BRPI0617488A2

BRPI0617488A2 - mÉtodo para a monitoraÇço do estado de uma doenÇa associada a uma via de vegf-165 ativada por ultra-expressço ou por mutaÇço de proteÍna vegf-165 em um paciente, mÉtodo de seleÇço de terapia para um paciente humano com uma doenÇa e mÉtodo de dignàstico para detectar uma doenÇa associada a uma via de vegf-165 ativada por ultra-expressço ou por mutaÇço de proteÍna vegf-165 em um paciente

Info

Publication number: BRPI0617488A2
Application number: BRPI0617488-4A
Authority: BR
Inventors: James J Elting; Walter P Carney; Peter J Hamer
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2011-07-26
Also published as: US20090221010A1; RU2008119468A; RU2395090C2; JP2009512860A; AU2006304764A1; EP1946115A4; WO2007047955A3; IL190852A0; EP1946115A2; CA2626019A1; CN101506351A; ZA200803430B; KR20080073711A; WO2007047955A2

Abstract

<B>MÉTODO PARA A MONITORAÇçO DO ESTADO DE UMA DOENÇA ASSOCIADA A UMA VIA DE VEGF-165 ATIVADA POR ULTRA-EXPRESSçO OU POR MUTAÇçO DE PROTEÍNA VEGF-165 EM UM PACIENTE, MÉTODO DE SELEÇçO DE TERAPIA PARA UM PACIENTE HUMANO COM UMA DOENÇA E MÉTODO DE DIAGNÕSTICO PA- RA DETECTAR UMA DOENÇA ASSOCIADA A UMA VIA DE VEGF-165 ATIVADA POR ULTRA-EXPRESSçO OU POR MUTAÇçO DE PROTEÍNA VEGF-165EM UM PACIENTE<D>A presente invenção refere-se a biomarcadores e ao uso de biomarcadores para a previsão e prognóstico de câncer bem como o uso de biomarcadores para monitorar a eficácia do tratamento de câncer. Especificamente, essa invenção refere-se ao uso de VEGF-165 como um biomarcador para inibidores de multicinases.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARAA MONITORAÇÃO DO ESTADO DE UMA DOENÇA ASSOCIADA A UMAVIA DE VEGF-165 ATIVADA POR ULTRA-EXPRESSÃO OU POR MUTA-ÇÃO DE PROTEÍNA VEGF-165 EM UM PACIENTE, MÉTODO DE SELEÇÃODE TERAPIA PARA UM PACIENTE HUMANO COM UMA DOENÇA E MÉ-TODO DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR UMA DOENÇA ASSOCIADA AUMA VIA DE VEGF-165 ATIVADA POR ULTRA-EXPRESSÃO OU POR MU-TAÇÃO DE PROTEÍNA VEGF-165EM UM PACIENTE".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a biomarcadores e ao uso de bi-omarcadores para a previsão e prognóstico de câncer bem como o uso debiomarcadores para monitorar a eficácia de tratamento de câncer. Especifi-camente, essa invenção refere-se ao uso de VEGF-165 como um biomarca-dor para inibidores de multicinases.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Receptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFRs) eseus ligantes, fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs)1 desempe-nham papéis críticos em migração e proliferação de célula endotelial. O sistemade VEGFR/VEGF inclui três receptores (VEGFR-1 , VEGFR-2, e VEGFR-3) equatro ligantes (VEGF-A, B, C1 D, e E e fator de crescimento placental). VEGF-Aulteriormente consiste em quatro isoformas, VEGF-121, VEGF-165, VEGF-185,e VEGF-204, derivado de transcrição alternativa do gene de VEGF-A. Os recep-tores são proteína de variação de membrana com domínios de tirosina cinaseintracelulares. Como com outras cinases de proteína, ativação dos VEGFRs éum mecanismo chave nos sinais de regulação para proliferação de célula endo-telial, e anormalidade de VEGFR/VEGF são pensados contribuir para angiogê-nese anormal em várias doenças humanas tais como psoríase e malignidade.

Na embriogênese, o sistema de VEGFR/VEGF é essencial parao desenvolvimento correto do sistema vascular. Em adultos, VEGFR/VEGF éimportante em cura de ferimento, inflamação e angiogênese.

Um ensaio não invasivo para a circulação de níveis de VEGF-165 em pacientes antes do tratamento com fármaco é um auxiliar potencial-mente importante para a formação da decisão terapêutica. Embora ensaiosto e quimioterapia fossem relatados. Portanto, VEGF-165 pode servir comoum indicador de prognóstico valioso, e como um biomarcador para monitorara eficácia do tratamento com um inibidor de multicinases.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a biomarcadores e ao uso de bio-marcadores para a previsão e prognóstico de câncer bem como o uso debiomarcadores para monitorar a eficácia de tratamento de câncer. Especifi-camente, essa invenção refere-se ao uso de VEGF-165 como um biomarca-dor para um inibidor de multicinases (por exemplo, Sorafenib).

Em uma concretização, a presente invenção refere-se ao uso deimunoensaios quantitativos para medir níveis de proteína de VEGF-165 emfluidos de corpo de ser humano antes do tratamento com um inibidor de mul-ticinases (por exemplo, Sorafenib). Os ditos níveis são particularmente úteiscomo um indicador do potencial para pacientes com câncer tratados com uminibidor de multicinases (por exemplo, Sorafenid) para se beneficiar de talterapia.

Medição dos níveis de pré-tratamento de VEGF-165 pode serusada clinicamente como um auxiliar terapêutico para seleção de terapia depaciente, para monitorar o estado de uma doença pré-neoplásica/neoplásicaem um paciente, e/ou para monitorar como um paciente com uma doençapré-neoplásica/neoplásica está respondendo a uma terapia. Em uma concre-tização, os níveis de VEGF-165 podem ser usados para auxiliar na seleçãode terapia de paciente, e para formar descisões sobre o melhor método paraa terapia do paciente.

Os níveis de VEGF-165 podem ser medidos em amostras de pa-ciente tais como, mas não limitados a, sangue, soro, plasma, urina, saliva,sêmen, exsudato de mama, fluido cerebroespinhal, lágrimas, escarro, muco,linfa, citosóis, ascítes, efusões pleurais, fluido amniótico, lavagens de bexigae lavagens broncoalveolares.

Em uma concretização, a invenção refere-se ao uso de um imu-noensaio como um método de seleção de pacientes os quais são prováveisde beneficar a partir de tratamento com inibidor de multicinases (por exem-plo, Sorafenid) por medição de níveis de pré-tratamento de VEGF-165 emamostras de paciente e avaliação de resultado provável com base em ummonograma de provável resultado de paciente versus níveis de VEGF-165.

Um método de monitoração do estado de uma doença associado a uma trajetória de VEGF-165 ativada em um paciente pode ser outro prog-nóstico para uma doença, em que os níveis de proteína de VEGF-165 totaisnas amostras do paciente são indicativos de um resultado de tratamento me-lhor ou mais pobre para o paciente. O prognóstico pode ser um resultadoclínico selecionado do grupo que consiste em taxa de resposta (RR), respos- ta completa (CR), resposta parcial (PR), doença estável (SD), benefício clí-nico [incluindo resposta completa] (CR), resposta parcial (PR) e doença es-tável (SD), tempo de progressão (TTP), sobrevivência livre de progressão(PFS) e sobrevivência total (OS).

Esses métodos podem estar em formatos padrão, por exemplo, um imunoensaio na forma de um imunoensaio de sanduíche, tais como en-saio imunossorvente ligado a enzima de sanduíche (ELISA) ou um ensaio deequivalente. Esses imunoensaios podem usar anticorpos monoclonais, taiscomo anticorpos monoclonais de anti-VEGF-165. Além do mais, o anticorpomonoclonal pode ser biotinilado. Uma outra concretização da invenção refere-se a um imunoen-saio quantitativo para medir mudanças em série nos níveis de proteína deVEGF-165 total em amostras de paciente, como um método de seleção deterapia para um paciente com uma doença, por exemplo, uma doença pré-neoplásica/neoplásica. Como um exemplo, um tal método de seleção de terapia podecompreender as etapas de:

(a) deleção e quantificação imunológica do nível de proteína deVEGF-165 total em uma amostra de uma população de controle;

(b) deleção e quantificação imunológica do nível de proteína de VEGF-165 total em amostras tiradas de um paciente durante um tempo; e

(c) determinação de se usar terapia convencional e/ou terapia deinibidor de multicinases (por exemplo, Sorafenid) para tratar o paciente combase no nível de proteína de VEGF-165 nas amostras do paciente.

Por exemplo, se o nível de proteína de VEGF-165 em uma amos-tra do paciente demonstrasse ser acima de 70 pg/ml, a conclusão poderiaser tirada que o paciente tem uma doença dirigida de VEGF1 e a decisãopode ser feita para usar terapia de inibidor de multicinases (por exemplo,Sorafenib) para tratar o paciente, ou sozinho ou em combinação com um oumais outras terapias.

Uma terapia dirigida de trajetória de VEGF-165 pode ser terapiasde inibidores de multicinases, inibidores de cinase de tirosina, bis-aril uréias,inibidores de anti-sentido de VEGFR-2 ou anticorpo monoclonal ou similares.Por exemplo, terapia dirigida de trajetória de VEGF-165 pode ser a bis-ariluréia Sorafenib, que é um inibidor de angiogênese bem como inibidor decinase de tirosina, ou o inibidor de cinase de tirosina, STI571 (também co-nhecido como imatinib mesilato ou Gleevec®).

Uma outra concretização da invenção refere-se ao uso de imu-noensaios quantitativos para detectar mudanças em níveis de VEGF-165 emcombinação com níveis de uma ou mais outras proteínas. Tal(is) proteína(s)adicional(ais) pode(m) incluir, por exemplo, inibidores (por exemplo, inibidorde metaloproteinase-1 (TIMP-1)), oncoproteínas (por exemplo, HER-2/neu,ras p21), receptores de fator de crescimento (por exemplo, receptor de fatorde crescimento epidérmico (EGFR)1 receptor alfa de fator de crescimentoderivado de plaqueta (PDGFR-alfa), proteínas de metástase (por exemplo,ativador de tipo uroquinase (uPA), marcadores de tumor (por exemplo, antí-geno carcinoembriogênico (CEA)), e supressores de tumor (por exemplo,p53). Esses métodos podem então ser usados, por exemplo, como ferra-mentas de diagnóstico/prognóstico, seleção de terapia para pacientes comuma doença, monitoração do estado de uma doença em um paciente, e mo-nitoração como um paciente com uma doença está respondendo a uma te-rapia dirigida de trajetória de VEGF ou outras terapia. Seria vantajoso paratestar pacientes (por exemplo, pacientes com câncer) para mudanças emsérie tanto em proteínas de VEGF-165 totais quanto proteínas adicionais,tais como proteínas que ativam a trajetória de VEGF-165, como um meio dealargar a perspectiva clínica, recursos terapêuticos, e parâmetros de diag-nóstico/prognóstico a fim de selecionar as ótimas combinações terapêuticaspara a maioria dos resultados de tratamento promissores.

Em uma outra concretização, a invenção provê um kit de teste demonitoração da eficácia de uma terapêutica em uma amostra de paciente,compreendendo um anticorpo específico para uma proteína. Em certas con-cretizações, o kit ulteriormente inclui instruções para o uso do kit. Em certasconcretizações, o kit pode ulteriormente incluir soluções para suspensão oufixação das células, etiquetas ou rótulos detectáveis, soluções para tornar um polipeptídeo suscetível à ligação de um anticorpo, soluções para a Iisede células, ou soluções para a purificação de polipeptídeos. Em ainda umaoutra concretização, o anticorpo é específico para VEGF-165.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 ilustra os níveis de VEGF-165 médio em populaçõesde pacientes para doença estável ou progressiva.

A figura 2 ilustra a diminuição média de tumor medida em popu-lações de pacientes para doença estável ou progressiva.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

É entendido que esta invenção não é limitada à metologiá parti- cular, protocolos, linhas de células, espécies e gêneros de animais, constru-tos, e reagentes descritos e como tal pode variar. É também entendido que aterminologia usada aqui é para a finalidade de descrever apenas concretiza-ções particulares, e pretende-se não limitar o escopo da presente invençãoserá limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Deve ser observado que como usado aqui e nas reivindicaçõesanexas, as formas singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referência plural anão ser que o contexto claramente dita de outra maneira. Assim, por exem-plo, referência a "um gene" é uma referência a um ou mais genes e incluiseus equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim pordiante.

A não ser que de outra maneira definida, todos os termos técni-cos ou científicos usados aqui têm os mesmos significados que comumenteentendendido àquele de habilidade normal na técnica à qual esta invençãopertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ouequivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testa-gem da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agoradescritos.

Todas as publicações e patentes mencionadas aqui são incorpo-radas aqui por referência para a finalidade de descrição, por exemplo, osconstrutos e metodologias que são descritos nas publicações que poderiamser usados em ligação com a invenção presentemente descrito. As publica-ções discutidas acima e através de todo o texto são providos unicamentepara sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aquideve ser interpretado como uma admissão que os inventores não são entitu-Iados para antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior.

DEFINIÇÕES

Para conveniência, o significado de certos termos e frases em-pregados no relatório, exemplos e reivindicações anexas são providos abai-xo.

O termo "amostra de paciente", como usado aqui, refere-se auma amostra obtida a partir de um paciente. A amostra pode ser de qualquerfluido ou tecido biológico. A amostra pode ser uma amostra que é derivadade um paciente. Tais amostras incluem, mas não são limitadas a, sangue,soro, plasma, urina, saliva, sêmen, exsudato de mama, fluido cerebroespi-nhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citosóis, ascítes, efusões pleurais, fluidoperitoneal, fluido amniótico, lavagens de bexiga, e lavagens broncoalveolar,células sangüíneas (por exemplo, leucócitos), amostras de tecido ou biopsia(por exemplo, biopsia de tumor), ou células a partir das mesmas. Amostrasbiológicas podem também incluir seções de tecidos tais como seções conge-ladas tiradas para as finalidades histológicas.

O termo "biomarcador" inclui uma ampla faixa de eventos intra- eextracelulares bem como mudanças fisiológicas de organismo totais. Bio-marcadores podem representar essencialmente qualquer aspecto de funçãode célula, por exemplo, mas não limitado a, níveis ou taxa de produção demoléculas de sinalização, fatores de transcrição, metabólitos, transcritos degene bem como modificações pós-traducionais de proteínas. Biomarcadorespodem incluir análise de genoma inteiro de níveis de transcrito ou análise deproteoma total de modificações e/ou níveis de proteína.

Um biomarcador pode também referir-se a um gene ou produtode gene que é regulado para cima ou para baixo em um composto tratado,célula doente de um indivíduo tendo a doença comparada com uma céluladoente não tratada. Isto é, o gene ou o produto de gene é suficientementeespecífico à célula tratada que pode ser usada, opcionalmente com outrosgenes ou produtos de gene, para identificar, prever ou deter eficácia de umamolécula pequena. Assim, um biomarcador é um gene ou produto de geneque é característico da eficácia de um composto em uma célula doente ou aresposta daquela célula doente a tratamento pelo composto.

O termo "câncer" inclui, mas não é limitado a, tumores sólidos,tais como cânceres da mama, do trato respiratório, cerebral, de órgãos re-produtivos, do trato digestivo, do trato urinário, de olho, de fígado, de pele,de cabeça e pescoço, tiróide, paratireóide, e suas metástases distantes. Otermo também inclui linfomas, sarcomas e leucemias.

Exemplos de câncer de mama incluem, mas não são limitados a,carcinoma de duto invasivo, carcinoma Iobular invasivo, carcinoma de dutoin situ, e carcinoma Iobular in situ.

Exemplos de cânceres do trato respiratório incluem, mas não sãolimitados a, carcinoma de pulmão de célula pequena e de célula não peque-na, bem como adenoma bronquial e blastoma pleuropulmonar.

Exemplos de cânceres cerebrais incluem, mas não são limitadosa, tronco cerebral e glioma hipotalámico, astrocitoma cerebelar e cerebral,meduloblastoma, ependimoma bem como tumor neuroectodérmico e pineal.

Tumores dos órgãos reprodutivos de homem incluem, mas nãosão limitados, próstata e câncer testicular. Tumores dos órgãos reprodutivosde mulher incluem, mas não são limitados a, câncer endometrial, cervical,ovariano, vaginal e vulvar, bem como sarcoma do útero.

Tumores do trato digestivo incluem, mas não são limitados a,cânceres anal, de cólon, colorretal, esofageano, de vesícula biliar, gástrico,pancreático, retal, de intestino delgado, e de glândula salivar.

Tumores do trato urinário incluem, mas não são limitados a, bexi-ga, peniano, rim, pelve renal, ureter, e uretral.

Cânceres de olho incluem, mas não são limitados a, melanomaintra-ocular e retinoblastoma.

Exemplos de cânceres de fígado incluem, mas não são limitadosa, carcinoma hepatocelular (carcinomas de célula de fígado com ou sem va-riante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma de duto biliar intra-hepático), e colangiocarcinoma hepatocelular misto.

Cânceres de pele incluem, mas não são limitados a, carcinomade célula escamosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pelede célula de Merkel, e câncer de pele de não melanoma.

Cânceres de cabeça e pescoço incluem, mas não são limitadosa, câncer de laringe/hipofaríngeo/nasofaríngeo/orofaríngeo, e câncer de ca-vidade oral e lábio.

Linfomas incluem, mas não são limitados a, Iinfoma relacionadocom AIDS, Iinfoma de não Hodgkin, Iinfoma de célula T cutâneo, doença deHodgkin e Iinfoma do sistema nervoso central.

Sarcomas incluem, mas não são limitados a, sarcoma de tecidomole, osteossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, Iinfossarcoma e rabdo-miossarcoma.

Leucemias incluem, mas não são limitadas a, leucemia mielóideaguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemiamielógena crônica e leucemia de célula pilosa.

O termo "paciente" ou "indivíduo" como usado aqui inclui mamífe-ros (por exemplo, seres humanos e animais).

A presente invenção refere-se a imunoensaios quantitativos quemedem os níveis de proteína de VEGF-165 em amostras de paciente. Essesensaios podem ser úteis para a seleção de uma terapia para um pacientecom uma doença associada à trajetória de VEGF-165. Como usado aqui,uma "trajetória de VEGF-165" é definida como uma trajetória de VEGF-165ativada por ou ultra-expressão ou mutação de proteína de VEGF-165 e co-mo tal, inclui trajetórias de VEGF-165 mutacionalmente estimuladas e/oureguladas para cima.

Exemplos de doenças neoplásicas associadas a uma trajetóriade VEGF-165 ativada bem como pré-cânceres que levam a doenças neoplá-sicas, são as seguintes: meduloblastoma metastático, tumores estromaisgastrointestinais (GIST), dermatofibrossarcoma protruberantes(DFSP), do-enças mieloproliferativas crônicas (CMPD), câncer colorretal, câncer de có-lon, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer depulmão de célula pequena, leucemia mielógena aguda, câncer de tiróide,câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de rim, melanoma, câncer demama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de ca-beça e pescoço, tumores cerebrais, carcinoma hepatocelular e malignidadeshematológicas. Assim, os níves de proteína de VEGF-165, sozinhos ou emcombinação com níveis de outras proteínas (por exemplo, outras oncoprote-ínas) podem ser usados para prever resultado clínico e/ou como um auxiliarna seleção de terapia.

Assim, a presente invenção descreve e reivindica o pedido de umimunoensaio para quantitivamente medir níveis de VEGF-165 em amostrasde paciente (por exemplo, níveis de VEGF-165 circulantes) a fim de avaliar aprobabilidade que um paciente que sofre de câncer beneficiaria a partir dotratamento com um inibidor de multicinases (por exemplo, Sorafenib).

Em uma concretização da invenção, proteína de VEGF-165 équantificada em amostras de paciente na hora do diagnóstico, ou antes dotratamento. Tais amostras de paciente podem ser, por exemplo, sangue,soro, plasma, urina, saliva, sêmen, exsudato de mama, fluido cerebroespi-nhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citosóis, ascítes, efusões pleurais, fluidoamniótico, lavagens de bexiga e lavagens broncoalveolares, entre outrasamostras de fluido de corpo. As amostras de paciente a serem frescas oucongeladas, e podem ser tratadas com heparina, citrato ou EDTA.

Como um exemplo de um imunoensaio que pode ser usado nosmétodos da invenção é um sanduíche ELISA. No entanto, pode ser aprecia-do que outros métodos, além daqueles descritos aqui, podem ser usadospara quantificar proteína de VEGF-165 em amostras de paciente. Além domais, numerosos métodos de detecção podem ser usados para visualizar aproteína de VEGF-165, tais como rótulos luminescentes.

Muitos formatos podem ser adaptados para o uso com os méto-dos da presente invenção. Por exemplo, a detecção e quantificação de pro-teína de VEGF-165 em amostras de paciente podem ser realizadas, por en-saios imunossorventes ligados a enzima, radioimunoensaios, ensaios desanduíche de anticorpo duplo, ensaios de algutinação, imunoensaios fluo-rescentes, microscopia de varredura e imunoeletrônica, entre outros ensaiosnormalmente conhecidos na técnica. A quantificação de proteína de VEGF-165 em tais ensaios podem ser adaptados por métodos convencionais co-nhecidos na técnica. Em uma concretização, mudanças em série em níveisde proteína de VEGF-165 circulantes podem ser detectados e quantificadospor um ensaio de sanduíche em que o anticorpo de captura foi imobilizadousando-se técnicas convencionais sobre a superfície do suporte.

Suportes adequados incluem, por exemplo, suportes de polímerosintético, tais como polipropileno, poliestireno, poliestireno substituído, polia-crilamidas (tais como poliamidas e cloreto de polivinila), contas de vidro, a-garose e nitrocelulose.

Um exemplo de um imunoensaio de sanduíche ELISA que podeser usado nos métodos da presente invenção, usa anticorpo monoclonal deVEGF-165 de anti-humano de camundongo purificado como o anticorpo decaptura e anticorpo policlonal de VEGF-165 de anti-humano de bode biotini-lado como o anticorpo de detector. O anticorpo monoclonal de captura é i-mobilizado nas cavidades de placa de microtítulo. Amostras de plasma/sorode ser humano diluídas ou padrões de VEGF-165 (proteína de VEGF-165 detipo selvagem recombinante) são incubadas nas cavidades para permitir li-gação de antígeno de VEGF-165 pelo anticorpo monoclonal de captura. De-pois da lavagem das cavidades, o antígeno de VEGF-165 imobilizado é ex-posto a um anticorpo de detector biotinilado depois do qual as cavidades sãonovamente lavadas. Um conjugado de peroxidase de rábano silvestre-estreptavidina é então adicionado. Depois de uma lavagem final, substratoTMB BLUE é adicionado às cavidades para detectar atividade de peroxidaseligada. A reação é parada pela adição de ácido sulfúrico a 2,5 N, e a absor-bância é medida a 450 nm. Correlação dos valores de absorbância de amos-tras com os padrões de VEGF-165 permite a determinação de um valorquantitativo de VEGF-165 em pg/ml de soro ou plasma.

Pode ser apreciado que outras proteínas (por exemplo, inibido-res, oncoproteínas, receptores de fator de crescimento, fatores angiogêni-cos, proteínas de metástase, marcadores de tumor, supressores de tumor,proteína associadas à trajetória de VEGF) podem ser adequadas para de-tecção ou quantificação em combinação com VEGF-165. Por exemplo, ou-tras proteínas adequadas para a testagem juntamente com VEGF-165 inclu-em inibidor de tecido de metaloproteinase-1 (TIMP-1), HER-2/neu, ras p21,receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor alfa de fatorde crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento endotelial vascu-lar (VEGF), ativador de plasminogênio de tipo uroquinase (uPA), antígeno decarcinoembriogênico (OEA), e p53. Essas outras proteínas podsm ser detec-tadas usando-se ensaios que são conhecidos por aqueles versados na téc-nica. Por exemplo, imunoensaios para a quantificação de HER-2/neu eTIMP-1 estão comercialmente disponíveis, tal como Oncogene ScienceTIMP-1 ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA (USA)) que pode detec-tar valores de ng/ml de níveis de TIMP-1 em plasma ou soro humano.

Monitoração dos níveis de pré-tratamento de VEGF-165 pode serindicativa de resultado clínico após o tratamento com um inibidor de multici-nases (por exemplo, Sorafenib). Um método de avaliação de um resultadoclínico pode ser avaliado de taxa de resposta (RR), resposta completa (CR),resposta parcial (PR), doença estável (SD)1 benefício clínico (incluindo res-posta completa (CR), resposta parcial (PR) e doença estável (SD)), tempode progressão (TTP)1 sobrevivência livre de progressão (PFS), e sobrevi-vência total (OS).

O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e espe-cificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonaisde comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos(por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo. Anticor-pos úteis de acordo com os métodos da invenção podem ser preparados pormetodologia convencional e/ou por engenheiramento genético. Por exemplo,anticorpos de acordo com a invenção incluem aqueles anticorpos que seligam a VEGF-165.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um an-ticorpo de comprimento total, em geral a ligação de antígeno ou seu domíniovariável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fab,Fab1, F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo decadeia simples; anticorpos bioespecíficos; e anticorpos multiespecíficos for-mados a partir de fragmentos de anticorpo.

O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a umanticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos, isto é, anticorpos individuais compreendendo uma populaçãoidêntica exceto quanto a mutações de ocorrência natural possível que po-dem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monocloriais sãoaltamente específicos, isto é, dirigidos contra um sítio antigênico simples.Além do mais, em contraste com as preparações de anticorpo convencionais(policlonal) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidas contradeterminantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigidocontra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indi-ca o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma populaçãosubstancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretadoquando exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular.Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com apresente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primei-ramente descrito por Kohler, e outros, (Nature 256:495, 1975), ou podem serproduzidos por métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a patenteU.S. Nq 4.816.567). Anticorpos monoclonais podem também ser isolados debibliotecas de anticorpo de fago usando-se as técnicas descritas em, porexemplo,, Clackson, e outros, (Nature 352:624-628,1991) and Marks, e ou-tros, (J. Mol. Biol. 222:581 -597, 1991).

Os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos"quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ouleve é idêntica com ou homóloga a seqüências correspondentes em anticor-pos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ousubclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) com ou homóloga(s) a seqüências correspondentes em an-ticorpos derivados de uma outra espécie ou que pertencem a uma outraclasse ou subclasse de anticorpo bem como fragmentos de tais anticorpos,contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (vide, por exemplo,a patente U.S. Ng 4,816,567; and Morrison, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 81 :6851-6855, 1984).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exem-plo, de camundongo) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mí-nima derivada da imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticor-pos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo de receptor) emque regiões de resíduos hipervariáveis do receptor são substituídas por resí=duos de região hipervariáveis de uma espécie não humana (anticorpo dedoador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo aespecificidade de afinidade e capacidade desejada. Em alguns casos, resí-duos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana pode ser substi-tuída por resíduo não humanos correspondentes. Além do mais, anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não são encontrados noanticorpo receptor ou no anticorpo de doador. Tais modificações são produ-zidas para ulteriormente refinar desempenho de anticorpo. Em geral, o anti-corpo humanizado pode compreender substancialmente completo de pelomenos um ou tipicamente dois domínios variáveis, em que a totalidade ousubstancialmente completa das regiões hipervariáveis correspondem àque-las de uma imunoglobulina não humana e a totalidade ou substancialmentecompleta das FRs são aquelas de seqüência de imunoglobulina de ser hu-mano. O anticorpo humanizado opcionalmente também pode compreenderpelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc),tipicamente aquela de uma imunoglobulina de ser humano. Para uma revi-são, vide Jones, e outros, (Nature 321 :522-525, 1986); Reichmann, e ou-tros, (Nature 332:323-329, 1988); and Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992).

Fragmentos de anticorpo de "sFv" ou "FV" de cadeia simples"compreendem os domínios de Vh e Vl de anticorpo, em que esses domíniosestão presentes em uma cadeia de polipeptídeo simples. Em geral, o poli-peptídeo de Fv ulteriormente compreende um Iigador de polipeptídeo entredomínios de Vh e Vl que permite o sFv pára formar a estrutura desejada pa-ra a ligação de antígeno. Para uma revisão, vide Pluckthun (The Pharmaco-Iogy of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Sprin-ger-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994).

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo peque-nos com dois sítios de ligação de antígeno, fragmentos esse que compreen-dem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) ligado a um domínio variá-vel de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl). Por uso deum Iigador que é demasiadamente curto para permitir emparelhamentc entreos dois domínio na mesma cadeia, os domínios são forçados para empare-lhar com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sí-tios de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais totalmente, porexemplo, na , EP 404,097; WO 93/11161 ; and Hollinger, e outros, (Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448, 1993).

A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos des-critos em Zapata, e outros, (Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995). Resumi-damente, tais anticorpos compreendem um par de segmentos de Fd tandem(Vh-Ch1-Vh-Ch1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno. An-ticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Anticorpos monoclonais representativos úteis de acordo com es-sa invenção incluem anticorpos monoclonais de VEGF-165 totais de anti-humanos de camundongo, tais como aqueles encontrados no kit sanduícheELISA Oncogene Science designado para medir anticorpos monoclonais deVEGF-165 de ser humano úteis de acordo com essa invenção servem paraidentificar proteínas de VEGF-165 em vários testes de prognósticos de labo-ratório, por exemplo, em amostras clínicas.

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas molecularesadicionais úteis aqui, incluindo a preparação de anticorpos incluem Bergerand Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymo-loqy, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, e outros, (Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual. (Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Mole-cular Biology, (F. M. Ausabel e outros [Eds.], Current Protocols, a joint ventu-re between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.(supplemented through 2000)); Harlow e outros, (Monoclonal Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]);Fundamental Immunology. (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Har-low, e outros, (Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring HarborLaboratory Press (1998)).

Os anticorpos úteis de acordo com essa invenção para identificarproteínas de VEGF-165 podem ssr marcados de qualquer modo convencio-nal. Um exemplo de um rótulo é peroxidase de rábano silvestre, e um exem-plo de um método de marcação de anticorpos é por uso de complexos debiotina-estrepavidina.

Como apropriado, anticorpos usados nos imunoensaios dessainvenção que são usados como traçadores podem ser marcados de qual-quer modo, diretamente ou indiretamente, que resulta em um sinal que évisível ou pode ser tornado visível. Substâncias de marcador detectáveisincluem radionuclídeos, tais como 3H, 125I, e 131I; fluorescedores, tais comoisotiocianato de fluoresceína, e outros fluorocromos, ficobiliproteínas, ficoeri-trina, quelado de terra-rara, vermelho Texas, dansila e rodamina; reagentescolorimétricos (cromogênios); materiais opacos eletrônicos, tal como ourocoloidal; bioluminescedores; quimioluminescedores; corantes; enzimas, taiscomo peroxidade de rábano silvestre, fosfatase alcalina, glicose oxidase,glicose-6-fosfato desidrogenase, acetilcolinaesterase, alfa-, beta-galactosidase, entre outros; coenzimas; substratos de enzima, co-fatores deenzima; inibidores de enzima; subunidades de enzima; íons de metal; radi-cais livres; ou qualquer outra substância imunologicamente ativa ou inerteque provê um meio de detecção ou medição da presença ou quantidade deimunocomplexo formado. Exemplar das combinações de substrato de enzi-ma são peroxidase de rábano silvestre e tetrametil benzidina (TMB) e fosfa-tases alcalinas e fosfato de paranitrofenila (pNPP).

Uns outros sistemas de quantificação e detecção de acordo comessa invenção produzem sinais, luminescentes, bioluminescentes (BL), quí-miluminescentes (CL). Nos ensaios quimiluminescentes (CL) ou biolumines-centes(BL), a intensidade ou a emissão de luz total é medida e é relacionadacom a concentração do análito conhecido. Luz pode ser medida quantitati-vamente usando-se um luminômetro (tubo fotomultiplicador como o detec-tor), ou um dispositivo acoplado a carga, ou qualitativamente por meio defilme fotográfico ou raios X. As principais vantagens do uso de tais ensaios ésua simplicidade e sensibilidade analítica, que permitem a detecção e/ou aquantificação de quantidades muito pequenas de análito.

Rótulos luminescentes exemplares são ésteres de acridínio, acri-dínio sulfonil, carboxamidas luminol, umbeliferona, derivados de isoluminol,fotoproteínas, tais como aequorina e Iuciferases oriundas de vaga-lumes,bactérias marinhas, Vargulla e Renilla. Luminol pode ser usado opcional-mente com uma molécula aumentadora tal como 4-iodofenol ou ácido 4-hidróxi-cinâmico. Tipicamente, um sinal de CL é gerado por tratamento comum oxidante sob condições básicas.

Sistemas de detecção Iuminescente adicionais são aqueles emque o sinal (marcador detectável) é produzido por uma reação enzimáticaem um substrato. Esquemas de detecção de CL e de BL foram desenvolvi-dos para analisar fosfatase alcalina (AP), glicose oxidase, glicose 6-fosfatodesidrogenase, peroxidase de rábano silvestre (HRP), rótulos de xantina-oxidase, entre outros. AP e HRP são dois rótulos de enzima que podem serquantificados por uma faixa de reações de CL e BL. Por exemplo, AP podeser usado com um substrato, tal como substrato de fosfato de adamantil 1,2-dioxetano arila (por exemplo, AMPPD ou CSPD; Kricka, LJ., "Chemilumines-cence and Bioluminescence, Analysis by," Molecular Biology and Biotechno-logy: A Comprehensive Desk Reference (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers;N.Y., N.Y.; 1995)); por exemplo, um sal de dissódio de 4-metóxi-4-(3-fosfatefenil) espiro [1,2-dioxetano-3,2'-adamantano], com ou sem uma molé-cula aumentadora tal como diocloreto de 1-(trioctilfosfonio metil)-4- (tributil-fosfônio metil) benzeno. HRP pode ser usado com substratos, tal como,2',3,,6,-trifluorofenil-metóxi-10-metilacridan-9-carboxilato.

Reações de CL e de BL podem ser adaptadas para análise nãoapenas de enzimas, mas também de outros substratos, cofatores, inibidores,íons de metal e similares. Por exemplo, reações de luminol, Iuciferase devaga-lume, e Iucinerase bacteriana marinha são reações indicadoras para aprodução ou consumo de peróxido, ATP e NADPH, respectivamente. Elespodem ser acoplados a outras reações que envolvem oxidases, cinases edesidrogenases, e podem ser usados para medir qualquer componente dareação acoplada (enzima, substrato, cofator).

O marcador detectável pode ser diretamente ou indiretamenteligado a um anticorpo usado em um ensaio dessa invenção. Exemplar deuma ligação indireta do rótulo detectável é o uso de um par de ligação entreum anticorpo e um marcador ou o uso de um sistema de ampliação de sinal.

Exemplos de pares de ligação que podem ser usados para ligaranticorpos para marcadores detectáveis são biotina/avidina, estreptovidina,ou antibiotina; avidina/anti-avidina; tiroxina/globulina de ligação tiroxina; antí-geno/anticorpo; anticorpo/anti-anticorpo; carboidrato/lecitinas; anticorpo deanti-hapteno/hapteno; corantes e molécula hidrofóbicas/sítios de ligação deproteína hidrofóbica; inibidor de enzima, coenzima ou cofator/enzima; ácidopolinucléico/seqüência de ácido polinucléico homóloga; fluoresceí-na/antifluoresceína; dinitrofenol/antidinitrofenol; vitamina B12/fator intrínsico;cortisona, cortisol/proteína de ligação a cortisol; e Iigantes para proteína dereceptor específica/proteína de receptor específica associada a membrana.

Vários meios para rótulos de ligação diretamente ou indiretamen-te a anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, rótulos podem serligados ou covalentemente ou não covalentemente. Métodos de conjugaçãode anticorpo exemplares são descritos em Avarmeas, e outros, Scan. J. Im-munol. 8(Suppl. 7): 7, 1978); Bayer, e outros, Meth. Enzymol. 62:308, 1979;Chandler, e outros, J. Immunol. Meth. 53:187, 1982; Ekeke and Abuknesha,J. Steroid Biochem. 11 :1579, 1979; Engvall and Perlmann, J. Immunol.109:129, 1972; Geoghegan, e outros, Immunol. Comm. 7:1 , 1978; and Wil-son and Nakane, Immunofluorescence and Related Techniques, Elsevi-er/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978).

Dependendo da natureza do rótulo, várias técnicas podem serempregadas para a detecção e quantificação do rótulo. Para fluorescedores,um gande número de fluorômetros estão disponíveis. Para quimiluminesce-dores, luminômetros ou películas estão disponíveis. Com enzimas, um pro-duto fluorescente, quimiluminescente ou colorido pode ser determinado oumedido fluorometricamente, luminometricamente, espectrofotometricamenteou visualmente.

Vários tipos de compostos quimiluminescentes tendo um acridí-nio, benzacridínio, ou tipo acridan de sistemas de anéis heterocíclicos sãooutros exemplos de rótulos. Exemplos de ésteres ds acridínio incluem aque-les compostos tendo anéis ou sistemas de anéis heterocíclicos que contêm oheteroátomo em um estado de oxidação positiva incluem tais sistemas deanéis como acridínio, benz[a]acridínio, benz[b]acridínio, benz[c]acridínio, umcátion de benzimidazol, quinolizínio, isoquinolínio, quinolínio, um quinolíniosubstituído cíclico, fenantridínio e quinoxalínio.

Um traçador pode ser preparado por ligação ao anticorpo sele-cionado ou diretamente ou indiretamente um grupo funcional reativo presen-te no éster de benzacridínio ou acridínio, como é bem-conhecido por aquelesversados na técnica (vide, por exemplo, Weeks, e outros, Clin. Chem. 29(8):1474-1479, 1983). Exemplos de compostos são ésteres de acridinío e ben-zacridínio com um grupo de saída de anel de arila e o grupo funcional reativoem qualquer a posição para ou meta do anel de arila , (vide, por exemplo, apatente U.S. Nq 4.745.181 e WO 94/21823).

Como usado aqui, "terapias dirigidas a trajetória de VEGF" inclu-em quaisquer terapias que são direcionadas à trajetória de VEGF, incluindoinibição de expressão de proteína de VEGF (por exemplo, oligonucleotídeosde anti-sentido), prevenção de localização de membrana essencial para ati-vação de VEGFR, ou inibição de efetores a jusante de VEGFR (por exemplo,cinases de treonina/serina de Raf). Terapias dirigidas a trajetória de VEGFincluem inibidores de multicinases, inibidores de cinase de tirosina, anticor-pos monoclonais, e bis-aril uréias.

Um exemplo de um inibidor de cinase é a bis-aril uréia Sorafenib,uma pequena molécula e um novo inibidor de ação dupla tanto de Raf (umaproteína-serina/cinase de treonina) quanto VEGFR (receptor de fator endote-liai vascular, uma cinase de tirosina de receptor), e conseqüentemente uminibidor tanto de proliferação de célula de tumor quanto angiogênese (OnyxPharmaceuticals, Richmond, CA, and Bayer Pharmaceuticals Corporation,West Haven, CT (USA); Lyons, e outros, Endocrine-Related Câncer 8:219-225, 2001). Além disso, Sorafenib demonstrou inibir outras cinases de tirosi-na de receptor envolvidas em progressão e neovascularização de tumor,incluindo PDGFR-β, Flt-3, e c-KIT. PD166285 (Pfizer, Groton, CT), um inibi-dor de cinase de tirosina geral, pode antagonizer tanto repostas mediadaspor FGF-2 quanto PDGF (Bansai, e outros, J. Neuroscience Res. 74(4):486-493, 2003).

Outras terapias exemplares que direcionam a trajetória de VEGFincluem: Sutent/SU11248, PTK 787, MLN518, PKC-412, CDP860, e XL9999.Sutent/SU11248 (sunitinib malato; uma indolina-2-ona) (Pfizer, Groton, CT)direciona cinases de tirosina de receptor (RTKs) incluindo PDGFR, com efei-tos antiangiogênicos e antitumor. PDGFR desempenha um papel significati-vo na promoção de angioênese por regulação da proliferação e migração deperfeitos, células que suportam vasos sangüíneos, e acredita-se que Su-tent/SU 11248 iniba ação angiogênica de PDGFR.

PTK 787 (Novartis, Basel, Switzerland and Schering AG, Berlin,Germany) é uma molécula pequena oral de agente de antiangiogênese (ani-linoftalazina) ativa contra PDGFR, bem como contra VEGFR e receptores decinase de tirosina de c-Kit (vide, por exemplo, Garcia-Echevera and Fabbro,Mini Reviews in Medicinal Chemistry 4(3):273-283, 2004).MLN518 (antigamente conhecido como CT53518; MilleniumPharmaceuticals, Cambridge, MA) é uma molécula pequena oral, projetadapara inibidor cinases de tirosina de receptor de tipo Il (RTKs)1 incluindoPDGFR, FLT3, e c-Kit.

PKC-412 [midostaurin; N-benzoyl-estauroesporina (um derivadode estauroesporina, um produto de bactérias de Streptomyces); Novartis,Basel, Suíça) inibe PDGFR, VEGFR e cinase de proteína múltipla Cs, "quepode ser especialmente atraente em pacientes com KIT de tipo selvagemcom mutações em PDGFR" (PKC 412-An Interview with Charles Blanke,MD, FACP (www.gistsupport.org/pkc412.html); vide também Reichardt, eoutros, J. Clin. Oncol. 23(16S): 3016, 2005).

XL999 (um dos vários Spectrum Selective Kinase Inhibitors®(SSKIs) da Exelixis (South San Francisco, CA, USA)] inibe VEGFR, bemcomo outros RTKs, tais como PDGFR- beta, FGFR1, e FLT3.

EXEMPLOS

Estruturas, materiais, composições e métodos descritos aqui des-tinam-se a serem representativos da invenção, e será entendido que o esco-po da invenção não é limitado pelo escopo dos exemplos. Aqueles versadosna técnica reconheceram que a invenção pode ser praticada com variaçõesnas estruturas, composições e métodos descritos, e tais variações são con-sideradas como dentro do âmbito da invenção.

Exemplo. Elisa de microtítulo de sanduíche de fase sólida parapreparação de amostra no soro e no plasma

Amostras adequadas para análise pela ELISA de VEGF-165 in-cluem plasma humano tratado com heparina, citrato ou EDTA e soro huma-no. Devido a fatores de interferência possíveis, cuidado especial deve sertomado na preparação e ensaio de soro e plasma humano. Qualquer materi-al floculante seria removido das amostras por microcentrifugação antes dadiluição. A concentração final da espécie de soro ou plasma a ser examina-da seria cerca de 12-13% (uma diluição de 1:8 da espécie no diluente daamostra). Por exemplo, 40 μΙ de amostra podem ser diluídos em 280 μΙ dediluente de amostra, e 100 μΙ adicionados às cavidades de microplaca.PROCEDIMENTO DE ENSAIO

O seguinte protocolo de ELISA é aquele usado para o sanduícheELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA) para medir VEGF-164 de serhumano em plasma ou soro humano.

1. Prepar uma solução de trabalho (1X) de lavagem de placa(provida como parte do kit de ensaio).

2. Adicionar amostra pré-diluída e controles, e cada um dos seispadrões de VEGF-165 (de 0 a 8000 pg/ml) em duplicata por pipetar 100 μlpara dentro das cavidades apropriadas usando-se as extremidades da pipe-ta limpa para cada amostra e Padrão. Adicionar Padrão 0 a uma cavidadeadicional a ser usada para a determinação de substrato em branco.

3. Cobrir cavidades com uma capa plástica ou um selador de pla-ca. Incubar placa de microtítulo por 1,5 h a 37°C.

4. Remover cuidadosamente a capa plástica ou o selador de pla-ca. Lavar cavidades usando-se 300 μl por cavidade com seis ciclos de tam-pão de lavagem de placa (lavar para três ciclos, girar a placa 180°, e lavarpara três mais ciclos).

5. Pipetar 100 μΙ de anticorpo de detector para dentro de todas ascavidades exceto a cavidade de substrato em branco, que é deixada vazia.Cobrir as cavidades com um pedaço fresco de capa plástica. Incubar placade microtítulo por 1 h a 37°C.

6. Preparar conjugado de trabalho por diluir um volume apropria-do de concentrado de conjugado (diluição de 1:50) em diluente de conjuga-do.

7. Lavar cavidades como na etapa 4. Prosseguir imediatamente aetapa 8.

8. Preparar 100 μΙ de conjugado de trabalho para dentro de todasas cavidades exceto a cavidade de substrato em branco, que é deixada va-zia. Cobrir as cavidades com um pedaço fresco de capa plástica. Incubar aplaca de microtítulo a temperatura ambiente (20-27°C) por 1 h.

9. Preparar substrato de trabalho por combinar partes iguais dasolução A e da solução B. 6 ml de cada solução de substrato proverão 12 mlde substrato de trabalho, suficiente para desenvolver um placa de microtítu-lo. Ajustar o volume do substrato de trabalho com base no número de tirasusadas. Misturar cavidade.

10. Distribuir o substrato de trabalho em um reagente limpo resis-tente e permiti-lo vir para a temperatura ambiente.

11. Lavar cavidades como na etapa 5. Cuidado: Não permitir queplacas sequem. Prosseguir imediatamente para a etapa 12.

12. Pipetar 100 μΙ de substrato de trabalho para dentro de todasas cavidades e cobrir a cavidade com capa plástica ou selador de placa. In-cubar a placa de microtítulo a temperatura ambiente (20-27°C) por 45 minutos.

13. Pipetar 100 μΙ de solução de parada para dentro de todas ascavidades.

14. Medir a absorbância em cada cavidade usando-se um leitorde placa espectofotométrico a um comprimento de onda de 650 nm. Cavida-des seriam lidas no período de 30 minutos de adição da solução de parada.

CURVAS PADRÃO

Análises quantitativas foram produzidas por construção de umacurva padrão usando-se padrão de VEGF-165 (VEGR-165 de ser humanorecombinante) a 6 concentrações diferentes de 0, 150, 1000, 3000, 5000 e8000 pg/ml.

AMOSTRAS DE PLASMA E SORO DE SER HUMANO

Amostras de plasma congeladas foram obtidas a partir de pacien-tes com câncer de pulmão de célula não pequena confirmado antes do tra-tamento como Sorafenib.

Exemplo 2. Plasma oriundo de pacientes de carcinoma de pul-mão de célula não pequena

Amostras em duplicata foram usadas para medir o nível deVEGF-165 usando-se o Oncogene Science VEGF-165 ELISA (OncogeneScience, Cambridge, MA) pelas orientações dos fabricantes. O valor médiodas medições em duplicata foi determinado para cada paciente. O nível deVEGF-165 médio para 31 pacientes nesse estudo é relatado na tabela 1. Atabela 2 mostra a diminuição média de tumor medida radiologicamente nosgrupos de paciente respectivos. Os resultados mostram que o nível médiode VEGF-165 em pacientes os quais subseqüentemente respondiam a tra-tamento com Sorafenib que mostra doença estável era de 67,9 pg/ml. Aque-les pacientes os quais mostravam doença progressiva apesar do tratamentocom Sorafenib tinha um nível de VEGF-165 de 227,2 pg/ml. Aqueles pacien-tes que mostravam doença estável tinham um crescimento médio de tumorde 5,1% enquanto aqueles nos quais a doença progrediu tiveram um cres-cimento médio no tumor de 20,6%. Esses resultados são mostrados grafi-camente nas figuras 1 e 2.

TABELA 1: VEGF-165

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TABELA 2: DIMINUIÇÃO DE TUMOR

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A descrição da concretização exposta acima da invenção foi a-presentada para as finalidades de ilustração e descrição. Pretende-se quenão seja exaustiva ou não limite a invenção à forma precisa descrita, e obvi-amente muitas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamen-tos acima. As concretizações foram escolhidas e descritas a fim de explicaros princípios da invenção e sua aplicação prática para permitir desse modoque outros versados na técnica utilizem a invenção em várias concretizaçõese com várias modificações quando são adequadas ao uso particular con-templado. Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referên-cia.

Claims

1. Método para a monitoração do estado de uma doença associ-ada a uma via de VEGF-165 ativada por ultra-expressão ou por mutação deproteína VEGF-165 em um paciente, e/ou monitoração de como um pacientecom a dita doença está respondendo a uma terapia, caracterizado pelo fatode que compreende detectar e quantificar imunologicamente mudanças emsérie em níveis de proteína VEGF-165 em amostras de paciente coletadasao longo do tempo, em que níveis crescentes de proteína VEGF-165 ao lon-go do tempo indicam progressão da doença ou uma resposta negativa à ditaterapia, e em que níveis decrescentes de proteína VEGF-165 ao longo dotempo indicam remissão de doença ou uma resposta positiva à dita terapia.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,, caracterizado pelofato de que a dita terapia é selecionada de inibidores de multicinases, inibi-dores de tirosina cinase, anticorpos monoclonais, e bis-aril uréias.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita terapia é uma terapia dirigida por via de VEGF-165.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a dita terapia dirigida por via de VEGF-165 é o mesilato de imati-nibe inibidor de tirosina cinase ou a bis-aril uréia Sorafenib.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as ditas amostras do paciente são de fluido corporal selecionadoa partir do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, urina, saliva, sê-men, exsudato de mama, fluido cerebroespinhal, lágrimas, escarno, muco,linfa, citosóis, ascítes, efusões pleurais, fluido amniótico, lavagens de bexigae lavagens broncoalveolares.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito fluido de corpo é soro ou plasma.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita detecção e quantificação imunológica é por um imunoen-saio na forma de sanduíche ELISA ou ensaio equivalente.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o sanduíche ELISA ou ensaio equivalente compreende o uso deum ou mais anticorpos monoclonais que seletivamente ligam a proteínaVEGF-165.

9. Método de seleção de terapia para um paciente humano comuma doença, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) detecção e quantificação imunológica do nível médio de pro-teína VEGF-165 nas amostras de controle tiradas de indivíduos de uma po-pulação de controle;(b) detecção e quantificação imunológica de mudanças em sérienos níveis de proteína VEGF-165 em amostras de paciente equivalentestiradas do paciente ao longo do tempo;(c) comparação dos níveis de proteína VEGF-165 nas amostrasdo paciente com o nível médio de proteína VEGF-165 nas amostras de con-trole; e(d) determinação de se usar terapia convencional e/ou terapiadirigida a uma via de VEGF-165 ativada por ultra-expressão ou por mutaçãode proteína VEGF-165 para tratar o paciente com base nas diferenças entreos níveis de proteína VEGF-165 nas amostras do paciente e o nível médiode proteína VEGF-165 nas amostras de controle, e em virtude das mudan-ças em série entre os níveis de proteína VEGF-165 nas amostras do pacien- te.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que as amostras de paciente são de um paciente com câncer o qualnão respondeu ao tratamento.

11. Método de diagnóstico para detectar uma doença associada auma via de VEGF-165 ativada por ultra-expressão ou por mutação de proteínaVEGF-165 em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) detecção e quantificação imunológica do nível médio de pro-teína VEGF-165 nas amostras de controle tiradas de indivíduos de uma po-pulação de controle;(b) detecção e quantificação imunológica de mudanças em sériena proteína VEGF-165 em amostras equivalentes de um paciente coletadasde um paciente ao longo do tempo; e(c) comparação dos níveis de proteína VEGF-165 nas amostrasdo paciente com o nível médio de proteína VEGF-165 nas amostras de con-trole; em que um nível de proteína VEGF-165 nas amostras do paciente queestá acima do nível médio de proteína VEGF-165 nas amostras de controleé indicativo de uma via de VEGF-165 ativada e a presença de uma doençaassociada com uma via de VEGF-165 ativada no paciente.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que as ditas detecção e quantificação imunológicas das etapas(a) e (b) são por um imunoensaio na forma de um sanduíche ELISA ou en-saio equivalente.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 11, caracteri-zado pelo fato de que é ainda prognóstico para a dita doença, em que osditos níveis de proteína VEGF-165 nas amostras do paciente são indicativosde um prognóstico melhor ou mais pobre para o dito paciente.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o dito prognóstico é um resultado clínico selecionado dogrupo que consiste em taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), res-posta parcial (PR), doença estável (SD), tempo para progressão (TTP)1 so-brevivência livre de progressão (PFS), sobrevivência total (OS), e benefíciosclínicos, que compreendem resposta completa (CR), resposta parcial (PR), edoença estável (SD).

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que níveis crescentes de VEGF-165 são indicativos de uma pro-babilidade maior de metástase ou recorrência precoce.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 11, caracteriza-do pelo fato de que a dita doença é uma doença pré-neoplásica/ neoplásíca.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a dita doença pré-neoplásica/neoplásica é selecionada dogrupo que consiste em meduloblastoma metastático, dermatofibrossarcomaprotruberantes, tumores estromais gastrointestinais, câncer colorretal, cân-cer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena,câncer de pulmão de célula pequena, doenças mieloproliferativas crônicas,leucemia mielógena aguda, câncer de tiróide, câncer pancreático, câncer debexiga, câncer de rim, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata,câncer ovariano, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, tumores ce-rebrais, carcinoma hepatocelular, malignidades hematológicas, e pré-cânceres que levam aos cânceres acima mencionados.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 11, caracteri-zado pelo fato de que compreende ainda o uso de um imunoensaio para de-tectar ou detectar ou quantificar níveis de uma ou mais outras proteínas nasamostras do indivíduo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a dita outra proteína é ou as ditas outras proteínas são se-lecionadas do grupo que consiste em inibidores, oncoproteínas, receptoresde fator de crescimento, fatores angiogênicos, proteínas de metástase, mar-cadores de tumor, e supressores de tumor.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o dito inibidor é inibidor de tecido de metaloproteinase-1(TIMP-1 ), as ditas oncoproteínas são selecionadas do grupo que consisteem HER-2/neu e ras p21, os ditos receptores de fator de crescimento sãoselecionados do grupo que consiste em receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) e receptor alfa de fator de crescimento derivado de pla-queta (PDGFR-alfa), o dito fator angiogênico é fator de crescimento endote-Iial vascular (VEGF)1 a dita proteína de metástase é ativadora de plaminogê-nio de tipo urocinase (uPA), o dito marcador de tumor é antígeno carcinoem-briônico (CEA), e o dito supressor de tumor é p53.

21. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 11, caracteriza-do pelo fato de que as ditas amostras do paciente são de fluido corporal se-lecionado a partir do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, urina,saliva, sêmen, exsudato de mama, fluido cerebroespinhal, lágrimas, escarno,muco, linfa, citosóis, ascítes, efusões pleurais, fluido amniótico, lavagens debexiga e lavagens broncoalveolares.

22. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 11, caracteriza-do pelo fato de que o dito fluido corporal é soro ou plasma.tra proteína é ou as ditas outras proteínas são selecionadas do grupo queconsiste em inibidores, oncoproteínas, receptores de fator de crescimento,fatores angiogênicos, proteínas de metástase, marcadores de tumor, e su-pressores de tumor.

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27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o dito ini-bidor é inibidor de tecido de metaloproteinase-1(TIMP-1 ), as ditas oncoproteínas são selecionadas do grupo queconsiste em HER-2/neu e ras p21, os ditos receptores de fator de crescimen-to são selecionados do grupo que consiste em, receptor de fator de cresci-mento epidérmico (EGFR) e receptor alfa de fator de crescimento derivadode plaqueta (PDGFR-alfa), o dito fator angiogênico é fator de crescimentoendotelial vascular (VEGF), a dita proteína de metástase é ativadora de pla-minogênio de tipo urocinase (uPA), o dito marcador de tumor é antígeno car-cinoembriônico (OEA), e o dito supressor de tumor é p53.

28. Método de diagnóstico para detectar uma doença associadaa uma trajetória de VEGF-165 em um paciente compreendendo:(a) deleção e quantificação imunológica do nível médio de proteí-na de VEGF-165 nas amostras de controle tiradas de indivíduos de uma po-pulação de controle;(b) deleção e quantificação imunológica mudanças em série naproteína de VEGF-165 em amostras de um paciente amostra tirada de umpaciente durante um tempo; e(c) comparação dos níveis de proteína de VEGF-165 nas amos-tras do paciente com o nível médio de proteína de VEGF-165 nas amostrasde controle; em que um nível de proteína de VEGF-165 nas amostras dopaciente que está acima do nível médio de proteína de VEGF-165 nas a-mostras de controle é indicativo de uma trajetória de VEGF-165 ativada e apresença de uma doença no paciente.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que as ditasdetecção e quantificação imunológicas das etapas (a) e (b) são por um imu-noensaio na forma de um sanduíche ELISA ou ensaio equivalente.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, que é ainda prog-nóstico para a dita doença, em que os ditos níveis de proteína de VEGF-165nas amostras do paciente são indicativos de um prognóstico melhor ou maispobre para o dito paciente.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o ditoprognóstico é um resultado clínico selecionado do grupo que consiste emtaxa de resposta (RR), resposta completa (CR), resposta parcial (PR), doen-ça estável (SD), tempo para progressão (TTP), sobrevivência livre de pro-gressão (PFS), sobrevivência total (OS), e benefícios clínicos, que compre-endem resposta completa (CR), resposta parcial (PR), e doença estável(SD).

32. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a dita do-ença é uma doença pré-neoplásica/neoplásica.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a dita do-ença pré-neoplásica/neoplásica associada a uma trajetória de PDGF ativadaé selecionada do grupo que consiste em meduloblastoma metastático, tumo-res estromais gastrointestinais, dermatofibrossarcoma protruberantes, cân-cer colorretal, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célu-la não pequena, câncer de pulmão de célula pequena, doenças mieloprolife-rativas crônicas, leucemia mielógena aguda, câncer de tiróide, câncer pan-creático, câncer de bexiga, câncer de rim, melanoma, câncer de mama, cân-cer de próstata, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de cabeça e pes-coço, tumores cerebrais, carcinoma hepatocelular, malignidades hematológi-cas, e pré-canceres que levam aos cânceres acima mencionados.

34. Método de acordo com a reivindicação 28, compreendendoainda o uso de um imunoensaio para detectar ou detectar ou quantificar ní-veis de uma ou mais outras proteínas nas amostras do paciente.

35. Método da reivindicação 34, em que a dita outra proteína é ouas ditas outras proteínas são selecionadas do grupo que consiste em inibido-res, oncoproteínas, receptores de fator de crescimento, fatores angiogêni-cos, proteínas de metástase, marcadores de tumor, e supressores de tumor.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o dito ini-bidor é inibidor de tecido de metaloproteinase-1 (TIMP-1), as ditas oncopro-teínas são selecionadas do grupo que consiste em HER-2/neu e ras p21, osditos receptores de fator de crescimento são selecionados do grupo queconsiste em receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e receptoralfa de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR-alfa), o dito fatorangiogênico é fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a dita proteí-na de metástase é ativadora de plaminogênio de tipo urocinase (uPA), o ditomarcador de tumor é antígeno carcinoembriônico (CEA), e o dito supressorde tumor é p53.