JP2019194232A - 標識されたｈｓｐ９０阻害剤の使用 - Google Patents

標識されたｈｓｐ９０阻害剤の使用 Download PDF

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Abstract

【課題】癌患者の処置を改善する方法を提供すること【解決手段】本発明は腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するためのｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの方法を含む標識ＨＳＰ９０阻害剤を使用してＨＳＰ９０阻害剤を用いる癌患者処置を改善する様々な方法に関する。本開示は腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって（ａ）腫瘍又は腫瘍に由来する細胞を含有する試料を腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接触させる工程；（ｂ）腫瘍又は試料中の腫瘍細胞に結合した標識ＨＳＰ９０阻害剤の量を測定する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）で測定された腫瘍又は試料中の腫瘍細胞に結合した標識ＨＳＰ９０阻害剤の量を参照に結合した標識ＨＳＰ９０阻害剤の量と比較する工程を含む方法を提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１１年７月８日に出願された米国特許仮出願第６１／５０６，０１０号
の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益を主張し、その内容は全て、その全体が
参照によりここに組込まれる。
恒常性を維持するために、細胞は、明確に定義された機能を実行するようにプログラム
された数千ものタンパク質から構成される複雑な分子機構を用いる。タンパク質誤発現ま
たは突然変異による、これらの経路の脱調節は、悪性表現型を付与する生物学的利益をも
たらし得る。そのような脱調節は、細胞レベルでは有益であってよいが（すなわち、生存
率の増加に有利に働く）、分子レベルでは、細胞は、これらのタンパク質の安定性および
機能の維持にエネルギーをつぎ込む必要がある。これらのタンパク質を疑似安定状態に維
持するため、がん細胞はＨＳＰ９０などの分子シャペロンを選出する（co-opt）と考えら
れる32、33。
この仮説を支持すれば、ＨＳＰ９０は、形質転換された表現型の維持において重要な役
割を果たすと認識される32、33。ＨＳＰ９０およびその関連するコシャペロンは、「クラ
イアントタンパク質」と総称される細胞タンパク質の正確なコンフォメーション的折畳み
を援助し、その多くは細胞増殖、分化、ＤＮＡ損傷応答、および細胞生存を制御するシグ
ナル伝達経路のエフェクターである。かくして、脱調節したタンパク質への腫瘍細胞依存
（すなわち、突然変異、異常発現、不適切な細胞転移などによる）は、ＨＳＰ９０に非常
に依存するようになり得る33。
様々な形態のがんにおけるＨＳＰ９０療法の論拠は、標準的な療法に対して耐性である
疾患におけるものなどの前臨床および臨床試験によって現在では十分に支持されている91
〜97。例えば、ＨＳＰ９０阻害剤に対する特定のＨＥＲ２＋腫瘍の顕著な感受性が、試験
により示されている98、99。これらの腫瘍においては、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン
とも呼ばれる）および１７−ＤＭＡＧ（アルベスピマイシン）は、特に、トラスツズマブ
療法後に進行性疾患を有する患者において同等の応答を惹起した98。他のＨＳＰ９０阻害
剤、例えば、ＰＵ−Ｈ７１は、いくつかの三重陰性乳がんマウスモデルにおいて前臨床試
験を行った場合、この難治性乳がんサブタイプにおいて未だ報告されていない最も強力な
標的単剤抗腫瘍効果を送達した100。
これらのデータは、がんにおけるＨＳＰ９０阻害剤の使用を強く支持するが、現在のと
ころ、ＨＳＰ９０療法から利益を得る可能性が最も高い患者を同定する方法に関しては明
確なコンセンサスがない101、102。標的剤の開発成功のためには、薬剤を受容するべき患
者亜集団（すなわち、タルセバについてはＥＧＦＲ突然変異を有する腫瘍）を定義するこ
とが必須であることを知れば、これは特に問題が多い。そのような選択は、有効でない処
置を受けている患者数を減らし、後期段階の臨床試験において失敗する驚異的な数の標的
抗がん剤を減少させ得る。
さらに、ＨＳＰ９０標的阻害を非侵襲的に確認することができる臨床アッセイは存在し
ない。末梢血リンパ球の薬力学的モニタリングが、臨床試験におけるＨＳＰ９０阻害剤の
ｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性の容易に利用でき、再現可能な指標を提供したが、正常な組
織における薬剤の効果は、腫瘍特異的活性を予測しない97、101、102。薬力学的変化を測
定するための生検の賢明な使用は、依然として標的調節をアッセイするための重要な方法
であったが、この方法は、侵襲的アッセイと関連する論理的および倫理的問題のため依然
として制限されている。別の方法として、腫瘍ＨＥＲ２のレベルおよびＶＥＧＦレベルの
変化が、ＥＬＩＳＡ105による患者血清中のジルコニウム８９標識抗体103、104および可
溶性ＨＥＲ２細胞外ドメインレベルを用いて現在調査されているが、これらの試験はこれ
らのバイオマーカーを発現する乳房腫瘍のサブセットに限定される。
したがって、ＨＳＰ９０標的療法におけるバイオマーカーの強い必要性が存在する：多
くのがん患者は、新規の実験的療法で処置され、多くの場合、特定の薬剤の作用機構、異
なる疾患サブセットのための特定の処置の適切性における洞察は少なく、異なる悪性設定
における治療剤の最適用量およびスケジューリングにおける知識は少ない。その最終的な
結果は、治療手法が異なる臨床状況にとって最適である知識がなく、難治性悪性腫瘍を有
する患者が様々な新規薬剤を用いて処置される経験的臨床調査である。
ＨＳＰ９０は、発がん性形質転換に関与するタンパク質を安定化し、折畳むその重要な
役割のため、がんにおいて高度に求められる標的である。いくつかの異なるがんタンパク
質を分解し、複数のシグナリング経路に影響するその可能性を考慮して、ＨＳＰ９０阻害
剤（ＨＳＰ９０ｉ）は、様々ながんにおいて活性であると仮定されている。初期臨床試験
は、腫瘍サブセットにおけるこの手法の治療剤としての可能性を確認したが、がんおよび
患者集団がそのような処置に対して最も感受性が高いことを予測するバイオマーカーの発
見は困難であることがわかっている。そのような乏しい理解および十分な患者集団の選択
は、ゆっくり進行するか、または開発を継続することができないＨＳＰ９０がん治療剤の
多数の出現をもたらしてきた。したがって、応答集団を同定し、ＨＳＰ９０療法のための
コンパニオン診断アッセイを開発する即時的努力が緊急に必要である。
抗腫瘍効果を達成するのに必要とされる適切な用量およびスケジュールの設計もまた、
ＨＳＰ９０療法においては理解が乏しい。血漿薬物動態は一般に、治療剤の投与の設計に
関する有益なデータを提供し、血漿曲線下面積（ＡＵＣ）が全身薬剤曝露の測定基準であ
ることが多い。しかしながら、ＨＳＰ９０阻害剤については、血中ではなく、腫瘍組織中
での薬剤の濃度および保持期間が、その抗腫瘍効果を決定付ける106〜109。具体的には、
多くのＨＳＰ９０阻害剤は、血漿および正常組織からの迅速なクリアランスの非定型的な
薬物動態プロフィールを特徴とするが、腫瘍中では比較的長い（すなわち、投与後１２〜
４８時間を超える）薬剤保持性を示す。そのようなものとして、ＨＳＰ９０療法に対する
腫瘍応答の臨床的理解は、応答が腫瘍用量よりも注入用量と相関する場合に依然として厳
しく制限されている。血漿薬物動態の限界値および腫瘍応答のための腫瘍用量の重要性は
、ＨＳＰ９０阻害剤に関する腫瘍薬物動態のアッセイの臨床開発にとっての必要性を示唆
する。腫瘍ＨＳＰ９０の認証された、臨床的に実用的な非侵襲的アッセイは、治療剤の投
与を、代用定常状態血漿濃度よりもむしろ、定常状態の腫瘍薬剤濃度の達成に集中させる
ことができる。そのようなアッセイは、最大許容用量で、またはそれより下で、治療上有
効な腫瘍内濃度を達成することができるかどうかを示唆し得る。逆の場合、患者は、臨床
利益のない潜在的な薬剤毒性に曝露する必要をなくす代替的な処置を続行することができ
る。
ＨＳＰ９０療法に関連するこれらの制限を克服するために、本発明者らはここで、本発
明者らが最適な臨床実施、がんにおけるＨＳＰ９０阻害剤の開発および使用を容易にする
と提唱する非侵襲的アッセイを設計および開発する。
本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤を用いるがん患者の処置を改善するための標識されたＨＳ
Ｐ９０阻害剤の使用方法を提供する。
本開示は、ＨＳＰ９０発現のみによっては決定されないこの特定の「発がん性ＨＳＰ９
０」種の存在量が、ＨＳＰ９０阻害療法に対する感受性を予測し、かくして、ＨＳＰ９０
療法のためのバイオマーカーであることの証拠を提供する。本開示はまた、腫瘍中のこの
発がん性ＨＳＰ９０種の存在量の同定および測定がＨＳＰ９０療法に対する応答を予測す
ることの証拠も提供する。「発がん性ＨＳＰ９０」はここで、細胞ストレス特異的形態の
シャペロン複合体であり、腫瘍細胞の状況において拡張され、構成的に維持され、および
悪性表現型を維持するのに必要な機能を実行してもよいＨＳＰ９０画分と定義される。そ
のような役割は、過剰発現された（すなわち、ＨＥＲ２）、突然変異した（すなわち、ｍ
Ｂ−Ｒａｆ）またはキメラタンパク質（すなわち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ）の折畳みを調節する
ことだけでなく、異常に活性化されたシグナリング複合体（すなわち、ＳＴＡＴ５、ＢＣ
Ｌ６）に関与する分子の足場および複合体形成を容易にすることでもある。腫瘍はＨＳＰ
９０−がんタンパク質のネットワーク上での生存に依存するようになるが、これらのタン
パク質は機能および安定性のために「発がん性ＨＳＰ９０」に依存するようになる。この
共生的相互依存は、ＨＳＰ９０がんタンパク質への腫瘍の依存が「発がん性ＨＳＰ９０」
への依存と同等であることを示唆している。後者の存在量の測定は、最初の読出しであり
、したがって、本開示によれば、ＨＳＰ９０療法の富化のためのバイオマーカーである。
さらに、本発明者らは、ＨＳＰ９０が悪性細胞中で生化学的に異なる複合体を形成する
ことを示す。がん細胞ＨＳＰ９０の主要画分は、正常細胞と類似する「ハウスキーピング
」シャペロン機能を保持するが、がん細胞中で富化されたか、または拡張された機能的に
異なるＨＳＰ９０プール（すなわち、「発がん性ＨＳＰ９０」）は、腫瘍細胞生存、異常
な増殖特性ならびに侵襲性および転移性挙動を維持するのに必要とされる発がん性タンパ
ク質と特異的に相互作用する。
腫瘍それぞれの様式で「発がん性ＨＳＰ９０」の存在量を測定するために、本発明は、
化学的手段も提供する。そのような手段は、蛍光標識された、およびＡＮＣＡ標識された
ＨＳＰ９０阻害剤、ビオチン化されたＨＳＰ９０阻害剤ならびにこの腫瘍「発がん性ＨＳ
Ｐ９０」種を特異的に同定し、それと相互作用する放射標識された阻害剤を含み、例えば
、血液悪性腫瘍、固形腫瘍および液性腫瘍における、様々な種類の腫瘍、腫瘍細胞、腫瘍
支援細胞および腫瘍関連生物学的構造中の「発がん性ＨＳＰ９０」種の存在量を測定し、
かくして、ＨＳＰ９０阻害療法に対する感受性を測定および予測するのが容易になる。こ
れらのものは、限定されるものではないが、固形または液性腫瘍中のがん細胞、がん幹細
胞、循環腫瘍細胞、腫瘍支援免疫細胞、エキソソームおよび腫瘍支援前駆細胞の形態にあ
ってもよい。
一側面において、本開示は、腫瘍がＨＳＰ阻害剤を用いる療法に応答する可能性がある
かどうかを決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細胞中に存在
する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻
害剤と接触させるステップ；
（ｂ）腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定
するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識された
ＨＳＰ９０阻害剤の量を、参照に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量と比較するス
テップを含み、ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識されたＨ
ＳＰ９０阻害剤の量が参照量と比較してより多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答す
る可能性があることを示す方法を提供する。
一態様において、参照は腫瘍を有する同じ患者の細胞に由来するものである。参照は、
がん患者に由来する正常細胞であってもよい。例えば、正常細胞は、血液腫瘍を有する患
者に由来するリンパ球、循環腫瘍細胞を有する患者に由来する白血球または固形腫瘍の周
囲の正常組織であってもよい。別の態様において、参照は、発がん性ＨＳＰ９０の発現が
ほとんどないか全くないがん患者に由来する腫瘍細胞または別の細胞である。別の態様に
おいて、参照は、腫瘍を有する患者とは異なる患者の細胞に由来する。例えば、参照は、
健康な個体の細胞または測定しようとする腫瘍を有する患者以外のがん患者に由来する発
がん性ＨＳＰ９０の発現がほとんどないか全くない細胞に由来するものであってもよい。
一側面において、本開示は、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性が
あるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細胞中に存在
する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する第一の検出可能に標識されたＨＳＰ
９０阻害剤および腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に最小限に結合するか、または全く結合し
ない第二の検出可能に標識された阻害剤と接触させるステップ；
（ｂ）腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した第一の標識された阻害剤および第二の標
識された阻害剤の量を測定するステップ；ならびに
（ｃ）腫瘍または腫瘍細胞に結合した第一の標識された阻害剤の量を、腫瘍または腫瘍
細胞に結合した第二の標識された阻害剤の量と比較するステップを含み、腫瘍または腫瘍
細胞に結合した第一の標識された阻害剤の量が、腫瘍または腫瘍細胞に結合した第二の標
識された阻害剤と比較してより多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があ
ることを示す方法を提供する。
一態様において、標識されたＨＳＰ９０阻害剤は、細胞透過性であり、「発がん性ＨＳ
Ｐ９０」に選択的に結合する蛍光標識されたか、またはＡＮＣＡ標識された阻害剤である
。例えば、固形または液性腫瘍、がん幹細胞、循環腫瘍細胞、腫瘍支援免疫細胞、エキソ
ソームおよび腫瘍支援前駆細胞において見出されるか、またはそれから単離されるがん細
胞のフローサイトメトリーにおける、およびその分析のための使用、ならびにいくつかの
介入方法、例えば、生検、手術および微細針吸引生検により得られた試料の組織染色にお
ける使用のために最適化された、様々な蛍光標識された、およびＡＮＣＡ標識された型の
ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１が提供される。
１つのそのような態様において、本発明者らは、蛍光標識された阻害剤、例えば、ＰＵ
−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（第５．２．１．１．節）を用いて、生検および外科的標本などの
供給源から得られた組織における「発がん性ＨＳＰ９０」の存在量を測定することができ
ることを示す。別の態様において、本発明者らは、蛍光標識された阻害剤、例えば、ＰＵ
−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２を用いて、確立されたがん細胞系または一次がん細胞中の「発がん
性ＨＳＰ９０」の存在量を測定することができることを示す。さらに別の態様において、
本発明者らは、蛍光標識された阻害剤を用いて、腫瘍などのがん標本から単離された細胞
、がん幹細胞、循環腫瘍細胞および微細針吸引生検から得られたがん細胞中の「発がん性
ＨＳＰ９０」の存在量を測定することができることを示す。さらに他の態様において、本
発明者らは、他の蛍光標識された、ＡＮＣＡ標識およびビオチン化されたＨＳＰ９０阻害
剤が上記測定を実施するのにも有用であることを示す。
別の態様において、標識されたＨＳＰ９０阻害剤は、「発がん性ＨＳＰ９０」に選択的
に結合する放射標識された阻害剤である。例えば、様々な型の放射標識されたＰＵ−Ｈ７
１がＰＥＴ画像化のために最適化されている。特定の態様においては、ヨウ素１２４で放
射標識された型のＰＵ−Ｈ７１は、固形および液性腫瘍のＰＥＴ画像化のためのものであ
る。放射標識された阻害剤を用いて、限定されるものではないが、結腸直腸がん、膵臓が
ん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細
胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、
食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む
脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、白血病
、骨髄腫、骨髄増殖性新生物ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含む
婦人科がんなどのいくつかの種類の原発性および転移性がんを画像化することができる。
本開示は、限定されるものではないが、上記で列挙された腫瘍などの固形腫瘍および限
定されるものではないが、リンパ腫、白血病、骨髄腫および骨髄増殖性新生物と関連する
ものなどの液性腫瘍における「発がん性ＨＳＰ９０」の存在量を腫瘍それぞれの様式で測
定する手段をさらに提供する。一態様において、本発明は、「発がん性ＨＳＰ９０」と特
異的に相互作用するヨウ素１２４標識されたＨＳＰ９０阻害剤の使用により、固形腫瘍お
よび液性腫瘍において、非侵襲的にＰＥＴ画像化を使用し、患者における「発がん性ＨＳ
Ｐ９０」を定量することができることを示す。
一側面において、本開示は、血液のがん（例えば、白血病）などの血液悪性腫瘍を有す
る患者がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するため
の方法であって、患者に由来するがん細胞および参照非がん細胞を含有する試料を、患者
のがん細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する細胞透過性の蛍
光標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接触させること、試料中のがん細胞および非がん細胞に
結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定すること、ならびにがん細胞に結合
した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を、非がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳ
Ｐ９０阻害剤の量と比較することを含み、非がん細胞よりもがん細胞に結合した蛍光標識
されたＨＳＰ９０阻害剤の量が多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があ
ることを示す方法を提供する。
１つのそのような態様においては、参照正常細胞は、がん細胞と同じ患者に由来するも
のである正常細胞（例えば、リンパ球）である。別の態様においては、参照非がん細胞は
、がん患者とは異なる患者から得られるものである。
別の側面において、本開示は、固形腫瘍を有する患者がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法
に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、患者に由来するがん細
胞および非がん細胞（例えば、標本中の周囲の間質、良性細胞または他の種類の正常細胞
）を含有する、例えば、生検、手術、微細針吸引生検または他の介入手順から得られた試
料を、患者のがん細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する細胞
透過性の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接触させること、試料中のがん細胞および非
がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定すること、ならびにがん
細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を、非がん細胞に結合した蛍光標識
されたＨＳＰ９０阻害剤の量と比較することを含み、非がん細胞よりもがん細胞に結合し
た蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答する
可能性があることを示す方法を提供する。
本開示はまた、固形腫瘍を有する患者がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能
性があるかどうかを決定するための方法であって、患者に由来する循環がん細胞および非
がん細胞（例えば、白血球）を含有する試料を、患者のがん細胞中に存在する腫瘍特異的
形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する細胞透過性の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接
触させること、試料中のがん細胞および非がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０
阻害剤の量を測定すること、ならびにがん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害
剤の量を、非がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量と比較することを
含み、非がん細胞よりもがん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が多い
場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
代替的な態様において、参照非がん細胞は、腫瘍を有する患者以外の患者から得られた
ものである。
別の側面において、本開示は、ＨＳＰ９０阻害療法に対して感受性である患者を決定す
るために放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を使用するための方法を提供する。
１つのそのような態様において、本開示は、画像化できる腫瘍を有するがん患者がＨＳ
Ｐ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であ
って、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０
に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の１つ以上の時点での患者の腫瘍による放射標識
されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）における投与後の前記１つ以上の時点での患者の所定の健康な組
織または血液による放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）における１つまたは複数の時点で測定された取込みと、ステップ
（ｃ）における同じ時点で測定された取込みとの比を算出するステップ；ならびに
（ｅ）がん患者がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性を決定するステッ
プを含み、１つまたは複数の時点でステップ（ｄ）において算出された比が２を超える場
合、患者が応答する可能性があることを示す方法を提供する。
別の態様において、本開示は、画像化できる腫瘍を有するがん患者がＨＳＰ９０の阻害
剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０
に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与の４時間後の１つ以上の時点で患者の腫瘍による放
射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップを含み、腫瘍の周囲の健康な
組織中での取込みと比較した前記１つ以上の時点での阻害剤の取込みが、患者がＨＳＰ９
０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、画像化できる腫瘍がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる
療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０
に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の投与後２時間以上の
１つ以上の時点で、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中の放射標識された阻害剤の取込みをＰ
ＥＴにより視覚的に検査するステップ、
（ｃ）前記１つ以上の時点で、ステップ（ｂ）で得られたＰＥＴ画像を、腫瘍の周囲の
健康な組織において得られたＰＥＴ画像と比較するステップを含み、前記１つ以上の時点
での腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中のＰＥＴ画像における明るい領域の存在が、患者がＨ
ＳＰ９０阻害療法に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、発がん性ＨＳＰ９０を発現する腫瘍を有する特定
のがん患者が、規定用量のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかど
うかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０
に優先的に結合する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の１つ以上の時点で患者の腫瘍による放射標識さ
れた形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）規定用量のＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｂ）における前記１つ以上の
時点で測定された取込みに基づいて、前記１つ以上の時点のそれぞれにおいて患者の腫瘍
中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を算出するステップ；ならびに
（ｄ）腫瘍の処置において有効であるＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｃ）で算
出されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を、前記１つ以上の時点で腫瘍中に存在する必要がある
ＨＳＰ９０阻害剤の参照濃度と比較するステップを含み、ステップ（ｃ）で算出されたＨ
ＳＰ９０阻害剤の濃度が、腫瘍を有効に処置するのに必要とされるＨＳＰ９０阻害剤の濃
度と等しいか、またはそれを超える場合、患者が規定用量のＨＳＰ９０阻害剤を用いる療
法に応答する可能性がある方法を提供する。
別の側面において、本発明者らは、放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を用いて、ＨＳＰ
９０阻害剤の有効用量および投与スケジュールを決定することができることを示す。
１つのそのような態様において、本開示は、発がん性ＨＳＰ９０を発現する腫瘍を有す
る特定のがん患者が、規定用量のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があ
るかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０
に優先的に結合する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の１つ以上の時点で患者の腫瘍による放射標識さ
れた形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）規定用量のＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｂ）における前記１つ以上の
時点で測定された取込みに基づいて、前記１つ以上の時点のそれぞれにおいて患者の腫瘍
中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を算出するステップ；ならびに
（ｄ）腫瘍の処置において有効であるＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｃ）で算
出されたＨＳＰ９０阻害剤への腫瘍の曝露を、前記１つ以上の時点で腫瘍中に存在する必
要があるＨＳＰ９０阻害剤への参照曝露と比較するステップを含み、ステップ（ｃ）で算
出されたＨＳＰ９０阻害剤への腫瘍曝露が、腫瘍を有効に処置するのに必要とされるＨＳ
Ｐ９０阻害剤への腫瘍曝露と等しいか、またはそれを超える場合、患者が規定用量のＨＳ
Ｐ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性がある方法を提供する。
さらなる態様は、画像化できる腫瘍を有する特定のがん患者について、ＨＳＰ９０の阻
害剤を用いる療法に関する有効用量および投与頻度を決定するための方法；がん患者にお
いて画像化できる腫瘍中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を決定するための方法；なら
びにがん患者における腫瘍のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に対する応答性を決定また
はモニタリングするための方法を含む。
さらに別の態様において、本開示は、発がん性ＨＳＰ９０を発現する腫瘍を有する特定
のがん患者について、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に関する有効用量および投与頻度
を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的
に結合する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の１つ以上の時点で患者の腫瘍による放射標識さ
れた形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記１つ以上の時点で測定された取込みに基づいて、前
記１つ以上の時点のそれぞれにおいて、腫瘍を処置するのに有効であるＨＳＰ９０阻害剤
の濃度を腫瘍中で維持するのに必要とされる用量および投与頻度を算出し、それによって
、がん患者について、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に関する有効用量および投与頻度
を決定するステップを含む方法を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、発がん性ＨＳＰ９０を発現する腫瘍を有する特定
のがん患者について、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に関する有効用量および投与頻度
を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的
に結合する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の１つ以上の時点での患者の腫瘍による放射標識
された形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）で前記１つ以上の時点で測定された取込みに基づいて、処置期間
にわたって、腫瘍を処置するのに有効であるＨＳＰ９０阻害剤の平均腫瘍内濃度を腫瘍中
で維持するのに必要とされる用量および投与頻度を算出し、それによって、がん患者につ
いて、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に関する有効用量および投与頻度を決定するステ
ップを含む方法を提供する。
さらなる側面において、本開示は、がん患者において発がん性ＨＳＰ９０を発現する腫
瘍中に存在するＨＳＰ９０の濃度を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、所定量のＨＳＰ９０阻害剤と、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特
異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する、ある量の放射標識された形態のＨＳＰ９０阻
害剤とを同時投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における同時投与後の１つ以上の時点での患者の腫瘍による放射
標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを定期的に測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みの測定値に基づいて
、任意のそのような時点で腫瘍中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を決定するステップ
を含む方法を提供する。
さらに別の側面において、本開示は、がん患者において発がん性ＨＳＰ９０を発現する
腫瘍のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に対する応答性を決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合す
る放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を、患者が療法としてＨＳＰ９０の阻害剤を受
けている期間内の１つ以上の時点で患者に投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の前記１つ以上の時点で、患者の腫瘍中の放射標
識されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を、腫瘍を
有効に処置するのに必要とされるＨＳＰ９０阻害剤の最小濃度と比較するステップを含み
、腫瘍を処置するのに必要とされる最小濃度よりも測定された濃度が高い場合、患者がＨ
ＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
別の側面において、本開示は、神経変性疾患に罹患する患者がＨＳＰ９０阻害剤を用い
る療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）脳を、患者の脳細胞中に存在する病原性形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する放
射標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接触させるステップ；
（ｂ）試料中の脳細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定するステップ
；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された試料中の脳細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻
害剤の量を、参照量と比較するステップを含み、ステップ（ｂ）で測定された脳細胞に結
合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が参照量と比較して多い場合、患者がＨＳＰ９０
阻害剤に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
別の側面において、本開示は、ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１を用いてＨＳＰ９０依存
的がんを処置する方法を提供する。特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１の特異的腫瘍曝
露を達成するためにＨＳＰ９０依存的がんを処置する方法が提供される。他の態様におい
ては、ＰＵ−Ｈ７１の新規投与レジメンが提供される。
別の側面において、本開示は、患者中に存在するヒトがんがＨＳＰ９０阻害剤を用いる
療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）ＨＳＰ９０タンパク質を単独で、またはそれに加えてＨＳＰ７０タンパク質を発
現する、患者のがんに由来する細胞を含有する試料を取得するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた試料中に存在する細胞について、以下のパラメータ：
活性化されたＡＫＴ経路、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の機能もしくは発現における欠陥、活性
化されたＳＴＡＴ５経路、またはＢｃｌ−ｘＬタンパク質発現のうちの少なくとも１つの
存在を評価するステップ；および
（ｃ）ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答した１人以上のがん患者に由来するヒトが
ん細胞について、ステップ（ｂ）で得られた評価を、ステップ（ｂ）で評価された同じパ
ラメータまたは複数のパラメータの所定の参照評価と比較して、それにより患者のがんが
ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するステップを含
む方法を提供する。
一態様において、この特定の方法の使用のために現在相当興味深いヒトがんは、乳がん
、膵臓がんおよび急性骨髄性白血病である。
それぞれのパラメータを評価する方法は、当業界で周知であり、容易に利用可能である
。しかしながら、これらの特定のパラメータの１つ以上と、ＨＳＰ９０阻害剤の効果の予
測との相関は以前には示されていない。理論的には、当業者が任意の所与のＨＳＰ９０阻
害剤の効果を予測できるためには、単一のパラメータで十分であってよいが、効果の妥当
な予測を行うためには、これらのパラメータのうちの少なくとも２つ、おそらくは少なく
とも３つ以上またはさらには全部を考慮に入れる必要がある。
ＰＵ−Ｈ７１は、がん細胞中により豊富であるＨＳＰ９０の限られた画分と優先的に相互作用する。（ａ）抗ＨＳＰ９０抗体であるＨ９０１０を用いる連続免疫精製ステップは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物中のＨＳＰ９０を枯渇させる。溶解物＝対照細胞抽出物。（ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８抽出物に由来するＨＳＰ９０を、連続化学精製および免疫精製ステップにより単離した。各プール中のＨＳＰ９０の量を密度測定により定量し、値を内部標準に対して正規化した。（ｃ）示された細胞中で131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１を用いて飽和試験を行った。全ての単離された細胞試料を計数し、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の特異的取込みを決定した。これらのデータを、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の濃度に対してプロットして、飽和結合曲線を得た。４つの別々の反復物の代表的なデータを提示する（下側）。示された細胞中でのＨＳＰ９０の発現を、ウェスタンブロットにより分析した（上側）。（ｄ）一次ＡＭＬおよびＣＭＬ、ＣＤ３４＋臍帯血細胞（ＣＢ）、またはＫ５６２細胞を、示された用量のＰＵ−Ｈ７１で２４時間、予備処理した。処理後の細胞を、１μＭのＰＵ−ＦＩＴＣで処理した。細胞へのＰＵ−ＦＩＴＣの結合をフローサイトメトリーにより評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表す。ＴＥＧ−ＦＩＴＣを、非特異的結合対照として示す。ＣＤ４５対ＳＳＣゲーティングを用いて、一次標本に由来する芽球またはリンパ球への結合を区別した。（ｅ）示された用量のＰＵ−Ｈ７１での処理後の一次ＡＭＬおよびＣＭＬ、ＣＤ３４＋ＣＢまたはＫ５６２細胞に関する未処理対照と比較した生存率（％）。処理の９６時間後にアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色により、細胞生存を評価した。データを、平均±ＳＥ（ｎ＝３）として提示する。 ＰＵ−Ｈ７１は、ＨＳＰ９０に対して選択的であり、がんタンパク質およびコシャペロンとの複合体中でＨＳＰ９０を単離する。（ａ）Ｋ５６２抽出物中のＨＳＰ９０複合体を、Ｈ９０１０、非特異的ＩｇＧを用いる沈降により、またはＰＵ−Ｈ７１もしくは対照ビーズにより単離した。対照ビーズは、エタノールアミン、ＨＳＰ９０−不活性分子を含有する。プルダウン中のタンパク質を、ウェスタンブロットにより分析した。（ｂ、ｃ）示される通り、単一または連続免疫および化学沈降を、示された頻度および示された順序でＨ９０１０およびＰＵ−ビーズを用いてＫ５６２抽出物中で行った。プルダウン中および残りの上清中のタンパク質を、ＷＢにより分析した。ＮＳ＝非特異的。（ｄ）Ｋ５６２細胞を、ビヒクル（−）またはＰＵ−Ｈ７１（＋）で２４時間処理し、タンパク質をウェスタンブロットにより分析した。（ｅ）Ｈｓｐ７０ノックダウン細胞中でのタンパク質の発現を、ウェスタンブロット（左側）により分析し、タンパク質レベルの変化を相対発光単位（ＲＬＵ）で提示した（右側）。対照＝スクランブルｓｉＲＮＡ。（ｆ）示される通り、連続化学沈降を、示された頻度および示された順序でＧＭ−、ＳＮＸ−およびＮＶＰ−ビーズを用いてＫ５６２抽出物中で行った。プルダウン中および残りの上清中のタンパク質を、ウェスタンブロットにより分析した。（ｇ）Ｋ５６２細胞中のＨＳＰ９０は、異常なＢｃｒ−Ａｂｌと、正常なｃ−Ａｂｌタンパク質の両方との複合体中に存在する。Ｈ９０１０ではなく、ＰＵ−Ｈ７１は、結合したＢｃｒ−Ａｂｌがんタンパク質であるＨＳＰ９０集団を選択する。 （ａ、ｂ）乳がんおよびＣＭＬ細胞抽出物（１２０μｇ）に由来するＨＳＰ９０を、示された通り、連続化学精製および免疫精製ステップを介して単離した。上清を単離して、使い残しのＨＳＰ９０を分析した。各画分中のＨＳＰ９０を、ウェスタンブロットにより分析した。溶解物＝内因性タンパク質内容物；ＰＵ−、ＧＭ−および対照ビーズは、特定のビーズ上で単離されたタンパク質を示す。Ｈ９０１０およびＩｇＧは、特定のＡｂにより単離されたタンパク質を示す。対照ビーズは、ＨＳＰ９０不活性分子を含有する。データは複数の反復実験から得られたものと一致する（ｎ≧２）。（ｃ）ＰＥコンジュゲート化抗体対ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣのＨＳＰ９０結合。ＰＵ−Ｈ７１により単離された全細胞性ＨＳＰ９０の％を、データバーの上に各細胞系について示す。（ｄ）末梢血白血球（ＰＢＬ）抽出物（２５０μｇ）中で連続化学精製および免疫精製ステップを実施して、ＰＵ−Ｈ７１およびＨ９０１０特異的ＨＳＰ９０種を単離した。全試料をウェスタンブロットにより分析した（上側）。ＰＢＬ中でのＨＳＰ９０の結合を、ＨＳＰ９０−ＰＥ抗体およびＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣを用いるフローサイトメトリーにより評価した。ＦＩＴＣ−ＴＥＧ＝非特異的結合に関する対照（下側）。（ｅ）ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ（１μＭ）のＨＳＰ９０への結合に関する相関および１４種の白血病細胞系のパネルにおけるＰＵ−Ｈ７１を用いる処理後の生存率（％）：Ｋａｓｕｍｉ−１、Ｋａｓｕｍｉ−４、ＫＣＬ−２２、ＲＥＨ、ＴＦ−１、ＫＧ−１、ＨＬ−６０、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、Ｋ５６２、ＭＯＬＭ−１３、ＴＵＲ、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７およびＭＶ４−１１。これらの細胞中の総ＨＳＰ９０レベルは、ウェスタンブロットにより示される通り、類似する（示さず）。 （ａ）フローサイトメトリードットプロットは、芽球（ＣＤ４５ｄｉｍ、赤丸）および非悪性リンパ球（青丸）を区別するための一次慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）試料に用いられるゲーティング戦略を示す。（ｂ）ＣＭＬ芽球と、（ａ）に示された一次ＣＭＬ患者試料に由来する正常リンパ球とのＨＳＰ９０へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合に関する比。（ｃ）示された時点および用量のＰＵ−Ｈ７１を用いる処理後の（ａ）に示された一次ＣＭＬ試料の未処理対照と比較したＣＭＬ芽球（赤色）または正常リンパ球（青色）の生存率（％）。 （ｄ）フローサイトメトリードットプロットは、芽球（ＣＤ４５ｄｉｍ、赤丸）と非悪性リンパ球（青丸）を区別するため、および芽球ゲート（ＣＤ４５ｄｉｍ、赤丸）内のＣＤ３４＋細胞（赤四角）の結合を分析するための、一次慢性期ＣＭＬ（ｃｐＣＭＬ）試料に用いられるゲーティング戦略を示す。ＣＤ４５とＳＳＣのドットプロットに、７−ＡＡＤ識別に基づいて生細胞上で予めゲートをかけた。（ｅ）慢性期ＣＭＬ（ｃｐＣＭＬ）ＣＤ３４＋細胞と正常リンパ球におけるＨＳＰ９０へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合に関する比。（ｆ）１μＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣまたはＴＥＧ−ＦＩＴＣで４８時間処理した後の未処理対照と比較したｃｐＣＭＬ ＣＤ３４＋細胞（赤色）および正常リンパ球（青色）の生存率（％）。（ｇ）ＣＤ３４＋細胞と正常臍帯血に由来するリンパ球、慢性期ＣＭＬ（ｃｐＣＭＬ）と急性転化期（ｂｐＣＭＬ）細胞におけるＨｓｐ９０へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合に関する比（ｎ＝５）。（ｈ）未処理対照と比較した、ＰＵ−Ｈ７１（１μＭ）の芽球および慢性ＣＭＬ ＣＤ３４＋細胞と、正常ＣＤ３４＋細胞（臍帯血由来；ＣＢ）を用いる４８時間の処理後の生存率（％）。パネルｃ、ｆおよびｈにおける細胞生存は、アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色により評価されたものである。データを平均±ＳＥ（ｎ＝３）として提示する。 （ａ）正常細胞内では、その適切な細胞内コンパートメント（「ハウスキーピング複合体」）に細胞タンパク質を折畳み、移行させるその進化的に保存されたハウスキーピング機能にとって、ＨＳＰ９０の構成的発現が必要である。悪性形質転換の際に、細胞タンパク質は、突然変異、活動過剰、不正確な細胞内コンパートメント中での保持または他の手段により無秩序になる。これらの機能的に変化したタンパク質の存在は、悪性表現型を開始させ、維持するのに必要であり、ストレスで修飾されたＨＳＰ９０のサブセット（「発がん性複合体」）により特異的に維持されるのはこれらの発がん性タンパク質である。ＰＵ−Ｈ７１は、発がん性タンパク質にシャペロン作用するＨＳＰ９０の画分（「発がん性複合体」）に特異的に結合する。（ｂ）ＨＳＰ９０およびその相互作用シャペロンを、ＰＵ−および対照ビーズ、ならびにＨ９０１０およびＩｇＧ−固定Ａｂを用いてＫ５６２細胞抽出物中で単離した。対照ビーズは、ＨＳＰ９０不活性分子を含有する。（ｃ）Ｋ５６２細胞抽出物に由来するＨＳＰ９０を、Ｈ９０１０ ＨＳＰ９０特異的抗体を用いる３つの連続免疫精製ステップにより単離した。残りの上清を単離して、使い残しのタンパク質を分析した。各画分中のタンパク質を、ウェスタンブロットにより分析した。溶解物＝内因性タンパク質内容物。データは、複数の反復実験（ｎ≧２）から得られたものと一致する。 ＧＭおよびＰＵ−Ｈ７１は異常タンパク質／ＨＳＰ９０種に対して選択的である。（ａ）一定容量のＰＵ−Ｈ７１ビーズ（８０μＬ）を示された量のＫ５６２細胞溶解物でプロービングする実験（左側）、または一定量の溶解物（１ｍｇ）を示された容量のＰＵ−Ｈ７１ビーズでプロービングする実験（右側）において、Ｂｃｒ−ＡｂｌおよびＡｂｌ結合ＨＳＰ９０種をモニタリングした。（ｂ）（左側）ＰＵ−およびＧＭ−ビーズ（８０μＬ）は、ＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞抽出物（３００μｇ）中のＨＳＰ９０突然変異Ｂ−Ｒａｆ複合体を認識するが、正常な結腸線維芽細胞ＣＣＤ１８Ｃｏ抽出物（３００μｇ）中に見出されるＨＳＰ９０−ＷＴ Ｂ−Ｒａｆ複合体と相互作用することができない。Ｈ９０１０ ＨＳＰ９０ Ａｂは、両方のＨＳＰ９０種を認識する。（ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物（３００μｇ）中で、ＰＵ−およびＧＭ−ビーズ（８０μｌ）はＨＥＲ３およびＲａｆ−１キナーゼと相互作用するが、非発がん性チロシンタンパク質キナーゼＣＳＫ、ｃ−Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼ、およびｐ３８とは相互作用しない。（ｄ）（右側）ＰＵ−ビーズ（８０μＬ）はｖ−Ｓｒｃ／ＨＳＰ９０と相互作用するが、ｃ−Ｓｒｃ／ＨＳＰ９０種とは相互作用しない。ｃ−Ｓｒｃの検出を容易にするために、ｖ−Ｓｒｃ形質転換３Ｔ３細胞（２５０μｇ）と比較した場合、ｖ−Ｓｒｃよりも低い存在量のタンパク質、より多量のｃ−Ｓｒｃ発現３Ｔ３細胞溶解物（１，０００μｇ）を使用し、３Ｔ３細胞中で検出されるより高いＨＳＰ９０レベルに関する説明を提供する（溶解物、３Ｔ３線維芽細胞対ｖ−Ｓｒｃ ３Ｔ３線維芽細胞）。溶解物＝内因性タンパク質内容物；ＰＵ−、ＧＭ−および対照ビーズは、特定のビーズ上で単離されたタンパク質を示す。ＨＳＰ９０ ＡｂおよびＩｇＧは、特定のＡｂにより単離されたタンパク質を示す。対照ビーズは、ＨＳＰ９０不活性分子を含有する。データは、複数の反復実験（ｎ≧２）から得られたものと一致する。 Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現ＣＭＬ細胞系（ａ）および一次ＣＭＬ細胞抽出物（ｂ）中で、ＰＵ−および対照ビーズを用いて単一化学沈降を行った。プルダウン中のタンパク質を、ウェスタンブロットにより分析した。いくつかのＢｃｒ−Ａｂｌ切断産物を、報告90のように一次ＣＭＬ試料中に注記する。Ｎ／Ａ＝利用不可。 いくつかのＨＳＰ９０阻害剤の構造。 ＰＵ−Ｈ７１にコンジュゲートしたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、４−ニトロベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール（ＮＢＤ）または赤色シフト染料スルホローダミン１０１（テキサスレッド）のいずれかを含有する合成された熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）のための蛍光リガンド。 示された反応スキームのための試薬および条件：（ａ）ＦＩＴＣ、Ｅｔ3Ｎ、ＤＭＦ、ｒｔ、１２時間、４０％；（ｂ）テキサスレッドスルホニルクロリド、ＤＭＦ、０〜１０℃、１２時間、６１％；（ｃ）ＤＭＦ、ｒｔ、２０時間、４７％。 示された反応スキームのための試薬および条件：（ａ）ＦＩＴＣ、Ｅｔ3Ｎ、ＤＭＦ、ｒｔ、５時間、７２％；（ｂ）ＮＢＤ−Ｃｌ、Ｅｔ3Ｎ、ＤＭＦ、ｒｔ、１２時間、４０％。 示された反応スキームのための試薬および条件：（ａ）Ｎ−（３−ブロモプロピル）−フタルイミド、Ｃｓ2ＣＯ3、ＤＭＦ、ｒｔ、３４％；（ｂ）ヒドラジン水和物、ＭｅＯＨ、ＣＨ2Ｃｌ2、ｒｔ、６４％；（ｃ）ＦＩＴＣ、Ｅｔ3Ｎ、ＤＭＦ、ｒｔ、１２時間、７４％；（ｄ）ＮＢＤ−Ｃｌ、Ｅｔ3Ｎ、ＤＭＦ、ｒｔ、１２時間、４２％。 （Ａ）ＭＯＬＭ−１３細胞を、３７℃で４時間、示されたＰＵ−Ｈ７１蛍光誘導体（１μＭ）で処理し、生細胞（ＤＡＰＩ陰性）への結合をフローサイトメトリーにより測定した。結合の程度を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示す。（Ｂ）ＭＯＬＭ−１３細胞を、３７℃で２４時間、示されたＰＵ−Ｈ７１蛍光誘導体（１μＭ）で処理した。それらの生存をＤＡＰＩ排除により決定した。（Ｃ）ＭＯＬＭ−１３細胞を、示されたＰＵ−Ｈ７１蛍光誘導体（１μＭ）で２４時間処理した。定常状態レベルのＨＳＰ９０クライアントタンパク質ｍＦＬＴ３およびＲａｆ−１を、ウェスタンブロットにより分析した。β−アクチンを用いて、等しいタンパク質負荷について正規化した。 （Ａ）ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２で染色した白血病細胞の共焦点蛍光顕微鏡観察は、顕著な細胞内局在化を示す。 （Ｂ）一次急性骨髄性白血病試料を、示された用量のＰＵ−Ｈ７１またはビヒクル（未処理）で２４時間予備処理した。処理後の細胞を、１μＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２またはＴＥＧ−ＦＩＴＣで処理した。細胞へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２およびＴＥＧ−ＦＩＴＣの結合をフローサイトメトリーにより評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表す。ＴＥＧ−ＦＩＴＣを非特異的結合対照として示す。ＣＤ４５対ＳＳＣゲーティングを用いて、一次標本に由来する芽球（悪性細胞）またはリンパ球（正常細胞）への結合を区別した。 正常細胞（左側）および乳がん細胞（右側）におけるＰＵ−ＡＮＣＡの蛍光放出スペクトル。乳がん細胞のスペクトル放出プロフィールは約５３０ｎｍの波長での蛍光放出ピークをもたらし、結合したＰＵ−Ｈ７１−ＡＮＣＡの代表的な蛍光放出であった。 （ａ）臍帯血およびＣＭＬ芽球と、健康なドナー（臍帯血）ならびに慢性および急性転化期ＣＭＬ患者（それぞれ、ｃｐＣＭＬおよびｂｐＣＭＬ）に由来する正常リンパ球とにおける、ＨＳＰ９０へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合に関する比。健康な患者に由来する臍帯血への有意な結合はなく、疾患進行と相関するＣＭＬ中の結合が増加することに留意されたい。（ｂ）未処理対照と比較した、急性転化期および慢性期ＣＭＬ ＣＤ３４＋細胞、ならびに正常ＣＤ３４＋細胞（臍帯血由来；ＣＢ）のＰＵ−Ｈ７１（１μＭ）を用いる処理の４８時間後の生存率（％）。細胞生存を、アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色により評価した。データを、平均±ＳＥ（ｎ＝３）として提示する。（ｃ）１９個の一次ＡＭＬ患者試料セットにおける、ＨＳＰ９０へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＦ（１μＭ）の結合と、５００ｎＭのＰＵ−Ｈ７１で４８時間処理した後の生存率（％）との相関。各ドットは一次ＡＭＬ試料を表す。各実験を少なくとも２回実施した。これらの細胞は、類似する総ＨＳＰ９０レベルを発現する。 異種移植アッセイは、高いＰＵ−ＦＩＴＣ結合を有するＡＭＬ試料のＰＵ−Ｈ７１処理に対するｉｎ ｖｉｖｏでの感受性を示唆する。（ａ）低いおよび高いＰＵ−ＦＩＴＣ取込みを示す２つの一次ＡＭＬ試料のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＵ−Ｈ７１処理に関する４８時間での生存率（％）（ｂ）。生存率をアネキシン／７ＡＡＤアッセイにより決定した。（ｂ）異種移植された動物に由来する骨髄細胞（パネルａに示されたＡＭＬ試料に関する）を、ヒト特異的抗体で染色して、ＰＵ−ＦＩＴＣ結合を決定した。ＰＵ−ＦＩＴＣ結合を、ヒト（白血病）／マウス（正常）細胞の比として表す。（ｃ）７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１で週３回、３週間にわたって処理された動物におけるＣＤ３４＋腫瘍細胞（％）。 「発がん性ＨＳＰ９０」を検出および定量し、ＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を予測するための標識されたＰＵ−Ｈ７１の使用。（Ａ）ＨＳＰ９０へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ（１μＭ）の結合と、膵臓がんおよび乳がん細胞系のパネルにおける４８時間の１μＭ ＰＵ−Ｈ７１、ＳＮＸ−２１１２またはＮＶＰ−ＡＵＹ９２２を用いる処理後の生存率（％）との相関。結合を、それぞれのがん細胞中でのＰＵ−ＦＩＴＣの取込みと、参照細胞であるＨＳＰ９０耐性白血病細胞ＨＬ６０中での取込みとの比として測定する（パネルＤを参照）。（Ｂ）総腫瘍ＨＳＰ９０の発現を、ウェスタンブロットにより測定し、ＰＵ−ＦＩＴＣ結合に対してプロットした。（Ｃ）膵臓および乳がん細胞系のパネルにおける、１μＭのＰＵ−Ｈ７１、ＳＮＸ−２１１２またはＮＶＰ−ＡＵＹ９２２を用いる４８時間の処理後の生存率（％）を、総腫瘍ＨＳＰ９０の発現に対してプロットした。（Ｄ）低い結合および感受性（ＨＬ−６０）および高い結合および感受性（ＭＶ４−１１）のＡＭＬ細胞系における、ＰＥコンジュゲート化抗体とＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣとのＨＳＰ９０結合。データを平均±ＳＥ（ｎ＝３）として提示する。 腫瘍細胞と、参照ＨＬ−６０白血病細胞との、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２結合の比。非応答性細胞に関する約１．２３〜約２．０７以下と比較した、応答性細胞に関する約２．７〜約５．８７以上のＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２への結合の比により、非応答性（生存率の５０％未満の低下）細胞から、応答性（生存率の５０％を超える低下）細胞を識別した。 ＥｐＣＡＭ＋循環腫瘍細胞中でのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２の蓄積：全血から単離されたＰＢＭＣを、ＰＵ−ＦＩＴＣまたは対照（ＰＵ−ＦＩＴＣ９、ＤＭＳＯ、１μＭ／２ｘ１０6細胞／ｍｌ、４時間）で予備処理した。次いで、細胞をＣＤ４５、ＣＤ１４およびＥｐＣＡＭ抗体で染色した。（Ａ）細胞にゲートをかけて死細胞を排除する。次いで、生細胞にゲートをかけて、ＥｐＣＡＭ＋対ＣＤ４５＋細胞を決定する。ＣＤ４５＋細胞、さらにＦＳＣ対ＣＤ１４にゲートをかけることにより、単球を分析から排除する。（Ｂ）ＣＤ４５＋ＣＤ１４−細胞（青色）およびＥｐＣＡＭ＋細胞（赤色）のＰＵ−ＦＩＴＣ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示すヒストグラムプロット。ＤＭＳＯおよびＰＵ−ＦＩＴＣ９対照（非特異的およびバックグラウンド結合を制御するために用いられる）の値を差し引いた後に、ＭＦＩ ＥｐＣＡＭ＋／ＭＦＩ ＣＤ４５＋ＣＤ１４−（循環腫瘍細胞／白血球）の比として、ＥｐＣＡＭ＋細胞中の薬剤蓄積を算出する。 異なるＬｙ１クローンによるＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２の取込みを示し、中央蛍光強度として表す。ＨＳＰ９０阻害剤へのこれらの細胞の感受性は、標識されたＰＵ−Ｈ７１のその取込みと相関する。これらの腫瘍細胞中での総腫瘍ＨＳＰ９０の発現を、ウェスタンブロットにより測定した（差込み図）。 （ａ〜ｃ）膵臓がん細胞中でのＰＵ−Ｈ７１結合と毒性との相関。（Ａ）生細胞中での結合；膵臓がん細胞（１ｘ１０6個の細胞）を、ＰＵＦＩＴＣ２（１μＭ）または対照［ＴＥＧ−ＦＩＴＣ（１μＭ）もしくはＤＭＳＯ］で６時間処理した。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）で２回洗浄し、室温でＦＡＣＳバッファー中の１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、分析した。ＰＵ−Ｈ７１蛍光誘導体結合を表す生細胞（ＤＡＰＩ陰性）に由来する蛍光強度を、フローサイトメトリー（ＬＳＲ−ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）により分析した。値は、ＤＭＳＯおよびＴＥＧ−ＦＩＴＣ対照から差し引かれた平均蛍光強度である。（Ｂ）毒性；膵臓がん細胞（１ｘ１０6個の細胞）を、ＰＵ−ＦＩＴＣ２（１μＭ）で４８時間処理した。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）で２回洗浄し、室温でＦＡＣＳバッファー中の１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリー（ＬＳＲ−ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により捕捉した。値は、ＤＭＳＯ対照に由来する値に対して正規化された生細胞（ＤＡＰＩ陰性）の％である。（Ｃ）相関分析；ＡおよびＢから得られたＭＦＩおよび毒性を、それぞれｘおよびｙ軸上にプロットし、相関線形回帰分析を行った。 （Ａ）白血病幹細胞（ＬＳＣ、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ｄｉｍ）へのＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２の結合。一次ＡＭＬ試料を、３７℃で４時間、１μＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と共にインキュベートした。細胞をＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５および７−ＡＡＤで染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。ＬＳＣへのＰＵ−Ｈ７１の結合を、生細胞（７−ＡＡＤ陰性）中での平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示す。 （Ｂ）１μＭのＰＵＨ７１を用いる４８時間の処理後の３つの一次ＡＭＬ試料に由来する未処理対照と比較したＬＳＣの生存率（％）。細胞をＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３８で染色した後、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色を行った。ＬＳＣの生存をフローサイトメトリーにより測定し、ＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋ＣＤ３８−ゲートのアネキシンＶ／７−ＡＡＤの割合として決定した。 腫瘍は、その「発がん性ＨＳＰ９０」含量、すなわちＨＳＰ９０療法に応答するその能力の差異を示す、異なる［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１取込みを有する。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入の２４時間後の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ画像を、乳がんを有する数人の患者において最大標準化取込み値（ＳＵＶmax）として測定した。ＢＣ＝乳がん。ＴＮＢＣ−三重陰性ＢＣ。 ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の投与後にＰＥＴにより決定された、ＨＳＰ９０阻害療法に応答する選択された患者数に関する腫瘍：筋肉ＳＵＶ比。これらの患者においては、腫瘍：筋肉ＳＵＶは、時間と共に増加する。いくつかの陽性および陰性腫瘍について平均された値を提示する。 マントル細胞リンパ腫を有する患者のＦＤＧ／ＣＴおよび［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴ。患者は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後３０分で病変の明確な可視化を示す。より後の時点（３．５〜２４時間以後）ではこの腫瘍中で［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１取込みは見られなかった。 ２つの示されたリンパ節（ＬＮ）における再発乳がんを有する患者の［12 4Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴ。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後のいくつかの時点（０．１、０．４、０．６、３．５および２１．４時間）でのＰＥＴ画像を定量し、［12 4Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１について得られたＳＵＶmaxデータを、１０ｍｇ／ｍ2のＰＵ−Ｈ７１の投与用量あたりのＨＳＰ９０ｉ濃度に変換した。０〜２４時間の経時的なＰＵ−Ｈ７１への２つの腫瘍の曝露も算出し、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。ＣＴ（左）、ＰＵ−ＰＥＴ／ＣＴ（中央）、およびＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ融合物（右）の横断画像は、疾患リンパ節の１つにおける［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１アビディティを示すが、他のものは、左気管気管支前角リンパ節（ＴＡＡＬＮ）中の病変が左気管気管支角ＬＮ（ＴＡＬＮ）よりもＨＳＰ９０療法に応答する可能性が低いことを示唆する。 三重陰性乳がん患者を、124Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを用いて画像化した。注入後２０分で、取込みは肺腫瘤（左矢印）および骨病変（右矢印）において顕著である（Ａ）が、２４時間の取込みは肺病変においてのみ見られる（Ｂ）。肺と骨腫瘍は両方とも、ＣＴおよびＦＤＧスキャンにより確認する（Ｃ）。患者は、ＨＳＰ９０阻害剤ＳＴＡ−９０９０を用いる処置を開始した。ＨＳＰ９０阻害剤処置の２０日後、ＣＴとＦＤＧ−ＰＥＴの両方により示されるように、骨病変ではなく肺病変の大きさが顕著に低下する（Ｄ）。 気管傍リンパ節における転移性ＨＥＲ２乳がんを有する患者の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴ。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後または［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１と１０ｍｇ／ｍ2のＰＵ−Ｈ７１との同時注入後の示された時点でのＰＥＴ画像を、最大標準化取込み値（ＳＵＶmax）として測定した。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１について得られたＳＵＶデータを、１０ｍｇ／ｍ2のＰＵ−Ｈ７１の投与用量あたりのＨＳＰ９０ｉ濃度に変換した。０〜４８時間の経時的なＰＵ−Ｈ７１への腫瘍の曝露も算出し、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴから見積もられたか、または［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１／ＰＵ−Ｈ７１の同時注入後の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより決定されたＰＵ−Ｈ７１の腫瘍内濃度（マイクロモル濃度の値）は、同等である。 ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは、ＨＳＰ９０阻害剤に関する非侵襲的アッセイである。（ａ）ＰＵ−Ｈ７１および［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の化学構造。（ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウスにおける［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の代表的なＰＥＴスキャン。腫瘍の位置を赤色の矢印で示す。（ｃ）投与後の示された時点での［12 4Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１腫瘍と臓器活性濃度との比。（ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍および血漿中の［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の生体内分布（ｎ＝５）。腫瘍−Ｓおよび腫瘍−Ｌは、それぞれ小さい腫瘍および大きい腫瘍である。（差込み図）腫瘍からのＰＵ−Ｈ７１の２４〜１４０時間の遅延最終クリアランス期を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ中に実装された線形回帰曲線適合を用いて分析した。 ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは、腫瘍中の治療上有効なＰＵ−Ｈ７１濃度の送達を正確に予測する。（ａ）［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより生成された平均％ＩＤ／ｇに基づく予測されたＰＵ−Ｈ７１腫瘍分布（下側）。示されたＰＵ−Ｈ７１用量の投与後（ｐ．ａ．）の示された時点での予測された腫瘍内濃度（上側）。（ｂ）［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより予測され、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１の同時注入後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより決定された、７５ｍｇ／ｋｇの薬剤の投与後の腫瘍ＰＵ−Ｈ７１濃度（ｎ＝５）。（ｃ、ｄ）示された用量でＰＵ−Ｈ７１を投与し、投与後２４時間で分析したＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍（ｃ）および示された濃度のＰＵ−Ｈ７１で２４時間処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ｄ）の代表的なウェスタンブロット分析。ブロット（ｎ＝３）を密度測定により定量し、タンパク質レベルの変化を、ＰＵ−Ｈ７１の濃度に対してプロットした（右パネル）。（ｅ、ｆ）示された用量のＰＵ−Ｈ７１と混合した微量の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の同時投与後の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより予測された投与後２４時間での標的占拠率。 ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは、ＨＳＰ９０療法のための有効な用量レジメンの設計を予測する。（ａ）［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより誘導された平均腫瘍活性濃度（％ＩＤ／ｇ）に基づく週３回（月曜−水曜−金曜、Ｓａｔ／Ｓｕｎは休み）のスケジュールでの示された用量で２週間にわたって投与した場合の予測されたＰＵ−Ｈ７１腫瘍分布。（差込み図）腫瘍中のＰＵ−Ｈ７１のＡＵＣを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて算出した。（ｂ）示された用量のＰＵ−Ｈ７１で４８時間処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の生存を、エチジウムブロマイド／アクリジンオレンジ染色により分析した（上側）。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより誘導された見積もられた腫瘍アポトーシスは、示された平均および最小ＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度を予測した。（ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウス（ｎ＝５）に、週３回のスケジュールで示された用量のＰＵ−Ｈ７１を腹腔内投与した。腫瘍体積およびマウス体重を、示された処置期間にわたってモニタリングした。（ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウス（ｎ＝５）に、週３回のスケジュールで示された用量のＰＵ−Ｈ７１を腹腔内投与した。腫瘍体積およびマウス体重を、示された処置期間にわたってモニタリングした。（ｅ）週３回（月−水−金、土／日は休み）のスケジュールで示された用量で投与した場合の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより誘導された平均腫瘍活性濃度（％ＩＤ／ｇ）に基づく予測されたＰＵ−Ｈ７１腫瘍分布。（ｆ）最後の投与の投与後２４時間の木曜に犠牲にした、ビヒクル（対照）およびＰＵ−Ｈ７１（５ｍｇ／ｋｇ）で処置された腫瘍のウェスタンブロット分析。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定された、ＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度を、それぞれの腫瘍について示す。（ｆ）パネル（ｄ）からのデータ（ｎ＝５）の分析。 ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは、ＨＳＰ９０療法のための有効なスケジュールレジメンの設計を予測する。（ａ）示されたスケジュールで７５ｍｇ／ｋｇで投与された場合の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより誘導された平均腫瘍活性濃度（％ＩＤ／ｇ）に基づく予測されたＰＵ−Ｈ７１腫瘍分布。（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析から予測された、示された平均および最小ＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度により誘導された見積もられた腫瘍アポトーシス。（ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍担持マウス（ｎ＝５）に、示されたスケジュールでＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。腫瘍体積およびマウス体重を、示された処置期間にわたってモニタリングした。（ｄ）最後の投与の投与後２４時間のＴｈｕおよび９６時間のＴｈｕに犠牲にした週１回のスケジュールでのＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｇ／ｋｇ）で処置された腫瘍の（ｄ）ウェスタンブロットおよび（ｅ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。対照；ビヒクルのみで処置したマウス。 肺および示されたリンパ節への転移疾患を有する膵臓患者に関するＰＵ−ＰＥＴにより予測されたＰＵ−Ｈ７１への腫瘍曝露。腫瘍内濃度を、２０ｍｇ／ｍ2の投与用量に基づいて算出する。血漿曝露も赤色で示す。０〜１２９時間の期間の算出されたＡＵＣ（μＭ−ｈ）を、右側に一覧化する。 肺での再発疾患を有する膵臓がん患者の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴ。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後の示された時点でのＰＥＴ画像（４８および１９６時間、左パネル）を定量し、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１について得られたＳＶＵデータを、ＰＵ−Ｈ７１の示された投与用量あたりの腫瘍中のＰＵ−Ｈ７１濃度に変換した。週２回（火および金）のスケジュールならびに２０、６０および８０ｍｇ／ｍ2の投与用量での２週間の処置にわたる０〜３３６時間の経時的な、一方は左肺および他方は右肺門ＬＮ中の２つの腫瘍の、ＰＵ−Ｈ７１への曝露（上右および下パネル）も算出し、曲線下面積（ＡＵＣ）として、および平均腫瘍内濃度として表した。 パネルＡは、ＰＵ−ＰＥＴから得られた乳がん患者の腫瘍における０〜７２時間にわたる124Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の生体内分布を示す。このデータを用いて、週末休みで２週間にわたって週に２回、週末休みで２週間にわたって週に３回、週末休みで２週間にわたって週に１回および週末休みで２週間にわたって週に５回投与した場合の１０ｍｇ／ｍ2の投与用量への腫瘍曝露をシミュレートした。 ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは、ＨＳＰ９０療法に対する応答の規模を予測する。（ａ）示された用量および示されたスケジュールで投与された場合のＰＵ−Ｈ７１による腫瘍ＨＳＰ９０部位の予測された平均占拠率。（ｂ、ｃ）腫瘍ＨＳＰ９０占拠率と観察された抗腫瘍効果との相関を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて分析した。 （ａ）有効な腫瘍内濃度、ＨＳＰ９０療法にふさわしい患者の選択を達成するのに必要とされるＨＳＰ９０阻害剤の用量の決定と、有効用量およびスケジュールレジメンの設計；（ｂ）腫瘍に送達される薬剤の実際の濃度のアッセイと、ＨＳＰ９０療法上での臨床転帰の予測ならびに （ｃ）「最大腫瘍用量」の決定における、ＨＳＰ９０阻害剤の臨床開発における124Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイの使用。ＣＲ＝完全な応答、ＰＲ＝部分的応答、ＮＲ＝応答なし。 ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植ＴＮＢＣマウスにおける［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３および［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１のｉｎ ｖｉｖｏでのＰＥＴ画像化。ＰＥＴ画像化を、Ｒ４またはＦｏｃｕｓ １２０小動物専用ＰＥＴスキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）上で行った；別々の解剖学的画像化を、特注生産された定位固定拘束装置を用いて、小動物専用ＣＴスキャナー（ＩｍＴｅｋ，Ｉｎｃ．，Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）上で行った。ＣＴおよびＰＥＴ画像データセットの最大値投影（ＭＩＰ）を解剖学的に登録し、ＰＥＴおよびＣＴデータのアルファ透明ブレンドを用いてオーバーレイ画像を作製した。 ＢＣの事例は、ＰＵ−Ｈ７１に対する用量依存的応答を示す。Ｈ＆Ｅ染色されたスライドは、腫瘍がＰＵ−Ｈ７１に対して高感受性である場合、核濃縮型細胞（初期段階のアポトーシスを示す）と核崩壊型細胞（後期アポトーシスを表す）の両方を含有する有意なアポトーシス領域を示す。（Ａ）示された濃度のＰＵ−Ｈ７１で４８時間処理したＴＮＢＣ標本におけるアポトーシス／細胞死を定量し、ＰＵ−Ｈ７１の濃度に対してプロットした。アポトーシスおよび壊死性／後期アポトーシス細胞の両方を計数し、ｙ軸上に示されたアポトーシス率（％）に加算した。３つの感受性群（最急降下、最も上の曲線、最も高感受性のＬＮ１５およびＮ１６；中央の曲線、感受性のＰＴ１２、ＰＴ１７、ＰＴ２５、ＰＴ２８およびＬＮ１０ならびに下側の曲線、低感受性のＰＴ１０、ＰＴ１５、ＰＴ１６およびＰＴ３０）における事例のクラスター化に留意されたい。興味深いことに、リンパ節転移は、等価用量の原発性腫瘍よりも高感受性を示した。ＰＴ＝原発性腫瘍、ＬＮ＝リンパ節。ＰＵ−Ｈ７１に対して最も高感受性の腫瘍も、ｐ−Ａｋｔに対して高く染色する。 （Ｂ）ＰＵ−Ｈ７１で２４または４８時間処置したＨＥＲ２＋、ＴＮＢＣおよびＥＲ＋ＢＣ患者からの標本に関する（Ａ）と同じもの。 ＨＳＰ９０阻害に対するアポトーシス感受性は、ＭＥＫ経路ではなく、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ経路上での生存への細胞の依存と相関する。（Ａ）、（Ｂ）代表的なＡＭＬ細胞を、示された濃度のＨＳＰ９０、ＡＫＴ、ＪＡＫおよびＭＥＫ阻害剤と共に示された時間インキュベートし、アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド法を用いてアポトーシスを評価した。データは、複数の反復実験（ｎ≧３）から得られたものと一致する。点は平均；バーはｓ．ｄ．である。（Ｃ）ＡＫＴｉ、ＭＥＫｉおよびＪＡＫｉのみで７２時間処理した細胞に由来するアポトーシス（％）値をＨＳＰ９０阻害剤処理の際に得られたものに対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ４．０中に実装された線形回帰分析を実施した。 ｐ−ＳＴＡＴ５のレベルが最も高いＡＭＬ一次細胞はまた、ＰＵ−Ｈ７１に対して最も高感受性である。（Ａ）芽細胞（ＣＤ４５ｄｉｍにゲートをかけた）におけるホスホ−ＳＴＡＴ５レベルを、３つの異なる一次ＡＭＬ試料に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。（Ｂ）１μＭのＰＵＨ７１を用いる４８時間の処理後の３つの一次ＡＭＬ試料に由来する未処理対照と比較したＡＭＬ芽球の生存率（％）。細胞をＣＤ４５で染色した後、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色した。ＡＭＬ芽細胞の生存能力をフローサイトメトリーにより測定し、ＡＭＬ芽球に関するＣＤ４５ｄｉｍ対ＳＳＣゲートのアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色の割合として決定した。 ８〜１０ ｍｏ ３ｘＴｇマウスに、（Ａ）７５ｍｇ／ｋｇまたは（Ｂ）示された用量のＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−ＨＺ１５１を投与し、ＰＤマーカー、ＨＳＰ７０を、投与後２４時間で、このＡＤのモデルにおいて罹患した脳領域である海馬中で測定した。ＨＳＰ７０は、ＨＳＰ９０が阻害された場合に誘導され、その誘導は、治療レベルのＨＳＰ９０阻害剤が対象の脳領域に送達されたことの指示因子である。（Ｃ）示された脳領域および血漿中のＨＳＰ９０阻害剤のレベルを、５０ｍｇ／ｋｇのＰＵ−ＨＺ１５１の投与後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した。単回腹腔内注射後の様々な時点でのＨｓｐ９０阻害剤レベルを、マイクロモル濃度単位で示す。また、脳曝露を曲線下面積（ＡＵＣ）として測定した。 ＰＵ−Ｈ７１はＨＳＰ９０に対して選択的である。（Ａ）いくつかのＨＳＰ９０阻害剤ビーズプルダウンのクマシー染色ゲル。Ｋ５６２溶解物（６０μｇ）を、２５μＬの示されたビーズと共にインキュベートした。示されたバッファーで洗浄した後、プルダウン中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに印加した。 （Ｂ）ＰＵ−Ｈ７１（１０μＭ）を、３５９キナーゼに対してｓｃａｎＭＡＸスクリーン（Ａｍｂｉｔ）中で試験した。ＰＵ−Ｈ７１のＴＲＥＥｓｐｏｔ（商標）相互作用マップを提示する。ＳＮＡＲＫ（ＮＵＡＫファミリーのＳＮＦ１様キナーゼ２）（キナーゼツリー上の赤いドット）は、小分子の潜在的な低親和性キナーゼヒットとして現れる。
５．１．腫瘍特異的バイオマーカーとしての発がん性ＨＳＰ９０
本開示は、ＨＳＰ９０発現のみによっては決定されない、この特定の「発がん性ＨＳＰ
９０」種の存在量が、ＨＳＰ９０阻害療法に対する感受性を予測し、かくして、ＨＳＰ９
０療法のためのバイオマーカーであることの証拠を提供する。本発明はまた、腫瘍中のこ
の発がん性ＨＳＰ９０種の存在量の同定および測定が、ＨＳＰ９０療法に対する応答を予
測することの証拠も提供する。
以下の節において、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１が腫瘍富化されたＨ
ＳＰ９０複合体を標的とし、ＨＳＰ９０依存的発がん性クライアントタンパク質を親和性
捕捉することを示す。化合物ＰＵ−Ｈ７１は米国特許第７，８３４，１８１号に開示され
ており、参照によりここに組込まれる。ＰＵ−Ｈ７１は、以下の化学構造：
を有する。ＰＵ−Ｈ７１を、遊離塩基として、または薬学的に許容される塩として投与す
ることができる。
さらに、本発明者らは、ＨＳＰ９０発現のみによっては決定されない、ＰＵ−Ｈ７１に
より富化されたＨＳＰ９０種の存在量が、ＰＵ−Ｈ７１および他のＨＳＰ９０阻害剤によ
るＨＳＰ９０阻害に対する細胞の感受性を予測することを示す。
５．１．１．がん細胞中での異種ＨＳＰ９０提示
小分子ＨＳＰ９０阻害剤と、腫瘍ＨＳＰ９０複合体との相互作用を調査するために、本
発明者らはゲルダナマイシン（ＧＭ）またはＰＵ−Ｈ７１のいずれか（それぞれ、ＧＭ−
およびＰＵ−ビーズ）に共有結合させたアガロースビーズを利用した（図１、２）。ＧＭ
とＰＵ−Ｈ７１は両方とも、化学的に異なる薬剤であり、そのＮ末端ドメイン調節ポケッ
トへの結合によりＨＳＰ９０と相互作用し、これを阻害する35。比較のために、本発明者
らは、抗ＨＳＰ９０抗体（Ｈ９０１０）にカップリングさせたＧタンパク質アガロースビ
ーズも作製した。
第一に、本発明者らは、乳がんおよび慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞溶解物中でのＨ
ＳＰ９０へのこれらの薬剤の結合を評価した。非特異的ＩｇＧではなく、Ｈ９０１０を用
いる４つの連続免疫沈降（ＩＰ）ステップは、これらの抽出物からＨＳＰ９０を効率的に
枯渇させた（図１ａ、４ｘＨ９０１０および示さず）。対照的に、ＰＵ−またはＧＭ−ビ
ーズを用いる連続プルダウンは、総細胞ＨＳＰ９０の画分のみを除去した（図１ｂ、３ａ
、３ｂ）。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳がん細胞中で、合わせたＰＵ−ビーズ画
分は、総細胞ＨＳＰ９０プールの約２０〜３０％に相当し、新鮮なＰＵ−ビーズのアリコ
ートのさらなる添加は溶解物中の残りのＨＳＰ９０を沈降させることができなかった（図
１ｂ、ＰＵ−ビーズ）。このＰＵ枯渇された、残りのＨＳＰ９０画分は、小分子には近づ
き難いが、Ｈ９０１０に対する親和性を維持した（図１ｂ、Ｈ９０１０）。このことから
、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物中のＨＳＰ９０の有意な画分がまだ天
然のコンフォメーションにあったが、ＰＵ−Ｈ７１と反応しなかったと結論付ける。
細胞溶解物中のＨＳＰ９０配置の変化が、抗体ではなく、固定されたＰＵ−Ｈ７１への
結合のためにそれを利用できなくする可能性を排除するために、本発明者らは、無傷のが
ん細胞における放射標識された131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１のＨＳＰ９０への結合を分析した（
図１ｃ、下側）。131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１の化学構造は同一である：Ｐ
Ｕ−Ｈ７１は安定なヨウ素原子（127Ｉ）を含有し、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１は放射性ヨウ素
を含有する；かくして、アイソトープ標識された131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１は、標識されてい
ないＰＵ−Ｈ７１と同一の化学的および生物学的特性を有する。いくつかのがん細胞系に
おける131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１のＨＳＰ９０への結合は、細胞あたりの明確に定義されてい
るが異なる数の部位で飽和するようになった（図１ｃ、下側）。本発明者らは、ＭＤＡ−
ＭＢ−４６８細胞中のＰＵ−Ｈ７１により結合した細胞性ＨＳＰ９０の画分を定量した。
第一に、本発明者らは、ＨＳＰ９０がこれらの細胞中の総細胞タンパク質の２．６６〜３
．３３％に相当し、これが他の腫瘍細胞中のＨＳＰ９０の報告された存在量33とほぼ一致
する値であることを決定した。約４１．６５ｘ１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を溶
解したところ、３８７５μｇのタンパク質が得られ、そのうちの１０３．０７〜１２９．
０４μｇがＨＳＰ９０であった。したがって、１個の細胞は、（２．４７〜３．０９）ｘ
１０-6μｇ、（２．７４〜３．４３）ｘ１０-11μｍｏｌまたは（１．６４〜２．０６）
ｘ１０7分子のＨＳＰ９０を含有していた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中で、131Ｉ−ＰＵ
−Ｈ７１は、多くても５．５ｘ１０6個の利用可能な細胞結合部位に結合したが（図１ｃ
、下側）、これは総細胞ＨＳＰ９０の２６．６〜３３．５％に達する（５．５ｘ１０6／
（１．６４〜２．０６）ｘ１０7*１００として算出される）。この値は、細胞抽出物中の
ＰＵ−ビーズプルダウンを用いて得られたものと非常に類似し（図１ｂ）、ＰＵ−Ｈ７１
が総ＨＳＰ９０プールの約３０％に相当するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中のＨＳＰ９０の
画分に結合することを確認し、このプールを効率的に単離するためのＰＵ−ビーズの使用
を正当化する。Ｋ５６２および他の確立されたｔ（９；２２）＋ＣＭＬ細胞系においては
、ＰＵ−Ｈ７１は総細胞ＨＳＰ９０の１０．３〜２３％に結
合した（図１ｃ、３ｂ、３ｃ）。
次に、本発明者らは、いくつかの一次白血病細胞および正常血液細胞にまで本発明者ら
の試験を拡張した。これらのものは芽球（悪性細胞集団）とリンパ球（正常細胞集団）の
両方を含有する一次慢性および急性転化期ＣＭＬならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試
料、健康なドナーの臍帯血から単離されたＣＤ３４＋細胞、末梢血に由来する総単核細胞
およびまた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であった（図１ｃ〜ｅ、３、４）。本発明者らは、
フルオレセイン標識されたＰＵ−Ｈ７１（ＰＵ−ＦＩＴＣ）を用いた。この化学的手段は
、細胞表面マーカーを用いて異なる細胞集団に結合するＰＵ−Ｈ７１の、異種細胞集団中
でのフローサイトメトリー分析、およびＰＵ−Ｈ７１に対する細胞の感受性の調査を可能
にする。テトラエチレングリコール誘導体化ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ−ＴＥＧ）を用いて、非
特異的結合を制御した（図１ｄ）。
ＰＵ−Ｈ７１はＫ５６２細胞中ならびにＣＭＬおよびＡＭＬ芽球中でＨＳＰ９０に効率
的に結合し、その半数相対結合親和性（ＥＣ50）はそれぞれ１１６、２０１および４２５
ｎＭであった（図１ｄ）。対照的に、正常血液細胞へのその親和性はより弱く、２，００
０ｎＭよりも高いＥＣ50であった（図１ｄ、３ｄ）。ＨＳＰ９０は、ＨＳＰ９０抗体への
実質的結合により示される通り、これらの正常血液細胞中で依然として高度に発現される
（図３ｄ）。
ＰＵ−Ｈ７１に対する最も高いアビディティを有する細胞もまた、薬剤による殺傷に対
して最も感受性が高かった（図１ｅ、３ｅ、４）。ＣＭＬおよびＡＭＬ細胞系および一次
試料のパネル中で評価した場合、ＨＳＰ９０に結合するＰＵ−Ｈ７１の能力と、これらの
細胞に対してＰＵ−Ｈ７１の細胞殺傷能力との有意な相関が見られた（図３ｅ、４）。
まとめると、これらのデータは、特定のＨＳＰ９０阻害剤、例えば、ＰＵ−Ｈ７１が、
正常細胞中よりもがん細胞中により豊富であるＨＳＰ９０種のサブセットに優先的に結合
することを示す（図５ａ）。ＨＳＰ９０発現レベルのみによっては決定されない、このＨ
ＳＰ９０種の存在量は、ＨＳＰ９０阻害に対する細胞の感受性を予測し、かくして、この
腫瘍ＨＳＰ９０種の存在量を用いて、ＨＳＰ９０療法に対する応答性を予測するバイオマ
ーカーとして用いることができる。
５．１．２．がんタンパク質および野生型タンパク質に結合したＨＳＰ９０種はがん細
胞中に同時に存在するが、ＰＵ−Ｈ７１はがんタンパク質／ＨＳＰ９０種を選択する
これらのＨＳＰ９０種と関連する生化学的機能を探索するために、本発明者らは、それ
ぞれ、抗体ビーズおよびＨＳＰ９０阻害剤ビーズを用いて免疫沈降（ＩＰ）および化学沈
降（ＣＰ）を実施し、本発明者らは選択されたサブセットの既知のクライアントと共沈降
するこれらの状況で結合したＨＳＰ９０の能力を分析した。Ｋ５６２ ＣＭＬ細胞は異常
なＢｃｒ−Ａｌｂタンパク質、構成的に活性なキナーゼ、およびその正常な対応するｃ−
Ａｂｌを同時発現するため、この細胞系を最初に調査した。これらの２つのＡｂｌ種は分
子量により明確に分離可能であり、かくして、ウェスタンブロットにより容易に識別可能
であり（図２ａ、溶解物）、同じ細胞状況におけるＨＳＰ９０がん性および野生型（ＷＴ
）クライアントの分析を容易にする。本発明者らは、非特異的ＩｇＧではなく、Ｈ９０１
０が、Ｂｃｒ−ＡｂｌとＡｂｌの両方との複合体中のＨＳＰ９０を単離することを観察し
た（図２ａ、５ｃ、Ｈ９０１０）。免疫沈降したＢｃｒ−ＡｂｌおよびＡｂｌ（図２ａ、
２ｂ、左側、Ｈ９０１０）と、上清中に残存する各タンパク質の画分（図２ｂ、左側、残
りの画分）との比較により、抗体がＫ５６２細胞中の突然変異型またはＷＴ型のＡｂｌに
結合したＨＳＰ９０を優先的に富化しないことが示された。
対照的に、ＰＵ結合したＨＳＰ９０は、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質を優先的に単離した
（図２ａ、２ｂ、右側、ＰＵ−ビーズ）。ＨＳＰ９０／Ｂｃｒ−Ａｂｌ種のＰＵ−ビーズ
枯渇後（図２ｂ、右側、ＰＵ−ビーズ）、Ｈ９０１０は残りのＨＳＰ９０／Ａｂｌ種を沈
降させた（図２ｂ、右側、Ｈ９０１０）。ＰＵ−ビーズは、実質的に飽和する条件（すな
わち、過剰の溶解物、図６ａ、左側、およびビーズ、図６ａ、右側）でＨＳＰ９０／Ｂｃ
ｒ−Ａｂｌ種に対する選択性を保持していた。Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＨＳＰ９０種に対するＰ
Ｕ−Ｈ７１の生化学的選択性のさらなる確認として、Ｂｃｒ−ＡｂｌはＡｂｌよりもＰＵ
−Ｈ７１による分解に非常により感受性があった（図２ｄ）。異常なＡｂｌ種に対するＰ
Ｕ−Ｈ７１の選択性は、他の確立されたｔ（９；２２）＋ＣＭＬ細胞系（図７ａ）、およ
び一次ＣＭＬ試料（図７ｂ）にまで拡張された。
５．１．３．ＨＳＰ９０種に結合したＷＴタンパク質ではなくがんタンパク質は、ＨＳ
Ｐ９０によるクライアントタンパク質調節のためのコシャペロン動員に最も依存する
ＰＵ−Ｈ７１−と抗体に関連するＨＳＰ９０画分とをさらに識別するために、本発明者
らは、連続枯渇実験を実施し、２つの種のコシャペロン構成性を評価した32。ＨＳＰ９０
／Ｂｃｒ−Ａｂｌ複合体を含有するＨＳＰ９０の画分は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、ＨＯ
ＰおよびＨＩＰを含むいくつかのコシャペロンに結合した（図２ｃ、ＰＵ−ビーズ）。ま
た、ＰＵ−ビーズプルダウンは、いくつかのさらなるＨＳＰ９０コシャペロン種について
富化された。これらの知見は、ＰＵ−Ｈ７１がコシャペロンに結合したＨＳＰ９０を認識
することを強く示唆している。ＨＳＰ９０／Ａｂｌ種を含むことが示された、ＰＵ−ビー
ズにより枯渇された、残りのＨＳＰ９０プールはコシャペロンと会合していなかったが（
図２ｃ、Ｈ９０１０）、その異常な発現は溶解物中で検出された（図２ｃ、残りの上清）
。しかしながら、コシャペロンは、総細胞抽出物中でＨ９０１０により単離される（図５
ｂ、５ｃ）。
これらの知見は、ＨＳＰ９０の異なるプールの存在が、ＣＭＬ細胞中でＢｃｒ−Ａｂｌ
またはＡｂｌのいずれかに優先的に結合したことを示唆している（図２）。Ｈ９０１０は
、ＨＳＰ９０種を含有するＢｃｒ−ＡｂｌとＡｂｌの両方に結合するが、ＰＵ−Ｈ７１は
Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＨＳＰ９０種に対して選択的である。本発明者らのデータはまた、ＨＳ
Ｐ９０が正常（すなわち、Ａｂｌ）タンパク質ではなく、異常（すなわち、Ｂｃｒ−Ａｂ
ｌ）タンパク質の活性を調節する場合、古典的コシャペロンＨｓｐ７０、Ｈｓｐ４０およ
びＨＯＰをより急性的に利用し、必要としてもよいことを示唆している（図５ａ）。この
仮説に従って、本発明者らは、Ｂｃｒ−Ａｂｌが、Ｋ５６２細胞中で、Ｈｓｐ７０、ＨＳ
Ｐ９０コシャペロンのノックダウンに対してＡｂｌよりも感受性が高いことを見出す（図
２ｅ）。
５．１．４．がんタンパク質／ＨＳＰ９０種選択性およびＰＵ−Ｈ７１の複合体捕捉能
力は、全てのＨＳＰ９０阻害剤により共有されない
本発明者らは次に、合成阻害剤ＳＮＸ−２１１２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２、ならび
に天然産物ＧＭ35を含む、ＰＵ−Ｈ７１と同様の様式でＨＳＰ９０のＮ末端調節ポケット
と相互作用する他の阻害剤が、類似するＨＳＰ９０種を選択的に単離することができるか
どうかを評価した（図２１）。ＳＮＸ−ビーズはＢｃｒ−Ａｂｌ／ＨＳＰ９０に対する選
択性を示したが、ＮＶＰ−ビーズはＨ９０１０と同様に挙動し、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＨＳＰ
９０とＡｂｌ／ＨＳＰ９０種とを区別しなかった（それぞれ、ＳＮＸ−対ＮＶＰ−ビーズ
を参照されたい；図２ｆ）。ＧＭ−ビーズも細胞溶解物中のＨＳＰ９０のサブ集団を認識
したが（図３ａ）、それらはＢｃｒ−Ａｂｌの共沈降においてＰＵ−ビーズよりも効率性
がずっと低かった（図２ｆ、ＧＭ−ビーズ）。ＨＳＰ９０／クライアントタンパク質複合
体の捕捉におけるＧＭの類似する無効性は、以前に報告されている36。
５．１．５．がんタンパク質／ＨＳＰ９０種選択性およびＰＵ−Ｈ７１の複合体捕捉能
力は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＨＳＰ９０種に限定されない
がんタンパク質に対する選択性がＢｃｒ−Ａｂｌに限定されるかどうかを決定するため
に、本発明者らは、他の腫瘍細胞系においていくつかのさらなる明確に定義されたＨＳＰ
９０クライアントタンパク質を試験した（図６ｂ〜ｄ）37、38。Ｋ５６２細胞における本
発明者らの結果と一致して、Ｈ９０１０は、ＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞中で発現され
た突然変異Ｂ−Ｒａｆと、ＣＣＤ１８Ｃｏ正常結腸線維芽細胞中で発現されたＷＴ Ｂ−
Ｒａｆの両方と複合体化したＨＳＰ９０を沈降させた（図６ｂ、Ｈ９０１０）。しかしな
がら、ＰＵ−およびＧＭ−ビーズはＨＳＰ９０／突然変異Ｂ−Ｒａｆを選択的に認識し、
ＨＳＰ９０／ＷＴ Ｂ−Ｒａｆの認識をほとんど示さなかった（図６ｂ、ＰＵ−ビーズお
よびＧＭ−ビーズ）。しかしながら、Ｋ５６２細胞の場合と同様、ＧＭ−ビーズは突然変
異クライアントタンパク質の共沈降においてＰＵ−ビーズよりも効率性が有意に低かった
。他のＨＳＰ９０クライアントについても同様の結果が得られた（図６ｃ、６ｄ）。
まとめると、ＰＵ−Ｈ７１は、ＣＭＬにおける悪性表現型にとって不可欠であるシグナ
リング経路に関与するタンパク質の広い横断面を富化させる。ＰＵに結合したＨＳＰ９０
と異常なＣＭＬシグナロソームとの相互作用は、一次ＣＭＬ試料中で保持された。
５．１．６．ＰＵ−Ｈ７１により同定されたタンパク質およびネットワークは、悪性表
現型にとって重要なものである
本発明者らは、ＰＵ−ビーズプルダウン中のこれらのタンパク質の存在が機能的に有意
であり、ＣＭＬ細胞中の悪性シグナロソームを広く支援するＨＳＰ９０の役割を示唆する
と仮定する。
ＰＵ−ビーズにより同定されるネットワークがＫ５６２における形質転換にとって重要
であることを証明するために、本発明者らは次に、個々のネットワークの重要な節となる
タンパク質（Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＮＦκＢ、ｍＴＯＲ、ＭＥＫおよびＣＡＭＩＩＫ）の阻害
剤がＫ５６２細胞の成長および増殖能力を低下させることを示した。
次に、本発明者らは、ＣＭＬにおいてはまだ役割を割り当てられていないＰＵ−ビーズ
により同定されたＨＳＰ９０相互作用因子も、形質転換された表現型に寄与することを示
した。多くの遺伝子の転写コアクチベーター57であるヒストン−アルギニンメチルトラン
スフェラーゼＣＡＲＭ１を、ＣＭＬ細胞系および一次ＣＭＬ細胞に由来するＰＵ−ビーズ
プルダウン中で実証した。これは、ＨＳＰ９０とＣＡＲＭ１との初めて報告される関連で
あるが、他のアルギニンメチルトランスフェラーゼ、例えば、ＰＲＭＴ５は卵巣がん細胞
におけるＨＳＰ９０クライアントであることが示された58。ＣＡＲＭ１レベルの上昇は前
立腺および乳がんの発達に関与するが、ＣＭＬ白血病誘発におけるＣＡＲＭ１の重要性に
関してはほとんど知られていない57。本発明者らは、ＣＡＲＭ１がＰＵ−ビーズにより認
識されるＨＳＰ９０種により本質的に完全に捕捉され、ＰＵ−Ｈ７１による分解に対して
より感受性であることも見出した。したがって、ＣＡＲＭ１は、ＣＭＬにおける新規ＨＳ
Ｐ９０がんタンパク質であってもよい。実際、対照ｓｈＲＮＡではなくＣＡＲＭ１を用い
るノックダウン実験は、正常なＣＤ３４＋細胞中ではなくＫ５６２中での生存能力の低下
およびアポトーシスの誘導を示し（示さず）、この仮説を支持している。ｑＰＣＲデータ
により、ＣＡＲＭ１ ｍＲＮＡレベルが２つの異なるｓｈＲＮＡにより顕著に低下するこ
とが確認された（データは示さず）。
ＰＵ−プルダウン中のタンパク質の存在がその異常な発現だけでなく、異常に活性化さ
れたシグナリングへのその関与に起因することを証明するために、本発明者らは、Ｋ５６
２および膵臓がん細胞系であるＭｉａ−ＰａＣａ−２に由来するＰＵ−ビーズプルダウン
を比較した。両細胞とも高レベルのＳＴＡＴ５タンパク質を発現するが、ＳＴＡＴリン酸
化およびＤＮＡ結合59により示されたように、ＳＴＡＴ５経路の活性化はＫ５６２細胞に
おいてのみ見られた。したがって、このタンパク質はＫ５６２ ＰＵ−ビーズプルダウン
においてのみ同定された。対照的に、活性化されたＳＴＡＴ３は、Ｋ５６２とＭｉａ−Ｐ
ａＣａ−２細胞抽出物の両方に由来するＰＵ−ＨＳＰ９０複合体において同定された。
ｍＴＯＲ経路はＫ５６２とＭｉａ−ＰａＣａ−２細胞の両方においてＰＵ−ビーズによ
り同定され、実際、ｍＴＯＲ60のＡＴＰドメインを標的とする選択的阻害剤であるＰＰ２
４２によるその薬理学的阻害は、両方の細胞に対して毒性的である。他方、Ａｂｌ阻害剤
Ｇｌｅｅｖｅｃ61は、Ｋ５６２細胞に対してのみ毒性的であった。両細胞はＡｂｌを発現
するが、Ｋ５６２だけが発がん性Ｂｃｒ−Ａｂｌを有し、ＰＵ−ビーズは、Ｍｉａ−Ｐａ
Ｃａ−２細胞中ではなく、Ｋ５６２中で、Ｂｃｒ−ＡｂｌとしてＡｂｌを同定する。
５．１．７．ＰＵ−Ｈ７１は発がん性ＳＴＡＴ活性化の新規機構を同定する
ＰＵ−ビーズプルダウンは、ＣＭＬ白血病誘発において構成的に活性化されるＢｃｒ−
Ａｂｌ41、ＣＡＭＫＩＩγ52、ＦＡＫ53、ｖａｖ−Ｉ62およびＰＲＫＤ２48などのいくつ
かのタンパク質を含有する。これらのものは、その安定状態レベルがＨＳＰ９０阻害時に
低下するため、その安定性に関してＨＳＰ９０に依存する古典的なＨＳＰ９０調節性クラ
イアントである32、33。ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の構成的活性化は、ＣＭＬにおいて
も報告されている41、46。しかしながら、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３レベルがＨＳＰ９
０阻害時に本質的に未改変のままであるため、これらのタンパク質は古典的ＨＳＰ９０ク
ライアントタンパク質の基準に適合しない。ＰＵ−プルダウンはまた、活性シグナリング
巨大複合体、例えば、ｍＴＯＲ、ＶＳＰ３２、ＶＳＰ１５およびＲＡＰＴＯＲの一部とし
て潜在的に単離されたタンパク質も含有する44。ｐ−ｍＴＯＲの細胞レベルにより測定さ
れる、ｍＴＯＲ活性もまた、複合体成分よりもＨＳＰ９０阻害に対して感受性が高いと考
えられる（すなわち、ＰＵ−Ｈ７１処理細胞中でのｐ−ｍＴＯＲおよびＲＡＰＴＯＲの相
対的減少を比較する）。さらに、ＰＵ−ＨＳＰ９０複合体は、アダプタータンパク質、例
えば、ＧＲＢ２、ＤＯＣＫ、ＣＲＫＬおよびＥＰＳ１５を含有し、これらはＫ５６２にお
ける複数の異常活性化されたシグナリング経路の重要なエフェクターにＢｃｒ−Ａｂｌを
結合させる30、41。それらの発現もＨＳＰ９０阻害時に未変化のままである。したがって
、本発明者らは、特定の発がん経路へのＨＳＰ９０の寄与がその古典的折畳み作用を超え
て拡張されるかどうかを知りたいと考えた。具体的には、本発明者らは、ＨＳＰ９０が、
以前に主張されたように40、63、シグナリング複合体をその活性な配置に維持する足場分
子としても作用することを示す。
５．１．８．ＨＳＰ９０はＳＴＡＴ５に結合し、そのコンフォメーションに影響する
この仮説をさらに調査するために、本発明者らは、ＣＭＬ中で構成的にリン酸化される
64、ＳＴＡＴ５に着目した。ｐ−ＳＴＡＴ５の全体的なレベルを、リン酸化および脱リン
酸化事象の平衡により決定する。かくして、Ｋ５６２細胞中の高レベルのｐ−ＳＴＡＴは
、上流のキナーゼ活性の増加またはタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）
活性のいずれかの低下を反映してもよい。ＨＳＰ９０とｐ−ＳＴＡＴ５の直接的相互作用
は、ｐ−ＳＴＡＴ５の細胞レベルを調節することもできる。
これらの潜在的な機構の相対的寄与を詳細に分析するために、本発明者らは、Ｋ５６２
細胞中でＳＴＡＴ５リン酸化を調節する主要なキナーゼおよびＰＴＰａｓｅに対するＰＵ
−Ｈ７１の効果を最初に調査した。Ｂｃｒ−Ａｂｌは、ＪＡＫリン酸化を要することなく
ＳＴＡＴ５を直接活性化する64。合致して、ＳＴＡＴ５リン酸化はＢｃｒ−Ａｂｌ阻害剤
Ｇｌｅｅｖｅｃの存在下で急速に低下した。ＨＳＰ９０はＢｃｒ−Ａｂｌ安定性を調節し
、ＨＳＰ９０阻害後の定常状態のＢｃｒ−Ａｂｌレベルの低下には３時間より多く必要で
ある65。実際、ＣＲＫＬリン酸化の低下がないことにより示されるように、Ｂｃｒ−Ａｂ
ｌ発現または機能の変化は、ｐ−ＳＴＡＴレベルを低下させる時間間隔でＰＵ−Ｈ７１に
関して観察されなかった。また、Ｂｃｒ−Ａｂｌでトランスフェクトされた３２Ｄｃｌ３
細胞におけるＳＴＡＴ５のキナーゼ活性化因子66であるＨＣＫの活性および発現の変化は
見られなかった。
かくして、０〜９０分間隔でのＰＵ−Ｈ７１によるｐ−ＳＴＡＴ５リン酸化の低下は、
Ｂｃｒ−Ａｂｌまたは他のキナーゼの脱安定化によっては説明されない可能性がある。
本発明者らはしたがって、ＰＵ−Ｈ７１の存在下でのｐ−ＳＴＡＴ５レベルの急速な低
下はＰＴＰａｓｅ活性の増加によって説明されてもよいかどうかを試験した。また、主要
な細胞質ＳＴＡＴ５ホスファターゼ67であるＳＨＰ２の発現および活性は、この時間間隔
内では変化しなかった。同様に、ＳＴＡＴシグナリングのスイッチを切る負のフィードバ
ックループを形成する61ＳＯＣＳ１およびＳＯＣＳ３のレベルは、ＰＵ−Ｈ７１により影
響されなかった。
かくして、間隔０〜９０分でＳＴＡＴ５に対する効果がないことは、ＨＳＰ９０阻害の
際のＳＴＡＴ５に対するキナーゼまたはホスファターゼ活性の変化に帰する可能性がある
。代替的機構として、およびＳＴＡＴ５ではなくｐ−ＳＴＡＴ５の大部分がＣＭＬ細胞中
で結合したＨＳＰ９０であるため、本発明者らは、活性化されたＳＴＡＴ５の細胞レベル
がＨＳＰ９０への直接結合により微調整されると仮定した。
ＳＴＡＴの活性化／不活化サイクルは、異なる二量体コンフォメーション間のそれらの
遷移を必要とする。ＳＴＡＴのリン酸化は、リン酸化の際に平行二量体コンフォメーショ
ンを誘発する逆平行二量体コンフォメーション中で起こる。他方、ＳＴＡＴの脱リン酸化
には、広範囲の空間的再配列が必要であり、チロシンリン酸化されたＳＴＡＴ二量体は平
行から逆平行配置にシフトして、ホスファターゼのより良好な標的としてホスホ−チロシ
ンを露出させなければならない68。本発明者らは、ＳＴＡＴ５が、ＨＳＰ９０に結合した
場合にトリプシン切断に対してより感受性であることを見出し、これはＨＳＰ９０の結合
がＳＴＡＴ５のコンフォメーション状態を直接調節し、脱リン酸化に好都合ではなく、お
よび／またはリン酸化に好都合であるコンフォメーションにＳＴＡＴ５を潜在的に維持す
ることを示している。
この可能性を調査するために、本発明者らは、非特異的ＰＴＰａｓｅ阻害剤であるオル
トバナデート（Ｎａ3ＶＯ4）を細胞に添加して、ＳＴＡＴ５の脱リン酸化を遮断するパル
スチェイス戦略を用いた。次いで、残留レベルのｐ−ＳＴＡＴ５を、いくつかの後の時点
で決定した。ＰＵ−Ｈ７１の非存在下では、ｐ−ＳＴＡＴ５は迅速に蓄積したが、その存
在下では、細胞ｐ−ＳＴＡＴ５レベルは低下した。このプロセスの動態は、ｐ−ＳＴＡＴ
５定常状態低下の速度と同様であった。
５．１．９．ＨＳＰ９０はＳＴＡＴ５を含有する転写複合体のすぐ内部で、ＳＴＡＴ５
を活性コンフォメーションに維持する
ＳＴＡＴ５リン酸化および二量体化に加えて、ＳＴＡＴ５の生物学的活性には、その核
移行およびその様々な標的遺伝子への直接結合が必要である64、68。本発明者らはしたが
って、ＨＳＰ９０がＳＴＡＴ５遺伝子の転写活性化も容易にし、かくして、プロモーター
と会合したＳＴＡＴ５転写複合体に関与するかどうかを知りたいと考えた。ＥＬＩＳＡに
基づくアッセイを用いて、本発明者らは、ＳＴＡＴ５がＫ５６２細胞中で構成的に活性で
あり、ＳＴＡＴ５結合コンセンサス配列（５’−ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ−３’）に結合する
ことを見出した。ＳＴＡＴ５活性化およびＤＮＡ結合は、ＰＵ−Ｈ７１を用いるＨＳＰ９
０阻害の際に、用量依存的様式で、部分的に無効化される。さらに、Ｋ５６２細胞中での
定量的ＣｈＩＰアッセイは、重要なＳＴＡＴ５標的ＭＹＣおよびＣＣＮＤ２でのＨＳＰ９
０とＳＴＡＴ５の両方の存在を示した。いずれのタンパク質も、遺伝子間制御領域には存
在しなかった（示さず）。したがって、ＰＵ−Ｈ７１（１μＭ）は、対照遺伝子ＨＰＲＴ
およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ存在量ではなく、ＳＴＡＴ５標的遺伝子ＣＣＮＤ２、ＭＹＣ
、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬＩ62のｍＲＮＡ存在量を減少させた。
まとめると、これらのデータは、ＳＴＡＴ５活性がＣＭＬ細胞中でＨＳＰ９０により正
に調節されることを示す。本発明者らの知見は、ＳＴＡＴ５に結合するＨＳＰ９０がタン
パク質のコンフォメーションを調節し、この機構によって、それがＳＴＡＴ５リン酸化／
脱リン酸化動態を変化させ、ｐ−ＳＴＡＴ５のレベルの上昇に向かうように平衡をシフト
させるシナリオと一致する。さらに、ＨＳＰ９０は、ＳＴＡＴ５含有転写複合体のすぐ内
部で、ＳＴＡＴ５を活性コンフォメーションに維持する。しかしながら、ＳＴＡＴ経路の
複雑性を考慮すると、他の機構の可能性も排除できない。したがって、タンパク質安定性
の促進におけるその役割に加えて、ＨＳＰ９０はクライアントタンパク質を活性コンフォ
メーションに維持することにより発がんを促進する。
より広くは、データは、腫瘍細胞中での発がん性タンパク質機能の支援に最も深く関与
するのは、細胞ＨＳＰ９０のＰＵ−Ｈ７１−ＨＳＰ９０画分であること、および標識され
たＰＵ−Ｈ７１を用いて、特定の腫瘍細胞中で悪性表現型を維持するのに必要とされるタ
ンパク質経路の広い横断面に結合したこの腫瘍ＨＳＰ９０種を同定することができること
を示している。
５．１．１０．ＨＳＰ９０は腫瘍細胞中で２つの異なる形態で存在する
上記で提供された方法は、ｉ）発がん性クライアントタンパク質と会合するＨＳＰ９０
の画分に優先的に結合し、ｉｉ）発がん性クライアント結合配置にＨＳＰ９０をロックす
る、ＰＵ−Ｈ７１のいくつかの特性を利用する。
腫瘍細胞の生存に必要とされるＨＳＰ９０クライアントの同定はまた、ＨＳＰ９０療法
から利益を得る可能性がある患者（すなわち、発現またはリン酸化がＨＳＰ９０阻害の際
に変化するクライアント）の選択のため、および臨床試験中のＨＳＰ９０阻害剤効果の薬
力学的モニタリングのための腫瘍特異的バイオマーカーとしても役立ってもよい。腫瘍特
異的ＨＳＰ９０クライアントプロファイリングは、腫瘍の個別治療標的化のための１つの
手法を提供する。
この研究は、Ｋａｍａｌらの研究を実証し、有意に拡張するものであり、腫瘍中のＨＳ
Ｐ９０はその全体が多シャペロン複合体中に存在すると説明されるが、正常組織に由来す
るＨＳＰ９０は潜在的な非複合体化状態で存在する元のモデルのより洗練された理解を提
供する34。本発明者らは、ＨＳＰ９０ががん細胞中で生化学的に異なる複合体を形成する
ことを示す（図５ａ）。この観点から考えると、がん細胞のＨＳＰ９０の主要画分は正常
細胞と類似する「ハウスキーピング」シャペロン機能を保持するが、がん細胞中で富化さ
れたか、または拡張された機能的に異なるＨＳＰ９０プールは、腫瘍細胞生存を維持する
のに必要とされる発がん性タンパク質と特異的に相互作用する。おそらく、このＨＳＰ９
０画分は、腫瘍細胞状況において拡張され、構成的に維持される細胞ストレス特異的形態
のシャペロン複合体である。本発明者らのデータは、それが悪性表現型を維持するのに必
要な機能を実行してもよいことを示唆する。１つのそのような役割は、突然変異型（すな
わち、ｍＢ−Ｒａｆ）またはキメラ型タンパク質（すなわち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ）の折畳み
を調節することである32、33。本発明者らはここで、さらなる役割に関する実験的証拠を
提示する；すなわち、異常に活性化されたシグナリング複合体に関与する分子の足場およ
び複合体形成を容易にする。ここで、本発明者らは、ＣＭＬにおける構成的ＳＴＡＴ５シ
グナリングの維持におけるＨＳＰ９０のそのような役割を記載する。これらのデータは、
本発明者らが、Ｂ細胞リンパ腫細胞中のＢＣＬ６発がん転写抑制因子により機能的転写抑
制複合体を維持するためにはＨＳＰ９０が必要であることを示した以前の研究70と一致し
ている。
ＨＳＰ９０のＰＵ結合画分と非ＰＵ結合画分とを区別するものは何であろうか？これは
、依然として活発に調査されている非常に複雑な問題である。ＨＳＰ９０αとＨＳＰ９０
βアイソフォームは両方ともＰＵ−Ｈ７１により認識されるが、本発明者らのデータは、
Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＨＳＰ９０（ＰＵ優先的）とＡｂｌ／ＨＳＰ９０（ＰＵ非優先的）シャ
ペロン複合体との少なくとも１つの差異に関する証拠を提供する。すなわち、Ｂｃｒ−Ａ
ｂｌ／ＨＳＰ９０シャペロン複合体は、いくつかのコシャペロンを含む（活発なシャペロ
ニングプロセスが進行中であることを示唆し、Ｈｓｐ７０のサイレンシングに対するＢｃ
ｒ−Ａｂｌの感受性によりさらに支持される）が、Ａｂｌ／ＨＳＰ９０複合体は会合した
コシャペロンを欠く（隔離されているが、活発にシャペロニングされていないＡｂｌであ
る可能性があり、Ｈｓｐ７０ノックダウンに対するＡｂｌの非感受性により支持される）
（図２ｅを参照）。さらに、本発明者らは、クライアントタンパク質により強く結合する
ように突然変異させたＨＳＰ９０がまた、野生型ＨＳＰ９０よりもＰＵ−ビーズにより強
く結合することを観察した（原稿準備中）。最後に、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１および
ゲルダナマイシン結合に対するＨＳＰ９０リン酸化の示差的影響を観察した。これらの知
見は、さらに追跡されているが、様々なＨＳＰ９０阻害剤がシャペロンに対する特異的翻
訳後修飾によって独自に影響されてもよいことを示唆する。総合すれば、これらの予備的
観察は、ＰＵ−Ｈ７１が活発なシャペロンサイクルに関与しているＨＳＰ９０画分を認識
し、この特徴が他のＨＳＰ９０阻害剤によって必ずしも共有されているとは限らないこと
を示している。
５．２．診断および予後適用のための標識されたＨＳＰ９０阻害剤
「発がん性ＨＳＰ９０」の存在量を腫瘍それぞれの様式で測定するために、本開示は、
診断および予後目的で用いることができるいくつかの化学的手段（５．２．１．および５
．２．２．節を参照されたい）を提供する。さらに、化学的手段は、腫瘍関連ＨＳＰ９０
の異種性における新しい洞察を提供し、腫瘍促進的生物学的経路およびタンパク質を調節
する腫瘍特異的ＨＳＰ９０を同定する特定のＨＳＰ９０阻害剤の生化学的特徴を利用する
。そのような手段は、この腫瘍「発がん性ＨＳＰ９０」種を特異的に同定し、これと相互
作用する標識されたＨＳＰ９０阻害剤を含み、腫瘍中の異なるサブ集団中の「発がん性Ｈ
ＳＰ９０」種の存在量を測定し、かくして、ＨＳＰ９０阻害療法に対する感受性を測定お
よび予測することが容易になる。さらに、「発がん性ＨＳＰ９０」の存在量の測定は、腫
瘍がＨＳＰ９０に依存するかどうかを決定するための手段を提供する。
一側面において、本開示は、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性が
あるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細胞中に存在
する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻
害剤と接触させるステップ；
（ｂ）腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定
するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識された
ＨＳＰ９０阻害剤の量を、正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量と比
較するステップを含み、ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識
されたＨＳＰ９０阻害剤の量が参照量と比較してより多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤
に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
その方法は、ＨＳＰ９０療法のバイオマーカーとして、「発がん性ＨＳＰ９０」である
ＨＳＰ９０種の存在量を腫瘍中で測定することを含む。このＨＳＰ９０種の存在量は、腫
瘍中の総ＨＳＰ９０発現と必ずしも相関するとは限らない。本開示は、「発がん性ＨＳＰ
９０」の存在量を測定するためのいくつかの解決法を提供する。１つのそのような態様に
おいては、特定のＨＳＰ９０阻害剤の標識された誘導体を、その存在およびその存在量を
測定するための手段として用いることができる。
さらに、この特定の方法において、ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に
結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量と参照量との比が大きくなるほど、ＨＳＰ９０
阻害剤療法に応答する可能性の規模が大きくなる。
さらに、この特定の方法において、ステップ（ａ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に
結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が大きくなるほど、ＨＳＰ９０阻害剤療法に応
答する可能性の規模が大きくなる。
この特定の方法の一態様においては、正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤
の参照量は、腫瘍に由来する細胞を含有する試料中の正常細胞に結合した標識されたＨＳ
Ｐ９０阻害剤の量である。
別の態様において、正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量は、参照
試料中の正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の所定量である。
別の側面において、本開示は、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性
があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細胞中に存在
する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻
害剤と接触と接触させるステップ；
（ｂ）腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定
するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識された
ＨＳＰ９０阻害剤の量を、参照と比較するステップを含み、ステップ（ｂ）で測定された
腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が、参照量と比較してよ
り多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があることを示す方法を提供する
。
この特定の方法の一態様においては、参照試料は「発がん性ＨＳＰ９０」発現がないか
、ほとんどないがん細胞である。別の態様においては、参照は「発がん性ＨＳＰ９０」に
ほとんど結合しないか全く結合しない相応に標識された化合物である。
検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤を任意の検出可能な標識で標識してもよく、多
くのそのような標識が当業界で周知である。例えば、検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻
害剤を、蛍光標識、ビオチン標識、ＡＮＣＡ標識または放射性標識してもよい。
この特定の方法の実施において、腫瘍は、「発がん性ＨＳＰ９０」、例えば、エキソソ
ームを含有する任意の腫瘍または腫瘍由来生物学的形成物であってもよい。例えば、「発
がん性ＨＳＰ９０」を含有する腫瘍および他の細胞または腫瘍由来生物学的形成物は、結
腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および
慢性骨髄性白血病を含む白血病、リンパ性白血病、多発性骨髄腫、基底細胞がん、メラノ
ーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺
がん、乳がん、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝
臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ
腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸が
ん、および子宮内膜がんを含む婦人科がんからなる群から選択される任意のがんと関連す
る、それを示す、またはそれに由来するものであってもよい。
この特定の方法の実施において、腫瘍、腫瘍細胞または腫瘍関連細胞または生物学的形
成物は、被験体中に存在するか、または被験体から単離されていてもよい。かくして、接
触させようとする腫瘍、腫瘍細胞または腫瘍関連細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでそれ自体固形
腫瘍の形態にあるか、または、例えば、組織試料中もしくは液性腫瘍もしくは生物学的液
体；採血、骨髄吸引、生検、微細針吸引生検もしくは外科的手順の間に得られた試料；生
物学的液体；血液もしくは骨髄内の結合した細胞の形態にあってもよい。標識されたＨＳ
Ｐ９０阻害剤と接触させようとする細胞は、破壊された細胞、生細胞、凍結された細胞、
固定および透過処理した細胞、またはホルマリン固定パラフィン包埋細胞などの任意の形
態で存在してもよい。
検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤は、療法として投与される標識された形態のＨ
ＳＰ９０阻害剤であってもよく、または化学的に関連しないＨＳＰ９０阻害剤を含む標識
された形態の異なるＨＳＰ９０阻害剤もしくは投与される標識された形態のＨＳＰ９０阻
害剤の類似体、相同体もしくは誘導体であってもよい。被験体にとっては、検出可能に標
識されたＨＳＰ９０阻害剤および十中八九は、対応する標識されていないＨＳＰ９０阻害
剤が、多くの腫瘍および腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結
合することが唯一の要件である。これに関連して、「優先的に」とは、ＨＳＰ９０阻害剤
が、あるとすればそれが正常または非腫瘍細胞に特徴的なＨＳＰ９０に結合する場合の親
和性と比較して、実質的により高い親和性で腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に結合すること
を意味する。
現在、療法として投与される可能性が考えられる１つのＨＳＰ９０阻害剤は、ＰＵ−Ｈ
７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似体、相同体もしくは誘導体である。例示的ＨＳＰ９０阻害
剤の説明については、例えば、米国特許第７，８２０，６５８Ｂ２号；第７，８３４，１
８１Ｂ２号；および第７，９０６，６５７Ｂ２号（これらは全て、その全体が参照により
ここに組込まれる）を参照されたい。
一態様においては、ＨＳＰ９０阻害剤はＰＵ−Ｈ７１であり、検出可能に標識されたＨ
ＳＰ９０阻害剤は、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似体、相同体、もしくは誘導体
の形態である。検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤であってもよいＰＵ−Ｈ７１の形
態の例としては、限定されるものではないが、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１、ＰＵ−Ｈ７１
−ＦＩＴＣ２もしくはＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１、またはＰＵ−Ｈ７１のビオチン化類似体
、例えば、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−５、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−６、ＰＵ−Ｈ７１−
ビオチン−８もしくはＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−９が挙げられ、以下に説明される。
したがって、ＰＵ−Ｈ７１の標識された誘導体、例えば、放射標識された［124Ｉ］−
ＰＵ−Ｈ７１、［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１、［123Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１、蛍光標識されたＰ
Ｕ−Ｈ７１、ビオチン標識されたＰＵ−Ｈ７１、またはＡＮＣＡ標識された阻害剤を、腫
瘍特異的ＨＳＰ９０腫を同定および定量するための手段として用いることができる。この
腫瘍ＨＳＰ９０腫の存在量を、ＨＳＰ９０療法に対する応答を予測するバイオマーカーと
して用いることができる。
５．２．１．発がん性ＨＳＰ９０を検出するための蛍光、ビオチン化およびＡＮＣＡ標
識されたプローブ
本開示は、がん細胞中の発がん性ＨＳＰ９０を検出することができる蛍光標識された、
ビオチン化プローブおよびＡＮＣＡ標識されたプローブを提供する。５．２．１．１．節
は、本開示に従って用いられる様々な種類のプローブの生成を説明する。５．２．１．２
節は、予後および診断アッセイにおけるそのようなプローブの使用を説明する。
５．２．１．１．プローブの生成
本開示は、細胞透過性であり、「発がん性ＨＳＰ９０」に選択的に結合する、蛍光標識
された、ビオチン化されたおよびＡＮＣＡ標識された阻害剤を提供する。細胞透過性阻害
剤は、細胞の細胞膜に浸透し、細胞の細胞質内のＨＳＰ９０に結合することができる。本
発明の方法において有用であるためには、標識された阻害剤は当業者には公知の検出方法
によって測定可能である量で細胞に浸透しなければならない。５．２．１．１．１．節は
、細胞透過性であり、「発がん性ＨＳＰ９０」に選択的に結合することができる様々な蛍
光標識されたプローブの開発を説明する。５．２．１．１．２．節は、細胞透過性であり
、「発がん性ＨＳＰ９０」に選択的に結合することができる様々なビオチン化されたプロ
ーブの開発を説明する。５．２．１．１．３．節は、細胞透過性であり、「発がん性ＨＳ
Ｐ９０」に選択的に結合することができる様々なＡＮＣＡ標識されたプローブの開発を説
明する。
５．２．１．１．１．蛍光標識されたプローブ
ＨＳＰ９０の蛍光標識された阻害剤は既に報告されており、ゲルダナマイシン（ＧＭ−
ＦＩＴＣ13、ＧＭ−Ｂｏｄｉｐｓｙ13、ＧＭ−ｃｙ３ｂ14）ならびにピラゾール１（フル
オレセイン類似体、ＶＥＲ−０００４５８６４）15の類似体が、蛍光偏光アッセイにおけ
るリガンドとして用いられている（図８）。細胞を透過しないＧＭ−ＦＩＴＣ誘導体を用
いて、蛍光顕微鏡観察により細胞表面ＨＳＰ９０を同定した16。しかしながら、ＨＳＰ９
０は主に細胞質タンパク質であり、細胞表面発現は特定の細胞中でのみ検出される1、2。
かくして、細胞内と細胞表面の両方のＨＳＰ９０を分析するためには、蛍光プローブが必
要である。
フローサイトメトリーによる細胞内抗原の検出に用いられる固定／透過処理方法は、異
種集団中の細胞の特性評価のためのフローサイトメトリーにおいて有用な特性である「発
がん性ＨＳＰ９０複合体」ならびに細胞形態および表面免疫反応性の破壊をもたらしても
よいため、「発がん性ＨＳＰ９０」と特異的に、また堅く相互作用するＨＳＰ９０細胞透
過性プローブは、この潜在的なバイオマーカーのフローサイトメトリー測定にとって好ま
しい。この問題を解決するために、本開示は、生細胞を透過し、標的に結合する蛍光標識
されたＨＳＰ９０阻害剤の合成、特性評価および評価のための方法を提供する。
本開示は、様々な新しい蛍光標識されたＰＵ−Ｈ７１の誘導体（２）、ＨＳＰ９０のプ
リン足場阻害剤（図８）を提供し、蛍光活性化フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡観
察によりＨＳＰ９０を試験するためのプローブとしてのその生物学的適用を記載する。Ｂ
ＩＩＢ０２１、ＭＰＣ−３１００、ＰＵ−Ｈ７１およびＤｅｂｉｏ０９３２（以前はＣＵ
ＤＣ−３０５）などのプリン足場に基づくいくつかのＨＳＰ９０阻害剤は現在、がんのた
めの臨床開発中である18、19。
ＰＵ−Ｈ７１にコンジュゲートしたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、
４−ニトロベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール（ＮＢＤ）または赤色にシフトした染
料スルホローダミン１０１（テキサスレッド）のいずれかを含む熱ショックタンパク質９
０（ＨＳＰ９０）のための蛍光リガンドを合成した（図９）。これらの化合物のうちの２
つ、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（９）およびＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１（８）は、蛍光活性
化フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡観察にとって好適であることが示された。かく
して、これらの分子は、異種生細胞集団中でＨＳＰ９０を試験するための有用なプローブ
として役立つ。
染料標識された小分子リガンドの開発のために、最適なフルオロフォアとその結合部位
の選択は関連する。特に、小分子においては、導入される染料はリガンドの生化学的およ
び薬理学的特徴に大きく影響し得る。ＨＳＰ９０に結合したＰＵ−Ｈ７１（２）のＸ線結
晶構造によれば20、リガンドのＮ９−アルキルアミノ鎖は溶媒の方を向いている。この結
果として、ならびに以前のＳＡＲの結果として、本開示において合成されるいくつかの化
合物は、Ｎ９位置に結合した蛍光標識を含有する。特定の態様においては、以下に記載の
ように、異なるリンカーを含むＰＵ−Ｈ７１の誘導体を、ＦＩＴＣ、ＮＢＤまたはテキサ
スレッド（ＴＲ）のいずれかで標識した（図１を参照されたい）。
本開示の一態様においては、６個の炭素のスペーサーを、プリン足場に基づく阻害剤の
構成アミンに付加し、それによって、化合物３を提供した（スキーム１および図１０）。
本発明者らは固相支持体にＰＵ−Ｈ７１を結合させるためにこのリンカーを以前に使用し
、化合物３がＨＳＰ９０に対する良好な親和性を保持することを示した21。スキーム１に
記載されるように、化合物３を、ＤＭＦ／Ｅｔ3Ｎ中でＦＩＴＣと反応させて、ＨＰＬＣ
による精製後に４０％の収率で化合物４（ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ１）を得た。
別の態様においては、ＤＭＦ中で化合物３とスルホローダミン１０１スルホニルクロリ
ドとの反応により、ＨＰＬＣによる精製後に６１％の収率で化合物５を得ることにより、
ＰＵ−Ｈ７１−テキサスレッド（化合物５；ＰＵ−Ｈ７１−ＴＲ）を合成した（スキーム
１）。ＮＢＤ類似体の場合、ブロミド６をＤＭＦ中で化合物７と反応させて、４７％の収
率で化合物８（ＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１）を得た（スキーム１）。化合物６21およびＮＢ
Ｄ誘導体７22を、以前に記載のように調製した。
別の態様において、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１中に存在する第二級アミン23を利用し
、それをＦＩＴＣまたはＮＢＤ−Ｃｌと直接反応させて、それぞれ、化合物９（ＰＵ−Ｈ
７１−ＦＩＴＣ２）（７２％）または化合物１０（ＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ２）（４０％）
を得た（スキーム２および図１１）。アミンへの直接的な染料の結合は、イオン化可能な
アミン官能基の存在のため、細胞透過性のより高い類似体をもたらすと仮定された。さら
に、水素の代わりにイソプロピル基を含有する誘導体（例えば、化合物９および化合物１
０）は、化合物をより親油性にし、その細胞透過性を増強する。
さらに別の態様においては、スキーム３および図１２に示されるように、デスイソプロ
ピル−ＰＵ−Ｈ７１（化合物１３）をＦＩＴＣまたはＮＢＤ−Ｃｌと反応させて、それぞ
れ、化合物１４（ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ３）（７４％）または化合物１５（ＰＵ−Ｈ７
１−ＮＢＤ３）（４２％）を得た。Ｎ−（３−ブロモプロピル）−フタルイミドを用いる
化合物１１のＮ９−アルキル化およびその後のヒドラジンを用いるフタルイミドの除去に
より、化合物１３を合成した（スキーム３）。
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ３（スキーム３に示される）と類似するが、異なる長さのリン
カーを有するさらなる化合物を、スキーム４に示されるように調製した。
スキーム１〜４で調製された化合物を、細胞を透過し、細胞内のＨＳＰ９０に結合する
その能力について評価した。フローサイトメトリーによる細胞内抗原の検出のために用い
られる固定／透過処理方法は、異種集団中の細胞の特性評価のためのフローサイトメトリ
ーにおいて有用な特性である細胞形態および表面免疫反応性の破壊をもたらすことが多い
ため、細胞透過性プローブが好ましい。かくして、固定および透過処理ステップを必要と
することなく、生細胞中の標的と相互作用する細胞透過性リガンドを見出すことが特に興
味深い。
上記の合成された蛍光標識されたＰＵ−Ｈ７１誘導体が親化合物であるＰＵ−Ｈ７１の
細胞透過性プロフィールを保持することを調査するために、本発明者らは、ヒト急性骨髄
性白血病（ＡＭＬ）細胞系ＭＶ４−１１およびＭＯＬＭ−１３中でこれらのＨＳＰ９０プ
ローブの細胞透過性を検査した。スキーム１〜４で調製されたＰＵ−Ｈ７１の１０種の蛍
光誘導体のうち、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（９）およびＰＵ−Ｈ７１−
ＮＢＤ１（８）が細胞を透過し、ＨＳＰ９０に結合する最も高い能力を有することを見出
した（図１３）。具体的には、本発明者らは、これらの２つの誘導体による生細胞の効率
的な染色（図１３Ａ）ならびに標的（ＨＳＰ９０）阻害を示すこれらの細胞中での生物学
的活性（図１３Ｂ、１３Ｃ）を示す。特に、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（
９）とＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１（８）は両方とも、ＭＯＬＭ−１３細胞の生存能力（図１
３Ｂ）、ＨＳＰ９０クライアントタンパク質、例えば、突然変異ＦＬＴ３およびＲａｆ−
１の分解と関連する効果（図１３Ｃ）を低下させることを示し、これは、これらのがん細
胞中で細胞内ＨＳＰ９０阻害を示す1〜3。
さらに、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（９）で染色された白血病細胞の共焦点蛍光顕微鏡
観察により、顕著な細胞内局在化が示された（図１４Ａ）。これらの実験においては、生
細胞と非生細胞とを区別するための生細胞染料として、ＤＡＰＩを用いた。この染料は試
験濃度では生細胞中で非透過性であるが、非生細胞を透過し、ＤＮＡの特定の領域に結合
する。ＤＡＰＩはＵＶレーザーを含む多くの装置中で励起される。ＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ
１（８）に関しても同様のデータが生成された（示さず）。
フローサイトメトリーは、特定のマーカーの使用により、正常および悪性造血中の異な
る細胞集団を分離および区別するために一般的に用いられる。一例として、芽細胞はｄｉ
ｍＣＤ４５染色（ＣＤ４５ｄｉｍ）により定量および特性評価されることが多いが、それ
とは対照的に、循環中の非芽細胞集団はＣＤ４５染色について明るい（ＣＤ４５ｈｉ）24
。本発明者らはここで、その同定マーカーの存在によりゲートをかけ分離したこれらの細
胞を、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２を用いて標的であるＨＳＰ９０について染色することも
できることを示す（図１４Ｂ）。ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍細胞ＨＳＰ９０への選択的結合を示
す以前の報告23と一致して、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２は、一次急性骨髄性白血病試料中
の正常細胞（リンパ球）集団ではなく、悪性細胞（芽球）を優先的に染色した（図１４Ｂ
）。
したがって、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（９）およびＰＵ−Ｈ７１−Ｎ
ＢＤ１（８）が生細胞を透過し、標的に結合することを示す。具体的には、本発明者らは
、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２およびＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１が生細胞を染色し（図１３Ａ
）、白血病細胞の生存能力を低下させ（図１３Ｂ）、ＨＳＰ９０クライアントタンパク質
の分解により示されるように細胞内ＨＳＰ９０を阻害し（図１３Ｃ）、共焦点顕微鏡によ
り示されるように細胞内に局在化し（図１４Ａ）、フローサイトメトリーにより示される
ように腫瘍対正常細胞のＨＳＰ９０に特異的に結合して（図１４Ｂ）、これらのプローブ
が、ＰＵ−Ｈ７１と同様、細胞を透過し、腫瘍ＨＳＰ９０標的に特異的に結合する豊富な
証拠を提供する。図４、図１５、図１６および図１８に提供される例はまた、ＰＵ−Ｈ７
１のこれらの蛍光誘導体が「発がん性ＨＳＰ９０」種と相互作用することを示し、さらに
、広範囲のがん細胞においてこの種を定量するための手段を提供する。５．２．１．２．
節で考察されるように、ＰＵ−Ｈ７１のこれらの蛍光誘導体を、蛍光活性化フローサイト
メトリーのためのプローブとして、または蛍光顕微鏡観察によるＨＳＰ９０と標的との相
互作用をリアルタイムでモニタリングするための手段として適用することができる。
上記で考察された結果に基づいて、本発明者らは、ＨＳＰ９０と相互作用することがで
き、かくして、診断的および／または予後的手段として用いることができる様々な他の細
胞透過性プローブを設計した。一態様において、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と類似するが
、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール環上に異なる置換基を有する化合物を、スキーム
５に示されるように、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と同様の様式で合成した。
別の態様においては、スキーム５に示される化合物と類似するが、プリン足場上のピリ
ミジン環がピリジン環で置きかえられた化合物を、スキーム６に示されるように、ＰＵ−
Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と同様の様式で合成した。
別の態様においては、化合物ＰＵ−ＦＩＴＣ７を、スキーム７に示されるように調製す
る。
別の態様においては、化合物ＰＵ−ＦＩＴＣ８を、スキーム８に示されるように調製す
る。
別の態様においては、化合物ＰＵ−ＦＩＴＣ９を、スキーム９に示されるように調製す
る。
さらに別の態様においては、化合物ＤＺ１３−ＦＩＴＣ１（ＰＵ−ＤＺ１３−ＦＩＴＣ
）を、スキーム１０に示されるように調製する。
さらに別の態様においては、化合物ＳＮＸ−ＦＩＴＣを、スキーム１１に示されるよう
に調製する。
５．２．１．１．２．発がん性ＨＳＰ９０を検出するためのビオチン化プローブの合成
ＰＵ−Ｈ７１（２）およびデスイソプロピル−ＰＵ−Ｈ７１（１３）の一連のビオチン
化類似体を、細胞膜を透過し、生細胞中の細胞内ＨＳＰ９０に結合することができる化合
物を取得するために調製した。ＨＳＰ９０阻害剤１３および２を、リンカーを介してビオ
チンにコンジュゲートさせた。リンカーの種類、ならびにその長さを体系的に変化させて
、生細胞中に透過し、ＨＳＰ９０に結合することができる化合物を同定した。
ビオチンタグは、その後のストレプトアビジンへの結合を介するプルダウン実験を可能
にする。リンカーは、ＨＳＰ９０およびストレプトアビジンへの同時的結合を可能にする
のに十分な長さのものであるべきである。
ビオチンタグはまた、標識されたストレプトアビジンまたはアビジン抗体を用いる検出
を可能にし、かくして、ビオチン化されたＨＳＰ９０阻害剤は、「発がん性ＨＳＰ９０」
を検出するために組織を染色する際に有用であり得る。
化合物１３および化合物２は、アミド結合の形成を介するビオチンおよびビオチン含有
リンカーの直接的結合を可能にするアミン官能基を含有する。一態様においては、ビオチ
ン化された分子を、リンカーを用いずに調製した（すなわち、ビオチンへの直接的結合）
。ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン２およびＰＵ−Ｈ７１−ビオチン３と呼ばれる、２つのそのよ
うな化合物の合成を、スキーム１２に示す。この化合物を、超音波処理下でのＤ−ビオチ
ンとのＤＣＣカップリングにより、それぞれ、化合物１３または化合物２から調製しても
よい。
別の態様においては、スキーム１３に示されるように、６−炭素鎖スペーサー基を介し
てビオチンにＰＵ−Ｈ７１（２）またはデスイソプロピル−ＰＵ−Ｈ７１（１３）を共有
結合させることによりビオチン化された分子を調製して、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン４また
はＰＵ−Ｈ７１−ビオチン７を生成した。化合物１３または化合物１２を、それぞれ、塩
基の存在下で、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと呼ばれる、ビオチ
ン分子を含有する市販のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと反応させることに
より、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン４およびＰＵ−Ｈ７１−ビオチン７を調製してもよい。
さらに別の態様においては、スキーム１４に示されるように、長い炭素鎖スペーサー基
を介してビオチンにＰＵ−Ｈ７１（２）またはデスイソプロピル−ＰＵ−Ｈ７１（１３）
を共有結合させることによりビオチン化された分子を調製して、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン
５またはＰＵ−Ｈ７１−ビオチン８を生成した。化合物１３または化合物１２を、それぞ
れ、塩基の存在下で、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンと呼ば
れる、ビオチン分子を含有する市販のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと反応
させることにより、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン５およびＰＵ−Ｈ７１−ビオチン８を調製し
てもよい。
さらに別の態様においては、スキーム１５に示されるように、ポリエチレングリコール
鎖を介してビオチンにＰＵ−Ｈ７１（２）またはデスイソプロピル−ＰＵ−Ｈ７１（１３
）を共有結合させることにより、ビオチン化された分子を調製して、ＰＵ−Ｈ７１−ビオ
チン６またはＰＵ−Ｈ７１−ビオチン９を生成した。化合物１３または化合物１２を、そ
れぞれ、塩基の存在下で、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチンと呼
ばれる、ビオチン分子を含有する市販のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと反
応させることにより、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン６およびＰＵ−Ｈ７１−ビオチン９を調製
してもよい。
スキーム１６に示されるさらに別の態様においては、ブロミド化合物６と、ＥＺ−Ｌｉ
ｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチンとの反応により、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン
と呼ばれる、アミン結合ビオチン類似体を合成した。
ビオチン化された化合物がＨＳＰ９０に対する親和性を依然として保持することを確保
するために、ＳＫＢｒ３がん細胞溶解物を用いる蛍光偏光アッセイにおいてそれらをそれ
ぞれ評価した。見ての通り、それぞれの化合物はＨＳＰ９０に対する良好な親和性を保持
し、そのＩＣ50は３１〜１５４ｎＭの範囲である（表１；ＰＵ−Ｈ７１、ＩＣ50＝２５ｎ
Ｍ）。
２つの一般的な傾向を観察することができる。第一に、ＰＵ−Ｈ７１類似体と比較して
、デスイソプロピル類似体は、平均して約２倍高い親和性で結合する（すなわち、ＰＵ−
Ｈ７１−ビオチン３対−２、−４対−７、−５対−８、−６対−９）。第二に、リンカー
に関して、炭素系はエチレングリコール系よりも強力である（すなわち、ＰＵ−Ｈ７１−
ビオチン４および−５対−６、−７および−８対−９）。まとめると、調製された全ての
化合物がＨＳＰ９０との良好な親和性を保持し、さらなる分析にとって好適であった。
調製されたビオチン化された分子の各々がＨＳＰ９０に対する良好な親和性を保持する
ことが示されたので、本発明者らは次に、鎖の長さがＨＳＰ９０およびストレプトアビジ
ンへの同時的結合を維持するのに十分であるかどうかを決定しようとした。Ｋ５６２溶解
物（５００μｇのタンパク質）を、ストレプトアビジンビーズと１００μＭの各化合物と
の混合物で一晩処理した。未結合の材料を除去するための十分な洗浄後、残存するビーズ
ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルを洗浄し、クマシーブルーで１時間染
色した。ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−５、−６、−８、−９ならびにＰＵ−Ｈ７１−ビオチ
ンは、約９０ｋＤａにバンドを示し、これはＨＳＰ９０およびストレプトアビジンへの同
時的結合を示す。リンカーを含まない類似体（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン２および−３）な
らびに６−炭素スペーサー基を含む類似体（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン４および−７）は、
９０ｋＤａにバンドを示さなかったが、これは、リンカーが短すぎることを示している。
対照的に、長い炭素鎖スペーサー基を含有する化合物（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン５および
−８）ならびにポリエチレン鎖を含有する化合物（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン６および−９
）は、同時的結合を可能にするのに十分な長さのものであった。
いくつかの分子がＨＳＰ９０およびストレプトアビジンに同時に結合することが示され
たので、本発明者らは次に、これを生細胞においても同様に達成することができるかどう
かを調査した。この場合、１００μＭのＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−５、−６、−８、−９
ならびにＰＵ−Ｈ７１−ビオチンで４時間処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する
ことにより、Ｋ５６２細胞中での結合を最初に決定した。評価した化合物のうち、ＰＵ−
Ｈ７１−ビオチンのみが生細胞中での結合を維持することができなかった。興味深いこと
に、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチンは、その透過性を制限するイオン化可能なアミンを含有し、
その結合の失敗に関する主要な因子であってよい。対照的に、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−
５、−６、−８、−９は、イオン化可能なアミンを含有し、細胞膜を透過することができ
る。活性化合物を５０、２５および１０μＭで評価したところ、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン
−６および９が１０μＭでも良好な結合を維持することを示す。これらの２つの化合物を
５、２．５および１μＭでさらに評価したところ、最も低い濃度でも、約９０ｋＤａに偽
バンドが依然として存在する。ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−６はさらに、０．５μＭでも偽
バンドを示し、これは、同時的結合が依然としてこの低濃度で維持されることを示してい
る。
長い炭素鎖スペーサー基を含有する化合物（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−５、−８）また
はポリエチレングリコール鎖リンカーを含有する化合物（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−６、
−９）は、１３または２が結合するかどうかに関わらず、Ｋ５６２細胞の細胞膜を透過し
、ＨＳＰ９０に結合した後、ストレプトアビジンビーズに結合することができると考えら
れる。さらに、ポリエチレングリコール鎖リンカーを含有する化合物（ＰＵ−Ｈ７１−ビ
オチン−６、−９）が好ましいものであるかのように考えられる。
５．２．１．１．３．ＡＮＣＡ標識されたプローブの合成
本開示は、阻害剤をアミノナフタレニル−２−シアノ−アクリレート（ＡＮＣＡ）で標
識することにより発がん性ＨＳＰ９０を検出するためのプローブをさらに提供する。ＡＮ
ＣＡは、ヒト組織中のアミロイド斑に結合し、これを染色することができる蛍光プローブ
である。ＡＮＣＡは、分子ローターと呼ばれることも多い。分子ローターは、蛍光量子収
率が周囲の環境に依存するプローブである。分子ローターの構造モチーフは、大分子のす
ぐ近くに持って行った場合、内部分子回転が阻害され（剛性が増加する）、蛍光放出の変
化をもたらす、すなわち、結合した、および未結合の分子ローターが異なる蛍光放出ピー
クを有するようなものである（図１５を参照されたい）。「発がん性Ｈｓｐ９０」に対す
る特異性を有する、ＰＵ−Ｈ７１にコンジュゲートさせる場合、この物理的側面を活用す
ることができる。ＰＵ−Ｈ７１にコンジュゲートした分子ローターにより、がん細胞の異
種集団中で、「発がん性Ｈｓｐ９０」を含む細胞を識別することができ、介入、例えば、
生検、手術または微細針吸引生検から得られた標本中に存在する細胞中でのそのような種
の定量が可能になる。
一態様においては、デスイソプロピル−ＰＵ−Ｈ７１（１３）、ＰＵ−Ｈ７１（２）ま
たは１３もしくは２の化合物類似体を、スキーム１７に示されるように、ＡＮＣＡで標識
してもよい。スキーム１７において、デスイソプロピル−ＰＵ−Ｈ７１（１３）を、シア
ノ酢酸と反応させて、化合物２６を生成する。次のステップにおいて、化合物２６を、高
温で化合物２７と反応させて、化合物２８（ＰＵ−ＡＮＣＡ）を得る。
さらに別の態様において、本発明において有用なＡＮＣＡ標識されたＨＳＰ９０阻害剤
、例えば、プリンに基づくものを、スキーム１８に示す。
さらに別の態様においては、本発明において有用なＡＮＣＡ標識されたＨＳＰ９０阻害
剤、例えば、イミダゾピリジンに基づくものを、スキーム１９に示す。
５．２．１．２．がんの予後および処置におけるプローブの利用
５．２．１．２．１．血液悪性腫瘍
５．１節で考察された試験は、特定のＨＳＰ９０阻害剤が、正常細胞におけるよりもが
ん細胞においてより豊富である「発がん性ＨＳＰ９０」であるＨＳＰ９０種のサブセット
に優先的に結合することを確認するものである。この種の存在量は、単にＨＳＰ９０発現
の量によって決定されるものではなく、ＨＳＰ９０阻害に対する細胞の感受性を予測する
ものである。かくして、この「発がん性ＨＳＰ９０」、例えば、ＰＵ−Ｈ７１を選択する
タグ付けされた阻害剤への結合に利用可能である患者のがん細胞におけるＨＳＰ９０集団
の割合の決定は、診療所におけるＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性を予測し、がん細胞が
ＨＳＰ９０に依存するレベルを示す。
具体的には、本開示は、細胞透過性の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤、例えば、ＰＵ
−Ｈ７１−ＦＩＴＣ誘導体（例えば、ＰＵ−ＦＩＴＣ；ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２）が、
曝露の早くも１時間後には生細胞を標識し、２４〜４８時間で白血病細胞の生存能力を低
下させ、ＨＳＰ９０クライアントがんタンパク質の分解により示されるように細胞内腫瘍
ＨＳＰ９０を阻害し、共焦点顕微鏡観察により示されるように細胞内に局在化し、フロー
サイトメトリーにより示されるように正常細胞のＨＳＰ９０に対して腫瘍に特異的に結合
することを示す。さらに、本開示の蛍光標識された化合物は、「発がん性ＨＳＰ９０」種
に結合し、このプローブが、ＰＵ−Ｈ７１と同様、細胞に透過し、腫瘍の「発がん性ＨＳ
Ｐ９０」標的に特異的に結合することの豊富な証拠を提供する。
本開示の方法を用いて、血液悪性腫瘍（例えば、白血病）または骨髄増殖性障害を有す
る患者がＨＳＰ９０阻害療法に応答するかどうかを決定してもよい。この方法を、限定さ
れるものではないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病および慢性骨髄性白血
病などの白血病、リンパ性白血病、多発性骨髄腫ならびに骨髄増殖性新生物および障害な
どの様々な血液悪性腫瘍に適用してもよい。
本開示は、血液のがんを有する患者がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性
があるかどうかを決定するための方法であって、患者に由来するがん細胞および非がん細
胞（例えば、リンパ球）を含有する試料を、患者のがん細胞中に存在する腫瘍特異的形態
のＨＳＰ９０に優先的に結合する細胞透過性の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接触さ
せること、試料中のがん細胞および非がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害
剤の量を測定すること、ならびにがん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の
量を、非がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量と比較することを含み
、がん細胞に結合した蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が非がん細胞よりも多い場合
、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があることを示す方法を提供する。特定の態
様においては、細胞透過性の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤に結合する量は、フローサ
イトメトリーを用いて決定される。
いくつかの態様においては、血液がん細胞と正常リンパ球との結合比率が約１．５以上
である場合、がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に感受性があることを示す。他の態様におい
ては、血液がん細胞と正常リンパ球との結合比率が約２以上である場合、がん患者がＨＳ
Ｐ９０阻害療法に感受性があることを示す。さらに他の態様においては、血液がん細胞と
正常リンパ球との結合比率が約２．５以上である場合、がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に
感受性があることを示す。さらに他の態様においては、血液がん細胞と正常リンパ球との
結合比率が約３以上である場合、がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に感受性があることを示
す。さらに他の態様においては、血液がん細胞と正常リンパ球との結合比率が約４以上で
ある場合、がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に感受性があることを示す。さらに他の態様に
おいては、血液がん細胞と正常リンパ球との結合比率が約５以上である場合、がん患者が
ＨＳＰ９０阻害療法に感受性があることを示す。
ＨＳＰ９０阻害剤への曝露の際の細胞透過性の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤（例え
ば、ＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２）の結合と、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞生存能力との相関分
析を行うことにより、多数の確立された細胞系および一次腫瘍試料を調査した。細胞系お
よび一次白血病試料のパネルへのＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２結合を決定するために、本発明
者らは、複数パラメータのフローサイトメトリー分析を用いた。本発明者らはまた、薬剤
曝露の４８時間後に生存能力アッセイを実施することにより、これらの細胞のＨＳＰ９０
阻害剤への感受性を試験した。
蛍光活性化フローサイトメトリーは、依然として細胞を計数し、精製し、分析するため
の選別方法である9、10。事実、多くの測定を現在フローサイトメトリーにより実施する
ことができるが、最近の技術的進歩により、これらの測定を異種集団内の個々の細胞に対
して同時に行うことができるようになっている11。そのような複数パラメータ分析は、少
ない試料からより多くのデータを提供するため非常に強力であり、患者試料が限られる場
合は重要な考慮となる。複数パラメータ分析はまた、いくつかの試薬に結合する望ましく
ない細胞を排除することにより、集団のより正確な同定を可能にする9、10。かくして、
この方法は、蛍光標識された場合、ＨＳＰ９０リガンドの異なる細胞集団への結合の分析
にとって最適である。
蛍光標識されたリガンドは、生物学および薬理学における様々な使用12、ならびに非標
識リガンドの薬理学的特性を残す利点を歴史的に有してきた。リガンド−受容体結合のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでの調査に加えて、小分子蛍光プローブは、例えば、フローサイトメトリ
ーを用いる、生細胞集団中での標的とリガンドとの相互作用のリアルタイムで非侵襲的な
モニタリングを可能にする。
蛍光染料は特定の波長で光を吸収し、次いで、より高い波長でその蛍光エネルギーを放
出する。それぞれの染料は異なる放出スペクトルを有し、フローサイトメトリーによる多
色分析に活用することができる。最も用いられるのは、フルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）、４−ニトロベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール（ＮＢＤ）または赤
色にシフトした染料スルホローダミン１０１（テキサスレッド）である。ＦＩＴＣおよび
ＮＢＤは多くの装置上でＦＬ１チャンネル中で検出され、蛍光顕微鏡観察のための良好な
選択でもある（それぞれ４９５および４６６ｎＭで励起され、５１９および５３９ｎＭで
放出される）が、テキサスレッドは単一レーザー装置上でＦＬ３中で検出される（５８９
ｎＭで励起され、６１５ｎＭで放出される）。
５．１．１．節において、本発明者らは、いくつかの一次白血病細胞および正常血液細
胞に関する試験を考察した。特に、本発明者らは、芽球（悪性細胞集団）とリンパ球（正
常細胞集団）との両方、健康なドナーの臍帯血から単離されたＣＤ３４＋細胞、末梢血に
由来する総単核細胞およびまた末梢血白血球（ＰＢＬ）を含む、一次慢性および急性転化
期ＣＭＬならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料を分析した（図１ｃ〜ｅ、３、４）。
本発明者らは、異種細胞集団において、複数パラメータフローサイトメトリー分析を実施
するための手段として蛍光標識されたＰＵ−Ｈ７１（ＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２）を用いた
。図４ａに示されるように、正常細胞集団（リンパ球）と悪性細胞集団（芽球）とを区別
するためのゲーティング戦略を用いる。３人の異なる患者に関するフローサイトメトリー
ドットブロットを示す。図４ｂにおいて、ＣＭＬ芽球中のＨＳＰ９０に結合するＰＵ−Ｈ
７１−ＦＩＴＣ２と、一次患者試料に由来する正常リンパ球との比を示す。
図４ｄにおいて、フローサイトメトリーを再度用いて、芽球と正常リンパ球とを区別し
、芽球ゲート内のＣＤ３４＋細胞の結合を分析する。図４ｅおよび４ｇにおいて、ＨＤＰ
９０ ＣＤ３４＋芽球に結合するＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と、６人の白血病患者および
３人の健康な患者中の正常リンパ球との比を決定した。９人の患者を、ＰＵ−Ｈ７１−Ｆ
ＩＴＣ２または対照（ＴＥＧ−ＦＩＴＣ）で処置した（図４ｆおよび４ｈ）。図４ｈに示
されるように、最も高い比を有する患者（ＣＭＬ０３１０６、０６１４および０１２４と
呼ぶ；図４ｇで「ｂｃＣＭＬ」として平均化された比）は、より低い比を有する患者（Ｃ
ＭＬ０１１８、０１２８および０２２２と呼ぶ；図４ｇで「ｃｐＣＭＬ」として平均化さ
れた比）よりも感受性が高かった。健康な患者は１に近い比（図４ｇ）を有し、臍帯血中
のそれらの細胞はＰＵ−Ｈ７１に対する感受性が有意に低かった（図４ｈ、ＣＢ１、２、
３と呼ぶ）ことがわかる。図４ｆに示される結果は、ＣＤ３４＋芽球の生存能力は患者に
おいて有意に低下したが、正常リンパ球は影響されなかったことを示している。同様に、
対照化合物（ＴＥＧ−ＦＩＴＣ）は、ＣＤ３４＋芽球または正常リンパ球のいずれかの生
存能力を低下させなかった。
一次試料中で、本発明者らは、同じ患者中の芽球集団と正常リンパ球との両方を分析し
た。本発明者らは、一次白血病細胞（一次慢性および急性転化期慢性骨髄性白血病（ＣＭ
Ｌ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料）、ならびに健康な血液細胞（ＣＤ３４＋臍
帯血細胞、および健康なドナーから単離された総末梢血単核細胞を含む）から構成される
パネルにおいて、ＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２に対する最も高いアビディティを有する細胞も
この薬剤による殺傷に対して最も感受性が高いことを見出した（図１６）。重要なことに
、白血病の血液試料中に存在する正常リンパ球は、ＰＵ−ＦＩＴＣに対する低い結合を示
し、ＰＵ−Ｈ７１により影響されなかった。かくして、本発明者らは、同じ患者中の正常
リンパ球と比較した白血病細胞中でのＰＵ−ＦＩＴＣの相対的結合の使用を、ＰＵＨ７１
−ＦＩＴＣ２結合を試料にわたって比較するための正規化された値として用いることがで
きることを理論的に説明した。具体的には、ＣＭＬ試料中で評価した場合、急性転化ＣＭ
Ｌ（ｂｃＣＭＬ）細胞がＰＵ−ＦＩＴＣに対する最も高い結合を提示し（正常リンパ球と
比較して４倍を超える）、慢性期（ｃｐＣＭＬ）と比較した場合、ＰＵ−Ｈ７１処置に対
する最も高い感受性を示した（図１６）。対照的に、ＰＵ−Ｈ７１は、正常血液細胞にお
いてＨＳＰ９０に弱く結合し（ｂｃＣＭＬ中の約１００ｎＭに対して２，０００ｎＭより
高いＩＣ50値）、がん細胞に対して毒性的である濃度でこれらの細胞中で非毒性的であっ
た（図１ｄ、ｅおよび１６Ｂ、Ｃ）。図１６Ｃは、１９個の一次ＡＭＬ試料中で芽球およ
び正常リンパ球へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２の結合を分析することにより得られた比（
Ｘ軸上でＰＵ結合倍数として報告される）と、ＰＵ−Ｈ７１で処置した場合の芽球の測定
された生存率とを相関させるグラフを示す。非応答性（生存率が５０％未満低下した）腫
瘍細胞から応答性（生存率が５０％を超えて低下した）腫瘍細胞を、それぞれ、約０．６
５〜約２．２２以下と比較して、約２．３１〜約７．４３以上の比により区別することが
できる。
さらに、１４種の白血病細胞系のパネルにおいて、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩ
ＴＣ２結合（平均蛍光強度で提示される）と、ＰＵ−Ｈ７１によるＨＳＰ９０阻害に対す
るこれらの細胞の感受性との有意な相関にも注目した（図３ｅ）。
１９個の一次ＡＭＬ標本について収集されたデータに基づいて、本発明者らは、感受性
および耐性ＡＭＬ標本を正確に同定するアッセイの確率を決定するための感受性および正
確性曲線を算出した。本発明者らは、ＰＵ−ＦＩＴＣ結合に関する２以上の任意的カット
オフ値（芽球／リンパ球）および予測される結果としての５０％未満の生存率を用いて分
類性能分析を実施し、以下の値を観察した：正確性：８３．３％（５３．２〜９３．８％
；９５％ＣＩ）；感受性：９１．７％（７２．８〜９９．５％；９５％ＣＩ）；負の予測
値：８０％（３４．７％〜９８．９％；９５％ＣＩ）；Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定、ｐ
＝０．０２２。これらの計算は、ＰＵ−ＦＩＴＣが良好な分類性能を有することを示唆す
る；この評価を、より正確で厳格な性能評価を得るためにより大きい試料コホートを用い
て繰り返す。実験的または装置的変動に起因するアッセイの差異を最小化するために、本
発明者らは、以下のもの：（１）自動的性能調整を可能にし、毎日のサイトメーターの性
能および一貫性を改善するためのＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｅｔｕｐ ＆ Ｔｒａｃ
ｋｉｎｇ（ＣＳＴ）ビーズを用いる。ＣＳＴビーズは新しい実験設定の度の前に実行する
。（２）陽性対照ＭＶ４１１（高感受性細胞系−高結合）および陰性対照ＨＬ６０（低感
受性細胞系−低結合）をアッセイに含有させる。
白血病細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの観察を動物前臨床モデルにおいて確認するこ
とができるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１に対する異なる感受
性（高感受性および低感受性）を有する一次ＡＭＬ試料を用いて異種移植を設定し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで評価し、および／またはＰＵ−ＦＩＴＣ結合により予測した。一次ＡＭＬ
細胞を、致死量未満で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８）に注入した。注入の
３〜４週間後、ヒト白血病細胞がマウスの骨髄（ＢＭ）中に生着した時、ＰＵ−Ｈ７１ま
たはビヒクル対照を用いる処置を開始し（７５ｍｇ／ｋｇ、３週間）、４週間継続した。
マウスを犠牲にし、抗ヒトＣＤ４５およびＣＤ３４を用いて白血病の生着を評価した。疾
患を生じる生存細胞の能力を決定するために、本発明者らは、同数のヒト細胞を、致死量
未満で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。この実験は、高い結合、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで高感受性の細胞に関するＰＵ−Ｈ７１処置が、腫瘍開始をさらに防止するかど
うかを決定するものである。もしそうだとしたら、それは、処置が再発の可能性を低下さ
せることを示唆する。異種移植は白血病試料の生物学を変化させてもよいため、一次細胞
へのＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２結合を、生着した細胞の注入前に評価した（移植の４週間後
）。
異種移植実験からの結果を、図１７に示す。２つの一次ＡＭＬ試料（高感受性および低
感受性、図１７ａ）を用いる実験において、本発明者らは、高感受性試料が異種移植され
たＡＭＬ試料において低感受性試料よりも高いＰＵＨ７１−ＦＩＴＣ２結合を有し（図１
７ｂ）、ＨＳＰ９０阻害剤を用いる処置により有意に良好に応答する（図１７ｃ）ことを
見出した。さらに、本発明者らは、ＰＵ高感受性ＡＭＬに由来する細胞が、二次移植にお
ける有意に低下した生着を示すことを見出した（ｐ＝０．０１６）。この結果は、疾患の
類似する段階での患者の白血病細胞の生存および増殖におけるＨＳＰ９０の関与が実質的
に異なってもよいことを示す。さらに、ＨＳＰ９０阻害療法の効果を、本開示の蛍光標識
されたプローブを用いて予測してもよい。
５．２．１．２．２．固形腫瘍および液性腫瘍
本開示の蛍光標識された、ＡＮＣＡ標識された、およびビオチン化されたプローブはま
た、固形腫瘍およびリンパ腫および他の液性腫瘍関連がんのための予後および診断適用を
有する。そのような腫瘍の例は、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、
メラノーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを
含む肺がん、乳がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆
嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびび
まん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および
子宮内膜がんを含む婦人科がんからなる群から選択されるがん、特に、乳がん、胃がん、
または膵臓がんと関連するものである。当業者であれば、例えば、腫瘍の生検または外科
的切除から得られる組織スライスの一部である腫瘍細胞上で標識化を実施することができ
ることを認識できる。この場合、腫瘍細胞は、間質の細胞、良性組織、血管および他の細
胞、例えば、リンパ球、マクロファージにより囲まれている。分離させた腫瘍細胞、例え
ば、そのような腫瘍細胞を含有する組織から得られるものにおいて標識化を実施すること
もできる。腫瘍細胞、例えば、確立されたがん細胞系から得られるものにおいて標識化を
実施することもできる。最後ではないが、腫瘍細胞、例えば、血漿および胸膜などのその
ような腫瘍細胞を含有する生物学的液体から得られるものにおいて標識化を実施すること
もできる。一態様においては、腫瘍細胞および腫瘍関連細胞ならびに生体、例えば、がん
患者の循環中に見出されるもの、微細針吸引生検またはがん細胞もしくは他の種類の細胞
もしくは「発がん性ＨＳＰ９０」を含有する生物学的形成物を含有する生物標本をもたら
す他の介入手順により得られる細胞において標識化を実施することもできる。さらに別の
態様においては、悪性形質転換と関連する他の細胞または発がん性ＨＳＰ９０を含む生体
、例えば、腫瘍エキソソームにおいて標識化を実施することができる。例えば、６．３．
８．節は、外科的切除後の胃がんおよび乳がんを有する患者からの染色のための組織の単
離を説明し、５．２．１．２．４．節は、がん患者からの循環腫瘍細胞の単離を説明する
。
膵臓がんおよび乳がん細胞系における実験は、血液腫瘍において行われた分析が固形腫
瘍およびリンパ腫においても有効であることを示す。かくして、標識された細胞透過性Ｈ
ＳＰ９０阻害剤は、固形腫瘍細胞またはリンパ腫細胞中に存在する「発がん性ＨＳＰ９０
」を検出および定量することができる。さらに、阻害剤を用いて、ＨＳＰ９０阻害療法に
対する固形または液体腫瘍細胞の感受性を予測することができる。当業者であれば、液性
腫瘍が、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫および骨髄増殖性新生物
と関連することを認識できる。そのような当業者であればまた、特定の液性腫瘍が固形腫
瘍も形成し、血液に加えて、これらの疾患と関連するがん細胞がリンパ節、脾臓、肝臓、
骨髄および他の部位に拡散し得ることを認識できる。
一例において、膵臓がんおよび乳がん細胞のパネルを、（１）いくつかの異なるＨＳＰ
９０阻害剤、例えば、ＰＵ−Ｈ７１、ＳＮＸ−２１１２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２に対
する感受性（図２を参照）；（２）ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２への結合；ならびに（３）
これらの腫瘍細胞中での総ＨＳＰ９０の発現について試験した。図１８は、ＰＵ−Ｈ７１
−ＦＩＴＣ２結合と、これらの細胞のＰＵ−Ｈ７１、ＳＮＸ−２１１２およびＮＶＰ−Ａ
ＵＹ９２２に対する感受性との有意な相関を示す（それぞれ図１８Ａのｒ2＝０．５９、
０．６２および０．６１）。対照的に、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性と、これらの細
胞中の総腫瘍ＨＳＰ９０の発現との有意な相関は決定されなかった（図１８Ｃ）。同様に
、ＰＵ−ＦＩＴＣにより決定された「発がん性ＨＳＰ９０」の発現と、これらの細胞中で
の総腫瘍ＨＳＰ９０の発現との有意な相関を確立することができなかった（図１８Ｂ）。
ＨＬ−６０白血病細胞はＰＵ−Ｈ７１および他のＨＳＰ９０阻害剤に対して耐性であり、
ＰＵ−ＦＩＴＣへの低い結合を示すか、結合を示さない。かくして、本発明者らは、ＨＬ
−６０と比較したがん細胞における標識されたＨＳＰ９０阻害剤（例えば、ＰＵ−Ｈ７１
−ＦＩＴＣ２）の相対的結合の使用を、試料および実験にわたってＰＵ−ＦＩＴＣ結合を
比較するための正規化された値として用いることもできることを理論的に説明した（図１
８Ｄ）。図１８は、いくつかの膵臓がんおよび乳がん細胞におけるそれぞれのがん細胞お
よびＨＬ６０に結合する標識されたＰＵＨ７１（例えば、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２）の
比を用いるそのような分析を示す。まとめると、これらのデータは、（１）ＰＵ−ＦＩＴ
Ｃが「発がん性ＨＳＰ９０」の存在量を測定するための好適な手段であること；（２）「
発がん性ＨＳＰ９０」の存在量の測定がＨＳＰ９０ｉに対する感受性を予測すること；お
よび（３）総腫瘍ＨＳＰ９０の存在量がＨＳＰ９０阻害剤に対する応答を予測するもので
はなく、それが標識されたＰＵ−Ｈ７１により測定された場合、「発がん性ＨＳＰ９０」
の存在量と相関もしないことを示す。
本開示の標識されたＨＳＰ９０阻害剤を用いて、患者がＨＳＰ９０阻害療法から利益を
得るかどうかを決定することができる。一態様においては、患者の腫瘍細胞への標識され
たＨＳＰ９０阻害剤の結合を、対照細胞への結合と比較することができる。結合が対照と
比較して増加した場合、患者がＨＳＰ９０阻害療法を受け入れられることを示す。図１９
に示されるように、非応答性（生存率が５０％未満低下した）腫瘍細胞から応答性（生存
率が５０％を超えて低下した）細胞を、非応答性細胞についての約１．２３または約２．
０７以下と比較した、応答性細胞についての約２．７〜約５．８７以上の、腫瘍細胞に結
合するＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と、参照ＨＬ６０細胞との比により区別することができ
る。ＨＳＰ９０阻害剤に対する応答性を決定するためのこれらの比は、アッセイにおいて
用いられる、標識されたＨＳＰ９０阻害剤、参照標本（すなわち、血液中のＨＬ６０細胞
、正常白血球、ＣＤ４５＋ＣＤ１４−細胞、または正常リンパ球）および／または対照誘
導体（すなわち、非特異的／バックグラウンド結合を説明するために用いられるＰＵＦＩ
ＴＣ９もしくはＦＩＴＣ−ＴＥＧ）の性質に依存する。
循環腫瘍細胞中の発がん性ＨＳＰ９０の標識における本発明のより詳細な説明は、５．
２．１．２．４．に与えられる。図２０は、発がん性ＨＳＰ９０に対する低い結合を有す
るか、結合を有さないように、かくして、非特異的／バックグラウンド結合を説明するよ
うに設計されたＰＵ誘導体としてのＰＵＦＩＴＣ９の使用を示す。また、それは参照細胞
（低い発がん性ＨＳＰ９０を有するか、それを有さない細胞）としての患者の白血球（Ｃ
Ｄ４５＋ＣＤ１４−細胞）の使用も示す。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞における実験はまた、これらの細
胞のＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性が、細胞中の総腫瘍ＨＳＰ９０の発現ではなく、標
識されたＰＵ−Ｈ７１のその取込みと相関することを示す（図２１）。具体的には、ＯＣ
Ｉ−Ｌｙ７およびＯＣＩ−Ｌｙ１はＨＳＰ９０阻害に対して高感受性である２つのＤＬＢ
ＣＬ細胞である（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００９
）。それらは両方とも親和性のＰＵ−Ｈ７１結合剤である。本発明者らは、治療濃度未満
のＨＳＰ９０阻害剤で長期間にわたってこれらの細胞を処理し、いくつかの試験したＨＳ
Ｐ９０阻害剤、例えば、ＰＵ−Ｈ７１、ＰＵ−ＤＺ１３および１７ＤＭＡＧに対する、親
細胞よりも５〜１０倍低い感受性を示したクローンを選択することができた（図８）。図
２１は、これらのクローンは親Ｌｙ１細胞と同様の総腫瘍ＨＳＰ９０レベルを発現するが
、それらは標識されたＰＵ−Ｈ７１の取込みにより測定された場合、より低い「発がん性
ＨＳＰ９０」レベルを有することを示す。結合実験を、ＰＳＣ８３３（２．５μＭ）、Ｐ
−ｇＰ阻害剤の存在下および非存在下で実行して、取込みの差異が異なる「発がん性ＨＳ
Ｐ９０」レベルの結果であり、薬剤ポンプにより媒介される流出の間接的尺度ではないこ
とを示した。
５．２．１．２．２．１．膵管腺がん
膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は、米国においてがん関連死の４番目に最も一般的な原因であ
る。５年生存率はあらゆるがんの中で最も低く、０．４〜４％の範囲であると見積もられ
ている。２００９年には、ＰＤＡＣの見積もりで４２，４７０件の新規事例が診断され、
見積もりで３５，２４０人の患者がその疾患の結果として死亡した。このがんの侵襲性、
それを早期に診断できないこと、および結果を変える療法の現在の欠如のため、ＰＤＡＣ
に由来する死亡率は発生率を密接に反映する。ＰＤＡＣの唯一の潜在的に治癒的な処置は
、外科的切除である。この疾患は一般的に診察時には進行しているため、治癒的切除に相
応しいのは患者の１０〜２０％に過ぎない。膵十二指腸切除術を受けるこれらの患者にお
いては、５年生存率は依然として暗く、約２０％である。ＰＤＡＣを処置するための有効
な化学療法剤の開発は大いにやりがいがあった。伝統的な細胞傷害剤は、腫瘍増殖の制御
、生活の質の改善および患者の生存期間の延長においてほとんど効果がない。
異常な経路および分子の複雑な負荷を許容するために、ＰＤＡＣは生存のために分子シ
ャペロンに依存するようになる。主なシャペロンである熱ショックタンパク質９０（ＨＳ
Ｐ９０）は、ＰＤＡＣにおける悪性プロセス、例えば、増殖、生存および転移を誘導する
がんタンパク質を補助し、唆し、がん表現型の発達を可能にする。さらに、ＨＳＰ９０は
、アポトーシス閾値を増加させることにより、がん細胞が他の療法に対する耐性を生じる
のを助ける。これらの包括的な生物学的機能は、ＰＤＡＣにおける抗ＨＳＰ９０標的化療
法に関する重要な役割を提唱する。結果として、これらの腫瘍は、主要ながんシャペロン
の１つであるＨＳＰ９０の阻害剤を用いる処置のための適切な候補である。
ＨＳＰ９０阻害剤、例えば、発がん性ＨＳＰ９０種に優先的に結合するＰＵ−Ｈ７１を
用いる膵臓がんの生存に必要とされる腫瘍ＨＳＰ９０種の存在量の同定は、ＨＳＰ９０療
法から利益を得る、および腫瘍の治療的標的化を個別化する可能性がある患者の選択のた
めの腫瘍特異的バイオマーカーとして役立つ。
実際、ＨＳＰ９０阻害剤に対する膵臓細胞系の感受性は、フルオレセイン標識されたＰ
Ｕ−Ｈ７１（ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２）の細胞取込みにより測定された場合、腫瘍ＨＳ
Ｐ９０種の存在量と相関する（図２２）。最も高い量のＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２を取り
込む細胞は、ＨＳＰ９０阻害剤に対して最も感受性であるものでもある。
血液のがんに関する試験（５．２．１．２．１．節）と同様、参照誘導体または参照細
胞（例えば、ＨＬ６０もしくは正常細胞）と比較して膵臓がん細胞における標識されたＨ
ＳＰ９０阻害剤（例えば、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２）の相対的結合が高いほど、膵臓腫
瘍または腫瘍細胞はＨＳＰ９０阻害剤療法に感受性となる（図１９）。いくつかの態様に
おいて、腫瘍細胞と参照細胞との結合の比が約２以上である場合、膵臓がん患者がＨＳＰ
９０阻害療法に感受性があることを示す。他の態様においては、腫瘍細胞と参照細胞との
結合の比が約２．５以上である場合、膵臓がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に感受性がある
ことを示す。他の態様においては、腫瘍細胞と参照細胞との結合の比が約３以上である場
合、膵臓がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に感受性があることを示す。
５．２．１．２．３．がん幹細胞
本開示は、正常細胞（例えば、リンパ球）と比較したがん幹細胞（ＣＳＣ）中の「発が
ん性ＨＳＰ９０」の量を決定し、それによって、ＣＳＣがＨＳＰ９０阻害剤療法に応答す
るかどうかを決定する方法を提供する。最近の証拠は、がん幹細胞（ＣＳＣ）が多様な種
類のがんについて疾患を生じさせ、維持することができることを示唆している。さらに、
これらの細胞は一般的な化学療法剤に対して耐性であり、かくして、疾患の再発または転
移をもたらす可能性がより高いことが示されている。したがって、より良好な治療結果を
得るために、ＣＳＣを除去することができる療法を同定することが重要である。熱ショッ
クタンパク質（ＨＳＰ）は、タンパク質の合成、維持および分解において重要な監視的役
割を果たす。図２３において、本発明者らは、ＣＳＣ集団がＨＳＰ９０阻害に対して感受
性であり、標識されたＰＵ−Ｈ７１により認識されるように、感受性が発がん性腫瘍ＨＳ
Ｐ９０種の存在量と相関することを示す、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）幹細胞におけるデ
ータを提供する。
図２３Ａは、ＰＵ−ＦＩＴＣと白血病幹細胞（ＬＳＣ、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５
ｄｉｍ）およびリンパ球との結合の比を示す。一次ＡＭＬ試料を、３７℃で４時間、１μ
ＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２と共にインキュベートした。細胞をＣＤ３４、ＣＤ３８、
ＣＤ４５および７−ＡＡＤで染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。図２３Ｂ
は、１μＭのＰＵ−Ｈ７１を用いる４８時間の処置後の、３つの一次ＡＭＬ試料に由来す
る未処理対照と比較したＬＳＣの生存率（％）を示す。細胞をＣＤ４５、ＣＤ３４および
ＣＤ３８で染色した後、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色した。ＬＳＣの生存能力を
、フローサイトメトリーにより測定し、ＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋ＣＤ３８−ゲートのア
ネキシンＶ−／７ＡＡＤ−の割合として決定した。注目すべきことに、ＰＵ−Ｈ７１−Ｆ
ＩＴＣ２により高く結合する細胞は、ＨＳＰ９０阻害剤を用いる処理に最も感受性があっ
た。
血液のがんに関する試験（５．２．１．２．１．節）と同様、同じ患者内で正常細胞（
例えば、リンパ球）と比較してＣＳＣ中の蛍光標識されたＨＳＰ９０阻害剤（例えば、Ｐ
Ｕ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２）の相対的結合が高いほど、ＣＳＣはＨＳＰ９０阻害剤療法に感
受性となる。いくつかの態様においては、ＣＳＣと正常リンパ球との結合の比が１．５以
上である場合、がん患者がＨＳＰ９０阻害療法に感受性があることを示す。他の態様にお
いては、ＣＳＣと正常リンパ球との結合の比が２以上である場合、がん患者がＨＳＰ９０
阻害療法に感受性があることを示す。
５．２．１．２．４．循環腫瘍細胞
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍から離れており、血流中に循環する細胞である。
ＣＴＣは、異なる組織中でのさらなる腫瘍のその後の増殖（転移）のための種子を構成し
てもよい。図２０は、ＨＥＲ２＋転移性乳がんを有する患者から単離されたＣＴＣの標識
化を示す。彼女の血漿から単離された腫瘍細胞は、同じく彼女の血漿から単離された白血
球（ＣＤ４５＋ＣＤ１４−細胞）よりも約８４倍多くＰＵＦＩＴＣに結合し、これは、こ
れらの腫瘍細胞が高レベルの発がん性ＨＳＰ９０を有し、ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法
がそれらの殺傷において有効であることを示している。実際、この患者が２０ｍｇ／ｍ2
のＰＵ−Ｈ７１を受けた２４時間後、血液中のＣＴＣの数の６倍の低下が測定された。
５．２．２．発がん性ＨＳＰ９０を検出するための放射標識プローブ
本開示は、がん細胞中で発がん性ＨＳＰ９０を検出することができる放射標識プローブ
の使用を提供する。５．２．２．１節は、本開示に従って用いられる様々な種類のプロー
ブを記載する。５．２．２．２節は、予後および診断アッセイにおけるそのようなプロー
ブの使用を記載する。
５．２．２．１．放射標識プローブ
阻害剤の親和性、選択性または生体内分布プロフィールを変化させることなく標識する
ことができるＨＳＰ９０阻害剤は、予後および／または診断目的にとって理想的なプロー
ブである。一態様において、プローブはヨウ素１２４放射標識型のＨＳＰ９０阻害剤であ
る。別の態様において、プローブはヨウ素１３１放射標識型のＨＳＰ９０阻害剤である。
別の態様において、プローブはヨウ素１２３放射標識型のＨＳＰ９０阻害剤である。別の
態様において、プローブはヨウ素１２５放射標識型のＨＳＰ９０阻害剤である。
一態様において、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
（ａ）Ｚ1、Ｚ2およびＺ3は、各々独立にＣＨまたはＮであり；
（ｂ）Ｙは、ＣＨ2、Ｏ、またはＳであり；
（ｃ）Ｘａ、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、カルボニル
、フルオロメチレン、および価数を満たすように選択されたジフルオロメチレンから独立
に選択され、ここでＸ基へのそれぞれの結合は、単結合または二重結合のいずれかであり
；
（ｄ）Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
（ｅ）Ｘ4は、水素またはハロゲンであり；
（ｆ）Ｒは、直鎖状もしくは分枝状の置換もしくは無置換アルキル、直鎖状もしくは分
枝状の置換もしくは無置換アルケニル、直鎖状もしくは分枝状の置換もしくは無置換アル
キニル、または置換もしくは無置換シクロアルキルであり、ここで、Ｒ基は任意に、−Ｓ
（Ｏ）Ｎ（ＲA）−、−ＮＲAＳ（Ｏ）−、−ＳＯ2Ｎ（ＲA）−、−ＮＲAＳＯ2−、−Ｃ（
Ｏ）Ｎ（ＲA）−、もしくは−ＮＲAＣ（Ｏ）−により中断されていてもよく、および／ま
たはＲ基は任意に、−Ｓ（Ｏ）ＮＲAＲB、−ＮＲAＳ（Ｏ）ＲB、−ＳＯ2ＮＲAＲB、−Ｎ
ＲAＳＯ2ＲＢ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲAＲＮ、もしくは−ＮＲAＣ（Ｏ）ＲBにより終結してもよ
く、ここで、ＲAおよびＲBはそれぞれ、水素、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、
Ｃ2〜Ｃ6アルキニル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリー
ル、ヘテロアリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、
ヘテロアリールアルキル、およびアルキルヘテロアリールアルキルから独立に選択される
。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
（ａ）Ｚ1、Ｚ2およびＺ3は、各々独立にＣＨまたはＮであり；
（ｂ）Ｙは、ＣＨ2、Ｏ、またはＳであり；
（ｃ）Ｘａ、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、ＣＨ、ＣＨ2、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、カルボニル
、フルオロメチレン、および価数を満たすように選択されたジフルオロメチレンから独立
に選択され、ここでＸ基へのそれぞれの結合は、単結合または二重結合のいずれかであり
；
（ｄ）Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
（ｅ）Ｘ4は、水素またはハロゲンであり；
（ｆ）Ｒは、−（ＣＨ2）m−Ｎ−Ｒ10Ｒ11Ｒ12または−（ＣＨ2）m−Ｎ−Ｒ10Ｒ11であ
り、ここで、ｍは２または３であり、Ｒ10〜Ｒ12は水素、メチル、エチル、エテニル、エ
チニル、プロピル、ヒドロキシアルキル、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル、シク
ロペンチル、窒素を含む３員環またはＮおよび任意に、価数を満たすための置換基を有す
るさらなるヘテロ原子を含む６員環から独立に選択されるが、但し、Ｒ10〜Ｒ12は全て、
薬学的に許容される対抗イオンをさらに含む化合物を提供する。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｙは、ＣＨ2またはＳであり；
Ｘ4は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
Ｒは、−（ＣＨ2）m−Ｎ−Ｒ10Ｒ11Ｒ12または−（ＣＨ2）m−Ｎ−Ｒ10Ｒ11であり、こ
こで、ｍは２または３であり、Ｒ10〜Ｒ12は水素、メチル、エチル、エテニル、エチニル
、プロピル、ヒドロキシアルキル、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル、シクロペン
チル、窒素を含む３員環またはＮおよび任意に、価数を満たすための置換基を有するさら
なるヘテロ原子を含む６員環から独立に選択されるが、但し、Ｒ10〜Ｒ12は全て、薬学的
に許容される対抗イオンをさらに含む化合物を提供する。
一態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｙは、ＣＨ2またはＳであり；
Ｘ4は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
Ｒは、２−エタンスルホン酸イソプロピルアミド、２−エタンスルホン酸エチルアミド
、２−エタンスルホン酸メチルアミド、２−エタンスルホン酸アミド、２−エタンスルホ
ン酸ｔ−ブチルアミド、２−エタンスルホン酸イソブチルアミド、２−エタンスルホン酸
シクロプロピルアミド、イソプロパンスルホン酸２−エチルアミド、エタンスルホン酸２
−エチルアミド、Ｎ−２エチルメタンスルホンアミド、２−メチル−プロパン−２−スル
ホン酸２−エチルアミド、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸２−エチルアミド、
２−メチル−プロパン−１−スルホン酸２−エチルアミド、シクロプロパンスルホン酸２
−エチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸イソプロピルアミド、３−プロパン−１
−スルホン酸エチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸メチルアミド、３−プロパン
−１−スルホン酸アミド、３−プロパン−１−スルホン酸ｔ−ブチルアミド、３−プロパ
ン−１−スルホン酸イソブチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸シクロプロピルア
ミド、プロパン−２−スルホン酸３−プロピルアミド、エタンスルホン酸３−プロピルア
ミド、Ｎ−３−プロピルメタンスルホンアミド、２−メチル−プロパン−２−スルホン酸
３−プロピルアミド、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸３−プロピルアミド、２
−メチル−プロパン−１−スルホン酸３−プロピルアミド、シクロプロパンスルホン酸３
−プロピルアミド、３−Ｎ−イソプロピルプロピオンアミド、３−Ｎ−エチルプロピオン
アミド、３−Ｎ−メチルプロピオンアミド、３−プロピオンアミド、３−Ｎ−ｔ−ブチル
プロピオンアミド、３−Ｎ−イソブチルプロピオンアミド、３−Ｎ−シクロプロピルプロ
ピオンアミド、Ｎ−２−エチルイソブチルアミド、Ｎ−２−エチルプロピオンアミド、Ｎ
−２−エチルアセトアミド、Ｎ−２−エチルホルムアミド、Ｎ−２−エチル２，２−ジメ
チル−プロピオンアミド、Ｎ−２−エチル３−メチルブチルアミド、またはシクロプロパ
ンカルボン酸２−エチル−アミドである。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
ＸａおよびＸｂの一方はＯであり、他方はＣＨ2であり；
Ｙは、ＣＨ2またはＳであり；
Ｘ4は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
Ｒは、２−エタンスルホン酸イソプロピルアミド、２−エタンスルホン酸エチルアミド
、２−エタンスルホン酸メチルアミド、２−エタンスルホン酸アミド、２−エタンスルホ
ン酸ｔ−ブチルアミド、２−エタンスルホン酸イソブチルアミド、２−エタンスルホン酸
シクロプロピルアミド、イソプロパンスルホン酸２−エチルアミド、エタンスルホン酸２
−エチルアミド、Ｎ−２エチルメタンスルホンアミド、２−メチル−プロパン−２−スル
ホン酸２−エチルアミド、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸２−エチルアミド、
２−メチル−プロパン−１−スルホン酸２−エチルアミド、シクロプロパンスルホン酸２
−エチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸イソプロピルアミド、３−プロパン−１
−スルホン酸エチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸メチルアミド、３−プロパン
−１−スルホン酸アミド、３−プロパン−１−スルホン酸ｔ−ブチルアミド、３−プロパ
ン−１−スルホン酸イソブチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸シクロプロピルア
ミド、プロパン−２−スルホン酸３−プロピルアミド、エタンスルホン酸３−プロピルア
ミド、Ｎ−３−プロピルメタンスルホンアミド、２−メチル−プロパン−２−スルホン酸
３−プロピルアミド、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸３−プロピルアミド、２
−メチル−プロパン−１−スルホン酸３−プロピルアミド、シクロプロパンスルホン酸３
−プロピルアミド、３−Ｎ−イソプロピルプロピオンアミド、３−Ｎ−エチルプロピオン
アミド、３−Ｎ−メチルプロピオンアミド、３−プロピオンアミド、３−Ｎ−ｔ−ブチル
プロピオンアミド、３−Ｎ−イソブチルプロピオンアミド、３−Ｎ−シクロプロピルプロ
ピオンアミド、Ｎ−２−エチルイソブチルアミド、Ｎ−２−エチルプロピオンアミド、Ｎ
−２−エチルアセタミド、Ｎ−２−エチルホルムアミド、Ｎ−２−エチル２，２−ジメチ
ル−プロピオンアミド、Ｎ−２−エチル２−メチルブチルアミド、またはシクロプロパン
カルボン酸２−エチル−アミドである。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｘａ−Ｘｃ−Ｘｂは、ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2、またはＣＨ2−ＣＨ
＝ＣＨであり；
Ｙは、ＣＨ2またはＳであり；
Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
Ｒは、２−エタンスルホン酸イソプロピルアミド、２−エタンスルホン酸エチルアミド
、２−エタンスルホン酸メチルアミド、２−エタンスルホン酸アミド、２−エタンスルホ
ン酸ｔ−ブチルアミド、２−エタンスルホン酸イソブチルアミド、２−エタンスルホン酸
シクロプロピルアミド、イソプロパンスルホン酸２−エチルアミド、エタンスルホン酸２
−エチルアミド、Ｎ−２エチルメタンスルホンアミド、２−メチル−プロパン−２−スル
ホン酸２−エチルアミド、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸２−エチルアミド、
２−メチル−プロパン−１−スルホン酸２−エチルアミド、シクロプロパンスルホン酸２
−エチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸イソプロピルアミド、３−プロパン−１
−スルホン酸エチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸メチルアミド、３−プロパン
−１−スルホン酸アミド、３−プロパン−１−スルホン酸ｔ−ブチルアミド、３−プロパ
ン−１−スルホン酸イソブチルアミド、３−プロパン−１−スルホン酸シクロプロピルア
ミド、プロパン−２−スルホン酸３−プロピルアミド、エタンスルホン酸３−プロピルア
ミド、Ｎ−３−プロピルメタンスルホンアミド、２−メチル−プロパン−２−スルホン酸
３−プロピルアミド、２−メチル−プロパン−２−スルフィン酸３−プロピルアミド、２
−メチル−プロパン−１−スルホン酸３−プロピルアミド、シクロプロパンスルホン酸３
−プロピルアミド、３−Ｎ−イソプロピルプロピオンアミド、３−Ｎ−エチルプロピオン
アミド、３−Ｎ−メチルプロピオンアミド、３−プロピオンアミド、３−Ｎ−ｔ−ブチル
プロピオンアミド、３−Ｎ−イソブチルプロピオンアミド、３−Ｎ−シクロプロピルプロ
ピオンアミド、Ｎ−２−エチルイソブチルアミド、Ｎ−２−エチルプロピオンアミド、Ｎ
−２−エチルアセタミド、Ｎ−２−エチルホルムアミド、Ｎ−２−エチル２，２−ジメチ
ル−プロピオンアミド、Ｎ−２−エチル２−メチルブチルアミド、またはシクロプロパン
カルボン酸２−エチル−アミドである。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｘ3は、ＣＨ2、ＣＦ2、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、Ｏ、ＮＨ、またはＮＲ2であり、ここで、Ｒ2
はアルキルであり；
Ｘ2は、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉまたは131Ｉであり；
Ｘ4は、水素またはハロゲンであり；
Ｘ5は、ＯまたはＣＨ2であり；
Ｒは、３−イソプロピルアミノプロピル、３−（イソプロピル（メチル）アミノ）プロ
ピル、３−（イソプロピル（エチル）アミノ）プロピル、３−（（２−ヒドロキシエチル
）（イソプロピル）アミノ）プロピル、３−（メチル（プロパ−２−イニル）アミノ）プ
ロピル、３−（アリル（メチル）アミノ）プロピル、３−（エチル（メチル）アミノ）プ
ロピル、３−（シクロプロピル（プロピル）アミノ）プロピル、３−（シクロヘキシル（
２−ヒドロキシエチル）アミノ）プロピル、３−（２−メチルアジリジン−１−イル）プ
ロピル、３−（ピペリジン−１−イル）プロピル、３−（４−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジン−１−イル）プロピル、３−モルホリノプロピル、３−（トリメチルアンモニ
オ）プロピル、２−（イソプロピルアミノ）エチル、２−（イソブチルアミノ）エチル、
２−（ネオペンチルアミノ）エチル、２−（シクロプロピルメチルアミノ）エチル、２−
（エチル（メチル）アミノ）エチル、２−（イソブチル（メチル）アミノ）エチル、また
は２−（メチル（プロパ−２−イニル）アミノ）エチルであり；
ｎは１または２である。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
を有する化合物から選択される。
別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
を有する化合物から選択される。
さらに別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
を有する化合物から選択される。
さらに別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
を有する化合物から選択される。
さらに別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
を有する化合物から選択される。
さらに別の態様においては、放射標識プローブは、以下の式：
を有する化合物から選択される。
上記態様における放射性トレーサを合成する方法は、例えば、米国特許第７，８３４，
１８１号、ＷＯ２０１１／０４４３９４、ＷＯ２００８／００５９３７およびＰＣＴ出願
第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３２３７１号に見出すことができ、それらの内容は全て、そ
の全体が参照によりここに組込まれる。放射標識プローブの特定例は、５．２．２．２．
１．節および５．２．２．２．２．節に記載される。
５．２．２．２．がん処置における放射標識プローブの利用
ＨＳＰ９０腫瘍種（「発がん性ＨＳＰ９０」）の発現を非侵襲的に測定し、ＨＳＰ９０
に対する腫瘍の依存性を決定し、標的阻害を確認するために、がん細胞中の「発がん性Ｈ
ＳＰ９０」に選択的に結合するＨＳＰ９０特異的阻害剤に基づくポジトロン放出断層撮影
（ＰＥＴ）アッセイが用いられる。いくつかの説得力のある理由から、ポジトロン放出断
層撮影（ＰＥＴ）は、個々の患者における腫瘍中の薬剤の薬物動態および保持を測定する
のに非常に適している110〜113。ＰＥＴは、他の形態の核画像化よりも高い解像度および
感受性を有する定量方法である。それは非侵襲的三次元画像化を可能にし、体内でのその
深さに関わらず、腫瘍および正常臓器中の投与された放射標識化合物の組織濃度（例えば
、μＣｉまたは１グラムあたりの注入用量の％（％ＩＤ））の信頼できる見積もりが得ら
れる110〜113。したがって、ＰＥＴは、空間的および時間的に分解された腫瘍取込み、濃
度およびクリアランス、ならびにトレーサの全身分布を提供することができる。ＰＥＴは
必ずしも詳細な解剖学的情報を提供するとは限らないため、ＰＥＴアッセイはＣＡＴスキ
ャンと組み合わされることが多い。ＣＡＴスキャンは、身体の構造解剖学の包括的表示を
提供する。ＰＥＴスキャン像をＣＡＴスキャンの上に重ねて、放射標識された阻害剤が体
内のどこに行くかを正確に決定することができる。ＰＥＴスキャンとＣＡＴスキャンの組
み合わせた使用は、ここではＰＥＴ／ＣＴと呼ばれる。
ＰＥＴ以外の検出および定量方法を用いてもよい。一態様において、ＳＰＥＣＴ画像化
（単一光子放射断層撮影）トレーサ、例えば、ヨウ素１３１、ヨウ素１２３、およびヨウ
素１２５を用いることができる。特定の態様においては、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１、123Ｉ−
ＰＵ−Ｈ７１または125Ｉ−ＰＵ−Ｈ７を、ＳＰＥＣＴ画像化のための放射標識阻害剤と
して用いることができる。
本開示の方法は、画像化してもよい任意の腫瘍に適用可能であり、固形および液性腫瘍
またはリンパ腫に対して最も明確な適用性がある。そのような腫瘍の例は、結腸直腸がん
、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺が
ん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳がん、神経芽細胞腫、消化管間
質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオー
マを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫
、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性新生物ならびに卵巣がん、子宮頸がん、
および子宮内膜がんを含む婦人科がんからなる群から選択されるがん、特に、乳がん、胃
がん、または膵臓がんと関連するものである。以下に考察されるように、本発明者らは、
放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤（例えば、124Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１）への腫瘍の取込みお
よび曝露が、ＨＳＰ９０療法に対する応答を予測し、ＰＵ−Ｈ７１または他のＨＳＰ９０
療法に対する好ましいか、または好ましくない治療応答のいずれかを有する可能性がある
患者を区別する様式で変化することを示す。具体的には、放射標識されたＨＳＰ９０阻害
剤（例えば、124Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１）の最小の取込みおよび／または迅速なクリアランス
を示す腫瘍は、ＰＵ−Ｈ７１または他のＨＳＰ９０阻害剤に対して接近できないか、また
は耐性であってよい。あるいは、そのような腫瘍は、生存のためにＨＳＰ９０に依存しな
くてもよく（すなわち、「低存在量の発がん性ＨＳＰ９０」）、ＨＳＰ９０療法を不適切
なものにする。逆に、放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の高い取込みおよび長い保持を有
する腫瘍（例えば、より後の時点での高い腫瘍と血液との比または０〜２４もしくは４８
時間以上の間隔に関する高い腫瘍ＡＵＣ）は、ＨＳＰ９０阻害剤による標的化に対してよ
り感受性が高いと予測される。ＰＥＴにより予測されるような、有効腫瘍内濃度を達成す
るのに必要とされる治療用量およびスケジュールが非常に高い毒性をもたらす場合（例え
ば、有効用量が最大許容用量（ＭＴＤ）よりも高いか、または１５〜１００％の「発がん
性ＨＳＰ９０」がＭＴＤよりも高い用量によってのみ占められる場合）、患者の選択をさ
らに指導することができる。
放射標識された阻害剤の取込みにより測定された場合のＨＳＰ９０発がん性複合体（す
なわち、「発がん性ＨＳＰ９０」）の存在量は、ＨＳＰ９０阻害に対する腫瘍の感受性を
反映する。かくして、本開示の一側面によれば、腫瘍中の「発がん性ＨＳＰ９０」の存在
量は、ＨＳＰ９０阻害に対する応答のバイオマーカーとして用いられる。上記で考察され
た通り、ＰＥＴは、腫瘍および正常臓器中に放射標識化合物の組織濃度の非侵襲的な信頼
できる見積もりを可能にする。かくして、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１およびＨＳＰ９０発
がん種に優先的に結合する他のＨＳＰ９０阻害剤を用いて、蛍光標識されたＰＵ−Ｈ７１
の上記の使用と同様、「発がん性複合体ＨＳＰ９０」の定量を可能にする特徴である、そ
の腫瘍取込みを非侵襲的に測定することができる。かくして、放射標識された阻害剤の高
い腫瘍取込みは、ＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性が最も高い腫瘍を有する患者を同定
する。腫瘍中のＰＵ−Ｈ７１トレーサ蓄積は、当業者には公知の技術を用いてＰＥＴ像か
ら定量される。ＰＵ−Ｈ７１トレーサの腫瘍蓄積は、単一の時点または複数の時点での腫
瘍トレーサ濃度の分析から定量することができる。トレーサ濃度とは、特定の体積の組織
中に存在するトレーサの量を指す。当業者には広く公知のトレーサ濃度の表現のための様
々な数学的形式が存在する。トレーサ量および／または組織体積をそれぞれ、参照値の分
数として表してもよい。例えば、一般的に用いられる標準化された取込み値、ＳＵＶは、
トレーサ量を、患者に投与された総トレーサ用量の分数として表したものであり；組織体
積を、身体の参照値（例えば、体重または体表面積）の分数として表したものである。
本開示において、本発明者らは、がん患者が「発がん性ＨＳＰ９０」に選択的に結合す
る放射標識された阻害剤に対する可変的「アビディティ」（取込みおよび保持）を示すこ
とを示す。類似する種類およびステージのがんを有するがん患者は、放射標識された阻害
剤の実質的に異なる取込みを有してもよく、これはがん細胞の生存および増殖におけるＨ
ＳＰ９０の改善のレベルが異なることを示す。一例として、１２人の乳がん患者を、２４
時間後の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の取込みについて評価した。これらの研究の結果を、
図２４に示す。グラフ上の各バーは、ＰＥＴにより決定された、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７
１の最大標準化取込み値（ＳＵＶmax）を示す。ＳＵＶmaxは、患者間で有意に変化し、こ
れは患者の腫瘍中の「発がん性ＨＳＰ９０」の量が異なることを示す。より高いＳＵＶma
x値を有する患者は、ＨＳＰ９０阻害療法に対して応答する可能性がより高い。例えば、
放射性トレーサの投与の２４時間後に測定した場合、約０．２５以上の［124Ｉ］−ＰＵ
−Ｈ７１のＳＵＶmaxを有する患者は、ＨＳＰ９０阻害療法のための潜在的な候補である
。化合物の投与の２４時間後に測定した場合に約０．７５以上の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７
１のＳＵＶmaxを有する患者は、ＨＳＰ９０阻害療法のための強力な候補である。化合物
の投与の２４時間後に測定した場合に約１．５以上の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１のＳＵＶm
axを有する患者は、ＨＳＰ９０阻害療法のための非常に強力な候補である。
がん患者が特定のＨＳＰ９０阻害剤（すなわち、「発がん性ＨＳＰ９０」に優先的に結
合するもの）に対する可変的アビディティを示すという本発明者らの知見に基づいて、放
射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を用いて、ＨＳＰ９０阻害療法に応答する可能性がある患
者を、応答する可能性がない患者から区別することができる。したがって、本開示は、腫
瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方
法であって、腫瘍または腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細胞中に
存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する検出可能に標識されたＨＳＰ９
０阻害剤と接触させること、腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９
０阻害剤の量を測定すること、および腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識された
ＨＳＰ９０阻害剤の量を、参照量と比較することを含む方法を提供する。腫瘍または腫瘍
細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が参照量と比較して多い場合、腫瘍がＨ
ＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があることを示す。
腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量の測定を、いくつかの
異なる方法で行ってもよい。例えば、一態様においては、上記で考察された通り、放射標
識された化合物のＳＵＶmax（またはＳＵＶavg）を、特定の時点で算出する。例えば、Ｓ
ＵＶを、放射標識された阻害剤の投与後４時間以上の時点で算出してもよい。いくつかの
態様においては、ＳＵＶを、放射標識された阻害剤の投与後８時間以上の時点で算出して
もよい。特定の態様においては、ＳＵＶを、放射標識された阻害剤の投与後１６時間以上
後の時点で算出してもよい（例えば、１６時間、２０時間、２４時間、４８時間、７２時
間、１９２時間）。ＳＵＶを、２つの前記値のいずれかを境界とする範囲で、例えば、８
時間〜１６時間、１６時間〜２４時間、１６時間〜４８時間などの範囲の時点で算出して
もよい。
ＳＵＶを、正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量と比較してもよい
。一態様においては、参照ＳＵＶは、特定の時点で、健康な個体から、または対照集団中
のがん患者の正常細胞および組織上での測定値から取られた平均レベルであってもよい。
５．１節で考察された通り、正常細胞は、最少の「発がん性ＨＳＰ９０」を有するか、ま
たはそれを有さない。したがって、健康な個体の細胞またはがん患者の健康な組織もしく
は臓器中の「発がん性ＨＳＰ９０」に特異的な放射標識された阻害剤の取込みは最少であ
る。標識された阻害剤が血液循環を消失した時点での測定が好ましいことが当業者によっ
て理解される。また、測定を任意の正常組織中で実施することができるが、標識された阻
害剤の代謝およびクリアランスに関与しないものが好ましいことも、当業者によって理解
される。一態様においては、そのような好ましい測定は、骨格筋、骨または心臓血液プー
ルから選択される１つ以上の領域に由来する。
別の態様においては、患者の腫瘍中での放射標識された阻害剤の最大取込み（すなわち
、ＳＵＶmax）（ここでは「腫瘍ＳＵＶ」と呼ぶ）を、患者の健康な細胞中での放射標識
された阻害剤の取込みと比較してもよい。例えば、一態様においては、特定の時点で取ら
れた患者の腫瘍からのＳＵＶデータを、血液または患者の骨もしくは筋肉に由来する選択
された領域からのＳＵＶと比較してもよい。用語「血液ＳＵＶ」とは、ＰＥＴアッセイか
ら誘導された心臓の内容物の平均ＳＵＶを指す。用語「筋肉ＳＵＶ」とは、ＰＥＴアッセ
イから誘導された患者の骨格筋組織の平均ＳＵＶを指す。心臓および骨格筋組織は腫瘍部
位を取り囲む「バックグラウンド」活性を代表するため、それらを選択した。
患者の選択および処置のためのＰＥＴアッセイの使用
本発明者らは、ＨＳＰ９０に依存する腫瘍を有する患者において、ＰＥＴから誘導され
る腫瘍：筋肉および腫瘍：血液ＳＵＶ比が、「発がん性ＨＳＰ９０」に特異的に結合する
放射標識された阻害剤（例えば、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１）の注入後、時間依存的様式
で増加することを見出した。これらの患者において、腫瘍：筋肉および腫瘍：血液ＳＵＶ
比は一般的に、放射標識された阻害剤の注入後１：１に近づき、その比は時間と共に増加
する。ＨＳＰ９０阻害療法に応答する様々な種類の固形腫瘍および液性腫瘍を有する選択
された数の患者に関するＰＥＴから誘導されるデータを、図２５に示す。それぞれの患者
について、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の投与後の複数の時点で、最大腫瘍ＳＵＶ（ＳＵＶm
ax）および平均筋肉ＳＵＶを、ＰＥＴアッセイから取得した。図２５は、がん患者に関す
る平均腫瘍：筋肉ＳＵＶ比および標準偏差値を示す。腫瘍：筋肉ＳＵＶ比は、０〜４８時
間増加する。
固形腫瘍に加えて、その方法により、ＰＵ−ＰＥＴにより画像化できる巨大脾腫を提示
した、辺縁帯リンパ腫およびステージＩＶの慢性リンパ球性白血病と診断された患者の場
合と同様、液性腫瘍の画像化が可能になった。
このデータの蓄積に基づいて、本発明者らは、「発がん性ＨＳＰ９０」に特異的に結合
するＨＳＰ９０阻害剤の投与後に２を超える腫瘍：筋肉ＳＵＶおよび／または腫瘍：血液
ＳＵＶ比を有するがん患者は、ＨＳＰ９０阻害療法に応答する可能性があると決定した。
この比は、好ましくは、放射標識された阻害剤の投与の４時間を超えた後の１つ以上の時
点で算出される。例えば、比を、放射標識された阻害剤の投与後８時間、１６時間、２４
時間または４８時間の時点で算出してもよい。特定の態様においては、放射標識された阻
害剤の投与後２４時間の時点での腫瘍：筋肉または腫瘍：血液ＳＵＶ比が２．５以上であ
る場合、患者がＨＳＰ９０阻害療法に応答する可能性があることを示す。他の態様におい
ては、放射標識された阻害剤の投与後２４時間の時点での腫瘍：筋肉または腫瘍：血液Ｓ
ＵＶ比が４以上である場合、患者がＨＳＰ９０阻害療法に応答する可能性があることを示
す。さらに他の態様においては、放射標識された阻害剤の投与後２４時間の時点での腫瘍
：筋肉または腫瘍：血液ＳＵＶ比が５以上である場合、患者がＨＳＰ９０阻害療法に応答
する可能性があることを示す。これらの態様においては、腫瘍におけるＳＵＶはＳＵＶma
xであり、筋肉または血液におけるＳＵＶは平均ＳＵＶ（すなわち、ＳＵＶavg）である。
別の態様においては、腫瘍中で得られたＰＥＴ画像を、患者の健康な（すなわち、非が
ん性）組織と比較する。好ましくは、この態様においては、参照ＰＥＴスキャンを、腫瘍
と同じ臓器中で取得する。例えば、患者が脊椎中に腫瘍を有する場合、脊椎腫瘍を正常脊
椎骨と比較する。腫瘍がＨＳＰ９０に依存する場合、健康な組織よりも腫瘍中により高濃
度の放射標識された阻害剤が見出される。放射標識された阻害剤の量を、ＰＥＴスキャン
を用いて定量的に決定することができる。腫瘍のＳＵＶ値を、放射標識された阻害剤の注
入後の特定の時点で、または複数の時点で、健康な周囲の組織のＳＵＶと比較することが
できる。あるいは、腫瘍に由来するＰＥＴ画像と健康な組織に由来するＰＥＴ画像とを、
目視検査により比較することができる。腫瘍が放射標識された阻害剤を保持する場合、Ｐ
ＥＴ像上で視覚的に、腫瘍は「点灯」し、「ホットスポット」のように見える（例えば、
図２６および図２７を参照されたい）。
本発明者らは、放射標識された阻害剤の投与後の特定の時点での「ホットスポット」ま
たは「複数のホットスポット」の存在が、患者のがんにおけるＨＳＰ９０の関与を包含し
、患者がＨＳＰ９０阻害療法を受け入れられるとの示唆を提供することを決定した。ＰＥ
Ｔ像におけるホットスポットの存在は、好ましくは放射標識された阻害剤の投与後少なく
とも１．５時間の時点で決定される。例えば、ホットスポットを、放射標識された阻害剤
の投与後２時間、４時間、６時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、
１６５時間または１９２時間で検出してもよい。ホットスポットの存在を、２つの上記値
のいずれかを境界とする範囲の間で、例えば、２時間〜４時間、４時間〜８時間、１６時
間〜２４時間などの範囲の時間で検出してもよい。２時間未満の時点での患者の腫瘍中の
ホットスポットの存在が、必ずしも、患者がＨＳＰ９０阻害療法のための良好な候補であ
ることを示すとは限らない。例えば、図２６（右パネル）は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１
注入の３０分後に取得されたマントル細胞リンパ腫を有する患者の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ
７１ ＰＥＴ／ＣＴを示す。ＰＥＴスキャンは、３０分後に明確な可視化を示す。しかし
ながら、より後の時点（３．５〜２４時間）では、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の取込みは
観察されなかった。したがって、患者は、ＨＳＰ９０療法のための相応しい候補ではない
。
また、本開示のＰＥＴアッセイを用いて、どの転移性または原発性固形腫瘍および液性
腫瘍がＨＳＰ９０阻害療法により感受性があるかを決定してもよい。例えば、図２７は、
２つの示されたリンパ節（ＬＮ）における再発乳がんを有する患者の［124Ｉ］−ＰＵ−
Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴを示す。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後の示された時点でのＰＥ
Ｔ画像を定量し、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１に関して得られたＳＵＶデータを、１０ｍｇ
／ｍ2のＰＵ−Ｈ７１の仮定された投与用量あたりのＨＳＰ９０阻害剤濃度に変換した。
０〜２４時間の時間にわたるＰＵ−Ｈ７１への２つの腫瘍の曝露も算出し、曲線下面積（
ＡＵＣ）として表した。図２７の下側パネルにおいて、ＣＴ（左）、ＰＵ−ＰＥＴ／ＣＴ
（中央）、およびＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴ融合物（右）横断画像は、一方のリンパ節におい
ては［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１−アビディティを示したが、他方においては示さなかった
。ＰＵ−ＰＥＴ画像は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後２４時間でのものである。興味
深いことに、ＰＵ−アビディティはこの事例においては、ＦＤＧ−アビディティと重複し
ない。これは珍しい事例ではなく、分析された患者のいくらかにおいては、ＦＤＧ−およ
びＰＵ−アビディティは、全てではないが、いくつかの腫瘍について相関した。腫瘍の位
置は矢印で示される。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後の示された時点でのＰＥＴ画像を
、最大標準化取込み値（ＳＵＶmax）として測定した。ＰＥＴアッセイからの結果は、左
気管気管支角リンパ節は、左気管気管支前角リンパ節の病変よりもＨＳＰ９０阻害療法に
感受性があると予想されることを示す。
本発明の別の側面においては、ＨＳＰ９０療法のための候補であると同定された患者を
、薬学的に有効な量のＨＳＰ９０阻害剤で処置する。本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害療法
に対する候補であると決定されたがん患者がＨＳＰ９０阻害療法に非常に好ましく応答す
ると決定した。患者が複数の腫瘍を有する場合、放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤に対す
る十分なアビディティを有するこれらの腫瘍だけが、ＨＳＰ９０阻害療法に応答すると予
想される。例えば、図２８は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを用いて画像化され、
次いで、ＨＳＰ９０阻害剤で処置された、肺および骨転移を有する４８歳の乳がん患者に
ついて観察された画像を示す。具体的には、患者を［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを
用いて画像化した場合、スキャンは、脊椎転移中ではなく、主要な右肺転移においてＨＳ
Ｐ９０標的化を示した。患者がＰＵ−Ｈ７１とは化学的に異なるＨＳＰ９０阻害剤である
ＳＴＡ９０９０（ガネテスピブ）を用いるＨＳＰ９０療法を続けた場合、初期部分応答は
脊椎病変ではなく肺腫瘤中でのＦＤＧ ＰＥＴ−ＣＴ研究により示され（図２８）、これ
は［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴによる予測と一致していた。リンパ腫、膵臓がんを
有する患者および神経芽細胞腫患者においても同様の結果が得られた。
用量決定のためのＰＥＴアッセイの使用
本開示は、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法の有効用量および投与頻度を決定する方法
であって、患者に、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先
的に結合する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を投与すること、１つ以上の時点で
の患者の腫瘍による放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定すること、な
らびにそれぞれの時点で腫瘍を処置するのに有効なＨＳＰ９０阻害剤の濃度を腫瘍中で維
持するのに必要とされる用量および投与頻度を算出することを含む方法を提供する。放射
標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを、上記で考察されたようなＰＥＴアッセイ
を用いて決定することができる。この方法を、限定されるものではないが、結腸直腸がん
、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺が
ん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳がん、神経芽細胞腫、消化管間
質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオー
マを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫
、白血病、骨髄腫および骨髄増殖性新生物ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内
膜がんを含む婦人科がんなどのいくつかの種類の固形および液性腫瘍に適用することがで
きる。
本開示の一態様においては、ＰＥＴから誘導された放射標識された阻害剤のＳＵＶを、
以下の式：
に従って、腫瘍中の薬剤のモル濃度に変換することができる。
上記の式において、［ＨＳＰ９０阻害剤］ｔは、放射標識された阻害剤の注入後の時間
ｔでの腫瘍中の阻害剤のモル濃度である。ＨＳＰ９０阻害剤（用量）の項は、注入される
治療用量である。Ｗ項は、腫瘍水分容積である。ＭＷ項は、注入される薬剤の分子量であ
る。［Ａ腫瘍］ｔ項は、時間ｔでの腫瘍中の注入された放射標識された用量％であり、こ
れはＰＥＴ画像から得られるＳＵＶから得られる値である。具体的には、［Ａ腫瘍］項は
、以下の式：
［Ａ腫瘍］／１００％＝ＳＵＶ腫瘍／［体重（ｇ）］により腫瘍（ＳＵＶmax）中の
ＳＵＶから誘導することができる。上記の式において、［体重］は、患者の体重を指す。
一側面において、本開示は、がん患者における画像化できる腫瘍中に存在するＨＳＰ９
０阻害剤の濃度を決定するための方法を提供する。放射標識された阻害剤の溶液（ここで
は「ホット」薬剤とも呼ばれる）を、薬剤を同時に注入することなく患者に注入すること
ができる（すなわち、非放射標識された形態の薬剤、ここでは「コールド」薬剤とも呼ば
れる）。そのような場合、薬剤［ＨＳＰ９０阻害剤腫瘍］ｔの濃度を、上記の式を用いて
決定することができる。一態様においては、放射標識された阻害剤（「ホット薬剤」）は
、標識された形態の注入される薬剤（「コールド薬剤」）である。例えば、放射標識され
た阻害剤は［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１であってもよく、投与される薬剤はＰＵ−Ｈ７１で
あってもよい。別の態様においては、放射標識された阻害剤は、注入される薬剤とは異な
っていてもよい。腫瘍［ＨＳＰ９０阻害剤腫瘍］ｔ中の薬剤の濃度の決定は、放射標識さ
れた阻害剤および治療剤の注入後の単一の時点または複数の時点で決定することができる
。腫瘍［ＨＳＰ９０阻害剤腫瘍］ｔ中の薬剤の濃度を、前臨床試験から得られた既知の有
効用量（例えば、半数阻害濃度（ＩＣ50））と比較することにより、当業者は投与される
用量が有効であるかどうかを決定することができる。次いで、医師はそれに従って用量を
調整し、望ましい量の薬剤が腫瘍中に入ることを確保することができる。
放射標識された阻害剤が、患者に投与される放射標識された形態の薬剤である態様にお
いては、腫瘍［ＨＳＰ９０阻害剤腫瘍］ｔ中の薬剤の濃度を、コールド薬剤を実際に投与
することなく決定することができる。そのような場合、ＰＥＴアッセイからの［Ａ腫瘍］
ｔの決定後、様々な仮定された注入用量値（Ｄ）を上記の式中で代入（impute）して、腫
瘍［ＨＳＰ９０阻害剤腫瘍］ｔ中の薬剤の濃度を決定することができる。したがって、腫
瘍［ＨＳＰ９０阻害剤腫瘍］ｔ中の薬剤の濃度を、上記で考察されたように前臨床試験か
ら得られた既知の有効用量と比較することにより、有効用量を決定することができる。さ
らに、５．２．１．２．１．節で詳細に考察されたように、その方法を用いて、ＨＳＰ９
０療法のための有効な投与レジメンを設計することができる。
本発明者らは、ホット薬剤の投与の直後の腫瘍内濃度または薬剤曝露（例えば、ＡＵＣ
）の算出およびＨＳＰ９０阻害剤の仮定量の入力により、コールドおよびホット薬剤が同
時投与される実験と同様の結果が得られると決定した。一例として、図２９は、２つの方
法により得られた画像の経時的な（０〜７２時間）疾患気管傍リンパ節中のＰＵ−Ｈ７１
の濃度を示す。この２つの方法により、顕著に類似する腫瘍内濃度およびかくしてＰＵ−
Ｈ７１への腫瘍曝露が測定される（ＡＵＣ0〜48h２４．９対２２．３μＭ−ｈ）。
本開示はまた、腫瘍中で発がん性ＨＳＰ９０受容体を飽和させるのに必要とされるＨＳ
Ｐ９０阻害剤の用量を決定する方法も提供する。上記の通り、放射標識されたＨＳＰ９０
阻害剤（すなわち、ホット薬剤）と特定量の治療剤（すなわち、コールド薬剤）の同時注
入により、ＰＥＴアッセイを行うことができる。注入される薬剤の用量が腫瘍中の「発が
ん性ＨＳＰ９０」の多くまたは全部を占拠するのに十分に高い場合、放射標識された阻害
剤の取込みは抑制される。放射標識された阻害剤の取込みが抑制される点を用いて、阻害
剤の標的飽和用量を決定することができ、これは単回用量の薬剤が送達することができる
「最大腫瘍用量」または薬剤の最大有効単回用量でもある。以下の５．２．２．２．１．
節の式（４）に示されるように、ＨＳＰ９０阻害剤により占拠される腫瘍部位の数を算出
し、占拠率（％）に変換することができる。ＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０部位の完全な
占拠に近い量で送達される場合、さらなる薬剤は効果レベルの増加を提供すると予想され
ない。したがって、その方法は、腫瘍中の発がん性ＨＳＰ９０の多くまたは全部を占拠す
ることができる阻害剤の用量を決定する手段を提供する。５．２．２．２．１．節により
詳細に考察されるように、上記方法は、従来の最大許容用量（ＭＴＤ）よりもむしろ、Ｐ
ＥＴ由来最大有効腫瘍内濃度に基づくより合理的で有効な投与戦略を提供する。この手法
は用量の上昇を回避し、薬剤に伴う毒性の問題を制限する。
５．２．２．２．１．［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１
本開示の一側面において、ＰＥＴ画像化のために用いられる放射標識されたＨＳＰ９０
阻害剤は、放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１、例えば、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１であ
る。以下に考察されるように、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を用いるＰＥＴ画像化を用いて
、がん患者がＨＳＰ９０療法に対して感受性であるかどうかを医師に知らせることができ
る。さらに、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を用いるＰＥＴ画像化から得られた結果を用いて
、特定のがん患者に投与すべきＨＳＰ９０阻害剤の用量を決定することができる。さらに
、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を用いるＰＥＴ画像化から得られた結果を用いて、ＨＳＰ９
０阻害剤の投与スケジュールを決定することができる。療法として投与されるＨＳＰ９０
阻害剤は、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似体、相同体、もしくは誘導体である。
潜在的な非侵襲的腫瘍ＨＳＰ９０アッセイとしての［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ
アッセイ
ＨＳＰ９０阻害剤の１つであるＰＵ−Ｈ７１が内因性のヨウ素原子、天然の安定なアイ
ソトープであるヨウ素−１２７（127Ｉ）を含有するため、ＨＳＰ９０阻害剤の非侵襲的
アッセイへのＰＥＴの導入が実現可能である（図３０ａ）114。これをＰＥＴのために、
４日の物理的半減期を有するアイソトープである、長半減期ポジトロン放射体ヨウ素−１
２４（124Ｉ）とアイソトープ置換することができる（図３０ａ）。そのようなアイソト
ープ標識は、この化合物の親和性、選択性または生体内分布プロフィールを変化させない
。事実、ＰＥＴ放射性医薬品、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１は治療化合物、ＰＵ−Ｈ７１と
同じ分子であり、したがって、その薬物動態を予測するはずである。微量（マイクログラ
ム）の放射標識された薬剤の単回投与もまた、生物学的に完全に非摂動的であり、複数の
日数にわたって組織トレーサ濃度をモニタリングするための連続ＰＥＴ画像化を可能にす
る。
124Ｉの相対的に長い半減期は、それが投与後最大で１週間にわたる十分な定量的ＰＥ
Ｔ画像化を可能にするため、ＨＳＰ９０阻害剤の報告された長い腫瘍薬物動態をモニタリ
ングするのに理想的である。さらに、124Ｉは米国では現在市販されており、その半減期
は［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を世界中の医療センターで利用できるようにすることを確保
する。
したがって、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１は、ＰＵ−Ｈ７１の真の「トレーサ」として、
および他のＨＳＰ９０阻害剤のための標的バイオマーカーとしての使用にとって非常に適
している。
ＨＳＰ９０阻害剤は、有望なクラスの標的化がん療法であるが、その最適な臨床開発に
は、ＨＳＰ９０標的に特異的な薬効評価アッセイの同時開発が必要である。その内因性ヨ
ウ素のため、本発明者らは、ポジトロン放射断層撮影に基づく腫瘍ＨＳＰ９０の今までに
類を見ない非侵襲的な画像化アッセイを開発するためにＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１を
使用する。本発明者らは、乳がんのマウスモデルにおいて、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１が
親薬剤の腫瘍内薬物動態および薬力学のための真のトレーサであることを示す。本発明者
らは、有効な腫瘍内濃度を達成するのに必要とされるＨＳＰ９０阻害剤の用量の決定、腫
瘍に送達される薬剤の実際の濃度のアッセイならびに有効な用量およびスケジュールレジ
メンの設計におけるその使用を証明する。アッセイはまた、腫瘍標的飽和用量に関する情
報を提供し、従来の最大許容用量を超えてＨＳＰ９０療法を誘導するのを約束する。この
研究に基づいて、本発明者らは、このアッセイが、治験の充実化（trialenrichment）の
ため、ならびに個々の患者に対する薬剤用量およびスケジュールを調整する改善された能
力を医師に提供することを提唱し、満たされない臨床必要性を満たし、ＨＳＰ９０標的剤
を用いる臨床決定の作製に正に影響することを約束する。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の生体内分布およびクリアランスはＰＵ−Ｈ７１のものを反
映する
ＰＵ−Ｈ７１および他のＨＳＰ９０阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏでの動態プロフィールの予
測およびモニタリングにおける［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の使用を評価するために、本発
明者らは、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を生成し、腫瘍担持マウス（ヒト乳がんＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４６８異種移植片）の連続小動物ＰＥＴ画像化研究を実施し、腫瘍および様々な正常
組織に関する時間−活性（すなわち、％ＩＤ／ｇ対投与後の時間）曲線を誘導した。注入
後の選択された時間に動物のコホートを犠牲にし、腫瘍および選択された正常組織を収穫
し、ガンマ計測することにより、［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１または［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７
１の協働的生体内分布試験を実施した（図３０ｂ〜ｃ）。静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔
内（ｉ．ｐ．）投与の後、薬剤は組織に迅速に分布し（図３０ｂ；１〜２時間）、その後
血液および他の正常組織から速やかに消失した（図３０ｂ；４〜１００時間）。投与後（
ｐ．ａ．）後４時間で、それは、それぞれ、脳、骨、筋肉、脾臓および心臓中よりも腫瘍
中に４０倍、９倍、１８倍、６倍および１０倍高い濃度で存在していた（図３０ｃ）。２
４時間までに、腫瘍と正常組織との比は、脳、筋肉、脾臓、心臓および血液について５０
〜１００に増加した。小さい方（体積約１００ｍｍ3）と大きい方（体積約２００ｍｍ3）
の両方の腫瘍における取込み（％ＩＤ／ｇ）は類似していた（図３０ｄ）。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１は双指数関数様式で腫瘍から消失した（図３０ｄ）。血液に
よる活性のクリアランスに帰する初期の急性期（図３０ｂ、ｄ）の後、特異的腫瘍保持に
帰する遅い最終クリアランス期（半減期約６０時間）があり（図３０ｄ、差込み図）、こ
れは、ＰＵ−Ｈ７１に関する以前に報告された直列液体クロマトグラフィー質量分析（Ｌ
Ｃ−ＭＳ／ＭＳ）に基づく腫瘍薬物動態データと一致していた100、115〜118。これらの
データは、腫瘍内で、治療型および放射性トレーサ型の薬剤が同一に挙動するという概念
を支持する。
腫瘍と対照的に、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１は単一指数関数様式で全身から迅速に消失
し、血漿タンパク質結合の証拠はなかった（図３０ｂ〜ｄ）。肝胆汁経路および泌尿器経
路により、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の排出が起きた（図３０ｂ）。肝臓活性は全身活性
よりもゆっくりと消失し、これはおそらく、肝臓薬剤代謝および肝胆汁性排出に起因する
ものであった。肝臓領域における活性は、肝細胞中の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ではなく
、胆道系中の無傷のトレーサと代謝物の両方に相当する可能性があり、これは無傷のＰＵ
−Ｈ７１がマウス肝臓から迅速に消失するという以前に報告された知見100、117と一致す
る。胃腸管における活性は、投与された活性の５０％以上を占めていた（図３０ｂ）が、
活性はほぼ完全に排出された（示さず）。
非胃腸管および非尿生殖器（すなわち、腎臓、尿管および膀胱）における活性は、投与
された活性の約１％を占めていた。残りの４９％（胃腸臓器における５０％−尿生殖器に
おける１％）は、おそらく尿管を介して排出された。この観察は、マウス全体を囲み、投
与された活性の４０〜５０％のみを占める対象領域（ＲＯＩ）を用いて誘導される４時間
のｉｎ ｖｉｖｏでの［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴデータ（図３０ｂ）により支持
される。マウスにおける腸管輸送時間は通常４時間より長いため１１９、投与された活性
の平衡（すなわち、４時間の全身ＲＯＩ中にない４０〜５０％）は尿管を介して排出され
たと考えられる。
マウスが放射性トレーサの投与前に飽和用量のヨウ化カリウムを受けた場合に抑制され
る甲状腺領域中で放射活性を可視化したところ（図３０ｂ）、ｉｎ ｖｉｖｏで遊離放射
性ヨード（すなわち、放射性ヨウ素）の生成が示された。ヨウ化カリウムを受けなかった
マウスにおいては、注入後４〜２８時間の最大甲状腺活性は、投与された活性の０．４％
未満であった。正常なマウスの甲状腺は、投与された放射性ヨードの最大約４〜７％を蓄
積する120、121。かくして、０．４％未満の甲状腺による取込みは、ｉｎ ｖｉｖｏで［
124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１から放出された遊離放射性ヨードの量が少ない（投与された活性
の約５〜１０％）ことを示唆する。少量の遊離放射性ヨードの放出は放射性ヨードトレー
サとしては珍しくなく、臨床実務においては、甲状腺による取込みは日常的であり、放射
性トレーサ投与の前のヨウ化カリウムの飽和溶液の経口投与を用いて効率的に遮断される
。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１はＰＥＴによる明確な腫瘍ＨＳＰ９０可視化を可能にする
腫瘍担持マウスにおける［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１のｉｎ ｖｉｖｏでのＰＥＴ画像化
は、注入の２時間後から、明確な腫瘍可視化、かくして、潜在的な腫瘍ＨＳＰ９０標的化
および腫瘍中での保持を提供した（図３０ｂ、矢印）。ＲＯＩ分析から得られた平均（＋
標準偏差）取込み値（％ＩＤ／ｇ）は、４、２４、４８、７２および１００時間で、それ
ぞれ０．３５±０．０７、０．０８３±０．０２、０．０５８±０．０２、０．０３１±
０．０１および０．０２４±０．００８であり、これは生体内分布試験において得られた
値と一致し（図３０ｄ）、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＵ−Ｈ７１の非侵襲的モニタリングおよ
びその時間依存的腫瘍内濃度の信頼性の高い定量が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴに
より可能であることを確認する。
薬学的に有効なＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度を達成するために必要とされるＰＵ−Ｈ７１の
用量を決定するための［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ画像化の使用
上記のように、腫瘍および血液中の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１、およびしたがって標識
されていないＰＵ−Ｈ７１の薬物動態は顕著に異なる：腫瘍薬剤濃度は、腫瘍血液プール
からの薬剤クリアランスに大きく起因する初期の迅速な指数的クリアランス後、注入後約
２４時間までに安定化した。対照的に、血中薬剤レベルは、迅速で連続的な指数的クリア
ランスを示した（図３０ｂ、３０ｄ）。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍と血液の活性濃
度比は、注入後約１２時間までに約１０以上の値に達した（図３０ｃ）。かくして、ＰＵ
−Ｈ７１の積分された血中レベル（すなわち、血液時間−活性濃度曲線下面積、ＡＵＣPU
-H71 血液）は、ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍レベルの信頼できる代用物ではなかった。実際、腫瘍
時間−活性濃度曲線下面積、ＡＵＣPU-H71 腫瘍は、ＡＵＣPU-H71 血液よりも１５倍大きい
（図３０ｄ、それぞれ、腫瘍および血液について、１１．４対０．７８％ＩＤ／ｇ−ｈ）
。したがって、血液薬物動態は、患者特異的な治療上有効な腫瘍内濃度を達成するための
投与レジメンの設計にとって信頼できるものではない。
したがって、本発明者らは、選択された期間にわたって治療上有効な腫瘍内濃度を達成
および維持するのに必要とされる投与されたＰＵ−Ｈ７１用量を予測する［124Ｉ］−Ｐ
Ｕ−Ｈ７１ ＰＥＴの能力を調査した。ＰＵ−Ｈ７１の投与された用量（ｍｇでのＰＵ−
Ｈ７１用量）について、投与後の時間ｔでの腫瘍水分容積（平均水分容積、Ｗ＝０．８ｍ
Ｌ／ｇを用いる）中の薬剤濃度（ｍｇ／ｍＬまたはｇ／Ｌ）、［ＰＵＨ７１腫瘍］tは、
平衡での腫瘍中のＰＥＴ由来［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１活性濃度（％ＩＤ／ｇ）、［Ａ腫
瘍］tから算出され、投与後の時間ｔで達成される：
したがって、投与後の時間ｔでの、腫瘍水分容積中の薬剤濃度（μＭ）、［ＰＵ−Ｈ７
１腫瘍］は、
であり、ここで、係数５１２は、ＰＵ−Ｈ７１の分子量であり、係数１ｘ１０6は濃度を
μＭに変換する。
逆に、選択された治療上有効な腫瘍ＰＵ−Ｈ７１濃度を達成するためには、個々の患者
について投与すべきＰＵ−Ｈ７１の必要な用量（ｍｇ）は、投与後の時間ｔでの腫瘍中の
彼または彼女のＰＥＴ由来活性濃度に基づいて算出することができる：
図３０ｄ中の腫瘍−活性データを用いて、１、５、２５、５０および７５ｍｇ／ｋｇの
ＰＵ−Ｈ７１（２０ｇのマウスについて０．０２、０．１、０．５、１および１．５ｍｇ
）の投与用量について、投与後（ｐ．ａ．）０〜１６０時間の腫瘍中の時間依存的ＰＵ−
Ｈ７１濃度を算出するために、式（１ａ）を用いた（図３１ａ、下パネル）。確立された
がん細胞におけるＰＵ−Ｈ７１に関する前臨床試験から、ＨＳＰ９０阻害剤へのいくつか
の確立された乳がん細胞の７２時間の曝露が、細胞型に応じて、０．０５〜０．２５μＭ
の記録された半数阻害濃度（ＩＣ50）で細胞増殖阻害を誘導することが公知である100。
かくして、投与後７２時間で腫瘍中の治療上有効な濃度を達成するために、［124Ｉ］−
ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより、それぞれの上記用量レベルでの単回用量を予測した（図３
１ａ、上パネル）。５、２５、５０および７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の投与された用
量ならびに約０．１４±０．０５％ＩＤ／ｇの［Ａ腫瘍］t=24h値について（図３１ｄ）
、式（１ａ）は、それぞれ、０．３７、１．８３、３．６７および５．５．１μＭのＰＵ
−Ｈ７１の腫瘍内濃度をもたらし、これはＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりこれらの腫瘍中で測定
された濃度と一致する（図３１ｂおよび示さず）。１ｍｇ／ｋｇの用量は、４８時間以上
で０．０５μＭ未満の腫瘍内濃度をもたらし（図３１ａ）、かくしておそらく、この腫瘍
モデルにおける治療上有効用量に関する下限である。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは腫瘍中の治療上有効なＰＵＨ７１濃度の送達を正
確に予測する
ＰＥＴが５〜７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の注入後に達成される腫瘍内濃度を正確に
予測したこと、およびこれらの濃度がｉｎ ｖｉｖｏで治療上有効であったことを実証す
るために、本発明者らは、これらの用量と関連する薬力学的効果を調査した（図３１ｃ、
３１ｄ）。薬学的に有効なＰＵ−Ｈ７１の腫瘍内濃度の送達を示唆する上記知見によれば
、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を担持するマウスへの５〜７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の
投与は、ＰＡＲＰ切断により示されるように、ＡｋｔおよびＲａｆ−１の下方調節および
／または阻害ならびにアポトーシスの誘導をもたらした（図３１ｃ、ｉｎ ｖｉｖｏ）。
これらの薬力学的変化は、組織培養において観察されたものと類似し、ここで、ＨＳＰ９
０依存的がんタンパク質（すなわち、Ｒａｆ−１、Ａｋｔ）の用量依存的枯渇により示さ
れるように、０．１μＭを超えるＰＵ−Ｈ７１濃度への２４時間にわたるＭＤＡ−ＭＢ−
４６８細胞の曝露はＨＳＰ９０阻害をもたらした（参考文献１００および図３１ｄ、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）。がん性クライアントタンパク質分解をもたらすとｉｎ ｖｉｔｒｏで決
定された半数阻害濃度（ＥＣ50 Raf-1＝０．１３±０．０２μＭおよびＥＣ50 Akt＝０．１
５±０．０２μＭ；図３１ｄ）は、腫瘍中にあると［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴに
より決定されたものと類似し、測定された薬力学的効果（ＥＣ50 Raf-1＝０．２４±０．
０３μＭおよびＥＣ50 Akt＝０．０９±０．０８μＭ；図３１ｃ）をもたらす。
まとめると、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定およびウェスタンブロット薬力学的分析により実証
されたＰＥＴ予測された腫瘍内濃度の一致は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセ
イが、治療上有効な腫瘍内濃度を達成するのに必要とされるこのＨＳＰ９０阻害剤の投与
される用量の選択を知らせる能力および正確性を証明する。
トレーサ用量の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１は、腫瘍中の最大標的飽和までのある範囲の
用量にわたるＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度を正確に予測する
トレーサ、微量の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の薬物動態は、肉眼的治療用量のものと相
関しなくてもよい。高用量のＰＵ−Ｈ７１では、腫瘍中でのＨＳＰ９０標的飽和、異なる
血漿タンパク質結合プロフィールまたは肝臓代謝酵素の潜在的阻害に起因する薬剤代謝の
変化などの因子が、薬剤の薬物動態を変化させてもよい。
したがって、本発明者らは、潜在的な飽和用量で、ＰＵ−Ｈ７１濃度のＰＥＴに基づく
予測が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより実験的に決定されたものと相関するかどうかを試験した
（図３１ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍への７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の投与は、
腫瘍の退縮および治癒をもたらし100、かくして、この治癒的用量で、腫瘍ＨＳＰ９０標
的の飽和または治療上有意な数の標的分子の少なくとも占拠がおそらく達成される。［12
4Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ研究または［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１生体内分布試験から誘
導された腫瘍内濃度に基づいて、７５ｍｇ／ｋｇの阻害剤の腫瘍担持マウスへの投与は、
投与後２４、４８、７２、９６および１２０時間で、それぞれ、５．５１±１．７８、３
．５０±０．２７、２．１８±１．７８、１．２９±０．２９および０．６９±０．２５
μＭの腫瘍内濃度をもたらした（図３１ｂ）。これらの値は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測
定された実際のＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度と良好に一致し（図３１ｂ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
、最大有効標的阻害をもたらすものまでのある範囲の用量にわたるＰＥＴアッセイ予測の
信頼性を証明する（図３１ｃ）。
ＨＳＰ９０療法のための患者選択における［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の使用
ＰＵ−Ｈ７１の生体内分布をモニタリングし、ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍薬物動態に関する情
報を提供するための臨床的に実用的なＰＥＴに基づく手法を提供することに加えて、前記
アッセイは、ＰＵ−Ｈ７１または他のＨＳＰ９０療法に対する好ましいか、または好まし
くない治療応答のいずれかを有する可能性がある患者を識別する、患者スクリーニングの
ための手法を示唆する。
具体的には、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の最少の取込みおよび／または迅速なクリアラ
ンスを示す腫瘍は、ＰＵ−Ｈ７１または他のＨＳＰ９０阻害剤に接近できなくてもよい。
あるいは、そのような知見はまた、腫瘍が生存のためにＨＳＰ９０に依存せず、かくして
、ＨＳＰ９０療法が適切ではないことを示してもよい93、97。逆に、［124Ｉ］−ＰＵ−
Ｈ７１の高い取込みおよび長い保持を有する腫瘍（例えば、より後の時点で、高い腫瘍と
血液との比に対応する、図３０）は、ＨＳＰ９０阻害剤による標的化に対してより感受性
が高いと予測される。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより予測される、有効な腫瘍
内濃度を達成するのに必要とされる治療用量が、非常に高い毒性をもたらす（例えば、有
効用量が最大許容用量よりも高い）場合、患者選択をさらに指導することができる。
結論として、長期間にわたってＨＳＰ９０阻害剤を有効濃度で保持し、非毒性的阻害剤
用量でそのような濃度を達成する腫瘍の能力は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴによ
り確実に測定することができるＨＳＰ９０療法エントリーのための２つの重要な基準であ
る。
ＰＥＴによりＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度をアッセイするための治療用量のＰＵ−Ｈ７１と
同時注入される微量の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の使用
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは有効腫瘍内濃度をもたらすのに必要とされるＨＳ
Ｐ９０阻害剤の用量を良好に見積もるが、本発明者らは、治療量のＰＵ−Ｈ７１（５ｍｇ
／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５，０００ｎｇ／ｇ〜７５，０００ｎｇ／ｇ）と同時投与
された微量（約６．５ｎｇ／ｇ）の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１が、腫瘍に本質的に送達さ
れたＰＵ−Ｈ７１の量を確実にアッセイすることができるかどうかを調査した（図３１ｂ
、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１の同時注入後のＰＥＴ）。薬剤活性の組
織中での薬剤曝露を測定する能力は、潜在的な応答を予測するための重要な情報を提供す
ることができる（例えば、どの濃度が腫瘍に送達されたか、およびそれが顕著な薬力学的
応答にとって十分なものであるかどうか）。処置時間にわたる連続的測定を、腫瘍生物学
およびかくして応答性が変化したかどうかの指示因子として用いることもできる（例えば
、腫瘍に送達された濃度の低下は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する耐性の潜在的発生を示唆し
得る）。
放射性トレーサ［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１および非放射性ＰＵ−Ｈ７１は約１：１０，
０００の比で注入されるため、本発明者らは、後者が本質的には腫瘍中の唯一の有意な形
態の薬剤であると合理的に推測することができる。かくして、ＰＵ−Ｈ７１（ｍｇで表し
たＰＵ−Ｈ７１用量）と微量の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１との同時投与用量について、腫
瘍水分容積中の薬剤濃度（再び、平均水分容積、Ｗ＝０．８ｍＬ／ｇおよび５１２のＭＷ
を用いる）は、
である。
５、２５、５０および７５ｍｇ／ｋｇ（２０ｇのマウスについて０．１、０．５、１お
よび１．５ｍｇ）のＰＵ−Ｈ７１用量について式（３）を解くと、ＨＳＰ９０阻害剤の実
際の腫瘍内濃度が得られる（図３１ｂ、７５ｍｇ／ｋｇについてのみ示される）。これら
の値は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥｔおよび［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１トレーサ生体
内分布により見積もられ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより実証されたＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度と
良好に相関する（図３１ｂおよび示さず）。
まとめると、これらのデータは、微量の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイに
より、特定の腫瘍内濃度をもたらすのに必要とされるＰＵ−Ｈ７１の用量と、腫瘍に送達
された治療的ＰＵ−Ｈ７１の実際の濃度との両方を得ることができることを示す。
最大腫瘍用量、ＨＳＰ９０薬剤による腫瘍標的飽和を送達する用量をアッセイするため
の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の使用
同時注入された［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７
１ ＰＥＴは、ＨＳＰ９０阻害剤による腫瘍ＨＳＰ９０標的の占拠を潜在的に評価するこ
とができる。例えば、所与の治療用量のＨＳＰ９０阻害剤が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の
腫瘍取込みを完全に、または有意に抑制することのＰＥＴによる証明は、その治療用量が
腫瘍ＨＳＰ９０標的を飽和させ、投与された用量が、単回用量の薬剤が送達することがで
きる「最大腫瘍用量」を送達することを示してもよい。この標的飽和用量を、薬剤の最大
有効単回用量と呼んでもよい。
この可能性を調査するために、本発明者らは、ＰＵ−Ｈ７１の治療用量（５〜７５ｍｇ
／ｋｇまたは５，０００〜７５，０００ｎｇ／ｇ）、ＰＵ−Ｈ７１用量と同時投与された
微量（約６．５ｎｇ／ｇ）の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１について、腫瘍１グラムあたりの
ＰＵ−Ｈ７１により占拠された腫瘍ＨＳＰ９０部位数（ＨＳＰ９０部位／ｇ腫瘍）を算出
した。これは、式：
を用いて得られた。
ＰＵＨ７１の非放射性用量、５、２５、５０および７５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、５，０
００、２５，０００、５０，０００および７５，０００ｎｇ／ｇ）のＰＵ−Ｈ７１用量の
同時投与された用量について式（４）を解くと、腫瘍１グラムあたりに結合したＰＵ−Ｈ
７１分子数（ｍｏｌで表される）が得られる。１分子のリガンドは１個のＨＳＰ９０分子
のポケットを占拠し、それに結合するため97、109、式（４）により、ＰＵ−Ｈ７１／ｇ
腫瘍により占拠される腫瘍ＨＳＰ９０部位の数（ｎｍｏｌで表される）も得られる（図３
１ｅ）。
注入後２４時間での結合曲線の分析は、利用可能なＨＳＰ９０部位の占拠が７５ｍｇ／
ｋｇのＰＵ−Ｈ７１用量で飽和に近く、１グラムの腫瘍が最大１６０．７ｘ１０-3ｎｍｏ
ｌのＨＳＰ９０を含有し（図３１ｅ、ＢＭＡＸ）、９６０ｘ１０11個のＨＳＰ９０分子に
相当することを示唆する。この値を用いて、本発明者らは次に、異なる投与用量のＰＵ−
Ｈ７１により占拠される腫瘍ＨＳＰ９０部位の割合を算出し、５、２５、５０および７５
ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の投与が、それぞれ、１２．１、５７．７、８８．７および９
２．７％の利用可能なＨＳＰ９０腫瘍部位をもたらし、阻害剤により占拠されると決定し
た（図３１ｆ）。腫瘍取込みのほぼ完全な飽和が、７５ｍｇ／ｋｇの単回治療用量のＰＵ
−Ｈ７１により達成されたので、その用量は多くの利用可能な腫瘍ＨＳＰ９０部位を占拠
し、したがって、用量の増加が腫瘍中に局在化する薬剤の量の増加をもたらすとはさらに
予想されないが、全身薬剤曝露および潜在的な患者毒性を増加させるであろう。
まとめると、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴによりここで示されたように、「最大
腫瘍用量」の分析は、「最大許容用量」よりも試験設計においてより価値がある情報を提
供する。具体的には、それは、投与された単回用量について、最大腫瘍（全身ではない）
曝露をもたらす用量が、投与された単回用量に関連する毒性を最小化しながら、実現し得
る最高の高腫瘍効果をもたらすことを示すであろう。さらに、それは、一度、最大腫瘍用
量が同定されたら、治療投与頻度を最大許容頻度（従来の最大許容用量、ＭＴＤよりもむ
しろ）の終点まで増加させ、それによって一時的に腫瘍曝露を最大化することができる、
治療投与頻度の選択のための新しい手法を示唆する。
ＨＳＰ９０療法のための有効な用量レジメンを設計するための［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７
１ ＰＥＴの使用
上記の結果は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを用いて、単回のＰＵ−Ｈ７１投与
後の選択された期間にわたって特定の腫瘍内濃度を達成および維持するのに必要とされる
用量を予測することができることを証明した。腫瘍はＰＵ−Ｈ７１の長い保持を示すため
、十分な頻度でのＰＵ−Ｈ７１の反復投与は、それぞれの連続的用量について、ＰＵ−Ｈ
７１のより高い累積腫瘍内濃度を潜在的にもたらす。用いた用量およびスケジュールに特
異的な定常状態の腫瘍ＰＵ−Ｈ７１濃度が最終的に達成される。したがって、データは、
定常状態の血漿濃度を達成することに対する投与の指導における血漿薬物動態の使用と同
様、ＰＵＨ７１投与設計の指導における腫瘍薬物動態の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥ
Ｔ画像化の潜在的な役割を示唆する。
これを探索するために、本発明者らは、週末は休みで週あたり３回の投与のスケジュー
ル（３ｘ週；月曜／水曜／金曜）で５、２５、５０および７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１
の投与をもたらすＰＵ−Ｈ７１の腫瘍内濃度を見積もった（図３２ａ）。このスケジュー
ルおよび示された用量で投与された場合のＰＵ−Ｈ７１の腫瘍内濃度を決定するために、
シミュレーションを実施した（図３２ａ）。このスケジュールおよびこれらの用量で得ら
れた腫瘍ＡＵＣ、ＰＵ−Ｈ７１の平均および最少腫瘍内濃度（それぞれ、［ＰＵ−Ｈ７１
］avgおよび［ＰＵＨ７１］min）も決定した（図３２ａ、差込み図）。５〜７５ｍｇ／ｋ
ｇの投与用量について、腫瘍中の予測されたＰＵ−Ｈ７１濃度は、それぞれ、［ＰＵ−Ｈ
７１］min＝０．１７〜２．５４μＭおよび［ＰＵ−Ｈ７１］avg＝０．４９〜７．４５μ
Ｍの範囲であった（図３２ａの差込み図を参照）。
記載のように、より低いＰＵ−Ｈ７１濃度（０．０５〜１μＭ）へのＭＤＡ−ＭＢ−４
６８乳がん細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの曝露は、強力な細胞増殖阻害をもたらし、その報
告されたＩＣ50は６０〜１００ｎＭである100。より高いＰＵ−Ｈ７１濃度（２μＭを超
える）で、およびこれらの細胞を４８時間、薬剤に曝露した場合、アポトーシスによる大
規模ながん細胞殺傷が見られた（すなわち、７０％を超える細胞がアポトーシスを受ける
）（図３２ｂ）。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析を考慮すると、週３回スケジュール
で、５〜７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の用量の投与は、主に腫瘍阻害効果（５ｍｇ／ｋ
ｇ）から強力な腫瘍アポトーシス（７５ｍｇ／ｋｇ）を予測する値に広がる治療上有効な
腫瘍薬剤濃度をもたらすと予測される（図３２ｂ）。実際、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移
植腫瘍を担持するマウスを上記のようにＰＵ−Ｈ７１で処置した場合、ＰＵ−Ｈ７１で処
置された腫瘍において用量依存的応答が観察された（図３２ｃ）。７週間の処置期間後、
有意な腫瘍応答が見られ、それぞれ５、２５および５０ｍｇ／ｋｇ用量に対して６３、８
２および９９％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が観察され、７５ｍｇ／ｋｇ用量では１００％
の退縮が観察された（図３２ｃ）。
本発明者らは、対照群の腫瘍が本発明者らのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａ
ｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＵＣＡＣ）により許容された最
大サイズに達するまで処置を継続し（図３２ｄ）、火曜日（用量を投与した最後の水曜日
の２４時間後）にマウスを犠牲にした。５ｍｇ／ｋｇ群の動物のみがウェスタンブロット
およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析にとって十分に大きい腫瘍を担持したが（腫瘍体積：
１３９±６６ｍｍ3）、ビヒクルのみで処置されたもの（腫瘍体積：１１２６±３９６ｍ
ｍ3）よりも有意に小さかった（図３２ｄ）。
５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１の投与用量について、腫瘍中の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１
に関する測定された腫瘍−活性データを用いて式（１ａ）を解くと（図３０ｄ）、処置期
間にわたるＰＵ−Ｈ７１腫瘍内濃度が得られる（図３２ｅ）。本発明者らのシミュレーシ
ョンは、犠牲にした時点でのＰＵ−Ｈ７１の腫瘍内濃度は０．４３μＭ（図３２ｅ）であ
るはずであり、これはＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりこれらの腫瘍中で決定された０．５２±０
．１３μＭの実際の濃度と顕著に類似することを示唆する（図３２ｆ、３２ｇ）。さらに
、観察された薬力学的効果、すなわち、腫瘍中での有意なＡｋｔ分解（５７％低下；Ｐ＝
０．００１７；図３２ｆおよび図３２ｇ、左パネル）およびＰＡＲＰ切断（図３２ｆ）に
より示されるＨＳＰ９０阻害は、この時点での腫瘍中の治療上有効なＰＵ−Ｈ７１濃度と
一致していた（図３２ｇ、右パネル）。これらの知見は、ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍取込みが１
２週間の処置にわたって依然として変化しなかったことを示し、これはＰＵ−Ｈ７１に対
するこれらの腫瘍の永続的な応答性と一致し（図３２ｄおよび参考文献１００）、［124
Ｉ］−ＰＵＨ７１ ＰＥＴを用いて、応答持続性または逆に、ＨＳＰ９０療法に対する獲
得された耐性の可能性をモニタリングしてもよいことを示す。
ＨＳＰ９０療法のための有効なスケジュールレジメンを設計するための［124Ｉ］−Ｐ
Ｕ−Ｈ７１ ＰＥＴの使用
腫瘍によるＰＵ−Ｈ７１の長い保持を考慮して、本発明者らは、薬剤の低頻度の投与が
その有効性を維持するかどうかを求めた。臨床設定において、これは、毒性を経験する患
者においてより低用量で療法を継続するか、または投与スケジュールの設計において用量
と投与頻度とを合理的に平衡を保つための論拠として有用であってよい。
週あたり３回（月曜−水曜−金曜）、２回（月曜および金曜）または１回（月曜）の投与
のスケジュール上で７５ｍｇ／ｋｇで投与されたＰＵ−Ｈ７１についてシミュレーション
を実施した（図３３ａ）。これらの計算は、腫瘍が、週３回、週２回および週１回のスケ
ジュールで、それぞれ、７．４５、５．４１および２．８８μＭの［ＰＵ−Ｈ７１腫瘍］
avgに曝露されることを示唆し（図３３ａ）、これは低頻度の投与スケジュールが腫瘍に
対して治療上有効濃度を依然として送達するはずであることを示している（図３３ｂ）。
実際、週１回のスケジュールで有意な腫瘍増殖阻害が得られたが、週２回の投与は５週間
の処置にわたって腫瘍の退縮をもたらした（図３３ｃ）。評価可能な腫瘍において（すな
わち、対照および５ｍｇ／ｋｇ処置群）、マウスを最後の投与用量の２４および９６時間
後に犠牲にした時、薬力学的マーカーの変化を分析した。
がんタンパク質の有意な、およびほぼ完全な枯渇（９５％レベルの低下、２４時間およ
び９６時間で、それぞれ、Ｐ＝０．００２１およびＰ＝０．００２５）が両時点で観察さ
れ（図３３ｄ）、標的飽和ＰＵ−Ｈ７１濃度（２μＭを超える）がこれらの時点で腫瘍中
に存在するはずであることを示唆する。これらの腫瘍中では、ＰＵ−Ｈ７１のＰＥＴによ
り予測された腫瘍内濃度は、２４時間および９６時間で、それぞれ、５．５．１および２
．１８μＭであり（図３３ａ、週１回のパネル）、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定された、
それぞれ、５．５３±０．２６および３．０９±１．４０の実際の腫瘍内濃度と厳密に一
致する（図３３ｅ）。
上記方法は、ヒト患者に容易に適用できる。一例は、図３４および図３５に示される。
図３４は、肺および隣接するリンパ節への疾患転移を有する再発膵臓がんを有する患者の
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴを示す。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１注入後のいく
つかの時点（４、２４、４８および１９２時間）でのＰＥＴ画像を定量し、［124Ｉ］−
ＰＵ−Ｈ７１について得られたＳＵＶデータを、２０ｍｇ／ｍ2のＰＵ−Ｈ７１の投与用
量あたりの濃度に変換した。これらの腫瘍は、非常に良好な［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の
取込みを示し、１９２時間（投与後８日）でも保持および可視化を示す。［124Ｉ］−Ｐ
Ｕ−Ｈ７１ ＰＥＴ／ＣＴは、この患者がＨＳＰ９０療法に応答する可能性があることを
予測する。１９２時間（８日）を超える時間にわたる腫瘍中でのＰＵ−Ｈ７１の保持は、
図３０に示されるように、マウス実験によっては予測されず、124Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１は投
与後１５０時間までにＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍から消失した。０〜１９２時間の様々な
時点でのＰＵ−Ｈ７１濃度の算出はまた、曲線下腫瘍面積（ＡＵＣ）の算出も可能にする
。図３４において、様々な肺結節およびリンパ節（ＬＮ）の曲線下面積は、０〜１９２時
間まで算出される。
ＰＵ−ＰＥＴにより決定されるように、ＰＵ−Ｈ７１へのこれらの腫瘍の曝露は、この患
者を処置するための最適な用量およびスケジュールの決定を可能にする。具体的には、週
２回（火曜および金曜）のスケジュールで２０ｍｇ／ｍ2の用量を投与した場合の２週間
の処置レジメンの経時的な、一方は左肺および他方は右肺門ＬＮ中の２つの特徴的な腫瘍
のＰＵ−Ｈ７１への曝露を算出し、曲線下面積（ＡＵＣ）として、および平均腫瘍内濃度
として表した（図３５、上パネル）。腫瘍は良好な薬剤曝露を示し、ＡＵＣ値はそれぞれ
１９０および４９９μＭ−ｈであり、Ｈｓｐ９０阻害剤の平均腫瘍内濃度はそれぞれ０．
７１および１．５７μＭを示す。膵臓がんの前臨床モデルにおいて、そのような濃度は、
増殖の阻害、その侵襲および転移能力の低下、ならびに膵臓がん細胞中でのアポトーシス
の誘導において有効であったが、これは、週２回のスケジュール（火曜−金曜）で与えら
れた２０ｍｇ／ｍ2の用量が患者にとって有益である可能性があることを示唆する。
また図３５（下パネル）に示されるように、週２回（火曜および金曜）のスケジュールで
４０ｍｇ／ｍ2および８０ｍｇ／ｍ2の用量で同様のシミュレーションを実施した。ＰＵ−
ＰＥＴ予測により最も最適な用量は、週２回のスケジュール（火曜日および金曜日）で与
えられる８０ｍｇ／ｍ2の用量であり、０〜３３６日にわたる腫瘍曝露および平均腫瘍内
濃度は、それぞれ、７６０および１９９８μＭ−ｈならびに２．８および６．３μＭ（図
３５、下パネル）より上に達した。これらの値は、有意な退縮および治癒をもたらすと前
臨床試験（図３２および３３）により予測される。
図３６は、肺に転移した疾患を有するＨＥＲ２＋乳がん患者に関する同様の計算を示す
。上のパネルは、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を用いるＰＥＴアッセイの結果を示す。中央
および下のパネルは、１０ｍｇ／ｍ2の投与されたＰＵ−Ｈ７１用量に基づく様々な時点
でのＰＵ−Ｈ７１の腫瘍内濃度を示す。薬力学的データは、０もしくは３３６時間の腫瘍
中のＰＵ−Ｈ７１のＡＵＣまたはその期間にわたる腫瘍中の薬剤の平均濃度を単位として
報告される。ＰＵ−ＰＥＴデータは、２週間にわたって週に２回与えられた場合、１０ｍ
ｇ／ｍ2の用量は１０３μＭ−ｈの腫瘍ＡＵＣ0〜336hを送達し、０．５９μＭの平均腫瘍
内濃度を維持し、かくして、このスケジュールでは、８０〜１００ｍｇ／ｍ2以上の用量
が好ましい応答にとって必要であると予測する。２週間にわたって週に３回与えられた場
合、１０ｍｇ／ｍ2の用量は１４０．８μＭ−ｈの腫瘍ＡＵＣ0〜336hを送達し、０．７１
μＭの平均腫瘍内濃度を維持し、かくして、このスケジュールでは、６０ｍｇ／ｍ2以上
の用量が好ましい応答にとって必要である。２週間にわたって週に１回与えられた場合、
１０ｍｇ／ｍ2の用量はわずかに５４μＭ−ｈの腫瘍ＡＵＣ0〜336hを送達し、０．４１μ
Ｍの平均腫瘍内濃度を維持し、かくして、このスケジュールでは、２００ｍｇ／ｍ2以上
の用量が好ましい応答にとって必要である。２週間にわたって週に５回（週末は休みで毎
日）与えられた場合、１０ｍｇ／ｍ2の用量は１８９．８μＭ−ｈの腫瘍ＡＵＣ0〜336hを
送達し、０．８１μＭの平均腫瘍内濃度を維持し、かくして、このスケジュールでは、５
０ｍｇ／ｍ2以上の用量が好ましい応答にとって必要である。
まとめると、これらのデータは、ＨＳＰ９０療法の個別化された臨床使用のための有効
な用量および用量−スケジュールレジメンの設計に関して情報を提供する際の［124Ｉ］
−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴの有用性を証明している。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴにより決定された場合のＰＵ−Ｈ７１への腫瘍曝露
は、ＨＳＰ９０療法に対する抗腫瘍応答を確実に予測する
治癒をもたらす処置時間にわたる阻害を必要とする標的部位数の理解は、依然として標
的化療法における大きな課題である。したがって、本発明者らは、上記で調査したいくつ
かの用量およびスケジュールレジメンについて、処置期間にわたる阻害剤によるＨＳＰ９
０部位の占拠をシミュレートした（図３７ａ）。次いで、本発明者らは、腫瘍ＨＳＰ９０
占拠と観察された抗腫瘍応答との相関分析を行うことを試みた（図３７ｂ）。
ＰＵ−Ｈ７１を治療用量（マウスにおいて５〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５，０００〜７５
，０００ｎｇ／ｇ）で投与された場合の、腫瘍１グラムあたりのＰＵ−Ｈ７１により占拠
される腫瘍ＨＳＰ９０部位数（ＨＳＰ９０部位／ｇ）を、式（４）を用いて得ることがで
きる。１グラムのＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍は最大１６０．７ｘ１０-3ｎｍｏｌのＨＳＰ
９０を含有するため（図３１ｄ、ＢＭＡＸ）、および１００％を超える部位の占拠は不可
能であることを考慮して、本発明者らは、各用量およびスケジュールレジメンに関して処
置時間にわたるＨＳＰ９０部位の占拠をシミュレートすることができた（図３７ａ）。
処置時間にわたってＰＵ−Ｈ７１により占拠および認識された平均％ＨＳＰ９０部位（
（ＨＳＰ９０部位占拠率％）avg）（図３７ｂ）、処置時間にわたって記録されたＰＵ−
Ｈ７１の平均腫瘍内濃度（［ＰＵ−Ｈ７１］腫瘍 avg；図３７ｃ）ならびに腫瘍ＡＵＣに
より算出された処置時間にわたる腫瘍曝露として測定された標的占拠は、観察された抗腫
瘍効果の規模と有意に良好に相関した（それぞれ、ｒ2＝０．７５５９、０．８１６２お
よび０．８１８８）。本発明者らの分析は、処置時間にわたって平均化された腫瘍ＨＳＰ
９０部位の８０％を超える占拠率（図３７ｂ）、または５μＭのＨＳＰ９０阻害剤の平均
腫瘍内濃度の維持（図３７ｃ）が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍退縮および治癒にとって必
要であることを示唆する。しかしながら、平均１５％以上の占拠部位により得られたか、
または０．５μＭ以上の処置時間にわたる平均腫瘍内濃度を維持することにより達成され
た、より低い占拠は、依然として部分的応答をもたらしてもよい（図３７ｂ、３７ｃ）。
考察
上記分析に基づいて、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤の臨床開発における使用可能性
を有する初めての非侵襲的なＰＥＴに基づくアッセイを設計および開発した。本発明者ら
は、親薬剤の腫瘍内薬物動態および薬力学の決定、有効腫瘍内濃度を達成するのに必要と
されるＨＳＰ９０阻害剤の用量の決定、腫瘍に送達される薬剤の実際の濃度のアッセイ、
ならびに最大許容用量（ＭＴＤ）ではなく標的調節効率に基づく有効用量およびスケジュ
ールレジメンの設計におけるその使用を証明する。本発明者らはまた、ＨＳＰ９０標的化
に対する腫瘍応答を有する可能性が最も高い患者の選択におけるその使用も証明する。
炭素１１−、フッ素１８−および窒素１３−標識された薬剤、例えば、Ｎ−［11Ｃ］−
メチルイマチニブ122、３−Ｎ−メチルおよび４−カルボニル−［11Ｃ］−テモゾロミド1
23、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アクリジン−４−カルボキサミド（［11Ｃ］
ＤＡＣＡ）124、［18Ｆ］５−ＦＵ124、ダサチニブの［18Ｆ］フッ素誘導体125および［1
3Ｎ］シスプラチン126が、半減期がスキャン中の総サンプリング時間よりも有意に短い薬
剤に関してＰＥＴ薬物動態パラメータにより評価するのに有用であることが、前臨床また
は臨床試験において他者によって示された。ＨＳＰ９０阻害剤については、その腫瘍半減
期（すなわち、２４時間を超える）はこれらのアイソトープにより許容されるサンプリン
グ期間よりも長く（すなわち、11Ｃ、13Ｎおよび18Ｆについて、それぞれ１０分、２０分
および１１０分）、これらの放射性アイソトープを用いるＰＥＴ薬物動態評価は不適切で
ある。124Ｉの比較的長い半減期のため、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイはか
くして、ＨＳＰ９０阻害剤の腫瘍薬物動態を非侵襲的および定量的にモニタリングするこ
とができる初めて報告されるアッセイである（図３８）。
さらに、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイは、医用画像化のための放射標識
された生物学的に不活性な微量の標的治療剤を用いる標的療法に関する標的画像化の概念
の真の具体化である127〜131。この概念は、薬剤開発の将来のために明確に認識され、高
度に支持されており、個別化医療に向かう道を開くが、その薬剤作用に最も応答する患者
を選択し、その投与用量のスケジュールに関して忠告する造影剤としてのがん小分子治療
剤の使用に関しては先例がない。ＰＵ−Ｈ７１の天然構造におけるヨウ素の存在およびし
たがって放射性ヨウ素標識の取込みによるその構造的および生物学的挙動の任意の摂動の
非存在のため、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイは、本発明者らの知る限り、
初めてのそのようなアッセイの１つである。具体的には、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の観
察された生体内分布プロフィール、すなわち、非腫瘍組織からの迅速なクリアランスを示
す腫瘍保持は、治療剤ＰＵ−Ｈ７１のそれを反映する。さらに、薬剤代謝物の形成はＰＥ
Ｔへの標識された薬剤の適用を制限するが41、本発明者らのデータは、［124Ｉ］−ＰＵ
−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイが微量と治療用量レベルの両方において腫瘍ＰＵ−Ｈ７１濃度
を正確に測定することを示し、これは、ＰＵ−Ｈ７１代謝物がＰＥＴにより測定された腫
瘍活性に有意に寄与しないことを示している。要するに、これらの知見は、［124Ｉ］−
ＰＵ−Ｈ７１がＰＵ−Ｈ７１の真のｉｎ ｖｉｖｏでの「トレーサ」としての使用にとっ
て非常に適していることを示唆する。
標的がん療法の開発において、臨床試験には有効腫瘍内濃度が達成されるかどうか、お
よび標的が適切に調節されるかどうかに関する知識が必要であることがよく理解されてい
る。本発明者らのデータは、［124Ｉ］−ＰＵＨ７１ ＰＥＴアッセイが腫瘍ＨＳＰ９０
阻害剤の薬物動態を定量的に測定し、注入用量または血漿薬物動態との従来の腫瘍応答相
関よりも多くの情報を提供する腫瘍用量−腫瘍応答相関を可能にすることを示している。
本発明者らのデータはまた、ＰＵ−Ｈ７１について、腫瘍薬物動態は腫瘍薬力学を反映し
、両パラメータの非侵襲的測定として［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを同定すること
も示している。かくして、標的占拠をも示す、腫瘍薬物動態は、ＨＳＰ９０阻害剤処置レ
ジメンに対する即時的応答（すなわち、１回用量の阻害剤後の標的調節）と長期的応答（
すなわち、設計されたスケジュールにわたる標的調節）の両方を理解する際の予測力を有
する。さらに、ＨＳＰ９０療法について考慮される個々の患者における［124Ｉ］−ＰＵ
−Ｈ７１腫瘍薬物動態を評価することにより、当業者はＨＳＰ９０処置から利益を得る可
能性が最も高い患者を同定し、結果として、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍取込みおよ
びクリアランスに基づいて、治療用量およびスケジュールを調整してもよい（図３８ａ）
。
本発明者らはまた、アッセイが、抗腫瘍効果およびＨＳＰ９０療法の経過にわたる結果
を予測する能力を有する、腫瘍ＨＳＰ９０標的化の程度およびＨＳＰ９０阻害剤治療用量
によるその飽和の画像化バイオマーカーとしての、ＰＥＴ由来腫瘍ＨＳＰ９０薬物動態に
基づく個別化投与レジメンの開発を指導することができることも示す（図３８ｂ）。これ
らの特徴のため、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイは、ＨＳＰ９０処置に対す
る腫瘍応答を理解し（図３８ａ）、潜在的には、それを予測する（図３８ｂ）ための薬効
評価手段としてのＨＳＰ９０阻害剤臨床試験における使用にとって最適である。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１データはまた、従来の最大許容用量（ＭＴＤ）よりもむしろ
ＰＥＴ由来最大有効腫瘍内濃度に基づくＨＳＰ９０標的化療法におけるより合理的で有効
な投与戦略を提供する。この手法は、ＰＥＴにより可視化されるように、腫瘍標的が薬剤
によりほぼ飽和される最適用量レベルである最大腫瘍用量を達成する新しい投与目標に向
かうものである（図３８ｃ）。この手法は、抗腫瘍効果ではなく患者に対する毒性を増加
させるだけであってよいさらなる用量上昇を回避する。最大許容用量（ＭＴＤ）未満の治
療用量で腫瘍飽和が観察される場合（例えば、用量漸増試験により決定される）、投与戦
略は、ＰＥＴにより決定された飽和最大有効腫瘍内濃度での投与の最大許容頻度を見出す
ことを追求してもよい。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴは、投与頻度の選択をさらに
情報提供するために最大有効腫瘍用量後に腫瘍飽和の持続期間を探索してもよい。［124
Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを同様に用いて、他のＨＳＰ９０阻害剤の用量および頻度選
択を指導してもよい。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１トレーサにより腫瘍標的化を競合的に阻
害する治療用量のＨＳＰ９０標的化剤の能力は、腫瘍薬剤飽和の指標を提供してもよい。
ＨＳＰ９０阻害剤の臨床開発のために、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴを用いて、一
般的に適用可能な投与戦略を誘導するために第１／２相臨床試験集団から腫瘍薬物動態デ
ータを収集するか、またはそれを真に「個別化された」用量−スケジュール選択のために
個々の患者ベースで用いてもよい。ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴ画像化は、本発明者らは考えて
いるが、これらの仮説を試験するのに非常に適した臨床手段である。現在行われている［
124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の第０相微量試験、およびＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅ
ｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒでのＰＵ−Ｈ７１の次回の第１相臨床試験
に含まれる［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイに関して、この概念は臨床設定に
おいて間もなく評価されるであろう。
結論として、腫瘍ＨＳＰ９０の標的化アッセイとしての［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ Ｐ
ＥＴは、ＨＳＰ９０標的化療法における分子標的のレベルでの患者選択、用量選択、腫瘍
診断および腫瘍応答の評価を劇的に、また合理的に前進させてもよい。そのようなものと
して、新規［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴアッセイは、ＨＳＰ９０の合理的、費用効
果的、および最適な臨床開発ならびにがんにおけるその使用を容易にするはずである。［
124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１ ＰＥＴの使用は、ＨＳＰ９０阻害剤の臨床試験の設計における
主要な前進であり、他の標的化治療剤の開発のための標的画像化薬効評価のパラダイムを
促進する。
５．２．２．２．２．［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３および［124Ｉ］−ＰＵ−ＨＺ１５１
内因性ヨウ素を含む他のＨＳＰ９０阻害剤を、ＨＳＰ９０ ＰＥＴアッセイにおいて働
くその能力について評価した。２つのそのような化合物としては、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｄ
Ｚ１３および［124Ｉ］−ＰＵ−ＨＺ１５１が挙げられ、これらをスキーム１６および１
７に示されるように合成した。

これらの化合物の放射化学的収率は３６．９６±１２．９７％（［124Ｉ］−ＰＵ−Ｄ
Ｚ１３）、３６．４５±１５．７５％（［124Ｉ］−ＰＵ−ＨＺ１５１）および４５．３
３±１５．７６％（［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１）であった；放射化学的純度（９８％を超
える）はＨＰＬＣにより確認された。比活性は、６３３ｍＣｉ／μｍｏｌ（［124Ｉ］−
ＤＺ１３）、５７６ｍＣｉ／μｍｏｌ（［124Ｉ］−ＨＺ１５１）および１０００ｍＣｉ
／μｍｏｌ（［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１）であった。
［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１および［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３のｉｎ ｖｉｔｒｏでの安
定性を評価するために、化合物を３７℃で５日間にわたってヒト血清中でインキュベート
し、脱ハロゲン化が起こったかどうかを決定するためにＩＴＬＣにより分析した。［124
Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１と［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３の両方が５日間（１２０時間）にわた
って安定である（９８％を超える）と決定された。
［131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３がＩＶとＩＰ経路の両方により投与された場合、腫瘍はそ
れを保持するが、腫瘍保持はＩＶによってより高く、統計的に有意である（Ｐ＜０．０５
）（投与後２４時間、腹腔内対静脈内経路）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ非腫瘍担持マウスにおい
て、［131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３は心臓血から迅速に消失し（％ＩＤ／ｇは２分で３．３
３±０．１３および投与後２４時間までに０．０１３±０．００であった）、胃および腸
による最大の取込みを有する（３〜８％ＩＤ／ｇ）。肝臓および脾臓は有意に異ならず（
Ｐ＜０．０５）、これは細網内皮系（ＲＥＳ）の改善を示唆している。しかしながら、［
131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３の腎臓による取込みは、尿クリアランスを意味する（％ＩＤ／
ｇは２分での５．５３±０．３４（データは示さず）から投与後２４時間までに０．０６
±０．０１に低下した）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ ＴＮＢＣマウスモデルにおいては、［
131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３は、腹腔内経路と比較して静脈内経路により投与された場合に
より長く腫瘍によって保持された。ＩＶ投与により、［131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３の腫瘍
取込み（１時間で１．４７±０．２２％ＩＤ／ｇ）は７２時間（０．０５±０．００％Ｉ
Ｄ／ｇ）にわたってゆっくりと減少した（％ＩＤ／ｇ＝０．５６±０．１４、４時間；０
．４０±０．０３、１２時間；０．０９±０．０３、２４時間）。非腫瘍担持マウスと同
様、［131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３の胃腸およびＲＥＳによる取込み、ならびに腎クリアラ
ンスはＭＢＡ−ＭＤ−４６８においても見られた。２５ｍｇ／ｋｇでＰＵ−ＤＺ１３と同
時投与した場合、［131Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３のｉｎ ｖｉｖｏでの生体内分布（投与後
２４時間、腹腔内対静脈内経路）は、ＰＵ−ＰＥＴにより予測された腫瘍内濃度がＬＣＭ
Ｓ−ＭＳにより決定された値と都合良く同等であることを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＥＴ画像化は、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１および［124Ｉ］−ＰＵ
−ＤＺ１３ ＨＳＰ９０阻害剤を含むＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を検出した。図３９は、
いずれかの阻害剤（［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１または［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３）を全身
的に注入したマウスの注入後４８時間でのＰＥＴ画像化の結果を示す。両方の放射性ヨウ
化ＨＳＰ９０阻害剤は、それぞれの時点でＰＥＴを用いて腫瘍を検出した。２つの阻害剤
の取込み％ＩＤ／ｇは腫瘍量において有意に異ならなかったが、［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ
１３は定性的に低い非特異的腹部取込みを有すると考えられた。
［124Ｉ］−ＰＵ−ＤＺ１３および［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１と違って、［124Ｉ］−Ｐ
Ｕ−ＨＺ１５１は、おそらく肝臓によるその迅速な代謝のため、マウス中の腫瘍を検出で
きなかった。
５．３．ＰＵ−Ｈ７１を用いるがん患者の処置
５．２．１．節に記載の方法は、放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤、例えば、［124Ｉ
］−ＰＵ−Ｈ７１を用いて、ＨＳＰ９０阻害剤療法に応答する可能性がある患者を同定し
、個々の患者のための最適化された投与レジメンを設計することができることを示す。投
与レジメンは、阻害剤の腫瘍曝露および阻害剤によるＨＳＰ９０の占拠などの因子に基づ
く。これらの薬物動態パラメータは本開示の放射標識された阻害剤を用いて容易に評価さ
れる。薬物動態データを大量の個々のがん患者から容易に得ることができるという事実の
ため、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤を過剰投与することにより引き起こされる毒性学
的問題を伴うことなく特定のＨＳＰ９０阻害剤の効果の望ましいレベルを達成するのに適
している薬物動態パラメータの範囲を決定する能力を有する。
したがって、本開示は、特定の薬物動態プロフィールを達成するために、ＨＳＰ９０阻
害剤、特に、ＰＵ−Ｈ７１を用いて、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、およびリンパ腫を有する
患者を処置する方法をさらに提供する。本開示はまた、特定の用量レベルおよび／または
特定の投与スケジュールで阻害剤を投与することによる、ＨＳＰ９０阻害剤、特に、ＰＵ
−Ｈ７１を用いて固形腫瘍、血液悪性腫瘍、およびリンパ腫を処置する方法も提供する。
特定の態様においては、ＨＳＰ９０阻害剤を用いて処置される腫瘍は、「ＨＳＰ９０依存
的腫瘍」である。上記で考察された通り、ＨＳＰ９０依存的腫瘍は、生理学がＨＳＰ９０
を用いる腫瘍である。ＨＳＰ９０依存的腫瘍は、正常なハウスキーピングＨＳＰ９０と比
較して有意な量の「発がん性ＨＳＰ９０」を含有する。この節に記載される方法を適用し
て、限定されるものではないが、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、
メラノーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんおよび
腺がんを含む肺がん、あらゆるサブタイプの乳がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食
道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む脳
腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、他の形質
細胞障害を含む多発性骨髄腫、白血病、骨髄増殖性新生物ならびに卵巣がん、子宮頸がん
、および子宮内膜がんを含む婦人科がんなどのいくつかの種類のがんに適用することがで
きる。
一態様において、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有するヒト患者
を処置する方法であって、薬剤の投与後の約１６時間〜約２４時間の少なくとも１つの時
点で、患者の腫瘍中の発がん性ＨＳＰ９０の１５％以上の占拠率、患者の腫瘍中の発がん
性ＨＳＰ９０の３０％以上の占拠率、患者の腫瘍中の発がん性ＨＳＰ９０の５０％以上の
占拠率、または患者の腫瘍中の発がん性ＨＳＰ９０の６０％以上の占拠率を提供するのに
十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供する。例えば、ＰＵ−Ｈ
７１の投与は、薬剤の投与後１６〜２４時間の少なくとも１つの時点で、患者における少
なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも
５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、
少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の発がん性ＨＳＰ９０の占拠率を提
供することができる。１つの特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１の投与は、薬剤の投与
後約２４時間で、患者における少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％
、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の
発がん性ＨＳＰ９０の占拠率を提供することができる。別の態様においては、ＰＵ−Ｈ７
１の投与は、薬剤の投与後１５時間〜２４時間の全範囲で、患者における少なくとも１５
％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少な
くとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％または１００％の発がん性ＨＳＰ９０の占拠率を提供することが
できる。ＰＵ−Ｈ７１を投与して、薬剤の投与後の約１６時間〜約２４時間の少なくとも
１つの時点またはその間の全範囲で、２つの前記値のいずれかを境界とする発がん性ＨＳ
Ｐ９０の占拠率、例えば、約２０％〜約８０％の占拠率、約３０％〜約８０％の占拠率、
約４０％〜約８０％の占拠率、約４０％〜約９０％の占拠率、約５０％〜約８０％の占拠
率、約５０％〜約９０％の占拠率、約６０％〜約８０％の占拠率、約６０％〜約９９％の
占拠率、約５０％〜約９９％の占拠率、約５０％〜約９９．９％の占拠率、約７０％〜約
９９．９％の占拠率などを提供することができる。別の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は
、発がん性ＨＳＰ９０の１００％の占拠率を達成する最少用量で投与される。５．２．１
．１．節で考察された通り、上記の発がん性ＨＳＰ９０占拠率を提供するためのＰＵ−Ｈ
７１の投与は、ＰＵ−Ｈ７１の有効用量をもたらす。１つの特定の態様においては、腫瘍
を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約０．３μＭ〜約７．５μＭの範囲の投与後２４時間での腫瘍
内濃度を提供するのに十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供す
る。例えば、ＰＵ−Ｈ７１の投与の約２４時間後の腫瘍中のＰＵ−Ｈ７１濃度は、０．３
μＭ、１μＭ、３μＭ、５μＭまたは７μＭであってもよい。２つの上記値のいずれかの
間の約２４時間後の薬剤の腫瘍内濃度、例えば、約１μＭ〜約３μＭの腫瘍内濃度、約１
μＭ〜約５μＭの腫瘍内濃度、約３μＭ〜約５μＭの腫瘍内濃度、約３μＭ〜約７μＭの
腫瘍内濃度などを提供するために、ＰＵ−Ｈ７１を投与することができる。１つの特定の
態様においては、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約０．０５μＭ〜約３．５μＭの範囲の投与後約４８時間での
腫瘍内濃度を提供するのに十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提
供する。例えば、ＰＵ−Ｈ７１の投与後約４８時間での腫瘍中のＰＵ−Ｈ７１濃度は、約
０．５μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭまたは約３μＭであってもよい。２つの
上記値のいずれかの間の約４８時間後の薬剤の腫瘍内濃度、例えば、約１μＭ〜約２μＭ
の腫瘍内濃度、約１μＭ〜約３μＭの腫瘍内濃度、約０．５μＭ〜約２μＭの腫瘍内濃度
、約０．２５μＭ〜約２μＭの腫瘍内濃度などを提供するために、ＰＵ−Ｈ７１を投与す
ることができる。１つの特定の態様においては、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的
腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約０．３μＭ〜約７．５μＭの範囲の投与後約２４時間での腫
瘍内濃度および約０．０５μＭ〜約３．５μＭの範囲の投与後約４８時間での腫瘍内濃度
を提供するのに十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供する。１
つの特定の態様においては、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患
者である。
５．２．１．１．節で考察された通り、放射標識アッセイは、ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍曝露
を決定する都合の良い手段を提供する。様々な薬物動態パラメータ、例えば、腫瘍におけ
るＡＵＣおよび特定の期間にわたる薬剤の平均腫瘍内濃度を用いて、腫瘍曝露を測定する
ことができる。いくつかの固形腫瘍を有する患者上で収集された大量の薬物動態データに
基づいて、本発明者らは、特定の処置期間（例えば、２週間）にわたるＡＵＣおよび平均
腫瘍内濃度の測定が、薬剤の効果および毒性に関する重要情報を提供することを決定した
。上記で考察された通り、用語「腫瘍ＡＵＣ」とは、薬剤の投与から別の時点までの期間
にわたる薬剤の累積細胞内濃度を指す。例えば、０時間〜３３６時間の期間にわたる腫瘍
の水分容積中のＡＵＣは、ここでは腫瘍ＡＵＣ0〜336hと呼ばれる。「０」時点は、新規
処置サイクルの開始時に薬剤が初めて投与される時間を指してもよい。あるいは、「０」
時点は、薬剤が処置サイクルの中央に投与される時点を指してもよい。複数の用量の薬剤
を０時点〜３３６時間の時点の様々な時間に投与することができることが理解される。以
下に考察されるように、特定の範囲内にある腫瘍ＡＵＣ値および平均腫瘍内濃度は、有効
用量を提供する。
一態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者を
処置する方法であって、約１５０〜約４，０００μＭ−ｈのＡＵＣ0〜336hを提供する十
分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供する。例えば、ＰＵ−Ｈ７
１の腫瘍ＡＵＣ0〜336hは、約３００μＭ−ｈ、約５００μＭ−ｈ、約８００μＭ−ｈ、
約１２００μＭ−ｈ、約１５００μＭ−ｈ、約２０００μＭ−ｈ、約３０００μＭ−ｈま
たは約４０００μＭ−ｈであってもよい。２つの上記値のいずれかの間の腫瘍ＡＵＣ0〜3
36h、例えば、約３００μＭ−ｈ〜約８００μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336h、約５００μ
Ｍ−ｈ〜約８００μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336h、約５００μＭ−ｈ〜約１０００μＭ
−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336h、約１０００μＭ−ｈ〜約１５００μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0
〜336h、約１０００μＭ−ｈ〜約２０００μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336h、約１５００
μＭ−ｈ〜約２０００μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336h、約２０００μＭ−ｈ〜約３００
０μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336h、約２０００μＭ−ｈ〜約４０００μＭ−ｈの範囲の
ＡＵＣ0〜336h、約３０００μＭ−ｈ〜約４０００μＭ−ｈの範囲のＡＵＣ0〜336hなどを
提供するために、ＰＵ−Ｈ７１を投与することができる。一態様においては、「０」時点
は、新規処置サイクルの開始時である。１つの特定の態様においては、腫瘍を有する患者
は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約７５μＭ−ｈ〜約２，０００μＭ−ｈのＡＵＣ0〜168hを提
供する十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供する。例えば、Ｐ
Ｕ−Ｈ７１の腫瘍ＡＵＣ0〜168hは、約７５μＭ−ｈ、約２５０μＭ−ｈ、約４００μＭ
−ｈ、約６００μＭ−ｈ、約７５０μＭ−ｈ、約１０００μＭ−ｈ、約１５００μＭ−ｈ
または約２０００μＭ−ｈであってもよい。２つの上記値のいずれかの間の腫瘍ＡＵＣ0
〜168h、例えば、約１５０μＭ−ｈ〜約４００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約
２５０μＭ−ｈ〜約４００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約２００μＭ−ｈ〜約
５００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約５００μＭ−ｈ〜約７５０μＭ−ｈの範
囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約５００μＭ−ｈ〜約１０００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜
168h、約７５０μＭ−ｈ〜約１０００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約１０００
μＭ−ｈ〜約１５００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約１０００μＭ−ｈ〜約２
０００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168h、約１５００μＭ−ｈ〜約２０００μＭ−ｈ
の範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜168hなどを提供するためにＰＵ−Ｈ７１を投与することができる
。一態様においては、「０」時点は、新規処置サイクルの開始時である。１つの特定の態
様においては、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約１０μＭ−ｈ〜約３００μＭ−ｈのＡＵＣ0〜48hを提供する
十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供する。例えば、ＰＵ−Ｈ
７１の腫瘍ＡＵＣ0〜48hは、約１５μＭ−ｈ、約２０μＭ−ｈ、約２５μＭ−ｈ、約３０
μＭ−ｈ、約４０μＭ−ｈ、約５０μＭ−ｈ、約８０μＭ−ｈ、約１００μＭ−ｈ、約１
５０μＭ−ｈまたは約２００μＭ−ｈであってもよい。２つの上記値のいずれかの間の腫
瘍ＡＵＣ0〜48h、例えば、約１０μＭ−ｈ〜約１００μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜48h
、約１０μＭ−ｈ〜約８０μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜48h、約１５μＭ−ｈ〜約８０
μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜48h、約１５μＭ−ｈ〜約５０μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵ
Ｃ0〜48h、約２０μＭ−ｈ〜約５０μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜48h、約２０μＭ−ｈ
〜約４０μＭ−ｈの範囲の腫瘍ＡＵＣ0〜48h、約２０μＭ−ｈ〜約３０μＭ−ｈの範囲の
腫瘍ＡＵＣ0〜48hなどを提供するためにＰＵ−Ｈ７１を投与することができる。一態様に
おいては、「０」時点は、新規処置サイクルの開始時である。１つの特定の態様において
は、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約０．５μＭ〜約７．５μＭの０〜３３６時間のＰＵ−Ｈ７１
の平均腫瘍内濃度（ここでは［ＰＵ−Ｈ７１］avgと呼ぶ）を提供する十分な量のＰＵ−
Ｈ７１を患者に投与することを含む方法を提供する。例えば、０〜３３６時間の［ＰＵ−
Ｈ７１］avgは、約１μＭ、約３μＭ、約５μＭ、または約７μＭであってもよい。２つ
の上記値のいずれかの間の［ＰＵ−Ｈ７１］avg、例えば、約１μＭ〜約５μＭ、約３μ
Ｍ〜７μＭ、約３μＭ〜約５μＭなどの範囲の［ＰＵ−Ｈ７１］avg（０時間〜３３６時
間に測定される）を提供するためにＰＵ−Ｈ７１を投与することができる。一態様におい
ては、「０」時点は、新規処置サイクルの開始時である。１つの特定の態様においては、
腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
別の態様においては、本開示は、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有する患者
を処置する方法であって、約０．２５μＭ〜約３．７５μＭの０〜１６８時間のＰＵ−Ｈ
７１の平均腫瘍内濃度（［ＰＵ−Ｈ７１］avg）を提供する十分な量のＰＵ−Ｈ７１を患
者に投与することを含む方法を提供する。例えば、０〜１６８時間の［ＰＵ−Ｈ７１］av
gは、約０．５μＭ、約１．５μＭ、約２．５μＭ、または約３．５μＭであってもよい
。２つの上記値のいずれかの間の［ＰＵ−Ｈ７１］avg、例えば、約０．５μＭ〜約２．
５μＭ、約１．５μＭ〜３．５μＭ、約１．５μＭ〜約２．５μＭなどの範囲の［ＰＵ−
Ｈ７１］avg（０時間〜１６８時間に測定される）を提供するためにＰＵ−Ｈ７１を投与
することができる。一態様においては、「０」時点は、新規処置サイクルの開始時である
。１つの特定の態様においては、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒ
ト患者である。
当業者によって理解されるように、所望の「発がん性ＨＳＰ９０」占拠率、腫瘍ＡＵＣ
または［ＰＵ−Ｈ７１］avgを達成するために投与する必要があるＰＵ−Ｈ７１の総量は
、投与経路と投与スケジュールの両方に依存する。ＰＵ−Ｈ７１を、静脈内、皮下、筋肉
内および腹腔内などの様々な注入可能な経路により投与することができる。あるいは、Ｐ
Ｕ−Ｈ７１を経口投与することができる。
本開示の一態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回または
週５回から選択される投与スケジュールに従って、約５ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2の
範囲の用量で、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有するヒト患者に静脈内投与さ
れる。特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回または
週５回から選択される投与スケジュールに従って、約２０ｍｇ／ｍ2〜約６０ｍｇ／ｍ2の
範囲の用量で、ヒト患者に静脈内投与される。特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、
週１回、週２回、週３回、週４回または週５回から選択される投与スケジュールに従って
、約５０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2の範囲の用量で、ヒト患者に静脈内投与される。
他の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回または週５回か
ら選択される投与スケジュールに従って、約５０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2の範囲の
用量で、ヒト患者に静脈内投与される。他の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、
週２回、週３回、週４回または週５回から選択される投与スケジュールに従って、約７５
ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2の範囲の用量で、ヒト患者に静脈内投与される。さらに他
の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回または週５回から
選択される投与スケジュールに従って、約７５ｍｇ／ｍ2〜約１５０ｍｇ／ｍ2の範囲の用
量で、ヒト患者に静脈内投与される。１つの特定の態様においては、腫瘍を有する患者は
、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
好ましい態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回または週３回の投与スケジ
ュールに従って、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有するヒト患者に静脈内投与
される。特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週２回の投与スケジュールに従って、
約５０ｍｇ／ｍ2〜約１５０ｍｇ／ｍ2または約７０ｍｇ／ｍ2〜約１２５ｍｇ／ｍ2の範囲
の量で静脈内投与される。別の特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、週３回の投与ス
ケジュールに従って、約２０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2または約４０ｍｇ／ｍ2〜約
８０ｍｇ／ｍ2の範囲の量で静脈内投与される。別の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、
週１回の投与スケジュールに従って、約９０ｍｇ／ｍ2〜約１９０ｍｇ／ｍ2または約１０
０ｍｇ／ｍ2〜約２５０ｍｇ／ｍ2の範囲の量で静脈内投与される。１つの特定の態様にお
いては、腫瘍を有する患者は、ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者である。
一態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は、２週間にわたって週１回または週２回、次いで、
１週間休みの投与スケジュールに従って、固形腫瘍、リンパ腫または血液悪性腫瘍を有す
るヒト患者に静脈内投与される。別の特定の態様においては、ＰＵ−Ｈ７１は１週間にわ
たって週１回または週２回、次いで、１週間休みの投与スケジュールで投与される。ある
いは、ＰＵ−Ｈ７１は間に週単位の休みをとらずに週１回または週２回投与することがで
きる。
５．４．予後および診断適用のためのＨＳＰ９０に依存する経路およびがんタンパク質
の評価
５．１．節で考察された通り、がん細胞における「発がん性ＨＳＰ９０」と正常ＨＳＰ
９０との比に関する情報を用いて、がん細胞の生存および増殖におけるＨＳＰ９０の寄与
を決定することができる。さらに、本発明者らは、生存のためにＨＳＰ９０に依存するこ
とが多い特定のタンパク質および経路を同定した。患者のがん細胞中でのこれらのタンパ
ク質および／またはこれらの経路の発現レベルの同定は、特に、ＨＳＰ９０療法に応答し
た患者に対して評価した場合、患者のがんにおけるＨＳＰ９０タンパク質の役割に関する
重要な情報を提供することができる。したがって、本開示は、患者に存在するヒトがんが
ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法で
あって、（ａ）患者のがんから、ＨＳＰ９０タンパク質を発現する細胞を含有する試料を
取得するステップ；（ｂ）以下のパラメータ：活性化されたＡＫＴ経路、ＰＴＥＮ腫瘍抑
制因子の機能もしくは発現の欠陥、活性化されたＳＴＡＴ５経路、またはＢｃｌ２ファミ
リーメンバー、例えば、Ｂｃｌ−ｘＬのタンパク質発現のうちの少なくとも１つの存在を
、試料中に存在する細胞について評価するステップ；および（ｃ）ＨＳＰ９０阻害剤を用
いる療法に応答した１人以上のがん患者に由来するヒトがん細胞について、ステップ（ｂ
）で得られた評価を、同じパラメータまたはステップ（ｂ）で評価されたパラメータの所
定の参照評価と比較して、それにより患者のがんがＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答
する可能性があるかどうかを決定するステップを含む方法を提供する。特定の態様におい
ては、細胞は、乳がん細胞または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。
毎年、多数の潜在的な新薬が臨床評価に入るにも拘らず、登録に達するのは５％〜８％
に過ぎない。特に懸念されるのは、第３相における高い失敗率であり、見積もりで５０％
の抗がん剤が開発停止になる。そのような失敗は特に費用が高くつき、多くの患者がより
有効な処置を受ける可能性が奪われる。これらの厳しい統計は、患者選択および臨床試験
濃縮のための予測的バイオマーカーを発見し、実現する必要性を明確に物語っている。
本発明者らが標的化剤に関してここ数年で得られた結果から学んだことは何か？いかな
るバイオマーカーによっても選択されていない試験集団において単一の薬剤として、また
は化学療法に加えて新しい薬剤を投与した場合、多くの臨床試験は陰性の結果をもたらし
たが、少数の事例では、統計的に有意な利益が証明された。しかしながら、この利益は、
最良でも、全生存の小さいか、または中程度の絶対的延長からなっていた。他方、バイオ
マーカーにより誘導される患者選択に基づく標的化剤の使用と共に得られるより高い絶対
的利益の例は定常的に増加する。バイオマーカーは、特定の機構に基づく療法を用いる効
果の正確な予測因子を統合するために腫瘍および患者の特徴を用いる可能性を提供し、そ
れぞれ個々の患者のための処置の選択を指導する。特に、実証された予測マーカーは、特
定の処置から正の臨床転帰を有する可能性がある個体を予測的に同定することができる。
本開示は、これらの問題を認識し、がんの処置へのＨＳＰ９０阻害剤の実装におけるバ
イオマーカーにより誘導された患者選択および臨床試験濃縮のためのバイオマーカーの開
発および実証を認識する。
５．４．１．乳がんにおけるＨＳＰ９０に対するアポトーシス感受性を予測するマーカ
ー
腫瘍の遺伝的作製に応じて、細胞増殖抑制または細胞毒性効果がＢＣにおけるＨＳＰ９
０阻害から生じてもよい。しかしながら、診療所においては、処置に対して細胞増殖抑制
性ではなく高度にアポトーシス性の応答が最も望ましい。かくして、ＰＵ−Ｈ７１および
他のＨＳＰ９０阻害剤でチャレンジした場合にアポトーシスを受ける可能性がより高い乳
がん腫瘍を同定するために、本発明者らは、細胞系中での予備試験を行って、ＨＳＰ９０
阻害の際に最も高いアポトーシス応答を伴う分子的病変を同定した。
これらの試験は、活性化されたＡｋｔならびに上昇したＢｃｌ−ｘＬおよび／またはＢ
ｃｌ２および／またはＭｃｌ−ｌａｓ主要エレメントのＨＳＰ９０により指令される調節
がＨＳＰ９０阻害に対する腫瘍のアポトーシス感受性（すなわち、応答を予測するバイオ
マーカー）を付与することを提唱する。当業者であれば、活性化されたＡｋｔ経路の測定
には、この経路と関連する１つ以上のタンパク質、例えば、限定されるものではないが、
Ａｋｔ、Ｓ６、ＰＲＡＳ４０、Ｂｃｌ２、ｍＴＯＲ、ＩＫＫ、ＮＦκＢの発現および／ま
たはリン酸化状態を測定することが必要であってもよいことを理解できる。Ａｋｔ経路お
よびその活性化に関する詳細な情報は、ＫＥＧＧ ＰＡＴＨＷＡＹデータベース；および
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｐａｔｈｗ
ａｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ中にオンライン上で見出してもよい。
また、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓ
ｓ．；ＢｉｏＣａｒｔａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；およびＩｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌａｒｓｂａ
ｄ，Ｃａｌｉｆ．のウェブサイトも参照されたい。この経路は、限定されるものではない
が、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオ−イノシトール４，５−ビスホスフェート、１４−３
−３、１４−３−３−Ｃｄｋｎｌｂ、Ａｋｔ、ＢＡＤ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＣＮ
Ｄ１、ＣＤＣ３７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、シトルリン、ＣＴＮＮＢ１、ＥＩＦ４
Ｅ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＲＫ１／２、ＦＫＨＲ、ＧＡＢ１／２、ＧＤＦ１５、グリコー
ゲンシンターゼ、ＧＲＢ２、Ｇｓｋ３、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、ＩＫＫ（複合体）、
ＩＬＫ、インテグリン、ＪＡＫ、Ｌ−アルギニン、ＬＩＭＳ１、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡ
Ｐ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰＫ８ＩＰ１、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＴＯＲ、ＮＡＮＯ
Ｇ、ＮＦｋＢ（複合体）、一酸化窒素、ＮＯＳ３、Ｐ１１０、ｐ７０ Ｓ６ｋ、ＰＤＰＫ
１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート、ＰＩ３Ｋ ｐ８５、
ＰＰ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＦ１、Ｒａｓ、ＲＨＥＢ、ＳＦＮ、ＳＨＣ１（Ｅ
Ｇ：２０４１６を含む）、ＳＨＩＰ、Ｓｏｓ、ＴＨＥＭ４、ＴＰ５３ （ＥＧ：２２０５
９を含む）、ＴＳＣ１、Ｔｓｃ１−Ｔｓｃ２、ＴＳＣ２、ＹＷＨＡＥから構成される。
当業者であれば、１つ以上のＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス分子、例えば、Ｂ
ｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１の発現の測定がこの抗アポトーシスファミリーの寄
与を理解するのに必要であってよいことを理解できる。
確立されたＢＣ細胞における試験はＨＳＰ９０療法に応答する可能性がより高いＢＣに
関する価値ある情報を提供するが、培養細胞は現実の臨床疾患を完全に要約することはで
きない。乳がんの実験モデルは非常に少数の細胞系を包含し、これは数十年も前に開発さ
れたものである。いくつかの細胞系は多くの元の特徴を保持しているが、本発明者らは患
者試料と細胞系との、ＨＳＰ９０のレベルおよび他の特徴における相違を見出したが、こ
れは部分的には、培養ストレスの結果であり得る。さらに、培養細胞系は、環境が腫瘍細
胞に対して有する効果を要約しない。同時に、本発明者らは、初代移植片は腫瘍の特徴と
類似し、細胞系よりも忠実に処置に対して応答することができると考えている。
かくして、「ＨＳＰ９０療法に対して最も感受性が高いＢＣ腫瘍の範囲は何か？」とい
う疑問に取り組むために、本発明者らの試験は、脱同定された病理的廃棄物から得られた
臨床乳がん腫瘍標本中でのＰＵ−Ｈ７１の評価を含む。
これらの試料中で、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤に対するＢＣ腫瘍の感受性と、選
択されたバイオマーカーの発現との相関関係を確立した。以降の段階は、次の臨床試験に
おける患者選択のためにこれを前進させ、提唱することである。一度、スコアリング系が
定義、実証されたら、最終的にはＦＦＰＥまたはＣＴＣ上で患者選択を行って、対象のマ
ーカーを、予測された応答と相関させることができる。次いで、そのような診断尺度を、
ＨＳＰ９０療法に応答する可能性がより高いＢＣ腫瘍の選択における一般的な実務として
導入することができ、ＨＥＲ２−スコアリングと同じ様式で、トラスツズマブ療法のため
の患者選択を指導するために用いられる。
ＰＵ−Ｈ７１に対するＢＣ試料の感受性のｅｘ ｖｉｖｏでの試験。ＢＣ患者腫瘍の新
鮮な組織切片を、ｅｘ ｖｉｖｏでＰＵ−Ｈ７１に曝露して、がん細胞の全体的感度およ
び正常細胞（すなわち、切片中に存在する場合、血管、良性の管）に対する効果を評価す
る。ＰＵ−Ｈ７１の濃度および曝露時間は、この薬剤を用いる予めのｉｎ ｖｉｔｒｏと
ｉｎ ｖｉｖｏとの両方でのＰＫ分析に基づくものであり、最大でマイクロモル濃度のＰ
Ｕ−Ｈ７１が投与後２４時間および４８時間で腫瘍中に送達され、そこで保持されること
が決定された。応答は１つまたは２つの尺度により決定される：１．アポトーシスを示す
形態学的変化を示す細胞のＨ＆Ｅ染色試料中での定量および２．ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定
量。
患者組織の調達：ＨＳＰ９０阻害剤臨床試験の間の脱同定された試料および針生検から
の病理的廃棄物を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの指針およ
び認可に従って取得する。新鮮に調達された組織をすぐに用いる。
ｅｘ ｖｉｖｏでの感受性試験：乳腺切除標本の外科的除去の直後に、組織を、Ｔｉｓ
ｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＴＰＳ）ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｓｕｉｔｅに輸送する。一度、病変を置いたら、組織を滅菌条件
下で収穫する。評価のために除去された標本サイズは、典型的には５〜１０ｍｍ ｘ ５
〜１０ｍｍである。最も生存能力のある領域をサンプリングするためにあらゆる努力を払
う。病変から遠くの、正常乳房上皮組織を代表する同等のサイズの標本を除去する。両標
本を１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む最少必須培地（ＭＥＭ）中に入れる。病
変の小部分および正常乳房上皮組織の全小片は、ＷＢによる将来の分子的評価のために「
簡易」凍結を受ける。残りの部分の病変（乳房切除）を、病理学的評価のために加工する
。全ての病変について、病理は、受容体状態、増殖マーカー、上皮マーカーおよび非標準
バイオマーカー（例えば、ｐＡＫＴ、ＢｃｌｘＬ、ＨＳＰ９０およびＨｓｐ７０）につい
てさらに評価される１０個の非染色を伴うヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色され
たスライドのためのＩＨＣを提供する。
予備分析から、本発明者らは、新鮮な組織スライスが一次細胞単離よりもＨＳＰ９０阻
害評価のための迅速でより有効なｅｘ ｖｉｖｏでの方法を提供することを学んだ。さら
に、それは周囲の組織の内因的環境中のがん細胞を保存する。間質細胞と腫瘍細胞との相
互作用はがんの増殖および進行において主要な役割を果たすことが知られているため、こ
れは重要である。この方法では、組織（すなわち、病変）を、プラスチック型に入れ、６
％アガロース中に埋込む。次いで、アガロースに埋込まれた組織をＶｉｂｒａｔｏｍｅの
ステージ上に載せ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭを含有する冷却さ
れた容器（組織保存用）中に沈める。次いで、組織を金属刃を用いてスライスし、２００
μｍの厚さの病変の連続切片を作製する。それぞれの切片（周囲のアガロース埋込み培地
を除く）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭを含有する２４穴組織培
養プレート中にすぐに入れる。５ｍｍ ｘ ５ｍｍの組織小片から、約２５個の切片が作
製される。これにより、最少４回用量のＨＳＰ９０阻害剤およびビヒクルのみを含むもの
で処理された組織切片の分析を繰り返すことができる。一度、組織切片がジスパーゼへの
簡単な曝露により酵素的解離を受けたら、反復物を、ＩＨＣおよび生存能力アッセイ（自
動化プレートリーダーまたはサイトスピン調製）の両方によりアッセイすることができる
。
現在まで、全てのＢＣサブタイプを包含する４２個の標本が獲得されている。これらの
うち、９個は受容体状態陰性のものであった。２００μｍの厚さの「新鮮な組織切片」を
増加用量のＰＵ−Ｈ７１に曝露させた、原発腫瘍（ＰＴ）とリンパ節転移（ＬＮ）（存在
する場合）の両方を評価した。ＰＵ−Ｈ７１を用いる三重陰性浸潤性腺管がん（ＩＤＣ）
の処置は、用量依存的様式で、原発腫瘍とリンパ節転移の両方のアポトーシスを達成した
。興味深いことに、ＬＮ転移（met）は、対応するＰＴよりもＰＵ−Ｈ７１に対してより
感受性が高いと考えられる。最も重要なことに、正常（例えば、血管、リンパ球）および
良性（例えば、管、小葉）組織は、ＰＵ−Ｈ７１への４８時間の曝露後にも未変化のまま
であった。データは、４つの異なる感受性群におけるＴＮＢＣ事例のクラスタリングを示
す：非常に高感受性、０．５μＭのＰＵ−Ｈ７１に見られる１００％のアポトーシス（上
の曲線、図４０Ａ）、１μＭのＰＵ−Ｈ７１で１００％のアポトーシスを示す感受性（中
央の曲線、図４０Ａ）、１〜２．５μＭで見られる約５０％のアポトーシスを示す部分的
耐性（下の曲線、図４０Ａ）および耐性（ＰＴ＃１４、試験濃度のいずれでも見られるア
ポトーシスなし、示さず）。
図４０Ｂに見られるように、いくつかの腫瘍は、細胞系上で生成された予備データから
予測されるよりもＨＳＰ９０阻害に対する感受性が高い。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−４
６８は最も感受性が高い乳がん細胞系の１つであるが（Ｃａｌｄａｓら、ＰＮＡＳ ２０
０９）、本発明において提示される試験は、ＰＵ−Ｈ７１に対してはるかに感受性が高い
腫瘍細胞をヒト乳がん患者から得られた一次標本中に見出すことができることを示す。具
体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の約５０％がアポトーシスを受けることを観察する
ためには、その細胞中で０．５μＭのＰＵ−Ｈ７１の４８時間の処理が必要であるが、本
発明者らは、いくつかのＨＥＲ２＋、三重陰性およびＥＲ＋乳がんについて、０．０５μ
Ｍほどの濃度が類似する効果を誘導することを見出す。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細
胞の約１００％がアポトーシスを受けることを観察するためには、その細胞中で約５μＭ
のＰＵ−Ｈ７１の４８時間の処理が必要であるが（図３２ｂ）、本発明者らは、いくつか
のＨＥＲ２＋、三重陰性およびＥＲ＋乳がんについて、０．５μＭほどの濃度が類似する
効果を誘導することを見出す。そのような試験は、治療効果をもたらすと予想されるＰＵ
−Ｈ７１の必要な腫瘍内濃度に関する情報を提供する。
ＧＩおよび膵臓がんにおける調査は同様の知見をもたらした。
５．４．１．１．ＩＨＣおよびＷＢによる提唱されたバイオマーカーの発現の調査、な
らびにバイオマーカー発現による試料のスコア化
ＩＨＣは、ＨＳＰ９０、Ｈｓｐ７０、ｐ−Ａｋｔ／ＡｋｔおよびＢｃｌ−ｘＬの低い〜
高い発現に基づいて試料をスコア化する。ＨＳＰ９０、ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ、Ｂｃｌ−ｘ
ＬおよびＨｓｐ７０染色強度は、０〜３のスケールでそれぞれの標本についてスコア化さ
れ（２回）、０は陰性、１は弱い陽性、２は中程度の陽性、および３は強い陽性の染色を
表す。スコアリングは非常に主観的であることが多いため、ＩＨＣ単独ではいくらか問題
が多いが、ウェスタンブロットなどの第二の方法と同時的なその使用はＩＨＣを「訓練」
および実証して、ｅｘ ｖｉｖｏとの、および患者応答における相関を作る。得られたタ
ンパク質の量が古典的な膜−ＷＢにとって十分なものでない場合、超高感度キャピラリー
ＷＢ技術が用いられる。典型的な針生検標本により、２０〜４０ｍｇの組織が得られ、こ
れは提唱されるＩＨＣにとって、および潜在的にはキャピラリーＷＢ分析にとって十分な
ものである。この情報を臨床応答の状況で分析し、提唱されたスコアリング方法の妥当性
を示すことができる。すなわち、本発明者らは、臨床応答を、バイオマーカー評価により
予測された応答と相関させる能力を有する。一度、スコアリング系が定義および実証され
たら、最終的にはＦＦＰＥ上で患者選択を行って、対象のマーカーを予測された応答と相
関させることができる。次いで、そのような診断尺度を、ＨＳＰ９０療法に応答する可能
性がより高いＴＮＢＣ腫瘍の選択における一般的な実務として導入することができ、ＨＥ
Ｒ２−スコアリングと同じ様式で用いて、トラスツズマブ療法のための患者選択を指導す
るために用いる。
いくらかの患者については、腫瘍に到達できない（深い内部転移）か、または同意が得
られないため、生検が可能ではなくてもよい。これらの事例については、本発明者らは、
血液から収穫された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が情報的価値があるかどうかを精査するつも
りである。疾患の段階に応じて、進行したがん患者については、本発明者らはこの技術を
用いて１，０００〜１０，０００個のＢＣ細胞を回収することを期待する。この細胞数は
、タンパク質のキャピラリー−ＷＢ分析（または必要に応じて、リアルタイムｑＰＣＲ分
析）にとって、ならびに免疫磁気的濃縮、次いで、フローサイトメトリーによるＨＳＰ９
０、Ｈｓｐ７０、ｐ−ＡｋｔおよびＢｃｌ−ｘＬ発現のスコアリングにとって十分なもの
である。
図４０は、ホスホ−Ａｋｔ、Ｓｅｒ４７３を用いる高い染色により示されるように、活
性化されたＡｋｔを有する乳がん腫瘍も、ＨＳＰ９０阻害に対して非常に高感受性である
ことを示すものである。
５．４．２．急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）におけるＨＳＰ９０阻害に対するアポトーシ
ス感受性の決定因子
白血病細胞においてアポトーシスを誘導するために設計された標的化療法は、最も有望
な抗白血病戦略である。本発明者らは、ＡＭＬにおける熱ショックタンパク質９０（ＨＳ
Ｐ９０）療法に対するアポトーシス感受性を予測するバイオマーカーを探索した。本発明
者らは、遺伝的に異なるＡＭＬ細胞系のパネルへのＨＳＰ９０阻害剤の添加が、細胞増殖
を強力に阻害し、いくつかのＡＭＬ細胞特異的がんタンパク質、例えば、突然変異ＦＬＴ
３、ＴＥＬ−ＴＲＫＣ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、突然変異ｃ−ＫＩＴおよび突然変異ＪＡＫ２
の分解を誘導した。注目すべきことに、これらの細胞がＨＳＰ９０阻害の際にアポトーシ
スを受ける傾向は、かなり変化した。最も感受性が高い細胞系はＭＯＬＭ−１３、ＭＶ−
４−１１およびＭ０−９１細胞であり、これらの細胞系のそれぞれについて、本発明者ら
はＨＳＰ９０阻害剤処理の４８〜７２時間後に初期細胞集団のほぼ１００％の殺傷を観察
した。対照的に、これらの条件下で、ＨＥＬおよびＨＬ−６０細胞においてはわずかに２
０％の細胞死が見られた。本発明者らは次に、ＡＭＬ中で脱調節されることが知られる公
知の発がんシグナリング経路の特異的阻害剤を利用して、ＨＳＰ９０阻害に対するＡＭＬ
細胞のアポトーシス感受性がＰＩ３Ｋ−ＡｋｔおよびＳＴＡＴ５活性化と相関するが、Ｒ
ａｆ−ＭＡＰＫ経路の活性化とは相関しないことを証明した。重要なことに、細胞系、異
種移植モデルおよび同系細胞系システムにおいて、類似する結果が観察された。本発明者
らはまた、Ｂｃｌ−ｘＬ過剰発現の状況下でも、これらの２つの経路の二重活性化が、Ｈ
ＳＰ９０が阻害された場合にＡＭＬのアポトーシス閾値を低下させることも見出した。総
合すれば、本発明者らの知見は、ＡｋｔおよびＳＴＡＴ５シグナリングが活性化されたＡ
ＭＬ患者が、ＨＳＰ９０阻害剤療法から利益を得る可能性が最も高く、これらの重要なシ
グナリング経路が特異的に活性化された患者を臨床試験に登録することを目標にすべきで
あることを示唆する。
重要なことに、ＡＭＬを有する患者の５０〜７０％は、ＡｋｔのＴｈｒ３０８とＳｅｒ
４７３の両方のリン酸化を示す。この分子は、ＡＭＬにおける増殖、生存および薬剤耐性
に寄与し、有害な転帰と関連する。総合すれば、本発明者らの知見は、ＡＫＴおよびＳＴ
ＡＴ５シグナリングが活性化されたＡＭＬ患者がＨＳＰ９０阻害剤療法から利益を得る可
能性が最も高く、これらの重要なシグナリング経路が特異的に活性化された患者を臨床試
験に登録することを目標にすべきであることを示唆する。
５．４．２．１．ＨＳＰ９０阻害はＡＭＬ細胞系における細胞型特異的殺傷を誘導する
いくつかの化学的に異なる小分子ＨＳＰ９０阻害剤が報告されており、いくつかは臨床
または後期前臨床調査中である（Ｃｈｉｏｓｉｓら、２００８）。これらのうち、アンサ
マイシン天然産物誘導体１７−ＡＡＧおよび１７−ＤＭＡＧ、ならびに合成化合物ＣＮＦ
−２０２４（ＢＩＩＢ０２１）およびＰＵ−Ｈ７１は全て臨床評価中であり、ＰＵ−Ｈ７
１の近い誘導体であるＰＵ−ＤＺ１３は前臨床開発中である。
ＨＳＰ９０阻害剤に対するＡＭＬ細胞系の感受性範囲を評価するため、およびその遺伝
的背景と、ＨＳＰ９０療法によるアポトーシスの誘導との可能な関係を調査するために、
本発明者らは、変化した細胞パネルを利用した。具体的には、本発明者らは、ＡＭＬ１−
ＥＴＯ融合物および突然変異ｃ−ＫＩＴ（Ｎ８２２Ｋ）タンパク質を含有する細胞系であ
るＫａｓｕｍｉ−１およびＳＫＮＯ−１；ＭＬＬ−ＡＦ９融合タンパク質とＦＬＴ３ Ｉ
ＴＤ突然変異の両方を含有する、ＭＤＳから進化したＡＭＬ再発患者の末梢血から確立さ
れたヒト細胞系であるＭＯＬＭ−１３；ＴＥＬ−ＴＲＫＣ融合タンパク質を含有し、構成
的に活性化されたＳＴＡＴ５も担持するＭ０−９１；ならびに最後に、ＪＡＫ２ Ｖ６１
７Ｆ突然変異を含有するＨＥＬを選択した。ＨＳＰ９０阻害剤は、用量および細胞依存的
様式で、それぞれの試験されたＡＭＬ細胞系の増殖を強力に阻害し、細胞殺傷も誘導し、
細胞系間で顕著な差異が観察された。最も感受性が高いのは、７２時間後に初期細胞集団
の１００％の殺傷が見られたＭＯＬＭ−１３およびＭ０−９１細胞、次いで、５０〜８０
％の殺傷が見られたＫａｓｕｍｉ−１およびＳＫＮＯ−１、ならびに２０％の殺傷が見ら
れたＨＥＬであった。正常な末梢血白血球は同様の濃度で影響されなかった。
異なるＨＳＰ９０阻害剤がＡＭＬ細胞系を殺傷する能力は類似しており、これは、化合
物の細胞毒性が共通の作用機構、すなわち、ＨＳＰ９０阻害を介して生じることを示唆し
ている。
５．４．２．２．ＨＳＰ９０阻害はＡＭＬ細胞中でアポトーシスを誘導する
かくして、ＨＳＰ９０阻害剤によるＡＭＬ細胞殺傷を担う機構をさらに調査するために
、ＰＵ−Ｈ７１を選択した。アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド二重染色、ＰＡ
ＲＰ切断およびキャスパーゼ３、７の活性化により証明されるように、ＡＭＬにおけるＰ
Ｕ−Ｈ７１の細胞毒性は主にアポトーシスの誘導を介して生じた。ＰＵ−Ｈ７１を用いる
処理の７２時間後にアポトーシスを受ける細胞の数は、ＭＯＬＭ−１３およびＭ０−９１
については１００％、ＳＫＮＯ−１およびＫａｓｕｍｉ−１については５０〜６０％、な
らびにＨＥＬについては３０％に近づき、その値は観察された細胞殺傷と良好に一致して
いた。ＭＯＬＭ−１３およびＭ０−９１においては１０倍、ならびにＫａｓｕｍｉ−１お
よびＳＫＮＯ−１においては２倍の、キャスパーゼ−３、７活性化の増加が、早くも２４
時間で観察された。ＨＳＰ９０阻害剤処理の４８時間後にはＭ０−９１細胞系について本
質的に生細胞は検出されなかった。最も感受性の高い細胞であるＭＯＬＭ−１３およびＭ
０−９１においては、アポトーシスは抗アポトーシス分子Ｂｃｌ−ｘＬの下方調節と関連
していた。
５．４．２．３．ＨＳＰ９０の阻害は重要なＡＭＬがんタンパク質を枯渇させるが、こ
の効果はアポトーシス感受性とは相関できない
ＨＳＰ９０阻害剤に対するＡＭＬ細胞系の異なるアポトーシス感受性は、特定の細胞系
においては有効なＨＳＰ９０阻害に起因するが、他のものにおいては無効であり得る。こ
の仮説を試験するために、本発明者らは、多くのがんにおいてＨＳＰ９０依存的であるこ
とが証明された２つのタンパク質、ＲＡＦ−１およびＡＫＴキナーゼに対するＰＵ−Ｈ７
１の効果を評価した。ＨＳＰ９０阻害剤は、全ての試験した細胞中のこれらのタンパク質
の定常状態レベルを用量依存的および顕著に低下させた。これは、ＨＳＰ９０ががん細胞
中でのこれらのキナーゼの安定性および機能にとって必要とされる確立された機構と一致
する。
これらの「膵臓がん」ＨＳＰ９０クライアントタンパク質に加えて、ＰＵ−Ｈ７１はま
た、特異的白血病誘発因子、例えば、ＭＯＬＭ−１３における突然変異ＦＬＴ３、Ｍ０−
９１におけるＴＥＬ−ＴＲＫＣ、Ｋａｓｕｍｉ−１およびＳＫＮＯ−１におけるＡＭＬ１
−ＥＴＯおよび突然変異ｃＫＩＴ、ならびにＨＥＬにおける突然変異ＪＡＫ２（ＡＭＬ細
胞特異的ＨＳＰ９０がん性クライアント）の分解をもたらした。突然変異ＦＬＴ３、ｃＫ
ＩＴおよびＪＡＫ２、ならびに融合タンパク質ＡＭＬ１−ＥＴＯは、ＡＭＬまたは他の形
質転換細胞中でのＨＳＰ９０阻害に対して感受性が高いことが以前に報告された。しかし
ながら、融合タンパク質ＴＥＬ−ＴＲＫＣは、Ｍ０−９１細胞系中でのＰＵ−Ｈ７１によ
るＴＥＬ−ＴＲＫＣの強力な分解を示す本発明者らの知見により示されるように、ＨＳＰ
９０の新規クライアントである。
まとめると、本発明者らの知見は、ＨＳＰ９０阻害剤が、ＡＭＬ細胞から、白血病誘発
にとって必須の事象であると主張される「２ヒット」を含む重要な悪性腫瘍誘導タンパク
質を枯渇させることを示すが、この効果と、ＨＳＰ９０阻害剤がＡＭＬ細胞中でアポトー
シスを誘導する能力との相関は明らかではない。
５．４．２．４．ＨＳＰ９０、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害に
対するアポトーシス感受性はＡＭＬ細胞中で重複する
遺伝子組成とＨＳＰ９０阻害に対するアポトーシス感受性との関係は明らかではないた
め、潜在的な答えは、抗アポトーシス表現型をもたらす機能的な差異またはこれらの細胞
間での特定の抗アポトーシス分子の示差的発現にあり得る。３つの主要な経路がＡＭＬに
おけるアポトーシスの調節と関連している：ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＮＦｋＢ、ＪＡＫ／ＳＴ
ＡＴおよびｒａｓ／ＭＡＰＫ経路。より重要なことに、ＨＳＰ９０はこれらの経路に沿う
いくつかの重要な分子を調節し、ＨＳＰ９０の阻害はこれらの分子、例えば、ｐ−ＡＫＴ
、ｐ−ＳＴＡＴおよびｐ−ＥＲＫの組合せ阻害を誘導することができる。
ＡＭＬ細胞系におけるアポトーシスに対する個々の経路の有意性を精査するために、本
発明者らは、特定の小分子、例えば、Ａｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ、Ａｋｔ１／Ａｋｔ２活性を
強力および選択的に阻害するキノキサリン化合物（ＡＫＴｉ）、ＭＡＰキナーゼＭＥＫ阻
害剤ＰＤ９８０５９（ＭＥＫｉ）およびｐａｎ−Ｊａｋ阻害剤２−（１，１−ジメチルエ
チル）−９−フルオロ−３，６−ジヒドロ−７Ｈ−ベンザ［ｈ］−イミダザ［４，５−ｆ
］イソキノリン−７−オン（ＪＡＫｉ））を用いた。本発明者らはまた、３つのさらなる
系：ｍｙｃがん遺伝子発現について陽性の広く研究されている前骨髄性細胞系であるＨＬ
−６０、単球性ＡＭＬを有する１歳男児の末梢血に由来する細胞系であるＴＨＰ−１、な
らびに４；１１転座およびＦＬＴ３ ＩＴＤ突然変異を含む細胞系であるＭＶ４−１１の
添加によりＡＭＬ細胞プールを拡張した。
ＡＫＴ、ＪＡＫおよびＭＥＫ阻害剤（ＡＫＴｉ、ＪＡＫｉおよびＭＥＫｉ）ならびにＨ
ＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１を用いる処置の際のアポトーシス細胞の数を、特定の阻害剤
の添加後２４、４８および７２時間で定量した。ＭＥＫ阻害剤の添加時に少ないか、また
はほんのわずかなアポトーシスの誘導が生じた。他方、ＡＫＴおよびＪＡＫ阻害剤は、ア
ポトーシスに対する可変的であるが、強力な効果を有していた。アポトーシスの分析は、
ＡＫＴｉに対して感受性である細胞が、ＨＳＰ９０が阻害された場合にアポトーシスする
可能性が最も高いものでもあることを示し（勾配＝０．９０２３±０．０９５７２）、こ
れは、ＨＳＰ９０阻害に対するアポトーシス感受性がＡＭＬ中でのＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路
阻害に対する感受性と潜在的に相関することを示唆している。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とＨ
ＳＰ９０阻害との相関もまた良好であった（勾配＝０．８２４５±０．１４９０）が、２
つの細胞系、ＭＶ４−１１およびＴＨＰ−１は明らかに線から外れていた。これらの知見
は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴとＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のいずれか、またはその両方への生存のた
めのＡＭＬ細胞依存が、ＨＳＰ９０阻害に対するアポトーシス感受性と相関し、それに潜
在的に影響することを示唆する。
５．４．２．５．ＡＫＴのｉｎ ｖｉｖｏでの阻害およびＳＴＡＴ５ ＳＰ９０阻害の
動態および効力は腫瘍アポトーシスと相関する
本発明者らは次に、マウスに異種移植されたＨＥＬとＭ０−９１腫瘍の両方におけるＨ
ＳＰ９０阻害の薬力学的効果を分析した。培養細胞と違って、ｉｎ ｖｉｖｏモデルの使
用により、ＨＳＰ９０依存的経路阻害のリアルタイムモニタリングが可能になる。ＨＳＰ
９０に最も依存する経路はまた、その薬理学的阻害に対して最も感受性が高いため、それ
らは依然として腫瘍中で最も長い時間、ＰＵ−Ｈ７１により阻害される。したがって、上
昇したｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＳＴＡＴ５を担持し、両経路の活性化に依存すると考えられ
るＭ０−９１腫瘍において、ＰＵ−Ｈ７１は顕著なアポトーシスを誘導した。Ｍ０−９１
におけるアポトーシスはＰＵ−Ｈ７１の１回用量の投与後９６時間持続し、これはＡＫＴ
とＳＴＡＴの両方の強力な阻害を反映する。最も高いレベルの切断されたＰＡＲＰは、Ｐ
Ｕ−Ｈ７１投与後１２〜７２時間の間隔で、ｐ−ＡＫＴとｐ−ＳＴＡＴ５レベルの両方が
初期レベルの７０〜１００％低下した時に観察された。ＰＡＲＰに対するＰＵ−Ｈ７１の
効果は９６時間までに低下し、その時、ｐ−ＳＴＡＴ５ではなくｐ−ＡＫＴがベースライ
ンレベルまで回復した。
ＨＥＬ異種移植腫瘍は、ＰＵ−Ｈ７１によるアポトーシス誘導に対してＭ０−９１腫瘍
よりも感受性が低かった。培養条件下では、ＨＥＬ細胞は上昇したｐ−ＳＴＡＴ５を発現
し、ＪＡＫｉまたはＰＵ−Ｈ７１によるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害は、２０〜３０％の
細胞にアポトーシスを受けさせる。他方、ＡＫＴｉはこれらの細胞における効果がほとん
どないか、または全くない。したがって、限定されたＰＡＲＰ切断およびキャスパーゼ−
３活性化が、これらの細胞においてＨＳＰ９０阻害時に見られる。
それにも拘らず、また組織培養とは対照的に、ヌードマウス中に異種移植した場合、Ｈ
ＥＬ細胞は低レベル〜中レベルのｐ−ＡＫＴ発現を示す。ＡＫＴ活性は環境、例えば、サ
イトカインによりＡＭＬ細胞中で刺激され得ることが報告されているため、これは驚くべ
きことではなく、腫瘍組織に対して独自のストレス要因、例えば、低酸素、酸性および異
常な血管形成のため、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍は、生存のためにＡＫＴ活性により多く依
存してもよい。ＰＵ−Ｈ７１は培養ＨＥＬ細胞中によりＨＥＬ腫瘍中で顕著により高いア
ポトーシスを誘導するため、異種移植されたＨＥＬ細胞中でのＡＫＴ活性の上昇が腫瘍生
存にとって必要であると考えられる。Ｍ０−９１腫瘍に関して、最も高いレベルの切断さ
れたＰＡＲＰは、ｐ−ＡＫＴとｐ−ＳＴＡＴ５レベルの両方がＰＵ−Ｈ７１によって初期
レベルの７０〜１００％低下した時（ＰＵ−Ｈ７１投与後１２〜４８時間の間隔で）に観
察された。ＰＡＲＰの切断は、ｐ−ＳＴＡＴ５ではなくｐ−ＡＫＴがベースラインレベル
に回復した時（７２時間）に有意に低下した。
まとめると、本発明者らのデータは、ＡＭＬ中のＨＳＰ９０阻害剤のアポトーシス活性
は、活性化されたｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＳＴＡＴ５種の下方調節と相関し、その尺度であ
る。ｐ−Ａｋｔ［すなわち、Ｓｅｒ４７３］の他に、Ａｋｔ経路の活性化状態を、ＰＵ−
Ｈ７１処置によっても下方調節される、Ｓ６、ｓ６ｋまたはｍＴＯＲのリン酸化状態の尺
度として決定することができる。この観察はまた、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ経路活性化への
ＡＭＬ細胞の付加的依存もまた、それらをＨＳＰ９０阻害に対してより感受性にすること
を暗示する。
５．４．２．６．ＨＳＰ９０阻害は、生存のためにＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＪＡＫ／Ｓ
ＴＡＴ経路に依存した細胞においてアポトーシスを誘導する
この仮説を証明するために、本発明者らは、ＦＬ５．１２同系細胞系を利用した。ＦＬ
５．１２は、機能的ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を含むインターロイキン−３（ＩＬ−３）依存
的細胞系として誘導されたものであり、それは初期のリンパ球前駆細胞の特有の特徴を有
する。親細胞とトランスフェクト細胞は両方とも、Ｓｅｒ４７３上でのＡＫＴリン酸化お
よびＴｙｒ６９４上でのＳＴＡＴ５リン酸化により示されるように、それぞれ中程度のレ
ベルの活性ＡＫＴおよびＳＴＡＴ５を発現する。ｐ−ＡＫＴではなくｐ−ＳＴＡＴ５のレ
ベルは、ＩＬ−３の存在に依存する。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性プロモーターの
制御下での構成的に活性化されたミリストイル化形態のＡＫＴ（ｍＡＫＴ）の導入により
、これらの細胞中でのｐ−ＡＫＴレベルの調節がさらに可能になる。一緒になって、これ
らの細胞は、活性化されたＡＫＴおよびＳＴＡＴ５経路へのＨＳＰ９０阻害剤アポトーシ
ス感受性の依存性を評価するための良好な同系モデルである。
ｍＡＫＴでトランスフェクトされた細胞をＡＫＴｉで処理した場合、５〜７％から１５
〜２０％のアポトーシス細胞の増加が見られた。この値は、これらの細胞の生存に対する
内因性ｐ−ＡＫＴの寄与を反映する。ＡＫＴ活性をＤＯＸの添加により増加させた場合、
細胞は生存のためにＡＫＴにより依存するようになり、ＡＫＴｉは３０％のアポトーシス
細胞をもたらした（Ｐ＝０．０１５）。
ｍＡＫＴでトランスフェクトされた細胞をＨＳＰ９０阻害剤で処理した場合、約３５〜
４０％のアポトーシス細胞が検出された。この値は、これらの細胞の生存に対する内因性
ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＳＴＡＴ５の組合せた寄与を反映する。Ｄｏｘによるｐ−ＡＫＴレ
ベルのさらなる増加は、ＰＵ−Ｈ７１依存時に３５〜４０％から５０％のアポトーシス細
胞の増加をもたらした。
総合して、これらの知見は、ＨＳＰ９０阻害剤に対するＡＭＬ細胞のアポトーシス感受
性が、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ経路への生存のための細胞の依存を反映することを示す。
５．４．２．７．Ｂｃｌ−ｘＬ過剰発現はＡＭＬにおけるＨＳＰ９０阻害のアポトーシ
ス効果を阻害することができない
構成的に高レベルのＢｃｌ−ｘＬは、様々なカテゴリーの化学療法剤に対する白血病細
胞の耐性と関連していた。したがって、本発明者らは、Ｂｃｌ−ｘＬの導入がＡＫＴおよ
びＳＴＡＴへの生存のためのＦＬ５．１２トランスフェクト細胞の依存性を克服するかど
うか、ＰＵ−Ｈ７１によるこれらの経路の阻害に対してそれらを耐性にするかどうかを調
査した。この仮説を調査するために、本発明者らは、アポトーシス阻害剤Ｂｃｌ−ｘＬを
含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＬ５．１２．ｍＡＫＴ細胞を利
用した。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖のためにＩＬ−３に依然として依存す
る。これらの細胞中では、Ｍ０−９１細胞と同様、ＳＴＡＴ５およびＡＫＴ経路の同時的
活性化ならびにＢｃｌ−ｘＬの過剰発現が観察される。Ｍ０−９１の場合と同様、ＰＵ−
Ｈ７１によるＨＳＰ９０阻害は、これらのタンパク質の活性および定常状態レベルの低下
をもたらし、そのアポトーシス効果を保持した。
５．４．２．８．考察
毎年、多数の潜在的な新薬が臨床評価に入るにも拘らず、登録に達するのは５％〜８％
に過ぎない。特に懸念されるのは、第３相における高い失敗率であり、見積もりで５０％
の抗がん剤が開発停止になる。そのような失敗は特に費用が高くつき、多くの患者がより
有効な処置を受ける可能性が奪われる。これらの厳しい統計は、患者選択および臨床試験
濃縮のための予測的バイオマーカーを発見し、実現する必要性を明確に物語っている。本
発明者らの研究は、ＡＭＬにおけるこの問題に取り組むものであり、ＨＳＰ９０阻害に対
するアポトーシス感受性が抗アポトーシス的役割を有するシグナリング経路への生存のた
めの累積的依存と相関することを示す。本発明者らは、これに関して主要な経路として活
性化されたＡｋｔおよびＳＴＡＴを同定する。
ＡＫＴシグナリングは急性ＡＭＬ患者の芽球中で活性化されることが多く、これらの細
胞の増殖、生存および薬剤耐性に強く寄与する。ＡＭＬを有する患者の５０〜７０％が、
Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３ ＡＫＴの両方のリン酸化を示す。ＡＫＴ活性化を示す患者
の無病生存期間と全生存期間は両方とも、ＡＫＴ活性化を示さない患者と比較して有意に
短かったが、これは、ＡＫＴ不活化がＡＭＬにおける強力な戦略であってよいことを全体
的に示唆する。ＨＳＰ９０は、同様に形質転換依存的様式で、この経路およびその重要な
エレメントのいくつかを調節する。したがって、一次急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞中
でのＨＳＰ９０の発現とｐＡＫＴの発現との有意な相関が観察されたが、これは、活性の
増加およびＡＫＴ経路への細胞の依存を緩衝するために、ＨＳＰ９０過剰発現がＡＭＬ細
胞にとって必要であることを示唆している。
構成的なＳＴＡＴ活性化はまた、約７０％のＡＭＬ試料中で起こる。ＡＭＬ細胞中での
ＳＴＡＴ活性化は、限定されるものではないが、ＦＬＴ３ ＩＴＤおよびＩＬ−６の自己
分泌刺激と関連していた。しかしながら、ＳＴＡＴ経路の他の上流のモジュレータもまた
、ＳＴＡＴの活性化において役割を果たしていてもよい。実際、ＫＩＴ突然変異はＪＡＫ
／ＳＴＡＴ経路を活性化することも見出されている。高いＳＴＡＴ５およびＦＬＴ３リン
酸化を示すＡＭＬの事例は、一般的に、同時的ＳＴＡＴ５リン酸化を示さないＡＭＬ芽球
と比較して、より低い割合の同時的アポトーシスを示した。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ遺伝子を含
む転座は、ＳＴＡＴ活性化と白血病誘発との別の関連を提供する。ＴＥＬ遺伝子の重合化
ドメインとＪＡＫ２の触媒ドメインとを組み合わせるｔ（９；１２）転座は、リンパ球と
骨髄性白血病の両方に見出されている。この転座は、下流のエフェクター、例えば、ＳＴ
ＡＴ５を構成的に活性化し、トランスフェクションモデルにおけるサイトカイン非依存的
増殖を誘導する。以前に報告され、またここで示されたように、これらのＳＴＡＴ活性化
タンパク質のいくつかは、その異常な活性を容易にするためにＨＳＰ９０を必要とする。
総合すれば、いくつかの活性化経路および分子、例えば、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ５への
侵襲性ＡＭＬクローンの生存のための依存は、それらをＨＳＰ９０に最も依存させる。か
くして、ＨＳＰ９０阻害は、これらの細胞を殺傷するのに最も有効になる。本発明者らの
知見はまた、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ５が活性化された状況下での抗アポトーシスＢｃｌ−
ｘＬの同時的過剰発現が、ＨＳＰ９０に対するこれらの細胞の感受性を有意に変化させな
いことを示唆している。Ｂｃｌ−ｘＬ過剰発現は、ＡＭＬにおける薬剤耐性への主要な寄
与因子である。Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ
−ｘ（Ｌ））の過剰発現は、１２２種の「標準的な」化学療法剤に対する薬剤耐性を引き
起こし、ＡＭＬ患者におけるより悪い臨床転帰と関連する。
結論として、本発明者らの知見は、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ５シグナリングが活性化され
たＡＭＬ患者がＨＳＰ９０阻害剤療法から利益を得る可能性が最も高く（図４１および４
２を参照）、これらの重要なシグナリング経路の特異的活性化を示す患者を臨床試験に登
録することを目標にすべきであることを示唆する。本発明者らの知見はまた、ＨＳＰ９０
阻害剤の導入が、そのアポトーシス閾値を低下させるための手段として、Ｂｃｌ−ｘＬを
過剰発現するＡＭＬにおける他の処置と共に正当化されることも示唆する。
５．５．ＨＳＰ９０阻害療法に感受性がある神経変性疾患患者を選択するための放射標
識されたＨＳＰ９０阻害剤の使用
ＨＳＰ９０阻害療法に感受性がある患者を選択するための放射標識されたＨＳＰ９０阻
害剤の使用は、５．２．１．節に記載された。同様の方法を用いて、ＨＳＰ９０療法に応
答する可能性がある神経変性疾患に罹患する患者を同定することができる。したがって、
本開示は、神経変性疾患に罹患する患者がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能
性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）脳を、患者の脳細胞中に存在する病原性形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する放
射標識されたＨＳＰ９０阻害剤と接触させるステップ；
（ｂ）試料中の脳細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測定するステップ
；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された試料中の脳細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻
害剤の量を、参照量と比較するステップを含み、ステップ（ｂ）で測定された脳細胞に結
合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が参照量と比較して多い場合、患者がＨＳＰ９０
阻害剤に応答する可能性があることを示す方法を提供する。
一態様において、参照は、神経変性疾患を有する同じ患者の細胞に由来する。例えば、
本発明者らは、正常ニューロンが「病原性ＨＳＰ９０」をほとんど有さないか、または全
く有さないと決定した。したがって、患者として罹患していない脳領域中の正常ニューロ
ンを用いて、参照量を決定することができる。別の態様においては、参照は、健康な個体
の細胞に由来するものであってもよい。別の態様においては、参照量を、健康な個体の試
験集団から測定することができる。
悪性形質転換も神経変性も、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭認知症およ
び他の認知症、球脊髄性筋萎縮症において起こる通り、特定のタンパク質の異常な発現、
翻訳後修飾、およびプロセッシングを特徴とする複雑で長い多段階のプロセスである。こ
れらの脱調節されたプロセスの蓄積を維持し、可能にするため、および疾患表現型の段階
的進化を容易にするために、細胞は代償性調節機構を選出しなければならない。がんにお
いては、この役割は熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）に起因してきた。この意味
で、表現型レベルでは、ＨＳＰ９０は多様な腫瘍に特徴的ないくつかのがん特異的病変の
ための生化学的緩衝材として働くと考えられる。同様の役割が神経変性においてＨＳＰ９
０のために存在し、かくして、５．２．１．節に記載のＰＥＴアッセイを用いて、疾患を
有する脳における「病原性ＨＳＰ９０」を同定することができる。神経変性疾患における
「病原性ＨＳＰ９０」は、がんにおける「発がん性ＨＳＰ９０」と同様の役割を果たす。
神経変性疾患の処置におけるＨＳＰ９０阻害剤の使用は、米国特許出願公開第２００９／
０２９８８５７号に記載されており、これは参照によりここに組込まれる。
ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−ＨＺ１５１は神経変性脳に対する高い結合親和性を示し、ＨＳ
Ｐ９０は、ＨＳＰ７０レベルを強く誘導することができ、脳に透過性であると見積もられ
ているので、本発明者らは、さらなるｉｎ ｖｉｖｏでの評価のためにそれを選択した。
ＰＵ−ＨＺ１５１は、ＷＯ２００８／００５９３７に記載されており、以下の化学構造：
を有する。
実際、３ｘＴｇ ＡＤマウスに腹腔内投与した場合、ＰＵ−ＨＺ１５１は、海馬におけ
るＨＳＰ７０誘導により示されたように、有意な標的調節をもたらした（図４３Ａ）。そ
の効果は用量依存的であり（図４３Ｂ）、１０ｍｇ／ｋｇの投与用量でもＨＳＰ７０の有
意な誘導が検出された。
本発明者らは次に、３ｘＴｇ ＡＤマウスの脳および血漿中で、これらの薬力学的効果
と関連するＨＳＰ９０阻害剤レベルを決定した（図４３Ｃ）。３ｘＴｇマウスに５０ｍｇ
／ｋｇで腹腔内投与した場合、皮質中でのＰＵ−ＨＺ１５１レベルは、投与後４時間で３
．３±０．９μｇ／ｇ（約５，０００ｎＭ）、１２時間で０．０５±０．０８μｇ／ｇ（
約１７０ｎＭ）、２４時間で０．０２±０．０３μｇ／ｇ（約６０ｎＭ）および４８時間
で０．０２±０．０２μｇ／ｇ（約５３ｎＭ）に達した。それと比べて、同様の用量（７
５ｍｇ／ｋｇ）で投与された、あまり有効でないＨＳＰ９０阻害剤であるＰＵ−Ｚ２８は
、投与後４時間でわずかに０．３５μｇ／ｇ（約７００ｎＭ）および１２時間で０．２μ
ｇ／ｇ（約３９０ｎＭ）の脳濃度に達し、投与後２４時間までに皮質中で検出されなくな
った。
血漿中では、ＰＵ−ＨＺ１５１は、４時間で２．１±０．１μｇ／ｇ（約４，０００ｎ
Ｍ）に達したが、８時間を超えると検出不可能であった。曲線下面積（ＡＵＣ）により測
定された、０〜４８時間の間隔にわたるＰＵ−ＨＺ１５１への皮質の曝露は、血漿のもの
よりも２．５倍高かった（１７．５対７．１μＭ−ｈ）。小脳（このモデルにおける疾患
に罹患していない脳領域）中のレベルは、皮質（このモデルにおける疾患を有する脳領域
）中で記録されたものよりも近く血漿のものと同等であった。この観察はまた、この脳領
域中での投与後４８時間を超える阻害剤ＰＵ−ＨＺ１５１の保持の延長によっても支持さ
れ、これは、腫瘍における、このクラスの阻害剤、例えば、ＰＵ−Ｈ７１に関して観察さ
れたものと類似する知見である。
したがって、124Ｉ−ＰＵ−ＨＺ１５１および他の放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を
用いて、ＨＳＰ９０依存的神経変性疾患に罹患した患者を選択し、そのような療法から利
益を得る可能性がより高い患者を同定することができる。それを、がんにおいてＰＵ−Ｈ
７１と同様の様式で用いて、ＨＳＰ９０阻害剤への病原性脳曝露を決定し、最適な用量お
よび投与スケジュールを決定することもできる。
当業者であれば、がんにおけるＰＵ−Ｈ７１に関する本発明により記載された使用を、
同様に放射標識された脳透過性ＨＳＰ９０阻害剤を用いて神経変性疾患において達成する
ことができることを理解できる。
６．材料および方法
６．１．合成方法
６．１．１．蛍光標識されたプローブの合成
Ｂｒｕｋｅｒ５００または６００ＭＨｚ装置上で1Ｈ ＮＭＲスペクトルを記録した。
内部標準としてのＴＭＳから下方へ化学シフトをδ値（ｐｐｍ）で報告する。1Ｈデータ
を以下のように報告する：化学シフト、多重性（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、
ｑ＝四重線、ｂｒ＝ブロード、ｍ＝多重線）、カップリング定数（Ｈｚ）、積分。高解像
度質量スペクトルを、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒシステム上で記録した。低
解像度質量スペクトルを、電子スプレーイオン化およびＳＱ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ
Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ上で取得した。高速液体
クロマトグラフィー分析を、ＰＤＡ、ＭｉｃｒｏＭａｓｓ ＺＱ、およびＥＬＳＤ検出器
ならびに方法Ａ（ａ）Ｈ2Ｏ＋０．１％ＴＦＡおよび（ｂ）ＣＨ3ＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、
５〜９５％ｂ、１．２ｍＬ／分で１３分；方法Ｂ（ａ）Ｈ2Ｏ＋０．１％ＴＦＡおよび（
ｂ）ＣＨ3ＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、５〜９５％ｂ、１．２ｍＬ／分で１３分の勾配を用い
る逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８、４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ
）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム上で実施した。２
３０〜４００メッシュのシリカゲル（ＥＭＤ）を用いてカラムクロマトグラフィーを実施
した。全反応をアルゴン保護下で実施した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）、スルホローダミン１０１スルホニルクロリド（テキサスレッド−Ｃｌ）および４−
クロロ−７−ニトロ−１，２，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）を、Ａｌｄｒ
ｉｃｈから購入した。
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ１［４］（スキーム１）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合物３
21（１５ｍｇ、０．０２６３ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（１１．３ｍｇ、０．０２８９ｍｍｏ
ｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で
濃縮し、残渣をＨＰＬＣにより精製したところ、１０．１ｍｇ（４０％）の化合物４が得
られた。1HNMR(500MHz, MeOH-d4) δ 8.17(s, 1H), 8.05(s, 1H), 7.93(s, 1H), 7.65-7
.74(m, 1H), 7.40(s, 1H), 7.08-7.16(m, 2H),6.76-6.89(m, 2H), 6.66(s, 2H), 6.50-6
.59(m, 2H), 6.02(s, 2H), 4.35(t, J=6.9Hz,2H), 3.96(t, J=6.4Hz, 2H), 3.78(br s,
2H), 3.62(br s, 2H), 2.31(m, 2H), 1.77(m,2H), 1.69(m, 2H), 1.45(m, 4H); HRMS(ES
I) m/z [M+H]+の計算値: C42H40IN8O7S2,959.1506; 実測値: 959.1530; HPLC(方法A) Rt
=4.52(96%).
ＰＵ−Ｈ７１−テキサスレッド［５］。ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中の化合物３21（４．
６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を、氷／水浴により０℃に冷却した。次いで、スルホロー
ダミン１０１スルホニルクロリド（３ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１２
時間撹拌し、温度を０℃から１０℃までゆっくり上昇させた。反応混合物をＨＰＬＣによ
り直接精製したところ、暗紫色の固体として３．４ｍｇ（６１％）の化合物５が得られた
。1HNMR(500MHz, MeOH-d4) δ 8.56(d, J=1.4Hz, 1H), 8.31(s, 1H), 8.16(dd,J=1.6,
7.9Hz, 1H), 7.48(s, 1H), 7.46(d, J=7.9Hz,1H), 7.28(s, 1H), 6.58(s, 2H), 6.08(s,
2H), 4.47(t, J=6.8Hz, 2H), 3.56(t,J=5.4Hz, 4H), 3.52(t, J=5.6Hz, 4H), 3.15(t,
J=7.6Hz, 2H), 3.08(m, 4H), 3.01(t, J=7.7Hz,2H), 2.93(t, J=6.7Hz, 2H), 2.68(m, 4
H), 2.35(m, 2H), 2.11(m, 4H), 1.90-2.00(m,4H), 1.66(m, 2H), 1.27-1.45(m, 6H); H
RMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C52H57IN9O8S3,1158.2537; 実測値: 1158.2534; HPLC(
方法B) Rt=9.40(99%).。
ＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１［８］（スキーム１）。化合物６21（１２．２ｍｇ、０．０２
２９ｍｍｏｌ）および化合物７32（３２ｍｇ、０．１１４５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４
ｍＬ）中に溶解し、ｒｔで２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られる残渣を分
取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、
７．９ｍｇ（４７％）の化合物８が得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ 8.32(
d, J=8.8Hz, 1H), 8.00(s, 1H), 7.21(s, 1H),6.89(s, 1H), 6.04(d, J=8.8Hz, 1H), 5.
89(s, 2H), 4.13(t, J=6.9Hz, 2H), 3.32(m,2H), 2.51(t, J=6.9Hz, 2H), 2.47(t, J=7
. 4Hz, 2H), 1.94(m, 2H), 1.63(m, 2H),1.36-1.45(m, 2H), 1.21-1.35(m, 4H); HRMS(E
SI) m/z [M+H]+の計算値: C27H30IN10O5S,733.1166; 実測値: 733.1171; HPLC(方法B) R
t=8.80(98%).
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２［９］（スキーム２）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合物２
23（１６．７ｍｇ、０．０３２６ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（１４．０ｍｇ、０．０３５９ｍ
ｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで５時間撹拌した。反応混合物を減圧下
で濃縮し、残渣をＨＰＬＣにより精製したところ、２１．２ｍｇ（７２％）の化合物９が
得られた。1HNMR(500MHz, CDCl3) δ 8.15(s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.77(d, J=7.9Hz, 1H
), 7.34(s, 1H), 7.09(d, J=7.9Hz, 1H),7.01(s, 1H), 6.63-6.71(m, 4H), 6.51(d, J=7
.3Hz, 2H), 6.02(s, 2H), 5.53(br s, 2H),4.30(br s, 2H), 3.64(br s, 2H), 2.85(br
s, 1H), 2.27(m, 2H), 1.23(d, J=6.2Hz, 6H);HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C39H33I
N7O7S2,902.0928; 実測値: 902.0942; HPLC(方法B) Rt=9.90(99%).
ＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ２［１０］。ＤＭＦ（０．３５ｍＬ）中の化合物２23（２５．４
ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、ＮＢＤ−Ｃｌ（１０．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）および
Ｅｔ3Ｎ（７．６μＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を、ｒｔで１２時間撹拌した。反応混合物
を減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、２５：
１）により精製したところ、１３．４ｍｇ（４０％）の化合物１０が得られた。1H NMR(6
00MHz, CDCl3/MeOH-d4)δ 8.25(d, J=8.9Hz, 1H), 8.06(s, 1H), 7.18(s, 1H), 6.85(s,
1H), 6.07(d, J=8.9Hz, 1H), 5.87(s, 2H),4.24(t, J=6.9Hz, 2H), 3.74(m, 2H), 3.18
(m, 1H), 2.12(m, 2H), 1.22(d, J=6.5Hz,6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C24H2
3IN9O5S,676.0588; 実測値: 676.0593; HPLC(方法B) Rt=10.37(99%).
２−（３−（６−アミノ−８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５
−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピル）イソインドリン−１，３−ジオン［
１２］（スキーム３）。５０ｍｇ（０．１２１ｍｍｏｌ）の化合物１１23を、ＤＭＦ（２
ｍＬ）中に溶解した。４３．４ｍｇ（０．１３３１ｍｍｏｌ）のＣｓ2ＣＯ3および１６２
ｍｇ（０．６０５ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ブロモプロピル）−フタルイミドを添加し、混
合物をｒｔで３０分間撹拌した。次いで、さらなるＣｓ2ＣＯ3（８ｍｇ、０．０２４２ｍ
ｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。次いで、さらなるＣｓ2ＣＯ3（８ｍｇ、
０．０２４２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、
得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１５：１：０．５）によ
り精製したところ、２５ｍｇ（３４％）の化合物１２が得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3
) δ 8.25(s, 1H), 7.85(dd, J=3.0, 5.5Hz,2H), 7.74(dd, J=3.0, 5.4Hz, 2H), 7.11(s
, 1H), 6.80(s, 1H), 6.10(br s, 2H), 6.00(s,2H), 4.27(t, J=7.6Hz, 2H), 3.77(t, J
=6.7Hz, 2H), 2.15(m, 2H); HRMS(ESI) m/z[M+H]+の計算値: C23H18IN6O4S,601.0155;
実測値: 601.0169; HPLC(方法A) Rt=7.74.
９−（３−アミノプロピル）−８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール
−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン［１３］（スキーム３）。ＭｅＯＨ／ＣＨ
2Ｃｌ2（０．７：０．１ｍＬ）中の化合物１２（３４ｍｇ、０．０５６６ｍｍｏｌ）の懸
濁液に、ヒドラジン水和物（４１μＬ、４２．５ｍｇ、０．８４９ｍｍｏｌ）を添加し、
混合物をｒｔで一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ
2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、１７ｍｇ（６４
％）の化合物１３が得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ 8.22(s, 1H),7.38(s
, 1H), 7.06(s, 1H), 6.05(s, 2H), 4.31(t,J=6.9Hz, 2H), 2.76(t, J=6.6Hz, 2H), 2.0
5(m, 2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値:C15H16IN6O2S, 471.0100; 実測値:471.0086
; HPLC(方法A) Rt=5.78.
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ３［１４］（スキーム３）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合物
１３（８．４ｍｇ、０．０１７９ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（７．７ｍｇ、０．０１９６ｍｍ
ｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下
で濃縮し、残渣をＨＰＬＣにより精製したところ、１１．４ｍｇ（７４％）の化合物１４
が得られた。1HNMR(600MHz, MeOH-d4) δ 8.23(s, 1H), 8.11(s, 1H), 7.68(d, J=8.0Hz
, 1H), 7.35(s, 1H), 7.20(s, 1H), 7.09(d,J=8.0Hz, 1H), 6.63-6.70(m, 4H), 6.50(d,
J=8.3Hz, 2H), 5.97(s, 2H), 4.34(t,J=6.5Hz, 2H), 3.61(m, 2H), 2.21(t, J=6.5Hz,
2H); MS(ESI) m/z 860.1 [M+H]+;HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C36H27IN7O7S2,860.
0458; 実測値: 860.0451; HPLC(方法B) Rt=9.48(96%).
ＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ３［１５］（スキーム３）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合物１
３（７．２ｍｇ、０．０１５３ｍｍｏｌ）、ＮＢＤ−Ｃｌ（３．１ｍｇ、０．０２１３ｍ
ｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（２．３μＬ、０．０１６８ｍｍｏｌ）を、ｒｔで１２時間撹拌
した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3
（７Ｎ）、２０：１）により精製したところ、４．１ｍｇ（４２％）の化合物１５が得ら
れた。1HNMR(600MHz, DMF-d7) δ 9.54(br s, 1H), 8.53(d, J=8.8Hz, 1H), 8.22(s,1H
), 7.51(br s, 2H), 7.28(s, 1H), 6.76(s,1H), 6.42(d, J=7.9Hz, 1H), 6.10(s, 2H),
4.47(t, J=7.0Hz, 2H), 3.67(m, 2H), 2.35(m,2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C2
1H17IN9O5S,634.0118; 実測値: 634.0130; HPLC(方法B) Rt=9.57(99%).
テトラエチレングリコール−ＦＩＴＣ（ＴＥＧ−ＦＩＴＣ）の合成。ＤＭＦ（０．４ｍ
Ｌ）中のＦＩＴＣ（２０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）、テトラエチレングリコール（４９
．９ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで１２時間撹拌
した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＨＰＬＣにより精製したところ、１７．３ｍ
ｇ（５８％）のＴＥＧ−ＦＩＴＣが得られた。1H NMR(600MHz, MeOH-d4) δ 7.53-8.25(m
, 2H), 7.14(d, J=8.2Hz, 1H), 6.72-6.91(m,4H), 6.65(d, J=6.8Hz, 2H), 4.60(br s,
2H), 3.77(m, 2H), 3.31-3.63(m, 12H);HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C29H30NO10S,
584.1590; 実測値: 584.1570; HPLC(方法B) Rt=8.97(99%).
２−（４−（６−アミノ−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−
５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）ブチル）イソインドリン−１，３−ジオン
（１６ａ）（スキーム４）。２００ｍｇ（０．４８４ｍｍｏｌ）の化合物１１を、ＤＭＦ
（８ｍＬ）中に溶解した。４６６ｍｇ（１．４３ｍｍｏｌ）のＣｓ2ＣＯ3および６８３ｍ
ｇ（２．４２ｍｍｏｌ）のＮ−（４−ブロモブチル）フタルイミドを添加し、混合物を３
０分超音波処理した。３１．５ｍｇ（０．０９７ｍｍｏｌ）のＣｓ2ＣＯ3を添加し、混合
物を再度３０分超音波処理した。これを、２時間の総反応時間にわたってさらに２回繰り
返した。ＤＭＦを除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ
、１５：１：０．５）により精製したところ、１３４ｍｇ（４５％）の化合物１６ａが得
られた。1HNMR(500MHz, CDCl3) δ 8.18(s, 1H), 7.84(dd, J=5.5, 3.1Hz, 2H), 7.72(d
d, J=5.5, 3.1Hz, 2H), 7.22(s, 1H), 6.89(s,1H), 6.76(br s, 2H), 5.99(s, 2H), 4.2
3(t, J=7.1Hz, 2H), 3.69(t, J=7.0Hz, 2H),1.67-1.83(m, 4H); MS(ESI) m/z 615.2 [M+
H]+.
９−（４−アミノブチル）−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール
−５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１７ａ）（スキーム４）。２ｍＬのＭ
ｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（７：１ｍＬ）中の化合物１６ａ（３８．９ｍｇ、０．０６３ｍｍｏ
ｌ）の懸濁液に、ヒドラジン水和物（４６μＬ、０．９５０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物
をｒｔで１２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2
Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、１８ｍｇ（５９％
）の化合物１７ａが得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ 8.22(s, 1H),7.38(s
, 1H), 7.04(s, 1H), 6.05(s, 2H), 4.23(t,J=7.4Hz, 2H), 2.78(t, J=7.1Hz, 2H), 1.8
2-1.91(m, 2H), 1.55-1.63(m, 2H); MS(ESI)m/z 485.0 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ４（１８ａ）（スキーム４）：ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合
物１７ａ（９．７ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（８．５７ｍｇ、０．０２２ｍ
ｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで３時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬ
Ｃにより直接精製したところ、５．２ｍｇ（３０％）の化合物１８ａが得られた。1H NMR
(600MHz, MeOH-d4) δ 8.22(s,1H), 8.00(s, 1H), 7.61(d, J=7.6Hz, 1H), 7.37(s, 1H
), 7.19(s, 1H), 7.06(d, J=8.2Hz, 1H),6.58-6.67(m, 4H), 6.48(dd, J=8.7, 2.0Hz, 2
H), 5.97(s, 2H), 4.30(t, J=7.0Hz, 2H),3.58(br s, 2H), 1.90-2.00(m, 2H), 1.61-1.
70(m, 2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値:C37H29IN7O7S2, 874.0615;実測値: 874.06
10; HPLC Rt=9.57(98%).
２−（６−（６−アミノ−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−
５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）ヘキシル）イソインドリン−１，３−ジオ
ン（１６ｂ）（スキーム４）。２００ｍｇ（０．４８４ｍｍｏｌ）の化合物１１を、ＤＭ
Ｆ（８ｍＬ）中に溶解した。４６６ｍｇ（１．４３ｍｍｏｌ）のＣｓ2ＣＯ3および７５１
ｍｇ（２．４２ｍｍｏｌ）のＮ−（６−ブロモヘキシル）フタルイミドを添加し、混合物
を２時間超音波処理した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃ
ｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１５：１：０．５）により精製したところ、１００ｍｇ（３
２％）の化合物１６ｂが得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.26(s, 1H), 7.83(dd, J
=5.4, 3.1Hz, 2H), 7.70(dd, J=5.4, 3.0Hz,2H), 7.26(s, 1H), 6.87(s, 1H), 6.36(br
s, 2H), 5.96(s, 2H), 4.18(t, J=7.5Hz, 2H),3.66(t, J=7.2Hz, 2H), 1.70-1.79(m, 2H
), 1.60-1.68(m, 2H), 1.32-1.43(m, 4H);MS(ESI) m/z 643.2 [M+H]+.
９−（６−アミノヘキシル）−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソー
ル−５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１７ｂ）（スキーム４）。４ｍＬの
ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（７：１ｍＬ）中の化合物１６ｂ（９７ｍｇ、０．１５１１ｍｍｏ
ｌ）の懸濁液に、ヒドラジン水和物（１１０μＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物
をｒｔで１２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2
Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、４７ｍｇ（６１％
）の１７ｂが得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.32(s, 1H), 7.31(s, 1H), 6.90(s,
1H), 5.99(s, 2H), 5.84(br s, 2H), 4.20(t,J=7.5Hz, 2H), 2.67(t, J=6.5Hz, 2H), 1
.72-1.84(m, 2H), 1.31-1.45(m, 6H); MS(ESI)m/z 513.0 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ５（化合物１８ｂ）（スキーム４）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中
の化合物１７ｂ（９．７ｍｇ、０．０１８９４ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（８．１１ｍｇ、０
．０２０８ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで３時間撹拌した。反応混
合物をＨＰＬＣにより直接精製したところ、８．０ｍｇ（４７％）の化合物１８ｂが得ら
れた。1HNMR(600MHz, MeOH-d4) δ 8.23(s, 1H), 8.09(s, 1H), 7.65(d, J=7.9Hz,1H),
7.35(s, 1H), 7.16(s, 1H), 7.08(d, J=8.3Hz,1H), 6.71(d, J=8.8Hz, 2H), 6.67(d, J
=2.2Hz, 2H), 6.53(dd, J=8.8, 2.2Hz, 2H),5.96(s, 2H), 4.24(t, J=7.1Hz, 2H), 3.50
(br s, 2H), 1.79-1.88(m, 2H), 1.52-1.61(m,2H), 1.31-1.42(m, 4H); HRMS(ESI) m/z
[M+H]+の計算値: C39H33IN7O7S2,902.0928; 実測値: 902.0939; HPLC Rt=10.02(99%).
２−（８−（６−アミノ−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−
５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）オクチル）イソインドリン−１，３−ジオ
ン（１６ｃ）（スキーム４）。２００ｍｇ（０．４８４ｍｍｏｌ）の化合物１１を、ＤＭ
Ｆ（８ｍＬ）中に溶解した。４６６ｍｇ（１．４３ｍｍｏｌ）のＣｓ2ＣＯ3および８１９
ｍｇ（２．４２ｍｍｏｌ）のＮ−（８−ブロモオクチル）フタルイミドを添加し、混合物
を１．５時間超音波処理した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ
2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１５：１：０．５）により精製したところ、１２０ｍｇ（
３４％）の化合物１６ｃが得られた。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 8.29(s, 1H), 7.84(dd,
J=5.5, 3.1Hz, 2H), 7.70(dd, J=5.5, 3.1Hz,2H), 7.28(s, 1H), 6.87(s, 1H), 6.29(b
r s, 2H), 5.96(s, 2H), 4.18(t, J=7.5Hz,2H), 3.67(t, J=7.3Hz, 2H), 1.62-1.77(m,
4H), 1.25-1.36(m, 8H); MS(ESI) m/z 671.3[M+H]+.
９−（８−アミノオクチル）−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソー
ル−５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１７ｃ）。４ｍＬのＭｅＯＨ／ＣＨ
2Ｃｌ2（７：１ｍＬ）中の化合物１６ｃ（９０．１ｍｇ、０．１３４５ｍｍｏｌ）の懸濁
液に、ヒドラジン水和物（９８μＬ、２．０１７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をｒｔで１
２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：Ｍｅ
ＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、２５ｍｇ（３４％）の１７ｃ
が得られた。1HNMR(500MHz, CDCl3) δ 8.33(s, 1H), 7.31(s, 1H), 6.90(s, 1H), 5.99
(s, 2H), 5.72(br s, 2H), 4.20(t, J=7.5Hz,2H), 2.66(t, J=7.1Hz, 2H), 1.70-1.80(
m, 2H), 1.36-1.45(m, 2H), 1.21-1.35(m, 8H);MS(ESI) m/z 541.1 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ６（化合物１８ｃ）の合成（スキーム４）。ＤＭＦ（０．２ｍ
Ｌ）中の化合物１７ｃ（１５．０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（１１．９ｍｇ
、０．０３１ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで４時間撹拌した。反応
混合物をＨＰＬＣにより直接精製したところ、１６．９ｍｇ（６６％）の化合物１８ｃが
得られた。1HNMR(600MHz, MeOH-d4) δ 8.22(s, 1H), 8.11(s, 1H), 7.68(d, J=7.8Hz,
1H), 7.34(s, 1H), 7.12(s, 1H), 7.09(d,J=8.2Hz, 1H), 6.72(d, J=8.7Hz, 2H), 6.67(
d, J=2.0Hz, 2H), 6.53(dd, J=8.7, 2.0Hz,2H), 5.96(s, 2H), 4.20(t, J=7.1Hz, 2H),
3.50(br s, 2H), 1.74-1.81(m, 2H),1.52-1.59(m, 2H), 1.23-1.35(m, 8H); HRMS(ESI)
m/z [M+H]+の計算値: C41H37IN7O7S2,930.1241; 実測値: 930.1231; HPLC Rt=10.60(96%
).
ＰＵ−ＦＩＴＣ７（化合物２０）の合成（スキーム７）。ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中の化
合物１９（１５．０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（１０．７ｍｇ、０．０２７
５ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで８時間撹拌した。反応混合物をＨ
ＰＬＣにより直接精製したところ、２３．５ｍｇ（９５％）のＰＵ−ＦＩＴＣ７が得られ
た。1HNMR(600MHz, MeOH-d4, 2 回転異性体) δ 8.18-8.22(m, 1H), 7.75-7.87(m, 4H),
7.53-7.58(m, 1H), 7.19-7.23(m, 1H),7.05(d, J=8.2Hz, 1H), 6.98(s, 0.15H), 6.95(
s, 0.85H), 6.57-6.75(m, 4H), 6.46-6.55(m,2H), 6.05(s, 0.3H), 6.00(s, 1.7H), 3.9
5-4.05(m, 2H), 3.55-3.64(m, 1.7H),2.86-2.92(m, 0.3H), 2.03-2.12(m, 1.7H), 1.93-
2.00(m, 0.3H), 1.18(d, J=6.5Hz, 0.9H),1.13(d, J=6.5Hz, 5.1H); HRMS(ESI) m/z [M+
H]+の計算値: C47H36F6N7O7S2,988.2022; 実測値: 988.2005; HPLC Rt=11.00(99%).
ＰＵ−ＦＩＴＣ８（化合物２２）の合成（スキーム８）。ＤＭＦ（０．４ｍＬ）中の化
合物１９（１９．４ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（２１．４ｍｇ、０．０５５
ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで１４時間撹拌した。反応混合物をＨ
ＰＬＣにより直接精製したところ、３４．３ｍｇ（８８％）のＰＵ−ＦＩＴＣ８が得られ
た。1HNMR(600MHz, MeOH-d4) δ 8.35(s, 1H), 7.97(s, 1H), 7.69(dd, J=8.2,1.9Hz,
1H), 7.20(dd, J=8.1, 1.9Hz, 1H),7.14-7.18(m, 2H), 6.91(d, J=8.0Hz, 1H), 6.76-6.
85(m, 4H), 6.59-6.65(m, 2H), 6.01(s, 2H),4.40(t, J=6.7Hz, 2H), 3.82(t, J=7.4Hz
, 2H), 2.35-2.43(m, 2H), 1.31(d, J=6.7Hz,6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+の計算値: C39
H34N7O7S2,776.1961; 実測値: 776.1978; HPLC Rt=10.13(98%).
ＰＵ−ＦＩＴＣ９（化合物２４）の合成（スキーム９）。ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中の化
合物２３（１０．０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（１３．９ｍｇ、０．０３６
ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで一晩撹拌した。反応混合物をＨＰＬ
Ｃにより直接精製したところ、１８．３ｍｇ（８２％）のＰＵ−ＦＩＴＣ９が得られた。
1HNMR(600MHz, MeOH-d4) δ 8.33(s, 1H), 7.92(s, 1H), 7.66(dd, J=8.1,1.8Hz, 1H),
7.15(d, J=8.2Hz, 1H), 6.73-6.83(m, 4H),6.58-6.65(m, 2H), 4.73-4.76(m, 2H), 4.2
3(t, J=6.5Hz, 2H), 3.81-3.85(m, 2H),3.74-3.81(m, 2H), 3.41(s, 3H), 2.28-2.37(m,
2H), 1.30(d, J=6.6Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z[M+H]+の計算値: C35H36N7O7S,698.2397;
実測値: 698.2399; HPLC Rt=9.20(99%).
ＤＺ１３−ＦＩＴＣ１の合成（スキーム１０）。ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＰＵ−ＤＺ
１３（２０．８ｍｇ、０．０４０６ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（１７．４ｍｇ、０．０４４７
ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで１２時間撹拌した。反応混合物をＨ
ＰＬＣにより直接精製したところ、３３．７ｍｇ（９２％）のＤＺ１３−ＦＩＴＣ１が得
られた。1HNMR(500MHz, DMF-d7) δ 9.46(s, 1H), 8.05(dd, J=7.0, 1.8Hz, 1H), 7.76-
7.82(m, 1H), 7.44(s, 1H), 7.26(d, J=7.3Hz,1H), 6.90(s, 1H), 6.78(m, 2H), 6.67-6
.72(m, 4H), 6.11(s, 2H), 4.59(t, J=6.0Hz,2H), 4.42(s, 2H), 4.39(t, J=6.0Hz, 2H)
, 3.53(d, J=6.9Hz, 2H), 2.17-2.28(m, 1H),0.92(d, J=6.7Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z [M
+H]+の計算値: C40H34FIN7O7S,902.1269; 実測値: 902.1293; HPLC Rt=11.77(98%).
ＳＮＸ−ＦＩＴＣの合成（スキーム１１）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合物２５（９
．５ｍｇ、０．０２０５ｍｍｏｌ）、ＦＩＴＣ（８．８ｍｇ、０．０２２５ｍｍｏｌ）お
よびＥｔ3Ｎ（０．１ｍＬ）を、ｒｔで４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、
残渣をＨＰＬＣにより精製したところ、１３．５ｍｇ（７７％）の橙色の固体が得られた
。RMS(ESI) m/z [M+HH]+の計算値: Ｃ44Ｈ40Ｆ3Ｎ6Ｏ7Ｓ,853.2631; 実測値 853.2630.
６．１．２．ビオチン化された化合物の合成
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン３。ＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）中の化合物１３（９．１ｍｇ、０．
０１９３ｍｍｏｌ）、Ｄ−ビオチン（７．１ｍｇ、０．０２９０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（８
ｍｇ、０．０３８６ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰを、５時間超音波処理した。反応
混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（
７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、７．５ｍｇ（５６％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオ
チン３が得られた。1H NMR(600MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ 7.97(s, 1H),7.17(s, 1H), 6.8
6(s, 1H), 5.84(s, 2H), 4.23-4.27(m, 1H),4.05-4.09(m, 1H), 4.03(t, J=7.2Hz, 2H),
3.02(t, J=6.4Hz, 2H), 2.90-2.97(m, 1H),2.67(dd, J=4.9, 12.8Hz, 1H), 2.49(d, J=
12.8Hz, 1H), 2.01(t, J=7.5Hz, 2H),1.75-1.83(m, 2H), 1.34-1.54(m, 4H), 1.18-1.27
(m, 2H); MS(ESI): m/z 697.1 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン２。ＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）中の化合物２（３０ｍｇ、０．０５
９３ｍｍｏｌ）、Ｄ−ビオチン（１９ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２４ｍｇ、
０．１１７ｍｍｏｌ）および触媒量のＤＭＡＰを、９時間超音波処理した。反応混合物を
減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、
１０：１）により精製したところ、４３．２ｍｇ（９９％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン２
が得られた。1HNMR(600MHz, CDCl3, 2 回転異性体) δ 8.22(s, 1H), 7.22(s, 0.6H), 7
.21(s, 0.4H), 6.87(s, 0.6H), 6.76(s, 0.4H),6.25(br s, 0.6H), 6.16(br s, 0.4H),
5.88-5.96(m, 2H), 5.85(br s, 0.6H), 5.78(brs, 0.4H), 4.54-4.63(m, 0.6H), 4.32-4
.45(m, 1.6H), 4.21-4.25(m, 0.4H),4.11-4.19(m, 1.4H), 4.00-4.07(m, 0.6H), 3.88-3
.95(m, 0.4H), 2.97-3.22(m, 2.4H),2.78-2.84(m, 1H), 2.69-2.77(m, 0.6H), 2.62-2.6
8(m, 1H), 2.22-2.27(m, 0.6H), 1.94-2.05(m,1.4H), 1.74-1.89(m, 1.4H), 1.43-1.72(
m, 3H), 1.16-1.40(m, 3.6H), 1.00-1.06(m,4H), 0.97(d, J=6.7Hz, 2H); MS(ESI): m/z
739.2 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン４。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１３（１６．９ｍｇ、０
．０３５９ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（１７．９
ｍｇ、０．０３９４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（９．３ｍｇ、１２．５μＬ、０．０７
１８ｍｍｏｌ）を、ｒｔで１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣
を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したとこ
ろ、２０．８ｍｇ（７２％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン４が得られた。1H NMR(500MHz, C
DCl3) δ 8.22(s, 1H), 7.52(t,J=5.6Hz, 1H), 7.36(s, 1H), 7.03(s, 1H), 6.66(t, J=
5.5Hz, 1H), 6.25(br s, 2H), 6.03(s, 2H),4.47-4.52(m, 1H), 4.28-4.33(m, 1H), 4.2
5(t, J=6.8Hz, 2H), 3.17-3.25(m, 4H),3.11-3.17(m, 1H), 2.90(dd, J=5.0, 12.9Hz, 1
H), 2.63-2.79(m, 1H), 2.24(t, J=7.4Hz, 2H),2.13-2.19(m, 2H), 1.94-2.02(m, 2H),
1.58-1.74(m, 6H), 1.48-1.56(m, 2H),1.31-1.46(m, 4H); MS(ESI): m/z 810.3 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン７。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物２（１５ｍｇ、０．０２
９２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（１４．６ｍｇ、
０．０３２１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７．５ｍｇ、１０．２μＬ、０．０５８４ｍ
ｍｏｌ）を、３５℃で６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分
取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したところ、
１０．３ｍｇ（４１％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン７が得られた。さらに、６．９ｍｇの
未反応の化合物２を回収したところ、７７％の実際の収率が得られた。1H NMR(500MHz, C
DCl3, 2 回転異性体) δ 8.26-8.29(m,1H), 7.29(s, 0.4H), 7.28(s, 0.6H), 6.87(s, 0
.4H), 6.85(s, 0.6H), 6.76(br s, 0.4H),6.74(br s, 0.6H), 6.51-6.63(br s, 2H), 5.
96-6.00(m, 2H), 5.68(br s, 0.4H), 5.58(brs, 0.6H), 4.56-4.64(m, 0.4H), 4.45-4.
52(m, 1H), 4.28-4.36(m, 1H), 4.20-4.27(m,2H), 4.01-4.09(m, 0.6H), 3.08-3.32(m,
5H), 2.86-2.94(m, 1H), 2.69-2.76(m, 1H),2.31-2.37(m, 1H), 1.96-2.22(m, 4H), 1.8
9-1.96(m, 1H), 1.30-1.80(m, 12H),1.10-1.16(m, 4H), 1.04-1.09(m, 2H); MS(ESI): m
/z 852.3 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン５。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１３（１６．６ｍｇ、０
．０３５２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（２
２．０ｍｇ、０．０３８７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（９．１ｍｇ、１２．３μＬ、０
．０７０４ｍｍｏｌ）を、ｒｔで１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られ
た残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製し
たところ、２７．８ｍｇ（８６％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン５が得られた。1H NMR(500
MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ8.12(s, 1H), 7.60(m, 1H), 7.30(s, 1H), 7.09(m, 1H), 6.98(
s, 1H), 5.97(s, 2H), 4.38-4.44(m, 1H),4.20-4.24(m, 1H), 4.17(t, J=7.1Hz, 2H), 3
.04-3.18(m, 7H), 2.83(dd, J=5.0, 12.9Hz,1H), 2.64(d, J=12.8Hz, 1H), 2.16(t, J=7
.5Hz, 2H), 2.03-2.12(m, 4H), 1.88-1.96(m,2H), 1.18-1.66(m, 18H); MS(ESI): m/z 9
23.4 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン８。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物２（１５ｍｇ、０．０２
９２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（１８．２
ｍｇ、０．０３２１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７．５ｍｇ、１０．２μＬ、０．０５
８４ｍｍｏｌ）を、３５℃で６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残
渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したと
ころ、８．２ｍｇ（２９％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン８が得られた。さらに、９．６ｍ
ｇの未反応の化合物２を回収したところ、８１％の実際の収率が得られた。1H NMR(500MH
z, CDCl3/MeOH-d4, 2 回転異性体)δ 8.18(s, 0.4H), 8.16(s, 0.6H), 7.31(s, 1H), 6.
98(s, 0.6H), 6.95(s, 0.4H), 6.80-6.90(m,2H), 5.98(s, 2H), 4.47-4.55(m, 0.4H),
4.41-4.47(m, 1H), 4.23-4.27(m, 1H),4.16-4.22(m, 2H), 3.95-4.03(m, 0.6H), 3.31-3
. 34(m, 0.6H), 3.19-3.24(m, 1.4H),3.07-3.17(m, 5H), 2.82-2.89(m, 1H), 2.64-2.70
(m, 1H), 2.25-2.32(m, 1H), 1.94-2.16(m,7H), 1.18-1.70(m, 18H), 1.09(d, J=6.7Hz,
4H), 1.03(d, J=6.8Hz, 2H); MS(ESI): m/z965.5 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン６。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１３（１７．６ｍｇ、０
．０３７４ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン（２４
．２ｍｇ、０．０４１１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（９．７ｍｇ、１３μＬ、０．０７
０４ｍｍｏｌ）を、ｒｔで１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣
を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したとこ
ろ、３１．０ｍｇ（８８％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン６が得られた。1H NMR(500MHz, C
DCl3) δ 8.29(s, 1H), 7.51(t,J=5.8Hz, 1H), 7.32(s, 1H), 7.03(t, J=5.3Hz, 1H), 6
.90(s, 1H), 6.79(s, 1H), 6.57(br s, 2H),6.01(s, 2H), 5.97(s, 1H), 4.48-4.53(m,
1H), 4.25-4.35(m, 3H), 3.79(t, J=6.1Hz,2H), 3.59-3.68(m, 12H), 3.57(t, J=5.1Hz,
2H), 3.40-3.46(m, 2H), 3.18-3.24(m, 2H),3.12-3.18(m, 1H), 2.90(dd, J=5.0, 12.8
Hz, 1H), 2.75(d, J=12.7Hz, 1H), 2.54(t,J=6.0Hz, 2H), 2.20(t, J=7.4Hz, 2H), 1.40
-2.01(m, 2H), 1.59-1.79(m, 4H),1.38-1.48(m, 2H); MS(ESI): m/z 944.4 [M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン９。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物２（１５ｍｇ、０．０２
９２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン（１８．９ｍ
ｇ、０．０３２１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７．５ｍｇ、１０．２μＬ、０．０５８
４ｍｍｏｌ）を、３５℃で６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣
を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製したとこ
ろ、９．３ｍｇ（３２％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチン９が得られた。さらに、９．０ｍｇ
の未反応の化合物２を回収したところ、８１％の実際の収率が得られた。1H NMR(500MHz,
CDCl3/MeOH-d4, 2 回転異性体)δ 8.18(s, 0.4H), 8.16(s, 0.6H), 7.30-7.32(m, 1H),
6.98(s, 0.6H), 6.96(s, 0.4H), 5.98(s, 2H),4.49-4.56(m, 0.4H), 4.39-4.46(m, 1H)
, 4.22-4.27(m, 1H), 4.15-4.21(m, 2H),3.99-4.07(m, 0.6H), 3.66-3.71(m, 2H), 3.51
-3.61(m, 12H), 3.45-3.50(m, 2H),3.29-3.38(m, 2H), 3.16-3.25(m, 2H), 3.07-3.12(m
, 1H), 2.81-2.88(m, 1H), 2.63-2.68(m, 1H),2.57-2.63(m, 1.2H), 2.41-2.47(m, 0.8H
), 1.98-2.18(m, 4H), 1.52-1.70(m, 4H),1.32-1.41(m, 2H), 1.08(d, J=6.7Hz, 4H), 1
.02(d, J=6.8Hz, 2H); MS(ESI): m/z 986.5[M+H]+.
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の化合物６（４．２ｍｇ、０．００
８６ｍｍｏｌ）およびＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチン（５．４
ｍｇ、０．０１２９ｍｍｏｌ）を、ｒｔで２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣
をクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、５：１）にかけたとこ
ろ、１．１ｍｇ（１６％）のＰＵ−Ｈ７１−ビオチンが得られた。1H NMR(CDCl3) δ 8.3
0(s, 1H), 8.10(s, 1H), 7.31(s, 1H), 6.87(s,1H), 6.73(br s, 1H), 6.36(br s, 1H),
6.16(br s, 2H), 6.00(s, 2H), 4.52(m, 1H),4.28-4.37(m, 3H), 3.58-3.77(m, 10H),
3.55(m, 2H), 3.43(m, 2H), 3.16(m, 1H),2.92(m, 1H), 2.80(m, 2H), 2.72(m, 1H), 2.
66(m, 2H), 2.17(t, J=7.0Hz, 2H), 2.04(m,2H), 1.35-1.80(m, 6H); MS(ESI): m/z 87
2.2 [M+H]+/
６．１．３．ＡＮＣＡ標識された化合物の合成
Ｎ−（３−（６−アミノ−８−（（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−
５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピル）２−シアノアセタミド（化合物
２６）の合成（スキーム１７）。ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍＬ）中の化合物１３1（１２０．３ｍ
ｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）に、シアノ酢酸（２６ｍｇ、０．３０７ｍｍｏｌ）およびＤＣ
Ｃ（６３ｍｇ、０．３０７ｍｍｏｌ）を添加し、ｒｔで５時間撹拌した。反応混合物を濃
縮し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１００：１〜５０
：１）により精製したところ、１３１ｍｇ（９５％）の化合物２６が得られた。1H NMR(6
00MHz, CDCl3/MeOH-d4):δ 8.25(s, 1H), 7.40(s, 1H), 7.08(s, 1H), 6.07(s, 2H), 4.
27(t, J=5.9Hz, 2H), 3.57(s, 2H), 3.27(t,J=5.1Hz, 2H), 1.98-2.06(m, 2H); MS(m/z
): [M+H]+ 538.0.
ＰＵ−ＡＮＣＡ（化合物２８）の合成（スキーム１７）。ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物
３２６（４４ｍｇ、０．０８２５ｍｍｏｌ）に、化合物２７（１９ｍｇ、０．０７５ｍｍ
ｏｌ）およびピペリジン（１０μＬ）を添加し、７０℃で２４時間加熱した。反応混合物
を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１２．５：１）により
精製したところ、橙色の固体として２４．３ｍｇ（４２％）の化合物２８が得られた。1H
NMR(600MHz, DMF-d7): δ 8.73(t,J=5.8Hz, 1H), 8.38(d, J=1.1Hz, 1H), 8.36(s, 1H)
, 8.29(s, 1H), 8.18(dd, J=8.8, 1.7Hz, 1H),7.95(d, J=9.2Hz, 1H), 7.92(d, J=8.8Hz
, 1H), 7.56(dd, J=9.2, 2.5Hz, 1H), 7.52(brs, 2H), 7.49(s, 1H), 7.34(d, J=2.2Hz,
1H), 6.95(s, 1H), 6.16(s, 2H), 4.40(t,J=6.9Hz, 2H), 3.44-3.47(m, 4H), 3.38-3.4
3(m, 2H), 2.53-2.58(m, 4H), 2.30(s, 3H),2.09-2.15(m, 2H); 13C NMR(150MHz, DMF-d
7): δ161.5, 156.0, 153.5, 151.7, 151.5, 151.2, 149.5, 148.8, 144.4, 137.2, 133
.6, 130.3, 129.2, 127.4, 127.0, 126.5,125.2, 120.1, 119.3, 118.9, 117.4, 111.0,
108.5, 103.0, 102.9, 89.4, 54.9, 47.9,45.6, 41.3, 40.5, 37.2; HRMS(ESI) m/z [M
+H]+の計算値: C34H33IN9O3S,774.1472; 実測値: 774.1473.
６．１．４．放射標識された化合物の合成
ＰＵ−Ｈ７１、ＰＵ−ＨＺ１５１およびＰＵ−ＤＺ１３の親化合物を、放射性ヨウ素化
にとって好適なものとして合成した（すなわち、Ｓｎ−前駆体）。放射性ヨウ素化のため
に、合成はスキーム１９に示される反応に従う。簡単に述べると、ＰＵ−化合物をメタノ
ール中で溶媒和し（２５μｇのＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−ＨＺ１５１；１５μｇのＰＵ−
ＤＺ１３）、ＮａＩ（５〜１０μＬ）に添加し（画像化については［124Ｉ］アイソトー
プ、生体内分布については［131Ｉ］）、次いで、酸性媒体中でクロラミンＴ（ＣＴ、１
０μＬ、１０分）で酸化した（酢酸中の２ｍｇ／ｍＬ）。ホット（放射性標識された）化
合物をアミン保護基ＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）を用いて合成し、これ
をそれぞれの化合物について酸性条件下（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（
ＨＣｌ））で除去し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。ＰＵ
−ＤＺ１３およびＰＵ−ＨＺ１５１前駆体を、１５μＬのメタノール（ＭｅＯＨ）を溶媒
和まで用いて放射標識し、放射標識の添加後、ＣＴ中、室温（ＲＴ）で１０分インキュベ
ートした後、５０μＬのＴＦＡを添加し、７０℃で１時間インキュベートした。ＰＵ−Ｈ
７１前駆体を、放射標識の添加の直後、２０μＬのＭｅＯＨおよび１５μＬのＣＴで放射
標識した後、溶液を５０℃で５分加熱し、次いで、２分冷却させた。その後、１０μＬの
メチオニンメチルエステル（Ｈ2Ｏ中の０．５ｇ／ｍＬから調剤）および１０μＬの濃Ｈ
Ｃｌを添加した後、５０℃（１時間）でインキュベートした。放射標識された生成物を採
取し、回転式蒸発装置を用いて減圧下で溶媒を除去した。［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１の比
活性は約１０００ｍＣｉ／μｍｏｌであり、これはこのクラスの［124Ｉ］化合物に関す
る本発明者らの以前の経験と一致していた。ｉｎ ｖｉｖｏでの投与については、［124
Ｉ］−ＰＵ−化合物を、滅菌した０．９％塩溶液中で調剤した。
６．２．がん細胞におけるＨＳＰ９０の役割の評価
本節に記載される方法は、５．１．節の開示と関連する。
細胞系および一次細胞：ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２、Ｋａｓｕｍｉ−４、ＭＥＧ−０１およ
びＫＵ１８２、三重陰性乳がん細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＥＲ２＋乳がん細胞系Ｓ
ＫＢｒ３、メラノーマ細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、前立腺がん細胞系ＬＮＣａＰおよびＤ
Ｕ１４５、膵臓がん細胞系Ｍｉａ−ＰａＣａ−２、結腸線維芽細胞、ＣＣＣＤ１８Ｃｏ細
胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得
した。ＣＭＬ細胞系ＫＣＬ−２２を、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓから取得した。ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞
を、以前に記載のようにトランスフェクトした65。細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グル
タミン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＭＤＡ
−ＭＢ−４６８、ＳＫＢｒ３およびＭｉａ−ＰａＣａ−２）、ＲＰＭＩ（Ｋ５６２、ＳＫ
−Ｍｅｌ−２８、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＮＩＨ−３Ｔ３）またはＭＥＭ（ＣＣＤ
１８Ｃｏ）中で培養した。Ｋａｓｕｍｉ−４細胞を、２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添
加したＩＭＤＭ中で維持した。ＰＢＬ（ヒト末梢血白血球）（ｎ＝３）および臍帯血（ｎ
＝５）を、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから購入した患者の血液から取
得した。３５ｍｌの細胞懸濁液を、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で溶解した。試料を４℃で４０分、２，０００ｒｐｍで遠
心分離し、白血球界面を採取した。細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に播種し、
示されたように用いた。一次ヒト慢性期および急性転化期ＣＭＬおよびＡＭＬ細胞を、イ
ンフォームドコンセントと共に取得した。標本の操作および分析は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌ
ｌｅｇｅおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓにより認可された。単核細胞を、Ｆｉｃｏ
ｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｙ）密度勾配分離を用いて単離した。細胞を、Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地
（ＩＭＤＭ）、４０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１０％ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）からなる凍結培地中またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ−１０（Ｂｉｏｌｉｆ
ｅ）中で凍結保存した。培養した場合、細胞を３７℃で５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で保持
した。
化学および免疫沈降のための細胞溶解：１μｇ／μＬのプロテアーゼ阻害剤（ロイペプ
チンおよびアプロチニン）を添加したＦｅｌｔｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ
、ＫＣｌ ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ、ＮＰ４０ ０．０１％、新鮮に調製されたＮ
ａ2ＭｏＯ4 ２０ｍＭ、ｐＨ７．２〜７．３）中に細胞を採取した後、３回の連続的凍結
（ドライアイス中）および解凍ステップを行うことにより、細胞を溶解した。総タンパク
質濃度を、製造業者の説明書に従ってＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。
免疫沈降：Ｈｓｐ９０抗体（Ｈ９０１０）または正常ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、１０μＬの容量で示された量の細胞溶解物に４０μＬ
のタンパク質Ｇアガロースビーズ（Ｕｐｓｔａｔｅ）と共に添加し、混合物を４℃で一晩
インキュベートした。ビーズをＦｅｌｔｓ溶解バッファーで５回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分離した後、標準的なウェスタンブロッティング手順を行った。
化学沈降：ＨＳＰ９０阻害剤ビーズまたはアガロースビーズにコンジュゲートさせたＨ
ＳＰ９０不活性化合物（エタノールアミン）を含有する対照ビーズを、溶解バッファー中
で３回洗浄した。別途指摘しない限り、その後ビーズコンジュゲート（８０μＬ）を示さ
れた量の細胞溶解物（１２０〜５００μｇ）と共に４℃でインキュベートし、溶解バッフ
ァーで容量を２００μＬに調整した。インキュベーション後、ビーズコンジュゲートを溶
解バッファーで５回洗浄し、プルダウン中のタンパク質をウェスタンブロットにより分析
した。枯渇試験のために、２〜４回の連続的化学沈降を実施した後、示された場合、免疫
沈降ステップを行った。
試薬：ＨＳＰ９０阻害剤、固相固定誘導体およびフルオレセイン標識誘導体を、以前に
報告されたように合成した75〜77。本発明者らは、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
Ｇｌｅｅｖｅｃを、ＳｅｌｌｅｃｋからＡＳ７０３０２６を、ＴｏｃｒｉｓからＫＮ−９
３を、ならびにＳｉｇｍａからＰＰ２４２、ＢＭＳ−３４５５４１およびバナジウム酸ナ
トリウムを購入した。全ての化合物をＤＭＳＯ保存物として用いた。
ウェスタンブロッティング：細胞をＰＵ−Ｈ７１またはＤＭＳＯ（ビヒクル）で２４時
間処理し、ロイペプチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびアプロチニン（Ｓｉｇｍ
ａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌおよび１％ＮＰ４０溶解バッファー中で溶解した。タンパク質濃度をＢＣＡキット（Ｐ
ｉｅｒｃｅ）を用いて製造業者の説明書に従って決定した。タンパク質溶解物（１５〜２
００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動分解し、ニトロセルロース膜に移し、ＨＳ
Ｐ９０（１：２０００、ＳＭＣ−１０７Ａ／Ｂ；ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ）、Ｂｃｒ−Ａｂ
ｌ（１：７５、５５４１４８；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ３Ｋ（１：１０００
、０６−１９５；Ｕｐｓｔａｔｅ）、ｍＴＯＲ（１：２００、Ｓｃ−１５４９；Ｓａｎｔ
ａ Ｃｒｕｚ）、ｐ−ｍＴＯＲ（１：１０００、２９７１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ
ｇ）、ＳＴＡＴ３（１：１０００、９１３２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−Ｓ
ＴＡＴ３（１：２０００、９１４５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＳＴＡＴ５（１
：５００、Ｓｃ−８３５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐ−ＳＴＡＴ５（１：１０００、９
３５１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＲＩＣＴＯＲ（１：２０００、ＮＢ１００−
６１１；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＲＡＰＴＯＲ（１：１０００、２２８
０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐ９０ＲＳＫ（１：１０００、９３４７；Ｃｅｌ
ｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｒａｆ−１（１：３００、Ｓｃ−１３３；Ｓａｎｔａ Ｃｒ
ｕｚ）、ＣＡＲＭ１（１：１０００、０９−８１８；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＲＫＬ（
１：２００、Ｓｃ−３１９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＧＲＢ２（１：１０００、３９７
２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＦＡＫ（１：１０００、Ｓｃ−１６８８；Ｓａｎ
ｔａ Ｃｒｕｚ）、ＢＴＫ（１：１０００、３５３３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）
、Ａ−Ｒａｆ（１：１０００、４４３２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＲＫＤ２
（１：２００、ｓｃ−１００４１５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＨＣＫ（１：５００、０
６−８３３；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）、ｐ−ＨＣＫ（１：５００、ａｂ５２２０３；Ａｂｃａ
ｍ）およびβ−アクチン（１：２０００、Ａ１９７８；Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体を
用いてプロービングした。次いで、膜を１：３０００倍希釈の対応する西洋ワサビペルオ
キシダーゼコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。ＥＣＬ−Ｅｎｈａｎｃｅ
ｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて製造業者の説明書に従って検出を実施し
た。
密度測定：ゲルをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ７．０．１中でスキャンし、Ｕｎ−
Ｓｃａｎ−Ｉｔ５．１ソフトウェア（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量的
密度測定分析を実施した。
放射性アイソトープ結合試験およびＨＳＰ９０定量試験：飽和試験を、131Ｉ−ＰＵ−
Ｈ７１および細胞（Ｋ５６２、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢｒ３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−
１４５、ＭＲＣ−５およびＰＢＬ）を用いて実施した。簡単に述べると、３つの細胞試料
を、１μＭの非標識ＰＵ−Ｈ７１を含むか、または含まない増加量の131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７
１と混合した。溶液をオービタルシェーカー中で振とうし、１時間後、Ｂｒａｎｄｅｌ細
胞収穫装置を用いて細胞を単離し、氷冷Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄した。全ての単離
された細胞試料を計数し、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の特異的取込みを決定した。これらのデ
ータを131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の濃度に対してプロットして、飽和結合曲線を得た。ＰＵに
結合したＨＳＰ９０の定量のために、９．２ｘ１０7個のＫ５６２細胞、６．５５ｘ１０7
個のＫＣＬ−２２細胞、２．５５ｘ１０7個のＫＵ１８２細胞および７．８ｘ１０7個のＭ
ＥＧ−０１細胞を溶解して、それぞれ、６３８２、３２２５、１３４９および３４１４μ
ｇの総タンパク質を得た。ＨＳＰ９０の割合を算出するために、ＨｅＬａ細胞（Ｓｔｒｅ
ｓｓｇｅｎ＃ＡＤＩ−ＳＰＰ−７７０）から精製された組換えＨＳＰ９０から作製した標
準曲線を用いることにより、細胞性ＨＳＰ９０発現を定量した。
パルス−チェイス。Ｋ５６２細胞を、示されたように、ＰＵ−Ｈ７１（５μＭ）を含む
か、または含まないＮａ3ＶＯ4（１ｍＭ）で処理した。細胞を、示された時間で採取し、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ＮＰ−４０溶解バッ
ファー中で溶解した後、ウェスタンブロッティング手順にかけた。
トリプシン消化：Ｋ５６２細胞を、ビヒクルまたはＰＵ−Ｈ７１（５０μＭ）で３０分
処理した。細胞を採取し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよ
び１％ＮＰ−４０溶解バッファー中で溶解した。ＳＴＡＴ５タンパク質を、抗ＳＴＡＴ５
抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−８３５）を用いて５００μｇの総タンパク質溶解物
から免疫沈降させた。タンパク質Ｇアガロースビーズに結合したタンパク質沈降物をトリ
プシンバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＣａＣｌ2）で洗浄し
、３３ｎｇのトリプシンを各試料に添加した。試料を３７℃でインキュベートし、示され
た時点でアリコートを採取した。タンパク質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＳＴ
ＡＴ５についてブロットした。
活性化ＳＴＡＴ５ ＤＮＡ結合アッセイ：ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂのＤＮＡ結
合能力を、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（ＴｒａｎｓＡＭ、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、
Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により、製造業者の説明書に従ってアッセイした。簡単に述べ
ると、５ｘ１０6個のＫ５６２細胞を、ＰＵ−Ｈ７１ １および１０μＭまたは対照で２
４時間処理した。１０マイクログラムの細胞溶解物を、予め吸着させたＳＴＡＴコンセン
サスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ−３’）を含有するウェルに添加し
た。対照処理された細胞のために、野生型または突然変異型ＳＴＡＴコンセンサス結合部
位を含む２０ｐｍｏｌの競合オリゴヌクレオチドの非存在下または存在下でアッセイを実
施した。インターフェロンで処理されたＨｅＬａ細胞（５μｇ／ウェル）を、アッセイの
ための陽性対照として用いた。インキュベーションおよび洗浄の後、ウサギポリクローナ
ル抗ＳＴＡＴ５ａまたは抗ＳＴＡＴ５ｂ抗体（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ
）を各ウェルに添加した後、ＨＰＲ−抗ウサギ二次抗体（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ
Ｍｏｔｉｆ）を添加した。ＨＲＰ基質の添加後、６５５ｎｍの参照波長を用いて吸光度を
４５０ｎｍで読み取った（Ｓｙｎｅｒｇｙ４、Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）
。このアッセイにおいては、吸光度は試料中に存在するＤＮＡ結合転写因子の量に正比例
する。実験を４回繰り返して実行した。結果を、ＳＥＭと共に平均吸光度値から任意単位
（ＡＵ）として表した。
定量的クロマチン免疫沈降（Ｑ−ＣｈＩＰ）：Ｑ−ＣｈＩＰを、以前に記載のものに改
変を加えて行った83。簡単に述べると、１０8個のＫ５６２細胞を１％ホルムアルデヒド
で固定し、溶解し、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｂｒａｎｓｏｎ
）を行った。ＳＴＡＴ５ Ｎ２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびＨＳＰ９０（Ｚｙｍｅ
ｄ）抗体を、予め透明化した試料に添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、タ
ンパク質ＡまたはＧビーズを添加し、試料をビーズから溶出させた後、脱架橋させた。Ｐ
ＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製した。ＣｈＩＰ生成物の定量を、
Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる定
量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ）により実施した。
ＳＴＡＴ結合部位を含有する標的遺伝子を、以下のプライマー：ＣＣＮＤ２（５−ＧＴＴ
ＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＴＴＴＡＡＴＣＧおよび５−ＡＣＣＴＣＧＣＡＴＡＣＣＣＡＧＡ
ＧＡ）、ＭＹＣ（５−ＡＴＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴおよび５−ＣＡＧＡＧ
ＣＧＴＧＧＧＡＴＧＴＴＡＧＴＧ）を用いて、遺伝子間制御領域については（５−ＣＣＡ
ＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧおよび５−ＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＴ
ＣＣ）を用いて検出した。
リアルタイムＱＰＣＲ：ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造
業者の説明書に従って、ＰＵ−Ｈ７１処理された、および対照のＫ５６２細胞からＲＮＡ
を抽出した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。本発明者らは、以下のプ
ライマー：ＭＹＣ（５−ＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣおよび５−ＣＣＴＴ
ＴＡＡＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣ）、ＣＣＮＤ２（５−ＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡ
ＡＧＡＴＣＡおよび５−ＡＣＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴ）、ＢＣＬ−ＸＬ（
５−ＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡおよび５−ＣＡＧＣＧＧＴＴＧ
ＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴ）、ＭＣＬ１（５−ＡＧＡＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＧおよ
び５−ＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣ）、ＣＣＮＤ１（５−ＣＣＴＧＴＣＣ
ＴＡＣＴＡＣＣＧＣＣＴＣＡおよび５−ＧＧＣＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧ）、ＨＰ
ＲＴ（５−ＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＧおよび５−ＧＣＡＣＡＣＡＧＡ
ＧＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＧ）、ＧＡＰＤＨ（５−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣ
ＴＣＡおよび５−ＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴ）、ＲＰＬ１３Ａ（５−Ｔ
ＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧおよび５−ＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡ
ＣＡＡＧＡ）を用いて特定の遺伝子を増幅した。転写物の存在量を、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ条件（９５℃で２０ｓｅｃの初期ステップ、９５℃で１ｓｅｃの４０サイク
ルおよび６０℃で２０ｓｅｃ）を用いて検出した。ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ１３
Ａ）のＣT値を、対象の対応遺伝子から差し引いた（ΔＣT）。差異の標準偏差を、ＣT値
の標準偏差から算出した（反復）。次いで、ＰＵ−Ｈ７１処理された細胞のΔＣT値を、
ΔΔＣT法を用いてその対応する対照処理された細胞と比較して表した。対照処理された
細胞と比較した薬剤で処理された細胞における各遺伝子の発現倍数を、式：２-ΔΔCTに
より決定する。結果を、反復物に関する平均の標準誤差と共に発現倍数として表した。
ＨＳＰ７０ノックダウン。エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ）およびＮｕｃｌｅｏ
ｆａｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Ａｍａｘａ）により、製造業者の説明書に従って
トランスフェクションを実行した。ＨＳＰ７０ノックダウン試験を、ＨＳＰ７０のオープ
ンリーディングフレーム（ＨＳＰＡ１Ａ；受託番号ＮＭ＿００５３４５）に対して以前に
報告されたように84設計されたｓｉＲＮＡを用いて実施した。陰性対照細胞を、逆転対照
ｓｉＲＮＡ配列（ＨＳＰ７０Ｃ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＲＮＡ技術）を用いてトランスフ
ェクトした。試験のために用いたＨＳＰ７０に対する活性配列は、ＨＳＰ７０Ａ（５’−
ＧＧＡＣＧＡＧＵＵＵＧＡＧＣＡＣＡＡＧ−３’）およびＨＳＰ７０Ｂ（５’−ＣＣＡＡ
ＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＵＣＵＵ−３’）である。対照の配列は、ＨＳＰ７０Ｃ（５’−
ＧＧＡＣＧＡＧＵＵＧＵＡＧＣＡＣＡＡＧ−３’）である。２ｍＬの培地（１％Ｌ−グル
タミン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ）中の３００万個
の細胞を、０．５μＭのｓｉＲＮＡを用いて製造業者の説明書に従ってトランスフェクト
した。トランスフェクト細胞を６穴プレート中で維持し、８４時間で溶解し、標準的なウ
ェスタンブロット手順を行った。
キナーゼスクリーン85（図４４）。多くのアッセイについて、キナーゼタグ付Ｔ７ファ
ージ株を、ＢＬ２１株に由来する大腸菌宿主中、２４穴ブロック中で同時に増殖させた。
大腸菌を対数期まで増殖させ、凍結保存物からＴ７ファージに感染させ（感染多重度＝０
．４）、溶解まで３２℃で振とうしながらインキュベートした（９０〜１５０分）。溶解
物を遠心分離し（６，０００ｘｇ）、濾過し（０．２μｍ）、細胞破片を除去した。残り
のキナーゼをＨＥＫ−２９３細胞中で生成させた後、ｑＰＣＲ検出のためにＤＮＡでタグ
付けした。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを、室温で３０分間、ビオチン化小分子リ
ガンドで処理して、キナーゼアッセイのための親和性樹脂を作製した。リガンド付ビーズ
を過剰のビオチンで遮断し、ブロッキングバッファー（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ
）、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄して、未結合のリ
ガンドを除去し、非特異的ファージ結合を減少させた。１ｘ結合バッファー（２０％Ｓｅ
ａＢｌｏｃｋ、０．１７ｘＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ ＤＴＴ）中でキ
ナーゼ、リガンド付親和性ビーズ、および試験化合物を混合することにより、結合反応物
を作った。試験化合物を、１００％ＤＭＳＯ中の４０ｘ保存液として調製し、アッセイ中
に直接希釈した。全ての反応物を、０．０４ｍｌの最終容量でポリプロピレン３８４穴プ
レート中で実施した。アッセイプレートを振とうしながら１時間、室温でインキュベート
し、親和性ビーズを洗浄バッファー（１ｘＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し
た。次いで、ビーズを溶出バッファー（１ｘＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５
μｍの非ビオチン化親和性リガンド）中に再懸濁し、浸透しながら３０分間、室温でイン
キュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度を、ｑＰＣＲにより測定した。ＫＩＮＯＭＥｓ
ｃａｎの選択性スコア（Ｓ）は、化合物選択性の定量的尺度である。それは、化合物に結
合するキナーゼの数を、突然変異体を除く試験した異なるキナーゼの総数で除算すること
により算出される。ＴＲＥＥｓｐｏｔ（商標）は、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ85により開発さ
れた商標で守られたデータ可視化ソフトウェアである。結合することがわかったキナーゼ
を図４４において丸で印を付け、ここで大きい方の丸はより高い親和性結合を示す。キナ
ーゼデンドログラムを適合させ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．からの許諾を以て再現する。
レンチウイルスベクター、レンチウイルス生成およびＫ５６２細胞の形質導入。ＣＡＲ
Ｍ１のｓｈＲＮＡノックダウンのレンチウイルス構築物を、Ｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
のＴＲＣレンチウイルスｓｈＲＮＡライブラリーから購入した：ｐＬＫＯ．１−ｓｈＣＡ
ＲＭ１−ＫＤ１（カタログ番号：ＲＨＳ３９７９−９５７６１０７）およびｐＬＫＯ．１
−ｓｈＣＡＲＭ１−ＫＤ２（カタログ番号：ＲＨＳ３９７９−９５７６１０８）。対照ｓ
ｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡスクランブル）は、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１８６４であった。
ＧＦＰをクローニングして、選択マーカーとしてピューロマイシンと置きかえた。レンチ
ウイルスを、以前に記載されたプロトコル86のように２９３Ｔの一過的トランスフェクシ
ョンにより生成させた。ウイルス上清を採取し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し
、濃縮した。Ｋ５６２細胞を、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で
高力価レンチウイルス濃縮懸濁液に感染させた。形質導入されたＫ５６２細胞を、トラン
スフェクションの７２時間後に緑色蛍光（ＧＦＰ）について選別した。
ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。ｑＲＴ−ＰＣＲのた
めに、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０6個の細
胞から総ＲＮＡを単離した後、ランダムヘキサマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩキッ
ト、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる逆転写にかけた。ＡＢＩ７５００配列検出システム
を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ Ｉ化学またはＴ
ａｑＭａｎ法（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）
を用いて、ＰＣＲ産物を検出した。リアルタイムＰＣＲアッセイに関する詳細は、他の場
所に記載されている87。ＣＡＲＭ１ ｑＰＣＲのためのプライマー配列は、ＴＧＡＴＧＧ
ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧ（フォワード）およびＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＡ
ＣＣＡＧ（リバース）である。
細胞生存、アポトーシス、および増殖アッセイ。ＣＡＲＭ１ ｓｈＲＮＡまたはスクラ
ンブルでトランスフェクトされていないか、またはトランスフェクトされたＫ５６２細胞
における生存評価を、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅを用いて実施した。この発色団は負に荷電
しており、膜が損傷していない限り細胞と相互作用しない。したがって、この染料を含ま
ない細胞は全て、生存している。２μＬのアクリジンオレンジ（１００μｇ／ｍＬ）、２
μＬのエチジウムブロマイド（１００μｇ／ｍＬ）、および２０μＬの細胞懸濁液を混合
することにより、蛍光顕微鏡を用いてアポトーシス分析を評価した。少なくとも５つの無
作為の視野で最少で２００個の細胞が計数された。特有の核および細胞質での蛍光に基づ
いて細胞形態の変化を検査することにより、死んだアポトーシス細胞、壊死細胞および正
常細胞から生きているアポトーシス細胞を識別した。生細胞は無傷の形質膜（緑色）を示
すが、死んだ細胞は損傷した形質膜（オレンジ色）を示す。収縮、ヘテロクロマチン凝縮
、および核脱顆粒などの超微形態的変化の出現は、アポトーシスおよび壊死を含む破壊さ
れた細胞膜とより一致する。アポトーシス細胞の割合（アポトーシス指数）を、アポトー
シス細胞（％）＝（アポトーシス核を有する細胞の総数／計数した細胞の総数）ｘ１００
として算出した。増殖アッセイのために、５ｘ１０3個のＫ５６２細胞を、９６穴黒色プ
レート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。アッセイを製造業者の説明書（ＣｅｌｌＴｉｔ
ｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、
Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実施した。全ての実験を３回繰り返した。示された場合、Ａｌ
ａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイを用いて増殖阻害試験を実施した。この試薬は、細胞培養物
中での細胞生存能力の迅速で客観的な尺度を提供し、それは細胞の代謝能力を測定するた
めの指示染料レサズリンを使用し、細胞生存能力の指示薬である。簡単に述べると、指数
増殖期の細胞をマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６０３）中に播種し、３
７℃で示された時間インキュベートした。薬剤を示された濃度で３回添加し、プレートを
７２時間インキュベートした。レサズリン（５５μＭ）を添加し、ＡｎａｌｙｓｔＧＴ（
蛍光強度モード、励起５３０ｎｍ、放出５８０ｎｍ、ダイクロイックミラー５６０ｎｍ）
を用いて６時間後にプレートを読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ ＰｒｏおよびＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結果を分析した。処理された細胞と対照細胞から
得られた蛍光読み取り値を比較することにより、細胞増殖阻害率を算出した。細胞増殖を
５０％阻害する薬剤濃度としてＩＣ50を算出した。
ｍＴＯＲとＨＳＰ９０阻害剤との相乗作用の定量的分析：ｐｐ２４２（ｍＴＯＲ阻害剤
）とＰＵ−Ｈ７１（ＨＳＰ９０阻害剤）との薬剤相互作用を決定するために、Ｃｈｏｕ−
Ｔａｌａｌａｙの組合せ指数（ＣＩ）アイソボログラム法を、以前に記載のように用いた
88、89。この方法は、質量作用の法則の中央効果原理に基づくものであり、コンピュータ
シミュレーションにより、それぞれの薬剤の機構とは無関係に、２つ以上の薬剤の相乗作
用または拮抗作用を定量するものである。アルゴリズムに基づいて、コンピュータソフト
ウェアは、中央効果プロット、組合せ指数プロットおよび正規化アイソボログラムを示す
（非一定的な比率の組合せの２つの薬剤を用いる場合）。ＰＵ−Ｈ７１（０．５、０．２
５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１２５μＭ）およびｐｐ２４２
（０．５、０．１２５、０．０３１２５、０．０００８、０．００２、０．００１μＭ）
を、記載の濃度の単一の薬剤として、または非一定的比率で組み合わせて用いた（ＰＵ−
Ｈ７１：ｐｐ２４２；１：１、１：２、１：４、１：７．８、１：１５．６、１：１２．
５）。Ｆａ（殺傷された細胞の画分）を、式Ｆａ＝１−Ｆｕを用いて算出した；Ｆｕは、
影響されていない細胞の画分であり、コンピュータソフトウェア（ＣｏｍｐｕＳｙｎ、Ｐ
ａｒａｍｕｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を用いて用量効果分析のために用いた。
６．３．細胞アッセイにおける蛍光標識されたプローブ
６．３．１．蛍光−ＰＵ−Ｈ７１結合のフローサイトメトリー分析
ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞系ＭＯＬＭ−１３およびＭＶ４−１１細胞は、Ｄ
ｒ．Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄ．Ｎｉｍｅｒ，ＭＳＫＣＣからの贈り物であり、１０％ウシ胎仔
血清（ＦＢＳ）および１ｘＰｅｎ／Ｓｔｅｒｐを添加したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃で
５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で維持した。細胞を５ｘ１０5個の細胞／ｍＬの密度で６穴プレ
ート中に播種し、３７℃で４時間、示された誘導体（１μＭ）で処理した。生細胞中での
ＨＳＰ９０結合の検出のために、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ
）で２回洗浄し、分析の前に、室温でＦＡＣＳバッファー中、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＰＵ−Ｈ７１−蛍光誘導体結合を表す生細胞に由来
する蛍光強度（ＤＡＰＩ陰性）をフローサイトメトリー（ＬＳＲ−ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）により捕捉し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓ
ｈｌａｎｄ、ＯＲ）により分析した。固定された細胞中でのＨＳＰ９０結合の評価のため
に、細胞を洗浄し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘバッファー（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、
Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて３０分固定した後、ＢＤ ＰｅｒｍバッファーＩＩＩ
（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて氷上で３０分透過
処理した。完全な細胞透過処理を、ＤＡＰＩを用いて決定した。細胞を上記のようにフロ
ーサイトメトリーにより分析した。競合試験のために、２ｘ１０6細胞／ｍｌの密度の一
次ＡＭＬ試料を、１μＭの非コンジュゲート化ＰＵ−Ｈ７１で４時間処理した後、１μＭ
のＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２で１時間処理した。細胞を採取し、２回洗浄し、ＣＤ４５に
ついて染色して、４℃で３０分インキュベートされた正常リンパ球から芽球を識別し、洗
浄し、ＦＡＣＳバッファー中の７−ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析し
た。
６．３．２．フローサイトメトリー、ＣＤ３４単離
ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔおよび自動化磁気細胞選別装置ａｕｔｏＭＡＣ
Ｓを用いて、製造業者の説明書に従って（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕ
ｒｎ、ＣＡ）、ＣＤ３４＋細胞単離を実施した。生存能力アッセイ−ＣＭＬ細胞系を、５
ｘ１０5細胞／ｍｌの密度で４８穴プレート中に播種し、示された用量のＰＵ−Ｈ７１で
処理した。細胞を２４時間毎に採取し、アネキシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）およびアネキシンＶバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．１４
Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）中の７−ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染
色した。細胞生存能力を、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によ
り分析した。患者試料について、一次急性転化期ＣＭＬ細胞を、２ｘ１０6細胞／ｍｌで
４８穴プレート中に播種し、示された用量のＰＵ−Ｈ７１で最大９６時間処理した。細胞
をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）中、４℃で３０分、ＣＤ３４−ＡＰ
Ｃ、ＣＤ３９−ＰＥ−ＣＹ７およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）で染色した後、アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色を行った。ＰＵ−Ｈ７１結合ア
ッセイ−ＣＭＬ細胞系を、５ｘ１０5細胞／ｍｌの密度で４８穴プレート中に播種し、１
μＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣで処理した。処理後４時間で、細胞をＦＡＣＳバッファー
で２回洗浄した。生細胞中でのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合を測定するために、細胞を室
温で１０分、ＦＡＣＳバッファー中の７−ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ処理後４８時間お
よび９６時間で、細胞をアネキシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およ
びアネキシンＶバッファー中の７−ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにかけて、ア
ネキシンＶ／７ＡＡＤ二重陰性ゲートにより決定された生存能力を測定した。白血病患者
試料へのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣの結合を評価するために、一次ｂｐまたはｃｐＣＭＬ細
胞を２ｘ１０6細胞／ｍｌで４８穴プレート中に播種し、１μＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴ
Ｃで処理した。処理後２４時間で、細胞を２回洗浄し、４℃で３０分、ＦＡＣＳバッファ
ー中のＣＤ３４−ＡＰＣ（またはＣＤ３４−ＰＥＣｙ７）、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７（ま
たはＣＤ３８−ＰＥ）およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体で染色した後、７−ＡＡＤ染色
した。処理後４８時間および９６時間で、細胞をＣＤ３４−ＡＰＣ（またはＣＤ３４−Ｐ
ＥＣｙ７）、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７（またはＣＤ３８−ＰＥ）およびＣＤ４５−ＡＰＣ
−Ｈ７抗体で染色した後、アネキシンＶ−Ｖ４５０および７−ＡＡＤ染色を行って、芽球
、リンパ球およびＣＤ３４＋細胞集団中の細胞生存能力を測定した。競合試験のために、
５ｘ１０5細胞／ｍｌの密度のＣＭＬ細胞系または２ｘ１０6細胞／ｍｌの密度の一次ＣＭ
Ｌ試料を、１μＭの非コンジュゲート化ＰＵ−Ｈ７１で４時間処理した後、１μＭのＰＵ
−Ｈ７１−ＦＩＴＣで１時間処理した。細胞を採取し、２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー
中の７−ＡＡＤについて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＨＳＰ９０染色
−細胞を４℃で３０分、固定バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、氷
上で３０分、Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で透
過処理した。細胞を抗ＨＳＰ９０フィコエリトリンコンジュゲート（ＰＥ）（Ｆ−８クロ
ーン、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＣＡ）で６０分間染色
した。細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーにより分析した。正常マウスＩｇＧ２ａ
−ＰＥを、アイソタイプ対照として用いた。
６．３．３．ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２（９）結合の蛍光顕微鏡分析
ＭＶ４−１１細胞を５ｘ１０5細胞／ｍｌの密度で４８穴プレート中に播種し、１μＭ
のＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２またはＰＵ−Ｈ７１−ＮＢＤ１で処理した。処理後２４時間
で、細胞を室温で３０分、３％ＢＳＡ／ＦＡＣＳバッファーで遮断し、室温で３０分、３
％ＢＳＡ／ＦＡＣＳバッファー中、Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅα１抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と共にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗
浄し、室温で２０分、３％ＢＳＡ／ＦＡＣＳバッファー中のヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆ
ｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を
ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中の１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩと共
に１０分インキュベートし、スライド上に載せ、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下で観察し
た。
ウェスタンブロッティング：細胞を、蛍光ＰＵ−Ｈ７１誘導体、ＴＥＧ−ＦＩＴＣまた
はＤＭＳＯ（ビヒクル）で２４時間処理し、ロイペプチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ
）およびアプロチニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ＮＰ４０溶解バッファー中で溶解させた。
ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて製造業者の説明書に従ってタンパク質濃度を決定
した。タンパク質溶解物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動分解し、ニトロ
セルロース膜に移し、Ｒａｆ−１（１：３００、Ｓｃ−１３３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）
、ＦＬＴ３（１：１０００、ｓｃ−４８０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびβ−アクチン
（１：２０００、Ａ１９７８；Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体を用いてプロービングした
。次いで、膜を１：３０００希釈率の対応する西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
ト二次抗体と共にインキュベートした。ＥＣＬ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）を用いて製造業者の説明書に従って検出を実施した。
６．３．４．腫瘍幹細胞アッセイ
ＰＵ−Ｈ７１結合アッセイ−一次試料を２ｘ１０6細胞／ｍｌで４８穴プレート中に播
種し、１μＭのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２またはＴＥＧ−ＦＩＴＣで処理した。処理後４
時間で、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）で１回洗浄し、４℃で
３０分、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）中のＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ３
８−ＰＥ−ＣＹ７およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
で染色した後、７−ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。結合したＰＵ−Ｈ７１
−ＦＩＴＣ２のＭＦＩをＢＤ−ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター中で評価し、ＴＥＧ−
ＦＩＴＣに対して正規化した。値を、リンパ球（ＣＤ４５ｈｉ対ＳＳＣゲート）と比較し
たＬＳＣ（ＣＤ４５ｄｉｍ、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−ゲート）中でのＰＵ−Ｈ７１−ＦＩ
ＴＣの結合の比として表した。
幹細胞生存能力アッセイ−一次細胞を２ｘ１０6細胞／ｍｌで４８穴プレート中に播種
し、１μＭのＰＵ−Ｈ７１で４８時間処理した。細胞を４℃で３０分、ＦＡＣＳバッファ
ー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）中のＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７および
ＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した後、アネキシ
ンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアネキシンＶバッファー（１０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）中の７
−ＡＡＤで染色した。細胞生存能力を、未処理の細胞に対して正規化したアネキシンＶ−
／７−ＡＡＤ−細胞の割合として決定した。
統計分析。別途指摘しない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン４；Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）中に実装された対応のない両側ｔ検定によりデータを
分析した。０．０５未満のＰ値を、有意であると考えた。別途注記しない限り、データは
２回または３回の反復の平均±ＳＤまたは平均±ＳＥＭとして提示される。エラーバーは
、平均のＳＤまたはＳＥＭを表す。単一のパネルが提示される場合、データは２または３
つの個別の実験の代表である。
６．３．５．一次白血病試料中ならびに白血病および固形腫瘍細胞系中でのＰＵ−ＦＩ
ＴＣ結合の評価
手順：白血病患者からの末梢血（ＰＢ）または骨髄（ＢＭ）単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ
密度勾配を用いて新鮮な試料から、または生きたまま凍結されたアリコートから単離する
。細胞を１μＭのＰＵ−ＦＩＴＣで処理し、処理後４時間で、細胞を洗浄し、抗体で染色
して、異なるサブ集団（芽球（ＣＤ４５ｄｉｍ対ＳＳＣゲート）およびリンパ球（ＣＤ４
５ｈｉ対ＳＳＣゲート）を同定するためのＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７）を識別し、７−ＡＡ
Ｄで染色して死んだ細胞を識別する。ＰＵ−ＦＩＴＣ結合を、ＢＤ ＬＳＲ−ＩＩ装置を
用いて評価する。装置を実験前にＣＳＴビーズを用いて設定する。様々な蛍光強度で標識
された市販のビーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８キット）を用い
る較正曲線を、ＰＵ−ＦＩＴＣ結合に関するＡＦ４８８／ＦＩＴＣ蛍光強度の定量のため
に用いる。リンパ球への結合を用いて、それぞれの患者試料に関するＰＵ−ＦＩＴＣのバ
ックグラウンド結合を決定する。ＰＵ−ＦＩＴＣ結合を、リンパ球と比較した芽球の平均
蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数差として評価する。非特異的対照（ＴＥＧ−ＦＩＴＣ）を用い
て、非特異的結合を決定する。本発明者らは、少なくとも１００個の一次白血病試料を評
価することを提唱する。それぞれのアッセイについて、本発明者らは、最少で９００，０
００個の総単核細胞を使用する。本発明者らは、分析のために少なくとも５０，０００の
事象を収集する。分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実施する。市販の細胞系（
リンパ腫、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がんおよび肺がん細胞系）のより大
きいパネルへのＰＵ−ＦＩＴＣの結合を評価することができる。細胞系はそれ自身、内部
対照を有さないため、本発明者らはＰＵＦＩＴＣから差し引いたＴＥＧ−ＦＩＴＣの計算
されたデルタＭＦＩ（蛍光ビーズを用いて実施された較正曲線を用いて定量される）また
は上記のようなＨＬ−６０への結合を使用する。
Ｈｓｐ９０阻害剤に対する感受性の評価：ＰＵ−ＦＩＴＣ結合について評価された全試
料の感受性を決定するために、細胞を９６穴プレート中に播種し、増加用量のＰＵ−Ｈ７
１で処理した。細胞系および選択された一次試料サブセットにおいて、十分な材料が利用
可能である場合、他の化学的に異なるＨｓｐ９０ｉ（１７−ＡＡＧ、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２
２およびＳＴＡＴ９０９０または現在臨床評価中の他のＨＳＰ９０ｉ）に対するその感受
性も試験する（５）。４８時間後に細胞を採取し、ＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７で染色して、
芽球と正常リンパ球（一次細胞について）とを識別する。次いで、細胞を洗浄し、アネキ
シンＶ−Ｖ４５０およびアネキシンＶバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０
．１４Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）中の７−ＡＡＤで染色する。細胞生存能
力をフローサイトメトリーにより分析する。
統計的考慮：主な目標は、ＰＵ結合倍数に関する本発明者らのアッセイがＨｓｐ９０ｉ
応答者と非応答者とを最良に識別するように、それを評価することである。これらの実験
を、一次試料および細胞系を含む１５０個の試料を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。５０
％を超える細胞が生きている場合、応答が定義される。受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下
面積を算出して、応答と非応答とを識別する際のＰＵ結合倍数の能力を評価する。本発明
者らの目的のために、本発明者らは、０．８７以上のＡＵＣ（０．７５のヌルＡＵＣと比
較）を、ＰＵ結合倍数が非応答者からＨｓｐ９０ｉ応答者を識別することができることを
示すと定義する。１５０個の試料について、および応答率が３０％であると仮定すると、
本発明者らは、５％のＩ型誤差で０．７５〜０．８７のＡＵＣの差異を検出する８０％の
力を有するであろう。応答率が減少するにつれて、力も低下する。一例として、本発明者
らが２０％の応答率を仮定する場合、本発明者らは５％のＩ型誤差で０．７５〜０．８９
のＡＵＣの差異を検出する８０％の力を有するであろう。
６．３．６．ｐｇｐ阻害剤の存在下または非存在下での生腫瘍細胞系におけるＰＵ−Ｆ
ＩＴＣ結合の測定
付着性がん細胞系を播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩接着させる。細胞を、ｐｇｐ阻
害剤（ＰＳＣ８３３、Ｔｏｃｒｉｓ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓもしくはＲｅｖｅｒｓａｎ
、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＤＭＳＯビヒクルで２時間予備処理（
５μＭ）した後、１μＭのＤＭＳＯ、ＰＵ−ＦＩＴＣ９（陰性ＰＵ−ＦＩＴＣ対照）およ
びＰＵ−ＦＩＴＣ２（ＦＩＴＣに標識付けられたＰＵ−Ｈ７１薬剤）を含有する培地を添
加する。細胞をＦＩＴＣ薬剤または対照コンジュゲートと共にさらに４時間、３７℃、５
％ＣＯ2でインキュベートする。次いで、細胞をトリプシン化し、１ＸＦＡＣＳバッファ
ー（１ＸＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄し、ペレットを、細胞生存染料（１μｇ／
ｍｌのＤＡＰＩ）を含有する５００μｌの１Ｘ ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁する。試
料をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上で泳動し、１０〜２０，０００の事象を収
集する。それぞれの実験泳動の前に、レーザーをＣＳＴビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ）を用いてＬＳＲＩＩ上で正規化する。ＦＩＴＣ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定す
ることによりＤＡＰＩ−ｖｅ生細胞中で腫瘍細胞中でのＰＵ−ＦＩＴＣの結合を決定する
。ＦＩＴＣ９およびＤＭＳＯ対照に由来する非特異的ＦＩＴＣシグナルを、ＰＵ−ＦＩＴ
Ｃシグナルから差し引く。
６．３．７．腫瘍細胞および循環腫瘍細胞の解離
腫瘍細胞の解離およびＰＵ−ＦＩＴＣ結合の測定−マウスから得たＥＧＦＲ＋腫瘍を、
製造業者のプロトコルに従って解離した（組織解離キット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。簡単
に述べると、１ｇの新鮮な組織を、外科用メスを用いて小片（例えば、組織１ｇあたり約
１０〜２０ピース）に切断する。細分した組織をＰＢＳ中で２回洗浄し、穏やかに撹拌し
ながら３７℃で５０分、解離溶液中に移す。解離後、細胞を洗浄し、篩を用いて濾し、解
離しなかった組織断片を廃棄する。解離した組織を、プロテアーゼ阻害剤を含む１Ｘ解離
バッファーを含有する新鮮なチューブに移す。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有する解
離バッファー中で２回洗浄する。細胞を、培地中で１ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁する。
試料を３つのチューブに等量に分割し、細胞を１μＭ（１ｘ１０6細胞／ｍｌあたり）の
ＤＭＳＯ、ＰＵ−ＦＩＴＣ９（陰性ＦＩＴＣ対照）およびＰＵ−ＦＩＴＣ２（ＦＩＴＣに
標識付けられたＰＵ−Ｈ７１薬剤）で３７℃、５％ＣＯ2で４時間処理する。血液バンク
から得られた解凍されたＰＢＭＣと混合した対照ＥＦＧＲ＋細胞系［ＡｓｐｃＩ（低結合
）；ＢｘＰｃ３（高結合）］を、上記のように解離された腫瘍細胞と同時に染色する。細
胞を１ＸＦＡＣＳバッファー（１ＸＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄し、氷上で３０
分、抗ヒトＥＧＦＲ−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ヒトＣＤ１４−ＡＰＣ
−Ｃｙ７（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＣＤ１４−ＰＥ−テキサスレッド（ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ヒトＣＤ４５−ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色す
る。次いで、細胞を１ＸＦＡＣＳバッファー（１ＸＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄
し、ペレットを、細胞生存染料（１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ）を含有する５００μｌの１Ｘ
ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁する。試料をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上
で泳動し、１００〜２００，０００の事象を収集する。レーザーを、それぞれの実験泳動
の前にＣＳＴビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬＳＲＩＩ上で正規化す
る。ＥＧＦＲ＋細胞（ＥＧＦＲ＋ＣＤ４５−）およびＥＧＦＲ−細胞（ＥＧＦＲ−ＣＤ４
５＋ＣＤ１４−）中のＦＩＴＣ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより、腫瘍細胞
中でのＰＵ−ＦＩＴＣの薬剤蓄積を決定する。ＰＵ−ＦＩＴＣ９およびＤＭＳＯ対照に由
来する非特異的ＦＩＴＣシグナルを差し引く。値を、腫瘍のＭＦＩ（ＥＧＦＲ＋ＣＤ４５
−ＣＤ１４−）：ＥＧＦＲ−ＣＤ４５＋ＣＤ１４−細胞のＭＦＩの比として算出する。患
者間のＭＦＩ値を正規化するために、Ｑｕａｎｔｕｍ ＦＩＴＣ標準化ビーズ（Ｂａｎｇ
ｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各試料と共に泳動し、標準曲線を作製する。これによ
り、同等の可溶性蛍光色素（ＭＥＳＦ単位）の分子中でのＦＩＴＣ蛍光強度の定量が可能
になる。標準曲線から生成された値を外挿することにより、試料間で各試料中でのＰＵ−
ＦＩＴＣ２蓄積を定量することができる。
ＰＢＭＣ中でのＥｐＣＡＭ＋循環腫瘍細胞へのＰＵ−ＦＩＴＣ結合の測定：全ての実験
的血液サンプリング手順を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａ
ｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒでＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄに認
可されたプロトコルの下で実施した。８ｍｌの末梢血を、ＰＵ−Ｈ７１臨床試験に登録し
たがん患者から抗凝固剤ＥＤＴＡチューブ中に引き出す。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配上
で単離し、細胞を計数し、生存能力をトリパンブルー色素排除アッセイにより決定する。
ＰＢＭＣを沈降させ、２ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁する。試料を３つのチューブに等量
に分割し、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、１μＭ（２ｘ１０6細胞／ｍｌあたり）のＤＭＳ
Ｏ、ＰＵ−ＦＩＴＣ９（陰性ＦＩＴＣ対照）およびＰＵ−ＦＩＴＣ２（ＦＩＴＣに標識付
けられたＰＵ−Ｈ７１薬剤）で処理する。対照ＥｐＣＡＭ＋細胞系［ＡｓｐｃＩ（低結合
）；ＢｘＰｃ３（高結合）］を、血液バンクから得られた新鮮に解凍されたＰＢＭＣと混
合し、上記のように患者のＰＢＭＣと同時に染色した。細胞を１ＸＦＡＣＳバッファー（
１ＸＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄し、氷上で３０分、抗ヒトＥｐＣＡＭ−ＰＥ（
ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ヒトＣＤ１４−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ｅｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）またはＣＤ１４−ＰＥ−テキサスレッド（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および
抗ヒトＣＤ４５−ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。次いで、細胞を１Ｘ
ＦＡＣＳバッファー（１ＸＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄し、ペレットを、細胞生
存能力染料（１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ）を含有する５００μｌの１ＸＦＡＣＳバッファー
中に再懸濁する。試料をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上で泳動し、１００〜２
００，０００の事象を収集する。それぞれの実験泳動の前に、レーザーをＣＳＴビーズ（
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬＳＲＩＩ上で正規化する。ＥｐＣＡＭ＋細胞
（ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ４５−）およびＥｐＣＡＭ−細胞（ＥｐＣＡＭ−ＣＤ４５＋ＣＤ１４
−）中でのＦＩＴＣ中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより、腫瘍細胞中のＰＵ−
ＦＩＴＣの結合を決定する。ＦＩＴＣ９およびＤＭＳＯ対照に由来する非特異的ＦＩＴＣ
シグナルを差し引く。値を、腫瘍（ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ４５−ＣＤ１４−）のＭＦＩ：Ｅｐ
ＣＡＭ−ＣＤ４５＋ＣＤ１４−細胞のＭＦＩの比として算出する。患者間のＭＦＩ値を正
規化するために、Ｑｕａｎｔｕｍ ＦＩＴＣ標準化ビーズ（Ｂａｎｇｓ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）を各患者試料と共に泳動し、標準曲線を作製する。これにより、同等の可溶
性蛍光色素（ＭＥＳＦ単位）の分子中でのＦＩＴＣ蛍光強度の定量が可能になる。標準曲
線から生成された値を外挿することにより、試料間で各試料中でのＰＵ−ＦＩＴＣ２結合
を定量することができる。
プロトコルの改変：患者から得られたＰＢＭＣを、２つのチューブに分割する。両方と
も上記のようにＰＵ−ＦＩＴＣで染色し、ＥｐＣＡＭ−ＰＥまたはアイソタイプ対照およ
びＣＤ１４−ＰＥ−テキサスレッドおよびＣＤ４５−ＡＰＣで染色する。試料を上記のよ
うに加工する。閾値比値を、ＰＢＭＣと混合したＰＵ−ＦＩＴＣ低および高蓄積細胞系を
用いて決定する。
６．３．８．組織中でのＰＵ−Ｈ７１結合の分析
ｅｘ ｖｉｖｏでの腫瘍組織源を用いるＨＳＰ９０阻害剤に対する胃がん患者腫瘍標本
の感受性の検査およびＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ染色との相関：胃切除術標本の外科的除去
の直後、組織をＴｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＴＰＳ）ａ
ｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｓｕｉｔｅに輸送する。一度、病変を置い
たら、組織を滅菌条件下で収穫する。評価のために除去される標本サイズは、典型的には
、５〜１０ｍｍ ｘ ５〜１０ｍｍである。最も生存能力のある領域をサンプリングする
ためにあらゆる努力を払う。病変から遠くの、正常胃上皮組織を代表する同等のサイズの
標本を除去する。両標本を１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む最少必須培地（Ｍ
ＥＭ）中に入れる。病変の小部分および正常胃上皮組織の全小片は、ＷＢによる将来の分
子的評価のために「簡易」凍結を受ける。残りの部分の病変（胃切除）を、病理学的評価
のために加工する。全ての病変について、病理は、増殖マーカー、上皮マーカーおよびフ
ルオレセイン標識されたＰＵ−Ｈ７１（ＰＵ−ＦＩＴＣ）での染色についてさらに評価さ
れる１０個の非染色を伴うヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたスライドのた
めのＩＨＣを提供する。ホルマリン固定されたパラフィン包埋切片または凍結切片を、Ｐ
ＵＨ７１−ＦＩＴＣ２染色について分析する。同時に、組織の一部を、ＰＵ−Ｈ７１に対
する腫瘍の感受性のｅｘ ｖｉｖｏでの分析のために調製する。予備分析から、本発明者
らは、新鮮な組織スライスが周囲の組織の内因的環境中にがん細胞を保存することを学ん
だ。この方法では、組織（すなわち、病変）を、プラスチック型に入れ、６％アガロース
中に埋込む。次いで、アガロースに埋込まれた組織をＶｉｂｒａｔｏｍｅのステージ上に
載せ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭを含有する冷却された容器（組
織保存用）中に沈める。次いで、組織を金属刃を用いてスライスし、２００μｍの厚さの
病変の連続切片を作製する。それぞれの切片（周囲のアガロース埋込み培地を除く）を、
１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭを含有する２４穴組織培養プレート中
にすぐに入れる。５ｍｍ ｘ ５ｍｍの組織小片から、約２５個の切片が作製される。こ
れにより、最少４回用量のＨｓｐ９０阻害剤およびビヒクルのみを含むもので処理された
組織切片の分析を繰り返すことができる。一度、組織切片がジスパーゼへの簡単な曝露に
より酵素的解離を受けたら、反復物を、ＩＨＣならびに生存能力アッセイ（自動化プレー
トリーダーまたはサイトスピン調製）の両方によりアッセイすることができる。次いで、
これらの胃腫瘍スライス中でＰＵ−Ｈ７１により誘導されるアポトーシスの程度を、ＰＵ
−Ｈ７１−ＦＩＴＣ染色と相関させる。ＰＵ−Ｈ７１の取込み（ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ
染色のＩＨＣスコアリングにより測定される）は、Ｈｓｐ９０阻害に対するこれらの腫瘍
の感受性と相関する。同様のプロトコルが、乳がんおよび膵臓がんのために開発されてい
る。
６．４．細胞アッセイにおけるＡＮＣＡ標識プローブ
蛍光プローブ処理：付着性細胞を、７０％集密になった時に、標準的な組織培養条件下
で１時間、５μＭのＰＵＨ７１−ＡＮＣＡで処理した。処理後、培地を吸引し、スライド
をＰＢＳで３回洗浄した後、完全培地を継ぎ足した。
蛍光放出スペクトル：倒立型蛍光共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ5）を用いて、５ｎ
ｍの増分で４００ｎｍ〜６００ｎｍでチャンバースライド上でがんおよび非がん細胞を走
査して、蛍光放出を決定した。
共焦点顕微鏡観察：処理後、倒立型蛍光共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ5）を用いて
、細胞の蛍光を観察した。結合した高親和性種の適切な蛍光放出ピーク（約５３０ｎｍ）
で共焦点画像を獲得した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェア中に画像をアップロードし
た。いくつかの無作為の視野からの個々の細胞の蛍光強度を測定し、バックグラウンドに
ついて補正した。
応答モデリング：ＩＣ50対蛍光密度インテグリティ（integrity）の標準曲線を、１２
種の乳がん細胞系および２種の正常乳房細胞系について確立した。細胞系をマルチウェル
プレート上で増殖させ、５個のウェルは応答について分析し（ビヒクルのみ、０．２５μ
Ｍ、０．５０μＭ、１．０μＭおよび２．５μＭのＰＵＨ７１処理）、１個のウェルは結
合した（ＰＵＨ７１−ＡＮＣＡ処理）の蛍光強度について分析した。全ての細胞系のＩＣ
50をｙ軸上にプロットし、密度インテグリティ（蛍光強度）をｘ軸上にプロットした。こ
の標準曲線を用いて、ＨＳＰ９０療法に対する、乳がん標本、例えば、生検、手術または
微細針吸引生検から得られたものの応答をモデリングし、予測する。
がん生検における応答測定：一度得られたら、患者生検を滅菌塩水に入れ、Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔにすぐに配達する。病変の一部を、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ
１０００）上で実施される新鮮な組織切片化のために取得する。２００μｍの厚さの切片
を切断し、増殖因子および抗生物質を含む最少必須培地中、マルチウェルプレートにすぐ
に入れ、一定の湿度の空気−５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃に入れる。次いで、切片をＰＵ
Ｈ７１−ＡＮＣＡで４５分〜１時間処理する。処理後、切片をＰＢＳで２回洗浄し、次い
で、ＯＣＴ包埋する（新鮮に凍結する）。次いで、ＯＣＴ包埋された標本をいくつかの４
μｍの厚さの切片に切断し、荷電したスライドに移す。次いで、核対抗染色、ＤＡＰＩを
スライドに印加する。次いで、スライドを共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ5）上で観察
し、５３０ｎｍの蛍光放出ピークで分析して、発がん性ＨＳＰ９０種に対するプローブに
結合したものの割合を決定する。
６．５．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を用いる試験
試薬。［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１および［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を、以前に報告された
ように合成および精製した132。
細胞系。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳がん細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グ
ルタミン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥ−ＨＧ中で日常的
に培養した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験。全ての動物試験を、ＭＳＫＣＣ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の
指針に従って行った。メスの無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＣＲＮＵ−Ｍ、２０〜２５ｇ、
６週齢）を、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得し、ＭＳＫＣＣ生態動物
園で１週間慣れさせた後、腫瘍を埋込んだ。マウスに食餌および水を自由に提供した。Ｐ
ＢＳと、再構成された基底膜（ＢＤ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）との
１：１ ｖ／ｖ混合物の２００μＬ細胞懸濁液中、１ｘ１０7個の細胞の皮下（ｓ．ｃ．
）注入により、マウスの前肢上にＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍異種移植片を確立した。投与
前に、ＰＵ−Ｈ７１の溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で製剤化した。
ｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布試験。急性ｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布試験のために、前肢上
にＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳房腫瘍異種移植片を有するマウス（ｎ＝５）に、２００μＬの
塩水中の０．９３〜１．１ＭＢｑ（２５〜５０μＣｉ）の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１また
は［131Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を、尾静脈中に静脈内注入した。用量評価実験のために、マ
ウスの群（ｎ＝５）に、５、２５、５０または７５ｍｇ／ｋｇのマウス体重に相当するＰ
Ｕ−Ｈ７１を含有する滅菌溶液中に希釈した［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１または［131Ｉ］−
ＰＵ−Ｈ７１を注入した。投与前後の注射筒内の活性を、用量較正装置（ＣＲＣ−１５Ｒ
；Ｃａｐｉｎｔｅｃ）中でアッセイして、各動物に投与された活性を決定した。動物（１
群あたりｎ＝４）を、トレーサの投与後の様々な時点でＣＯ2窒息により安楽死させ、腫
瘍を含む臓器を収穫し、計量した。さらなる生化学的および組織学的分析のために、腫瘍
組織の一部を収穫後すぐに凍結した。４００〜６００ｋｅＶのエネルギーウインドウを用
いるシンチレーションγ−カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １４８０ Ｗｉｚａ
ｒｄ ３ Ａｕｔｏ Ｇａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で124Ｉ
を測定した。計数データを注入時点に対してバックグラウンドおよび遅延補正し、測定さ
れた較正係数を用いることにより、それぞれの組織試料に関する１グラムあたりの注入用
量パーセント（％ＩＤ／ｇ）を算出して、計数率を活性に変換し、活性を、注入された活
性に対して正規化して、％ＩＤ／ｇで活性濃度を得た。
小動物ＰＥＴ画像化。小動物画像化試験のために、前肢上にＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳が
ん異種移植片を有するマウスを用いた。画像化を、小動物専用ＰＥＴスキャナー（Ｆｏｃ
ｕｓ １２０ ｍｉｃｒｏＰＥＴ；Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｋｎ
ｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を用いて実施した。全走査期間に２Ｌ／分で酸素中の２％イソフ
ルラン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）麻酔下でマ
ウスを維持した。好適な事例では、トレーサの代謝から生じる遊離ヨウ素の甲状腺取込み
を低下させるために、マウスはトレーサ投与の４８時間前に開始してその飲用水中に０．
０１％のヨウ化カリウム溶液を受けた。ＰＥＴ画像化のために、それぞれのマウスに尾静
脈を通して９．２５ＭＢｑ（２５０μＣｉ）の［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１を投与した。ト
レーサ投与後の様々な時点で、それぞれの動物について連続リストモード収集データ（１
０〜３０分）を取得した。４２０〜５８０ｋｅＶのエネルギーウインドウおよび６ｎｓの
一致タイミングウィンドウを用いた。得られたリストモードデータを、フーリエリビニン
グにより２次元ヒストグラムに選別した；横断面画像を、フィルタ補正逆投影（ＦＢＰ）
により再構築した。画像データを、スキャナー応答の非均一性、応答待ち時間計数ロス、
および注入時間に対する物理的遅延について補正した。減衰、散乱または部分容積平均化
に適用された補正はなかった。Ｆｏｃｕｓ １２０の測定された再構築空間分解能は、視
野の中心において１．６ｍｍ ＦＷＨＭである。再構築された画像のＲＯＩ分析を、ＡＳ
ＩＰｒｏソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌ
ｌｅ、ＴＮ）を用いて実施し、それぞれの組織／臓器のＲＯＩについて最大ピクセル値を
記録した。18Ｆを含有するマウスサイズ水充填シリンダの再構築画像から誘導されたシス
テム較正係数（すなわち、μＣｉ／ｍＬ／ｃｐｓ／ｖｏｘｅｌ）を用いて、124Ｉボクセ
ル計数率を活性濃度に変換した（124Ｉポジトロン分岐比について調整後）。次いで、得
られた画像データを投与された活性に対して正規化して、％ＩＤ／ｇを単位としてマイク
ロＰＥＴ画像をパラメータ化した（注入時間に対する遅延について補正）。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。凍結組織を乾燥、計量した後、アセトニトリル／Ｈ2Ｏ（３：
７）中でホモジェナイズした。ＰＵ−Ｈ７１を塩化メチレン中に抽出し、有機層を分離し
、減圧下で乾燥した。試料を移動相中で再構成させた。組織または結晶中のＰＵ−Ｈ７１
の濃度を、高速ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定した。ＰＵ−Ｈ７１−ｄ6を、内部標準とし
て添加した133。化合物分析を、陽イオン電子スプレーイオン化を用いる多反応モニタリ
ング（ＭＲＭ）モードで６４１０ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で実施した。組織試料については、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓ
ｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ）をＬＣ分離のために使用し
、０．４ｍＬ／分の流量で３分間、イソクラチック条件（８０％Ｈ2Ｏ＋０．１％ＨＣＯ
ＯＨ：２０％ＣＨ3ＣＮ）下で分析物を溶出させた。血漿試料については、Ｚｏｒｂａｘ
Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｘ５０ｍｍ、５μｍ）をＬＣ分離のた
めに使用し、０．３５ｍｌ／分の流量で勾配条件（Ｈ2Ｏ＋０．１％ＨＣＯＯＨ：ＣＨ3Ｃ
Ｎ、９５：５〜７０：３０）下で分析物を溶出させた。
薬力学的分析。タンパク質分析のために、腫瘍をＳＤＳ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ７．４、２％ＳＤＳ）中でホモジェナイズし、ウェスタンブロット分析にか
けた。タンパク質濃度を、製造業者の説明書に従ってＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用
いて決定した。タンパク質溶解物（２０〜１００μｇ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより電気泳
動分解し、ニトロセルロース膜に移し、示された一次抗体：マウス由来抗Ｈｓｐ９０（１
：５００、ＳＰＡ−８３０；Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）、ウサギ由来抗Ａｋｔ（１：５００、
９２７２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７
３）（１：５００、９２７１Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来抗ＰＡＲ
Ｐ（ｐ８５断片）（１：２５０、Ｇ７３４１；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプロービングし
た。次いで、膜を１：５，０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲート対応二次抗体と
共にインキュベートした。等量のタンパク質試料を、β−アクチンに関する平行ウェスタ
ンブロット（１：５，０００、ａｂ８２２７−５０；Ａｂｃａｍ）により確認した。ＥＣ
Ｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って
用いて、検出を実施した。
密度測定。ゲルをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ中でスキャンし、Ｕｎ−Ｓｃａｎ−
Ｉｔ５．１を用いて定量密度測定分析を実施した。
効果試験。１００〜１５０ｍｍ3の体積に達するＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を担持する
マウス（ｎ＝５）を、示されるような様々な用量およびスケジュールを用いて腹腔内（ｉ
．ｐ．）処置した。腫瘍体積をＶｅｒｎｉｅｒカリパスを用いる測定により決定し、腫瘍
体積をその長さｘ幅2ｘ０．４の積として算出した。腫瘍体積を、マウス群について示さ
れた中央腫瘍体積±ＳＤとして示された日に表現した。腫瘍増殖阻害率値（％）を、ビヒ
クル処置されたマウスと比較して薬剤処置されたマウスについて試験の最終日に測定し、
１００ｘ｛１−［（処置最終日−処置1日目）／（対照最終日−対照1日目）］｝として算
出した。所与の処置群について、処置を開始した時点での中央腫瘍体積と、試験の最終日
での中央腫瘍体積との比を算出することにより、腫瘍退縮値を決定した。腫瘍退縮率（％
）は、１００ｘ［１−（処置最終日／処置1日目）］である。
アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド細胞生存能力アッセイ。Ｅａｓｙｃｏｕｎ
ｔ ＶｉａＳｕｒｅキット（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎ）をＥａｓｙｃｏｕｎｔシステムと共に
用いて、死細胞と生細胞を自動的に計数した。ＶｉａＳｕｒｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｒｅ
ａｇｅｎｔは、すぐに使用できる核酸染料、アクリジンオレンジおよびエチジウムブロマ
イドの混合物を使用して、単一の試験において、それぞれ、生細胞と死細胞を同定する。
アクリジンオレンジは、生細胞と非生細胞の両方により取り込まれ、二本鎖核酸（ＤＮＡ
）中に挿入された場合は緑色蛍光、または一本鎖核酸（ＲＮＡ）に結合した場合は赤色蛍
光を放出する。エチジウムブロマイドは非生細胞によってのみ取り込まれ、ＤＮＡ中への
挿入により赤色蛍光を放出する。生細胞は組織化された構造を含む均一な緑色の核を有す
る。初期アポトーシス細胞（まだ無傷の膜を有するが、ＤＮＡ切断を受け始めている）は
緑色の核を有するが、核周囲クロマチン凝縮は明るい緑色のパッチまたは断片として見え
る。後期アポトーシス細胞は凝縮したか、または断片化されたクロマチンを含むオレンジ
色から赤色の核を有する。壊死細胞は、組織化された構造を含む均一にオレンジ色から赤
色の核を有する。条件あたり合計少なくとも２００個の細胞を計数した。
シミュレーション。二重指数関数ｘ（ｔ）＝α1ｅｘｐ（−β1ｔ）＋α2ｅｘｐ（−β2
ｔ）を、測定に適合させた。一般に、指数の和を用いて、薬力学的データを分析した123
。Ｒ統計的言語（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）における一般化非線形モデルパ
ッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇ
ｅ／ｇｎｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、モデルをデータに適合させた。最初は数
回の適合が求められ、最良なものを、様々な薬剤投与シナリオのさらなるシミュレーショ
ンのために用いた。Ｒにおけるスクリプトを開発した。
統計分析。別途指摘しない限り、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョ
ン４；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）中に実装された対応のない両側ｔ検定によ
り分析した。０．０５未満のＰ値を有意であると考えた。別途注記しない限り、データは
２回または３回の反復物の平均±標準偏差（ＳＤ）または平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ
）として提示する。エラーバーは平均のＳＤまたはＳＥＭを表す。単一のパネルが提示さ
れる場合、データは２つまたは３つの個々の実験の代表である。
ヒトにおける試験。１日１回用量のヨウ化カリウム溶液（ＳＳＫＩ）を、注入の前日か
ら開始して１４日間投与する。単回トレーサ注入（４〜１１．０ｍＣｉ；１００μｇ未満
）を、ゆっくりした末梢ＩＶボーラスにより投与する。患者は０時間（動的スキャン）、
３〜４時間、２４時間および４０〜８０時間および／または１６０〜２００時間（静的ス
キャン）で非侵襲的ＰＥＴに基づくアッセイを受ける。本発明者らのＰＵ−ＰＥＴパイロ
ット試験においては、患者の動員における困難性または「脱落」なしに、より厳しいスケ
ジュールが患者によって良好に許容された。時点を、本発明者らのヒト124Ｉ−ＰＵＨ７
１ ＰＫデータに基づいて選択する：
（１）124Ｉ−ＰＵＨ７１は、双指数関数様式で、血液循環から迅速に消失し（迅速
なクリアランス（血液ｔ1/2約２０分））、次いで、無視できるほど低い血中レベルでゆ
っくりと消失した；
（２）ＰＥＴ画像化による腫瘍ＰＵＨ７１トレーサ濃度は可変的であり、バックグラ
ウンド組織トレーサレベルよりも量的に多いか、または同等であり、トレーサの示差的取
込みおよび／または保持が、トレーサ注入後４〜２４時間または４８時間および７２時間
以後で明らかである；
（３）ＰＵＨ７１親和性腫瘍内濃度は数日間にわたって持続したか、または単指数関
数型クリアランスを示した。
本発明者らは、強固な計数統計を確保するために本発明者らの124Ｉ−ＰＵＨ７１ Ｐ
ＥＴ画像収集プロトコルを最適化した。研究専用ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（ＧＥ Ｄｉｓ
ｃｏｖｅｒｙ ＤＳＴＥ）は、減衰、崩壊および散乱補正ならびにシステム感度のための
調整と共に定量的生体内分布画像を取得する。減衰補正のためのＣＴスキャンおよび解剖
学的同時登録を、トレーサ注入の前に実施し、体重に対して拡大する（８１ｋｇ以上につ
いては最大８５ｍＡ）。放射線曝露を最小化しながら、トレーサ−シグナルの解剖学的局
在化および減衰補正を満足させるようにＣＴプロトコルを設計する。静脈内または経口Ｘ
線造影剤は投与しない。標準的な逐次部分期待値最大化反復アルゴリズムを用いてＰＥＴ
データを再構成する。放出データを、散乱、減衰および崩壊について補正する。
ＰＵ−腫瘍アビディティは、任意の時点で、参照血液プールまたは臓器バックグラウン
ドよりもかなり高いと判定された腫瘍トレーサシグナルとして、ＰＥＴ画像の目視上で定
義される二値の結果（binary outcome）である。（１）任意の時点での最も高い腫瘍標準
化取込み値（ＳＵＶ）；および（２）最初と最後のＰＥＴ時点間のＰＵ−Ｈ７１注入後の
時点の関数としての腫瘍ＳＵＶの積分により、ＰＥＴデータから定量的に腫瘍ＰＵ−Ｈ７
１濃度を評価する（すなわち、ＰＵ−ＰＥＴ ＳＵＶｍａｘ読み取り値またはそのような
ＳＵＶ読み取り値から算出されたモル濃度を、ＰＵ投与後の時間とＡＵＣ値の関数として
グラフ化し、Ｈｓｐ９０阻害剤の平均腫瘍内濃度を図２７に示されるように算出する）。
次いで、これらのパラメータ（または定義された他のもの）を、ＨＳＰ９０阻害剤を用
いる治療試験に対する応答と相関させる。これらの試験の際に、腫瘍あたりおよび患者あ
たりの腫瘍応答を評価する。腫瘍応答評価のタイミングを、療法試験プロトコル通りに作
った。腫瘍応答評価は、第１サイクルの終わりにもっと近い時点で実施した臨床画像化に
由来する（１サイクルは、典型的には３〜５週間である）。腫瘍応答を、ＣＴもしくはＭ
ＲＩのためにはＲＥＣＩＳＴ１．１および／またはＦＤＧ ＰＥＴ−ＣＴのためにはＰＥ
ＲＣＩＳＴ１．０により定義する（３６、３７）。一致しない場合、より好ましい応答を
用いる。臨床応答を、がん特異的療法試験応答基準に従って判定する。
ＰＥＴ画像に関する腫瘍ＰＵＨ７１アビディティデータを、２つの方法で二分する：
（１）腫瘍の定性的／視覚的判定の二値の結果を「親和性」または「非親和性」とし
て用いることによる（上記で考察）；
（２）クラスター化したデータについて算出されたＲＯＣ曲線を用いることにより、
腫瘍応答と非応答とを識別する際の最良操作特性を有する腫瘍アビディティのための切断
点を算出することができる（４０）。
両二分化について、感受性、特異性および他の分類尺度を、患者応答を真実として用い
て算出する。各患者が単一の腫瘍を有する場合、４０人の患者の試料サイズは０．３２４
の最大幅の両側信頼区間をもたらす。患者あたりの腫瘍数が増加するにつれて、信頼区間
幅は一般的には全体として減少する。全体的なＲＥＣＩＳＴ患者レベル応答と最良に相関
する腫瘍アビディティに関する患者レベルの要約統計量を発見するために設計された予備
分析を実施する。調査されるアビディティに関する患者レベルの要約統計量は、１）最も
高い腫瘍ＳＵＶおよび／またはＡＵＣならびに２）全ての腫瘍ＳＵＶおよび／またはＡＵ
Ｃの平均を含む。この患者レベルデータを用いて、Ｙｏｕｄｅｎ指数に基づく患者要約腫
瘍アビディティに関するＲＯＣ曲線およびカットオフを構築し、（０、１）に最も近い点
を算出する。
前臨床試験において、特定の時点で、またはある期間にわたっての取込みおよび保持を
、観察された応答と最良に相関させる。予備データは、ＡＵＣにより測定された長時間の
腫瘍保持（２４〜４８時間にわたる）および腫瘍曝露の両方がＨｓｐ９０阻害療法に対す
る腫瘍応答を予測するために適正なパラメータであることを示唆する。具体的には、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−４６８腫瘍における予備調査において、いくつかのパラメータ、例えば、腫瘍
曲線下面積（ＡＵＣ）、ＰＵ−Ｈ７１の平均および最小腫瘍内濃度、処置時間にわたるＰ
Ｕ−Ｈ７１により占拠および認識された平均％Ｈｓｐ９０部位（（％占拠Ｈｓｐ９０部位
）avg）として測定される標的占拠率を算出した。本発明者らは、処置時間にわたって記
録されたＰＵ−Ｈ７１の平均腫瘍内濃度、腫瘍ＡＵＣおよび％「発がん性Ｈｓｐ９０」占
拠率が、観察された抗腫瘍効果の規模と有意に良好に相関することを見出した（それぞれ
、ｒ2＝０．８１６２、０．８１８８および０．７５５９）（図３７）。これらのことは
、Ｈｓｐ９０ｉに対する応答を予測するための最も好適なパラメータが、時間依存的曝露
、すなわち、取込みおよび保持を測定するものであることを示唆する。
６．６．乳がんおよびＡＭＬにおけるＨＳＰ９０に対するアポトーシス感受性を予測す
るマーカーを同定するための試験
細胞：Ｋａｓｕｍｉ−１、ＳＫＮＯ−１、ＭＯＬＭ−１３、Ｍ０−９１、ＨＥＬ、ＨＬ
−６０、ＴＨＰ−１、ＭＶ４−１１を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４．５ｇ／Ｌグルコース
、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳ、および
１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地中で増殖させた。ＦＬ５．
１２の安定なトランスフェクタントは以前に記載されている（１８−Ｋａｒｎａｕｓｋａ
ｓ ２００３）。簡単に述べると、ＦＬ５．ｍＡＫＴの作製のために、ミリストイル化さ
れたＡＫＴを、ドキシサイクリン誘導性ベクターｐＲｅｖＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中
にクローニングした（このクローンをｍＡＫＴと命名する）。対照として、細胞をベクタ
ーのみでトランスフェクトした（このクローンをＶｅｃｔｏｒと命名する）。ＦＬ５．ｍ
Ａｋｔ．Ｂｃｌ−ｘＬの作製のために、ヒトＢｃｌ−ｘＬ ｃＤＮＡを、ｐＢａｂｅＰｕ
ｒｏベクターのＥｃｏＲＩ部位中にクローニングし、記載のようにＦＬ５．ｍＡｋｔ３中
にトランスフェクトした（１８）（このクローンをｍＡＫＴ．Ｂｃｌ−ｘＬと命名する）
。これらの系を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８）（Ｓｉ
ｇｍａ ＃Ｇ９５１６）および１または２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ
＃４０３ ＭＬ）を含有する１０％ＦＢＳ培地を添加したＤＭＥ−ＨＧ培地を用いて以
前に記載のように培養した。
ＰＢＬ（ヒト末梢血白血球）を、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから購
入した患者血液から単離した。３５ｍｌの細胞懸濁液を、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａ
ｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重ねた。試料を４℃で４０分、２
，０００ｒｐｍで遠心分離し、白血球界面を採取した。細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭ
Ｉ培地中に播種し、次の日、示された時間、適切な濃度のＰＵ−Ｈ７１で処理した。
試薬：Ｈｓｐ９０阻害剤を以前に報告されたように合成した。本発明者らは、Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍから、Ａｋｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｉｓｏｚｙｍｅ−Ｓｅｌｅ
ｃｔｉｖｅ、Ａｋｔｉ−１／２（＃１２４０１８）、ＰＤ９８０５９ ＭＥＫ阻害剤（＃
５１３０００）およびｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤Ｉ（＃４２００９９）を購入した。これらの
化合物を、販売会社により示された濃度で使用して、その標的経路の阻害をもたらした。
ｉｎ ｖｉｖｏでの試験を除いて、全ての化合物をＤＭＳＯ保存液として用いた。
増殖阻害：増殖阻害試験を、Ａｌａｍａｒブルーアッセイを用いて実施した。この試薬
は、細胞培養物中での細胞生存能力の迅速な客観的尺度を提供し、それは、細胞生存能力
の指示因子である細胞の代謝能力を測定するために指示染料レサズリンを用いる。簡単に
述べると、指数増殖するＡＭＬ細胞系を、マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ
＃３６５０）中、２ｘ１０4細胞／ウェルで播種し、示された時間、３７℃でインキュベ
ートした。薬剤を示された濃度で３回添加し、プレートを７２時間インキュベートした。
レサズリン（５５μＭ）を添加し、Ａｎａｌｙｓｔ ＧＴ（蛍光強度モード、励起５３０
ｎｍ、放出５８０ｎｍ、ダイクロイックミラー５６０ｎｍ）を用いて６時間後にプレート
を読み取った。結果を、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。細胞増
殖阻害のパーセンテージを、処理された細胞と初期細胞集団を構成する対照細胞（０時間
）から得られた蛍光読み取り値を比較することにより算出した。ＩＣ50を、細胞増殖を５
０％阻害する薬剤濃度として算出した。
アポトーシスアッセイ：細胞を、示されたようにビヒクル（ＤＭＳＯ）または阻害剤で
２４、４８または７２時間処理した。アクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイド（
１００ ｇ／ｍｌの１：１混合物）で染色した後、細胞を蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘ
ｉｏｖｅｒｔ ４０ ＣＦＬ）で可視化し、計数した。アポトーシス細胞の割合を、各群
において計数された２００〜３００個の細胞から決定した。アポトーシス細胞のパーセン
テージを、％アポトーシス細胞＝（アポトーシス核を有する細胞の総数／計数された細胞
の総数）ｘ１００として算出した。アクリジンオレンジは、生細胞と非生細胞の両方によ
り取り込まれ、二本鎖核酸（ＤＮＡ）中に挿入された場合は緑色蛍光を、または一本鎖核
酸（ＲＮＡ）に結合した場合は赤色蛍光を放出する。エチジウムブロマイドは非生細胞に
よってのみ取り込まれ、ＤＮＡへの挿入により赤色蛍光を放出する。生細胞は組織化され
た構造を含む均一な緑色の核を有する。初期アポトーシス細胞（まだ無傷の膜を有するが
、ＤＮＡ切断を受け始めている）は緑色の核を有するが、核周囲クロマチン凝縮は明るい
緑色のパッチまたは断片として見える。後期アポトーシス細胞は凝縮したか、または断片
化されたクロマチンを含むオレンジ色から赤色の核を有する。壊死細胞は、組織化された
構造を含む均一にオレンジ色から赤色の核を有する。
キャスパーゼ３、７活性化アッセイ：細胞を、増殖阻害アッセイの節に記載のように播
種、処理した。Ｈｓｐ９０阻害剤への細胞の２４時間または４８時間の曝露後、１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ
ＰＭＳＦ、完全プロテアーゼ阻害剤ミックス（＃１６９７４９８；Ｒｏｃｈｅ）、およ
び２５μＭのキャスパーゼ基質Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０（＃Ｒ２２１２０；Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する１００μＬのバッファーを、各ウェルに添加した。プ
レートをオービタルシェーカー上に置き、細胞溶解および反応を促進させた。各ウェルの
蛍光シグナルを、Ａｎａｌｙｓｔ ＧＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイク
ロプレートリーダー（励起４８５ｎｍ；放出５３０ｎｍ）中で測定した。キャスパーゼ３
、７活性の増加パーセンテージを、処理細胞と対照細胞とから得られた蛍光読み取り値の
比較により算出した。全ての実験データを、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ４．３．１を用いて
分析し、Ｐｒｉｓｍ４．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてプロットした。
ウェスタンブロット：細胞を６０〜７０％集密まで増殖させ、示された時間、阻害剤ま
たはビヒクルで処理した。タンパク質溶解物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５
０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ＮＰ−４０溶解バッファー中で調製した。タンパク質濃度を
、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて製造業者の説明書に従って測定した。タンパク
質溶解物（１０〜１００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ニトロセルロース膜上
に移し、示された一次抗体と共にインキュベートした。ＡＫＴを活性化するために、ＦＬ
５．１２由来細胞系を、１μｇ／ｍｌのＤｏｘで１８時間予備処理した後、阻害剤で処理
した。
抗体：ウサギ由来抗Ａｋｔ（１：５００、９２７２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）
、ウサギ由来抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（１：５００、９２７１Ｓ；Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来抗ＲＡＦ−１（１：３００、ｓｃ−１３３；Ｓａｎｔ
ａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ由来抗ＰＡＲＰ（ｐ８５断片）（
１：２５０、Ｇ７３４１；Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウサギ由来抗Ｂｃｌ−ｘＬ（１：１，００
０、２７６２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来抗ＪＡＫ２（１：５００、
３７７３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス由来抗ｃ−ＫＩＴ（１：１，０００
、３３０８；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来抗ＡＭＬ１（１：５００、４
３３４；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来抗ＦＬＴ３（１：１，０００、３
４６２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ由来ＴＲＫＣ（１：１，０００、ａｂ
４３０７８；Ａｂｃａｍ）、マウス由来ＳＴＡＴ５、ｐ−ＳＴＡＴ５、ｐ−ＥＲＫおよび
抗β−アクチン（１：３，０００、ａｂ８２２７−５０；Ａｂｃａｍ）。次いで、膜を１
：３，０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲート対応二次抗体と共にインキュベート
し、タンパク質をＥＣＬ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により
検出した。
薬力学的試験：４〜６週齢のｎｕ／ｎｕ無胸腺メスマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒ
ｍｓから取得した。実験をＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎ
ｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認可されたプロトコルの下で実行し、研究における動
物の適正で人道的な使用のための制度指針に従った。ＨＥＬおよびＭ０−９１細胞を、２
０ゲージの針を用いてマウスの右脇腹に皮下的に埋込み、成長させた。投与前に、ＰＵ−
Ｈ７１ ＨＣｌの溶液を滅菌ＰＢＳ中で調剤した。このアッセイのために、腫瘍を直径６
〜８ｍｍに到達させた後、処置した。Ｍ０−９１およびＨＥＬ腫瘍を担持するマウスに、
７５ｍｇ／ｋｇのＰＵ−Ｈ７１を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ＰＵ−Ｈ７１の投与後、
１２、２４、４８、７２および９６時間でＣＯ2安楽死により動物を犠牲にした。腫瘍を
ホモジェナイズし、上記のようにウェスタンブロットによりタンパク質を分析した。
密度測定。ゲルをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ７．０．１中でスキャンし、Ｕｎ−
Ｓｃａｎ−Ｉｔ５．１を用いて定量的密度測定分析を実施した。
統計。本発明者らは、Ｐｒｉｓｍ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用
いて統計分析およびグラフプロッティングを実施した。本発明者らは、全てのデータを平
均±ｓ．ｄ．として提示した。０．０５未満のＰ値を有意と考えた。
Ｓｔａｔ５ホスホフロー−一次細胞を、４℃で３０分、ＦＡＣＳバッファー中のＣＤ３
４−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を１回洗浄し、室温で３０分、４％パラホルムアル
デヒドで固定し、氷上で１０分、ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理
した。細胞を４℃で一晩、ｐ−Ｓｔａｔ５−ＰＥまたはアイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＢＤ−ＬＳＲ Ｉ
Ｉフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるフローサイトメトリ
ー分析にかけた。ｐ−Ｓｔａｔ５染色のＭＦＩを、アイソタイプ対照に対して正規化した
。
幹細胞生存能力アッセイ−一次細胞を、２ｘ１０6細胞／ｍｌで４８穴プレート中に播
種し、１μＭ ＰＵ−Ｈ７１で４８時間処理した。細胞を、４℃で３０分、ＦＡＣＳバッ
ファー（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）中のＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７お
よびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した後、アネ
キシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアネキシンＶバッファー（
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）中
の７−ＡＡＤで染色した。細胞生存能力を、未処理細胞に対して正規化した。
６．７．ＨＳＰ９０阻害療法に感受性である神経変性疾患患者を同定するための試験
ヒトＡＰＰｓｗｅ、ＰＳ１Ｍ１４６ＶおよびｔａｕＰ３０１Ｌを発現するＡＤのトラン
スジェニックモデル（３ｘＴｇ−ＡＤ）は、疾患関連脳領域中で年齢依存的様式でＡベー
タとタウ病変の両方を進行的に発症する（Ｂｉｌｌｉｎｇｓら、２００５；Ｏｄｄｏら、
２００５；Ｏｄｄｏら、２００３）。このマウスモデルは、ＰＳ１Ｍ１４６ノックインマ
ウス胚へのＡＰＰおよびタウｃＤＮＡ構築物の同時注入により確立される。これらのマウ
スは、アミロイド斑沈着に先立って細胞内Ａβを生じ、これは軽度認識障害（ＭＣＩ）を
有する患者およびダウン症候群を有する患者における観察と一致している。それらはまた
、もつれ形成の前に細胞外Ａベータ沈着も生じ、これにより本発明者らはこれらの２つの
ＡＤ発達段階に関与する事象を試験することができる。タウ病変は、最初は海馬のＣＡ１
領域の錐体細胞中で明白であり、皮質中に進行し、ヒトＡＤ脳における分布パターンを模
倣する（Ｍｅｓｕｌａｍ、２０００）。したがって、ＡＤ ３ｘｔｇマウスモデルは、ヒ
トＡＤとの多くの類似性を示し、病原的に影響された脳領域および正常脳領域中でのＨｓ
ｐ９０阻害剤の効果および保持を試験する機会を提供する。
脳および血漿薬剤濃度の決定。ＨＣｌ塩としての化合物ＰＵ−ＨＺ１５１の水溶液を、
示された用量で３ｘＴｇ ＡＤマウス（３５ｇの平均体重）に腹腔内投与した。ＭＳＫＣ
Ｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍ
ｉｔｔｅｅにより認可されたプロトコルに従って処置した後、様々な時点でＣＯ2安楽死
により、マウスを殺傷した。半脳を皮質辺縁領域と皮質下領域に分離し、液体窒素中で急
速凍結し、−８０℃で保存した。血漿を、氷中で冷却した１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆチューブ中に採取し、遠心分離にかけた血液から取得した。凍結脳組織を乾燥し、計量
した後、アセトニトリル／Ｈ2Ｏ（３：７）中でホモジェナイズした。混合物を塩化メチ
レンで抽出し、有機層を分離し、減圧下で乾燥した。血漿（５０μＬ）をアセトニトリル
（０．２５ｍＬ）と混合し、遠心分離した。得られた上清を減圧下で乾燥した。試料を移
動相中で再構成させた。脳および血漿中の化合物の濃度を、高速ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより
決定した。内部標準としてハロペリドールを添加した。化合物分析を、陽イオン電子スプ
レーイオン化を用いる多反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで６４１０ ＬＣ−ＭＳ／Ｍ
Ｓシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で実施した。Ｚｏｒｂａｘ
Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ）をＬＣ分離
のために使用し、分析物をイソクラチック条件（６５％Ｈ2Ｏ＋０．１％ＨＣＯＯＨ：３
５％ＣＨ3ＣＮ）下、０．３５ｍｌ／分の流量で５分間溶出させた。
薬力学的分析：タンパク質分析のために選択された脳領域（海馬）をＳＤＳ溶解バッフ
ァー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２％ＳＤＳ）中でホモジェナイズし、ウェスタ
ンブロット分析にかけた。タンパク質のレベルを、抗Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０抗体を
用いる免疫ブロッティングにより分析した。
７．態様
本発明を、以下の番号付段落に列挙される以下の態様により例示することができる。
１．腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定する
ための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細胞中に存
在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する検出可能に標識されたＨＳＰ９０
阻害剤と接触させるステップ；
（ｂ）腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を測
定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または試料中の腫瘍細胞に結合した標識ＨＳ
Ｐ９０阻害剤の量を、正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量と比較す
るステップを含み、ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識され
たＨＳＰ９０阻害剤の量が参照量と比較してより多い場合、腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤に応
答する可能性があることを示す方法。
２．ステップ（ｂ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０
阻害剤の量と参照量との比が大きくなるほど、ＨＳＰ９０阻害剤療法に応答する可能性の
規模が大きくなる、態様１に記載の方法。
３．ステップ（ａ）で測定された腫瘍または腫瘍細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０
阻害剤の量が大きくなるほど、ＨＳＰ９０阻害剤療法に応答する可能性の規模が大きくな
る、態様１に記載の方法。
４．正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量が、腫瘍に由来する細胞
を含有する試料中の正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量である、態様１
に記載の方法。
５．正常細胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量が、参照試料中の正常細
胞に結合した標識されたＨＳＰ９０阻害剤の所定量である、態様１に記載の方法。
６．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が蛍光標識される、態様１に記載の方法。
７．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤がビオチン標識される、態様１に記載の方
法。
８．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射性標識される、態様１に記載の方法
。
９．腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽
球性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、多発性骨髄腫、基底細胞がん、メラノ
ーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺
がん、乳がん、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝
臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ
腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸が
ん、および子宮内膜がんを含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、態
様１に記載の方法。
１０．がんが乳がんである、態様９に記載の方法。
１１．がんが白血病である、態様９に記載の方法。
１２．白血病が慢性骨髄性白血病である、態様１１に記載の方法。
１３．がんが胃がんである、態様９に記載の方法。
１４．がんが膵臓がんである、態様９に記載の方法。
１５．腫瘍細胞が腫瘍幹細胞である、態様１に記載の方法。
１６．ステップ（ａ）において、腫瘍が接触され、被験体中に存在する、態様１に記載
の方法。
１７．ステップ（ａ）において、腫瘍細胞を含有する試料が接触され、組織試料である
、態様１に記載の方法。
１８．組織試料が、生検、微細針吸引生検または外科的手順の間に得られた試料である
、態様１に記載の方法。
１９．ステップ（ａ）において、試料が接触され、生物学的液体を含む、態様１に記載
の方法。
２０．生物学的液体が血液または骨髄である、態様１９に記載の方法。
２１．ステップ（ａ）において、試料が接触され、破壊された腫瘍細胞を含む、態様１
に記載の方法。
２２．ステップ（ａ）において、試料が接触され、生細胞を含む、態様１に記載の方法
。
２３．ステップ（ａ）において、試料が接触され、凍結細胞を含む、態様１に記載の方
法。
２４．ステップ（ａ）において、試料が接触され、固定された、および透過処理された
細胞を含む、態様１に記載の方法。
２５．ステップ（ａ）において、試料が接触され、ホルマリン固定、パラフィン包埋細
胞を含む、態様１に記載の方法。
２６．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される標識された形
態のＨＳＰ９０阻害剤である、態様１に記載の方法。
２７．療法として投与されるＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類
似体、相同体もしくは誘導体である、態様１に記載の方法。
２８．ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１である、態様２７に記載の方法。
２９．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の
類似体、相同体もしくは誘導体の形態である、態様１に記載の方法。
３０．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１の形態である、態様１
に記載の方法。
３１．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、
態様３０に記載の方法。
３２．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ２またはＰ
Ｕ−Ｈ７１−ＮＢＤ１である、態様３０に記載の方法。
３３．検出可能に標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１のビオチン化された類
似体である、態様３０に記載の方法。
３４．ＰＵ−Ｈ７１のビオチン化された類似体が、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−５、ＰＵ
−Ｈ７１−ビオチン−６、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−８またはＰＵ−Ｈ７１−ビオチン−
９である、態様３３に記載の方法。
３５．画像化できる腫瘍を有するがん患者がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答す
る可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９
０に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の複数の時点での患者の腫瘍による放射標識さ
れたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）における投与後の同じ複数の時点での患者の所定の健康な組織
による放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）における複数の時点で測定された取込みと、ステップ（ｃ）に
おける同じ時点で測定された取込みとの比を算出するステップ；ならびに
（ｅ）がん患者がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性を決定するステ
ップを含み、複数の時点でステップ（ｄ）において算出された比が２を超える場合、患者
が応答する可能性があることを示す方法。
３６．腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎
細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳
がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門が
んを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型
Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを
含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、態様３５に記載の方法。
３７．がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、態様
３６に記載の方法。
３８．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される放射標識された形態
のＨＳＰ９０阻害剤である、態様３５に記載の方法。
３９．療法として投与されるＨＳＰ９０阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の
類似体、相同体もしくは誘導体である、態様３６に記載の方法。
４０．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である
、態様３５に記載の方法。
４１．放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、態様４
０に記載の方法。
４２．画像化できる腫瘍を有するがん患者が所定の用量のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる
療法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍中または腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９
０に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の複数の時点での患者の腫瘍による放射標識さ
れたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）所定の用量のＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｂ）におけるそのような
複数の時点で測定された取込みに基づいて、そのような複数の時点のそれぞれでの患者の
腫瘍中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を算出するステップ；および
（ｄ）腫瘍を処置するのに有効であるＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｃ）で
算出されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を、そのような複数の時点で腫瘍中の存在する必要が
あるＨＳＰ９０阻害剤の参照濃度と比較するステップを含み、ステップ（ｃ）で算出され
たＨＳＰ９０阻害剤の濃度が、腫瘍を有効に処置するのに必要とされるＨＳＰ９０阻害剤
の濃度と等しいか、またはそれを超え、患者に対して毒性的でない場合、患者が所定の用
量のＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性がある方法。
４３．腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎
細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳
がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門が
んを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型
Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを
含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、態様４０に記載の方法。
４４．がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、態様
４３に記載の方法。
４５．療法として投与されるＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類
似体、相同体もしくは誘導体である、態様４２に記載の方法。
４６．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
態様４２に記載の方法。
４７．放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、態様４
６に記載の方法。
４８．画像化できる腫瘍を有する特定のがん患者について、ＨＳＰ９０の阻害剤を用い
る療法に関する有効用量および投与頻度を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先
的に結合する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の複数の時点での患者の腫瘍による放射標識さ
れた形態のＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるそのような時点で測定された取込みに基づいて、その
ような複数の時点のそれぞれにおいて、腫瘍を処置するのに有効であるＨＳＰ９０阻害剤
の濃度を腫瘍中で維持するのに必要とされる用量および投与頻度を算出し、それによって
、がん患者について、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に関する有効用量および投与頻度
を決定するステップを含む方法。
４９．腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎
細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳
がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門が
んを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型
Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを
含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、態様４８に記載の方法。
５０．がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、態様
４９に記載の方法。
５１．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が療法として投与される放射標識された形態の
ＨＳＰ９０阻害剤である、態様４８に記載の方法。
５２．療法として投与されるＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類
似体、相同体もしくは誘導体である、態様４８に記載の方法。
５３．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
態様４８に記載の方法。
５４．放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、態様５
３に記載の方法。
５５．がん患者における画像化できる腫瘍中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を決定
するための方法であって、
（ａ）患者に、所定量のＨＳＰ９０阻害剤と、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍
特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する、所定量の放射標識された形態のＨＳＰ９０
阻害剤とを同時投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における同時投与後の１つ以上の規定の時点で患者の腫瘍によ
る放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを定期的に測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）における放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みの測定値に
基づいて、任意のそのような時点で腫瘍中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を決定する
ステップを含む方法。
５６．腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎
細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳
がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門が
んを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型
Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを
含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、態様５４に記載の方法。
５７．がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、態様
５６に記載の方法。
５８．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が療法として投与される放射標識された形態の
ＨＳＰ９０阻害剤である、態様５５に記載の方法。
５９．療法として投与されるＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類
似体、相同体もしくは誘導体である、態様５５に記載の方法。
６０．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
態様５５に記載の方法。
６１．放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、態様６
０に記載の方法。
６２．がん患者における画像化できる腫瘍のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に対する
応答性を決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合
する放射標識された形態のＨＳＰ９０阻害剤を、患者が療法としてＨＳＰ９０の阻害剤を
受けている期間内の複数の時点で患者に投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後のそのような複数の時点で、患者の腫瘍中の放
射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定された放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を
、腫瘍を有効に処置するのに必要とされるＨＳＰ９０阻害剤の最小濃度と比較するステッ
プを含み、腫瘍を処置するのに必要とされる最小濃度よりも測定された濃度が高い場合、
患者がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があることを示す方法。
６３．腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎
細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳
がん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門が
んを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型
Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを
含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、態様６２に記載の方法。
６４．がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、態様
６３に記載の方法。
６５．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が療法として投与される放射標識された形態の
ＨＳＰ９０阻害剤である、態様６２に記載の方法。
６６．療法として投与されるＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類
似体、相同体もしくは誘導体である、態様６２に記載の方法。
６７．放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
態様６２に記載の方法。
６８．放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［124Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、態様６
７に記載の方法。
６９．患者中に存在するヒトがんがＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性が
あるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）ＨＳＰ９０タンパク質を単独で、またはそれに加えてＨＳＰ７０タンパク質を
発現する、患者のがんに由来する細胞を含有する試料を取得するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた試料中に存在する細胞について、以下のパラ
メータ：活性化されたＡＫＴ経路、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の機能もしくは発現における異
常、活性化されたＳＴＡＴ５経路、またはＢｃｌ−ｘＬタンパク質発現のうちの少なくと
も１つの存在を評価するステップ；および
（ｃ）ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答した１人以上のがん患者に由来するヒト
がん細胞について、ステップ（ｂ）において得られた評価を、ステップ（ｂ）で評価され
た同じパラメータまたは複数のパラメータの所定の参照評価と比較して、それにより患者
のがんがＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するステ
ップを含む方法。
７０．ヒトがんが乳がんである、態様６９に記載の方法。
７１．がん細胞が急性骨髄性白血病と関連する、態様６９に記載の方法。
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本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１）
腫瘍がＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決定するため
の方法であって、
（ａ）前記腫瘍または前記腫瘍に由来する細胞を含有する試料を、腫瘍または腫瘍細
胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９
０阻害剤と接触させるステップ；
（ｂ）前記腫瘍または前記試料中の前記腫瘍細胞に結合した放射標識されたＨＳＰ９
０阻害剤の量を測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された前記腫瘍または前記試料中の前記腫瘍細胞に結合
した放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量を、参照に結合した放射標識されたＨＳＰ９０
阻害剤の量と比較するステップを含み、ステップ（ｂ）で測定された前記腫瘍または前記
腫瘍細胞に結合した放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の量が前記参照量と比較してより多
い場合、前記腫瘍が前記ＨＳＰ９０阻害剤に応答する可能性があることを示す方法。
（項２）
ステップ（ｂ）で測定された前記腫瘍または前記腫瘍細胞に結合した放射標識されたＨ
ＳＰ９０阻害剤の量と前記参照量との比が大きくなるほど、前記ＨＳＰ９０阻害剤療法に
応答する可能性の規模が大きくなる、上記項１に記載の方法。
（項３）
ステップ（ａ）で測定された前記腫瘍または前記腫瘍細胞に結合した放射標識されたＨ
ＳＰ９０阻害剤の量が大きくなるほど、前記ＨＳＰ９０阻害剤療法に応答する可能性の規
模が大きくなる、上記項１に記載の方法。
（項４）
正常細胞に結合した前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の前記参照量が、前記腫瘍に
由来する細胞を含有する前記試料中の正常細胞に結合した前記放射標識されたＨＳＰ９０
阻害剤の量である、上記項１に記載の方法。
（項５）
正常細胞に結合した前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の参照量が、参照試料中の正
常細胞に結合した前記標識されたＨＳＰ９０阻害剤の所定量である、上記項１に記載の方
法。
（項６）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が 124 Ｉまたは 131 Ｉで標識される、上記項１〜５
のいずれか一項に記載の方法。
（項７）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、多発性骨髄腫、基底細胞がん、メ
ラノーマ、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含
む肺がん、乳がん、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん
、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リ
ンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮
頸がん、および子宮内膜がんを含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する
、上記項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項８）
前記がんが乳がんである、上記項７に記載の方法。
（項９）
前記がんが肺がんである、上記項７に記載の方法。
（項１０）
前記がんがリンパ腫である、上記項７に記載の方法。
（項１１）
前記がんが胃がんである、上記項７に記載の方法。
（項１２）
前記がんが膵臓がんである、上記項７に記載の方法。
（項１３）
前記腫瘍細胞が腫瘍幹細胞である、上記項１に記載の方法。
（項１４）
ステップ（ａ）において、前記腫瘍が接触され、被験体中に存在する、上記項１に記載
の方法。
（項１５）
ステップ（ａ）において、腫瘍細胞を含有する前記試料が接触され、組織試料である、
上記項１に記載の方法。
（項１６）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される標識された形態の前記
ＨＳＰ９０阻害剤である、上記項１に記載の方法。
（項１７）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項１８）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似体、
相同体もしくは誘導体の形態である、上記項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項１９）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１の形態である、上記項１８に記載
の方法。
（項２０）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項１〜
１９のいずれか一項に記載の方法。
（項２１）
固形または液性腫瘍がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどう
かを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態の
ＨＳＰ９０に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記投与後の１つ以上の時点で前記患者の腫瘍による
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）における前記投与後の前記１つ以上の時点で前記患者の所定の
健康な組織による前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）において複数の時点で測定された前記取込みと、ステップ（ｃ
）において同じ時点で測定された前記取込みとの比を算出するステップ；および
（ｅ）前記腫瘍がＨＳＰ９０の前記阻害剤を用いる療法に応答する可能性を決定する
ステップを含み、１つまたは複数の時点でのステップ（ｄ）で算出された比が２より大き
い場合、前記腫瘍が応答する可能性があることを示す方法。
（項２２）
１つまたは複数の時点でのステップ（ｄ）で算出された比が２．５より大きい場合、前
記腫瘍が応答する可能性があることを示す、上記項２１に記載の方法。
（項２３）
１つまたは複数の時点でのステップ（ｄ）で算出された比が３より大きい場合、前記腫
瘍が応答する可能性があることを示す、上記項２２に記載の方法。
（項２４）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆
嚢がん、肛門がんを含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびび
まん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および
子宮内膜がんを含む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項２１〜
２３のいずれか一項に記載の方法。
（項２５）
前記がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、上記項
２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項２６）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される放射標識された形態の
前記ＨＳＰ９０阻害剤である、上記項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項２７）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項２８）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
上記項２７に記載の方法。
（項２９）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項２
８に記載の方法。
（項３０）
画像化できる腫瘍がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうか
を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態の
ＨＳＰ９０に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記投与後の４時間を超える１つ以上の時点で前記患
者の腫瘍による前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップを含み
、前記腫瘍の周囲の健康な組織における取込みと比較した前記１つ以上の時点での阻害剤
の取込みが、前記腫瘍がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があることを
示す方法。
（項３１）
放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の前記取込みが、ステップ（ａ）における投与後の８
時間以上の１つ以上の時点で測定される、上記項３０に記載の方法。
（項３２）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される放射標識された形態の
前記ＨＳＰ９０阻害剤である、上記項３０または３１に記載の方法。
（項３３）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項３４）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
上記項３３に記載の方法。
（項３５）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項３
４に記載の方法。
（項３６）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がん
を含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含
む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項３０〜３５のいずれか一
項に記載の方法。
（項３７）
前記がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、上記項
３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項３８）
画像化できる腫瘍がＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうか
を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態の
ＨＳＰ９０に優先的に結合する放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の投与後２時間
以上の１つ以上の時点で前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中での前記放射標識された
阻害剤の取込みをＰＥＴにより視覚的に検査するステップ、
（ｃ）前記１つ以上の時点で、ステップ（ｂ）で得られたＰＥＴ画像を、前記腫瘍の
周囲の健康な組織中で得られたＰＥＴ画像と比較するステップを含み、前記１つ以上の時
点で前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中の前記ＰＥＴ画像における明るい領域の存在
が、前記患者がＨＳＰ９０阻害療法に応答する可能性があることを示す方法。
（項３９）
ステップ（ａ）における前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の投与後の４時間以上の
１つ以上の時点で前記ＰＥＴ画像が取得される、上記項３８に記載の方法。
（項４０）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される放射標識された形態の
前記ＨＳＰ９０阻害剤である、上記項３８または３９に記載の方法。
（項４１）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項４２）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
上記項４１に記載の方法。
（項４３）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項４
２に記載の方法。
（項４４）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がん
を含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含
む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項３８〜４３のいずれか一
項に記載の方法。
（項４５）
前記がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、上記項
３８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項４６）
発がん性ＨＳＰ９０を発現する特定の腫瘍が規定用量のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療
法に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）そのような腫瘍を有する患者に、前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中に存
在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する放射標識された形態の前記ＨＳＰ
９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記投与後の１つ以上の時点で前記患者の腫瘍による
前記放射標識された形態の前記ＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）前記規定用量の前記ＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｂ）における前記
１つ以上の時点で測定された前記取込みに基づいて、前記１つ以上の時点のそれぞれにお
いて前記患者の腫瘍中に存在する前記ＨＳＰ９０阻害剤の濃度を算出するステップ；およ
び
（ｄ）前記腫瘍を処置するのに有効である前記ＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ
（ｃ）で算出された前記ＨＳＰ９０阻害剤への前記腫瘍の曝露を、前記１つ以上の時点で
前記腫瘍中に存在する必要がある前記ＨＳＰ９０阻害剤への参照曝露と比較するステップ
を含み、ステップ（ｃ）で算出された前記ＨＳＰ９０阻害剤への前記腫瘍曝露が前記参照
曝露と等しいか、またはそれを超える場合、前記腫瘍が前記規定用量の前記ＨＳＰ９０阻
害剤を用いる療法に応答する可能性がある方法。
（項４７）
画像化できる腫瘍が規定用量のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に応答する可能性があ
るかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）患者に、前記腫瘍中または前記腫瘍の腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態の
ＨＳＰ９０に優先的に結合する放射標識された形態の前記ＨＳＰ９０阻害剤を投与するス
テップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における投与後の１つ以上の時点で前記患者の腫瘍による前記
放射標識された形態の前記ＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；
（ｃ）前記規定用量の前記ＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ（ｂ）における前記
１つ以上の時点で測定された取込みに基づいて、前記１つ以上の時点のそれぞれにおいて
前記患者の腫瘍中に存在する前記ＨＳＰ９０阻害剤の濃度を算出するステップ；および
（ｄ）前記腫瘍を処置するのに有効である前記ＨＳＰ９０阻害剤について、ステップ
（ｃ）で算出された前記ＨＳＰ９０阻害剤の前記濃度を、前記１つ以上の時点で前記腫瘍
中に存在する必要がある前記ＨＳＰ９０阻害剤の参照濃度と比較するステップを含み、ス
テップ（ｃ）で算出された前記ＨＳＰ９０阻害剤の前記濃度が前記参照濃度と等しいか、
またはそれを超える場合、前記腫瘍が前記規定用量の前記ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法
に応答する可能性がある方法。
（項４８）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項４
６または４７に記載の方法。
（項４９）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がん
を含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含
む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項４６〜４８のいずれか一
項に記載の方法。
（項５０）
画像化できる腫瘍について、ＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に関する有効用量および
投与頻度を決定するための方法であって、
（ａ）患者に、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先
的に結合する放射標識された形態の前記ＨＳＰ９０阻害剤を投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記投与後の１つ以上の時点で前記患者の腫瘍による
前記放射標識された形態の前記ＨＳＰ９０阻害剤の取込みを測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記１つ以上の時点で測定された前記取込みに基づい
て、前記１つ以上の時点のそれぞれにおいて、前記腫瘍を処置するのに有効である前記Ｈ
ＳＰ９０阻害剤の濃度を前記腫瘍中で維持するのに必要とされる用量および投与頻度を算
出し、それによって、前記がん患者について、ＨＳＰ９０の前記阻害剤を用いる療法に関
する前記有効用量および前記投与頻度を決定するステップを含む方法。
（項５１）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がん
を含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含
む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項５０に記載の方法。
（項５２）
前記がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、上記項
５１に記載の方法。
（項５３）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、療法として投与される放射標識されたＨＳＰ
９０阻害剤である、上記項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項５４）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項５３に記載の方法。
（項５５）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が、放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、
上記項５４に記載の方法。
（項５６）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項５
０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項５７）
がん患者における画像化できる腫瘍中に存在するＨＳＰ９０阻害剤の濃度を決定するた
めの方法であって、
（ａ）患者に、所定量のＨＳＰ９０阻害剤と、腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍
特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合する、所定量の放射標識された形態の前記ＨＳＰ
９０阻害剤とを同時投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記同時投与後の１つ以上の予め規定された時点で前
記患者の腫瘍による前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の取込みを定期的に測定するス
テップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の前記取込みの
測定値に基づいて、任意のそのような時点で前記腫瘍中に存在する前記ＨＳＰ９０阻害剤
の前記濃度を決定するステップを含む方法。
（項５８）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がん
を含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含
む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項５７に記載の方法。
（項５９）
前記がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、上記項
５８に記載の方法。
（項６０）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が療法として投与される放射標識された形態の前
記ＨＳＰ９０阻害剤である、上記項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項６１）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項６０に記載の方法。
（項６２）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、上記項６１に記載の方法。
（項６３）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項５
７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項６４）
がん患者における画像化できる腫瘍のＨＳＰ９０の阻害剤を用いる療法に対する応答性
を決定するための方法であって、
（ａ）腫瘍または腫瘍細胞中に存在する腫瘍特異的形態のＨＳＰ９０に優先的に結合
する放射標識された形態の前記ＨＳＰ９０阻害剤を、前記患者が療法としてＨＳＰ９０の
阻害剤を受けている期間内の１つ以上の時点で前記患者に投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）における前記投与後の前記１つ以上の時点で、前記患者の腫瘍
中の前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の濃度を測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤の前記濃度
を、前記腫瘍を有効に処置するのに必要とされる前記ＨＳＰ９０阻害剤の最小濃度と比較
するステップを含み、前記腫瘍を処置するのに必要とされる前記最小濃度よりも測定され
た濃度が高い場合、前記患者が前記ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があ
ることを示す方法。
（項６５）
前記腫瘍が、結腸直腸がん、膵臓がん、甲状腺がん、基底細胞がん、メラノーマ、腎細
胞がん、膀胱がん、前立腺がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、乳が
ん、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆嚢がん、肛門がん
を含む消化管がん、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫を含むリンパ腫、ならびに卵巣がん、子宮頸がん、および子宮内膜がんを含
む婦人科がんからなる群から選択されるがんと関連する、上記項６４に記載の方法。
（項６６）
前記がんが乳がん、リンパ腫、神経芽細胞腫、胃がん、または膵臓がんである、上記項
６５に記載の方法。
（項６７）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が療法として投与される放射標識された形態の前
記ＨＳＰ９０阻害剤である、上記項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項６８）
療法として投与される前記ＨＳＰ９０阻害剤がＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の類似
体、相同体もしくは誘導体である、上記項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項６９）
前記放射標識されたＨＳＰ９０阻害剤が放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１である、上記項６８に記載の方法。
（項７０）
前記放射標識された形態のＰＵ−Ｈ７１が［ 124 Ｉ］−ＰＵ−Ｈ７１である、上記項６
４〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項７１）
患者中に存在するヒトがんがＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるか
どうかを決定するための方法であって、
（ａ）ＨＳＰ９０タンパク質を単独で、またはそれに加えてＨＳＰ７０タンパク質を
発現する、患者のがんに由来する細胞を含有する試料を取得するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記試料中に存在する前記細胞について、以下のパ
ラメータ：活性化されたＡＫＴ経路、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子の機能もしくは発現における
欠陥、活性化されたＳＴＡＴ５経路、またはＢｃｌ−ｘＬタンパク質発現のうちの少なく
とも１つの存在を評価するステップ；および
（ｃ）前記ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答した１人以上のがん患者に由来する
ヒトがん細胞について、ステップ（ｂ）で得られた前記評価を、ステップ（ｂ）で評価さ
れた同じパラメータまたは複数のパラメータの所定の参照評価と比較して、それにより前
記患者のがんが前記ＨＳＰ９０阻害剤を用いる療法に応答する可能性があるかどうかを決
定するステップを含む方法。
（項７２）
前記ヒトがんが乳がんである、上記項７１に記載の方法。
（項７３）
前記がん細胞が急性骨髄性白血病と関連する、上記項７１に記載の方法。
（項７４）
化学式：

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩。
（項７５）
化学式：

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩。
（項７６）
化学式：

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩。
（項７７）
化学式：

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩。
（項７８）
化学式：

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩。
（項７９）
上記項７４〜７８のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
（項８０）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有するヒト患者を処置する方法であって、十分な量の以下の式
：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与して、前記化合物の投
与後約１６時間〜約２４時間の少なくとも１つの時点で前記患者の腫瘍中の発がん性ＨＳ
Ｐ９０の少なくとも１５％の占拠率を提供することを含む方法。
（項８１）
１０時間〜２４時間の全範囲において、前記患者の腫瘍中の前記発がん性ＨＳＰ９０の
少なくとも１５％の占拠率から、前記患者の腫瘍中の前記発がん性ＨＳＰ９０の１００％
の占拠率を達成する最小用量を提供する十分な量の前記化合物を投与することを含む、上記項８０に記載の方法。
（項８２）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有する患者を処置する方法であって、十分な量の以下の式：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与して、約０．３μＭ〜
約７．５μＭの範囲の投与後約２４時間での腫瘍内濃度を提供することを含む方法。
（項８３）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有する患者を処置する方法であって、十分な量の以下の式：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与して、約０．０５μＭ
〜約３．５μＭの範囲の投与後約４８時間での腫瘍内濃度を提供することを含む方法。
（項８４）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有する患者を処置する方法であって、十分な量の以下の式：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与して、約１５０〜約４
，０００μＭ−ｈの新規処置サイクルの開始後のＡＵＣ 0〜336h を提供することを含む方
法。
（項８５）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有する患者を処置する方法であって、十分な量の以下の式：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与して、約７５〜約２，
０００μＭ−ｈの新規処置サイクルの開始後のＡＵＣ 0〜168h を提供することを含む方法
。
（項８６）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有する患者を処置する方法であって、十分な量の以下の式：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与して、約０．５μＭ〜
約７．５μＭの０〜３３６時間の［ＰＵ−Ｈ７１］ avg を提供することを含む方法。
（項８７）
ＨＳＰ９０依存的腫瘍を有する患者を処置する方法であって、１週間休みに先立つ、週
１回、週２回、および週２回から選択される投与スケジュールに従って、約５ｍｇ／ｍ２
〜約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で、十分な量の以下の式：

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。

Claims (1)

  1. 明細書または図面に記載の発明。

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