CN109374889B - 标记的hsp90抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及标记的HSP90抑制剂的用途。本发明还提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：(a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；(b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及(c)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与结合于参考的标记的HSP90抑制剂的量比较。

Description

标记的HSP90抑制剂的用途
本申请是申请日为2012年7月6日、申请号为201280040632.X、发明名称为“标 记的HSP90抑制剂的用途”发明专利申请的分案申请。
相关申请案的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请案要求于2011年7月8日提出的美国临时申请案第61/506,010号的权益，所述临时申请案的所有内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及标记的HSP90抑制剂的用途。
背景技术
为了维持稳态，细胞采用复杂的分子机器，这些分子机器由数以千计的被程序化以 执行明确的功能的蛋白质构成。通过蛋白质错误表达或突变的这些通路调节异常会产生 赋予恶性表型的生物优势。虽然在细胞水平下，所述调节异常可能是有益的(即有利于提高存活率)，但在分子水平下，此需要细胞投入能量来维持这些蛋白质的稳定性和功 能。相信为了将这些蛋白质维持在假稳定状态，癌细胞指派分子伴随蛋白，包括 HSP9032,33。
支持此假设，HSP90被公认为在维持转化的表型中起到重要的作用32,33。HSP90和其相关辅助伴随蛋白帮助统称为“客户蛋白”的细胞蛋白质进行正确的构象折叠，许多 这些蛋白是控制细胞生长、分化、DNA破坏反应和细胞存活的信号转导通路的效应物。 因此，肿瘤细胞对失调蛋白质的依赖(即通过突变、异常表达、不当的细胞移位等)可 能变得决定性地依赖于HSP9033。
在各种形式的癌症中HSP90疗法的基本原理目前由包括在对标准疗法具有抗性的疾病内的临床前和临床研究很好地支持91-97。举例来说，研究已经证明某些HER2+肿瘤 对HSP90抑制剂的显著敏感性98,99。在这些肿瘤中，17-AAG(又称为坦螺旋霉素(Tanespimycin))和17-DMAG(阿螺旋霉素(Alvespimycin))甚至引起反应，并且特别 是在曲妥珠单抗疗法(trastuzumab therapy)后的进行性疾病患者中98。例如PU-H71等 其它HSP90抑制剂，在许多三阴性乳癌小鼠模型中进行临床前测试时，提供了至今在此 难以治疗的癌症亚型中所报导的最有效的靶向单一药剂抗肿瘤作用100。
虽然这些数据强烈地支持HSP90抑制剂用于癌症中，但此刻关于如何鉴别最可能受 益于HSP90疗法的那些患者没有清晰的一致意见101,102。此尤其成问题，众所周知对于靶向药剂的成功开发来说，最基本的是确定应接收药物的患者亚群(即，具有EGFR突 变的肿瘤对它赛瓦(tarceva))。所述选择可以减少接收低效治疗的患者数目并且减少在 晚期临床试验中无效的靶向肿瘤学药剂的交错数目。
此外，没有临床分析可以非侵入性地确定HSP90标靶抑制。虽然外周血淋巴细胞的药效监测已经在临床试验中提供了HSP90抑制剂的体内生物活性的易得且可再现指标， 但在正常组织中的药效并不预测肿瘤比活性97,101,102。明智地使用活组织检查来测量药效 变化仍然是一种分析标靶调节的重要方式，但此种方法由于与侵入性分析有关的逻辑和 伦理问题而仍然是受限制的。作为一种替代方案，目前使用锆89标记的抗体研究肿瘤 HER2水平和VEGF水平的变化103,104，以及通过ELISA研究患者血清中可溶性HER2 胞外域水平的变化105，但这些研究限于表达这些生物标记物的乳房肿瘤的子集。
因此，在HSP90靶向疗法中对生物标记物有强烈的需要：大部分癌症患者用新颖的实验性疗法治疗，在很多情况下几乎不了解特定药剂的作用机制、不同疾病子集的具体 治疗的适合性并且几乎不知道不同恶性背景下治疗剂的最佳剂量和时程安排。最终结果 是根据经验的临床研究，其中难治性恶性疾病患者在不知道哪一种治疗方法对不同的临 床背景为最佳的情况下用一连串的新颖药剂治疗。
HSP90是一种在癌症中备受追捧的标靶，此是因为它在稳定和折叠与致癌性转化有 关的蛋白质中起到关键作用。鉴于其可能降解许多不同的癌蛋白和影响多条信号传导通 路，已经假设HSP90抑制剂(HSP90i)在多种癌症中是有效的。虽然早期临床试验已 经证实此方法在肿瘤子集中的治疗可能性，但找到生物标记物来预测哪些癌症和患者群 体将对所述治疗最敏感已经证明是挑战性的。所述对充足的患者群体的了解缺乏和选择 已经导致大量新兴的HSP90癌症治疗剂进展缓慢或无法继续开发。因此迫切需要立即尝 试针对HSP90疗法鉴别反应群体和开发伴随诊断性分析。
在HSP90疗法中对实现抗肿瘤功效所需要的适当剂量和时程的设计也缺乏了解。血 浆药物动力学一般提供有益于治疗剂给药设计的数据，其中血浆曲线下面积(AUC)通常作为全身性药物暴露的量度。然而，对于HSP90抑制剂，肿瘤组织中而不是血液中药 物滞留的浓度和持续时间决定它们的抗肿瘤作用106-109。确切地说，大部分HSP90抑制 剂特征是从血浆和正常组织迅速清除，但在肿瘤内相对长时间药物滞留(即投药后12-48 小时内)的非典型的药物动力学型态。因而，如果反应与注入剂量而不是肿瘤剂量相关， 那么对HSP90疗法的肿瘤反应的临床了解严重地受到限制。血浆药物动力学有限的价值 和肿瘤剂量对肿瘤反应的重要性表明需要临床开发一种对HSP90抑制剂的肿瘤药物动 力学的分析。肿瘤HSP90的验证的临床上实践的非侵入性分析将能够将治疗剂给药集中 于实现稳态的肿瘤药物浓度，而不是替代的稳态血浆浓度。所述分析可以指示在等于或 低于最高许可剂量下，是否可以实现治疗有效肿瘤浓度。在相反情况下，患者可以实行 一种替代治疗，使他们在无临床益处下无需暴露于可能的药物毒性。
为了克服与HSP90疗法有关的这些限制，这里设计和开发了一种所提出的非侵入性 分析，它将推动HSP90抑制剂在癌症中的最佳临床实施、开发和使用。
发明内容
本发明提供了使用标记的HSP90抑制剂改善使用HSP90抑制剂治疗癌症患者的方法。
本发明证明了不仅仅是由HSP90表达决定的此具体“致癌HSP90”物质的丰度预 测对HSP90抑制疗法的敏感性并且因此是HSP90疗法的生物标记物。本发明还证明了 鉴别和测量肿瘤内此致癌HSP90物质的丰度预测对HSP90疗法的反应。“致癌HSP90” 在本文中定义为代表伴随蛋白复合物的细胞应激特定形式的HSP90部分，其在肿瘤细胞 环境下扩增并且组成性维持，并且可以执行维持恶性表型所需的功能。所述作用不仅调 节过度表达(即HER2)、突变(即mB-Raf)或嵌合蛋白(即Bcr-Abl)的折叠，而且还 促进与异常活化信号传导复合物(即STAT5、BCL6)相关的分子的架构和复合物形成。 虽然肿瘤存活变得依赖于HSP90-癌蛋白的网络，但这些蛋白质在功能和稳定性上变得 依赖于“致癌HSP90”。此共生性互相依赖表明肿瘤对HSP90癌蛋白的依赖等同于对 “致癌HSP90”的依赖。测量后者的丰度是第一读数，因此，根据本发明，是HSP90 疗法富集的生物标记物。
此外，展示HSP90在恶性细胞中形成生物化学不同的复合物。癌细胞HSP90的主 要部分保留类似于正常细胞的“管家”伴侣功能，而癌细胞中富集或扩增的功能上不同 的HSP90池(即，“致癌HSP90”)特异性地与维持肿瘤细胞存活、异常增生特征以及 侵入和转移行为所需的癌蛋白相互作用。
为了以逐肿瘤的方式测量“致癌HSP90”的丰度，本发明还提供了化学工具。所述工具包括荧光标记和ANCA标记的HSP90抑制剂、生物素标记的HSP90抑制剂和放射 性标记的抑制剂，它们特异性地鉴别此肿瘤“致癌HSP90”物质并且与其相互作用，这 使得可以测量不同类型的肿瘤、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞和肿瘤相关生物形式中(例如 血液科恶性疾病、实体肿瘤和液体肿瘤中)“致癌HSP90”物质的丰度，并且因此测量 和预测对HSP90抑制疗法的敏感性。这些可以呈但不限于实体或液体肿瘤中的癌细胞、 癌症干细胞、循环肿瘤细胞、肿瘤支持免疫细胞、外来体和肿瘤支持祖细胞的形式。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗 法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中 存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；
(b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与结合于参考的标记的HSP90抑制剂的量比较；
其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
在一个实施例中，参考细胞来自患有肿瘤的相同患者的细胞。参考细胞可以是来自 癌症患者的正常细胞。举例来说，正常细胞可以是来自患有血液肿瘤的患者的淋巴细胞、 来自具有循环肿瘤细胞的患者或实体肿瘤周围的正常组织的白血球。在另一实施例中， 参考细胞是肿瘤细胞或来自癌症患者的几乎不表达致癌HSP90的另一细胞。在另一实施 例中，参考细胞来自与患有肿瘤的患者不同的患者的细胞。举例来说，参考细胞可以来自健康个体的细胞或来自除待测量的患有肿瘤的患者以外的癌症患者的几乎不表达致 癌HSP90的细胞。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗 法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中 存在的HSP90的肿瘤特异性形式的第一可检测地标记的HSP90抑制剂和最低程度或不结合于所述HSP90的肿瘤特异性形式的第二可检测地标记的抑制剂接触；
(b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的第一标记的抑制剂和第二标 记的抑制剂的量；以及
(c)将结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的第一标记的抑制剂的量与结合于所述肿瘤 或肿瘤细胞的第二标记的抑制剂的量比较，
其中结合于所述肿瘤或肿瘤细胞的第一标记的抑制剂的量比结合于所述肿瘤或肿 瘤细胞的第二标记的抑制剂大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
在一个实施例中，标记的HSP90抑制剂是可渗透细胞并且选择性地结合于“致癌HSP90”的荧光标记或ANCA标记的抑制剂。举例来说，提供HSP90抑制剂PU-H71的 不同的荧光标记和ANCA标记型式，其已经针对用于流式细胞术，以及用于分析在实体 或液体肿瘤中发现或从中分离的癌细胞、癌症干细胞、循环肿瘤细胞、肿瘤支持免疫细 胞、外来体和肿瘤支持祖细胞，以及用于通过例如活组织检查、手术和细针吸取等若干 介入方法获得的样品的组织染色而最佳化。
在一种所述实施例中，展示例如PU-H71-FITC2(部分5.2.1.1.)等荧光标记的抑制剂可以用于测量从例如活组织检查和手术样品等来源中获得的组织中“致癌HSP90” 的丰度。在另一实施例中，展示例如PU-H71-FITC2等荧光标记的抑制剂可以用于测量 建立的癌细胞系或原代癌细胞中“致癌HSP90”的丰度。在另一实施例中，展示荧光标 记的抑制剂可以用于测量从例如来自肿瘤等癌症样品中分离的细胞中、癌症干细胞中、 循环肿瘤细胞中和从细针吸取中获得的癌细胞中“致癌HSP90”的丰度。在其它实施例 中，展示也适用于进行以上提及的测量的其它荧光标记、ANCA标记和生物素标记的 HSP90抑制剂。
在另一实施例中，标记的HSP90抑制剂是选择性地结合于“致癌HSP90”的放射性标记的抑制剂。举例来说，放射性标记的PU-H71的不同型式已经针对PET成像而最佳 化。在一特定实施例中，PU-H71的碘124放射性标记的型式用于实体和液体肿瘤的PET 成像。放射性标记的抑制剂可用于使许多类型的原发性和转移性癌症成像，包括(但不 限于)结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、 前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃 肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质 瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤、白血病、 骨髓瘤、骨髓增生性赘生物以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
本发明进一步提供了以逐肿瘤的方式测量例如(但不限于)上列的那些肿瘤等实体 肿瘤中和例如(但不限于)与淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和骨髓增生性赘生物有关的液体肿瘤等液体肿瘤中“致癌HSP90”的丰度的方式。在一个实施例中，本发明展示通过使 用特异性地与“致癌HSP90”相互作用的碘124标记的HSP90抑制剂，可使用非侵入性 PET成像并且定量患者中、实体肿瘤和液体肿瘤中的“致癌HSP90”。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定患有例如血液癌症(例如白血病)等血液科恶性疾病的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含：使含 有来自所述患者的癌细胞的样品和参考非癌细胞与优先结合于患者癌细胞中存在的 HSP90的肿瘤特异性形式的可渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂接触，测量结合于所 述样品中所述癌细胞和非癌症的荧光标记的HSP90抑制剂的量，并且将结合于所述癌细 胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量与结合于所述非癌细胞的所述荧光标记的 HSP90抑制剂的量比较，其中结合于所述癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于所 述非癌细胞表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
在一种所述实施例中，参考正常细胞是来自与癌细胞相同的患者的正常细胞(例如 淋巴细胞)。在另一实施例中，参考非癌细胞是从与癌症患者不同的患者中获得。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定患有实体肿瘤的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含：使含有来自患者的癌细胞和非癌细胞(例 如周围基质、良性细胞或样品中的其它类型正常细胞)的样品(例如从活组织检查、手 术、细针吸取或其它介入程序中获得)与优先结合于所述患者的癌细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的可渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂接触，测量结合于所述样品 中所述癌细胞和非癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量，并且将结合于所述癌细胞的 所述荧光标记的HSP90抑制剂的量与结合于所述非癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑 制剂的量比较，其中结合于所述癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于所述非癌细 胞表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
本发明还提供了一种用于确定患有实体肿瘤的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含：使含有来自所述患者的循环癌细胞和非癌细胞(例如 白血球)的样品与优先结合于所述患者的癌细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可 渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂接触，测量结合于所述样品中所述癌细胞和非癌细 胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量，并且将结合于所述癌细胞的所述荧光标记的HSP90 抑制剂的量与结合于所述非癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量比较，其中结合 于所述癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于所述非癌细胞表明所述肿瘤将可能 对所述HSP90抑制剂起反应。
在一替代性实施例中，参考非癌细胞是从除患有肿瘤的患者以外的患者中获得。
在另一方面，本发明提供了使用放射性标记的HSP90抑制剂确定将对HSP90抑制疗法敏感的患者的方法。
在一个所述实施例中，本发明提供了用于确定患有可成像肿瘤的癌症患者是否将可 能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
(b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
(c)在步骤(a)中所述投予后所述一个或一个以上时间点测量所述患者的预定健康组织或血液对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
(d)计算步骤(b)中在一个或多个时间点测量的吸收与步骤(c)中相同时间点测量的吸收的比率；以及
(e)确定所述癌症患者将对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的可能性，其中在一个或多个时间点步骤(d)中计算的比率超过2表明所述患者将可能起反应。
在另一实施例中，本发明提供了一种用于确定患有可成像肿瘤的癌症患者是否将可 能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
(b)在步骤(a)中所述投予后4小时以上的一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收，
其中相对于所述肿瘤周围的健康组织中的吸收，在所述一个或一个以上时间点所述 抑制剂的吸收表明所述患者将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应。
在又一个实施例中，本发明提供了一种用于确定可成像肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
(b)在步骤(a)中所述放射性标记的HSP90抑制剂投予后2个小时或2个小时以 上的一个或一个以上时间点通过PET目视检查所述放射性标记的抑制剂在所述肿瘤中 或在所述肿瘤的肿瘤细胞中的吸收，
(c)将步骤(b)中获得的PET影像与在所述一个或一个以上时间点在所述肿瘤周围的健康组织中获得的PET影像比较；
其中在所述一个或一个以上时间点所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中PET影像中的明亮区域的存在表明所述患者将可能对HSP90抑制疗法起反应。
在另一实施例中，本发明提供了一种用于确定患有表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌 症患者是否将可能对使用界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；
(c)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收，针对所述HSP90 抑制剂的界定剂量，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中 存在的所述HSP90抑制剂的浓度；以及
(d)将步骤(c)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度与在所述一个或一个以上时间点在肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的 参考浓度比较，
其中如果步骤(c)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度将等于或超过有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的浓度，那么所述患者将可能对使用所述界定剂量的 HSP90抑制剂的疗法起反应。
在另一方面，展示放射性标记的HSP90抑制剂可以用于确定HSP90抑制剂的有效剂量和给药时程。
在一个所述实施例中，本发明提供了一种用于确定患有表达致癌HSP90的肿瘤的特 定癌症患者是否将可能对使用界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；
(c)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收，针对所述HSP90 抑制剂的界定剂量，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中 存在的所述HSP90抑制剂的浓度；以及
(d)将步骤(c)中计算的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露与在所述一个或一个以上时间点在所述肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的对所 述HSP90抑制剂的参考暴露比较，
其中如果步骤(c)中计算的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露将等于或超过有效治疗所述肿瘤所需的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露，那么所述患者将可能对使 用所述界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应。
额外的实施例包括一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对于患有可成像肿瘤的特定癌症患者投予的有效剂量和频率的方法；一种用于确定癌症患者中可成像肿瘤中存在的HSP90抑制剂的浓度的方法；以及一种用于确定或监测癌症患者中肿瘤对使用 HSP90抑制剂的疗法起反应的方法。
在又一个实施例中，本发明提供了一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对于患有 表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌症患者投予的有效剂量和频率的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式 的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及
(c)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个维持所述肿瘤中有效治疗所述肿瘤的所述HSP90抑制剂 的浓度所需的投予剂量和频率，由此确定使用所述HSP90抑制剂的疗法对于所述癌症患 者投予的有效剂量和频率。
在又一个实施例中，本发明提供了一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对于患有 表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌症患者投予的有效剂量和频率的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式 的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及
(c)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收，计算在治疗时期内维持所述肿瘤中有效治疗所述肿瘤的所述HSP90抑制剂的平均肿瘤浓度所需的投予 剂量和频率，由此确定使用所述HSP90抑制剂的疗法对于所述癌症患者投予的有效剂量 和频率。
在又一方面，本发明提供了一种用于确定癌症患者中表达致癌HSP90的肿瘤中存在 的HSP90抑制剂的浓度的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者共投予预定量的所述HSP90抑制剂和一定量的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式，所述HSP90抑制剂优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的 肿瘤特异性形式；
(b)在步骤(a)中所述共投予后一个或一个以上时间点周期性地测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；以及
(c)基于步骤(b)中所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收的测量，确定在任何 所述时间点所述肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度。
在另一方面，本发明提供了一种用于确定癌症患者中表达致癌HSP90的肿瘤对使用 HSP90抑制剂的疗法的反应的方法，其包含以下步骤：
(a)在所述患者接收所述HSP90抑制剂作为疗法的时期内一个或一个以上时间点向 所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后所述一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤中所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度；以及
(c)将步骤(b)中测量的所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度与有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的最小浓度比较，其中测量的浓度超过治疗所述肿瘤所需 的最小值表明所述患者可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
在另一方面，本发明提供了一种用于确定罹患神经变性疾病的患者是否将可能对使 用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使脑与优先结合于所述患者的脑细胞中存在的HSP90的病原性形式的放射性标 记的HSP90抑制剂接触；
(b)测量结合于样品中脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于样品中脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量与参考量比较；
其中步骤(b)中测量的结合于脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述患者将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
在另一方面，本发明提供了用HSP90抑制剂PU-H71治疗HSP90依赖性癌症的方 法。在特定实施例中，提供治疗HSP90依赖性癌症的方法以实现PU-H71的特定肿瘤暴 露。在其它实施例中，提供PU-H71的新颖给药方案。
在另一方面，本发明提供了一种用于确定患者中存在的人类癌症是否将可能对使用 HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含：
(a)获得含有来自患者癌症的细胞的样品，所述细胞仅仅表达HSP90蛋白质或除HSP70蛋白质外还表达HSP90蛋白质；
(b)针对步骤(a)中获得的所述样品中存在的所述细胞，评估至少一个以下参数的存在：活化AKT通路、PTEN肿瘤抑制因子功能或表达的缺陷、活化STAT5通路或 Bcl-xL蛋白质表达；以及
(c)将步骤(b)中获得的所述评估与步骤(b)中评估的相同参数对于来自对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的一个或一个以上癌症患者的人类癌细胞的预定参考 评估比较，以便由此确定所述患者的癌症是否将可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起 反应。
在一个实施例中，相当关注此特定方法的使用的人类癌症是乳癌、胰腺癌和急性骨 髓白血病。
用于评估每一参数的方法在所属领域中众所周知并且容易获得。然而，先前尚未展 示一个或一个以上这些特定参数与预测HSP90抑制剂功效的相关性。虽然理论上单个参数可足以能够使技术熟练的行业者预测任何既定HSP90抑制剂的功效，但更可能需要考 虑至少2个、或许至少3个或3个以上或甚至所有这些参数来对功效作一个可靠的预测。
附图说明
图1.PU-H71优先与在癌细胞中更丰富的HSP90的限定部分相互作用。(a)使用H9010(一种抗-HSP90抗体)的连续免疫纯化步骤耗尽MDA-MB-468细胞提取物中的 HSP90。溶解产物＝对照细胞提取物。(b)来自MDA-MB-468提取物的HSP90通过连 续的化学和免疫纯化步骤分离。每一池中HSP90的量都通过密度测定法定量并且值相对 于内标归一化。(c)在指示的细胞中用131I-PU-H71进行饱和度研究。对所有分离的细 胞样品计数并且确定131I-PU-H71的特定吸收。这些数据相对于131I-PU-H71的浓度绘图 以得到饱和结合曲线。呈现四个分开的重复研究的代表性数据(下图)。指示的细胞中 HSP90的表达通过蛋白质印迹法分析(上图)。(d)原代AML和CML CD34+脐带血细 胞(CB)或K562细胞用指示剂量的PU-H71预处理24小时。处理后的细胞用1μM PU-FITC处理。PU-FITC与细胞的结合通过流式细胞术评估并且表示为平均荧光强度 (MFI)。TEG-FITC作为非特异性结合对照展示。使用CD45对比SSC的门控将结合于 胚细胞或淋巴细胞与原代样品区分。(e)在指示剂量的PU-H71下原代AML和CML CD34+CB或K562细胞在处理后相对于未处理的对照的活力％。细胞活力通过在处理后 96小时膜联蛋白V/7-AAD染色来评估。数据呈现为平均值±SE(n＝3)。
图2.PU-H71对与癌蛋白和辅助伴随蛋白呈复合物的HSP90具有选择性且分离其。(a)K562提取物中的HSP90复合物通过用H9010(一种非特异性IgG)沉淀或通过 PU-H71-珠粒或对照珠粒分离。对照珠粒含有乙醇胺，一种HSP90惰性分子。下拉物(pull-down)中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。(b、c)如所指示的单一或连续的免疫 和化学沉淀在K562提取物中使用H9010和PU-珠粒以指示的频率和所示顺序进行。下 拉物中和剩余上清液中的蛋白质通过WB分析。NS＝非特异性。(d)K562细胞用媒剂 (-)或PU-H71(+)处理24小时，并且通过蛋白质印迹法分析蛋白质。(e)Hsp70敲减 的细胞中蛋白质的表达通过蛋白质印迹法(左图)分析并且蛋白质水平的变化以相对发 光单位(RLU)呈现(右图)。对照＝零乱siRNA。(f)如所指示的单一或连续的化学沉 淀在K562提取物中使用GM-珠粒、SNX-珠粒和NVP-珠粒以指示的频率和所示顺序进 行。下拉物中和剩余上清液中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。(g)K562细胞中的 HSP90以与异常Bcr-Abl和正常c-Abl蛋白质的复合物存在。PU-H71，而不是H9010， 选择Bcr-Abl癌蛋白结合的HSP90群体。
图3.(a、b)来自乳癌和CML细胞提取物(120μg)的HSP90通过如所指示的连 续的化学和免疫纯化步骤分离。分离上清液以分析留下的HSP90。每一部分中的HSP90 通过蛋白质印迹法分析。溶解产物＝内源蛋白内含物；PU-珠粒、GM-珠粒和对照珠粒指 示在特定珠粒上分离的蛋白质。H9010和IgG指示通过特定Ab分离的蛋白质。对照珠 粒含有一种HSP90惰性分子。数据与从多个重复实验(n≥2)中获得的数据一致。(c) PE结合抗体对比PU-H71-FITC的HSP90结合。在数据条上方指示每一细胞系通过 PU-H71分离的总细胞HSP90百分比。(d)在外周血白血球(PBL)提取物(250μg) 中进行连续的化学和免疫纯化步骤以分离PU-H71和H9010特异性HSP90物质。所有样 品都通过蛋白质印迹法分析(上图)。PBL中HSP90的结合是通过流式细胞术使用 HSP90-PE抗体和PU-H71-FITC评估。FITC-TEG＝非特异性结合的对照(下图)。(e) 一组14种白血病细胞系中PU-H71-FITC(1μM)与HSP90的结合对比用PU-H71处理 后活力百分比的相关性：香住(Kasumi)-1、香住-4、KCL-22、REH、TF-1、KG-1、 HL-60、OCI-AML3、K562、MOLM-13、TUR、THP-1、U937和MV4-11。这些细胞中 总HSP90水平类似，如通过蛋白质印迹法显示(未图示)。
图4.(a)流式细胞术点图说明用于原代慢性骨髓白血病(CML)样品的门控策略 以区分胚细胞(CD45dim，红色圆圈)与非恶性淋巴细胞(蓝色圆圈)。(b)来自(a) 中所示的原代CML患者样品的CML胚细胞相对于正常淋巴细胞中PU-H71-FITC与 HSP90结合的比率。(c)(a)中所示的原代CML样品在指示时间点和指示剂量的 PU-H71处理后CML胚细胞(红色)或正常淋巴细胞(蓝色)相对于未经处理对照的活 力百分比。(d)流式细胞术点图显示用于原代慢性期CML(cpCML)样品的门控策略 以区分胚细胞(CD45dim，红色圆圈)与非恶性淋巴细胞(蓝色圆圈)，并且分析胚细 胞门(CD45dim，红色圆圈)内CD34+细胞(红色方块)的结合。基于7-AAD区分， CD45对比SSC点图对活细胞进行预先门控。(e)慢性期CML(cpCML)CD34+细胞和 正常淋巴细胞中PU-H71-FITC与HSP90结合的比率。(f)用1μM PU-H71-FITC或 TEG-FITC处理48小时后cpCML CD34+细胞(红色)和正常淋巴细胞(蓝色)相对于 未经处理对照的活力百分比。(g)来自正常脐带血、慢性期CML(cpCML)和胚细胞 期(bpCML)细胞(n＝5)的CD34+细胞和淋巴细胞中PU-H71-FITC与Hsp90结合的比 率。(h)用PU-H71(1μM)处理胚细胞和慢性CML CD34+细胞以及正常CD34+细胞 (来自脐带血；CB)48小时后相对于未经处理对照的活力百分比。图c、f和h中的细 胞活力通过膜联蛋白V/7-AAD染色评估。数据呈现为平均值±SE(n＝3)。
图5.(a)在正常细胞内，HSP90使细胞蛋白折叠和移位到其适当细胞区室(“管 家复合物”)中的进化守恒的管家功能需要HSP90的组成型表达。恶性转化时，细胞蛋 白质通过突变、机能亢进、滞留不正确的细胞区室中或其它方式被扰乱。这些功能上改 变的蛋白质的存在是起始和维持恶性表型所需的，并且正是这些癌蛋白被应激改变的 HSP90的子集(“致癌复合物”)特异性地维持。PU-H71特异性地结合于伴随癌蛋白 的HSP90部分(“致癌复合物”)。(b)使用PU-珠粒和对照珠粒以及H9010和IgG固 定的抗体，在K562细胞提取物中分离HSP90和其相互作用的辅助伴随蛋白。对照珠粒 含有一种HSP90惰性分子。(c)来自K562细胞提取物的HSP90通过三个连续的免疫纯 化步骤利用H9010HSP90特异性抗体分离。分离剩余上清液以分析留下的蛋白质。每一 部分中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。溶解产物＝内源蛋白内含物。数据与从多个重 复实验(n≥2)中获得的数据一致。
图6.GM和PU-H71对异常的蛋白质/HSP90物质具有选择性。(a)在实验中监测 Bcr-Abl和Abl结合的HSP90物质，其中用指示量的K562细胞溶解产物探测恒定体积 的PU-H71珠粒(80μL)(左图)，或者其中用指示体积的PU-H71珠粒探测恒定量的溶 解产物(1mg)(右图)。(b)(左图)PU-珠粒和GM-珠粒(80μL)识别SKMel28黑色 素瘤细胞提取物(300μg)中的HSP90-突变体B-Raf复合物，但无法与在正常结肠成纤 维细胞CCD18Co提取物(300μg)中发现的HSP90-WT B-Raf复合物相互作用。H9010 HSP90Ab识别两种HSP90物质。(c)在MDA-MB-468细胞提取物(300μg)中，PU- 珠粒和GM-珠粒(80μl)与HER3和Raf-1激酶相互作用，但不与非致癌性酪氨酸-蛋白 激酶CSK(一种c-Src相关酪氨酸激酶)和p38相互作用。(d)(右图)PU-珠粒(80μL) 与v-Src/HSP90相互作用，但不与c-Src/HSP90物质相互作用。为了促进c-Src(丰度低 于v-Src的一种蛋白质)检测，与v-Src转化的3T3细胞(250μg)相比，使用较高量的 表达c-Src的3T3细胞溶解产物(1,000μg)，此解释了在这些3T3细胞(溶解产物，3T3成纤维细胞对比v-Src 3T3成纤维细胞)中检测到的较高HSP90水平。溶解产物＝内源 蛋白内含物；PU-珠粒、GM-珠粒和对照珠粒指示在特定珠粒上分离的蛋白质。HSP90Ab 和IgG指示通过特定抗体分离的蛋白质。对照珠粒含有一种HSP90惰性分子。数据与从 多个重复实验(n≥2)中获得的数据一致。
图7.单一化学沉淀是在表达Bcr-Abl的CML细胞系(a)中和原代CML细胞提取 物(b)中用PU-珠粒和对照珠粒进行。下拉物中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。若 干Bcr-Abl裂解产物在原代CML样品中如所报导注释90。N/A＝不可得。
图8.若干HSP90抑制剂的结构。
图9.合成的热休克蛋白90(HSP90)的荧光配体含有异硫氰酸荧光素(FITC)、4- 硝基苯并[1,2,5]噁二唑(NBD)或红移染料磺酰罗丹明101(得克萨斯红(Texas Red)) 结合于PU-H71。
图10.所示反应方案的试剂和条件：(a)FITC、Et3N、DMF、室温、12小时、40％； (b)得克萨斯红磺酰氯、DMF、0-10℃、12小时、61％；(c)DMF、室温、20小时、 47％。
图11.所示反应方案的试剂和条件：(a)FITC、Et3N、DMF、室温、5小时、72％； (b)NBD-Cl、Et3N、DMF、室温、12小时、40％。
图12.所示反应方案的试剂和条件：(a)N-(3-溴丙基)-邻苯二甲酰亚胺、Cs2CO3、DMF、室温、34％；(b)水合肼、MeOH、CH2Cl2、室温、64％；(c)FITC、Et3N、DMF、 室温、12小时、74％；(d)NBD-Cl、Et3N、DMF、室温、12小时、42％。
图13.(A)在37℃下将MOLM-13细胞用指示的PU-H71-荧光衍生物(1μM)处 理4小时，并且通过流式细胞术来测量与活细胞的结合(DAPI阴性)。结合程度显示为 平均荧光强度(MFI)。(B)在37℃下将MOLM-13细胞用指示的PU-H71-荧光衍生物 (1μM)处理24小时。通过DAPI排除测定其活力。(C)将MOLM-13细胞用指示的 PU-H71-荧光衍生物(1μM)处理24小时。通过蛋白质印迹法分析HSP90客户蛋白mFLT3 和Raf-1的稳态水平。β-肌动蛋白用以针对相等的蛋白负荷归一化。
图14.(A)用PU-H71-FITC2染色的白血病细胞的共焦荧光显微镜术展示显著的 细胞内定位。(B)将原代急性骨髓白血病样品用指示剂量的PU-H71或媒剂(未经处理) 预先处理24小时。将处理后细胞用1μM PU-H71-FITC2或TEG-FITC处理。 PU-H71-FITC2和TEG-FITC与细胞的结合通过流式细胞术评估并且表示为平均荧光强 度(MFI)。TEG-FITC作为非特异性结合对照展示。CD45对比SSC的门控用以区分结 合于胚细胞(恶性细胞)或淋巴细胞(正常细胞)与原代样品。
图15.正常细胞(左图)和乳癌细胞(右图)中的PU-ANCA的荧光发射光谱。乳 癌细胞的光谱发射型态在约530nm波长下产生荧光发射峰，这是结合的PU-H71-ANCA 的代表性荧光发射。
图16.(a)来自健康供体(脐带血)和慢性和胚细胞期CML患者(分别是cpCML 和bpCML)的脐带血和CML胚细胞相对于正常淋巴细胞中的PU-H71-FITC与Hsp90 结合的比率。注意，对比与疾病进展有关的CML中的结合增加，未显著结合于来自健 康患者的脐带血。(b)用PU-H71(1μM)处理胚细胞和慢性CML CD34+细胞以及正常 CD34+细胞(来自脐带血；CB)48小时后相对于未经处理对照的活力百分比。细胞活 力通过膜联蛋白V/7-AAD染色来评估。数据呈现为平均±SE(n＝3)。(c)在一组19个 原代AML患者样品中用500nM PU-H71处理48小时后PU-H71-FITC(1μM)结合于 HSP90与活力百分比的相关性。每一点表示原代AML样品。每一实验至少进行一式两 份。这些细胞表达类似的总HSP90水平。
图17.异种移植分析表明体内高PU-FITC结合的AML样品对PU-H71处理的敏感 性。(a)体外PU-H71处理显示低和高PU-FITC吸收(b)的两个原代AML样品48小 时的活力百分比。活力通过膜联蛋白/7AAD分析测定。(b)来自异种移植动物的骨髓细 胞(对于图a中所示的AML样品)用人类特异性抗体染色以测定PU-FITC结合。PU-FITC 结合表示为人类(白血病)/鼠类(正常)的比率。(c)一周用75mg/kg PU-H71处理3 次，持续3周的动物中CD34+肿瘤细胞百分比。
图18.使用标记的PU-H71检测和定量“致癌HSP90”并且预测肿瘤细胞对HSP90 抑制剂的敏感性。(A)在一组胰腺癌和乳癌细胞系中用1μM PU-H71、SNX-2112或 NVP-AUY922处理48小时后PU-H71-FITC(1μM)结合于HSP90与活力百分比的相关 性。结合测量为各别癌细胞中PU-FITC吸收与参考细胞HSP90抗性白血病细胞HL60 中吸收(参见图D)的比率。(B)总肿瘤HSP90的表达通过蛋白质印迹法来测量并且 相对于PU-FITC结合绘图。(C)在一组胰腺癌和乳癌细胞系中用1μM PU-H71、 SNX-2112或NVP-AUY922处理48小时后的活力百分比相对于总肿瘤HSP90的表达绘 图。(D)在低结合和敏感性(HL-60)以及高结合和敏感性(MV4-11)AML细胞系中 PE结合的抗体对比PU-H71-FITC的HSP90结合。数据呈现为平均值±SE(n＝3)。
图19.PU-H71-FITC2结合于肿瘤细胞和参考HL-60白血病细胞的比率。可以通过与非反应性细胞的结合于PU-H71-FITC2的比率为约1.23到约2.07或低于2.07相比， 反应细胞的结合于PU-H71-FITC2的比率为约2.7到约5.87或超过5.87，来区分反应细 胞(>50％活力减少)与非反应性细胞(<50％活力减少)。
图20.EpCAM+循环肿瘤细胞中PU-H71-FITC2的累积：从全血分离的PBMC预先 用PU-FITC或对照(PU-FITC9、DMSO、1μM/2×106个细胞/毫升、4小时)处理。接 着细胞用CD45、CD14和EpCAM抗体染色。(A)对细胞门控以排除死细胞。接着对活 细胞门控以对比CD45+细胞测定EpCAM+。通过进一步以FSC，针对CD14，对CD45+ 细胞门控，将单核细胞从分析排除。(B)展示CD45+CD14-细胞(蓝色)和EpCAM+ 细胞(红色)的PU-FITC中值荧光强度(MFI)的直方图。EpCAM+细胞中药物的累积 计算为减去DMSO和PU-FITC9对照(用作非特异性和背景结合对照)的值后MFI EpCAM+/MFI CD45+CD14-(循环肿瘤细胞/白血球)的比率。
图21.展示不同Ly1克隆对PU-H71-FITC2的吸收并且表示为中值荧光强度。这些细胞对HSP90抑制剂的敏感性与其对标记的PU-H71的吸收有关。这些肿瘤细胞中总肿 瘤HSP90的表达通过蛋白质印迹法来测量(插图)。
图22(a-c).胰腺癌细胞中PU-H71结合和毒性的相关性。(A)活细胞中的结合； 将胰腺癌细胞(1×106个细胞)用PUFITC2(1μM)或对照[TEG-FITC(1μM)或DMSO] 处理6小时。将细胞用FACS缓冲液(PBS、0.05％FBS)洗涤两次，并且在分析前在室 温下在FACS缓冲液中用1μg/ml DAPI(英杰公司(Invitrogen))染色。通过流式细胞 术(LSR-II，碧迪生物科学公司(BD Biosciences))获得表示PU-H71-荧光衍生物结合 的来自活细胞(DAPI阴性)的荧光强度，并且通过FlowJo软件(俄勒冈州亚什兰的树 星公司(Tree Star,Ashland,OR))分析。值表示减去DMSO和TEG-FITC对照的平均荧 光强度。(B)毒性：将胰腺癌细胞(1×106个细胞)用PU-FITC2(1μM)处理48小时。 将细胞用FACS缓冲液(PBS、0.05％FBS)洗涤两次，并且在室温下在FACS缓冲液中 用1μg/ml DAPI(英杰公司)染色并通过流式细胞术(LSR-II，碧迪生物科学公司)获 得。值表示相对于来自DMSO对照的值归一化的活细胞(DAPI阴性)％。(C)相关分 析；从A和B中获得的MFI和毒性分别在x和y轴上绘图并且进行相关线性回归分析。
图23.(A)PUH71-FITC2与白血病干细胞(LSC，CD34+CD38-CD45dim)的结合。 将原代AML样品与1μM PU-H71-FITC2在37℃下一起培育4小时。细胞用CD34、 CD38、CD45和7-AAD染色，接着进行流式细胞术分析。PU-H71与LSC的结合显示为 活细胞(7-AAD阴性)中的平均荧光强度(MFI)。(B)在用1μM PUH71处理48小时 后LSC相对于来自三个原代AML样品的未经处理对照的活力百分比。细胞在膜联蛋白 V和7-AAD染色前用CD45、CD34和CD38染色。LSC活力通过流式细胞术来测量并 且确定为CD45dim CD34+CD38-门的膜联蛋白V-/7AAD-百分比。
图24.肿瘤的不同的[124I]-PU-H71吸收指示其“致癌HSP90”含量有差异，因此其对HSP90疗法的反应有差异。若干乳癌患者中[124I]-PU-H71注射后24小时的 [124I]-PU-H71PET影像测量为最大标准化吸收值(SUVmax)。BC＝乳癌。TNBC-三 阴性BC。
图25.如通过PET测定，在投予[124I]-PU-H71后，对HSP90抑制疗法起反应的选 定数目的患者的肿瘤:肌肉SUV比率。这些患者中，肿瘤:肌肉SUV随时间推移而增加。 呈现针对若干阳性和阴性肿瘤平均的值。
图26.患有套细胞淋巴瘤的患者的FDG/CT和[124I]-PU-H71 PET/CT。患者展示在注射[124I]-PU-H71后30分钟清晰可见病变。在后期(3.5-24小时和24小时以上)在此肿 瘤中未看见[124I]-PU-H71吸收。
图27.两个指示的淋巴结(LN)中复发性乳癌患者的[124I]-PU-H71 PET/CT。对[124I]-PU-H71注射后若干时间(0.1、0.4、0.6、3.5和21.4小时)的PET定量，并且对 于10mg/m2的PU-H71的投予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUVmax数据转变为 HSP90i浓度。还计算在0到24小时的时间内两个肿瘤对PU-H71的暴露并且表示为曲 线下面积(AUC)。CT(左)、PU-PET/CT(中间)和FDG-PET/CT联合(右)经轴影 像显示在一个患病淋巴结而不是在另一个中的[124I]-PU-H71-亲合力，表明气管支气管左 前角淋巴结(TAALN)中的病变对HSP90疗法起反应的可能性低于气管支气管左角LN (TALN)。
图28.用124I-PU-H71 PET对三阴性乳癌患者成像。在注射后20分钟，吸收在肺肿块(左箭头)和骨头病变(右箭头)中显著(A)，但在24小时，仅在肺病变中看见吸 收(B)。肺和骨头肿瘤都通过CT和FDG-扫描确认(C)。患者开始用HSP90抑制剂 STA-9090处理。HSP90抑制剂处理后二十天，如通过CT和FDG-PET两者证明，肺而 不是骨头病变的尺寸明显下降(D)。
图29.气管旁淋巴结中转移性HER2乳癌患者的[124I]-PU-H71 PET/CT。 [124I]-PU-H71后或[124I]-PU-H71与10mg/m2PU-H71共注射后的指示时间的PET影像测 量为最大标准化吸收值(SUVmax)。对于10mg/m2的PU-H71的投予剂量，将针对 [124I]-PU-H71获得的SUV数据转变为HSP90i浓度。还计算在0到48小时的时间内两 个肿瘤对PU-H71的暴露并且表示为曲线下面积(AUC)。在共注射[124I]-PU-H71/PU-H 71 后如从[124I]-PU-H71 PET估计或如从[124I]-PU-H71 PET测定的PU-H71的肿瘤浓度(以 微摩尔值为单位)是相当的。
图30.[124I]-PU-H71 PET是一种用于HSP90抑制剂的非侵入性分析。(a)PU-H71 和[124I]-PU-H71的化学结构。(b)MDA-MB-468肿瘤负载小鼠中[124I]-PU-H71的代表 性PET扫描。肿瘤的位置由红色箭头指示。(c)投予后指示时间的[124I]-PU-H71肿瘤对 器官活性浓度比率。(d)MDA-MB-468肿瘤和血浆(n＝5)中[131I]-PU-H71的生物学分 布。肿瘤-S和肿瘤-L分别是小的和大的肿瘤。(插图)使用如在GraphPad Prism中实施 的线性回归曲线拟合，分析PU-H71从肿瘤的24到140小时缓慢终末清除期。
图31.[124I]-PU-H71 PET准确地预测肿瘤中治疗有效PU-H71浓度的递送。(a)预测的PU-H71肿瘤分布基于由[124I]-PU-H71 PET产生的平均％ID/g(下图)。投予指示 PU-H71剂量后指示时间的预测肿瘤浓度(上图)。(b)在投予75mg/kg药剂后的肿瘤 PU-H71浓度(n＝5)如通过[124I]-PU-H71 PET预测，并且在共注射[124I]-PU-H71和PU-H71 后由LC-MS/MS测定并由[124I]-PU-H71 PET测定。(c、d)以指示剂量投予PU-H71并 在投予后24小时分析的MDA-MB-468肿瘤(c)以及用指示浓度的PU-H71处理24小 时的MDA-MB-468细胞(d)的代表性蛋白质印迹分析。印迹(n＝3)由密度测定法定 量并且蛋白质水平的变化相对于PU-H71的浓度绘图(右图)。(e、f)在示踪量的 [124I]-PU-H71与指示剂量的PU-H71混合进行共投予后如通过[124I]-PU-H71 PET预测的 投予后24小时标靶占有率。
图32.[124I]-PU-H71PET预测HSP90疗法的有效剂量方案的设计。(a)当以一周3 次(星期一-星期三-星期五，星期六/星期天中断)的时程以指示剂量投予2周时基于由[124I]-PU-H71PET获得的平均肿瘤活性浓度(％ID/g)预测的PU-H71肿瘤分布。(插图) 肿瘤中PU-H71的AUC使用GraphPad Prism计算。(b)用指示剂量的PU-H71处理48 小时的MDA-MB-468细胞的活力通过溴化乙锭/吖啶橙染色分析(上图)。通过 [124I]-PU-H71PET估计的诱发的肿瘤细胞凋亡预测指示的平均和最小PU-H71肿瘤浓 度。(c)以一周3次的时程向MDA-MB-468肿瘤负载小鼠(n＝5)腹膜内投予指示剂 量的PU-H71。肿瘤体积和小鼠重量在指示的处理时间内监测。(d)以一周3次的时程 向MDA-MB-468肿瘤负载小鼠(n＝5)腹膜内投予指示剂量的PU-H71。肿瘤体积和小 鼠重量在指示的处理时间内监测。(e)当以一周3次(星期一-星期三-星期五，星期六/ 星期天中断)的时程以指示剂量投予时，基于由[124I]-PU-H71PET获得的平均肿瘤活性 浓度(％ID/g)预测的PU-H71肿瘤分布。(f)在星期四，即上次剂量投予后24小时处 死的经媒剂(对照)和PU-H71(5mg/kg)处理的肿瘤的蛋白质印迹分析。针对每一肿 瘤指示如由LC-MS/MS测定的PU-H71肿瘤浓度。(g)来自图(d)的数据分析(n＝5)。
图33.[124I]-PU-H71 PET预测HSP90疗法的有效时程方案的设计。(a)当以指示的时程以75mg/kg投予时，基于由[124I]-PU-H71 PET获得的平均肿瘤活性浓度(％ID/g) 的预测的PU-H71肿瘤分布。(b)如从体外分析预测，通过指示的平均和最小PU-H71 肿瘤浓度估计的诱发的肿瘤细胞凋亡。(c)以指示的时程向MDA-MB-468肿瘤负载小 鼠(n＝5)腹膜内投予PU-H71(75mg/kg)。肿瘤体积和小鼠重量在指示的处理时间内 监测。以一周1次的时程，在星期四给药，在上次剂量投予后24小时处死，以及在星 期四给药，在上次剂量投予后96小时处死得到的经PU-H71(75mg/kg)处理的肿瘤的 蛋白质印迹(d)和LC-MS/MS分析(e)。对照；仅媒剂处理的小鼠。
图34.针对患有转移到肺的疾病的胰腺患者和指示的淋巴结，如通过PU-PET预测的肿瘤对PU-H71的暴露。肿瘤浓度是基于20mg/m2的投予剂量计算。血浆暴露也以 红色展示。时间0到192小时的计算的AUC(μM-h)列表在右侧。
图35.肺中患有复发性疾病的胰腺癌患者的[124I]-PU-H71 PET/CT。对[124I]-PU-H71 注射后指示时间(48和196小时，左图)的PET影像定量，并且对于PU-H71的指示投 予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUV数据转变为肿瘤中的PU-H71浓度。还计算以 一周两次(星期二和星期五)的时程和20、60和80mg/m2的投予剂量(右上图和下图) 处理两周的两个肿瘤(一个在左肺并且另一个在右肺门LN)在0到336小时的时间内 对PU-H71的暴露，并且表示为曲线下面积(AUC)并且为平均肿瘤浓度。
图36.图A展示如从PU-PET中获得的在乳癌患者的肿瘤中0到72小时内的 124I-PU-H71的生物学分布。数据用以模拟当在周末中断下一周两次持续两周，在周末中 断下一周三次持续两周，在周末中断下一周一次持续两周，以及在周末中断下一周五次 持续两周给予时肿瘤对10mg/m2的投予剂量的暴露。
图37.[124I]-PU-H71 PET预测对HSP90疗法的反应程度。(a)当以指示剂量和指示时程投予时PU-H71对肿瘤HSP90位点的预期平均占有率。(b、c)在GraphPad Prism 中分析肿瘤HSP90位点占有率与观测到的抗肿瘤作用的相关性。
图38.124I-PU-H71 PET分析在HSP90抑制剂的临床开发中的用途：(a)测定实现 有效肿瘤浓度所需的HSP90抑制剂的剂量、选择适于HSP90疗法的患者和设计有效的 剂量和时程方案；(b)分析递送到肿瘤的药物的实际浓度并且预测HSP90疗法的临床结 果；以及(c)测定“最大肿瘤剂量”。CR＝完全反应，PR＝部分反应，NR＝无反应。
图39.MDA-MB-468异种移植TNBC小鼠中[124I]-PU-DZ13和[124I]-PU-H71的体内PET成像。在R4或Focus 120专用小动物PET扫描器(田纳西州诺克斯维尔的康科德 微系统公司(Concord Microsystems,Inc.,Knoxville,TN))上进行PET成像；在专用小 动物CT扫描器(田纳西州橡树岭的爱姆替科公司(ImTek,Inc.,Oak Ridge,TN))上， 使用专用立体定向约束装置进行分开的解剖成像。CT和PET影像数据集的最大强度投 影(MIP)在解剖学上记录，并且使用PET和CT数据的阿尔法透明掺合产生重叠影像。
图40.BC的情况展示对PU-H71的剂量依赖性反应。当肿瘤对PU-H71高度敏感时 H&E染色的载片显示含有核浓缩细胞(指示早期细胞凋亡)与核破裂细胞(表示晚期 细胞凋亡)的细胞凋亡显著区域。(A)对用指示浓度的PU-H71处理48小时的TNBC 样品中细胞凋亡/细胞死亡定量并且相对于PU-H71的浓度绘图。细胞凋亡与坏死性/晚 期细胞凋亡细胞都进行计数并且添加到如y轴上描绘的细胞凋亡％。注意，在三个敏感 性群组中的一连串情况(最陡峭的上部曲线，最敏感，LN15和LN16；中间曲线，敏感， PT12、PT17、PT25、PT28和LN10；以及下部曲线，不太敏感、PT10、PT15、PT16和 PT30)。有趣地，淋巴结转移展示在同等剂量下比原发性肿瘤敏感性高。PT＝原发性肿 瘤，LN＝淋巴结。对PU-H71最敏感的肿瘤也针对p-Akt高度染色。(B)与(A)相同， 使用来自用PU-H71处理24或48小时的HER2+、TNBC和ER+BC患者的样品。
图41.对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性与细胞存活对AKT-和STAT-通路而不是MEK-通路的依赖性有关。(A)、(B)代表性AML细胞与指示浓度的HSP90、AKT、JAK 和MEK抑制剂一起培育指示的时间，并且使用吖啶橙/溴化乙锭方法评估细胞凋亡。数 据与从多个重复实验(n≥3)中获得的数据一致。点，平均值；棒，标准偏差。(C)来 自仅仅用AKTi、MEKi和JAKi处理72小时的细胞的细胞凋亡％值相对于在HSP90抑 制剂处理后获得的值绘图，并且如Prism 4.0中实施，进行线性回归分析。
图42.具有最高水平p-STAT5的AML原代细胞也对PU-H71最敏感。(A)胚细胞 中磷酸化STAT5水平(CD45dim门控)表示为三个不同原代AML样品的平均荧光强度 (MFI)。Stat5的磷酸化水平通过流式细胞术评估。(B)在用1μM PUH71处理48小时 后AML胚细胞相对于来自三种原代AML样品的未经处理对照的活力百分比。细胞在膜 联蛋白V和7-AAD染色前用CD45染色。AML胚细胞的活力通过流式细胞术来测量并 且确定为针对AML胚细胞的CD45dim对比SSC门的膜联蛋白V-/7AAD-百分比。
图43.向8-10月龄的3xTg小鼠投予(A)75mg/kg或(B)指示剂量的HSP90抑 制剂PU-HZ151并且在投予后24小时，在海马区(在此AD模型中受折磨的脑部区)中 测量PD标记物HSP70。当HSP90被抑制时诱发HSP70，并且其诱发指示治疗水平的 HSP90抑制剂递送到相关的脑部区域。(C)在投予50mg/kg PU-HZ151后通过LC-MS/MS 测定指示的脑部区域和血浆中HSP90抑制剂的水平。在单次腹膜内注射后不同时间的 Hsp90抑制剂水平以微摩尔单位展示。脑暴露也测量为曲线下面积(AUC)。
图44.PU-H71对HSP90具有选择性。(A)若干HSP90抑制剂珠粒下拉物的考马斯 染色凝胶(Coomassie stained gel)。将K562溶解产物(60μg)与25μL指示珠粒一起 培育。用指示的缓冲液洗涤后，下拉物中的蛋白质施加于SDS-PAGE凝胶。(B)PU-H71 (10μM)在scanMAX筛(阿姆比特公司(Ambit))中针对359种激酶测试。呈现PU-H71 的TREEspotTM相互作用图。仅SNARK(NUAK家族SNF1-样激酶2)(激酶树上的红点) 表现为靶向小分子的潜在低亲和力激酶。
具体实施方式
5.1.作为肿瘤特异性生物标记物的致癌HSP90
本发明证明了不仅仅是由HSP90表达决定的此具体“致癌HSP90”物质的丰度预 测对HSP90抑制疗法的敏感性并且因此是HSP90疗法的生物标记物。本发明还证明了 鉴别和测量肿瘤内此致癌HSP90物质的丰度预测对HSP90疗法的反应。
在以下部分中，展示HSP90抑制剂PU-H71靶向肿瘤富集的HSP90复合物和以亲 和力捕获HSP90依赖性致癌客户蛋白。化合物PU-H71在以引用的方式并入本文中的美 国专利第7,834,181号中公开。PU-H71具有以下化学结构：
Figure BDA0001717339850000211
PU-H71可以呈游离碱或呈医药学上可接受的盐的形式投予。
此外，展示不仅仅由HSP90表达决定的富集PU-H71的HSP90物质的丰度可预测 细胞对使用PU-H71和其它HSP90抑制剂进行的HSP90抑制的敏感性。
5.1.1.癌细胞中非均质HSP90呈现
为了研究小分子HSP90抑制剂与肿瘤HSP90复合物的相互作用，利用共价连接于格尔德霉素(geldanamycin，GM)或PU-H71(分别是GM-珠粒和PU-珠粒)的琼脂糖 珠粒(图1、2)。化学上不同的药剂GM与PU-H71都通过结合于HSP90的N端区域 调节袋而与其相互作用并且抑制其35。为了比较，还产生偶联于抗-HSP90抗体(H9010) 的G蛋白琼脂糖-珠粒。
首先，评估这些药剂与乳癌和慢性骨髓白血病(CML)细胞溶解产物中HSP90的 结合。利用H9010而不是利用非特异性IgG的四个连续的免疫沉淀(IP)步骤有效地耗 尽来自这些提取物的HSP90(图1a，4×H9010并且未展示)。相比之下，利用PU-珠粒 或GM-珠粒的连续下拉仅移除总细胞HSP90的一小部分(图1b、3a、3b)。确切地说， 在MDA-MB-468乳癌细胞中，合并的PU-珠粒部分代表总细胞HSP90池的20-30％，并 且进一步添加新鲜PU-珠粒等分试样无法使溶解产物中的剩余HSP90沉淀(图1b，PU- 珠粒)。此PU耗尽的剩余HSP90部分虽然难以接近小分子，但对H9010维持亲和力(图 1b，H9010)。由此推断出，MDA-MB-468细胞提取物中显著部分的HSP90仍然呈原来 构象，而不是与PU-H71反应。
为了排除细胞溶解产物中HSP90配置的变化使得无法结合于固定PU-H71而不是抗体的可能性，分析完整癌细胞中放射性标记的131I-PU-H71与HSP90的结合(图1c，下 图)。131I-PU-H71和PU-H71的化学结构一致：PU-H71含有稳定的碘原子(127I)，而 131I-PU-H71含有放射性碘；因此，同位素标记的131I-PU-H71具有与未标记的PU-H71 一致的化学和生物特性。在若干癌细胞系中131I-PU-H71与HSP90的结合在每个细胞虽 不同但明确的数目的位点变得饱和(图1c，下图)。定量MDA-MB-468细胞中PU-H71 结合的细胞HSP90的分数。首先，确定HSP90占这些细胞中总细胞蛋白的2.66-3.33％， 这是与其它肿瘤细胞中报导的HSP90丰度接近一致的值33。约41.65×106个MDA-MB-468 细胞溶解，得到3875μg蛋白质，其中103.07-129.04μg是HSP90。因此，一个细胞含 有(2.47-3.09)×10-6μg、(2.74-3.43)×10-11μmol或(1.64-2.06)×107个分子的HSP90。在 MDA-MB-468细胞中，131I-PU-H71结合至多5.5×106个可用的细胞结合位点(图1c，下 图)，这占到总细胞HSP90的26.6-33.5％(计算为5.5×106/(1.64-2.06)×107×100)。此值非 常类似于由细胞提取物中PU-珠粒下拉物得到的值(图1b)，证实了PU-H71结合于 MDA-MB-468细胞中一小部分的HSP90，占到总HSP90池的约30％，并且验证了PU- 珠粒有效地分离此池的用途。在K562和其它建立的t(9；22)+CML细胞系中，PU-H71 结合总细胞HSP90的10.3-23％(图1c、3b、3c)。
然后，将研究延伸到若干原代白血病细胞和正常血液细胞。其中有原代慢性和胚细 胞期CML和急性骨髓白血病(AML)样品，它们含有胚细胞(恶性细胞群体)和淋巴 细胞(正常细胞群体)、从健康供体的脐带血分离的CD34+细胞、来自外周血的总单核 细胞以及外周血白血球(PBL)(图1c-e、3、4)。使用荧光素标记的PU-H71(PU-FITC)。 此化学工具允许在非均质细胞群体中对PU-H71结合于不同的细胞群体使用细胞表面标 记物进行流式细胞术分析以及研究细胞对PU-H71的敏感性。四乙二醇衍生的FITC (FITC-TEG)用作非特异性结合对照(图1d)。
PU-H71分别以116、201和425nM的半相对结合亲和力(EC50)有效地结合于k562 细胞中以及CML和AML胚细胞中的HSP90(图1d)。相比之下，其对正常血液细胞的 亲和力较弱，其中EC50高于2,000nM(图1d、3d)。如实质上结合于HSP90抗体所指 示，HSP90保持在这些正常血液细胞中高度表达(图3d)。
对PU-H71具有最高亲和力的细胞也对被药剂杀死最敏感(图1e、3e、4)。当在一 组CML和AML细胞系和原代样品中评估时，注意到PU-H71结合HSP90的能力与 PU-H71针对这些细胞的细胞杀死能力的显著相关性(图3e、4)。
总起来说，这些数据展示例如PU-H71等某些HSP90抑制剂优先结合于在癌细胞中比在正常细胞中更丰富的HSP90物质子集(图5a)。不仅仅由HSP90表达水平决定的此 HSP90物质的丰度可预测细胞对HSP90抑制的敏感性，因此此肿瘤HSP90物质的丰度 可用作一种可预测对HSP90疗法的反应的生物标记物。
5.1.2.癌蛋白和野生型蛋白质结合的HSP90物质共同存在于癌细胞中，但PU-H71选择癌蛋白/HSP90物质
为了研究与这些HSP90物质有关的生物化学功能，分别用抗体-珠粒和HSP90抑制剂-珠粒进行免疫沉淀(IP)和化学沉淀(CP)，并且分析在这些环境中结合的HSP90 与所选择的已知客户蛋白子集共同沉淀的能力。首先研究K562CML细胞，因为此细胞 系共表达异常的Bcr-Abl蛋白质(一种组成性活性的激酶)和其正常相应物c-Abl。此两 种Abl物质通过分子量可清楚地分离，因此通过蛋白质印迹法是容易区别的(图2a，溶 解产物)，这有助于在相同细胞环境下对HSP90致癌和野生型(WT)客户蛋白的分析。 注意到，H9010而不是非特异性IgG分离呈与Bcr-Abl和Abl形成复合物的HSP90(图 2a、5c，H9010)。免疫沉淀的Bcr-Abl和Abl(图2a、2b，左图，H9010)与在上清液 中剩余的每一蛋白质的部分(图2b，左图，剩余上清液)比较，指示抗体不优先地富集 K562细胞中结合于Abl的突变或野生形式的HSP90。
相比之下，PU结合的HSP90优先地分离Bcr-Abl蛋白质(图2a、2b，右图，PU- 珠粒)。在PU-珠粒耗尽HSP90/Bcr-Abl物质(图2b，右图，PU-珠粒)后，H9010使 剩余HSP90/Abl物质沉淀(图2b，右图，H9010)。在实质上饱和条件(即过量溶解产 物，图6a，左图，以及珠粒，图6a，右图)下PU-珠粒保留对HSP90/Bcr-Abl物质的选 择性。因为进一步确认了PU-H71对Bcr-Abl/HSP90物质的生物化学选择性，所以Bcr-Abl 对被PU-H71降解比Abl敏感得多(图2d)。PU-H71对异常Abl物质的选择性延伸到其 它建立的t(9；22)+CML细胞系(图7a)以及原代CML样品(图7b)。
5.1.3.癌蛋白而不是野生型蛋白质结合的HSP90物质最依赖于HSP90的客户蛋白调节的辅助伴随蛋白募集
为了进一步区分PU-H71相关的HSP90部分与抗体相关的HSP90部分，进行连续 的耗尽实验并且评估两种物质的辅助伴随蛋白支持者32。含有HSP90/Bcr-Abl复合物的 HSP90部分结合若干辅助伴随蛋白，包括Hsp70、Hsp40、HOP和HIP(图2c，PU-珠 粒)。PU-珠粒下拉物也富集若干额外的HSP90辅助伴随蛋白物质。这些发现强烈地表 明PU-H71识别辅助伴随蛋白结合的HSP90。虽然在溶解产物中检测到展示包括 HSP90/Abl物质的PU-珠粒耗尽的剩余HSP90池丰富的表达(图2c，剩余上清液)，但 其不与辅助伴随蛋白有关(图2c，H9010)。然而，通过H9010在总细胞提取物中分离 辅助伴随蛋白(图5b、5c)。
这些发现表明存在优先结合于CML细胞中的Bcr-Abl或Abl的不同的HSP90池(图2)。H9010结合于含有Bcr-Abl与Abl的HSP90物质，而PU-H71对Bcr-Abl/HSP90物 质具有选择性。数据也表明当HSP90调节异常(即Bcr-Abl)而不是正常(即Abl)蛋 白质的活性时，HSP90可能更高程度地利用和需要经典辅助伴随蛋白Hsp70、Hsp40和 HOP(图5a)。依照此假设，发现在K562细胞中Bcr-Abl比Abl对Hsp70(一种HSP90 辅助伴随蛋白)的敲减更敏感(图2e)。
5.1.4.癌蛋白/HSP90物质选择性和PU-H71捕集复合物的能力不是所有HSP90抑制剂共享的
然后评估与HSP90的N端调节袋以类似于PU-H71的方式相互作用的其它抑制剂(包括合成抑制剂SNX-2112和NVP-AUY922)以及天然产物GM35是否可以选择性地分 离类似HSP90物质(图2f)。SNX-珠粒显示对Bcr-Abl/HSP90的选择性，而NVP-珠粒 行为类似于H9010并且不区分Bcr-Abl/HSP90与Abl/HSP90物质(分别参见SNX-珠粒 对比NVP-珠粒；图2f)。虽然GM-珠粒也识别细胞溶解产物中HSP90亚群(图3a)， 但其在共沉淀Bcr-Abl方面远不如PU-珠粒有效(图2f，GM-珠粒)。先前报导GM在捕 集HSP90/客户蛋白复合物方面类似的低效36。
5.1.5.癌蛋白/HSP90物质选择性和PU-H71捕集复合物的能力不局限于 Bcr-Abl/HSP90物质
为了确定对癌蛋白的选择性不局限于Bcr-Abl，在其它肿瘤细胞系中测试了若干额 外的明确的HSP90客户蛋白(图6b-d)37,38。与K562细胞中的结果一致，H9010使与 在SKMel28黑色素瘤细胞中表达的突变B-Raf与在CCD18Co正常结肠成纤维细胞中表 达的WTB-Raf形成复合物的HSP90沉淀(图6b，H9010)。然而，PU-珠粒和GM-珠粒 选择性地识别HSP90/突变B-Raf，展示几乎不识别HSP90/WT B-Raf(图6b，PU-珠粒 与GM-珠粒)。然而，如K562细胞中的情况一样，GM-珠粒在共沉淀突变客户蛋白方面 远不如PU-珠粒有效。对于其它HSP90客户蛋白，获得类似的结果(图6c、6d)。
总之，PU-H71富集多种参与CML中恶性表型所不可缺少的信号传导通路的蛋白质。原代CML样品中保留PU结合的HSP90与异常CML信号复合体的相互作用。
5.1.6.PU-H71鉴别的蛋白质和网络是对恶性表型重要的蛋白质和网络
假设，PU-珠粒下拉物中这些蛋白质的存在在功能上是重要的并且表明HSP90在CML细胞中广泛支持恶性信号复合体的作用。
为了显示由PU-珠粒鉴别的网络对K562中的转化是重要的，接下来展示来自个别网络Bcr-Abl、NFκB、mTOR、MEK和CAMIIK)的关键结点蛋白质的抑制剂降低K562 细胞的生长和增殖潜力。
接下来显示PU-珠粒鉴别的还没有在CML中分配作用的HSP90相互作用物也有助于转化表型。在来自CML细胞系和原代CML细胞的PU-珠粒下拉物中验证组蛋白-精 氨酸甲基转移酶CARM1(许多基因的转录辅助活化剂57)。这是第一次报导的HSP90 与CARM1之间的联系，不过例如PRMT5等其它精氨酸甲基转移酶已经展示是卵巢癌 细胞中的HSP90客户蛋白58。虽然提高的CARM1水平与前列腺癌和乳癌的发展相关， 但对CARM1在CML白血病生成中的重要性知之甚少57。发现CARM1基本上完全被 PU-珠粒识别的HSP90物质捕获并且也对PU-H71的降解作用敏感。因此，CARM1可 能是CML中一种新颖的HSP90癌蛋白。实际上，使用CARM1而不是对照shRNA的敲 减实验显示，K562中而不是正常CD34+细胞中活力和细胞凋亡诱发减少(未展示)，支 持了此假设。qPCR数据证实两种不同的shRNA明显地降低CARM1mRNA水平(数据 未展示)。
为了显示PU-下拉物中蛋白质的存在是由于其参与异常活化信号传导而不仅仅是其 丰富的表达，将来自K562和Mia-PaCa-2(一种胰腺癌细胞系)的PU-珠粒下拉物进行 比较。虽然两种细胞表达高水平的STAT5蛋白质，但如STAT5磷酸化和DNA结合59所显示，STAT5通路的活化仅在K562细胞中注意到。因此，此蛋白质仅在k562PU-珠 粒下拉物中鉴别到。相比之下，活化的STAT3在来自K562和Mia-PaCa-2细胞提取物 的PU-HSP90复合物中鉴别到。
在K562和Mia-PaCa-2细胞两者中mTOR通路由PU-珠粒鉴别，并且实际上，PP242(一种靶向mTOR的ATP域的选择性抑制剂60)对它的药理学抑制对两种细胞来说是有 毒的。另一方面，Abl抑制剂格列卫(Gleevec)61只对K562细胞有毒。两种细胞都表 达Abl，但只有K562具有致癌Bcr-Abl并且PU-珠粒鉴别K562中而不是Mia-PaCa-2细 胞中的Abl，与Bcr-Abl一样。
5.1.7.PU-H71鉴别致癌STAT-活化的新颖机制
PU-珠粒下拉物含有若干蛋白质，包括在CML白血病生成中组成性活化的 Bcr-Abl41、CAMKIIγ52、FAK53、vav-162和PRKD248。这些是经典的HSP90调节客户蛋 白，其稳定性取决于HSP90，因为其稳态水平在HSP90抑制后降低32,33。STAT3和STAT5 的组成性活化也在CML中报导41,46。然而，这些蛋白质不符合经典HSP90客户蛋白的 标准，因为STAT5和STAT3水平在HSP90抑制后保持基本上不改变。PU-下拉物也含 有可能作为活性信号传导的强效复合物一部分分离的蛋白质，例如mTOR、VSP32、 VSP15和RAPTOR44。如通过p-mTOR的细胞水平来测量的mTOR活性也似乎对HSP90 抑制比复合物组分更敏感(即比较PU-H71处理的细胞中p-mTOR和RAPTOR的相对减 少。此外，PU-HSP90复合物含有衔接蛋白质，例如GRB2、DOCK、CRKL和EPS15，这 些蛋白质将Bcr-Abl与K562中多个异常活化的信号传导通路的关键效应物联系起来30,41。 其表达在HSP90抑制后也保持不变。因此，想知道HSP90对某些致癌通路的影响是否 延伸超过其经典的折叠作用。确切地说，展示HSP90也充当一种维持信号传导复合物呈 其活性配置的架构分子，如先前所假定40,63。
5.1.8.HSP90结合于并且影响STAT5的构象
为了研究此假设，进一步地，集中于STAT5，STAT5在CML中组成性磷酸化64。 p-STAT5的总水平由磷酸化和去磷酸化事件的平衡决定。因此，K562细胞中高水平的 p-STAT5可能反映上游激酶活性的增加或蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)活性的降低。 HSP90与p-STAT5之间的直接相互作用也可以调节p-STAT5的细胞水平。
为了剖析这些潜在机制的相对影响，首先研究PU-H71对调节K562细胞中STAT5 磷酸化的主要激酶和PTPase的作用。Bcr-Abl在不需要JAK磷酸化下直接活化STAT564。 相应地，在Bcr-Abl抑制剂格列卫存在下STAT5-磷酸化迅速减少。虽然HSP90调节 Bcr-Abl稳定性，但在HSP90抑制后稳态Bcr-Abl水平的降低需要3小时以上65。如CRKL 磷酸化未减少所证明，在PU-H71下在其使p-STAT5水平降低的时间间隔内实际上 Bcr-Abl表达或功能无变化。此外，注意到HCK(经Bcr-Abl66转染的32Dcl3细胞中STAT5 的一种激酶活化剂)的活性和表达无变化。
因此，在0到90分钟时间间隔内PU-H71使p-STAT5磷酸化的减少不可能由Bcr-Abl或其它激酶的不稳定来解释。
因此，检验在PU-H71存在下p-STAT5水平的迅速降低是否可以由PTPase活性增 加来解释。在此时间间隔内SHP2(主要的细胞溶质STAT5磷酸酶67)的表达和活性也 未改变。类似地，形成切断STAT-信号传导的负反馈环61的SOCS1和SOCS3的水平不 受PU-H71影响。
因此，在0-90分钟时间间隔内对STAT5无作用可能归于在HSP90抑制后对STAT5 的激酶或磷酸酶活性变化。作为替代性机制，并且因为大部分p-STAT5而非STAT5是 CML细胞中HSP90结合的，所以假设活化STAT5的细胞水平通过直接结合于HSP90 而微调。
STAT的活化/不活化循环需要其在不同二聚体构象之间转换。STAT的磷酸化存在于 在磷酸化后引发平行二聚体构象的反向平行二聚体构象。另一方面STAT去磷酸化需要宽广的空间重新定向，因为酪氨酸磷酸化的STAT二聚体必须从平行于反向平行的配置 转移到暴露磷酸化酪氨酸作为磷酸酶的更佳标靶68。发现STAT5在结合于HSP90时对 胰蛋白酶裂解更敏感，指示HSP90的结合直接调节STAT5的构象状态，可能保持STAT5 处于不利于去磷酸化和/或有利于磷酸化的构象。
为了研究此可能性，使用一种脉冲追踪策略，其中将一种非特异性PTPase抑制剂原钒酸盐(Na3VO4)添加到细胞中以阻挡STAT5的去磷酸化。然后在若干随后时间点 测定残余的p-STAT5水平。在PU-H71缺乏下，p-STAT5迅速地累积，而在其存在下， 细胞p-STAT5水平降低。此过程的动力学类似于p-STAT5稳态降低的速率。
5.1.9.HSP90维持STAT5呈活性构象直接在含有STAT5的转录复合物内
除STAT5磷酸化和二聚化外，STAT5的生物活性需要其核移位和直接结合于其各种标靶基因64,68。因此，想知道HSP90是否也可能促进STAT5基因的转录活化并且因此 参与启动子相关的STAT5转录复合物。使用基于ELISA的分析，发现STAT5在K562 细胞中是组成性活性的，并且结合于STAT5结合共同序列(5'-TTCCCGGAA-3')。在用 PU-H71抑制HSP90后，STAT5活化和DNA结合以剂量依赖性方式部分地消除。此外， K562细胞中的定量ChIP分析揭露在关键STAT5标靶MYC和CCND2存在HSP90和 STAT5两者。两种蛋白质都不存在于基因间的控制区域(未展示)。因此，PU-H71(1μM) 降低STAT5标靶基因CCND2、MYC、CCND1、BCL-XL和MCL162，而不是对照基因 HPRT和GAPDH的mRNA丰度。
总起来说，这些数据展示CML细胞中STAT5活性由HSP90正调节。我们的发现与 如下情况一致，其中HSP90结合于STAT5调节蛋白质的构象，并且通过此机制，其改 变STAT5磷酸化/去磷酸化动力学，将平衡移向增加水平的p-STAT5。此外，HSP90维 持STAT5呈活性构象直接在含有STAT5的转录复合物内。然而，考虑到STAT-通路的复 杂性，不能排除其它可能的机制。因此，除其在促进蛋白质的稳定性方面的作用外，HSP90 通过维持客户蛋白处于活性配置中来促进肿瘤发生。
更广泛地，数据揭露了正是细胞HSP90的PU-H71-HSP90部分与支持肿瘤细胞中的致癌蛋白质功能最密切相关，并且标记的PU-H71可以用于鉴别结合于多种维持特定肿 瘤细胞中恶性表型所需的蛋白质通路的此肿瘤HSP90物质。
5.1.10.HSP90以两种不同的形式存在于肿瘤细胞中
以上呈现的方法利用PU-H71的若干特性，PU-H71i)优先结合于与致癌客户蛋白有关的HSP90部分，并且ii)将HSP90锁定于致癌客户蛋白结合的配置中。
鉴别肿瘤细胞存活所需的HSP90客户蛋白也可以用作肿瘤特异性生物标记物，用于 选择可能受益于HSP90疗法的患者和药物动力学监测临床试验期间HSP90抑制剂功效(即，在HSP90抑制后表达或磷酸化变化的客户蛋白)。肿瘤特异性HSP90客户蛋白型 态分析提供了一种使肿瘤治疗靶向个性化的方法。
此工作证实了并且显著地扩展了卡莫尔(Kamal)等人的工作，更细致地了解了原始模型，其中肿瘤内的HSP90被描述成是完全以多伴随蛋白复合物存在，而来自正常组 织的HSP90以潜在的未复合的状态存在34。展示HSP90在癌细胞中形成生物化学不同 的复合物(图5a)。从这个观点，癌细胞HSP90的主要部分保留类似于正常细胞的“管 家”伴随蛋白功能，而癌细胞中富集或扩增的功能上不同的HSP90池特别与维持肿瘤细 胞存活所需的致癌蛋白质相互作用。或许此HSP90部分代表了在肿瘤细胞环境下扩增和 组成性维持的伴随蛋白复合物的细胞应激特定形式。数据表明其可以执行维持恶性表型 所需的功能。一种这样的作用是调节突变(即，mB-Raf)或嵌合蛋白(即，Bcr-Abl) 的折叠32,33。目前呈现了关于额外作用的实验证据；也就是说，促进与异常活化信号传 导复合物相关的分子的架构和复合物形成。本文中描述HSP90维持CML中组成性STAT5 信号传导的此类作用。这些数据与先前的工作一致，其中展示需要HSP90通过B细胞 淋巴瘤细胞中的BCL6致癌转录抑制物维持功能性转录抑制复合物70。
什么来区分HSP90的PU结合部分与非PU结合部分？这是一个仍然在积极研究下 的很复杂的问题。虽然HSP90α和HSP90β同功异构物由PU-H71识别，但数据证明了 Bcr-Abl/HSP90(PU优选)与Abl/HSP90(PU非优选)伴随蛋白复合物之间的至少一个 差异。也就是说，Bcr-Abl/HSP90伴随蛋白复合物含有许多辅助伴随蛋白(表明正在进 行活性陪伴过程，由Bcr-Abl对Hsp70沉默的敏感性进一步支持)，而Abl/HSP90复合 物缺乏相关的辅助伴随蛋白(可能代表分离而不积极陪伴的Abl，由Abl对Hsp70敲减 的不敏感支持)(参见图2e)。此外，已经注意到进行突变以更侵袭性地结合于其客户蛋 白的HSP90还比野生型HSP90更侵袭性地结合于PU-珠粒(投稿准备中)。最终，已经 观测到HSP90磷酸化对PU-H71和格尔德霉素结合的有差异的影响。这些正在进一步追 寻的发现表明，各种HSP90抑制剂可能受伴随蛋白特定的翻译后改性独特地影响。总之， 这些初步观察展示PU-H71识别参与活性伴随蛋白循环的HSP90部分，并且此特征不一 定由其它HSP90抑制剂共享。
5.2.标记的HSP90抑制剂用于诊断性和预后的应用
为了以逐肿瘤的方式测量“致癌HSP90”的丰度，本发明提供了若干可以用于诊断性和预后目的化学工具(参见部分5.2.1.和5.2.2.)。另外，这些化学工具提供了对肿瘤 相关HSP90的不均一性新的了解并且利用特定HSP90抑制剂的生物化学特征来鉴别调 节促进肿瘤的生物通路和蛋白质的肿瘤特异性HSP90。所述工具包括标记的HSP90抑制 剂，其特异性地鉴别此肿瘤“致癌HSP90”物质并且与其相互作用，使得可以测量肿瘤 内不同亚群中“致癌HSP90”物质的丰度，并且因此，测量和预测对HSP90抑制疗法的 敏感性。此外，测量“致癌HSP90”的丰度提供了一种确定肿瘤是否依赖于HSP90的方 式。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗 法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中 存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；
(b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与结合于正常细胞的所述标记的HSP90抑制剂的参考量比较；
其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
所述方法涉及测量肿瘤内作为HSP90疗法的生物标记物的HSP90物质“致癌HSP90”的丰度。此HSP90物质的丰度不一定与肿瘤内总HSP90表达一致。本发明提 供测量“致癌HSP90”的丰度的若干解决方法。在一种所述实施例中，某些HSP90抑制 剂的标记的衍生物可以用作测量其存在和其丰度的工具。
此外，在此具体的方法中，步骤(b)中测量的结合于肿瘤或肿瘤细胞的标记的HSP90 抑制剂的量与参考量相比的比率越大，对HSP90抑制剂疗法可能的反应程度越大。
另，此外在此具体的方法中，步骤(a)中测量的结合于肿瘤或肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量越大，对HSP90抑制剂疗法可能的反应程度越大。
在此具体的方法的一个实施例中，结合于正常细胞的标记的HSP90抑制剂的参考量 是结合于含有来自肿瘤的细胞的样品中的正常细胞的标记的HSP90抑制剂的量。
在另一实施例中，结合于正常细胞的标记的HSP90抑制剂的参考量是结合于参考样 品中的正常细胞的标记的HSP90抑制剂的预定量。
在另一方面，本发明提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗 法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中 存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；
(b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与参考比较；
其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
在此具体方法的一个实施例中，参考样品是几乎没有“致癌HSP90”表达的癌细胞。在另一实施例中，参考是几乎不结合于“致癌HSP90”的相应标记的化合物。
可检测地标记的HSP90抑制剂可以用任何可检测的标记来标记，并且许多所述标记 是所属领域中众所周知的。举例来说，可检测地标记的HSP90抑制剂可以是荧光标记、生物素标记、ANCA标记或放射性标记的。
在实施此具体的方法时，肿瘤可以是任何肿瘤或含有“致癌HSP90”的肿瘤衍生的生物形式，例如外来体。举例来说，肿瘤和含有“致癌HSP90”的其它细胞或肿瘤衍生 的生物形式可以与选自由以下组成的群组的任何癌症有关、指示其或衍生自其：结肠直 肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、包括急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞白血病和慢性骨髓白 血病在内的白血病、淋巴样白血病、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、 膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、 脊髓增生性病症、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌症、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊 癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴 瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
在实施此具体的方法时，肿瘤、肿瘤细胞或肿瘤相关的细胞或生物形式可以存在于 个体中，或者可以从个体中分离。因此，有待接触的肿瘤、肿瘤细胞或肿瘤相关的细胞可以呈自身在体内的实体肿瘤形式或呈例如在组织样品中或如在液体肿瘤或生物流体 内的粘附细胞形式；在抽血、骨髓抽吸、活组织检查、细针抽吸或手术程序期间获得的 样品；生物流体；血液或骨髓。有待与标记的HSP90抑制剂接触的细胞可以呈包括破坏 细胞、活细胞、冷冻细胞、固定和渗透化细胞或福尔马林(formalin)固定的石蜡包埋 的细胞在内的任何形成存在。
可检测地标记的HSP90抑制剂可以是待作为疗法投予的HSP90抑制剂的标记形式，或者可以是包括化学上无关的HSP90抑制剂的不同的HSP90抑制剂的标记形式或待投 予的HSP90抑制剂的类似物、同系物或衍生物的标记形式。仅仅要求可检测地标记的 HSP90抑制剂和很可能所对应的未标记的HSP90抑制剂优先结合于许多肿瘤和肿瘤细 胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式。在这方面，“优先”意指HSP90抑制剂以比其 结合于表征正常或非肿瘤细胞的HSP90的亲和力(如果有的话)实质上更大的亲和力结 合于HSP90的肿瘤特异性形式。
目前，一种考虑可能作为疗法投予的HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。关于例示性HSP90抑制剂的描述，参见例如美国专利7,820,658B2； 7,834,181B2；和7,906,657B2，它们都以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，HSP90抑制剂是PU-H71并且可检测地标记的HSP90抑制剂是 PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物的形式。可以是可检测地标记的HSP90 抑制剂的PU-H71的形式的实例包括(但不限于)[124I]-PU-H71、PU-H71-FITC2或 PU-H71-NBD1，或PU-H71的生物素标记类似物，例如下文所述的PU-H71-生物素-5、 PU-H71-生物素-6、PU-H71-生物素-8或PU-H71-生物素-9。
因此，PU-H71的标记的衍生物，例如放射性标记的[124I]-PU-H71、[131I]-PU-H71、[123I]-PU-H71、荧光标记的PU-H71、生物素标记的PU-H71或ANCA标记的抑制剂可以 用作鉴别和定量肿瘤特异性HSP90物质的工具。此肿瘤HSP90物质的丰度可以用作可 预测对HSP90疗法的反应的生物标记物。
5.2.1.用于检测致癌HSP90的荧光、生物素标记和ANCA标记的探针
本发明提供了能够检测癌细胞中致癌HSP90的荧光标记的、生物素标记的探针和ANCA标记的探针。部分5.2.1.1.描述根据本发明使用的各种类型的探针的产生。部分5.2.1.2.描述所述探针在预后和诊断性分析中的用途。
5.2.1.1.探针的产生
本发明提供了可渗透细胞并且选择性地结合于“致癌HSP90”的荧光标记、生物素标记和ANCA标记的抑制剂。可渗透细胞的抑制剂能够穿透细胞的细胞膜并且结合细胞 的细胞质内的HSP90。为了可用于本发明的方法，标记的抑制剂必须以通过所属领域的 技术人员已知的检测方法可测量的量穿透细胞。部分5.2.1.1.1.描述了可渗透细胞并且能 够选择性地结合于“致癌HSP90”的不同的荧光标记的探针的开发。部分5.2.1.1.2.描述 了可渗透细胞并且能够选择性地结合于“致癌HSP90”的不同的生物素标记的探针的 开发。部分5.2.1.1.3.描述了可渗透细胞并且能够选择性地结合于“致癌HSP90”的不同 的ANCA标记的探针的开发。
5.2.1.1.1.荧光标记的探针
已经报导HSP90的荧光标记的抑制剂，在荧光偏振分析中使用格尔德霉素的类似物 (GM-FITC13、GM-Bodipy13、GM-cy3b14)以及吡唑1(荧光素类似物，VER-00045864)15作为配体(图8)。通过荧光显微镜术，不能渗透细胞的GM-FITC衍生物用以鉴别细胞 表面HSP9016。然而，HSP90主要是一种仅在某些细胞中检测到在细胞表面表达的胞质 蛋白1,2。因此，荧光探针是分析细胞内与细胞表面HSP90所需要的。
特异性并且紧密地与“致癌HSP90”相互作用的可渗透细胞的HSP90探针是此可 能的生物标记物的流式细胞术测量所偏爱的，因为通过流式细胞术用于检测细胞内抗原 的固定/渗透化方法可能破坏“致癌HSP90复合物”以及细胞形态和表面免疫反应性， 而这些是流式细胞术中可用于表征非均质群体中的细胞的特性。为了解决这个问题，本 发明提供了合成、表征和评估渗透活细胞并且结合于标靶的荧光标记的HSP90抑制剂的 方法。
本发明提供了PU-H71(2)(一种嘌呤骨架的HSP90抑制剂(图8))的各种新的荧 光标记的衍生物并且描述了其作为探针通过荧光活化的流式细胞术和荧光显微镜术来 研究HSP90的生物应用。包括BIIB021、MPC-3100、PU-H71和Debio 0932(以前是 CUDC-305)在内的基于嘌呤骨架的若干HSP90抑制剂目前正处于针对癌症的临床开发 中18,19。
合成热休克蛋白90(HSP90)的荧光配体，其含有异硫氰酸荧光素(FITC)、4-硝 基苯并[1,2,5]噁二唑(NBD)或红移染料磺酰罗丹明101(得克萨斯红)结合于PU-H71 (图9)。这些化合物中的两种PU-H71-FITC2(9)和PU-H71-NBD1(8)展示适于荧光 活化的流式细胞术和荧光显微镜术。因此，这些分子用作适用于研究非均质活细胞群体 中的HSP90的探针。
对于小的染料标记的配体的开发，最佳荧光团和其连接位点的选择是相关的。尤其 在小分子中，引入的染料可能显著地影响配体的生物化学和药理学特征。根据结合于HSP90的PU-H71(2)的X射线晶体结构20，配体的N9-烷基氨基链面向溶剂定向。作 为此以及先前SAR的结果，本发明中合成的化合物的一部分含有连接于N9位的荧光标 记。在具体实施例中，如下所述，具有不同键联基团的PU-H71的衍生物用FITC、NBD 或得克萨斯红(TR)标记(参见图1)。
在本发明的一个实施例中，六个碳间隔基附加到基于嘌呤骨架的抑制剂的构成胺， 由此提供化合物3(方案1和图10)。先前已经使用此键联基团将PU-H71连接到固体支撑物并且展示化合物3保留对HSP90的良好亲和力21。如方案1中描绘，化合物3与 FITC在DMF/Et3N中反应，在通过HPLC纯化后，得到化合物4(PU-H71-FITC1)，产 率40％。
Figure BDA0001717339850000331
方案1：合成PU-H71-FITC和PU-H71-NBD1
在另一实施例中，PU-H71-得克萨斯红(化合物5；PU-H71-TR))是通过以下合成： 3与磺酰罗丹明101磺酰氯在DMF中反应，在通过HPLC纯化后得到化合物5，产率 61％(方案1)。在NBD类似物的情况下，溴化物6与化合物7在DMF中反应，得到化 合物8(PU-H71-NBD1)，产率47％(方案1)。化合物621和NBD衍生物722如先前所 述来制备。
在另一实施例中，利用PU-H71中存在的仲胺23并且使其与FITC或NBD-Cl直接 反应，分别得到化合物9(PU-H71-FITC2)(72％)或化合物10(PU-H71-NBD2)(40％) (方案2和图11)。假设，染料直接连接到胺将因存在可电离的胺官能团而产生更加可渗 透细胞的类似物。另外，含有异丙基代替氢的衍生物(例如化合物9和化合物10)致使 化合物更加亲脂并且增强其细胞渗透性。
Figure BDA0001717339850000341
方案2：合成PU-H71-FITC2和PU-H71-NBD2
在又一个实施例中，如方案3和图12中描绘，去异丙基-PU-H71(化合物13)与 FITC或NBD-Cl反应，分别得到化合物14(PU-H71-FITC3)(74％)或化合物15 (PU-H71-NBD3)(42％)。化合物13通过用N-(3-溴丙基)-邻苯二甲酰亚胺对化合物11 进行N9-烷基化并且随后用肼去除邻苯二甲酰亚胺来合成(方案3)。
Figure BDA0001717339850000351
方案3：合成PU-H71-FITC3和PU-H71-NBD3
如方案4中描绘，制备类似于PU-H71-FITC3(方案3中所示)但具有不同的键联 基团长度的额外化合物。
Figure BDA0001717339850000361
方案4：合成PU-H71-FITC4、PU-H71-FITC5和PU-H71-FITC6
评估方案1-4中制备的化合物渗透细胞和结合于细胞内的HSP90的能力。偏好可渗透细胞的探针是因为通过流式细胞术用于检测细胞内抗原的固定/渗透化方法通常破坏细胞形态学和表面免疫反应性，而这些是流式细胞术中可用于表征非纯质群体中的细胞的特性。因此，特别感兴趣发现在不需要固定和渗透化步骤下与活细胞中的标靶相互作 用的可渗透细胞的配体。
为了研究以上合成的荧光标记的PU-H71衍生物中哪个保留了母体化合物PU-H71的细胞渗透性型态，检验这些HSP90探针在人类急性骨髓白血病(AML)细胞系MV4-11 和MOLM-13中的细胞渗透性。在十种于方案1-4中制备的PU-H71的荧光衍生物中， 发现PU-H71-FITC2(9)和PU-H71-NBD1(8)渗透细胞和结合于HSP90的能力最高(图 13)。确切地说，展示这两种衍生物将活细胞有效染色(图13A)以及在这些细胞中指 示标靶(HSP90)抑制的生物活性(图13B、13C)。具体地说，展示PU-H71-FITC2(9) 和PU-H71-NBD1(8)降低MOLM-13细胞的活力(图13B)，这是与指示这些癌细胞中 细胞内HSP90抑制的如突变FLT3和Raf-1等HSP90-客户蛋白的降解作用(图13C)有 关的作用1-3。
此外，用PU-H71-FITC2(9)染色的白血病细胞的共焦荧光显微镜术展示显著的细胞内定位(图14A)。在这些实验中，DAPI用作活力染料以区分活细胞和非活细胞。此 染料在测试浓度下在活细胞中不能渗透，但渗透非活细胞并且结合DNA的特定区域。 在大部分仪器中用紫外激光激发DAPI。类似数据用PU-H71-NBD1(8)产生(未展示)。
流式细胞术通常用以通过利用特定的标记物分开并区分正常和恶性血液细胞生成 中不同的细胞群体。举例来说，胚细胞通常通过CD45染色暗处(CD45dim)定量和表 征，和CD45染色亮处(CD45hi)的循环非胚细胞群体形成对比24。这些细胞通过其鉴 别标记物的存在来门控和分开，这里展示也可以用PU-H71-FITC2针对标靶HSP90染色 (图14B)。依照先前指示PU-H71选择性结合于肿瘤细胞HSP90的报导23，在原代急性 骨髓白血病样品中PU-H71-FITC2优先地染色恶性细胞(胚细胞)，并且不染色正常细胞 (淋巴细胞)群体(图14B)。
因此，展示PU-H71-FITC2(9)和PU-H71-NBD1(8)渗透活细胞并且结合于标靶。 确切地说，展示PU-H71-FITC2和PU-H71-NBD1染色活细胞(图13A)，降低白血病细 胞的活力(图13B)，如HSP90客户蛋白的降解作用所指示，抑制细胞内HSP90(图13C)， 如共焦显微镜术所指示，定位于细胞内(图14A)，并且如流式细胞术所指示，对比正 常细胞HSP90特异性地结合于肿瘤(图14B)，从而提供了这些探针类似于PU-H71，渗 透细胞并且特异性地结合于肿瘤HSP90标靶的充分的证据。例如图4、图15、图16和 图18中提供的实例还显示PU-H71的这些荧光衍生物与“致癌HSP90”物质相互作用并 且此外提供一种定量广泛癌细胞中此物质的方式。如部分5.2.1.2.中所讨论，PU-H71的 这些荧光衍生物可以用作荧光活化的流式细胞术的探针或用作通过荧光显微镜术监测 HSP90与标靶的实时相互作用的工具。
基于以上所讨论的结果，设计出可以与HSP90相互作用并且因此可以用作诊断性和 /或预后工具的各种其它可渗透细胞的探针。在一个实施例中，类似于PU-H71-FITC2，但在苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯环上具有不同取代基的化合物以类似于PU-H71-FITC2的方式合成，如方案5中所示。
Figure BDA0001717339850000381
方案5：合成类似于PU-H71-FITC2的化合物
在另一实施例中，类似于方案5中描绘的化合物但在嘌呤骨架上的嘧啶环经吡啶环 置换的化合物以类似于PU-H71-FITC2的方式合成，如方案6中所示。
Figure BDA0001717339850000391
方案6：合成类似于PU-H71-FITC2的化合物
在另一实施例中，化合物PU-FITC7可如方案7中描绘来制备。
Figure BDA0001717339850000401
方案7：合成PU-FITC7
在另一实施例中，化合物PU-FITC8如方案8中描绘来制备。
Figure BDA0001717339850000402
方案8：合成PU-FITC8
在另一实施例中，化合物PU-FITC9如方案9中描绘来制备。
Figure BDA0001717339850000403
方案9：合成PU-FITC9
在另一个实施例中，化合物DZ13-FITC1(PU-DZ13-FITC)如方案10中描绘来制 备。
Figure BDA0001717339850000411
方案10：合成化合物DZ13-FITC1
在另一实施例中，化合物SNX-FITC如方案11中描绘来制备。
Figure BDA0001717339850000412
方案11：合成化合物SNX-FITC
5.2.1.1.2.合成用于检测致癌HSP90的生物素标记的探针
为了获得能够渗透细胞膜并且结合于活细胞中的细胞内HSP90的化合物，制备PU-H71(2)和去异丙基-PU-H71(13)的一系列生物素标记的类似物。HSP90抑制剂 13和2通过键联基团结合于生物素。键联基团的类型以及其长度系统地改变以便鉴别能 够渗透到活细胞中并且结合于HSP90的化合物。
生物素标签能够通过随后结合于抗生蛋白链菌素用于下拉实验。键联基团应具有足 够长度以能够同时结合于HSP90和抗生蛋白链菌素。
生物素标签还能够使用标记的抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白抗体进行检测，并且 因此生物素标记的HSP90抑制剂可用于染色组织以检测“致癌HSP90”。
化合物13和化合物2含有能够通过酰胺键的形式直接连接生物素与含有键联基团的生物素的胺官能团。在一个实施例中，生物素标记的分子在无键联基团下制备(即， 直接连接到生物素)。方案12中描绘两种称为PU-H71-生物素2和PU-H71-生物素3的 所述化合物的合成。化合物可以通过在超声波处理下DCC与D-生物素偶合，分别由化 合物13或化合物2制备。
Figure BDA0001717339850000421
方案12：合成PU-H71-生物素2和PU-H71-生物素3
在另一实施例中，如方案13中描绘，生物素标记的分子通过用6碳链间隔基将 PU-H71(2)或去异丙基-PU-H71(13)共价连接于生物素以产生PU-H71-生物素4或 PU-H71-生物素7来制备。PU-H71-生物素4和PU-H71-生物素7可以通过分别使化合 物13或化合物2与可购得的含有N-羟基丁二酰亚胺活性酯的生物素分子(称为
Figure BDA0001717339850000422
NHS-LC-生物素)在碱存在下反应来制备。
Figure BDA0001717339850000431
方案13：合成PU-H71-生物素4和PU-H71-生物素7
在另一实施例中，如方案14中描绘，生物素标记的分子通过用延伸的碳链间隔基将PU-H71(2)或去异丙基-PU-H71(13)共价连接于生物素以产生PU-H71-生物素5 或PU-H71-生物素8来制备。PU-H71-生物素5和PU-H71-生物素8可以通过分别使化 合物13或化合物2与可购得的含有N-羟基丁二酰亚胺活性酯的生物素分子(称为
Figure BDA0001717339850000432
NHS-LC-生物素)在碱存在下反应来制备。
Figure BDA0001717339850000441
方案14：合成PU-H71-生物素5和PU-H71-生物素8
在又一实施例中，如方案15中描绘，生物素标记的分子通过用聚乙二醇链将PU-H71 (2)或去异丙基-PU-H71(13)共价连接于生物素以产生PU-H71-生物素6或PU-H71- 生物素9来制备。PU-H71-生物素6和PU-H71-生物素9可以通过分别使化合物13或化 合物2与可购得的含有N-羟基丁二酰亚胺活性酯的生物素分子(称为
Figure BDA0001717339850000442
NHS-PEG4-生物素)在碱存在下反应来制备。
Figure BDA0001717339850000451
方案15：合成PU-H71-生物素6和PU-H71-生物素9
在方案16中描绘的又一实施例中，称为PU-H71-生物素的胺键联的生物素类似物通过溴化物6与
Figure BDA0001717339850000452
胺-PEO3-生物素反应来合成。
Figure BDA0001717339850000461
方案16：合成PU-H71-生物素
为了确保生物素标记的化合物仍然对HSP90保留亲和力，在荧光偏振分析中使用SKBr3癌细胞溶解产物评估每一者。如可见，每一化合物对HSP90保留良好的亲和力， 其中IC50在31-154nM范围内(表1；PU-H71，IC50＝25nM)。
表1.生物素标记的化合物的特性
Figure BDA0001717339850000462
n.a.＝不适用
n.d.＝未确定；TPSA和Clog P值用Chemdraw测定，并且n.d.指示对于既定结构，无法测定值。
可以观测到两种一般趋势。首先，与PU-H71类似物相比，去异丙基类似物平均以约2倍更大的亲和力结合(即PU-H71-生物素3对比-2、-4对比-7、-5对比-8、-6对比 -9)。第二，就键联基团而言，碳系列比乙二醇系列更有效(即PU-H71-生物素4和-5 对比-6、-7和-8对比-9)。总之，制备的所有化合物都对HSP90保留良好的亲和力并且 都适于进一步分析。
已经展示每一制备的生物素标记的分子对HSP90保留良好的亲和力，然后想确定链 长是否足够维持同时结合于HSP90和抗生蛋白链菌素。将K562溶解产物(500μg蛋白 质)用抗生蛋白链菌素珠粒与100μM每一化合物的混合物处理过夜。充分洗涤以去除 任何未结合的物质后，剩余的珠粒小球通过SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯蓝(coomasie blue)洗涤和染色1小时。PU-H71-生物素-5、-6、-8、-9以及PU-H71-生物素展示约90 kDa的亮带，指示同时结合于HSP90和抗生蛋白链菌素。无键联基团的类似物(PU-H71- 生物素2和-3)和具有6碳间隔基的类似物(PU-H71-生物素4和-7)未展示90kDa的 亮带，指示键联基团过短。相比之下，含有延伸碳链间隔基(PU-H71-生物素5和-8和 聚乙烯链(PU-H71-生物素6和-9)的化合物具有足以能够同时结合的长度。
已经展示一些分子同时结合于HSP90和抗生蛋白链菌素，然后研究此是否可以类似 地在活细胞中实现。在这种情况下，K562细胞中的结合首先通过用100μM PU-H71-生 物素-5、-6、-8、-9以及PU-H71-生物素处理4小时，然后通过SDS-PAGE分析来确定。 在评估的化合物中，仅PU-H71-生物素无法维持活细胞中的结合。有趣地，PU-H71-生 物素含有可电离的胺，其限制了PU-H71-生物素的渗透性并且可能是PU-H71-生物素无 法结合的主要因素。相比之下，PU-H71-生物素-5、-6、-8、-9不含有可电离的胺并且能 够渗透细胞膜。活性化合物在50、25和10μM下评估并且展示PU-H71-生物素-6和9 甚至在10μM下仍维持良好的结合。这两种化合物在5、2.5和1μM下进一步评估并且 甚至在最低浓度下模糊的亮带仍然存在于约90kDa下。PU-H71-生物素-6仍然展示0.5 μM下的模糊亮带，指示在此低浓度下仍然维持同时结合。
看来含有延伸碳链间隔基(PU-H71-生物素-5、-8)或聚乙二醇链键联基团(PU-H71- 生物素-6、-9)的化合物不管连接13还是2，都能够渗透K562细胞的膜，结合于HSP90并且随后结合于抗生蛋白链菌素珠粒。此外，看起来含有聚乙二醇链键联基团的化合物(PU-H71-生物素-6、-9)可能优选。
5.2.1.1.3.合成ANCA标记的探针
本发明进一步提供了用于检测致癌HSP90的探针，它是通过用氨基萘基-2-氰基-丙 烯酸酯(ANCA)标记抑制剂。ANCA是一种可以结合于人类组织中的淀粉样蛋白斑并 且染色的荧光探针。ANCA通常称为分子转子。分子转子是其中荧光量子产率依赖于周 围环境的探针。分子转子的结构基元使得当与大分子接近时，内部分子转动被阻碍(硬 度增加)，导致荧光发射改变，即结合和未结合分子转子具有不同的荧光发射峰(参见 图15)。此物理方面可以在结合于对“致癌HSP90”具有特异性的PU-H71时利用。结 合于PU-H71的分子转子允许在癌细胞的非纯质群体中辨别具有“致癌HSP90”的细 胞，并且允许定量从例如活组织检查、手术或细针吸取等介入术中获得的样品中存在的 细胞中的所述物质。
在一个实施例中，如方案17中描绘，去异丙基-PU-H71(13)、PU-H71(2)或13 或2的化合物类似物可以用ANCA标记。方案17中，去异丙基-PU-H71(13)与氰基 乙酸反应，产生化合物26。下一步，化合物26与化合物27在高温下反应得到化合物 28(PU-ANCA)。
Figure BDA0001717339850000481
方案17：合成PU-ANCA
在又一实施例中，方案18中展示适用于本发明的ANCA标记的HSP90抑制剂，例 如基于嘌呤的ANCA标记的HSP90抑制剂。
Figure BDA0001717339850000491
方案18：合成基于嘌呤的ANCA标记的HSP90抑制剂
在又一实施例中，方案19中展示适用于本发明的ANCA标记的HSP90抑制剂，例 如基于咪唑并吡啶的ANCA标记的HSP90抑制剂。
Figure BDA0001717339850000501
方案19：合成基于咪唑并吡啶的ANCA标记的HSP90抑制剂
5.2.1.2.在癌症预后和治疗中探针的利用
5.2.1.2.1.血液科恶性疾病
部分5.1中讨论的研究证实某些HSP90抑制剂优先结合于在癌细胞中比在正常细胞 中更丰富的HSP90物质子集“致癌HSP90”。此物质的丰度不仅仅由HSP90表达的量 决定并且可预测对HSP90抑制的细胞敏感性。因此，确定患者的癌细胞中可用于结合于 选择此“致癌HSP90”的标记的抑制剂(例如PU-H71)的HSP90群体的比例预测临床 中对HSP90抑制剂的敏感性并且揭露癌细胞依赖于HSP90的程度。
确切地说，本发明展示例如PU-H71-FITC衍生物(例如PU-FITC；PU-H71-FITC2) 等可渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂早在暴露后1小时就标记活细胞，在24-48小 时降低白血病细胞的活力，如通过HSP90客户癌蛋白的降解作用所指示，抑制细胞内肿 瘤HSP90，如通过共焦显微镜术所指示，细胞内定位，并且如流式细胞术所指示，对比 正常细胞HSP90特异性结合于肿瘤。此外，本发明的荧光标记的化合物结合于“致癌 HSP90”物质，此充分证明了此探针类似于PU-H71，渗透细胞并且特异性地结合于肿瘤 “致癌HSP90”标靶。
本发明的方法可以用于确定患有血液科恶性疾病(例如白血病)或骨髓增生性病症 的患者是否将对HSP90抑制疗法起反应。此方法可以应用于不同的血液科恶性疾病，包括(但不限于)包括急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞白血病和慢性骨髓白血病在内的 白血病、淋巴样白血病、多发性骨髓瘤以及骨髓增生性赘生物和病症。
本发明提供了一种用于确定血液癌症患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含使含有来自患者的癌细胞和非癌细胞(例如淋巴细胞)的样品与 优先结合于患者癌细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可渗透细胞的荧光标记的 HSP90抑制剂接触，测量结合于样品中癌细胞和非癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的 量，并且将结合于癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量与结合于非癌细胞的荧光标记 的HSP90抑制剂的量比较，其中结合于癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于非 癌细胞指示肿瘤将可能对HSP90抑制剂起反应。在某些实施例中，结合于可渗透细胞的 荧光标记的HSP90抑制剂的量使用流式细胞术测定。
在一些实施例中，结合血液癌细胞与正常淋巴细胞的比率为约1.5或更大指示癌症 患者将对HSP90抑制疗法敏感。在其它实施例中，结合血液癌细胞与正常淋巴细胞的比率为约2或更大指示癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。在其它实施例中，结合血液癌 细胞与正常淋巴细胞的比率为约2.5或更大指示癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。在 其它实施例中，结合血液癌细胞与正常淋巴细胞的比率为约3或更大指示癌症患者将对 HSP90抑制疗法敏感。在其它实施例中，结合血液癌细胞与正常淋巴细胞的比率为约4 或更大指示癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。在其它实施例中，结合血液癌细胞与正 常淋巴细胞的比率为约5或更大指示癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。
大量建立的细胞系和原代肿瘤样品通过在体外暴露于HSP90抑制剂后在可渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂(例如PUH71-FITC2)的结合与细胞活力之间进行相关 分析来研究。为了确定PUH71-FITC2与一系列细胞系和原代白血病样品的结合，使用 多参数流式细胞术分析。还通过在药物暴露后48小时进行活力分析，测试这些细胞对 HSP90抑制剂的敏感性。
荧光活化的流式细胞术仍然是一种选择用于列举、纯化和分析细胞的方法9,10。实际上，目前大量的测量可以通过流式细胞术进行，并且新近的技术发展允许这些测量在 非均质群体内的个别细胞上同时进行11。所述多参数分析非常强大，因为其从更少样品 获得更多的数据，这是在患者样品有限时的一个关键因素。多参数分析还允许通过排除 结合一些试剂的不必要的细胞，更精确地鉴别群体9,10。因此，这种方法对于分析HSP90 配体在荧光标记时与不同的细胞群体的结合是最佳的。
荧光标记的配体在历史上具有多种生物学和药理学用途12，并且提供了保留未标记 配体的药理学特性的优点。除了体外研究配体-受体结合外，小分子荧光探针还允许例如 借助于流式细胞术，实时和非侵入性地监测活细胞群体中标靶与配体之间的相互作用。
荧光染料吸收某些波长的光并且又以较高波长发射其荧光能量。每一染料具有不同 的发射光谱，其可以用于通过流式细胞术进行多色分析。最常用的是异硫氰酸荧光素(FITC)、4-硝基苯并[1,2,5]噁二唑(NBD)或红移染料磺酰罗丹明101(得克萨斯红)。 FITC和NBD在大部分仪器上的FL1通道中检测到，并且还是一种用于荧光显微镜术的 良好的选择(分别地，激发495和466nM以及发射519和539nM)，而得克萨斯红在 单一激光仪器上的FL3中检测到(激发589nM和发射615nM)。
部分5.1.1.中，讨论使用若干原代白血病细胞和正常血液细胞的研究。具体地说，分析原代慢性和胚细胞期CML和急性骨髓白血病(AML)样品，它们含有胚细胞(恶 性细胞群体)和淋巴细胞(正常细胞群体)、从健康供体的脐带血分离的CD34+细胞、 来自外周血的总单核细胞以及外周血白血球(PBL)(图1c-e、3、4)。使用荧光素标记 的PU-H71(PUH71-FITC2)作为一种在非均质细胞群体中进行多参数流式细胞术分析 的工具。如图4a中所示，门控策略用以区分正常细胞群体(淋巴细胞)与恶性细胞群 体(胚细胞)。展示三种不同患者的流式细胞术斑点印迹。图4b中，展示来自原代患者 样品的CML胚细胞与正常淋巴细胞中PU-H71-FITC2与HSP90的结合的比率。
图4d中，流式细胞术再次用以区分胚细胞与正常淋巴细胞并且分析胚细胞门内CD34+细胞的结合。图4e和4g中，测定六名白血病患者和三名健康患者中CD34+胚细 胞与正常淋巴细胞的PU-H71-FITC2与HSP90的结合的比率。九名患者用PU-H71-FITC2 或对照(TEG-FITC)处理(图4f和4h)。如图4h中所示，具有最高比率的患者(称为 CML03106、0614和0124；图4g中比率平均为“bcCML”)比具有较低比率的患者(称 为CML0118、0128和0222；图4g中比率平均为“cpCML”)更敏感。注意到，健康 患者具有靠近1的比率(图4g)并且脐带血中其细胞对PU-H71不显著敏感(图4h，称 为CB1、2、3)。图4f中展示的结果指示在患者中CD34+胚细胞的活力显著降低，而正 常淋巴细胞不受影响。类似地，对照化合物(TEG-FITC)不降低CD34+胚细胞或正常 淋巴细胞的活力。
在原代样品中，分析相同患者内的胚细胞群体与正常淋巴细胞。发现在由原代白血 病细胞(原代慢性和胚细胞期慢性骨髓白血病(CML)以及急性骨髓白血病(AML)样 品)和健康血液细胞(包括CD34+脐带血细胞和从健康供体分离的总外周血单核细胞) 构成的一组中，对PUH71-FITC2具有最高亲合力的细胞也对被此药剂杀死最敏感(图 16)。重要地，白血病血液样品内存在的正常淋巴细胞展示弱结合于PU-FITC并且不受 PU-H71影响。因此，合理地说明与相同患者内的正常淋巴细胞相比，白血病细胞中 PU-FITC的相对结合的使用可以用作比较整个样品中PUH71-FITC2结合的归一化值。 确切地说，当在CML样品中评估时，胚细胞危象CML(bcCML)细胞呈现与PU-FITC 的最高结合(相对于正常淋巴细胞的4倍以上)并且当与慢性期相比(cpCML)时，显 示对PU-H71处理的最高敏感性(图16)。相比之下，PU-H71弱结合于正常血液细胞中 的HSP90(IC50值高于2,000nM，对比bcCML中的约100nM)，并且在这些细胞中在 对癌细胞有毒的浓度下无毒(图1d、e和16B、C)。图16C展示将通过分析19个原代 AML样品中PU-H71-FITC2与胚细胞和正常淋巴细胞的结合获得的比率(在X轴上报 导为PU结合倍数)与用PU-H71处理时胚细胞的测量活力相关的图。可以分别通过与 约0.65到约2.22或2.22以下相比，约2.31到约7.43或7.43以上的比率来区分反应(>50％ 活力降低)与非反应(<50％活力降低)肿瘤细胞。
此外，在一组14个白血病细胞系中，还注意到PU-H71-FITC2结合(如以平均荧光强度呈现)与这些细胞对PU-H71抑制HSP90的敏感性之间的显著相关(图3e)。
基于针对19个原代AML样品收集的数据，已经计算出敏感性和精确性曲线以确定正确地鉴别敏感性和抗性AML样品的分析概率。针对PU-FITC结合(胚细胞/淋巴细胞)， 使用2或2以上的随意截止值，以及小于50％活力作为预测结果，进行一项分类性能分 析，并且观测到以下值：精确性：83.3％(53.2-93.8％；95％CI)；敏感性：91.7％(72.8-99.5％；95％CI)；特异性：66.7％(28.9％-82.4％；95％CI)；阳性预测值：84.6％(67.2-91.9％；95％CI)；阴性预测值：80％(34.7％-98.9％；95％CI)；费希尔精确检验(Fisher exacttest)， p＝0.022。这些计算表明，PU-FITC具有良好的分类性能；此评估将对较大群组的样品 重复以获得更精确和准确的性能估计。为了将因实验或仪器变化引起的分析差异减到最 少，使用以下：(1)碧迪细胞计数器装置和追踪(BD Cytometer Setup&Tracking，CST)珠粒以允许自动化性能调试并且改善每日细胞计数器性能和一致性。CST珠粒将在每个 新的实验设置前运行。(2)阳性对照MV411(敏感细胞系-高度结合)和阴性对照HL60 (低敏感性细胞系-弱结合)将包括在分析内。
为了确定在白血病细胞中的体外观测是否可以在动物临床前模型中证实，使用体外 评估和或通过PU-FITC结合预测，对PU-H71具有不同的敏感性(高和低)的原代AML 样品建立异种移植物。将原代AML细胞注射到次致死照射的NOD/SCID小鼠(n＝8) 中。注射三到四周后，当人类白血病细胞已经移入小鼠骨髓(BM)中时，开始用PU-H71 或媒剂对照处理(75mg/kg，一周3次)并且继续四周。处死小鼠并且使用抗人类CD45 和CD34评估白血病移入。为了确定存活细胞的致病能力，移植同等数目的人类细胞到 次致死照射的NOD/SCID小鼠中。此实验确定针对高度结合-高体外敏感性细胞的 PU-H71处理是否防止进一步肿瘤开始。如果是这种情况，那么将表明处理将降低复发 可能性。因为异种移植可能改变白血病样品的生物学，所以在移入细胞注射前(移植后 4周)评估PUH71-FITC2与原代细胞的结合。
图17中描绘异种移植实验的结果。在使用两种原代AML样品(高敏感性和低敏感性，图17a)的实验中，发现异种移植AML样品中高敏感性样品具有高于低敏感性样 品的PUH71-FITC2结合(图17b)并且对用HSP90抑制剂处理显著更好地起反应(图 17c)。此外，发现来自PU-高敏感性AML的细胞在第二移植物中展示显著降低的移入 (p＝0.016)。结果展示在类似的疾病阶段HSP90与患者白血病细胞的存活和增殖的牵连 可能实质上是不同的。另外，HSP90抑制疗法的作用可以通过使用本发明的荧光标记的 探针来预测。
5.2.1.2.2.实体和液体肿瘤
本发明的荧光标记、ANCA标记和生物素标记的探针对实体肿瘤和淋巴瘤以及其它液体肿瘤相关癌症也具有预后和诊断应用。所述肿瘤的实例是与选自由以下组成的群组的癌症有关的肿瘤：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞 癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细 胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、 包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴 瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症，尤其乳癌、胃癌或胰腺癌。 所属领域的技术人员将认识到标记可以在作为例如从肿瘤的活组织检查或手术切除中 获得的组织切片的一部分的肿瘤细胞上进行。在这种情况下，肿瘤细胞将被基质细胞、 良性组织、血管和例如淋巴细胞、巨噬细胞等其它细胞围绕。标记也可以在例如从含有 所述肿瘤细胞的组织中获得的肿瘤细胞等分离的肿瘤细胞中进行。标记也可以在例如从 建立的癌细胞系中获得的肿瘤细胞等肿瘤细胞中进行。特别地，标记也可以在例如从含 有所述肿瘤细胞的包括血浆和胸膜在内的生物流体中获得的肿瘤细胞等肿瘤细胞中进 行。在一个实施例中，标记可以在肿瘤细胞和肿瘤相关细胞以及生物主体(例如在癌症 患者的循环中存在的那些生物主体、通过细针吸取或产生含有癌细胞或含有“致癌 HSP90”的其它类型细胞或生物形式的生物样品的其它介入程序获得的细胞)中进行。 在又一实施例中，标记可以在与恶性转化有关的其它细胞或并有致癌HSP90的生物主体 (例如肿瘤外来体)中进行。举例来说，部分6.3.8.描述在手术切除术后从胃癌和乳癌患 者分离组织用于染色，并且部分5.2.1.2.4.描述从癌症患者分离循环肿瘤细胞。
胰腺癌和乳癌细胞系中的实验指示在血液肿瘤中进行的分析在实体肿瘤和淋巴瘤 中也有效。因此，可渗透细胞的标记的HSP90抑制剂可以检测和定量实体肿瘤细胞或淋巴瘤细胞中存在的“致癌HSP90”。此外，抑制剂可以用于预测实体或液体肿瘤细胞对 HSP90抑制疗法的敏感性。所属领域的技术人员将认识到液体肿瘤是与白血病、淋巴瘤、 骨髓瘤和骨髓增生性赘生物相关，但不限于其。这些人还将认识到某些液体肿瘤也可以 形成实体肿瘤，并且除血液外，与这些疾病有关的癌细胞可以扩散到淋巴结、脾、肝脏、 骨髓和其它部位。
在一个实例中，测试一组胰腺癌和乳癌细胞(1)对例如PU-H71、SNX-2112和 NVP-AUY922等若干不同的抑制剂的敏感性(参见图2)；(2)与PU-H71-FITC2的结合； 以及(3)这些肿瘤细胞中总HSP90的表达。图18展示PU-H71-FITC2结合与这些细胞 对PU-H71、SNX-2112和NVP-AUY922的敏感性之间的显著相关性(图18A，分别地， r2＝0.59、0.62和0.61)。相比之下，在对HSP90抑制剂的敏感性与这些细胞中总肿瘤 HSP90的表达之间未测定到显著相关性(图18C)。类似地，在如通过PU-FITC确定的 “致癌HSP90”的表达与这些细胞中总肿瘤HSP90的表达之间无法建立显著相关性(图 18B)。HL-60白血病细胞对PU-H71和其它HSP90抑制剂具有抗性，并且展示低程度到 不结合于PU-FITC。因此，合理地说明与HL-60相比，癌细胞中标记的HSP90抑制剂 (例如PU-H71-FITC2)的相对结合的使用还可以用作比较整个样品和实验中PU-FITC结 合的归一化值(图18D)。图18展示在若干胰腺癌和乳癌细胞中使用标记的PUH71(例 如PU-H71-FITC2)与各别癌细胞和HL60的结合的比率的所述分析。总起来说，这些数 据表明：(1)PU-FITC是一种测量“致癌HSP90”丰度的适当的工具；(2)测量“致癌 HSP90”的丰度预测对HSP90i的敏感性；以及(3)总肿瘤HSP90的丰度不可预测对HSP90抑制剂的反应，也不与如通过标记的PU-H71测量的“致癌HSP90”的丰度相关。
本发明的标记HSP90抑制剂可以用于确定患者是否将受益于HSP90抑制疗法。在一个实施例中，可以将标记的HSP90抑制剂与患者的肿瘤细胞的结合同与对照细胞的结 合比较。相对于对照结合增加表明患者将服从HSP90抑制疗法。如图19中所示，可以 通过与非反应性细胞的约1.23或约2.07或低于2.07相比，反应细胞的PU-H71-FITC2 与肿瘤细胞和参考HL60细胞的结合的比率为约2.7到约5.87或超过5.87，来区分反应 细胞(>50％活力减少)与非反应性细胞(<50％活力减少)。应了解用于确定对HSP90 抑制剂的反应性的这些比率将取决于分析中使用的标记的HSP90抑制剂和参考样品 (即，HL60细胞、正常白血球、CD45+CD14-细胞或血液中的正常淋巴细胞)和/或对照 衍生物(即用以解释非特定/背景结合的PUFITC9或FITC-TEG)的性质。
本发明中关于标记循环肿瘤细胞中致癌HSP90的更详细的描述在部分5.2.1.2.4.中 给出。图20展示PUFITC9作为被设计成低程度到不结合于致癌HSP90，并且因此解释 非特定/背景结合的PU衍生物的用途。其还展示患者白血球(CD45+CD14-细胞)作为 参考细胞(具有低含量到无致癌HSP90的细胞)的用途。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞中的实验还表明这些细胞对HSP90抑制剂 的敏感性与其对标记的PU-H71的吸收而不是细胞中总肿瘤HSP90的表达有关(图21)。 确切地说，OCI-Ly7和OCI-Ly1是两种对HSP90抑制高度敏感的DLBCL细胞(塞西提 (Cerchietti)等人,自然：医学(Nature Medicine)2009)。它们都是炙手可热的PU-H71 结合剂。用次治疗浓度的HSP90抑制剂处理这些细胞长时间，并且能够选择显示出对若 干测试的HSP90抑制剂(例如PU-H71、PU-DZ13和17DMAG)的敏感性是亲本细胞的 5到10倍的克隆(图8)。图21展示虽然这些克隆的总肿瘤HSP90的表达水平类似于亲 本Ly1细胞，但如通过标记PU-H71-吸收来测量，它们具有较低的“致癌HSP90”水平。 结合实验在PSC833(2.5μM)(一种P-gP抑制剂)存在和不存在下进行以显示有差异 的吸收是不同的“致癌HSP90”水平的结果而不是泵介导的药物流出的间接测量。
5.2.1.2.2.1.胰腺导管腺癌
胰腺导管腺癌(PDAC)是美国癌症相关死亡的第四大最常见病因。五年存活率是所有癌症中最低的，估计值在0.4到4％范围内。2009年，诊断出估计42,470例新的PDAC 病例，并且估计35,240名患者死于其疾病。由于此癌症具有侵袭性，无法在早期诊断其， 并且当前缺乏改变结果的疗法，所以PDAC的死亡率密切地反映出发病率。PDAC唯一 可能的治愈治疗是手术切除。因为此疾病一般在呈现时已是晚期，所以仅10到20％的 患者适合于治愈性切除。这些进行胰十二指肠切除术的患者中，五年存活率仍然惨淡， 约20％。开发有效化学治疗剂来治疗PDAC已经面临着巨大挑战。传统的细胞毒性剂在 控制肿瘤生长、改善生活品质和延长患者存活上基本上低效。
为了允许异常通路和分子的复合负荷，PDAC为求存活变得依赖于分子伴随蛋白。主要的伴随蛋白热休克蛋白90(HSP90)帮助和教唆癌蛋白驱动PDAC中的恶性过程， 例如增殖、存活和转移，并且允许发展癌症表型。此外，HSP90通过增加细胞凋亡临限 值帮助癌细胞建立对其它疗法的抗性。这些全面的生物功能提出了抗-HSP90靶向疗法 在PDAC中的重要作用。因此，这些肿瘤是用一种主要癌症伴随蛋白HSP90的抑制剂 治疗的适当候选者。
借助于优先结合致癌HSP90物质的HSP90抑制剂(例如PU-H71)鉴别胰腺癌存活 所需的肿瘤HSP90物质的丰度将用作选择可能受益于HSP90疗法的患者和使肿瘤的治 疗靶向个性化的肿瘤特异性生物标记物。
实际上，如通过荧光素标记的PU-H71(PU-H71-FITC2)的细胞吸收来测量，胰腺 细胞系对HSP90抑制剂的敏感性与肿瘤HSP90物质丰度相关(图22)。吸收最高量的 PU-H71-FITC2的细胞也是那些对HSP90抑制剂最敏感的细胞。
类似于血液癌症的研究(部分5.2.1.2.1.)，与参考衍生物或参考细胞(例如HL60或正常细胞)相比胰腺癌细胞中标记的HSP90抑制剂(例如PU-H71-FITC2)的相对结 合程度越高，胰腺肿瘤或肿瘤细胞越对HSP90抑制剂疗法敏感(图19)。在一些实施例 中，结合肿瘤细胞与参考细胞的比率为约2或更大表明胰腺癌患者将对HSP90抑制疗法 敏感。在其它实施例中，结合胰腺癌肿瘤或肿瘤细胞与参考细胞的比率为2.5或更大表 明癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。在其它实施例中，结合胰腺癌肿瘤或肿瘤细胞与 参考细胞的比率为3或更大表明癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。
5.2.1.2.3.癌症干细胞
本发明提供了确定相对于正常细胞(例如淋巴细胞)在癌症干细胞(CSC)中“致 癌HSP90”的量并且由此确定CSC是否对HSP90抑制剂疗法起反应的方法。新近的证 明表明癌症干细胞(CSC)针对不同类型的癌症能够开始并维持疾病。此外，已经展示 这些细胞对常见的化学治疗剂具有抗性并且因此更可能引起疾病复发或转移。因此，关 键的是鉴别可以除去CSC的疗法以获得更好的治疗结果。热休克蛋白(HSP)在蛋白质 合成、维持和降解中起着重要的监督角色。图23中，提供急性骨髓白血病(AML)干 细胞中的数据，这些数据显示CSC群体对HSP90抑制敏感并且敏感性与如被标记的 PU-H71识别的致癌肿瘤HSP90物质的丰度有关。
图23A显示PU-FITC与白血病干细胞(LSC，CD34+CD38-CD45dim)和淋巴细胞 的结合的比率。将原代AML样品与1μM PU-H71-FITC2在37℃下一起培育4小时。细 胞用CD34、CD38、CD45和7-AAD染色，接着进行流式细胞术分析。图23B显示在用 1μM PU-H71处理48小时后LSC相对于来自三个原代AML样品的未经处理对照的活 力百分比。细胞在膜联蛋白V和7-AAD染色前用CD45、CD34和CD38染色。LSC活 力通过流式细胞术来测量并且确定为CD45dim CD34+CD38-门的膜联蛋白V-/7AAD-百 分比。显著地，与PU-H71-FITC2较高程度结合的细胞对用HSP90抑制剂处理最敏感。
类似于血液癌症的研究(部分5.2.1.2.1.)，与相同患者内正常细胞(例如淋巴细胞) 相比CSC中荧光标记的HSP90抑制剂(例如PU-H71-FITC2)的相对结合程度越高， CSC越对HSP90抑制剂疗法敏感。在一些实施例中，结合CSC与正常淋巴细胞的比率 为1.5或更大表明癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。在其它实施例中，结合CSC与 正常淋巴细胞的比率为2或更大表明癌症患者将对HSP90抑制疗法敏感。
5.2.1.2.4.循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞(CTC)是已经与原发性肿瘤分开并且在血流中循环的细胞。CTC可能形成不同组织中随后额外肿瘤生长(转移)的种子。图20展示从HER2+转移性乳癌 患者分离的CTC的标记。从其血浆分离的肿瘤细胞与PUFITC的结合是也从其血浆分离 的白血球(CD45+CD14-细胞)的约84倍之多，表明这些肿瘤细胞具有高含量的致癌 HSP90并且使用HSP90抑制剂的疗法将有效地杀死它们。实际上，在此患者接收20 mg/m2剂量的PU-H71后二十四小时，测出血液中CTC的数目下降6倍。
5.2.2.用于检测致癌HSP90的放射性标记的探针
本发明提供了使用放射性标记的探针，其能够检测癌细胞中的致癌HSP90。部分5.2.2.1描述了根据本发明使用的各种类型的探针。部分5.2.2.2描述了所述探针在预后和诊断性分析中的用途。
5.2.2.1.放射性标记的探针
可以在不改变抑制剂的亲和力、选择性或生物学分布型态下标记的HSP90抑制剂是 达成预后和/或诊断目的理想的探针。在一个实施例中，探针是HSP90抑制剂的碘124 放射性标记的型式。在另一实施例中，探针是HSP90抑制剂的碘131放射性标记的型式。 在另一实施例中，探针是HSP90抑制剂的碘123放射性标记的型式。在另一实施例中， 探针是HSP90抑制剂的碘125放射性标记的型式。
在一个实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000591
或其医药学上可接受的盐，其中：
(a)Z1、Z2和Z3中的每一者独立地是CH或N；
(b)Y是CH2、O或S；
(c)Xa、Xb、Xc和Xd独立地选自经选择以满足价数的CH、CH2、O、N、NH、S、 羰基、氟亚甲基和二氟亚甲基，其中键结到X基团的每一键是单键或双键；
(d)X2是123I、124I、125I或131I；
(e)X4是氢或卤素；并且
(f)R为经取代或未经取代的直链或分支链烷基、经取代或未经取代的直链或分支链烯基、经取代或未经取代的直链或分支链炔基或经取代或未经取代的环烷基，其中R 基团任选地间杂有-S(O)N(RA)-、-NRAS(O)-、-SO2N(RA)-、-NRASO2-、-C(O)N(RA)-或 -NRAC(O)-，和/或R基团任选地经-S(O)NRARB、-NRAS(O)RB、-SO2NRARB、-NRASO2RB、 -C(O)NRARB或-NRAC(O)RB终止，其中每一RA和RB独立地选自氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、芳基烷基、 烷基杂芳基、杂芳基烷基和烷基杂芳基烷基。
在另一实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000592
或其医药学上可接受的盐，其中：
(a)Z1、Z2和Z3中的每一者独立地是CH或N；
(b)Y是CH2、O或S；
(c)Xa、Xb、Xc和Xd独立地选自经选择以满足价数的CH、CH2、O、N、NH、S、 羰基、氟亚甲基和二氟亚甲基，其中键结到X基团的每一键是单键或双键；
(d)X2是123I、124I、125I或131I；
(e)X4是氢或卤素；并且
(f)R是-(CH2)m-N-R10R11R12或-(CH2)m-N-R10R11，其中m是2或3并且其中R10-R12独立地选自氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、羟基烷基、异丙基、叔丁基、异 丁基、环戊基、包括氮的3元环或包括N和任选地额外杂原子的6元环，具有取代基以 满足价数，其限制条件为当所有R10-R12都存在时，化合物进一步包含医药学上可接受 的平衡离子。
在另一实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000601
或其医药学上可接受的盐，其中：
Y是CH2或S；
X4是H或卤素；
X2是123I、124I、125I或131I；并且
R是-(CH2)m-N-R10R11R12或-(CH2)m-N-R10R11，其中m是2或3并且其中R10-R12独 立地选自氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、羟基烷基、异丙基、叔丁基、异丁 基、环戊基、包括氮的3元环或包括N和任选地额外杂原子的6元环，具有取代基以满 足价数，其限制条件为当所有R10-R12都存在时，化合物进一步包含医药学上可接受的 平衡离子。
在一个实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000602
或其医药学上可接受的盐，其中：
Y是CH2或S；
X4是H或卤素；
X2是123I、124I、125I或131I；并且
R是2-乙烷磺酸异丙酰胺、2-乙烷磺酸乙基酰胺、2-乙烷磺酸甲基酰胺、2-乙烷磺酸酰胺、2-乙烷磺酸叔丁酰胺、2-乙烷磺酸异丁酰胺、2-乙烷磺酸环丙酰胺、异丙烷磺 酸2-乙基酰胺、乙烷磺酸2-乙基酰胺、N-2乙基甲烷磺酰胺、2-甲基-丙烷-2-磺酸2-乙 基酰胺、2-甲基-丙烷-2-亚磺酸2-乙基酰胺、2-甲基-丙烷-1-磺酸2-乙基酰胺、环丙烷磺 酸2-乙基酰胺、3-丙烷-1-磺酸异丙酰胺、3-丙烷-1-磺酸乙基酰胺、3-丙烷-1-磺酸甲基酰 胺、3-丙烷-1-磺酸酰胺、3-丙烷-1-磺酸叔丁酰胺、3-丙烷-1-磺酸异丁酰胺、3-丙烷-1- 磺酸环丙酰胺、丙烷-2-磺酸3-丙基酰胺、乙烷磺酸3-丙基酰胺、N-3-丙基甲烷磺酰胺、 2-甲基-丙烷-2-磺酸3-丙基酰胺、2-甲基-丙烷-2-亚磺酸3-丙基酰胺、2-甲基-丙烷-1-磺酸 3-丙基酰胺、环丙烷磺酸3-丙基酰胺、3-N-异丙基丙酰胺、3-N-乙基丙酰胺、3-N-甲基 丙酰胺、3-丙酰胺、3-N-叔丁基丙酰胺、3-N-异丁基丙酰胺、3-N-环丙基丙酰胺、N-2- 乙基异丁酰胺、N-2-乙基丙酰胺、N-2-乙基乙酰胺、N-2-乙基甲酰胺、N-2-乙基2,2-二 甲基-丙酰胺、N-2-乙基3-甲基丁酰胺或环丙烷甲酸2-乙基-酰胺。
在另一实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000611
或其医药学上可接受的盐，其中：
Xa和Xb中的一者是O并且另一者是CH2；
Y是CH2或S；
X4是氢或卤素；并且
X2是123I、124I、125I或131I；并且
R是2-乙烷磺酸异丙酰胺、2-乙烷磺酸乙基酰胺、2-乙烷磺酸甲基酰胺、2-乙烷磺酸酰胺、2-乙烷磺酸叔丁酰胺、2-乙烷磺酸异丁酰胺、2-乙烷磺酸环丙酰胺、异丙烷磺 酸2-乙基酰胺、乙烷磺酸2-乙基酰胺、N-2乙基甲烷磺酰胺、2-甲基-丙烷-2-磺酸2-乙 基酰胺、2-甲基-丙烷-2-亚磺酸2-乙基酰胺、2-甲基-丙烷-1-磺酸2-乙基酰胺、环丙烷磺 酸2-乙基酰胺、3-丙烷-1-磺酸异丙酰胺、3-丙烷-1-磺酸乙基酰胺、3-丙烷-1-磺酸甲基酰 胺、3-丙烷-1-磺酸酰胺、3-丙烷-1-磺酸叔丁酰胺、3-丙烷-1-磺酸异丁酰胺、3-丙烷-1- 磺酸环丙酰胺、丙烷-2-磺酸3-丙基酰胺、乙烷磺酸3-丙基酰胺、N-3-丙基甲烷磺酰胺、2-甲基-丙烷-2-磺酸3-丙基酰胺、2-甲基-丙烷-2-亚磺酸3-丙基酰胺、2-甲基-丙烷-1-磺酸 3-丙基酰胺、环丙烷磺酸3-丙基酰胺、3-N-异丙基丙酰胺、3-N-乙基丙酰胺、3-N-甲基 丙酰胺、3-丙酰胺、3-N-叔丁基丙酰胺、3-N-异丁基丙酰胺、3-N-环丙基丙酰胺、N-2- 乙基异丁酰胺、N-2-乙基丙酰胺、N-2-乙基乙酰胺、N-2-乙基甲酰胺、N-2-乙基2,2-二 甲基-丙酰胺、N-2-乙基3-甲基丁酰胺或环丙烷甲酸2-乙基-酰胺。
在另一实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000621
或其医药学上可接受的盐，其中：
Xa-Xc-Xb是CH2-CH2-CH2、CH＝CH-CH2或CH2-CH＝CH；
Y是CH2或S；
X2是123I、124I、125I或131I；并且
R是2-乙烷磺酸异丙酰胺、2-乙烷磺酸乙基酰胺、2-乙烷磺酸甲基酰胺、2-乙烷磺酸酰胺、2-乙烷磺酸叔丁酰胺、2-乙烷磺酸异丁酰胺、2-乙烷磺酸环丙酰胺、异丙烷磺 酸2-乙基酰胺、乙烷磺酸2-乙基酰胺、N-2乙基甲烷磺酰胺、2-甲基-丙烷-2-磺酸2-乙 基酰胺、2-甲基-丙烷-2-亚磺酸2-乙基酰胺、2-甲基-丙烷-1-磺酸2-乙基酰胺、环丙烷磺 酸2-乙基酰胺、3-丙烷-1-磺酸异丙酰胺、3-丙烷-1-磺酸乙基酰胺、3-丙烷-1-磺酸甲基酰 胺、3-丙烷-1-磺酸酰胺、3-丙烷-1-磺酸叔丁酰胺、3-丙烷-1-磺酸异丁酰胺、3-丙烷-1- 磺酸环丙酰胺、丙烷-2-磺酸3-丙基酰胺、乙烷磺酸3-丙基酰胺、N-3-丙基甲烷磺酰胺、 2-甲基-丙烷-2-磺酸3-丙基酰胺、2-甲基-丙烷-2-亚磺酸3-丙基酰胺、2-甲基-丙烷-1-磺酸 3-丙基酰胺、环丙烷磺酸3-丙基酰胺、3-N-异丙基丙酰胺、3-N-乙基丙酰胺、3-N-甲基 丙酰胺、3-丙酰胺、3-N-叔丁基丙酰胺、3-N-异丁基丙酰胺、3-N-环丙基丙酰胺、N-2- 乙基异丁酰胺、N-2-乙基丙酰胺、N-2-乙基乙酰胺、N-2-乙基甲酰胺、N-2-乙基2,2-二 甲基-丙酰胺、N-2-乙基3-甲基丁酰胺或环丙烷甲酸2-乙基-酰胺。
在另一实施例中，放射性标记的探针是以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000631
或其医药学上可接受的盐，其中：
X3是CH2、CF2、S、SO、SO2、O、NH或NR2，其中R2是烷基；
X2是123I、124I、125I或131I；
X4是氢或卤素；
X5是O或CH2；
R是3-异丙基氨基丙基、3-(异丙基(甲基)氨基)丙基、3-(异丙基(乙基)氨基)丙基、 3-((2-羟基乙基)(异丙基)氨基)丙基、3-(甲基(丙-2-炔基)氨基)丙基、3-(烯丙基(甲基)氨基) 丙基、3-(乙基(甲基)氨基)丙基、3-(环丙基(丙基)氨基)丙基、3-(环己基(2-羟基乙基)氨基) 丙基、3-(2-甲基氮丙啶-1-基)丙基、3-(哌啶-1-基)丙基、3-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)丙基、 3-吗啉基丙基、3-(三甲基铵基)丙基、2-(异丙基氨基)乙基、2-(异丁基氨基)乙基、2-(新 戊基氨基)乙基、2-(环丙基甲基氨基)乙基、2-(乙基(甲基)氨基)乙基、2-(异丁基(甲基)氨 基)乙基或2-(甲基(丙-2-炔基)氨基)乙基；并且
n是1或2。
在另一实施例中，放射性标记的探针选自具有以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000641
在另一实施例中，放射性标记的探针选自具有以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000651
在另一实施例中，放射性标记的探针选自具有以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000661
在另一实施例中，放射性标记的探针选自具有以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000671
在另一实施例中，放射性标记的探针选自具有以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000681
在另一实施例中，放射性标记的探针选自具有以下各式的化合物：
Figure BDA0001717339850000691
以上实施例中合成放射性示踪剂的方法可见于例如美国专利第7,834,181号、WO2011/044394、WO 2008/005937和PCT申请案PCT/US2012/032371中，所有这些的内容 以全文引用的方式并入本文中。放射性标记的探针的特定实例描述于部分5.2.2.2.1.和5.2.2.2.2.中。
5.2.2.2.癌症治疗中放射性标记的探针的使用
为了非侵入性地测量HSP90肿瘤物质(“致癌HSP90”)的表达、确定肿瘤对HSP90 的依赖性以及确定标靶抑制，使用正电子发射断层摄影法(PET)分析，其是基于选择 性地结合于癌细胞中的“致癌HSP90”的HSP90特定抑制剂。出于许多迫不得已的原 因，正电子发射断层摄影术(PET)非常适于测量个别患者的肿瘤中药物的药物动力学 和滞留110-113。PET是一种与其它形式的核成像相比，具有较高分辩率和灵敏度的定量 方法。其允许非侵入性的三维成像，可靠地估计肿瘤和正常器官内投予的放射性标记的 化合物的组织浓度(例如每公克所注射的剂量的μCi或百分比(％ID))，不管其在体内 的深度如何110-113。因此PET可以提供在空间和时间上分辨的肿瘤吸收、浓度和清除率 以及示踪剂的整个身体分布。因为PET不一定提供详细的解剖信息，所以PET分析通 常与CAT扫描组合。CAT扫描提供了对身体的结构解剖的全面观察。PET扫描影像可 以覆盖在CAT扫描上面以准确地确定体内放射性标记的抑制剂所去之处。PET扫描与 CAT扫描的组合使用将在本文中称为PET/CT。
还可以使用除PET以外的检测和定量方法。在一个实施例中，可以使用SPECT成 像(单光子发射计算机断层摄影法)示踪剂，例如碘131、碘123和碘125。在具体实 施例中，131I-PU-H71、123I-PU-H71或125I-PU-H7可以用作用于SPECT成像的放射性标 记的抑制剂。
本发明的方法可应用到任何可以成像的肿瘤，最清晰的可应用性是用于实体和液体 肿瘤或淋巴瘤。所述肿瘤的实例是与选自由以下组成的群组的癌症有关的肿瘤：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包 括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤 在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿 瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、多发 性骨髓瘤、骨髓增生性赘生物以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症， 尤其乳癌、胃癌或胰腺癌。如下文所讨论，展示肿瘤对放射性标记的HSP90抑制剂(例 如124I-PU-H71)的吸收和暴露以可预测对HSP90疗法的反应，并且将区分可能对PU-H71 或其它HSP90疗法具有有利的或不利的治疗反应的患者的方式变化。确切地说，显示放 射性标记的HSP90抑制剂(例如124I-PU-H71)最低程度吸收和/或迅速清除的肿瘤可能 是PU-H71或其它HSP90抑制剂难接近或对其有抗性的。或者，所述肿瘤的存活可能不 依赖于HSP90(即，“低丰度的“致癌HSP90”)，因而HSP90疗法是不适当的。相反 地，对放射性标记的HSP90抑制剂高度吸收并且长期滞留(例如对应于在较后时间点的 高肿瘤:血液比率或对于0到24或48小时或48小时以上的时间间隔高肿瘤AUC)的肿 瘤将预测对用HSP90抑制剂靶向更敏感。如果如通过PET预测，实现有效肿瘤浓度所 需的治疗剂量和时程将产生禁止性毒性(例如有效剂量高于最大耐药剂量(MTD)或如 果使用高于MTD的剂量仅仅占有15％到100％的“致癌HSP90”，那么可以进一步指 导患者选择。
如通过放射性标记的抑制剂的吸收来测量的HSP90致癌复合物(即，“致癌HSP90”)的丰度反映了肿瘤对HSP90抑制的敏感性。因此，根据本发明的一个方面， 肿瘤内“致癌HSP90”的丰度用作对HSP90抑制的反应的生物标记物。如上所讨论， PET允许非侵入性、可靠地估计肿瘤和正常器官内放射性标记的化合物的组织浓度。因 此[124I]-PU-H71和优先结合于HSP90致癌物质的其它HSP90抑制剂可以用以非侵入性 地测量其肿瘤吸收，这是一种类似于以上描述的荧光标记的PU-H71的使用，允许定量 “致癌复合HSP90”的特征。因此，放射性标记的抑制剂的高度肿瘤吸收将鉴别患有很 可能对HSP90抑制剂起反应的肿瘤的患者。使用所属领域的技术人员已知的技术，从 PET影像来定量肿瘤内PU-H71示踪剂的累积。PU-H71示踪剂的肿瘤累积可以在单个 时间点或多个时间点，从肿瘤示踪剂浓度的分析定量。示踪剂浓度是指特定体积的组织 中存在的示踪剂的量。如所属领域的技术人员已知，现行技术中广泛已知表示示踪剂浓 度的各种数学形式。示踪剂-量和/或组织-体积每一者可以表示为参考值的一部分。举例 来说，通常使用的标准化吸收值SUV将示踪剂-量表示为向患者投予的总示踪剂-剂量的 一部分；并且将组织-体积表示为身体参考值(例如体重或体表面积)的一部分。
在本发明中，展示癌症患者显示对选择性地结合于“致癌HSP90”的放射性标记的抑制剂可变的‘亲合力’(吸收和滞留)。患有类似类型和阶段的癌症的癌症患者可以 具有实质上不同的对放射性标记的抑制剂的吸收，此表明HSP90在癌细胞的存活和增殖 中的涉及程度不同。举例来说，评估24小时后十二名乳癌患者对[124I]-PU-H71的吸收。 这些研究的结果描绘于图24中。图上的每一个条表明如通过PET确定的[124I]-PU-H71 的最大标准化吸收值(SUVmax)。SUVmax在患者之间显著地变化，这表明患者肿瘤中“致 癌HSP90”的量有差异。。具有较高SUVmax值的患者更可能对HSP90抑制疗法起反应。 举例来说，当在投予放射性示踪剂后24小时测量时[124I]-PU-H71的SUVmax为约0.25 或更大的患者是HSP90抑制疗法可能的候选者。当在投予化合物后24小时测量时 [124I]-PU-H71的SUVmax为约0.75或更大的患者是HSP90抑制疗法有力的候选人。当在 投予化合物后24小时测量时[124I]-PU-H71的SUVmax为约1.5或更大的患者是HSP90抑 制疗法非常有力的候选人。
基于癌症患者对特定HSP90抑制剂(即，优先结合于“致癌HSP90”的HSP90抑 制剂)显示可变的亲合力的发现，放射性标记的HSP90抑制剂可以用于区分可能对 HSP90抑制疗法起反应的患者与不可能起反应的患者。因此，本发明提供了一种用于确 定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含使肿瘤或含有来自 肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的 可检测地标记的HSP90抑制剂接触，测量结合于肿瘤或样品中肿瘤细胞的标记的HSP90 抑制剂的量，并且将结合于肿瘤或样品中肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与参考量 比较。结合于肿瘤或肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明肿瘤将可能对 HSP90抑制剂起反应。
测量结合于肿瘤或肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量可以用许多不同的方式进行。举例来说，在一个实施例中，如上所讨论，在特定的时间点计算放射性标记的化合 物的SUVmax(或SUVavg)。举例来说，SUV可以在投予放射性标记的抑制剂后4小时或 4小时以上的时间计算。在一些实施例中，SUV可以在投予放射性标记的抑制剂后8小 时或8小时以上的时间计算。在具体实施例中，SUV可以在投予放射性标记的抑制剂后 16小时或16小时以上的时间(例如16小时、20小时、24小时、48小时、72小时、192 小时)计算。SUV可以在任两个前述值范围内，例如在8小时到16小时、16小时到24 小时、16小时到48小时等范围内的时间计算。
SUV可以与结合于正常细胞的标记的HSP90抑制剂的参考量比较。在一个实施例中，参考SUV可以是在特定时间点取自健康个体或取自对照群体中癌症患者的正常细 胞和组织的测量值的平均水平。如部分5.1.中所讨论，正常细胞具有最低或无“致癌 HSP90”。因此，在健康个体或癌症患者的健康组织或器官的细胞中对“致癌HSP90” 具有特异性的放射性标记的抑制剂的吸收是最低的。所属领域的技术人员应了解，在标 记的抑制剂已经从血液循环清除时测量是优选的。所属领域的技术人员还应了解，测量 可以在任何正常的组织中进行，但那些未参与标记的抑制剂新陈代谢和清除的组织是优 选的。在一个实施例中，所述优选的测量是来自如选自骨骼肌、骨头或心脏血液池的一 个或一个以上区域。
在另一实施例中，患者肿瘤中放射性标记的抑制剂的最大吸收(即，SUVmax)(本 文中称为“肿瘤SUV’)可以与患者健康细胞中放射性标记的抑制剂的吸收比较。举例 来说，在一个实施例中，在特定时间点取得的来自患者肿瘤的SUV数据可以与来自血 液或来自患者骨头或肌肉的选定区域的SUV比较。术语“血液SUV”是指来源于PET 分析的心脏内含物的平均SUV。术语“肌肉SUV”是指来源于PET分析的患者骨骼肌 肉系统的平均SUV。选择心脏和骨骼肌肉系统是因为其代表了在肿瘤部位周围的‘背 景’活性。
使用PET分析进行患者选择和处理
已经发现，在患有依赖于HSP90的肿瘤的患者中，来源于PET的肿瘤:肌肉和肿瘤:血液SUV比率在注射或特异性地结合“致癌HSP90”的放射性标记的抑制剂(例如 [124I]-PU-H71)后以时间依赖性方式增加。在这些患者中，在注射放射性标记的抑制剂 后，肿瘤:肌肉和肿瘤:血液SUV比率一般接近1:1，并且比率随时间推移而增加。图25 中展示来源于选定数目的对HSP90抑制疗法起反应的患有各种类型实体肿瘤和液体肿 瘤的患者的PET的数据。对于每一患者，在投予[124I]-PU-H71后多个时间的最大肿瘤 SUV(SUVmax)和平均肌肉SUV从PET分析中获得。图25展示癌症患者的平均肿瘤: 肌肉SUV比率和标准偏差值。肿瘤:肌肉SUV比率从0到48小时增加。
除实体肿瘤外，所述方法允许液体肿瘤的成像，例如经诊断患有边缘区淋巴瘤和IV 期慢性淋巴细胞性白血病的患者的情况，其呈现通过PU-PET可成像的巨大脾肿大。
基于此数据累积，已经确定在投予特异性地结合“致癌HSP90”的HSP90抑制剂后肿瘤:肌肉SUV和/或肿瘤:血液SUV比率超过2的癌症患者可能对HSP90抑制疗法起反 应。比率优选地在投予放射性标记的抑制剂后4小时以上的一个或一个以上时间计算。 举例来说，比率可以在投予放射性标记的抑制剂后8小时、16小时、24小时或48小时 的时间计算。在特定实施例中，在投予放射性标记的抑制剂后24小时的时间肿瘤:肌肉 或肿瘤:血液SUV比率为2.5或更大表明患者可能对HSP90抑制疗法起反应。在其它实 施例中，在投予放射性标记的抑制剂后24小时的时间肿瘤:肌肉或肿瘤:血液SUV比率 为4或更大表明患者可能对HSP90抑制疗法起反应。在其它实施例中，在投予放射性标 记的抑制剂后24小时的时间肿瘤:肌肉或肿瘤:血液SUV比率为5或更大表明患者可能 对HSP90抑制疗法起反应。在这些实施例中，肿瘤中的SUV是SUVmax并且肌肉或血液 中的SUV是平均SUV(即，SUVavg)。
在另一实施例中，在肿瘤中获得的PET影像与患者的健康(即，非癌)组织相比较。优选地，在此实施例中，参考PET扫描在与肿瘤相同的器官中取得。举例来说，如果患 者的脊柱中具有肿瘤，那么脊柱肿瘤与正常脊柱骨相比较。如果肿瘤依赖于HSP90，那 么将在此肿瘤中发现比健康组织中更大浓度的放射性标记的抑制剂。放射性标记的抑制 剂的量可以使用PET扫描定量测定。可以在注射放射性标记的抑制剂后的特定时间点或 多个时间点，将肿瘤的SUV值与健康的周围组织的SUV值相比较。或者，来自肿瘤的 PET影像和来自健康组织的PET影像可以通过目测检查进行比较。如果肿瘤保留放射性 标记的抑制剂，那么在PET影像上，在视觉上，肿瘤将‘点亮’并且看起来像‘热点’ (例如参见图26和图27)。
已经确定在投予放射性标记的抑制剂后特定的时间‘热点’的存在意味着HSP90与患者癌症有牵连并且表明患者将服从HSP90抑制疗法。PET影像中热点的存在优选地 在投予放射性标记的抑制剂后至少1.5小时的时间确定。举例来说，热点可以在投予放 射性标记的抑制剂后2小时、4小时、6小时、8小时、16小时、24小时、48小时、72 小时、165小时或192小时检测。热点的存在可以在由任两个前述值界定的范围之间， 例如在2小时到4小时、4小时到8小时、16小时到24小时等范围内的时间检测。在 少于2小时的时间点患者肿瘤中热点的存在不一定表明患者将是HSP90抑制疗法的优良 候选者。举例来说，图26(右图)描绘在[124I]-PU-H71注射后30分钟取得的套细胞淋 巴瘤患者的[124I]-PU-H71 PET/CT。PET扫描展示30分钟后清晰的可见性。然而，在后 期阶段(3.5-24小时)未观测到[124I]-PU-H71的吸收。因此，患者不是HSP90疗法可能 的候选者。
本发明的PET分析还可以用以确定哪些转移性或原发性实体肿瘤和液体肿瘤对HSP90抑制疗法更敏感。举例来说，图27展示两个指示的淋巴结(LN)中复发性乳癌 患者的[124I]-PU-H71 PET/CT。将在[124I]-PU-H71注射后指示时间的PET影像定量并且 针对假设的10mg/m2的PU-H71的投予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUV数据转 变为HSP90抑制剂浓度。还计算在0到24小时的时间内两个肿瘤对PU-H71的暴露并 且表示为曲线下面积(AUC)。在图27的下图中，CT(左)、PU-PET/CT(中间)和 FDG-PET/CT联合(右)经轴影像显示一个淋巴结而非另一个中的[124I]-PU-H71-亲合力。 PU-PET成像是在[124I]-PU-H71注射后24小时。有趣地，在这种情况下PU-亲合力不与 FDG-亲合力重叠。这不是一种独特的情况，并且对于一些肿瘤而非所有肿瘤中，在若干 分析患者中FDG-亲合力和PU-亲合力相关。肿瘤的位置由箭头指示。在注射[124I]-PU-H71 后指示时间的PET影像测量为最大标准化吸收值(SUVmax)。PET分析的结果指示气管 支气管左角淋巴结预计比气管支气管左前角淋巴结的病变对HSP90抑制疗法敏感。
在本发明的另一方面，确定为HSP90疗法候选者的患者用医药学上有效量的HSP90抑制剂处理。已经确定了确定是HSP90抑制疗法候选者的癌症患者高度有利地对HSP90 抑制疗法起反应。如果患者具有多个肿瘤，那么预计只有对放射性标记的HSP90抑制剂 具有足够亲合力的那些肿瘤才对HSP90抑制疗法起反应。举例来说，图28展示针对肺 和骨头转移的48岁乳癌患者获得的影像，对此患者用[124I]-PU-H71成像并且接着用 HSP90抑制剂处理。确切地说，当患者用[124I]-PU-H71成像时，扫描展示在显性右肺转 移中靶向HSP90，而不是脊柱转移中。当患者进行使用STA9090(格尼特皮(ganetespib)) (化学上不同于PU-H71的一种HSP90抑制剂)的HSP90疗法时，通过FDG PET-CT研 究在肺肿块中，而不是脊柱病变中显示早期部分反应(图28)，与通过[124I]-PU-H71 PET 的预测。类似的结果在淋巴瘤、胰腺癌和成神经细胞瘤患者的患者中获得。
使用PET分析确定剂量
本发明提供了确定使用HSP90抑制剂的疗法投予的有效剂量和频率的方法，其包含 向患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的HSP90抑制剂的放射性标记的形式，在一个或一个以上时间点测量患者肿瘤对HSP90抑制剂的放 射性标记的形式的吸收，并且计算在每个时间点维持肿瘤中有效治疗肿瘤的浓度的 HSP90抑制剂所需的投予剂量和频率。HSP90抑制剂的放射性标记的形式的吸收可以使 用如上所讨论的PET分析测定。此方法可以施加于许多类型的实体和液体肿瘤，包括(但 不限于)结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、 前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃 肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌症、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶 质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤、白血病、 骨髓瘤和骨髓增生性赘生物以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
在本发明的一个实施例中，根据以下方程式，来源于PET的放射性标记的抑制剂的SUV可以转变为肿瘤中药物的摩尔浓度：
Figure BDA0001717339850000751
在以上方程式中，[HSP90抑制剂]t是在注射放射性标记的抑制剂后的时间t肿瘤中 抑制剂的摩尔浓度。术语HSP 90抑制剂(剂量)是注射的治疗剂量。术语W是肿瘤水间 隙(tumor water space)。术语MW是注射药物的分子量。术语[A肿瘤]t是在时间t肿瘤中 注射的放射性标记的剂量％，从获自PET影像的SUV中获得的值。确切地说，术语[A肿瘤] 可以通过以下方程式，从肿瘤中SUV(SUV肿瘤)推导而来：
[A肿瘤]/100％＝SUV肿瘤/[体重(g)]
在以上方程式中，[体重]是指患者的体重。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定癌症患者中可成像的肿瘤中存在的HSP90 抑制剂浓度的方法。将放射性标记的抑制剂的溶液(本文中又称为“热”药物)注射到患者中，不同时注射药物(即，药物的非放射性标记的形式，本文中又称为“冷”药物)。 在所述情况下，药物[HSP90抑制剂肿瘤]t的浓度可以使用上述方程式确定。在一个实施例 中，放射性标记的抑制剂(“热药物”)是注射药物(“冷药物”)的标记形式。举例 来说，放射性标记的抑制剂可以是[124I]-PU-H71并且投予药物可以是PU-H71。在另一 实施例中，放射性标记的抑制剂可以不同于注射药物。肿瘤中药物浓度[HSP90抑制剂肿瘤]t 的确定可以在注射放射性标记的抑制剂和治疗药物后单一时间点或多个时间点确定。通 过将肿瘤中药物浓度[HSP90抑制剂肿瘤]t与从临床前研究中获得的已知有效剂量(例如半 抑制浓度(IC50))比较，可以确定投予剂量是否将是有效的。然后医生可以因此调节剂 量以确保所需量的药物在肿瘤中。
在放射性标记的抑制剂是有待投予患者的药物的放射性标记的形式的实施例中，肿 瘤中药物浓度[HSP90抑制剂肿瘤]t可以在实际上不投予冷药物的情况下确定。在所述情况 下，在从PET分析确定[A肿瘤]t后，可以将不同的假设注射剂量值(D)输入以上方程式 中以确定肿瘤中药物浓度[HSP90抑制剂肿瘤]t。由此可以通过如上所讨论，将肿瘤中药物 浓度[HSP90抑制剂肿瘤]t与从临床前研究中获得的已知有效剂量比较来确定有效剂量。此 外，如部分5.2.1.2.1.中详细地讨论，此方法可以用于设计HSP90疗法的有效给药方案。
已经确定，输入假设量的HSP90抑制剂，计算在仅仅投予热药物后的肿瘤浓度或药物暴露(例如AUC)提供了类似于冷和热药物共投予的实验的结果。举例来说，图29 展示在患病的气管旁淋巴结中在成像时间(0-72小时)内如通过这两种方法所获得的 PU-H71的浓度。通过这两种方法测出非常类似的肿瘤浓度和因此肿瘤对PU-H71暴露 (AUC0-48h 24.9对比22.3μM-h)。
本发明还提供了确定使肿瘤中致癌HSP90受体饱和所需的HSP90抑制剂的剂量的方法。如上所述，PET分析可以通过共注射放射性标记的HSP90抑制剂(即，热药物) 和特定量的治疗药物(即，冷药物)进行。如果注射药物的剂量高到足够占有肿瘤内的 大部分或所有“致癌HSP90”，那么放射性标记的抑制剂的吸收被抑制。放射性标记的 抑制剂的吸收被抑制的点可以用于确定抑制剂的标靶饱和剂量，此还将是单剂量的药物 可以递送的‘最大肿瘤剂量’或药物的最大有效单剂量。如下文部分5.2.2.2.1.的方程式 (4)中所示，可以计算由HSP90抑制剂占有的肿瘤位点数目并且转变为占有率百分比。 如果HSP90抑制剂以接近完全占有HSP90位点的量递送，那么预计额外的药物将不会 增加功效水平。因此，此方法提供了一种确定可以占有肿瘤中大部分或所有致癌HSP90 的抑制剂剂量的方式。如部分5.2.2.2.1.中更详细地讨论，以上描述的方法提供了一种更 合理并且有效的给药策略，它是基于PET推导的最大有效肿瘤浓度，而不是常规的最大 耐受剂量(MTD)。此方法避免了剂量递增并且限制了与药物有关的毒物学问题。
5.2.2.2.1.[124I]-PU-H71
在本发明的一个方面，待用于PET成像的放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71 的放射性标记的形式，例如[124I]-PU-H71。如下所讨论，使用[124I]-PU-H71的PET成像 可以用于告知医师癌症患者是否将对HSP90疗法敏感。此外，从使用[124I]-PU-H71的 PET成像中获得的结果可以用于确定应向特定癌症患者投予的HSP90抑制剂的剂量。另 外，从使用[124I]-PU-H71的PET成像中获得的结果可以用于确定HSP90抑制剂的给药 时程。待作为疗法投予的HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生 物。
作为潜在非侵入性肿瘤HSP90分析的[124I]-PU-H71 PET分析
用于HSP90抑制剂非侵入性分析的PET的引入是可行的，因为HSP90抑制剂之一PU-H71含有内源性碘原子，天然存在的稳定同位素碘-127(127I)(图30a)114。对于PET， 此可以被长寿命正电子发射体碘-124(124I)(一种物理半衰期为四天的同位素)同位素 取代(图30a)。所述同位素标记不改变此化合物的亲和力、选择性或生物学分布型态。 实际上，PET放射性药物[124I]-PU-H71是与治疗化合物PU-H71相同的分子，并且因此 应预测其药物动力学。单次投予痕(微克)量放射性标记的药物在生物学上也是完全不 会造成扰乱的，并且允许连续的PET成像以监测多天内的组织示踪剂-浓度。
124I的相对长半衰期对于监测HSP90抑制剂报导的长时期肿瘤药物动力学来说是理 想的，因为其允许进行符合要求的定量PET成像长达投药后一周。此外，124I目前在美 国可购得，并且其半衰期确保[124I]-PU-H71可在全世界的医疗中心可得。
因此，[124I]-PU-H71非常适用作PU-H71的理想‘示踪剂’并且作为其它HSP90抑 制剂的标靶生物标记物。
HSP90抑制剂是一种有前途的靶向癌症疗法类别，但其最佳临床发展需要HSP90标靶特异性的药物计量学分析的协同发展。由于HSP90抑制剂PU-H71具有内源性碘， 所以使用其发展基于正电子发射断层摄影法的用于肿瘤HSP90的第一种非侵入性成像 分析。在乳癌小鼠模型中展示[124I]-PU-H71是一种用于肿瘤内药物动力学和母体药物的 药效学的理想示踪剂。显示其在确定实现有效肿瘤浓度所需的HSP90抑制剂的剂量、分 析递送到肿瘤的药物的实际浓度和设计有效的剂量和时程方案方面的用途。分析还告知 肿瘤标靶饱和剂量，有望引导HSP90疗法超过常规最大耐受剂量。基于此工作，提出此 分析将为临床医师提供改善的试验富集和针对个别患者改变药物剂量和时程的能力，有 望满足未得到满足的临床需求并且积极影响使用HSP90靶向药剂的临床决策。
[124I]-PU-H71生物学分布和清除映射出PU-H71的生物学分布和清除
为了评估[124I]-PU-H71预测和监测PU-H71和其它HSP90抑制剂在体内的动力学型态，已经制造出[124I]-PU-H71，并且对负载肿瘤的小鼠(人类乳癌MDA-MB-468异种移 植物)进行连续的小动物PET成像研究，得出肿瘤和各种正常组织的时间-活性(即， ％ID/g对比投予后时间)曲线。通过在注射后选择的时间处死成组动物并且收获肿瘤和 选择的正常组织并对其进行γ计数来进行[131I]-PU-H71或[124I]-PU-H71的确证生物学分 布研究(图30b-c)。静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)投予后，药剂迅速地分布到组织(图 30b；1-2小时)，随后迅速地从血液和其它正常组织清除(图30b；4到100小时)。在 投予后(p.a.)4小时，其以分别是脑、骨头、肌肉、脾和心脏中40、9、18、6和10倍 的浓度存在于肿瘤中(图30c)。到24小时，脑、肌肉、脾、心脏和血液的肿瘤与正常 组织比率增加到50到100。较小(按体积计约100mm3)和较大(按体积计约200mm3) 肿瘤中的吸收(％ID/g)类似(图30d)。
[124I]-PU-H71以双指数方式从肿瘤清除(图30d)。初始是可归因于血液载有的活性 清除的快速期(图30b、d)，接着是可归因于特定肿瘤滞留的缓慢终末清除期(半衰期 约60小时)(图30d，插图)，这与针对PU-H71先前报导的基于串联液相色谱质谱 (LC-MS/MS)的药物动力学数据一致100,115-118。这些数据支持如下观念：在肿瘤内，治 疗剂和此药物的放射性示踪剂形式举止相同。
与肿瘤对比，[124I]-PUH71以单指数方式从整个主体迅速清除，没有证据证明血浆蛋白质结合(图30b-d)。[124I]-PU-H71通过肝胆和尿途径排泄(图30b)。肝脏活性比 整个身体活性清除得慢，可能是因为肝脏药物代谢和肝胆排泄。肝区中的活性可能代表 胆系中完整示踪剂与代谢物而不是肝细胞中的[124I]-PU-H71，这与先前报导的完整 PU-H71迅速地从小鼠肝脏消失的发现一致100,117。胃肠道中的活性占投予活性的50％以 上(图30b)，但为几乎完全排泄的活性(未图示)。
非胃肠道和非泌尿生殖器官(即，肾、输尿管和膀胱)中的活性占投予活性的约1％。 剩余49％(胃肠道器官中的50％减去泌尿生殖器器官中的1％)可能通过泌尿道排泄。此观测结果由使用环绕整个小鼠并仅占投予活性的40-50％的感兴趣区(ROI)得到的4 小时体内[124I]-PU-H71 PET数据(图30b)支持。因为小鼠中肠通过时间通常比4小时 长119，所以很可能其余投予活性(即，不在4小时整个身体ROI中的40-50％)通过泌 尿道排泄。
目测甲状腺区中的放射性，如果小鼠在投予放射性示踪剂前接收饱和剂量的碘化钾，那么其被抑制(图30b)，表明体内产生游离放射性碘(即放射性碘化物)。在未接 收碘化钾的小鼠中，注射后4小时与28小时之间的最大甲状腺活性<投予活性的0.4％。 正常小鼠甲状腺积累达到约4-7％的投予放射线碘120,121。因此，<0.4％的甲状腺吸收表 明体内从[124I]-PU-H71释放的游离放射性碘的量小(约投予活性的5-10％)。少量游离放 射性碘的释放对于放射性碘化示踪剂来说并不罕见，并且在临床实践中，习惯性地并且 有效地，在投予放射性示踪剂前使用饱和碘化钾溶液的经口投与来阻止甲状腺的吸收。
[124I]-PU-H71允许通过PET清晰地目测肿瘤HSP90
负载肿瘤的小鼠中的体内[124I]-PU-H71 PET成像可清晰地目测肿瘤，并且因此提供 在注射后2小时起可能的肿瘤HSP90靶向和肿瘤滞留(图30b，箭头)。从ROI分析中 获得的平均(+标准偏差)吸收值(％ID/g)在4、24、48、72和100小时分别是0.35±0.07、 0.083±0.02、0.058±0.02、0.031±0.01和0.024±0.008，这与在生物学分布研究中获得的值 一致(图30d)，证实了体内PU-H71的非侵入性监测和其时间依赖性的肿瘤浓度的可靠 定量通过[124I]-PU-H71 PET是可能的。
使用[124I]-PU-H71 PET成像确定实现药理学有效的PU-H71肿瘤浓度所需的 PU-H71剂量
如上所指出，肿瘤和血液中[124I]-PU-H71以及因此未标记的PU-H71的药物动力学是显著不同的：到注射后约24小时，在基本上可归因于药物从肿瘤血池清除的初始快 速的指数清除后，肿瘤药物浓度稳定化。相比之下，血液药物水平显示出快速并连续的 指数清除(图30b、30d)。到注射后约12小时，[124I]-PU-H71的肿瘤与血液活性浓度比 到达约10和更大的值(图30c)。因此，积分得到的PU-H71血液水平(即血液时间-活 性浓度曲线下面积，AUCPU-H71 血液)不是PU-H71肿瘤水平的可靠替代品。实际上，肿瘤 时间-活性浓度曲线下面积AUCPU-H71 肿瘤是AUCPU-H71 血液的15倍(图30d，对于肿瘤和血 液，分别是11.4与0.78)。因此，血液药物动力学用于设计实现患者特异性治疗有效肿 瘤浓度的给药方案是不可靠的。
因此，研究[124I]-PU-H71 PET预测在选择时间段内实现和维持治疗有效肿瘤浓度所 需的投予的PU-H71剂量的能力。对于投予剂量的PU-H71(PU-H71剂量，以mg计)，在 投予后时间t的肿瘤水间隙(使用平均水间隙，W＝0.8mL/g)中的药物浓度(mg/mL 或g/L)[PUH71肿瘤]t由平衡状态下和投予后时间t时实现的通过PET得出的肿瘤中 [124I]-PU-H71活性浓度(以％ID/g计)[A肿瘤]t计算：
Figure BDA0001717339850000791
因此投予后时间t时肿瘤水间隙中药物浓度(以μM计)[PU-H71肿瘤]是：
Figure BDA0001717339850000792
其中因子512是PU-H71的分子量并且因子1×106将浓度转变成μM。
相反地，为了实现选择的治疗有效的肿瘤PU-H71浓度，对个别患者投予的PU-H71的所需剂量(以mg计)可以基于其通过PET得到的投予后时间t时的肿瘤中活性浓度 计算：
Figure BDA0001717339850000793
使用图30d中的肿瘤-活性数据，方程式(1a)用以计算针对1、5、25、50和75mg/kgPU-H71的投予剂量(对于20g小鼠0.02、0.1、0.5、1和1.5mg)，肿瘤中从投予后(p.a.) 0到160小时的时间依赖性PU-H71浓度(图31a，下图)。从在建立的癌细胞中使用 PU-H71的临床前研究已知，若干建立的乳癌细胞对HSP90抑制剂的72小时暴露会抑制 细胞生长，其中记录的半抑制浓度(IC50)为0.05到0.25μM，取决于细胞类型100。因 此，在每一先前剂量水平下通过[124I]-PU-H71 PET预测单次剂量，以通过投予后72小 时实现肿瘤中的治疗有效浓度(图31a，上图)。对于5、25、50和75mg/kg的PU-H71 的投予剂量和约0.14±0.05％ID/g的[A肿瘤]t＝24h值(图31d)，方程式(1a)分别得到0.37、 1.83、3.67和5.51μM的PU-H71的肿瘤浓度，这与在这些肿瘤中通过LC-MS/MS测量 的浓度一致(图31b并且未展示)。1mg/kg的剂量得到了在48小时和48小时以上肿瘤 浓度小于0.05μM(图31a)，并且因此或许代表了此肿瘤模型中治疗有效剂量的下限。
[124I]-PU-H71 PET准确地预测了肿瘤中治疗有效PUH71浓度的递送
为了验证PET准确地预测在注射5到75mg/kg PU-H71后实现的肿瘤浓度以及这些浓度在体内治疗有效，研究与这些剂量有关的药效学作用(图31c、31d)。依照以上表 明递送药理学有效肿瘤浓度的PU-H71的发现，投予5到75mg/kg的PU-H71剂量到负 载MDA-MB-468肿瘤的小鼠会引起Akt和Raf-1下调和/或抑制以及诱发细胞凋亡，如 PARP裂解所证明(图31c，体内)。这些药效学改变类似于在组织培养物中观测到的， 其中MDA-MB-468细胞暴露于超过0.1μM的PU-H71浓度24小时导致HSP90抑制， 如通过HSP90依赖性癌蛋白(即，Raf-1、Akt)的剂量依赖性耗尽显示(参考100和图 31d，体外)。体外确定的引起致癌客户蛋白降解的半抑制浓度(EC50 Raf-1＝0.13±0.02μM 和EC50 Akt＝0.15±0.02μM；图31d)类似于通过[124I]-PU-H71 PET确定的在肿瘤中并且 产生测量的药效学作用的浓度(EC50 Raf-1＝0.24±0.03μM和EC50 Akt＝0.09±0.08μM；图 31c)。
总起来说，通过LC-MS/MS测量并且通过蛋白质印迹法药效学分析验证的一致的PET预测的肿瘤浓度显示[124I]-PU-H71 PET分析告知选择实现治疗有效肿瘤浓度所需的此HSP90抑制剂投予剂量的能力和准确性。
示踪剂-剂量[124I]-PU-H71在至多肿瘤内标靶饱和度的剂量的范围内准确地预测PU-H71肿瘤浓度
示踪剂微小剂量的[124I]-PU-H71的药物动力学可能与宏观治疗剂量的药物动力学不 相关。在高PU-H71剂量下，例如肿瘤内HSP90标靶饱和度、不同的血浆蛋白结合型态或由肝脏代谢酶的可能抑制引起的药物代谢变化等因素可能改变药剂的药物动力学。
因此检验在可能饱和剂量下，基于PET的PU-H71浓度预测是否与通过LC-MS/MS 在实验上确定的浓度相关(图31b)。投予75mg/kg PU-H71到MDA-MB-468肿瘤引起 肿瘤消退和治愈100，并且因此在此治愈剂量下，可能实现肿瘤HSP90标靶饱和或至少 占有治疗显著数目的标靶分子。基于来源于[124I]-PU-H71 PET研究或[131I]-PU-H71生物 学分布研究的肿瘤浓度，向负载肿瘤的小鼠投予75mg/kg抑制剂在投予后24、48、72、 96和120小时分别得到5.51±1.78、3.50±0.27、2.18±1.78、1.29±0.29和0.69±0.25μM的 肿瘤浓度(图31b)。这些值与通过LC-MS/MS测量的实际PU-H71肿瘤浓度(图31b， LC-MS/MS)非常一致，说明在至多引起最大有效标靶抑制的剂量的范围内PET分析预 测的可靠性(图31c)。
[124I]-PU-H71用于HSP90疗法的患者选择中的用途
除了提供用于监测PU-H71的生物学分布和报告PU-H71的肿瘤药物动力学的临床上实践的基于PET的方法外，上述分析还提出一种筛选患者、区分对PU-H71或其它 HSP90疗法可能具有有利或不利治疗反应的患者的方法。
确切地说，显示[124I]-PU-H71最低程度吸收和/或迅速清除的肿瘤可能是PU-H71或 其它HSP90抑制剂难接近的。或者，所述发现还可能指示肿瘤的存活不依赖于HSP90， 因此HSP90疗法不是适当的93,97。相反地，对[124I]-PU-H71高度吸收并且长期滞留(例 如对应于在较后时间点的高肿瘤:血液比率，图30)的肿瘤将预测对用HSP90抑制剂靶 向更敏感。如果如通过[124I]-PU-H71 PET预测的实现有效肿瘤浓度所需的治疗剂量将引 起禁止性毒性(例如有效剂量高于最大耐药剂量)，那么可以进一步指导患者选择。
最后，肿瘤能够维持HSP90抑制剂长期处于有效浓度下以及在无毒抑制剂剂量下实 现所述浓度是可以通过[124I]-PU-H71 PET可靠测量的HSP90疗法进入的两个关键标准。
与治疗剂量的PU-H71共注射的微小剂量的[124I]-PU-H71用于通过PET分析 PU-H71肿瘤浓度的用途
虽然[124I]-PU-H71 PET很好地估计产生有效肿瘤浓度所需的HSP90抑制剂的剂量，但将研究与治疗量的PU-H71(5mg/kg到75mg/kg或5,000ng/g到75,000ng/g)共 投予的示踪剂量(约6.5ng/g)的[124I]-PU-H71是否可以可靠地分析基本上递送到肿瘤 的PU-H71的量(图31b，在[124I]-PU-H71和PU-H71共注射后的PET)。测量药物活 性组织中药物暴露的能力可以提供用于预测可能反应的关键信息(例如多少浓度已经递 送到肿瘤以及其是否足够引起显著的药效学反应)。在处理时间内一系列测量值还可以 用作肿瘤生物学以及因此的反应是否已经改变的指示物(例如递送到肿瘤的浓度降低可 以指示可能发展对HSP90抑制剂的抗性)。
因为放射性示踪剂[124I]-PU-H71和非放射性的PU-H71以约1:10,000的比率注射，所以可以合理地假定，后者基本上是肿瘤中药物的唯一重要形式。因此，对于共投予剂 量的PU-H71(PU-H71剂量，以mg计)和示踪剂量的[124I]-PU-H71，肿瘤水间隙中药物 浓度(再次使用平均水间隙，W＝0.8mL/g和MW 512)是：
Figure BDA0001717339850000811
针对5、25、50和75mg/kg(对于20g小鼠0.1、0.5、1和1.5mg)的PU-H71剂 量解答方程式(3)，得到HSP90抑制剂的实际肿瘤浓度(图31b，仅展示75mg/kg)。 这些值与通过[124I]-PU-H71 PET和通过[131I]-PU-H71示踪剂生物学分布估计并通过验证 的PU-H71肿瘤浓度(图31b且未展示)非常相关。
总的来说，这些数据展示微小剂量[124I]-PU-H71 PET分析可以得到产生特定肿瘤浓 度所需的PU-H71剂量和递送到肿瘤的治疗PU-H71的实际浓度。
[124I]-PU-H71用于分析最大肿瘤剂量(提供HSP90药物的肿瘤标靶饱和的剂量)的用途
共注射的[124I]-PU-H71和PU-H71的[124I]-PU-H71 PET可以大概评估HSP90抑制剂对肿瘤HSP90标靶的占有率。举例来说，通过PET显示既定治疗剂量的HSP90抑制剂 完全或显著地抑制[124I]-PU-H71的肿瘤吸收可能表明此治疗剂量已经使肿瘤HSP90标 靶饱和，并且投予的剂量递送了单次剂量的药物可以递送的‘最大肿瘤剂量’。此标靶 饱和剂量还可以称为药物的最大有效单次剂量。
为了研究此可能性，对于与治疗剂量(5到75mg/kg或5,000到75,000ng/g) PU-H71剂量的PU-H71共投予的示踪剂量(约6.5ng/g)的[124I]-PU-H71，计算每公克肿 瘤被PU-H71占有的肿瘤HSP90位点数目(每公克肿瘤的HSP90位点)。此使用下式获 得：
Figure BDA0001717339850000821
针对5、25、50和75mg/kg(分别是5,000、25,000、50,000和75,000ng/g)的非 放射性剂量PUH71的共投予剂量PU-H71剂量解答方程式(4)，得到每公克肿瘤结合的 PU-H71分子数(以nmol计)。因为一个配体分子占有一个HSP90分子的袋并且结合于 其97,109，所以方程式(4)也得到每公克肿瘤PU-H71占有的肿瘤HSP90位点数目(以 nmol计)(图31e)。
注射后24小时结合曲线的分析表明在75mg/kg的PU-H71剂量下可用HSP90位点的 占有率接近饱和，其中一公克肿瘤含有最高160.7×10-3nmol的HSP90(图31e，BMAX)， 对应于960×1011个HSP90分子。使用此值，然后计算被不同投予剂量的PU-H71占有的 肿瘤HSP90位点百分比，并且确定投予5、25、50和75mg/kg PU-H71导致分别12.1％、 57.7％、88.7％和92.7％的可用HSP90肿瘤位点被抑制剂占有(图31f)。在通过75mg/kg 单一治疗剂量的PU-H71实现的肿瘤吸收接近完全饱和下，此剂量已经占有大部分可用 的肿瘤HSP90位点，因此进一步提高剂量预计不会增加肿瘤中定位的药物量，但会增加 全身药物暴露和可能的患者毒性。
概括地说，如这里通过[124I]-PU-H71 PET所显示，‘最大肿瘤剂量’的分析提供了比‘最大耐受剂量’更有用于试验设计的信息。确切地说，其将针对单次投予剂量，指 示产生最大肿瘤(非全身)暴露的剂量，得到最好的可能抗肿瘤作用，同时将与单次投 予剂量有关的毒性减到最小。此外，其提出了一种新的选择治疗给药频率的方法，其中 一旦已经鉴别最大肿瘤剂量，治疗给药频率就可以增加到最高耐受频率的端点(而不是 常规的最大耐受剂量，MTD)，由此暂时使肿瘤暴露达到最大。
[124I]-PU-H71 PET用于设计HSP90疗法的有效给药方案的用途
前面的结果显示[124I]-PU-H71 PET可以用于预测在单次PU-H71投予后的选择时间 段内实现和维持特定肿瘤浓度所需的剂量。因为肿瘤显示PU-H71长期滞留，所以在每一连续剂量下，以足够频率重复投予PU-H71将可能导致PU-H71较高的累积肿瘤浓度。 最终将实现针对所用剂量和时程特定的稳态肿瘤PU-H71浓度。因此，数据表明肿瘤药 物动力学的[124I]-PU-H71 PET成像在指导PUH71给药设计方面的潜在作用，类似于血 浆药物动力学在指导实现稳态血浆浓度的给药方面的用途。
为了研究此，估计在以周末中断，每周3次投予的时程(一周3次；星期一/星期三 /星期五)投予5、25、50和75mg/kg PU-H71后将得到的PU-H71肿瘤浓度(图32a)。 进行模拟，以确定在以此时程和指示的剂量投予时PU-H71的肿瘤浓度(图32a)。还确 定以此时程和这些剂量得到的肿瘤AUC和PU-H71的平均和最小肿瘤浓度(分别是 [PU-H71]avg和[PUH71]min)(图32a，插图)。分别对于5到75mg/kg的投予剂量，预测 的肿瘤内PU-H71浓度在[PU-H71]min＝0.17到2.54μm和[PU-H71]avg＝0.49到7.45μM 范围内(参见图32a插图)。
如所提及，MDA-MB-468乳癌细胞体外暴露于较低PU-H71浓度(0.05到1μM) 有效地抑制细胞生长，其中报导IC50为60到100nM100。在较高PU-H71浓度(>2μM) 下，并且当这些癌细胞暴露于药物48小时的时候，注意细胞凋亡杀死大量癌细胞(即 >70％细胞进行细胞凋亡)(图32b)。按照这些体外分析，预测以一周3次的时程，投予 5到75mg/kg剂量的PU-H71将产生治疗有效肿瘤药物浓度，这些浓度跨越主要预测肿 瘤抑制作用(5mg/kg)到有效肿瘤细胞凋亡(75mg/kg)的值(图32b)。实际上，当 负载MDA-MB-468异种移植肿瘤的小鼠用如上所述的PU-H71处理时，在PU-H71处理 的肿瘤中观测到剂量依赖性反应(图32c)。在7周处理时期后，注意到显著的肿瘤反应， 其中在5、25和50mg/kg剂量下分别观测到63％、82％和99％肿瘤生长抑制(TGI)， 以及在75mg/kg剂量下100％消退(图32c)。
继续处理，直到对照臂中的肿瘤到达机构动物管理与使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee，IUCAC)所许可的最大尺寸(图32d)并在星期四(上 次星期三投予剂量后的24小时)处死小鼠。只有5mg/kg臂的动物具有足够大以用于蛋 白质印迹法和LC-MS/MS分析的肿瘤(肿瘤体积：139±66mm3)，不过显著小于仅用媒 剂处理的那些动物(肿瘤体积：1126±396mm3)(图32d)。
针对5mg/kg的PU-H71投予剂量并使用肿瘤中[124I]-PU-H71的测量的时间-活性数据(图30d)解答方程式(1a)，得到处理时间内的PU-H71肿瘤浓度(图32e)。模拟表 明在处死的时候PU-H71的肿瘤浓度应为0.43μM(图32e)，其非常类似于在这些肿瘤 中通过LC-MS/MS测定的0.52±0.13μM的实际浓度(图32f、32g)。此外，在肿瘤内观 测到的药效学作用，即如通过显著的Akt降解(57％降低；P＝0.0017；图32f和图32g， 左图)和PARP裂解(图32f)所显示的HSP90抑制，与此时肿瘤内的治疗有效PU-H71 浓度一致(图32g，右图)。这些发现展示PU-H71的肿瘤吸收在12周处理期间保持不 变，与这些肿瘤对PU-H71的持续反应一致(图32d和参考100)，表明[124I]-PUH71 PET 可以用于监测反应持久性，或相反地，预测对HSP90疗法的获得抗性的可能性。
[124I]-PU-H71 PET用于设计HSP90疗法的有效时程方案的用途
考虑到PU-H71长期滞留肿瘤，询问不太频繁的投予药剂是否将维持其效力。在临床背景下，此可用作在遭遇毒性的患者中以较低剂量继续疗法，或在设计给药时程时合 理地平衡剂量和给药频率的基本原理。
针对以75mg/kg投予的PU-H71，以每周3次(星期一-星期三-星期五)、2次(星 期一和星期五)或1次(星期一)投予的时程进行模拟(图33a)。这些计算表明肿瘤将 分别以一周3次、一周2次和一周1次的时程暴露于7.45、5.41和2.88μM的[PU-H71肿瘤]avg (图33a)，表明不太频繁的投予时程仍然将向肿瘤提供治疗有效浓度(图33b)。实际上， 以一周1次的时程获得显著的肿瘤生长抑制，而一周2次投予使得在5周处理期间肿瘤 消退(图33c)。在可评估的肿瘤(即对照和5mg/kg处理臂)中，当在上次投予剂量后 24和96小时处死小鼠时分析药物动力学标记物的变化。
在两个时间点都观测到癌蛋白的显著和接近全部耗尽(降低95％水平，在24小时和96小时，分别P＝0.0021和P＝0.0025)(图33d)，表明在这些时间点标靶饱和PU-H71 浓度(>2μM)应存在于肿瘤中。这些肿瘤中，PET预测的PU-H71肿瘤浓度在24小时 和96小时分别是5.51和2.18μM(图33a，一周1次的图)，此与通过LC-MS/MS测量 的分别5.53±0.26和3.09±1.40的实际肿瘤浓度非常一致(图33e)。
上述方法容易应用于人类患者。一个实例描绘于图34和图35中。图34展示疾病 转移到肺和相邻淋巴结的复发性胰腺癌患者的[124I]-PU-H71 PET/CT。对[124I]-PU-H71注 射后若干时间(4、24、48和192小时)的PET影像定量，并且对于20mg/m2的PU-H71 的投予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUV数据转变为浓度。这些肿瘤展示 [124I]-PU-H71很好地被吸收，甚至在192小时(投予后8天)滞留和目测到。[124I]-PU-H71 PET/CT预测此患者可能对HSP90疗法起反应。通过小鼠实验无法预测肿瘤中PU-H71 滞留超过192小时(8天)的时间，其中如图30中指出，到投予后150小时124I-PU-H71 从MDA-MB-468肿瘤清除。计算0到192小时的各个时间点的PU-H71浓度还允许计算 肿瘤曲线下面积(AUC)。图34中，计算0到192小时各肺结节和淋巴结(LN)的曲 线下面积。
如通过PU-PET测定的这些肿瘤对PU-H71的暴露允许测定用于处理此患者的最佳剂量和时程。确切地说，计算当以两周(星期二和星期五)时程投予20mg/m2的剂量 时在两周处理方案时间内两个特征肿瘤(一个在左肺并且另一个在右肺门LN中)的 PU-H71暴露并且表示为曲线下面积(AUC)和平均肿瘤浓度(图35，顶图)。肿瘤展 示AUC值分别为190和499μM-h，以及Hsp90抑制剂的平均肿瘤浓度分别为0.71和 1.57μM的良好药物暴露。在胰腺癌的临床前模型中，所述浓度有效抑制生长，降低其 侵入性和转移性可能性并且诱发胰腺癌细胞的细胞凋亡，表明了以一周2次(星期二- 星期五)的时程给予的20mg/m2剂量可能有益于患者。
又如图35(底图中所示，以一周两次(星期二和星期五)的时程，以40mg/m2和80mg/m2的剂量进行类似模拟。按照PU-PET预测最佳的是以一周2次的时程(星期二 和星期五)给予的80mg/m2剂量，其中0-336天内肿瘤暴露和平均肿瘤浓度将分别超 过760和1998μM-h以及2.8和6.3μM(图35，底图)。这些值通过临床前研究(图32 和33)预测引起显著消退和治愈。
图36展示疾病转移到肺的HER2+乳癌患者的类似计算。顶图展示使用[124I]-PU-H71 的PET分析的结果。中间和底图展示基于10mg/m2的PU-H71投予剂量的各个时间的 PU-H71肿瘤浓度。药物动力学数据根据0或336小时之间肿瘤中PU-H71的AUC或在 此时间段内肿瘤中药物的平均浓度来报导。PU-PET数据预测当一周两次给予持续两周 时，10mg/m2的剂量将提供103μM-h的肿瘤AUC0-336h，并且维持0.59μM的平均肿瘤 浓度，因此以此时程，80-100mg/m2和超过其的剂量是有利反应所需的。当一周三次给 予持续两周时，10mg/m2的剂量将提供140.8μM-h的肿瘤AUC0-336h，并且维持0.71μM 的平均肿瘤浓度，因此以此时程，60mg/m2和超过其的剂量是有利反应所需的。当一周 一次给予持续两周时，10mg/m2的剂量将提供仅54μM-h的肿瘤AUC0-336h，并且维持 0.41μM的平均肿瘤浓度，因此以此时程，200mg/m2和超过其的剂量是有利反应所需的。 当一周5次(每日一次，周末中断)给予持续两周时，10mg/m2的剂量将提供189.8μM-h 的肿瘤AUC0-336h，并且维持0.81μM的平均肿瘤浓度，因此以此时程，50mg/m2和超过 其的剂量是有利反应所需的。
总的来说，这些数据显示[124I]-PU-H71 PET在报告针对HSP90疗法的个性化临床使 用的有效剂量和给药时程方案的设计方面的效用。
如通过[124I]-PU-H71 PET测定，肿瘤对PU-H71的暴露可靠地预测对HSP90疗法 的抗肿瘤反应
了解在处理时间内需要抑制以引起治愈的标靶位点的数目在靶向疗法中仍然是一 个巨大的挑战。因此针对以上研究的若干剂量和时程方案，模拟治疗时期内抑制剂对HSP90位点的占有率(图37a)。然后试图进行肿瘤HSP90占有率与观测到的抗肿瘤反 应的相关分析(图37b)。
当PU-H71以治疗剂量(小鼠中5到75mg/kg或5,000到75,000ng/g)投予时每公 克肿瘤的PU-H71占有的肿瘤HSP90位点的数目(HSP90位点/公克)可以使用方程式 (4)获得。因为一公克MDA-MB-468肿瘤含有最高160.7×10-3nmol HSP90(图31d， BMAX)并且假使超过100％的位点的占有率不可能，可以模拟每一剂量和时程方案的 处理时间内的HSP90位点占有率(图37a)。
标靶占有率测量为处理时间内PU-H71占有和识别的平均HSP90位点％(占有的HSP90位点％)(图37b)，处理时间内记录的PU-H71平均肿瘤浓度([PU-H71]肿瘤 avg； 图37c)，以及如通过肿瘤AUC计算的处理时间内的肿瘤暴露，其与观测到的抗肿瘤作 用程度非常显著地相关(分别r2＝0.7559、0.8162和0.8188)。分析表明，处理时间内平 均超过80％的肿瘤HSP90位点的占有率(图37b)或维持HSP90抑制剂5μM的平均肿 瘤浓度(图37c)是MDA-MB-468肿瘤消退和治愈所需的。然而，如通过15％和15％ 以上的占有位点的平均值所获得或通过在处理时间内维持0.5μM和超过0.5μM的平均 肿瘤浓度所实现的较低占有率可能仍然产生部分反应(图37b、37c)。
讨论
基于上述分析，已经设计和发展了第一非侵入性基于PET的分析，其在HSP90抑 制剂的临床开发中具有潜在用途。显示了其在测定母体药物的肿瘤内药物动力学和药效 学，测定实现有效肿瘤浓度所需的HSP90抑制剂剂量，分析递送到肿瘤的药物实际浓度 以及基于标靶调节效率而非最大耐受剂量(MTD)设计有效剂量和时程方案方面的用途。 还显示了其在选择最可能对HSP90靶向具有肿瘤反应的患者方面的用途。
别人已经在临床前或临床研究中展示针对半衰期显著小于扫描期间的总取样时间 的药剂，碳11、氟18和氮13标记的药物，例如N-[11C]-甲基伊马替尼(N-[11C]-methylimatinib)122、3-N-甲基和4-羰基-[11C]-替莫唑胺(3-N-methyl and 4- carbonyl-[11C]-temozolomide)123、N-[2-(二甲氨基)乙基]吖啶-4-甲酰胺([11C]DACA)124、[18F]5-FU124、达沙替尼(dasatinib)的[18F]氟衍生物125和[13N]顺铂([13N]cisplatin)126可用于通过PET药物动力学参数估计。对于肿瘤半衰期(即>24小时)长于这些同位素 (即11C、13N和18F分别是10分钟、20分钟和110分钟)所许可的取样持续时间的HSP90 抑制剂，使用这些放射性同位素进行PET药物动力学评估是不适当的。由于124I的半衰 期相对较长，因此[124I]-PU-H71PET分析是能够非侵入性和定量地监测HSP90抑制剂的 肿瘤药物动力学的第一报导分析(图38)。
此外，[124I]-PU-H71 PET分析使用放射性标记的生物学上非活性的痕量的靶向治疗 剂进行医学成像，将靶向疗法的靶向成像的概念真实地具体化127-131。虽然此概念是未来的药物开发所公认和大大提倡的，提供了一条使医学个性化的途径，但使用肿瘤学小 分子治疗剂作为成像剂来选择对其药物作用最起反应并且提出其投予剂量的时程是没 有先例的。由于PU-H71的原来结构中存在碘，并且由此其结构和生物行为因结合放射 性碘标记而无任何干扰，所以[124I]-PU-H71 PET分析将是所知道的第一所述分析中的一 者。确切地说，[124I]-PU-H71的观测到的生物学分布型态，即肿瘤滞留和从非肿瘤组织 快速清除，映射出治疗剂PU-H71的生物学分布型态。此外，虽然药物代谢物的形成限 制用于PET的标记药物的应用41，但是数据显示[124I]-PU-H71 PET分析在微小剂量和治 疗剂量水平下都准确地测量肿瘤PU-H71浓度，表明PU-H71代谢物不显著地影响PET 测量的肿瘤活性。总而言之，这些发现表明[124I]-PU-H71非常适用作PU-H71的理想体 内‘示踪剂’。
在发展靶向癌症疗法的过程中，非常了解临床试验需要关于是否实现有效肿瘤浓度 以及是否适当地调节标靶的知识。数据显示[124I]-PUH71 PET分析定量地测量肿瘤HSP90抑制剂药物动力学，提供肿瘤剂量-肿瘤反应相关性，此比常规的肿瘤反应与注 射剂量或血浆药物动力学的相关性更能提供信息。数据还显示，对于PU-H71，肿瘤药 物动力学映射出肿瘤药效学，确定了[124I]-PU-H71 PET作为两种参数的一种非侵入性测 量。因此，还指示标靶占有率的肿瘤药物动力学在了解对HSP90抑制剂治疗方案的直接 (即在一次剂量抑制剂后调节标靶)和长期(即在设计的时程期间调节标靶)反应方面 具有预测功效。此外，通过评估考虑进行HSP90疗法的个别患者中的[124I]-PU-H71肿瘤 药物动力学，还可以基于[124I]-PU-H71的肿瘤吸收和清除率，鉴别最可能受益于HSP90 治疗的患者并且因此调节治疗剂量和时程(图38a)。
还展示分析可以基于通过PET得到的肿瘤HSP90药物动力学，作为肿瘤HSP90靶 向程度和其对HSP90抑制剂治疗剂量的饱和程度的成像生物标记物，指导个性化给药方 案的开发，可预测HSP90疗法过程期间抗肿瘤作用和结果(图38b)。归因于这些特征，[124I]-PU-H71 PET分析作为一种药物计量学工具用于HSP90抑制剂临床研究是最佳的， 以了解(图38a)和可能预测肿瘤对HSP90治疗的反应(图38b)。
[124I]-PU-H71数据还提供了一种在HSP90靶向疗法中更合理和有效的给药策略，其 基于通过PET得到的最大有效肿瘤浓度，而不是常规的最大耐受剂量(MTD)。此方法 目标是实现最高肿瘤剂量的新的给药目标，最高肿瘤剂量是如通过PET目测，药物几乎 使肿瘤标靶饱和的最佳剂量水平(图38c)。此方法将避免了可能只会增加患者毒性而不 会增加抗肿瘤功效的进一步剂量递增。如果在小于最大耐受剂量(MTD)的治疗剂量下 观测到肿瘤饱和度(如例如通过剂量递增试验测定)，那么给药策略可能继续寻找在如 通过PET测定的饱和最大有效肿瘤浓度下给药的最大耐受频率。[124I]-PU-H71 PET可能 研究在最大有效肿瘤剂量后的肿瘤饱和持续时间，以进一步告知给药频率的选择。 [124I]-PU-H71 PET可以类似地用以指导其它HSP90抑制剂的剂量和频率选择。治疗剂量 的靶向HSP90药剂竞争性地抑制[124I]-PU-H71示踪剂靶向肿瘤的能力可提供肿瘤药物 饱和的指示物。为了临床开发HSP90抑制剂，[124I]-PU-H71 PET可以用于从1/2期试验 群体集合肿瘤药物动力学数据以得到一般可应用的给药策略，或其可基于个别患者使用 以做到真正的‘个性化’剂量-时程选择。认为，PU-H71 PET成像是非常适合于测试这 些假设的临床工具。随着在纪念斯隆-凯特林癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)，[124I]-PU-H71的0期微小剂量试验目前正在进行中，并且[124I]-PU-H71 PET分 析结合到即将进行的PU-H71的1期临床研究中，此概念将很快在临床背景下评估。
最后，[124I]-PU-H71 PET作为肿瘤HSP90的靶向分析，可以在HSP90靶向疗法中 在分子标靶水平下显著而合理地推进患者选择、剂量选择、肿瘤诊断和肿瘤反应评估。 因而，新颖的[124I]-PU-H71 PET分析应促进HSP90抑制剂的合理、成本有效和最佳临床 开发以及其在癌症中的用途。[124I]-PU-H71 PET的使用代表了HSP90抑制剂临床试验设 计的一项重大发展，并且建立了开发其它靶向治疗剂的靶向成像药物计量学的范例。
5.2.2.2.2.[124I]-PU-DZ13和[124I]-PU-HZ151
评估具有内源性碘的其它HSP90抑制剂在HSP90PET分析中执行的能力。两种所 述化合物包括[124I]-PU-DZ13和[124I]-PU-HZ151，如方案16和17中所示合成。
Figure BDA0001717339850000891
方案16：合成[124I]-PU-DZ13
Figure BDA0001717339850000892
方案17：合成[124I]-PU-HZ151。试剂和条件：a.Et3N、(Boc)2O、CH2Cl2、室温；b.Pd(PPh3)4、 六甲基二锡、二噁烷、90℃；c.[124I]-NaI、氯胺-T、室温、10分钟；d.TFA、70℃、60
分钟。
这些化合物的放射化学产率是36.96±12.97％([124I]-PU-DZ13)、36.45±15.75％ ([124I]-PU-HZ151)和45.33±15.76％([124I]-PU-H71)；放射化学纯度(>98％)由HPLC 证实。比活性是633mCi/μmol([124I]-DZ13)、576mCi/μmol([124I]-HZ151)和1000 mCi/μmol([124I]-PU-H71)。
为了评估[124I]-PU-H71和[124I]-PU-DZ13的体外稳定性，将化合物在人类血清中在 37℃下培育五天，并且通过ITLC分析以确定是否发生脱卤。确定[124I]-PU-H71和[124I]-PU-DZ13在五天(120小时)内都是稳定的(98％)。
当通过静脉内和腹膜内两条途径投予时肿瘤维持[131I]-PU-DZ13，然而，通过静脉内 投予肿瘤滞留较高，具有统计显著性(P<0.05)(投予后24小时，腹膜内对比静脉内途径)。在C57BL/6J非肿瘤负载小鼠中，[131I]-PU-DZ13从心脏血液迅速地清除(2分钟 时％ID/g是3.33±0.13，并且到投予后24小时，是0.013±0.00)，并且通过胃和肠具有 最大的吸收(3-8％ID/g)。肝脏和脾吸收没有显著不同(P<0.05)，表明网状内皮系统 (RES)受累。然而，[131I]-PU-DZ13的肾吸收意味着尿清除(％ID/g从2分钟时5.53±0.34 (数据未示)到投予后24小时0.06±0.01)。在MDA-MB-468TNBC小鼠模型中， [131I]-PU-DZ13在通过静脉内途径投予时与腹膜内途径相比较，维持肿瘤时间较长。通 过静脉内投予，[131I]-PU-DZ13的肿瘤吸收(1小时，1.47±0.22％ID/g)在72小时(0.05 ±0.00％ID/g)内缓慢降低(％ID/g＝0.56±0.14，4小时；0.40±0.03，12小时；0.09± 0.03，24小时)。如同未负载肿瘤小鼠一样，在MBA-MD-468中看见[131I]-PU-DZ13的 胃肠道和RES吸收以及肾清除。当与25mg/kgPU-DZ13共投予时[131I]-PU-DZ13的体内 生物学分布(投予后24小时，腹膜内对比静脉内途径)展示PU-PET预测的肿瘤浓度有 利地与通过LCMS-MS确定的值相比。
体内PET成像用[124I]-PU-H71和[124I]-PU-DZ13HSP90抑制剂检测MDA-MB-468 肿瘤。图39展示全身注射每一抑制剂([124I]-PU-H71或[124I]-PU-DZ13)的小鼠在注射 后48小时的PET成像结果。两种放射性碘化的HSP90抑制剂在每个时间点用PET都检 测到肿瘤。在肿瘤肿块中两种抑制剂的吸收％ID/g方面没有显著不同，不过 [124I]-PU-DZ13在质量上似乎具有较少的非特异性腹部吸收。
不同于[124I]-PU-DZ13和[124I]-PU-H71，[124I]-PU-HZ151可能由于其通过肝脏快速代 谢，而无法检测小鼠中的肿瘤。
5.3.用PU-H71治疗癌症患者
部分5.2.1.中所述的方法表明例如[124I]-PU-H71等放射性标记的HSP90抑制剂可以 用于鉴别可能对HSP90抑制疗法起反应的患者并且设计对于个别患者最佳化的给药方案。这些给药方案是基于例如抑制剂的肿瘤暴露和抑制剂对HSP90的占有率等因素。这 些药物动力学参数容易使用本发明的放射性标记的抑制剂评估。由于药物动力学数据可 以从一大群个别癌症患者中容易地获得，所以能够确定一系列将适于实现特定HSP90 抑制剂的所希望的功效水平的药物动力学参数，而不会同时带来HSP90抑制剂所引起的 毒物学问题。
因此，本发明进一步提供了用HSP90抑制剂、尤其PU-H71治疗患有实体肿瘤、血 液科恶性疾病和淋巴瘤的患者以实现特定的药物动力学型态的方法。本发明还提供了用HSP90抑制剂、尤其PU-H71治疗实体肿瘤、血液科恶性疾病和淋巴瘤的方法，其是通 过以特定剂量水平和/或特定给药时程投予抑制剂。在特定实施例中，待用HSP90抑制 剂治疗的肿瘤是“HSP90依赖性肿瘤”。如上所讨论，HSP90依赖性肿瘤是生理学利用 HSP90的肿瘤。HSP90依赖性肿瘤相对于正常管家HSP90含有显著数目的“致癌 HSP90”。本部分中描述的方法可应用于许多类型的癌症，包括(但不限于)结肠直肠 癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括 小细胞肺癌、非小细胞肺癌和腺癌在内的肺癌、所有亚型乳癌、成神经细胞瘤、包括胃 肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质 瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤、包括其它 浆细胞病症在内的多发性骨髓瘤、白血病、骨髓增生性赘生物以及包括卵巢癌、宫颈癌 和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
在一个实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的人 类患者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71，以在药物投予后约16小时到约24小时之间的至少一个时间点提供患者肿瘤内致癌HSP90 15％或15％以上的占有率、患者肿瘤内致癌HSP90 30％或30％以上的占有率、患者肿瘤内致癌HSP90 50％或50％以上 的占有率或患者肿瘤内致癌HSP90 60％或60％以上的占有率。举例来说，PU-H71的投 予可以在药物投予后16与24小时之间的至少一个时间点提供患者中致癌HSP90至少 15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、 至少85％、至少90％、至少95％或100％的占有率。在一个具体实施例中，PU-H71的投 予可以在药物投予后约24小时提供患者中致癌HSP90至少15％、至少20％、至少30％、 至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％或100％的占有率。在另一实施例中，PU-H71的投予可以在药物投予后16小时与 24小时之间的整个范围内提供患者中致癌HSP90至少15％、至少20％、至少30％、至 少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％ 或100％的占有率。可以投予PU-H71以在药物投予后约16小时到约24小时之间的至少 一个时间点或整个范围内提供受任两个先前值限制的致癌HSP90占有率，例如约20％ 到约80％的占有率、约30％到约80％的占有率、40％与80％之间的占有率、40％与90％ 之间的占有率、约50％到约80％的占有率、约50％到约90％的占有率、约60％到约80％ 的占有率、约60％到约99％的占有率、约50％到约99％的占有率、约50％到约99.9％的 占有率、约70％到约99.9％的占有率等。在另一实施例中，PU-H71以实现致癌HSP90 100％占有率的最小剂量投予。如部分5.2.1.1.中讨论，投予提供以上致癌HSP90占有率 的PU-H71会产生有效剂量的PU-H71。在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患有 HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71以在投予后24小时提供在约0.3μM到 约7.5μM范围内的肿瘤浓度。举例来说，投予PU-H71后约24小时肿瘤中PU-H71浓 度可以是0.3μM、1μM、3μM、5μM或7μM。可以投予PU-H71以在约24小时后提 供在任两个先前值之间的药物肿瘤浓度，例如约1μM到约3μM的肿瘤浓度、约1μM 到约5μM的肿瘤浓度、约3μM到约5μM的肿瘤浓度、约3μM到约7μM的肿瘤浓度 等。在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71以在投予后约48小时提供在约0.05μM 到约3.5μM范围内的肿瘤浓度。举例来说，PU-H71投予后约48小时肿瘤中PU-H71 浓度可以为约0.5μM、约1μM、约1.5μM、约2μM或约3μM。可以投予PU-H71以 在约48小时后提供在任两个先前值之间的药物肿瘤浓度，例如约1μM到约2μM的肿 瘤浓度、约1μM到约3μM的肿瘤浓度、约0.5μM到约2μM的肿瘤浓度、约0.25μM 到约2μM的肿瘤浓度等。在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患有HSP90依赖性 肿瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71以提供在投予后约24小时在约0.3μM 到约7.5μM范围内以及投予后约48小时在约0.05μM到约3.5μM范围内的肿瘤浓度。 在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
如部分5.2.1.1.中讨论，放射性标记的分析提供了一种确定PU-H71的肿瘤暴露的适 宜方式。肿瘤暴露可以使用各种药物动力学参数，例如特定时期内肿瘤AUC和药物的 平均肿瘤浓度来测量。基于对患有许多实体肿瘤的患者集合的大量药物动力学数据，已 经确定测量特定治疗时期(例如两周)内的AUC和平均肿瘤浓度提供了有关药物的功 效和毒理学的重要信息。如上所讨论，术语“肿瘤AUC”是指从药物投予到另一时间点 的时期内药物的累积细胞内浓度。举例来说，0小时到336小时的时期内肿瘤水间隙中 的AUC在本文中称为肿瘤AUC0-336h。“0”时间点可以指在新的治疗周期开始时药物首 次投予的时间。或者，“0”时间点可以指在新的治疗周期中间药物投予的时间点。应 了解多剂量的药物可以在0时间点与336时间点之间的多个时间投予。如下所讨论，在 特定范围内的肿瘤AUC值和平均肿瘤浓度提供有效的剂量。
在一个实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71，以提供约150到约4,000μM-h的AUC0-336h。举例来说，PU-H71的肿瘤AUC0-336h可以是约300μM-h、约500μM-h、约 800μM-h、约1200μM-h、约1500μM-h、约2000μM-h、约3000μM-h或约4000μM-h。 可以投予PU-H71以提供在任两个先前值之间的肿瘤AUC0-336h，例如在约300μM-h到 约800μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h、在约500μM-h到约800μM-h范围内的肿瘤 AUC0-336h、在约500μM-h到约1000μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h、在约1000μM-h到 约1500μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h、在约1000μM-h到约2000μM-h范围内的肿瘤 AUC0-336h、在约1500μM-h到约2000μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h、在约2000μM-h 到约3000μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h、在约2000μM-h到约4000μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h、在约3000μM-h到约4000μM-h范围内的肿瘤AUC0-336h等。在一个实施例 中，“0”时间点是新的治疗周期的开始。在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患 有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71，以提供约75μM-h到约2,000μM-h的AUC0-168h。举例来说，PU-H71的肿瘤AUC0-168h可以是约75μM-h、约250μM-h、约400 μM-h、约600μM-h、约750μM-h、约1000μM-h、约1500μM-h或约2000μM-h。可以 投予PU-H71以提供在任两个先前值之间的肿瘤AUC0-168h，例如在约150μM-h到约400 μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h、在约250μM-h到约400μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h、 在约200μM-h到约500μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h、在约500μM-h到约750μM-h 范围内的肿瘤AUC0-168h、在约500μM-h到约1000μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h、在约 750μM-h到约1000μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h、在约1000μM-h到约1500μM-h范 围内的肿瘤AUC0-168h、在约1000μM-h到约2000μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h、在约 1500μM-h到约2000μM-h范围内的肿瘤AUC0-168h等。在一个实施例中，“0”时间点 是新的治疗周期的开始。在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患有HSP90依赖性肿 瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71，以提供约10到约300μM-h的AUC0-48h。 举例来说，PU-H71的肿瘤AUC0-48h可以是约15μM-h、约20μM-h、约25μM-h约30 μM-h、约40μM-h、约50μM-h、约80μM-h、约100μM-h、约150μM-h或约200μM-h。 可以投予PU-H71以提供在任两个先前值之间的肿瘤AUC0-48h，例如在约10μM-h到约 100μM-h范围内的肿瘤AUC0-48h、在约10μM-h到约80μM-h范围内的肿瘤AUC0-48h、 在约15μM-h到约80μM-h范围内的肿瘤AUC0-48h、在约15μM-h到约50μM-h范围内 的肿瘤AUC0-48h、在约20μM-h到约50μM-h范围内的肿瘤AUC0-48h、在约20μM-h到 约40μM-h范围内的肿瘤AUC0-48h、在约20μM-h到约30μM-h范围内的肿瘤AUC0-48h等。在一个实施例中，“0”时间点是新的治疗周期的开始。在一个具体实施例中，患 有肿瘤的患者是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71，以提供0与336小时之间约0.5μM到 约7.5μM的PU-H71平均肿瘤浓度(本文中称为[PU-H71]avg)。举例来说，0与336小 时之间的[PU-H71]avg可以是约1μM、约3μM、约5μM或约7μM。可以投予PU-H71 以提供在任两个先前值之间的[PU-H71]avg，例如在约1μM到约5μM、约3μM到7μM、 约3μM到约5μM等范围内的[PU-H71]avg(在0小时与336小时之间测量)。在一个实 施例中，“0”时间点是新的治疗周期的开始。在一个具体实施例中，患有肿瘤的患者 是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在另一实施例中，本发明提供了治疗患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的患 者的方法，其包含向患者投予足够量的PU-H71，以提供0与168小时之间约0.25μM 到约3.75μM的PU-H71平均肿瘤浓度([PU-H71]avg)。举例来说，0与168小时之间的 [PU-H71]avg可以是约0.5μM、约1.5μM、约2.5μM或约3.5μM。可以投予PU-H71以 提供在任两个先前值之间的[PU-H71]avg，例如在约0.5μM到约2.5μM、约1.5μM到3.5 μM、约1.5μM到约2.5μM等范围内的[PU-H71]avg(在0小时与168小时之间测量)。 在一个实施例中，“0”时间点是新的治疗周期的开始。在一个具体实施例中，患有肿 瘤的患者是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
如所属领域的技术人员所了解，待投予以实现所希望的“致癌HSP90”占有率、肿瘤AUC或[PU-H71]avg所需的PU-H71总量取决于投药途径与给药时程。PU-H71可以通 过各种可注射途径投予，包括静脉内、皮下、肌肉内和腹膜内。或者，PU-H71可以经 口投予。
在本发明的一个实施例中，PU-H71根据选自一周一次、一周两次、一周三次、一 周四次或一周五次的给药时程以约5mg/m2到约250mg/m2范围内的剂量静脉内投予患 有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的人类患者。在具体实施例中，PU-H71根据选 自一周一次、一周两次、一周三次、一周四次或一周五次的给药时程以约20mg/m2到 约60mg/m2的剂量静脉内投予人类患者。在具体实施例中，PU-H71根据选自一周一次、 一周两次、一周三次、一周四次或一周五次的给药时程以约50mg/m2到约250mg/m2 的剂量静脉内投予人类患者。在其它实施例中，PU-H71根据选自一周一次、一周两次、 一周三次、一周四次或一周五次的给药时程以约50mg/m2到约100mg/m2的剂量静脉 内投予人类患者。在其它实施例中，PU-H71根据选自一周一次、一周两次、一周三次、 一周四次或一周五次的给药时程以约75mg/m2到约200mg/m2的剂量静脉内投予人类 患者。在其它实施例中，PU-H71根据选自一周一次、一周两次、一周三次、一周四次 或一周五次的给药时程以约75mg/m2到约150mg/m2的剂量静脉内投予人类患者。在 一个具体实施例中，患有肿瘤的患者是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在优选实施例中，PU-H71根据一周一次、一周两次或一周三次的给药时程静脉内投予患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的人类患者。在一个具体实施例中，PU-H71根据一周两次的给药时程以在约50mg/m2到约150mg/m2或约70mg/m2到约125 mg/m2范围内的量静脉内投予。在另一具体实施例中，PU-H71根据一周三次的给药时 程以在约20mg/m2到约100mg/m2或约40mg/m2到约80mg/m2范围内的量静脉内投 予。在另一实施例中，PU-H71根据一周一次的给药时程以在约90mg/m2到约190mg/m2 或约100mg/m2到约250mg/m2范围内的量静脉内投予。在一个具体实施例中，患有肿 瘤的患者是患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者。
在一个实施例中，PU-H71根据一周一次或一周两次，持续两周，接着中断一周的给药时程静脉内投予患有实体肿瘤、淋巴瘤或血液科恶性疾病的人类患者。在另一具体 实施例中，PU-H71以一周一次或一周两次，持续一周，接着中断一周的给药时程投予。 或者，PU-H71可以一周一次或一周两次，中间无任一周中断来投予。
5.4.针对预后和诊断应用，评估依赖于HSP90的通路和癌蛋白
如部分5.1.中所讨论，有关癌细胞中“致癌HSP90”与正常HSP90之间的比率的信息可以用于确定HSP90对癌细胞的存活和增殖的影响。另外，已经鉴别出通常依赖于 HSP90进行存活的特定蛋白质和通路。鉴别出患者的癌细胞中这些蛋白质和或这些通路 的表达水平可以提供有关HSP90蛋白质在患者癌症中的作用的重要信息，尤其是在对已 经对HSP90疗法起反应的患者评估时。因此，本发明提供了用于确定患者中存在的人类 癌症是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含(a)获得含有来自 患者癌症的表达HSP90蛋白质的细胞的样品；(b)针对样品中存在的细胞，评估至少一 个以下参数的存在：活化AKT通路、PTEN肿瘤抑制因子功能或表达的缺陷、活化STAT5 通路或Bcl2家族成员(例如Bcl-xL)的蛋白质表达；以及(c)将步骤(b)中获得的 评估与步骤(b)中评估的相同参数对于来自一个或一个以上对使用HSP90抑制剂的疗 法起反应的癌症患者的人类癌细胞的预定参考评估相比较，以由此确定患者癌症是否将 可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应。在具体实施例中，细胞是乳癌细胞或急性骨髓 白血病(AML)细胞。
尽管每年大量潜在的新药剂进入临床评估，但只有5％到8％曾经到达注册。特别注 意到3期高衰竭率，其中估计有50％的肿瘤学药剂停止开发。所述衰竭代价尤其大，并且剥夺了许多患者可能更有效的治疗。这些可怕的统计数字清楚地表明了对发现和实施可预测生物标记物用于患者选择和试验富集的需要。
从过去这些年用靶向药剂获得的结果中我们学习到了什么？当作为单一药剂或除在未用任何生物标记物选择的研究群体中进行化学疗法外，投予新药时，大部分试验已 经产生负面的结果，虽然在一小部分病例中已经显示统计上显著的益处。然而，此益处 最多是由整体存活小或缓和的绝对延长组成。另一方面，基于生物标记物驱动的患者选 择，使用靶向药剂获得的更大绝对益处的实例不断地增加。生物标记物提供了使用肿瘤 和患者特征汇集使用基于特定机制的疗法的功效的精确预测因子的可能性，指导了针对 每一个别患者治疗的选择。具体地说，验证的可预测标记物可以在将来鉴别可能从特定 治疗获得正面临床结果的个体。
本发明认识到这些问题和目的，从而发展和验证生物标记物用于在HSP90抑制剂实 施到癌症治疗中进行生物标记物驱动的患者选择和试验富集。
5.4.1.可预测乳癌中对HSP90的细胞凋亡敏感性的标记物
取决于肿瘤的遗传制造，BC中HSP90抑制可能引起抑制细胞生长或细胞毒性作用。然而，临床中，最希望对治疗起高度细胞凋亡反应，而非抑制细胞生长反应。因此，为 了鉴别当用PU-H71和其它HSP90抑制剂攻击时乳癌肿瘤更可能进行细胞凋亡，已经在 细胞系中进行初步研究以鉴别与对HSP90抑制的最高细胞凋亡反应有关的分子损害。
这些研究提出了HSP90直接调节作用，其活化Akt和提高Bcl-xL和/或Bcl2和/或Mcl-1，这些是作为授予肿瘤对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性的主要要素(即可预测反 应的生物标记物)。所属领域的技术人员将了解测量活化Akt通路可能需要测量一种或 一种以上与此通路有关的蛋白质(例如(但不限于)Akt、S6、PRAS40、Bcl2、mTOR、 IKK、NFkB)的表达和/或磷酸化状态。关于Akt通路和其活化的详细信息可以在KEGG PATHWAY数据库和美国国家癌症研究院的自然通路相互作用数据库(the National Cancer Institute's NaturePathway Interaction Database)中在线找到。还参见马萨诸塞州贝 佛利的赛信通公司(Cell Signaling Technology,Beverly,Mass.)；加利福尼亚州圣地亚哥 的拜卡公司(BioCarta,San Diego,Calif.)；以及加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰/生命技 术公司(Invitrogen/Life Technologies Corporation,Clarsbad,Calif.)的网站。此通路包括但不限于1-磷脂酰基-D-肌醇4,5-二磷酸、14-3-3、14-3-3-Cdkn1b、Akt、BAD、BCL2、BCL2L1、CCND1、CDC37、CDKN1A、CDKN1B、瓜氨酸、CTNNB1、EIF4E、EIF4EBP1、 ERK1/2、FKHR、GAB1/2、GDF15、糖原合成酶、GRB2、Gsk3、Ikb、IkB-NfkB、IKK (复合物)、ILK、整合素、JAK、L-精氨酸、LIMS1、MAP2K1/2、MAP3K5、MAP3K8、 MAPK8IP1、MCL1、MDM2、MTOR、NANOG、NFkB(复合物)、一氧化氮、NOS3、 P110、p70S6k、PDPK1、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸、PI3K p85、PP2A、PTEN、PTGS2、 RAF1、Ras、RHEB、SFN、SHC1(包括EG:20416)、SHIP、Sos、THEM4、TP53(包 括EG:22059)、TSC1、Tsc1-Tsc2、TSC2、YWHAE。
所属领域的技术人员将了解测量一种或一种以上Bcl-2家族抗细胞凋亡分子(例如 Bcl-2、Bcl xL、Mcl-1)的表达可能是了解此抗细胞凋亡家族的影响所需要的。
虽然在建立的BC细胞中的研究提供了有关更可能对HSP90疗法起反应的BC的有价值的信息，但培养的细胞无法完全再现实际的临床疾病。乳癌实验模型涵盖极少数目 的细胞系，此在数十年前发展。虽然一些细胞系维持大部分原始特征，但发现在患者样 品与细胞系之间HSP90水平和其它特征存在差异，此在某种程度上可能是培养应激的后 果。此外，培养细胞系未再现环境对肿瘤细胞的作用。总而言之，相信原代外植体可以 比细胞系更如实地模仿肿瘤特征和对治疗的反应。
因此，为了解决“对HSP90疗法最敏感的BC肿瘤范围是什么”的问题，研究包括 评估从去鉴别的病变丢弃物中获得的临床乳癌肿瘤样品中的PU-H71。
在这些样品中，在BC肿瘤对HSP90抑制剂的敏感性与所选生物标记物的表达之间建立了相关关系。以下阶段将前进并且提出在接下来的试验中使用此用于患者选择。一 旦评分系统界定并验证，患者选择可以最终在FFPE或CTC进行以使感兴趣的标记物与 预测的反应相关。接着可以引入所述诊断测量，作为以与HER2-评分用以指导曲妥珠单 抗(Trastuzumab)疗法的患者选择相同的方式，选择对HSP90疗法更可能起反应的BC 肿瘤的惯例。
离体测试BC样品对PU-H71的敏感性.BC患者肿瘤的新鲜组织切片离体暴露于 PU-H71，以评估癌细胞的总敏感性以及对正常细胞(即血管、良性管(如果存在于切片 中的话))的作用。PU-H71的浓度和暴露时间是基于使用此药剂的先前体外与体内PK 分析，其中确定了在投予后24小时和48小时高达微摩尔浓度的PU-H71递送到肿瘤中 并且维持。反应通过一次或两次测量确定：1.H&E染色的细胞样品中的定量，显示出 指示细胞凋亡的形态变化，以及2.定量TUNEL-阳性细胞。
患者组织获取：根据机构审查委员会(the Institutional Review Board)的指南和批 准，从HSP90抑制剂试验期间去鉴别的样品和针芯活组织检查获得病变丢弃物。新鲜获取的组织将立即使用。
离体敏感性检查：手术去除乳房切除术样品后，立即将组织输送到病变组的组织获取服务(the Tissue Procurement Services，TPS)区。一旦定位病变，就在无菌条件下收获组织。被去除以供评估的样品尺寸典型地是5-10mm×5-10mm。尽一切努力取样最 有活力的区域。远离病变，去除代表正常乳房上皮组织的同等尺寸的样品。两种样品都 放在具有1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的最低必需培养基(MEM)中。 一小部分病变和整片正常乳房上皮组织进行“快速”冷冻以供将来通过WB进行分子评 估。病变(乳房切除术)的剩余部分进行加工，以用于病理学评估。对于每个病变，病 理学提供了受体状态、增殖标记物、上皮标记物和一个苏木精/曙红(H&E)染色的载 片以及10个未染色的载片的IHC以针对非标准生物标记物(例如pAKT、BclxL、HSP90 和Hsp70)进一步评估。
从初步分析，已经得知新鲜的组织切片提供了一种比初级细胞分离迅速并更有效的 用于HSP90抑制评估的离体方法。此外，其保持癌细胞处于周围组织的内源性环境中。这是重要的，因为已知基质细胞与肿瘤细胞之间的相互作用在癌症生长和进展中起重要作用。在此方法中，组织(即病变)放在塑料模具中并且包埋于6％琼脂糖中。琼脂糖 包埋的组织然后安装在被浸没在含有具有1％青霉素/链霉素的MEM的冷却的储集器(用 于保存组织)中的Vibratome切片机平台上。然后使用金属刀片将组织切片，产生200μm 厚的病变连续切片。每一切片(减去周围的琼脂糖包埋培养基)立即放入含有具有1％ 青霉素/链霉素的MEM的24孔组织培养板中。从5mm×5mm组织块，产生约25个切 片。此允许重复分析用最少4个剂量的HSP90抑制剂处理和一个仅媒剂处理的组织切片。 一旦组织切片通过短暂暴露于分散酶进行酶促分离，重复实验就可以通过IHC以及活力 分析(自动板式读数器或细胞离心涂片机设备)来分析。
迄今，已经获得涵盖所有BC亚型的四十二个样品。其中，九个具有受体状态阴性。已经评估原发性肿瘤(PT)与淋巴结转移(LN)(如果存在的话)，其中200μm厚“新 鲜组织切片”暴露于递增剂量的PU-H71。用PU-H71处理三阴性浸润性导管癌(IDC) 以剂量依赖性方式实现原发性肿瘤与淋巴结转移的细胞凋亡。有趣地，LN转移似乎比 相应PT对PU-H71更敏感。最显著地，正常(例如血管、淋巴细胞)和良性(例如管、 小叶)组织在暴露于PU-H71 48小时后保持不变。数据展示4个不同敏感性的群组中一 串TNBC病例：很敏感，注意到在0.5μM PU-H71下100％细胞凋亡(顶部曲线，图40A)； 敏感，在1μM PU-H71下100％细胞凋亡(中间曲线，图40A)；部分抗性，注意到在 1-2.5μM下约50％细胞凋亡(底部曲线，图40A)；以及抗性(PT#14，注意到在任何 测试浓度下无细胞凋亡，未展示)。
如图40B中指出，若干肿瘤对HSP90抑制比从在细胞系上产生的初步数据中预测得更敏感。确切地说，虽然MDA-MB-468是最敏感的乳癌细胞系之一(卡尔达什(Caldas) 等人PNAS 2009)，但是本发明中呈现的研究展示在从人类乳癌患者中获得的原代样品 中可以发现对PU-H71敏感性高得多的肿瘤细胞。确切地说，虽然MDA-MB-468细胞中 需要0.5μMPU-H71的48小时处理以观测到其约50％进行细胞凋亡，但是发现对于若 干HER2+、三阴性和ER+乳癌，低到0.05μM的浓度诱发类似的作用。此外，虽然 MDA-MB-468细胞中需要5μMPU-H71的48小时处理以观测到其约100％进行细胞凋 亡(图32b)，但是发现对于若干HER2+、三阴性和ER+乳癌，低到0.5μM的浓度诱发 类似的作用。所述研究提供了有关预计提供治疗作用所需的PU-H71肿瘤浓度的信息。
GI和胰腺癌中的研究得到类似发现。
5.4.1.1.通过IHC和WB研究所提出的生物标记物的表达，并且通过生物标记物 表达对样品评分
IHC基于HSP90、Hsp70、p-Akt/Akt和Bcl-xL的低程度到高程度表达来对样品评分。通过用抗体稀释缓冲液置换初级抗体获得充足的阴性对照组。将针对每一样品，以0到 3的量表，评分HSP90、p-Akt/Akt、Bcl-xL和Hsp70染色强度(2次)，其中0表示阴 性染色，1表示弱阳性染色，2表示适度阳性染色，以及3表示强阳性染色。虽然单独 IHC因为评分通常非常主观而在某种程度上可能是成问题的，但是其与如蛋白质印迹法 等第二种方法联用将“训练”和验证IHC来使离体和患者中反应产生相关性。如果获得 的蛋白质量对于典型的膜-WB不足够，那么使用超敏感毛细管-WB技术。典型的芯针活 组织检查样品产生20与40mg之间的组织，此足够用于所提出的IHC以及可能用于毛 细管WB分析。将在临床反应的背景下分析此信息，指导所提出的评分方法的有效性。 也就是说，将能够使临床反应与通过生物标记物评估预测的反应相关。一旦评分系统界 定并验证，患者选择就可以最终在FFPE上进行以使感兴趣的标记物与预测的反应相关。 接着可以引入所述诊断测量，作为以与HER2-评分用以指导曲妥珠单抗疗法的患者选择 相同的方式，选择对HSP90疗法更可能起反应的TNBC肿瘤的惯例。
对于一些患者，由于肿瘤难接近(深度内部转移)或未获得同意，活组织检查可能是不行。对于这些情况，将旨在探测从血液收获的循环肿瘤细胞(CTC)是否是有提供 信息的价值。取决于疾病阶段，对于晚期癌症患者，预计使用此技术回收1,000与10,000 个之间的BC细胞。此数目的细胞足够用于蛋白质的毛细管-WB分析(或如果需要的话， 实时qPCR分析)和通过免疫磁性富集、然后流式细胞术对HSP90、Hsp70、p-Akt和 Bcl-xL表达进行评分。
图40展示如通过用磷酸化Akt Ser473高度染色证明，具有活化Akt的乳癌肿瘤也是对HSP90抑制很敏感的肿瘤。
5.4.2.急性骨髓白血病(AML)中对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性的决定因素
设计成能诱发白血病细胞中细胞凋亡的靶向疗法是最有希望的抗白血病策略。研究 可预测AML中对热休克蛋白90(HSP90)疗法的细胞凋亡敏感性的生物标记物。发现HSP90抑制剂添加到一组遗传上不同的AML细胞系有效地抑制细胞生长和诱发若干 AML细胞特异性癌蛋白(例如突变FLT3、TEL-TRKC、AML1-ETO、突变c-KIT和突 变JAK2)的降解。显著地，在HSP90抑制后这些细胞进行细胞凋亡的倾向显著地发生 变化。最敏感的细胞系是MOLM-13、MV-4-11和M0-91细胞，并且对于这些细胞系中 的每一者，观测到在HSP90抑制剂处理48-72小时后原始细胞群体接近100％杀死。相 比之下，在HEL和HL-60细胞中在这些条件下仅看见20％死亡。然后，利用已知在AML 中失调的已知致癌信号传导通路的特定抑制剂显示AML细胞对HSP90抑制的细胞凋亡 敏感性与PI3K Akt和STAT5活化相关，而不是与Raf-MAPK通路的活化相关。重要地， 在细胞系、异种移植模型和同基因的细胞系系统中观测到类似结果。还发现甚至在 Bcl-xL过度表达的情况下，这两条通路的双重活化也降低了抑制HSP90时AML的细胞 凋亡临限值。总之，研究结果表明Akt和STAT5信号传导活化的AML患者最可能受益 于HSP90抑制剂疗法，并且临床试验应旨在招收这些重要的信号传导通路特定活化的患 者。
重要地，50-70％的AML患者显示Thr308与Ser473Akt磷酸化。此分子促进AML 中的增殖、存活和药物抗性，并且与不利的结果相关联。总之，研究结果表明Akt和STAT5 信号传导活化的AML患者最可能受益于HSP90抑制剂疗法，并且临床试验应旨在招收 这些重要的信号传导通路特定活化的患者。
5.4.2.1.HSP90抑制诱发AML细胞系中细胞类型特异性杀死
已经报导了许多化学上不同的小分子HSP90抑制剂，并且若干处于临床或晚期临床 前研究中(池欧斯(Chiosis)等人,2008)。其中有安沙霉素(ansamycin)天然产物衍生物17-AAG和17-DMAG，以及都处于临床评估中的合成化合物CNF-2024(BIIB021) 和PU-H71，以及处于临床前开发中的PU-H71紧密衍生物PU-DZ13。
为了评估AML细胞系对HSP90抑制剂的敏感性范围，并且研究其遗传背景与通过HSP90疗法诱发细胞凋亡之间的可能关系，利用变化的细胞组。确切地说，选择香住-1 和SKNO-1，它们是含有AML1-ETO融合和突变c-KIT(N822K)蛋白的细胞系； MOLM-13，它们是从由MDS进化而来的AML复发患者外周血建立的人类细胞系，其 含有MLL-AF9融合蛋白和FLT3ITD突变；M0-91，其含有TEL-TRKC融合蛋白并且还 具有组成性活化的STAT5；以及最终HEL，其含有JAK2V617F突变。HSP90抑制剂以 剂量和细胞依赖性方式有效地抑制每一测试的AML细胞系的生长以及诱发细胞杀死， 在这些细胞系中观测到显著的差异。最敏感的是MOLM-13和M0-91细胞，其中在72 小时后注意到原始细胞群体100％杀死，接着是香住-1和SKNO-1，50-80％杀死，以及 HEL是20％杀死。在类似浓度下，正常外周血白血球未受影响。
不同的HSP90抑制剂杀死AML细胞系的能力类似，表明这些化合物的细胞毒性是通过共同的作用机制，即HSP90抑制发生的。
5.4.2.2HSP90抑制诱发AML细胞的细胞凋亡
因此选择PU-H71进一步研究可解释HSP90抑制剂杀死AML细胞的机制。如通过 双重吖啶橙/溴化乙锭染色、PARP裂解和卡斯蛋白酶3,7的活化证明，AML中PU-H71 的细胞毒性主要是通过诱发细胞凋亡发生的。用PU-H71处理72小时后进行细胞凋亡的 细胞数目对于MOLM-13和M0-91接近100％，对于SKNO-1和香住-1是50-60％，并且 对于HEL是30％，这些值与观测到的细胞杀死非常一致。早在24小时就观测到 MOLM-13和M0-91中卡斯蛋白酶-3,7活化增加十倍，并且香住-1和SKNO-1中增加两 倍。在HSP90抑制剂处理48小时后M0-91细胞系基本上没有检测到活细胞。在最敏感 细胞MOLM-13和M0-91中，细胞凋亡与抗细胞凋亡分子Bcl-xL的下调相关联。
5.4.2.3.HSP90的抑制耗尽关键的AML癌蛋白，但此作用无法与细胞凋亡敏感 性相关
AML细胞系对HSP90抑制剂不同的细胞凋亡敏感性可能是由于某些细胞系中HSP90抑制有效，而其它细胞系中低效。为了测试此假设，评估PU-H71对在大部分癌 症中显示依赖于HSP90的两种蛋白质RAF-1和AKT激酶的作用。在所有测试的细胞中 HSP90抑制剂剂量依赖性地并且明显地降低这些蛋白质的稳态水平。此与所建立的其中 HSP90为这些激酶在癌细胞中的稳定性和功能所需的机制一致。
除这些“泛癌”HSP90客户蛋白外，PU-H71还引起特定白血病生成驱动因子(例 如MOLM-13中的突变FLT3、M0-91中的TEL-TRKC、香住-1和SKNO-1中的 AML1-ETO和突变cKIT以及HEL中的突变JAK2(AML细胞特异性HSP90致癌客户蛋 白))降解。先前报导AML或其它转化细胞中突变FLT3、cKIT和JAK2以及融合蛋白 AML1-ETO对HSP90抑制敏感。然而，融合蛋白TEL-TRKC是一种新颖的HSP90客户 蛋白，如展示M0-91细胞系中PU-H71使TEL-TRKC有效降解的研究结果所指示。
总的来说，研究结果表明HSP90抑制剂耗尽AML细胞的关键恶性驱动蛋白，包括 假定是白血病生成的必需事件的‘两个标靶’，但此作用与HSP90抑制剂诱发AML细 胞中细胞凋亡的能力之间无明显相关。
5.4.2.4.AML细胞中对HSP90、PI3K/AKT和JAK/STAT通路的抑制的细胞凋 亡敏感性重叠
因为遗传构成与对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性之间的关系不明显，所以可能的答 案可能在于引起抗细胞凋亡表型的功能差异或这些细胞中某些抗细胞凋亡分子的差异表达。三个主要通路已经与AML中细胞凋亡的调节有联系：PI3K/AKT/NFkB、JAK/STAT 和ras/MAPK通路。更重要地，HSP90沿这些通路调节若干关键分子，并且HSP90的抑 制可以引起这些分子例如p-AKT、p-STAT和p-ERK的组合抑制。
为了探测AML细胞系中个别通路对细胞凋亡的意义，使用特定的小分子，例如Akt抑制剂VIII(一种有效并选择性地抑制Akt1/Akt2活性(AKTi)的喹喔啉化合物)、MAP 激酶MEK抑制剂PD98059(MEKi)和泛Jak抑制剂2-(1,1-二甲基乙基)-9-氟-3,6-二氢-7H- 苯并[h]-咪唑并[4,5-f]异喹啉-7-酮(JAKi))。还通过添加三种额外的细胞系扩大AML细 胞池：HL-60，一种对myc致癌基因表达呈阳性的广泛研究的前髓细胞的细胞系；THP-1， 一种来自患有单核细胞AML的一岁男婴的外周血的细胞系；以及MV4-11，一种含有 4；11移位和FLT3ITD突变的细胞系。
在用AKT、JAK和MEK抑制剂(AKTi、JAKi和MEKi)以及HSP90抑制剂PU-H71 处理后细胞凋亡的细胞数目在添加特定抑制剂后24、48和72小时定量。在添加MEK 抑制剂后少量或几乎不诱发细胞凋亡。另一方面，AKT和JAK抑制剂对细胞凋亡具有 变化但有效的作用。细胞凋亡的分析表明对AKTi敏感的细胞也是在抑制HSP90时最可 能细胞凋亡的细胞(斜率＝0.9023±0.09572)，表明AML中对HSP90抑制的细胞凋亡敏 感性可能与对PI3K/AKT通路抑制的敏感性有关。JAK/STAT通路与HSP90抑制之间的 相关性也是良好的(斜率＝0.8245±0.1490)，不过两个细胞系MV4-11和THP-1清楚地 概述了这一点。研究结果表明AML细胞存活对PI3K/AKT和JAK/STAT通路中任一者 或两者的依赖与对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性相关并且可能决定了对HSP90抑制的 细胞凋亡敏感性。
5.4.2.5.AKT和STAT5SP90抑制的体内抑制的动力学和效能与肿瘤细胞凋亡相 关
接下来分析小鼠中异种移植的HEL与M0-91肿瘤中HSP90抑制的药效学作用。不 同于培养的细胞，使用体内模型允许实时监测HSP90依赖性通路抑制。因为最依赖于 HSP90的通路也是对其药理学抑制最敏感的，所以在肿瘤内其保持被PU-H71抑制最长 时间段。因此，在具有提高的p-AKT和p-STAT5并且似乎依赖于两种通路活化的M0-91 肿瘤中，PU-H71诱发显著的细胞凋亡。在投予一次剂量PU-H71后M0-91中的细胞凋 亡持续96小时，映射出AKT与STAT的有效抑制。在投予PU-H71后12-72小时的时 间间隔内，当p-AKT与p-STAT5水平降低了70到100％的初始水平时，观测到最高水 平的裂解PARP。到96小时，当p-AKT而不是p-STAT5回复到基线水平时，PU-H71对 PARP的作用下降。
HEL异种移植肿瘤对PU-H71的细胞凋亡诱发不如M0-91肿瘤敏感。在培养条件下，HEL细胞表达提高的p-STAT5，并且通过JAKi或通过PU-H71抑制JAK/STAT通路使 20-30％的细胞进行细胞凋亡。另一方面，AKTi在这些细胞中几乎没有作用。因此，在 这些细胞中HSP90抑制后注意到有限的PARP裂解和卡斯蛋白酶-3活化。
尽管如此，并且与组织培养对比，当在裸小鼠异种移植时，HEL细胞显示低到中等的p-AKT表达水平。这不令人惊奇，因为据报导在AML细胞中AKT活性可以通过环 境、例如通过细胞激素刺激，并且由于具有肿瘤组织独有的应激物，例如低氧、酸度和 异常血管形成，所以体内肿瘤存活可能更依赖于AKT活性。异种移植HEL细胞中AKT 活性提高似乎是肿瘤存活所需的，因为在HEL肿瘤中PU-H71诱发比培养的HEL细胞 明显更高的细胞凋亡。如同M0-91肿瘤一样，当p-AKT和p-STAT5水平通过PU-H71 降低了70到100％的初始水平时(在投予PU-H71后12-48小时的时间间隔内)，观测到 最高水平的裂解PARP。当p-AKT而不是p-STAT5回复到基线水平时(72小时)PARP 的裂解显著减少。
总的来说，数据表明AML中HSP90抑制剂的细胞凋亡活性与活化的p-AKT和 p-STAT5物质的下调相关并且是其量度。除p-Akt[即Ser 473]外，Akt-通路的活化状态 可以作为S6、s6k或mTOR的磷酸化状态的量度确定，也由PU-H71处理下调。观测结 果也意味着AML细胞累加依赖于AKT和STAT-通路活化也使它们对HSP90抑制更敏 感。
5.4.2.6.HSP90抑制诱发存活依赖于PI3K/AKT和JAK/STAT通路的细胞中的细 胞凋亡
为了证明此假设，利用FL5.12同基因的细胞系。FL5.12作为具有功能性JAK/STAT通路的介白素-3(IL-3)依赖性细胞系获得，并且其具有早期淋巴细胞祖细胞的特征要 素。亲本细胞与转染的细胞都表达中等水平的活性AKT和STAT5，如分别通过Ser473 上的AKT磷酸化和Tyr694上的STAT5磷酸化证明。p-STAT5而不是p-AKT的水平依 赖于IL-3的存在。在多西环素(doxycycline，DOX)诱导性启动子的控制下引入AKT 的组成性活化的十八烷基化形式(mAKT)进一步允许这些细胞中p-AKT水平的调节。 总之，这些细胞是评估HSP90抑制剂细胞凋亡敏感性对活化AKT和STAT5-通路的依赖 性的良好的同基因模型。
当mAKT转染的细胞用AKTi处理时，注意到细胞凋亡细胞从5-7％增加到15-20％。此值反映了内源性p-AKT对这些细胞存活的影响。当AKT活性通过DOX的添加增加 时，细胞的存活变得更依赖于AKT，并且AKTi引起30％细胞凋亡细胞(P＝0.015)。
当mAKT转染的细胞用HSP90抑制剂处理时，检测到约35-40％细胞凋亡细胞。此 值反映了内源性p-AKT和p-STAT5对这些细胞存活的组合影响。在添加PU-H71后， p-AKT水平通过Dox的进一步增加引起细胞凋亡细胞从35-40％增加到50％。
总之，这些研究结果证明AML细胞对HSP90抑制剂的细胞凋亡敏感性反映了细胞存活依赖于AKT和STAT-通路。
5.4.2.7.Bcl-xL过度表达无法抑制AML中HSP90抑制的细胞凋亡作用
组成性高水平的Bcl-xL已经与白血病细胞对各种类别的化学治疗剂的抗性有关。因 此，研究引入Bcl-xL是否将克服FL5.12转染细胞存活对AKT和STAT的依赖性并且将 使它们对PU-H71抑制这些通路有抗性。为了研究此假设，利用经含有细胞凋亡抑制剂 Bcl-xL的表达载体稳定转染的FL5.12.mAKT细胞。在体外这些细胞的增殖保持依赖于 IL-3。在这些细胞中，类似于M0-91细胞，观测到STAT5和AKT-通路的同时活化和Bcl-xL 的过度表达。如M0-91中的情况，通过PU-H71抑制HSP90引起这些蛋白质的活性和稳 态水平降低并且保持其细胞凋亡作用。
5.4.2.8.讨论
尽管每年大量潜在的新药剂进入临床评估，但只有5％到8％曾经到达注册。特别注 意到3期高衰竭率，其中估计有50％的肿瘤学药剂停止开发。所述衰竭代价尤其大，并且剥夺了许多患者可能更有效的治疗。这些可怕的统计数字清楚地表明了对发现和实施可预测生物标记物用于患者选择和试验富集的需要。研究解决了AML中的此问题，并 且表明对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性与细胞存活累积依赖于具有抗细胞凋亡作用的 信号传导通路有关。在这方面，鉴别活化的Akt和STAT为重要的通路。
AKT信号传导常常在急性AML患者胚细胞中活化并且强有力地促进这些细胞的增殖、存活和药物抗性。50到70％的AML患者显示Thr308与Ser473AKT磷酸化。与无 AKT活化的患者相比，显示AKT活化的患者的无病与整体存活时间显著较短，共同表 明AKT不活化可能是AML中有效的策略。HSP90可能是以转化依赖性方式调节此通路 和若干其关键要素。因此，观测到原代急性骨髓白血病(AML)细胞中HSP90表达与 pAKT表达之间的显著相关性，表明HSP90过度表达为AML细胞缓冲增加的活性和细 胞对AKT通路的依赖性所必需的。
组成性STAT活化也存在于约70％AML样品中。AML细胞中的STAT活化已经与FLT3ITD和IL-6的自分泌刺激有关，但不限于此。然而，STAT通路的其它上游调节剂 也可以在STAT活化中起作用。实际上，还发现KIT突变活化JAK/STAT通路。具有高 度STAT5和FLT3磷酸化的AML病例一般显示，与没有自发STAT5磷酸化的AML胚 细胞相比，自发细胞凋亡百分比较低。涉及JAK/STAT基因的移位提供了STAT活化与 白血病生成之间的另一联系。已经在淋巴细胞与骨髓白血病中发现将TEL基因的寡聚域 与JAK2的催化域组合的t(9；12)移位。此移位组成性活化下游效应物，例如STAT5，并 且诱发转染模型中不依赖于细胞激素的生长。如先前报导以及这里又展示，若干这些 STAT活化蛋白需要HSP90促进其异常活性。
总之，侵袭性AML克隆存活依赖于例如AKT和STAT5等若干活化通路和分子致 使它们也最依赖于HSP90。因此HSP90抑制变得最有效于杀死这些细胞。研究结果还表 明在活化AKT和STAT5的情况下抗细胞凋亡Bcl-xL的同时过度表达不显著地改变这些 细胞对HSP90的敏感性。Bcl-xL过度表达对AML中药物抗性有重大的影响。Bcl-2家 族(Bcl-2、Bcl-x(L))的抗细胞凋亡剂蛋白质的过度表达引起对122种“标准”化学疗 法药剂的药物抗性并且与AML患者更坏的临床结果相关联。
最后，研究结果表明Akt和STAT5信号传导活化的AML患者很可能受益于HSP90 抑制剂疗法(参见图41和42)并且临床试验应旨在招收这些重要的信号传导通路特定 活化的患者。研究结果还表明准许引入HSP90抑制剂与Bcl-xL过度表达的AML中的其 它处理组合，作为一种降低其细胞凋亡临限值的方式。
5.5.使用放射性标记的HSP90抑制剂选择将对HSP90抑制疗法敏感的神经变性 患者
使用放射性标记的HSP90抑制剂选择将对HSP90抑制疗法敏感的患者描述于部分5.2.1.中。类似的方法可用于鉴别可能对HSP90疗法起反应的罹患神经变性疾病的患者。因此，本发明提供了用于确定罹患神经变性疾病的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂 的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使脑与优先结合于患者脑细胞中存在的HSP90的病原性形式的放射性标记的HSP90抑制剂接触；
(b)测量结合于样品中脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于样品中脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量与参考量比较；
其中步骤(b)中测量的结合于脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明患者将可能对HSP90抑制剂起反应。
在一个实施例中，参考来自患有神经变性疾病的相同患者的细胞。举例来说，已经确定正常神经元几乎没有“病原性HSP90：因此，参考量可以使用患者的非患病脑区域 中的正常神经元确定。在另一实施例中，参考可以来自健康个体的细胞。在另一实施例 中，参考量可以由健康个体的研究群体测量。
恶性转化与神经变性在其存在于阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏 病(Parkinson's)、额颞叶痴呆和其它痴呆、脊柱和延髓肌肉萎缩中时，是复杂而冗长的 多步过程，其特征为异常的表达、翻译后改性以及某些蛋白质加工。为了维持和允许这些失调过程累积，并且促进疾病表型逐步发展，细胞必须指派一种补偿性的调节机制。 癌症中，此作用已经归因于热休克蛋白90(HSP90)。在这种意义上，在表型水平下， HSP90似乎用作表征不同肿瘤的许多癌症特异性病变的生物化学缓冲剂。。HSP90在神 经变性中存在类似的作用并且因此部分5.2.1.中描述的PET分析可以用于鉴别患病脑中 的“病原性HSP90”。神经变性疾病中的“病原性HSP90”在癌症中起到类似于“致癌 HSP90”的作用。HSP90抑制剂治疗神经变性疾病的用途描述于美国公开申请案第 2009/0298857号中，此案以引用的方式并入本文中。
因为HSP90抑制剂PU-HZ151展示对神经变性脑HSP90的高度结合亲和力，能够 强有力地诱发HSP70水平，并且估计可渗透脑，所以选择其用于进一步体内评估。 PU-HZ151描述于WO 2008/005937中并且其具有以下化学结构：
Figure BDA0001717339850001071
实际上，当腹膜内投予3xTg AD小鼠时，PU-HZ151产生显著的标靶调节作用，如 通过海马区中HSP70诱发显示(图43A)。作用是剂量依赖性的(图43B)，在低到10mg/kg 投予剂量下检测到HSP70显著诱发。
然后在3xTg AD小鼠的脑和血浆中确定HSP90抑制剂水平与这些药物动力学作用有关(图43C)。当以50mg/kg腹膜内投予3xTg小鼠时，皮层中的PU-HZ151水平在投 予后4小时到达3.3±0.9μg/g(约5,000nM)，12小时到达0.05±0.08μg/g(约170nM)， 24小时到达0.02±0.03μg/g(约60nM)，并且48小时到达0.02±0.02μg/g(约53nM)。 比较起来，以类似剂量(75mg/kg)投予的PU-DZ8(一种效力较差的HSP90抑制剂) 在投予后4小时仅到达0.35μg/g(约700nM)以及12小时0.2μg/g(约390nM)的脑 浓度，并且到24小时，在皮层中未检测到。
血浆中，PU-HZ151在4小时到达2.1±0.1μg/g(约4,000nM)，但超过8小时无法 检测到。如通过曲线下面积(AUC)测量，0到48小时的时间间隔内皮层对PU-HZ151 的暴露是血浆的2.5倍(17.5对比7.1μM-h)。小脑(此模型中疾病未影响的脑区域)中 的水平比皮层(此模型中患病脑区域)中记录的水平更接近于血浆水平。此观测结果还 由以下来支持：此脑区域中抑制剂PU-HZ151延长滞留到投予后48以上小时，这是类 似于肿瘤内使用例如PU-H71等此类别抑制剂获得的结果的研究结果。
124I-PU-HZ151和其它放射性标记的HSP90抑制剂因此可以用以选择患有HSP90依赖性神经变性疾病的患者以及鉴别更可能受益于所述疗法的患者。还可以用类似于 PU-H71在癌症中的方式用于确定病原性脑对HSP90抑制剂的暴露以及确定投予的最佳 剂量和时程。
所属领域的技术人员可了解本发明所描述的PU-H71在癌症中的用途也可以在神经 变性疾病中用放射性标记的可渗透脑的HSP90抑制剂实现。
6.材料与方法
6.1.合成方法
6.1.1.合成荧光标记的探针
1H NMR谱是在布鲁克(Bruker)500或600MHz仪器上记录。化学位移是以ppm 为单位，从作为内标的TMS往低磁场偏移的δ值报导。1H数据报导如下：化学位移、 峰裂数(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，br＝宽峰，m＝多重峰)、耦合常 數(Hz)、积分。高分辨率质谱是在沃特世LCT第一系统(Waters LCT Premier system) 上记录。低分辨率质谱是在具有电喷雾电离和SQ检测器的沃特世阿可力超效LC(Waters Acquity UltraPerformance LC)上获得。高效液相色谱分析是在具有PDA、MicroMass ZQ 和ELSD检测器的沃特世自动净化系统(Waters Autopurification system)以及逆相柱(沃 特世X型桥(Waters X-Bridge)C18，4.6×150mm，5μm)上进行，使用以下梯度；方 法A(a)H2O+0.1％TFA和(b)CH3CN+0.1％TFA，在1.2mL/min下经10分钟5到 95％b；方法B(a)H2O+0.1％TFA和(b)CH3CN+0.1％TFA，在1.2mL/min下经 13分钟5到95％b。使用230-400目硅胶(EMD)进行柱色谱法。所有反应都在氩气保 护下进行。异硫氰酸荧光素(FITC)、磺酰罗丹明101磺酰氯(得克萨斯红-Cl)和4-氯 -7-硝基-1,2,3-苯并噁二唑(NBD-Cl)是从奥德里奇(Aldrich)购买的。
PU-H71-FITC1[4](方案1).将含化合物321(15mg，0.0263mmol)、FITC(11.3 mg，0.0289mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌12小时。反应 混合物在减压下浓缩并且残余物通过HPLC纯化，得到10.1mg(40％)4。1H NMR(500 MHz,MeOH-d4)δ8.17(s,1H),8.05(s,1H),7.93(s,1H),7.65-7.74(m,1H),7.40(s,1H), 7.08-7.16(m,2H),6.76-6.89(m,2H),6.66(s,2H),6.50-6.59(m,2H),6.02(s,2H),4.35(t,J ＝6.9Hz,2H),3.96(t,J＝6.4Hz,2H),3.78(br s,2H),3.62(br s,2H),2.31(m,2H),1.77(m, 2H),1.69(m,2H),1.45(m,4H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C42H40IN8O7S2的计算值, 959.1506；实验值959.1530；HPLC(方法A)Rt＝4.52(96％)。
PU-H71-德克萨斯红(PU-H71-Texas Red)[5].将含化合物321(4.6mg，0.008mmol)的DMF(0.25mL)通过冰/水浴冷却到0℃。然后添加磺酰罗丹明101磺酰氯(3mg， 0.005mmol)并且溶液搅拌12小时，以使温度从0℃缓慢升到10℃。反应混合物直接通 过HPLC纯化，得到3.4mg(61％)呈暗紫色固体状的5。1H NMR(500MHz,MeOH-d4) δ8.56(d,J＝1.4Hz,1H),8.31(s,1H),8.16(dd,J＝1.6,7.9Hz,1H),7.48(s,1H),7.46(d, J＝7.9Hz,1H),7.28(s,1H),6.58(s,2H),6.08(s,2H),4.47(t,J＝6.8Hz,2H),3.56(t,J＝ 5.4Hz,4H),3.52(t,J＝5.6Hz,4H),3.15(t,J＝7.6Hz,2H),3.08(m,4H),3.01(t,J＝7.7 Hz,2H),2.93(t,J＝6.7Hz,2H),2.68(m,4H),2.35(m,2H),2.11(m,4H),1.90-2.00(m, 4H),1.66(m,2H),1.27-1.45(m,6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C52H57IN9O8S3的计算值, 1158.2537；实验值1158.2534；HPLC(方法B)Rt＝9.40(99％)。
PU-H71-NBD1[8](方案1).将化合物621(12.2mg，0.0229mmol)和722(32mg，0.1145mmol)溶解于DMF(0.4mL)中并且在室温下搅拌20小时。在减压下去除溶剂 并且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到7.9mg (47％)8。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ8.32(d,J＝8.8Hz,1H),8.00(s,1H),7.21 (s,1H),6.89(s,1H),6.04(d,J＝8.8Hz,1H),5.89(s,2H),4.13(t,J＝6.9Hz,2H),3.32(m, 2H),2.51(t,J＝6.9Hz,2H),2.47(t,J＝7.4Hz,2H),1.94(m,2H),1.63(m,2H),1.36-1.45 (m,2H),1.21-1.35(m,4H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C27H30IN10O5S的计算值,733.1166； 实验值733.1171；HPLC(方法B)Rt＝8.80(98％)。
PU-H71-FITC2[9](方案2).将含化合物223(16.7mg，0.0326mmol)、FITC(14.0 mg，0.0359mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌5小时。反应混 合物在减压下浓缩并且残余物通过HPLC纯化，得到21.2mg(72％)9。1H NMR(500MHz, CDCl3)δ8.15(s,1H),7.86(s,1H),7.77(d,J＝7.9Hz,1H),7.34(s,1H),7.09(d,J＝7.9Hz, 1H),7.01(s,1H),6.63-6.71(m,4H),6.51(d,J＝7.3Hz,2H),6.02(s,2H),5.53(br s,2H), 4.30(br s,2H),3.64(br s,2H),2.85(br s,1H),2.27(m,2H),1.23(d,J＝6.2Hz,6H)； HRMS(ESI)m/z[M+H]+C39H33IN7O7S2的计算值,902.0928；实验值902.0942；HPLC(方 法B)Rt＝9.90(99％)。
PU-H71-NBD2[10].将含化合物223(25.4mg，0.050mmol)、NBD-Cl(10.0mg，0.05mmol)和Et3N(7.6μL，0.055mmol)的DMF(0.35mL)在室温下搅拌12小时。 反应混合物在减压下浓缩并且残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，25:1) 纯化，得到13.4mg(40％)10。1H NMR(600MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ8.25(d,J＝8.9Hz, 1H),8.06(s,1H),7.18(s,1H),6.85(s,1H),6.07(d,J＝8.9Hz,1H),5.87(s,2H),4.24(t,J ＝6.9Hz,2H),3.74(m,2H),3.18(m,1H),2.12(m,2H),1.22(d,J＝6.5Hz,6H)；HRMS (ESI)m/z[M+H]+C24H23IN9O5S的计算值,676.0588；实验值676.0593；HPLC(方法B)Rt＝10.37(99％)。
2-(3-(6-氨基-8-(6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)异吲 哚啉-1,3-二酮(2-(3-(6-amino-8-(6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-9-yl)propyl) isoindoline-1,3-dione)[12](方案3).将50mg(0.121mmol)化合物1123溶解于DMF(2 mL)中。添加43.4mg(0.1331mmol)Cs2CO3和162mg(0.605mmol)N-(3-溴丙基)- 邻苯二甲酰亚胺并且在室温下搅拌混合物30分钟。然后添加额外的Cs2CO3(8mg，0.0242 mmol)并且搅拌混合物30分钟。然后添加额外的Cs2CO3(8mg，0.0242mmol)并且 搅拌混合物30分钟。在减压下去除溶剂并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化，得到25mg(34％)12。1H NMR(500MHz,CDCl3) δ8.25(s,1H),7.85(dd,J＝3.0,5.5Hz,2H),7.74(dd,J＝3.0,5.4Hz,2H),7.11(s,1H), 6.80(s,1H),6.10(br s,2H),6.00(s,2H),4.27(t,J＝7.6Hz,2H),3.77(t,J＝6.7Hz,2H), 2.15(m,2H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C23H18IN6O4S的计算值,601.0155；实验值 601.0169；HPLC(方法A)Rt＝7.74。
9-(3-氨基丙基)-8-(6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基硫基)-9H-嘌呤-6-胺(9-(3-aminopropyl)-8-(6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-ylthio)-9H-purin-6-amine)[13](方案3).向 化合物12(34mg，0.0566mmol)于MeOH/CH2Cl2(0.7:0.1mL)中的悬浮液中添加水 合肼(41μL，42.5mg，0.849mmol)并且在室温下搅拌混合物过夜。在减压下去除溶 剂并且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到17mg (64％)13。1HNMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ8.22(s,1H),7.38(s,1H),7.06(s,1H), 6.05(s,2H),4.31(t,J＝6.9Hz,2H),2.76(t,J＝6.6Hz,2H),2.05(m,2H)；HRMS(ESI) m/z[M+H]+C15H16IN6O2S的计算值,471.0100；实验值471.0086；HPLC(方法A)Rt＝ 5.78。
PU-H71-FITC3[14](方案3).将含化合物13(8.4mg，0.0179mmol)、FITC(7.7 mg，0.0196mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌12小时。反应 混合物在减压下浓缩并且残余物通过HPLC纯化，得到11.4mg(74％)14。1H NMR(600 MHz,MeOH-d4)δ8.23(s,1H),8.11(s,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.35(s,1H),7.20(s, 1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),6.63-6.70(m,4H),6.50(d,J＝8.3Hz,2H),5.97(s,2H),4.34 (t,J＝6.5Hz,2H),3.61(m,2H),2.21(t,J＝6.5Hz,2H)；MS(ESI)m/z 860.1[M+H]+； HRMS(ESI)m/z[M+H]+C36H27IN7O7S2的计算值,860.0458；实验值860.0451；HPLC(方 法B)Rt＝9.48(96％)。
PU-H71-NBD3[15](方案3).将含化合物13(7.2mg，0.0153mmol)、NBD-Cl (3.1mg，0.0213mmol)和Et3N(2.3μL，0.0168mmol)的DMF(0.2mL)在室温下搅 拌12小时。反应混合物在减压下浓缩并且残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N)，20:1)纯化，得到4.1mg(42％)15。1H NMR(600MHz,DMF-d7)δ9.54(br s,1H), 8.53(d,J＝8.8Hz,1H),8.22(s,1H),7.51(br s,2H),7.28(s,1H),6.76(s,1H),6.42(d,J＝ 7.9Hz,1H),6.10(s,2H),4.47(t,J＝7.0Hz,2H),3.67(m,2H),2.35(m,2H)；HRMS(ESI) m/z[M+H]+C21H17IN9O5S的计算值,634.0118；实验值634.0130；HPLC(方法B)Rt＝9.57 (99％)。
合成四乙二醇-FITC(TEG-FITC).将含FITC(20mg，0.051mmol)、四乙二醇(49.9mg，0.257mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.4mL)在室温下搅拌12小时。 反应混合物在减压下浓缩并且残余物通过HPLC纯化，得到17.3mg(58％)TEG-FITC。 1H NMR(600MHz,MeOH-d4)δ7.53-8.25(m,2H),7.14(d,J＝8.2Hz,1H),6.72-6.91(m, 4H),6.65(d,J＝6.8Hz,2H),4.60(br s,2H),3.77(m,2H),3.31-3.63(m,12H)；HRMS(ESI) m/z[M+H]+C29H30NO10S的计算值,584.1590；实验值584.1570；HPLC(方法B)Rt＝8.97 (99％)。
2-(4-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丁基)异吲 哚啉-1,3-二酮(2-(4-(6-Amino-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)butyl) isoindoline-1,3-dione)(16a)(方案4).将200mg(0.484mmol)化合物11溶解于DMF (8mL)中。添加466mg(1.43mmol)Cs2CO3和683mg(2.42mmol)N-(4-溴丁基)邻 苯二甲酰亚胺并且对混合物超音波处理30分钟。添加31.5mg(0.097mmol)Cs2CO3并且对混合物再次超音波处理30分钟。此重复两次，总反应时间2小时。去除DMF并 且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化，得到134mg(45％) 化合物16a。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.18(s,1H),7.84(dd,J＝5.5,3.1Hz,2H),7.72(dd,J＝5.5,3.1Hz,2H),7.22(s,1H),6.89(s,1H),6.76(br s,2H),5.99(s,2H),4.23(t,J＝ 7.1Hz,2H),3.69(t,J＝7.0Hz,2H),1.67-1.83(m,4H)；MS(ESI)m/z 615.2[M+H]+。
9-(4-氨基丁基)-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺 (9-(4-Aminobutyl)-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-6-amine)(17a)(方案4).向 化合物16a(38.9mg，0.063mmol)于2mL MeOH/CH2Cl2(7:1mL)中的悬浮液中添 加水合肼(46μL，0.950mmol)并且在室温下搅拌混合物12小时。在减压下去除溶剂 并且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到18mg (59％)化合物17a。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ8.22(s,1H),7.38(s,1H),7.04 (s,1H),6.05(s,2H),4.23(t,J＝7.4Hz,2H),2.78(t,J＝7.1Hz,2H),1.82-1.91(m,2H), 1.55-1.63(m,2H)；MS(ESI)m/z 485.0[M+H]+。
PU-H71-FITC4(18a)(方案4)：将含化合物17a(9.7mg，0.020mmol)、FITC(8.57 mg(0.022mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌3小时。反应混 合物直接通过HPLC纯化，得到5.2mg(30％)化合物18a。1H NMR(600MHz,MeOH-d4) δ8.22(s,1H),8.00(s,1H),7.61(d,J＝7.6Hz,1H),7.37(s,1H),7.19(s,1H),7.06(d,J＝ 8.2Hz,1H),6.58-6.67(m,4H),6.48(dd,J＝8.7,2.0Hz,2H),5.97(s,2H),4.30(t,J＝7.0 Hz,2H),3.58(br s,2H),1.90-2.00(m,2H),1.61-1.70(m,2H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C37H29IN7O7S2的计算值,874.0615；实验值874.0610；HPLC Rt＝9.57(98％)。
2-(6-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)己基)异吲 哚啉-1,3-二酮(2-(6-(6-Amino-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)hexyl)isoindoline -1,3-dione)(16b)(方案4).将200mg(0.484mmol)化合物11溶解于DMF(8mL) 中。添加466mg(1.43mmol)Cs2CO3和751mg(2.42mmol)N-(6-溴己基)邻苯二甲酰 亚胺并且对混合物超音波处理2小时。在减压下去除溶剂并且所得残余物通过制备型 TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化，得到100mg(32％)化合物16b。1H NMR (500MHz,CDCl3)δ8.26(s,1H),7.83(dd,J＝5.4,3.1Hz,2H),7.70(dd,J＝5.4,3.0Hz, 2H),7.26(s,1H),6.87(s,1H),6.36(br s,2H),5.96(s,2H),4.18(t,J＝7.5Hz,2H),3.66(t, J＝7.2Hz,2H),1.70-1.79(m,2H),1.60-1.68(m,2H),1.32-1.43(m,4H)；MS(ESI)m/z 643.2[M+H]+。
9-(6-氨基己基)-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺 (9-(6-Aminohexyl)-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-6-amine)(17b)(方案4). 向化合物16b(97mg，0.1511mmol)于4mL MeOH/CH2Cl2(7:1mL)中的悬浮液中添 加水合肼(110μL，2.27mmol)并且在室温下搅拌混合物12小时。在减压下去除溶剂 并且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到47mg (61％)17b。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.32(s,1H),7.31(s,1H),6.90(s,1H),5.99(s, 2H),5.84(brs,2H),4.20(t,J＝7.5Hz,2H),2.67(t,J＝6.5Hz,2H),1.72-1.84(m,2H), 1.31-1.45(m,6H)；MS(ESI)m/z 513.0[M+H]+。
PU-H71-FITC5(化合物18b)(方案4).将含化合物17b(9.7mg，0.01894mmol)、 FITC(8.11mg，0.0208mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌3小 时。反应混合物直接通过HPLC纯化，得到8.0mg(47％)化合物18b。1H NMR(600MHz, MeOH-d4)δ8.23(s,1H),8.09(s,1H),7.65(d,J＝7.9Hz,1H),7.35(s,1H),7.16(s,1H), 7.08(d,J＝8.3Hz,1H),6.71(d,J＝8.8Hz,2H),6.67(d,J＝2.2Hz,2H),6.53(dd,J＝8.8, 2.2Hz,2H),5.96(s,2H),4.24(t,J＝7.1Hz,2H),3.50(br s,2H),1.79-1.88(m,2H), 1.52-1.61(m,2H),1.31-1.42(m,4H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C39H33IN7O7S2的计算值, 902.0928；实验值902.0939；HPLC Rt＝10.02(99％)。
2-(8-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)辛基)异吲 哚啉-1,3-二酮(2-(8-(6-Amino-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)octyl) isoindoline-1,3-dione)(16c)(方案4).将200mg(0.484mmol)化合物11溶解于DMF (8mL)中。添加466mg(1.43mmol)Cs2CO3和819mg(2.42mmol)N-(8-溴辛基)邻 苯二甲酰亚胺并且对混合物超音波处理1.5小时。在减压下去除溶剂并且所得残余物通 过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH，15:1:0.5)纯化，得到120mg(34％)化合物16c。 1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.29(s,1H),7.84(dd,J＝5.5,3.1Hz,2H),7.70(dd,J＝5.5, 3.1Hz,2H),7.28(s,1H),6.87(s,1H),6.29(br s,2H),5.96(s,2H),4.18(t,J＝7.5Hz,2H), 3.67(t,J＝7.3Hz,2H),1.62-1.77(m,4H),1.25-1.36(m,8H)；MS(ESI)m/z671.3[M+H]+。
9-(8-氨基辛基)-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺 (9-(8-Aminooctyl)-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-6-amine)(17c).向化合物 16c(90.1mg，0.1345mmol)于4mL MeOH/CH2Cl2(7:1mL)中的悬浮液中添加水合 肼(98μL，2.017mmol)并且在室温下搅拌混合物12小时。在减压下去除溶剂并且所 得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到25mg(34％) 17c。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.33(s,1H),7.31(s,1H),6.90(s,1H),5.99(s,2H),5.72 (br s,2H),4.20(t,J＝7.5Hz,2H),2.66(t,J＝7.1Hz,2H),1.70-1.80(m,2H),1.36-1.45(m, 2H),1.21-1.35(m,8H)；MS(ESI)m/z 541.1[M+H]+。
合成PU-H71-FITC6(化合物18c)(方案4)：将含化合物17c(15.0mg，0.028mmol)、FITC(11.9mg，0.031mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌4小 时。反应混合物直接通过HPLC纯化，得到16.9mg(66％)化合物18c。1H NMR(600MHz, MeOH-d4)δ8.22(s,1H),8.11(s,1H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(s,1H),7.12(s,1H), 7.09(d,J＝8.2Hz,1H),6.72(d,J＝8.7Hz,2H),6.67(d,J＝2.0Hz,2H),6.53(dd,J＝8.7, 2.0Hz,2H),5.96(s,2H),4.20(t,J＝7.1Hz,2H),3.50(br s,2H),1.74-1.81(m,2H), 1.52-1.59(m,2H),1.23-1.35(m,8H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C41H37IN7O7S2的计算值, 930.1241；实验值930.1231；HPLC Rt＝10.60(96％)。
合成PU-FITC7(化合物20)(方案7).将含化合物19(15.0mg，0.025mmol)、 FITC(10.7mg，0.0275mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.3mL)在室温下搅拌8小 时。反应混合物直接通过HPLC纯化，得到23.5mg(95％)PU-FITC7。1H NMR(600MHz, MeOH-d4,两种旋转异构体)δ8.18-8.22(m,1H),7.75-7.87(m,4H),7.53-7.58(m,1H), 7.19-7.23(m,1H),7.05(d,J＝8.2Hz,1H),6.98(s,0.15H),6.95(s,0.85H),6.57-6.75(m, 4H),6.46-6.55(m,2H),6.05(s,0.3H),6.00(s,1.7H),3.95-4.05(m,2H),3.55-3.64(m, 1.7H),2.86-2.92(m,0.3H),2.03-2.12(m,1.7H),1.93-2.00(m,0.3H),1.18(d,J＝6.5Hz, 0.9H),1.13(d,J＝6.5Hz,5.1H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C47H36F6N7O7S2的计算值, 988.2022；实验值988.2005；HPLC Rt＝11.00(99％)。
合成PU-FITC8(化合物22)(方案8)：将含化合物21(19.4mg，0.050mmol)、 FITC(21.4mg，0.055mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.4mL)在室温下搅拌14小 时。反应混合物直接通过HPLC纯化，得到34.3mg(88％)PU-FITC8。1H NMR(600MHz, MeOH-d4)δ8.35(s,1H),7.97(s,1H),7.69(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),7.20(dd,J＝8.1,1.9 Hz,1H),7.14-7.18(m,2H),6.91(d,J＝8.0Hz,1H),6.76-6.85(m,4H),6.59-6.65(m,2H), 6.01(s,2H),4.40(t,J＝6.7Hz,2H),3.82(t,J＝7.4Hz,2H),2.35-2.43(m,2H),1.31(d,J＝ 6.7Hz,6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C39H34N7O7S2的计算值,776.1961；实验值776.1978； HPLC Rt＝10.13(98％)。
合成PU-FITC9(化合物24)(方案9)：将含化合物23(10.0mg，0.032mmol)、 FITC(13.9mg，0.036mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.3mL)在室温下搅拌过夜。 反应混合物直接通过HPLC纯化，得到18.3mg(82％)PU-FITC9。1H NMR(600MHz, MeOH-d4)δ8.33(s,1H),7.92(s,1H),7.66(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H),7.15(d,J＝8.2Hz, 1H),6.73-6.83(m,4H),6.58-6.65(m,2H),4.73-4.76(m,2H),4.23(t,J＝6.5Hz,2H), 3.81-3.85(m,2H),3.74-3.81(m,2H),3.41(s,3H),2.28-2.37(m,2H),1.30(d,J＝6.6Hz, 6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C35H36N7O7S的计算值,698.2397；实验值698.2399；HPLC Rt＝9.20(99％)。
合成DZ13-FITC1(方案10).将含PU-DZ13(20.8mg，0.0406mmol)、FITC(17.4 mg，0.0447mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.3mL)在室温下搅拌12小时。反应 混合物直接通过HPLC纯化，得到33.7mg(92％)DZ13-FITC1。1H NMR(500MHz, DMF-d7)δ9.46(s,1H),8.05(dd,J＝7.0,1.8Hz,1H),7.76-7.82(m,1H),7.44(s,1H),7.26 (d,J＝7.3Hz,1H),6.90(s,1H),6.78(m,2H),6.67-6.72(m,4H),6.11(s,2H),4.59(t,J＝ 6.0Hz,2H),4.42(s,2H),4.39(t,J＝6.0Hz,2H),3.53(d,J＝6.9Hz,2H),2.17-2.28(m, 1H),0.92(d,J＝6.7Hz,6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C40H34FIN7O7S的计算值, 902.1269；实验值902.1293；HPLC Rt＝11.77(98％)。
合成SNX-FITC(方案11).将含化合物25(9.5mg，0.0205mmol)、FITC(8.8mg，0.0225mmol)和Et3N(0.1mL)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌4小时。反应混合物 在减压下浓缩并且残余物通过HPLC纯化，得到13.5mg(77％)橙色固体。RMS(ESI) m/z[M+HH]+C44H40F3N6O7S的计算值,853.2631；实验值853.2630。
6.1.2.合成生物素标记的化合物
PU-H71-生物素3.将含13(9.1mg，0.0193mmol)、D-生物素(7.1mg，0.0290 mmol)、DCC(8mg，0.0386mmol)和催化量DMAP的CH2Cl2(1mL)超音波处理5 小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N)，10:1)纯化，得到7.5mg(56％)PU-H71-生物素3。1H NMR(600MHz, CDCl3/MeOH-d4)δ7.97(s,1H),7.17(s,1H),6.86(s,1H),5.84(s,2H),4.23-4.27(m,1H), 4.05-4.09(m,1H),4.03(t,J＝7.2Hz,2H),3.02(t,J＝6.4Hz,2H),2.90-2.97(m,1H),2.67 (dd,J＝4.9,12.8Hz,1H),2.49(d,J＝12.8Hz,1H),2.01(t,J＝7.5Hz,2H),1.75-1.83(m, 2H),1.34-1.54(m,4H),1.18-1.27(m,2H)；MS(ESI):m/z 697.1[M+H]+。
PU-H71-生物素2.将含2(30mg，0.059mmol)、D-生物素(19mg，0.078mmol)、 DCC(24mg，0.117mmol)和催化量DMAP的CH2Cl2(1mL)超音波处理9小时。反 应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1) 纯化，得到43.2mg(99％)PU-H71-生物素2。1H NMR(600MHz,CDCl3,两种旋转异 构体)δ8.22(s,1H),7.22(s,0.6H),7.21(s,0.4H),6.87(s,0.6H),6.76(s,0.4H),6.25(br s, 0.6H),6.16(br s,0.4H),5.88-5.96(m,2H),5.85(br s,0.6H),5.78(br s,0.4H),4.54-4.63(m, 0.6H),4.32-4.45(m,1.6H),4.21-4.25(m,0.4H),4.11-4.19(m,1.4H),4.00-4.07(m,0.6H), 3.88-3.95(m,0.4H),2.97-3.22(m,2.4H),2.78-2.84(m,1H),2.69-2.77(m,0.6H),2.62-2.68 (m,1H),2.22-2.27(m,0.6H),1.94-2.05(m,1.4H),1.74-1.89(m,1.4H),1.43-1.72(m,3H), 1.16-1.40(m,3.6H),1.00-1.06(m,4H),0.97(d,J＝6.7Hz,2H)；MS(ESI):m/z 739.2 [M+H]+。
PU-H71-生物素4.将含13(16.9mg，0.0359mmol)、
Figure BDA0001717339850001151
NHS-LC-生物素(17.9mg，0.0394mmol)和DIEA(9.3mg，12.5μL，0.0718mmol)的DMF(0.5mL)在室 温下搅拌1小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到20.8mg(72％)PU-H71-生物素4。1H NMR (500MHz,CDCl3)δ8.22(s,1H),7.52(t,J＝5.6Hz,1H),7.36(s,1H),7.03(s,1H),6.66(t, J＝5.5Hz,1H),6.25(br s,2H),6.03(s,2H),4.47-4.52(m,1H),4.28-4.33(m,1H),4.25(t, J＝6.8Hz,2H),3.17-3.25(m,4H),3.11-3.17(m,1H),2.90(dd,J＝5.0,12.9Hz,1H), 2.63-2.79(m,1H),2.24(t,J＝7.4Hz,2H),2.13-2.19(m,2H),1.94-2.02(m,2H),1.58-1.74 (m,6H),1.48-1.56(m,2H),1.31-1.46(m,4H)；MS(ESI):m/z 810.3[M+H]+。
PU-H71-生物素7.将含2(15mg，0.0292mmol)、
Figure BDA0001717339850001152
NHS-LC-生物素(14.6 mg，0.0321mmol)和DIEA(7.5mg，10.2μL，0.0584mmol)的DMF(0.5mL)在35℃ 下加热6小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到10.3mg(41％)PU-H71-生物素7。此外， 回收6.9mg未反应的2，得到实际产率77％。1HNMR(500MHz,CDCl3,两种旋转异构 体)δ8.26-8.29(m,1H),7.29(s,0.4H),7.28(s,0.6H),6.87(s,0.4H),6.85(s,0.6H),6.76(br s,0.4H),6.74(br s,0.6H),6.51-6.63(br s,2H),5.96-6.00(m,2H),5.68(br s,0.4H),5.58(br s,0.6H),4.56-4.64(m,0.4H),4.45-4.52(m,1H),4.28-4.36(m,1H),4.20-4.27(m,2H), 4.01-4.09(m,0.6H),3.08-3.32(m,5H),2.86-2.94(m,1H),2.69-2.76(m,1H),2.31-2.37(m, 1H),1.96-2.22(m,4H),1.89-1.96(m,1H),1.30-1.80(m,12H),1.10-1.16(m,4H),1.04-1.09 (m,2H)；MS(ESI):m/z 852.3[M+H]+。
PU-H71-生物素5.将含13(16.6mg，0.0352mmol)、
Figure BDA0001717339850001161
NHS-LC-LC-生物 素(22.0mg，0.0387mmol)和DIEA(9.1mg，12.3μL，0.0704mmol)的DMF(0.5mL) 在室温下搅拌1小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到27.8mg(86％)PU-H71-生物素5。1H NMR (500MHz,CDCl3/MeOH-d4)δ8.12(s,1H),7.60(m,1H),7.30(s,1H),7.09(m,1H),6.98(s, 1H),5.97(s,2H),4.38-4.44(m,1H),4.20-4.24(m,1H),4.17(t,J＝7.1Hz,2H),3.04-3.18 (m,7H),2.83(dd,J＝5.0,12.9Hz,1H),2.64(d,J＝12.8Hz,1H),2.16(t,J＝7.5Hz,2H), 2.03-2.12(m,4H),1.88-1.96(m,2H),1.18-1.66(m,18H)；MS(ESI):m/z 923.4[M+H]+。
PU-H71-生物素8.将含2(15mg，0.0292mmol)、
Figure BDA0001717339850001162
NHS-LC-LC-生物素(18.2mg，0.0321mmol)和DIEA(7.5mg，10.2μL，0.0584mmol)的DMF(0.5mL) 在35℃下加热6小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到8.2mg(29％)PU-H71-生物素8。此外， 回收9.6mg未反应的2，得到实际产率81％。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4,两种 旋转异构体)δ8.18(s,0.4H),8.16(s,0.6H),7.31(s,1H),6.98(s,0.6H),6.95(s,0.4H), 6.80-6.90(m,2H),5.98(s,2H),4.47-4.55(m,0.4H),4.41-4.47(m,1H),4.23-4.27(m,1H), 4.16-4.22(m,2H),3.95-4.03(m,0.6H),3.31-3.34(m,0.6H),3.19-3.24(m,1.4H),3.07-3.17 (m,5H),2.82-2.89(m,1H),2.64-2.70(m,1H),2.25-2.32(m,1H),1.94-2.16(m,7H), 1.18-1.70(m,18H),1.09(d,J＝6.7Hz,4H),1.03(d,J＝6.8Hz,2H)；MS(ESI):m/z 965.5 [M+H]+。
PU-H71-生物素6.将含13(17.6mg，0.0374mmol)、
Figure BDA0001717339850001163
NHS-PEG4-生物素(24.2mg，0.0411mmol)和DIEA(9.7mg，13μL，0.0704mmol)的DMF(0.5mL) 在室温下搅拌1小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到31.0mg(88％)PU-H71-生物素6。1H NMR (500MHz,CDCl3)δ8.29(s,1H),7.51(t,J＝5.8Hz,1H),7.32(s,1H),7.03(t,J＝5.3Hz, 1H),6.90(s,1H),6.79(s,1H),6.57(br s,2H),6.01(s,2H),5.97(s,1H),4.48-4.53(m,1H), 4.25-4.35(m,3H),3.79(t,J＝6.1Hz,2H),3.59-3.68(m,12H),3.57(t,J＝5.1Hz,2H), 3.40-3.46(m,2H),3.18-3.24(m,2H),3.12-3.18(m,1H),2.90(dd,J＝5.0,12.8Hz,1H), 2.75(d,J＝12.7Hz,1H),2.54(t,J＝6.0Hz,2H),2.20(t,J＝7.4Hz,2H),1.40-2.01(m, 2H),1.59-1.79(m,4H),1.38-1.48(m,2H)；MS(ESI):m/z 944.4[M+H]+。
PU-H71-生物素9.将含2(15mg，0.0292mmol)、
Figure BDA0001717339850001171
NHS-PEG4-生物素(18.9mg，0.0321mmol)和DIEA(7.5mg，10.2μL，0.0584mmol)的DMF(0.5mL) 在35℃下加热6小时。反应混合物在减压下浓缩并且所得残余物通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到9.3mg(32％)PU-H71-生物素9。此外， 回收9.0mg未反应的2，得到实际产率81％。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4,两种 旋转异构体)δ8.18(s,0.4H),8.16(s,0.6H),7.30-7.32(m,1H),6.98(s,0.6H),6.96(s, 0.4H),5.98(s,2H),4.49-4.56(m,0.4H),4.39-4.46(m,1H),4.22-4.27(m,1H),4.15-4.21(m, 2H),3.99-4.07(m,0.6H),3.66-3.71(m,2H),3.51-3.61(m,12H),3.45-3.50(m,2H), 3.29-3.38(m,2H),3.16-3.25(m,2H),3.07-3.12(m,1H),2.81-2.88(m,1H),2.63-2.68(m, 1H),2.57-2.63(m,1.2H),2.41-2.47(m,0.8H),1.98-2.18(m,4H),1.52-1.70(m,4H), 1.32-1.41(m,2H),1.08(d,J＝6.7Hz,4H),1.02(d,J＝6.8Hz,2H)；MS(ESI):m/z 986.5 [M+H]+。
PU-H71-生物素.将含6(4.2mg，0.0086mmol)和
Figure BDA0001717339850001172
胺-PEO3-生物素(5.4 mg，0.0129mmol)的DMF(0.2mL)在室温下搅拌24小时。浓缩反应混合物并且残 余物进行色谱分析(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，5:1)，得到1.1mg(16％)PU-H71-生物 素。1H NMR(CDCl3)δ8.30(s,1H),8.10(s,1H),7.31(s,1H),6.87(s,1H),6.73(br s,1H), 6.36(br s,1H),6.16(br s,2H),6.00(s,2H),4.52(m,1H),4.28-4.37(m,3H),3.58-3.77(m, 10H),3.55(m,2H),3.43(m,2H),3.16(m,1H),2.92(m,1H),2.80(m,2H),2.72(m,1H), 2.66(m,2H),2.17(t,J＝7.0Hz,2H),2.04(m,2H),1.35-1.80(m,6H)；MS(ESI):m/z 872.2[M+H]+/
6.1.3.合成ANCA标记的化合物
合成N-(3-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙 基)-2-氰基乙酰胺(N-(3-(6-Amino-8-((6-iodobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)thio)-9H-purin-9-yl)propyl) -2-cyanoacetamide)(化合物26)(方案17).向含化合物131(120.3mg，0.256mmol) 的CH2Cl2(4mL)添加氰基乙酸(26mg，0.307mmol)和DCC(63mg，0.307mmol) 并且在室温下搅拌5小时。浓缩反应混合物并且通过色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 100:1到50:1)纯化，得到131mg(95％)化合物26。1H NMR(600MHz,CDCl3/MeOH-d4): δ8.25(s,1H),7.40(s,1H),7.08(s,1H),6.07(s,2H),4.27(t,J＝5.9Hz,2H),3.57(s,2H),3.27(t,J＝5.1Hz,2H),1.98-2.06(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+538.0。
合成PU-ANCA(化合物28(方案17).向含化合物326(44mg，0.0825mmol) 的DMF(1mL)添加27(19mg，0.075mmol)和哌啶(10μL)并且在70℃下加热24 小时。浓缩反应混合物并且通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，12.5:1)纯化， 得到24.3mg(42％)呈橙色固体状的化合物28。1H NMR(600MHz,DMF-d7):δ8.73(t, J＝5.8Hz,1H),8.38(d,J＝1.1Hz,1H),8.36(s,1H),8.29(s,1H),8.18(dd,J＝8.8,1.7Hz, 1H),7.95(d,J＝9.2Hz,1H),7.92(d,J＝8.8Hz,1H),7.56(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),7.52 (br s,2H),7.49(s,1H),7.34(d,J＝2.2Hz,1H),6.95(s,1H),6.16(s,2H),4.40(t,J＝6.9 Hz,2H),3.44-3.47(m,4H),3.38-3.43(m,2H),2.53-2.58(m,4H),2.30(s,3H),2.09-2.15(m, 2H)；13C NMR(150MHz,DMF-d7):δ161.5,156.0,153.5,151.7,151.5,151.2,149.5,148.8, 144.4,137.2,133.6,130.3,129.2,127.4,127.0,126.5,125.2,120.1,119.3,118.9,117.4, 111.0,108.5,103.0,102.9,89.4,54.9,47.9,45.6,41.3,40.5,37.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C34H33IN9O3S的计算值,774.1472；实验值774.1473。
6.1.4.合成放射性标记的化合物
PU-H71、PU-HZ151和PU-DZ13的母体化合物经合成适于放射性碘化(即Sn-前驱体)。对于放射性碘化，合成根据方案19中所示的反应。简单地说，PU-化合物在甲醇 中溶剂化(25μg PU-H71和PU-HZ151；15μg PU-DZ13)，并且添加到NaI(5-10μL) 中([124I]同位素用于成像，[131I]用于生物学分布)，接着在酸性介质(乙酸中2mg/mL) 中用氯胺T(CT，10μL，10分钟)氧化。针对每一化合物，热(放射性标记的)化合 物用胺保护基BOC(叔丁氧羰基)合成，胺保护基BOC在酸性条件(例如三氟乙酸(TFA)、 盐酸HCl))下去除，并且使用高压液相色谱法(HPLC)纯化。PU-DZ13和PU-HZ151 前驱体使用15μL甲醇(MeOH)溶剂化，在添加放射性标记后在室温(RT)下在CT 中培育10分钟，接着添加50μL TFA并且在70℃下培育1小时来放射性标记。PU-H71 前驱体直接在添加放射性标记后用20μL MeOH和15μL CT放射性标记，接着在50℃ 下加热溶液5分钟，接着使其冷却2分钟。后来，添加10μL甲硫氨酸甲酯(从H2O中 0.5g/mL调配)和10μL浓HCl，接着在50℃下培育(1小时)。收集放射性标记的产物 并且使用旋转蒸发器在减压下去除溶剂。[124I]-PU-H71的比活性是约1000mCi/μmol， 此与先前使用此类别[124I]化合物的经验一致。对于体内投予，[124I]-PU-化合物在无菌 0.9％盐水溶液中调配。
6.2.评估HSP90在癌细胞中的作用
本部分中所述的方法涉及部分5.1.中的公开内容。
细胞系和原代细胞：CML细胞系K562、香住-4、MEG-01和KU182、三阴性乳癌 细胞系MDA-MB-468、HER2+乳癌细胞系SKBr3、黑色素瘤细胞系SK-Mel-28、前列腺 癌细胞系LNCaP和DU145、胰腺癌细胞系Mia-PaCa-2、结肠成纤维细胞、CCCD18Co 细胞系是从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)中获得。CML细 胞系KCL-22是从日本研究生物资源保藏中心(the Japanese Collection of Research Bioresources)中获得。NIH-3T3成纤维细胞如先前所述转染65。将细胞在补充有10％ FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素的DMEM/F12(MDA-MB-468、SKBr3和 Mia-PaCa-2)、RPMI(K562、SK-Mel-28、LNCaP、DU145和NIH-3T3)或MEM (CCD18Co)中培养。将香住-4细胞维持于补充有20％FBS、10ng/ml粒细胞巨噬细胞 群落刺激因子(GM-CSF)和1×青霉素/链霉素的IMDM中。PBL(人类外周血白血球) (n＝3)和脐带血(n＝5)是从购自纽约血液中心(the New York Blood Center)的患者 血液中获得。35ml细胞悬浮液堆积在15ml Ficoll-Paque plus分离液(通用电气医疗集 团(GE Healthcare))上。样品在4℃下在2,000rpm下离心40分钟，并且收集白血球界面。将细胞涂铺在具有10％FBS的RPMI培养基中并且如指示使用。在知情同意下获得 原代人类慢性和胚细胞危象CML和AML细胞。样品的操作和分析经罗切斯特大学(theUniversity of Rochester)、威尔康奈尔医学院(Weill Cornell Medical College)和宾夕法 尼亚大学的机构审查委员会(University of Pennsylvania Institutional ReviewBoards)批 准。单核细胞使用Ficoll-Plaque(纽约州皮斯卡塔韦法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech,Piscataway,NY))密度梯度分离来分离。将细胞在由伊斯科夫改良达伯克培养 基(Iscove's modified Dulbecco medium，IMDM)、40％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚 砜(DMSO)组成的冷冻介质中或CryoStorTMCS-10(生物生命公司(Biolife))中低温 保存。培养时，细胞保持在37℃下5％CO2的湿润氛围中。
用于化学和免疫沉淀的细胞溶解：通过将细胞收集在添加有1μg/μL蛋白酶抑制剂(亮肽素和抗蛋白酶)的费尔特斯缓冲液(Felts Buffer)(HEPES 20mM、KCl 50mM、 MgCl25mM、NP40 0.01％、新鲜制备的Na2MoO4 20mM，pH 7.2-7.3)中来溶解，接着 三个连续的冷冻(干冰中)和融解步骤。总蛋白质浓度使用BCA试剂盒(皮尔斯公司 (Pierce))，根据制造商的说明书测定。
免疫沉淀：Hsp90抗体(H9010)或正常IgG(圣克鲁斯生物技术公司(Santa CruzBiotechnology))以10μL的体积连同40μL蛋白质G琼脂糖珠粒(阿斯特公司(Upstate)) 一起添加到指示量的细胞溶解产物中，并且在4℃下培育混合物过夜。珠粒用费尔特斯 溶解缓冲液洗涤五次，并且通过SDS-PAGE分开，接着进行标准蛋白质印迹程序。
化学沉淀：将含有HSP90非活性化学物质(乙醇胺)结合到琼脂糖珠粒的HSP90 抑制剂珠粒或对照珠粒在溶解缓冲液中洗涤三次。除非另外指示，否则珠粒结合物(80 μL)然后在4℃下与指示量的细胞溶解产物(120-500μg)一起培育，并且体积用溶解 缓冲液调至200μL。培育后，将珠粒结合物用溶解缓冲液洗涤5次，并且通过蛋白质印 迹法分析下拉物中的蛋白质。对于耗尽研究，进行2-4个连续化学沉淀，接着在指示下 进行免疫沉淀步骤。
试剂：HSP90抑制剂固体支撑物固定和荧光素标记的衍生物如先前所报导合成75-77。 从LC实验室(LC Laboratories)购买格列卫(Gleevec)，从赛力克公司(Selleck)购买 AS703026，从托克瑞斯公司(Tocris)购买KN-93，以及从西格玛公司(Sigma)购买PP242、BMS-345541和钒酸钠。所有化合物都以DMSO储备液使用。
蛋白质印迹法：将细胞用PU-H71或DMSO(媒剂)处理24小时，并且在50mM Tris (pH7.4)、150mM NaCl和补充有亮肽素(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))和抗蛋白 酶(西格玛奥德里奇)的1％NP40溶解缓冲液中溶解。蛋白质浓度使用BCA试剂盒(皮 尔斯公司)，根据制造商的说明书测定。蛋白质溶解产物(15-200μg)通过SDS/PAGE 电泳解析，转移到硝酸纤维素膜并且用针对以下各物的以下初级抗体探测：HSP90 (1:2000，SMC-107A/B；斯曲玛克公司(StressMarq))、Bcr-Abl(1:75，554148；碧迪 医药公司(BD Pharmingen))、PI3K(1:1000，06-195；阿斯特公司(Upstate))、mTOR (1:200，Sc-1549；圣克鲁斯公司(SantaCruz))、p-mTOR(1:1000，2971；赛信通公司 (Cell Signaling))、STAT3(1:1000，9132；赛信通公司)、p-STAT3(1:2000，9145；赛 信通公司)、STAT5(1:500，Sc-835；圣克鲁斯公司)、p-STAT5(1:1000，9351；赛信通 公司)、RICTOR(1:2000，NB100-611；诺瓦斯生物公司(NovusBiologicals))、RAPTOR (1:1000，2280；赛信通公司)、P90RSK(1:1000，9347；赛信通公司)、Raf-1(1:300， Sc-133；圣克鲁斯公司)、CARM1(1:1000，09-818；密理博公司(Millipore))、CRKL (1:200，Sc-319；圣克鲁斯公司)、GRB2(1:1000，3972；赛信通公司)、FAK(1:1000， Sc-1688；圣克鲁斯公司)、BTK(1:1000，3533；赛信通公司)、A-Raf(1:1000，4432； 赛信通公司)、PRKD2(1:200，sc-100415、圣克鲁斯公司)、HCK(1:500，06-833；密 理博公司(Milipore))、p-HCK(1:500，ab52203；阿科玛(Abcam))和β-肌动蛋白(1:2000， A1978；西格玛)。然后膜与相应辣根过氧化酶结合的二级抗体的1:3000稀释液一起培 育。使用ECL-增强化学发光检测系统(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences))， 根据制造商的说明书进行检测。
密度测定法：在Adobe Photoshop 7.0.1中扫描凝胶，并且使用Un-Scan-It 5.1软件 (斯尔克科学公司(Silk Scientific))进行定量密度分析。
放射性同位素结合研究和HSP90定量研究：用131I-PU-H71和细胞(K562、 MDA-MB-468、SKBr3、LNCaP、DU-145、MRC-5和PBL)进行饱和度研究。简单地 说，在有或者没有1μM未标记的PU-H71下将三份相同细胞样品与增加量的131I-PU-H71 混合。将溶液在回旋震荡器中震荡并且在1小时后，使用布兰德尔细胞收集器(Brandel cell harvester)分离细胞并用冰冷的Tris-缓冲盐水洗涤。对所有分离的细胞样品计数并 且确定131I-PU-H71的特定吸收。这些数据相对于131I-PU-H71的浓度绘图以得到饱和结 合曲线。为了定量PU结合的HSP90，将9.2×107个K562细胞、6.55×107个KCL-22细 胞、2.55×107个KU182细胞和7.8×107个MEG-01细胞溶解以分别产生6382、3225、1349 和3414μg总蛋白质。为了计算HSP90百分比，通过使用由从海拉细胞(HeLa cell)(斯 杰公司(Stressgen)#ADI-SPP-770)纯化的重组HSP90产生的标准曲线定量细胞HSP90 表达。
脉冲追踪.在有或者没有PU-H71(5μM)下将K562细胞按指示用Na3VO4(1mM) 处理。在指示的时间收集细胞并且溶解于50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和1％NP-40 溶解缓冲液中，并且然后进行蛋白质印迹程序。
胰蛋白酶的消化：将K562细胞用媒剂或PU-H71(50μM)处理30分钟。收集细 胞并溶解于50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、1％NP-40溶解缓冲液中。使用抗-STAT5 抗体(圣克鲁斯公司，sc-835)将STAT5蛋白质从500μg总蛋白质溶解产物免疫沉淀。 将结合于蛋白质G琼脂糖珠粒的蛋白质沉淀用胰蛋白酶缓冲液(50mM Tris pH 8.0、20 mM CaCl2)洗涤并且已经添加33ng胰蛋白酶到每一样品中。将样品在37℃下培育并且 在指示的时间点收集等分试样。蛋白质等分试样进行SDS-PAGE并且针对STAT5进行 印迹。
活化STAT5 DNA结合分析：STAT5a和STAT5b的DNA结合能力通过基于ELISA 的分析(曲斯姆(TransAM)，加利福尼亚州卡尔斯巴德市阿莫公司(Active Motif, Carlsbad,CA))，根据制造商的说明书分析。简单地说，将5×106个K562细胞用1和 10μM PU-H71或对照处理24小时。10微克细胞溶解产物添加到含有预吸附的STAT一 致寡核苷酸(5'-TTCCCGGAA-3')的孔中。对于对照处理的细胞，分析在缺乏或存在20 pmol含有野生型或突变STAT一致结合位点的竞争寡核苷酸下进行。干扰素处理的海拉 细胞(每孔5μg)用作此分析的阳性对照。培育和洗涤后，兔多克隆抗-STAT5a或抗 -STAT5b抗体(1:1000，阿莫公司)添加到每一孔中，接着添加HPR-抗兔二级抗体(1:1000， 阿莫公司)。添加HRP底物后，吸光度在450nm下读取，参考波长为655nm(斯勒4 (Synergy4)，佛蒙特州威努斯基市博特克公司(Biotek,Winooski,VT))。在此分析中， 吸光度与样品中存在的DNA结合转录因子的数量成正比。实验一式四份进行。结果表 示为平均吸光度值加SEM的任意单位(AU)。
定量染色质免疫沉淀(Q-ChIP)：Q-ChIP如先前所述在进行修改下进行83。简单 地说，将108个K562细胞用1％甲醛固定，溶解，并且音波处理(布兰森音波处理器 (Bransonsonicator)，布兰森公司(Branson))。STAT5N20(圣克鲁斯公司)和HSP90 (泽迈公司(Zymed))抗体添加到预先清理的样品中并且在4℃下培育过夜。然后添加 蛋白质-A或G珠粒，并且从珠粒洗脱样品，接着去交联。使用PCR纯化柱(凯杰公司 (Qiagen))纯化DNA。通过定量的PCR(应用生物系统公司(Applied Biosystems)7900HT) 使用Fast SYBR Green染料(应用生物系统公司)进行ChIP产物的定量。含有STAT结 合位点的标靶基因用以下引物检测：CCND2(5-GTTGTTCTGGTCCCTTTAATCG和 5-ACCTCGCATACCCAGAGA)、MYC(5-ATGCGTTGCTGGGTTATTTT和 5-CAGAGCGTGGGATGTTAGTG)并且对于基因间控制区 (5-CCACCTGAGTCTGCAATGAG和5-CAGTCTCCAGCCTTTGTTCC)。
实时QPCR：使用RNeasy Plus试剂盒(凯杰公司)，按照制造商的说明书从PU-H71处理和对照K562细胞提取RNA。使用大容量RNA到cDNA试剂盒(应用生物系统公 司)合成cDNA。用以下引物扩增特定的基因：MYC(5-AGAAGAGCATCTTCCGCATC 和5-CCTTTAAACAGTGCCCAAGC)、CCND2(5-TGAGCTGCTGGCTAAGATCA和 5-ACGGTACTGCTGCAGGCTAT)、BCL-XL(5-CTTTTGTGGAACTCTATGGGAACA和 5-CAGCGGTTGAAGCGTTCCT)、MCL1(5-AGACCTTACGACGGGTTGG和 5-ACATTCCTGATGCCACCTTC)、CCND1(5-CCTGTCCTACTACCGCCTCA和5-GGCTTCGATCTGCTCCTG)、HPRT(5-CGTCTTGCTCGAGATGTGATG和 5-GCACACAGAGGGCTACAATGTG)、GAPDH(5-CGACCACTTTGTCAAGCTCA和 5-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT)、RPL13A(5-TGAGTGAAAGGGAGCCAGAAG和 5-CAGATGCCCCACTCACAAGA)。使用Fast SYBR Green条件(初始步骤在95℃下20 秒，接着在95℃下1秒和60℃下20秒的40个循环)检测转录物丰度。从相关的对应 基因减去管家基因(RPL13A)的CT值(ΔCT)。差异的标准偏差由CT值的标准偏差计 算(重复实验)。然后，PU-H71处理的细胞的ΔCT值相对于其各别对照处理的细胞使用 ΔΔCT方法表示。用药物处理的细胞中每一基因相对于对照处理的细胞的表达倍数由以 下表达式确定：2-ΔΔCT。结果表示为表达倍数加重复实验的平均标准误差。
HSP70敲减.通过电穿孔(阿玛兹公司(Amaxa))和Nucleofector溶液V(阿玛兹 公司)，根据制造商的说明书进行转染。HSP70敲减研究使用如先前所报导设计的 siRNA84，针对HSP70的开放阅读框架(HSPA1A；寄存编号NM_005345)进行。阴性 对照细胞用反向对照siRNA序列(HSP70C；达玛肯RNA技术(Dharmacon RNA technologies))转染。针对用于研究的HSP70的活性序列是HSP70A (5'-GGACGAGUUUGAGCACAAG-3')和HSP70B(5'-CCAAGCAGACGCAGAUCUU-3')。 对照的序列是HSP70C(5'-GGACGAGUUGUAGCACAAG-3')。根据制造商的说明书，2 mL培养基(补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素的RPMI)中三百万个细胞用 0.5μM siRNA转染。转染的细胞维持于6孔板中，并且在84小时，溶解，接着进行标准蛋白质印迹程序。
激酶筛选85(图44).对于大部分分析，激酶标记的T7噬菌体菌株在24孔区块中 来源于BL21菌株的大肠杆菌宿主中平行生长。大肠细菌生长到对数期并且用来自冷冻 储备物的T7噬菌体感染(感染倍率＝0.4)，并且在32℃下在震荡下培育，直到溶解(90-150 分钟)。溶解产物离心(6,000×g)并过滤(0.2μm)以去除细胞碎片。剩余激酶在HEK-293 细胞中产生并且随后用DNA标记以进行qPCR检测。在室温下抗生蛋白链菌素涂布的 磁性珠粒用生物素标记的小分子配体处理30分钟，以产生亲和力树脂用于激酶分析。 已结合的珠粒用过量的生物素阻断，并且用阻断缓冲液(西伯(SeaBlock)(皮尔斯公司)、 1％BSA、0.05％吐温20(Tween 20)、1mM DTT)洗涤以去除未结合的配体并减少非 特异性噬菌体结合。结合反应通过将激酶、已结合的亲和力珠粒和测试化合物组合于1x 结合缓冲液(20％西伯、0.17xPBS、0.05％吐温20、6mM DTT)中来集合。测试化合 物在100％DMSO中制备为40x储备液并且直接稀释以用于分析中。所有反应都在聚丙 烯384孔板中以0.04ml最终体积进行。分析板在室温下在震荡下培育1小时，并且亲 和力珠粒用洗涤缓冲液(1x PBS、0.05％吐温20)洗涤。然后将珠粒再悬浮于洗脱缓冲 液(1x PBS、0.05％吐温20、0.5μm非生物素标记亲和配体)中，并且在室温下在震荡 下培育30分钟。洗脱液中激酶浓度通过qPCR来测量。KINOMEscan的选择性评分(S) 是化合物选择性的定量量度。其是通过排除突变体，将结合于化合物的激酶的数目除以 测试的不同激酶的总数来计算。TREEspotTM是一种KINOMEscan85开发的专有数据可视 化软件工具85。发现结合的激酶在图44中用圆圈标记，其中较大圆圈指示较高亲和力 结合。在科学和赛信通公司(Science and Cell SignalingTechnology,Inc.)许可下修改和 复制激酶树状图。
慢病毒载体、慢病毒产生和K562细胞转导.CARM1的shRNA敲减的慢病毒构筑 体购自欧普生物系统公司(Openbiosystem)的TRC慢病毒shRNA库： pLKO.1-shCARM1-KD1(目录号：RHS3979-9576107)和pLKO.1-shCARM1-KD2(目 录号：RHS3979-9576108)。对照shRNA(shRNA零乱)是亚当基因公司(Addgene)质 粒1864。GFP克隆以作为选择标记物置换嘌呤霉素。慢病毒通过如先前描述的程序短暂 转染293T来产生86。收集病毒上清液，通过0.45μm滤纸过滤并浓缩。在8μg/ml聚凝 胺(奥德里奇)存在下，K562细胞用高力价慢病毒浓悬浮液感染。在72小时转染后， 针对绿色荧光(GFP)将转导的K562细胞分选。
RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR).对于qRT-PCR，使用RNeasy微型试剂盒 (德国凯杰公司(QIAGEN,Germany))将总RNA从106个细胞分离，并且接着在随机六 聚体下进行逆转录(SuperScript III试剂盒，英杰公司)。实时PCR反应使用ABI 7500 序列检测系统进行。PCR产物使用Sybr绿色I化学或者TaqMan法(康涅狄格州诺沃克 的PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems,Norwalk,CT))检测。实时PCR分析 的细节在别处描述87。CARM1qPCR的引物序列是TGATGGCCAAGTCTGTCAAG(正 向)和TGAAAGCAACGTCAAACCAG(反向)。
细胞活力、细胞凋亡和增殖分析.使用锥虫蓝(Trypan Blue)在未经转染或经CARM1 shRNA或零乱转染的K562细胞中进行活力评估。此发色团带负电并且除非膜被破坏，否则不与细胞相互作用。因此，除染料外的所有细胞都是有活力的。细胞凋亡分析是使 用荧光显微镜术，通过将2μL吖啶橙(100μg/mL)、2μL溴化乙锭(100μg/mL)和20 μL细胞悬浮液混合来评估。在至少五个随机场中计数最少200个细胞。通过基于明显 不同的细胞核和细胞质荧光，检验细胞形态学的变化，将活的细胞凋亡细胞与死亡的细 胞凋亡细胞、坏死性细胞和正常细胞区别开。活细胞显示完整的质膜(绿色)，而死细 胞显示破损的质膜(橙色)。超微结构变化的外观，包括皱缩、异染色质缩合和核脱粒， 更符合细胞凋亡的情况，并且破坏的细胞质膜更符合坏死的情况。细胞凋亡细胞百分比 (细胞凋亡指标)计算为：％细胞凋亡细胞＝(具有细胞凋亡的核的细胞总数/计数的细胞 总数)×100。对于增殖分析，将5×103个K562细胞涂铺于96孔固定黑色板(康宁公司 (Corning))中。分析根据制造商指示(CellTiter-Glo发光细胞活力分析，普洛麦格公司 (Promega))进行。所有实验重复三次。指示的情况下，生长抑制研究使用阿拉马蓝分 析(Alamar blue assay)进行。此试剂提供了细胞培养物中细胞活力的迅速客观测量， 并且其使用指示染料刃天青(resazurin)来测量细胞代谢能力(细胞活力的指示物)。简 单地说，指数生长的细胞涂铺于微量滴定板(康宁#3603)中并且在37℃下培育指示的 时间。药物以指示的浓度一式三份地添加，并将板培育72小时。添加刃天青(55μM)， 并且6小时后使用Analyst GT(荧光强度模式，激发530nm，发射580nm，使用560nm 分色镜)阅读培养板。结果使用Softmax Pro和GraphPad Prism软件分析。细胞生长抑 制百分比通过将从处理的细胞获得的荧光读数与从对照细胞获得的荧光读数比较来计 算。IC50计算为抑制细胞生长50％的药物浓度。
mTOR与HSP90抑制剂之间的协同作用的定量分析：为了确定pp242(mTOR抑制 剂)与PU-H71(HSP90抑制剂)之间的药物相互作用，如先前所述使用周-特拉莱 (Chou-Talalay)的组合指数(CI)等效线法88,89。通过计算机化模拟，此方法基于质量 作用定律的中效原理定量两种或两种以上药物组合的协同作用或拮抗作用，无论每一药 物的机制如何。基于算法，计算机软件显示中效图、组合指数图和归一化的等效线图(其 中使用2种药物非恒定比例的组合)。PU-H71(0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0125 μM)和pp242(0.5、0.125、0.03125、0.0008、0.002、0.001μM)以所提及的浓度作为 单一药剂使用，或以非恒定比例组合(PU-H71：pp242；1:1、1:2、1:4、1:7.8、1:15.6、 1:12.5)。使用式Fa＝1-Fu计算Fa(杀死细胞分数)；Fu是未受影响细胞的分数，并且 用于使用计算机软件(CompuSyn，美国新泽西州帕拉姆斯(Paramus,New Jersey,USA)) 进行剂量作用分析。
6.3.细胞分析中荧光标记的探针
6.3.1.荧光-PU-H71结合的流式细胞术分析
人类急性骨髓白血病(AML)细胞系MOLM-13和MV4-11细胞是由MSKCC的史 蒂芬D.尼莫博士(Dr.Stephen D.Nimer)赠予的，并且维持于37℃下5％CO2的湿润氛 围中补充有10％胎牛血清(FBS)和1×青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。将细胞以 5×105个细胞/毫升的密度涂铺于6孔板中，并且在37℃下用指示的衍生物(1μM)处理 4小时。为了检测活细胞中的HSP90结合，将细胞用FACS缓冲液(PBS、0.05％FBS) 洗涤两次，并且在分析前，在室温下在FACS缓冲液中用1μg/ml DAPI(英杰公司)染 色。通过流式细胞术(LSR-II，碧迪生物科学)获得表示PU-H71-荧光衍生物结合的来 自活细胞(DAPI阴性)的荧光强度，并且由FlowJo软件(俄勒冈州亚什兰的树星公司) 分析。为了评估固定细胞中的HSP90结合，洗涤细胞，用碧迪Cytofix缓冲液(加利福 尼亚州圣胡塞的碧迪生物科学公司)固定30分钟，接着使用碧迪Perm缓冲液III(加利 福尼亚州圣胡塞的碧迪生物科学公司)在冰上渗透化30分钟。用DAPI确定完全的细胞 渗透化。如上所提及，通过流式细胞术分析细胞。对于竞争测试，将密度为2×106个细 胞/毫升的原代AML样品用1μM未结合的PU-H71处理4小时，接着用1μM PU-H71-FITC2处理1小时。将细胞收集，洗涤两次，针对CD45染色以区分胚细胞与 正常淋巴细胞，在4℃下培育30分钟，洗涤并且在FACS缓冲液中用7-AAD染色，以 由流式细胞术分析。
6.3.2.流式细胞术：CD34分离
CD34+细胞分离使用CD34MicroBead试剂盒和自动化磁性细胞分选仪 autoMACS，根据制造商的说明书(加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech,Auburn,CA))进行。活力分析-CML细胞系以5×105个细胞/毫升的密度涂铺于 48孔板中，并且用指示剂量的PU-H71处理。每24小时收集细胞，在膜联蛋白V缓冲 液(10mM HEPES/NaOH、0.14M NaCl、2.5mM CaCl2)中用膜联蛋白V-V450(碧迪 生物科学公司)和7-AAD(英杰公司)染色。细胞活力通过流式细胞术(碧迪生物科学 公司)分析。对于患者样品，将原代胚细胞危象CML细胞以2×106个细胞/毫升涂铺于 48孔板中，并且用指示剂量的PU-H71处理长达96小时。将细胞在FACS缓冲液(PBS、 0.05％FBS)中在4℃下用CD34-APC、CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体(碧迪生物 科学公司)染色30分钟，接着进行膜联蛋白V/7-AAD染色。PU-H71结合分析-CML 细胞系以5×105个细胞/毫升的密度涂铺于48孔板中，并且用1μM PU-H71-FITC处理。 处理后4小时，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次。为了测量活细胞中的PU-H71-FITC结 合，将细胞在室温下在FACS缓冲液中用7-AAD染色10分钟，并且通过流式细胞术(碧 迪生物科学公司)分析。在PU-H71-FITC处理后48小时和96小时，将细胞在膜联蛋白V缓冲液中用膜联蛋白V-V450(碧迪生物科学公司)和7-AAD染色，并且进行流式细 胞术以测量通过膜联蛋白V/7AAD双重阴性门确定的活力。为了评估PU-H71-FITC与 白血病患者样品的结合，将原代bp或cpCML细胞以2×106个细胞/毫升涂铺于48孔板 中，并且用1μM PU-H71-FITC处理。处理后24小时后，将细胞洗涤两次，并且在4℃ 下在FACS缓冲液中用CD34-APC(或CD34-PECy7)、CD38-PE-CY7(或CD38-PE)和 CD45-APC-H7抗体染色30分钟，接着进行7-AAD染色。在处理后48小时和96小时， 将细胞用CD34-APC(或CD34-PECy7)、CD38-PE-CY7(或CD38-PE)和CD45-APC-H7 抗体染色，接着膜联蛋白V-V450和7-AAD染色，以测量胚细胞、淋巴细胞和CD34+ 细胞群体中的细胞活力。对于竞争测试，将密度为5×105个细胞/毫升的CML细胞系或 密度为2×106个细胞/毫升的原代CML样品用1μM未结合的PU-H71处理4小时，接着 用1μM PU-H71-FITC处理1小时。收集细胞，洗涤两次，在FACS缓冲液中进行7-AAD 染色，并且通过流式细胞术分析。HSP90染色-将细胞在4℃下用固定缓冲液(碧迪生物 科学公司)固定30分钟，并且在Perm缓冲液III(碧迪生物科学公司)中在冰上渗透化 30分钟。将细胞用抗-HSP90藻红素结合物(PE)(加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司 的F-8克隆(F-8clone,Santa Cruz Biotechnologies))染色60分钟。洗涤细胞，接着通 过流式细胞术分析。正常小鼠IgG2a-PE用作同型对照。
6.3.3.PU-H71-FITC2(9)结合的荧光显微镜术分析
将MV4-11细胞以5×105个细胞/毫升的密度涂铺于48孔板中，并且用1μM PU-H71-FITC2或PU-H71-NBD1处理。在处理后24小时，将细胞在室温下用3％BSA/FACS缓冲液阻断30分钟，并且在室温下在3％BSA/FACS缓冲液中与 Na+/K+-ATPaseα1抗体(诺瓦斯生物公司(Novus Biologicals))一起培育30分钟。将 细胞用FACS缓冲液洗涤三次，并且在室温下在3％BSA/FACS缓冲液中与山羊抗兔 Alexa Fluor 568(英杰公司)一起培育20分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤三次， 在FACS缓冲液中与1μg/ml DAPI一起培育10分钟，安装在载片上，并且在共焦显微 镜(蔡司公司(Zeiss))下观测。
蛋白质印迹法：将细胞用荧光PU-H71衍生物、TEG-FITC或DMSO(媒剂)处理 24小时，并且在50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和补充有亮肽素(西格玛奥德里奇) 和抗蛋白酶(西格玛奥德里奇)的1％NP40溶解缓冲液中溶解。蛋白质浓度使用BCA 试剂盒(皮尔斯公司)，根据制造商的说明书测定。蛋白质溶解产物(50μg)通过 SDS/PAGE电泳解析，转移到硝酸纤维素膜并且用针对以下各物的以下初级抗体探测： Raf-1(1:300，Sc-133；圣克鲁斯公司)、FLT3(1:1000，sc-480；圣克鲁斯公司)和β- 肌动蛋白(1:2000，A1978；西格玛)。然后膜与相应辣根过氧化酶结合的二级抗体的 1:3000稀释液一起培育。使用ECL-增强化学发光检测系统(安玛西亚生物科学公司)， 根据制造商的说明书进行检测。
6.3.4.肿瘤干细胞分析
PU-H71结合分析–将原代样品以2×106个细胞/毫升涂铺于48孔板中，并且用1μMPU-H71-FITC2或TEG-FITC处理。在处理后4小时，将细胞用FACS缓冲液(PBS、0.05％ FBS)洗涤一次，并且在4℃下在FACS缓冲液(PBS+0.5％FBS)中用CD34-APC、 CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体(碧迪生物科学公司)染色30分钟，接着进行7-AAD (英杰公司)染色。在BD-LSRII流式细胞仪)中评估结合PU-H71-FITC2的MFI并且 相对于TEG-FITC归一化。值表示为相对于淋巴细胞(CD45hi对比SSC门)，LSC (CD45dim、CD34+、CD38-门)中PUH71-FITC的结合比率。
干细胞活力分析-将原代细胞以2×106个细胞/毫升涂铺于48孔板中，并且用1μMPU-H71处理48小时。将细胞在4℃下在FACS缓冲液(PBS、0.05％FBS)中用CD34-APC、 CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体(碧迪生物科学公司)染色30分钟，接着在膜联 蛋白V缓冲液(10mM HEPES/NaOH、0.14M NaCl、2.5mM CaCl2)中进行膜联蛋白 V-V450(碧迪生物科学公司)和7-AAD染色。细胞活力确定为相对于未经处理的细胞 归一化的膜联蛋白V-/7AAD-细胞百分比。
统计分析除非另外指示，否则如在GraphPad Prism(第4版；格兰帕蒂软件公司(GraphPad Software))中执行，通过未配对的双尾t检验，分析数据。认为P值小于0.05 为显著的。除非另作说明，否则数据以两次或三次重复实验的平均值±SD或平均值±SEM 呈现。误差条表示平均值的SD或SEM。如果呈现单个图，那么数据代表2个或3个个 别的实验。
6.3.5.评估原代白血病样品中以及白血病和实体肿瘤细胞系中的PU-FITC结合
程序：将来自白血病患者的外周血(PB)或骨髓(BM)单核细胞使用菲科尔密度 梯度从新鲜样品分离或者从活冷冻的等分试样分离。将细胞用1μM PU-FITC处理，并 且在处理后4小时，将细胞洗涤并且用抗体染色，以区分不同的亚群(CD45-APC-H7， 以鉴别胚细胞(CD45dim对比SSC门)和淋巴细胞(CD45hi对比SSC门))，以及进行 7-AAD染色以区分死细胞。PU-FITC结合将使用碧迪LSR-II仪器评估。仪器是在实验 前使用CST珠粒建立。针对PU-FITC结合，使用经不同的荧光强度(Quantum Alexa Fluor 488试剂盒)标记的市售珠粒的校准曲线用于定量AF488/FITC荧光强度。与淋巴细胞 的结合用以确定每一患者样品的PU-FITC的背景结合。PU-FITC结合被评价为胚细胞相 对于淋巴细胞的平均荧光强度(MFI)的差异倍数。非特异性对照(TEG-FITC)用以确 定非特异性结合。提出评估至少100个原代白血病样品。对于每一分析，使用最少900,000 个总单核细胞。对于此分析，收集了至少50,000个事件。使用FlowJo软件进行分析。 可以评估较大组的市售细胞系(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳癌、前列腺癌、胰腺癌和肺 癌细胞系)的PU-FITC结合。因为细胞系不具有其自己的内部对照，所以使用从PU-FITC 减去的针对TEG-FITC计算的ΔMFI(使用以荧光珠粒进行的校准曲线定量)或如上所 述与HL-60细胞的结合。
评估对Hsp90抑制剂的敏感性：为了确定针对PU-FITC结合评估的所有样品的敏感性，将细胞涂铺于96孔板中并且用递增剂量的PU-H71处理。在可获得足够材料的细 胞系和选择子集的原代样品中，还测试其对其它化学上不同的Hsp90i(17-AAG、 NVP-AUY922和STA9090或目前处于临床评估中的其它Hsp90i)的敏感性(5)。48小 时后收集细胞并且用CD45-APC-H7染色，以区分胚细胞与正常淋巴细胞(对于原代细 胞)。然后洗涤细胞，并且在膜联蛋白V缓冲液(10mM HEPES/NaOH、0.14M NaCl、 2.5mM CaCl2)中用膜联蛋白V-V450和7-AAD染色。细胞活力将通过流式细胞术分析。
统计学考虑：初始目标是评估对PU结合倍数的分析，以便其最佳地区分Hsp90i 反应者与无反应者。这些实验使用150个包括原代样品和细胞系在内的样品体外进行。 如果超过50％的细胞是活的，那么确定反应。计算接受者操作特性(ROC)曲线下面积 以评估PU结合倍数在区分反应与无反应方面的能力。对我们来说，界定.87或更高的 AUC(与.75的零AUC相比)指示PU结合倍数可以区分Hsp90i反应者与无反应者。对 于150个样品并且采用30％反应率，用5％的第I型误差检测.75到.87的AUC差异将具 有80％功效。当反应率减小时，功效也减小。举例来说，如果采用20％反应率，那么用 5％的第I型误差检测.75到.89的AUC差异将具有80％功效。
6.3.6.测量在pgp抑制剂存在或不存在下活肿瘤细胞系中的PU-FITC结合
将粘附癌细胞系涂铺，并且在37℃、5％CO2下粘附过夜。将细胞用pgp抑制剂(托克瑞斯公司的PSC 833或托克瑞斯公司的瑞瓦萨(Reversan))或DMSO媒剂预处理(5 μM)2小时，接着添加含有1μM DMSO、PU-FITC9(阴性PU-FITC对照)和PU-FITC2 (经FITC标记的PU-H71药物)的培养基。在37℃、5％CO2下将细胞与FITC药物或对 照结合物一起再培育4小时。然后将细胞以胰蛋白酶处理，用1X FACS缓冲液(1X PBS+0.5％FBS)洗涤两次，并且将小球再悬浮于500μl含有细胞活力染料(1μg/ml DAPI)的1X FACS缓冲液中。样品在碧迪LSRII流式细胞仪上操作并且收集10-20,000 个事件。在每一实验操作前，激光在LSRII(碧迪生物科学公司)上用CST珠粒归一化。 通过测量FITC中值荧光强度(MFI)确定DAPI-ve活细胞中肿瘤细胞中PU-FITC的结 合。从PU-FITC信号减去FITC9和DMSO对照的非特异性FITC信号。
6.3.7分离的肿瘤细胞和循环肿瘤细胞
分离肿瘤细胞和测量PU-FITC结合-从小鼠中获得的EGFR+肿瘤根据制造商方案分离(组织分离试剂盒，密理博公司)。简单地说，使用解剖刀将1g新鲜组织切成小块(例 如每公克组织约10-20块)。切碎的组织在PBS中洗涤两次并且在和缓的搅拌下在37℃ 下在分离溶液中转移50分钟。分离后，洗涤细胞，使用筛网过滤，并且弃去未分离的 组织碎片。将分离的组织转移到含有1X具有蛋白酶抑制剂的分离缓冲液的新管中。将 细胞在含有蛋白酶抑制剂的分离缓冲液中洗涤两次。细胞在培养基中再悬浮到1×106个 细胞/毫升。将样品同等地分成3管细胞并且在37℃、5％CO2下用1μM(每1×106个细 胞/毫升)DMSO、PU-FITC9(阴性FITC对照)和PU-FITC2(标记到FITC的PU-H71 药物)处理4小时。外加有从血库中获得的融解的PBMC的对照EGFR+细胞系[AspcI (低程度结合)；BxPc3(高度结合)]与如上所提及的分离的肿瘤细胞同时染色。将细胞 用1X FACS缓冲液(1X PBS+0.5％FBS)洗涤两次，并且在冰上用抗人类EGFR-PE(碧 迪生物科学公司)、抗人类CD14-APC-Cy7(艾尔生物科学公司(ebiosciences))或 CD14-PE-得克萨斯红(英杰公司)和抗人类CD45-APC(艾尔生物科学公司)染色30 分钟。然后将细胞用1X FACS缓冲液(1X PBS+0.5％FBS)洗涤两次，并且将小球再悬 浮于500μl含有细胞活力染料(1μg/ml DAPI)的1X FACS缓冲液中。样品在碧迪LSRII流式细胞仪上操作并且收集100-200,000个事件。在每一实验操作前，激光在LSRII(碧 迪生物科学公司)上用CST珠粒归一化。肿瘤细胞中PU-FITC的药物累积通过测量 EGFR+细胞(EGFR+CD45-)和EGFR-细胞(EGFR-CD45+CD14-)中FITC中值荧光强 度(MFI)来确定。减去PU-FITC9和DMSO对照的非特异性FITC信号。值计算为肿 瘤(EGFR+CD45-CD14-)MFI:EGFR-CD45+CD14-细胞MFI的比率。为了在整个患者中 归一化MFI值，将用每一样品操作QuantumFITC标准化珠粒(邦斯实验室(Bangs laboratories))并且产生标准曲线。此允许定量同等可溶性荧光染料(MESF单元)分子 中的FITC荧光强度。每一样品中的PU-FITC2累积可以在整个样品中通过外延由标准 曲线产生的值来定量。
测量PBMC中PU-FITC与EpCAM+循环肿瘤细胞的结合：所有实验性采血程序在 纪念斯隆-凯特林癌症中心根据机构审查委员会批准的方案进行。将8ml外周血从 PU-H71临床试验所招收的癌症患者抽到抗凝血EDTA管中。PBMC以菲科尔梯度分离， 对细胞计数并且活力通过锥虫蓝染料排除分析测定。PBMC短暂离心并且再悬浮到 2×106个细胞/毫升。将样品同等地分成3管并且在37℃、5％CO2下用1μM(每2×106个细胞/毫升)DMSO、PU-FITC9(阴性FITC对照)和PU-FITC2(标记到FITC的PU-H71 药物)处理。对照EpCAM+细胞系[AspcI(低程度结合)；BxPc3(高度结合)]外加有 从血库中获得的新鲜融解的PBMC并且与如上所提及的患者PBMC同时染色。将细胞 用1X FACS缓冲液(1X PBS+0.5％FBS)洗涤两次，并且在冰上用抗人类EpCAM-PE (美天旎生物技术公司)、抗人类CD14-APC-Cy7(艾尔生物科学公司)或CD14-PE-得克 萨斯红(英杰公司)和抗人类CD45-APC(艾尔生物科学公司)染色30分钟。然后将细 胞用1X FACS缓冲液(1X PBS+0.5％FBS)洗涤两次，并且将小球再悬浮于500μl含有细胞活力染料(1μg/ml DAPI)的1X FACS缓冲液中。样品在碧迪LSRII流式细胞仪上 操作并且收集100-200,000个事件。在每一实验操作前，激光在LSRII(碧迪生物科学公 司)上用CST珠粒归一化。肿瘤细胞中PU-FITC的结合通过测量EpCAM+细胞 (EpCAM+CD45-)和EpCAM-细胞(EpCAM-CD45+CD14-)中FITC中值荧光强度(MFI) 来确定。减去FITC9和DMSO对照的非特异性FITC信号。值计算为肿瘤 (EpCAM+CD45-CD14-)MFI:EpCAM-CD45+CD14-细胞MFI的比率。为了在患者中归 一化MFI值，将用每一患者样品操作Quantum FITC标准化珠粒(邦斯实验室)并且产 生标准曲线。此允许定量同等可溶性荧光染料(MESF单元)分子中的FITC荧光强度。 每一样品中的PU-FITC2结合可以在整个样品中通过外延由标准曲线产生的值来定量。
对方案的修改：从患者中获得的PBMC将分成2管。两者都如上所提及用PU-FITC 染色，并且用EpCAM-PE或同型对照以及CD14-PE-得克萨斯红和CD45-APC染色。样 品将如上所提及加工。临限比率值将使用外加有PBMC的PU-FITC低程度和高度积累 细胞系确定。
6.3.8.组织中PU-H71结合的分析
使用离体肿瘤组织资源检查胃肿瘤患者样品对HSP90抑制剂的敏感性并且与 PU-H71-FITC染色相关：手术去除胃切除术样品后，立即将组织输送到病变组的组织 获取(TPS)区。一旦定位病变，就在无菌条件下收获组织。被去除以供评估的样品尺 寸典型地是5-10mm×5-10mm。尽一切努力取样最有活力的区域。远离病变，去除代表 正常胃上皮组织的同等尺寸的样品。两种样品都放在具有1％青霉素/链霉素的最低必需 培养基(MEM)中。一小部分病变和整片正常胃上皮组织进行“快速”冷冻以供将来通 过WB进行分子评估。病变(胃切除术)的剩余部分进行加工，以用于病理学评估。对 于每个病变，病理学提供了增殖标记物、上皮标记物和一个苏木精/曙红(H&E)染色 的载片以及10个未染色的载片的IHC以针对用荧光素标记的PU-H71(PU-FITC)染色 进一步评估。针对PUH71-FITC2染色分析福尔马林固定的石蜡包埋的切片或冷冻切片。 平行地，准备一部分组织用于肿瘤对PU-H71的敏感性的离体分析。从初步分析中已经 得知新鲜的组织切片将癌细胞保存在周围组织的内源性环境中。在此方法中，组织(即 病变)放在塑料模具中并且包埋于6％琼脂糖中。琼脂糖包埋的组织然后安装在被浸没 在含有具有1％青霉素/链霉素的MEM的冷却的储集器(用于保存组织)中的Vibratome 切片机平台上。然后使用金属刀片将组织切片，产生200μm厚的病变连续切片。每一 切片(减去周围的琼脂糖包埋培养基)立即放入含有具有1％青霉素/链霉素的MEM的 24孔组织培养板中。从5mm×5mm组织块，产生约25个切片。此允许重复分析用最 少4个剂量的HSP90抑制剂处理和一个仅媒剂处理的组织切片。一旦组织切片通过短暂 暴露于分散酶进行酶促分离，重复实验就可以通过IHC以及活力分析(自动板式读数器 或细胞离心涂片机设备)来分析。然后这些胃肿瘤切片中PU-H71诱发的细胞凋亡程度将与PU-H71-FITC染色相关。PU-H71吸收(如通过PU-H71-FITC染色的IHC评分来 测量)与这些肿瘤对Hsp90抑制的敏感性相关。类似方案已经发展用于乳癌和胰腺癌。
6.4.细胞分析中ANCA标记的探针
荧光探针处理：当70％汇合时，将粘附细胞在标准组织培养条件下用5μM PUH71-ANCA处理1小时。在处理后，吸出培养基，用PBS洗涤载片3次，接着补充 完全培养基。
荧光发射光谱：使用倒置荧光共焦显微镜(徕卡(Leica)SP5)并且从400nm到600nm以5nm增量扫描腔室载片上的癌症和非癌细胞，来测定荧光发射。
共焦显微镜术：处理后，使用倒置荧光共焦显微镜(徕卡SP5)观测细胞的荧光。 在高度亲和力结合物质的适当荧光发射峰(约530nm)获得共焦影像。影像上传到NIH ImageJ软件。测量来自若干随机场的个别细胞的荧光强度并且针对背景校正。
反应模型化：针对12个乳癌细胞系和2个正常乳房细胞系建立IC50对比荧光密度积分的标准曲线。细胞系在多孔板上生长，其中五个孔针对反应分析(仅媒剂、0.25μM、0.50μM、1.0μM和2.5μM PUH71处理)并且一个孔针对结合(PUH71-ANCA处理) 的荧光强度分析。所有细胞系的IC50在y轴上绘出，并且密度积分(荧光强度)在x轴 上绘出。此标准曲线用以模仿和预测乳癌样品(例如从活组织检查、手术或细针吸取中 获得的样品)对HSP90疗法的反应。
癌症活组织检查中反应的测量：患者活组织检查一旦获取，就放在无菌生理盐水中， 并且立即递送到病理学部门的组织获取区。取得一部分病变以在Vibratome切片机(徕卡VT1000)上进行新鲜组织切片。切割200μm厚切片并且立即放入多孔板中的具有生 长因子和抗生素的最低必需培养基中，并且放在37℃、空气-5％CO2氛围、恒定湿度下。 然后切片用PUH71-ANCA处理45分钟到1小时。处理后，切片用PBS洗涤2次，接着 OCT-包埋(新鲜冷冻)。OCT-包埋的样品然后切成若干4μm厚的切片并且转移到加料 载片。核的对比染色DAPI然后施加于载片。然后在共焦显微镜(徕卡SP5)上观测载 片并且在530nm荧光发射峰下分析以确定结合于致癌HSP90物质的探针的百分比。
6.5.使用放射性标记的HSP90抑制剂的研究
试剂.[131I]-PU-H71和[124I]-PU-H71如先前报导来合成和纯化132。
细胞系.MDA-MB-468人类乳癌细胞系是从美国模式培养物保藏所中获得。细胞通常在补充有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素的DME-HG中培养。
体内研究.所有动物研究都是按照MSKCC机构动物管理与使用委员会(IACUC) 指南进行。雌性无胸腺nu/nu小鼠(NCRNU-M，20-25g，6周大)是从哈尔伦实验室(HarlanLaboratories)中获得并且使其在植入肿瘤前适应MSKCC动物园环境1周。小鼠随意取 用食物和水。在小鼠前肢上，通过皮下(s.c.)注射PBS与复原基底膜(BD MatrigelTM， 马萨诸塞州贝德福德的合作生物医学产物公司(Collaborative Biomedical Products Inc.,Bedford,MA))的1:1v/v混合物的200μL细胞悬浮液中1×107个细胞来建立 MDA-MB-468肿瘤异种移植物。投予前，在PBS(pH 7.4)中调配PU-H71溶液。
体内生物学分布研究.对于急性体内生物学分布研究，在尾静脉中向前肢上具有MDA-MB-468乳房肿瘤异种移植物的小鼠(n＝5)静脉内注射200μL生理盐水中的 0.93-1.1MBq(25-50μCi)[124I]-PU-H71或[131I]-PU-H71。为进行剂量估计，向小鼠实 验群组(n＝5)注射在含有PU-H71的无菌溶液中稀释的[124I]-PU-H71或[131I]-PU-H71， 对应于每公斤小鼠体重5、25、50或75mg/kg。在投予前后注射器中的活性在剂量校正 器(CRC-15R；凯宾泰克公司(Capintec))中分析以确定向每一动物投予的活性。通过 在示踪剂投予后不同的时间点进行CO2窒息来处死动物(每组n＝4)，并且收获包括肿 瘤在内的器官并称重。一部分肿瘤组织在收获后立即冷冻以供进一步生物化学和组织学 分析。124I是使用400-600keV能量窗在闪烁γ-计数器(马萨诸塞州沃尔瑟姆的铂金埃 尔默1480维士得3自动γ计数器(Perkin Elmer 1480Wizard 3Auto Gamma counter, Waltham,MA)中测量。计数数据是背景并且相对于注射时间衰减校正，并且每一组织 样品的每公克注射剂量百分比(％ID/g)通过使用测量校准因子将计数率转变成活性来 计算，并且将活性相对于注射的活性归一化以产生活性浓度，以％ID/g计。
小动物PET成像.对于小动物成像研究，使用在前肢上具有MDA-MB-468乳癌异 种移植物的小鼠。使用专用的小动物PET扫描器(Focus 120microPET；田纳西州诺克 斯维尔的康克德微系统公司(Concorde Microsystems,Knoxville,TN))进行成像。在整 个扫描周期期间，小鼠维持在2％异氟烷(伊利诺斯州迪尔菲尔德的百特医疗用品(BaxterHealthcare,Deerfield,IL))麻醉下2L/min的氧气中。在适合的情况下，为了降低由示踪剂代谢引起的游离碘的甲状腺吸收，小鼠在其饮用水中接收0.01％碘化钾溶液，在示踪 剂投予前48小时开始。为进行PET成像，每一小鼠通过尾静脉投予9.25MBq(250μCi) [124I]-PU-H71。在示踪剂投予后各时间点，针对每一动物获得连续的列出模式获得物 (10-30分钟)。使用420-580keV的能量窗和6ns的重合时序窗。所得的列出模式的数 据通过傅里叶再分装(Fourier rebinning)分选成二维直方图；横向影像通过滤波反向投 影法(FBP)重建。针对扫描器反应的不均匀性、死时间计数损失和注射时间的物理衰 减校正影像数据。不针对减弱、散射或部分体积平均进行校正。Focus 120的测量的重 建空间分辨率在视场中心是1.6mm FWHM。重建影像的ROI分析是使用ASIPro软件(田 纳西州诺克斯维尔的康克德微系统公司)进行，并且针对每一组织/器官ROI记录最大 像素值。来源于小鼠尺寸的充满水的含18F圆筒的重建影像的系统校准因子(即，对于 每个体素μCi/mL/cps)用以将124I体素计数率转变成活性浓度(针对124I正电子分支比 调整后)。所得影像数据然后相对于投予活性归一化，以根据％ID/g将microPET影像参 数化(相对于注射时间校正衰减)。
LC-MS/MS分析.在乙腈/H2O(3:7)中均质化前，冷冻组织干燥并称重。在二氯 甲烷中萃取PU-H71并且分离有机层并在真空下干燥。样品在移动相中复原。组织或血 浆中PU-H71的浓度通过高效LC-MS/MS测定。添加PU-H71-d6作为内标133。在6410 LC-MS/MS系统(安捷伦技术公司(Agilent Technologies))上以多个反应监测(MRM) 模式使用正离子电喷雾电离进行化合物分析。对于组织样品，Zorbax Eclipse XDB-C18 柱(2.1×50mm，3.5μm)用于LC分离，并且分析物在等度条件(80％H2O+0.1％HCOOH: 20％CH3CN)下以0.4mL/min的流速洗脱3分钟。对于血浆样品，Zorbax Eclipse XDB-C18 柱(4.6×50mm，5μm)用于LC分离，并且分析物在等度条件(H2O+0.1％HCOOH:CH3CN， 95:5到70:30)下以0.35ml/min的流速洗脱。
药物动力学分析.对于蛋白质分析，肿瘤在SDS溶解缓冲液(50mM Tris pH 7.4、2％SDS)中均质化并且进行蛋白质印迹分析。蛋白质浓度使用BCA试剂盒(皮尔斯公 司)，根据制造商的说明书测定。蛋白质溶解产物(20-100μg)通过SDS/PAGE电泳解 析，转移到硝酸纤维素膜并且用指示的初级抗体探测：来自小鼠的抗Hsp90(1:500， SPA-830；斯杰公司)、来自兔的抗-Akt(1:500，9272；赛信通公司)、来自兔的抗-磷酸 化Akt(Ser 473)(1:500，9271S；赛信通公司)、来自兔的抗-PARP(p85片段)(1:250， G7341；普洛麦格公司)。然后膜与过氧化酶结合的相应二级抗体的1:5,000稀释液一起 培育。针对β-肌动蛋白(1:5,000，ab8227-50；阿科玛公司)，同等负荷的蛋白质样品通 过平行蛋白质印迹法证实。使用ECL增强化学发光检测系统(安玛西亚生物科学公司)， 根据制造商的说明书进行检测。
密度测定法.在Adobe Photoshop中扫描凝胶，并且使用Un-Scan-It 5.1软件进行定 量密度分析。
功效研究.如指示，使用不同的剂量和时程，腹膜内(i.p.)处理负载到达100-150mm3体积的MDA-MB-468肿瘤的小鼠(n＝5)。肿瘤体积通过用游标测径规测量来确定，并且肿瘤体积计算为其长度×宽度2×0.4的乘积。指示当日的肿瘤体积表示为针对小鼠群组所指示的中值肿瘤体积±SD。在研究最后一天，针对药物处理的小鼠，与媒剂处理的小 鼠相比，测量肿瘤生长抑制值百分比(％)，并且计算为100×{1–[(处理最后一天–处理第一天)/(对照最后一天–对照第一天)]}。针对既定处理组，肿瘤消退值通过计算处理开始时中值肿瘤体积 与研究最后一天的中值肿瘤体积的比率来确定。肿瘤消退百分比(％)是100×[1–(处理最后一天/处理第一天)]。
吖啶橙/溴化乙锭细胞活力分析.Easycount ViaSure试剂盒(伊莫肯公司(Immunocon))连同Easycount系统一起使用以自动计数死和活的细胞。在单一测试中ViaSure染色剂使用即用型核酸染料吖啶橙与溴化乙锭的混合物来分别鉴别活和死的细胞。吖啶橙被活细胞与非活细胞吸收，并且如果嵌入双股核酸(DNA)中，那么发射绿 色荧光，或者如果结合于单股核酸(RNA)，那么发射红色荧光。溴化乙锭仅仅被非活 细胞吸收并通过嵌入DNA中发射红色荧光。活细胞具有含组织结构的均匀绿色细胞核。 早期细胞凋亡细胞(其仍然具有完整的膜，但已经开始进行DNA裂解)具有绿色细胞 核，但可见核周染色质缩合成鲜绿色小块或片段。晚期细胞凋亡细胞具有含缩合或破碎 染色质的橙色到红色细胞核。坏死性细胞具有含组织结构的均匀橙色到红色细胞核。每 一条件计数总共至少200个细胞。
模拟.双指数函数x(t)＝α1exp(-β1t)+α2exp(-β2t)与这些测量进行拟合。一般说来， 许多指数函数已经用以分析药物动力学数据123。R统计语言(www.r-project.org)中广义非线性模型程序包(http://cran.rproject.org/web/packages/gnm/index.html)已经用以将 模型与数据拟合。最初寻求若干拟合，并且最佳的一个用于进一步模拟不同的药物投予 情况。已经发展R的脚本。
统计分析.除非另外指示，否则如在GraphPad Prism(第4版；格兰帕蒂软件公司)中执行，通过未配对的双尾t检验，分析数据。认为P值小于0.05为显著的。除非另作 说明，否则数据以两次或三次重复实验的平均值±标准偏差(SD)或平均值±平均值标准 误差(SEM)呈现。误差条表示平均值的SD或SEM。如果呈现单个图，那么数据代表 2个或3个个别的实验。
人类研究.在注射前一天开始，投予一日一次剂量的碘化钾溶液(SSKI)，持续14天。通过缓慢周边静脉内推注，投予单一示踪剂注射(4-11.0mCi；<100μg)。在0小 时(动态扫描)、3-4小时、24小时和40-80小时和/或160-200小时(静态扫描)患者进 行非侵入性基于PET的分析。在PU-PET先导试验中，在患者募集无困难或‘退出’下， 患者已经很好地耐受更苛求的时程。时间点是基于人类124I-PUH71PK数据选择：
(1)124I-PUH71以双指数方式迅速地从血液循环清除-快速清除(血液t1/2≈20min.)， 接着以可忽视低的血液水平缓慢清除；
(2)通过PET成像，肿瘤PUH71-示踪剂浓度是可变的，数量上超过或等于背景组 织示踪剂水平，从示踪剂注射后4到24或者48和超过72小时示踪剂的差异吸收和/或 滞留是明显的；
(3)PUH71-侵袭性肿瘤浓度在数天时间内已经持续或已经展示单指数类型清除。
已经最佳化124I-PUH71 PET影像获取方案以确保稳固的计数-统计数字。专用的研究PET/CT扫描器(GE Discovery DSTE)在减弱、衰减和散射校正以及针对系统灵敏度 调整下获得定量生物学分布影像。在示踪剂注射前，以体重(≥81kg达到85mA)衡量， 针对衰减校正和解剖共登记进行CT扫描。CT方案设计成能足够用于示踪剂-信号的解 剖学定位和衰减校正，同时将放射性照射减到最少。未投予静脉内或经口射线照片造影 剂。PET数据使用标准有序子集预期的最大化迭代算法重建。发射数据针对散射、减弱 和衰减校正。
PU-肿瘤亲合力是在目测检查PET影像时界定的二元结果，因为认为在任何时间点， 肿瘤示踪剂-信号清楚地高于参考血液池或器官背景。从PET数据，通过以下来定量评估肿瘤PU-H71浓度：(1)任何时间点的最高肿瘤标准化吸收值(SUV)；和(2)第一 个与最后一个PET时间点之间的作为PU-H71注射后时间函数的肿瘤SUV积分(即由 所述SUV读数计算的PU-PET SUVmax读数或摩尔浓度作为PU投予后时间的函数作图， 并且AUC值和Hsp90抑制剂的平均肿瘤浓度如图27中所示计算)。
然后这些参数(或如定义的其它参数)与在治疗试验上对HSP90抑制剂的反应相关。 在这些研究上，评估每一肿瘤和每一患者的肿瘤反应。肿瘤反应评估的时序按照疗法试 验方案进行。肿瘤反应评估来自最接近第一周期末端(一个周期典型地是3-5周)的临床成像。肿瘤反应由CT或MRI的RECIST 1.1界定，和/或FDG PET-CT的PERCIST 1.0 界定(36,37)。如果不一致，那么将使用更有利的反应。根据癌症特异性疗法试验反应 标准判断临床反应。
关于PET影像的肿瘤PUH71-亲合力数据以两种方式分成两部分：
(1)通过使用肿瘤的定性/视觉判断的二元结果，为‘侵袭性’或‘非侵袭性’(以 上所讨论)；
(2)通过使用针对群聚的数据计算的ROC曲线，将计算在区分肿瘤-反应对比无反应方面具有最佳操作特性的肿瘤-亲合力的割点(40)。
对于两种二分法，使用患者反应作为事实，计算分类的敏感性、特异性和其它量度。 如果每一患者具有单一肿瘤，那么40个患者的样本大小将产生最大宽度为.324的双侧置信区间。当每一患者的肿瘤数目增加时，置信区间的宽度一般将整体降低。进行一种 探索性分析，其被设计成能发现与整体RECIST患者水平反应最佳相关的肿瘤-亲合力的 患者水平的汇总统计量。所研究的亲合力的患者水平的汇总统计量包括1)最高肿瘤SUV 和/或AUC以及2)所有肿瘤SUV和/或AUC的平均值。此患者水平的数据用以构筑基 于约登指数的患者汇总肿瘤-亲合力的ROC曲线和截止值，并且将计算最接近(0,1)的 点。
在临床前研究中，某些时间点或在时间段内的吸收和滞留与观测到的反应相关。初 步资料表明如通过AUC测量的延长肿瘤滞留(24-48小时内)以及肿瘤-暴露都是预测 对Hsp90抑制疗法的肿瘤反应的相关参数。确切地说，在MDA-MB-468肿瘤中的初步 研究中，计算若干参数，例如肿瘤曲线下面积(AUC)、PU-H71的平均和最小肿瘤浓度、 测量为在处理时间内PU-H71占有和识别的平均Hsp90位点％的标靶占有率((占有的 Hsp90位点％)avg)。发现，在处理时间内记录的PU-H71的平均肿瘤浓度、肿瘤AUC和 “致癌Hsp90”占有％与观测到的抗肿瘤作用的程度非常显著相关(分别r2＝0.8162、 0.8188和0.7559)(图37)。这些表明大部分预测对Hsp90i的反应的适当的参数是测量 时间依赖性暴露，即吸收和滞留的参数。
6.6.鉴别可预测乳癌和AML中对HSP90的细胞凋亡敏感性的标记物的研究
细胞：香住-1、SKNO-1、MOLM-13、M0-91、HEL、HL-60、THP-1、MV4-11在 补充有10mMHEPES、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢钠、1mM丙酮酸钠、10％FBS和 1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中生长。先前描述FL5.12的稳定转染物(18-卡纳斯 (Karnauskas)2003)。简单地说，为了产生FL5.mAKT，将十八烷基化的AKT在多西环 素诱导性载体pRevTRE(克隆技术公司(Clontech))中克隆(此克隆称为mAKT)。作 为对照，细胞单独用载体转染(此克隆称为载体)。为了产生FL5.mAkt.Bcl-xL，人类 Bcl-xL cDNA克隆到pBabePuro载体的EcoRI位点中，并且转染到如描述的FL5.mAkt3 中(18)(此克隆称为mAKT.Bcl-xL)。这些细胞系如先前描述，使用补充有10mM HEPES、含有1mg/ml遗传霉素(Geneticin)(G418)(西格玛#G9516)和1或2ng/mL IL -3(碧迪系统#403ML)的10％FBS培养基的DME-HG培养基培养。
PBL(人类外周血白血球)从购自纽约血液中心的患者血液分离。35ml细胞悬浮液堆积在15ml Ficoll-Paque plus分离液(通用电气医疗集团)上。样品在4℃下在2,000rpm下离心40分钟，并且收集白血球界面。将细胞涂铺于具有10％FBS的RPMI培养基中 并且第二天用适当浓度的PU-H71处理指示的时间。
试剂：Hsp90抑制剂如先前报导合成。从卡尔生物化学公司(Calbiochem)购得Akt抑制剂VIII同功酶-选择性的Akti-1/2(#124018)、PD98059MEK抑制剂(#513000)和 全JAK抑制剂I(#420099)。这些化合物在如供应商指示的浓度下使用以抑制其标靶通 路。除了体内研究，所有化合物都呈DMSO储备液使用。
生长抑制：生长抑制研究使用阿拉马蓝分析进行。此试剂提供了细胞培养物中细胞 活力的迅速客观测量，并且其使用指示染料刃天青来测量细胞代谢能力(细胞活力的指示物)。简单地说，将指数生长的AML细胞系以2×104个细胞/孔涂铺于微量滴定板(康 宁#3650)中并且在37℃下培育指示的时间。药物以指示的浓度一式三份地添加，并将 板培育72小时。添加刃天青(55μM)，并且6小时后使用Analyst GT(荧光强度模式， 激发530nm，发射580nm，使用560nm分色镜)阅读培养板。结果使用Softmax Pro 软件分析。细胞生长抑制百分比通过将从处理的细胞中获得的荧光读数与从对照细胞中 获得的荧光读数比较，占初始细胞群体(零时)来计算。IC50计算为抑制细胞生长50％ 的药物浓度。
细胞凋亡分析：如所指示，将细胞用媒剂(DMSO)或抑制剂处理24、48或72小 时。在用吖啶橙和溴化乙锭(100μg/ml的1:1混合物)染色后，用荧光显微镜(蔡司 Axiovert40CFL)目测细胞并计数。细胞凋亡百分比由每组中计数的200-300个细胞来 确定。细胞凋亡细胞百分比计算为：细胞凋亡细胞％＝(具有细胞凋亡的核的细胞总数/ 计数的细胞总数)×100。吖啶橙被活细胞与非活细胞吸收，并且如果嵌入双股核酸(DNA) 中，那么发射绿色荧光，或者如果结合于单股核酸(RNA)，那么发射红色荧光。溴化 乙锭仅仅被不能存活的细胞吸收并藉由嵌入DNA中发射红色荧光。活细胞具有含组织 结构的均匀绿色细胞核。早期细胞凋亡细胞(其仍然具有完整的膜，但已经开始进行 DNA裂解)具有绿色细胞核，但可见核周染色质缩合成鲜绿色小块或片段。晚期细胞凋 亡细胞具有含缩合或破碎染色质的橙色到红色细胞核。坏死性细胞具有含组织结构的均 匀橙色到红色细胞核。
卡斯蛋白酶3,7活化分析：细胞如生长抑制分析部分中所述来涂铺和处理。在细胞暴露于Hsp90抑制剂24小时或48小时后，将含有10mM Hepes pH 7.5、2mM EDTA、 0.1％CHAPS、0.1mg/mL PMSF、完全蛋白酶抑制剂混合物(#1697498；罗氏公司(Roche)) 和25μM卡斯蛋白酶底物Z-DEVD-R110(#R22120；分子探针公司(Molecular Probes)) 的100μL缓冲液添加到每一孔中。培养板放在回旋震荡器上以促进细胞溶解和反应。 每一孔的荧光信号在Analyst GT(分子仪器公司(Molecular Devices))微定量板式读数 器(激发485nm；发射530nm)中测量。卡斯蛋白酶-3,7活性增加百分比通过比较从 处理中获得的荧光读数对比对照细胞中获得的荧光读数来计算。所有实验数据都是使用 SOFTmax Pro 4.3.1分析并且使用Prism 4.0(加利福尼亚州圣地亚哥的格兰帕蒂软件公 司(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA))绘图。
蛋白质印迹法：细胞生长到60-70％汇合并且用抑制剂或媒剂处理指示的时间。在50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和1％NP-40溶解缓冲液中制备蛋白质溶解产物。蛋 白质浓度使用BCA试剂盒(皮尔斯公司)，根据制造商的说明书测量。蛋白质溶解产物 (10-100μg)通过SDS-PAGE解析，转移到硝酸纤维素膜上并且与指示的初级抗体一起 培育。为了活化AKT，在用抑制剂处理前，将FL5.12衍生的细胞系预先用1mg/ml Dox 处理18小时。
抗体：来自兔的抗-AKT(1:500，9272；赛信通公司)、来自兔的抗-磷酸化AKT(Ser473)(1:500，9271S；赛信通公司)、来自兔的抗-RAF-1(1:300，sc-133；圣克鲁斯生 物技术公司)、来自兔的抗-PARP(p85片段)(1:250，G7341；普洛麦格公司)、来自兔 的抗-Bcl-xL(1:1,000，2762；赛信通公司)、来自兔的抗-JAK2(1:500，3773；赛信通 公司)、来自小鼠的抗-c-KIT(1:1,000，3308；赛信通公司)、来自兔的抗-AML1(1:500， 4334；赛信通公司)、来自兔的抗-FLT3(1:1,000，3462；赛信通公司)、来自兔的抗-TRKC (1:1,000，ab43078；阿科玛公司)、来自小鼠的STAT5、p-STAT5、p-ERK和抗-β-肌动 蛋白(1:3,000，ab8227-50；阿科玛公司)。然后膜与过氧化酶结合的相应二级抗体的 1:3,000稀释液一起培育并且通过ECL-增强化学发光检测系统(安玛西亚生物科学公司) 检测蛋白质。
药物动力学研究：从塔可尼克法姆公司(Taconic Farms)获得4到6周龄的nu/nu无胸腺雌性小鼠。实验根据机构动物管理与使用委员会批准的方案进行，并遵循动物在 研究中的适当和人类使用的机构准则。使用20规格针将HEL和M0-91细胞皮下植入鼠 标右侧腹部中并且使其生长。投予前，在无菌PBS中调配PU-H71的HCl溶液。对于此 分析，使肿瘤在处理前到达6-8mm直径。负载M0-91和HEL肿瘤的小鼠腹膜内(i.p.) 投予75mg/kg PU-H71。通过在PU-H71投予后12、24、48、72和96小时CO2安乐死 来处死动物。肿瘤均质化并且如上所述通过蛋白质印迹法分析蛋白质。
密度测定法.在Adobe Photoshop 7.0.1中扫描凝胶，并且使用Un-Scan-It 5.1软件进 行定量密度分析。
统计量.进行统计分析并且使用Prism 4.0(格兰帕蒂软件公司)绘图。所有数据呈现为平均值±s.d.。认为P值小于0.05为显著的。
Stat5phosphoflow-将原代细胞在4℃下用FACS缓冲液中CD34-APC、 CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体(碧迪生物科学公司)染色30分钟。细胞洗涤一 次，在室温下用4％三聚甲醛固定30分钟，并且在冰上用PBS/0.1％曲拉通X-100渗透 化10分钟。将细胞在4℃下用p-Stat5-PE或同型对照(碧迪生物科学公司)染色过夜。 然后细胞用PBS洗涤一次，并且使用碧迪-LSR II流式细胞仪(碧迪生物科学公司)进 行流式细胞术分析。将p-Stat5染色的MFI相对于同型对照归一化。
干细胞活力分析-将原代细胞以2×106个细胞/毫升涂铺于48孔板中，并且用1μMPU-H71处理48小时。将细胞在4℃下在FACS缓冲液(PBS、0.05％FBS)中用CD34-APC、 CD38-PE-CY7和CD45-APC-H7抗体(碧迪生物科学公司)染色30分钟，接着在膜联 蛋白V缓冲液(10mM HEPES/NaOH、0.14M NaCl、2.5mM CaCl2)中进行膜联蛋白 V-V450(碧迪生物科学公司)和7-AAD染色。细胞活力相对于未经处理的细胞归一化。
6.7.鉴别对HSP90抑制疗法敏感的神经变性患者的研究
表达人类APPswe、PS1M146V和τP301L的AD转基因模型(3xTg-AD)在疾病相 关脑区域中以年龄依赖性方式逐渐地发展Aβ和τ病理学(比灵斯(Billings)等人,2005； 奥多(Oddo)等人,2005；奥多(Oddo)等人,2003)。此小鼠模型通过将APP和τcDNA 构筑物共注入PS1M146嵌入小鼠胚胎中来建立。这些小鼠在淀粉样斑沉积前发展细胞 内Aβ，与在轻度认知障碍(MCI)患者和唐氏综合征(Down's syndrome)患者中的观 测结果一致。其还在缠结形成前发展细胞外Aβ沉积物，允许我们来研究与这两个AD 发展阶段相关的事件。τ病理学首先在海马区CA1区域的锥体细胞中明显，并且进展到 皮层，模拟人类AD脑中的分布模式(梅舒拉姆(Mesulam),2000)。因此，AD 3x-tg 小鼠模型显示与人类AD许多相似之处，并且提供了研究Hsp90抑制剂在病原上受影响 和正常脑区域中的作用和滞留的机会。
确定脑和血浆药物浓度.将呈HCl盐形式的化合物PU-HZ151的水溶液以指示的剂量腹膜内投予3×Tg AD小鼠(平均体重35g)。根据MSKCC机构动物管理与使用委员 会批准的方案，通过在处理后不同的时间点进行CO2安乐死来杀死小鼠。半脑分成皮质 边缘和皮质下区域，迅速地在液氮中冷冻并且储存在-80℃下。将血浆从血液中获得，血 液是收集到1.5mL在冰中冷却的埃彭道夫管(Eppendorf tube)中并且进行离心。将冷 冻的脑组织干燥并且称重，接着在乙腈/H2O(3:7)中均质化。将混合物用二氯甲烷萃取， 有机层分开并且在真空下干燥。将血浆(50μl)与乙腈(0.25mL)混合并且离心。所 得上清液在真空下干燥。样品在移动相中复原。化合物在脑和血浆中的浓度通过高效 LC-MS/MS确定。添加氟哌啶醇作为内标。在6410LC-MS/MS系统(安捷伦技术公司) 上以多个反应监测(MRM)模式使用正离子电喷雾电离进行化合物分析。Zorbax Eclipse XDB-C18柱(2.1×50mm，3.5μm)用于LC分离，并且分析物在等度条件(65％H2O+0.1％ HCOOH:35％CH3CN)下以0.35ml/min的流速洗脱5分钟。
药物动力学分析.对于蛋白质分析，选择的脑区域(海马区)在SDS溶解缓冲液(50mM Tris pH 7.4、2％SDS)中均质化并且进行蛋白质印迹分析。蛋白质水平通过用抗 -Hsp70和Hsp90抗体进行免疫印迹来分析。
7.实施例
本发明可以通过以下文编号段落中列举的以下实施例说明：
1.一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中 存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；
(b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与结合于正常细胞的所述标记的HSP90抑制剂的参考量比较；
其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量比所述参考量大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
2.根据实施例1的方法，其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与所述参考量相比的比率越大，对所述HSP90抑制剂疗法 的所述可能反应的程度越大。
3.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量越大，对所述HSP90抑制剂疗法的所述可能反应的程度越 大。
4.根据实施例1的方法，其中结合于正常细胞的所述标记的HSP90抑制剂的所述参考量是结合于含有来自所述肿瘤的细胞的所述样品中的正常细胞的所述标记的 HSP90抑制剂的量。
5.根据实施例1的方法，其中结合于正常细胞的所述标记的HSP90抑制剂的所述参考量是结合于参考样品中的正常细胞的所述标记的HSP90抑制剂的预定量。
6.根据实施例1的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂经荧光标记。
7.根据实施例1的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂经生物素标记。
8.根据实施例1的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂经放射性标记。
9.根据实施例1的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、包括急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞白血病和慢性骨髓 白血病在内的白血病、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前 列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、脊髓增生 性病症、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、 包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴 瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
10.根据实施例9的方法，其中所述癌症是乳癌。
11.根据实施例9的方法，其中所述癌症为白血病。
12.根据实施例11的方法，其中所述白血病是慢性骨髓白血病。
13.根据实施例9的方法，其中所述癌症是胃癌。
14.根据实施例9的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
15.根据实施例1的方法，其中所述肿瘤细胞是肿瘤干细胞。
16.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述肿瘤进行接触并且存在于个体中。
17.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述含有肿瘤细胞的样品进行接触并且是组织样品。
18.根据实施例1的方法，其中所述组织样品是在活组织检查、细针抽吸或手术程序 期间获得的样品。
19.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述样品进行接触并且包含生物流体。
20.根据实施例19的方法，其中所述生物流体是血液或骨髓。
21.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述样品进行接触并且包含破坏的肿瘤细胞。
22.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述样品进行接触并且包含活细胞。
23.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述样品进行接触并且包含冷冻细胞。
24.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述样品进行接触并且包含固定和渗透化细胞。
25.根据实施例1的方法，其中步骤(a)中所述样品进行接触并且包含福尔马林(formalin)固定的石蜡包埋的细胞。
26.根据实施例1的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的标记形式。
27.根据实施例1的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
28.根据实施例27的方法，其中所述HSP90抑制剂是PU-H71。
29.根据实施例1的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂是PU-H71或 PU-H71的类似物、同系物或衍生物的形式。
30.根据实施例1的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂是PU-H71的形式。
31.根据实施例30的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂是[124I]-PU-H71。
32.根据实施例30的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂是PU-H71-FITC2或PU-H71-NBD1。
33.根据实施例30的方法，其中所述可检测地标记的HSP90抑制剂是PU-H71的生物素标记类似物。
34.根据实施例33的方法，其中所述PU-H71的生物素标记类似物是PU-H71-生物素-5、PU-H71-生物素-6、PU-H71-生物素-8或PU-H71-生物素-9。
35.一种用于确定患有可成像肿瘤的癌症患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗 法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
(b)在步骤(a)中所述投予后多个时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
(c)在步骤(a)中所述投予后相同的多个时间点测量所述患者的预定健康组织对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
(d)计算步骤(b)中在多个时间点测量的所述吸收与步骤(c)中相同时间点测量的所述吸收的比率；以及
(e)确定所述癌症患者将对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的可能性，其中在多个时间点步骤(d)中计算的比率超过2表明所述患者将可能起反应。
36.根据实施例35的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、 包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿 瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑 肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈 癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
37.根据实施例36的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
38.根据实施例35的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
39.根据实施例36的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
40.根据实施例35的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71的放射性标记形式。
41.根据实施例40的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
42.一种用于确定患有可成像肿瘤的癌症患者是否将可能对使用预定剂量的HSP90 抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90 的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后多个时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及
(c)基于步骤(b)中在所述多个时间点测量的所述吸收，针对所述HSP90抑制剂 的所述预定剂量，计算在所述多个时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中存在的所述 HSP90抑制剂的浓度；以及
(d)将步骤(c)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度与在所述多个时间点在所述肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的参考浓 度比较，
其中如果步骤(c)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度将等于或超过有效治疗所述肿瘤并且不会对所述患者有毒性所需的所述HSP90抑制剂的浓度，那么所述患者将可能 对使用所述预定剂量的所述HSP90抑制剂疗法起反应。
43.根据实施例40的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、 包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿 瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑 肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈 癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
44.根据实施例43的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
45.根据实施例42的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
46.根据实施例42的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71的放射性标记形式。
47.根据实施例46的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
48.一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对患有可成像肿瘤的特定癌症患者投予 的有效剂量和频率的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式 的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
(b)在步骤(a)中所述投予后多个时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及
(c)基于步骤(b)中在所述时间点测量的所述吸收，计算在所述多个时间点中的每一个维持所述肿瘤中有效治疗所述肿瘤的所述HSP抑制剂的浓度所需的投予剂量和 频率，由此确定使用所述HSP90抑制剂的疗法对所述癌症患者投予的有效剂量和频率。
49.根据实施例48的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、 包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿 瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑 肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈 癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
50.根据实施例49的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
51.根据实施例48的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
52.根据实施例48的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
53.根据实施例48的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71的放射性标记形式。
54.根据实施例53的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
55.一种用于确定癌症患者中可成像肿瘤中存在的HSP90抑制剂的浓度的方法，其包含以下步骤：
(a)向所述患者共投予预定量的所述HSP90抑制剂和预定量的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式，所述HSP90抑制剂优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的 肿瘤特异性形式；
(b)在步骤(a)中所述共投予后一个或一个以上预定时间点周期性地测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；以及
(c)基于步骤(b)中所述放射性标记的HSP90抑制剂的所述吸收的测量，确定在 任何所述时间点所述肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度。
56.根据实施例54的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、 包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿 瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑 肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈 癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
57.根据实施例56的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
58.根据实施例55的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
59.根据实施例55的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
60.根据实施例55的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71的放射性标记形式。
61.根据实施例60的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
62.一种用于确定癌症患者中可成像肿瘤对使用HSP90抑制剂的疗法的反应的方法，其包含以下步骤：
(a)在所述患者接收所述HSP90抑制剂作为疗法的时期内的多个时间点向所述患者 投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；以及
(b)在步骤(a)中所述投予后所述多个时间点测量所述患者的肿瘤中所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度；以及
(c)将步骤(b)中测量的所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度与有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的最小浓度比较，其中测量的浓度超过治疗所述肿瘤所需 的最小值表明所述患者可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
63.根据实施例62的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关：结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、 包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿 瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑 肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈 癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
64.根据实施例63的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
65.根据实施例62的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
66.根据实施例62的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
67.根据实施例62的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71的放射性标记形式。
68.根据实施例67的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
69.一种用于确定患者中存在的人类癌症是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起 反应的方法，其包含：
(a)获得含有来自所述患者的癌症的细胞的样品，所述细胞仅仅表达HSP90蛋白质或除HSP70蛋白质外还表达HSP90蛋白质；
(b)针对步骤(a)中获得的所述样品中存在的所述细胞，评估至少一个以下参数的存在：活化AKT通路、PTEN肿瘤抑制因子功能或表达的缺陷、活化STAT5通路或 Bcl-xL蛋白质表达；以及
(c)将步骤(b)中获得的所述评估与步骤(b)中评估的相同参数对于来自对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的一个或一个以上癌症患者的人类癌细胞的预定参考 评估比较，以便由此确定所述患者的癌症是否将可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起 反应。
70.根据实施例69的方法，其中所述人类癌症是乳癌。
71.根据实施例69的方法，其中所述癌细胞与急性骨髓白血病有关。
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<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND2 引物
<400> 1
gttgttctgg tccctttaat cg 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND2 引物
<400> 2
acctcgcata cccagaga 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYC 引物
<400> 3
atgcgttgct gggttatttt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYC 引物
<400> 4
cagagcgtgg gatgttagtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因间的控制区域引物
<400> 5
ccacctgagt ctgcaatgag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因间的控制区域引物
<400> 6
cagtctccag cctttgttcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYC 引物
<400> 7
agaagagcat cttccgcatc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYC 引物
<400> 8
cctttaaaca gtgcccaagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND2 引物
<400> 9
tgagctgctg gctaagatca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND2 引物
<400> 10
acggtactgc tgcaggctat 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL-XL 引物
<400> 11
cttttgtgga actctatggg aaca 24
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCL-XL 引物
<400> 12
cagcggttga agcgttcct 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCL1 引物
<400> 13
agaccttacg acgggttgg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCL1 引物
<400> 14
acattcctga tgccaccttc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1 引物
<400> 15
cctgtcctac taccgcctca 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCND1 引物
<400> 16
ggcttcgatc tgctcctg 18
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPRT 引物
<400> 17
cgtcttgctc gagatgtgat g 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPRT 引物
<400> 18
gcacacagag ggctacaatg tg 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH 引物
<400> 19
cgaccacttt gtcaagctca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH 引物
<400> 20
ccctgttgct gtagccaaat 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL13A 引物
<400> 21
tgagtgaaag ggagccagaa g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL13A 引物
<400> 22
cagatgcccc actcacaaga 20
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSP70A, 针对HSP70的活性序列
<400> 23
ggacgaguuu gagcacaag 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSP70B, 针对HSP70的活性序列
<400> 24
ccaagcagac gcagaucuu 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSP70C, 针对HSP70的活性序列
<400> 25
ggacgaguug uagcacaag 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CARM1 正向引物
<400> 26
tgatggccaa gtctgtcaag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CARM1 反向引物
<400> 27
tgaaagcaac gtcaaaccag 20

Claims (20)

1.一种化合物，其具有以下化学式：
Figure FDA0003420269700000011
或其医药学上可接受的盐，其中IX是选自123I、124I、125I、131I的放射性同位素。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中IX是124I。
3.一种放射性标记的HSP90抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于确定罹患神经变性疾病的患者是否将可能对使用所述放射性标记的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使含脑细胞的样品与所述放射性标记的HSP90抑制剂接触，所述放射性标记的HSP90抑制剂优先结合于所述患者的脑细胞中存在的HSP90的病原性形式；
(b)测量结合于所述样品中所述脑细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量；以及
(c)将步骤(b)中测量的结合于所述样品中所述脑细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量与参考量比较；
其中步骤(b)中测量的结合于所述脑细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述患者将可能对所述HSP90抑制剂起反应，其中所述标记的HSP90抑制剂是根据权利要求1所述的化合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述样品在活组织检查、细针抽吸或手术程序期间获得。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述样品包含活细胞、冷冻细胞、固定和渗透化细胞或福尔马林固定的石蜡包埋的细胞。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述方法进一步包括作为疗法向所述患者投予HSP90抑制剂的步骤，其中所述标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的标记形式。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述方法进一步包括作为疗法向所述患者投予HSP90抑制剂的步骤，其中所述标记的HSP90抑制剂不同于待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂。
8.根据权利要求3所述的用途，其中所述神经变性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、痴呆、脊髓性肌萎缩和延髓肌肉萎缩。
9.根据权利要求3所述的用途，其中所述神经变性疾病是τ病理学。
10.根据权利要求3所述的用途，其中所述神经变性疾病包括τ斑沉积。
11.根据权利要求3所述的用途，其中所述参考来自相同患者的未受疾病影响的组织。
12.根据权利要求3所述的用途，其中所述参考来自不是所述患者的健康个体的组织。
13.根据权利要求3所述的用途，其中所述参考来自健康个体的研究群体。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的用途，其中所述参考包括脑细胞。
15.一种放射性标记的HSP90抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于确定罹患神经变性疾病的患者是否将可能对使用所述放射性标记的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使具有神经变性疾病的患者的脑与所述放射性标记的HSP90抑制剂接触，所述放射性标记的HSP90抑制剂优先结合于所述脑中存在的HSP90的疾病特异性形式；
(b)在步骤(a)的所述接触之后具体时间点或多个时间点，测量被所述疾病特异性影响的所述患者的脑区域对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
(c)在步骤(a)的所述接触之后相同的多个时间点测量所述患者的预定健康组织对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
(d)计算步骤(b)中在多个时间点测量的所述吸收与步骤(c)中相同时间点测量的所述吸收的比率；以及
(e)确定所述患者将对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的可能性，其中在多个时间点步骤(d)中计算的比率超过2表明所述患者将可能起反应，其中所述标记的HSP90抑制剂是根据权利要求1所述的化合物。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述方法进一步包括作为疗法向所述患者投予HSP90抑制剂的步骤，其中所述标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的标记形式。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述方法进一步包括作为疗法向所述患者投予HSP90抑制剂的步骤，其中所述标记的HSP90抑制剂不同于待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述神经变性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、痴呆、脊髓性肌萎缩和延髓肌肉萎缩。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述神经变性疾病是τ病理学。
20.根据权利要求15所述的用途，其中所述神经变性疾病包括τ斑沉积。
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