTTTTTC GTCCTTTGAC CGGGACTATC TGCCAAAAAG CAGGAAACTG ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA TATCACCTGA GAACMGGT? TGACCTTGTT TATTCTTTTG ATTTATAAGG GATTTTGCCG ATAAGAAAAC TAAATATTCC CTAAAACGGC AAATGAGCTG ATTTAACAAA AATTTAACGC TTTACTCGAC TAAATTGTTT TTAAATTGCG CGTTÍACAAT TTTATGGTGC AGTCTCAGTA GCAAATGTTA AAATACCACG TCAGAGTCAT TAGTTAAGCC AGCCCCGACA CCCGCCÃACA ATCAATTCG6 TCGGGGCTGT GGGCGGTTGT GGCTTGTCTG CTCCCGGCAT CCGCTTACAG CCGAACAGAC GAGGGCCGTA GGCGAATGTC GGAGCTGCAT GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CCTCGACGTA CACAGTCTCC AAAAGTGGCA Fig. 13 20/30 Λναΐ (3048) região Μ13. \

-35 21/30 Sequência de nucleotidos pXPl4 A Jt 1 GACGAAAGGG CCTCGTGATA CT6CTTTCCC ggagcactat 51 ATAATGGTTT CTTAGACGTC TATTACCAAA GAATCTGCAG 101 AACCCCTATT TGTTTATTTT TTGGGGATAA ACAAATAAAA 151 TGAGACAATA ACCCTGATAA ACTCTGTTAT TGGGACTATT 201 ATGAGTATTC AACATTTCCG TACTCATAAG TTGTAAAGGC 251 TTGCCTTCCf GTTTTTGCTC AACGGAAGGA CAAAAACGAG 301 CTGAAGATCA GTTGGGTGCT GACTTCTAGT CAACCCACGA 351 AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TCGCCATTCT AGGAACTCTC 401 GAGCACTTTT AAAGTTCTGC CTCGTGAAAA TTTCAAGACG 451 CCGGGCAAGA GCAACTCGGT GGCCCGTTCT CGTTGAGCCA 501 GTTGAGTACT CACCAGTCAC CAACTCATGA GTGGTCAGTG 551 AAGAGAATTA TGCAGTGCTG TTCTCTTAAT ACGTCACGAC 601 ACTTACTTCT GACAACGATC TGAATGAAGA CTGTTGGTAG 651 CACAACATGG GGGATCATGT GTGTTGTACC CCCTAGTACA 701 GAATGAAGCC ATACCAMCG CTTACTTCGG TATGGTTTGC 751 TGGCAACAAC GTTGCGCAAA ACCGTTGTTG CAACGCGTTT 601 TCCCGGCAAC AATTAATAGÃ AGGGCCGTTG TTAATTATCT 851 ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC TGAAGACGCG AGCCGGGAAG 901 GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CTCGGCCACT CGCACCCAGA 951 GGTAAGCCCT CCCGTATCGT CCATTCGGGA GGGCATAGCA 1001 TATGGATGAA CGAAATAGAC ATACCTACTT GCTTTATCTG 1051 AGCATTGGTA ACTGTCAGAC TCGTAACCAT TGACAGTCTG 1101 TTAAAACTTC ATTTTTMTT AATTTTGAAG TAAAAATTAA 1151 TAATCTCATG ACCAAAATCC ATTAGÃGTAC TGGTTTTAGG 1201 CAGACCCCGT AGAAAAGATC GTCTGGGGCA TCTTTTCTAG CGCCTATTTT TATAGGTTAA TGTCATGATA GCGGATAAAA ATATCCAATT ACAGTACTAT AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG TCCACCGTGA AAAGCCCCTT TACACGCGCC TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCÃ AGATTTATGT AAGTTTATAC ATAGGCGAGT ATGCTTCAAT AATATTGAAA AAGGAAGAGT TACGAAGTTA TTATAACTTT TTCCTTCTCA TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCMT ACAGCGGGAA TAAGGGAAAA AACGCCGTAA ACCCAGAAAC GCTGCTGAAA GTAAAAGATG TGGGTCTTTG CGACCACTTT CATTTTCTAC CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC GCTCACCCAA TGTAGCTTGA CCTAGÃGITG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCGAATGAT AAAAGCGGGG CTTCTTGCAA AAGGTTACTA TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG ATACACCGCG CCATAATAGG GCATAACTGC CGCCGCATAC ACTATTCTCA GAATGACTTG GCGGCGTATG TGATAAGAGT CTTACTGAAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG GCATGACAGT TCTTTTCGTA GAATGCCTAC CGTACTGTCA CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA GGTATTGGTA CTCACTATTG TGACGCCG5T GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CCTCCTGGCT TCCTCGATTG GCGAAAAAAC AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT TTG&GCGGM CTAGCAACCC TTGGCCTCGA ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA TGCTCGCACT GTGGTGCTAC GGACATCGTT CTATTAACTG GCGÃACTACT TACTCTAGCT GATAATTGAC CGCTTGATGA ATGAGATCGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC GACCTACCTC CGCCTATTTC AACGTCCTGG CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG GCCGACCGAC CAAATAACGA CTATTTAGAC CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GCGCCATAGT AACGTCGTGA CCCCGGTCTA AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TCAATAGATG TGCTGCCCCT CAGTCCGTTG AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA TCTAGCGACT CTATCCACGG AGTGACTAAT CAAGTTTACT CATATATACT TTAGATTGAT GTTCAAATGA GTATATATGA AATCTAACTA TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA ATTTTCCTAG ATCCACTTCT AGGAAAAACT CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT GAATTGCACT CAAAAGCAAG GTGHCTCGCA AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG TTTCCTAGAA GAACTCTAGG AAAAAAAGAC 22/30 1251 CGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT GCGCATTAGA CGACGAACGT TTGTTTTT'1'T GGTGGCGATG GTCGCCACCA 1301 TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT AACAAACGGC CTAGTTCTCG ATGGTTGAGA AAAAGGCTTC CATTGACCGA 1351 TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA AGTCGTCTCG CGTCTÃTGGT TTATGACAGG AAGATCACAT CGGCÃTCAAT 1401 GGCCACCAC? TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT CCGGTGGTGA AGTTCTTGAG ACATCGTGGC GGATGTATGG AGCGAGACGA 1451 AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CXGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG TTAGGACAAT GGTCACCGAC GACGGTCACC GCTATTCAGC ACAGAATGGC 1501 GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTC6GGCTGA CCAACCTGAG TTCTGCTATC AATGGCCTAT TCCGCGTCGC CAGCCCGACT 1551 ACGGGGGGTT CGTGCATACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA TGCCCCCCM GCACGTATGT CGGGTCGMC CTCGCTTGCT GGATGTGGCT 1601 ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCTATGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG tgactctatg gatgtcgcac tcgatactct ttcgcggtgc gaagggcttc 1651 GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CCTCTTTCCG CCTGTCCATA GGCCATTCGC CGTCCCAGCC TTGTCCTCTC 1701 CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT GCGTGCTCCC TCGAAGGTCC CCCTTTGCGG ACCATAG&AA TATCAGGACA 1751 CGGGTTTCGC cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag GCCCAAAGCG GTGGAGACTG AACTCGCAGC TAAAAACACT ACGAGCAGTC 1801 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCXT TTTACGGTTC CCCCCGCCTC GGMACCTTX TTGCGGTCGT TGCGCCGGAA AAATGCCAAG 1851 CTGGCCTTTT GCTGGCCTT? TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC GACCGGMAA CGACCGGAM ACGAGTGTAC AAGAAAGGAC GCAATAGGGG 1901 TGATTCTGTG GATAACCGTA TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC ACTAAGACAC CTATTGGCAT AATGGCGGAA ACTCACTCGA CTATGGCGAG 1951 GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA CGGCGTCGGC TTGCTGGCTC GCGTCGCTCA GTCACTCGCT CCTTCGCCTT 2001 GAGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA CTCGCGGGTT ATGCGTTTGG CGGAGAGGGG CGCGCAACCG GCTAAGTAAT 2051 ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA TACGTCGACC GTGCTGTCCA AAGGGCTGAC CTTTCGCCCG TCACTCGCGT 2101 ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT AGGCACCCCA GGCTTTACAC TGCGTTAATT ACACTCAATC GAGTGAGTAA TCCGTGGGGT CCGAAATGTG 2151 TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT AAATACGAAG GCCGAGCATA CAACACACCT TAACACTCGC CTATTGTTAA 2201 TCACACAGGÁ AACAGCTATG ACCATGATTA CGCCAAGCTT GCATGCAAAT AGTGTGTCCT TTGTCGATAC TGGTACTAAT GCGGTTCGAA CGTACGTTTA 2251 TCTATTTCAA GGAGACAGTC ATAATGAAAT ACCTATTGCC TACGGCAGCC AGATAAAGTT CCTCTGTCAG TATTACTTTA TGGATAACGG ATGCCGTCGG 2301 GCTGGATTGT TATTACTCGC GGCCCAGCCG GCCATGGCCC AGGTGCAGCT CGACCTAACA ATAATGAGCG CCGGGTCGGC CGGTACCGGG TCCACGTCGA 2351 GCAGGTCGGC CTCGAGATCA AACGGGCGGC CGCAGGTGCG CCGGTGCCGT CGTCCAGCCG GAGCTCTAGT TTGCCCGCCG GCGTCCACGC GGCCACGGCA 2401 ATCCAGATCC GCTGGAACCG CGTGGGGCCG CAAGCGCTTG GAGCCACCCG TAGGTCTAGG CGACCTTGGC GCACCCCGGC GTTCGCGAAC CTCGGTGGGC 2451 CAGTTCGAAA AATAATAAGG ATCCGAATTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCAAGCTTT TTATTATTCC TAGGCTTAAG TGACCGGCAG CAAAATGTTG 23/30 2501 GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGTTACCC AACTTAATCG CCTTGCAGCA CAGCACTGAC CCTTTTGGGA CCGCAATGGG TTG&ATTAGC GGAACGTCGT 2551 CATCCCCCTT TCGCCAGCT6 GCGTAATAGC GAAGAGGCCC GCACCGATCG GTAGGGGGAA AGCGGTCGAC CGCATTATCG CTTCTCCGGG CGTGGCTAGC 2601 CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGCGC CTGATGCGGT GGGAAGGGTT GTCAACGCGT CGGACTTACC GCTTACCGCG GACTACGCCA 2651 ATTTTCTCCT TACGCATCTG TGCGGTATTT CACACCGCAT ACGTCAAAGC TAAAAGAGGA ATGCGTAGAC ACGCCATAAA GTGTGGCGTA TGCAGTTTCG 2701 AACCATAGTA CGCGCCCTGT AGCGGCGCAT TMGCCCGGC GGGTGTGGTG TTGGTATCAT GCGCGGGACA TCGCCGCGTA ATTCGGGCCG CCCACACCAC 2751 GTTACGCGCA GCGTGACCGC TACACTTGCC AGCGCCCTAG CCCCCGCTCC CAATGCGCGT CGCACTGGCG ATGTGAACGG TCGCGGGATC GGGGGCGAGG 2801 TTTCGCTTTC TTCCCTTCCT TTCTCGCCAC GTTCGCCGGC TTTCCCCGTC AAAGCGAAAG AAGGGAAGGA AAGAGCGGTG CAAGCGGCCG AAAGGGGCAG 2851 AAGCTCTAM TCGGGGGCTC CCTTTAGGGT TCCGATTTAG TGCTTTACGG TTCGAGATXT AGCCCCCSAG GGAAATCCCA AGGCTAAATC ACGAAATGCC 2901 CACCTCGACC CCAAAAAACT TGATTTGGGX GATGGTTCAC GXAGTGGGCC GTGGAGCTGG GGTTTTTTGA ACTAAACCCA CTACCAAGTG CATCACCCGG 2951 ATCGCCCTGA TAGACGGTTT TTCGTCCTTT GACGTTCGAG TCCACGTTCT TAGCGGGACT ATCTGCCAAA AAGCAGGAAA CTGCAAGCTC AGGTGCAAGA 3001 TTAATAGTGG ACTCTTGTTC CAAACTGGM CAATACTCAA CCCTATCTCG AATTATCACC TGAGAACAAG GTTTGACCTT GTWGAGTT GGGATAGAGC 3051 GGCTATTCTT TTGATTTATA AGGGATTTTG CCGATTTCGG CCTATTGGTT CCGATAAGM MCTAMTAT TCCCTAAAAC GGCTAAAGCC GGATAACCAA 3101 AAAAAATGAG CTGATTTAAC AAAAATTTM CGCGAATTTT AACAAAATAT TTTTTTACTC GACTAAATTG TTTTTAAATT GCGCTTAAM TTGTTTTATA 3151 TAACGTTTAC AATTTTATGG TGCAGTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC ATTGCAAATG TTAAAATACC ACGTCAGAGT CATGTTAGAC GAGACTACGG 3201 GCATAGTTAA GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG CGTATCAATT CGGTCGGGGC TGTGGGCGGT TGTGGGCGAC TGCGCGG6AC 3251 ACGGGCTTGT CTGCTCCCGG CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT TGCCCGAACà GACGAGGGCC GTAGGCGAAT GTCTGTTCGA CACTGGCAGA 3301 CCGGGAGCTG CATGTGTCAG AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG GGCCCTCGAC GTACACAGTC TCCAAAAGTG GCAGTAGTGG CTTTGCGCGC 3351 A T Fig. 14 24/30 Iniciadores de ADNc VLK~c CTC-GATGGTGGGMC-ÃTGGA yLL~c ICAGAGGAAGGAAACAGGGT lgG1~c CTTACAACCACAATCCCTGGGCACAATTTT lgG2a-c CTTTGTGGGCCCTCTGGGCTCAAT lgG2-b rGAAATGGGCCCGCTGGGCTCAAG lgG3-c GGGCTTGGGTATTCTAGGCfCGAT Iniciadores directos de VH sem locais de restrição M-VH1 GAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG ivl VH2 CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCÀGG M-VH3 GAGGTCCAGCTGCMCAGTCTGG M-VH4 GAGGTTCãGCTGCAGCAGTCTGG M-VH5 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG M-VH6 CAGG TTCAGCTGCAGCAGTCTGG M-VH7 GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGG M-VH8 SAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGG M-VH9 GAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGG Iniciadores reversos de VH sem locais de restrição M-JH1 [tgaggagacggtgaccgtggtccc | pGAGGAGiKTGTGSGAGTGGTGCC M-JH3 pGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC M-JH4 fTGAGGAG&CGGTGftCTGAGGTTCC | Iniciadores directos de VL sem locais de restrição M-VK1 GACATTGTGATGACACAGTCTCC M-VK2 GATGTTGTGATGACCCMACTCC M-VK3 SATATCCAGATGACACAGACTCC M-VK4 CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC M-VL1 CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATC Iniciadores reversos de VL sem locais de restrição

25/30 Iniciadores directos de VH com locais de restrição MVH1 Sfil S1XXTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGA5TCAGG MVH2 Sfil STCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGMGG&GTCAGG MVH3 Sfil gtcctcgcaactgcggcccagccggccatggccgaggtccagctgcaacagtctgg MVH4 Sfil STCOTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTÍCAGCTGCAGCAGTCTGG MVH5 Sfil STCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG MVH6 Sfil GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGG MVH7Sfil GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGG MVHS Sfii gtcctcgcaactgcggcccagccggccatggccgaggtgaagctggtggaatctgg SV1VH9 Sfil ctcctcgcaactgcggcccagccggccatggccgaggttcagcttcagcagtctgg iniciadores reversos de VH com locais de restrição MJH1 Sall ôAGTCATTCTCGTGTCGACACGGTGACCGTGGTCCC MJH2 Saíl 3AGTCATTCTCGTGTCGACACTGTGAGAGTGGTGCC MJH3 Sall GAGTCATTCTCGTGtCGACACAGTGACCAGAGTCCC MJH4 Sall GAGTCATTCTCGTGTCGACACGGTGACTGAGGTTCC iniciadores directos de VL com locais de restrição MVK1 ApaLl TGAGCACACAGTGCACTCGACATTGTGATGACACAGTCTCC MVK2 ApaLl MVKSÀpaLt “ TGAGCACAXAGTGCACTCGÃTGTTGTGATGACCCAAACTCC TGÃC^rcÃi^GTGCACTCGATATCCAGATGACACÃGACTCC MVK4 ApaLl TGAGCACACAGTGCACTCCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC MVL1 ApaLl rGAGCACACAGTGCACTCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATC iniciadores reversos de VL com tocais de restrição M-JK1 Not1 GAGICATTCTCGACTTGCGGCCGCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC M-JK2 Not1 GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC M-JK3 Notl GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC M-JL1 Not1 SAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACAGTGACCTTGGTTCC Fig. 15 26/30

Ο tf! (9 tf R ts O tf fH o (S tu H r O *c «c tf o tu fn-, V) υ Í3 tf ÍH CJ Cl H ei* β“ f 1 feH 1¾ tf Γη 10 i s u ci o Vi tu Ο CS o tf o f-> y ír< ts R π W o u IV tf U3 O í3T f0 ÍV Η H C 1 IS f-í O < C l f 1 f-l t 1 Ί > V .) o H ÍS fH H H n n Cl O LO u o L> Cl «:; < fH tf Η t.O (0 L» H t > H Λ ω cs 1¾ CS < fH ti tf (1 ts ts Η CS tf tf t j »n ts o '< O tu F-i λ: c.l CU H fH tf < O tf R Ui u CS cy CS W o CS H n t > ãã ts (S tf C.S C9 O u ts ÍH tf O F”< H n CS y Ο CU tf H tf! rtj H Eh o tf n R R U CS U υ CS H fM f 5 R ts 1 > c > H C > t > H t s t 1 tf tf tf R < < Eh t> rtl υ tu Ο li) R u rn u CS CS < < H CS O' tf CS «: H CS H tf Cl U C.> 3 2 <1> fH IV < u o U y H < y B H ts o H LO tf tn o 3 *?, CS O tf tf LS O u cs ti o t,s pC υ H H <·) CS {> H Er» ri. tf O {0 tf o tf ('? «tf tf fT <*> tf f 3 *c 3 Li υ C‘i CS ζ 1 cj c.s tu n o O u> ll> l!) Kft fj f.i> w O t1 H H tf! fS i > t > H H tf 19 CS tf O fH Ci o π C.l ts CS < uv H R Ci CS H Cl f*=t tf to R 3 o tf C.) H IS u C.s (1 {> d« (9 H tf ts H Cl LS H CS y f > H y tf tf Q CS «t Cl cu tf ÍS tf φ tf H u fí ci y H t) t. tf H ci C > CS (S <s y tf y 11 is 2 R CS tf H ÍV CS tf n tf ts R 0 O H tf n Eh Fh <9 cs ri R n υ CU tf (9 υ λ· u CS CS ts o CS IH tf f-t λ: H 5-* n tf <s tf tf; Eh CU «C R fH ti ti C5 o R R y CU tf H iv O l{) < H LS fH l*i tf U y CS u E~* ω Cl CS tf tf y υ <9 tf R CS tf! H 1 > t> R y 0 1» H tf tf CS H tí.1 jf-H <0 y 0 u *s o Ci o U cu H o ts o CU tf C‘J tf! tf! tf! H tf o tfr o υ tf V) tf u Ví V) tf o CS < > CS tf ϋ tí* cs rtj Ci CS O ts o y tf n R tf B tf u CU tf R cu tf u w tf U C.) tH t.v H y y H ã y r O u Ci y Cl υ CS O co tf C.S R H H Ci 4¾ H R cu H y 2 CS tf tf CJ H ti CS H Cl R U a tf CS CS O tf EH H CS o tf tu R 0 3 H ω tf CS o tf R τ> U) fi, ÍH tf! < 10 u {-η R 'tf TS U H u 1¾ ti H U> H u C,S tf r CU ts >ο O IH « tf! ÍS Cl y < tf CS R D φ CS H u ts LV < o ts R r O tf u tf tf! n u V tu cu t) ts tf Q u CS 3| Cfi CS tf cs B H {0 tf 3 □ o ts CS tf! fcH 10 tf tf O CU tf u C R r i.y ti Ci CS o u H tf fl tu φ V) CS H t'J tf H o tf ÍH IS y υ ts H H tf! H Cl H M o tu tf υ < H < CS H C9 o B (S Fh rs ΰ « o u O < tf tf Eh tu tu tf y CU ο C φ r-t fH H rH rH íH rH H fH r- H CQ ϊΓ} C-í CA tc PV O r σ H Csí N ΓΛ «5* in ID h- φ Φ Ò Ζ 9 σ U1 m CNÍ > U. ο m φ Ό 2 > Ο IL < O v> Ό

27/30

ço m 28/30

οο Μ CL > 29/30

δ Ο Φ Cl «ο CM CM CL EL Vrr*Lt s I Ο α 30/30 < Ο φ JXi ο ο 8 ί—1 C Ο ο δ 0) Ο Ό V) m ο 'Φ .φ CL Cl □

<Λ rçο «, Ό> Ο. 0) Ό νΡ Ο ώ roο ν~ ·α>α. ω Ό ί\0 θ'* ΙΟ oώ Ο Γ~“!-1--1-ί-1-1-ί-1-1 οοοοοοοοοοο ίΟ Ο! v C\! 00 ^ »ί) <D Κ oeseAuí ap eóuepniu ap %