KR102138218B1 - 표지된 ｈｓｐ90 억제제의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 생체외 및 생체내 방법을 포함하는, HSP90 억제제를 사용한 암 환자의 치료를 개선시키기 위해 표지된 HSP90 억제제를 사용하는 다양한 방법에 관한 것이다.

Description

표지된 ＨＳＰ90 억제제의 용도{USES OF LABELED HSP90 INHIBITORS}
본 발명은, 종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 생체외 및 생체내 방법을 포함하는, HSP90 억제제를 사용한 암 환자의 치료를 개선시키기 위해 표지된 HSP90 억제제를 사용하는 다양한 방법에 관한 것이다.
항상성을 유지하기 위해, 세포는 잘 규정된 기능을 수행하도록 프로그래밍된 수천개 단백질로 이루어진 복잡한 분자 기구를 사용한다. 이들 경로의 조절이상은, 단백질 오발현 또는 돌연변이를 통해, 악성 표현형을 부여하는 생물학적 잇점을 유도할 수 있다. 세포 수준에서 이러한 조절이상은 유리할 수 있지만(즉, 생존 증가의 조장), 분자 수준에서 이는 이들 단백질의 안정성 및 기능의 유지에 있어서 세포가 에너지를 투자하게 한다. 가안정(pseudo-stable) 상태에서 이들 단백질을 유지하기 위해, 암세포는 HSP90을 포함하는 분자 샤페론을 흡수한다32 .33.
이러한 가설을 지원하여, HSP90은 형질전환된 표현형을 유지하는데 있어서 중요한 역활을 담당하는 것으로 인식되어 있다32 ,33. HSP90 및 이의 관련 공-샤페론은, 집합적으로 "클라이언트 단백질"로서 지칭되는, 세포 단백질의 정확한 배좌 폴딩을 보조하고, 대부분은 세포 성장, 분화, DNA 손상 반응 및 세포 생존을 조절하는 신호 형질도입 경로의 효과기이다. 따라서, 비조절된 단백질(즉, 돌연변이, 이상 발현, 부적절한 세포 전좌 등을 통해)에 대한 종양 세포 의존성은 중요하게는 HSP90에 의존적으로 될 수 있다33.
다양한 형태의 암에서 HSP90 치료에 대한 원리는 표준 치료에 내성이 있는 질환을 포함하여 임상전 및 임상 연구에 의해 현재 잘 뒷받침되고 있다91 -97. 예를 들면, 연구들은 HSP90 억제제에 대한 특정 HER2+ 종양의 현저한 감수성을 증명했다98 ,99. 이들 종양에서,17-AAG(또한 타네스리마이신으로 불리움) 및 17-DMAG(알베스피마이신)은 심지어 및 특히 트라스투주맵 치료 후에 진행성 질환을 갖는 환자에서 반응을 유도했다98. PU-H71 등의 기타 HSP90 억제제는, 다수의 삼중 음성 유방암 마우스 모델에서 임상전에 시험하는 경우, 이러한 난치 유방암 아형에서 보고된 가장 강력한 단일-제제 항-종양 효과를 산출했다100.
이들 데이터는 암에서 HSP90 억제제의 용도를 강력하게 뒷받침하지만, HSP90 치료로부터 가장 유리할 것 같은 이들 환자를 확인하는 방법에 대한 명백한 합의는 현재 존재하지 않는다101 ,102. 이는, 표적화된 제제의 성공적 개발을 위해서는 약물을 제공해야 하는 환자 부분모집단을 규정하는 것이 필수적이라는 점에서 특히 문제가 되는 지식이다(즉, 타세바의 경우에 EGFR 돌연변이를 갖는 종양). 이러한 선택은 비효과적 치료를 제공한 환자의 수를 감소시킬 수 있고, 후기 임상 실험에서 실패하는 표적화된 종양 제제의 압도적 수를 감소시킬 수 있다.
추가로, HSP90-표적 억제를 비침략적으로 확인할 수 있는 임상적 분석법이 없다. 말초혈 림프구의 약동학적 모니터링은 임상 실험에서 HSP90 억제제의 생체내 생물학적 활성의 용이하게 접근가능한 및 재현가능한 지수를 제공하였지만, 정상 조직에서 약물 효과는 종양-특이적 활성을 예상하지 못한다97 ,101,102. 약동학 변화를 측정하기 위한 생검법의 현명한 사용은 표적 조절을 위한 중요한 분석 방식을 유지했지만, 이 방법은 침략적 분석법과 관련된 논리적 및 윤리적 문제로 인해 제한되었다. 또 다른 방안으로서, 종양 HER2 및 VEGF 수준에서의 변화가 지르코니움 89 표지된 항체103 ,104 및 ELISA에 의한 환자 혈청 중의 가용성 HER2 세포외 도메인 수준105을 사용하여 현재 연구되고 있지만, 이들 연구는 이들 생물마커를 발현하는 유방 종양의 서브세트로 제한되고 있다.
따라서, HSP90 표적화된 치료에서 생물마커에 대한 강력한 요구가 존재한다: 대다수의 암 환자는, 대부분의 경우, 특정 제제의 작용 기작, 상이한 질환 서브세트에 대한 특정 치료의 적합성에 대한 약간의 통찰력, 및 상이한 악성 세팅에 대한 최적 용량 및 치료 계획에 대한 약간의 지식과 함께, 신규한 실험 치료법으로 치료된다. 최종 결과는 경험적 임상 조사이고, 여기서 난치성 악성종양을 갖는 환자는 치료적 방법이 상이한 임상적 환경에 대해 최상이라는 지식 없이 다양한 신규 제제로 치료된다.
HSP90은 발암성(oncogenic) 형질전환에 수반된 단백질의 안정화 및 폴딩에서 이의 중요한 역활 때문에 암에서 고도로 탐구되는 표적이다. 상이한 종양단백질의 수를 저하시키고 복수의 신호전달 경로에 영향을 미칠 가능성이 있으면, HSP90 억제제(HSP90i)는 광범위한 암에서 활성적인 것으로 가정되었다. 초기 임상 실험은 종양 서브세트에서 이러한 방법의 치료적 가능성을 확인시켰지만, 암 및 환자 모집단이 이러한 치료에 대부분 감수성일 것임을 예상하는 생물마커의 발견은 도전을 증명했다. 적절한 환자 모집단의 이러한 불충분한 이해 및 선택은 서서히 진행하는 다수의 최근 HSP90 암 치료법 및 지속적 개발의 실패를 유도한다. 따라서, 반응성 모집단을 확인하고 HSP90 치료에 대한 동반 진단 분석법을 개발하기 위한 즉시 노력이 긴급히 요구되고 있다.
또한, 항-종양 효능을 달성하는데 필요한 적절한 용량 및 계획의 설계는 HSP90 치료에서 불충분하게 이해된다. 혈장 약동학은 일반적으로, 전신 약물 노출의 척도로서 종종 곡선하 혈장 면적(AUC)와 함께, 치료학적 투약의 설계에 대한 정보를 제공하는 데이터를 제공한다. 그러나, HSP90 억제제의 경우, 혈액이 아닌 종양 조직에서 약물의 농도 및 체류 기간은 이들의 항-종양 효과를 결정한다106 -109. 구체적으로, 대부분의 HSP90 억제제는 혈장 및 정상 조직으로부터 신속한 정화의 비전형적 약동학 프로파일을 특징으로 하지만, 종양에서 비교적 연장된 약물 체류를 특징으로 한다(즉, 투여후 12 내지 48시간에 걸쳐). 이와 같이, HSP90 치료에 대한 종양 반응의 임상적 이해는, 반응이 종양 용량보다는 주사된 용량과 관련되지의 여부로 심각하게 제한된다. 종양 반응에 대한 혈장 약동학의 종양 용량의 한계치 및 종양 용량의 중요성은 HSP90 억제제를 위한 종양 약동학 분석의 임상적 개발에 대한 필요성을 시사한다. 종양 HSP90의 입증된 임상적 실시 비-침입성 분석법은 대용의 정상-상태 혈장 농도보다는 정상-상태 종양 약물 농도의 달성을 중심으로 치료학적 투약을 가능하게 할 것이다. 이러한 분석법은 최대 허용 용량 이하에서 치료학적으로 효과적인 종양 농도가 달성될 수 있는지를 나타낼 수 있다. 반대의 경우, 환자는 임상적 이익 없이 잠재적 약물 독성에 대한 불필요한 노출 없이 대체 치료를 추구할 수 있다.
HSP90 치료와 관련된 이들 한계를 극복하기 위해, 본 발명자들은, 암에서 HSP90 억제제의 최적 임상 수행, 개발 및 사용을 촉진시킬 수 있는 본 발명자들이 제안한 비-침략적 분석법을 본원에서 설계 및 개발한다.
본 발명은 HSP90 억제제를 사용한 암 환자의 치료를 개선시키기 위해 표지된 SHP90 억제제를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은, HSP90 발현 단독에 의해 지시되지 않는 이러한 특정 "발암성 HSP90" 종의 존재량이 HSP90 억제 치료에 대한 감수성을 예측하고, 따라서 HSP90 치료에 대한 생물마커라는 증거를 제공한다. 본 발명은 또한 종양에서 이러한 발암성 HSP90 종의 존재량을 확인 및 측정하는 것이 HSP90 치료에 대한 반응을 예측하는 증거를 제공한다. "발암성 HSP90"은, 세포 스트레스 특이적 형태의 샤페론 복합체를 나타내고, 종양 세포 환경에서 확장 및 구조적으로 유지되며, 악성 표현형을 유지하는데 필요한 기능을 실행할 수 있는 HSP90 분획으로 본원에서 정의된다. 이러한 역활은 과발현된(즉, HER2), 돌연변이된(즉, mB-Raf) 또는 키메라 단백질(즉, Bcr-Abl)의 폴딩을 조절할 뿐만 아니라, 비정상적으로 활성화된 신호전달 복합체(즉, STAT5, BCL6)에 수반된 분자의 스캐폴딩 및 복합체 형성을 촉진시킬 수 있다. 종양은 HSP90-종양단백질의 네트워크 상에서 생존에 대해 중독 상태로 되지만, 이들 단백질은 기능화 및 안정성에 대한 "발암성 HSP90"에 의존성으로 된다. 이러한 공생 상호 의존성은 HSP90에 대한 종양의 중독이 "발암성 HSP90"에 대한 중독에 동등함을 시사한다. 후자의 존재량을 측정하는 것은 최초의 판독이고, 따라서 본 발명에 따라 HSP90 치료 강화를 위한 생물마커이다.
추가로, 본 발명자들은 HSP90이 악성 세포에서 생화학적으로 독특한 복합체를 형성함을 나타낸다. 암세포 HSP90의 주요 분획은 정상 세포와 유사한 "관리" 샤페론 기능을 보유하지만, 암세포(즉, "발암성 HSP90")에서 풍부화 또는 확장된 기능적으로 독특한 HSP90 풀은 종양 세포 생존, 비정상 증식성 특징 및 침략적 및 대사적 거동을 유지하는데 요구되는 발암성 단백질과 특이적으로 상호작용한다.
"발암성 HSP90"의 존재량을 종양-대-종양 방식으로 측정하기 위해, 본 발명은 또한 화학적 도구를 제공한다. 이러한 도구는, 이러한 종양 "발암성 HSP90" 종을 특이적으로 동정하고 이와 상호작용하는, 형광 표지된 및 ANCA-표지된 HSP90 억제제, 비오티닐화 HSP90 억제제 및 방사선표지된 억제제를 포함하고, 이는 상이한 유형의 종양, 종양 세포, 종양-지지 세포 및 종양-관련 생물학적 형성체, 예를 들면, 조혈 악성종양, 고형 종양 및 액상 종양에서 "발암성 HSP90" 종의 존재량을 적절하게 측정하게 하여 HSP90 억제 치료에 대한 감수성을 측정 및 예측하게 한다. 이들은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 고형 또는 액상 종양, 암 간세포, 순환 종양 세포, 종양 지지 면역 세포, 엑소좀 및 종양-지지 간세포에서 암세포의 형태로 존재할 수 있다.
한 가지 측면에서, 본 발명은,
종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 세포를 함유하는 샘플을, 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계;
(b) 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 측정된 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 참조(reference)에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
단계 (b)에서 측정된 종양 또는 종양세포에 결합된 참조 양과 비교하여 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법이 제공한다.
한 가지 실시양태에서, 참조는 종양을 갖는 동일한 환자의 세포의 것이다. 참조는 암 환자의 정상 세포일 수 있다. 예를 들면, 정상 세포는 혈액 종양을 갖는 환자의 림프구, 순환 종양 세포를 갖는 환자의 백혈구 또는 고형 종양 주위의 정상 조직일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 참조는 종양 세포 또는, 발암성 HSP90을 거의 발현시키지 않거나 전혀 발현시키지 않는 암 환자의 또 다른 세포일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 참조는 종양을 갖는 환자와는 상이한 건강한 개체의 세포의 것일 수 있다. 예를 들면, 참조는 건강한 개체의 세포의 것이거나, 측정되는 종양을 갖는 환자 이외에 암 환자로부터 발암성 HSP90을 거의 발현시키지 않거나 전혀 발현시키지 않는 세포의 것일 수 있다.
한 가지 측면에서, 본 발명은 종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 세포를 함유하는 샘플을, 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 제1 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제 및 HSP90의 종양-특이적 형태에 최소 결합하거나 전혀 결합하지 않는 제2 검출가능하게 표지된 억제제와 접촉시키는 단계;
(b) 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 제1 표지된 억제제 및 제2 표지된 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 종양 또는 종양 세포에 결합된 제1 표지된 억제제의 양을 종양 또는 종양 세포에 결합된 제2 표지된 억제제의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
종양 또는 종양 세포에 결합된 제2 표지된 억제제와 비교하여 종양 또는 종양 세포에 결합된 제1 표지된 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
한 가지 실시양태에서, 표지된 HSP90 억제제는 세포 투과성이고 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합하는 형광 표지되거나 ANCA-표지된 억제제이다. 예를 들면, HSP90 억제제 PU-H71의 상이한 형광 표지된 및 ANCA-표지된 버젼이 제공되고, 이는 유동 세포계수를 위해 및 고형 또는 액상 종양, 암 간세포, 순환 종양 세포, 종양 지지 면역 세포, 엑소좀 및 종양-지지 간세포에서 발견되거나 이로부터 분리된 암세포의 분석을 위해, 및 생검, 수술 및 세침 흡인 등의 몇몇 개재 방법에 의해 수득된 샘플을 위한 조직 염색에 사용하기 위해 최적화될 수 있다.
이러한 한 가지 실시양태에서, 본 발명자들은 PU-H71-FITC2(섹션 5.2.1.1.) 등의 형광 표지된 억제제가 생검 및 수술 시료 등의 공급원으로부터 수득된 조직에서 "발암성 HSP90"의 존재량을 측정하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명자들은 PU-H71-FITC2 등의 형광 표지된 억제제가 확립된 암세포주 또는 일차 암세포에서 "발암성 HSP90"의 존재량을 측정하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명자들은 형광 표지된 억제제가 종양 등의 암 시료로부터 분리된 세포, 암 간세포, 순환 종양 세포 및 세침 흡인으로부터 수득된 암세포에서 "발암성 HSP90"의 존재량을 측정하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 다른 실시양태에서, 본 발명자들은 다른 형광 표지된, ANCA-표지된 및 비오티닐화된 HSP90 억제제가 상기 언급한 측정을 수행하는데 유용할 수 있음을 보여준다.
또 다른 실시양태에서, 표지된 HSP90 억제제는 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합하는 방사선표지된 억제제이다. 예를 들면, 상이한 버젼의 방사선표지된 PU-H71은 PET 영상화를 위해 최적화되었다. 특정 실시양태에서, 요오드 124 방사선표지된 버젼의 PU-H71은 고형 및 액상 종양의 PET 영상화를 위한 것이다. 방사선표지된 억제제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 결직장암, 췌장암, 갑상선암, 기저 세포 암종, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장 기질 종양, 식도암, 위암을 포함하는 위장암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌 종양, 여포성 림프종 및 확산 거대 B-세포 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병, 골수종, 골수증식성 종양, 및 난소암, 경부암 및 자궁내막암을 포함하는 부인과암을 포함하는 다수 형태의 일차 및 전이 암을 영상화하는데 사용될 수 있다.
본 발명은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 상기 수록된 종양 등의 고형 종양 및, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 림프종, 백혈병, 골수종 및 골수증식성 종양과 관련된 것들 등의 액상 종양에서 "발암성 HSP90"의 존재량을 종양-대-종양 방식으로 측정하는 수단을 제공한다. 한 가지 양태에서, 본 발명은 "발암성 HSP90"과 특이적으로 상호작용하는 요오드 124 표지된 HSP90 억제제를 사용함으로써 비-침략적 PET 영상화를 사용할 수 있고 환자, 고형 종양 및 액상 종양에서 "발암성 HSP90"을 정량화할 수 있음을 보여준다.
한 가지 측면에서, 본 발명은, 혈액암(예: 백혈병) 등의 조혈 악성종양을 갖는 환자가 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서, 환자의 암세포 및 참조 비-암세포를 함유하는 샘플을, 환자의 암세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 세포 투과성 형광 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계; 샘플 중의 암세포 및 비-암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및 암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 비-암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 비-암세포보다 암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
이러한 한 가지 양태에서, 참조 정상 세포는 암세포와 동일한 환자로부터 유래하는 정상 세포(예: 림프구)이다. 또 다른 양태에서, 참조 비-암세포는 암세포와는 상이한 환자로부터 수득된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 고형 종양을 갖는 환자가 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서, 환자의 암세포 및 비-암세포(예: 주위의 간질, 양성 세포 또는 시료 중의 다른 유형의 정상 세포)를 함유하는, 생검, 수술, 세침 흡인 또는 기타 개재 과정으로부터 수득한 샘플을, 환자의 암세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 세포 투과성 형광 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계; 샘플 중의 암세포 및 비-암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및 암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 비-암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 비-암세포보다 암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 고형 종양을 갖는 환자가 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서, 환자의 암세포 및 비-암세포(예: 백혈구)를 함유하는 샘플을, 환자의 암세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 세포 투과성 형광 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계; 샘플 중의 암세포 및 비-암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및 암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 비-암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 비-암세포보다 암세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
대체 양태에서, 참조 비-암세포는 종양을 갖는 환자가 아닌 환자로부터 수득된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HSP90 억제 치료에 감수성일 수 있는 환자를 측정하기 위해 방사선표지된 HSP90 억제제를 사용하는 방법을 제공한다.
이러한 한 가지 양태에서, 본 발명은 영상화가능한 종양을 갖는 암 환자가 HSP90의 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여 후에 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(c) 단계(a)에서 투여 후에 하나 이상의 상기 시점에서 소정의 건강한 조직 또는 환자의 혈액에 의한 방사선표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(d) 단계(b)에서 하나 또는 복수의 시점에서 측정한 흡수와 단계(c)에서 동일한 시점에서 측정한 흡수의 비를 계산하는 단계; 및
(e) 암 환자가 HSP90의 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 또는 복수의 시점에서 계산된 2 이상의 비는 당해 환자가 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 영상화가능한 종양을 갖는 암 환자가 HSP90의 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 HSP90 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여후 4시간 이상의 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계를 포함하고;
여기서 종양 주변의 건강한 조직에서의 흡수에 대한 하나 이상의 상기 시점에서의 억제제의 흡수는 당해 환자가 HSP90의 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 영상화가능한 종양이 HSP90의 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 HSP90 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 방사선표지된 HSP90 억제제의 투여후 2시간 이상의 하나 이상의 시점에서 종양 또는 종양의 종양 세포에서 방사선표지된 억제제의 흡수를 PET에 의해 시각적으로 검사하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 수득한 PET 영상을 하나 이상의 상기 시점에서 종양 주변의 건강한 조직에서 수득한 PET 영상과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서 하나 이상의 상기 시점에서 종양 또는 종양의 종양 세포에서 PET 영상 중의 밝은 영역의 존재는 당해 환자가 HSP90 억제 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 발암성 HSP90을 발현하는 종양을 갖는 특정 암 환자가 소정 용량의 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여후 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(c) 단계(b)에서 하나 이상의 상기 시점에서 측정한 흡수에 기반하여, 하나 이상의 상기 시점 각각에서 환자의 종양에 존재할 수 있는 HSP90의 농도를 소정 용량의 HSP90에 대해 계산하는 단계; 및
(d) 단계(c)에서 계산된 HSP90 억제제의 농도를, 종양의 치료에 효과적인 HSP90 억제제를 위해 하나 이상의 상기 시점에서 종양에 존재할 필요가 있는 HSP90 억제제의 참조 농도와 비교하는 단계를 포함하고,
여기서 단계(c)에서 계산된 HSP90 억제제의 농도가 종양을 효과적으로 치료하는데 요구되는 HSP90 억제제의 농도에 동등하거나 초과하는 경우, 당해 환자는 소정 용량의 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는, 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명자들은 방사선표지된 HSP90 억제제가 HSP90 억제제의 유효 용량 및 투약 계획을 결정하는데 사용될 수 있음을 보여준다.
이러한 한 가지 양태에서, 본 발명은 발암성 SHP90를 발현하는 종양을 갖는 특정한 암 환자가 소정 용량의 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여후 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(c) 단계(b)에서 하나 이상의 상기 시점에서 측정한 흡수에 기반하여, 하나 이상의 상기 시점 각각에서 환자에 종양에 존재할 수 있는 HSP90 억제제의 농도를 소정 용량의 HSP90 억제제에 대해 계산하는 단계; 및
(d) 단계(c)에서 계산된 HSP90 억제제에 대한 종양의 노출을, 종양의 치료에 효과적인 HSP90 억제제를 위해 하나 이상의 상기 시점에서 종양에 존재할 필요가 있는 HSP 억제제에 대한 참조 노출과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서 단계(c)에서 계산된 HSP90 억제제에 대한 종양 노출이 종양을 효과적으로 치료하는데 요구되는 HSP90 억제제에 대한 종양 노출과 동등하거나 이를 초과하는 경우, 당해 환자는 소정 용량의 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는, 방법을 제공한다.
추가의 양태는, 영상화가능한 종양을 갖는 특정한 암 환자를 위해, HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 유효 용량 및 투여 빈도를 측정하는 방법; 암 환자에서 영상화가능한 종양에 존재하는 HSP90 억제제의 농도를 측정하는 방법; 및 암 환자에서 종양의 HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 반응성을 측정 또는 모니터링하는 방법을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 발암성 HSP90을 발현하는 종양을 갖는 특정한 암 환자를 위해, HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 유효 용량 및 투여 빈도를 측정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여후 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 하나 이상의 상기 시점에서 측정한 흡수에 기반하여, 종양의 치료에 효과적인 HSP90 억제제의 농도를 하나 이상의 상기 시점 각각에서 종양에서 유지하는데 요구되는 투여 용량 및 빈도를 계산하여, 암 환자에 있어서 HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 유효 용량 및 투여 빈도를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 발암성 HSP90을 발현하는 종양을 갖는 특정한 암 환자를 위해, HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 유효 용량 및 투여 빈도를 측정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여후 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 하나 이상의 상기 시점에서 측정한 흡수에 기반하여, 종양의 치료에 효과적인 HSP90 억제제의 평균 종양 농도를 치료 기간에 걸쳐 종양에서 유지하는데 요구되는 투여 용량 및 빈도를 계산하여, 암 환자에 있어서 HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 유효 용량 및 투여 빈도를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 추가의 측면에서, 본 발명은 암 환자에서 발암성 HSP90을 발현하는 종양에 존재하는 HSP90 억제제의 농도를 측정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 소정량의 HSP90 억제제 및 소정량의 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제를 환자에게 동시-투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 동시-투여후 하나 이상의 시점에서 환자의 종양에 의한 방사선표지된 HSP90 억제제의 흡수를 주기적으로 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 방사선표지된 HSP90 억제제의 흡수의 측정치에 기반하여, 임의의 이러한 시점에서 종양에 존재하는 HSP90 억제제의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에서 발암성 HSP90을 발현하는 종양의 HSP90 억제제를 사용한 치료에 대한 반응성을 측정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 형태의 HSP90 억제제를, 환자가 HSP90 억제제를 치료로서 제공받는 기간 내에 하나 이상의 시점에서 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계(a)에서 투여후 하나 이상의 상기 시점에서 환자의 종양 중의 방사선표지된 HSP90 억제제의 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 측정한 방사선표지된 HSP90 억제제의 농도를, 종양을 효과적으로 치료하는데 요구되는 HSP90 억제제의 최소 농도와 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 종양의 치료에 요구되는 최소 농도보다 큰 측정 농도는 당해 환자가 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 환자가 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 뇌를, 환자의 뇌 세포에 존재하는 병원성 형태의 HSP90에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계;
(b) 샘플 중의 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 측정된 샘플 중의 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 참조 양과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서 참조 양과 비교하여 단계(b)에서 측정된 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 환자가 HSP90 억제제에 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HSP90 의존성 암을 HSP90 억제제 PU-H71로 치료하는 방법을 제공한다. 특정한 양태에서, PU-H71의 특정한 종양 노출을 달성하기 위해 HSP90 의존성 암을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 양태에서, PU-H71의 신규한 투약 섭생이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에 존재하는 인간 암이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 세포가 HSP90 단백질을 단독으로 또는 HSP70 단백질과 함께 발현하는 환자의 암세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 단계(a)에서 수득한 샘플에 존재하는 세포에 대해 하기 매개변수: 활성화된 AKT 경로, PTEN 종양 억제인자 기능 또는 발현의 결함, 활성화된 STAT5 경로 또는 Bc1-xL 단백질 발현 중의 적어도 하나의 존재를 평가하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 수득한 평가치를, HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응한 하나 이상의 암 환자로부터의 인간 암 세포에 대해 단계(b)에서 평가된 동일한 매개변수(들)의 소정 참조 평가치와 비교하여, 환자의 암이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 가지 양태에서, 이러한 특정 방법을 사용하기 위해 현재 상당히 흥미있는 인간 암은 유방암, 췌장암 및 급성 골수성 백혈병이다.
각각의 매개변수를 평가하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 용이하게 입수가능하다. 그러나, 하나 이상의 이들 특정 매개변수와 HSP90 억제제의 효능을 예측하는 것과의 상관관계는 이전에 제시된 바가 없다. 이론적으로 단일 매개변수가 임의의 소정 HSP90 억제제의 효능을 예측하기 위해 당업자에게 충분할 수 있지만, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 그 이상 또는 모든 이들 매개변수는 효능의 적절한 예측을 수행하기 위해 고려할 필요가 있을 수 있다.
도 1. PU-H71은 암 세포에서 보다 풍부한 HSP90의 제한된 분획과 상호작용한다. (a) MDA-MB-468 세포 추출물에서 H9010, 항-HSP90 항체, 고갈 HSP90을 사용한 순차 면역-정제 단계. 용해물 = 대조군 세포 추출물. (b) MDA-MB-468 추출물로부터의 HSP90은 순차 화학적- 및 면역-정제 단계를 통해 분리했다. 각각의 풀에서 HSP90의 양은 밀도계측에 의해 정량화하고, 값은 내부 표준으로 표준화했다. (c) 포화 연구는 지시된 세포에서 131I-PU-H71로 수행했다. 모든 분리된 세포 샘플을 계수하고, 131I-PU-H71의 특정한 흡수를 측정했다. 이들 데이터는 131I-PU-H71의 농도에 대해 플롯팅하여 포화 결합 곡선을 제공한다. 4개 분리된 반복체의 대표적 데이터가 제시되어 있다(하부). 지시된 세포에서 HSP90의 발현은 웨스턴 블롯으로 분석했다(상부). (d) 일차 AML 및 CML, CD34+ 제대혈 세포(CB) 또는 K562 세포를 지시된 용량의 PU-H71로 24시간 동안 전처리했다. 처리후 세포를 1μM PU-FITC로 처리했다. 세포에 대한 PU-FITC의 결합은 유동 세포주수에 의해 평가하고, 평균 형광 강도(MFI)로 제시되어 있다. TEG-FITC은 비-특이적 결합 대조군으로 제시된다. CD45 대 SSC 통문을 사용하여 일차 시료료부터의 배아 또는 림프구에 대한 결합을 구별했다. (e) PU-H71의 지시된 용량 처리후 일차 AML 및 CML, CD34+ CB 또는 K562 세포에 있어서 무처리 대조군에 대한 생존률(%). 세포 생존률은 처리후 96시간에서 아넥신 V/7-AAD 염색으로 평가했다. 데이터는 평균 ± SE(n = 3)로 제시된다.
도 2. PU-H71은 종양단백질 및 코-샤페론과의 복합체에서 HSP90에 대해 선택적으로 이를 분리한다. (a) K562 중의 HSP90 복합체는 H9010, 비특이적 IgG를 사용한 침전, 또는 PU-H71- 또는 대조군-비드에 의해 분리했다. 대조군 비드는 에탄올아민, HSP90-불활성 분자를 함유한다. 풀-다운 중의 단백질은 웨스턴 블롯으로 분석했다. (b,c) 지시된 바와 같이 단일 또는 순차 면역- 및 화학적-침전을 지시된 빈도 및 제시된 순서로 H9010 및 PU-비드로 K562 추출물에서 수행했다. 풀-다운 및 잔류 상청액 중의 단백질은 WB로 분석했다. NS = 비-특이적. (d) K562 세포는 24시간 동안 비히클(-) 또는 PU-H71(+)로 처리하고, 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석했다. (e) Hsp70-녹-다운 세포에서 단백질의 발현은 웨스턴 블롯(좌측에 의해 분석하고, 단백질 수준의 변화는 상대 형광 단위(RLU)(우측)로 제시한다. 대조군 = 스크램블 siRNA. (f) 지시된 바와 같이, 순차 화학적-침전은 지시된 빈도 및 제시된 순서로 GM-, SNX- 및 NVP-비드로 K562 추출물에서 수행했다. 풀-다운 및 잔류 상청액 중의 단백질은 웨스턴 블롯으로 분석했다. (g) K562 세포 중의 HSP90은 비정상, Bcr-Abl, 및 정상, c-Abl, 단백질과의 복합체로 존재한다. H9010이 아닌 PU-H71은 결합된 Bcr-Abl 종양-단백질인 HSP90 모집단을 위해 선택한다.
도 3. (a,b) 유방암 및 CML 세포 추출물(120㎍)로부터의 HSP90은 지시된 바와 같이 일련의 화학적- 및 면역-정제 단계를 통해 분리했다. 상청액을 분리하여 좌상 HSP90을 분석했다. 각 분획 중의 HSP90은 웨스턴 블롯으로 분석했다. 용해물 = 내인성 단백질 함량; PU-, GM- 및 대조군-비드는 특정 비드 상에서 분리된 단백질을 나타낸다. H9010 및 IgG는 특정 Ab에 의해 분리한 단백질을 나타낸다. 대조군 비드는 HSP90 불활성 분자를 함유한다. 데이터는 복수의 반복 실험(n ≥ 2)으로부터 수득한 것과 일치한다. (c) PE 접합된 항체 대 PU-H71-FITC의 HSP90 결합. PU-H71에 의해 분리된 전체 세포 HSP90의 퍼센트는 데이터 막대 위의 각 세포주에 대해 제시되어 있다. (d) 순차 화학적- 및 면역-침전 단계를 말초혈 백혈구(PBL) 추출물(250㎍)에서 수행하여 PU-H71 및 H9010-특이적 HSP90 종을 분리했다. 모든 샘플은 웨스턴 블롯으로 분석했다(상부). PBL 중의 HSP90에 대한 결합은 HSP90-PE 항체 및 PU-H71-FITC를 사용하여 유동 세포주수에 의해 평가했다. FITC-TEG = 비특이적 결합에 대한 대조군(하부). (e) HSP90에 대한 PU-H71-FITC(1μM)의 결합 대 하기 14개 백혈구 세포주 패널에서 PU-H71로 처리한 후의 생존률의 상관관계: Kasumi-1, Kasumi-4, KCL-22, REH, TF-1, KG-1, HL-60, OCI-AML3, K562, MOLM-13, TUR, THP-1, U937 및 MV4-11. 이들 세포 중의 전체 HSP90 수준은, 웨스턴 블롯에 의해 증명된 바와 같이(제시되지 않음), 유사하다.
도 4. (a) 유동 세포주수 도트 플롯은 배아(CD45dim, 적색 원) 및 비-악성 림프구(청색 원)을 구별하기 위해 일차 만성 골수종 백혈병 (CML) 샘플에 사용된 통문 방법을 증명한다. (b) (a)에 제시된 일차 CML 환자 샘플의 정상 림프구에 대한 CML 배아 중의 HSP90에 대한 PU-H71-FITC 결합의 비. (c) 지시된 시점에서 PU-H71의 용량으로 처리한 후에 (a)에 제시된 일차 CML 샘플에 대한 무처리 대조군과 비교하여 CML 배아(적색) 또는 정상 림프구(청색)의 생존률(%). (d) 유동 세포주수 도트 플롯은, 배아(CD45dim, 적색 원) 및 비-악성 림프구(청색 원)을 구별하고 배아 통문(gate)(CD45dim, 적색 원) 내의 CD34+ 세포(적색 사각형)의 결합을 분석하기 위해 일차 만성 상 CML(cpCML) 샘플에 사용된 통문 방법을 증명한다. CD45 대 SSC 도트 플롯은 7-AAD 식별에 기반하여 생존 세포 상에서 예비-통문된다. (e) 만성 상 CML(cpCML) CD34+ 세포 및 정상 림프구에 대한 PU-H71-FITC 결합의 비. (f) 1μM PU-H71-FITC 또는 TEG-FITCP로 48시간 처리후에 무처리 대조군과 비교하여 cpCML CD34+ 세포(적색) 및 정상 림프구(청색)의 생존률(%). (g) 정상 제대혈의 CD34+ 세포 및 림프구, 만성 상 CML(cpCML) 및 배아 상(bpCML) 세포(n=5)에서 HSP90에 대한 PU-H71-FITC 결합의 비. (h) 무처리 대조군과 비교하여 배아 및 만성 CML CD34+ 세포 및 정상 CD34+ 세포(제대혈; CB)에 대한 PU-H71(1μM)의 처리 48시간 후의 생존률(%). 패널 c, f 및 h 중의 세포 생존능은 아넥신 V/7-AAD 염색으로 평가했다. 데이터는 평균 ± SE(n = 3)로 제시되어 있다.
도 5. (a) 정상 세포 내에서, HSP90의 구조적 발현은 세포 단백질을 이들의 적절한 세포 구획으로 폴딩 및 전좌시키는 이의 진화상 보존된 관리 기능에 요구된다("관리(housekeeping) 복합체"). 악성 형질전환에 있어서, 세포 단백질은 돌연변이, 과활성, 부정확한 세포 구획 내의 체류 또는 기타 수단을 통해 동요된다. 이들 기능상 변경된 단백질의 존재는 악성 표현형의 개시 및 유지에 요구되고, 이는 응력 변형된 HSP90의 서브세트("발암성 복합체")에 의해 특이적으로 유지되는 이들 발암성 단백질이다. PU-H71은 발암성 단백질("발암성 복합체")을 동반하는 HSP90의 분획에 특이적으로 결합한다. (b) HSP90 및 이의 상호작용 공-샤페론은 PU- 및 대조군-비드, 및 H9010 및 IgG-고정된 Ab를 사용하여 K562 세포 추출물에서 분리했다. 대조군 비드는 HSP90 불활성 분자를 함유한다. (c) K562 세포 추출물의 HSP90은 3개의 H9010 HSP90 특이적 항체를 사용한 일련의 면역-정제 단계를 통해 분리했다. 잔류 상청액을 분리하여 좌상 단백질을 분석했다. 각 분획 중의 단백질은 웨스턴 블롯으로 분석했다. 용해물 = 내인성 단백질 함량. 데이터는 복수의 반복 실험(n ≥ 2)로부터 수득된 것들과 일치한다.
도 6. GM 및 PU-H71은 비정상 단백질/HSP90 종에 대해 선택적이다. (a) Bcr-Abl 및 Abl 결합된 HSP90 종은, PU-H71 비드(80μL)의 일정 용적이 지시된 양의 K562 용해물(좌측)로 조사되거나, 일정한 양의 용해물(1mg)이 지시된 용적의 PU-H71 비드(우측)로 조사되는 실험에서 모니터링되었다. (b) (좌측) PU-비드 및 GM-비드(80μL)은, SKMel28 흑색종 세포 추출물(300㎍) 중의 HSP90-돌연변이체 B-Raf 복합체를 인식하지만, 정상 결장 섬유아세포 CCD18Co 추출물(300㎍)에서 발견된 HSP90-WT B-Raf 복합체와 상호작용하지 않는다. H9010 HSP90 Ab는 두 HSP90 종을 인식한다. (c) MDA-MB-468 세포 추출물(300㎍)에서, PU-비드 및 GM-비드(80㎕)은 HER3 및 Raf-1 키나제와 상호작용하지만, 비-발암성 티로신-단백질 키나제 CSK, c-Src 관련 티로신 키나제 및 p38과 상호작용하지 않는다. (d) (우측) PU-비드(80㎕)은 c-Src/HSP90 종이 아닌 v-Src/HSP90과 상호작용한다. c-Src 검출을 촉진하기 위해서, v-Src 형질전환된 3T3 세포(250㎍)와 비교할 때, v-Src보다 적은 풍부함의 단백질, 보다 높은 양의 c-Src 발현 3T3 용해물(1, 000㎍)이 사용되어, 3T3 세포(용해물, 3T3 섬유아세포 대 v-Src 3T3 섬유아세포)에서 검출된 보다 높은 HSP90 수준의 설명을 제공한다. 용해물 = 내인성 단백질 함량; PU-, GM-비드 및 대조군-비드는 특정 비드 상에서 분리된 단백질을 나타낸다. HSP90 Ab 및 IgG는 특정 Ab에 의해 분리된 단백질을 나타낸다. 대조군 비드는 HSP90 불활성 분자를 함유한다. 데이터는 복수의 반복 실험(n ≥ 2)로부터 수득된 것과 일치한다.
도 7. 단일 화학-침전은 PU-비드 및 대조군 비드로 Bcr-Abl-발현 CML 세포주 (a) 및 일차 CML 세포 추출액(b)에서 수행했다. 풀-다운시의 단백질은 웨스턴 블롯으로 분석했다. 몇몇 Bcr-Abl 분해 생성물은 보고된 바와 같이 일차 CML 샘플에서 관찰된다. N/A = 이용가능하지 않음.
도 8. 몇몇 HSP90 억제제의 구조.
도 9. PU-H71에 접합된 형광 이소티오시아네이트(FITC), 4-니트로벤조[1,2,5]옥사졸(NBD) 또는 적색 이동된 염료 설포르호다민 101(텍사스 레드)을 함유하는 합성된 열 충격 단백질 90(HSP90)에 대한 형광 리간드.
도 10. 제시된 반응 계획을 위한 시약 및 조건: (a) FITC, Et3N, DMF, rt, 12h, 40%; (b) 텍사스 레드 설포닐 클로라이드, DMF, 0 내지 10℃, 12h, 61%; (c) DMF, rt, 20h, 47%.
도 11. 제시된 반응 계획을 위한 시약 및 조건: (a) FITC, Et3N, DMF, rt, 5h, 72%; (b) NBD-Cl, Et3N, DMF, rt, 12h, 40%.
도 12. 제시된 반응 계획을 위한 시약 및 조건: (a) N-(3-브로모프로필)-프탈이미드, Cs2CO3, DMF, rt, 34%; (b) 하이드라진 수화물, MeOH, CH2Cl2, rt, 64%; (c) FITC, Et3N, DMF, rt, 12h, 74%; (d) NBD-Cl, Et3N, DMF, rt, 12h, 42%.
도 13. (A) MOLM-13 세포를 4시간 동안 37℃로 지시된 PU-H71 형광 유도체(1μM)로 처리하고, 유동 세포계수에 의해 생존 세포(DAPI 음성)에 대한 결합을 측정했다. 결합 정도는 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된다. (B) MOLM-13 세포를 24시간 동안 37℃로 지시된 PU-H71 형광 유도체(1μM)로 처리했다. 이들의 생존력은 DAPI 배제에 의해 측정했다. (C) MOLM-13 세포를 24시간 동안 지시된 PU-H71 형광 유도체(1μM)로 처리했다. HSP90 클라이언트 단백질 mFLT3 및 Raf-1의 고정상 수준은 웨스턴 블롯으로 분석했다. β-액틴을 사용하여 동일한 단백질 부하에 대해 표준화했다.
도 14. (A) PU-H71-FITC2로 염색한 백혈병 세포의 공초점 형광 현미경법은 현저한 세포내 국지화를 나타낸다. (B) 일차 급성 골수성 백혈병 샘플을 24시간 동안 지시된 용량의 PU-H71 또는 비히클(무처리)로 전처리했다. 처리후 세포는 1μM PU-H71-FITC2 또는 TEG-FITC로 처리했다. 세포에 대한 PU-H71-FITC2 및 TEG-FITC의 결합은 유동 세포계수에 의해 평가하고, 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된다. TEG-FITC은 비특이적 결합 대조군로서 제시된다. CD45 대 SSC 통문을 사용하여 주요 시료로부터 배아(악성 세포) 또는 림프구(정상 세포)에 대한 결합을 구별했다.
도 15. 정상 세포(좌측) 및 유방암 세포(우측)에서 PU-ANCA의 형광 방사 스펙트럼. 유방암 세포의 스펙트럼 방사 프로파일은 약 530nm 파장, 결합된 PU-H71-ANCA의 대표적 형광 방사에서 형광 방사 피크를 제공했다.
도 16. (a) 건강한 공여체(제대혈) 및 만성 및 배아 상 CML 환자(각각 cpCML 및 bpCML)로부터 정상 림프구에 대한 제대혈 및 CML 배아 중의 HSP90에 대한 PU-H71-FITC 결합의 비. 건강한 환자의 제대혈에 대한 유의적 결합 대 질병 진행과 관련되는 CML에서 증가된 결합이 없음을 주목한다. (b) 무처리 대조군과 비교하여, 배아 및 만성 CML CD34+ 세포, 및 정상 CD34+ 세포(제대혈로부터; CB)에 대해 PU-H71(1μM)로 처리후 48시간에서의 생존률(%). 세포 생존률은 아넥신 V/7-AAD 염색으로 평가되었다. 데이터는 평균 ± SE(n=3)로서 제시된다. (c) HSP90에 대한 PU-H71-FITC(1μM)의 결합 대, 19개 일차 AML 환자 샘플의 세트에서 48시간 동안 500nM PU-H71로 처리후 생존률(%)의 상관관계. 각각의 도트는 일차 AML 샘플을 나타낸다. 실험은 각각 적어도 이중으로 수행했다. 이들 세포는 유사한 전체 HSP90 수준을 발현한다.
도 17. 이종이식편 분석은 높은 PU-FITC 결합을 갖는 AML 샘플의 PU-H71 처리에 대한 생체내 감수성을 시사한다. (a) 낮은 및 높은 PU-FITC 흡수(b)를 나타내는 2개 일차 AML 샘플의 시험관내 PU-H71 처리에 대한 48시간에서의 생존률(%). 생존률은 아넥신/7AAD 분석에 의해 측정되었다. (b) 이종이식된 동물(패널 a에 제시된 AML 샘플용)의 골수 세포는 PU-FITC 결합을 측정하기 위해 사람 특이적 항체로 염색되었다. PU-FITC 결합은 사람(백혈병)/쥐(정상) 세포의 비로서 제시된다. (c) 3주 동안 75mg/kg PU-H71(1주 3회)로 처리된 동물에서 CD34+ 종양 세포 백분율.
도 18. "발암성 HSP90"을 검출 및 정량화하고 HSP90 억제제에 대한 종양 세포의 감수성을 예측하기 위한 표지된 PU-H71의 용도. (A) HSP90에 대한 PU-H71-FITC(1μM)의 결합 대, 췌장 및 유방암 세포주에서 48시간 동안 1μM PU-H71, SNX-2112 또는 NVP-AUY922로 처리후의 생존률의 상관관계. 결합은 각각의 세포주에서 PU-FTTC 흡 및 참조 세포, HSP90 내성 백혈병 세포 HL60(패널 D 참조)에서의 흡수의 비로서 측정된다. (B) 전체 종양 HSP90의 발현은 웨스턴 블롯으로 측정하고, PU-FITC 결합에 대해 플롯팅된다. (C) 췌장 및 유방암 세포주의 패널에서 48시간 동안 1μM PU-H71, SNX-2112 또는 NVP-AUY922로 처리하의 생존률(%)은 전체 종양 HSP90의 발현에 대해 플롯팅된다. (D) 낮은 결합 및 감수성(HL-60) 및 높은 결합 및 감수성(MV4-11) AML 세포주에서 PE 접합된 항체 대 PU-H71-FITC의 HSP90 결합. 데이터는 평균±SE(n=3)로서 제시된다.
도 19. 종양 세포 및 참조 HL-60 백혈병 세포에 대한 PU-H71-FITC2의 결합의 비. 비-반응성(50% 미만 감소된 생존률) 세포로부터의 반응성 세포(50% 초과 감소된 생존률)은 PU-H71-FITC2에 대한 결합 비에 의해 구별할 수 있고, 반응성 세포에 있어서 약 2.7 내지 약 5.87 또는 그 이상은 비반응성 세포에 있어서 약 1.23 내지 약 2.07 또는 그 미만과 비교된다.
도 20. EpCAM+ 순환 종양 세포 중의 PU-H71-FITC2 축적: 전혈로부터 분리된 PBMC는 PU-FITC 또는 대조군(PU-FITC9, DMSO, 1μM/2x106 세포/ml, 4시간)로 전처리했다. 이어서, 세포는 CD45, CD14 및 EpCAM 항체로 염색되었다. (A) 세포는 사멸 세포를 배제하기 위해 통문된다. 이어서, 생존 세포는 EpCAM+ 대 CD45+ 세포를 측정하기 위해 통문된다. 단핵구는 FSC 대 CD14로서 CD45+ 세포를 추가로 통문함으로써 분석으로부터 제외된다. (B) CD45+CD14- 세포(청색) 및 EpCAM+ 세포(적색)의 PU-FITC 중앙 형광 강도(MFI)를 나타내는 히스토그램 플롯. EpCAM+ 세포의 약물 축적은 DMSO 및 PU-FITC9 대조군(비특이적 및 배경 결합에 대한 대조군으로 사용됨)을 뺀 후에 MFI EpCAM+/MFI CD45+CD14-(순환 종양 세포/백혈구)의 비로서 계산된다.
도 21. 상이한 Ly1 클론에 의한 PU-H71-FITC2의 흡수를 나타내고, 중앙 형광강도로서 제시된다. HSP90 억제제에 대한 이들 세포의 감수성은 표지된 PU-H71의 흡수와 관련된다. 이들 종양 세포에서 전체 종양 HSP90의 발현은 웨스턴 블롯에 의해 측정되었다.
도 22(a-c). PU-H71 결합 및 췌장 암 세포의 독성에서의 상관관계. (A) 생존 세포에서의 결합; 췌장 암 세포(1x106 세포)은 PUFITC2(1μM) 또는 대조군[TEG-FITC(1μM) 또는 DMSO]으로 6시간 동안 처리했다. 세포를 FACS 완충제(PBS, 0.05% FBS)로 2회 세정하고, 분석 전에 실온에서 FACS 완충제 중의 DAPI(Invitrogen) 1㎍/ml로 오염시켰다. PU-H71 형광 유도체 결합을 나타내는 생존 세포(DAPI 음성)로부터의 형광 강도는 유동 세포계수(LSR-II, BD bioscience)에 의해 포집하고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)에 의해 분석했다. 수치는 DMSO 및 TEG-FITC 대조군로부터 뺀 평균 형광 강도를 나타낸다. (B) 독성; 췌장 암 세포(1x106 세포)은 PU-FITC2(1μM)로 48시간 동안 처리했다. 세포를 FACS 완충제(PBS, 0.05% FBS)로 2회 세척하고, 실온에서 FACS 완충제에서 DAPI(Invitrogen) 1㎍/ml로 염색하고, 유동 세포계수(LSR-II, BD bioscience)에 의해 포집했다. 수치는 DMSO 대조군로부터 당해 수치로 표준화된 % 생존 세포(DAPI 음성)를 나타낸다. (C) 상관관계 분석; A 및 B로부터 수득된 MFI 및 독성은 x 및 y축 위에서 각각 플롯팅하고, 상관관계 선형 회귀 분석을 수행했다.
도 23. (A) 백혈병 간세포(LSC, CD34+CD38- CD45dim)에 대한 PUH71-FITC2의 결합. 일차 AML 샘플을 4시간 동안 37℃에서 1μM PU-H71-FITC2로 배양했다. 세포를 CD34, CD38, CD45 및 7-AAD로 염색한 다음, 유동 세포계수 분석을 수행했다. LSC에 대한 PU-H71의 결합은 생존 세포(7-AAD 음성)에서 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된다. (B) 1μM PUH71로 48시간 처리후 3개 일차 AML 샘플로부터 무처리 대조군에 대한 LSC의 생존률(%). 세포를 아넥신 V 및 7-AAD 염색 전에 CD45, CD34 및 CD38로 염색했다. 생존률 LSC는 유동 세포계수에 의해 측정하고, CD45dimCD34+CD38- 통문의 아넥신V-/7AAD-의 백분률로서 측정했다.
도 24. 종양은 독특한 [124I]-PU-H71 흡수를 갖고, 이는 이들의 "발암성 HSP90" 함량 및 따라서 HSP90 치료에 반응하는 이들의 가능성의 차이를 나타낸다. [124I]PU-H71 주사후 24시간에서 [124I]-PU-H71 PET 영상은 유방암을 갖는 몇몇 환자에서 최대 표준화 흡수치(SUVmax)로서 측정되었다. BC=유방암. TNBC-3중-음성 BC.
도 25. [124I]-PU-H71의 투여후에 PET로 측정한, HSP90 억제에 반응성인 환자의 소정 수에 대한 종양:근육 SUV 비. 이들 환자에서, 종양:근윤 SUV는 시간에 따라 증가한다. 몇몇 양성 및 음성 종양에 대해 평균한 수치가 제시된다.
도 26. 맨틀 세포 림프종을 갖는 환자의 FDG/CT 및 [124I]PU-H71 PET/CT. 환자는 [124I]-PU-H71-주사 후에 30분에서 병변의 명백한 시각화를 나타낸다. 어떠한 [124I]-PU-H71 흡수도 후속 시점에서 이러한 종양에서 관찰되지 않았다(3.5 내지 24시간 및 그 이후).
도 27. 2개의 지시된 림프절(LN)에서 재발 유방암을 갖는 환자의 [124I]PU-H71 PET/CT. [124I]-PU-H71 주사후 몇몇 시점(0.1, 0.4, 0.6, 3.5 및 21.4시간)에서 PET 영상은 10mg/m2의 PU-H71의 투여량에 대한 HSP90i 농도로 전환되었다. 0 내지 24시간에 걸쳐 PU-H71에 대한 2개 종양의 노출을 또한 계산하고, 곡선하 면적(AUC)로서 제시했다. CT(좌측), PU-PET/CT(중간) 및 FDG-PET/CT 융합(우측) 경축 영상은 발병된 림프절 중의 하나에서 [124I]-PU-H71- 중독을 증명하지만, 나머지는 좌측 기관지 전방 각도 림프절(TAALN) 중의 병변이 좌측 기관지 각도 LN(TALN)보다 적게 HSP90 치료에 반응할 가능성이 있음을 시사한다.
도 28. 3중-음성 유방암 환자는 124I-PU-H71 PET로 영상화되었다. 주사후 20분에서, 흡수는 폐 질량(좌측 화살표) 및 골 병변(우측 화살표)(A)에서 관착되었지만, 24시간 흡수에서 폐 병변(B)에서만 관찰된다. 폐 및 골 종양 둘 다는 CT 및 FDG-스캔(C)에 의해 확인된다. 환자는 HSP90 억제제 STA-9090을 사용한 치료를 개시했다. HSP90 억제제 치료후 20일에서, 골 병변이 아닌 폐 병변은, CT 및 FDG-PET(D) 둘 다에 의해 입증된 바와 같디, 크기가 현저히 감소된다.
도 29. 기관주위 림프절에서 대사성 HER2 유방암을 갖는 환자의 [124I]PU-H71 PET/CT. [124I]-PU-H71 주사후 또는 [124I]-PU-H71과 10mg/m2 PU-H71과의 동시-주사후 지시된 시점에서 PET 영상은 최대 표준화된 흡수치(SUVmax)로서 측정되었다. [124I]-PU-H71에 대해 수득된 SUV 데이터는, 10mg/m2의 PU-H71의 투여 용량에 대한 HSP90i 농도로 전환되었다. 0 내지 48시간에 걸쳐 PU-H71에 대한 종양의 노출을 또한 계산하고, 곡선하 면적(AUC)으로서 제시된다. [124I]-PU-H71 PET로부터 평가되고 [124I]-PU-H71/PU-H71의 동시-주사후에 [124I]-PU-H71 PET로부터 측정한 바와 같이, PU-H71의 종양 농도(마이크로몰 값)는 비교가능하다.
도 30. [124I]PU-H71 PET는 HSP90 억제제를 위한 비침입성 분석이다. (a) PU-H71 및 [124I]PU-H71의 화학 구조. (b) MDA-MB-468 종양-함유 마우스에서 [124I]-PU-H71의 대표적 PET 스캔. 종양의 위치는 적색 화살표로 제시된다. (c) 투여후 지시된 시간에 대한 [124I]-PU-H71 종양-대-기관 활성 농도 비. (d) [MDA-MB-468 종양 및 혈장(n=5) 중의 [131I]PU-H71의 생물분포. 종양-S 및 종양-L, 각각 소형 및 대형 종양. (삽입) 종양으로부터 24시간 내지 240시간 지연 말단 정화 상의 PU-H71은 GraphPad 프리즘에서 수행된 바와 같이 선형 회귀 곡선 적합도를 사용하여 분석했다.
도 31. [124I]PU-H71 PET는 종양에서 치료학적으로 효과적인 PU-H71 농도의 전달을 정확하게 예측한다. (a) [124I]-PU-H71 PET(하부)에 의해 생성된 평균 %ID/g에 기반한 예측된 PU-H71 종양 분포. 지시된 PU-H71 용량(상부)의 지시된 시점(p.a.)에서 예측된 종양 농도. (b) [124I]-PU-H71 PET에 의해 예측되고 [124I]PU-H71 및 PU-H71의 동시-주사후에 LC-MS/MS 및 [124I]-PU-H71 PET에 의해 측정된, 75mg/kg 제제의 투여후의 종양 PU-H71 농도. (c,d) 지시된 용량으로 PU-H71 투여되고 24시간(p.a)에서 분석한 MDA-MB-468 종양(c) 및 지시된 용량의 PU-H71으로 24시간 동안 처리한 MDA-MB-468 세포(d)의 대표적 웨스턴 블롯 분석. 블롯(n=3)은 광밀도 및 그래프화된 단백질 수준의 변화 대 PU-H71의 농도(우측 패널)에 의해 정량화했다. (e,f) 지시된 용량의 PU-H71과 혼합된 [124I]-PU-H71의 미량의 동시-투여 후에 [124I]-PU-H71 PET에 의해 예측된 바와 같은 24시간(p.a.)의 표적 점유율.
도 32. [124I]PU-H71 PET는 HSP90 치료에 대한 효율적인 용량 섭생의 설계를 예측한다. (a) [124I]PU-H71 PET에 의해 유래된 평균 종양 활성 농도(%ID/g)에 기반하여 1주 3회(월-수-금, 토/일 중단) 지시된 용량으로 2주 동안 투여할 때의 예측된 PU-H71 종양 분포. (삽입) 종양 중의 PU-H71에 대한 AUC는 GraphPad 프리즘을 사용하여 계산되었다. (b) 지시된 용량의 PU-H71로 48시간 동안 처리된 MDA-MB-468 세포의 생존률은 에티디움 브로마이드/아크리딘 오렌지 염색(상부)에 의해 분석했다. [124I]-PU-H71 PET에 의해 유도된 평가된 종양 아폽토시스는 지시된 평균 및 최소 PU-H71 종양 농도를 예측했다. (c) MDA-MB-468 종양-함유 마우스(n =5)에게 1주 3회 계획으로 지시된 용량의 PU-H71을 i.p로 투여했다. 종양 용적 및 마우스 중량은 지시된 처리 기간에 걸쳐 모니터링했다. (d) MDA-MB-468 종양 함유 마우스(n=5)에게 1주 3회 계획으로 지시된 용량의 PU-H71을 i.p로 투여했다. 종양 용적 및 마우스 중량은 지시된 처리 기간에 걸쳐 모니터링했다. (e) 1주 3회(월-수-금, 토/일 중단) 계획으로 지시된 용량으로 투여하는 경우, [124I]-PU-H71 PET에 의해 유도된 평균 종양 활성 농도(%ID/g)에 기반한 예측된 PU-H71 종양 분포. (f) 최종 용량의 24시간(p.a.)에서, 목요일에 희생시킨 비히클(대조군) 및 PU-H71(5mg/kg) 처리된 종양의 웨스턴 블롯 분석. LC-MS/MS에 의해 측정한 바와 같이 PU-H71 종양 농도는 각각의 종양에 대해 지시되어 있다. (f) 패널(d)로부터의 데이터 분석(n=5).
도 33. [124I]PU-H71 PET는 HSP90 치료에 대한 효과적인 계획 섭생의 설계를 예측한다. (a) 지시된 투여 계획으로 75mg/kg에서 투여하는 경우, [124I]-PU-H71 PET에 의해 유래된 평균 종양 활성 농도(%ID/g)에 기반한 예측된 PU-H71 종양 분포. (b) 시험관내 분석으로부터 예측된 바와 같이 지시된 평균 및 최소 PU-H71 종양 농도에 의해 유도된 평가된 종양 아폽토시스. (c) MDA-MB-468 종양 함유 마우스(n=5)에게 지시된 계획으로 PU-H71(75mg/kg)을 i.p.로 투여했다. 종양 용적 및 마우스 중량은 지시된 치료 기간에 걸쳐 모니터링되었다. 24시간 및 목요일, 최종 용량의 96시간(p.a.)에서, 목요일에 희생시킨 1주 1회 계획으로 PU-H71(75mg/kg) 처리된 종양의 (d) 웨스턴 분석 및 (e) LC-MS/MS. 대조군; 비히클 단독 처리된 마우스.
도 34. 폐 및 지시된 림프절로의 전이성 질환을 갖는 췌장 환자에 있어서 PU-PET에 의해 예측된 바와 같은 PU-H71에 대한 종양 노출. 종양 농도는 20mg/m2의 투여 용량에 기반하여 계산된다. 혈장 노출은 또한 적색으로 제시된다. 기간 0 내지 192시간 동안 계산된 AUC(μM-h)은 우측에 수록된다.
도 35. 폐에서 재발 질환을 갖는 췌장암을 갖는 환자의 [124I]PU-H71 PET/CT. [124I]-PU-H71 주사(48시간 및 196시간, 좌측 패널) 후에 지시된 시점에서 PET 영상을 정량화하고, [124I]-PU-H71에 대해 수득한 SVU 데이터를 PU-H71의 지시된 투여 용량에 있어서 종양 중의 PU-H71 농도로 전환시켰다. 또한, 1주 2회(목 및 금) 계획 및 20, 60 및 80mg/m2(상부 우측 및 하부 패널)로 2주 처리 동안 시간 0 내지 336시간에 걸쳐 PU-H71에 대한 2개 종양(좌측 폐에 1개 및 우측 폐문에 또 다른 1개)의 노출을 계산하고, 곡선하 면적(AUC) 및 평균 종양 농도로서 제시된다.
도 36. 패널 A는, PU-PET로부터 수득된 유방암 환자의 종양에서 0 내지 72시간에 걸쳐 124I-PU-H71의 생물분포를 나타낸다. 데이터는, 1주 2회 2주간(주말 중단), 1주 3회 2주간(주말 중단), 1주 1회 2주간(주말 중단) 및 1주 5회 2주간(주말 중단)으로 제공하는 경우, 10mg/m2의 투여 용량에 대한 종양 노출을 모의실험하기 위해 사용된다.
도 37. [124I]PU-H71 PET는 HSP90 치료에 대한 반응 정도를 예측한다. (a) 지시된 용량 및 지시된 계획으로 투여하는 경우, PU-H71에 의한 종양 HSP90 부위의 평균 점유율(%). (b,c) 관찰된 항-종양 효과와 종양 HSP90 부위 점유의 상관관계는 GraphPad 프리즘으로 분석했다.
도 38. HSP90 억제제의 임상 개발에서 124I-PU-H71 PET 분석의 사용: (a) 효과적 종양 농도, HSP90 치료에 적합한 환자의 선택을 달성하는데 요구되는 HSP90 억제제 용량의 측정 및 효율적인 용량 및 계획 섭생의 설계에서, (b) 종양에 전달된 약물의 실제 농도를 분석하고 HSP90 치료에 대한 임상 결과의 예상에 있어서, 및 (c) "최대 종양 용량"의 결정에 있어서. CR= 완전 반응, PR = 부분 반응, NR = 무반응.
도 39. MDA-MB-468 이종이식편 TNBC 마우스에서 [124I]-PU-DZ13 및 [124I]PU-H71의 생체내 PET 영상화. PET 영상화는 R4 또는 포커스 120 제공된 소형 동물 PET 스캐너(Concord Microsystems, Inc., Knoxville, TN)로 수행하고; 별개의 해부학적 영상화는 통상 제작된 입체공간 제한 장치를 사용하여 제공된 소형 동물 CT 스캐너(ImTek, Inc., Oak Ridge, TN)으로 수행했다. CT 및 PET 영상 데이터세트의 최대 강도 투영법(MIP)을 해부학적으로 등록하고, 중첩 영상은 PET 및 CT 데이터의 알파 투명 혼합을 사용하여 생성했다.
도 40. BC의 경우는 PU-H71에 대한 용량 의존적 반응을 나타낸다. H&E 염색된 슬라이드는, 종양이 PU-H71에 고도로 감수성인 경우, 색혈 세포(초기 단계 아폽토시스를 나타냄) 및 핵붕괴 세포(후기 단계 아폽토시스를 나타냄) 둘 다를 함유하는 유의적 아폽토시스 부분을 나타낸다. (A) 지시된 농도의 PU-H71로 48시간 동안 처리한 TNBC 시료 중의 아폽토시스/세포 사멸을 정량화하고, PU-H71의 농도에 대해 플롯팅했다. 아폽토시스 및 괴사/후기 아폽토시스 세포를 계수하고, y축에 도시된 바와 같이 아폽토시스(%)로서 부가했다. 3개 감수성 그룹(최급경사, 상부 곡선, 최고 감수성, LN15 및 LN16; 중간 곡선, 감수성, PT12, PT17, PT25, PT28 및 LN10 및 하부 곡선, 보다 적은 감수성, PT10, PT15, PT16 및 PT30)에서 클러스터링을 주목한다. 흥미롭게는, 림프절 전이는 동등한 용량에서 일차 종양보다 높은 감수성을 나타냈다. PT = 일차 종양, LN = 림프절. 또한, PU-H71에 가장 감수성인 종양은 p-Akt에 대해 고도로 염색한다. (B) HER2+, TNBC 및 ER+ BC 환자로부터의 시료를 사용한 (A)와 동일하게 PU-H71로 24시간 또는 48시간 동안 처리했다.
도 41. HSP90 억제에 대한 아폽토시스 감수성은 AKT- 및 STAT 경로 상에서의 생존을 위한 세포의 중독과 상관관계가 있지만, MEK-경로와는 상관관계가 없다. (A),(B) 대표적인 AML 세포는 지시된 농도의 HSP90, AKT, JAK 및 MEK 억제제와 함께 지시된 시간 동안 배양하고, 아폽토시스는 아크리딘 오렌지/에틸디움 브로마이드 방법을 사용하여 평가했다. 데이터는 복수의 반복 실험(n≥3)로부터 수득된 것과 일치한다. 시점, 평균; 막대, 표준편차. (C) AKTi, MEKi 및 JAKi 단독으로 72시간 동안 처리한 세포의 아폽토시스 값(%)을 HSP90 억제제 처리로 수득한 것들에 대해 플롯팅하고, 프리즘 4.0에서 수행한 바와 같이 선형 회귀 분석을 실시했다.
도 42. 최고 수준의 p-STAT5을 갖는 AML 일차 세포는 또한 PU-H71에 대해 가장 감수성이다. (A) 배아 세포(CD45dim 통문됨)에서 포스포-STAT5 수준은 3개의 상이한 일차 AML 샘플에 대한 평균 형광 강도(MFI)로서 나타냈다. Stat5의 포스포릴화 수준은 유동 세포계수에 의해 평가했다. (B) 1μM PUH71로 48시간 처리후에 3개 일차 AML 샘플로부터 무처리 대조군에 대한 AML 배아의 생존률(%). 세포는 아넥신 V 및 7-AAD 염색 전에 CD45로 염색시켰다. AML 배아 세포의 생존률은 유동 세포계수에 의해 측정하고, AML 배아에 대한 CD45dim 대 SSC 통문의 아넥신V-/7AAD-의 백분률로서 측정했다.
도 43. 8-10마리의 mo 3xTg 마우스에게 (A) 75mg/kg 또는 (B) 지시된 용량의 HSP90 억제제 PU-HZ151를 투여하고, PD 마커, HSP70을 투여후 24시간에서 해마, 즉 이러한 AD 모델 중의 발병된 뇌 영역에서 측정했다. HSP90이 억제되는 경우에 HSP70이 유도되고, 이의 유도는 HSP90 억제제의 치료학적 수준이 목적하는 뇌 영역에 전달되었다는 지표이다. (C) 지시된 뇌 영역 및 혈장에서 HSP90 억제제의 수준은 50mg/kg PU-HZ151의 투여후에 LC-MS/MS에 의해 측정되었다. 단일 ip 주사후의 상이한 시점에서 Hsp90 억제제 수준은 마이크로몰 단위로 제시된다. 뇌 노출은 또한 곡선하 면적(AUC)로서 측정되었다.
도 44. PU-H71은 HSP90에 선택적이다. (A) 몇몇 HSP90 억제제 비드-풀 다운의 쿠마시에 염색된 겔. K562 용해물(60㎍)을 지시된 비드 25μL로 배양했다. 지시된 완충제로 세척한 다음, 풀-다운시의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 적용했다. (B) PU-H71(10μM)은 359 키나제에 대하여 scanMAX 스크린(Ambit)에서 시험했다. PU-H71에 대한 TREEspotTM 인터액션 맵(Interaction Map)이 제시된다. SNARK(NUAK 부류 SNF1-유사 키나제 2)(키나제 트리 상의 적색 도트)는 소분자의 잠재적 저친화성 키나제 타격으로서 나타난다.
5.1.종양 특이적 생물마커로서의 발암성 HSP90
본 발명은, HSP90 발현 단독에 의해 지시되지 않는, 이러한 특정 "발암성 HSP90" 종의 풍부함이 HSP90 억제 치료에 대한 감수성을 예측하고, 따라서 HSP90 치료를 위한 생물마커라는 증거를 제공한다. 본 발명은 또한 종양에서 HSP90 치료에 대한 종양 반응 예측에서 이러한 발암성 HSP90 종의 풍부함을 확인 및 측정하는 증거를 제공한다.
하기 부분에서, 본 발명자들은 HSP90 억제제 PU-H71이 종양 풍부한 HSP90 복합체를 표적화하고, HSP90-의존성 발암성 클라이언트 단백질을 친화성-포착한다는 것을 보여준다. 화합물 PU-H71은 본원에서 참조로서 도입되는 미국 특허 제7,834,181호에 개시되어 있다. PU-H71는 다음 화학 구조를 갖는다:
Figure 112017033467195-pat00001
PU-H71
PU-H71은 유리 염기 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 투여될 수 있다.
또한, 본 발명자들은, HSP90 발현 단독에 의해 지시되지 않는, PU-H71 풍부한 HSP90 종의 풍부함이 PU-H71 및 기타 HSP90 억제제에 의한 HSP90 억제에 대한 세포 감수성을 나타냄을 보여준다.
5.1.1. 암 세포에서 이종성 HSP90 제시
종양 HSP90 복합체와 소분자 HSP90 억제제의 상호작용을 조사하기 위해, 본 발명자들은, 겔다나마이신(GM) 또는 PU-H71(각각 GM-비드 및 PU-비드)에 공유 결합된 아가로즈 비드를 사용했다(도 1 및 2). 화학상 별개의 제제인 GM 및 PU-H71은 이의 N-말단 도메인 조절 포켓에 결합함으로써 HSP90과 상호작용하고 이를 억제시킨다35. 비교를 위해, 본 발명자들은 또한 항-HSP90 항체에 결합된 G 단백질 아가로즈-비드를 생성했다(H9010).
먼저, 본 발명자들은 유방암 및 만성 골수성 백혈병(CML) 세포 용해물에서 HSP90에 대한 이들 제제의 결합을 평가했다. 비특이적 IgG가 아닌 H9010을 사용한 연속 4개 면역침전(IP) 단계는 이들 추출물로부터 HSP90을 효율적으로 고갈시켰다(도 1a, 4xH9010 및 도시되지 않음). 대조적으로, PU-비드 또는 GM-비드를 사용한 순차 풀-다운은 전체 세포 HSP90의 분획만을 제거했다(도 1b, 3a, 3b). 구체적으로, MDA-MB-468 유방암 세포에서, 조합된 PU-비드 분획은 전체 세포 HSP90 풀의 대략 20 내지 30%를 나타냈고, 추가로 신선한 PU-비드 분획의 첨가는 당해 용해물에서 잔류 HSP90을 침전시키지 못했다(도 1b, PU-비드). 소분자에 접근가능하면, 이러한 PU-고갈된 잔류 HSP90 분획은 H9010에 대한 친화성을 유지했다(도 1b, H9010). 이로부터, 본 발명자들은, MDA-MB-468 세포 추출액 중의 HSP90의 상당한 분획이 순수한 배좌로 존재하지만 PU-H71과 반응하지 않는 것으로 결론지었다.
세포 용해물 중의 HSP90 배치의 변화가 당해 항체가 아닌 고정된 PU-H71에 대한 결합에 이용할 수 없게 할 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 순수한 암세포에서 HSP90에 대한 방사선표지된 131I-PU-H71의 결합을 분석했다(도 1c, 하부). 131I-PU-H71 및 PU-H71의 화학 구조는 동일하다: PU-H71은 안정한 요오드 원자(127I)을 함유하고, 131I-PU-H71은 방사성 요오드를 함유하며; 따라서 동위원소 표지된 131I-PU-H71은 비표지된 PU-H71과 동일한 화학적 및 생물학적 특성을 갖고 있다. 몇몇 암 세포주에서 HSP90에 대한 131I-PU-H71의 결합은, 독특하기는 하지만, 세포당 잘 규정된 수의 부위에서 포화된다(도 1c, 하부). 본 발명자들은 MDA-MB-468 세포에 의해 결합된 세포 HSP90의 분획을 정량했다. 먼저, 본 발명자들은 HSP90이 이들 세포 중의 전체 세포 단백질의 2.66 내지 3.33%, 즉 다른 종양 세포에서 HSP90의 보고된 풍부함과 밀접하게 일치하는 값을 나타냄을 측정했다33. 대략 41.65x106 MDA-MB-468 세포를 용해시켜 단백질 3875㎍을 수득했고, 이중 103.07 내지 129.04㎍은 HSP90이었다. 따라서, 1개 세포는 (2.47-3.09)x10-6㎍, (2.74-3.43)x10- 11μmol 또는 (1.64-2.06)x107 분자의 HSP90을 함유한다. MDA-MB-468 세포에서, 131I-PU-H71은 기껏 5.5x106개의 이용가능한 세포 결합 부위에 결합했고(도 1c, 하부), 이는 전체 세포 HSP90의 26.6 내지 33.5%의 양이다(5.5x106/(1.64-2.06)x107*100으로 계사됨). 이 값은 세포 추출물에서 PU-비드 풀-다운으로 수득한 것과 현저하게 유사하고(도 1b), 이는 PU-H71이 전체 HSP90 풀의 대략 30%를 나타내는 MDA-MB-468 세포에서 HSP90의 분획에 결합함을 확증하고 이러한 풀을 효율적으로 분리하기 위해 PU-비드의 사용을 입증한다. K562 및 기타 확립된 t(9;22)+ CML 세포주에서, PU-H71은 전체 세포 HSP90의 10.3 내지 23%를 결합시켰다(도 1c, 3b, 3c).
이어서, 본 발명자들은 본 발명자들의 연구를 몇몇 일차 백혈병 및 정상 혈액 세포로 연장시켰다. 이들 중에는 배아(악성 세포 모집단) 및 림프구(정상 세포 모집단) 둘 다를 함유하는 일차 만성 및 배아 상 CML 및 급성 골수성 백혈병(AML) 샘플이 있고, CD34+ 세포는 건강한 공여체의 제대혈로부터 분리하고, 전체 단핵구 세포는 말초혈 및 또한 말초혈 백혈구(PBL)로부터 분리했다(도 1c-e, 3, 4). 본 발명자들은 형광 표지된 PU-H71을 사용했다(PU-FITC). 이러한 화학적 도구는, 이종성 세포 모집단에서, PU-H71 결합의 유동 세포계수 분석을 가능하게 하여, PU-H71에 대한 세포 감수성의 조사 뿐만 아니라, 세포 표면 마커를 사용한 세포 모집단을 명백하게 한다. 테트라에틸렌 글리콜 유도체화된 FITC(FITC-TEG)가 비특이적 결합을 위한 대조군으로 사용되었다(도 1d).
PU-H71은 각각 116, 201 및 425nM의 절반 상대 결합 친화성(EC50)으로 K562 세포, 및 CML 및 AML 배아에서 HSP90에 효율적으로 결합했다(도 1d). 대조적으로, 정상 혈액 세포에 대한 이의 친화성은, 2,000nM보다 높은 EC50과 함께, 보다 약했다(도 1d, 3d). HSP90은, HSP90 항체에 대한 실질적 결합에 의해 지시된 바와 같이 이들 정상 혈액 세포에서 고도 발현된다(도 3d).
PU-H71에 대해 최고 중독을 갖는 세포는 또한 당해 제제에 의한 사멸에 가장 감수성이다(도 1e, 3e, 4). CML 및 AML 세포주 및 일차 샘플의 패널에서 평가하는 경우, HSP90에 결합하는 PU-H71의 능력과 이들 세포에 대한 PU-H71의 세포 사멸 가능성 사이의 유의적 상관관계가 관찰되었다(도 3e, 4).
총괄적으로, 이들 데이터는, PU-H71 등의 특정한 HSP90 억제제가 정상 세포보다는 암 세포에서 보다 풍부한 HSP90 종의 서브세트에 우선적으로 결합함을 보여준다(도 5a). HSP90 발현 수준 단독에 의해 지시되지 않은 이러한 HSP90 종의 풍부함은 HSP90 억제에 대한 세포 감수성을 나타내고, 따라서 이러한 종양 HSP90 종의 풍부함을 사용하여 HSP90 치료에 대한 반응을 나타내는 생물마커로서 사용될 수 있다.
5.1.2. 종양- 및 WT-단백질 결합된 HSP90 종은 암세포에서 공존하지만, PU-H71은 종양-단백질/HSP90 종을 선택한다.
이들 HSP90 종과 관련된 생화학적 기능을 개발하기 위해, 본 발명자들은 각각 항체- 및 HSP90-억제제 비드를 사용한 면역침전(IP) 및 화학적 침전(CP)을 수행하고, 공지된 클라이언트의 선택된 서브세트와 공-침전하는 이들 기질에 결합된 HSP90의 능력을 분석했다. K562 CML 세포가 먼저 조사되었는데, 이는 이러한 세포주가 비정상 Bcr-Abl 단백질, 구조적 활성 키나제 및 이의 정상 대응체 c-Abl을 공-발현시키기 때문이다. 이들 2개 Abl 종은 분자량에 의해 명백하게 분리가능하고, 따라서 웨스턴 블롯에 의해 용이하게 구별가능하며(도 2a, 용해물), 이는 동일한 세포 기질에서 HSP90 종양- 및 야생형(WT)-클라이언트의 분석을 촉진시킨다. 본 발명자들은, 비특이적 IgG가 아닌 H9010이 Bcr-Abl 및 Abl 둘 다와 복합체를 형성하여 HSP90을 분리했다(도 2a, 5c, H9010). 상청액에 잔류하는 각각의 단백질 분획(도 2b, 좌측, 잔류 상청액)과 면역침전된 Bcr-Abl 및 Abl(도 2a, 2b, 좌측, H9010)의 비교는, 당해 항체가 K562 세포에서 돌연변이체 또는 WT 형태의 Abl에 결합된 HSP90에 대해 우선적으로 풍부하지 않음을 나타냈다.
대조적으로, PU-결합된 HSP90은 Bcr-Abl 단백질을 우선적으로 분리했다(도 2a, 2b, 우측, PU-비드). HSP90/Bcr-Abl 종의 PU-비드 고갈 후(도 2b, 우측, PU-비드), H9010은 잔류 HSP90/Abl 종을 침전시켰다(도 2b, 우측, H9010). PU-비드는 실질적으로 포화 조건(즉, 과량의 용해물, 도 6a, 좌측, 및 비드, 도 6a, 우측)에서 Hsp90/Bcr-Abl 종의 선택성을 유지했다. Bcr-Abl/HSP90 종에 대한 PU-H71의 생화학적 선택성의 추가의 확인으로서, Bcr-Abl은 Abl보다 PU-H71에 의한 퇴화에 더욱 감수성이었다(도 2d). 비정상 Abl 종에 대한 PU-H71의 선택성은 일차 CML 샘플(도 7b) 뿐만 아니라 기타 확립된 t(9; 22)+ CML 세포주(도 7a)로 확장시켰다.
5.1.3. 종양-단백질 결합된, 그러나 WT-단백질 결합되지 않은 HSP90 종은 HSP90에 의한 클라이언트 단백질 조절에 대한 공-샤페론 점증에 가장 의존적이다.
PU-H71- 및 항체-관련 HSP90 분획 사이를 추가로 차별화하기 위해, 본 발명자들은 순차 고갈 실험을 수행했고, 2개 종의 공-샤페론 후보자를 평가했다32. HSP90/Bcr-Abl 복합체를 함유하는 HSP90의 분획은 Hsp70, Hsp40, HOP 및 HIP를 포함하여 몇몇 공-샤페론을 결합했다(도 2c, PU-비드). PU-비드 풀-다운은 또한 몇몇 추가의 HSP90 공-샤페론 종에 대해 풍부해졌다. 이들 발견은 PU-H71이 공-샤페론-결합된 HSP90을 인식함을 강력하게 시사한다. HSP90/Abl 종을 포함하는 것으로 밝혀진 PU-비드-고갈된 잔류 HSP90 풀은 공-샤페론에 결합하지 않았지만(도 2c, H9010), 이들의 풍부한 발현은 당해 용해물에서 검출되었다(도 2c, 잔류 상청액). 그러나, 공-샤페론은 전체 세포 추출물 중의 H9010에 의해 분리되었다(도 5b, 5c).
이들 발견은 CML 세포에서 Bcr-Abl 또는 Abl에 우선적으로 결합된 HSP90의 명백한 풀의 존재를 시사한다(도 2). H9010은 Bcr-Abl 및 Abl 함유 HSP90 종 둘 다에 결합하고, PU-H71은 Bcr-Abl/HSP90 종에 선택적이다. 본 발명자들의 데이터는 또한 HSP90이, 비정상(즉, Bcr-Abl) 단백질의 활성을 조절하지만 정상(즉, Abl) 단백질의 활성을 조절하는 않는 경우에 고전적 공-샤페론 Hsp70, Hsp40 및 HOP를 사용하고 보다 급격하게 요구할 수 있음을 시사한다(도 5a). 이러한 가설에 따라, 본 발명자들은 Bcr-Abl이 K562 세포에서 Hsp70, HSP90 공-샤페론의 녹-다운에 대해 Abl보다 더욱 감수성임을 발견한다(도 2e).
5.1.4. 종양-단백질/HSP90 종 선택성 및 PU-H71의 복합체 포착능은 모든 HSP90 억제제에 의해 공유되지 않는다.
이어서, 본 발명자들은, 합성 억제제 SNX-2112 및 NVP-AUY922, 및 천연 생성물 GM35를 포함하여, PU-H71과 유사한 방식으로 HSP90의 N-말단 조절 포켓과 상호작용하는 기타 억제제가 유사한 HSP90 종을 선택적으로 분리할 수 있는지를 평가했다(도 2f). SNX-비드는 Bcr-Abl/HSP90에 대한 선택성을 입증했고, NVP-비드는 H9010과 유사하게 거동했지만 Bcr-Abl/HSP90 및 Abl/HSP90 종을 구별하지 못했다(각각 SNX- 대 NVP-비드, 도 2f). GM-비드는 또한 세포 용해물에서 HSP90의 부모집단을 인식했지만(도 3a), 이들은 공침전 Bcr-Abl에서 PU-비드보다 훨씬 덜 효율적이었다(도 2f, GM-비드). HSP90/클라이언트 단백질 복합체의 포착에 있어서 GM의 유사한 비효율성은 이미 보고되어 있다36.
5.1.5. 종양-단백질/HSP90 종 선택성 및 PU-H71의 복합체 포착능은 Bcr-Abl/HSP90 종으로 제한되지 않는다.
종양-단백질에 대한 선택성이 Bcr-Abl로 제한되는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 기타 종양 세포주에서 몇몇 추가로 잘-규정된 HSP90 클라이언트 단백질을 시험했다(도 6b-d)37,38. K562 세포에서 본 발명자들의 결과와 일치하게, H9010은 SKMe128 흑색종 세포에서 발현된 돌연변이체 B-Raf 및 CCD18Co 정상 결장 섬유아세포에서 발현된 ST B-Raf 둘 다와 복합체를 형성한 HSP90을 침전시켰다(도 6b, H9010). 그러나, PU- 및 GM-비드는 HSP90/돌연변이체 B-Raf를 선택적으로 인식했고, 이는 HSP90/WT B-Raf의 보다 적은 인식을 나타낸다(도 6b, PU-비드 및 GM-비드). 그러나, K562 세포의 경우에서와 같이, GM-비드는 돌연변이체 클라이언트 단백질의 공-침전에 있어서 PU-비드보다 현저히 덜 효율적이었다. 유사한 결과는 기타 HSP90 클라이언트에 대해 수득되었다(도 6c, 6d).
요약하면, PU-H71은, CML에서 악성 표현형에 중요한 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 광범위한 단면적을 풍부하게 한다. PU-결합된 HSP90과 비정상 CML 복합체와의 상호작용은 일차 CML 샘플에서 유지되었다.
5.1.6. PU-H71은 단백질을 동정했고, 네트워크는 악성 표현형에 중요한 것들이다.
본 발명자들은, PU-비드 풀-다운시의 이들 단백질의 존재가 기능적으로 중요하고 CML 세포에서 악성 복합체를 광범위하게 뒷받침하는데 있어서 HSP90에 대한 소정 역할을 시사하는 것으로 가정한다.
PU-비드에 의해 동정된 네트워크가 K562에서 형질전환에 중요하다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은, 개개 네트워크로부터의 중요 결절 단백질의 억제제(Bcr-Abl, NFκB, mTOR, MEK 및 CAMIIK)가 K562 세포의 성장 및 증식을 감소시키는 것을 후속적으로 밝혀냈다.
이어서, 본 발명자들은 PU-비드가 CML에서 할당된 역할 없이 HSP90 상호작용제를 동정했고, 또한 형질전환된 표현형에 관현함을 입증했다. 히스톤-아르기닌 메틸트랜스퍼라제 CARM1, 다수 유전자57의 전사 공-활성화제는 CML 세포주 및 일차 CML 세포로부터 PU-비드 풀-다운시에 확인되었다. 이는, PRMT5 등의 기타 아르기닌 메틸트랜스퍼라제가 난소암 세포에서 HSP90 클라이언트인 것으로 밝혀졌지만58, HSP90과 CARM1 사이의 최초 보고된 연계이다. 상승된 CARM1 수준은 전립선 및 유방암의 발달에 관련되지만, CML 백혈병원성에서 CARM1의 중요성은 전혀 알려져 있지 않다57. 본 발명자들은 PU-비드에 의해 인식되고 또한 PU-H71에 의한 퇴화에 감수성인 HSP90 종에 의해 실질적으로 완전히 포획된 CARM1을 발견했다. 따라서, CARM1은 CML에서 신규 HSP90 종양-단백질일 수 있다. 실제로, 대조군 shRNA가 아닌 CARM1을 사용한 녹-다운 실험은 정상 CD34+ 세포가 아닌 K562 세포에서 감소된 생존률 및 아폽토시스의 유도를 입증했고(도시되지 않음), 이는 이러한 가설을 뒷받침한다. qPCR 데이터는 CARM1 mRNA 수준이 2개의 상이한 shRNA에 의해 현저히 감소되었음을 확인시켰다(데이터는 도시되지 않음).
PU-풀다운시에 단백질의 존재가, 단지 이들의 풍부한 발현이 아니라 비정상적으로 활성화된 신호전달에서 이들의 관여에 기인한다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 K562 및 Mia-PaCa-2(췌장암 세포주)로부터의 PU-비드 풀다운을 비교했다. 두 세포는 고도의 STAT5 단백질을 발현하지만, STAT5 포스포릴화 및 DNA-결합59에 의해 입증된 바와 같이, STAT5 경로의 활성화는 K562 세포에서만 관찰되었다. 따라서, 이러한 단백질은 K562 PU-비드 풀다운에서만 동정되었다. 대조적으로, 활성화된 STAT3은 K562 및 Mia-PaCa-2 세포 추출물 둘 다로부터의 PU-HSP90에서 동정되었다.
mTOR 경로는 K562 및 Mia-PaCa-2 세포 둘 다에서 PU-비드에 의해 동정되었고, 실제로 PP242(mTOR60의 ATP 도메인을 표적화하는 선택적 억제제)에 의한 이의 약리학적 억제는 두 세포에 독성이 있다. 한편, Abl 억제제 Gleevec61은 K562 세포에 대해서만 독성이 있다. 두 세포는 Abl을 발현하지만, K562만이 발암성 Bcr-Abl을 갖고, PU-비드는, Mia-PaCa-2 세포가 아닌 K562 세포에서 Abl을 Bcr-Abl로서 동정한다.
5.1.7. PU-H71은 발암성 STAT-활성화의 신규 메카니즘을 동정한다.
PU-비드 풀-다운은, CML 백혈병원성에서 구조적으로 활성화되는, Bcr-Abl41, CAMKIIγ52, FAK53, vav-I62 및 PRKD248을 포함하는 몇몇 단백질을 포함한다. 이들은, 이들의 고정상 수준이 HSP90 억제에 따라 감소하기 때문에 이들의 안정성을 위해 HSP90에 의존하는 종래의 HSP90-조절된 클라이언트이다. 또한, STAT3 및 STAT5의 구조적 활성화는 CML에서 보고되어 있다41 ,46. 그러나, 이들 단백질은, STAT5 및 STAT3 수준이 HSP90 억제시에 본질적으로 비변형 상태로 존재하기 때문에 종래 HSP90 클라이언트의 참조에 적합하지 않다. 또한, PU-풀-다운은 mTOR, VSP32, VSP15 및 RAPTOR 등의 활성 신호전달 메가-복합체의 일부로서 잠재적으로 분리된 단백질을 함유한다44. 또한, p-mTOR의 세포 수준에 의해 측정된 mTOR 활성은 복합체 성분보다 HSP90 억제에 보다 감수성인 것으로 나타난다(즉, PU-H71 처리된 ㅅ포에서 p-mTOR 및 RAPTOR의 상대적 감소를 비교한다). 추가로, PU-HSP90 복합체는 GRB2, DOCK, CRKL 및 EPS15 등의 개작 단백질을 함유하고, 이들은 K562에서 복수의 비정상적으로 활성화된 신호전달 경로의 중요 효과기에 Bcr-Abl을 연결시킨다30 ,41. 또한, 이들의 발현은 HSP90 억제시에 변하지 않은 상태로 유지된다. 따라서, 본 발명자들은 특정한 발암성 경로에 대한 HSP90의 기여가 이의 종래 폴딩 작용 이상까지 연장하는 것으로 생각했다. 구체적으로, 본 발명자들은 HSP90이 또한, 이전에 주장된 바와 같이40 ,63, 이들의 활성 배치에서 신호전달 복합체를 유지하는 스캐폴딩 분자로서 작용하는 것을 보여준다.
5.1.8. HSP90은 STAT5에 결합하고 이의 형태에 영향을 미친다.
이러한 가설을 조사하기 위해, 추가로 본 발명자들은 CML에서 구조적으로 포스포릴화되는 STAT5에 집중했다64. p-STAT5의 전체 수준은 포스포릴화 및 탈포스포릴화 이벤트의 균형에 의해 측정했다. 따라서, K562 세포에서 고도의 p-STAT5는 상류 키나제 활성의 증가 또는 단백질 티로신 포스파타제(PTPase) 활성의 감소를 반영할 수 있다. 또한, HSP90 및 p-STAT5 사이의 직접 상호작용은 p-STAT5의 세포 수준을 조절할 수 있다.
이들 잠재적 메카니즘의 상대적 기여를 분석하기 위해, 본 발명자들은 먼저, K562 세포에서 STAT5 포스포릴화를 조절하는 주요 키나제 및 PTPase에 대한 PU-H71의 효과를 조사했다. Bcr-Abl은 JAK 포스포릴화에 대한 요구 없이 직접 STAT5를 활성화시킨다64. 따라서, STAT5-포스포릴화는 Bcr-Abl 억제제 Gleevec의 존재하에 신속하게 감소되었다. HPS90은 Bcr-Abl 안정성을 조절하지만, HSP90 억제 후의 고정상 Bcr-Abl 수준의 감소는 3시간 이상을 필요로 한다65. 실제로, CRKL 포스포릴화의 무감소에 의해 증명된 바와 같이, Bcr-Abl 발현 또는 기능의 어떠한 변화도 p-STAT5 수준이 감소된 시간 간격에서 PU-H71에 의해 관찰되지 않았다. 또한, HCK(Bcr-Abl로 형질감염된 32Dcl3 세포에서 STAT5dml 키나제 활성화제66)의 활성 및 발현의 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
따라서, 0 내지 90분 간격에서 PU-H-71에 의한 p-STAT5 포스포릴화의 감소는 Bcr-Abl 또는 기타 키나제의 불안정화에 의해 설명되지 않는것 같다.
따라서, 본 발명자들은 PU-H71의 존재하에 p-STAT5 수준의 신속한 감소가 PTPase 활성의 감소에 의해 설명될 수 있는지를 검사했다. SHP2(주요 시토졸 STAT5 포스파타제67)의 발현 및 활성은 또한 이러한 시간 간격에서 변화되지 않았다. 유사하게는, STAT-신호전달61을 스위칭하는 음성 피드백 루프를 형성하는 SOCS1 및 SOCS3의 수준은 PU-H71에 의해 영향을 받지 않았다.
따라서, 간격 0-90분에서 STAT5에 대한 어떠한 효과도 HSP90 억제에 있어서 STAT5에 대한 키나제 또는 포스파타제 활성의 변화에 기인하지 않을 수 있다. 대체 메카니즘으로서, 및 STAT5가 아닌 p-STAT5의 대부분이 CML 세포에서 HSP90 결합되기 때문에, 본 발명자들은 활성화된 STAT5의 세포 수준이 HSP90에 대한 직접 결합에 의해 미세 전환된다고 가정했다.
STAT의 활성화/불활성화 주기는 상이한 이량체 형태 사이의 이들의 변화를 수반한다. STAT의 포스포릴화는, 포스포릴화시에 병렬 이량체 형태를 유발하는 항-병렬 이량체 형태로 발생한다. 한편, STAT의 탈포스포릴화는, 티로신 포스포릴화된 STAT 이량체가 병렬 형태로부터 반-병렬 형태로 이동하여 포스포-티로신을 포스파타제에 대한 최상의 표적으로 노출시켜야 한다는 점68에서 과도한 공간적 재배향을 필요로 한다. 본 발명자들은, STAT5가 HSP90에 결합하는 경우에 트립신 분해에 보다 감수성임을 발견하고, 이는, HSP90의 결합이 STAT5의 형태 상태를 직접 조절하여, 탈포스포릴화에 바람직하지 않고/않거나 포스포릴화에 바람직한 형태로 STAT5를 잠재적으로 유지한다는 것을 나타낸다.
이러한 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 오르토바나데이트(NH3VO4)(비특이적 PTPase 억제제)가 세포에 부가되어 STAT5의 탈포스포릴화를 차단하는 펄스-추적 방법을 사용했다. 이어서, p-STAT5의 잔류 수준은 몇몇 후기 시점에서 측정했다. PU-H71의 부재하에, p-STAT5는 신속하게 축적되었고, 이의 존재하에 세포 p-STAT5 수준은 감소되었다. 이러한 과정의 역학은 p-STAT5 고정상 감소 속도와 유사하다.
5.1.9. HSP90은 STAT5-함유 전사 복합체에서 직접 활성 형태로 STAT5를 유지한다.
STAT5 포스포릴화 및 이량체화 이외에, STAT5의 생물학적 활성은 이의 핵 전좌 및 이의 다양한 유전자에 대한 직접 결합를 필요로 한다64 ,68. 따라서, 본 발명자들은 HSP90이 STAT5 유전자의 전사 활성화를 촉진시킬 수 있고 따라서 프로모터 결합된 STAT5 전사 복합체에 관여하는지를 생각했다. ELISA-기반 분석을 사용하여, 본 발명자들은 STAT5가 K562 세포에서 구조적으로 활성이고 STAT5 결합 콘센서스 서열(5'-TTCCCGGAA-3')에 결합하는 것을 발견했다. STAT5 활성화 및 DNA 결합은 PU-H71을 사용한 HSP90 억제시에 용량-의존적 방식으로 부분적으로 폐기된다. 추가로, K562 세포에서 정량적 ChIP 분석은 중요한 STAT5 표적 MYC 및 CCND2에서 HSP90 및 STAT5 둘 다의 존재를 나타냈다. 어떠한 단백질도 유전자간 조절 영역에 존재하지 않았다(도시하지 않음). 따라서, PU-H71(1μM)은 STAT5 표적 유전자 CCND2, MYC, CCND1, BCL-XL 및 MCL162의 mRNA 풍부함을 감소시켰지만, 대조군 유전자 HPRT 및 GAPDH의 풍부함을 감소시키지 않았다.
종합적으로, 이들 데이터는, STAT5 활성이 CML 세포에서 HSP90에 의해 양으로 조절됨을 나타낸다. 본 발명자들의 발견은, STAT5에 대한 HSP90 결합이 당해 단백질의 형태를 조절하고 이러한 메카니즘에 의해 STAT5 포스포릴화/탈포스포릴화 역학을 변경시켜 p-STAT5의 증가된 수준으로 당해 균형을 이동시킨다는 시나리오와 일치한다. 또한, HSP90은 STAT5 함유 전사 복합체 내에서 STAT5를 활성 형태로 직접 유지한다. STAT-경로의 복잡성을 고려하면, 기타 잠재적 메카니즘은 배제될 수 없다. 따라서, 단백질 안정성의 촉진에서의 이들의 역활 이외에, HSP90은 활성 형태로 클라이언트 단백질을 유지함으로써 종양원성을 촉진시킨다.
보다 광범위하게는, 당해 데이터는, 세포 HSP90의 PU-H71-HSP90이 종양 세포에서 종양원성 단백질 기능의 후원에 가장 밀접하게 연루되고, 표지된 PU-H71을 사용하여, 특이적 종양 세포에서 악성 표현형을 유지하는데 요구되는 단백질 경로의 광범위한 단면적에 결합되는 이러한 종양 HSP90 종을 동정할 수 있음을 보여준다.
5.1.10. HSP90은 종양 세포에서 2개의 독특한 형태로 존재한다.
상기 제공된 방법은 i) 발암성 클라이언트 단백질과 관련되는 HSP90의 분획에 우선적으로 결합하고 ii) 종양-클라이언트 결합된 형태로 HSP90을 고정하는 PU-H71의 몇몇 특성의 잇점을 취한다.
또한, 종양 세포 생존에 요구되는 HSP90 클라이언트의 동정은 HSP90 치료에 유리할 가능성이 있는 환자의 선택 및 임상 시험 동안 HSP90 억제제 효능의 약동학적 모니터링을 위한 종양-특이적 생물마커로서 사용할 수 있다(즉, 발현 또는 포스포릴화가 HSP90 억제시에 변화하는 클라이언트). 종양 특이적 HSP90 클라이언트 프로파일링은 종양의 개인화된 치료적 표적화를 위한 한 가지 방법을 제공한다.
이러한 연구는, 종양 중의 HSP90이 다중-샤페론 복합체에 전적으로 존재하는 반면 정상 조직으로부터의 HSP90이 잠재적 비복합체화된 상태로 존재하는 본래 모델의 보다 복잡한 이해를 제공하는, 문헌[참조: Kamal et al]의 연구를 실증하고 현저히 확장한다34. 본 발명자들은 HSP90이 암세포에서 생화학적으로 독특한 복합체를 형성한다는 것을 보여준다(도 5a). 이러한 관점에서, 암세포 HSP90의 주요 분획은 정상 세포와 유사한 "관리" 샤페론 기능을 유지하고, 암세포에서 풍부화되거나 확장된 기능상 독특한 HSP90 풀은 종양 세포 생존을 유지하는데 요구되는 종양원성 단백질과 특이적으로 상호작용한다. 아마도, 이러한 HSP90 기능은 종양 세포 기질에서 확장되고 구조적으로 유지되는 샤페론 복합테의 세포 스트레스 특이적 형태를 나타낸다. 본 발명자들의 데이터는 이것이 악성 표현형을 유지하는데 필요한 기능을 수행할 수 있음을 시사한다. 이러한 한 가지 역활은 돌연변이된(즉, mB-Raf) 또는 키메라 단백질(즉, Bcr-Abl)의 폴딩을 조절하는 것이다32 ,33. 본 발명자들은 이제 추가 역활에 대한 실험적 증거를 제시한다; 즉 비정상적으로 활성화된 신호전달 복합체에 연루된 분자의 스캐폴딩 및 복합체 형성을 촉진시키기 위해. 본 발명자들은 CML에서 구조적 STAT5 신호전달을 유지하는데 있어서 HSP90에 대한 이러한 역활을 기재했다. 이들 데이터는 이전 연구와 일치하고, 여기서 본 발명자들은 HSP90이 B 세포 림프종 세포에서 BCL6 발암성 전사 리프레서에 의해 기능적 전사 저해 복합체를 유지하는데 요구되었음을 밝혀냈다70.
HSP90의 PU-결합 분획을 비-PU-결합 분획과 어떻게 구별할 수 있는가? 이는 활성 조사하에 남아 있는 매우 복잡한 문제이다. HSP90α 및 HSP90β 이소형은 HP-H71에 의해 인식되지만, 본 발명자들의 데이터는 Bcr-Abl/HSP90(UP-선호) 및 Abl/HSP90(PU-비-선호) 샤페론 복합체 사이의 적어도 하나의 차이에 대한 증거를 제공한다. 즉, Bcr-Abl/HSP90 샤페론 복합체는 다수의 공-샤페론(이는 활성 샤페론 공정이 진행중임을 시사하고, Hsp70의 침묵에 대한 Bcr-Abl의 감수성에 의해 추가로 뒷받침됨)을 함유하는 반면, Abl/HSP90 복합체는 관련된 공-샤페론을 결여한다(활성적으로 샤페론된 Abl이 아닌 격리된 Abl을 나타내고, Hsp70 녹다운에 대한 Abl의 비감수성에 의해 추가로 뒷받침됨)(도 2e 참조). 추가로, 본 발명자들은 이의 클라이언트 단백질에 보다 열광적으로 결합하도록 돌연변이된 HSP90이 야생형 HSP90보다 PU-비드에 대해 더욱 열광적으로 결합하는 것을 관찰했다(준비시의 원고). 마지막으로, 본 발명자들은 PU-H71 및 겔다나마이신 결합에 대한 HSP90 포스포릴화의 상이한 영향을 관찰했다. 추가로 추구되는 이들 발견은 다양한 HSP90 억제제가 샤페론에 대한 특이적 전사후 변형에 의해 독특하게 영향을 받을 수 있음을 시사한다. 함께 고려하면, 이들 주요 관찰은 PU-H71이 활성 샤페론 주기에 관여하는 HSP90 분획을 인식하고 이러한 특징이 다른 HSP90 억제제에 의해 반드시 공유되는 것은 아님을 보여준다.
5.2. 진단 및 예방 분야를 위한 표지된 HSP90 억제제
종양-대-종양 방식으로 "발암성 HSP90"의 풍부함을 측정하기 위해, 본 발명은 진단 및 예방 목적에 사용될 수 있는 몇몇 화학적 도구를 제공한다(섹션 5.2.1 및 5.2.2 참조). 추가로, 화학적 도구는 종양 관련된 HSP90의 유전성에 대한 새로운 식견을 제공하고, 종양-촉진 생물학적 경로 및 단백질을 조절하는 종양-특이적 HSP90을 동정하기 위한 특정 HSP90 억제제의 생화학적 특징을 충족시킨다. 이러한 도구는 이러한 종양 "발암성 HSP90" 종을 특이적으로 동정하고 이와 상호작용하는 표지된 HSP90 억제제를 포함하고, 이는 적절하게는 종양 중의 상이한 부모집단에서 "발암성 HSP90" 종의 풍부함을 측정할 수 있게 하여 HSP90 억제 치료에 대한 감수성을 측정 및 예측한다. 더욱이, "발암성 HSP90"의 풍부함의 측정은 종양이 HSP90에 의존적인지를 측정하는 수단을 제공한다.
한 가지 측면에서, 본 발명은, 종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 세포를 함유하는 샘플을, 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계;
(b) 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 측정된 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 정상 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
참조 양과 비교하여 단계(b)에서 측정된 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
당해 방법은 HSP90 치료용 생물마커로서 HSP90 종("발암성 HSP90)의 풍부함을 종양에서 측정하는 것을 포함한다. 이러한 HSP90 종의 풍부함은 종양 중의 전체 HSP90 발현과 반드시 상응하는 것은 아니다. 본 발명은 "발암성 HSP90"의 풍부함을 측정하는 것에 대한 몇몇 해결책을 제공한다. 이러한 한 가지 양태에서, 특정 HSP90 억제제의 표지된 유도체를 도구로서 사용하여 이의 존재 및 이의 풍부함을 측정할 수 있다.
추가로, 이러한 특정 방법에서, 참조 양과 비교하여 단계(b)에서 측정한 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제 양의 비가 보다 클수록, HSP90 억제제 치료에 대한 반응 가능성 정도는 보다 크다.
또한, 이러한 특정 방법에서, 단계(a)에서 측정한 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양이 보다 클수록, HSP90 억제제 치료에 대한 반응 가능성 정도는 보다 크다.
이러한 특정 방법의 한 가지 양태에서, 정상 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 참조 양은 종양으로부터의 세포를 함유하는 샘플에서 정상 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양이다.
또 다른 양태에서, 정상 세포에 결합된 표지된 HSP 억제제의 참조 양은 참조 샘플에서 정상 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 소정 양이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서,
(a) 종양 또는 종양의 세포를 함유하는 샘플을, 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계;
(b) 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 측정된 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 참조와 비교하는 단계를 포함하고,
참조 양과 비교하여 단계(b)에서 측정된 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HPS90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타내는, 방법을 제공한다.
이러한 특정 방법의 한 가지 양태에서, 참조 샘플은 전혀 또는 거의 "발암성 HSP90" 발현을 갖지 않는 암세포이다. 또 다른 양태에서, 참조는 "발암성 HSP90"에 대한 결합을 전혀 또는 거의 갖지 않는 상응하게 표지된 화합물이다.
검출가능하게 표지된 HSP90 억제제는 임의의 검출가능한 표지로 표지될 수 있고, 이러한 다수의 표지는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제는 형광 표지된, 비오틴 표지된, ANCA-표지된 또는 방사활성적으로 표지된 것일 수 있다.
이러한 특정 방법의 실시에서, 종양은 엑소좀 등의 "발암성 HSP90"을 함유하는 임의의 종양 또는 종양-유래된 생물학적 형태일 수 있다. 예를 들면, "발암성 HSP90"을 함유하는 종양 및 기타 세포 또는 종양-유래된 생물학적 형태는, 결직장암, 췌장암, 갑상선암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림파구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 백혈병, 림프구 백혈병, 다발성 골수종, 기저 세포 암종, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 골수증식성 질환, 위장 기질 종양, 식도암, 위암을 포함하는 위장암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌 종양, 여포성 림프종 및 확산 거대 B-세포 림프종을 포함하는 림프종, 및 난소암, 경부암 및 자궁내막암을 포함하는 부인과암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 암과 관련되거나, 이를 나타내거나, 이로부터 유래될 수 있다.
이러한 특정 방법의 실시에서, 종양 세포 또는 종양 관련 세포 또는 생물학적 형태는 대상체에 존재하거나 대상체로부터 분리될 수 있다. 따라서, 접촉되는 종양, 종양 세포 또는 종양 관련 세포는 자체로 생체내에서 고형 종양 형태 또는 조직 샘플 또는 액상 종양 또는 생물학적 유체; 혈액 채취 동안 수득한 샘플, 골수 흡인, 생검, 세침 흡인 또는 수술 과정; 생물학적 유체; 혈액 또는 골수에서와 같이 부착된 세포의 형태로 존재할 수 있다. 표지된 HSP90 억제제와 접촉되는 세포는 분쇄된 세포, 살아있는 세포, 동결 세포, 고정된 및 투과된 세포 또는 포르말린-고정된 파라핀-매립된 세포를 포함하는 임의의 형태로 존재할 수 있다.
검출가능하게 표지된 HSP90 억제제는 치료제로서 투여되는 표지된 형태의 HSP90 억제제일 수 있거나, 화학적으로 무관한 HSP90 억제제 또는 투여되는 HSP90 억제제의 표지된 형태의 유사체(analog), 동족체(homolog) 또는 유도체(derivative)를 포함하는 표지된 형태의 상이한 HSP90 억제제일 수 있다. 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제 및 가장 가능하게는 상응하는 비표지된 HSP90 억제제가 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 요건에 대한 대상체는 다수의 종양 및 종양 세포에 존재한다. 이와 관련하여, "우선적으로"는 HSP90 억제제가, 만약에 있다면, 정상 또는 비-종양 세포의 HSP90 특성에 결합하는 친화성과 비교하여, HSP90의 종양-특이적 형태에 대해 실질적으로 보다 큰 친화성으로 결합하는 것을 의미한다.
현재, 치료제로서 투여될 것으로 고려되는 한 가지 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 PU-H71의 동족체, 유사체 또는 유도체이다[참조: 예시적 HSP90 억제제를 기재하기 위한 미국 특허 제7,820,658호, 제7,834,181 B2호, 제7,906,657 B2호, 이는 모두 이들의 전체가 본원에서 도입된다].
한 가지 양태에서, HSP90 억제제는 PU-H71이고, 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 PU-H71의 동족체, 유사체 또는 유도체의 형태이다. 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제일 수 있는 PU-H71 형태의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하기에 기재되어 있는, [124I]-PU-H71, PU-H71-FITC2 또는 PU-H71-NBD1, 또는 PU-H71-비오틴-5, PU-H71-비오틴-6, PU-H71-비오틴-8 또는 PU-H71-비오틴-9와 같은 PU-H71의 비오티닐화 동족체를 포함한다.
5.2.1. 발암성 HSP90을 검출하기 위한 형광성, 비오티닐화된 및 ANCA-표지된 프로브
본 발명은 암세포에서 발암성 HSP90을 검출할 수 있는 형광 표지된, 비오티닐화된 프로브 및 ANCA-표지된 프로브를 제공한다. 섹션 5.2.1.1.은 본 발명에 따라 사용되는 다양한 형태의 프로브의 생성을 기재한다. 섹션 5.2.1.2.는 예방 및 진단 분석에서 이러한 프로브의 사용을 기재한다.
5.2.1.1. 프로브의 생성
본 발명은 세포 투과성이고 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합하는 형광 표지된, 비오티닐화된 및 ANCA-표지된 억제제를 제공한다. 세포 투과성 억제제는 세포의 세포막을 투과하고 세포의 세포질 내에서 HSP90을 결합할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용하도록 하기 위해, 표지된 억제제는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 검출 방법에 의해 측정할 수 있는 양으로 세포를 투과해야 한다. 섹션 5.2.1.1.1.은 세포 투과성이고 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합할 수 있는 상이한 형광 표지된 프로브의 개발을 기재한다. 섹션 5.2.1.1.2.는 세포 투과성이고 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합할 수 있는 상이한 비오티닐화된 프로브의 개발을 기재한다. 섹션 5.2.1.1.3.은 세포 투과성이고 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합할 수 있는 상이한 ANCA-표지된 프로브의 개발을 기재한다.
5.2.1.1.1. 형광 표지된 프로브
HSP90의 형광 표지된 억제제는, 형광 편광 분석에서 리간드로서 사용된 피라졸 1(플루오레세인 동족체, VER-00045864)15 뿐만 아니라 겔다나마이신(GM-FITC, 13GM-Bdipy, 13GM-cy3b14)의 동족체와 함께 이미 보고되어 있다(도 8). 세포 투과성 GM-FITC 유도체는 형광 현미경에 의해 세포 표면 HSP90을 동정하기 위해 사용되었다16. 그러나, HSP90은 특정한 세포에서만 검출된 세포 표면 발현을 갖는 주로 세포질 단백질이다1 ,2. 따라서, 형광 프로브는 세포내 및 세포 표면 HSP90 둘 다를 분석하는데 요구된다.
"발암성 HSP90"과 특이적으로 및 밀접하게 상호작용하는 HSP90 세포-투과성 프로브는 이러한 잠재적 생물마커의 유동 세포계수 측정에 바람직한데, 이는 유동 세포계수에 의해 세포내 항원의 검출에 사용된 고정/투과 방법이, 이종 모집단에서 세포의 특성화를 위한 유동 세포계수에 유용한 특성인, "발암성 HSP90 복합체" 및 세포 형태 및 표면 면역반응성의 파괴를 생성할 수 있기 때문이다. 이러한 문제를 해소하기 위해, 본 발명은 살아있는 세포를 투과하고 표적에 결합하는 형광 표지된 HSP90 억제제의 합성, 특성화 및 평가 방법을 제공한다.
이러한 본 발명은 PU-H71(2)의 다양한 신규 형광 표지된 유도체, HSP90의 퓨린-스캐폴드 억제제(도 8)를 제공하며, 형광-활성화된 유동 세포계수 및 형광 현미경에 의한 HSP90의 연구를 위한 프로브로서 이들의 생물학적 적용을 기재한다. BIIB021, MPC-3100, PU-H71 및 Debio 0932(이전 CUDC-305)를 포함하여 퓨린-스캐폴드에 기반한 몇몇 HSP90 억제제는 현재 암을 위한 임상 개발하에 있다18,19.
형광 이소티오시아네이트(FITC), 4-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸(NBD) 또는 PU-H71에 접합된 적색 이동된 염료 설포르호다민 101(텍사스 레드)을 함유하는, 열 충격 단백질 90(HSP90)을 위한 형광 리간드가 합성되었다(도 9). 2개의 화합물, 즉 PU-H71-FITC2(9) 및 PU-H71-NBD1(8)은 형광-활성화된 유동 세포계수 및 형광 현미경에 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 분자는 이종성 살아있는 세포 모집단에서 HSP90의 연구에 유용한 프로브로서 사용한다.
작은 염료-표지된 리간드의 개발을 위해, 최적 형광체 및 이의 부착 부위의 선택이 적절하다. 특히 소분자에서, 도입된 염료는 리간드의 생화학적 및 약동학적 특성에 현저히 영향을 미칠 수 있다. HSP90에 결합된 PU-H71(2)의 X-선 결정 구조에 따라20, 당해 리간드의 N9-알킬아미노 쇄는 용매를 향해 배향된다. 이전 SAR 뿐만 아니라 이러한 결과, 본 발명에서 합성된 몇몇 화합물은 N9 위치에 부착된 형광 표지를 함유한다. 특정한 양태에서, 하기 기재한 바와 같이, 상이한 링커를 갖는 PU-H71의 유도체는 FITC, NBD 또는 텍사스 레드(TR)로 표지되었다(도 1 참조).
본 발명의 한가지 양태에서, 6개 탄소 스페이서는 퓨린 스캐폴드에 기반하여 억제제의 구성 아민에 부착되고, 이에 의해 화합물 3을 제공한다(반응식 1 및 도 10). 본 발명자들은 고체 지지체에 PU-H71을 부착시키기 위해 이러한 링커를 이미 사용했고, 화합물 3이 HSP90에 대해 우수한 친화성을 보유함을 밝혀냈다21. 반응식 1에 도시된 바와 같이, 화합물 3은 DMF/Et3N에서 FITC와 반응하여 화합물 4(PU-H71-FITC1)을 HPLC에 의한 정제후에 40% 수율로 제공한다.
Figure 112017033467195-pat00002
반응식 1: PU-H71-FITC 및 PU-H71-NBD1의 합성
또 다른 양태에서, PU-H71-텍사스 레드(화합물 5; PU-H71-TR)는 화합물 3을 DMF 중에서 설포로다민 101 설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 5를 61% 수율로 수득한 후 HPLC로 정제하여 합성했다(반응식 1). NBD 유사물의 경우, 브로마이드 6을 DMF 중에서 화합물 7과 반응시켜 화합물 8(PU-H71-NBD1)을 47% 수율로 수득했다(반응식 1). 화합물 621 및 NBD 유도체 722는 사전에 기술된 바와 같이 제조했다.
또 다른 양태에서, 본 발명자들은 PU-H7123에 존재하는 2급 아민을 사용하고, 이를 FITC 또는 NBD-Cl과 직접 반응시켜 화합물 9(PU-H71-FITC2)(72%) 또는 화합물 10(PU-H71-NBD2)(40%)을 각각 수득했다(반응식 2 및 도 11). 아민에 직접 염료를 부착시키면 이온화가능한 아민 작용기의 존재에 기인하여 보다 세포 투과성인 유사물을 유도할 것임을 가정했다. 추가로, 수소 대신 이소프로필 그룹을 함유하는 유도체(예: 화합물 9 및 화합물 10)은 화합물이 보다 친유성이도록 하여 이들의 세포 투과성을 강화한다.
Figure 112017033467195-pat00003
반응식 2: PU-H71-FITC2 및PU-H71-NBD2의 합성
또 다른 양태에서, 반응식 3 및 도 12에 도시된 바와 같이, 데스이소프로필-PU-H71(화합물 13)을 FITC 또는 NBD-Cl과 반응시켜 화합물 14(PU-H71-FITC3)(74%) 또는 화합물 15(PU-H71-NBD3)(42%)를 각각 수득했다. 화합물 13은 N-(3-브로모프로필)-프탈이미드로 화합물 11을 N9-알킬화한 후, 하이드라진에 의해 프탈이미드를 제거하여 합성했다(반응식 3).
Figure 112017033467195-pat00004
반응식 3: PU-H71-FITC3 및 PU-H71-NBD3의 합성
PU-H71-FITC3(반응식 3에 도시됨)과 유사하지만 링커 길이가 상이한 추가의 화합물은 반응식 4에 묘사된 바와 같이 제조했다.
Figure 112017033467195-pat00005
반응식 4: PU-H71-FITC4, PU-H71-FITC5 및 PU-H71-FITC6의 합성
반응식 1-4에서 제조된 화합물들을 세포를 투과하고 세포 내에서 HSP90에 결합하는 이들의 능력에 대해 평가했다. 세포 투과성 프로브가 바람직한데, 이는 유세포 분석에 의한 세포내 항원 검출용으로 사용된 고착/투과화 방법이 흔히 이종 집단에서 세포의 특성화를 위한 유세포 분석에 유용한 특성인 세포 형태학 및 표면 면역반응성의 파괴를 유도하기 때문이다. 따라서, 고착 및 투과화 단계의 요구 없이 생존 세포에서 표적물과 상호작용하는 세포 투과성 리간드를 발견하는 것이 특별한 관심사이다.
상기 합성된 형광 표지된 PU-H71 유도체 중 어떤 것이 모체 화합물 PU-H71의 세포 투과성을 유지시켰는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 사람 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주, MV4-11 및 MOLM-13에서 이들 HSP90 프로브의 세포 투과성을 시험했다. 반응식 1-4에서 제조된 PU-H71의 10개의 형광성 유도체 중에서, 본 발명자들은, PU-H71-FITC2(9) 및 PU-H71-NBD1(8)이 세포를 투과하고 HSP90에 결합하는 가장 높은 능력을 갖는다(도 13)는 것을 발견한다. 구체적으로, 본 발명자들은 이들 두 유도체에 의한 생존 세포의 효율적인 염색(도 13A) 뿐만 아니라 표적물(HSP90) 억제를 나타내는 이들 세포 중의 생물학적 활성(도 13B, 13C)을 보여준다. 특히, 본 발명자들은, 두 PU-H71-FITC2(9) 및 PU-H71-NBD1(8)이 HSP90-클라이언트 단백질, 예를 들면, 돌연변이 FLT3 및 Raf-1을 퇴화시켜(도 13C) 이들 암 세포에서 세포간 HSP90 억제를 나타냄과 관련된 효과인 MOLM-13 세포의 생존력을 감소시킨다(도 13B)는 것을 보여준다.1-3
또한, PU-H71-FITC2(9)로 염색된 백혈병 세포의 공초점 형광 현미경 검사법은 탁월한 세포내 국지화를 나타냈다(도 14A). 이러한 실험에서, DAPI는 생존 및 비-생존 세포를 구별하기 위한 생존 염료로서 사용했다. 이 염료는 시험된 농도에서 생존 세포에서 불투과성이지만, 비-생존 세포를 투과하여 DNA의 특이 영역을 결합한다. DAPI는 대부분의 기구에서 UV 레이저로 여기시킨다. 유사한 데이터가 PU-H71-NBD1(8)로 생성되었다(도시되지 않음).
유세포 분석은 통상적으로 특정 마커를 사용하여 정상 및 악성 조혈에서 상이한 세포 집단을 분리하고 구별하는데 사용된다. 예로써, 배아 세포는 흔히 정량화되고, CD45 염색에 대해 밝은(CD45hi) 순환성 비-배아 세포와 대조적으로, 어두운 CD45 염색(CD45dim)을 특징으로 한다.24 이들 세포를 이들의 식별마커의 존재로 통문화하고 분리하고, 본 발명자들은 본원에서 표적물 HSP90을 또한 PU-H71-FITC2로 염색시킬 수 있음을 보여준다(도 14B). 종양 세포 HSP90에 대한 PU-H71의 선택적 결합을 지시하는 이전 보고서에 따라,23 PU-H71-FITC2는 1차 급성 골수성 백혈병 샘플에서 정상 세포(림프구)가 아니라 악성 세포(배아)를 우선적으로 염색시킨다(도 14B).
따라서, 본 발명자들은, PU-H71-FITC2(9) 및 PU-H71-NBD1(8)이 생존 세포를 투과하고 표적물에 결합한다는 것을 보여준다. 구체적으로, 본 발명자들은, PU-H71-FITC2 및 PU-H71-NBD1이 생존 세포를 염색하고(도 13A), 백혈병 세포의 생존력을 감소시키고(도 13B), HSP90 클라이언트 단백질의 퇴화로 지시된 바와 같이 세포내 HSP90을 억제하고(도 13C), 공초점 현미경 검사로 지시된 바와 같이 세포내로 국지화되고(도 14A), 유세포 분석에 의해 지시된 바와 같이 구체적으로 HSP90을 종양 세포 대 정상 세포에 결합하고(도 14B), 이들 프로브가 세포를 침투하고 PU-H71에 대해서와 유사하게, 구체적으로 종양 HSP90 표적물에 결합한다는 충분한 증거를 제공한다는 것을 보여준다. 도 4, 도 15, 도 16 및 도 18에 제공된 바와 같은 예들은 또한 이러한 PU-H71의 형광성 유도체가 "발암성" 종과 상호작용하고, 추가로 암세포의 거대한 스펙트럼에서 이 종들을 정량화하기 위한 수단을 제공한다는 것을 입증한다. 항목 5.2.1.2.에서 논의된 바와 같이, 이러한 PU-H71의 형광성 유도체는 형광 활성화된 유세포 분석용 프로브로서 또는 형광 현미경 검사에 의해 HSP90과 표적물의 실시간 상호작용을 모노터링하기 위한 수단으로서 적용할 수 있다.
상기 논의된 결과에 기초하여, 본 발명자들은 HSP90과 상호작용할 수 있고, 따라서 진단 및/또는 예방 수단으로서 사용될 수 있는 각종 기타 세포 투과성 프로브를 고안했다. 하나의 양태에서, PU-H71-FITC2와 유사하지만 벤조[d][1,3]디옥솔 환 상에 상이한 치환체를 갖는 화합물은 반응식 5에 도시된 바와 같이, PU-H71-FITC2와 유사한 방식으로 합성했다.
Figure 112017033467195-pat00006
반응식 5: PU-H71-FITC2와 유사한 화합물의 합성
또 다른 양태에서, 반응식 5에 묘사된 화합물과 유사하지만 퓨린 골격 상의 피리미딘 환이 피리딘 환으로 치환된 화합물을 반응식 6에 도시된 바와 같이, PU-H71-FITC2와 유사한 방식으로 합성했다.
Figure 112017033467195-pat00007
반응식 6: PU-H71-FITC2와 유사한 화합물의 합성
또 다른 양태에서, 화합물 PU-FITC7은 반응식 7에 묘사된 바와 같이 제조된다.
Figure 112017033467195-pat00008
반응식 7: PU-FITC7의 합성
또 다른 양태에서, 화합물 PU-FITC8은 반응식 8에 묘사된 바와 같이 제조된다.
Figure 112017033467195-pat00009
반응식 8: PU-FITC8의 합성
또 다른 양태에서, 화합물 PU-FITC9는 반응식 9에 묘사된 바와 같이 제조된다.
Figure 112017033467195-pat00010
반응식 9: PU-FITC9의 합성
또 다른 양태에서, 화합물 DZ13-FITC1(PU-DZ13-FITC)은 반응식 10에 묘사된 바와 같이 제조된다.
Figure 112017033467195-pat00011
반응식 10: 화합물 DZ13-FITC1의 합성
또 다른 양태에서, 화합물 SNX-FITC는 반응식 11에 묘사된 바와 같이 제조된다.
Figure 112017033467195-pat00012
반응식 11: 화합물 SNX-FITC의 합성
5.2.1.1.2. 발암성 HSP90을 검출하기 위한 비오티닐화 프로브의 합성
PU-H71(2) 및 데스이소프로필-PU-H71(13)의 일련의 비오티닐화 유사물을 세포막을 침투할 수 있고, 생존 세포에서 세포내 HSP90에 결합할 수 있는 화합물을 수득할 목적으로 제조했다. HSP90 억제제 13 및 2를 링커를 통해 비오틴에 접합시켰다. 링커의 형태뿐만 아니라 이의 길이를 생존 세포를 침투하여 HSP90에 결합할 수 있는 화합물을 식별하기 위해 계통적으로 변경했다.
비오틴 태그는 스트렙타비딘에의 후속적 결합을 통해 풀 다운 실험을 가능하게 한다. 링커는 HSP90 및 스트렙타비딘에 대한 동시 결합을 가능하게 하기에 충분한 길이여야 한다.
화합물 13 및 화합물 2는 아미드 결합의 형성을 통해 비오틴 및 비오틴 함유 링커의 직접 부착을 가능하게 하는 아민 작용기를 함유한다. 하나의 양태에서, 비오티닐화 분자는 링커 없이(즉, 비오틴에 직접 부착) 제조했다. PU-H71-비오틴2 및 PU-H71-비오틴3으로서 칭명되는 상기 두 화합물의 합성은 반응식 12에 묘사된다. 당해 화합물들은 초음파 처리하에 D-비오틴과의 DCC 커플링에 의해 각각 화합물 13 또는 화합물 2로부터 제조할 수 있다.
Figure 112017033467195-pat00013
반응식 12. PU-H71-비오틴2 및 PU-H71-비오틴3의 합성
또 다른 양태에서, 비오티닐화 분자는 도 13에 묘사된 바와 같이, PU-H71-비오틴4 또는 PU-H71-비오틴7을 생성하기 위해 PU-H71(2) 또는 데스이소프로필-PU-H71(13)을 6-탄소 쇄 스페이서 그룹을 통해 비오틴에 공유 부착시켜 제조했다. PU-H71-비오틴4 및 PU-H71-비오틴7은 화합물 13 또는 화합물 2를 각각 염기의 존재하에 EZ-LinkR NHS-LC-비오틴으로 칭명되는 시판되는 비오틴 분자를 함유하는 N-하이드록시석신이미드 활성 에스테르와 반응시켜 제조할 수 있다.
Figure 112017033467195-pat00014
반응식 13. PU-H71-비오틴4 및 PU-H71-비오틴7의 합성
또 다른 양태에서, 비오티닐화 분자는 도 14에 묘사된 바와 같이, PU-H71-비오틴5 또는 PU-H71-비오틴8을 생성하기 위해 PU-H71(2) 또는 데스이소프로필-PU-H71(13)을 연장된 탄소 쇄 스페이서 그룹을 통해 비오틴에 공유 부착시켜 제조했다. PU-H71-비오틴5 및 PU-H71-비오틴8은 화합물 13 또는 화합물 2를 각각 염기의 존재하에 EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴으로 칭명된 시판되는 비오틴 분자를 함유하는 N-하이드록시석신이미드 활성 에스테르와 반응시켜 제조할 수 있다.
Figure 112017033467195-pat00015
반응식 14. PU-H71-비오틴5 및 PU-H71-비오틴8의 합성
또 다른 양태에서, 비오티닐화 분자는 도 15에 묘사된 바와 같이, PU-H71-비오틴6 또는 PU-H71-비오틴9를 생성하기 위해 PU-H71(2) 또는 데스이소프로필-PU-H71(13)을 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 통해 비오틴에 공유 부착시켜 제조했다. PU-H71-비오틴6 및 PU-H71-비오틴9는 화합물 13 또는 화합물 2를 각각 염기의 존재하에 EZ-Link®NHS-PEG4-비오틴으로 칭명되는 시판되는 비오틴 분자를 함유하는 N-하이드록시석신이미드 활성 에스테르와 반응시켜 제조할 수 있다.
Figure 112017033467195-pat00016
반응식 15. PU-H71-비오틴6 및 PU-H71-비오틴9의 합성
반응식 16에 묘사된 또 다른 양태에서, dPU-H71-비오틴으로 칭명되는 아민 결합된 비오틴 유사물은 브로마이드 화합물 6을 EZ-Link®아민-PEO3-비오틴과 반응시켜 합성했다.
Figure 112017033467195-pat00017
반응식 16. PU-H71-비오틴의 합성
비오티닐화 화합물이 여전히 HSP90에 대한 친화도를 유지함을 보장하기 위해, 본 발명자들은 SKBr3 암 세포 용해물을 사용하여 형광 편광 검정으로 각각 평가했다. 알 수 있는 바와 같이, 화합물 각각은 31-154nM 범위의 IC50 과 함께 HSP90에 대한 우수한 친화도를 유지시킨다(표 1; PU-H71, IC50 = 20nM).
표 1. 비오티닐화 화합물의 특성
Figure 112017033467195-pat00018
n.a.= 적용가능하지 않음
n.d.= 측정되지 않음; TPSA 및 Clog P 값은 켐드로우로 측정하고, n.d.는 소정의 구조에 대해 값을 측정하는 것이 가능하지 않았음을 나타낸다.
두 개의 일반적 경향이 관찰될 수 있다. 첫째, PU-H71 유사물과 대조적으로, 데스이소프로필 유사물은 평균 약 2배 더 큰 친화도로 결합한다(즉, PU-H71-비오틴3 대 -2, -4 대 -7, -5 대 -8, -6 대 -9). 둘째, 링커와 관련하여, 탄소 계열이 에틸렌 글리콜 계열보다 더 강력하다(즉, PU-H71-비오틴4 및 -5 대 -6, -7 및 -8 대 -9). 결국, 제조된 화합물 모두가 HSP90에 대한 우수한 친화도를 유지하고, 추가의 분석용으로 적합했다.
제조된 비오티닐화 분자 각각이 HSP90에 대해 우수한 친화도를 유지한다는 것을 나타낸 후, 본 발명자들은 쇄 길이가 HSP90 및 스트렙타비딘에 대한 동시 결합을 유지시키기에 충분했는지의 여부를 측정하고자 했다. K562 용해물(500㎍ 단백질)을 밤새 스트렙타비딘 비드와 100μM의 각 화합물의 혼합물로 처리했다. 임의의 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 충분히 세척 후, 잔류 비드 펠릿을 SDS-PAGE로 분석했다. 겔을 세척하고, 쿠마시 블루로 1시간 동안 염색했다. PU-H71-비오틴-5, -6, -8, -9 및 PU-H71-비오틴은 약 90kDa에서 밴드를 나타내어 HSP90 및 스트렙타비딘에 대한 동시 결합을 나타낸다. 링커 없는 유사물(PU-H71-비오틴2 및 -3) 및 6-탄소 스페이서 그룹을 갖는 유사물(PU-H71-비오틴4 및 -7)은 90kDa에서 밴드를 나타내지 않고 링커가 너무 짧았음을 나타낸다. 대조적으로, 연장된 탄소 쇄 스페이서 그룹을 함유하는 화합물(PU-H71-비오틴5 및 -8) 및 폴리에틸렌 쇄를 함유하는 화합물(PU-H71-비오틴6 및 -9)은 동시 결합을 가능하게 하기에 충분한 길이였다.
분자 중 일부가 HSP90 및 스트렙타비딘에 동시에 결합한다는 것을 나타낸 후, 본 발명자들은 이것이 생존 세포에서 유사하게 달성될 수 있는지의 여부를 조사했다. 이러한 경우에, K562 세포 중에서의 결합은 먼저 100μM의 PU-H71-비오틴-5, -6, -8, -9 및 PU-H71-비오틴으로 4시간 동안 처리하여 측정한 다음, SDS-PAGE로 분석했다. 평가된 화합물 중, 단지 PU-H71-비오틴만 생존 세포에서 결합을 유지시키는데 실패했다. 흥미롭게, PU-H71-비오틴은 이의 투과성을 제한하고 결합에 대한 이의 실패의 주요 요인일 수 있는 이온성 아민을 함유한다. 대조적으로, PU-H71-비오틴-5, -6, -8, -9는 이온성 아민을 함유하지 않고, 세포 막을 투과할 수 있다. 활성 화합물들을 50, 25 및 10μM에서 평가했고, PU-H71-비오틴-6 및 9가 10μM에서 정말로 우수한 결합을 유지시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 두 화합물은 5, 2.5 및 1μM에서 추가로 평가했고, 심지어 최저 농도에서 희미한 밴드가 약 90kDa에서 존재한다. PU-H71-비오틴-6은 0.5μM에서 희미한 밴드를 나타내어 동시 결합이 이 저농도에서 여전히 유지된다는 것을 지시한다.
연장된 탄소 쇄 스페이서 그룹(PU-H71-비오틴-5, -8) 또는 폴리에틸린 글리콜 쇄 링커(PU-H71-비오틴-6, -9)를 함유하는 화합물은 화합물 13 또는 2가 부착되었는지의 여부와 무관하게, K562 세포의 막을 투과할 수 있고, HSP90에 결합하고, 이어서 스트렙타비딘 비드에 결합할 수 있다는 것이 나타난다. 또한, 마치 폴리에틸렌 글리콜 쇄 링커(PU-H71-비오틴-6, -9)를 함유하는 화합물이 바람직할 수 있다고 나타난다.
5.2.1.1.3. ANCA-표지된 프로브의 합성
본 명세서는 억제제를 아미노 나프탈레닐-2-시아노-아크릴레이트(ANCA)로 표지화함으로써 발암성 HSP90를 검출하기 위한 프로브를 추가로 제공한다. ANCA는 사람 조직 중의 아밀로이드 플라크에 결합하고 염색시킬 수 있는 형광성 프로브이다. ANCA는 흔히 분자로터로서 칭명된다. 분자 로터는 형광 양자 수율이 주위 환경에 좌우되는 프로브이다. 분자 로터의 구조적 모티브는, 거대분자에 근접하여 존재할 때 내부 분자 회전이 장해되어(강성 증가) 형광 방출을 변화시키고, 즉 결합된 및 결합되지 않은 분자 로터가 상이한 형광 방출 피크를 갖는 것이다(도 15 참조). 이 물리적 측면은 PU-H71에 접합될 때 악용될 수 있고, 이는 "발암성 Hsp90"에 대한 특이성을 갖는다. PU-H71에 접합된 분자 로터는 "발암성 Hsp90"을 갖는 암 세포의 이종 집단에서 식별하도록 하고, 중재, 예를 들어, 생검, 수술 또는 미세한 침상 흡인으로부터 수득된 표본에 존재하는 세포에서 상기 종들의 정량화를 허용한다.
하나의 양태에서, 데스이소프로필-PU-H71(13), PU-H71(2) 또는 13 또는 2의 화합물 유사물은 반응식 17에 묘사된 바와 같이, ANCA로 표지화할 수 있다. 반응식 17에서, 데스이소프로필-PU-H71(13)을 시아노아세트산과 반응시켜 화합물 26을 생성한다. 다음 단계에서, 화합물 26을 승온에서 화합물 27과 반응시켜 화합물 28(PU-ANCA)을 수득한다.
Figure 112017033467195-pat00019
반응식 17. PU-ANCA의 합성
또 다른 양태에서, 본 발명에 유용한 ANCA 표지된 HSP90 억제제, 예를 들면, 푸린에 기초하는 것들을 반응식 18에 도시한다.
Figure 112017033467195-pat00020
반응식 18. 푸린에 기초하는 ANCA-표지된 HSP90 억제제의 합성
또 다른 양태에서, 본 발명에 유용한 ANCA 표지된 HSP90 억제제, 예를 들면, 이미다조피리딘에 기초하는 것들을 반응식 19에 도시한다.
Figure 112017033467195-pat00021
반응식 19. 이미다조피리딘에 기초하는 ANCA-표지된 HSP90 억제제의 합성
5.2.1.2. 암 예방 및 치료에 프로브의 사용
5.2.1.2.1. 혈액 악성 종양
항목 5.1에서 논의된 연구는, 특정 HSP90 억제제가 우선적으로 HSP90 종의 서브세트에 결합하고, "발암성 HSP90"가 정상 세포에서보다 암 세포에서 더 풍부함을 확인한다. 이 종들의 풍부는 HSP90 발현양에 의해 단독으로 지시되지 않고, HSP90 억제에 대한 세포 민감도의 전조이다. 따라서, 이 "발암성 HSP90", 예를 들면, PU-H71를 선택하는 태그화된 억제제에 대한 결합에 이용할 수 있는 환자의 암 세포에서 HSP90 집단의 비율을 측정하면 임상에서 HSP90에 대한 민감도를 예측하고, 암 세포가 HSP90에 좌우되는 수준을 나타낸다.
구체적으로, 본 명세서는 세포 투과성 형광 표지된 HSP90 억제제, 예를 들면, PU-H71-FITC 유도체(예: PU-FITC; PU-H71-FITC2)가 이미 노출 1시간 후 생존 세포를 표지화하고, 24-48시간에 백혈병 세포의 생존력을 감소시키고, HSP90 클라이언트 암 단백질의 퇴화에 의해 지시된 바와 같이 세포내 종양 HSP90을 억제하고, 공초점 현미경 검사에 의해 지시된 바와 같이 세포내로 국지화되고, 유세포 분석에 의해 지시된 바와 같이 종양 대 정상 세포 HSP90에 구체적으로 결합함을 나타낸다. 또한, 본 발명의 형광 표지된 화합물은 "발암성 HSP90" 종에 결합하고, 이는 이 프로브가 세포를 투과하고 구체적으로 종양 "발암성 HSP90" 표적물에, 유사하게 PU-H71에 결합한다는 충분한 증거를 제공한다.
본 발명의 방법을 사용하여 혈액 악성 종양(예: 백혈병) 또는 척수 증식 증후군을 갖는 환자가 HSP90 억제 요법에 반응성인지를 측정할 수 있다. 당해 방법은, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 혈액 악성 종양, 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 및 척수 증식성 신생물 및 장애에 적용할 수 있다.
본 명세서는 혈액암 환자가, 환자로부터 암 세포 및 비-암 세포(예: 림프구)를 함유하는 샘플을 환자의 암 세포에 존재하는 HSP90의 종양 특이적 형태에 우선적으로 결합하는 세포 투과성 형광 표지된 HSP 억제제와 접촉시킴을 포함하는 HSP90 억제제를 사용하는 요법에 반응하는지의 여부를 결정하고, 샘플 중의 암 세포 및 비-암 세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하고, 암 세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양과 비-암 세포에 결합된 형광 표지된 HSP90 억제제의 양을 비교하는 방법을 제공하고, 여기서, 비-암 세포보다 암 세포에 결합된 다량의 형광 표지된 HSP90 억제제는 종양이 HSP90 억제제에 반응할 것임을 나타낸다. 특정 양태에서, 세포 투과성 형광 표지된 HSP90 억제제에 대한 결합량은 유세포 분석을 사용하여 측정한다.
일부 양태에서, 약 1.5 또는 그 이상의 정상 림프구에 대한 혈액암 세포의 결합 비율은, 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 2 또는 그 이상의 정상 림프구에 대한 혈액암 세포의 결합 비율은 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 2.5 또는 그 이상의 정상 림프구에 대한 혈액암 세포의 결합 비율은 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 3 또는 그 이상의 정상 림프구에 대한 혈액암 세포의 결합 비율은 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 4 또는 그 이상의 정상 림프구에 대한 혈액암 세포의 결합 비율은 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 5 또는 그 이상의 정상 림프구에 대한 혈액암 세포의 결합 비율은 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다.
다수의 확립된 세포주 및 1차 종양 샘플을 세포 투과성 형광 표지된 HSP90 억제제(예: PUH71-FITC2)의 결합과 HSP90 억제제에 노출시 시험관내 세포 생존력 사이의 상관 분석을 수행하여 조사했다. 세포주 및 1차 백혈병 샘플 패널에 대한 PUH71-FITC2 결합을 측정하기 위해, 본 발명자들은 다변수 유세포 분석을 사용했다. 본 발명자들은 또한 약물 노출 후 48시간에 생존력 검정을 수행함으로써 HSP90 억제제에 대한 이들 세포의 민감성을 시험했다.
형광 활성화된 유세포 분석은 세포를 열거하고, 정제하고 분석하기 위한 선택 방법을 유지한다.9 ,10 실제로, 다양한 측정이 지금 유세포 분석에 의해 수행될 수 있고, 최근 기술적 진보는 이러한 측정이 이종 집단 내에서 개별 세포에 대해 동시에 수행되도록 한다.11 이러한 다변수 분석은, 환자 샘플이 제한될 경우 주요 고려사항인 적은 샘플로부터 더 많은 데이터를 제공하기 때문에 매우 강력하다. 다변수 분석은 또한 일부 시약을 결합하는 바람직하지 않은 세포를 제외함으로써 집단의 보다 정확한 식별을 허용한다.9 ,10 당해 방법은 따라서 형광 표지될 경우, 별개의 세포 집단에 대한 HSP90 리간드의 결합을 분석하는데 최적이다.
형광 표지된 리간드는 역사적으로 생물학 및 약학에서 다양한 용도를 가졌고,12 비표지된 리간드의 약물학적 성질을 유지시키는 이점을 제공한다. 리간드-수용체 결합의 시험관내 조사 이외에, 소분자 형광성 프로브는, 예를 들면, 유세포 분석에 의해 생존 세포 집단에서 표적물과 리간드의 상호작용의 실시간 비공격적 모니터링을 허용한다.
형광성 염료는 특정 파장에서 빛을 흡수하고, 또한 높은 파장에서 이의 형광 에너지를 방출한다. 각 염료는 뚜렷한 방출 스펙트럼을 갖고, 이는 유세포 분석에 의한 다색 분석에 악용될 수 있다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 4-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸(NBD) 또는 레드 이동 염료 설포로다민 101(텍사스 레드)가 가장 많이 사용된다. FITC 및 NBD는 대부분 기구 상의 FL1 채널에서 검출되고, 또한 형광 현미경 검사를 위한 양호한 선택인(각각 여기 495 및 466 nM 및 방출 519 및 539 nM) 반면, 텍사스 레드는 단일 레이저 기구(여기 589nM 및 방출 615 nM) 상의 FL3에서 검출된다.
항목 5.1.1.에서, 본 발명자들은 다수의 1차 백혈병 세포 및 정상 혈액 세포를 사용하는 연구를 논의했다. 특히, 본 발명자들은 배아(악성 세포 집단) 및 림프구(정상 세포 집단) 모두를 함유하는 1차 만성 및 배아 상 CML 및 급성 골수성 백혈병(AML) 샘플, 건강한 공여자의 코드 혈액으로부터 분리된 CD34+ 세포, 말초 혈액으로부터의 총 단핵 세포 및 말초 혈액 백혈구(PBL)를 분석했다(도 1c-e, 3, 4). 본 발명자들은 이종 세포 집단에서 다변수 유세포 분석을 수행하기 위한 수단으로서 플루오레세인 표지된 PU-H71(PUH71-FITC2)을 사용했다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 통문 전략을 사용하여 정상 세포 집단(림프구) 및 악성 세포 집단(배아)을 구별한다. 유세포 분석 도트 블롯이 3명의 상이한 환자에 대해 나타난다. 도 4b에서, 1차 환자 샘플로부터의 정상 림프구에 대한 CML 배아 중의 HSP90에 결합하는 PU-H71-FITC2의 비율이 도시된다.
도 4d에서, 유세포 분석을 다시 사용하여 배아와 림프구를 구별하고 배아 통문 내의 CD34+ 세포의 결합을 분석한다. 도 4e 및 4g에서, 6명의 백혈병 환자 및 3명의 건강한 환자에서 정상 림프구에 대한 HSP90 CD34+ 배아에 결합하는 PU-H71-FITC2의 비율을 측정했다. 9명의 환자를 PU-H71-FITC2 또는 대조군(TEG-FITC)으로 처리했다(도 4f 및 4h). 도 4h에 도시된 바와 같이, 가장 높은 비(CML03106, 0614 및 0124로서 칭명됨; 비율은 도 4g에서 "bcCML"로서 평균화됨)를 갖는 환자들은 낮은 비(CML0118, 0128 및 0222로서 칭명됨; 비율은 도 4g에서 "cpCML"로서 평균화됨)를 갖는 환자들보다 더욱 민감했다. 건강한 환자가 1에 근접한 비율을 갖고(도 4g), 제대혈 중의 이들의 세포가 PU-H71에 상당히 민감하지 않았다(도 4h, CB1,2,3으로서 칭명됨)는 것이 주시된다. 도 4f에 나타난 결과는, CD34+ 배아의 생존력이 환자에게서 상당히 감소되는 반면, 정상 림프구는 영향받지 않았음을 지시한다. 유사하게, 대조군 화합물(TEG-FITC)은 CD34+ 배아 또는 정상 림프구의 생존력을 감소시키지 않았다.
1차 샘플에서, 본 발명자들은 동일 환자 내에서 배아 집단 및 정상 림프구 둘 다를 분석했다. 본 발명자들은, 1차 백혈병 세포(1차 만성- 및 배아-상 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 샘플), 및 건강한 혈액 세포(CD34+ 코드 혈액 세포, 및 건강한 공여자로부터 분리된 총 말초 혈액 단핵 세포 포함)로 이루어진 패널에서, PUH71-FITC2에 대한 최고 친화력을 갖는 세포가 이 제제로 죽이는데 가장 민감했다는 것을 밝혀냈다(도 16). 중요하게는, 백혈병 혈액 세포 내에 존재하는 정상 림프구는 PU-FITC에 대한 낮은 결합을 나타내고, PU-H71에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, 본 발명자들은, 동일 환자 내에서 정상 림프구와 비교하여 백혈병 세포 중의 PU-FITC의 상대적 결합의 사용을 샘플을 교차하는 PUH71-FITC2 결합을 비교하기 위한 표준화 값으로서 사용할 수 있음을 합리화했다. 구체적으로, CML 샘플로 평가할 경우, 배아 위기 CML(bcCML) 세포는 PU-FITC에 대해 최고 결합을 제시하고(정상 림프구에 대해 4배 이상), 만성 상(cpCML)과 비교시 PU-H71 처리에 대해 최고 감수성을 입증했다(도 16). 대조적으로, PU-H71은 정상 혈액 세포에서 HSP90에 약하게 결합되었고(bcCML 중에서 IC50 값 2,000nM 이상 대 약 100nM), 암 세포에 대해 독성이었던 농도에서 이들 세포에서 무독성이었다(도 1d, e 및 16B, C). 도 16C는 19개의 AML 샘플에서 배아 및 정상 림프구에 대한 PU-H71-FITC2의 결합(X-축 상에서 중첩 PU 결합으로서 기록됨) 및 PU-H71로 처리될 경우 배아의 측정된 생존력을 분석하여 수득된 비율을 서로 관련시키는 그래프를 도시한다. 비-반응성(<50% 감소된 생존력) 종양 세포로부터 반응성(>50% 감소된 생존력) 종양 세포는 각각 약 0.65 내지 약 2.22 또는 이하에 대한 약 2.31 내지 약 7.43 또는 이상의 비율로 식별할 수 있었다.
또한, 14개의 백혈병 세포주의 패널에서, 본 발명자들은 또한 PU-H71-FITC2 결합(평균 형광 세기로 제시됨)과 PU-H71에 의한 HSP90 억제에 대한 이들 세포의 감수성 사이의 상당한 상호 관련을 주의했다(도 3e).
19개의 1차 AML 표본에 대해 수집된 데이터를 토대로 하여, 본 발명자들은 감수성 및 내성 AML 표본을 올바르게 식별하는 검정의 가능성을 측정하기 위해 감수성 및 정확한 곡선을 계산했다. 본 발명자들은 PU-FITC 결합(배아/림프구)에 대해 임의 컷-오프 값 2 이상 및 예측 결과로서 50% 미만 생존력을 사용하는 분류 성능 분석을 수행하였고, 다음 값들을 관찰했다: 정확성: 83.3% (53.2 - 93.8%; 95% CI); 감수성: 91.7% (72.8 - 99.5%; 95% CI); 특이성: 66.7% (28.9% - 82.4%; 95% CI); 양성 예측 값: 84.6% (67.2 - 91.9%; 95% CI); 음성 예측 값: 80% (34.7% - 98.9%; 95% CI); 피셔 정확 시험, p = 0.022. 이러한 계산은, PU-FITC가 양호한 분류 성능을 갖는다는 것을 제시하고, 보다 정확하고 정밀한 성능 추정을 수득하기 위해 보다 큰 샘플의 코호트를 사용하여 이 평가를 반복한다. 실험적 또는 기구 변동에 기인하는 검정 차이를 최소화하기 위해, 본 발명자들은 다음을 사용한다: (1) 자동화 성능 조정을 허용하고 일상 혈구계 성능 및 일관성을 향상시키는 BD Cytometer Setup & Tracking (CST) 비드. CST 비드는 모든 새로운 실험 세트 전에 작동될 것이다. (2) 양성 대조군 MV411(감수성 세포주-높은 결합) 및 음성 대조군 HL60(저감수성 세포주-낮은 결합)이 이 검정에 포함될 것이다.
백혈병 세포에서 시험관내 관찰이 동물 임상전 모델에서 확인될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 PU-FITC 결합에 의해 시험관내 평가되거나 예견된 PU-H71에 대한 상이한 감수성(고 및 저)을 갖는 1차 AML 샘플을 사용하는 이종 이식을 설정했다. 1차 AML 세포를 하위 치명적으로 조사된 NOD/SCID 마우스(n=8)에 주입시켰다. 주사 후 3 내지 4주에, 사람 백혈병 세포가 마우스의 골수(BM)에 접목될 경우, PU-H71 또는 비히클 대조군에 의한 처리를 개시하였고(75mg/kg 3x주), 4주 동안 계속했다. 마우스를 희생시키고, 백혈병 접목을 항-사람 CD45 및 CD34를 사용하여 평가했다. 질환을 야기하는 생존 세포의 능력을 측정하기 위해, 본 발명자들은 동일 수의 사람 세포를 하위 치명적으로 조사된 NOD/SCID 마우스에 이식했다. 이 실험은, 고 결합-고 시험관내 감수성 세포에 대한 PU-H71 처리가 추가의 종양 개시를 예방하는지의 여부를 측정한다. 그러한 경우, 처리가 재발 가능성을 감소시킨다고 제시한다. 이종 이식이 백혈병 샘플의 생물학을 변경할 수 있기 때문에, 1차 세포에 대한 PUH71-FITC2 결합은 접목 세포의 주입(이식 후 4주) 전에 평가했다.
이종 이식 실험으로부터의 결과는 도 17에 묘사된다. 2개의 1차 AML 샘플(고감수성 및 저감수성, 도 17a)을 사용하는 실험에서, 본 발명자들은 고감수성 샘플이 이종 이식된 AML 샘플에서 저감수성 샘플보다 높은 PUH71-FITC2 결합을 갖고(도 17b), HSP90 억제제에 의한 처리에 상당히 양호하게 반응한다(도 17c)는 것을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자들은 PU-고감수성 AML로부터의 세포가 2차 이식에서 상당히 감소된 접목을 나타낸다(p=0.016)는 것을 밝혀냈다. 결과는, 질환의 유사한 단계에서 환자의 백혈병 세포의 생존 및 증식에서 HSP90 관여가 상당히 상이하다는 것을 보여준다. 추가로, HSP90 억제 요법의 효과는 본 명세서의 형광 표지된 프로브의 사용으로부터 예견될 수 있다.
5.2.1.2.2. 고형 및 액상 종양
본 발명의 형광 표지된 프로브, ANCA-표지된 프로브 및 비오티닐화 프로브는 또한 고체 종양 및 림프종 및 기타 액체 종양 관련 암에 대한 예방 및 진단 적용을 갖는다. 이러한 종양의 예는 결장직장암, 췌장암, 갑상선암, 기저 세포암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장 기질 종양을 포함하는 위장 암, 식도암, 위암, 간암, 쓸개암, 항문 암, 신경교종을 포함하는 뇌 종양, 여포성 림프종 및 확산 거대 B-세포 림프종을 포함하는 림프종, 및 난소암, 자궁경부암 및 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암, 특히 유방암, 위암 또는 췌장암과 관련된 것들이다. 당해 분야의 숙련가는 표지화가 종양의 생검 또는 수술적 절제로부터 수득된 바와 같은 조직 슬라이스의 일부인 종양 세포에서 수행될 수 있음을 인지한다. 이러한 경우에, 종양 세포는 기질, 양성 조직, 혈관 및 림프구, 대식세포와 같은 기타 세포의 세포로 둘러싸인다. 표지화는 또한 상기한 종양 세포를 함유하는 조직으로부터 수득된 것과 같은 분리된 종양 세포에서 수행될 수 있다. 표지화는 또한 확립된 암 세포주로부터 수득된 것과 같은 종양 세포에서 수행될 수 있다. 지속적이지 않은 표지화는 또한 혈장 및 늑막을 포함하는 상기한 종양 세포를 함유하는 생물학적 유체로부터 수득된 것과 같은 종양 세포에서 수득될 수 있다. 하나의 양태에서, 표지화는 종양 세포 또는 종양 관련 세포 및 암 환자의 순환에서 밝혀진 것과 같은 생물학적 신체, 암 세포 또는 세포의 기타 형태를 함유하는 생체표본 또는 "발암성 HSP90"을 함유하는 생물학적 제형을 유도하는 미세한 침상 흡인 또는 기타 중재 절차로 수득된 세포에서 수행될 수 있다. 또 하나의 양태에서, 표지화는 악성 형질 변환과 관련된 기타 세포 또는 발암성 HSP90, 예를 들면, 종양 엑소솜을 혼입하는 생물학적 신체에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 항목 6.3.8.은 수술 절제 후 위암 및 유방암 환자로부터 염색을 위한 조직을 분리함을 기술하고, 항목 5.2.1.2.4.는 암 환자로부터 순환성 종양 세포를 분리함을 기술한다.
췌장암 및 유방암 세포주에서의 실험은, 혈액 종양에서 수행된 분석이 고형 종양 및 림프종에서 또한 효과적이다는 것을 나타낸다. 따라서, 표지된 세포 투과성 HSP90 억제제는 고형 종양 세포 또는 림프종 세포에 존재하는 "발암성 HSP90"을 검출하고 정량화할 수 있다. 또한, 당해 억제제를 사용하여 HSP90 억제 요법에 대한 고형 또는 액상 종양 세포의 감수성을 예측할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 액상 종양이 제한되지 않지만 백혈병, 림프종, 흑색종 및 척수 증식성 신생물과 관련된다는 것을 인지한다. 이러한 숙련가는 또한, 특정 액상 종양이 또한 고형 종양을 형성할 수 있고, 혈액 이외에, 이들 질환과 관련된 암 세포가 림프절, 비장, 간, 골수 및 기타 부위로 퍼질 수 있음을 인지한다.
하나의 예에서, 췌장암 및 유방암 세포의 패널을 (1) 다수의 별개의 HSP90 억제제, 예를 들면, PU-H71, SNX-2112 및 NVP-AUY922에 대한 감수성(도 2 참조); (2) PU-H71-FITC2에 대한 결합; 및 (3) 이들 종양 세포에서 총 HSP90의 발현에 대해 시험했다. 도 18은 PU-H71-FITC2 결합과 PU-H71, SNX-2112 및 NVP-AUY922에 대한 이들 세포의 감수성(r2는 각각 0.59, 0.62 및 0.61임, 도 18A) 사이의 중요한 상호 관련을 나타낸다. 대조적으로, HSP90 억제제에 대한 감수성과 이들 세포에서 총 종양 HSP90의 발현 사이에는 중요한 상호 관련이 없었다(도 18C). 유사하게, PU-FITC에 의해 측정된 "발암성 HSP90"의 발현과 이들 세포에서 총 종양 HSP90의 발현 사이에는 어떠한 중요한 상호 관련도 확립될 수 없다(도 18B). HL-60 백혈병 세포는 PU-H71 및 기타 HSP90 억제제에 내성이고, PU-FITC에 대한 낮은 결합을 나타내거나 전혀 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명자들은, HL-60과 비교하여 암 세포에서 표지된 HSP90 억제제(예: PU-H71-FITC2)의 상대적 결합의 사용을 또한 샘플 및 실험을 교차하는 PU-FITC 결합을 비교하기 위한 표준화 값으로서 사용할 수 있음을 합리화한다(도 18D). 도 18은 각각의 암 세포 및 다수의 췌장암 및 유방암 세포에서 HL-60에 대한 표지된-PUH71(예: PU-H71-FITC2) 결합의 비를 사용하는 상기한 분석을 나타낸다. 총괄적으로, 이들 데이터는 (1) PU-FITC가 "발암성 HSP90"이 풍부를 측정하기 위한 적합한 수단이고, (2) "발암성 HSP90"의 풍부를 측정하면 HSP90i에 대한 감수성을 예견하고; (3) 총 종양 HSP90의 풍부는 HSP90 억제제에 대한 반응의 전조도 아니고, 이는 표지화된 PU-H71에 의해 측정된 바와 같은 "발암성 HSP90"의 풍부와 상호 관련되지도 않음을 나타낸다.
본 발명의 표지된 HSP90 억제제를 사용하여 환자가 HSP90 억제 요법으로부터 이익을 얻는지를 측정할 수 있다. 하나의 양태에서, 환자 종양 세포에 대한 표지된 HSP90 억제제의 결합을 대조군 세포에 대한 결합과 비교할 수 있다. 대조군에 대한 증가된 결합은, 환자가 HSP90 억제 요법에 순응할 것임을 나타낸다. 도 19에 도시된 바와 같이, 비-반응성(<50% 감소된 생존력) 세포로부터 반응성(>50% 감소된 생존력) 세포는 비반응 세포에 대한 약 1.23 또는 약 2.05 또는 그 이상에 대해 반응성 세포에 대한 약 2.7 내지 약 5.87 또는 이상으로부터 구별될 수 있다. HSP90 억제제에 대한 반응성을 측정하기 위한 이들 비가 표지된 HSP90 억제제 및 당해 검정에 사용된 표준 표본(즉, HL60 세포, 정상 백혈구, CD45+CD14-세포, 또는 혈액 내의 정상 백혈구) 및/또는 대조군 유도체(즉,비-특이적/배경 결합을 설명하는데 사용된 PUFITC9 또는 FITC-TEG)의 특성에 좌우된다는 것을 이해한다.
종양 세포를 순환시키는데 있어서, 발암성 HSP90을 표지화에서 본 발명의 더욱 상세한 설명은 항목 5.2.1.2.4.에 제시한다. 도 20은 발암성 HSP90에 대한 낮은 결합을 갖거나 전혀 갖지 않고, 따라서 비-특이적/배경 결합을 설명하도록 고안된 PU 유도체로 PUFITC9의 사용을 나타낸다. 이는 또한 표준 세포(발암성 HSP90에 대해 낮은 결합을 갖거나 전혀 갖지 않는 세포)로서 환자의 백혈구(CD45+CD14-세포)의 사용을 도시한다.
확산 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 세포에서의 실험은 또한 HSP90 억제제에 대한 이들 세포의 감수성이 이들의 표지된-PU-H71의 흡수와 상호 관련되지만 세포에서 총 종양 HSP90의 발현과는 상호 관련되지 않음을 나타낸다(도 21). 구체적으로, OCI-Ly7 및 OCI-Ly1은 HSP90 억제에 매우 민감한 2개의 DLBCL 세포이다(참조: Cerchietti et al Nature Medicine 2009). 이들은 모두 열렬한 PU-H71 결합제이다. 본 발명자들은 이들 세포를 연장된 기간 동안 HSP90 억제제의 하위-치료 농도로 처리하고, 다수의 시험된 HSP90 억제제, 예를 들면, PU-H71, PU-DZ13 및 17DMAG에 대해 모체 세포보다 5 내지 10배 낮은 감수성을 나타내는 클론을 선택할 수 있었다(도 8). 도 21은, 이들 클론이 모체 Ly1 세포와 유사한 총 종양 HSP90 수준을 발현시키는 반면, 이들은 표지화된 PU-H71-섭취로 측정된 바와 같은 낮은 "발암성 HSP90" 수준을 가짐을 보여준다. 결합 실험은 차등 섭취가 별개의 "발암성 HSP90" 수준의 결과였고 약물 펌프 매개된 유출의 간접적 척도가 아님을 입증하기 위해, PSC833(2.5μM), P-gP 억제제의 존재 및 부재하에 수행했다.
5.2.1.2.2.1. 췌장 관 선암
췌장 관 선암(PDAC)은 미국에서 암-관련 사망률의 네번째 가장 흔한 원인이다. 5년 생존률은, 0.4 내지 4% 추정으로 모든 암 중에서 최저이다. 2009년에, PDAC의 추정된 42,470건의 새로운 케이스가 진단되었고, 추정된 35,240명의 환자가 이들 질환의 결과로 사망했다. 이 암의 공격성 때문에, 이를 초기에 진단하는 무능력, 및 요법을 변경하는 결과의 현재 부족, PDAC로부터의 사망률은 발생률을 밀접하게 반영한다. PDAC에 대한 유일한 잠재적 치유 치료는 수술 절제술이다. 질환이 일반적으로 프리젠테이션에서 진행되기 때문에, 단지 10 내지 20%의 환자만 치유 절제술을 받을 수 있다. 췌십이지장 절제술을 받은 이들 환자에서, 5년 생존은 약 20%의 참담한 상태이다. PDAC를 치료하기 위한 효과적인 화학요법제의 개발이 거대하게 도전되고 있다. 전통적인 세포독성제는 종양 성장을 억제하고 삶의 질을 향상시키고 환자 생존을 연장하는데 있어서 매우 무력하다.
비정상적 경로 및 분자의 복잡한 부하를 견디기 위해, PDAC는 생존을 위해 샤프론 분자에 의존하게 된다. 주요 샤프론 열 충격 단백질 90(HSP90)은 PDAC에서 악성 프로세스, 예를 들면, 증식, 생존 및 전이를 구동하는 종양 단백질을 돕고 지원하고, 암 표현형의 개발을 허용한다. 또한, HSP90은 아폽토시스 임계값을 증가시킴으로써 암 세포가 다른 요법에 대한 저항을 구축하는 것을 돕는다. 이러한 포괄적인 생물학적 기능은 PDAC에서 항-HSP90-표적화 요법을 위한 중요한 역할을 제안한다. 결과적으로, 이러한 종양들은 주요 암 샤프론 중의 하나의 억제제, HSP90으로 치료하기 위한 적합한 지원자이다.
HSP90 억제제, 예를 들면, 발암성 HSP90 종을 우선적으로 결합하는 PU-H71에 의해 췌장암 생존에 필요한 종양 HSP90 종의 풍부의 식별은 HSP90-요법으로부터 이익을 얻을 수 있고 종양의 치료학적 표적화를 개인화하는 환자를 선별하기 위한 종양-특이적 생물마커로서 작용한다.
실제로, HSP90 억제제에 대한 췌장 세포주의 감수성은 플루오레세인 표지된 PU-H71(PU-H71-FITC2)의 세포상 섭취에 의해 측정된 바와 같이, 종양 HSP90 종 풍부와 상호 관련된다(도 22). 최고량의 PU-H71-FITC2를 흡수한 세포가 또한 HSP90 억제제에 대해 가장 민감하다.
혈액암을 사용하는 연구(항목 5.2.1.2.1.)와 유사하게, 표준 유도체 또는 표준 세포(예: HL60 또는 정상 세포)에 비해 췌장암 세포에서 표지된 HSP90 억제제(예: PU-H71-FITC2)의 상대적 결합이 클수록, HSP90 억제제 요법에 대해 췌장 종양 또는 종양 세포는 더 민감하다(도 19). 일부 양태에서, 약 2 이상인 표준 세포에 대한 종양 세포의 결합 비율은, 췌장암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 2.5 이상인 표준 세포에 대한 췌장암 종양 또는 종양 세포의 결합 비율은, 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 3 이상인 표준 세포에 대한 췌장암 종양 또는 종양 세포의 결합 비율은, 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다.
5.2.1.2.3. 암 줄기 세포
본 명세서는 표준 세포(예: 림프구)에 비해 암 줄기 세포(CSC)에서 "발암성 HSP90"의 양을 측정하고, 이에 의해 CSC가 HSP90 억제제 요법에 반응성인지를 측정하는 방법을 제공한다. 최근의 증거는, 암 줄기 세포(CSC)가 다양한 형태의 암에 대한 질환을 일으키고 유지시킬 수 있음을 제시한다. 또한, 이들 세포가 통상적인 화학요법제에 내성이고, 따라서 질환 재발 또는 전이를 유도하기가 더 쉽다는 것이 제시되었다. 따라서, 우수한 치료학적 결과를 수득하기 위해 CSC를 제거할 수 있는 요법을 식별하는 것이 중요하다. 열 충격 단백질(HSP)은 단백질 합성, 유지 및 퇴화에서 중요한 감시 역할을 한다. 도 23에서, 본 발명자들은 CSC 집단이 HSP90 억제에 민감하고, 감수성이 표지된 PU-H71로 인지된 바와 같이, 발암성 종양 HSP90 종의 풍부와 상호 관련됨을 나타내는 급성 골수성 백혈병(AML) 줄기 세포에 데이터를 제공한다.
도 23A는 백혈병 줄기 세포(LSCs, CD34+CD38- CD45dim) 및 림프구에 대한 PU-FITC의 결합 비율을 나타낸다. 1차 AML 샘플을 1μM PU-H71-FITC2와 함께 37℃에서 4시간 동안 배양했다. 세포를 CD34, CD38, CD45 및 7-AAD로 염색한 후, 유세포 분석을 수행했다. 도 23B는 1μM PU-H71로 48시간 처리 후, 3개의 1차 AML 샘플로부터 미처리된 대조군에 대한 LSC의 생존률(%)을 나타낸다. 세포를 아넥신(Annexin) V 및 7-AAD 염색 이전에 CD45, CD34 및 CD38로 염색했다. LSC에서의 생존력은 유세포 분석으로 측정했고, CD45dim CD34+CD38-통문의 아넥신V-/7AAD-의 비율로서 측정되었다. 특히, PU-H71-FITC2에 대한 높은 결합을 갖는 세포가 HSP90 억제제를 사용하는 치료에 가장 민감했다.
혈액암을 사용하는 연구(항목 5.2.1.2.1.)와 유사하게, 동일 환자 내에서 표준 세포(예: 림프구)에 비해 CSC에서 형광 표지된 HSP90 억제제(예: PU-H71-FITC2)의 상대적 결합이 클수록, HSP90 억제제 요법에 대해 CSC가 더 민감하다. 일부 양태에서, 약 1.5 이상인 표준 림프구에 대한 CSC의 결합 비율은, 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다. 기타 양태에서, 약 2 이상인 표준 림프구에 대한 CSC의 결합 비율은, 암 환자가 HSP90 억제 요법에 민감하다는 것을 나타낸다.
5.2.1.2.4. 순환성 종양 세포
순환성 종양 세포(CTC)는 1차 종양으로부터 분리되어 혈류에서 순환하는 세포이다. CTC는 상이한 조직에서 추가 종양의 후속적 성장(전이)을 위한 종균을 구성할 수 있다. 도 20은 HER2+ 전이성 유방암 환자로부터 분리된 CTC의 표지화를 도시한다. her 혈장으로부터 분리된 종양 세포는 또한 her 혈장으로부터 분리된 백혈구(CD45+CD14-세포)보다 약 84배 더 PUFITC를 결합하여 이들 종양 세포가 높은 수준의 발암성 HSP90을 갖고, HSP90 억제제를 사용하는 요법이 이들을 죽이는데 효과적임을 나타낸다. 실제로, 이 환자가 20mg/m2 PU-H71의 용량을 복용한 후 24시간에, 혈액 중의 CTC의 수의 6배 강하가 측정되었다.
5.2.2. 발암성 HSP90을 검출하기 위한 방사선표지된 프로브
본 명세서는 암 세포에서 발암성 HSP90을 검출할 수 있는 방사선표지된 프로브를 사용함을 제공한다. 항목 5.2.2.1은 본 명세서에 따라 사용되는 각종 형태의 프로브를 기술한다. 항목 5.2.2.2는 예방 및 진단 검정에서 이러한 프로브의 사용을 기술한다.
5.2.2.1. 방사선표지된 프로브
억제제의 친화도, 선택도 또는 생물분포 프로파일을 변화시키지 않고 표지화될 수 있는 HSP90 억제제기 예방 및/또는 진단 목적을 위한 이상적 프로브이다. 하나의 양태에서, 프로브는 HSP90 억제제의 요오드 124 방사선표지된 변형이다. 또 다른 양태에서, 프로브는 HSP90 억제제의 요오드 131 방사선표지된 변형이다. 또 다른 양태에서, 프로브는 HSP90 억제제의 요오드 123 방사선표지된 변형이다. 또 다른 양태에서, 프로브는 HSP90 억제제의 요오드 125 방사선표지된 변형이다.
한 가지 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00022
상기식에서,
(a) 각각의 Z1, Z2 및 Z3은 독립적으로 CH 또는 N이고,
(b) Y는 CH2, O 또는 S이고,
(c) Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 원자가를 충족시키도록 선택된, CH, CH2, O, N, NH, S, 카보닐, 플루오로메틸렌 및 디플루오로메틸렌으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 X 기에 대한 각각의 결합은 단일결합 또는 이중결합이고,
(d) X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
(e) X4는 수소 또는 할로겐이고,
(f) R은 직쇄 또는 분지쇄의 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 치환되거나 치환되지 않은 알케닐, 직쇄 또는 분지쇄의 치환되거나 치환되지 않은 알키닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 사이클로알킬이고, 여기서 R기는 -S(O)N(RA)-, -NRAS(O)-, -SO2N(RA)-, -NRASO2-, -C(O)N(RA)- 또는 -NRAC(O)-에 의해 선택적으로 차단되고/되거나, R가는 -S(O)NRARB, -NRAS(O)RB, -SO2NRARB, -NRASO2RB, -C(O)NRARB 또는 -NRAC(O)RB에 의해 선택적으로 종결되고, 여기서 각각의 RA 및 RB는 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 및 알킬헤테로아릴알킬로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00023
상기식에서,
(a) 각각의 Z1, Z2 및 Z3은 독립적으로 CH 또는 N이고,
(b) Y는 CH2, O 또는 S이고,
(c) Xa, Xb, Xc 및 Xd는, 원자가를 충족시키도록, CH, CH2, O, N, NH, S, 카보닐, 플루오로메틸렌 및 디플루오로메틸렌으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 X기에 대한 각각의 결합은 단일결합 또는 이중결합이고,
(d) X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
(e) X4는 수소 또는 할로겐이고,
(f) R은 -(CH2)m-N-R10R11R12 또는 -(CH2)m-N-R10R11이고, 여기서 m은 2 또는 3이고, R10-R12은 수소, 메틸, 에틸, 에테닐, 에티닐, 프로필, 하이드록시알킬, 이소프로필, t-부틸, 이소부틸, 사이클로펜틸, 질소를 포함하는 3원의 환, 또는 원자가를 충족시키도록 치환체와 함께 N 및 임의의 추가의 헤테로원자를 포함하는 6원의 환으로부터 독립적으로 선택되고, 단 모든 R10-R12가 존재하는 경우, 당해 화합물은 약제학적으로 허용되는 카운터 이온을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00024
상기식에서,
Y는 CH2 또는 S이고,
X4는 H 또는 할로겐이고,
X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
R은 -(CH2)m-N-R10R11R12 또는 -(CH2)m-N-R10R11이고, 여기서, m은 2 또는 3이고, R10-R12는 수소, 메틸, 에틸, 에테닐, 에티닐, 프로필, 하이드록시알킬, 이소프로필, t-부틸, 이소부틸, 사이클로펜틸, 질소를 포함하는 3원의 환, 또는 원자가를 충족시키도록 치환체와 함께 N 및 임의의 추가의 헤테로원자를 포함하는 6원의 환으로부터 독립적으로 선택되고, 단 모든 R10-R12이 존재하는 경우, 당해 화합물은 약제학적으로 허용되는 카운터 이온을 추가로 포함한다.
한 가지 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00025
상기식에서,
Y는 CH2 또는 S이고,
X4는 H 또는 할로겐이고,
X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
R은 2-에탄설폰산 이소프로필아미드, 2-에탄설폰산 에틸아미드, 2-에탄설폰산 메틸아미드, 2-에탄설폰산 아미드, 2-에탄설폰산 t-부틸아미드, 2-에탄설폰산 이소부틸아미드, 2-에탄설폰산 사이클로프로필아미드, 이소프로판설폰산 2-에틸아민, 에탄설폰산 2-에틸아민, N-2 에틸 메탄설폰아미드, 2-메틸-프로판-2-설폰산 2-에틸아미드, 2-메틸-프로판-2-설핀산 2-에틸아미드, 2-메틸-프로판-1-설핀산 2-에틸아미드, 사이클로프로판설폰산 2-에틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 이소프로필아미드, 3-프로판-1-설폰산 에틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 메틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 아미드, 3-프로판-1-설폰산 t-부틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 이소부틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 사이클로프로필아미드, 프로판-2-설폰산 3-프로필아미드, 에탄설폰산 3-프로필아미드, N-3-프로필 메탈설폰아미드, 2-메틸-프로판-2-설폰산 3-프로필아미드, 2-메틸-프로판-2-설핀산 3-프로필아미드, 2-메틸-프로판-1-설폰산 3-프로필아미드, 사이클로프로판설폰산 3-프로필아미드, 3-N-이소프로필 프로피온아미드, 3-N-에틸 프로피온아미드, 3-N-메틸 프로피온아미드, 3-프로피온아미드, 3-N-t-부틸 프로피온아미드, 3-N-이소부틸 프로피온아미드, 3-N-사이클로프로필 프로피온아미드, N-2-에틸 이소부티르아미드, N-2-에틸 프로피온아미드, N-2-에틸 아세트아미드, N-2-에틸 포름아미드, N-2-에틸 2,2-디메틸-프로피온아미드, N-2-에틸 3-메틸부티르아미드 또는 사이클로프로판 카복실산 2-에틸-아미드이다.
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00026
상기식에서,
Xa 및 Xb 중의 하나는 O이고, 다른 하나는 CH2이고,
Y는 CH2 또는 S이고,
X4는 수소 또는 할로겐이고,
X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
R은 2-에탄설폰산 이소프로필아미드, 2-에탄설폰산 에틸아미드, 2-에탄설폰산 메틸아미드, 2-에탄설폰산 아미드, 2-에탄설폰산 t-부틸아미드, 2-에탄설폰산 이소부틸아미드, 2-에탄설폰산 사이클로프로필아미드, 이소프로판설폰산 2-에틸아미드, 에탄설폰산 2-에틸아미드, N-2 에틸 메탄설폰아미드, 2-메틸-프로판-2-설폰산 2-에틸아미드, 2-메틸-프로판-2-설핀산 2-에틸아미드, 2-메틸-프로판-1-설폰산 2-에틸아미드, 사이클로프로판설핀산 2-에틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 이소프로필아미드, 3-프로판-1-설폰산 에틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 메틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 아미드, 3-프로판-1-설폰산 t-부틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 이소부틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 사이클로프로필아미드, 프로판-2-설폰산 3-프로필아미드, 에탄설폰산 3-프로필아미드, N-3-프로필 메탄설폰아미드, 2-메틸-프로판-2-설폰산 3-프로필아미드, 2-메틸-프로판-2-설핀산 3-프로필아미드, 2-메틸-프로판-1-설폰산 3-프로필아미드, 사이클로프로판설폰산 3-프로필아미드, 3-N-이소프로필 프로피온아미드, 3-N-에틸 프로피온아미드, 3-N-메틸 프로피온아미드, 3-프로피온아미드, 3-N-t-부틸 프로피온아미드, 3-N-이소부틸 프로피온아미드, 3-N-사이클로프로필 프로피온아미드, N-2-에틸 이소부티르아미드, N-2-에틸 프로피온아미드, N-2-에틸 아세트아미드, N-2-에틸 포름아미드, N-2-에틸 2,2-디메틸-프로피온아미드, N-2-에틸 3-메틸부티르아미드 또는 사이클로프로판 카복실산 2-에틸-아미드이다.
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00027
상기식에서,
Xa-Xc-Xb는 CH2-CH2-CH2, CH=CH-CH2 또는 CH2-CH=CH이고,
Y는 CH2 또는 S이고,
X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
R은 2-에탄설폰산 이소프로필아미드, 2-에탄설폰산 에틸아미드, 2-에탄설폰산 메틸아미드, 2-에탄설폰산 아미드, 2-에탄설폰산 t-부틸아미드, 2-에탄설폰산 이소부틸아미드, 2-에탄설폰산 사이클로프로필아미드, 이소프로판설폰산 2-에틸아미드, 에탄설폰산 2-에틸아미드, N-2 에틸 메탄설폰아미드, 2-메틸-프로판-2-설폰산 2-에틸아미드, 2-메틸-프로판-2-설핀산 2-에틸아미드, 2-메틸-프로판-1-설폰산 2-에틸아미드, 사이클로프로판설핀산 2-에틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 이소프로필아미드, 3-프로판-1-설폰산 에틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 메틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 아미드, 3-프로판-1-설폰산 t-부틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 이소부틸아미드, 3-프로판-1-설폰산 사이클로프로필아미드, 프로판-2-설폰산 3-프로필아미드, 에탄설폰산 3-프로필아미드, N-3-프로필 메탄설폰아미드, 2-메틸-프로판-2-설폰산 3-프로필아미드, 2-메틸-프로판-2-설핀산 3-프로필아미드, 2-메틸-프로판-1-설폰산 3-프로필아미드, 사이클로프로판설폰산 3-프로필아미드, 3-N-이소프로필 프로피온아미드, 3-N-에틸 프로피온아미드, 3-N-메틸 프로피온아미드, 3-프로피온아미드, 3-N-t-부틸 프로피온아미드, 3-N-이소부틸 프로피온아미드, 3-N-사이클로프로필 프로피온아미드, N-2-에틸 이소부티르아미드, N-2-에틸 프로피온아미드, N-2-에틸 아세트아미드, N-2-에틸 포름아미드, N-2-에틸 2,2-디메틸-프로피온아미드, N-2-에틸 3-메틸부티르아미드 또는 사이클로프로판 카복실산 2-에틸-아미드이다.
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다:
Figure 112017033467195-pat00028
상기식에서,
X3는 CH2, CF2, S, SO, SO2, O, NH 또는 NR2이고, 여기서 R2는 알킬이고,
X2는 123I, 124I, 125I 또는 131I이고,
X4는 수소 또는 할로겐이고,
X5는 O 또는 CH2이고,
R은 3-이소프로필아미노프로필, 3-(이소프로필(메틸)아미노)프로필, 3-(이소프로필(에틸)아미노)프로필, 3-((2-하이드록시에틸)(이소프로필)아미노)프로필, 3-(메틸(프로프-2-이닐)아미노)프로필, 3-(알릴(메틸)아미노)프로필, 3-(에틸(메틸)아미노)프로필, 3-(사이클로프로필(프로필)아미노)프로필, 3-(사이클로헥실(2-하이드록시에틸)아미노)프로필, 3-(2-메틸아지리딘-1-일)프로필, 3-(피페리딘-1-일)프로필, 3-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)프로필, 3-모르폴리노프로필, 3-(트리메틸암모니오)프로필, 2-(이소프로필아미노)에틸, 2-(이소부틸아미노)에틸, 2-(네오펜틸아미노)에틸, 2-(사이클로프로필메틸아미노)에틸, 2-(에틸(메틸)아미노)에틸, 2-(이소부틸(메틸)아미노)에틸 또는 2-(메틸(프로프-2-이닐)아미노)에틸이고,
n은 1 또는 2이다.
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112017033467195-pat00029
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112017033467195-pat00030
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112017033467195-pat00031
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112017033467195-pat00032
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112017033467195-pat00033
또 다른 양태에서, 방사선표지된 프로브는 하기 화학식을 갖는 화합물로부터 선택된다:
Figure 112017033467195-pat00034
상기 양태에서 방사선추적자를 합성하는 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제7,834,181호, 국제공개공보 제WO 2011/044394호, 제WO 2008/005937호 및 PCT 출원 제PCT/US2012/032371호에서 발견할 수 있고, 이의 모든 내용은 본원에서 이의 전체가 참조로서 도입된다. 방사선표지된 프로브의 특정한 예는 섹션 5.2.2.2.1. 및 5.2.2.2.2에 기재되어 있다.
5.2.2.2. 암 치료에서 방사선표지된 프로브의 이용
HSP90 종양 종("발암성 HSP90")의 발현을 비-침략적으로 측정하고 HSP90에 대한 종양의 의존성을 측정하며 표적 억제를 확인하기 위해, 암세포에서 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합하는 HSP90 특이적 억제제에 기반하는 양전자 방사 단층촬영(PET) 분석을 사용한다. 다수의 강제적 이유를 위해, 양성자 방사 단층촬영(PET)은 개개 환자의 종양에서 약물의 약동학 및 체류를 측정하는데 적합하다110 -113. PET는 다른 형태의 핵 영상화와 비교하여 보다 높은 해상도 및 감수성을 갖는 정량적 방법이다. 이는 비침략적 3차원 영상화를 가능하게 하여, 신체에서의 깊이와 무관하게, 종양 및 정상 기관에서 투여된 방사선표지된 화합물의 조직 농도의 신뢰가능한 평가를 제공한다(예: 그램당 주사 용량의 μCi 또는 백분률(%ID))110-113. 따라서, PET는 추적자의 전체 체내 분포 뿐만 아니라 공간적 및 일시적으로 용해된 종양 흡수, 농도 및 정화도를 제공한다. PET는 상세한 해부학적 정보를 반드시 제공하는 것은 아니기 때문에, PET 분석은 종종 CAT 스캔과 조합된다. CAT 스캔은 신체의 구조적 해부의 포괄적 개관을 제공한다. PET 스캔 영상은, 체내에서 방사선표지된 억제제가 진행하는 것을 정확하게 측정하기 위해 CAT 스캔의 상부에 적재될 수 있다. PET 스캔 및 CAT 스캔의 조합 사용은 본원에서 PET/CT로서 지칭될 것이다.
PET 이외의 검출 및 정량화 방법이 또한 사용될 수 있다. 한 가지 양태에서, 요오드 131, 요오드 123 및 요오드 125 등의 SPECT 영상화(Single Photon Emission Computed Tomography)가 사용될 수 있다. 특정한 양태에서, 131I-PU-H71, 123I-PU-H71 또는 125I-PU-H71이 SPECT 영상화를 위한 방사선표지된 억제제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 고형 및 액상 종양 또는 림프종을 위한 명백한 적용가능성과 함께 영상화될 수 있는 임의의 종양에 적용가능하다. 이러한 종양의 예는, 결직장암, 췌장암, 갑상선암, 기저 세포 암종, 흑색종, 신장 세포암, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장 기질 종양, 식도암, 위암을 포함하는 위장암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌 종양, 여포성 림프종 및 확산 거대 B-세포 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병, 골수종, 골수증식성 종양, 및 난소암, 경부암 및 자궁내막암을 포함하는 부인과암, 특히 유방암, 위암 또는 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암과 관련된 것들이다. 하기 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 방사선표지된 HSP90 억제제(예: 124I-PU-H71)에 대한 종양의 흡수 및 노출이, HSP90 치료에 대한 반응을 나타내고 PU-H71 또는 기타 HSP90 치료에 대한 바람직한 또는 바람직하지 않은 치료학적 반응 나타낼 가능성이 있는 환자를 구별하는 방식으로 달라짐을 보여준다. 구체적으로, 방사선표지된 HSP90 억제제(예: 124I-PU-H71)의 최소 흡수 및/또는 신속한 정화를 입증하는 종양은 PU-H71 또는 기타 HSP90 억제제에 대해 접근불가능하거나 내성이 있을 수 있다. 또는, 이러한 종양은 생존을 위해 HSP90에 의존하지 않을 수 있고(즉, "발암성 HSP90"의 낮은 풍부함), 따라서 HSP90 치료를 부적절하게 한다. 반대로, 방사선표지된 HSP90 억제제의 고도의 흡수 및 장기간 체류(예를 들면, 후속 시점에서 고도의 종양-대-혈액 비 또는 0 내지 24시간 또는 48시간 또는 그 이상의 간격 동안 고도의 종양 AUC에 상응함)를 갖는 종양은 HSP90 억제제에 의한 표적에 보다 감수성인 것으로 예측될 수 있다. 환자 선택은, PET에 의해 예상되는 바와 같이, 효과적 종양 농축을 달성하는데 요구되는 치료학적 용량 및 계획이 과도한 독성을 생성하는지에 따라 유도될 수 있다(예를 들면, 유효 용량은 최대 내성 용량(MTD)보다 높거나, "발암성 HSP90"의 15 내지 100%가 MTD보다 높은 용량에 의해서만 점유된다).
방사선표지된 억제제의 흡수에 의해 측정된 HSP90 발암성 복합체(즉, "발암성 HSP90")의 풍부함은 HSP90 억제에 대한 종양의 감수성을 반영한다. 따라서, 본 발명의 한 가지 측면에 따라, 종양 중의 "발암성 HSP90"의 풍부함은 HSP90 억제에 대한 반응의 생물마커로서 사용된다. 상기 언급된 바와 같이, PET는 종양 및 정상 기관에서 방사선표지된 화합물의 조직 농도의 비침략적 신뢰성 있는 평가를 가능하게 한다. 따라서, HSP90 발암성 종에 우선적으로 결합하는 [124I]-PU-H71 및 기타 HSP90 억제제는, 형광 표지된 PU-H71의 상기한 용도와 유사하게, "발암성 복합체 HSP90"의 정량화를 가능하게 하는 특징인 이들의 종양 흡수를 비침략적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 방사선표지된 억제제의 고도 종양 흡수는 HSP90 억제제에 가장 반응할 가능성이 있는 종양을 갖는 환자를 동정할 것이다. 종양에서 PU-H71 추적자 축적은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 PET 영상으로부터 정량화된다. PU-H71 추적자의 종양 축적은 단일 시점 또는 복수 시점에서 종양 추적자 농도의 분석으로부터 정량화될 수 있다. 추적적 농도는 조직의 특정 용적에 존재하는 추적자의 양을 지칭한다. 본원에서 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 당해 기술분야에 광범위하게 공지된 추적자 농도를 표현하는 다양한 수학적 형태가 존재한다. 추적자-양 및/또는 조직-용적은 각각 참조 값의 분획으로 나타낼 수 있다. 예를 들면, 통상 사용된 표준화 흡수치(SUV)는 환자에게 투여된 전체 추적자-용량의 분획으로서 나타내며; 신체 참조 값의 분획으로서 조직-용적을 나타낸다(예를 들면, 체질량 또는 체표면적).
본 발명에 있어서, 본 발명자들은 암 환자가 "발암성 HSP90"에 선택적으로 결합하는 방사선표지된 억제제에 대해 다양한 "친화성"(흡수 또는 체류)을 입증하는 것을 보여준다. 유사한 형태 및 단계의 암을 갖는 암 환자는 방사선표지된 억제제의 실질적으로 상이한 흡수를 가질 수 있고, 이는 암세포의 생존 및 증식에서 HSP90의 상이한 관여 수준을 나타낸다. 예로서, 12개의 유방암 환자를 24시간 후에 [124I]-PU-H71의 흡수에 대해 평가했다. 이들 연구 결과는 도 24에 제시되어 있다. 그래프 상의 각각의 막대는 PET를 통해 측정한 바와 같이 [124I]-PU-H71의 최대 표준화된 흡수치(SUVmax)를 나타낸다. SUVmax는 환자마다 현저히 달라지며, 이는 환자의 종양에서 "발암성 HSP90" 양의 차이를 나타낸다. 보다 높은 SUVmax 값을 갖는 환자는 HSP90 억제 치료에 대해 더 많이 반응할 가능성이 있다. 예를 들면, 방사선추적자의 투여후 24시간에서 측정하는 경우, 약 0.25 이상의 [124I]-PU-H71의 SUVmax 값을 갖는 환자는 HSP90 억제 치료를 위한 잠재적 후보물질이다. 화합물 투여후 24시간에서 측정하는 경우, 약 0.75 이상의 [124I]-PU-H71의 SUVmax를 갖는 환자는 HSP90 억제 치료를 위한 강력한 후보물질이다. 화합물 투여후 24시간에서 측정하는 경우, 약 1.5 이상의 [124I]-PU-H71의 SUVmax를 갖는 환자는 HSP90 억제 치료를 위한 매우 강력한 후보물질이다.
암 환자가 특정 HSP90 억제제("발암성 HSP90"에 우선적으로 결합하는 것들)에 대한 다양한 친화성을 입증한다는 본 발명자들의 발견에 기반하여, 방사선표지된 HSP90 억제제는 HSP90 억제 치료에 반응하지 않을 것 같은 환자로부터 HSP90 억제 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 종양이 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서, 종양 또는 종양 세포를 함유하는 샘플을, 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 검출가능하게 표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계, 및 샘플 중의 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 참조 양과 비교하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 참조 양과 비교하여 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 보다 큰 양은 당해 종양이 HSP90 억제제와 반응할 가능성이 있음을 나타낸다.
종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 것은 다수의 상이한 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 양태에서, 상기 언급된 바와 같이, 방사선표지된 화합물의 SUVmax(또는 SUVavg)는 방사선표지된 억제제의 투여후에 4시간 이상의 시간에서 계산할 수 있다. 몇몇 양태에서, SUV는 방사선표지된 억제제의 투여후에 8시간 이상의 시간에서 계산할 수 있다. 특정한 양태에서, SUV는 방사선표지된 억제제의 투여후에 16시간 이상의 시간(예: 16시간, 20시간, 24시간, 48시간, 72시간, 192시간)에서 계산할 수 있다. SUV는 2개의 상기 값의 어느 하나에 의해 경계를 이루는 범위, 예를 들면, 8시간 내지 16시간, 16시간 내지 24시간, 16시간 내지 48시간 등에서 계산될 수 있다.
SUV는 정상 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 참조 양과 비교될 수 있다. 한 가지 양태에서, 참조 SUV는 건강한 개체 또는 특정 시점에서 대조군 모집단 중의 암 환자의 정상 세포 및 조직에 대한 측정치로부터 수득한 평균 수준일 수 있다. 섹션 5.1에 언급된 바와 같이, 정상 세포는 최소 "발암 HSP90"을 갖거나 전혀 "발암 HSP90"을 갖지 않는다. 따라서, 건강한 개체의 세포 또는 암 환자의 건강한 조직 또는 기관에서 "발암성 HSP90"에 특이적인 방사선표지된 억제제의 흡수는 최소이다. 표지된 억제제가 혈류를 정화시킨 시점에서의 측정이 바람직하다는 것은 당해 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다. 또한, 측정은 임의의 정상 조직에서 수행할 수 있지만, 표지된 억제제 대사작용 및 정화에 연루되지 않은 것들이 바람직하다는 것은 당해 기술분야의 기술자에게 자명하다. 한 가지 양태에서, 이러한 바람직한 측정은 골격근, 골 또는 심장 혈액 풀로부터 선택된 바와 같은 하나 이상의 부분의 것이다.
또 다른 양태에서, 환자의 종양에서 방사선표지된 억제제의 최대 흡수(즉, SUVmax)(이하 "종양 SUV"로서 본원에서 지칭됨)는 환자의 건강한 세포에서 방사선표지된 억제제의 흡수와 비교될 수 있다. 예를 들면, 한 가지 양태에서, 특정한 시점에서 수득한 환자 종양으로부터의 SUV 데이터는 혈액으로부터의 SUV 또는 환자의 골 또는 근육으로부터 선택 면적과 비교될 수 있다. 용어 "혈액 SUV"는 PET 분석으로부터 유래된 심장의 함량중 평균 SUV를 지칭한다. 용어 "근육 SUV"는 PET 분석으로부터 유래된 환자의 골격근의 평균 SUV를 지칭한다. 심장 및 골격근은, 이들이 종양 부위 주위의 "배경" 활성을 나타내기 때문에, 선택되었다.
환자 선택 및 치료를 위한 PET 분석의 용도
본 발명자들은, HSP90에 의존적인 종양을 갖는 환자에서, PET로부터 유래된 종양:근육 및 종양:혈액 SUV 비가 주사후 시간 의존적 방식으로 또는 "발암 HSP90"에 특이적으로 결합하는 방사선표지된 억제제(예: [124I]-PU-H71)에서 증가함을 발견했다. 이들 환자에서, 종양:근육 및 종양:혈액 SUV 비는 일반적으로 방사선표지된 억제제의 주사후에 1:1로 선택하고, 당해 비는 시간에 따라 증가한다. HSP90 억제 치료에 반응성인 다양한 유형의 고형 종양 및 액상 종양을 갖는 선택된 환자 수에 대해 PET로부터 유래된 데이터는 도 25에 제시되어 있다. 각각의 환자에 있어서, [124I]-PU-H71의 투여후에 복수의 시점에서 최대 종양 SUV(SUVmax) 및 평균 근육 SUV는 PET 분석으로부터 수득했다. 도 25는 암 환자에 대한 평균 종양:근육 SUV 비 및 표준 편차 값을 나타낸다. 종양:근육 SUV 비는 0에서 48시간까지 증가한다.
고형 종양 이외에, 당해 방법은 액상 종양의 영상화를 가능하게 하고, 이는 PU-PET에 의해 질량 비장 영상화를 제공한 주변 영역 림프종 및 만성 림파구 백혈병 단계 IV로 진단된 환자에 대한 경우이다.
이러한 데이터 축적에 기반하여, 본 발명자들은 "발암성 HSP90"에 특이적으로 결합하는 HSP90 억제제의 투여후에 2 이상의 종양:근육 SUV 및/또는 종양:혈액 SUV 비를 갖는 암 환자가 HSP90 억제 치료에 반응할 가능성이 있음을 측정했다. 당해 비는 바람직하게는 방사선표지된 억제제의 투여후 4시간 이상에서 하나 이상의 시점에서 계산한다. 예를 들면, 당해 비는 방사선표지된 억제제의 투여후에 8시간, 16시간, 24시간 또는 48시간에서 계산할 수 있다. 특정한 양태에서, 방사선표지된 억제제의 투여후 24시간에서 2.5 이상의 종양:근육 또는 종양:혈액 WUV 비는 당해 환자가 HSP90 억제 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 다른 양태에서, 방사선표지된 억제제의 투여후 24시간에서 4 이상의 종양:근육 또는 종양:혈액 SUV 비는 당해 환자가 HSP90 억제 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 다른 양태에서, 방사선표지된 억제제의 투여후 24시간에서 5 이상의 종양:근육 또는 종양:혈액 SUV 비는 당해 환자가 HSP90 억제 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 이들 양태에서, 종양 중의 SUV는 SUVmax이고, 근육 또는 혈액 중의 SUV는 평균 SUV(즉, SUVavg)이다.
또 다른 양태에서, 종양에서 수득한 PET 영상은 환자의 건강한 조직(즉, 비-암성)과 비교된다. 바람직하게는, 이러한 양태에서, 참조 PET 스캔은 종양과 동일한 기관에서 수득된다. 예를 들면, 환자가 척추에 종양을 갖는 경우, 척추 종양은 정상 척추 골과 비교된다. 당해 종양이 HSP90에 의존성인 경우, 보다 큰 농도의 방사선표지된 억제제는 PET 스캔을 사용하여 정량적으로 측정할 수 있다. 종양의 SUV 값은 방사선표지된 억제제의 주사후 특정한 시점 또는 복수의 시점에서 건강한 주위 조직에 대한 SUV 값과 비교될 수 있다. 대안적으로, 종양으로부터의 PET 영상 및 건강한 조직으로부터의 PET 영상은 시각적 검사에 의해 비교될 수 있다. 종양이 방사선표지된 억제제를 보유하는 경우, 시각적으로 PET 영상 위에서 종양은 "발광"할 것이고 "핫스팟"처럼 보일 것이다(예를 들면, 도 26 및 도 27 참조).
본 발명자들은 방사선표지된 억제제의 투여후 특정 시점에서 "핫스팟" 또는 "핫스팟들"의 존재는 암 환자에서의 HSP90 연루를 암시하고 당해 환자가 HSP90 억제 치료를 받을 수 있는 징후를 제공한다는 것을 측정했다. PET 영상에서 핫스팟의 존재는 바람직하게는 방사선표지된 억제제의 투여후 적어도 1.5시간의 시점에서 측정된다. 예를 들면, 핫 스팟은 방사선표지된 억제제의 투여후 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 165시간 또는 192시간에서 검출할 수 있다. 핫 스팟의 존재는 상기 2개 값의 임의의 경계 범위, 예를 들면, 2시간 내지 4시간, 4시간 내지 8시간, 16시간 내지 24시간 등의 범위 사이에서 검출할 수 있다. 2시간 미만의 시점에서 환자 종양에 핫스팟의 존재는 당해 환자가 HSP90 억제 치료에 대한 양호한 후보물질일 수 있음을 반드시 나타내는 것은 아니다. 예를 들면, 도 26(우측 패널)은 [124I]-PU-H71 주사후 30분에 수득한 맨틀 세포 림프구를 갖는 환자의 [124I]-PU-H71 PET/CT를 도시한다. PET 스캔은 30분 후에 깨끗한 시각화를 나타낸다. 그러나, [124I]-PU-H71의 어떠한 흡수도 후속 시점(3.5 내지 24시간)에서 관찰되지 않았다. 따라서, 환자는 HSP90 치료를 위한 후보물질일 가능성이 없다.
본 발명의 PET 분석은 또한 전이성 또는 원발성 고형 종양 및 액상 종양이 HSP90 억제 치료에 더욱 감수성인지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 도 27은 2개의 지시된 림프절(LN)에서 재발 유방암을 갖는 환자의 [124I]-PU-H71 PET/CT를 나타낸다. [124I]-PU-H71 주사후 지시된 시간에서의 PET 영상을 정량화하고, [124I]-PU-H71에 대해 수득한 SUV 데이터를 10mg/m2의 PU-H71의 가설 투여 용량에 대한 HSP90 억제 농도로 전환시켰다. 0 내지 24시간에 걸쳐 PU-H71에 대한 2개 종양의 노출을 또한 계산하고, 곡선하 면적(AUC)로 나타냈다. 도 27의 하부 패널에서, CT(좌측), PU-PET/CT(중간) 및 EDG-PET/CT 융합(우측) 횡단면 영상은 림프절 중 하나에서 [124I]-PU-H71- 친화성을 입증하지만, 다른 것들은 입증하지 못한다. PU-PET 영상화는 [124I]-PU-H71 주사후 24시간에서 수행한다. 흥미롭게도, PU-친화성은 이 경우에 FDG-친화성과 중첩하지 않는다. 이는 유일한 경우가 아니고, 분석된 환자의 FDG- 및 PU-친화성중 몇몇에서 전부는 아니지만 일부 종양에 대해 상호관련된다. 종양의 위치는 화살표로 제시된다. [124I]-PU-H71 주사후 지시된 시점에서 PET 영상은 최대 표준화된 흡수치(SUVmax)로서 측정했다. PET 분석으로부터의 결과는 좌측 기관지 각도 림프절이 좌측 기관지 전방 각도 림프절의 병변보다 HSP90 억제 치료에 더욱 감수성인 것으로 예상됨을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면에서, HSP90 치료에 대한 후보물질인 것으로 동정된 환자는 치료학적 유효량의 HSP90 억제제로 처리한다. 본 발명자들은 HSP90 억제 치료에 대한 후보물질인 것으로 측정되는 암 환자가 HSP90 억제 치료에 대해 고도로 양호하게 반응하는지를 측정했다. 환자가 복수의 종양을 갖는 경우, 방사선표지된 HSP90 억제제에 대해 충분한 친화성을 갖는 종양은 HSP90 억제 치료에 반응할 것으로 예상된다. 예를 들면, 도 28은 [124I]-PU-H71로 영상화된 다음 HSP90 억제제로 처리한 폐 및 골 전이를 갖는 48세 유방암 환자에 대해 수득한 영상을 나타낸다. 구체적으로, 환자를 [124I]-PU-H71 PET로 영상화하는 경우, 스캔은 척추 전이에서는 아니지만 우성 우측 폐 전이에서 HSP90-표적화를 나타냈다. 환자에게 STA9090(가네테스핍)을 사용한 HSP90 치료를 진행한 경우, HSP90 억제제는 PU-H71로부터 화학적으로 구별되고, 초기 부분 반응은, [124I]-PU-H71 PET에 의한 예측에 따라, 척추 병변에서가 아닌 폐 매쓰에서 FDG PET-CT 연구에 의해 입증되었다(도 28). 유사한 결과는 림프종을 갖는 환자, 췌장암 및 신경아세포 환자에서 수득되었다.
투약량 결정을 위한 PET 어세이의 사용
본 기재는 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 HSP90 억제제의 방사성 표지 형태를 환자에게 투여하는 단계, 일 또는 그 이상의 시간점에 환자의 종양에 의한 HSP90 억제제의 방사성 표지 형태의 섭취를 측정하는 단계, 및 종양을 치료하기 위한 HSP90 억제제의 효과적인 농도를 각각의 시간점에 종양에 있어서 유지하기 위해서 필요한 투여의 투약량 및 주기를 계산하는 단계를 포함하는, HSP90 억제제를 이용한 치료를 위한 효과적인 투약량 및 투여의 빈도를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 HSP90 억제제의 방사성 표지 형태의 섭취는 PET 어세이를 사용하여 상기에서 논의된 바와 같이 결정할 수 있다. 상기 방법론은 결장 암, 췌장 암, 갑상선 암, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비소세포 폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경모세포종, 위장 기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌암, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병, 골수종, 및 골수증식종양, 및 난소, 자궁, 및 자궁내막암을 포함하는 부인과질병암에 제한되지는 않으나 이를 포함하는 고형 및 액체 종양의 다양한 형태에 적용될 수 있다.
개시의 일 양태로서, 상기 PET로부터 유도되는 방사성 표지 형태의 억제제의 SUV는 다음과 같은 식에 따라서 종양에서 약물의 몰농도로 전환될 수 있다.
Figure 112017033467195-pat00035
상기 식에서, 상기 용어 [HSP90 inhibitor]t는 방사성 표지된 억제제의 투입후 시간 t에 있어서 종양에서 억제제의 몰농도이다. 상기 용어 HSP90 inhibitor (dose)는 투입된 치료학적 투약량을 의미한다. 상기 용어 W는 종양물부분이다. 상기 용어 MW는 투입된 약의 분자량이다. 상기 용어 [Atumor]t는 시간 t에서 종양에 있어서 %-투여된 방사성 표지된 투약량이고, PET 영상으로부터 얻는 SUV로부터 얻은 값이다. 구체적으로, 상기 용어 [Atumor]는 다음과 같은 식에 따라서 종양 (SUVtumor)에 있어서 SUV로부터 유도될 수 있다.
Figure 112017033467195-pat00036
상기 식에서, [body weight]는 환자의 체중을 의미한다.
한가지 측면으로, 본 기재는 암 환자에게 있어서 영상화 할 수 있는 암에 존재하는 HSP90 억제제의 농도를 결정하는 방법을 제공한다. 방사성 표지 억제제 (또한 여기에서 “핫(hot)”약물로 언급한) 용액은 약물(예를 들어, 약물의 비-방사성 표지된 형태, 또한 여기에서 “콜드(cold)”약물로 언급한)의 수반되는 투여없이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상기 약물의 농도[HSP90 inhibitortumor]t는 상기의 식을 사용하여 결정할 수 있다. 한 가지 일 양태로서, 상기 방사성 표지 억제제(“핫 약물”)은 투여된 약물(“콜드 약물”)의 방산선 표지된 형태이다. 예를 들어, 상기 방사성 표지된 억제제는 [124I]-PU-H71 일 수 있고, 상기 투여된 약물은 PU-H71 일 수 있다. 다른 하나의 양태로서, 상기 방사성 표지된 억제제는 투여된 약물과 다를 수 있다. 종양에 있어서 약물의 농도[HSP90 inhibitortumor]t의 결정은 방사성 표지된 억제제 및 치료학적 약물의 투여 다수의 시간 점 또는 단일 시간 점에서 결정될 수 있다. 종양에 있어서 약물의 농도[HSP90 inhibitortumor]t를 전임상의 연구로부터 얻어진 알려진 효과적인 투약량(예를 들어, 반-저해 농도 (IC50))과 비교함으로써, 투여된 투약량이 효과가 있는지를 결정할 수 있다. 의사는 종양에 있어서 약물의 바람직한 양을 확보하기 위해서 따라서 투약량을 적절히 조절할 수 있다.
방사성 표지된 억제제가 환자에게 투여되는 약물의 방사성 표지된 형태인 일 양태에서, 종양에서 약물의 농도([HSP90 inhibitortumor]t)는 사실상 콜드 약물의 투여 없이 결정될 수 있다. 이러한 경우, PET 어세이로부터 [Atumor]t의 결정후, 다양한 가설적 투여 량 값(D)이 종양에 있어서 약물의 농도([HSP90 inhibitortumor]t)를 결정하기 위해서 상기 식에 대입될 수 있다. 효과적인 투약량은 종양에서의 약물의 농도([HSP90 inhibitortumor]t)를 상기에서 논의된 바와 같이, 전임상 연구로부터 얻어진 알려져 있는 효과가 있는 투약량과 비교하여 결정될 수 있다. 게다가, 구체적인 Section 5.2.1.2.1.에서 논의된 바와 같이, 상기 방법론은 HSP90 치료를 위한 효과적인 투약 요법을 디자인하기 위해서 사용할 수 있다.
우리는 단지 핫 약물의 투여 후 종양 농도 또는 약물 노출(예를 들어, AUC)의 수치를 결정하였고 그리고 HSP90 억제제의 가설적 양을 입력하는 것은 콜드 및 핫 약물이 동시-투여되는 실험에 있어서 유사한 결과를 제공한다. 실시예로서, 도 29는 두 가지 방법에 의해서 얻어진 영상화 시간(0-72h)에 걸친 질환이 있는 임파선 노드에 있어서 PU-H71의 농도를 나타낸다. 놀랍게도 유사한 종양 농도 및 PU-H71에의 종양의 노출이 두가지의 방법에 의해서 측정되었다 (AUC0 -48h 24.9 vs. 22.3μM-h).
본 기재는 또한 종양에 있어서 발암의 HSP90 수용체를 포화시키기 위해서 필요한 HSP90 억제제의 투약량을 결정하는 방법을 제공한다. 상기에 기재한 바와 같이, 상기 PET 어세이는 방사성 표지된 HSP90 억제제 (예를 들어, 핫 약물) 및 치료학적 약물(예를 들어, 콜드 약물)의 구체적인 양의 공동-투여에 의해서 수행될 수 있다. 만약 상기 투여된 약의 투약량이 종양에 있어서 “발암성의 HSP90”의 거의 또는 전부를 차지 할 만큼 충분히 높다면, 방사성 표지된 억제제의 섭취는 억압받는다. 방사성 표지된 억제제의 섭취가 억제되는 시점은 억제제의 표적-포화 용량을 결정하기 위해서 사용될 수 있고, 이것은 또한 약물의 단일 투약으로 전달될 수 있는 '최대 종양 투약량'이거나 약물의 최대한으로 효과가 있는 단일 투약량일 수 있다. 아래 Section 5.2.2.2.1.의 식(4)에 나타낸 바와 같이, 아래, HSP90 억제제에 의해서 채워지는 종양 부분의 수는 계산될 수 있고 퍼센트 점유율로 전환될 수 있다. 만약 HSP90 억제제가 HSP90 부분의 전체 점유율에 근접하는 양으로 전달될 수 있다면, 추가 약물은 효율에 있어서 증가된 레벨을 제공하는 것으로 기대되지 않을 것이다. 따라서, 상기 방법론은 종양에 있어서 발암성 HSP90의 대부분 또는 전부를 차지할 수 있는 억제제의 투약량을 결정하는 방법을 제공한다. Section 5.2.2.2.1.에서 보다 구체적으로 언급한 바와 같이, 상기 기재된 방법론은 보다 합리적이고 효과적인 투약 전략을 제공하고 이것은 전통적인 최대 용인된 투약량(MTD)이라기 보다 PET-유도된 최대 효과 종양 농도에 기반한 것이다. 상기 접근은 투약량의 확대를 피하고 약물과 관련된 독성의 문제를 제한한다.
5.2.2.2.1. [ 124 I]-PU-H71
본 기재의 하나의 측면에서, PET 영상에 적용될 수 있는 상기 방사성 표지 HSP90 억제제는 [124I]-PU-H71과 같은, PU-H71의 방사성 표지 형태이다. 하기와 같이 논의한 바와 같이, [124I]-PU-H71을 이용한 PET 영상은 암환자가 HSP90 치료에 적합한지를 의사에게 알려주기 위해서 사용될 수 있다. 게다가, [124I]-PU-H71을 이용한 PET 영상으로부터 얻어진 결과를 특정 암 환자에게 투여하여야 하는 HSP90 억제제의 투약량을 결정하기 위해서 사용할 수 있다. 추가적으로, [124I]-PU-H71를 이용한 PET 영상으로부터 얻어진 결과는 HSP90 억제제의 투약량 스케쥴을 결정하는데 사용될 수 있다. 상기 치료제로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 PU-H71의 유사체, 동족체, 또는 유도체이다.
잠재적인 비-침습성 종양 HSP90 어세이로서 [ 124 I]-PU-H71 PET 어세이
HSP90 억제제의 비-침습성 분석을 위한 PET의 도입은 실현가능하다 왜냐하면 HSP90 억제제 중 하나인, PU-H71는 내생의 아이오딘 원자, 자연적으로 발생하는 안정한 동위원소 아이오딘-127 (127I) (도 30a)114을 함유하기 때문이다. 이것은 장수명 양전자 방출 아이오딘-124 (124I), 4일 물리적 반-감기를 갖는 동위원소 (도 30a)로 PET를 위해 동위원소적으로 치환될 수 있다. 이러한 동위원소 라벨링 투약량은 이러한 화합물의 친화력, 선택성 또는 생물학적 분배 프로파일을 변화시키지 않는다. 사실상, PET 방사성 의약품, [124I]-PU-H71,은 약학적 화합물, PU-H71과 동일한 분자이고, 이의 약동학을 따라서 예측하여야 한다. 방사성 표지된 약물의 미량(마이크로그램) 단일 투여는 또한 완전하게 생물학적으로 비-동요되고, 그리고 몇일에 걸쳐 조직 추적-농도를 추적하기 위한 시리얼 PET 영상을 허용한다.
투여 후 일주일에 걸쳐서 만족스러운 정량적 PET 영상을 허용하기 때문에 상대적으로 124I의 긴 반-감기는 HSP90 억제제의 보고된 장기적 종양 약동학을 감시하는데 이상적이다. 또한, 124I는 이제 미국에서 상업적으로 구매가 가능하고, 그리고 이의 반-감기는 [124I]-PU-H71는 세계적인 의학 센터에서 이용 가능하다는 것을 보장한다.
따라서, [124I]-PU-H71은 PU-H71의 진실된 '추적자'로서 사용되기에 매우-적합하고 다른 HSP90 억제제에 대한 표적 바이오마커로서 매우-적합하다.
상기 HSP90 억제제는 표적화된 종양 치료의 유망한 군이나, 이들의 최적의 임상학적 발달은 HSP90 표적에 특이적인 약학적 어세이 동시-개발을 요구한다. 이의 내성 아이오딘 때문에, 우리는 양전자 방출 단층촬영에 근거하여 종양 HSP90을 위한 그 종류의 첫번째의 비-침습 영상 어세이를 발달시키기 위한 HSP90 억제제 PU-H71을 사용한다. 우리는 [124I]-PU-H71은 종양내 약동학 및 모 약물의 약력학을 위한 진정한 추적자(tracer)라는 것을 유방암의 마우스 모델에서 나타낸다. 우리는 종양에 전달되는 약물의 실질적 농도 어세이, 효율적 투약량 및 스케쥴 요법을 계획, 및 효과적인 종양 농도를 획득하는데 필요한 HSP90 억제제의 투약량을 결정하는데 있어서 이의 사용을 증명한다. 상기 어세이(assay)는 또한 일반적인 최대 용인 투약량을 넘어서는 HSP90 치료를 보장하는, 종양 표적 포화 투약량을 보고한다. 이러한 작업에 근거하여 우리는 상기 어세이는 임상의들에게 풍부한 시도를 위한 향상된 능력 및 개개인의 환자에게 약물 투약량 및 스케쥴을 재단하기 위한 향상된 능력을 제공하고, 충족되지 않은 치료학적 필요를 만족하거나 HSP90-표적제로 긍정적-영향을 미치는 치료적 결정을 만드는 것을 보장한다.
[ 124 I]-PU-H71 생물분포 및 PU-H71의 클리어런스 미러(clearance mirrors)
PU-H71 및 다른 HSP90 억제제의 in vivo 역학적 프로파일을 예상 및 감시함에 있어서 [124I]-PU-H71의 사용을 평가하기 위해서, 우리는 [124I]-PU-H71을 생산하였고, 암을-가지고 있는 마우스들 (인간 유방암 MDA-MB-468 이종이식)에서의 연속적인 작은 동물 PET 영상 연구 및 종양 및 다양한 평균 조직에 대한 시간-활성 (i.e %ID/g 대 투여-후 시간) 커브 도출을 수행하였다. [131I]-PU-H71 또는 [124I]-PUH71의 확증하는 생물분포 연구는 투여-후 선택된 시간에 있어서 동물의 집단을 희생하는 것 및 종양 및 선택된 정상 조직의 수확 및 감마 집계에 의해서 수행되었다(도 30b-c). 정맥(i.v.) 또는 복강내(i.p.) 투여후, 약제는 빠르게 조직에 분배되었고(도 30b; 1-2시간), 그 후 혈액 및 다른 정상 조직으로부터 빨리 제거되었다(도 30b; 4-100 시간). 투여 후 4시간에(p.a.), 뇌, 골, 근육, 지라, 및 심장에서 보다 종양에서 각각 40-, 9-, 18-, 6- 및 10-배 더 높게 존재하였다(도 30c). 24시간에서, 종양-대-정상 조직 비율은 뇌, 근육, 지라, 심장 및 혈액에서 50 에서 100배 상승하였다. 작은 (부피 ~100 mm3) 및 큰 (부피 ~200 mm3) 종양에 있어서 섭취 (%ID/g)는 유사하였다 (도 30d).
[124I]-PU-H71은 이중-지수 형태로 종양으로부터 사라졌다(도 30d). 혈액-생성 활성의 제거에 기인하는(도 30b,d), 초기 빠른 상은 이전에 보고된 PU-H71100,115-118을 위한 탄뎀 액체 크로마토그래피 질량 분석계(LC-MS/MS)-기반 종양 약력학적 데이터에 의해서 보고된 바와 일치하는 특정 종양 체류(도 30d, 삽도)에 기인할 수 있는 느린 최종 제거 상(반감기~60시간)으로 이어졌다. 이들 데이터는 종양 내에서 약물의 치료 형태 및 방사성 추적자 형태가 동일하게 거동한다는 개념을 지지한다.
종양에 대조적으로, [124I]-PUH71는 단일 지수 형태로 혈장 단백질-결합의 증거 없이(도 30b-d) 전체 신체로부터 빠르게 없어졌다. [124I]-PU-H71 방출은 간담즙성 및 비뇨기 루트를 통해서 발생하였다(도 30b). 추측하건데 간장 약물 대사 때문에 그리고 간담즙성의 배설 때문에, 간장 활성은 담즙구조계열에서 순수 추적자(tracer) 및 대사체 모두를 나타내었으나 간세포에서 [124I]-PU-H71는 나타내지 않았다. 위장관에 있어서 활성(도 30b)은 투여된 활성의 50% 이상을 차지하였으나, 그러나 거의 완전하게 배설되는 활성을 나타냈다(보여지지는 않음).
비-위장관 및 비-비뇨생식 기관에 있어서의 활성(예를들어, 신장, 수뇨관 및 방광)은 투약 활성의 ~1%를 차지하였다. 잔여 49%(장관 기관에 있어서 50% - 비뇨생식기관에 있어서 1%)는 쉽게 요로를 통해서 배설되었다. 이러한 발견은 in vivo [124I]-PU-H71 PET 데이터(도 30b)에 의해서 뒷받침되었다. 이러한 관찰은 전체 마우스를 제한하는 관심영역(ROI: region of interest)을 이용하여 유도되며 4시간 in vivo [124I]-PU-H71 PET 데이터(도 30b)에 의해서 뒷받침된다. 투여 활성의 40-50%만을 차지하며 마우스들에 있어서 장 변형시간이 대개 4시간119보다는 길기 때문에, 투여활성의 나머지(예를 들어, 4h 전신 ROI에 있어서 40-50%가 아님)이 요로를 통해서 배설되는 것으로 보인다.
만약 마우스들이 방사성추적자의 투여 이전에 요오드화 칼륨의 포화 투약량을 받는다면(도 30b) 억제되는 갑상선 영역에서 방사성 활성을 가시화하여, 생체 내(in vivo ) 자유 방사성 요오도(예를 들어, 라디오-이오다이드, radio-iodide)의 생산을 나타내었다. 요오드화 칼륨을 받지 않은 마우스들에 있어서, 주사 후 4시간 및 28시간 사이의 최대 갑상샘 활성은 투여된 활성의 <0.4% 였다. 정상 마우스 갑상선은 투여된 방사성 요오드120 ,121의 ~4-7%까지 축적된다. 따라서, <0.4%의 갑상선 섭취는 [124I]-PU-H71로부터 생체내 방출되는 자유 방사성요오드의 양이 작다(투여 활성의 ~5-10%)는 것을 의미한다. 자유 방사성요오드의 작은 양의 방출은 방사성 표지화된 추적자에서 흔한 것이고, 그리고 임상 실무에서, 갑상선 섭취는 방사성추적자의 투여 이전에 요오드화 칼륨의 포화 용액의 구강 투여를 사용하여 일상적이고 효과적으로 막는다.
[ 124 I]-PU-H71는 PET에 의해서 깨끗한 종양 HSP90 영상화를 허용한다.
종양을 가지고 있는 마우스들에 있어서 [124I]-PU-H71의 생체 내 PET영상은 깨끗한 종양 영상을 제공하였고, 따라서 잠재적 종양 HSP90 표적화 및 종양 체류를 제공하였다(도 30b, 화살표). ROI 분석으로부터 얻어지는 섭취 값(%ID/g) 평균(+표준편차)은 4시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 100 시간에서 각각 0.35 ± 0.07, 0.083 ± 0.02, 0.058 ± 0.02, 0.031 ± 0.01 및 0.024 ± 0.008 이었고, 생물분포 연구에서 얻어지는 값과 일치하고(도 30d), 생체 내 PU-H71의 비-침습적 모니터링 및 이의 시간-의존적 종양 농도의 믿을 수 있는 수량화가 [124I]-PU-H71 PET에 의해서 가능함을 확인해준다.
약학적으로 효과가 있는 PU-H71 종양 농도를 얻기 위해서 필요한 PU-H71의 투약량을 결정하기 위해서 [124I]-PU-H71 PET 영상의 사용
상기에서 언급한 바와 마찬가지로, 종양 및 혈액에서 [124I]-PU-H71 그리고 따라서 비표지된 PU-H71의 약동학은 상당히 다르다: 종양 약물 농도는 종양 혈액 풀로부터 약물 제거에 상당히 기인하는 최초 빠른 지수적 제거 후에 주사 후 ~24시간에 안정화되었다. 대조적으로, 혈액 약물 레벨은 빠른 그리고 지속적인 지수적 제거를 나타내었다 (도 30b, 30d). 상기 [124I]-PU-H71의 종양 대 혈액 활성 농도비율은 주사후 ~12시간에 ~10 내지 그 이상의 값에 도달하였다(도 30c). 따라서 상기 PU-H71의 통합 혈액레벨 (예를들어, 혈액 시간-활성 농도 커브 하에서의 면적, AUCPU-H71 blood)은 PU-H71의 종양 레벨의 믿을만한 대용물이 아니었다. 진정으로, 종양 시간-활성 농도 커브 하의 면적, AUCPU - H71 tumor은 AUCPU - H71 blood 보다 15-배 더 컸다(도 30d, 종양 및 혈액에서 각각 11.4 대 0.78 %ID/g-h). 따라서, 혈액 약동학은 환자-특이적 치료학적으로 효과적인 종양 농도를 달성하기 위한 투약요법을 디자인하기위해서 믿을만하지 않다.
따라서, 우리는 선택된 시간의 기간에 걸쳐서 치료학적으로 효과적인 종양 농도를 얻고 유지하기 위해서 요구되는 투여되는 PU-H71 투약량을 예측하기 위한 [124I]-PU-H71 PET의 능력을 조사하였다. PU-H71 (PU-H71dose in mg)의 투여된 투약량에 대해서, 상기 투여후 시간 t에서 종양물부분(water space) (평균 물부분을 사용하여, W = 0.8 mL/g)에 있어서 약물 농도(mg/mL 또는 g/L), [PUH71tumor] t ,는 평형상태 및 투여후 시간 t에서 얻어진, 종양(%ID/g)에 있어서 PET-유도된 [124I]-PU-H71 활성 농도[Atumor] t 로부터 계산한다.
Figure 112017033467195-pat00037
투여후 시간 t에서 상기 종양물부분에 있어서 약물 농도(μM) [PU-H71tumor],는 따라서 다음과 같다:
Figure 112017033467195-pat00038
여기에 있어서, 상기 값 512는 PU-H71의 분자량이고 1x106은 μM 농도로 바꾸는 요소이다.
역으로, 선택된 치료학적으로-효과적인 종양 PU-H71 농도를 얻기 위해서, 개인적인 환자에 대한 투여를 위한 PU-H71의 바람직한 투약량(mg)은 투여후 시간 t에서의 종양에서 그 또는 그녀의 PET-유도된 활성농도에 근거하여 계산할 수 있다:
Figure 112017033467195-pat00039
도 30d에서와 같이 종양-활성 자료를 사용하여, 화학식 (1a)를 이용하여 1, 5, 25, 50 및 75 mg/kg PU-H71 (20g 마우스에 대한 0.02, 0.1, 0.5, 1 및 1.5mg)의 투약량에 대한 투여 후(p.a.) 0 내지 160시간에서 종양에 있어서 시간-의존적 PU-H71 농도를 계산하였다(도 31a, 낮은 패널). 확립된 암세포에 있어서 PU-H71을 이용한 전임상연구로부터 HSP90 억제제의 몇몇의 정립된 유방암 세포의 72시간-노출은 세포의 종류100에 의존하는, 0.05 내지 0.25μM의 반-저해 농도 (IC50)의 기록으로 세포 성장 저해를 이끈다는 것이 알려진다. 따라서, 각각의 앞선 투약량 레벨에서, 단일 투약량은 72시간 p.a.를 통한 종양에 있어서 치료학적으로 효과적인 농도를 획득하기 위해서 [124I]-PU-H71 PET에 의해서 예상되었다(도 31a, 상부 패널). 5, 25, 50 및 75 mg/kg의 PU-H71의 투약량 및 ~0.14±0.05 %ID/g의 [Atumor] t =24h 값(도 31d)을 위해, 식(1a)는 각각 0.37, 1.83, 3.67 및 5.51μM의 PU-H71의 종양 농도를 생산하고, 이는 LC-MS/MS에 의해서 이러한 종양에서 측정된 농도와 일치한다 (도 31b 및 나타내지 않음). 1mg/kg의 투약량은 48시간 이상에서 0.05μM 보다 적은 종양 농도를 생산하고(도 31a), 아마도 따라서, 이러한 종양모델에 있어서 치료학적으로 효과적인 투약량에 대한 더 낮은 한계를 나타낸다.
[ 124 I]-PU-H71 PET는 종양에 있어서 치료학적으로 효과적인 PUH71 농도의 전 달을 예상한다.
PET는 5 내지 75mg/kg PU-H71의 투여후에 얻어지는 종양 농도를 정확하게 예측했다는 것을 입증하기 위해서, 그리고 이러한 농도들이 생체내에서 치료학적으로 유효했다는 것을 입증하기 위해서, 우리는 이러한 투약량과 관련된 약물학적 효과를 연구하였다(도 31c, 31d). PU-H71의 약학적으로 효과적인 종양농도의 전달을 제안하는 상기의 발견들과 관련하여, MDA-MB-468 종양을 갖고 있는 마우스들에 5 내지 75 mg/kg의 PU-H71 투약량의 투여는 PARP 절단 (PARP cleavage)에 의해서 증거가 되는, Akt 및 Raf-1의 하향조절 및/또는 저해를 이끌었고 세포괴사의 유도를 이끌었다(도 31c, 세포 내). 이러한 약동학적 변화는 조직배양에서 관찰되는 것과 유사하고, 여기서 0.1μM 이상 PU-H71의 농도로 24시간 동안 MDA-MB-468 세포의 노출은 HSP90-의존적 발암-단백질(onco-proteins)(예를 들어, Raf-1, Akt)(참고 100 및 도 31d, 세포 내)의 투약량-의존적 고갈에 의해서 증명되는 것과 같은 HSP90을 저해하는 결과를 초래하였다. 발암-클라이언트 단백질 분해(onco-client protein degradation) (EC50 Raf -1 = 0.13±0.02μM 및 EC50 Akt = 0.15±0.02μM; 도 31d)의 결과를 초래하는, 세포 내에서 결정된 저해 농도는 종양에서 [124I]-PU-H71 PET에 의해서 결정되는 것과 유사하고, 측정된 약동학적 효과 (EC50 Raf -1 = 0.24±0.03μM 및 EC50 Akt = 0.09±0.08μM; 도 31c)의 결과를 초래한다.
종합적으로, LC-MS/MS 측정 및 웨스턴 블롯 약동학 분석에 의해서 증명되는 일치하는 PET-예상 종양 농도는 약학적으로 효과가 있는 종양 농도를 획득하는데 필요한 이러한 HSP90 억제제의 투여된 투약량의 선택을 알려주기 위한 [124I]-PU-H71 PET 어세이의 능력 및 정확성을 증명한다.
추적자-투약량 [ 124 I]-PU-H71은 정확하게 종양에 있어서 최대 표적 포화까지, 투약 범위에 걸쳐서 PU-H71 종양 농도를 예상한다.
추적자의 약동학, [124I]-PU-H71의 마이크로투약량은 거시적 치료량에 관한 것과 관련이 없을 수도 있다. 높은 PU-H71 투약량에서, 종양에서 HSP90 표적 포화 구별되는 혈장 단백질 결합 프로파일 또는, 간 대사 효소의 잠재적 저해로 인한 약물 대사에 있어서의 변화와 같은 요소들은 약제의 약동학을 변화시킬 수 있다.
우리는 따라서 잠재적으로 포화된 투약량에서, LC-MS/MS에 의해서 실험적으로 결정되는 것들과 PU-H71 농도의 PET-기반 예측이 상관되는지 여부를 검사하였다(도 31b). 75mg/kg PU-H71의 MDA-MB-468 종양으로의 투여는 종양 퇴행 및 치료의 결과를 초래하였고, 따라서 이러한 치유력이 있는 투약량에서 종양 HSP90 표적의 포화 또는 적어도 표적분자의 치료학적으로 중요한 수의 차지가 아마도 얻어진다. [124I]-PU-H71 PET 연구 또는 [131I]-PU-H71 생물 분포 연구로부터 유도되는 종양 농도에 근거하여, 종양을 갖고 있는 마우스들에게 75 mg/kg억제제의 투여는 각각 투여후 24, 48, 72, 96 및 120시간에서 5.51±1.78, 3.50±0.27, 2.18±1.78, 1.29±0.29 및 0.69±0.25μM의 종양 농도를 생산하였다(도 31b). 이러한 값은 LC-MS/MS에 의해서 측정된 사실상 PU-H71 종양 농도와 잘 일치하고, 이것은 최대한 효과적인 표적 저해결과를 초래하는 것까지의 복용량 범위에 걸친 PET 어세이 예측의 신뢰성을 증명한다(도 31c).
HSP90 치료를 위한 환자 선택에 있어서 [ 124 I]-PU-H71의 사용
PU-H71의 생물분포를 감시 및 PU-H71의 종양 약동학을 보고하기 위한 치료학적으로 실행가능한 PET-기반 접근을 제공하는 것에 더하여, 이전의 분석들은 환자가 PU-H71 또는 다른 HSP90 치료에 대한 호의적인 또는 비호의적인 치료학적 반응을 갖는지를 분별할수 있는 환자 스크리닝 접근법을 제안한다.
구체적으로, [124I]-PU-H71의 최소 섭취 및/또는 빠른 제거를 증명하는 종양은 PU-H71 또는 다른 HSP90 억제제에 접근하기 어려울 수 있다. 대안적으로, 이러한 발견들은 또한 생존을 위해서 종양은 HSP90에 의존하지 않는다는 것을 나타낼 수 있고, 따라서 HSP90 치료는 적당하지 않을 수 있다93 ,97. 반대로, [124I]-PU-H71의 고 섭취 및 오랜 지속성(예를 들어, 이후 시간 점에서 고 종양 대 혈액 비율에 대응, 도 30)을 갖는 종양은 HSP90 억제제에 의해서 표적화하는데 더욱 민감할 것으로 예상할 수 있다. [124I]-PU-H71 PET에 의해서 예상되는 것과 같이, 효과적인 종양 농도를 획득하기 위해서 요구되는 치료학적 복용량이 독성을 저해하는 결과(예를 들어, 상기 효과적인 복용량은 최대 용인 복용량보다 더 높을 수 있다)를 나타낸다면, 환자 선택은 추가적으로 가이드할 수 있다.
연장된 시간 기간에 걸쳐서 효과적인 농도에서 HSP90 억제제를 유지하고, 그리고 비-독성 억제제 투약량에서 이러한 농도를 획득하는 종양능력은 [124I]-PU-H71 PET에 의해서 신뢰성 있게 측정될 수 있는 HSP90 치료 기회에 대한 두 가지 중요한 기준이다.
PET에 의한 PU-H71 종양 농도 어세이를 위한, 치료학적-투약량 PU-H71와 공 동-주입된 마이크로투약량 [124I]-PU-H71의 사용
[124I]-PU-H71 PET는 효과적인 종양 농도의 결과를 초래하는데 필요한 HSP90 억제제의 투약량을 잘 추정하는 한편, 우리는 PU-H71의 치료학적 양(5mg/kg 에서 75mg/kg 또는 5,000ng/g 에서 75,000ng/g)과 공동 투여된 추적자 양(~6.5ng/g)의 [124I]-PU-H71는 종양에 본질적으로 전달되는 PU-H71의 양을 신뢰할 수 있게 어세이 할 수 있는지를 시험하였다 (도 31b, [124I]-PU-H71 및 PU-H71의 공동-주사에 따른 PET). 약물 활성의 조직에 있어서 약물 노출을 측정하기 위한 능력은 잠재적인 반응을 예측하기 위한 중요한 정보를 제공할 수 있었다(예를 들어, 종양에 얼머의 농도로 전달되었는지 그리고 표지된 약동학 반응에 충분한지 아닌지). 치료 시간에 걸친 연속적인 측정은 또한 종양 생물학 및, 따라서 민감성이 변화되었는지의 표시자로 사용될 수 있다(예를들어, 종양으로 전달된 농도가 감소하는 것은 HSP90 억제제에 대한 저항력의 잠재적인 발달을 나타낼 수 있다).
방사성추적자 [124I]-PU-H71 및 비-방사성 PU-H71은 ~1:10,000의 비율로 주사되기 때문에, 우리는 후자는 종양에 있어서 유일한 중요한 약물의 형태라는 것을 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, PU-H71 (PU-H71dose in mg)과 [124I]-PU-H71의 추적자 양의 공동-투여량의 경우, 종양물공간(tumor water space)에 있어서 약물의 농도(다시 평균물공간, W = 0.8 mL/g 및 MW 512를 이용)는:
Figure 112017033467195-pat00040
이다.
5, 25, 50 및 75 mg/kg (20g 마우스에 대한 0.1, 0.5, 1 및 1.5mg)의 PU-H71의 투약량에 대한 식(3)을 풀면, HSP90 억제제의 사실상 종양농도를 생산한다(도 31b, 오직 75mg/kg에 대해서만 나타낸다). 이러한 값은 [124I]-PU-H71 PET 및 [131I]-PU-H71 추적자 생물분포에 의해서 추정되고 LC-MS/MS에 의해 확인된 PU-H71 종양 농도와 잘 관련되어 있다(도 31b 및 나타내지 않음).
종합적으로, 이러한 데이터는 마이크로투약량 [124I]-PU-H71 PET 어세이는 구체적인 종양 농도를 야기하는데 필요한 PU-H71의 투약량 및 종양에 전달되는 치료학적 PU-H71의 사실상의 농도 둘 모두를 생산할 수 있음을 보여준다.
HSP90 약물에 의한 종양 표적 포화를 전달하는 투약량인, 최대 종양 투약량 어세이를 위한 [124I]-PU-H71의 사용
공동-주사된 [124I]-PU-H71 및 PU-H71의 [124I]-PU-H71 PET는 잠재적으로 HSP90 억제제에 의한 종양 HSP90 표적의 차지율을 잠재적으로 측정할 수 있다. 예를 들어, HSP90 억제제의 주어진 치료학적 투약은 완전하게 또는 상당하게 [124I]-PU-H71의 종양 흡수를 억압한다는 PET에 의한 증명은, 치료학적 투약은 종양 HSP90 표적을 포화시키고, 그리고 투여된 투약량은 단일 약물의 투약량이 전달할 수 있는 '최대 종양 투약량'을 전달한다는 것을 나타낼 수 있다. 이러한 표적-포화 투약량은 또한 약물의 최대한으로 효과있는 단일 투약량으로서 언급될 수 있다.
이러한 가능성을 실험해보기 위해서, 우리는 PU-H71의 치료학적 투약량(5 내지 75mg/kg 또는 5,000 내지 75,000ng/g), PU-H71dose와 동시 투여된 [124I]-PU-H71의 추적자 투약량(~6.5ng/g)을 위한, 종양 그람 당 PU-H71에 의해서 차지되는 종양 HSP90부위의 수를 측정하였다(HSP90 부위/g 종양). 이것을 하기 식을 이용하여 얻었다.
Figure 112017033467195-pat00041
5, 25, 50 및 75 mg/kg (각각 5,000, 25,000, 50,000, 및 75,000ng/g)의 PUH71의 비-방사성 투약량(PU-H71dose)의 동시-투여된 복용량에 대한 식(4)을 풀면 종양 그람당 PU-H71 분자(nmol)의 개수를 생산한다. 리간드 한 분자는 하나의 HSP90 분자97 ,109의 포켓을 차지하고 결합하기 때문에, 식(4)는 또한 PU-H71/g 종양에 의해서 차지되는 종양 HSP90 부위의 개수를 생산한다(도 31e).
투여 후 24시간에 결합 커브의 분석은 이용 가능한 HSP90부분의 차지는 75mg/kg의 PU-H71dose에서 거의 포화된다는 것을 제안하며 이때 종양 1 그람은 960x1011 HSP90 분자에 상응하는 최대 HSP90 160.7x10-3 nmols을 포함한다. 이러한 값을 사용하여, 우리는 PU-H71의 다양한 투약량에 의해서 차지되는 종양 HSP90 부위의 퍼센트를 그 다음에 계산하였고 5, 25, 50 및 75mg/kg PU-H71의 투여는 각각 이용 가능한 HSP90 종양 부위의 12.1, 57.7, 88.7 및 92.7%가 저해제에 의해 차지되도록 하는 것을 확정하였다(도 31f). 75mg/kg의 PU-H71의 단일 치료학적 투약량에 의해서 얻어지는 종양 섭취의 거의-완전한 포화에서, 상기 투약량은 이용 가능한 종양 HSP90 부위의 대부분을 차지하고 따라서 추가적으로 투약량 증가는 종양에서 국소화되는 약물의 양을 향상시킬 것으로 기대되지 않았다. 그러나 전신 약물 노출 및 잠재적 환자의 독성을 증가시킬 것이다.
요약하면, 여기에서 [124I]-PU-H71 PET에 의해서 증명되는 것과 같은, '최대 종양 투약량'의 분석은 시험적 디자인에 있어서, '최대 용인 투약량' 보다 더 가치 있는 정보를 제공한다. 구체적으로 이것은 투여된 단일 투약량과 관련된 독성을 최소화하는 반면에 최고로 가능한 항-종양 효과를 이끄는 투여되는 단일 투약량을 위한 최대 종양(전신이 아닌) 노출의 결과를 초래하는 투약량을 나타낼 것이다. 게다가, 이것은 치료학적 투약 빈도의 선택을 위한 새로운 접근을 제안한다. 여기에서 일단 최대 종양 투약량은 확인되면, 치료학적 투약빈도는 (전형적인 최대 용인량, MTD라기 보다는) 최대 허용 빈도의 마지막점까지 증가될 수 있고, 따라서 일시적으로 종양 노출을 최대화시킬 수 있다.
HSP90 치료를 위한 효과적인 투약 스케쥴 요법계획을 위한 [ 124 I]-PU-H71 PET 의 사용
앞선 결과는 [124I]-PU-H71 PET는 단일 PU-H71 투여 후에 선택된 시간-기간에 걸친 구체적 종양 농도를 성취 및 유지하기 위해서 필요한 투약량을 예측하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 증명한다. 종양은 PU-H71의 계속되는 보유를 증명하기 때문에, 충분한 빈도로 PU-H71의 반복되는 투여는 잠재적으로 각각의 연속되는 투약량에서, 더 높은 PU-H71 종양 농도 축적의 결과를 초래한다. 사용되는 투약량 및 스케쥴에 있어서 특이적인, 정상-상태 종양 PU-H71 농도가 결국 획득될 수 있다. 따라서, 정상-상태 형장 농도를 얻기 위한 투약을 안내함에 있어서 혈장 약동학의 사용과 유사하게 PUH71 투약을 디자인을 안내하는데 있어서 종양 약동학의 [124I]-PU-H71 PET 영상에 대한 잠재적인 역할을 상기 데이터는 제안한다.
이것을 연구하기 위해서, 우리는 주말은 제외하고 주 당 3회 투여 스케쥴 (3x주; 월요일/수요일/금요일)로 5, 25, 50 및 75 mg/kg PU-H71의 투여시 얻어지는 PU-H71의 종양 농도를 측정하였다(도 32a). 상기와 같은 스케쥴 및 지시한 투약량으로 투여시 PU-H71의 종양 농도를 결정하기 위해서 모의실험을 수행하였다(도 32a). 상기 스케쥴 및 이러한 투약량의 결과인 종양 AUC, 및 PU-H71의 평균 및 최소종양 농도(각각 [PU-H71]avg 및 [PUH71]min)는 또한 결정되었다(도 32a, 삽도). 종양에 있어서 예상되는 PU-H71 농도는 각각 5 내지 75mg/kg 투여된 투약량에 대한, [PU-H71]min = 0.17 에서 2.54μM 및 [PU-H71]avg = 0.49 에서 7.45μM의 범위를 나타내었다(도 32a 삽도를 보라).
언급한 바와 같이, 낮은 PU-H71 농도(0.05 에서 1μM)에의 MDA-MB-468 유방암 세포의 세포 내(in vitro) 노출은 60 내지 100nM100의 보고된 IC50을 갖는 강한 세포 성장 억제 결과를 나타낸다. 더 높은 PU-H71 농도 (>2μM), 그리고 이러한 암 세포가 48시간 동안 약물에 노출될 시, 세포괴사에 의한 암 세포 대량사멸이 나타났다(예를 들어, 세포괴사를 겪는 세포 >70%)(도 32b). 이러한 세포 내 분석의 관점에서, 3x주 스케쥴에서, 5 내지 75mg/kg PU-H71의 투약량의 투여는, 주로 종양 저해 효과로 예상되는 값에서 강한 종양 세포괴사(75mg/kg)까지의 치료학적으로 효과적인 종양 약물 농도의 결과를 나타낼 것이다(도 32b). 진정으로, MDA-MB-468 이종 이식 종양을 갖고 있는 마우스들을 상기에서 언급한 바와 같은 PU-H71로 처리시, 투약량-의존 반응은 PU-H71-처리된 종양에서 관찰되었다(도 32c). 7-주 처리기간 후에, 상당한 종양 반응이 각각, 5, 25 및 50 mg/kg 투약량에서 관찰되는 63, 82 및 99% 종양 성장 저해(TGI)으로, 그리고 75mg/kg 투약량에서 100% 퇴행으로 나타났다(도 32c).
우리는 대조군의 종양이 동물 보호 기관 및 사용 단체(IUCAC)에서 허용되는 최대크기가 될때까지 처리하였고(도 32d), 목요일에 마우스들을 희생시켰다(투약량 투여한 마지막 수요일 24시간 후). 오직 5 mg/kg 군의 동물만이 웨스턴 블롯 및 LC-MS/MS (종양 부피: 139±66mm3)에 의한 분석을 위해서 충분히 큰 종양을 보유하였으며(종양 부피: 1126±396mm3)(도 32d), 비히클 만으로 처리된 것들(종양 부피: 1126±396mm3) 보다 상당히 작았다.
5 mg/kg의 PU-H71의 투여된 투약량에 대해 식(1a)를 풀고 종양에서 [124I]-PU-H71에 대한 측정된 시간-활성 데이터를 사용하면(도 30d) 처리기간에 걸쳐서 PU-H71 종양 농도를 생산한다. 우리의 모의실험은 희생 시간에서의 PU-H71의 종양 농도는 0.43μM이어야 한다는 것을 제안하고(도 32e), 이것은 LC-MS/MS에 의해서 이러한 종양에서 결정되는 사실상의 0.52±0.13μM 농도와 상당히 유사하다(도 32f, 32g). 더 나아가서, 상기 관찰되는 약동학적 효과, 즉 상당한 Akt 분해(57% 감소; P=0.0017; 도 32f 및 도 32g, 왼쪽 패널) 및 PARP 절단 (PARP cleavage) (도 32f)에서 증명되는 HSP90 저해는 이 시간에 있어서 종양에서 치료학적으로 효과적인 PU-H71 농도와 일치한다(도 32g, 오른쪽 패널). 이러한 발견은 PU-H71의 종양 섭취는 처리 12주 동안 변화되지 않는다는 것을 나타내고, 이는 PU-H71에 대한 이들 종양의 지속되는 민감성과 일치하며, [124I]-PUH71 PET가 지속되는 반응 또는 정반대로, HSP90 치료에 대한 획득 저항 가능성을 감시하기 위해서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
HSP90 치료를 위한 효과적인 스케쥴 요법을 디자인하기 위한 [ 124 I]-PU-H71 PET의 사용
종양에 의한 PU-H71의 연장된 보유를 고려하여, 우리는 약제의 적은 빈도의 투여는 이의 유효성을 지속할 수 있는지 아닌지 여부를 질문하였다. 임상적 환경에서, 이것은 독성을 경험한 환자에게 더 낮은 투약량으로 치료를 계속하기 위한 또는 투약량 스케쥴 디자인에 있어서 합리적으로 균형 잡힌 투약량 및 투약량 빈도를 결정하는데 유용할 수 있다.
모의실험은 주 당 3-(월-수-금), 2-(월 및 금) 또는 1-(월) 투여의 스케쥴에 의거하여 75 mg/kg으로 투여된 PU-H71에 대해서 수행하였다(도 33a). 이러한 계산은, 덜 빈번한 투여 스케쥴이 종양에 여전히 치료학적으로 유효한 농도를 전달해야 한다는 것을 나타낸다(도 33b). 종양이 각각 3x주, 2x주 및 1x주 스케쥴로 7.45, 5.41 및 2.88μM의 [PU-H71tumor]avg에 노출(도33a)될 것을 제안하고, 이는 실제로, 상당한 종양 성장 저해가 1x주 스케쥴에서 얻어졌고, 반면에 2x주 투여는 치료 5주의 기간에 걸쳐서 종양 퇴보를 이끌었다(도 33c). 평가할 수 있는 종양(즉, 대조군 및 5 mg/kg 치료 팔)에 있어서, 약동학적 마커에 있어서 변화를 마지막 투여량 이후에 24 및 96 시간에 마우스를 희생시키면서 분석하였다.
발암-단백질(onco-proteins)의 상당한 그리고 거의 전체 고갈(95% 레벨 감소, 24시간 및 96시간에서 각각 P=0.0021 및 P=0.0025)은 두 시점 모두에서 관찰되었고(도 33d), 이를 표적 포화 PU-H71 농도(>2μM)가 이를 시점에서 종양에 존재해야 한다는 것을 제시한다. 이러한 종양에서, 상기 PU-H71의 PET-예상된 종양 농도는 각각, 24시간 및 96시간에서 5.51μM 및 2.18μM이고(도 33a, 1x주 패널), 이것은 LC-MS/MS에 의해서 각각 측정된 5.53±0.26 및 3.09±1.40의 실제 종양 농도에 거의 일치한다(도 33e).
상기에 기재된 방법론은 인간 환자에게 매우 적용 가능하다. 하나의 실시예는 도 34 및 도 35에 기재되어 있다. 도 34는 폐 및 근접한 림프절에 전이되는 반복되는 췌장 암을 갖는 환자의 [124I]-PU-H71 PET/CT를 나타낸다. 수차례의 [124I]-PU-H71 접종 후 (4, 24, 48 및 192시간)에 PET 영상을 정량화 하였고 [124I]-PU-H71로부터 얻어진 SUV 데이터를 20mg/m2의 PU-H71의 투여용량에 대한 농도로 전환하였다. 이러한 종양은 심지어 192시간(투여 후 8일)으로 유지 및 가시화하는 [124I]-PU-H71의 매우 우수한 섭취를 나타낸다. 상기 [124I]-PU-H71 PET/CT는 이 환자가 HSP90 치료에 반응할 것 같다고 예상한다. 192시간(8 일)을 넘는 동안 종양에서 PU-H71의 유지는 마우스 실험에 의해서는 예상되지 않았는데, 도 30에서 언급한, 124I-PU-H71는 MDA-MB-468 종양으로부터 소거되었다. 또한, 0 내지 192시간 다양한 시점에서 PU-H71 농도의 계산은 또한 곡선 하 종양 면적(AUC, area under the curve)의 계산을 가능케 한다. 도 34에서, 다양한 폐 결절 및 림프절(LN)에 대한 곡선하의 면적은 0 내지 192 시간사이에 계산된다.
PU-PET에 의해서 결정되는 바와같은, PU-H71에 대한 이러한 종양의 노출은 이러한 환자의 치료를 위한 최적의 투약량 및 스케쥴의 결정을 가능케 한다. 구체적으로, 두 개의 특징적 종양의 PU-H71에 노출은 주 2회 (화요일 및 금요일) 스케쥴로 20mg/m2의 투약량으로 투여시 2주 치료 요법의 기간에 걸쳐서 좌측 폐에 하나 그리고 오른쪽 폐문(helium) LN에 다른 하나가 계산되었고, 곡선 하 면적 (AUC) 및 평균 종양 농도(도 35, 상위 패널)로서 나타내었다. 상기 종양은 각각 190 및 499μM-h의 AUC 값과, 각각 0.71 및 1.57 μM의 Hsp90 억제제의 평균 종양 농도를 갖는 우수한 약물 노출을 나타낸다. 췌장암의 전임상 모델에서 이러한 농도로 췌장암 세포의 성장을 저해하고, 전이 가능성을 감소시키며, 세포자멸을 유도하는데 효과적이었으며, 이는 2x주 스케쥴(목요일-금요일)에서 주어진 20mg/m2의 투약량이 환자에게 유익할 수 있음을 제안한다.
도 35(아래 패널, 주 2회(목요일 및 금요일) 스케쥴에 따라 40 mg/m2 및 80mg/m2 복용량으로 유사 모의실험을 수행하였다. PU-PET 예상 당 가장 최적치는 2주 스케쥴(목요일 및 금요일)로 주어진 80mg/m2의 투약량이고, 이 경우에 0-336일에 걸친 종양 노출 및 평균 종양 농도는 각각 760 이상과 1998uM-h, 및 2.8과 6.3 uM (도 35, 아래 패널)에 도달하였다. 이러한 값은 상당한 퇴행 및 치료의 결과를 나타내는 것으로 전임상 연구에 의해서 예측된다(도 32 및 33).
도 36은 폐로 전이되는 질병을 갖는 HER2+유방암 환자에 대한 유사한 계산을 나타낸다. 상부 패널은 [124I]-PU-H71을 이용한 PET 어세이의 결과를 나타낸다. 중간 및 아래 패널은 10 mg/m2의 투여된 PU-H71 투약량을 기준으로 다양한 시간에서, PU-H71의 종양 농도를 나타낸다. 상기 약동학 데이터는 0 또는 336시간 사이에 종양에서 PU-H71의 AUC 및 상기 기간에 걸쳐서 종양에서 약물의 평균 농도와 관련하여 보고된다. PU-PET 데이터는 이주일 동안에 주2회씩 주어질 때, 10mg/m2의 투약량은 103μM-h의 종양 AUC0 -336h을 전달하고, 0.59μM의 평균 종양 농도를 유지하며, 따라서 이러한 스케쥴상에서, 80-100mg/m2의 투약량 및 이를 넘어서는 투약량이 바람직한 반응을 위해서 요구될 수 있음을 예시한다. 이주일 동안에 주 1회씩 주어질 때, 10mg/m2의 투약량은 오직 54μM-h의 종양 AUC0 -336h을 전달하고, 0.41μM의 평균 종양 농도를 유지하며, 따라서 이러한 스케쥴상에서, 200mg/m2의 투약량 및 이를 넘어서는 투약량이 바람직한 반응을 위해서 요구될 수 있다. 이주일 동안에 주5회씩 주어질 때(주말을 제외하고 매일), 10mg/m2의 투약량은 189.8μM-h의 종양 AUC0 -336h을 전달하고, 0.81μM 의 평균 종양 농도를 유지하며, 따라서 이러한 스케쥴상에서, 50mg/m2의 투약량 및 이를 넘어서는 투약량이 바람직한 반응을 위해서 요구될 수 있다.
결론적으로, 이러한 결과는 HSP90 치료의 개인 맞춤형 임상을 위해서 효과적인 투약 및 투약-스케쥴 요법을 디자인하는 데 있어서 정보를 제공하는데 [124I]-PU-H71 PET의 유용성을 증명한다
[ 124 I]-PU-H71 PET에 의해서 결정된 바와 같은, PU-H71에의 종양 노출은 HSP90 치료에 대한 항-종양 반응을 신뢰할 수 있게 예상한다.
치료결과를 얻기 위해 처리시간에 걸쳐서 저해를 요구하는 표적 부위의 수를 이해하는 것은 표적화된 치료에 있어서 주요한 도전으로 남아있다. 이에 본 발명자들은, 상기에서 조사된 몇몇의 투약량 및 요법 스케쥴에 대하여, 처리 기간에 걸친 억제제에 의한 HSP90 부위의 점유를 모의 실험 하였다(도 37a). 그리고 나서 본 발명자들은 관찰된 항-종양 반응으로 종양 HSP90 점유의 상관관계 분석 수행을 시도하였다(도 37b).
PU-H71이 치료학적 투약량으로 투여될 시(마우스 당 5 내지 75mg/kg 또는 5,000 내지 75,000ng/g) 종양의 그람 당 PU-H71에 의해서 점유되는 종양 HSP90 부위의 개수(HSP90 sites/g)는 방정식 (4)를 이용하여 얻을 수 있다. 1 그람 MDA-MB-468 종양은 최대 160.7x10-3 nmols의 HSP90을 포함하기 때문에(도 31d, BMAX), 그리고 상기 부위의 100% 초과의 점유는 가능하지 않다고 하면, 각각의 투약량 및 요법 스케쥴에 대해 본 발명자들은 처리 시간에 걸쳐서 HSP90 부위의 점유를 모의실험할 수 있다(도 37a).
점유된 평균 %HSP90 부위로 측정되고 처리 시간에 걸친 PU-H71((% 점유된 HSP90 부위)avg)로 인식되는(도 37b), 표적 점유는, 처리의 시간에 걸쳐서 기록된 PU-H71의 평균 종양 농도([PU-H71]tumor avg; 도 37c), 그리고 종양 AUC에 의해서 계산되는 것과 같은 처리의 시간에 걸친 종양 노출로서 관찰된 항-종양 효과의 크기(각각 r2=0.7559,0.8162 및 0.8188)와 상당히 잘 관련되어 있었다. 본 발명의 분석은 처리 시간에 걸쳐서 평균화되는 종양 HSP90 부위의 80% 이상의 점유(도 37b), 또는 5μM의 HSP90 억제제의 평균 종양 농도의 유지(eh 37c)가, MDA-MB-468 종양 퇴행 및 치료를 위해서 필요함을 제안한다. 그러나, 평균 및 그 이상 점유되는 부위에 의해서 얻어지는 바와같이 또는 처리 시간에 걸쳐서 0.5μM 및 그 이상의 평균 종양 농도 유지에 의해서 달성되는 바와 같이, 더 낮은 점유가 여전히 부분적 반응을 이끌 수 있다(도 37b, 37c)
논의
이전의 분석에 기반하여, 본 발명은 HSP90 억제제의 임상적 개발에 있어 잠재적 용도를 갖는 첫번째 비-침습적 PET-기반 어세이를 고안하고 개발하였다. 본 발명은 모약의 약동학(pharmacokinetics) 및 약력학(pharmacodynamics)을 결정하며, 효과적인 종양 농도를 달성하는데 필요한 HSP90 억제제의 투약량을 결정하고, 종양에 전달되는 약물의 실제 농도를 분석하며, 최대 용인 투약량(MTD)이 아닌 표적 조절 효율에 기반한 효과적인 복용량 및 스케쥴 요법을 디자인하는데 있어서, 이의 사용을 증명하였다. 본 발명은 또한 HSP90-타겟팅에 대해 종양 반응을 가장 잘 가질 것 같은 환자의 선택에 있어서 이의 사용을 증명하였다.
다른 전임상 또는 임상 연구에서 N-[11C]-메틸 이마티닙122, 3-N-메틸 및 4-카르보닐-[11C]-테모졸로미드123, N-[2-(다이메틸아미노)에틸]아크리딘-4-카르복스아미드([11C]DACA)124, [18F]5-FU124, 다사티닙의 [18F]플루오린 유도체 및 [13N]시스플라틴126과 같은 탄소 11-, 플루오린 18- 및 질소 13-표지된 약물이, 스캔하는 동안 전체 샘플링 시간 보다 상당히 더 짧은 반감기를 갖는 제제에 대해 PET 약동학적 파라미터에 의해서 측정하는데 유용하다는 것을 보여주었다. 종양 반-감기(i.e.>24h)가 동위원소(즉, 각각 11C, 13N 및 18F에 대해서 10분, 20분 및 110분)에 의해서 허용되는 샘플링 기간보다 더 긴 HSP90 억제제에 대해서는, 상기 동위원소를 사용한 PET 약동학 측정은 부적당하다. 124I의 상대적으로 긴 반-감기 때문에, [124I]-PU-H71 PET 분석은 따라서 HSP90 억제제의 종양 약동학을 비-침습적으로 그리고 정량적으로 감시할 수 있는 첫번째 보고된 어세이이다(도 38).
더 나아가, [124I]-PU-H71 PET 어세이는 의학영상127 -131을 위한 방사성 표지화된 생물학적으로-비활성인 미량의 표적화된 치료제를 사용하는 표적화된 치료를 위한 표적화된 영상 개념의 진정한 구체화이다. 개인 맞춤형 의약을 향한 길을 제공하는, 상기 개념은 잘 인정되고 약물 발전의 미래를 위해 매우 지지되는 반면에, 이의 약물 작용에 가장 잘 반응하는 환자를 선택하고 이의 투여 투약량의 스케쥴에 대해 권고하기 위한 영상약물로서, 소-분자 치료제 종양학으로 사용한 선례는 없다.
PU-H71의 고유 구조에서, 아이오딘의 존재 및 따라서 방사성 요오드 라벨의 도입에 의한 이의 구조 및 생물학적 행동의 임의의 동요의 부재 때문에, [124I]-PU-H71 PET 어세이는 이러한 최초의 어세이 중 하나의 지식이다. 구체적으로, [124I]-PU-H71의 관찰된 생물분포 프로파일, 즉 비-종양 조직으로부터의 신속한 소거를 갖는 종양 보유는 치료제 PU-H71의 것을 반영한다. 게다가, 약물 대사산물의 형성은 PET41를 위한 표지된 약물의 적용을 제한하는 반면에, 본 발명의 데이터는 [124I]-PU-H71 PET 어세이가 마이크로투약량 및 치료학적-투약량 수준에서 종양 PU-H71 농도를 정확하게 측정한다는 것을 증명하였고, 이는 PU-H71 대사체가 PET-측정된 종양 활성에 유의미하게 기여하지 않는다는 것을 나타내는 것이다. 종합적으로, 이러한 발견은 [124I]-PU-H71이 PU-H71의 생체 내 '추적자'로서 사용을 위한 잘-적합화된 것임을 제안한다.
표적화된 암치료의 개발에 있어서, 임상 시험이 효과적인 종양 농도가 얻어지는지 그리고 표적이 적절하게 조절되는지에 대한 지식을 요구한다는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명 데이터는 [124I]-PUH71 PET 어세이가 주사된 투약량 또는 혈장 약동학과 관련된 통상적인 종양 반응 상관관계 보다 더 많은 정보를 제공하는 종양 투약량-종양 반응 상관관계를 가능케하는 종양 HSP90 억제제 약동학을 정량적으로 측정한다는 것을 증명한다. 본 발명의 데이터는 또한 PU-H71의 경우, 종양 약동학이 종양 약동력학을 반영하며 양쪽 파라미터의 비-침습적 측정으로서 [124I]-PU-H71 PET를 확인하였음을 증명한다. 따라서, 종양 약동학은, 또한 표적 점유의 표시로서, HSP90 억제제 치료 요법에 대한 즉시(즉, 하나의 투약량 억제제에 따른 표적 조절) 및 장기(즉, 디자인된 스케쥴에 걸친 표적 조절) 반응 모두를 이해하는데 있어서 예측 능력을 갖는다. 게다가, HSP90 치료를 고려하는 개별 환자에서 [124I]-PU-H71 종양 약동학을 측정함으로써, HSP90 치료로부터 가장 이득을 받을 수 있는 환자를 확인할 수 있고 따라서 [124I]-PU-H71의 종양 섭취 및 소거에 근거하여 치료학적 투약량 및 스케쥴을 조절할 수 있다(도 38a).
본 발명은 또한 어세이가 HSP90 치료의 과정에 대한 항-종양 효과 및 결과를 예상하는 위한 잠재력을 갖는, HSP90 억제제 치료학적 투약량에 의한 종양 HSP90 표적 및 이의 포화 범위의 영상 바이오마커로서, PET-유도된 종양 HSP90 약동학에 근거하여 개인 맞춤형 개인 요법의 개발을 인도할 수 있다는 것을 나타낸다(도 38b). 이러한 특징 때문에, [124I]-PU-H71 PET 어세이는 HSP90 치료에 대한 종양 반응을 이해하고(도 38a), 잠재적으로는, 이를 예상하기 위한(도 38b) 약동학적 도구로서 HSP90 억제제 임상 연구에서 사용하기에 최적이다.
[124I]-PU-H71 데이터는 또한 통상적인 최대 용인 투약량(MTD)이 아닌 PET-유도된 최대한으로 효과적인 종양 농도에 기반하여 HSP90-표적화된 치료에 있어서 더욱 합리적이고 효과적인 투약 전략을 제공한다. 이러한 접근은 PET에 의해서 가시화되는 바와 같이, 종양 표적이 약물에 의해서 거의 포화되는 최적 약물 레벨로서, 최대 종양 투약량 획득의 새로운 투약 목적을 달성하는 것을 목표로 한다(도 38c). 이러한 접근은 항-종양 효과가 아닌 단지 환자 독성을 증가시 추가적인 투약량의 증가를 피하도록 한다. 만약 종양 포화가 최대 용인 투약량(MTD)보다 더 적은 치료학적 투약량으로 관찰된다면(예를들어, 투약량-증가 시험에 의해 결정되는 바와 같이), 투약량 전략은 PET에 의해서 결정되는 것과 같은 최대한으로 효과적인 종양 농도 포화에서 투약량의 최대 용인 빈도를 발견하는 것을 추구할 수 있다. [124I]-PU-H71 PET는 추가적으로 투약량 빈도의 선택에 대한 정보를 제공하기 위해서 최대한으로 효과적인 종양 투약량 후에 종양 포화의 기간을 측정할 수 있다. [124I]-PU-H71 PET는 다른 HSP90 억제제의 투약량 및 빈도를 지시하는데 유사하게 사용될 수 있다. [124I]-PU-H71 추적자에 의한 종양-타겟팅을 경쟁적으로 저해하기 위한 HSP90-표적화된 약제의 치료학적 투약량의 능력은 종양 약물 포화의 인덱스를 제공할 수 있다. HSP90 억제제의 임상 개발을 위해서, [124I]-PU-H71 PET는 일반적으로 허용가능한 투약 전략을 유도하기 위해서 임상 제1/2상 시험 집단으로부터 종양 약동학 데이터를 수집하기 위해서 사용될 수 있고, 또는 진정한 '개인 맞춤형' 투약-스케쥴 선택을 위한 개별 환자 기반에 사용될 수 있다. 본 발명은 PU-H71 PET 영상이 이러한 가설을 테스트하기에 잘 적합화된 임상 도구라고 믿는다. 최근에 진행되고 [124I]-PU-H71의 임상 제O상 마이크로투약 시험와 함께, 메모리얼 슬로안-케터링(Memorial Sloan-Kettering) 암 센터에서 PU-H71의 다가오는 임상 제1상 시험에 포함되어 있는 [124I]-PU-H71 PET 어세이와 함께, 이러한 컨셉은 임상 세팅에서 곧 평가될 것이다.
결론적으로, 종양 HSP90의 표적 어세이로서, [124I]-PU-H71 PET는 HSP90-표적화된 치료에 있어서 환자 선택, 투약량 선택, 종양 진단 및 표적 분자의 수준에서 종양 반응의 평가를 극적으로 그리고 합리적으로 전진시킬 수 있다. 따라서, 신규한 [124I]-PU-H71 PET 어세이는 암에서 HSP90 억제제의 합리적 비용-효율적, 그리고 최적의 임상 개발 및 사용을 촉진할 수 있다. [124I]-PU-H71 PET의 사용은 HSP90 억제제의 임상 시험의 디자인에 있어서 주요한 발전을 나타내고 다른 표적화된 치료의 발전을 위한 표적화된 영상 계량약리학의 패러다임을 촉진한다.
5.2.2.2.2. [ 124 I]-PU-DZ13 및 [ 124 I]-PU-HZ151
내인성 요오드를 가지는 다른 HSP90 저해제에 대해 HSP90 PET 분석에서의 그의 수행능을 평가하였다. [124I]-PU-DZ13 및 [124I]-PU-HZ151을 포함한 이러한 종류의 두 화합물을 하기 반응식 16 및 17에서와 같이 합성하였다.
Figure 112017033467195-pat00042
반응식 16: [ 124 I]-PU-DZ13의 합성
Figure 112017033467195-pat00043
반응식 17: [ 124 I]-PU-HZ151의 합성. 시약 및 조건: a. Et3N, (Boc)2O, CH2Cl2, rt; b. Pd(PPh3)4, 헥사메틸디틴, 디옥산, 90℃; c. [124I]-NaI, 클로라민-T, rt, 10 min.; d. TFA, 70℃, 60 min.
이들 화합물의 방사화학적 수율은 36.96±12.97% ([124I]-PU-DZ13), 36.45±15.75% ([124I]-PU-HZ151) 및 45.33±15.76% ([124I]-PU-H71)이었다; 방사화학적 순도 (>98%)를 HPLC로 확인하였다. 비방사능은 633 mCi/μmol ([124I]-DZ13), 576 mCi/μmol ([124I]-HZ151) 및 1000 mCi/μmol ([124I]-PU-H71)이었다.
[124I]-PU-H71 및 [124I]-PU-DZ13의 인비트로 안정성을 평가하기 위해, 화합물을 인간 혈청에서 37℃로 5일간 배양하고, ITLC로 분석하여 탈할로겐화가 일어났는지를 결정하였다. [124I]-PU-H71 및 [124I]-PU-DZ13 모두 5일간 (120 시간) 안정하였다 (> 98%).
종양은 IV 및 IP 양 경로로 투여된 경우 [131I]-PU-DZ13을 보유하나, IV 투여가 통계적 유의성으로 (P < 0.05) (투여 24 시간 후, 복강내 대 정맥내 경로) 종양 체류가 더 높다. C57BL/6J 비종양 마우스에서, [131I]-PU-DZ13은 심장 혈액을 신속히 제거하며 (%ID/g는 2분에 3.33±0.13이고 투여 24 시간 후 0.013±0.00이었다), 위 및 장에서의 흡수가 가장 높았다 (3-8% ID/g). 간 및 비장 흡수는 유의적인 차이가 없었으며 (P < 0.05), 이는 세망내피계 (RES) 관여를 제안한다. 그러나, [131I]-PU-DZ13의 신장 흡수는 비뇨 클리어런스를 암시한다 (%ID/g가 2분에 5.53±0.34 (데이터는 도시되지 않음)에서 투여 24 시간 후 0.06±0.01로 감소하였다). MDA-MB-468 TNBC 마우스 모델에서, [131I]-PU-DZ13은 정맥내 경로에 의해 투여된 경우 복강내 경로에 비해서 종양에 의해 더 길게 보유되었다. IV 투여에 의해, [131I]-PU-DZ13의 종양 흡수 (1시간에 1.47±0.22 %ID/g)는 72 시간에 걸쳐 (0.05±0.00 %ID/g) 서서히 감소되었다 (%ID/g = 0.56±0.14, 4 시간; 0.40±0.03, 12 시간; 0.09±0.03, 24 시간). 비종양 마우스에서, [131I]-PU-DZ13의 위장 및 RES 흡수, 및 신장 클리어런스가 MBA-MD-468에서 확인되었다. 25 mg/kg으로 PU-DZ13과 공투여된 경우 (투여 24 시간 후, 복강내 대 정맥내 경로) [131I]-PU-DZ13의 생체내 생체내 분포는 PU-PET 예측 종양 농도가 LCMS-MS에 의해 측정된 값에 뒤지지 않는 것으로 입증되었다.
생체내 PET 이미징은 [124I]-PU-H71 및 [124I]-PU-DZ13 HSP90 저해제를 갖는 MDA-MB-468 종양을 검출하였다. 도 39는 저해제 ([124I]-PU-H71 또는 [124I]-PU-DZ13)이 전신적으로 주사된 마우스의 주사 후 48 시간에 PET 이미징 결과를 보여준다. 두 방사요오드화 HSP90 저해제는 모두 각 시점에 PET로 종양 검출되었다. [124I]-PU-DZ13이 정성적으로 덜 비특이적인 복부 흡수를 지니는 것으로 나타났지만, 두 저해제의 흡수 %ID/g는 종양 덩어리에서 유의적인 차가 없었다.
[124I]-PU-DZ13 및 [124I]-PU-H71과 달리, [124I]-PU-HZ151은 마우스에서 종양 검출을 할 수 없었는데, 이는 간에 의한 그의 신속한 대사 때문인 것으로 보인다.
5.3. PU-H71로 암 환자 치료
섹션 5.2.1.에 기술된 방법은 [124I]-PU-H71과 같은 방사성표지된 HSP90 저해제를 사용하여 HSP90 저해 요법에 반응할 것 같고 개개인의 환자에 대해 최적의 투여 계획을 설계할 수 있는 환자를 식별할 수 있음을 보여준다. 투여 계획은 저해제의 종양 노출 및 저해제에 의한 HSP90 점유와 같은 인자에 기초한다. 이들 약동학적 파라미터는 본원 개시내용의 방사성표지된 저해제를 사용하여 용이하게 평가된다. 약동학적 데이터는 개개 암 환자의 대형 풀에서 용이하게 얻을 수 있기 때문에, 본원 발명자들은 HSP90 저해제의 과잉투여에 의한 독물학적 문제의 수반없이 특정 HSP90 저해제의 목적하는 효능 수준을 달성하기에 적합한 광범위 약동학적 파라미터를 결정할 능력이 있다.
따라서, 개시내용은 특정 약동학적 프로파일을 달성하기 위해 HSP90 저해제, 특히 PU-H71로 고형 종양, 혈액학적 악성종양, 및 림프종을 가지는 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 개시내용은 또한 저해제를 특정 용량 수준 및/또는 특정 투약 스케줄로 투여하는, HSP90 저해제, 특히 PU-H71로 고형 종양, 혈액학적 악성종양, 및 림프종의 치료 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에 있어서, HSP90 저해제로 치료될 종양은 "HSP90 의존성 종양"이다. 상술한 바와 같이, HSP90 의존성 종양은 생리학상 HSP90을 이용하는 종양이다. HSP90 의존성 종양은 정상적인 하우스키핑 HSP90에 비해 상당량의 "종양 형성 HSP90"을 함유한다. 본 섹션에 기술된 방법은 결장암, 췌장암, 갑상선암, 기저세포암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 방광암, 전립선암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암 및 선암을 포함한 폐암, 모든 아류형의 유방암, 신경아세포종, 위장 기질 종양을 포함한 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함한 뇌종양, 난포 림프종 및 확산성 대 B-세포 림프종을 포함한 림프종, 다른 혈장 세포 장애를 포함한 다발성 골수종, 백혈병, 척수증식성 신생물 및 난소, 자궁경부 및 자궁내막 암을 포함한 부인과 암을 포함하나 이들에만 제한되지 않는 다양한 유형의 암에 적용될 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 개시내용은 약물 투여 후 약 16 시간 내지 약 24 시간의 적어도 한 시점에 환자 종양에서 종양 형성 HSP90의 15% 이상 점유율, 환자 종양에서 종양 형성 HSP90의 30% 이상 점유율, 환자 종양에서 종양 형성 HSP90의 50% 이상 점유율, 또는 환자 종양에서 종양 형성 HSP90의 60% 이상 점유율을 제공하기에 충분한 양의 PU-H71을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 인간 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, PU-H71의 투여는 약물 투여 후 약 16 시간 내지 약 24 시간의 적어도 한 시점에 환자에서 종양 형성 HSP90의 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 점유율을 제공할 수 있다. 특정 일 실시양태에 있어서, PU-H71의 투여는 약물 투여 후 약 24 시간에 환자에서 종양 형성 HSP90의 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 점유율을 제공할 수 있다. 또다른 실시양태에 있어서, PU-H71의 투여는 약물 투여 후 약 16 시간 내지 약 24 시간의 전 범위에서 환자에서 종양 형성 HSP90의 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 점유율을 제공할 수 있다. PU-H71은 약물 투여 후 약 16 시간 내지 약 24 시간의 적어도 한 시점 또는 전 범위에서 상기 언급된 두 값의 어느 것으로 한정되는 종양 형성 HSP90의 점유율, 예를 들면, 약 20% 내지 약 80%의 점유율, 약 30% 내지 약 80%의 점유율, 40% 내지 80%의 점유율, 40% 내지 90%의 점유율, 약 50% 내지 약 80%의 점유율, 약 50% 내지 약 90%의 점유율, 약 60% 내지 약 80%의 점유율, 약 60% 내지 약 99%의 점유율, 약 50% 내지 약 99%의 점유율, 약 50% 내지 약 99.9%의 점유율, 약 70% 내지 약 99.9%의 점유율 등을 제공하도록 투여될 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, PU-H71은 종양 형성 HSP90의 100% 점유율을 달성하기에 최소 투여량으로 투여된다. 섹션 5.2.1.1.에서 논의한 바와 같이, 상기 종양 형성 HSP90 점유율을 제공하기 위해 투여되는 PU-H71은 PU-H71의 효과적인 용량이다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
또 다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 투여 후 24 시간에 약 0.3 μM 내지 약 7.5 μM 범위의 종양 농도를 제공하기에 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, PU-H71의 투여 후 약 24 시간에 종양중 PU-H71 농도는 0.3 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM 또는 7 μM일 수 있다. PU-H71은 약 24 시간 후 상기 언급된 두 값의 어느 것으로 한정되는 약물의 종양 농도, 예를 들면, 약 1 μM 내지 약 3 μM의 종양 농도, 약 1 μM 내지 약 5 μM의 종양 농도, 약 3 μM 내지 약 5 μM의 종양 농도, 약 3 μM 내지 약 7 μM의 종양 농도 등을 제공하도록 투여될 수 있다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
또 다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 투여 후 48 시간에 약 0.05 μM 내지 약 3.5 μM 범위의 종양 농도를 제공하기에 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, PU-H71의 투여 후 약 48 시간에 종양중 PU-H71 농도는 약 0.5 μM, 약 1 μM, 약 1.5 μM, 약 2 μM 또는 약 3 μM일 수 있다. PU-H71은 약 48 시간 후 상기 언급된 두 값의 어느 것으로 한정되는 약물의 종양 농도, 예를 들면, 약 1 μM 내지 약 2 μM의 종양 농도, 약 1 μM 내지 약 3 μM의 종양 농도, 약 0.5 μM 내지 약 2 μM의 종양 농도, 약 0.25 μM 내지 약 2 μM의 종양 농도 등을 제공하도록 투여될 수 있다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
또다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 투여 후 24 시간에 약 0.3 μM 내지 약 7.5 μM 및 투여 후 약 48 시간에 약 0.05 μM 내지 약 3.5 μM 범위의 종양 농도를 제공하기에 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
섹션 5.2.1.1.에서 논의한 바와 같이, 방사성표지 분석은 PU-H71의 종양 노출을 결정하기에 편리한 수단을 제공한다. 종양 노출은 특정 기간에 걸쳐 종양에서의 AUC 및 약물의 평균 종양 농도와 같은 다양한 약동학적 파라미터를 사용하여 측정할 수 있다. 많은 고형 종양을 가지는 환자에게서 모은 풍부한 약동학적 데이터에 기반해, 본 발명자들은 특정 처리 기간 (예를 들면, 2주)에 걸쳐 AUC 및 평균 종양 농도를 측정하여 약물의 효능 및 독성과 관련한 중요한 정보를 제공하였다. 상술한 바와 같이, 용어 "종양 AUC"란 약물 투여로부터 다른 시점까지의 시간에 걸쳐 축적된 세포내 약물 농도를 가리킨다. 예를 들어, 0 시간 내지 336 시간의 기간에 걸친 종양의 수공간내 AUC는 본원에서 종양 AUC0 -336h로서 언급된다. "0" 시점은 새로운 치료 사이클의 시초에 약물이 최초 투여된 때의 시간을 가리킬 수 있다. 다른 한편으로, "0" 시점은 치료 사이클 중간에 약물이 투여되는 시점을 가리킬 수 있다. 다회용량의 약물이 0 시점 내지 336 시간 시점 사이 다양한 시간에 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 후술하는 바와 같이, 특정 범위에 속하는 종양 AUC 값 및 평균 종양 농도가 효과적인 용량을 제공한다.
일 실시양태에 있어서, 개시내용은 약 150 내지 약 4,000 μM-h의 AUC0 - 336h를제공하는 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 PU-H71의 종양 AUC0 -336h는 약 300 μM-h, 약 500 μM-h, 약 800 μM-h, 약 1200 μM-h, 약 1500 μM-h, 약 2000 μM-h, 약 3000 μM-h 또는 약 4000 μM-h일 수 있다. PU-H71는 상기 언급된 두 값의 어느 것 사이의 종양 AUC0 -336h, 예를 들면, 약 300 μM-h 내지 약 800 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 500 μM-h 내지 약 800 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 500 μM-h 내지 약 1000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 1000 μM-h 내지 약 1500 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 1000 μM-h 내지 약 2000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 1500 μM-h 내지 약 2000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 2000 μM-h 내지 약 3000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 2000 μM-h 내지 약 4000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h, 약 3000 μM-h 내지 약 4000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -336h 등을 제공하도록 투여될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, "0 시점"은 새로운 치료 사이클 시작이다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 약 75 μM-h 내지 약 2,000 μM-h의 AUC0-168h를 제공하는 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 PU-H71의 종양 AUC0 -168h는 약 75 μM-h, 약 250 μM-h, 약 400 μM-h, 약 600 μM-h, 약 750 μM-h, 약 1000 μM-h, 약 1500 μM-h 또는 약 2000 μM-h일 수 있다. PU-H71은 상기 언급된 두 값의 어느 것 사이의 종양 AUC0 -168h, 예를 들면, 약 150 μM-h 내지 약 400 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 250 μM-h 내지 약 400 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 200 μM-h 내지 약 500 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 500 μM-h 내지 약 750 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 500 μM-h 내지 약 1000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 750 μM-h 내지 약 1000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 1000 μM-h 내지 약 1500 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 1000 μM-h 내지 약 2000 μM-h 범위의 종양 AUC0 -168h, 약 1500 μM-h 내지 약 2000 μM-h 범위의 종양 AUC0-168h 등을 제공하도록 투여될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, "0 시점"은 새로운 치료 사이클 시작이다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 약 10 내지 약 300 μM-h의 AUC0 -48h를 제공하는 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, PU-H71의 종양 AUC0 -48h는 약 15 μM-h, 약 20 μM-h, 약 25 μM-h, 약 30 μM-h, 약 40 μM-h, 약 50 μM-h, 약 80 μM-h, 약 100 μM-h, 약 150 μM-h 또는 약 200 μM-h일 수 있다. PU-H71은 상기 언급된 두 값의 어느 것 사이의 종양 AUC0 -48h, 예를 들면, 약 10 μM-h 내지 약 100 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h, 약 10 μM-h 내지 약 80 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h, 약 15 μM-h 내지 약 80 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h, 약 15 μM-h 내지 약 50 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h, 약 20 μM-h 내지 약 50 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h, 약 20 μM-h 내지 약 40 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h, 약 20 μM-h 내지 약 30 μM-h 범위의 종양 AUC0 -48h 등을 제공하도록 투여될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, "0 시점"은 새로운 치료 사이클 시작이다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 0 내지 336 시간에 약 0.5 μM 내지 약 7.5 μM의 PU-H71의 평균 종양 농도 (본원에서 [PU-H71]avg 로서 칭해짐)를 제공하는 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 0 내지 및 336 시간의 [PU-H71]avg는 약 1 μM, 약 3 μM, 약 5 μM, 또는 약 7 μM일 수 있다. PU-H71은 상기 언급된 두 값의 어느 것 사이의 [PU-H71]avg, 예를 들면, 약 1 μM 내지 약 5 μM, 약 3 μM 내지 7 μM, 약 3 μM 내지 약 5 μM 범위 등의 [PU-H71]avg (0 시간 내지 336 시간에 측정)을 제공하도록 투여될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, "0 시점"은 새로운 치료 사이클 시작이다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
다른 실시양태에 있어서, 개시내용은 0 내지 168 시간에 약 0.25 μM 내지 약 3.75 μM의 PU-H71의 평균 종양 농도 (PU-H71 ([PU-H71]avg))를 제공하는 충분한 양의 PU-H71을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 0 내지 168 시간에 [PU-H71]avg는 약 0.5 μM, 약 1.5 μM, 약 2.5 μM, 또는 약 3.5 μM일 수 있다. PU-H71은 상기 언급된 두 값의 어느 것 사이의 [PU-H71]avg, 예를 들면, 약 0.5 μM 내지 약 2.5 μM, 약 1.5 μM 내지 3.5 μM, 약 1.5 μM 내지 약 2.5 μM 범위 등의 [[PU-H71]avg (0 내지 시간 및 168 시간에 측정)을 제공하도록 투여될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, "0 시점"은 새로운 치료 사이클 시작이다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
당업자들이 이해하고 있는 바와 같이, 목적하는 "종양 형성 HSP90" 점유율을 달성하기 위해 필요한 PU-H71의 총량, 종양 AUC 또는 [PU-H71]avg는 투여 경로 및 투약 스케줄 둘 다에 좌우된다. PU-H71은 정맥내, 피하, 근육내 및 복강내를 비롯하여 다양한 주사가능한 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 한편으로, PU-H71은 경구적으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 일 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 주 5회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 인간 환자에 약 5 mg/m2 내지 약 250 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 주 5회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 20 mg/m2 내지 약 60 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 주 5회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 50 mg/m2 내지 약 250 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 다른 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 주 5회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 50 mg/m2 내지 약 100 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 다른 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 주 5회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 75 mg/m2 내지 약 200 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 다른 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 주 5회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 75 mg/m2 내지 약 150 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
바람직한 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회, 주 2회 또는 주 3회에서 선택되는 투약 스케줄에 따라 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 인간 환자에 정맥내로 투여된다. 특정 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 2회의 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 50 mg/m2 내지 약 150 mg/m2 또는 약 70 mg/m2 내지 약 125 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 다른 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 3회의 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 20 mg/m2 내지 약 100 mg/m2 또는 약 40 mg/m2 내지 약 80 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 또다른 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회의 투약 스케줄에 따라 인간 환자에 약 90 mg/m2 내지 약 190 mg/m2 또는 약 100 mg/m2 내지 약 250 mg/m2의 용량으로 정맥내로 투여된다. 특정 일 실시양태에 있어서, 종양을 가지는 환자는 HSP90 의존성 종양을 가지는 인간 환자이다.
일 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회 또는 주 2회로 2주동안 이어 1주 쉬는 투약 스케줄에 따라 정맥내로 고형 종양, 림프종 또는 혈액학적 악성 종양을 가지는 인간 환자에 투여된다. 다른 특정 실시양태에 있어서, PU-H71은 주 1회 또는 주 2회로 1주동안 이어 1주 쉬는 투약 스케줄로 투여된다. 다른 한편으로, PU-H71은 주 1회 또는 주 2회 휴식기 없는 투약 스케줄로 투여된다.
5.4. 예후 및 진단 적용을 위한 HSP90 의존성 종양 단백질 및 경로 평가
섹션 5.1.에서 논의한 바와 같이, 암 세포에서의 "종양 형성 HSP90"과 정상 HSP90 간의 비에 대한 정보를 이용하여 암 세포의 생존 및 증식에서의 HSP90 기여를 결정할 수 있다. 또, 본 발명자들은 보통 생존에 있어서 HSP90 의존성인 특정 단백질 및 경로를 동정하였다. 특히 HSP90 요법에 반응한 환자에 대해 평가한 경우, 환자의 암 세포에서 이들 단백질의 발현 수준 및 또는 이들 경로 동정으로 환자의 암에서 HSP90 단백질 역할에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 본원 개시내용은 (a) 환자의 암으로부터 HSP90 단백질을 발현하는 세포를 함유하는 샘플을 얻고; (b) 샘플에 존재하는 세포에 대해 하기 파라미터중 적어도 하나의 존재를 평가하고: 활성화된 AKT 경로, PTEN 종양 억제제 기능 또는 발현 결핍, 활성화된 STAT5 경로, 또는 Bcl2 패밀리 멤버, 예컨대 Bcl-xL, 단백질 발현; (c) 단계 (b)에서 얻은 평가를 미리 결정된 동일 파라미터의 기준 평가 또는 HSP90 저해제 요법에 반응한 한명 이상의 암 환자(들)로부터의 인간 암 세포에 대해 단계 (b)에서 평가한 파라미터와 비교하여 환자의 암이 HSP90 저해제로의 요법에 반응할지를 결정하는 것을 포함하여, 환자에 존재하는 인간 암이 HSP90 저해제로의 요법에 반응할 것인지를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에 있어서, 세포는 유방암 세포 또는 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포이다.
매년 임상 평가에 들어가는 많은 잠재적인 신약에도 불구하고, 연구의 5% 내지 8% 만이 등록된다. 특히 관건인 것은 3상의 높은 실패율이며, 종양학 제제의 50%가 개발을 중단하는 것으로 추정된다. 이러한 실패는 특히 비용이 많이 들고 많은 환자에게서 잠재적으로 더욱 효과적인 치료법을 앗아간다. 이들 어마어마한 통계는 분명히 환자 선별 및 시도 강화에 대한 예측 바이오마커를 발견하고 이행할 필요성에 대해 일러준다.
표적 제제로 과거에 얻은 결과로부터 우리가 습득한 것은 무엇인가? 어떤 바이오마커에 의해서도 선택되지 않은 연구 집단에서 신약을 단일 제제 또는 화학요법과 더불어 투여하였을 때, 대부분의 시도는 부정적인 결과를 낳았지만, 소수 사례에서는 통계적으로 유의적인 혜택이 입증되었다. 그러나, 그 혜택은 기껏해야 전체 생존의 작은 또는 약간의 절대적인 연장이다. 다른 한편, 바이오마커-유도 환자 선별에 기초한 표적제의 사용으로 얻은 더 큰 절대적인 혜택의 예가 지속적으로 증가하고 있다. 바이오마커는 특이적인 메카니즘을 기반으로 한 요법으로 효능의 정확한 예측 변수를 통합하여 각 개개 환자에 치료 선택을 제시하기 위해 종양 및 환자 특성을 사용할 가능성을 제공한다. 특히, 적합한 예측 마커는 장래 특정 치료로부터 긍정적인 임상 성과를 가질 개인을 동정할 수 있다
본 개시내용은 이들 이슈를 인식하고, HSP90 저해제를 암 치료에 이행하는 데에 바이오마커-유도 환자 선별 및 시도 강화에 적합한 바이오마커의 개발을 제안한다.
5.4.1. 유방암에서 HSP90에 대한 세포자멸 감수성 예측 마커
종양의 유전적 구성에 따라, 세포증식 억제 또는 세포독성 효과는 BC에서 HSP90 저해에 의할 수 있다. 그러나 임상적으로, 치료에 대해 세포증식 억제 반응이 아닌 고도의 세포자멸이 가장 바람직하다. 따라서, PU-H71 및 다른 HSP90 저해제로 부과된 경우 좀 더 세포자멸사를 겪을 것 같은 유방암 종양을 동정하기 위해, 본 발명자들은 세포주에서 HSP90 저해시 최고의 세포자멸 반응과 연관되는 분자적 손상을 확인하기 위한 예비 연구를 행하였다.
이들 연구는 HSP90 저해에 대해 종양의 세포자멸 감수성을 부여하는 주 요소 (즉, 반응 예측 바이오마커)로서 활성화된 Akt의 HSP90-지향 조절 및 상승된 Bcl-xL 및/또는 Bcl2 및/또는 Mcl-1as를 제안한다. 당업자라면 활성화된 Akt 경로의 측정이 Akt, S6, PRAS40, Bcl2, mTOR, IKK, NFkB를 예로 들 수 있으나 이들에 제한되지는 않는 이러한 경로와 연관된 하나 이상의 단백질의 발현 및/또는 인산화 상태의 측정을 필요로 할 수 있음을 알 수 있을 것이다. Akt 경로 및 그의 활성화에 대한 상세한 정보는 KEGG PATHWAY 데이터베이스; 및 National Cancer Institute's Nature Pathway Interaction 데이터베이스의 온라인에서 찾을 수 있다. 또한 Cell Signaling Technology, Beverly, Mass.; BioCarta, San Diego, Calif.; 및 Invitrogen/Life Technologies Corporation, Clarsbad, Calif의 웹사이트를 참조바람. 이 경로는 1-포스파티딜-D-미오-이노시톨 4,5-비스포스페이트, 14-3-3, 14-3-3-Cdkn1b, Akt, BAD, BCL2, BCL2L1, CCND1, CDC37, CDKN1A, CDKN1B, 시트룰린, CTNNB1, EIF4E, EIF4EBP1, ERK1/2, FKHR, GAB1/2, GDF15, 글리코겐 합성효소, GRB2, Gsk3, Ikb, IkB-NfkB, IKK (복합체), ILK, 인테그린, JAK, L-아르기닌, LIMS1, MAP2K1/2, MAP3K5, MAP3K8, MAPK8IP1, MCL1, MDM2, MTOR, NANOG, NFkB (복합체), 산화질소, NOS3, P110, p70 S6k, PDPK1, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트, PI3K p85, PP2A, PTEN, PTGS2, RAF1, Ras, RHEB, SFN, SHC1 (EG:20416 포함), SHIP, Sos, THEM4, TP53 (G:22059 포함), TSC1, Tsc1-Tsc2, TSC2, YWHAE로 구성되나, 이들로만 한정되지는 않는다.
당업자라면 하나 이상의 Bcl-2 패밀리 항-세포자멸 분자, 예컨대 Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1의 발현 측정이 이러한 항-세포자멸 패밀리의 기여를 인식하는데 필요할 수 있음을 알 것이다.
확립된 BC 세포에서의 연구가 HSP90 요법에 더 잘 반응할 것 같은 BC에 대해 유용한 정보를 제공하지만, 배양된 세포가 실제 임상 질환을 완전히 설명할 수는 없다. 유방암의 실험 모델은 매우 적은 수의 세포주를 포함하며, 수십년전 개발되었다. 일부 세포주는 원래의 특징들을 대부분 보유하지만, 본 발명자들은 환자 샘플과 세포주 간에 HSP90의 수준과 다른 특징들에 차이가 있음을 발견하였으며, 여기서 일부는 배양 스트레스에 의한 것일 수 있다. 또, 배양된 세포주는 환경이 종양 세포에 주는 효과를 설명하지 않는다. 동시에, 본 발명자들은 일차 조직 배양이 종양 특징과 비슷할 수 있고 세포주 보다 더 충실히 치료에 반응할 것으로 판단한다.
요컨대, "HSP90 요법에 가장 감수성인 BC 종양 스펙트럼은 무엇인가?" 라는 물음을 짚고 넘어가기 위해, 우리의 연구는 탈동정된 병리 디스카드 (discards)로부터 얻은 임상적 유방암 종양 표본에서 PU-H71의 평가를 포함한다.
이들 샘플에서, 본 발명자들은 HSP90 저해제에 대한 BC 종양의 감수성과 선별한 바이오마커의 발현 사이에 상관관계를 확립하였다. 하기 단계는 보다 진전하여 다음 시도에서 환자 선별에 이를 사용하는 것에 대해 제안한다. 점수 체계가 정의되고 입증되면, 환자 선별은 궁극적으로 해당 마커와 예측 반응을 연관시키기 위해 FFPE 또는 CTC에서 행해질 수 있다. 이러한 진단 척도는 이어서 트라스투주맙 치료를 위한 환자 선별을 유도하기 위해 사용되는 HER2-점수 기록과 동일한 방식으로 통례상 HSP90 요법에 더 잘 반응할 것 같은 BC 종양 선별에 도입될 수 있다.
PU-H71에 대한 BC 샘플의 엑스 비보 감수성 테스트. BC 환자 종양의 신선한 조직 섹션을 PU-H71에 대해 엑스 비보 노출하여 암 세포의 전체적인 감수성 및 정상 세포 (즉, 섹션에 존재하는 경우 혈관, 양성 도관)에 대한 효과를 평가하였다. PU-H71의 농도 및 노출 시간은 이러한 제제를 사용한 사전 인비트로 및 생체내 PK 분석 둘다에 기초하며, 여기서는 투여 후 24 시간 및 48 시간에 종양에 전달되고 보유된 마이크로몰 농도 이하의 PU-H71이 결정된다. 반응은 1 또는 2 측정으로 결정된다: 1. 세포자멸사의 지표인 형태 변화를 나타내는 세포의 H&E 염색 샘플에서의 정량화 및 2. TUNEL-양성 세포의 정량화.
환자 조직 입수: 탈동정된 샘플로부터 병리 디스카드 및 HSP90 저해제 시도 도중 니들 코어 생검은 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)의 가이드라인 및 승인하에 구하였다. 새로이 입수한 조직이 즉시 사용된다.
엑스 비보 감수성 조사: 유방절제술로 제거 수술을 이행한 후 즉시 표본 조직을 병리 공간의 조직채취소 (Tissue Procurement Services: TPS) 구역으로 이송한다. 병변을 위치시키고, 조직을 멸균 조건하에 수거한다. 평가를 위해 제거한 표본 크기는 전형적으로 5-10 mm x 5-10 mm이다. 샘플이 가장 이행가능한 면적이 되도록 최선을 다했다. 정상유방 상피 조직의 전형으로 병변으로부터 떨어진 동등한 크기의 표본을 제거한다. 양 표본을 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 최소필수배지 (MEM)에 위치시켰다. 병변의 작은 부분 및 정상유방 상피 조직의 전체 조각을 WB에 의한 추후 분자적 평가를 위해 스냅 냉동한다. 남은 병변 부분 (유방 절제술)을 병리적 평가를 위해 처리한다. 모든 병변에 대해 병리는 수용체 상태를 위한 IHC, 증식 마커, 상피 마커 및 비표준 바이오마커 (예를 들면 pAKT, BclxL, HSP90 및 Hsp70)를 추가 평가하기 위한 10개의 스테인드되지 않은 것과 하나의 헤마톡실린/에오신 (H&E) 스테인드 슬라이드를 제공한다.
예비 분석으로부터 본 발명자들은 신선한 조직 슬라이싱이 HSP90 저해 평가를 위해 일차 세포 분리 보다 신속하고 더 효율적인 엑스 비보 방법을 제공함을 알았다. 또한, 이는 조직 주변의 내인성 환경에서 암 세포를 방지한다. 이는 기질 세포와 종양 세포간의 상호작용이 암 성장 및 진행에 중요한 역할을 하기 때문에 중요하다. 이 방법에서는, 조직 (즉, 병변)을 플라스틱 몰드에 놓고, 6% 아가로스에 포매한다. 이어, 아가로스-포매 조직을 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 MEM을 함유하는 냉각 저장소에 잠긴 (조직 보존을 위해) 바이브라톰 스테이지에 마운팅한다. 그 다음으로, 조직을 금속 블레이드를 이용하여 슬라이싱하여 200 μm 두께로 일련의 병변 섹션을 만든다. 각 섹션 (주변 아가로스-포매 매질 제외)을 즉시 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 MEM을 함유하는 24-웰 조직 배양 플레이트에 위치시킨다. 5 mm x 5 mm의 조직 조각으로부터 약 25개의 섹션이 생성된다. 이로서 최소 4 용량의 HSP90 저해제 및 하나는 비히클로만 처리된 조직 조각의 분석이 중복가능하다. 조직 조각을 디스파제에 잠시 노출시켜 효소적 해리시키면, 중복물을 IHC 뿐만 아니라 생존력 분석 (자동 플레이트 판독기 또는 사이토스핀 제제) 둘 다로 분석할 수 있다.
지금까지, 모든 BC 아류형을 포함하는 42개의 표본이 획득되었다. 이들중에서, 9개는 수용체 상태 음성이다. 일차 종양 (PT) 및 림프절 전이 (LN) (존재하는 경우) 모두를 평가하였는데, 여기서는 200 um 두께의 "신선한 조직 조각"을 PU-H71의 용량을 증가시키면서 노출하였다. PU-H71로 삼중 음성 침윤성 췌관 암종 (IDC)을 용량-의존적 방식으로 처리하여 일차 종양 및 림프절 전이 모두 세포자멸사에 이르렀다. 흥미롭게도, LN은 상응하는 PT 보다 PU-H71에 더 감수성인 것으로 나타났다. 가장 유의적으로, 정상 (예를 들면 혈관, 림프구) 및 양성 (예를 들면 췌관, 소엽) 조직은 PU-H71에 48 시간 노출 후 변하지 않고 남아 있었다. 데이터는 4개의 상이한 감수성 군에서 TNBC 케이스의 클로스터링을 보여준다: 0.5uM PU-H71에서 100% 세포자멸사로 매우 감수성임 (상부 곡선, 도 40 A), 1uM PU-H71에서 100% 세포자멸사로 감수성임 (중간 곡선, 도 40 A), 1-2.5uM에서 ~50% 세포자멸사로 부분적 내성임 (하부 곡선, 도 40 A) 및 내성 (PT#14, 모든 시험 농도에서 세포자멸사 없음, 도시되지 않음).
도 40B에서 알 수 있는 바와 같이, 다수 종양은 세포주에서 생성된 예비 데이터로부터 예측되는 것보다 HSP90 저해에 더 감수성이다. 구체적으로, MDA-MB-468은 가장 감수성인 유방암 세포주중 하나인데 (Caldas et al PNAS 2009), 본 발명에서 제시한 연구는 PU-H71에 대해 훨씬 더 감수성인 종양 세포가 인간 유방암 환자로부터 얻은 일차 표본에서 얻어질 수 있음을 보여준다. 특히, 0.5μm PU-H71의 48 시간 처리가 세포자멸사를 겪은 것의 약 50%를 관찰하기 위한 MDA-MB-468 세포에서 필요한데, 본 발명자들은 수개의 HER2+, 삼중-음성 및 ER+ 유방암에 대해, 0.05 μm 정도로 낮은 농도가 유사 효과를 유도할 수 있음을 발견하였다. 또한, 약 5μm PU-H71의 48 시간 처리가 세포자멸사를 겪은 것의 약 100%를 관찰하기 위한 MDA-MB-468 세포에서 필요한데, 본 발명자들은 수개의 HER2+, 삼중-음성 및 ER+ 유방암에 대해, 0.5 μm 정도로 낮은 농도가 유사 효과를 유도할 수 있음을 발견하였다. 본 연구는 치료 효과를 제공할 것으로 예상되는 PU-H71의 필요한 종양 농도에 대한 정보를 제공한다.
GI 및 췌장암에서의 조사도 유사한 결과를 제공하였다.
5.4.1.1. IHC 및 WB에 의한 제안된 바이오마커의 발현 조사, 및 바이오마커 발현에 의한 샘플 점수 기록
IHC는 HSP90, Hsp70, p-Akt/Akt 및 Bcl-xL의 저 내지 고 발현을 기초로 샘플의 점수를 매긴다. 일차 항체를 항체 희석 완충제로 대체하여 적절한 음성 대조군을 얻었다. HSP90, p-Akt/Akt, Bcl-xL 및 Hsp70 착색 강도를 각 표본에 대해 0 내지 3의 스케일로 점수를 매길 것인데 (2 시간), 여기서 0은 음성-, 1은 약 양성-, 2는 중등 양성-, 및 3은 강한 양성-착색을 나타낸다. 점수 기록은 보통 매우 주관적이기 때문에 IHC 단독은 다소 문제가 될 수 있을 것이지만, 웨스턴 블롯과 같은 제2의 방법과 병행하여 사용하면 환자 반응에서와 엑스 비보와 연관짓기 위해 "정규적이고" 유효한 IHC가 될 것이다. 얻은 단백질의 양이 전통적인 막-WB를 위해 충분치 않으면, 초감수성 모세관-WB 기술이 이용된다. 전형적인 코어 니들 생검 표본은 20 내지 40 mg의 조직을 수득하는데, 이는 제안된 IHC, 및 잠재적으로는 모세관 WB 분석에 충분하다. 이 정보가 제안된 점수 기록 방법의 유효 지침으로서, 임상 반응과 관련하여 분석될 것이다. 즉, 본 발명자들은 임상 반응과 바이오마커 평가로 예측되는 반응을 연관시킬 능력을 가질 것이다. 점수 체계가 정의되고, 유효하면, 환자 선별은 궁극적으로 해당 마커와 예측 반응을 연관시키기 위해 FFPE에서 행해질 수 있다. 이러한 진단 척도는 이어서 트라스투주맙 치료를 위한 환자 선별을 유도하기 위해 사용되는 HER2-점수 기록과 동일한 방식으로 통례상 HSP90 요법에 더 잘 반응할 것 같은 TNBC 종양 선별에 도입될 수 있다.
일부 환자의 경우는, 접근할 수 없는 종양 (심한 내적 전이)이거나, 동의서가 없어 생검이 가능하지 않을 수 있다. 이들 경우, 본 발명자들은 혈액에서 수거한 순환 종양 세포 (CTC)가 정보를 제공할 수 있는 값인지를 조사하는 것에 목적을 둘 것이다. 질병 단계에 따라 진전된-암 환자의 경우, 본 발명자들은 이 기술로 1,000 내지 10,000개의 BC 세포를 회수할 것으로 예상한다. 이러한 세포수는 단백질의 모세관-WB 분석 (또는 필요에 따라 실시간 qPCR 분석)과 면역자기성 농축에 이은 유세포 분석에 의해 HSP90, Hsp70, p-Akt 및 Bcl-xL 발현의 점수를 기록하는 데 충분하다.
도 40은 포스포-Akt, Ser473으로의 높은 착색으로 입증되는 바와 같이, 활성화된 Akt을 가지는 유방암 종양이 또한 HSP90 저해에 매우 감수성인 것임을 보여준다.
5.4.2. 급성 골수성 백혈병 ( AML )에서 HSP90 저해에 대한 세포자멸 감수성의 결정인자
백혈병 세포에서 세포자멸사를 유도하기 위해 설계된 표적 치료가 가장 유망한 항-백혈병 전략이다. 본 발명자들은 AML에서 열충격 단백질 90 (HSP90) 치료에 대한 세포자멸 감수성 예측 바이오마커를 탐구하였다. 본 발명자들은 유전적으로 상이한 AML 세포주 패널에 HSP90 저해제 첨가가 세포 성장을 강력하게 저해하고 돌연변이 FLT3, TEL-TRKC, AML1-ETO, 돌연변이 c-KIT 및 돌연변이 JAK2와 같은 다수의 AML 세포-특이적 종양-단백질의 분해를 유도하는 것을 발견하였다. 특히, HSP90 저해시 세포자멸사를 겪는 이들 세포의 경향은 상당히 다르다. 가장 감수성인 세포주는 MOLM-13, MV-4-11 및 M0-91 세포이었고, 이들 각 세포주에 대해 본 발명자들은 SP90 저해제 처리 48-72 시간 후에 초기 세포 집단의 거의 100%가 사멸하는 것을 관찰하였다. 이에 반해, 이들 조건하에 불과 20% 사멸만이 HEL 및 HL-60 세포에서 관찰되었다. 그 다음으로, 본 발명자들은 HSP90 저해에 대해 AML 세포의 세포자멸 감수성이 PI3K-Akt 및 STAT5 활성화와 연관되나, Raf-MAPK 경로의 활성화와는 연관되지 않음을 입증하기 위해, AML에서 불규칙적인 것으로 알려진 공지 종양 형성 시그널링 경로의 특이적 저해제를 사용하였다. 중요하게도, 유사한 결과가 세포주, 이종이식 모델 및 동질 세포주 시스템에서 관찰되었다. 본 발명자들은 또한 HSP90이 저해되는 경우, 심지어 Bcl-xL 과발현과 관련한 이들 두 경로의 이중 활성화가 AML의 세포자멸 한계를 낮추는 것을 발견하였다. 종합하면, 본원의 결론은 STAT5 시그널링 및 Akt의 활성화를 가지는 AML 환자가 HSP90 저해제 치료에 가장 혜택을 많이 입을 것 같고, 임상 시험은 이들 중요한 시그널링 경로의 특이적 활성화를 가지는 환자를 명부에 올려야 한다는 것을 제안한다.
중요하게도, AML을 가지는 환자의 50-70%가 Thr308 및 Ser473 Akt 양자의 인산화를 나타낸다. 이 분자는 AML에서 증식, 생존 및 약물 내성에 기여를 하고, 반대의 결과를 수반한다. 종합하면, 본원의 결론은 STAT5 시그널링 및 Akt의 활성화를 가지는 AML 환자가 HSP90 저해제 치료에 가장 혜택을 많이 입을 것 같고, 임상 시험은 이들 중요한 시그널링 경로의 특이적 활성화를 가지는 환자를 명부에 올려야 한다는 것을 제안한다.
5.4.2.1. HSP90 저해는 AML 세포주에서 세포-타입 특이적 사멸을 유도한다
다수의 화학적으로 상이한 소분자 HSP90 저해제가 보고되었고, 다수는 임상 또는 후기 전임상 조사중에 있다 (Chiosis et al., 2008). 이들중에는 모두 임상 평가중인 안사마이신 천연 산물 유도체 17-AAG 및 17-DMAG, 및 합성 화합물 CNF-2024 (BIIB021) 및 PU-H71, 및 전임상 개발중에 있는 PU-DZ13, PU-H71의 근접 유도체가 있다.
HSP90 저해제에 대한 AML 세포주의 감수성 스펙트럼을 평가하고, 그의 유전적 배경과 HSP90 치료에 의한 세포자멸사의 유도 사이에 가능한 관계를 조사하기 위해, 본 발명자들은 다양한 세포 패널을 이용하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 Kasumi-1 및 SKNO-1, AML1-ETO 융합 및 돌연변이화된 c-KIT (N822K) 단백질을 함유하는 세포주; MOLM-13, LL-AF9 융합 단백질 및 FLT3 ITD 돌연변이 둘 다를 함유하는 MDS에서 발달한 AML의 회기로 환자의 말초 혈액으로부터 확립된 인간 세포주; TEL-TRKC 융합 단백질을 함유하고, 또한 구성적으로 활성화된 STAT5가 내재하는 M0-91: 최종적으로 JAK2 V617F 돌연변이를 함유하는 HEL을 선택하였다. HSP90 저해제는 용량- 및 세포-의존적 방식으로 각 시험 AML 세포주의 성장을 강력히 저해하고, 또한 세포 사멸을 유도한다 (세포주 중에 주목할만한 차이가 관찰된다). 가장 감수성인 것은 72 시간 후 초기 세포 집단의 100%가 사멸하는 MOLM-13 및 M0-91 세포였고, Kasumi-1 및 SKNO-1, 50-80% 및 HEL, 20%가 뒤를 이었다. 정상말초 혈액 백혈구는 유사 농도에서 영향을 받지 않았다.
AML 세포주를 사멸시키는 상이한 HSP90 저해제의 능력은 유사하였으며, 이는 일반적인 작용 메카니즘, 즉 HSP90 저해를 통해 화합물의 세포독성이 일어남을 제시한다.
5.4.2.2 HSP90 저해는 AML 세포에서 세포자멸사를 유도한다
HSP90 저해제에 의한 AML 세포-사멸에 해당하는 메카니즘의 추가 조사를 위해 PU-H71을 선택하였다. 이중 아크리딘 오렌지/에티듐 브로마이드 염색으로 명백한 바와 같이, 캐스파제 3,7의 PARP 절단 및 활성화, AML에서 PU-H71의 세포독성은 주로 세포자멸사의 유도를 통해 일어난다. PU-H71로 처리하고 72 시간 후에 세포자멸사를 겪는 세포수는 MOLM-13 및 M0-91에 대해 거의 100%, SKNO-1 및 Kasumi-1에 대해 50-60% 및 HEL에 대해 30%였으며, 이 값은 관찰된 세포 사멸과 잘 일치를 이룬다. 24 시간 정도의 초기에 MOLM-13 및 M0-91에서 10배, 및 Kasumi-1 및 SKNO-1에서 2배의 캐스파제-3,7 활성화 증가가 관찰되었다. HSP90 저해제 처리 48 시간 후 M0-91 세포주에서 실질적으로 살아있는 세포는 검출되지 않았다. 가장 감수성인 세포, MOLM-13 및 M0-91에서, 세포자멸사는 항-세포자멸 분자 Bcl-xL의 하향조절과 관련이 있었다.
5.4.2.3. HSP90의 저해는 주요 AML 종양-단백질을 결핍시키나, 이 효과가 세포자멸 감수성과 연관되지는 않는다
HSP90 저해제에 대한 AML 세포주의 상이한 세포자멸 감수성은 특정 세포주에서 효과적인 HSP90 저해에 의할 수 있으나, 다른 곳에서는 비효과적이다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 다수의 암에서 HSP90-의존성인 것으로 입증된 두 단백질, RAF-1 및 AKT 키나제에 대해 PU-H71의 효과를 평가하였다. HSP90 저해제는 모든 시험 세포에서 이들 단백질의 정상 상태 수준을 용량-의존적으로 현저히 감소시켰다. 이는 HSP90이 암 세포에서 이들 키나제의 안정성 및 기능에 필요하다는 확립된 메카니즘과 부합한다.
이들 "전-암" HSP90 클라이언트 단백질 외에, PU-H71이 또한 특이적 백혈병유발 추진제, 예컨대 MOLM-13에서 돌연변이 FLT3, M0-91에서 TEL-TRKC, Kasumi-1 및 SKNO-1에서 AML1-ETO 및 돌연변이 cKIT, 및 HEL에서 돌연변이 JAK2 (AML -세포 특이적 HSP90 종양-클라이언트)의 분해를 이끈다. 돌연변이 FLT3, cKIT 및 JAK2, 및 융합 단백질 AML1-ETO는 AML 또는 다른 형질전환된 세포에서 HSP90 저해에 감수성이라고 이미 보고되었다. 그러나, 융합 단백질 TEL-TRKC는 M0-91 세포주에서 PU-H71에 의한 TEL-TRKC의 강력한 분해를 나타내는 본 발명의 발견으로 제시되는 바와 같이, HSP90의 신규 클라이언트이다.
종합적으로, 본 발명의 결과는 HSP90 저해제가 백혈병유발에 필수 이벤트인 것으로 상정되는 "두 히트 (two hit)"를 포함하는 주요 악성 종양 추진 단백질의 AML 세포를 결핍시키나, 이 효과와 AML 세포에서 세포자멸사를 유도하는 HSP90 저해제의 능력 사이에 상관관계가 분명치 않음을 제시한다.
5.4.2.4. HSP90 , PI3K / AKT 및 JAK /STAT 경로의 저해에 대한 세포자멸 감수성은 AML 세포에서 중첩된다
유전적 구성과 HSP90 저해에 대한 세포자멸 감수성 사이의 관계는 분명치 않기 때문에, 잠재적인 해답은 항-세포자멸 표현형에 이르는 기능적 차이 또는 이들 세포중 특정 항-세포자멸 분자의 발현 차이에 놓일 수 있다. 이들 주요 경로는 AML에서 세포자멸사 조절과 연결된다: PI3K/AKT/NFkB, JAK/STAT 및 ras/MAPK 경로. 더욱 중요하게, HSP90은 이들 경로를 따라 다수의 주요 분자를 조절하고, HSP90의 저해는 이들 분자, 예컨대 p-AKT, p-STAT 및 p-ERK의 조합 저해에 이를 수 있다.
AML 세포주에서 세포자멸사에 대한 개개 경로의 유의성을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 특이적인 소분자, 예컨대 Akt 저해제 VIII, Akt1/Akt2 활성을 강력하면서 선택적으로 저해하는 퀴녹살린 화합물 (AKTi), MAP 키나제 MEK 저해제 PD98059 (MEKi) 및 pan-Jak 저해제 2-(1,1-디메틸에틸)-9-플루오로-3,6-디하이드로-7H-벤즈[h]-이미다즈[4,5-f]이소퀴놀린-7-온 (JAKi))을 사용하였다. 본 발명자들은 또한 3개 추가 세포주의 첨가로 AML 세포 풀을 확장하였다: HL-60, 광범위 연구되는 myc 종양 유전자 발현에 양성인 전골수구성 세포주, THP-1, 단구성 AML을 갖는 한살 짜리 남유아의 말초 혈액에서 유래하는 세포주, 및 MV4-11, 4;11 전좌 및 FLT3 ITD 돌연변이를 함유하는 세포주.
AKT, JAK 및 MEK 저해제 (AKTi, JAKi 및 MEKi) 및 HSP90 저해제 PU-H71로 처리 시 세포자멸 세포의 수를 특이적 저해제 첨가 후 24, 48 및 72 시간에 정량하였다. MEK 저해제의 첨가로 보통 또는 약간의 세포자멸사가 있었다. 다른 한편으로, AKT 및 JAK 저해제는 세포자멸사에 가변적이지만 강력한 효과가 있었다. 세포자멸사 분석은 AKTi에 감수성인 세포는 또한 HSP90이 저해되었을 때 가장 잘 세포자멸사할 것임을 보여주었으며 (기울기 = 0.9023±0.09572), 이는 HSP90 저해에 대한 세포자멸 감수성은 AML에서 PI3K/AKT 경로 저해에 대한 감수성과 강력하게 연관됨을 시사한다. JAK/STAT 경로와 HSP90 저해 간의 상관관계가 또한 우수하지만 (기울기 = 0.8245±0.1490), 두 세포주, MV4-11 및 THP-1은 명백한 아우트라이너였다. 이들 결과는 PI3K/AKT 및 JAK/STAT 경로중 어느 하나 또는 둘 다에 대해 생존을 위한 AML 세포 중독이 HSP90 저해에 감수성인 세포자멸사와 상관관계가 있고 강력하게 영향을 줌을 제시한다.
5.4.2.5. AKT의 생체내 저해 및 STAT5 SP90 저해 키네틱스와 효능은 종양 세포자멸사와 연관된다
본 발명자들은 이어서, 마우스에 이종이식된 HEL 및 M0-91 종양 모두에서 약력학적 HSP90 저해 효과를 분석하였다. 배양 세포와 달리, 생체내 모델의 사용은 HSP90-의존성 경로 저해의 실시간 모니터링을 가능케 한다. HSP90에 가장 의존성인 경로는 또한 그의 약학적 저해에 가장 감수성이기 때문에, 이들은 PU-H71에 의해 종양에서 가장 긴 시간동안 저해된 상태로 유지된다. 따라서, 상승된 p-AKT 및 p-STAT5를 보유하고, 양 경로의 활성화에 중독된 것으로 나타난 M0-91 종양에서, PU-H71은 현저한 세포자멸사를 유도하였다. M0-91에서 세포자멸사는 단일 용량의 PU-H71의 투여 후 96 시간동안 유지되었으며, 이는 양 AKT 및 STAT의 강력한 저해를 반영한다. 양 p-AKT 및 p-STAT5 수준이 초기 수준의 70 내지 100%로 감소되었을 때, 절단된 PARP의 최고 수준이 PU-H71의 투여 후 12-72 시간에서 관찰되었다. PARP에 대한 PU-H71의 효과는 p-AKT (p-STAT5는 아님)이 기저 수준으로 회복되었을 때, 96 시간부터 하락하였다.
HEL 이종이식 종양은 PU-H71에 의한 세포자멸사 유도에 덜 감수성인 M0-91 종양이었다. 배양 조건하에, HEL 세포는 상승된 p-STAT5를 발현하며, JAKi 또는 PU-H71에 의한 JAK/STAT 경로의 저해는 세포의 20-30%가 세포자멸사를 겪도록 한다. 다른 한편, AKTi는 이들 세포에서 거의 내지 전혀 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 이들 세포에서 HSP90 저해 시 제한된 PARP 절단 및 캐스파제-3 활성화가 주목된다.
그렇더라도, 조직 배양과 달리, 누드 마우스에 이종이식된 경우, HEL 세포는 저 내지는 중등의 p-AKT 발현 수준을 입증한다. 이는 AML 세포에서 AKT 활성이 환경, 예컨대 사이토카인으로 모의될 수 있고, 종양 조직에 고유한 스트레스 요인, 예컨대 저산소증, 산도 및 이상 혈관화로 인해, 생체내 종양이 생존을 위해 AKT 활성에 더욱 중독성일 수 있는 것으로 보고되었기 때문에, 놀라운 일이 아니다. PU-H71이 배양된 HEL 세포에서 보다 HEL 종양에서 세포자멸사를 현저히 더높은 수준으로 유도하기 때문에, 이종이식된 HEL 세포에서 AKT 활성의 상승은 종양 생존을 위해 필수적인 것으로 보인다. M0-91 종양에서, p-AKT 및 p-STAT5 양 수준이 PU-H71에 의해 초기 수준의 70 내지 100%로 감소된 경우 (PU-H71의 투여 후 12-48 시간 사이에), 최고 수준의 절단된 PARP가 관찰되었다. PARP의 절단은 p-AKT (p-STAT5는 아님)이 기저 수준으로 회복되었을 때 (72 시간) 상당히 감소하였다.
총괄하면, 본 발명의 데이터는 AML에서 HSP90 저해제의 세포자멸 활성이 활성화된 p-AKT 및 p-STAT5 종의 하향조절과 연관되며, 그의 척도임을 제시한다. p-Akt [즉, Ser 473] 외에, Akt-경로의 활성화 상태는 S6, s6k 또는 mTOR의 인산화 상태의 척도로서 결정될 수 있으며, 또한 PU-H71 처리로 하향조절될 수 있다. 관찰된 사항은 또한 AKT 및 STAT-경로 활성화에 대한 AML 세포의 가중 중독이 또한 이들을 HSP90 저해에 더욱 감수성이 되도록 하는 것을 내포한다.
5.4.2.6. HSP90 저해는 생존을 위해 PI3K / AKT 및 JAK /STAT 경로에 중독된 세포에서 세포자멸사를 유도한다
이러한 가설을 입증하기 위해, 본 발명자들은 FL5.12 동질 세포주를 사용하였다. FL5.12을 기능적 JAK/STAT 경로를 가지는 인터류킨-3 (IL-3)-의존성 세포주로서 유도하였으며, 이는 초기 림프구 선조체의 특징적인 일면을 가진다. 부모 세포 및 트랜스펙션된 세포는 각각 Ser473에서의 AKT 인산화 및 Tyr694에서의 STAT5 인산화로 입증되는 바와 같이, 중등-수준의 활성적 AKT 및 STAT5를 발현한다. p-STAT5의 수준은 IL-3 존재에 의존성이다 (p-AKT는 아님). 데옥시사이클린 (DOX)-유도성 프로모터 대조군 하에 구성적으로 활성화된, 미리스토일화된 형태의 AKT (mAKT)는 추가로 이들 세포에서 p-AKT 수준의 조절을 가능케 한다. 동시에, 이들 세포는 활성화된 AKT 및 STAT5-경로에 대한 HSP90 저해제 세포자멸 감수성의 의존성을 평가하기 위한 우수한 동질 모델이다.
mAKT-트랜스펙션된 세포를 AKTi로 처리한 경우, 5-7%에서 15-20%로 세포자멸 세포 증가가 확인되었다. 이 값은 이들 세포의 생존에 대한 내인성 p-AKT의 기여를 반영한다. DOX 첨가로 AKT 활성이 증가되면, 세포는 생존을 위해 AKT에 더욱 중독성으로 되며, AKTi는 30% 세포자멸 세포로 된다 (P = 0.015).
mAKT-트랜스펙션된 세포를 HSP90 저해제로 처리한 경우, 약 35-40% 세포자멸 세포가 검출되었다. 이 값은 이들 세포의 생존에 대한 내인성 p-AKT 및 p-STAT5의 기여를 반영한다. Dox에 의한 p-AKT 수준의 추가 증가는 U-H71 첨가 시에 세포자멸 세포를 35-40에서 50%로 증가되도록 한다.
종합하면, 이들 결과는 HSP90 저해제에 대한 AML 세포의 세포자멸 감수성은 생존을 위해 세포가 AKT 및 STAT-경로에 중독된다는 것을 보여준다.
5.4.2.7. Bcl - xL 과발현은 AML에서 HSP90 저해의 세포자멸 효과를 저해하지 못한다
구성적으로 고수준의 Bcl-xL은 다양한 범주의 화학요법제에 대한 백혈병 세포의 내성과 연관된다. 따라서, 본 발명자들은 Bcl-xL의 도입이 생존을 위해 FL5.12 트랜스펙션된 세포가 AKT 및 STAT에 대한 의존성을 극복하고, PU-H71에 의한 이들 경로의 저해에 내성토록 할 수 있을지를 조사하였다. 이러한 가설을 조사하기 위해, 본 발명자들은 세포자멸 저해제 Bcl-xL을 함유하는 발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 FL5.12.mAKT 세포를 사용하였다. 이들 세포는 인비트로에서 증식을 위해 IL-3에 대해 의존성으로 유지된다. 이들 세포에서, M0-91 세포와 유사하게, STAT5 및 AKT-경로의 동시 활성화 및 Bcl-xL의 과발현이 관찰된다. M0-91에서 볼 수 있는 바와 같이, PU-H71에 의한 HSP90 저해로 이들 단백질의 활성 및 정상 상태의 수준이 감소되며, 그의 세포자멸 효과를 유지한다.
5.4.2.8. 검토
매년 임상 평가에 들어가는 많은 잠재적인 신약에도 불구하고, 연구의 5% 내지 8% 만이 등록된다. 특히 관건인 것은 3상의 높은 실패율이며, 종양학 제제의 50%가 개발을 중단하는 것으로 추정된다. 이러한 실패는 특히 비용이 많이 들고 많은 환자에게서 잠재적으로 더욱 효과적인 치료법을 앗아간다. 이들 어마어마한 통계는 분명히 환자 선별 및 시도 강화에 대한 예측 바이오마커를 발견하고 이행할 필요성에 대해 일러준다. 본 발명의 연구는 AML에서 이러한 문제를 다루었으며, HSP90 저해에 대한 세포자멸 감수성이 생존을 위해 시그널링 경로에 대한 세포의 축적 중독이 항-세포자멸 역할과 연관이 있음을 제시한다. 본 발명자들은 이에 대한 주요 경로로서 활성화된 Akt 및 STAT를 동정하였다.
AKT 시그널링은 보통 급성 AML 환자 블라스트에서 활성화되며, 이들 세포의 증식, 생존 및 약물 내성에 강하게 기여한다. AML을 가지는 환자의 50 내지 70%가 Thr308 및 Ser473 AKT 양자의 인산화를 나타낸다, AKT 활성화가 입증된 환자의 질병이 없는 전체적인 생존 시간은 AKT 활성화가 없는 환자에 비해 상당히 짧으며, 이는 총괄적으로 AKT-불활성화가 AML에서 강력한 전략일 수 있음을 제시한다. HSP90은 거의 전환-의존적 방식으로 이러한 경로 및 다수의 그의 주요 요소를 조절한다. 따라서, 일차 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에서 HSP90의 발현과 pAKT의 것 사이에 유효한 상관관계가 관찰되었으며, 이는 증가된 활성 및 AKT-경로에 대한 세포의 의존성을 버퍼링하기 위해 HSP90 과발현이 AML 세포에 필수적임을 제안한다.
구성적 STAT 활성화가 또한 AML 샘플의 약 70%에서 일어난다. AML 세포에서 STAT 활성화는 FLT3 ITDs 및 IL-6의 오토크린 자극과 관련되나, 이들에만 한정되지는 않는다. 그러나, STAT 경로의 다른 상류 조절제가 또한 STAT의 활성화에 기여한다. 실제, KIT 돌연변이가 또한 JAK/STAT 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌다. 높은 STAT5 및 FLT3 인산화를 가지는 AML 케이스는 일반적으로 자발적인 STAT5 인산화를 갖지 않는 AML 블라스트에 비해 자발적인 세포자멸사 비율이 낮은 것으로 입증되었다. JAK/STAT 유전자를 포함하는 전좌는 STAT 활성화와 백혈병유발 사이에 다른 관계를 제공한다. TEL 유전자의 올리고머화 도메인을 JAK2의 촉매적 도메인과 결합시키는 t(9;12) 전좌가 림프구 및 골수성 백혈병 모두에서 발견되었다. 이 전좌는 트랜스펙션 모델에서 STAT5와 같은 하류 이펙터를 구성적으로 활성화하고, 사이토카인-독립적 성장을 유도한다. 기존에 보고되고 본원에 보여진 바와 같이, 다수의 이들 STAT-활성화 단백질은 그의 이상 활성을 촉진하기 위해 HSP90를 필요로 한다.
종합하면, 공격적인 AML 클론의 생존을 위한 다수 활성화 경로 및 분자, 예컨대 AKT 및 STAT5에 대한 중독은 이들을 또한 HSP90에 가장 중독되도록 한다. 따라서, HSP90 저해는 이들 세포를 사멸하는데 가장 효과적으로 된다. 본원의 결론은 또한 활성화된 AKT 및 STAT5에 대해 항-세포자멸 Bcl-xL의 동시 과발현이 HSP90에 대한 이들 세포의 감수성을 유의적으로 변경하지 않음을 제시한다. Bcl-xL 과발현은 AML에서 약물 내성에 주 요인체이다. Bcl-2 패밀리 (Bcl-2, Bcl-x(L))의 항세포자멸 단백질 과발현은 122 "표준" 화학요법제에 대한 약물 내성을 일으키고, AML 환자에서 좋지 않은 임상 성과와 결부된다.
결론적으로, 본원의 결론은 AKT 및 STAT5 시그널링의 활성화를 가지는 AML 환자가 HSP90 저해제 치료에 가장 혜택을 많이 입을 것 같고 (도 41 및 42 참조), 임상 시험은 이들 중요한 시그널링 경로의 특이적 활성화를 가지는 환자를 명부에 올려야 한다는 것을 제시한다. 본원의 결론은 또한 그의 세포자멸 한계를 낮추기 위한 수단으로서, HSP90 저해제의 도입이 AML을 과발현하는 Bcl-xL에서 다른 치료와의 병용이 보장됨을 제시한다.
5.5. HSP90 저해 요법에 감수성인 신경병성 환자를 선별하기 위해 방사성표지된 HSP90 저해제의 사용
HSP90 저해 요법에 감수성인 환자를 선별하기 위해 방사성표지된 HSP90 저해제를 사용하는 것이 섹션 5.2.1.에 기술되었다. HSP90 치료에 잘 반응할 것 같은 신경병성 질병으로 고통받는 환자를 추리기 위해 유사한 방법론을 이용할 수 있다. 따라서, 개시내용은
(a) 뇌를 환자의 뇌 세포에 존재하는 발병형의 HSP90에 우선적으로 결합하는 방사성표지된 HSP90 저해제와 접촉시키는 단계;
(b) 샘플중 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 저해제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 측정된 샘플중 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 저해제의 양을 기준량과 비교하는 단계를 포함하고,
여기에서 단계 (b)에서 측정된 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 저해제의 양이 기준량에 비해 더 크면 환자는 HSP90 저해제에 잘 반응하는 것인,
신경병성 질병으로 고통받는 환자가 HSP90 저해제 치료에 잘 반응할 것인지를 결정하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에 있어서, 기준은 신경병성 질병을 갖는 동일 환자의 세포의 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 정상 뉴론이 "발병성 HSP90"을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는지를 결정한다: 따라서, 기준량은 환자로서 병에 걸리지 않은 뇌 영역에서 정상 뉴론을 사용하여 결정될 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 기준은 건강한 개체의 세포로부터 유래할 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 기준량은 건강한 개체의 연구 집단으로부터 측정될 수 있다.
알츠하이머병, 파킨슨병, 전측두엽 치매 및 기타 치매, 척추 및 안구 근위축에서 일어나는 악성 변환 및 신경퇴화는 모두 복합성이며, 이상 발현, 번역후 변환, 및 특정 단백질 처리가 특징인 아주 긴 다단계 과정이다. 이들 조절되지 않는 과정의 유지 및 축적을 가능케 하고, 질병 표현형의 단계식 발전을 촉진하기 위해, 세포는 보상적 조절 메카니즘을 끌어내야만 한다. 암에서, 이러한 역할은 열충격 단백질 90 (HSP90)에 기인한다. 이런 의미에서, 표현형 수준으로, HSP90은 다양한 종양의 특징인 수많은 암-특이적 병변에 대한 생화학적 완충제로서 제공되는 것으로 보인다. 유사한 역할이 신경퇴화에서 HSP90에 대해 존재하며, 따라서 섹션 5.2.1.에 기술된 PET 분석을 이용하여 질병에 걸린 뇌에서 "발병성 HSP90"을 동정할 수 있다. 신경병성 질병에서 "발병성 HSP90"은 암에서의 "발병성 HSP90"과 유사한 역할을 한다. HSP90 저해제를 사용하여 신경병성 질병을 치료하는 것이 본원에 참고로 원용되는 미국 공개 출원 제09/0298857호에 기술되었다.
HSP90 저해제 PU-HZ151은 신경병성 뇌 HSP90에 높은 결합 친화성을 나타내고, HSP70 수준을 강력하게 유도할 수 있으며, 뇌 침투성인 것으로 여겨지기 때문에, 본 발명자들은 이를 추가 생체내 평가를 위해 선택하였다. PU-HZ151은 WO 2008/005937호에 기술되어 있으며, 하기 화학 구조를 가진다:
Figure 112017033467195-pat00044
실제로, 3xTg AD 마우스에 복강내로 투여되었을 때, PU-HZ151은 해마에서 HSP70 유도에 의해 입증된 바와 같이, 상당한 표적 조절로 이어졌다 (도 43A). 효과는 용량 의존성이며 (도 43B), HSP70의 상당한 유도가 10 mg/kg 투여 용량 정도로 낮은 곳에서 검출되었다.
다음으로, 본 발명자들은 3xTg AD 마우스의 뇌 및 혈장에서 이들 약력학적 효과와 관련되는 HSP90 저해제 수준을 결정하였다 (도 43C). 3xTg 마우스에 50 mg/kg으로 복강내 투여된 경우, 피질에서의 PU-HZ151 수준은 투여 후 4 시간에 3.3±0.9 ㎍/g (~5,000 nM), 12 시간에 0.05±0.08 ㎍/g (~170 nM), 24 시간에 0.02±0.03 ㎍/g (~60 nM) 및 48 시간에 0.02±0.02 ㎍/g (~53 nM)에 도달하였다. 이에 비해, 유사 용량 (75 mg/kg)으로 투여된 덜 효과적인 HSP90 저해제인 PU-DZ8은 투여 후 4 시간에 겨우 0.35 ㎍/g (~700 nM) 및 12 시간에 0.2 ㎍/g (~390 nM)으로 뇌 농도에 도달하였으며, 투여 후 24 시간에는 피질에서 검출되지 않았다.
혈장에서, PU-HZ151은 4 시간에 2.1±0.1 ㎍/g (~4,000 nM)에 도달하였으나, 8 시간을 넘어서는 검출되지 않았다. 0 내지 48 시간에 걸친 피질의 PU-HZ151 노출은 곡선 아래 면적 (AUC)으로 측정한 바, 혈장의 것 보다 2.5-배 더 높았다 (17.5 대 7.1 μm-h). 소뇌 (이 모델에서 질병에 걸리지 않은 뇌 영역)에서의 수준은 피질 (이 모델에서 질병에 걸린 뇌 영역)에서 기록된 것보다 더 엄밀하게는 혈장의 것과 유사하였다. 이러한 관찰은 또한 이 뇌 영역에서 투여 후 48 시간 이상의 저해제 PU-HZ151의 장기 체류로 지지되며, 이 결과는 종양에서 이러한 부류의 저해제, 예컨대 PU-H71로 얻은 것과 유사하다.
따라서, 124I-PU-HZ151 및 다른 방사성표지된 HSP90 저해제는 HSP90-의존성 신경병성 질병에 걸린 환자를 선별하고 이러한 치료로 혜택을 입을 것 같은 환자를 확인하는데 이용될 수 있다. 이는 또한 HSP90 저해제에 발병성 뇌 노출을 결정하고, 최적의 투여 용량 및 스케줄을 결정하기 위해, 암에서의 PU-H71과 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
당업자라면 암에서의 PU-H71을 위해 본 발명에 의해 기술된 용도가 신경병성 질병에서 방사성표지된 뇌 침투성 HSP90 저해제를 사용하여 또한 달성될 수 있음을 인식할 것이다.
6. 재료 및 방법
6.1. 합성 방법
6.1.1. 형광 표지된 프로브의 합성
1H NMR 스펙트럼은 Bruker 500 또는 600 MHz 기기 상에서 기록하였다. 화학 이동은 내부 표준으로서 MTS로부터 ppm 다운필드 내의 δ 값으로 보고한다. 1H 데이터는 하기와 같이 보고한다: 화학 이동, 다중도(s = 일중항, d = 2중선, t = 3중선, q = 4중선, br = 브로드, m = 다중선), 결합 상수(Hz), 통합. 고해상도 질량 스펙트럼은 Waters LCT Premier 시스템 상에서 기록하였다. 저해상도 질량 스펙트럼은 전기분무 이온화 및 SQ 검출기가 구비된 Waters Acquity Ultra Performance LC 상에서 기록하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 PDA, MicroMass ZQ, 및 ELSD 검출기가 구비된 Waters Autopurification 시스템, 및 방법 A 1.2 mL/분에서 10분에 걸쳐 5 내지 95% b,(a) H2O + 0.1% TFA 및(b) CH3CN + 0.1% TFA; 방법 B 1.2 mL/분에서 13분에 걸쳐 5 내지 95% b,(a) H2O + 0.1% TFA 및(b) CH3CN + 0.1% TFA의 구배를 사용하는 역상 컬럼(Waters X-Bridge C18, 4.6 x 150 mm, 5 ㎛) 상에서 수행하였다. 컬럼 크로마토그래피는 230-400 메쉬 실리카 겔(EMD)을 사용하여 수행하였다. 모든 반응은 아르곤 보호하에 수행하였다. 플루오레세인이소티오시안산염(FITC), 설포로다민 101 설포닐 클로라이드(Texas Red-Cl) 및 4-클로로-7-니트로-1,2,3-벤즈옥사디아졸(NBD-Cl)는 Aldrich로부터 입수하였다.
PU-H71- FITC1 [4](반응식 1). DMF(0.2 mL) 중에 화합물 3 21(15 mg, 0.0263 mmol), FITC(11.3 mg, 0.0289 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)를 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 잔사를 HPLC로 정제하여 10.1 mg(40%)의 4를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, MeOH-d 4)δ 8.17(s, 1H), 8.05(s, 1H), 7.93(s, 1H), 7.65-7.74(m, 1H), 7.40(s, 1H), 7.08-7.16(m, 2H), 6.76-6.89(m, 2H), 6.66(s, 2H), 6.50-6.59(m, 2H), 6.02(s, 2H), 4.35(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.96(t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.78(br s, 2H), 3.62(br s, 2H), 2.31(m, 2H), 1.77(m, 2H), 1.69(m, 2H), 1.45(m, 4H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C42H40IN8O7S2에 대한 계산치, 959.1506; 실측치 959.1530; HPLC(방법 A) Rt = 4.52(96%).
PU-H71-Texas Red [5]. DMF(0.25 mL) 중 화합물 3 21(4.6 mg, 0.008 mmol)을 얼음/물 배스로 0℃로 냉각하였다. 그후 설포로다민 101 설포닐 클로라이드(3 mg, 0.005 mmol)를 첨가하고 용액을 12시간 동안 교반하면서, 온도를 0 내지 10℃로 서서히 가열하였다. 반응 혼합물은 HPLC로 직접 정제하여 어두운 자주색 고체로서 3.4 mg(61%)의 5를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.56(d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.31(s, 1H), 8.16(dd, J = 1.6, 7.9 Hz, 1H), 7.48(s, 1H), 7.46(d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.28(s, 1H), 6.58(s, 2H), 6.08(s, 2H), 4.47(t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56(t, J = 5.4 Hz, 4H), 3.52(t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.15(t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.08(m, 4H), 3.01(t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.93(t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.68(m, 4H), 2.35(m, 2H), 2.11(m, 4H), 1.90-2.00(m, 4H), 1.66(m, 2H), 1.27-1.45(m, 6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C52H57IN9O8S3에 대한 계산치, 1158.2537; 실측치 1158.2534; HPLC(방법 B) Rt = 9.40(99%).
PU-H71- NBD1 [8](반응식 1). 화합물 6 21(12.2 mg, 0.0229 mmol) 및 7 22(32 mg, 0.1145 mmol)를 DMF(0.4 mL) 중에 용해시키고 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 생성된 잔사는 예비(preparatory) TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 7.9 mg(47%)의 8을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.32(d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.00(s, 1H), 7.21(s, 1H), 6.89(s, 1H), 6.04(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.89(s, 2H), 4.13(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.32(m, 2H), 2.51(t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.47(t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94(m, 2H), 1.63(m, 2H), 1.36-1.45(m, 2H), 1.21-1.35(m, 4H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C27H30IN10O5S에 대한 계산치, 733.1166; 실측치 733.1171; HPLC(방법 B) Rt = 8.80(98%).
PU-H71- FITC2 [9](반응식 2). DMF(0.2 mL) 중에 화합물 2 23(16.7 mg, 0.0326 mmol), FITC(14.0 mg, 0.0359 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압 농축시키고, 잔사를 HPLC로 정제하여 21.2 mg(72%)의 9를 정제하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.15(s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.77(d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.34(s, 1H), 7.09(d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.01(s, 1H), 6.63-6.71(m, 4H), 6.51(d, J = 7.3 Hz, 2H), 6.02(s, 2H), 5.53(br s, 2H), 4.30(br s, 2H), 3.64(br s, 2H), 2.85(br s, 1H), 2.27(m, 2H), 1.23(d, J = 6.2 Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C39H33IN7O7S2에 대한 계산치, 902.0928; 실측치 902.0942; HPLC(방법 B) Rt = 9.90(99%).
PU-H71- NBD2 [10]. DMF(0.35 mL) 중에 화합물 2 23(25.4 mg, 0.050 mmol), NBD-Cl(10.0 mg, 0.05 mmol) 및 Et3N(7.6μL, 0.055 mmol)를 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 25:1)로 정제하여 13.4 mg(40%)의 10을 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.25(d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.06(s, 1H), 7.18(s, 1H), 6.85(s, 1H), 6.07(d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.87(s, 2H), 4.24(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.74(m, 2H), 3.18(m, 1H), 2.12(m, 2H), 1.22(d, J = 6.5 Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C24H23IN9O5S에 대한 계산치, 676.0588; 실측치 676.0593; HPLC(방법 B) Rt = 10.37(99%).
2-(3-(6-아미노-8-(6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-9-일)프로필)이소인돌린-1,3-디온 [12](반응식 3). DMF(2 mL) 중에 50 mg(0.121 mmol)의 화합물 11 23을 용해시켰다. 43.4 mg(0.1331 mmol)의 Cs2CO3 및 162 mg(0.605 mmol)의 N-(3-브로모프로필)-프탈이미드를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 그후 부가적인 Cs2CO3(8 mg, 0.0242 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)로 정제하여 25 mg(34%)의 12를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ8.25(s, 1H), 7.85(dd, J = 3.0, 5.5 Hz, 2H), 7.74(dd, J = 3.0, 5.4 Hz, 2H), 7.11(s, 1H), 6.80(s, 1H), 6.10(br s, 2H), 6.00(s, 2H), 4.27(t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.77(t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.15(m, 2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C23H18IN6O4S에 대한 계산치, 601.0155; 실측치 601.0169; HPLC(방법 A) Rt = 7.74.
9-(3-아미노프로필)-8-(6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일티오 )-9H-퓨린-6-아민 [13](반응식 3). MeOH/CH2Cl2(0.7:0.1 mL) 중의 화합물 12(34 mg, 0.0566 mmol)의 현탁액에 하이드라진 하이드레이트(41 μL, 42.5 mg, 0.849 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 17 mg(64%)의 13을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.22(s, 1H), 7.38(s, 1H), 7.06(s, 1H), 6.05(s, 2H), 4.31(t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.76(t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.05(m, 2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C15H16IN6O2S에 대한 계산치, 471.0100; 실측치 471.0086; HPLC(방법 A) Rt = 5.78.
PU-H71- FITC3 [14](반응식 3) DMF(0.2 mL) 중에 화합물 13(8.4 mg, 0.0179 mmol), FITC(7.7 mg, 0.0196 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압 하에 농축하고, 잔사를 HPLC로 정제하여 11.4 mg(74%)의 14를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.23(s, 1H), 8.11(s, 1H), 7.68(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35(s, 1H), 7.20(s, 1H), 7.09(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.63-6.70(m, 4H), 6.50(d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.97(s, 2H), 4.34(t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.61(m, 2H), 2.21(t, J = 6.5 Hz, 2H); MS(ESI) m/z 860.1 [M+H]+; HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C36H27IN7O7S2에 대한 계산치, 860.0458; 실측치 860.0451; HPLC(방법 B) Rt = 9.48(96%).
PU-H71- NBD3 [15](반응식 3). DMF(0.2 mL) 중에 화합물 13(7.2 mg, 0.0153 mmol), NBD-Cl(3.1 mg, 0.0213 mmol) 및 Et3N(2.3 μL, 0.0168 mmol)을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 20:1)으로 정제하여 4.1 mg(42%)의 15를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, DMF-d 7 ) δ 9.54(br s, 1H), 8.53(d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.22(s, 1H), 7.51(br s, 2H), 7.28(s, 1H), 6.76(s, 1H), 6.42(d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.10(s, 2H), 4.47(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.67(m, 2H), 2.35(m, 2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C21H17IN9O5S에 대한 계산치, 634.0118; 실측치 634.0130; HPLC(방법 B) Rt = 9.57(99%).
테트라에틸렌 글리콜- FITC(TEG-FITC)의 합성. DMF(0.4 mL) 중에 FITC(20 mg, 0.051 mmol), 테트라에틸렌 글리콜(49.9 mg, 0.257 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)를 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 잔사를 HPLC로 정제하여 17.3 mg(58%)의 TEG - FITC를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ7.53-8.25(m, 2H), 7.14(d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.72-6.91(m, 4H), 6.65(d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.60(br s, 2H), 3.77(m, 2H), 3.31-3.63(m, 12H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C29H30NO10S에 대한 계산치, 584.1590; 실측치 584.1570; HPLC(방법 B) Rt = 8.97(99%).
2-(4-(6-아미노-8-((6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-9-일)부틸)이소인돌린-1,3-디온(16a)(반응식 4). DMF(8 mL) 중에 200 mg(0.484 mmol)의 화합물 11을 용해시켰다. 466 mg(1.43 mmol)의 Cs2CO3 및 683 mg(2.42 mmol)의 N-(4-브로모부틸)프탈이미드를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 초음파처리하였다. 31.5 mg(0.097 mmol)의 Cs2CO3을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 다시 초음파처리하였다. 이를 2시간의 총 반응 시간 동안 2회 이상 반복하였다. DMF를 제거하고 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)로 정제하여 134 mg(45%)의 화합물 16a을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.18(s, 1H), 7.84(dd, J = 5.5, 3.1 Hz, 2H), 7.72(dd, J = 5.5, 3.1 Hz, 2H), 7.22(s, 1H), 6.89(s, 1H), 6.76(br s, 2H), 5.99(s, 2H), 4.23(t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.69(t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.67-1.83(m, 4H); MS(ESI) m/z 615.2 [M+H]+.
9-(4- 아미노부틸 )-8-((6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-6-아민(17a)(반응식 4). 2 mL MeOH/CH2Cl2(7:1 mL) 중 화합물 16a(38.9 mg, 0.063 mmol)의 현탁액에 하이드라진 하이드레이트(46 μL, 0.950 mmol)를 첨가하고 혼합물을 12시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 18 mg(59%)의 화합물 17a을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.22(s, 1H), 7.38(s, 1H), 7.04(s, 1H), 6.05(s, 2H), 4.23(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.78(t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.82-1.91(m, 2H), 1.55-1.63(m, 2H); MS(ESI) m/z 485.0 [M+H]+.
PU-H71- FITC4 (18a)(반응식 4): DMF(0.2 mL) 중에 화합물 17a(9.7 mg, 0.020 mmol), FITC(8.57 mg(0.022 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 직접적으로 HPLC로 정제하고, 5.2 mg(30%)의 화합물 18a를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.22(s, 1H), 8.00(s, 1H), 7.61(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.37(s, 1H), 7.19(s, 1H), 7.06(d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.58-6.67(m, 4H), 6.48(dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 2H), 5.97(s, 2H), 4.30(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.58(br s, 2H), 1.90-2.00(m, 2H), 1.61-1.70(m, 2H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C37H29IN7O7S2에 대한 계산치, 874.0615; 실측치 874.0610; HPLC Rt = 9.57(98%).
2-(6-(6-아미노-8-((6-아이오도벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)티오)-9H-퓨린-9-일)헥실)이소인돌린-1,3-디온(16b)(반응식 4). DMF(8 mL) 중에 200 mg(0.484 mmol)의 화합물 11을 용해시켰다. 466 mg(1.43 mmol)의 Cs2CO3 및 751 mg(2.42 mmol) N-(6-브로모헥실)프탈이미드를 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 초음파처리하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)로 정제하여 100 mg(32%)의 화합물 16b를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.26(s, 1H), 7.83(dd, J = 5.4, 3.1 Hz, 2H), 7.70(dd, J = 5.4, 3.0 Hz, 2H), 7.26(s, 1H), 6.87(s, 1H), 6.36(br s, 2H), 5.96(s, 2H), 4.18(t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.66(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.70-1.79(m, 2H), 1.60-1.68(m, 2H), 1.32-1.43(m, 4H); MS(ESI) m/z 643.2 [M+H]+.
9-(6- 아미노헥실 )-8-((6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-6-아민(17b)(반응식 4). 4 mL MeOH/CH2Cl2(7:1 mL) 중에 화합물 16b(97 mg, 0.1511 mmol)의 현탁액에 하이드라진 하이드레이트(110 μL, 2.27 mmol)을 첨가하고, 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 제거하고 47 mg(61%)의 17b를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ8.32(s, 1H), 7.31(s, 1H), 6.90(s, 1H), 5.99(s, 2H), 5.84(br s, 2H), 4.20(t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.67(t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.72-1.84(m, 2H), 1.31-1.45(m, 6H); MS(ESI) m/z 513.0 [M+H]+.
PU-H71- FITC5 (화합물 18b(반응식 4). DMF(0.2 mL) 중에 화합물 17b(9.7 mg, 0.01894 mmol), FITC(8.11 mg, 0.0208 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)를 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 직접적으로 HPLC로 정제하여 8.0 mg(47%)의 화합물18b를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.23(s, 1H), 8.09(s, 1H), 7.65(d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.35(s, 1H), 7.16(s, 1H), 7.08(d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.71(d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.67(d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.53(dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 2H), 5.96(s, 2H), 4.24(t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.50(br s, 2H), 1.79-1.88(m, 2H), 1.52-1.61(m, 2H), 1.31-1.42(m, 4H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C39H33IN7O7S2에 대한 계산치, 902.0928; 실측치 902.0939; HPLC Rt = 10.02(99%).
2-(8-(6-아미노-8-((6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-9-일)옥틸)이소인돌린-1,3-디온(16c)(반응식 4). DMF(8 mL) 중에 200 mg(0.484 mmol)의 화합물 11을 용해시켰다. 466 mg(1.43 mmol)의 Cs2CO3 및 819 mg(2.42 mmol) N-(8-브로모옥틸)프탈이미드를 첨가하고, 혼합물을 1.5시간 동안 초음파처리하였다. 용매는 감압하에 제거하고, 생성된 잔사는 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH:AcOH, 15:1:0.5)로 정제하여 120 mg(34%)의 화합물 16c를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.29(s, 1H), 7.84(dd, J = 5.5, 3.1 Hz, 2H), 7.70(dd, J = 5.5, 3.1 Hz, 2H), 7.28(s, 1H), 6.87(s, 1H), 6.29(br s, 2H), 5.96(s, 2H), 4.18(t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.67(t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.62-1.77(m, 4H), 1.25-1.36(m, 8H); MS(ESI) m/z 671.3 [M+H]+.
9-(8- 아미노옥틸 )-8-((6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-6-아민(17c). 4 mL MeOH/CH2Cl2(7:1 mL) 중에 화합물 16c(90.1 mg, 0.1345 mmol)의 현탁액에 하이드라진 하이드레이트(98 μL, 2.017 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 12시간 동안 교반하였다. 용매는 감압하에 제거하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 25 mg(34%)의 17c를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.33(s, 1H), 7.31(s, 1H), 6.90(s, 1H), 5.99(s, 2H), 5.72(br s, 2H), 4.20(t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.66(t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.70-1.80(m, 2H), 1.36-1.45(m, 2H), 1.21-1.35(m, 8H); MS(ESI) m/z 541.1 [M+H]+.
PU-H71- FITC6 (화합물 18c(반응식 4)의 합성: DMF(0.2 mL) 중에 화합물 17c(15.0 mg, 0.028 mmol), FITC(11.9 mg, 0.031 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 직접적으로 HPLC로 정제하여 16.9 mg(66%)의 화합물 18c을 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.22(s, 1H), 8.11(s, 1H), 7.68(d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34(s, 1H), 7.12(s, 1H), 7.09(d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.72(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.67(d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.53(dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 2H), 5.96(s, 2H), 4.20(t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.50(br s, 2H), 1.74-1.81(m, 2H), 1.52-1.59(m, 2H), 1.23-1.35(m, 8H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C41H37IN7O7S2에 대한 계산치, 930.1241; 실측치 930.1231; HPLC Rt = 10.60(96%).
PU- FITC7 (화합물 20(반응식 7)의 합성. DMF(0.3 mL) 중에 화합물 19(15.0 mg, 0.025 mmol), FITC(10.7 mg, 0.0275 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 HPLC로 직접적으로 정제하여 23.5 mg(95%)의 PU-FITC7을 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 , 2 로타머) δ 8.18-8.22(m, 1H), 7.75-7.87(m, 4H), 7.53-7.58(m, 1H), 7.19-7.23(m, 1H), 7.05(d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.98(s, 0.15H), 6.95(s, 0.85H), 6.57-6.75(m, 4H), 6.46-6.55(m, 2H), 6.05(s, 0.3H), 6.00(s, 1.7H), 3.95-4.05(m, 2H), 3.55-3.64(m, 1.7H), 2.86-2.92(m, 0.3H), 2.03-2.12(m, 1.7H), 1.93-2.00(m, 0.3H), 1.18(d, J = 6.5 Hz, 0.9H), 1.13(d, J = 6.5 Hz, 5.1H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C47H36F6N7O7S2에 대한 계산치, 988.2022; 실측치 988.2005; HPLC Rt = 11.00(99%).
PU- FITC8 (화합물 22(반응식 8)의 합성: DMF(0.4 mL) 중에 화합물 21(19.4 mg, 0.050 mmol), FITC(21.4 mg, 0.055 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 직접적으로 HPLC로 정제하여 34.3 mg(88%)의 PU-FITC8을 수행하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.35(s, 1H), 7.97(s, 1H), 7.69(dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1H), 7.20(dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 7.14-7.18(m, 2H), 6.91(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.76-6.85(m, 4H), 6.59-6.65(m, 2H), 6.01(s, 2H), 4.40(t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.82(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.35-2.43(m, 2H), 1.31(d, J = 6.7 Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C39H34N7O7S2에 대한 계산치, 776.1961; 실측치 776.1978; HPLC Rt = 10.13(98%).
PU- FITC9 (화합물 24(반응식 9)의 합성: DMF(0.3 mL) 중에 화합물 23(10.0 mg, 0.032 mmol), FITC(13.9 mg, 0.036 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물은 직접적으로 HPLC로 정제하여 18.3 mg(82%)의 PU- FITC9를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, MeOH-d 4 ) δ 8.33(s, 1H), 7.92(s, 1H), 7.66(dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.15(d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.73-6.83(m, 4H), 6.58-6.65(m, 2H), 4.73-4.76(m, 2H), 4.23(t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.81-3.85(m, 2H), 3.74-3.81(m, 2H), 3.41(s, 3H), 2.28-2.37(m, 2H), 1.30(d, J = 6.6 Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C35H36N7O7S에 대한 계산치, 698.2397; 실측치 698.2399; HPLC Rt = 9.20(99%).
DZ13- FITC1(반응식 10)의 합성. DMF(0.3 mL) 중에 PU-DZ13(20.8 mg, 0.0406 mmol), FITC(17.4 mg, 0.0447 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)를 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 직접적으로 HPLC로 정제하여 33.7 mg(92%)의 DZ13- FITC1를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, DMF-d 7 ) δ9.46(s, 1H), 8.05(dd, J = 7.0, 1.8 Hz, 1H), 7.76-7.82(m, 1H), 7.44(s, 1H), 7.26(d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.90(s, 1H), 6.78(m, 2H), 6.67-6.72(m, 4H), 6.11(s, 2H), 4.59(t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.42(s, 2H), 4.39(t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.53(d, J = 6.9 Hz, 2H), 2.17-2.28(m, 1H), 0.92(d, J = 6.7 Hz, 6H); HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C40H34FIN7O7S에 대한 계산치, 902.1269; 실측치 902.1293; HPLC Rt = 11.77(98%).
SNX - FITC(반응식 11)의 합성. DMF(0.2 mL) 중에 화합물 25(9.5 mg, 0.0205 mmol), FITC(8.8 mg, 0.0225 mmol) 및 Et3N(0.1 mL)을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고, 잔사를 HPLC로 정제하여 13.5 mg(77%)의 주황색 고체를 수득하였다. RMS(ESI) m/z [M+HH]+ C44H40F3N6O7S에 대한 계산치, 853.2631; 실측치 853.2630.
6.1.2. 바이오티닐화된 화합물의 합성
PU-H71- 비오틴3 . CH2Cl2(1 mL) 중에 13(9.1 mg, 0.0193 mmol), D-비오틴(7.1 mg, 0.0290 mmol), DCC(8 mg, 0.0386 mmol) 및 촉매량의 DMAP를 5시간 동안 초음파처리하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 7.5 mg(56%)의 PU-H71- 비오틴3를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 7.97(s, 1H), 7.17(s, 1H), 6.86(s, 1H), 5.84(s, 2H), 4.23-4.27(m, 1H), 4.05-4.09(m, 1H), 4.03(t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.02(t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.90-2.97(m, 1H), 2.67(dd, J = 4.9, 12.8 Hz, 1H), 2.49(d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.01(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.75-1.83(m, 2H), 1.34-1.54(m, 4H), 1.18-1.27(m, 2H); MS(ESI): m/z 697.1 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴2 . CH2Cl2(1 mL) 중에 2(30 mg, 0.059 mmol), D-비오틴(19 mg, 0.078 mmol), DCC(24 mg, 0.117 mmol) 및 촉매량의 DMAP를 9시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 43.2 mg(99%)의 PU-H71- 비오틴2를 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, CDCl3, 2 로타머) δ 8.22(s, 1H), 7.22(s, 0.6H), 7.21(s, 0.4H), 6.87(s, 0.6H), 6.76(s, 0.4H), 6.25(br s, 0.6H), 6.16(br s, 0.4H), 5.88-5.96(m, 2H), 5.85(br s, 0.6H), 5.78(br s, 0.4H), 4.54-4.63(m, 0.6H), 4.32-4.45(m, 1.6H), 4.21-4.25(m, 0.4H), 4.11-4.19(m, 1.4H), 4.00-4.07(m, 0.6H), 3.88-3.95(m, 0.4H), 2.97-3.22(m, 2.4H), 2.78-2.84(m, 1H), 2.69-2.77(m, 0.6H), 2.62-2.68(m, 1H), 2.22-2.27(m, 0.6H), 1.94-2.05(m, 1.4H), 1.74-1.89(m, 1.4H), 1.43-1.72(m, 3H), 1.16-1.40(m, 3.6H), 1.00-1.06(m, 4H), 0.97(d, J = 6.7 Hz, 2H); MS(ESI): m/z 739.2 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴4 . DMF(0.5 mL) 중에 13(16.9 mg, 0.0359 mmol), EZ-Link® NHS-LC-비오틴(17.9 mg, 0.0394 mmol) 및 DIEA(9.3 mg, 12.5 μL, 0.0718 mmol)를 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)를 정제하여 20.8 mg(72%)의 PU-H71- 비오틴4를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.22(s, 1H), 7.52(t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.36(s, 1H), 7.03(s, 1H), 6.66(t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.25(br s, 2H), 6.03(s, 2H), 4.47-4.52(m, 1H), 4.28-4.33(m, 1H), 4.25(t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.17-3.25(m, 4H), 3.11-3.17(m, 1H), 2.90(dd, J = 5.0, 12.9 Hz, 1H), 2.63-2.79(m, 1H), 2.24(t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.13-2.19(m, 2H), 1.94-2.02(m, 2H), 1.58-1.74(m, 6H), 1.48-1.56(m, 2H), 1.31-1.46(m, 4H); MS(ESI): m/z 810.3 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴7 . DMF(0.5 mL) 중에 2(15 mg, 0.0292 mmol), EZ-Link® NHS-LC-비오틴(14.6 mg, 0.0321 mmol) 및 DIEA(7.5 mg, 10.2 μL, 0.0584 mmol)를 6시간 동안 35 ℃에서 가열하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성 혼합물을 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)를 정제하여 10.3 mg(41%)의 PU-H71- 비오틴7을 수득하였다. 추가로, 6.9 mg의 비처리된 2를 회수하여 77%의 실제 수율을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3, 2 로타머) δ 8.26-8.29(m, 1H), 7.29(s, 0.4H), 7.28(s, 0.6H), 6.87(s, 0.4H), 6.85(s, 0.6H), 6.76(br s, 0.4H), 6.74(br s, 0.6H), 6.51-6.63(br s, 2H), 5.96-6.00(m, 2H), 5.68(br s, 0.4H), 5.58(br s, 0.6H), 4.56-4.64(m, 0.4H), 4.45-4.52(m, 1H), 4.28-4.36(m, 1H), 4.20-4.27(m, 2H), 4.01-4.09(m, 0.6H), 3.08-3.32(m, 5H), 2.86-2.94(m, 1H), 2.69-2.76(m, 1H), 2.31-2.37(m, 1H), 1.96-2.22(m, 4H), 1.89-1.96(m, 1H), 1.30-1.80(m, 12H), 1.10-1.16(m, 4H), 1.04-1.09(m, 2H); MS(ESI): m/z 852.3 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴5 . DMF(0.5 mL) 중에 13(16.6 mg, 0.0352 mmol), EZ-Link® NHS-LC-LC-비오틴(22.0 mg, 0.0387 mmol) 및 DIEA(9.1 mg, 12.3 μL, 0.0704 mmol)를 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 27.8 mg(86%)의 PU-H71- 비오틴5를 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ) δ 8.12(s, 1H), 7.60(m, 1H), 7.30(s, 1H), 7.09(m, 1H), 6.98(s, 1H), 5.97(s, 2H), 4.38-4.44(m, 1H), 4.20-4.24(m, 1H), 4.17(t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.04-3.18(m, 7H), 2.83(dd, J = 5.0, 12.9 Hz, 1H), 2.64(d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.16(t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.03-2.12(m, 4H), 1.88-1.96(m, 2H), 1.18-1.66(m, 18H); MS(ESI): m/z 923.4 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴8 . DMF(0.5 mL) 중에 2(15 mg, 0.0292 mmol), EZ-Link®NHS-LC-LC-비오틴(18.2 mg, 0.0321 mmol) 및 DIEA(7.5 mg, 10.2 μL, 0.0584 mmol)를 6시간 동안 35 ℃에서 가열하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 8.2 mg(29%)의 PU-H71- 비오틴8을 수득하였다. 추가적으로, 9.6 mg의 비처리된 2를 회수하여, 81%의 실제 수율을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 , 2 로타머) δ 8.18(s, 0.4H), 8.16(s, 0.6H), 7.31(s, 1H), 6.98(s, 0.6H), 6.95(s, 0.4H), 6.80-6.90(m, 2H), 5.98(s, 2H), 4.47-4.55(m, 0.4H), 4.41-4.47(m, 1H), 4.23-4.27(m, 1H), 4.16-4.22(m, 2H), 3.95-4.03(m, 0.6H), 3.31-3.34(m, 0.6H), 3.19-3.24(m, 1.4H), 3.07-3.17(m, 5H), 2.82-2.89(m, 1H), 2.64-2.70(m, 1H), 2.25-2.32(m, 1H), 1.94-2.16(m, 7H), 1.18-1.70(m, 18H), 1.09(d, J = 6.7 Hz, 4H), 1.03(d, J = 6.8 Hz, 2H); MS(ESI): m/z 965.5 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴6 . DMF(0.5 mL) 중에 13(17.6 mg, 0.0374 mmol), EZ-Link®NHS-PEG4-비오틴(24.2 mg, 0.0411 mmol) 및 DIEA(9.7 mg, 13 μL, 0.0704 mmol)를 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 31.0 mg(88%)의 PU-H71- 비오틴6을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3) δ 8.29(s, 1H), 7.51(t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.32(s, 1H), 7.03(t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.90(s, 1H), 6.79(s, 1H), 6.57(br s, 2H), 6.01(s, 2H), 5.97(s, 1H), 4.48-4.53(m, 1H), 4.25-4.35(m, 3H), 3.79(t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.59-3.68(m, 12H), 3.57(t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.40-3.46(m, 2H), 3.18-3.24(m, 2H), 3.12-3.18(m, 1H), 2.90(dd, J = 5.0, 12.8 Hz, 1H), 2.75(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.54(t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.20(t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.40-2.01(m, 2H), 1.59-1.79(m, 4H), 1.38-1.48(m, 2H); MS(ESI): m/z 944.4 [M+H]+.
PU-H71- 비오틴9 . DMF(0.5 mL) 중에 2(15 mg, 0.0292 mmol), EZ-Link®NHS-PEG4-비오틴(18.9 mg, 0.0321 mmol) 및 DIEA(7.5 mg, 10.2 μL, 0.0584 mmol)를 6시간 동안 35 ℃에서 가열하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 생성된 잔사를 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 10:1)로 정제하여 9.3 mg(32%)의 PU-H71- 비오틴9를 수득하였다. 추가로, 9.0 mg의 비처리된 2를 회수하여 81%의 실제 수율을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 , 2 로타머) δ 8.18(s, 0.4H), 8.16(s, 0.6H), 7.30-7.32(m, 1H), 6.98(s, 0.6H), 6.96(s, 0.4H), 5.98(s, 2H), 4.49-4.56(m, 0.4H), 4.39-4.46(m, 1H), 4.22-4.27(m, 1H), 4.15-4.21(m, 2H), 3.99-4.07(m, 0.6H), 3.66-3.71(m, 2H), 3.51-3.61(m, 12H), 3.45-3.50(m, 2H), 3.29-3.38(m, 2H), 3.16-3.25(m, 2H), 3.07-3.12(m, 1H), 2.81-2.88(m, 1H), 2.63-2.68(m, 1H), 2.57-2.63(m, 1.2H), 2.41-2.47(m, 0.8H), 1.98-2.18(m, 4H), 1.52-1.70(m, 4H), 1.32-1.41(m, 2H), 1.08(d, J = 6.7 Hz, 4H), 1.02(d, J = 6.8 Hz, 2H); MS(ESI): m/z 986.5 [M+H]+.
PU-H71-비오틴. DMF(0.2 mL) 중에 6(4.2 mg, 0.0086 mmol) 및 EZ-Link®아민-PEO3-비오틴(5.4 mg, 0.0129 mmol)을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 잔사를 크로마토그래프(CHCl3:MeOH-NH3(7N), 5:1)하여 1.1 mg(16%)의 PU-H71-비오틴을 수득하였다. 1H NMR(CDCl3) δ 8.30(s, 1H), 8.10(s, 1H), 7.31(s, 1H), 6.87(s, 1H), 6.73(br s, 1H), 6.36(br s, 1H), 6.16(br s, 2H), 6.00(s, 2H), 4.52(m, 1H), 4.28-4.37(m, 3H), 3.58-3.77(m, 10H), 3.55(m, 2H), 3.43(m, 2H), 3.16(m, 1H), 2.92(m, 1H), 2.80(m, 2H), 2.72(m, 1H), 2.66(m, 2H), 2.17(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.04(m, 2H), 1.35-1.80(m, 6H); MS(ESI): m/z 872.2 [M+H]+/
6.1.3. ANCA-표지된 화합물의 합성
N-(3-(6-아미노-8-((6- 아이오도벤조[d][1,3]디옥솔 -5-일) 티오 )-9H-퓨린-9-일)프로필)-2-시아노아세트아미드(화합물 26)의 합성(반응식 17). CH2Cl2(4 mL) 중에 화합물 13 1(120.3 mg, 0.256 mmol)에 시아노아세트산(26 mg, 0.307 mmol) 및 DCC(63 mg, 0.307 mmol)를 첨가하고, 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 감압하에 농축하고, 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 100:1 내지 50:1)로 정제하여 131 mg(95%)의 화합물 26을 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, CDCl3/MeOH-d 4 ): δ8.25(s, 1H), 7.40(s, 1H), 7.08(s, 1H), 6.07(s, 2H), 4.27(t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.57(s, 2H), 3.27(t, J = 5.1 Hz, 2H), 1.98-2.06(m, 2H); MS(m/z): [M+H]+ 538.0.
PU- ANCA (화합물 28(반응식 17)의 합성. DMF(1 mL) 중에 화합물 326(44 mg, 0.0825 mmol)에 27(19 mg, 0.075 mmol) 및 피페리딘(10 μL)을 첨가하고 24시간 동안 70 ℃에서 가열하였다. 반응 혼합물은 농축하고, 예비 TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N), 12.5:1)로 정제하여 주황색 고체로서 24.3 mg(42%)의 화합물 28을 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, DMF-d 7 ): δ 8.73(t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.38(d, J = 1.1 Hz, 1H), 8.36(s, 1H), 8.29(s, 1H), 8.18(dd, J = 8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.95(d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.92(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.56(dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 1H), 7.52(br s, 2H), 7.49(s, 1H), 7.34(d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.95(s, 1H), 6.16(s, 2H), 4.40(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.44-3.47(m, 4H), 3.38-3.43(m, 2H), 2.53-2.58(m, 4H), 2.30(s, 3H), 2.09-2.15(m, 2H); 13C NMR(150 MHz, DMF-d 7 ): δ 161.5, 156.0, 153.5, 151.7, 151.5, 151.2, 149.5, 148.8, 144.4, 137.2, 133.6, 130.3, 129.2, 127.4, 127.0, 126.5, 125.2, 120.1, 119.3, 118.9, 117.4, 111.0, 108.5, 103.0, 102.9, 89.4, 54.9, 47.9, 45.6, 41.3, 40.5, 37.2; HRMS(ESI) m/z [M+H]+ C34H33IN9O3S 에 대한 계산치, 774.1472; 실측치 774.1473.
6.1.4. 방사선표지된 화합물의 합성
PU-H71, PU-HZ151 및 PU-DZ13의 모 화합물을 방사성요오드화(즉. Sn-전구체)를 위해 적합한 것으로서 합성하였다. 방사성요오드화를 위해, 합성은 반응식 19에서 나타낸 반응을 따른다. 요약하면, PU-화합물을 메탄올(25 ㎍ PU-H71 및 PU-HZ151; 15 ㎍ PU-DZ13)중에 용매화하고, NaI(5-10 μL)(이미징을 위해 [124I] 동위원소, 생물분류를 위해 [131I])를 첨가한 후, 산성 배지(아세트산 중 2 mg/mL) 중에 클로로아민 T(CT, 10 μL, 10 분)으로 산화시켰다. 온(hot)(방사선표지된) 화합물을 각각의 화합물에 대해 산성 조건하(예. 트리플루로아세트산(TFA), 하이드로클론산 HCl))에서 제거되는 아민 보호성기 BOC(tert-부틸옥시카르보닐)를 이용해 합성하고, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용해 정제하였다. PU-DZ13 및 PU-HZ151 전구체를 15 μL 메탄올(MeOH)을 사용해 방사선표지하여 용매화하고, 방사선표지의 첨가후 CT 중에 실온(RT)에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 그 이후에 50 μL의 TFA를 첨가하고, 70℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PU-H71 전구체는 방사선표지의 첨가직후, 20 μL MeOH 및 15 μL CT를 이용해 방사선표지하였고, 이 시점 후 용액을 5분 동안 50℃에서 가열한 후, 2분 동안 냉각되게 두었다. 그 후에, 10 μL의 메티오닌 메틸 에스테르(H2O 중에 0.5 g/mL로부터 만들어진) 및 10 μL 농축된 HCl를 첨가한 후 50 ℃(1시간)에서 인큐베이션시켰다. 방사선표지된 생성물을 수집하고, 용매를 회전증발기를 사용해, 감압하에 제거하였다. [124I]-PU-H71의 특이적 활성은 ~1000 mCi/μmol이었고, 이는 이 분류의 [124I] 화합물을 이용한 본 발명자들의 이전 실험과 긴밀히 연관되었다. 생체내 투여의 경우, [124I]-PU-화합물은 멸균된 0.9% 염수 용액 중에서 만들었다.
6.2. 암 세포에서 HSP90의 역할 평가
본 항목에 기술된 방법은 항목 5.1에 개시내용에 관한 것이다.
세포주 및 일차 세포: CML 세포주 K562, 카수미-4, MEG-01 및 KU182, 삼중-음성 유방암 세포주 MDA-MB-468, HER2+ 유방암 세포주 SKBr3, 흑색종 세포주 SK-Mel-28, 전립선암 세포주 LNCaP 및 DU145, 췌장암 세포주 Mia-PaCa-2, 결장 섬유아세포, CCCD18Co 세포주는 American Type Culture Collection로부터 입수하였다. CML 세포주 KCL-22는 Japanese Collection of Research Bioresources로부터 입수하였다. NIH-3T3 섬유아세포는 이전 기술된 바와 같이 형질감염시켰다65. 세포는 DMEM/F12(MDA-MB-468, SKBr3 및 Mia-PaCa-2), RPMI(K562, SK-Mel-28, LNCaP, DU145 및 NIH-3T3) 또는 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 MEM(CCD18Co) 중에 배양하였다. 카수미-4 세포는 20% FBS로 보충된 IMDM, 10 ng/ml 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 1 x Pen/Strep 중에 유지시켰다. PBL(인간 말초 혈액 백혈구)(n=3) 및 제대혈(n=5)은 New York Blood Center로부터 구입한 환자 혈액으로부터 얻었다. 35 ㎖의 세포 현탁액은 15 ㎖의 Ficoll-Paque 플러스(GE Healthcare)에 걸쳐 층을 만들었다. 샘플은 4 ℃에서 40분 동안 2,000 rpm으로 원심분리하고, 백혈구 인터페이스를 수집하였다. 세포는 10% FBS로 보충된 RPMI 배지 중에 플레이팅하고 지시된 바와 같이 사용하였다. 일차 인간 만성 및 급성 전환기 CML 및 AML 세포는 사전 동의와 함께 얻었다. 표본의 조작 및 분석은 University of Rochester, Weill Cornell Medical College 및 University of Pennsylvania Institutional Review Boards로부터 승인받았다. 단핵 세포는 Ficoll-Plaque(Pharmacia Biotech, Piscataway, NY) 밀도 구배 분리를 사용해 분리하였다. 세포는 이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco medium(IMDM)), 40% 소 태아 혈청(FBS), 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)로 구성된 동결배지 또는 CryoStorTM CS-10(Biolife) 중에 동결보존하였다. 배양하는 동안, 세포는 37℃에서 5% CO2의 가습 대기 중에 보존하였다.
화학 및 면역-침강을 위한 세포 용해: 세포를 1 ㎍/μL의 프로테아제 억제제(류펩틴 및 아프로티닌)가 함께 첨가된, Felts 완충액(HEPES 20mM, KCl 50mM, MgCl2 5mM, NP40 0.01%, 신선하게 제조된 Na2MoO4 20mM, pH 7.2-7.3) 중에 수집하여 용해한 후, 3회 연속 동결(드라이아이스 중에) 및 해동 단계를 수행하였다. 총 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 BCA 키트(Pierce)를 사용해 측정하였다.
면역침강 : Hsp90 항체(H9010) 또는 정상 IgG(Santa Cruz Biotechnology)는 40 μL의 단백질 G 아가로스 비드(Upstate)를 포함하는 지시된 양의 세포 용해물에 10 μL 부피로 첨가하고, 혼합물을 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 비드는 Felts 용해 버퍼로 5회 세척하고, SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 표준 웨스턴 블랏 절차를 수행하였다.
화학 침강: 아가로스 비드에 접합된 HSP90 불활성 화학(에탄올아민)을 함유하는 HSP90 억제제 비드 또는 제어 비드를 용해 완충액 중에 3회 세척하였다. 달리 지시되지 않는 한, 비드 접합체(80 μL )는 그후 지시된 양의 세포 용해물(120-500 ㎍)과 함께 4℃에서 인큐베이션시키고, 용해 완충액으로 부피를 200 μL로 조정하였다. 인큐베이션 후, 비드 접합체를 용해 완충액으로 5회 세척하고, 풀-다운(pull-down) 내의 단백질은 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 고갈 연구의 경우, 2-4회 연속적인 화학 침강을 수행한 후, 지시된 경우, 면역침강 단계를 수행하였다.
시약: HSP90 억제제, 고체-지지 고정화 및 플루오레세인-표지된 유도체를 이전 보고된 바와 같이 합성하였다75 -77. 본 발명자들은 LC 연구실로부터 글리벡(Gleeve), Selleck으로부터 AS703026, Tocris로부터 KN-93, 및 Sigma로부터 PP242, BMS-345541 및 바나데이트 나트륨를 구입하였다. 모든 화합물은 DMSO 스톡으로서 사용하였다.
웨스턴 블롯 : 세포를 PU-H71 또는DMSO(비히클)로 24시간 동안 처리하고 50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 류펩틴(Sigma Aldrich) 및 아프로티닌(Sigma Aldrich)으로 보충된 1% NP40 용해 완충액 중에 용해시켰다. 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 BCA 키트(Pierce)를 사용해 측정하였다. 단백질 용해물(15-200 ㎍)을 SDS/PAGE에 의해 전기적으로 분해하고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고, 하기: HSP90(1:2000, SMC-107A/B; StressMarq), Bcr-Abl(1:75, 554148; BD Pharmingen), PI3K(1:1000, 06-195; Upstate), mTOR(1:200, Sc-1549; Santa Cruz), p-mTOR(1:1000, 2971; Cell Signaling), STAT3(1:1000, 9132; Cell Signaling), p-STAT3(1:2000, 9145; Cell Signaling), STAT5(1:500, Sc-835; Santa Cruz), p-STAT5(1:1000, 9351; Cell Signaling), RICTOR(1:2000, NB100-611; Novus Biologicals), RAPTOR(1:1000, 2280; Cell Signaling), P90RSK(1:1000, 9347; Cell Signaling), Raf-1( 1:300, Sc-133; Santa Cruz), CARM1(1:1000, 09-818; Millipore), CRKL(1:200, Sc-319; Santa Cruz), GRB2(1:1000, 3972; Cell Signaling), FAK(1:1000, Sc-1688; Santa Cruz), BTK(1:1000, 3533; Cell Signaling), A-Raf(1:1000, 4432; Cell Signaling), PRKD2(1:200, sc-100415, Santa Cruz), HCK(1:500, 06-833; Milipore), p-HCK(1:500, ab52203; Abcam) 및 β-액틴(1:2000, A1978; Sigma)에 대한 일차 항체로 표지하였다. 그후 막을 1:3000 희석의 상응하는 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 검출은 제조자의 지시에 따라 ECL-증강된 화학발광 검출 시스템(Amersham Biosciences)을 사용해 수행하였다.
덴시토미트리 : 겔을 아도브 포토샵 7.0.1로 스캔하고, 정량적 덴시토미드리 분석을 Un-Scan-It 5.1 소프트웨어(Silk Scientific)를 사용해 수행하였다.
방사성동위원소 결합 연구 및 HSP90 정량 연구: 포화 연구는 131I-PU-H71 및 세포(K562, MDA-MB-468, SKBr3, LNCaP, DU-145, MRC-5 및 PBL)를 사용해 수행하였다. 요약하면, 세포의 삼중 샘플을 1 μM 비표지 PU-H71 없이 또는 이와 함께 131I-PU-H7 양을 증가시키면서 혼합하였다. 용액을 오비탈 쉐이커에서 흔들어, 1시간 후 세포가 분리되었고, Brandel 세포 수확기를 사용하여 아주 찬 Tris-완충된 염수로 세척하였다. 모든 분리된 세포 샘플을 계수하고 131I-PU-H71의 특정 흡수를 측정하였다. 이들 데이터를 131I-PU-H71의 농도에 대하여 플로팅하여 포화 결합 곡선을 수득하였다. PU-결합 HSP90, 9.2x107 K562 세포, 6.55x107 KCL-22 세포, 2.55x107 KU182 세포 및 7.8x107 MEG-01 세포의 정량화를 위해, 세포를 용해하여 각각 6382, 3225, 1349 및 3414 ㎍의 총 단백질을 수득하였다. HSP90의 퍼센트를 계산하기 위해, 세포 HSP90 발현을 HeLa 세포(Stressgen#ADI-SPP-770)로부터 정제된 재조합 HSP90의 만들어진 표준 곡선을 사용해 정량화하였다.
펄스-추적. K562 세포를 지시된 바와 같이, PU-H71(5 μM) 없이 또는 이와 함께 Na3VO4(1 mM)로 처리하였다. 세포를 지시된 시간에 수집하고, 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP-40 용해 완충액 중에 용해시킨 후, 웨스턴 블롯 절차에 적용하였다.
트립신 소화: K562 세포를 비히클 또는 PU-H71(50 μM)로 30분 동안 처리하였다. 세포를 수집하고, 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP-40 용해 완충액 중에 용해시켰다. STAT5 단백질을 항-STAT5 항체(Santa Cruz, sc-835)를 사용해 500 ㎍의 총 단백질 용해물로부터 면역침강시켰다. 단백질 G 아가로스 비드에 결합된 단백질 침전물은 트립신 완충액(50 mM Tris pH 8.0, 20 mM CaCl2)으로 세척하고, 33 ng의 트립신을 각각의 샘플에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 인큐베이션시키고 부분표본을 지시된 시간 시점에 수집하였다. 단백질 부분표본을 SDS-PAGE에 적용시키고, STAT5에 대해 블롯팅하였다.
활성화된 STAT5 DNA 결합 분석: STAT5a 및 STAT5b의 DNA-결합 능력을 제조자의 지시에 따라 ELISA-기반 분석(TransAM, Active Motif, Carlsbad, CA)에 의해 평가하였다. 요약하면, 5x106 K562 세포를 PU-H71 1 μM 및 10 μM 또는 대조군으로 24시간 동안 처리하였다. 10 마이크로그램의 세포 용해물을 미리-흡수된 STAT 컨센서스 올리고뉴클레오티드(5'-TTCCCGGAA-3')를 함유하는 웰로 첨가하였다. 대조군 처리된 세포의 경우, 분석은 야생형 또는 돌연변이된 STAT 컨센서스 결합 부위를 함유하는 20 pmol의 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 부재 또는 존재 하에 수행하였다. 인터페론-처리된 HeLa 세포(웰당 5 ㎍)를 분석을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 인큐베이션과 세척 후, 토끼 폴리클론 항-STAT5a 또는 항-STAT5b 항체(1:1000, Active Motif)를 각각의 웰에 첨가하고, 이어서 HPR-항-토끼 이차 항체(1:1000, Active Motif)를 첨가하였다. HRP 기질 첨가 후, 655 nm(Synergy4, Biotek, Winooski, VT)의 참조 파장을 이용해 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 이 분석에서, 흡광도는 샘플에 존재하는 DNA-결합 전사 인자의 양에 직접적으로 비례한다. 실험은 4회반복하였다. 결과는 SEM을 갖는 평균 흡광도 값으로부터 임의 유닛(AU)으로서 표현하였다.
정량적 크로마틴 면역침강(Q-ChIP): Q-ChIP은 이전 기술된 바와 같이 변형하여 만들었다83 . 요약하면, 108 K562 세포를 1%의 포름알데히드로 고정하고, 용해시키고, 초음파처리하였다(Branson sonicator, Branson). STAT5 N20(Santa Cruz) 및 HSP90(Zymed) 항체를 미리-클리어된(pre-cleared) 항체 샘플에 첨가하고, 밤새 4 ℃에서 인큐베이션시켰다. 그후, 단백질-A 또는 G 비드를 첨가하고, 샘플을 비드로부터 용출시키고, 이어서 탈-가교화시켰다. DNA를 PCR 정체 컬럼(Qiagen)을 통해 정제하였다. ChIP 생성물의 정량화는 Fast SYBR Green(Applied Biosystems)을 사용하는 정량적 PCR(Applied Biosystems 7900HT)을 사용해 수행하였다. STAT 결합 부위를 함유하는 표적 유전자는 하기의 프라이머로 검출하였다: CCND2(5-GTTGTTCTGGTCCCTTTAATCG 및 5-ACCTCGCATACCCAGAGA), MYC(5-ATGCGTTGCTGGGTTATTTT 및 5-CAGAGCGTGGGATGTTAGTG) 및 유전자간 조절 영역을 위한(5-CCACCTGAGTCTGCAATGAG 및 5-CAGTCTCCAGCCTTTGTTCC).
실시간 QPCR : RNA는 PU-H71-처리된 세포 및 대조군 K562 세포로부터 제조자의 지시에 따라 RNeasy Plus 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. cDNA는 고성능 RNA-대-cDNA 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 본 발명자들은 하기의 프라이머로 특정 유전자를 증폭하였다: MYC(5-AGAAGAGCATCTTCCGCATC 및 5-CCTTTAAACAGTGCCCAAGC), CCND2(5-TGAGCTGCTGGCTAAGATCA 및 5-ACGGTACTGCTGCAGGCTAT), BCL-XL(5- CTTTTGTGGAACTCTATGGGAACA 및 5-CAGCGGTTGAAGCGTTCCT), MCL1(5-AGACCTTACGACGGGTTGG 및 5-ACATTCCTGATGCCACCTTC), CCND1(5-CCTGTCCTACTACCGCCTCA 및 5-GGCTTCGATCTGCTCCTG), HPRT(5- CGTCTTGCTCGAGATGTGATG 및 5-GCACACAGAGGGCTACAATGTG), GAPDH(5-CGACCACTTTGTCAAGCTCA 및 5-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT), RPL13A(5- TGAGTGAAAGGGAGCCAGAAG 및 5-CAGATGCCCCACTCACAAGA). 전사물 존재도는 Fast SYBR Green 조건(95 ℃에서 20초간 초기 단계, 이어서 95 ℃에서 1초 및 60 ℃에서 20초의 40 사이클)을 사용해 검출하였다. 하우스키핑 유전자(RPL13A)의 CT 값은 관심의 상응하는 유전자(△CT)로부터 감산하였다. 차이의 표준 편자는 CT 값(복제물)의 표준 편차로부터 계산하였다. 그후, PU-H71-처리된 세포의 △CT 값은△△CT 방법을 사용하여 그들 각각의 대조군-처리된 세포에 비례하여 발현하였다. 대조군 처리된 세포에 비례하여 약물로 처리된 세포 내의 각각의 유전자의 배수 발현은 발현:2-△△CT에 의해 결정하였다. 결과는 복제물의 평균의 표준오차를 갖는 배수 발현으로 나타냈다.
HSP70 녹-다운. 형질감염은 제조자의 지시에 따라, 전기천공 및 Nucleofector 용액 V(Amaxa)에 의해 수행하였다. HSP70 녹다운 연구는 HSP70(HSPA1A; 등록번호 NM_005345)의 오픈 리딩 프레임에 대해 이전 보고된 바와 같이 설계된 siRNA를 사용하여 수행하였다84. 음성 대조군 세포는 역 조절 siRNA 서열(HSP70C; Dharmacon RNA technologies)로 형질감염시켰다. 연구를 위해 사용된 HSP70DP 대한 활성 서열은 HSP70A(5'-GGACGAGUUUGAGCACAAG-3') 및 HSP70B(5'-CCAAGCAGACGCAGAUCUU-3')이다. 대조군을 위한 서열은 HSP70C(5'-GGACGAGUUGUAGCACAAG-3')이다. 2 mL 배지(1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI) 중의 3백만개 세포를 제조자의 지시에 따라 0.5 μM siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 6-웰 플레이트에서 유지시키고, 84시간째에 용해시키고, 이어서 표준 웨스턴 블롯 절차를 수행하였다.
키나제 스크린 85 (도 44). 대부분의 분석을 위해, 키나제-태그된 T7 파지 균주를 BL21 균주 유래 대장균 숙주 내의 24-웰 블록에서 동시에 성장시켰다. 대장균을 로그-상까지 성장시키고, 냉동 스톡으로부터의 T7 파지로 감염시키고(감염의 다중도 = 0.4), 용해시까지 (90-150분) 32℃에서 흔들면서 인큐베이션시켰다. 용해물을 원심분리(6,000 x g)시키고, 여과하여(0.2㎛) 세포 잔해를 제거하였다. 잔류 키나제는 HEK-293 세포에서 생산하고, 이어서 qPCR 검출을 위해 DNA로 태그하였다. 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드는 비오틴화 소분자 리간드로 실온에서 30분 동안 처리하여 키나제 분석을 위한 친화성 수지를 생성하였다. 리간드화된 비드는 과량의 비오틴으로 블로킹시키고, 블록킹 완충액(SeaBlock(Pierce), 1% BSA, 0.05 % Tween 20, 1 mM DTT)으로 세척하여 비결합 리간드를 제거하고 비-특이적 파지 결합을 감소시켰다. 결합 반응은 키나제, 리간드화된 친화성 비드, 및 1x 결합 완충액(20 % SeaBlock, 0.17x PBS, 0.05 % Tween 20, 6 mM DTT) 중의 시험 화합물 를 결합함으로써 조성하였다. 시험 화합물을 100% DMSO 중의 40x 스톡으로 제조하고, 분석으로 직접 희석하였다. 모든 반응은 최종부피 중 폴리프로필렌 384-웰 플레이트에서 수행하였다. 분석 플레이트를 1시간 동안 흔들면서 실온에서 인큐베이션시키고 친화성 비드는 세척 완충액(1x PBS, 0.05 % Tween 20)으로 세척하였다. 그후 비드를 용출 완충액(1x PBS, 0.05 % Tween 20, 0.5 ㎛ 비-비오틴화된 친화성 리간드) 중의 재현탁시키고, 30분 동안 흔들면서 실온에서 인큐베이션시켰다. 용출물 중에 키나제 농도는 PCR에 의해 측정하였다. KINOMEscan's 선별도 점수(S)는 화합물 선별의 정량적 척도이다. 이는 화합물에 결합된 키나제의 수를 돌연변이 변이체를 제외한, 시험한 특수한 키나제의 총 수에 의해 나누어 계산하였다. TREEspot TM는 KINOMEscan에 의해 개발된 등록의 데이터 시각화 소프트웨어 장치이다 85. 결합한 것으로 확인된 키나제는 도 44에서 동그라미로 표시하였으며, 더 큰 동그라미는 더 높은 친화성-결합을 나타낸다. 키나제 덴드로그램을 조정하고 Science 및 Cell Signaling Technology, Inc로부터 허가를 받아 재생산하였다.
렌티바이러스 벡터, 렌티바이러스 생산 및 K562 세포 형질도입. CARM1의 shRNA 녹다운의 렌티바이러스 구조체는 Openbiosystem:pLKO.1-shCARM1-KD1(catalog No: RHS3979-9576107) 및 pLKO.1-shCARM1-KD2(catalog No: RHS3979-9576108)의 TRC 렌티바이러스 shRNA 라이브러리로부터 구입하였다. 대조군 shRNA(shRNA 스크램블)은 Addgene 플라스미드 1864였다. GFP는 선별 마커로서 퓨로마이신을 대체하기 위해 클로닝하였다. 렌티바이러스를 이전 기술된 프로토콜을 사용해 생산하였다. 바이러스 상청액을 수집하고, 0.45-㎛ 필터를 통해 여과하고, 농축하였다. K562 세포는 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(Aldrich)의 존재 하에 고-역가 렌티바이러스 농축된 현탁액으로 감염시켰다. 형질도입된 K562 세포는 72시간 형질감염 후, 녹색 형광(GFP)를 위해 분류하였다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR ( qRT -PCT). qRT-PCR를 위해, 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(QIAGEN, Germany)를 사용하여 세포로부터 분리한 후, 무작위 헥사(SuperScript III kit, Invitrogen)와 함께 역-전사에 대해 적용하였다. 실시간 PCR 반응은 ABI 7500 서열 검출 시스템을 사용해 수행하였다. PCR 생성물은 Sybr 녹색 I 화학 또는 TaqMan 방법론(PE Applied Biosystems, Norwalk, CT)를 사용해 검출하였다. 실시간 PCR 분석에 대한 상세설명은 다른 문서에 기술되어 있다. CARM1 qPCR에 대한 프라이머 서열은 TGATGGCCAAGTCTGTCAAG(정방) 및 TGAAAGCAACGTCAAACCAG(역방)이다.
세포 생존력, 아폽토시스 및 증식 분석. CARM1 shRNA로 비형질감염되거나 형질감염된 K562 세포 내의 생존력 평가 또는 스크램블(scramble)을 트리판 블루를 사용하여 수행하였다. 이 발색단은 음성적으로 하전되고 막이 손상되지 않는 한 세포와 상호작용하지 않는다. 그러므로, 염료가 배제된 세포 모두는 생존가능하다. 아폽토시스 분석은 2 μL의 아크리딘 오렌지(100 ㎍/mL), 2 μL의 에티듐 브로마이드(100 ㎍/mL), 및 20 μL의 세포 현탁액을 혼합하여 형광현미경 검사를 사용하여 평가하였다. 최소 200개 세포를 적어도 5개 무작위 필드에서 계수하였다. 살아있는 아폽토시스 세포는 독특한 핵 및 세포질 형광을 기초로 한 세포 형태학에서의 변화를 검사하여 사멸, 아폽토시스, 괴사 및 정상 세포로부터 분화되었다. 생존 세포는 온전한 원형질막(녹색)을 보이는 반면, 사멸 세포는 손상된 원형질막(주황색)을 보인다. 수축, 헤테로크로마틴 축합, 및 핵 탈과립을 포함하는 초미세구조의 형태는 아폽토시스 및 괴사로 붕괴된 세포질 막과 더 일치하였다. 아폽토시스 세포의 비율(아폽토시스 인덱스)는 % 아폽토시스 세포 = 아폽토시스 핵을 갖는 세포의 총 숫자/계수된 세포의 총 숫자) x 100으로서 계산하였다. 증식 분석을 위해, 5 x 103 K562 세포를 96-웰 고체 블랙 플레이트(Corning) 상에 플레이팅하였다. 분석을 제조자(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega)의 지시에 따라 수행하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다. 지시된 경우, Alamar 블루 분석을 사용해 성장 억제 연구를 수행하였다. 이 시약은 세포 배양에서 세포 생존력의 빠르고 객관적인 측정을 제공하고, 생존력의 지표, 지표 염료 레자주린을 사용하여 세포의 대사 능력 세포 생존력을 측정한다. 요약하면, 기하급수적으로 성장하는 세포는 마이크로리터 플레이트(Corning # 3603)에 플레이팅하고, 37℃에서 지신된 시간 동안 인큐베이션시켰다. 지시된 농도에서 약물을 삼중 첨가하고, 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 레자주린(55 μM) was added, 플레이트를 Analyst GT(형광 강도 모드, 여기 530nm, 방출 580nm, 560nm 색선별거울 사용)를 사용해 6시간 후에 판독하였다. 결과는 Softmax Pro 및 the GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 분석하였다. 세포 성장 억제 퍼센트는 처리된 세포 대 대조군 세포로부터 얻은 형광 판독을 비교하여 계산하였다. IC50은 50%까지 세포 성장을 억제하는 약물 농도로서 계산하였다.
mTOR와 HSP90 억제제 사이의 상승효과의 정량적 분석: pp242(mTOR 억제제)와 PU-H71(HSP90 억제제) 사이의 약물 상호작용을 측정하기 위해, Chou-Talalay의 조합 인덱스(CI) 아이소볼로그램 방법을 이전 기술된 바와 같이 사용하였다88 ,89. 질량 작용의 법칙의 중간값-효과 원리에 기반한 이 방법은, 둘 이상의 약물 조합의 경우 상승작용 또는 길항작용을 컴퓨터화된 시뮬레이션에 의해 각각의 약물의 기전에 상관없이, 정량화한다. 알고리즘을 기초로 하여, 컴퓨터 소프트웨어는 중간값-효과 플롯, 조합 인덱스 플롯 및 정규화된 아이소볼로그램(2개 약물의 비 상수 비율 조합(non constant ratio combination)이 사용되는 경우)을 보여준다. PU-H71(0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.0125 μM) 및 pp242(0.5, 0.125, 0.03125, 0.0008, 0.002, 0.001 μM)를 언급된 농도에서 단일 제제로서 또는 비 상수 비율(PU-H71: pp242; 1:1, 1:2, 1:4, 1:7.8, 1:15.6, 1:12.5)에서 조합하여 사용하였다. Fa(분획 사멸된 세포)는 공식 Fa=1-Fu를 사용하여 계산하였고; Fu는 영향받지 않은 세포의 분획이며 컴퓨터 소프트웨어(CompuSyn, Paramus,New Jersey, USA)를 사용하는 용량 효과 분석을 위해 사용하였다.
6.3. 세포 분석에서 형광 표지된 프로브
6.3.1. 형광-PU-H71 결합의 유동 세포계수법 분석
인간 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주 MOLM-13 및 MV4-11 세포를 Dr. Stephen D. Nimer 박사, MSKCC로부터 받아서, 37℃ 5% CO2 습한 공기에서 10% 소태아혈청(FBS) 및 1×Pen/Strep이 보충된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포를 5×105 세포/mL에서 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 4 시간동안 지정된 파생물(1 μM)로 처리하였다. 생존 세포에서 HSP90 결합의 검출을 위해, 세포를 FACS 완충제 (PBS, 0.05% FBS)로 두 번 세정하고, 분석 전에 실온에서 FACS 완충제에서 DAPI (Invitrogen) 1μg/ml로 염색했다. PU-H71-형광 파생 결합을 나타내는 생존 세포(DAPI 네거티브)의 형광 강도를 유동 세포계수법(LSR-II, BD Biosciences)으로 캡쳐하고, FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR)로 분석하였다. 고정 세포에서의 HSP90 결합 측정을 위해, 세포를 BD Cytofix 완충제 (BD, Biosciences, San Jose, CA)로 세정하고 30 분 동안 고정시킨 후 BD Perm 완충제 III (BD Biosciences, San Jose, CA)로 아이스 상에서 30 분 동안 투과시켰다. 완료된 세포 투과도를 DAPI로 측정하였다. 세포를 상기 기재된 바와 같이 유동 세포계수법으로 분석하였다. 경쟁 테스트를 위해, 2×106 세포/ml의 일차 AML 샘플을 4 시간 동안 접합되지 않은 PU-H71 1μM로 처리하고, 1 시간 동안 PU-H71-FITC2 1 μM로 처리하였다. 세포를 수집하고, 두 번 세정하고, 4 ℃에서 30 분 동안 배양된 정상 림프구와 배아(blasts)를 구별하기 위해 CD45를 위해 염색하고, 세정하고, FACS 완충제에서 7-AAD로 염색하고 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.
6.3.2. 유동 세포계수법. CD34 분리
제조업자의 지시(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)에 따라 CD34 MicroBead Kit 및 자동 자성 세포 분류기 autoMACS를 사용하여 CD34+ 세포 분리를 수행하였다. 생존력 분석-CML 세포주를 5×105 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, 지정된 용량의 PU-H71로 처리하였다. 세포를 24 시간 마다 수집하고, Annexin V 완충제 (10 mM HEPES/NaOH, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl2)에서 Annexin V-V450 (BD Biosciences) 및 7-AAD (Invitrogen)로 염색하였다. 유동 세포계수법(BD Biosciences)으로 세포 생존력을 분석하였다. 환자 샘플을 위해, 일차 배아 크리아시스 CML 세포를 2×106 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, 최고 96 시간 동안 지정된 용량의 PU-H71로 처리하였다. 세포를 30 분 동안 4 ℃에서 FACS 완충제 (PBS, 0.05% FBS)에서 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체 (BD Biosciences)로 염색한 후 Annexin V/7-AAD 염색을 하였다. PU-H71 결합 분석 CML 세포주를 5×105 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, PU-H71-FITC 1μM로 처리하였다. 처리 4 시간 후, 세포를 FACS 완충제로 두 번 세정하였다. 생존 세포에서 PU-H71-FITC 결합을 측정하기 위해, 세포를 10분 동안 실온에서 FACS 완충제에서 7-AAD로 염색하고, 유동 세포계수법(BD Biosciences)으로 분석하였다. PU-H71-FITC 처리 48 시간 후 및 96 시간 후에, 세포를 Annexin V 완충제에서 Annexin V-V450 (BD Biosciences) 및 7-AAD로 염색하고, AnnexinV/7AAD 이중 음성 통문에 의해 생존력을 측정하기 위해 유동 세포계수법에 넣었다. 백혈병 환자 샘플과 PU-H71-FITC의 결합을 측정하기 위해, 일차 bp 또는 cpCML 세포를 2×106 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, PU-H71-FITC 1μM로 처리하였다. 처리 24 시간 후에, 세포를 30 분 동안 4 ℃에서 FACS 완충제에서 CD34-APC(또는 CD38-PECy7, CD38-PE-CY7 (또는 CD38-PE) CD45-APC-H7 항체로 염색한 후 7-AAD 염색을 하였다. 처리 48 시간 및 96 시간 후에, 배아, 림프구 및 CD34+세포군에서 세포 생존력을 측정하기 위해, 세포를 CD34-APC (또는 CD34-PECy7), CD38-PE-CY7 (또는 CD38-PE) 및 CD45-APC-H7 항체로 염색한 후 Annexin V-V450 및 7-AAD 염색하였다. 경쟁 시험을 위해, 5x105 세포/ml의 CML 세포주 또는 2x106 세포/ml의 일차 CML 샘플을 4 시간 동안 비접합 PU-H71 1μM로 처리한 후 1 시간 동안 1μM PU-H71-FITC 로 처리하였다. 세포를 수집하여 두 번 세정한 후 FACS 완충제에서 7-AAD 염색하고 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. HSP90 -염색 세포를 30 분 동안 4 ℃에서 고정 완충제(BD Biosciences) 로 고정하고 30 분 동안 얼음 상에서 Perm Buffer III (BD Biosciences)에 투과시켰다. 세포를 항-HSP90 피코에리트린 접합(PE) (F-8 clone, Santa Cruz Biotechnologies; CA) 로 염색하였다. 세포를 세정한 후 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 정상 마우스 IgG2a-PE 를 이소타입 대조군로 사용하였다.
6.3.3. PU-H71-FITC2 (9) 결합의 형광 현미경 분석
MV4-11 세포를 5 x 105 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고 1 μM PU-H71-FITC2 또는 PU-H71-NBD1로 처리하였다. 처리 24 시간 후에, 세포를 실온에서 30분 동안 3% BSA/FACS 완충제로 블로킹하고 실온에서 30분 동안 3% BSA/FACS 완충제 중 Na+/K+-ATPase α1 항체 (Novus Biologicals)로 배양하였다. 세포를 FACS 완충제로 세 번 세정하고 실온에서 20분 동안 3% BSA/FACS 완충제 중 염소 항-래빗 Alexa Fluor 568 (Invitrogen)로 배양하였다. 세포를 FACS 완충제로 세 번 세정하고 10분 동안 FACS 완충제 중 1 μg/ml DAPI로 배양하고 고체 상에 마운팅하고 공초점 현미경(Zeiss) 하에 관찰하였다.
웨스턴 블롯 : 세포를 24 시간 동안 형광 PU-H71 파생물, TEG-FITC 또는 DMSO (vehicle)로 처리하고 류펩틴(Sigma Aldrich) 및 아프로티닌(Sigma Aldrich)으로 보충된 50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP40 라이시스 완충제에서 용해시켰다. BCA 키트 (Pierce)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 용해물(50 μg)을 SDS/PAGE로 전기영동 분석하고 니트로 섬유소막으로 옮기고 하기의 일차 항체로 탐침하였다: Raf-1 (1:300, Sc-133; Santa Cruz), FLT3 (1:1000, sc-480; Santa Cruz) 및 β-actin (1:2000, A1978; Sigma). 이후 상기 막을 상응하는 겨자무과 산화효소 접합 이차 항체의 1:3000 희석액으로 배양하였다. ECL-Enhanced Chemiluminescence Detection System (Amersham Biosciences)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 검출을 수행하였다.
6.3.4. 종양 줄기 세포 분석
PU-H71 결합 분석 - 일차 샘플을 2x106 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고 1 μM PU-H71-FITC2 또는 TEG-FITC 로 처리하였다. 처리 4 시간 후에, 세포를 FACS 완충제(PBS, 0.05% FBS)로 한 번 세정하고 실온에서 30분 동안 4℃에서 FACS 완충제 (PBS + 0.5% FBS) 중 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체 (BD Biosciences)로 염색한 후 7-AAD (Invitrogen)로 염색하였다. 결합 PU-H71-FITC2 의 MFI를 BD-LSR II 유동 세포계수법에서 측정하고 TEG-FITC로 정규화하였다. 림프구(CD45hi vs SSC gate)와 비교하여 LSCs (CD45dim, CD34+, CD38- gate) 중 PUH71-FITC의 결합비를 값으로 나타내었다.
줄기 세포 생존력 분석 - 일차 샘플을 2x106 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고 48시간 동안 1 μM PU-H71로 처리하였다. 세포를 30분 동안 4 ℃ FACS 완충제 (PBS, 0.05% FBS) 중 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체 (BD Biosciences)로 염색하고 Annexin V 완충제 (10 mM HEPES/NaOH, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl2) 중 Annexin V-V450 (BD Biosciences) 및 7-AAD로 염색하였다. 세포 생존력을 비처리 세포로 정규화된 아넥신 V-/7AAD-세포의 백분율로서 측정하였다.
통계 분석 - 달리 지시된 바가 없다면, GraphPad Prism (version 4; GraphPad Software)에서 실행된 것과 같이 비쌍 2-꼬리 t 테스트에 의해 데이터를 분석하였다. 0.05 미만의 P 값을 구체적으로 고려하였다. 달리 언급된 바가 없다면, 이중 또는 삼중 복제물의 평균±D 또는 평균±EM으로 데이터를 나타내었다. 에러 막대는 평균의 SD 또는 SEM을 나타낸다. 만약 단일 패널이 있다면, 데이터는 2 또는 3의 개별 실험의 대표값을 나타낸다.
6.3.5. 일차 백혈병 샘플 및 백혈병 및 고형암 세포주에서의 PU- FITC 결합의 측정
공정 : 백혈병 환자의 말초혈액(PB) 또는 골수(BM) 단핵 세포를 생존 가능하도록 동결된 엘리쿼트로부터 또는 Ficoll 밀도 경사를 사용한 새로운 샘플로부터 분리한다. 세포를 1μM PU-FITC 로 처리하고 처리 4 시간 후 세포를 세정하고 상이한 소집단( 배아(CD45 dim vs SSC gate) 및 림프구(CD45hi vs. SSC gate)를 동정하기 위한 CD45-APC-H7) 을 구별하기 위해 항체로 염색하고 사멸 세포를 식별하기 위해 7-AAD 염색 하였다. BD LSR-II 기구를 사용하여 PU-FITC 결합을 평가한다. 상기 기구는 실험 전에 CST 비드를 사용하여 세팅한다. 상업적으로 입수할 수 있는 상이한 형광 강도로 표지된 비드(Quantum Alexa Fluor 488 키트)를 사용한 교정 곡선이 PU-FITC 결합의 AF488/FITC 형광 강도 정량화를 위해 사용된다. 각각의 환자 샘플의 PU-FITC 백그라운드 결합을 측정하기 위해 림프구 결합을 이용한다. 림프구와 비교하여 배아의 평균 형광 강도(MFI)의 폴드 차이로서 PU-FITC 결합을 평가한다. 비-특이적 결합을 측정하기 위해 비-특이적 대조군(TEG-FITC) 를 사용한다. 본 발명자들은 적어도 100 일차 백혈병 샘플을 평가할 것을 제안한다. 각 분석을 위해 본 발명자들은 최소 900,000 총 단핵 세포를 사용한다. 본 발명자들은 분석을 위해 적어도 50,000 사건을 수집한다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행한다. 상업적으로 구할 수 있는 세포주(림프종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 췌장암 및 폐암 세포주)의 넓은 패널 상의 PU-FITC 결합이 평가될 수 있다. 세포주는 고유의 내부 대조군가 없기 때문에, 본 발명자들은 상기에서 기재된 바와 같이 HL-60 세포로의 결합 또는 PU-FITC에서 제외된 TEG-FITC의 계산된 데이터 MFI(형광 비드로 수행된 교정 곡선을 이용하여 정량화 됨)를 이용한다.
Hsp90 억제제에 대한 감수성 평가 : PU-FITC 결합에 대한 모든 샘플의 감수성을 측정하기 위해, 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 PU-H71의 증가량으로 처리한다. 충분한 물질을 구할 수 있는 세포주 및 일차 샘플의 선택 아단위에서, 기타 화학적으로 구별되는 Hsp90i (17-AAG, NVP-AUY922 및 STA9090 또는 임상 측정의 기타 Hsp90i) (5)에 대한 감수성을 또한 시험한다. 세포를 48시간 후에 수집하고 (일차 세포에 대한) 배아 및 정상 림프구를 구별하기 위해 CD45-APC-H7로 염색한다. 이후 세포를 세정하고 Annexin V 완충제 (10 mM HEPES/NaOH, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl2) 중 Annexin V-V450 및 7-AAD로 염색한다. 세포 생존력을 유동 세포계수법에 의해 분석한다.
통계학적 고찰 : 일차 목표는 폴드 PU 결합에 대한 분석을 평가하여 Hsp90i 반응 대 비반응을 최적으로 구별하는 것이다. 이러한 실험은 일차 샘플 및 세포주를 포함한 150 샘플을 사용하여 생체외에서 수행한다. 만약 50% 이상의 세포가 생존한다면 반응이 분명히 나타난다. 리시버 작동 특정(ROC) 곡선 하 부분은 반응 대 비반응을 구별할 수 있는 폴드 PU 결합의 가능성을 평가하기 위해 고려된다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자들은 .87 또는 그 이상(.75의 널(null) AUC에 비교하여)을, 폴드 PU 결합이 Hsp90i 반응을 비반응으로부터 구별할 수 있다는 것을 나타내는 것으로 정의한다. 본 발명자들은, 150 샘플 및 30% 반응비를 가정하여, 5%의 유형 I 에러로 .75에서 .89까지의 AUC에서의 상이점을 측정할 수 있는 80%의 능력을 가질 것이다.
6.3.6. pgp 억제제의 존재 또는 부재 하의 생존 종양 세포주에서의 PU- FITC 결합의 측정
부착 암 세포주를 플레이팅하고 37oC, 5% CO2에서 밤새 부착되도록 한다. 세포를 2시간 동안 pgp 억제제 (PSC 833, Tocris Biosciences 또는 Reversan, Tocris Biosciences) 또는 DMSO 비히클로 미리 처리(5uM)하고 1uM의 DMSO, PU-FITC9 (네거티브 PU-FITC 대조군) 및 PU-FITC2 (FITC로 표지된 PU-H71 약물)를 포함하는 배지에 첨가한다. 37oC, 5% CO2에서 추가로 4시간 동안 FITC 약물 또는 대조군 컨쥬게이츠로 배양한다. 이후 세포를 트립신화하고 1XFACS 완충제 (1XPBS+0.5% FBS)로 두번 세정하고 세포 생존 염료(1μg/ml DAPI)를 포함하는 1X FACS 완충제 500ul에 펠렛 재현탁한다. 샘플을 BD LSRII 유동 세포계수법에 적용하여 10-20,000 사건을 수집한다. 각각의 실험 작동 전에, CST 비드 (BD Biosciences)로 LSRII 상에서 레이저를 정규화한다. FITC 평균 형광 강도(MFI)를 측정함으로써, 종양 세포의 PU-FITC 결합을 DAPI-ve 생존 세포에서 측정한다. FITC9 및 DMSO 대조군의 비-특이적 FITC 신호를 PU-FITC 신호에서 배제한다.
6.3.7 종양 세포의 분리 및 종양 세포의 순환
종양 세포의 분리 및 PU- FITC 결합의 측정- 마우스로부터 수득한 EGFR+ 종양을 제조자의 프로토콜(tissue dissociation kit, Millipore)에 따라 분리한다. 간략하면, 새로운 조직 1 g을 메스를 이용하여 작은 조각(예를 들어, 조직 g 당 ~10-20 조각)으로 자른다. 상기의 작은 조직을 PBS에서 두번 세정하고 37℃ 에서 50분 동안 서서히 교반하면서 분리된 용액에 옮긴다. 분리 후에, 상기 세포를 세정하고 체(sieve)를 이용하여 염색한 후 비-분리 조직 단편은 버린다. 상기의 분리된 조직을 프로테아제 억제제를 함유하는 1X 분리 완충제가 포함된 새로운 튜브에 옮긴다. 세포를 프로테아제 억제제를 포함하는 분리 완충제에서 두번 세정한다. 세포를 배지에서 1 x 106 세포/ml로 재현탁한다. 샘플을 3 튜브로 동일하게 분리하고 37oC, 5% CO2 4시간 동안 DMSO 1μM(1 x 106 세포/ml), PU-FITC9 (네거티브 FITC 대조군) 및 PU-FITC2 (FITC로 표지된 PU-H71 약물)로 처리한다. 혈액 은행으로부터 수득한 녹힌 PBMC's와 섞인 대조군 EGFR+ 세포주 [AspcI (낮은 결합); BxPc3 (높은 결합)]를 상기 기재와 같이 분리된 종양 세포와 동시에 염색한다. 세포를 1XFACS 완충제(1XPBS, 0.05% FBS)로 두 번 세정하고 30분 동안 얼음 상에서 항-인간 EGFR-PE (BD Biosciences), 항-인간 CD14-APC-Cy7 (ebiosciences) 또는 CD14- PE-Texas Red (invitrogen) 및 항-인간 CD45-APC (ebiosciences)로 염색한다. 이후 세포를 1XFACS 완충제(1XPBS, 0.05% FBS)로 두 번 세정하고 세포 생존 염료(1μg/ml DAPI)를 포함하는 1X FACS 완충제 500ul에 펠렛 재현탁한다. 샘플을 BD LSRII 유동 세포계수법에 적용하여 10-20,000 사건을 수집한다. 각각의 실험 작동 전에, CST 비드 (BD Biosciences)로 LSRII 상에서 레이저를 정규화한다. EGFR+ 세포 (EGFR+CD45-) 및 EGFR- 세포 (EGFR-CD45+CD14-)에서 FITC 평균 형광 강도(MFI)를 측정함으로써, 종양 세포에서의 PU-FITC의 약물 축적을 측정한다. PU-FITC9 및 DMSO 대조군의 비-특이적 FITC 신호를 배제한다. 종양 MFI(EGFR+CD45-CD14-): EGFR-CD45+CD14- 세포 MFI 비로써 값을 계산한다. 모든 환자에 대해 MFI 값을 정규화하기 위해, Quantum FITC 표준화 비드(standardizations beads) (Bangs laboratories)를 각각의 샘플로 적용시키고 표준 곡선을 얻는다. 이것은 동일 용해도의 형광색소 분자(MESF 단위)에서의 FITC 형광 강도 정량화를 가능하게 한다. 상기 표준 곡선으로부터 얻어진 값을 추론하여 모든 샘플에 대해 각 샘플의 PU-FITC2 축적을 정량화 할 수 있다.
PBMC's에서의 EpCAM + 순환 종양 세포의 PU- FITC 결합 측정: 모든 실험 혈액 샘플링 공정을 Memorial Sloan Kettering Cancer Center에서 Institutional Review Board-승인 프로토콜 하에 수행하였다. PU-H71 임상 시험에 참가한 암 환자로부터 말초혈액 8ml을 항응고제 EDTA 튜브로 빼낸다. PBMC's를 피콜 구배 상에서 분리하고 세포를 계수한 후 트리판 블루 염료 배제 분석에 의해 생존력을 측정한다. PBMC's를 스핀다운하고 2 x 106 세포/ml로 재현탁한다. 샘플을 3 튜브로 동일하게 분리하고 37oC, 5% CO2 4시간 동안 DMSO 1μM(2 x 106 세포/ml), PU-FITC9 (네거티브 FITC 대조군) 및 PU-FITC2 (FITC로 표지된 PU-H71 약물)로 처리한다. 대조군 EpCAM+ 세포주 [AspcI (낮은 결합); BxPc3 (높은 결합)]를 혈액 은행으로부터 수득한 새로 녹힌 PBMC's와 섞고 상기 기재와 같이 환자 PBMC's와 동시에 염색한다. 세포를 1XFACS 완충제(1XPBS, 0.05% FBS)로 두 번 세정하고 30분 동안 얼음 상에서 항-인간 EpCAM-PE (miltenyi biotech), 항-인간 CD14-APC-Cy7 (ebiosciences) 또는 CD14-PE-Texas Red (invitrogen) 및 항-인간 CD45-APC (ebiosciences)로 염색한다. 이후 세포를 트립신화하고 1XFACS 완충제 (1XPBS+0.5% FBS)로 두번 세정하고 세포 생존 염료(1μg/ml DAPI)를 포함하는 1X FACS 완충제 500ul에 펠렛 재현탁한다. 샘플을 BD LSRII 유동 세포계수법에 적용하여 100-200,000 사건을 수집한다. 각각의 실험 작동 전에, CST 비드 (BD Biosciences)로 LSRII 상에서 레이저를 정규화한다. EpCAM+세포 (EpCAM+CD45-) 및 EpCAM+ 세포 (EpCAM-CD45+CD14-)에서 FITC 평균 형광 강도(MFI)를 측정함으로써, 종양 세포에서의 PU-FITC 결합을 측정한다. FITC9 및 DMSO 대조군의 비-특이적 FITC 신호를 배제한다. 종양 MFI(EpCAM+CD45-CD14-): EpCAM-CD45+CD14- 세포 MFI 비로써 값을 계산한다. 모든 환자에 대해 MFI 값을 정규화하기 위해, Quantum FITC 표준화 비드(standardizations beads) (Bangs laboratories)를 각각의 샘플로 적용시키고 표준 곡선을 얻는다. 이것은 동일 용해도의 형광색소 분자(MESF 단위)에서의 FITC 형광 강도 정량화를 가능하게 한다. 상기 표준 곡선으로부터 얻어진 값을 추론하여 모든 샘플에 대해 각 샘플의 PU-FITC2 축적을 정량화 할 수 있다.
프로토콜의 변경 : 환자로부터 수득된 PBMC's를 2 튜브로 나눈다. 두 개를 상기와 같이 PU-FITC로 염색하고 EpCAM-PE 또는 이소타입 대조군 및 CD14-PE-Texas red 및 CD45-APC로 염색한다. 샘플을 상기 기재와 같이 처리한다. PBMC's와 섞인 PU-FITC 고 및 저 축적 세포주를 이용하여 한계 비율 값을 측정한다.
6.3.8. 조직의 PU-H71 결합 분석
생체외 종양 조직 리소시스 (resources) 및 PU-H71- FITC 염색 관련물을 이용한 HSP90 억제제에 대한 위암 환자 시표의 감수성 측정: 위절제 시료의 제거수술 직후 상기 조직을 Pathology 세트의 Tissue Procurement Services (TPS) 부분으로 옮긴다. 상기 병소를 옮긴 후, 조직을 멸균하에 수집한다. 측정을 위해 제거된 시표의 크기는 대략 5-10mm x 5-10 mm이다. 샘플이 생존할 수 있는 모든 노력을 한다. 정상 위 상피 조직의 대표로 병소로부터 멀리 떨어진 동일한 크기의 시료를 제거한다. 두 시료를 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 최소 필수 배지에 넣는다. 상기 병소의 일부 및 정상 위 상피 조직의 전체 조각을 WP에 의해 다음의 분자 평가를 위해 "스냅"("snap") 동결시킨다. 병소(위절제)의 잔여 부분을 병리학적 평가를 위해 처리한다. 모든 병소에 대해 병리학은 형광 표지 PU-H71 (PU-FITC)로의 염색을 위해 추가로 분석되는 염색되지 않은 10과 함께 하나의 헤마톡실린/에오신(H&E) 및 증식 마커, 상피 마커의 IHC를 제공한다. 포르말린-고정 파라핀-임베딩 단편 또는 동결 단편을 PUH71-FITC2 염색을 위해 분석한다. 병행하여, 상기 조직의 일부분을 PU-H71에 대한 종양의 감수성의 생체외 분석을 위해 준비한다. 예비 분석으로부터 본 발명자들은, 새로운 조직 절개가 주변 조직의 내생 환경에서 암 세포를 보호한다는 것을 알았다. 이러한 방법으로, 상기 조직(즉, 병소)을 플라스틱 몰드에 넣고 6% 아가로오스에 임베딩(embedding)한다. 이후 상기 아가로오스-임베딩 조직을 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 MEM을 포함하는 냉각된 레저부아(reservoir)(조직 보호를 위해)에 가라앉아 있는 Vibratome 상에 마운팅한다. 이후 상기 조직을 금속 날을 사용하여 절개하여 200 μM 두께의 일련의 병소 단편을 만든다. 각각의 단편(영하의 주변 아가로오스-임베딩 배지)을 즉시 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 MEM을 포함하는 24-웰 조직 배양 플레이트에 넣는다. 5mm x 5mm의 조직 조각으로부터 대략 25 단편을 만든다. 이것은 Hsp90 억제제의 최소 4 용량으로 처리된 조직 단편 및 단지 비히클로 처리된 것의 복제 분석을 가능하게 한다. 조직 단편을 디스파제에 짧게 노출시킴으로써 효소적으로 분리시키면, 복제물을 생존력 분석(자동 플레이트 판독기 또는 시토스핀 준비) 뿐만 아니라 IHC에 의해 분석할 수 있다. 이러한 위암 조각에서 PU-H71에 의해 유도되는 아포토시스의 정도는 PU-H71-FITC 염색과 연관된다. PU-H71 흡수(PU-H71-FITC 염색의 IHC 기록에 의해 측정된 바와 같다)는 이러한 종양의 Hsp90 저해에 대한 감수성와 연관된다. 유사한 프로토콜이 유방암 및 췌장암을 위해 개발되었다.
6.4. 세포 분석에서의 ANCA-표지 프로브
형광 프로브 처리: 부착 세포를 70% 융합일 때 표준 조직 배양 조건에서 1 시간 동안 5μM PUH71-ANCA로 처리하였다. 처리 후 상기 배지를 흡입시키고 상기 슬라이드를 PBS로 3 번 세정한 후 완성 배지로 재충전하였다.
형광 방출 스펙트럼: 역전 형광 공초점 현미경(Leica SP5)을 사용하고 400nm 내지 600nm 5nm 증량에서 챔버 슬라이드 상에 암 및 비-암 세포를 스캐닝함으로서 형광 방출을 측정하였다.
공초점 현미경: 처리 후 세포의 형광 강도를 역전 형광 공초점 현미경(Leica SP5)을 이용하여 측정하였다. 결합 고 친화성 유형(~530nm)의 적절한 형광 방출 피크에서 공초점 이미지를 얻었다. 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어로 업로드시켰다. 수 개의 임의의 분야의 개별 세포의 형광 강도를 백그라운드를 위해 측정하고 수집하였다.
반응 모델링: IC50 vs. 형광 밀도 완성의 표준 곡선을 12 유방암 세포주 및 2 정상 유방 세포주에 대해 완성하였다. 세포주를 멀티-웰 플레이트 상에서 배양하고, 5 웰을 반응(비히클만, 0.25μM, 0.50 μM, 1.0 μM and 2.5 μM PUH71-처리)에 대해 분석하고 1 웰을 결합의 형광 강도(PUH71-ANCA-처리)에 대해 분석하였다. 모든 세포주의 IC50을 y-아식스( y-axis) 상에 플로팅하였다. 상기 표준 곡선은 생검, 수술 또는 미세 바늘 흡입으로부터 수득된 것과 같은 유방암 시료의 HSP90 치료법에 대한 반응을 모델링하고 예측하는데 사용된다.
암 생검에서의 반응 측정: 환자 생검을 멸균 살린에 두고 즉시 Pathology Department의 조직 조달 부분에 전달한다. Vibratome (Leica VT1000) 상에서 수행되는 새로운 조직 섹셔닝을 위해 병소 일부분을 취한다. 200μM 두께의 단편을 자르고 즉시 성장 인자 및 항체가 포함된 최소 필수 배지의 멀티-웰 플레이트에 넣고 일정한 습도하에 공기-5% CO2 대기 37℃에 둔다. 이후 상기 단편을 45분 내지 1시간 동안 PUH71-ANCA로 처리한다. 처리 후 상기 단편을 PBS로 2 번 세정하고 OCT-임베딩(새로운 동결)한다. 이후 상기 OCT-임베딩 시료를 수 개의 4 μM 두께 단편으로 자르고 충전된 슬라이드로 옮긴다. 이후 핵 대비염색제 DAPI를 상기 슬라이드에 적용한다. 이후 상기 슬라이드를 공초점 현미경(Leica SP5) 상에서 관찰하고 발암 HSP90 유형에의 프로브-결합률을 측정하기 위해 530nm 형광 방출 피크에서 분석한다.
6.5. 방사성 동위 원소 표지된 HSP90 억제제로의 연구
시약. [ 131I]-PU-H71 및 [124I]-PU-H71을 이미 보고된 바대로 합성하고 정제한다132.
세포주. MDA-MB-468 인간 유방암 세포주를 미국형 문화 집단에서 수득하였다. 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민, 1%페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 DME-HG에서 통상적으로 배양한다.
생체내 연구. 모든 동물 연구는 MSKCC's Institutional Animal Care 및 Use Committee (IACUC) 가이드라인에 따라 수행하였다. 암컷 무흉선 nu/nu 마우스 (NCRNU-M, 20 - 25 g, 출생 후 6 주)를 Harlan Laboratories로부터 수득하고 종양 이식 전에 1 주일 동안 MSKCC 동물 사육장에서 적응시켰다. 마우스에게 사료 및 물 ad 리비툼을 제공하였다. 복원된 기저막(BD MatrigelTM, Collaborative Biomedical Products Inc., Bedford, MA)을 함유하는 PBS 1:1 v/v 혼합물 200 μM 세포 현탁액 중 1x107 세포를 피하 주사하여 마우스 앞다리 상에 MDA-MB-468 종양 이종이식체를 수립하였다. 투여 전에 PU-H71 용액을 PBS (pH 7.4) 중에 생성하였다.
생체내 생물 분류 연구. 급성 생체내 생물 분류 연구를 위해 앞다리에 MDA-MB-468 유방암 이종이식체를 함유하는 마우스(n=5)에게 살린 200 μL 중 [124I]-PU-H71 또는 [131I]-PU-H71의 0.93-1.1 MBq (25 - 50 μCi)를 꼬리 혈관내에 정맥주사로 주입하였다. 용량 측정 실험을 위해 몇 그룹의 마우스(n=5)에게 마우스 몸무게 kg 당 5, 25, 50 or 75 mg에 상응하는 PU-H71을 포함하는 멸균 용액 중에 희석된 [124I]-PU-H71 또는 r [131I]-PU-H71을 주입하였다. 각 동물에 투여되는 활성도를 측정하기 위해 투여 전 및 후의 주사기 활성을 용량 구경측정기(CRC-15R; Capintec)에서 분석하였다. 종양을 포함한 프레이서 및 기관의 투여 후 상이한 시점에서 동물(n=4/그룹)을 안락사시키고 수집하고 몸무게를 측정하였다. 종양 조직 일부분을 추가의 생화학 및 조직학 분석을 위한 수집 후 즉시 동결시켰다. 400-600 keV 에너지 창을 이용하여 신틸레이션 γ카운터(Perkin Elmer 1480 Wizard 3 Auto Gamma counter, Waltham, MA)에서 124I를 측정하였다. 카운트 데이터는 백그라운드이고 주입 시간에 쇠퇴-수집하였고 활성도에 대한 카운트 비율을 역전시키기 위해 각 조직 샘플의 그람 당 주입 용량율(%ID/g)을 측정된 눈금을 이용하여 추산하고 %ID/g의 활성 농도를 산출하기 위해 활성도를 주입된 활성도에 대해 정규화하였다.
작은-동물 PET 이미징 . 작은-동물 이미징 연구를 위해 앞다리에 MDA-MB-468 유방암 이종이식체를 함유하는 마우스를 사용하였다. 전용 작은-동물 PET 스캐너(Focus 120 microPET; Concorde Microsystems, Knoxville, TN)로 이미징을 수행하였다. 스캐닝의 전 시기 동안 2 L/min 의 산소에서 2% 아이소플루레인(Baxter Healthcare, Deerfield, IL) 마취 하에 마우스를 유지시켰다. 적합한 경우에서, 트레이서의 물질 대사에서 발생하는 자유 요오드화물의 티로이드 흡수를 감소시키기 위해, 마우스에 트레이서 투여 48 시간 전에 식수에 0.01% 요오드화 칼륨 용액을 제공하였다. PET 이미징을 위해 각각의 마우스에게 꼬리 혈관을 통해 9.25 MBq (250 μCi) of [124I]-PU-H71을 투여하였다. 추작자 투여 후 다양한 시점에서 각 동물에 대해 일련의 리스트-모드 수득(10-30 min)을 얻었다. 420-580 keV의 에너지 창 및 6 ns의 동시 시간 창이 사용되었다. 상기 결과의 리스트-모드 데이터를 Fourier 재배열에 의해 2-차원 히스토그램으로 분류하였다; 여과후역투사(filtered back projection, FBP)에 의해 가로 이미지를 재구성 하였다. 상기 이미지 데이터를 스캐너 반응의 불-일치, 데드-타임 카운트 손실 및 주사 시간에 대한 물리적 쇠퇴에 대해 수정하였다. 경감, 분산 또는 부분적-부피 평균화에 대해 적용된 수정은 없었다. Focus 120의 측정된 재구성 공간 해는 관측 시야의 중심에서 1.6-mm FWHM이다. 재구성 이미지의 ROI 분석을 ASIPro 소프트웨어 (Concorde Microsystems, Knoxville, TN)를 사용하여 수행하였고, 각 조직/기관 ROI에 대해 최대 픽셀 값을 기록하였다. 18F를 포함하는 마우스-크기 물-충전 실린더의 재구성 이미지로부터 유도된 시스템 눈금 요소(즉, μCi/mL/cps/voxel)를 (124I양전자 브랜칭(positron branching ) 비에 대한 조정 후) 활성 농도에 대한 124I 복셀 카운트 비로 전환하는데 사용하였다. 이후 결과적 이미지 데이터를 %ID/g (주사 시간의 쇠퇴에 대해 수정)로 마이크로PET 이미지를 파라미터로 나타내기 위해 투여된 활성에 대해 정규화하였다.
LC-MS/MS 분석. 동결된 조직을 건조시키고 아세토니트릴/H2O (3:7)에서 균질화하기 전에 무게를 측정하였다. PU-H71를 메틸렌 클로라이드에서 추출하고 유기층을 분리하고 진공하에 건조하였다. 샘플을 운동상에서 재구성하였다. 조직 또는 플라즈마의 PU-H71 농도를 고-성능 LC-MS/MS에 의해 측정하였다. PU-H71-d6 를 내부 표준133에 따라 추가하였다. 양이온 전자분무이온화를 이용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 모드의 6410LC-MS/MS 시스템(Agilent Technologies) 상에서 화합물 분석을 수행하였다. 조직 샘플에 대해 Zorbax Eclipse XDB-C18 칼럼 (2.1 x 50 mm, 3.5 μm)을 LC 분리를 위해 사용하고 0.4 mL/분 유속으로 3 분 동안 등용매 조건(80% H2O+0.1% HCOOH: 20% CH3CN) 하에서 상기 분석물을 용리하였다. 플라즈마 샘플에 대해 Zorbax Eclipse XDB-C18 칼럼 (4.6 x 50 mm, 5 μm)을 LC 분리를 위해 사용하고 0.35 mL/분 유속으로 구배 조건(H2O+0.1% HCOOH:CH3CN, 95:5 to 70:30) 하에서 상기 분석물을 용리하였다.
약물학적 분석. 단백질 분석에 대해 종양을 SDS 라이시스 완충제(50 mM Tris, pH 7.4, 2% SDS)에서 균질화하고 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 단백질 농도를 제조업자의 지시에 따라 BCA kit (Pierce) 를 이용하여 측정하였다. 단백질 분해물(20-100μg) SDS/PAGE에 의해 전기영동하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후 지시된 일차 항체로 프로빙하였다: 마우스의 Anti-Hsp90 (1:500, SPA-830; Stressgen), 래빗의 anti-Akt (1:500, 9272; Cell Signaling), 래빗의 anti-phospho-Akt (Ser 473)(1:500, 9271S; Cell Signaling), 래빗의 anti-PARP (p85 fragment)(1:250, G7341; Promega). 상기 단백질 샘플의 동일 로딩을 β-액틴(1:5,000, ab8227-50; Abcam)에 대한 병행 웨스턴블롯에 의해 확인하였다. 검출은 제조업자의 지시에 따라 ECL Enhanced Chemiluminescence Detection System (Amersham Biosciences)을 이용하여 수행하였다.
덴시토미트리 . 겔을 Adobe Photoshop에서 스캐닝하고 양적 농도 분석은 Un-Scan-It 5.1를 이용하여 수행하였다.
효능 연구. 100-150 mm3 부피의 MDA-MB-468 종양을 가지는 마우스(n=5)를 지시된 바와 같이 상이한 용량 및 스케줄을 사용하여 i.p. (i.p.)로 처리하였다. 종양 부피를 Vernier 칼리퍼스에 의해 측정하고 종양 부피를 길이 x 넓이 x 0.4로 계산하였다. 종양 부피를 마우스 그룹 당 평균 종양 부피±SD로 지시된 날짜 상에 나타내었다. 종양 성장 저해율(%) 값을 비히클 처리된 마우스와 비교하여 약물-처리 연구의 최종일에 측정하고 100 x {1 -[(TreatedFinal day -TreatedDay 1)/(ControlFinal day -ControlDay 1)]}로 계산하였다. 종양 감소율(%)은 100 x [1 -(TreatedFinal day/TreatedDay 1)] 이다.
아크리딘 오렌지/브롬화 에티듐 세포 생존력 분석. 자동으로 사멸 및 생존 세포를 카운트하기 위해 Easycount 시스템과 함께 Easycount ViaSure 키트 (Immunocon) 를 사용하였다. 각각 단일 테스트에서 사멸 및 생존 세포를 동정하기 위해 상기 ViaSure Staining Reagent 는 레디-투-유스 핵산 염료, 아크리딘 오렌지 및 브롬화 에티듐의 혼합물을 사용한다. 아크리딘 오렌지는 생존 및 비-생존 세포 모두에 의해 흡수되고 이중-사슬 핵산(DNA)에 삽입된 경우에는 그린 형광을 방출하고 단일-사슬 핵산(RNA)에 삽입된 경우에는 레드 형광을 방출한다. 브롬화 에티듐은 비-생존 세포에 의해서만 흡수되고 DNA에 삽입되어 레드 형광을 방출한다. 생존 세포는 조직 구조를 가진 균일한 그린 핵을 가진다. 초기 세포사멸 세포(여전히 온전한 막을 가지지만 DNA 파열이 일어나기 시작한다)는 그린 핵을 가진다. 그러나 핵주변 크로마틴 응축이 밝은 그린 부분 또는 단편으로 나타난다. 후기 세포사멸 세포는 응축 또는 단편 크로마틴의 오렌지 내지 레드의 핵을 가진다. 괴사 세포는 균일하게 조직 구조의 오렌지 내지 레드 핵을 가진다. 조건 당 총 적어도 200 세포가 카운트되었다.
시뮬레이션. 이중 지수 함수 x(t) = α1 exp(-β1 t) + α2 exp(-β2 t) 가 측정에 적합하였다. 전형적으로 지수의 합이 약동학 데이터를 분석하는데 사용된다123. R 통계학적 언어(www.r-project.org)의 Generalized Nonlinear Model 패키지(http://cran.rproject.org/web/packages/gnm/index.html)가 상기 데이터로 상기 모델을 적용하기 위해 사용된다. 여러개의 적용이 초기에 추구되었고 최고의 것이 상이한 약물 투여 시나리오의 추가적 시뮬레이션에 적용되었다. R 스크립이 개발되었다.
통계학적 분석. 달리 지시된 바가 없다면, 데이터는 GraphPad Prism (version 4; GraphPad Software)의 비쌍 2-꼬리 t 테스트에 의해 분석하였다. 0.05 미만의 P 값을 구체적으로 고려하였다. 달리 언급된 바가 없다면, 이중 또는 삼중 복제물의 평균±표준 편차 (SD) 또는 평균의 평균±표준 에러(SEM)로 데이터를 나타내었다. 에러 막대는 평균의 SD 또는 SEM을 나타낸다. 만약 단일 패널이 있다면, 데이터는 2 또는 3의 개별 실험의 대표값을 나타낸다.
인간 연구. 요오드화 칼륨 용액(SSKI)의 하루 용량을 주사 전에 시작 후 14일에 투여한다. 단일 트레이서-주사(4-11.0 mCi; <100 μg)를 병행 IV 볼루스 서방출에 의해 투여하였다. 0h (동적 스캔), 3-4h, 24h 및 40-80 h 및/또는 160-200 h (고정 스캔)에서 환자에게 비-침습 PET-기저 분석을 하였다. 본 발명자들의 PU-PET 선행 시도에서 환자의 회복 또는 '드롭-아웃'에 어려움 없이 많은 요구 스케줄이 환자에 의해 잘 인내되었다.
시점을 본 발명자들의 인간124I-PUH71 PK 데이터 기초하여 선택한다:
(1)124I-PUH71 PK가 2-대표 방식-신속 제거(혈액 t1/2≒20)로 혈액 순환에서 신속하게 제거된 후 무시할 수 있을만한-낮은 혈액-수준에서 서서히 제거된다;
(2)PET 이미징에 의한 종양 PUH71-트레이서 농도는 다양하고 백그라운드 조직 트레이서-수준과 양적으로 동일하거나 또는 그 이상이고 트레이서-주사 후에 4-to-24 또는 48 및 72h 이상에서 트레이서의 상이한 흡수 및/또는 보유가 분명하다;
(3)PUH71-겨냥 종양 농도는 몇일의 기간 동안 유지되거나 또는 단일지수-형 제거를 나타낸다.
본 발명자들은 로부스트 카운트-통계를 확실하게 하기 위해 본 발명자들의 124I-PUH71 PET 이미지 수득 프로토콜을 최적화하였다. 전용 연구 PET/CT 스캐너(GE Discovery DSTE)는 감소-, 쇠퇴- 및 분산-수정 및 시스템 감수성의 조정으로 양적 생물 분류 이미지를 얻는다. 감소 수정 및 해부학적 공동-등록에 대한 CT 스캔이 수행된 후에 트레이서-주사가 이루어지고 체중(최고 85 mA for =81 kg)이 체크된다. 상기 CT 프로토콜은 트레이서-신호의 해부학적 편재 및 감소 수정에 충분하도록 디자인된다. 정맥내 또는 경구 방사선 투과사진 콘트라스트는 투여되지 않는다. PET 데이터는 표준 요구 부분 집합 기대 최적화 반복적 알고리즘을 이용하여 재구성한다. 방출 데이터는 분산, 감소 및 쇠퇴에 대해 수정된다.
PU-종양 활성은, 임의 시점에서 참조 혈액 풀 또는 기관 백그라운드 보다 명백히-더 높은 것으로 평가되는 종양 트레이서-신호로서 PET 사진의 외관검사 상으로 정의되는 양자택일 결과이다. 종양 PU-H71 농도는, (1)임의 시점에서의 가장 높은 종양 Standardized Uptake Value (SUV); 및 (2) 제 1 및 최종 PET 시점 사이의 PU-H71-주사 후 시간 함수로서의 종양 SUV의 적분에 의해 PET 데이터로부터 양적으로 분석된다(즉, PU-PET SUVmax 판독 또는 SUV 판독으로부터 계산되는 몰 농도는 도 27에 제시된 바와 같이 계산된 Hsp90 억제제의 평균 종양 농도 및 PU 투여 후 시간 함수 및 AUC 값으로서 도시된다.
이후 이러한 파라미터(또는 기타 정의된 것)는 HSP90 억제제로의 치료학적 시도 상 반응과 관련된다. 이러한 연구에서 종양 반응은 종양 당 및 환자 당 평가된다. 종양 반응 평가의 시간은 치료 시도 프로토콜 당 조절된다. 종양 반응 평가는 첫번째 사이클(한 사이클은 전형적으로 3-5 주이다)의 거의 마지막에 수행되는 임상 이미징으로부터 이루어진다. 종양 반응은 , CT 또는 MRI의 RECIST 1.1, 및/또는 FDG PET-CT의 PERCIST 1.0(36.37)에 의해 정의된다. 일치하지 않는다면, 더 적합한 반응이 이용될 것이다. 임상 반응은 암-특이적 치료 시도 반응 표준에 따라 평가된다.
PET 사진 상의 종양 PUH71-활성 데이터는 두 방향에서 나누어진다:
(1) '겨냥' 또는 '비-겨냥'된 것으로서 종양의 양적/외관 평가의 이용에 의해(상기에서 논의됨);
(2)종양-반응 대 무 반응 사이의 분석에 있어서 최고의 작용 특질을 가지는 종양-활성의 차단점, 연속 데이터로서 계산되는 ROC 곡선 사용에 의해(40).
두 이원론화에 있어서, 감수성, 특이성 및 기타 분류 측정이 사실과 같이 환자 반응을 사용하여 계산된다. 만약 각각의 환자가 단일 종양이 있다면, 40 환자의 샘플 크기는 최대 넓이인 .324와 2-측면 신뢰구간을 생성한다. 환자 당 종양의 갯수가 증가함에 따라, 상기 신뢰구간은 일반적으로 대체로 감소한다. 조사되는 목표에 대한 환자-수준 요약 통계학은 1) 가장 높은 종양 SUV 및/또는 AUC 및 2) 모든 종양 SUV 및/또는 AUCs의 평균을 포함한다. 이러한 환자-수준 데이터는, Youden 지수에 기초한 종양-목표를 요약하는 환자의 ROC 곡선 및 컷오프를 구성하는데 사용되고 (0.1)에 근접한 지점이 계산된다.
잠복 기간 연구에서, 특정 시점 또는 전 기간에서의 흡수 및 보유는 관찰되는 반응과 관련된다. 일차 데이터는 AUC에 의해 측정되는 바와 같이 종양-노출뿐만 아니라 종양 장기 보유(24-48 시간 이상 동안) 모두가 Hsp90 저해 치료에 종양 반응을 예상하도록 하는 적절한 파라미터이다. 구체적으로, MDA-MB-468 종양의 일차 조사에서, 종양 부분-하-곡선(AUC), PU-H71의 평균 및 최소 종양 농도, 처리 기간 동안 PU-H71에 의해 점유 및 인식되는 평균 %Hsp90 위치((% Occupied Hsp90 sites)avg) 로서 측정되는 타겟 점유와 같은 수개의 파라미터가 계산되었다. 본 발명자들은, 처리 전 기간 동안 기록된 PU-H71의 평균 종양 농도, 종양 AUC 및 %"발암 Hsp90" 점유가 관찰된 항-종양 효과의 크기(각각 r2= 0.8162, 0.8188 및 0.7559)에 매우 현저하게 관련됨을 알았다(도 37). 이러한 것은, Hsp90i에 대한 반응을 예측하기에 가장 적합한 파라미터는 시간-의존적 노출, 즉 흡수 및 보유를 측정하는 것이라는 것을 제시한다.
6.6. 유방암 및 AML에서의 HSP90에 대한 세포자멸성 감수성의 예측 마커를 동정하기 위한 연구
세포: Kasumi-1, SKNO-1, MOLM-13, M0-91, HEL, HL-60, THP-1, MV4-11을 10mM HEPES, 4.5g/L 글루코오스, 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트, 1mM 소듐 피루베이트, 10% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. FL5.12의 안정한 감염체는 상기에서 기술되었다(18-Karnauskas 2003). 간단히 말해서, FL5.mAKT의 생성에 있어서, 미리스토일화된 AKT를 독시사이클린 유도 벡터 pRevTRE (Clontech) 에서 클로닝한다(상기 클론을 mAKT라 한다). 대조군로서, 세포를 벡터만으로 세포감염시켰다(상기 클론을 Vector라 한다). FL5.mAkt.Bcl-xL의 생성에 있어서, 인간 Bcl-xL cDNA를 pBabePuro 벡터의 EcoRI 자리로 클로닝하고 기술된 바(18)와 같이 FL5.mAkt3로 세포감염시켰다(상기 클론을 mAKT.Bcl-xL라 한다). 이러한 라인을 1 mg/ml Geneticin (G418) (Sigma #G9516) 및 1 또는 2 ng/mL of IL-3 (RD Systems#403 ML)을 함유하는 10mM HEPES, 10% FBS 배지로 보충된 DME-HG 배지를 이용하여 상기에서 기술된 바와 같이 배양한다.
PBL(인간 말초혈액 림프구)을 New York Blood Center로부터 구입한 환자 혈액에서 분리하였다. 상기 세포 현탁액 34ml을 15 ml Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) 상에 도포하였다. 샘플을 4℃에서 40분 동안 2,000rpm으로 원심분리하고 림프구 계면을 수집하였다. 세포를 10% FBS의 RPMI 배지에 플레이팅하고 다음 날 지시된 시간에 적당한 농도의 PU-H71로 처리하였다.
시약: Hsp90 억제제를 이미 보고된 바와 같이 합성하였다. 본 발명자들은 Calbiochem the Akt Inhibitor VIII, Isozyme-Selective, Akti-1/2 (#124018), the PD98059 MEK inhibitor (#513000) 및 the pan-JAK Inhibitor I (#420099)로부터 구입하였다. 이러한 화합물은 이들의 타겟 경로의 저해를 결과하기 위해 매도인에 의해 지시된 바와 같은 농도에서 사용하였다. 생체내 연구를 제외하고, 모든 화합물은 DMSO 스탁으로서 사용되었다.
성장 저해: Alamar 블루 어세이를 사용하여 성장 저해 연구를 수행하였다. 이러한 시약은 세포 배양에서 세포 생존력의 빠르고 객관적인 측정을 제공하고 세포의 물질대사능, 세포 생존의 지표를 측정하기 위해 지표 염료 제자주린을 사용한다. 간단히 말해서, 기하급수적으로 성장하는 AML 세포주를 미세적정 플레이트에 2x104 세포/웰로 플레이팅하고 37℃에서 지시된 시간 동안 배양하였다. 약물을 지시된 농도에서 삼중으로 첨가하고 상기 플레이트를 72 시간 동안 배양하였다. 레자주린(55 μM)을 첨가하고 상기 플레이트를 Analyst GT (Fluorescence intensity mode, excitation 530nm, emission 580nm, 560nm 다이클로익 미러 장착)를 사용하여 6 시간 후에 판독하였다. 결과를 Softmax Pro 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 초기 세포군(시간 0)을 고려하여 처리 대 대조군 세포로부터 수득된 형광 표시를 비교함으로써 세포 성장 저해율을 계산하였다. IC50은 세포 성장을 50% 저해한 약물 농도로서 계산되었다.
아폽토시스 분석: 세포를 지시된 바와 같이 비히클(DMSO) 또는 억제제로 24, 48 또는 72 시간 동안 처리하였다. 세포를 아크리딘 오렌지 및 브롬화 에티듐으로 염색한 후 형광 현미경(Zeiss Axiovert 40 CFL)으로 시각화하고 카운트하였다. 각 그룹에서 카운트된 200-300 세포로부터 세포자멸성 세포의 백분율을 측정하였다. 세포자멸성 세포의 백분율을 하기와 같이 계산하였다: % 세포자멸성 세포=(세포자멸성 핵을 가진 세포의 총수/카운팅된 세포의 총수)x100. 아크리딘 오렌지는 생존 및 비-생존 세포 모두에 의해 흡수되고 이중-사슬 핵산(DNA)에 삽입된 경우에는 그린 형광을 방출하고 단일-사슬 핵산(RNA)에 삽입된 경우에는 레드 형광을 방출한다. 브롬화 에티듐은 비-생존 세포에 의해서만 흡수되고 DNA에 삽입되어 레드 형광을 방출한다. 생존 세포는 조직 구조를 가진 균일한 그린 핵을 가진다. 초기 세포사멸 세포(여전히 온전한 막을 가지지만 DNA 파열이 일어나기 시작한다)는 그린 핵을 가진다. 그러나 핵주변 크로마틴 응축이 밝은 그린 부분 또는 단편으로 나타난다. 후기 세포사멸 세포는 응축 또는 단편 크로마틴의 오렌지 내지 레드의 핵을 가진다. 괴사 세포는 균일하게 조직 구조의 오렌지 내지 레드 핵을 가진다.
카스파아제 3.7 활성 분석: 세포를 상기의 성장 저해 분석 부분에서 기술된 바와 같이 플레이팅하고 처리하였다. Hsp90 억제제에 세포를 24 시간 또는 48 시간 동안 노출시킨 후, 10 mM Hepes, pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, 0.1 mg/mL PMSF, Complete Protease Inhibitor mix (#1697498; Roche), 및 카스파아제 기질 Z-DEVD-R110 (#R22120; Molecular Probes) 25 μM을 함유하는 100 μM 완충제를 각 웰에 첨가하였다. 세포 라이시스 및 반응을 증진시키기 위해 오비탈 쉐이커에 넣었다. 각 웰의 형광 신호를 Analyst GT (Molecular Dev ices) 마이크로플레이트리더( 여기 485 nm; 방출 530 nm)에서 측정하였다. 카스파제-3.7에서 백분율 증가가 처리 대 대조군 세포로부터 수득된 형광 판독의 비교로서 계산되었다. 모든 실험 데이터는 SOFTmax Pro 4.3.1를 사용하여 분석하였고 Prism 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA)를 사용하여 플로팅하였다.
웨스턴 블롯 : 세포를 60-70% 융합으로 성장시키고 지시된 시간에 억제제 또는 비히클로 처리하였다. 단백질 분해물을 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl 및 1% NP-40 라이시스 완충제에 준비하였다. 제조업자의 지시에 따라 BCA 키트 (Pierce)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 분해물(10-100μg)을 SDS-PAGE로 분해하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후 지시된 일차 항체로 배양하였다. AKT를 활성화하기 위해, FL5.12-유도 세포주를 18 시간 동안 1 μg/ml Dox로 예비-처리한 후 억제제로 처리하였다.
항체: 래빗의 Anti-AKT (1:500, 9272; Cell Signaling), 래빗의 anti-phospho-AKT (Ser 473)(1:500, 9271S; Cell Signaling), 래빗의 anti-RAF-1(1:300, sc-133; Santa Cruz Biotechnology), 래빗의 anti-PARP (p85 fragment)(1:250, G7341; Promega), 래빗의 anti-Bcl-xL(1:1,000, 2762; Cell Signaling), 래빗의 anti-JAK2(1:500, 3773; Cell Signaling), 마우스의 anti-c-KIT(1:1,000, 3308; Cell Signaling), 래빗의 anti-AML1(1:500, 4334; Cell Signaling), 래빗의 anti-FLT3(1:1,000, 3462; Cell Signaling), 래빗의 anti-TRKC (1:1,000, ab43078; Abcam), 마우스의 STAT5, p-STAT5, p-ERK 및 항-β-Actin (1:3,000, ab8227-50;Abcam). 이후 상기 막을 상응하는 겨자무과산화효소 접합 이차 항체의 1:3000 희석액으로 배양하였다. ECL-Enhanced Chemiluminescence Detection System (Amersham Biosciences)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 단백질을 검출하였다.
약역학적 연구: 4 내지 6 주된 암컷 무흉선 nu/nu 마우스를 Taconic Farms로부터 수득하였다. Institutional Animal Care 및 Use Committee-승인 프로토콜 하에서 실험을 수행하였고 연구에 있어서 동물의 적합하고 인간적 이용에 대한 기관 가이드라인을 따랐다. HEL 및 M0-91 세포를 20-게이지 바늘을 사용하여 마우스의 우측 옆구리에 피하 주입하여 성장할 수 있도록 한다. 투여 전에 PU-H71.HCl 용액을 멸균 PBS에 형성시킨다. 상기 분석을 위해, 종양은 처리 전에 6-8 mm 직경에 이르도록 하였다. M0-91 및 HEL 종양을 가진 마우스에 75mg/kg PU-H71을 복강내(i.p.) 투여하였다. PU-H71 투여 12, 24, 48, 72, 및 96 시간 후에 CO2 안락사에 의해 동물을 희생시켰다. 종양을 균질화하고 단백질을 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
덴시토미트리 . 겔을 Adobe Photoshop 7.0.1에서 스캔하고 Un-Scan-It 5.1를 사용하여 양적 덴시토미트리 분석을 수행하였다.
통계. 본 발명자들은 Prism 4.0 (GraphPad Software)로 통계 분석 및 그래프 플로팅을 수행하였다. 본 발명자들은 모든 데이터를 평균±s.d로 나타내었고 0.05 미만의 P 값을 구체적으로 고려하였다.
Stat5 포스포클로우 ( phosphoflow )-일차 세포를 30분 동안 4℃ FACS 완충제에서 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체 (BD Biosciences)로 염색하였다. 세포를 한번 세정하고 30분 동안 실온에서 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 10분 동안 얼음 상에서 PBS/0.1% Triton X-100로 투과시켰다. 세포를 밤새 4℃에서 p-Stat5-PE 또는 이소타입 대조군 (BD Biosciences)로 염색하였다. 이후 세포를 PBS로 한 번 세정하고 BD-LSR II 유동 세포계수법(BD Biosciences)을 사용하여 유동 세포계수법 분석하였다. p-Stat5의 MFI 염색을 이소타입 대조군로 정규화하였다.
줄기 세포 생존력 분석-일차 세포를 2x106 세포/ml로 48-웰 플레이트에 플레이팅하고 48 시간 동안 1 μM PU-H71로 처리하였다. 세포를 30분 동안 4℃ FACS 완충제(PBS, 0.05% FBS)에서 CD34-APC, CD38-PE-CY7 및 CD45-APC-H7 항체(BD Biosciences)로 염색하고 Annexin V 완충제 (10 mM HEPES/NaOH, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaCl2)에서 Annexin V-V450 (BD Biosciences) 및 7-AAD 염색하였다. 세포 생존력을 비처리 세포로 정규화하였다.
6.7. HSP90 저해 치료에 민감한 신경퇴행성 환자를 동정하기 위한 연구
인간 APPswe, PS1M146V 및 tauP301L를 발현하는 AD (3xTg-AD) 형질전환 모델은 질환-관련 뇌 영역에서 아가-의존 방식으로 Abeta 및 tau 병리학 모두를 점진적으로 발전시켰다(Billings et al., 2005; Oddo et al., 2005; Oddo et al., 2003). 상기 마우스 모델을 PS1M146 노킹 마우스 배아에 APP 및 tau Cdna 구조체를 동시-주입시킴으로써 생성한다. 이러한 마우스는 경도인지장애(MCI) 환자 및 Down 신드롬 환자의 관측과 같이 세포내 Aβ 선행 아밀로이드 플라크 축적을 발전시킨다. 이것은 또한 탱글(tangle) 형성 전에 세포외 Abeta 축적을 발전시켜서 이러한 AD 발전 두 단계에 포함되는 사건을 연구할 수 있도록 한다. tau 병리학은 우선 해마 CA1 영역의 피라미드 세포 및 피질로의 진전, 인간 AD 뇌(Mesulam, 2000)에서의 모방 분산 패턴에서 분명하다. 따라서, AD 3x-tg 마우스 모델은 인간 AD와 많은 유사점을 나타내고 병리학적으로 영향을 받은 것 및 정상 뇌 영역에서의 Hsp90 억제제의 효과 및 보유를 연구할 수 있는 기회를 제공한다.
뇌 및 혈장 약물 농도 측정. HCI 염으로서 화합물 PU-HZ151 수용액을 지시된 용량으로 3xTgAD 마우스(평균 체중 35g)에 i.p. 주입시켰다. MSKCC Institutional Animal Care 및 Use Committee에 의해 승인된 프로토콜에 따라 상기 처리 후 상이한 시점에서 CO2 안락사에 의해 희생시켰다. 헤미뇌(hemibrain)를 피질-변연계 및 피질하 영역으로 분리하여 액체 질소에서 급속 동결시키고 -80℃에 저장하였다. 얼음에서 냉각된 1.5 Ml Eppendorf 튜브에 수집하여 원심분리한 혈액으로부터 혈장을 수득하였다. 동결된 뇌 조직을 건조시키고 중량을 측정한 후 아세토니트릴/H2O (3:7)에서 균질화하였다. 상기 혼합물을 메틸렌 클로라이드로 추출하고 유기층 분리시킨 후 진공하에 건조시켰다. 혈장(50μL)을 아세토니트릴(0.25mL)과 혼합한 후 원심분리시켰다. 수득된 상청액을 진공하에서 건조시켰다. 샘플을 이동 상에서 재구성하였다. 고성능 LC-MS/MS에 의해 뇌 및 혈장의 화합물 농도를 측정하였다. 할로페리돌(Haloperidol)을 내부 표준으로서 첨가하였다. 음이온 전기분무이온화를 이용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 모드의 6410 LC-MS/MS 시스템 (Agilent Technologies) 상에서 화합물 분석을 수행하였다. LC 분리를 위해 Zorbax Eclipse XDB-C18 칼럼(2.1 x 50 mm, 3.5 μm)을 사용하고 상기 분석물을 0.35 ml/분 유속으로 5분 동안 등용매 조건(65% H2O+0.1% HCOOH: 35% CH3CN) 하에서 용리시켰다.
약역학적 분석. 단백질 분석을 위해, 선택된 뇌 영역(해마)을 SDS 라이시스 완충제 (50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS)에서 균질화시키고 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 항-Hsp70 및 Hsp90 항체로 면역블로팅하여 단백질 수준을 분석하였다.
실시양태
본 발명은 하기 번호가 붙은 단락에서 열거된 하기 실시양태에 의해 설명될 수 있다:
1. 하기 단계를 포함하는, 종양이 HSP90 억제제 치료에 반응 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위한 방법:
(a) 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 검출가능 표지된 HSP90 억제제에 종양 세포를 포함하는 종양 또는 샘플을 접촉시키는 단계;
(b) 샘플에서 종양 또는 종양 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 측정된 샘플의 종양 또는 종양 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 양을 정상 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 참조량을 비교하는 단계;
여기서 상기 참조량과 비교되여, 단계 (b)에서 측정된 종양 또는 종양 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 양이 더 큰 것은 종양이 상기 HSP90 억제제에 반응 가능성이 있음을 가리킨다.
2. 실시양태 1의 방법, 여기서 상기 참조량과 비교하여 단계 (b)에서 측정된 종양 또는 종양 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 양의 비율이 더 크면 클수록, HSP90 억제제 치료에 더 큰 반응 가능성이 있다.
3. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 측정된 종양 또는 종양 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 양의 비율이 더 크면 클수록, HSP90 억제제 치료에 더 큰 반응 가능성이 있다.
4. 실시양태 1의 방법, 여기서 정상 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 양이 더 크면 클수록, HSP90 억제제 치료에 더큰 반응 가능성이 있다.
5. 실시양태 1의 방법, 여기서 정상 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 양은 참조 샘플에서 정상 세포에 결합한 표지된 HSP90 억제제의 미리 측정된 양이다.
6. 실시양태 1의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 형광 표지된 것이다.
7. 실시양태 1의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 비오틴-표지된 것이다.
8. 실시양태 1의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 방사성 표지된 것이다.
9. 실시양태 1의 방법, 여기서 종양은, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비-소세포폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 골수증식성질환, 위장기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암과 관련된다.
10. 실시양태 9의 방법, 여기서 상기 암은 유방암이다.
11. 실시양태 9의 방법, 여기서 상기 암은 백혈병이다.
12. 실시양태 11의 방법, 여기서 상기 백혈병은 만성 골수종 백혈병이다.
13. 실시양태 9의 방법, 여기서 상기 암은 위암이다.
14. 실시양태 9의 방법, 여기서 상기 암은 췌장암이다.
15. 실시양태 1의 방법, 여기서 상기 종양 세포는 종양 줄기 세포이다.
16. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 종양은 대상체에 접촉되고 존재한다.
17. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 종양 세포를 포함하는 샘플은 접촉되고 조직 샘플이다.
18. 실시양태 1의 방법, 여기서 상기 조직 샘플은 생검, 미세 바늘 흡입 또는 수술 과정 동안 수득된 샘플이다.
19. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 샘플은 접촉되고 생물학적 유체이다.
20. 실시양태 19의 방법, 여기서 상기 생물학적 유체는 혈액 또는 골수이다.
21. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 샘플은 접촉되고 교란된 종양 세포를 포함한다.
22. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 샘플은 접촉되고 간세포를 포함한다
23. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 샘플은 접촉되고 동결된 세포를 포함한다
24. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 샘플은 접촉되고 고정되고 투과된 세포를 포함한다
25. 실시양태 1의 방법, 여기서 단계 (a)에서 상기 샘플은 접촉되고 포르말린-고정, 파라핀-임베딩 세포를 포함한다
26. 실시양태 1의 방법, 여기서 상기 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제의 표지된 형태이다.
27. 실시양태 1의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
28. 실시양태 27의 방법, 여기서 HSP90 억제제는 PU-H71이다.
29. 실시양태 1의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
30. 실시양태 1의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71 형태이다.
31. 실시양태 30의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 [124I]PU-H71 이다.
32. 실시양태 30의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71-FITC2 또는 PU-H71-NBD1 이다.
33. 실시양태 30의 방법, 여기서 검출가능하도록 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71의 바이오티닐화된 유사체이다.
34. 실시양태 33의 방법, 여기서 PU-H71의 바이오티닐화된 유사체는 PU-H71-바이오틴-5, PU-H71-바이오틴-6, PU-H71-바이오틴-8 또는 PU-H71-바이오틴-9이다.
35. 하기 단계를 포함하는, 이미지를 형성하는 종양을 가진 암 환자가 HSP90 억제제 치료에 반응할 수 있는지 여부를 결정하는 방법:
(a) 종양의 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사능 표지된 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 상기 투여 후 복수의 시점에 환자의 종양에 의한 방사능 표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(c) 단계 (a)에서 상기 투여 후 동일한 복수의 시점에 미리 측정된 환자의 건강한 조직에 의한 방사능 표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 동일한 시점에 측정된 흡수와 단계 (b)에서복수의 시점에서 측정된 흡수의 비율을 컴퓨터를 사용하여 비교하는 단계; 및
(e) 암 환자가 HSP90 억제제 치료에 반응할 가능성을 결정하는 단계, 여기서 복수의 시점에서 단계 (d)의 비율이 2를 초과한다면 환자의 반응 가능성을 나타내는 것이다.
36. 실시양태 35의 방법, 여기서 종양은, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비-소세포폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장 기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암과 관련된다.
37. 실시양태 36의 방법, 여기서 상기 암은 유방암, 림프종, 신경아세포종, 위암 또는 췌장암이다.
38. 실시양태 35의 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제의 방사능 표지된 형태이다.
39. 실시양태 35의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
40. 실시양태 35의 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71의 방사능 표지된 형태이다.
41. 실시양태 40의 방법, 여기서 PU-H71의 방사능 표지된 형태는 [124I]PU-H71 이다.
42. 하기 단계를 포함하는, 이미지를 형성하는 종양을 가진 암 환자가 HSP90 억제제의 미리 측정된 용량 치료에 반응할 수 있는지 여부를 결정하는 방법:
(a) 종양의 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사능 표지된 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 상기 투여 후 복수의 시점에 환자의 종양에 의한 방사능 표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 동일한 복수의 시점에서의 흡수에 기초하여, 이러한 복수의 시점의 각각의 경우에 환자의 종양에 존재하는 HSP90 억제제의 농도, HSP90의 미리 측정된 용량을 계산하는 단계; 및
(d) 종양을 치료하는데 효과적인 HSP90 억제제에 있어서, 상기의 복수의 시점에 존재해야 하는 HSP90 억제제의 참조 농도와 단계 (c)에서 계산된 HSP90 억제제의 농도를 비교하는 단계
여기서 단계 (c)에서 계산된 HSP90 억제제의 농도가 환자에게 유독하지 않고 종양을 효과적으로 치료하는데 필요한 HSP90 억제제의 농도와 동일하거나 또는 초과한다면 환자는 HSP90 억제제의 미리 측정된 용량 치료에 반응할 가능성이 있는 것이다.
43. 실시양태 40의 방법, 여기서 종양은, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비-소세포폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암과 관련된다.
44. 실시양태 40의 방법, 여기서 상기 암은 유방암, 림프종, 신경아세포종, 위암 또는 췌장암이다.
45. 실시양태 35의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
46. 실시양태 35의 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71의 방사능 표지된 형태이다.
47. 실시양태 40의 방법, 여기서 PU-H71의 방사능 표지된 형태는 [124I]PU-H71 이다.
48. 하기 단계를 포함하는, 이미지를 형성하는 종양을 가진 특이적 암 환자를 위해 HSP90 억제제 치료에 있어서 효과적인 투여 용량 및 횟수를 측정하는 방법:
(a) 종양의 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사능 표지된 HSP90 억제제를 환자에게 투여하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 상기 투여 후 복수의 시점에 환자의 종양에 의한 방사능 표지된 HSP90 억제제의 흡수를 측정하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 동일한 시점에서의 흡수에 기초하여, 종양을 치료하는데 효과적인 HSP 억제제 농도를 상기와 같은 복수의 시점 각각에 종양내에 유지하는데 필요한 투여 용량 및 횟수를 계산하여, 암 환자에 있어서, HSP90 억제제 치료를 위한 효과적인 투여 용량 및 횟수를 결정하는 단계.
49. 실시양태 48의 방법, 여기서 종양은, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비-소세포폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암과 관련된다.
50. 실시양태 49의 방법, 여기서 상기 암은 유방암, 림프종, 신경아세포종, 위암 또는 췌장암이다.
51. 실시양태 48의 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제의 방사능 표지된 형태이다
52. 실시양태 48의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
53. 실시양태 48의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71의 방사능 표지된 형태이다.
54. 실시양태 53의 방법, 여기서 PU-H71의 방사능 표지된 형태는 [124I]PU-H71 이다.
55. 하기 단계를 포함하는, 암 환자에 있어서 이미지를 형성하는 종양에 존재하는 HSP90 억제제 농도를 측정하는 방법:
(a) 종양의 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 방사능 표지된 HSP90 억제제의 미리 측정된 양 및 HSP90 억제제의 미리 측정된 양을 환자에게 동시-투여하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 동시-투여 후 한 번 또는 그 이상의 미리 정의된 시점에서 환자에 의한 방사능 표지된 HSP90 억제제의 흡수를 주기적으로 측정하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 방사능 표지된 HSP90 억제제 흡수에 기초하여, 상기 임의의 시점에서 종양에 존재하는 HSP 억제제 농도를 측정하는 단계.
56. 실시양태 54의 방법, 여기서 종양은, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비-소세포폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암과 관련된다.
57. 실시양태 56의 방법, 여기서 상기 암은 유방암, 림프종, 신경아세포종, 위암 또는 췌장암이다.
58. 실시양태 55 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제의 방사능 표지된 형태이다
59. 실시양태 55의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
60. 실시양태 55의 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71의 방사능 표지된 형태이다.
61. 실시양태 60의 방법, 여기서 PU-H71의 방사능 표지된 형태는 [124I]PU-H71 이다.
62. 하기 단계를 포함하는, 암 환자에 있어서 이미지를 형성하는 종양의 HSP90 억제제 치료법에 대한 반응을 결정하는 방법:
(a) 환자가 치료법으로서 HSP90 억제제를 제공 받는 기간에 복수의 시점에서 환자에게, 종양 또는 종양 세포에 존재하는 HSP90의 종양-특이적 형태에 우선적으로 결합하는 HSP90 억제제의 방사능 표지 형태를 투여하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 투여 후 상기와 같은 복수의 시점에서 환자의 종양의 방사능 표시 HSP90 억제제 농도를 측정하는 단계; 및
(c) 종양을 효과적으로 치료하는데 필요한 HSP90 억제제의 최소 농도와, 단계 (b)에서 측정된 방사능 표지 HSP90 억제제 농도를 비교하는 단계, 여기서 종양을 치료하는데 필요한 최소 농도를 초과하는 농도가 측정된 경우에는 환자가 HSP90 억제제 치료법에 반응할 수 있음을 나타낸다.
63. 실시양태 62의 방법, 여기서 종양은, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 기저세포암, 악성 흑색종, 신장암, 방광암, 전립선암, 소세포폐암 및 비-소세포폐암을 포함하는 폐암, 유방암, 신경아세포종, 위장기질 종양을 포함하는 위장암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 항문암, 신경교종을 포함하는 뇌종양, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하는 림프종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암을 포함하는 부인과 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암과 관련된다.
64. 실시양태 63의 방법, 여기서 상기 암은 유방암, 림프종, 신경아세포종, 위암 또는 췌장암이다.
65. 실시양태 62 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제의 방사능 표지된 형태이다
66. 실시양태 62의 방법, 여기서 치료법으로서 투여되는 HSP90 억제제는 PU-H71 또는 그 유사체, 동종체, 또는 유도체이다.
67. 실시양태 62의 방법, 여기서 방사능 표지된 HSP90 억제제는 PU-H71의 방사능 표지된 형태이다.
68. 실시양태 67의 방법, 여기서 PU-H71의 방사능 표지된 형태는 [124I]PU-H71 이다.
69. 하기 단계를 포함하는, 환자에 존재하는 인간 암이 HSP90 억제제 치료에 반응할 수 있는지 여부를 결정하는 방법:
(a) 환자의 암 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계, 여기서 세포는 HSP90 단백질 만을 발현하거나 또는 추가로 HSP70 단백질을 발현한다;
(b) 단계 (a)에서 수득된 샘플에 존재하는 세포에 있어서, 하기 파라미터 중 적어도 하나의 존재를 분석하는 단계: 활성화된 AKT 경로, PTEN 종양 억제 기능 또는 발현의 결함, 활성화된 STAT5 경로 또는 Bcl-xl 단백질 발현; 및
(c) 환자의 암이 HSP90 억제제 치료에 반응할 수 있는지를 결정하기 위해, HSP90 억제제 치료에 반응하는 한 명 이상의 암 환자의 인간 암 세포에 있어서, 단계 (b)에서 분석된 파라미너 또는 동일한 파라미터의 미리 측정된 참조 분석과 단계 (b)에서 수득된 분석을 비교하는 단계.
70. 실시양태 69의 방법, 여기서 인간 암은 유방암이다.
71. 실시양태 69의 방법, 여기서 상기 암 세포는 급성 골수종 백혈병과 관련된 것이다.
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  27. 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 환자가 HSP90 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    (a) 뇌 세포를 포함하는 샘플을, 환자의 뇌 세포에 존재하는 HSP90의 병원성 형태에 우선적으로 결합하는 방사선표지된 HSP90 억제제와 접촉시키는 단계;
    (b) 샘플 중의 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 측정하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 측정된 샘플 중의 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 양을 참조 양과 비교하는 단계를 포함하고,
    참조 양과 비교하여 단계 (b)에서 측정된 뇌 세포에 결합된 표지된 HSP90 억제제의 더 많은 양은 환자가 HSP90 억제제에 반응할 가능성이 있음을 나타내고,
    상기 방사선표지된 HSP90 억제제가 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    Figure 112019131546071-pat00131

    상기 식에서, XI는 123I, 124I, 125I, 131I로부터 선택되는 방사성 동위원소이다.
  28. 제27항에 있어서,
    방사선표지된 HSP90 억제제가 치료제로서 투여될 HSP90 억제제의 표지된 형태인, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    방사선표지된 HSP90 억제제가 치료제로서 투여될 HSP90 억제제와 상이한 것인, 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    신경퇴행성 질환이 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 척추 근위축증 및 안구 근위축증 중에서 선택되는, 방법.
  31. 제27항에 있어서,
    샘플이 생검, 세침 흡인 또는 수술 동안 수득되는 것인, 방법.
  32. 제27항에 있어서,
    샘플이 살아있는 세포, 동결 세포, 고정 및 투과된 세포, 또는 포르말린-고정된, 파라핀-매립된 세포를 포함하는, 방법.
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