BR112013011072B1 - métodos de diagnóstico e prognóstico de cânceres que expressam receptor alfa de folato - Google Patents

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Abstract

RECEPTOR ALFA DE FOLATO COMO UM MARCADOR DE DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO PARA CÂNCERES QUE EXPRESSAM RECEPTOR ALFA DE FOLATO A presente invenção diz respeito a métodos e estojos para avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRa, métodos e estojos para prever a progressão de câncer de ovário em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRa, métodos e estojos para avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolverá um câncer que expressa FRa, e métodos de estratificar um sujeito com um câncer que expressa FRa nos grupos de terapia de câncer. Os métodos envolvem determinar o nível de receptor alfa de folato (FRa) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito e comparar este nível com o nível de FRa em uma amostra controle.

Description

Pedidos Relacionados
[001]Este pedido reivindica o benefício da data do depósito do pedido provisório U.S. No. 61/410.497, depositado em 5 de novembro de 2010, e pedido provisório U.S. No. 61/508.444, depositado em 15 de julho de 2011, cujos teores nas íntegras estão por meio disso incorporados pela referência.
Antecedentes da Invenção
[002]Em humanos, o receptor de alta afinidade para folato vem em três isoformas: alfa, beta e gama. As formas alfa e beta são tipicamente ligadas nas membranas de células por uma âncora de glicosil fosfatidilinositol (GPI). Elas reciclam entre compartimentos extracelulares e endocíticos e são capazes de transportar fola- to na célula. Formas solúveis de FRα podem ser derivadas pela ação de proteases ou fosfolipase nos receptores de folato ancorados na membrana.
[003]Receptor alfa de folato (também referido como FRα, FR-alfa, FOLR-1 ou FOLR1) é expresso em uma variedade de tecidos epiteliais, incluindo aqueles do plexo coróide, pulmão, tireóide, rim, útero, mama, trompas de falópio, epidídimos e glândulas salivares. Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman SD et al, Cancer Res 52: 6708-6711. Sobre-expressão de FRα foi observada em vários cânceres, incluindo câncer de pulmão (por exemplo, carcinomas bronquioal- veolares, tumores carcinóides e cânceres de pulmão de célula não pequena, tais como adenocarcinomas); mesotelioma; câncer de ovário; câncer renal; câncer cerebral (por exemplo, ependimoma anaplástica, astrocitoma pilocítica juvenil cerebelar, e metástases cerebrais); câncer cervical; câncer nasofaringeal; tumor derivado me- sodermalmente; carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço; câncer do endométrio; adenocarcinomas endometrióide do ovário, cistadenocarcinomas serosos, câncer de mama; câncer de bexiga; câncer pancreático; câncer ósseo (por exemplo, osteosarcoma em alto grau); câncer pituitário (por exemplo, adenomas pituitários); câncer colorretal e câncer da tireóide medular. Vide por exemplo, patente U.S. No. 7.754.698; pedido de patente U.S. No. 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2) : 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Fisher R.E. J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Parker N. et al. Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). Em alguns tipos de cânceres (por exemplo, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço), um maior nível de expressão de FRα é associado com um prognóstico de piora, enquanto em outros tipos de cânceres (por exemplo, cânceres de pulmão de célula não pequena), um maior nível de expressão de FRα é associado com um prognóstico de melhora. Vide, por exemplo, Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009).
[004]A detecção precoce de câncer aumenta as taxas de sobrevivência e qualidades de vida. Para aumentar a probabilidade de detecção precoce e tratamento, existe uma necessidade urgente de métodos não invasivos para diagnosticar câncer, determinar o nível de risco de desenvolver câncer, e prever a progressão de câncer. A presente invenção satisfaz estas necessidades para cânceres que expressam FRα.
Sumário da Invenção
[005]A presente invenção diz respeito a métodos de avaliar se um sujeito está sofrendo de cânceres que expressam FRα, tal como câncer de pulmão ou ovário, métodos de avaliar a progressão de cânceres que expressam FRα, tal como câncer de pulmão ou ovário, em um sujeito sofrendo com os cânceres que expressam FRα, métodos de estratificar um sujeito com câncer que expressa FRα em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer, métodos de avaliar a eficácia do tratamento MORAb-003 de câncer de ovário ou câncer de pulmão e estojos para avaliar se um sujeito está sofrendo de cânceres que expressam FRα, tal como câncer de pulmão ou ovário, ou para avaliar a progressão de cânceres que expressam FRα, tal como câncer de pulmão ou ovário, em um sujeito. Métodos de Avaliar se um Sujeito está Sofrendo de um Câncer que Expressa FRα
[006]Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα; em que o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Em uma modalidade particular, a amostra é tanto urina, soro, plasma quanto ascites.
[007]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de urina derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα. Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de soro derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de soro derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα.
[008]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o câncer que expressa FRα é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, me- sotelioma, câncer de ovário, câncer renal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer nasofaringeal, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer do en- dométrio, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer pituitário, câncer colorretal e câncer da tireóide medular. Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena, tal como um adenocarcinoma.
[009]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos de avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0010]Em vários aspectos dos aspectos anteriores da invenção, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, ou cerca de 20.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0011]Em vários aspectos, o nível de FRα é determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo do 19D4 anticorpo; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o 19D4 anticorpo; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo do 9F3 anticorpo; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0012]Em uma modalidade particular, o anticorpo liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo MOV18. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo liga no mesmo epí- topo que o anticorpo MOV18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, o anticorpo inclui (i) a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0013]Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um par de anticorpos selecionados do grupo que consiste em (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado; (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado; (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado; e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado.
[0014]Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, affibody, avimer, versabody, nanobody, e um anticorpo do domínio. Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo é marcado, por exemplo, com um marcador selecionado do grupo que consiste em um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0015]Em certas modalidades, o nível de FRα é determinado usando uma técnica selecionada do grupo que consiste em análise western blot, radioimunoen- saio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) e ensaio ELISA.
[0016]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a amostra controle é um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável.
[0017]Em certas modalidades, a amostra é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é diluída antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de determinar o nível de FRα na amostra.
[0018]Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre os níveis de FRα na amostra derivada do sujeito e na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário; em que o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado, (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado, (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado, e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado. Por exemplo, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites. Métodos de Avaliar a Progressão de um Câncer Expressando FRα em um Sujeito
[0019]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá rapidamente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá lentamente ou regredirá, avaliando por meio disto a progressão do câncer que expressa FRα no sujeito; em que o nível de FRα que não é ligado a uma célula na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Em uma modalidade particular, a amostra é urina, soro, plasma ou ascites.
[0020]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de urina derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá rapidamente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá lentamente ou regredirá, avaliando por meio disto a progressão do câncer que expressa FRα no sujeito.
[0021]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a métodos de avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de soro derivada do sujeito com o nível de FRα na amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra de soro derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá rapidamente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra de soro deriva-da do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá lentamente ou regredirá, avaliando por meio disto a progressão do câncer que expressa FRα no sujeito.
[0022]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o câncer que expressa FRα é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, me- sotelioma, câncer de ovário, câncer renal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer nasofaringeal, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer do en- dométrio, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer pituitário, câncer colorretal e câncer da tireóide medular. Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena, tal como um adenocarcinoma.
[0023]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos de avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0024]Em vários aspectos dos aspectos anteriores da invenção, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, ou cerca de 20.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0025]Em vários aspectos, o nível de FRα é determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0026]Em uma modalidade particular, o anticorpo liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo MOV18. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo liga no mesmo epí- topo que o anticorpo MOV18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, o anticorpo inclui (i) a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0027]Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um par de anticorpos selecionado do grupo que consiste em (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado; (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado; (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado; e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado.
[0028]Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, affibody, avimer, versabody, nanobody, e um anticorpo do domínio. Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo é marcado, por exemplo, com um marcador selecionado do grupo que consiste em um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0029]Em certas modalidades, o nível de FRα é determinado usando uma técnica selecionada do grupo que consiste em análise western blot, radioimunoen- saio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) e ensaio ELISA.
[0030]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a amostra controle é um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável. Em uma outra modalidade, a amostra controle é uma amostra previamente obtida do sujeito.
[0031]Em certas modalidades, a amostra é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é diluída antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de determinar o nível de FRα na amostra.
[0032]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a métodos de avaliar a progressão de câncer de ovário em um sujeito sofrendo de câncer de ovário, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer de ovário progredirá rapidamente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer de ovário progredirá lentamente ou regredirá, avaliando por meio disto a progressão de câncer de ovário no sujeito; em que o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado, (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado, (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado, e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado. Por exemplo, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites. Métodos de Estratificar um Câncer que Expressa FRα nos Grupos de Terapia de Câncer
[0033]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de estratificar um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra derivada do sujeito; e estratificar o sujeito em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer com base no nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula; em que o nível de FRα que não é ligado a uma célula na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, a amostra é selecionada do grupo que consiste em urina, soro, plasma ou ascites.
[0034]Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de estratificar um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito; e estratificar o sujeito em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer com base no nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra. Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a métodos de estratificar um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro derivada do sujeito; e estratificar o sujeito em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer com base no nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de soro.
[0035]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o câncer que expressa FRα é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, me- sotelioma, câncer de ovário, câncer renal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer nasofaringeal, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer do en- dométrio, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer pituitário, câncer colorretal e câncer da tireóide medular. Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena, tal como um adenocarcinoma.
[0036]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos de avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0037]Em vários aspectos dos aspectos anteriores da invenção, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, ou cerca de 20.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0038]Em vários aspectos, o nível de FRα é determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, o anticorpo é selecio- nado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0039]Em uma modalidade particular, o anticorpo liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo MOV18. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo liga no mesmo epí- topo que o anticorpo MOV18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, o anticorpo inclui (i) a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0040]Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um par de anticorpos selecionado do grupo que consiste em (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado; (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado; (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado; e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado.
[0041]Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, affibody, avimer, versabody, nanobody, e um anticorpo do domínio. Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo é marcado, por exemplo, com um marcador selecionado do grupo que consiste em um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0042]Em certas modalidades, o nível de FRα é determinado usando uma técnica selecionada do grupo que consiste em análise western blot, radioimunoen- saio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) e ensaio ELISA.
[0043]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a amostra controle é um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável.
[0044]Em certas modalidades, a amostra é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é diluída antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de determinar o nível de FRα na amostra.
[0045]Em uma modalidade particular, o sujeito é estratificado em câncer de ovário do Estágio I, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV.
[0046]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de estratificar um sujeito com câncer de ovário em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e estratificar o sujeito em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer com base no nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra; em que o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado, (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado, (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado, e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado. Por exemplo, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites. Métodos de Monitorar a Eficácia de Tratamento com MORAb-003 de Câncer de Ovário ou Câncer de Pulmão
[0047]Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de monitorar a eficácia de MORAb-003 no tratamento de câncer de ovário ou câncer de pulmão em um sujeito sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra derivada do sujeito, em que o sujeito foi previamente administrado com MORAb-003; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 não é efici-ente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 é eficiente. Em modalidades particulares, o nível de FRα que não é ligado a uma célula na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites.
[0048]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método de monitorar a eficácia de tratamento com MORAb-003 de câncer de ovário ou câncer de pulmão em um sujeito sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que o sujeito foi previamente administrado com MORAb-003; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de urina derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 não é eficiente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MO- RAb-003 é eficiente.
[0049]Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de monitorar a eficácia de tratamento com MORAb-003 de câncer de ovário ou câncer de pulmão em um sujeito sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro derivada do sujeito, em que o sujeito foi previamente administrado com MORAb-003; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de soro derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra de soro derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra con-trole é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 não é eficiente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra de soro derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 é eficiente.
[0050]Em vários aspectos, o nível de FRα é determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0051]Em uma modalidade particular, o anticorpo liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo MOV18. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo liga no mesmo epí- topo que o anticorpo MOV18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, o anticorpo inclui (i) a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0052]Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um par de anticorpos selecionado do grupo que consiste em (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado; (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado; (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado; e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado.
[0053]Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, affibody, avimer, versabody, nanobody, e um anticorpo do domínio. Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo é marcado, por exemplo, com um marcador selecionado do grupo que consiste em um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0054]Em certas modalidades, o nível de FRα é determinado usando uma técnica selecionada do grupo que consiste em análise western blot, radioimunoen- saio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) e ensaio ELISA.
[0055]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a amostra controle é um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável. Em uma outra modalidade, a amostra controle é uma amostra previamente obtida do sujeito.
[0056]Em certas modalidades, a amostra é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é diluída antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de determinar o nível de FRα na amostra. Métodos de Prever Se um Sujeito Responderá ao tratamento com MORAb- 003
[0057]Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para prever se um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, tal como câncer de ovário ou câncer de pulmão, responderá ao tratamento com MORAb-003, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
[0058]Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para prever se um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, tal como câncer de ovário ou câncer de pulmão, responderá ao tratamento com MORAb-003, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de urina derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
[0059]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método para prever se um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, tal como câncer de ovário ou câncer de pulmão, responderá ao tratamento com MORAb-003, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de soro derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de soro derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
[0060]Em modalidades adicionais, o câncer que expressa FRα é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, mesotelioma, câncer de ovário, câncer renal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer nasofaringeal, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer do endométrio, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer pituitário, câncer color- retal e câncer da tireóide medular. Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα de pulmão é câncer de pulmão de célula não pequena, tal como adenocarcinoma.
[0061]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a métodos para prever se um sujeito sofrendo de câncer de ovário responderá ao tratamento com MORAb-003, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
[0062]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, ou cerca de 20.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0063]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o nível de FRα é determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0064]Em uma modalidade particular, o anticorpo liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo MOV18. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo liga no mesmo epí- topo que o anticorpo MOV18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, o anticorpo inclui (i) a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0065]Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um par de anticorpos selecionado do grupo que consiste em (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado; (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado; (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado; e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado.
[0066]Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, affibody, avimer, versabody, nanobody, e um anticorpo do domínio. Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo é marcado, por exemplo, com um marcador selecionado do grupo que consiste em um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0067]Em certas modalidades, o nível de FRα é determinado usando uma técnica selecionada do grupo que consiste em análise western blot, radioimunoen- saio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) e ensaio ELISA.
[0068]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a amostra controle é um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável.
[0069]Em certas modalidades, a amostra é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é diluída antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de determinar o nível de FRα na amostra.
[0070]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método para prever se um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, tal como câncer de ovário ou câncer de pulmão, responderá ao tratamento com MORAb-003, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre os níveis de FRα na amostra derivada do sujeito e na amostra controle é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003; em que o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado, (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado, (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado, e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado. Por exemplo, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites.
[0071]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o MO- RAb-003 para tratamento é (a) um anticorpo que compreende a sequência de ami- noácidos de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO:7 e a sequência de amino- ácidos de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO:8; (b) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; ou (c) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Métodos de Tratar um Sujeito Com Câncer de Ovário ou Câncer de Pulmão
[0072]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos de tratar um sujeito com câncer de ovário ou câncer de pulmão determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra derivada do dito sujeito (por exemplo, urina, soro, plasma ou ascites); e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão; e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de MORAb-003 ao dito sujeito.
[0073]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos de tratar um sujeito com câncer de ovário ou câncer de pulmão determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra de urina derivada do dito sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão; e administrar uma quantidade terapeuti- camente efetiva de MORAb-003 ao dito sujeito.
[0074]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos de tratar um sujeito com câncer de ovário ou câncer de pulmão determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra de soro derivada do dito sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de soro derivada do dito sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão; e administrar uma quantidade terapeutica- mente efetiva de MORAb-003 ao dito sujeito.
[0075]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a métodos para tratar um sujeito sofrendo de câncer de ovário determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003; e administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de MORAb-003 ao dito sujeito.
[0076]Em modalidades particulares, o nível de FRα que não é ligado a uma célula na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα.
[0077]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, ou cerca de 20.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[0078]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o nível de FRα é determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Por exemplo, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0079]Em uma modalidade particular, o anticorpo liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003. Em uma outra modalidade, o anticorpo inclui SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma outra modalidade, o anticorpo é o anticorpo MOV18. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo liga no mesmo epí- topo que o anticorpo MOV18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Em certas modalidades, o anticorpo inclui (i) a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0080]Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um par de anticorpos selecionado do grupo que consiste em (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado; (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado; (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado; e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado.
[0081]Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, affibody, avimer, versabody, nanobody, e um anticorpo do domínio. Alternativamente, ou em combinação, o anticorpo é marcado, por exemplo, com um marcador selecionado do grupo que consiste em um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0082]Em certas modalidades, o nível de FRα é determinado usando uma técnica selecionada do grupo que consiste em análise western blot, radioimunoen- saio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) e ensaio ELISA.
[0083]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, a amostra controle é um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável.
[0084]Em certas modalidades, a amostra é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é diluída antes de determinar o nível de FRα na amostra. Alternativamente, ou em combinação, a amostra é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de determinar o nível de FRα na amostra.
[0085]Em um aspecto adicional, a presente invenção diz respeito a um método para tratar um sujeito sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre os níveis de FRα na amostra derivada do sujeito e na amostra controle é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003; em que o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB-003 marcado, (b) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 24F12 marcado, (c) anticorpo 26B3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 19D4 marcado, e (d) anticorpo 9F3 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo 26B3 marcado. Por exemplo, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites.
[0086]Em várias modalidades dos aspectos anteriores da invenção, o MO- RAb-003 para tratamento é (a) um anticorpo que compreende a sequência de ami- noácidos de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO:7 e a sequência de amino- ácidos de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO:8; (b) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; ou (c) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.
Estojos da Invenção
[0087]Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um estojo para avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα ou para avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito, o estojo incluindo meios para determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do sujeito; e instruções para uso do estojo para avaliar se o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα ou para avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα. Por exemplo, o câncer que expressa FRα é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, mesotelioma, câncer de ovário, câncer renal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer nasofaringeal, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer do endométrio, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer pituitário, câncer colorretal e câncer da tireóide medular. Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Ainda em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena, por exemplo, adenocarcinoma. Em uma modalidade adicional, a amostra é tanto urina, soro, plasma quanto ascites.
[0088]Em uma modalidade adicional, o meio inclui um receptor alfa de agente de ligação de folato (FRα), por exemplo, um anticorpo. Em uma modalidade adicional, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma cadeia leve de região variável selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a cadeia leve de região variável LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[0089]Em certas modalidades, o anticorpo é marcado incluindo, mas sem limitações, um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, ou um marcador de enzima.
[0090]Ainda em uma outra modalidade, o estojo inclui um meio para obter uma amostra do sujeito.
[0091]A presente invenção é adicionalmente ilustrada pela seguinte descrição detalhada e desenhos.
Descrição Resumida dos Desenhos
[0092]A figura 1 é um representação esquemática de um imunoensaio de método de eletroquimioluminescência (ECLIA) para avaliar o FRα em urina conforme descrito nos exemplos. Anticorpo MOV18 anexado aos suportes sólidos liga FRα em urina. O FRα foi subsequentemente detectado pela ligação no anticorpo MORAb-003 marcado por Ru.
[0093]A figura 2 mostra a distribuição de níveis de FRα na urina de sujeitos com câncer de ovário e sujeitos controles normais medidos por ECLIA (vide Exemplo 1).
[0094]A figura 3 representa a detecção de FRα em urina de pacientes com câncer de ovário (banda desbotada na pista 1, banda clara na pista 2) usando imu- noblotting (vide Exemplo 5).
[0095]A figura 4 mostra a distribuição de níveis de FRα na urina de sujeitos com câncer de ovário e sujeitos controles normais medidos por ECLIA depois que a urina foi tratada com guanidina, conforme descrito no exemplo 7.
[0096]A figura 5 representa um curva ROC mostrando o sensibilidade e es-pecificidade da medição de ECLIA de níveis de FRα em urina depois que a urina foi tratada com guanidina, conforme descrito no exemplo 7. A área sob a curva (AUC) mede a precisão do teste na separação de câncer de ovário de sujeitos controles. Um valor de corte (acima do qual os resultados do teste foram considerados anormais) de 9.100 pg/mL foi usado.
[0097]A figura 6 mostra a distribuição de níveis de FRα em câncer de ovário (OC) e sujeitos controles normais depois da correção para níveis de creatinina. Existe uma diferença estatisticamente significativa entre pacientes com câncer de ovário e controles em níveis corrigidos de creatinina de FRα (p=0.007) (vide Exemplo 8).
[0098]A figura 7 representa um análise ROC de níveis de FRα corrigidos por creatinina determinados usando ensaio de eletroquimioluminescência (ECLIA) de amostras de urina tratadas com guanidina (vide Exemplo 8).
[0099]A figura 8 é um representação esquemática do método de imunoen- saio de enzima (EIA) usado para avaliar o nível de FRα (isto é, FRα) nas amostras, conforme descrito no exemplo 9. MOV-18 serviu como o anticorpo de captura, que liga FRα de fluidos biológicos. O FRα foi detectado pela ligação no MORAb-003 bio- tinilado, que foi detectado usando avidina conjugada com peroxidase do rábano silvestre (avidina-HRP).
[00100]A figura 9 representa resultados obtidos para a medição de FRα em soro usando procedimentos de incubação de uma e duas etapas, conforme descrito no exemplo 9.
[00101]A figura 10 é um representação esquemática das três diferentes combinações de anticorpos de captura e detectores que foram usados com o método de imunoensaio de enzima (EIA) para avaliar o nível de FRα em plasma de hu- mano, conforme descrito no exemplo 11.
[00102]A figura 11 mostra as concentrações de FRα no plasma (pg/mL) para sujeitos individuais determinadas usando EIA com três combinações de anticorpos de captura e detectores, conforme descrito no exemplo 11.
[00103]A figura 12 representa o relacionamento entre valores OD e concentrações de FRα (vide Exemplo 11).
[00104]A figura 13 mostra a distribuição de concentrações de FRα no plasma em sujeitos com câncer de ovário e sujeitos controles normais determinado usando EIA (vide Exemplo 12).
[00105]A figura 14 representa a correlação entre concentrações de plasma FRαs determinada usando EIA e ECLIA (vide Exemplo 12).
[00106]A figura 15 mostra correlações entre medições ECLIA de níveis de FRα em soro e urina. A correlação para pacientes com câncer de pulmão foi r=0,24 (painel superior) e a correlação para pacientes com câncer de ovário foi r=-0,76 (painel inferior) (vide Exemplo 13).
[00107]A figura 16 mostra a correlação de níveis de FRα no soro versus plasma para ensaios conduzidos usando o par 1 (vide Exemplo 16).
[00108]A figura 17 mostra a correlação de níveis de FRα no soro versus plasma para ensaios conduzidos usando o par 2 (vide Exemplo 16).
[00109]A figura 18 mostra a correlação de níveis de FRα no soro para ensaios conduzidos usando o par 1 versus par 2 (vide Exemplo 16).
[00110]A figura 19 mostra a correlação de níveis de FRα no plasma para ensaios conduzidos usando o par 1 versus par 2 (vide Exemplo 16).
[00111]A figura 20 mostra a correlação intradia de níveis de FRα no soro para ensaios conduzidos usando o par 2 (Exemplo 16).
Descrição Detalhada da Invenção
[00112]A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta surpreendente de que receptor alfa de folato (FRα), não ligado a uma célula, é ob-servado a níveis elevados nos fluidos corpóreos, por exemplo, urina ou soro, de um sujeito com um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário, comparado com uma amostra controle. Além disso, a presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na identificação de um ensaio imunológico que exibe a sensi-bilidade necessária para avaliar níveis de FRα nas amostras, onde tentativas anteriores de avaliação falharam repetidamente. Em decorrência disso, a presente invenção diz respeito a métodos para diagnosticar um câncer que expressa FRα avaliando níveis de um FRα não ligado a uma célula nas amostras derivadas do sujeito. Certamente, a presente invenção supera os desafios observados durante tentativas anteriores de desenvolver um ensaio de diagnóstico baseado em FRα para cânceres que expressam FRα, tal como câncer de ovário, fornecendo um ensaio imunológico capaz de avaliar precisamente níveis de FRα não ligado a uma célula nas amostras.
[00113]Dessa maneira, são providos métodos e estojos para avaliar se um sujeito tem um câncer que expressa FRα ou corre um risco de desenvolvê-lo e, adicionalmente, para avaliar a progressão de câncer que expressa FRα. Em várias modalidades, os métodos envolvem a comparação de níveis de FRα não ligado a uma célula nas amostras, por exemplo, urina e soro, em relação aos níveis de controle, na avaliação da presença, grau ou risco de desenvolvimento de câncer de ovário no sujeito. Em modalidades particulares, os métodos envolvem o uso do anticorpo MO- RAb-003, anticorpos que ligam o mesmo epítopo do anticorpo MORAb-003 ou anticorpos com a SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3, na avaliação dos níveis de FRα não ligado a uma célula em uma amostra, por exemplo, urina ou soro. Alternativamente, ou adicionalmente, o anticorpo MOV18 ou um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18, o anticorpo 548908, um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908, o anticorpo 6D398 ou um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908 pode ser usado de acordo com os métodos da presente invenção. Vários aspectos da invenção são descritos com mais detalhes nas seguintes subseções: I. Definições
[00114]Da maneira aqui usada, cada qual dos seguintes termos tem o significado associado com ele nesta seção.
[00115]Os artigos “um” e “uma” são usados aqui para referir-se a um ou a mais que um (isto é q pelo menos um) do objetivo gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais que um elemento.
[00116]Da maneira aqui usada, o termo “sujeito” refere-se a animais humanos e não humanos, incluindo sujeitos veterinários. Os termos “animal não humano” incluem todos vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, camundongos, coelhos, cabras, cão, gato, cavalo, vaca, galinhas, anfíbios e répteis. Em uma modalidade preferida, o sujeito é um humano.
[00117]Os termos "câncer" ou "tumor" são bem conhecidos na técnica e referem-se à presença, por exemplo, em um sujeito, de características possuindo células típicas de células causadoras de câncer, tais como proliferação não controlada, imortalidade, potencial metastático, crescimento e taxa de proliferação rápidos, e certos recursos morfológicos característicos. Células cancerígenas são frequentemente na forma de um tumor, mas tais células podem existir sozinhas em um sujeito, ou podem ser células cancerígenas não tumorigênicas, tais como células de leucemia. Da maneira aqui usada, o termo “câncer” inclui cânceres pré-malígnos bem como malígnos.
[00118]Da maneira aqui usada, um “câncer que expressa FRα” inclui qual- quer tipo de câncer caracterizado em que as células cancerígenas expressam FRα. Em modalidades particulares, o câncer que expressa FRα inclui condições cancerosas caracterizadas em que as células cancerígenas são capazes de secretar, abrigar, exportar ou liberar FRα de uma maneira tal que níveis elevados de FRα sejam detectáveis em uma amostra biológica do sujeito. Cânceres que expressam FRα incluem, mas sem limitações, câncer de pulmão (por exemplo, carcinomas bronquioal- veolares, tumores carcinóides, e cânceres de pulmão de célula não pequena, tal como adenocarcinomas); mesotelioma; câncer de ovário; câncer renal; câncer cerebral (por exemplo, ependimoma anaplástica e astrocitoma pilocítica juvenil cerebe- lar); câncer cervical; câncer nasofaringeal; tumor derivado mesodermalmente; carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço; câncer do endométrio; adenocarcinomas endometrióide do ovário, cistadenocarcinomas serosos, câncer de mama; câncer de bexiga; câncer pancreático; câncer ósseo (por exemplo, osteosarcoma em alto grau); câncer pituitário (por exemplo, adenoma pituitário). Vide por exemplo, patente U.S. No. 7.754.698; pedido de patente U.S. No. 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2) : 225233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão tal como câncer de pulmão de célula não pequena. Em outras modalidades, o câncer que expressa FRα é câncer colorretal e câncer da tireóide medular.
[00119]Da maneira aqui usada, um sujeito que está “sofrendo de um câncer que expressa FRα” é um que é clinicamente diagnosticado com um câncer como esse por um médico qualificado (por exemplo, pelos métodos da presente invenção), ou um que apresenta um ou mais sinais ou sintomas (por exemplo, níveis elevados de FRα em fluidos biológicos) de um câncer como esse e é subsequentemente clinicamente diagnosticado com um câncer como esse por um médico qualificado (por exemplo, pelos métodos da presente invenção). Um sujeito não humano que serve como um modelo animal de câncer que expressa FRα pode também ficar dentro do escopo dos termos um sujeito “sofrendo de um câncer que expressa FRα”.
[00120]Os termos “câncer de ovário” referem-se a doença reconhecida pela técnica e inclui cada qual de câncer de ovário epitelial (EOC; >90 % de câncer de ovário em países ocidentais), tumores celulares de germe (circa 2-3 % de câncer de ovário), e câncer de ovário estromal. Câncer de ovário é estratificado nos diferentes grupos com base na diferenciação do tecido do tumor. No grau I, o tecido do tumor é bem diferenciado. No grau II, o tecido do tumor é moderadamente bem diferenciado. No grau III, o tecido do tumor é fracamente diferenciado. Este grau correlaciona com um prognóstico menos favorável do que os graus I e II.
[00121]O câncer de ovário é estratificado nos diferente estágios com base no espalhamento do câncer. O estágio I é no geral confinado dentro da cápsula envolvendo um (estágio IA) ou ambos (estágio IB) ovários, embora em alguns cânceres do estágio I (isto é estágio IC), células malignas possam ser detectadas em ascites, em fluido de lavagem peritoneal, ou na superfície dos ovários. Estágio II envolve extensão ou metástase do tumor de um ou ambos ovários para outras estruturas pélvicas. No estágio IIA, o tumor estende-se ou foi metastizado no útero, nas trompas falopianas, ou ambos. O estágio IIB envolve extensão do tumor par a pélvis. O estágio IIC é estágio IIA ou IIB no qual células malignas podem ser detectadas em ascites, em fluido de lavagem peritoneal, ou na superfície dos ovários. No estágio III, o tumor compreende pelo menos uma extensão maligna para o intestino delgado ou o omento, foram formados implantes peritoneais extrapélvicos de tamanho microscó- pico (estágio IIIA) ou macroscópico (< 2 centímetros de diâmetro, estágio IIIB; > 2 centímetros de diâmetro, estágio IIIC), ou foi metastizado em um linfonódulo retroperitoneal ou inguinal (um indicador alternado de estágio IIIC). No estágio IV, metásta- ses distantes (isto é não peritoneal) do tumor podem ser detectadas.
[00122]As durações dos vários estágios de câncer de ovário não são conhecidas atualmente, mas acredita-se que sejam pelo menos cerca de um ano cada qual (Richart et al., 1969, Am. J. Obstet. Gynecol. 105:386). O prognóstico declina com maior designação do estágio. Por exemplo, taxas de sobrevivência de 5 anos para sujeitos humanos diagnosticados com câncer de ovário de estágio I, II, III, e IV são 80 %, 57 %, 25 %, e 8 %, respectivamente.
[00123]Cada qual dos tipos anteriores, grupos e estágios de câncer de ovário são englobados pelos termos “câncer de ovário” da maneira aqui usada.
[00124]Da maneira aqui usada, os termos “câncer de pulmão” referem-se a uma doença em tecidos do pulmão envolvendo crescimento celular não controlado, que, em alguns casos, leva a metástase. Câncer do pulmão é a causa mais comum de morte relacionada ao câncer em homens e mulheres. A maioria de cânceres de pulmão primários são carcinomas do pulmão, derivados de células epiteliais. O principais tipos de câncer de pulmão são carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC) e carcinoma do pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é uma câncer de pulmão de célula não pequena.
[00125]Câncer de pulmão de célula pequena ou carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC) é um câncer maligno do pulmão, em que as células cancerígenas têm uma forma plana e citoplasma escasso; portanto, SCLC é algumas vezes chamado “carcinoma linfocitóide”. SCLC é no geral mais metastático do que NSCLC e é algumas vezes vista em combinação com carcinoma de célula escamosas.
[00126]Da maneira aqui usada, os termos “câncer de pulmão de célula não pequena,” também conhecido como carcinoma do pulmão de célula não pequena (NSCLC), referem-se a câncer de pulmão epitelial sem ser carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC). Existem três principais subtipos: adenocarcinoma, carcinoma do pulmão de célula escamosa, e carcinoma do pulmão de célula grande. Outros tipos menos comuns de câncer de pulmão de célula não pequena incluem tumor carcinóides pleomórficos, carcinoma da glândula salivar, e carcinoma não classificado. Adenocarcinomas representam aproximadamente 40 % de cânceres de pulmão, e são o tipo mais comum de câncer de pulmão em pessoas que nunca fumaram. Carcinomas de célula escamosa representam cerca de 25 % de cânceres de pulmão. Carcinoma do pulmão de célula escamosa é mais comum em homens do que em mulheres e está ainda mais altamente correlacionado com um histórico de fumantes de tabaco que são outros tipos de carcinoma do pulmão. Existem pelo menos quatro variantes (papilar, célula pequena, célula clara, e basalóide) de carcinoma do pulmão de célula escamosa. Carcinomas do pulmão de célula grande são um grupo heterogêneo de neoplasmas malígnos que se originam de células epiteliais transformadas no pulmão. Carcinomas do pulmão de célula grande são carcinomas que não têm características microscópicas leves de carcinoma de célula pequena, carcinoma de célula escamosa, ou adenocarcinoma.
[00127]Diferentes sistemas do estágio são usado para SCLC e NSCLC. SCLC é categorizado como doença limitada confinada no hemitórax ipsilateral ou como doença extensiva com metástase além do hemitórax ipsilateral.
[00128]NSCLC pode ser categorizado usando o sistema do estágio tumor- nódulos-metástase (TNM). Vide Spira J & Ettinger, D.S. Multidisciplinary management of lung cancer, N Engl J Med, 350:382- (2004) (em seguida, Spira); Greene FL, Page DL, Fleming ID, Fritz AG, Balch CM, Haller DG, et al (eds). AJCC Cancer Staging Manual. 6th edition. New York: Springer-Verlag, 2002:167-77 (em seguida Greene); Sobin LH, Wittekind CH (eds). International Union Against Cancer. TNM classi fication of maligant tumours. 6th edition. New York: Wiley-Liss (2002) (em seguida Sobin). Além do mais, NSCLC é tipicamente tratado de acordo com o estágio de câncer determinado pelo seguinte esquema de classificação (vide http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/non-small-cell- lung/Patient/page2#Keypoint10).
[00129]No estágio oculto (escondido), são observadas células cancerígenas em esputo (muco expelido pelos pulmões), mas não pode ser observado nenhum tumor no pulmão por imageamento ou broncoscopia, ou o tumor é muito pequeno para ser verificado.
[00130]No estágio 0 (carcinoma in situ), são observadas células anormais no revestimento das vias aéreas. Essas células anormais podem se tornar câncer e espalhar no tecido normal por perto. O estágio 0 é também chamado carcinoma in situ.
[00131]O estágio I, no qual câncer foi formado, é dividido nos Estágios IA e IB.
[00132]No estágio LlA, o tumor está somente no pulmão e tem 3 centímetros ou menos.
[00133]No estágio IB, o câncer não espalhou nos linfonódulos e um ou mais do seguinte é verdadeiro: (i) O tumor é maior que 3 centímetros mas não maior que 5 centímetros; (ii) o câncer espalhou nos brônquios principais e está pelo menos 2 centímetros abaixo onde a traquéia une os brônquios; (iii) o câncer espalhou na camada mais interna da membrana que cobre o pulmão; (iv) parte do pulmão colapsou ou desenvolveu pneumonite (inflamação do pulmão) na área onde a traquéia une os brônquios.
[00134]No estágio IIA, o câncer espalhou em certos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor primário; o câncer é (a) 5 cm ou menor que, (b) espalhou nos brônquios principais, e/ou (c) espalhou na camada mais interna do revestimento do pulmão. O câncer não espalhou nos linfonódulos; o câncer é (d) maior que 5 cm, mas não maior que 7 cm, (e) espalhou nos brônquios principais, e/ou (f) espalhou na camada mais interna do revestimento do pulmão. Parte do pulmão pode ter colapsa- do ou ficado inflamado. O estágio IIA é dividido em duas seções, dependendo do tamanho do tumor, onde o tumor é encontrado, e se existe câncer nos linfonódulos. Na primeira seção, o câncer espalhou nos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor. O linfonódulos com câncer estão dentro do pulmão ou próximos dos brônquios. Também, um ou mais do seguinte é verdadeiro: (i) o tumor não é maior que 5 centímetros, (ii) o câncer espalhou nos brônquios principais e está pelo menos 2 centímetros abaixo onde a traquéia une os brônquios, (iii) o câncer espalhou na camada mais interna da membrana que cobre o pulmão, (iv) parte do pulmão colapsou ou desenvolveu pneumonite (inflamação do pulmão) na área onde a traquéia une os brônquios. Na segunda seção, o câncer não espalhou nos linfonódulos e um ou mais do seguinte é verdadeiro: (i) o tumor é maior que 5 centímetros, mas não maior que 7 centímetros, (ii) o câncer espalhou nos brônquios principais e está pelo menos 2 centímetros abaixo onde a traquéia une os brônquios, (iii) o câncer espalhou na camada mais interna da membrana que cobre o pulmão, (iv) parte do pulmão colapsou ou desenvolveu pneumonite (inflamação do pulmão) na área onde a traquéia une os brônquios.
[00135]No estágio IIB, o câncer espalhou em certos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor primário; o câncer é (a) maior que 5 cm mas não maior que 7 cm, (b) espalhou nos brônquios principais, e/ou (c) espalhou na camada mais interna do revestimento do pulmão. Parte do pulmão pode ter colapsado ou ficado inflamado. Alternativamente, (d) o câncer é maior que 7 cm; (e) espalhou nos brônquios principais, (f) no diafragma, (g) na parede do peito ou o revestimento do parede do peito; e/ou (h) espalhou na membrana em torno do coração. pode existir um ou mais tumores separados no mesmo lóbulo do pulmão; câncer pode ter espalhado no nervo que controla o diafragma; todo o pulmão pode ter colapsado ou ficado inflamado. O estágio IIB é dividido nas duas seções dependendo do tamanho do tumor, onde o tumor é encontrado, e se existe câncer nos linfonódulos. Na primeira seção, o câncer espalhou nas imediações dos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor. Os linfonódulos com câncer estão dentro do pulmão ou próximos dos brônquios. Também, um ou mais do seguinte é verdadeiro: (i) o tumor é maior que 5 centímetros, mas não maior que 7 centímetros, (ii) o câncer espalhou nos brônquios principais e está pelo menos 2 centímetros abaixo onde a traquéia une os brônquios, (iii) o câncer espalhou na camada mais interna da membrana que cobre o pulmão, (iv) parte do pulmão colapsou ou desenvolveu pneumonite (inflamação do pulmão) na área onde a traquéia une os brônquios. Na segundo seção, o câncer não espalhou nos linfonódulos e um ou mais do seguinte é verdadeiro: (i) o tumor é maior que 7 centímetros, (ii) o câncer espalhou nos brônquios principais (e é menor que 2 centímetros abaixo onde a traquéia une os brônquios), na parede do peito, no diafragma, ou no nervo que controla o diafragma, (iii) o câncer espalhou na membrana em torno do coração ou revestimento da parede do peito, (iv) todo o pulmão colapsou ou desenvolveu pneumonite (inflamação do pulmão), (v) existem um ou mais tumores separados no mesmo lóbulo do pulmão.
[00136]Estágio IIIA é dividido em três seções dependendo do tamanho do tumor, onde o tumor é encontrado, e que linfonódulos têm câncer (se houver). Na primeira seção do Estágio IIIA, o câncer espalhou nos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor. Os linfonódulos com câncer estão próximos do esterno (osso do peito) ou onde os brônquios entram no pulmão. Também, o tumor pode ter qualquer tamanho; parte do pulmão (onde a traquéia une os brônquios) ou todo o pulmão pode ter colapsado ou desenvolvido pneumonite (inflamação do pulmão); pode existir um ou mais tumores separados no mesmo lóbulo do pulmão; e o câncer pode ter espalhado em qualquer do seguinte: (i) principais brônquios, mas não a área onde a traquéia une os brônquios, (ii) parede do peito, (iii) diafragma e o nervo que o contro- la, (iv) membrana em torno do pulmão ou revestimento da parede do peito, (iv) membrana em torno do coração. Na segunda seção do Estágio IIIA, o câncer espalhou nos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor. Os linfonódulos com câncer estão dentro do pulmão ou próximos dos brônquios. Também, o tumor pode ter qualquer tamanho; todo o pulmão pode ter colapsado ou desenvolvido pneumonite (inflamação do pulmão); pode existir um ou mais tumores separados em qualquer dos lóbulos do pulmão com câncer; e o câncer pode ter espalhado em qualquer do seguinte: (i) principais brônquios, mas não a área onde a traquéia une os brônquios, (ii) parede do peito, (iii) diafragma e o nervo que o controla, (iv) membrana em torno do pulmão ou revestimento da parede do peito, (v) coração ou a membrana em torno dele, (vi) vasos sanguíneos principais que entram ou saem do coração, (vi) traquéia, (vii) esôfago, (viii) nervo que controla a laringe (caixa de voz), (ix) esterno (osso do peito) ou clavícula, (x) carina (onde o traquéia une o brôquio). Na terceira seção do Estágio IIIA, o câncer não espalhou nos linfonódulos e o tumor pode ter qualquer tamanho, e câncer espalhou to qualquer do seguinte: (i) coração, (ii) principais vasos sanguíneos que entram e saem do coração, (iii) traquéia, (iv) esôfago, (v) nervo que controla a laringe (caixa de voz), (vi) esterno (osso do peito) ou espinha dorsal, (vi) carina (onde a traquéia une o brônquio).
[00137]Estágio IIIB é dividido nas duas seções dependendo do tamanho do tumor, onde o tumor é encontrado, e quais linfonódulos têm câncer. Na primeira seção, o câncer espalhou nos linfonódulos acima da clavícula ou nos linfonódulos no lado oposto do peito do tumor; o tumor pode ter qualquer tamanho; parte do pulmão (onde a traquéia une os brônquios) ou todo o pulmão pode ter colapsado ou desenvolvido pneumonite (inflamação do pulmão); pode existir um ou mais tumores separados em qualquer dos lóbulos do pulmão com câncer; e o câncer pode ter espalhado em qualquer do seguinte: (i) principais brônquios, (ii) parede do peito, (iii) diafragma e o nervo que o controla, (iv) membrana em torno do pulmão ou revestimento da parede do peito, (iv) coração ou a membrana em torno dele, (v) principais vasos sanguíneos que entram e saem do coração, (vi) traquéia, (vii) esôfago, (viii) nervo que controla a laringe (caixa de voz), (ix) esterno (osso do peito) ou espinha dorsal, (x) carina (onde a traquéia une o brônquio). Na segunda seção do Estágio IIIB, o câncer espalhou nos linfonódulos do mesmo lado do peito do tumor; os linfonódulos com câncer estão próximos do esterno (osso do peito) ou onde os brônquios entram no pulmão; o tumor pode ter qualquer tamanho; pode existir tumores separados em diferentes lóbulos do mesmo pulmão; e câncer espalhou em qualquer do seguinte: (i) coração, (ii) principais vasos sanguíneos que entram e saem do coração, (iii) tra- quéia, (iv) esôfago, (v) nervo que controla a laringe (caixa de voz), (vi) esterno (osso do peito) ou espinha dorsal, (vii) carina (onde a traquéia une o brônquio).
[00138]No estágio IV, o tumor pode ter qualquer tamanho e o câncer pode ter espalhado para os linfonódulos. Um ou mais do seguinte é verdadeiro: existem um ou mais tumores em ambos pulmões; câncer é encontrado no fluido em torno dos pulmões ou do coração; câncer espalhou para outras partes do corpo, tal como o cérebro, fígado, glândulas adrenais, rins, ou osso.
[00139]Dessa maneira, em várias modalidades da invenção anterior, o câncer de pulmão pode ser estratificado em qualquer dos estágios anteriores (por exemplo, oculto, estágio 0, estágio IA, estágio IB, estágio IIA, estágio IIB, estágio IIIA, estágio IIIB ou estágio IV) com base na avaliação dos níveis de FRα não ligado a uma célula, tal como uma célula normal ou cancerígena, em um exemplo de amostra (por urina ou soro) de um sujeito.
[00140]Da maneira aqui usada, os termos “receptor alfa de folato” (também referido como FRα, FR-alfa, FOLR-1 ou FOLR1) referem-se a isoforma alfa do receptor de alta afinidade para folato. FRα ligado a membrana é anexado na superfície da célula por uma reciclagem da âncora de glicosil fosfatidilinositol (GPI)), entre compartimentos extracelulares e endocíticos e é capaz de transportar folato nas cé- lula. FRα é expresso em uma variedade de tecidos epiteliais incluindo aqueles do trato reprodutor da fêmea, placenta, mama, rim proximal tubular, plexo coróide, pulmão e glândulas salivares. Formas solúveis de FRα podem ser derivadas pela ação de proteases ou fosfolipase nos receptores de folato ancorados na membrana.
[00141]As sequências de nucleotídeo e aminoácidos consenso para humano FRα são apresentados aqui como SEQ ID NOs: 24 e 25, respectivamente. Variantes, por exemplo, variantes alélicas de ocorrência natural ou sequências contendo pelo menos uma substituição de aminoácido, são englobadas pelos termos da maneira aqui usada.
[00142]Da maneira aqui usada, os termos “não ligado a uma célula” referem- se a FRα que não é anexado na membrana celular de uma célula, tal como uma célula cancerígena. Em uma modalidade particular, o FRα não ligado a uma célula é não ligado a qualquer célula e é livremente flutuante ou solubilizado em fluidos biológicos, por exemplo, urina ou soro. Por exemplo, o FRα pode ser abrigado, secreta- do ou exportado de células normais ou cancerígenas, por exemplo, da superfície de células cancerígenas, nos fluidos biológicos.
[00143]O “nível” de receptor alfa de folato não ligado a uma célula, da maneira aqui usada, refere-se ao nível de proteína do receptor alfa de folato determinado usando qualquer método conhecido na técnica para a medição de níveis de proteína. Tais métodos incluem, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, croma- tografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão, reações de precipitação de fluido ou gel, espectros- copia de absorção, ensaios colorimétricos, ensaios espectrofotométricos, citometira de fluxo, imunodifusão (única ou dupla), ensaio da fase da solução, imunoeletrofore- se, Western blotting, radioimunoensaio (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imunofluorescente, e imunoensaio eletroquimiolumines- cente (exemplificados a seguir), e similares. Em uma modalidade preferida, o nível é determinado usando técnicas baseadas em anticorpo, conforme descrito com mais detalhes aqui.
[00144]Prefere-se no geral tanto imobilizar um anticorpo quanto uma proteína de ligação específica para FRα não ligado a uma célula em um suporte sólido para técnicas Western blots e de imunofluorescência. Suportes ou veículos de fase sólida adequados incluem qualquer suporte capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Suportes ou veículos bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropile- no, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacri- lamidas, gabbros, e magnetita.
[00145]Versados na técnica perceberão muitos outros veículos adequados para ligar anticorpo ou antígeno, e poderão adaptar tal suporte para uso com a presente invenção. Por exemplo, proteína isolada de uma amostra do sujeito (por exemplo, urina ou soro) pode ser corrida em um eletroforese de gel de poliacrilamida e imobilizada em um suporte de fase sólida tal como nitrocelulose. O suporte pode então ser lavado com tampões adequados seguido por tratamento com o anticorpo marcado. O suporte de fase sólida pode então ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não ligado. A quantidade de marcador ligado no suporte sólido pode então ser detectada por meios convencionais. Meios de detectar proteínas usando técnicas eletroforéticas são bem conhecidos pelos versados na técnica (vide no geral, R. Escopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
[00146]Outros métodos padrões incluem técnicas de imunoensaio que são bem conhecidas pelos versados na técnica e podem ser observadas em Principles And Practice OD Immunoassay, 2nd Edition, Price and Newman, eds., MacMillan (1997) and Antibodies, a Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988), cada um dos quais está incorporado aqui pela refe- rência na sua íntegra.
[00147]Anticorpos usados em imunoensaios para determinar o nível de expressão de receptor alfa de folato podem ser marcados com um marcador detectá- vel. O termo "marcado", com relação ao agente ou anticorpo de ligação, visa englobar marcação direta do agente de ligação ou anticorpo de acoplamento (isto é, ligando fisicamente) uma substância detectável no agente de ligação ou anticorpo, bem como marcação indireta do agente de ligação ou anticorpo por reatividade com um outro reagente que é diretamente marcado. Um exemplo de marcação indireta inclui detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário fluores-centemente marcado. Em uma modalidade, o anticorpo é, por exemplo, radio marcado, cromoforo marcado, fluorforo marcado, ou enzima marcado. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um derivado do anticorpo (por exemplo, um anticorpo conjugado com um substrato ou com a proteína ou ligante de um par proteína-ligante (por exemplo, biotina-estreptavidina), ou um fragmento do anticorpo (por exemplo, um anticorpo de cadeia única, um domínio hipervariável anticorpo isolado) que liga especificamente com FRα não ligado a uma célula.
[00148]Em uma modalidade da invenção, são usados métodos proteômicos, por exemplo, espectrometria de massa. Espectrometria de massa é uma técnica analítica que consistem em compostos químicos ionizantes para gerar moléculas carregadas (ou seus fragmentos) e medir suas razões massa para carga. Em um procedimento espectrometria de massa típico, uma amostra é obtida de um sujeito, carregada na espectrometria de massa, e seus componentes (por exemplo, FRα) são ionizados por diferentes métodos (por exemplo, impactando-os com um feixe eletrônico), resultando na formação de partículas carregadas (íons). A razão de massa para carga das partículas é então calculada a partir do movimento dos íons a medida que eles transitam pelos campos eletromagnéticos.
[00149]Por exemplo, espectrometria de massa de tempo de vôo de dessor- ção/ionização a laser associada com a matriz (MALDI-TOF MS) ou espectrometria de massa de tempo de vôo de dessorção/ionização a laser intensificada na superfície (SELDI-TOF MS) que envolve a aplicação de uma amostra, tal como urina ou soro, em um chipe de ligação de proteína (Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029) pode ser usada para determinar o nível de FRα.
[00150]Além disso, técnicas in vivo para determinação do nível de FRα não ligado a uma célula incluem introduzir em um sujeito um anticorpo marcado direcionado contra FRα, que liga e transforma o FRα em uma molécula detectável. A presença, nível, ou local do FRα não ligado detectável a uma célula em um sujeito podem ser determinados usando técnicas de imageamento padrões.
[00151]O termo “amostra” da maneira aqui usada refere-se a uma coleta de fluidos similares, células, ou tecidos isolados de um sujeito, bem como fluidos, células, ou tecidos presentes em um sujeito. Em modalidade preferidas a amostra é um fluido biológico contendo FRα não ligado a uma célula cancerígena. Fluidos biológicos são tipicamente líquidos a temperaturas fisiológicas e podem incluir fluidos de ocorrência natural presentes, retirados, expressos ou de outra forma extraídos de um sujeito ou fonte biológica. Certos fluidos biológicos derivam de tecidos, órgão particulares ou regiões localizadas e certos outros fluidos biológicos podem ser mais global ou sistematicamente situados em um sujeito ou fonte biológica. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, linfo, urina, fluido cerebroespinhal, saliva, fluidos oculares, fluido císticos, gotas de lágrima, fezes, es- puto, secreções mucosais dos tecidos secretórios e secreções do órgão vaginal, fluidos ginecológicos, fluidos de ascites tais como aqueles associados com tumores não sólidos, fluidos da pleura, pericardial, peritoneal, abdominal e outras cavidades do corpo, fluidos coletados por lavagem bronquial e similares. Em uma modalidade particular, a amostra é urina ou soro. Em uma outra modalidade, a amostra não inclui ascites ou não é uma amostra de ascite. Em uma outra modalidade, a amostra não inclui fluido peritoneal ou não é fluido peritoneal.
[00152]Em uma modalidade, a amostra é removida do sujeito. Em uma outra modalidade, a amostra está presente no sujeito. Fluidos biológicos podem também incluir soluções líquidas em contato com um sujeito ou fonte biológica, por exemplo, meio de cultura de célula e órgão incluindo meio condicionado de célula ou órgão, fluidos de lavagem e similares.
[00153]Em algumas modalidades, somente uma porção da amostra é submetida a um ensaio para determinar o nível de FRα não ligado a uma célula, ou várias porções da amostra são submetidas a vários ensaios para determinar o nível de FRα não ligado a uma célula. Também, em muitas modalidades, a amostra pode ser pré-tratada por meios físicos ou químicos antes do ensaio. Por exemplo, em modalidades discutidas com mais detalhes na seção de exemplos, amostras, por exemplo, amostras de urina, foram submetidas a centrifugação, diluição e/ou tratamento com uma substância solubilizante (por exemplo, tratamento com guanidina) antes de ensaiar as amostras para FRα não ligado a uma célula. Tais técnicas servem para aumentar a precisão, confiabilidade e reprodutibilidade dos ensaios da presente invenção.
[00154]Os termos “amostra controle,” da maneira aqui usada, referem-se a qualquer amostra controle clinicamente relevante, incluindo, por exemplo, uma amostra de um sujeito saudável não sofrendo de câncer de ovário, uma amostra de um sujeito com um câncer de ovário menos grave ou de progressão mais lenta do que o sujeito a ser avaliado, uma amostra de um sujeito com algum outro tipo de câncer ou doença, e similares. Uma amostra controle pode incluir uma amostra derivada de um ou mais sujeitos. Uma amostra controle pode também ser uma amostra feita em um ponto de tempo precoce do sujeito a ser avaliado. Por exemplo, a amostra controle poderia ser uma amostra tirado do sujeito a ser avaliado antes do início de ação do câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário, em um estágio precoce da doença, ou antes da administração de tratamento ou de uma porção de tratamento. A amostra controle pode também ser uma amostra de um modelo animal, ou de um tecido ou linhagens celulares derivados do modelo animal, do câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário. O nível de FRα não ligado a uma célula em uma amostra controle que consiste em um grupo de medições pode ser determinado com base em qualquer medida estatística apropriada, tal como, por exemplo, medidas de tendência central incluindo valores médios, medianos, ou modais.
[00155]Os termos “nível de controle” referem-se a um nível aceito ou predeterminado de FRα que é usado para comparar com o nível de FRα em uma amostra derivada de um sujeito. Em uma modalidade, o nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em amostra(s) de um sujeito(s) com baixa progressão da doença. Em uma outra modalidade, o nível de controle de FRα não ligado a uma célula é com base no nível em uma amostra de um(s) sujeito(s) com rápida progressão da doença. Em uma outra modalidade, o nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em uma(s) amostra(s) de um(s) sujeito(s), não afetado(s), isto é, não doente isto é, um sujeito que não tem um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário. Ainda em uma outra modalidade, o nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em uma amostra de um(s) sujeito(s) antes da administração de um terapia para câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em uma(s) amostra(s) de um(s) sujeito(s) com um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário que não está em contato com um composto teste. Em uma outra modalidade, o nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em uma(s) amostra(s) de um(s) sujeito(s) não com um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário que está em contato com um composto teste. Em uma modalidade, o nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em uma(s) amostra(s) de um modelo animal de um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário, uma célula, ou uma linhagem celular derivada do modelo animal de um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário.
[00156]Em uma modalidade, o controle é um controle padronizado, tal como, por exemplo, um controle que é predeterminado usando uma médio dos níveis de FRα não ligado a uma célula de uma população de sujeitos sem nenhum câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário. Ainda em outras modalidades da invenção, um nível de controle de FRα é com base no nível de FRα não ligado a uma célula em uma(s) amostra(s) não cancerígena(s) derivada(s) do sujeito com um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário. Por exemplo, quando uma laparotomia ou outro procedimento médico revela a presença de câncer de ovário em uma porção dos ovários, o nível de controle de FRα pode ser determinado usando a porção não afetada dos ovários, e este nível de controle pode ser comparado com o nível de FRα em um porção afetada dos ovários. Similarmente, quando uma biópsia ou outro procedimento médico revela a presença de um câncer de pulmão em uma porção dos pulmões, o nível de controle de FRα pode ser determinado usando a porção não afetada dos pulmões, e este nível de controle pode ser comparado com o nível de FRα em uma porção afetada dos pulmões.
[00157]Da maneira aqui usada, “uma diferença” entre o nível de receptor alfa de folato não ligado a uma célula em uma amostra de um sujeito (isto é, uma amostra teste) e o nível de receptor alfa de folato não ligado a uma célula em uma amostra controle refere-se amplamente a qualquer diferença clinicamente relevante e/ou estatisticamente significativa no nível de receptor alfa de folato nas duas amostras. Em uma modalidade exemplar, a diferença é selecionada com base em um valor de corte determinado usando uma análise característica operacional do receptor (ROC), um exemplo de que está apresentado no exemplo 6.
[00158]Em outras modalidades, a diferença deve ser maior que os limites de detecção do método para determinar o nível de FRα não ligado a uma célula. Prefere-se que a diferença seja pelo menos maior que o erro padrão do método de avaliação, e preferivelmente uma diferença de pelo menos cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 100, cerca de 500, cerca de 1.000-vezes ou mais que o erro padrão do método de avaliação. A diferença pode ser avaliada por qualquer comparação apropriada, incluindo qualquer estatística ou comparação descritiva paramétrica ou não paramétrica apropriada. Por exemplo, “um aumento” no nível de FRα não ligado a uma célula pode referir-se a um nível em uma amostra teste que é cerca de dois, e mais preferivelmente cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco, cerca de seis, cerca de sete, cerca de oito, cerca de nove, cerca de dez ou mais vezes mais que o nível de FRα na amostra controle. Um aumento pode também referir-se a um nível em uma amostra teste que é preferivelmente pelo menos cerca de 1,5, e mais preferivelmente cerca de dois, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou mais desvios padrões acima do nível médio de FRα na amostra controle. Similarmente, “uma diminuição” no nível de FRα não ligado a uma célula pode referir-se a um nível em uma amostra teste que é preferivelmente pelo menos cerca de dois, e mais preferivelmente cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco, cerca de seis, cerca de sete, cerca de oito, cerca de nove, cerca de dez ou mais vezes menos que o nível de FRα na amostra controle. Uma diminuição pode também referir-se a um nível em uma amostra teste que é preferivelmente pelo menos cerca de 1,5, e mais preferivelmente cerca de dois, cerca de três, cerca de qua- tro, cerca de cinco ou mais desvios padrões abaixo do nível médio de FRα na amostra controle.
[00159]Da maneira aqui usada, os termos “colocar em contato a amostra” com um agente de ligação de FRα, por exemplo, um anticorpo anti-FRα, inclui expor a amostra, ou qualquer porção desta com o agente ou anticorpo, de maneira tal que pelo menos uma porção da amostra fique em contato com o agente ou anticorpo. A amostra ou porção desta pode ser alterada de alguma maneira, tal como por submetê-la a tratamentos físicos ou químicos (por exemplo, diluição ou tratamento com guanidina), antes do ato de colocá-la em contato com o agente ou anticorpo.
[00160]O termo “anticorpo”, da maneira aqui usada, compreende quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), interco- nectadas por ligações de dissulfeto, bem como qualquer fragmento, mutante, variante funcionais, ou sua destes (isto é, ligação de antígeno) que retêm os recursos ligação de epítopo essenciais de uma molécula Ig. Tais formatos do anticorpo mutante, variante, ou derivados são conhecidos na técnica, e incluem moléculas tal como fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fd, fragmentos Fabc, anticorpos Sc (anticorpos de cadeia única), diacorpos, cadeias leves do anticorpo individuais, cadeias pesadas do anticorpo individuais, fusões quiméricas entre cadeias do anticorpo e similares. Moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.
[00161]Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas nas regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs), entrelaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de armação (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas de terminal amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Cadeias leves são classificadas tanto como kappa quanto lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
[00162]As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina nos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico.
[00163]Os termos “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo, da maneira aqui usada, referem-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém o capacidade de ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, FRα não ligado a uma célula). Mostrou-se que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos fragmentos de ligação englobados nos termos “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste em o domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por um ligação de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um Fv fragmento que consiste em o VL e VH domínios de um único braço de um anticorpo, (v) um dAb incluindo domínios VH e VL; (vi) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546), que consiste em um domínio VH; (vii) um dAb que consiste em um domínio VH ou um VL; e (viii) uma região determinante de complementariedade isolada (CDR) ou (ix) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem opcionalmente ser unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados para genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); vide por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única devem também ser englobados nos termos “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo. Esses fragmentos do anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica, e os fragmentos são classificados para utilidade da mesma maneira já que são anticorpos intactos. Porções de ligação de antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.
[00164]O termo “anticorpo”, da maneira aqui usada, inclui anticorpos policlo- nais, anticorpos monoclonais, anticorpos murino, anticorpos quiméricos, anticorpo humanizados, e anticorpo humanos, e aqueles que ocorrem naturalmente ou são produzidos recombinantemente de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.
[00165]Em uma modalidade, um anticorpo para uso nos métodos da invenção é um anticorpo biespecífico. Um “anticorpo biespecífico” é um anticorpo híbrido artificial com dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dois diferentes locais de ligação. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553.
[00166]Em uma outra modalidade, um anticorpo para uso nos métodos da invenção é um anticorpo camelídeo conforme descrito, por exemplo, em publicação PCT WO 94/04678, cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência.
[00167]Uma região de o anticorpo camelídeo que é o domínio variável único pequeno, identificado como VHH pode ser obtido por engenharia genética para produzir um proteína pequena com alta afinidade para um alvo, resultando em uma proteína derivada do anticorpo de baixo peso molecular, conhecida como um “nanocor- po camelídeo”. Vide patente U.S. No. 5.759.808; vide também Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Plesch- berger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; and Lauwereys et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520. Bibliotecas modificadas por engenharia de anticorpos camelídeos e fragmentos do anticorpo, por exemplo, são da Ablynx, Ghent, Bélgica. Dessa maneira, um recurso da presente invenção é um nanocorpo camelídeo com alta afinidade para FRα.
[00168]Em outras modalidades da invenção, um anticorpo para uso nos métodos da invenção é um diacorpo, um diacorpo de cadeia única, ou um di-diacorpo.
[00169]Diacorpos são moléculas bivalentes, biespecíficas nas quais domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, conectados por um ligante que é muito pequeno par permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios VH e VL paream com domínios complementares de uma outra cadeia, criando por meio disso dois locais de ligação de antígeno (vide, por exemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Estrutura 2:1121-1123). Diacorpos podem ser produzidos expressando duas cadeias de polipeptídeo tanto com a estrutura VHA-VLB e VHB-VLA (configuração VH-VL), quanto VLA-VHB e VLB-VHA (configuração VL-VH) dentro da mesma célula. A maioria delas pode ser expressa em forma solúvel em bactérias.
[00170]Diacorpos de cadeia única (scDb) são produzidos conectando as duas cadeias de polipeptídeo de formação de diacorpo com ligante de aproximadamente 15 resíduos de aminoácido (vide Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). scDb pode ser expresso em bactérias em forma monomérica solúvel ativa (vide Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21).
[00171]Um diacorpo pode ser fundido no Fc para gerar um “di-diacorpo” (vide Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).
[00172]Moléculas de ligação de FRα que apresentam propriedades funcionais de anticorpos, mas derivam suas porções de ligação de armação e antígeno dos outros polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos sem ser aqueles codificados para genes do anticorpo ou gerados pela recombinação de genes do anticorpo in vivo) podem também ser usados nos métodos da presente invenção. Os domínios de ligação de antígeno (por exemplo, domínios de ligação de FRα) dessas moléculas de ligação são gerados através de um processo de evolução direcionado. Vide patente U.S. No. 7.115.396. Moléculas que têm uma dobra geral similar àquela de um domínio variável de um anticorpo (uma dobra “tipo imunoglobulina”) são proteí-nas andaime apropriadas. Proteínas andaime adequadas para derivar moléculas de ligação de antígeno incluem fibronectina ou um dímero de fibronectina, tenascina, N- caderina, E-caderina, ICAM, titina, receptor de GCSF, receptor de citocina, inibidor de glicosidase, antibiótico cromoproteína, molécula de adesão da membrana de mie- lina P0, CD8, CD4, CD2, MHC classe I, receptor do antígeno da célula T, CD1, C2 e domínios I-set de VCAM-1, domínio de imunoglobulina I-set de proteína de ligação de miosina C, domínio de imunoglobulina I-set da proteína de ligação de miosina H, domínio de imunoglobulina de telocina I-set, NCAM, twitchin, neurogliana, receptor do hormônio do crescimento, receptor de eritropoietina, receptor de prolactina, receptor gama interferon, β-galactosidase/glucuronidase, β-glucuronidase, transglutaminase, receptor do antígeno da célula T, superóxido dismutase, domínio do fator do tecido, citocromo F, proteína fluorescente verde, GroEL, e taumatina.
[00173]“Ligação específica” quando usada no contexto de anticorpos, ou fragmentos do anticorpo, representa ligação por meio de domínios codificados para genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina com um ou mais epítopos de um proteína de interesse, mas que não reconhece e liga substancialmente e outras moléculas em uma amostra contendo uma população misturada de moléculas antigênicas. Tipicamente, um anticorpo liga a um antígeno cognato com um Kd de menos que cerca de 1x10-8 M, medido por um ensaio de ressonância plasmon de superfície ou um ensaio de ligação de célula.
[00174]Da maneira aqui usada, um receptor alfa de folato “agente de ligação” inclui um anticorpo que liga FRα não ligado a uma célula bem como agentes de ligação não anticorpo. Para gerar agentes de ligação não anticorpo ou moléculas de ligação, uma biblioteca de clones pode ser criada na qual sequências em regiões da proteína andaime que formam superfícies de ligação de antígeno (por exemplo, regiões análogas em posição e estrutura para CDRs de uma dobra de imunoglobulina o domínio variável do anticorpo) são randomizadas. Clones de biblioteca são testados para ligação específica no antígeno de interesse (por exemplo, FRα) e para outras funções (por exemplo, inibição da atividade biológica de FRα). Clones selecionados podem ser usados como a base para randomização e seleção adicional para produzir derivados de maior afinidade para o antígeno.
[00175]Moléculas de ligação de alta afinidade são geradas, por exemplo, usando o décimo módulo de fibronectina III (10Fn3) como o andaime, descrito na patente U.S. Nos. 6.818.418 e 7.115.396; Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297; patente U.S. No. 6.261.804; patente U.S. No. 6.258.558; and Szostak et al. WO98/31700, cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência.
[00176]Moléculas de ligação não anticorpo podem ser produzidas como dí- meros ou multímeros para aumentar avidez para o alvo antígeno. Por exemplo, o domínio de ligação de antígeno é expresso como uma fusão com uma região constante (Fc) de um anticorpo que forma dímeros fr Fc-Fc. Vide, por exemplo, patente U.S. No. 7.115.396, cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência.
[00177]Um “antígeno” é uma molécula reconhecida pelo sistema imune; o termo originalmente vem de “gerador de anticorpo” e inclui uma molécula que liga especificamente a um anticorpo. No nível molecular, um antígeno é caracterizado por sua capacidade de ser ligada no local de ligação de antígeno de um anticorpo. Na presente invenção, o antígeno é FRα, tal como FRα que não é ligado a uma célula FRα ou uma porção deste.
[00178]Da maneira aqui usada, o termo “epítopo” refere-se a recursos superficiais moleculares de um antígeno, por exemplo, FRα, capaz de ser ligado por um anticorpo. Moléculas antigênicas, normalmente sendo polímeros biológicos "grandes", normalmente apresentam diversos recursos superficiais que podem agir como pontos de interação para anticorpos específicos. Qualquer tal recurso molecular distinto constitui um epítopo. A maioria dos antígenos, portanto, têm o potencial to ser ligados por diversos anticorpos distintos, cada um dos quais está tipicamente específico para um epítopo particular. Em uma modalidade da presente invenção, um agente de ligação, por exemplo, anticorpo, liga a um epítopo no FRα que é disponível na forma do receptor que não é ligado a uma célula, mas não na forma da mem-brana ligada do receptor. Por exemplo, o anticorpo pode ligar ao mesmo epítopo no FRα no qual MORAB-003 se liga.
[00179]Da maneira aqui usada, a frase “progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα” inclui a progressão de um câncer como esse de um estado menos grave para um mais grave. Isto poderia incluir um aumento no número ou gravidade de tumores, o grau de me- tástase, a velocidade com a qual o câncer cresce e se espalha, e similares. Por exemplo, “a progressão de câncer de ovário” inclui a progressão de um câncer como esse de um estado menos grave para um mais grave, tal como a progressão do Estágio I para o Estágio II, do Estágio II para o Estágio III, etc. Alternativamente, a frase “progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα” pode referir-se à regressão de um câncer que expressa FRα de um estado mais grave para um estado menos grave. Por exemplo, em uma modalidade, “a progressão de câncer de ovário” refere-se à regressão do Estágio IV para o Estágio III, do Estágio III para o Estágio II, etc. Em outras modalidades, a “progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα” pode referir-se à taxa de sobrevivência determinada a partir do começo de sintomas do câncer que expressa FRα, ou à taxa de sobrevivência a partir do tempo de diagnóstico do câncer que expressa FRα.
[00180]Da maneira aqui usada, o termo “estratificar” refere-se a caracterização de um câncer que expressa FRα, por exemplo, câncer do ovário ou de pulmão, em um estágio apropriado, por exemplo, baseado no grau do espalhamento do câncer, igualmente aceita estratificações na técnica. Por exemplo, estratificação inclui caracterização do câncer que expressa FRα no Estágio I, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV. Em certas modalidades, Estágio I refere-se aos cânceres que são localizados em um parte do corpo. Em certas modalidades, Estágios II e III referem-se aos cânceres que estão localmente avançados, em que uma distinção entre os estágios é frequentemente específica para o câncer particular. Finalmente, Estágio IV refere-se aos cânceres que foram frequentemente metastizados, ou espalhados para outro órgão ou todo o corpo.
[00181]Da maneira aqui usada, o termo “sobrevivência” refere-se à continuação de vida de um sujeito que foi tratado para câncer. Em uma modalidade, sobrevivência refere-se à falha de um tumor de reocorrer. Da maneira aqui usada, o termo “reocorrência” refere-se a recrescimento de tumor ou células cancerígenas em um sujeito nos quais o tratamento primário para o tumor foi administrado. O tumor pode reocorrer no local original ou em uma outra parte do corpo. Em uma modalidade, um tumor que reocorre é do mesmo tipo do tumor original para o qual o sujeito foi tratado. Por exemplo, se um sujeito teve um câncer de tumor de ovário, foi tratado e subsequentemente desenvolveu um outro câncer de tumor de ovário, o tumor reocorreu. Além do mais, um câncer pode reocorrer em um diferente órgão ou tecido daquele onde ele originalmente ocorreu. II. Métodos e Estojos da Invenção
[00182]A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta inesperada de que receptor alfa de folato (FRα), não ligado a uma célula, é observado a níveis elevados nos fluidos corpóreos, por exemplo, urina ou soro, de um sujeito com um câncer que expressa FRα comparado com uma amostra controle. Além disso, a presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na identificação de um ensaio imunológico que exibe a sensibilidade necessária para avaliar níveis de FRα não ligado a uma células nas amostras, onde tentativas anteriores de avaliação falharam repetidamente. Certamente, a presente invenção supera os desafios obser-vados durante tentativas anteriores de desenvolver um ensaio de diagnóstico baseado em FRα para câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário fornecendo um ensaio imunológico capaz de avaliar precisamente níveis de FRα não ligado a uma célula em uma amostra, por exemplo, urina ou soro.
[00183]Dessa maneira, são providos métodos e estojos para avaliar se um sujeito tem ou corre um risco de desenvolver um câncer que expressa FRα e, adicionalmente, para avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα. Em várias modalidades, os métodos envolvem a comparação de níveis de FRα não ligado a uma célula nas amostras, por exemplo, urina e soro, em relação ao níveis de controle, na avaliação a presença, grau ou risco de desenvolvimento de câncer de ovário no sujeito. A. Métodos de Diagnóstico, Métodos de Prognóstico, Métodos de avaliação de Risco, e Métodos de Estratificação
[00184]Especificamente, a presente invenção diz respeito a métodos de diagnóstico para avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, tal como câncer de pulmão ou ovário, métodos de prognóstico para prever a progressão de um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário, e métodos de avaliação de risco para avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolva o câncer que expressa FRα. Além disso, a invenção diz respeito a métodos de estratificação para estratificar um câncer que expressa FRα tal como sujeito com câncer de pulmão ou ovário nos grupos de terapia de câncer. Os vários aspectos e modalidades da invenção discutidos aqui são considerados não limitantes e englobar todas as combinações possíveis das modalidades específicas mencionadas, que podem aplicar a qualquer um dos métodos e estojos discutidos aqui ou reivindicados a seguir.
[00185]Os métodos da presente invenção podem ser praticados junto com qualquer outro método usado pelos versados na técnica para diagnosticar um câncer que expressa FRα, prever a progressão de um câncer que expressa FRα, ou para avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolva um câncer que expressa FRα.
[00186]Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra (tal como urina ou soro) derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα. Em uma modalidade particular, o nível de FRα na amostra derivada do sujeito é avaliado colocando a amostra em contato com um an- ticorpo que liga FRα não ligado a uma célula e é selecionado do grupo que consiste em (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; e (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Em uma modalidade, a amostra é selecionada do grupo que consiste em urina e soro.
[00187]Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα tal como câncer de câncer de pulmão ou ovário, o método compreendendo determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) não ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) na amostra de urina derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de urina derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα.
[00188]Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) não ligado a uma célula em uma amostra de soro derivada do sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) na amostra de soro derivada do sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra de soro derivada do sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα. Em modalidades particulares, o sujeito não foi tratado com um agente, tal como um esteróide, que aumenta os níveis de FRα em soro. Em uma modalidade específica, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário e o su-jeito não foi tratado com um agente, tal como um esteróide, que aumenta os níveis de FRα em soro.
[00189]Nos métodos e estojos da presente invenção, cânceres que expressam FRα incluem cânceres caracterizados em que as células cancerígenas expressam FRα. Em modalidades particulares, o FRα é liberado das células cancerígenas, por exemplo, da superfície da célula cancerígena, e nos fluidos biológicos do sujeito. Cânceres que expressam FRα incluem câncer de pulmão (por exemplo, carcinomas bronquioalveolares, tumores carcinóides, e cânceres de pulmão de célula não pequena, tal como adenocarcinomas); mesotelioma; câncer de ovário; câncer renal; câncer cerebral (por exemplo, ependimoma anaplástica e astrocitoma pilocítica juvenil cerebelar); câncer cervical; câncer nasofaringeal; tumor derivado mesodermal- mente; carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço; câncer do endométrio; adenocarcinomas endometrióide do ovário, cistadenocarcinomas serosos, câncer de mama; câncer de bexiga; câncer pancreático; câncer ósseo (por exemplo, osteosarcoma em alto grau); e câncer pituitário (por exemplo, adenoma pituitário). Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário.
[00190]Em certas modalidades dos métodos e estojos da presente invenção, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão. Em modalidades mais específicas, o câncer de pulmão é carcinoma do pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em uma tal modalidade, o NSCLC é selecionado do grupo que consiste em adenocarcinoma, carcinoma do pulmão de célula escamosa, carcinoma do pulmão de célula grande, NSCLC pleomórfico, tumor carcinóides, carcinoma da glândula salivar, e carcinoma não classificado. Em uma modalidade preferida, o NSCLC é adenocarcinoma. Em modalidades alternativas, o câncer de pulmão é carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC). Em uma outra modalidade, o câncer de pulmão é carcinoma bronquioalveolar. Ainda em uma outra modalidade, o câncer de pulmão é um tumor carcinóide do pulmão.
[00191]A presente invenção também diz respeito a métodos para avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) não ligado a uma célula em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 3.000 a.u./mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário. Em modalidades particulares, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 4.000 a.u./mL, cerca de 5.000 a.u./mL, cerca de 6.000 a.u./mL, cerca de 7.000 a.u./mL, cerca de 8.000 a.u./mL, cerca de 9.000 a.u./mL, cerca de 10.000 a.u./mL, cerca de 11.000 a.u./mL, cerca de 12.000 a.u./mL, cerca de 13.000 a.u./mL, cerca de 14.000 a.u./mL, cerca de 15.000 a.u./mL, cerca de 16.000 a.u./mL, cerca de 17.000 a.u./mL, cerca de 18.000 a.u./mL, cerca de 19.000 a.u./mL, cerca de 20.000 a.u./mL, cerca de 21.000 a.u./mL, cerca de 22.000 a.u./mL, cerca de 23.000 a.u./mL, cerca de 24.000 a.u./mL, cerca de 25.000 a.u./mL, cerca de 26.000 a.u./mL, cerca de 27.000 a.u./mL, cerca de 28.000 a.u./mL, cerca de 29.000 a.u./mL ou cerca de 30.000 a.u./mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[00192]Ainda em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) em uma amostra de urina derivada do sujeito, em que a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou em que uma concentração de menos que cerca de 9.100 pg/mL é uma indicação de que o sujeito não está sofrendo de câncer de ovário. Por exemplo, a presença de FRα na amostra de urina a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, cerca de 20.000 pg/mL, cerca de 21.000 pg/mL, cerca de 22.000 pg/mL, cer- ca de 23.000 pg/mL, cerca de 24.000 pg/mL, cerca de 25.000 pg/mL, cerca de 26.000 pg/mL, cerca de 27.000 pg/mL, cerca de 28.000 pg/mL, cerca de 29.000 pg/mL, cerca de 30.000 pg/mL, cerca de 40.000 pg/mL, cerca de 50.000 pg/mL, cerca de 60.000 pg/mL, cerca de 70.000 pg/mL, cerca de 80.000 pg/mL, cerca de 90.000 pg/mL, cerca de 100.000 pg/mL ou cerca de 150.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário.
[00193]Em certas modalidades dos aspectos anteriores da invenção, os níveis de FRα não ligado a uma célula em uma amostra (por exemplo, uma amostra tal como uma amostra de amostra de urina ou soro) derivadas de um sujeito são comparados com os níveis de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre os níveis é uma indicação de que o sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα tal como câncer de pulmão ou ovário. Em uma modalidade particular, a diferença constitui um aumento no nível de FRα não ligado a uma célula na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle, em que este aumento é indicativo da presença ou crescimento de câncer que expressa FRα. Alternativamente, a diferença constitui uma diminuição no nível de FRα, em que a diminuição é indicativo da ausência ou regressão de câncer que expressa FRα. Da maneira aqui usada, “uma diferença” entre o nível de receptor alfa de folato não ligado a uma célula em uma amostra de um sujeito (isto é, uma amostra teste) e o nível de receptor alfa de folato em uma amostra controle refere-se amplamente a qualquer mudança clinicamente relevante (incluindo um aumento ou uma diminuição) e/ou diferença estatisticamente significativa no nível de receptor alfa de folato nas duas amostras. Em uma modalidade exemplar, a diferença é selecionada com base em um valor de corte determinado usando uma análise característica operacional do receptor (ROC), um exemplo de que está apresentado no exemplo 6. O valor de corte ideal pode variar dependendo dos métodos de ensaio e condições empregados. Em outras modalidades, a diferença deve ser maior que os limites de detecção do método para determinar o nível de FRα não ligado a uma célula. Prefere-se que a diferença seja pelo menos maior que o erro padrão do método de avaliação, e preferivelmente uma diferença de pelo menos cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 100, cerca de 500, cerca de 1.000 vezes ou mais que o erro padrão do método de avaliação. A diferença pode ser avaliada por qualquer comparação apropriado, incluindo qualquer estatística ou comparação descritiva paramétrica ou não paramétrica apropriada. Por exemplo, “um aumento” no nível de FRα pode referir-se a um nível que excede um valor de corte determinado usando uma análise ROC. Ele pode também referir-se a um nível em uma amostra teste que é dois, e mais preferivelmente cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 100 %, cerca de 150 %, cerca de 200 %, cerca de 300 %, cerca de 400 %, cerca de 500 %, cerca de 600 %, cerca de 700 %, cerca de 800 %, cerca de 900 % ou cerca de 1.000 % mais que o nível de FRα na amostra controle. Um aumento pode também referir-se a um nível em uma amostra teste que é preferivelmente pelo menos cerca de 1,5, e mais prefe-rivelmente cerca de dois, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou mais desvios padrões acima do nível médio de FRα na amostra controle. Similarmente, “uma diminuição” no nível de FRα não ligado a uma célula pode referir-se a um nível em uma amostra teste que não excede um valor de corte determinado usando uma análise ROC. Ele pode também referir-se a um nível em uma amostra teste que é cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, ou cerca de 90 % menos que o nível de FRα na amostra controle. Uma diminui-ção pode também referir-se a um nível em uma amostra teste que é preferivelmente pelo menos cerca de 1,5, e mais preferivelmente cerca de dois, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou mais desvios padrões abaixo do nível médio de FRα na amostra controle.
[00194]Amostras usadas nos métodos e estojos da invenção incluem qualquer tecido, célula, biópsia, ou fluido corpóreo que pode conter níveis detectáveis de FRα não ligado a uma célula. Em uma modalidade, uma amostra pode ser um tecido, uma célula, sangue total, plasma, raspagem bucal, saliva, fluido cerebroespinhal, rezes, ou lavagem broncoalveolar. Em algumas modalidades, a amostra é amostra de tumor que expressa FRα ou uma amostra de tecidos ou células onde câncer que expressa FRα pode ser observado. Em modalidade preferidas, a amostra é uma amostra de urina ou soro.
[00195]Amostras corpóreas podem ser obtidas de um sujeito por uma variedade de técnicas conhecida na técnica incluindo, por exemplo, pelo uso de uma biópsia ou raspando ou esfregando uma área ou usando um agulha para aspirar os fluidos corpóreos. Métodos para coletar várias amostras corpóreas são bem conhecidos na técnica.
[00196]Amostras adequadas para detectar e quantificar o nível da proteína de FRα pode ser frescas, congeladas, ou fixas de acordo com métodos conhecidos pelos versados na técnica. Amostras de tecido adequadas são preferivelmente seccionadas e colocadas em uma lâmina de microscópio para análises adicionais. Amostras sólidas, isto é, amostras de tecido, podem ser solubilizadas e/ou homogeneizadas e subsequentemente analisadas como extratos solúveis. Amostras líquidas podem também ser submetidas a tratamentos físicos ou químicos. Em algumas modalidades, amostras de urina são tratadas por centrifugação, vortexação, diluição e/ou tratamento com uma substância solubilizante (tal como, por exemplo, tratamento com guanidina).
[00197]Em uma modalidade, uma amostra de biópsia recém obtida é congelada usando, por exemplo, nitrogênio líquido ou difluordiclorometano. A amostra congelada é montada para seccionamento usando, por exemplo, OCT, e seccionadas serialmente em um criostato. As seções seriais são coletadas em uma lâmina de microscópio de vidro. Para manchamento imunoistoquímico as lâminas podem ser revestidas, por exemplo, com cromo-alum, gelatina ou poli-L-lisina para assegurar que as seções grudem nas lâminas. Em uma outra modalidade, amostras são fixas e embutidas antes do seccionamento. Por exemplo, uma amostra do tecido pode ser fixa, por exemplo, em formalina, serialmente desidratada e embutida, por exemplo, em parafina.
[00198]Uma vez que a amostra é obtida, qualquer método conhecido na técnica para ser adequado para detectar e quantificar FRα não ligado a uma célula pode ser usado (tanto no ácido nucléico quanto, preferivelmente, no nível de proteína), conforme descrito na seção (B) a seguir. Métodos exemplares são bem conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitações, western blots, northern blots, southern blots, imunoistoquímica, ensaio da fase da solução, ELISA, por exemplo, ELISA amplificada, imunoprecipitação, imunofluorescência, citometira de fluxo, imunocitoquí- mica, análises de espectrometria de massa, por exemplo, MALDI-TOF e SELDI- TOF, técnicas de hibridização do ácido nucléico, métodos de transcrição reversa do ácido nucléico, e métodos de amplificação do ácido nucléico.
[00199]Em muitas modalidades, o nível de FRα não ligado a uma célula na amostra (tal como, por exemplo, urina ou soro) é avaliado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα. Anticorpos que ligam FRα são conhecidos na técnica e incluem (i) o anticorpo LK26 monoclonal murino (as suas cadeias pesadas e leves são apresentadas aqui como SEQ ID NOs: 22 e 23), conforme descrito no pedido de patente europeu No. 86104170,5 (Rettig) (cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência); (ii) o anticorpo MORAB-003, conforme descrito em publicação internacional No. WO2004/113388 e patente U.S. No. 5.646.253, cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência. Os anticorpos mono- clonais MOV18 e MOv19 também ligam diferentes epítopos na molécula de FRα (previamente conhecida como gp38/FBP). Miotti, S. et al. Int J Cancer, 38: 297-303 (1987). Por exemplo, o anticorpo MOV18 liga o epítopo apresentado aqui como SEQ ID NO:26 (TELLNVXMNAK*XKEKPXPX*KLXXQX) (note que na posição 12, um resíduo de tritofano ou histidina é possível, e na posição 21, um resíduo de ácido as- pártico ou ácido glutâmico é possível), conforme preceituado em Coney et al. Cancer Res, 51: 6125-6132 (1991).
[00200]Da maneira aqui usada, o termo “MORAb-003” refere-se a um anticorpo que liga especificamente FRα e que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada madura apresentada em SEQ ID NO:7 e a sequência de cadeia leve madura de SEQ ID NO:8. As sequências de aminoácidos da preproteína correspondente para MORAb-003 são apresentadas em SEQ ID NOs: 9 (cadeia pesada) e 10 (cadeia leve). O anticorpo MORAb-003 compreendo o seguinte CDRs: SEQ ID NO:1 como CDRH1, SEQ ID NO:2 como CDRH2, SEQ ID NO:3 como CDRH3, SEQ ID NO:4 como CDRL1, SEQ ID NO:5 como CDRL2, e SEQ ID NO:6 como CDRL3. Células de produção do anticorpo MORAb-003 foram depositadas com o American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209) em 24 de abril de 2006 e foram atribuídas com o No. de acesso PTA- 7552.
[00201]Outros anticorpos que ligam FRα e para uso nos métodos da presente invenção incluem 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (também referidos como 9F3),19D4.B7 (também referidos como 19D4), 24F12.B1 (também referidos como 24F12), e 26B3.F2 (também referidos como 26B3). As sequências de aminoácidos desses anticorpos, seus CDRs, e seus domínios variáveis de cadeia pesada e leve, bem como sequências de polinucleotídeo que podem codificá-los, são providos na tabela 33. Em algumas modalidades, esses anticorpos são IgG de murino, ou seus derivados. Em outras modalidades, os anticorpos são humanos, humanizados, ou quiméricos. 9F3
[00202]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:27. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoáci- dos de CDR2 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:28. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO 29. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO 31. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:32. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:33. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:27; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:28; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:29. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:31; uma sequência de amino- ácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO: 32; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:33. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:27; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:28; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancial- mente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:29, e também têm uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:31; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:32; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:33.
[00203]O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia leve que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:30. O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:34. O anticorpo que liga FRα pode incluir domínios variáveis de uma cadeia leve e uma pesada, em que o domínio variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:30, e o domínio variável de cadeia pesada inclui uma sequência de ami- noácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:34. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é o anticorpo 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (9F3) ou um fragmento de ligação de antígeno deste, capaz de ligar tanto uma forma nativa quanto não reduzida de FRα. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante de IgG de murino.
[00204]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo que é produzido por células de produção de anticorpo depositadas com o American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209) em 19 de maio de 2011 e foram atribuídas com o No. de acesso PTA-11887. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα compreende um ou mais dos CDRs de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. Em algumas modalidades, anticorpo que liga FRα compreende as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. 19D4
[00205]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:35. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoáci- dos de CDR2 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:36. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:37. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:39. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:40. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:41. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:35; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:36; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:37. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:39; uma sequência de amino- ácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO: 40; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:41. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:35; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:36; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancial- mente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:37, e também têm uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:39; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:40; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:41.
[00206]O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia leve que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:38. O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:42. O anticorpo que liga FRα pode incluir domínios variáveis de uma cadeia leve e uma pesada, em que o domínio variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:38, e o domínio variável de cadeia pesada inclui uma sequência de ami- noácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:42. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é o 19D4.B7 (19D4) anticorpo ou um frag-mento de ligação de antígeno deste, capaz de ligar tanto uma forma nativa quanto não reduzida de FRα. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante de IgG de murino.
[00207]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo que é produzido por células de produção de anticorpo depositadas com o American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209) em 19 de maio de 2011 e foram atribuídas com o No. de acesso PTA-11884. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα compreende um ou mais dos CDRs de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. Em algumas modalidades, anticorpo que liga FRα compreende as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. 24F12
[00208]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:43. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoáci- dos de CDR2 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:44. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:45. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:47. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:48. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:49. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:43; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:44; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:45. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:47; uma sequência de amino- ácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO: 48; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:49. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:43; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:44; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancial- mente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:45, e também têm uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:47; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:48; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:49.
[00209]O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia leve que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:46. O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:50. O anticorpo que liga FRα pode incluir domínios variáveis de uma cadeia leve e uma pesada, em que o domínio variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:46, e o domínio variável de cadeia pesada inclui uma sequência de ami- noácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:50. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é o anticorpo 24F12.B1 (24F12) ou um frag-mento de ligação de antígeno deste, capaz de ligar tanto uma forma nativa quanto não reduzida de FRα. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante de IgG1 de murino.
[00210]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo que é produzido por células de produção de anticorpo depositadas com o American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209) em 19 de maio de 2011 e foram atribuídas com o No. de acesso PTA-11886. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα compreende um ou mais dos CDRs de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. Em algumas modalidades, anticorpo que liga FRα compreende as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. 26B3
[00211]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno que inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:51. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoáci- dos de CDR2 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:52. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:53. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:55. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:56. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα inclui uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:57. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:51; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:52; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:53. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:55; uma sequência de amino- ácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:56; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:57. O anticorpo que liga FRα pode incluir uma cadeia leve com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:51; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:52; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancial- mente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:53, e também têm uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos de CDR1 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:55; uma sequência de aminoácidos de CDR2 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:56; e uma sequência de aminoácidos de CDR3 substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:57. O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia leve que inclui uma sequência de amino- ácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:54. O anticorpo que liga FRα pode incluir um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:58. O anticorpo que liga FRα pode incluir domínios variáveis de uma cadeia leve e uma pesada, em que o domínio variável de cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:54, e o domínio variável de cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos substancialmente a mesma, ou idêntica a SEQ ID NO:58. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é o anticorpo 26B3.F2 (26B3) ou um fragmento de ligação de antígeno deste, capaz de ligar tanto uma forma nativa quanto não reduzida de FRα. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região constante de IgG1 de murino.
[00212]Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα é um anticorpo que é produzido por células de produção de anticorpo depositadas com o American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virgínia 20110-2209) em 19 de maio de 2011 e foram atribuídas com o No. de acesso PTA-11885. Em algumas modalidades, o anticorpo que liga FRα compreende um ou mais dos CDRs de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas. Em algumas modalidades, anticorpo que liga FRα compreende as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos produzidos pelas células de produção de anticorpo depositadas.
[00213]Arranjos de ligação de antígeno de CDRs podem ser modificados por engenharia usando proteínas tipo anticorpo como andaime de CDR. Proteínas de ligação de antígeno modificadas por engenharia estão incluídas no escopo de anticorpos que ligam FRα.
[00214]Outros anticorpos reagentes que ligam FRα são conhecidos na técnica, e atualmente, múltiplos tais anticorpos reagentes são comercialmente disponíveis (com base em pesquisa de anticorpo anti-FRαs em http://www.biocompare.com), conforme na tabela a seguir.
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[00215]Em uma modalidade preferida, o anticorpo que liga FRα compreende pelo menos um dos seguintes CDRs, como derivados das cadeias pesadas e leves de LK26 de murino: SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3. Vide patente US No. 5.646.253, cujos teores, uma vez que eles se relacionam com o anticorpo anti- FRαs que pode ser usado na presente invenção, estão incorporados aqui pela refe- rência. Mutações adicionais pode ser feitas nas regiões de armação conforme preceituado na patente US No. 5.646.253, cujos teores estão por meio disso incorporados pela referência.
[00216]Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo inclui uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13) LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14), LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15), e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). Vide patente US No. 5.646.253 e patente US No. 6.124.106. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a região variável de cadeia leve LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a região variável de cadeia leve LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a região variável de cadeia leve LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
[00217]Em algumas modalidades, amostras podem precisar ser modificadas a fim de tornar FRα acessível a ligação do anticorpo. Em um aspecto particular dos métodos de imunocitoquímica ou imunoistoquímica, lâminas podem ser transferidas para um tampão de pré-tratamento e opcionalmente aquecidas para aumentar acessibilidade do antígeno. Aquecimento da amostra no tampão de pré-tratamento rompe rapidamente a bicamada de lipídio das células e torna os antígenos (pode ser o caso em espécies frescas, mas não tipicamente o que ocorre em espécies fixas) (isto é, a proteína de FRα) mais acessíveis a ligação do anticorpo. Os termos "tampão de pré- tratamento" são usados indiferentemente aqui para referir-se a um tampão que é usado para preparar amostras de citologia ou histologia para imunomanchamento, particularmente aumentando acessibilidade da proteína de FRα para ligação do anticorpo. O tampão de pré-tratamento pode compreender uma solução de sal de pH específico, um polímero, um detergente, ou um agente tensoativo não iônico ou aniônico tais como, por exemplo, um agente tensoativo aniônico ou não iônico etoxi- lado, um alcanoato ou um alcoxilato ou mesmo misturas desses agentes tensoativos ou mesmo o uso de um sal de biles. O tampão de pré-tratamento pode, por exemplo, ser uma solução de 0,1 % a 1 % de ácido deoxicólico, sal de sódio, ou uma solução de laureth-13-carboxilato de sódio (por exemplo, Sandopan LS) ou e complexo aniô- nico etoxilado. Em algumas modalidades, o tampão de pré-tratamento pode também ser usado como um tampão de armazenamento da lâmina. Em uma modalidade particular, a amostra, por exemplo, a amostra de urina, é centrifugada, turbilhonada, diluída e/ou submetida a tratamento com guanidina.
[00218]Qualquer método para tornar a proteína de FRα mais acessível à ligação do anticorpo pode ser usado na prática da invenção, incluindo os métodos de recuperação de antígeno conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bi- bbo, et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11, cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência.
[00219]Após o pré-tratamento para aumentar acessibilidade da proteína de FRα, amostras podem ser bloqueadas usando um agente de bloqueio apropriado, por exemplo, um reagente de bloqueio de peroxidase tal como peróxido de hidrogênio. Em algumas modalidades, as amostras podem ser bloqueadas usando um reagente de bloqueio de proteína para impedir ligação não específica do anticorpo. O reagente de bloqueio de proteína pode compreender, por exemplo, caseína purificada. Um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal ou policlonal, que liga especificamente a FRα é então incubado com a amostra.
[00220]Técnicas para detectar ligação do anticorpo são bem conhecidas na técnica. Ligação de anticorpo a FRα pode ser detectada através do uso de reagentes químicos que geram um sinal detectável que corresponde ao nível de ligação do anticorpo e, dessa maneira, ao nível de expressão da proteína de FRα. Em um dos métodos de imunoistoquímica ou imunocitoquímica da invenção, ligação do anticorpo é detectada através do uso de um anticorpo secundário que é conjugado com um polímero marcado. Exemplos de polímeros marcados incluem, mas sem limitações, conjugados polímero-enzima. As enzimas nesses complexos são tipicamente usadas para catalisar a deposição de um cromogênio no sítio de ligação anticorpo- antígeno, por meio disso resultando em manchamento da célula que corresponde ao nível de expressão dos biomarcadores de interesse. Enzimas incluem, mas sem limitações, peroxidase de rábano silvestre (HRP) e fosfatase alcalina (AP).
[00221]Em um método de imunoistoquímica ou imunocitoquímica da invenção, ligação do anticorpo na proteína de FRα é detectada através do uso de um polímero HRP-marcado que é conjugado com um anticorpo secundário. Ligação de anticorpo pode também ser detectada através do uso de um reagente de sonda específica da espécie, que liga aos anticorpos monoclonais ou policlonais, e um polímero conjugado com HRP, que liga no reagente da sonda específica da espécie. Lâminas são manchadas para ligação do anticorpo usando qualquer cromogênio, por exemplo, o cromogênio 3,3-diaminobenzidina (DAB), e então contramanchada com hematoxilina e, opcionalmente, um agente de manchamento tal como hidróxido de amônio ou TBS/Tween-20. Outros cromogênios adequados incluem, por exemplo, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC). Em alguns aspectos da invenção, lâminas são revistas microscopicamente por um citotecnologista e/ou um patologista para avaliar manchamento da célula, por exemplo, manchamento fluorescente (isto é, expressão de FRα). Alternativamente, amostras podem ser revistas por meio de microscopia automatizada ou por pessoas com a assistência de software computador que facilita a identificação de células de manchamento positivo.
[00222]Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo é marcado. Por exemplo, detecção de ligação do anticorpo pode ser facilitada acoplando o anticorpo anti-FRα em uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais lumi- nescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase do rábano silvestre, alcalina fosfatase, β- galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluo- resceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritri- na; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S, 14C, ou 3H. Em uma modalidade particular, o anticorpo é marcado com um rádio marcador, marcador de cromoforo, marcador de fluorforo, ou marcadora de enzima.
[00223]Em uma modalidade da invenção amostras congeladas são preparadas conforme descrito anteriormente e subsequentemente manchadas com anticorpos contra FRα diluído em uma concentração apropriada usando, por exemplo, salina Tris-tamponada (TBS). Anticorpos primários podem ser detectados incubando as lâminas em anti-imunoglobulina biotinilada. Este sinal pode opcionalmente ser amplificado e visualizado usando precipitação de diaminobenzidina do antígeno. Além disso, lâminas podem ser opcionalmente contramanchada, por exemplo, com hema- toxilina, para visualizar as células.
[00224]Em uma outra modalidade, amostras fixas e embutidas são manchadas com anticorpos contra FRα e contramanchadas conforme descrito anteriormente para seções congeladas. Além do mais, amostras podem ser opcionalmente tratadas com agentes para amplificar o sinal a fim de visualizar manchamento do anticorpo. Por exemplo, pode ser usada uma deposição catalisada por peroxidase de biotinil- tiramida, que por sua vez é reagida com estreptavidina conjugada com peroxidase (Sistema de Amplificação do Sinal Catalisado (CSA), DAKO, Carpinteria, CA).
[00225]Versados na técnica perceberão que a concentração de um anticorpo particular usado para praticar os métodos da invenção variará dependendo de tais fatores como tempo para ligar, nível de especificidade do anticorpo para FRα, e método de preparação da amostra. Além disso, quando múltiplos anticorpos são usados, a concentração exigida pode ser afetada pela ordem na qual os anticorpos são aplicados na amostra, por exemplo, simultaneamente como um coquetel ou sequencialmente como reagentes de anticorpo individuais. Além disso, a substância química de detecção usada para visualizar a ligação do anticorpo em FRα deve ser otimizada para produzir o sinal desejado para razão de ruído.
[00226]Em uma modalidade da invenção, métodos proteômicos, por exemplo, espectrometria de massa, são usados para detectar e quantificar o proteína de FRα. Por exemplo, espectrometria de massa de tempo de vôo de dessor- ção/ionização a laser associada com a matriz (MALDI-TOF MS) ou espectrometria de massa de tempo de vôo de dessorção/ionização a laser intensificada na superfície (SELDI-TOF MS) que envolve a aplicação de uma amostra, tal como soro, em um chipe de ligação de proteína (Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029) pode ser usado para detectar e quantificar a proteína de FRα. Métodos espectrométrico de massa são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 5.622.824, 5.605,798 e 5.547.835, cujos teores na íntegra estão incorporados aqui pela referência.
[00227]A presente invenção é adicionalmente considerada, pelo menos em parte, na identificação de FRα como um biomarcador de prognóstico, isto é, como um biomarcador da progressão e/ ou gravidade, de um câncer que expressa FRα tal como câncer de ovário ou câncer de pulmão de célula não pequena. Dessa maneira, a presente invenção diz respeito a métodos de avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de câncer de ovário comparando o nível de FRα em uma amostra derivada de um sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença no nível de FRα na amostra (tal como uma amostra de urina ou soro) derivada do sujeito comparada com a amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá rapidamente. Similarmente, métodos de avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolverá um câncer que expressa FRα envolve comparar o nível de FRα em uma amostra derivada de um sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença no nível de FRα na amostra (tal como amostra de urina ou soro) derivada do sujeito comparada com a amostra controle é uma indicação de que o sujeito tem um maior nível de risco de desenvolver um câncer que expressa FRα comparado com normal risco em um indivíduo saudável.
[00228]Em uma modalidade, a diferença é um aumento. Em uma outra modalidade, a diferença é uma diminuição. Em alguns tipos de cânceres (por exemplo, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer de ovário), um maior nível de expressão de FRα é associado com um prognóstico de piora, enquanto em outros tipos de cânceres (por exemplo, cânceres de pulmão de célula não pequena), um maior nível de expressão de FRα é associado com um prognóstico de melhora. Assim, em uma modalidade específica, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário ou carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço e a diferença é um aumento. Em uma outra modalidade específica, o câncer que expressa FRα é um câncer de pulmão de célula não pequena, e a diferença é uma diminuição.
[00229]Em certos aspectos, a invenção diz respeito a métodos de avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα comparando o nível de FRα em uma amostra derivada de um sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra (tal como uma amostra de urina ou soro) derivada do sujeito comparado com a amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá ra-pidamente, ou uma diminuição no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o câncer progredirá lentamente ou regredirá. Similarmente, métodos de avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolverá um câncer que expressa FRα envolve comparar o nível de FRα em uma amostra derivada de um sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento no nível de FRα na amostra (tal como amostra de urina ou soro) derivada do sujeito comparada com a amostra controle é uma indicação de que o sujeito tem um maior nível de risco de desenvolver um câncer que expressa FRα comparado com normal risco em um indivíduo saudável, ou uma diminuição no nível de FRα na amostra derivada do sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito tem um menor nível de risco de desenvolver um câncer que expressa FRα comparado com um risco normal em um indivíduo saudável.
[00230]Qualquer aumento ou diminuição clinicamente relevante ou estatisticamente significativo, usando qualquer método analítico conhecido na técnica, pode ser utilizado no prognóstico, avaliação de risco e outros métodos da invenção. Em uma modalidade, um aumento no nível de FRα refere-se a um nível que excede um valor de corte determinado usando uma análise ROC conforme exemplificado no exemplo 6. Em uma outra modalidade, uma diminuição no nível de FRα refere-se a um nível em uma amostra teste que não excede um valor de corte determinado usando uma análise ROC.
[00231]Em outras modalidades, o aumento ou diminuição deve ser maior que os limites de detecção do método para determinar o nível de FRα. Em modalidades adicionais, o aumento ou diminuição deve ser pelo menos maior que o erro padrão do método de avaliação, e preferivelmente uma diferença de pelo menos cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 100, cerca de 500, cerca de 1.000 vezes ou mais que o erro padrão do método de avaliação. Em algumas modalidades, o aumento ou diminuição é avaliado usando estatísticas descritivas paramétricas ou não paramétricas, análises de comparações, regressão, e similares.
[00232]Em outras modalidades, o aumento ou diminuição é um nível na amostra derivada do sujeito que é cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 100 %, cerca de 150 %, cerca de 200 %, cerca de 300 %, cerca de 400 %, cerca de 500 %, cerca de 600 %, cerca de 700 %, cerca de 800 %, cerca de 900 % ou cerca de 1.000 % mais ou menos que o nível de FRα na amostra controle. Em modalidades alternativas, o aumento ou diminuição é um nível na amostra derivada do sujeito que é pelo menos cerca de 1,5, e mais preferivelmente cerca de dois, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou mais desvios padrões acima ou abaixo do nível médio de FRα na amostra controle. Da maneira aqui usada, a frase “progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα” pode referir- se à progressão de um câncer que expressa FRα de um estado de câncer menos grave para um mais grave. Isto poderia incluir um aumento no número ou gravidade de tumores, no grau de metástase, na velocidade com a qual o câncer cresce e se espalha, e similares. Em certas modalidades, a progressão é uma progressão de um estágio menos grave para um estágio mais grave, em que o estágio é avaliado de acordo com um esquema de estageamento conhecido na técnica. Em uma modalidade, em que o câncer que expressa FRα é câncer de ovário, a progressão refere- se a uma progressão do Estágio I para Estágio II, do Estágio II para o Estágio III, etc. Em uma outra modalidade, em que o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), a progressão refere-se a uma progressão do Estágio 0 para o Estágio IA, Estágio IA para o Estágio IB, Estágio IB para o Estágio IIA, Estágio IIA para o Estágio IIB, Estágio IIB para o Estágio IIC, etc. Em uma outra modalidade, em que o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), a progressão refere-se a uma progressão de um estágio menos grave para um mais grave determinado no sistema de classificação TNM. Vide Spira; Greene; Sobin.
[00233]Alternativamente, a frase “progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα” pode referir-se a uma regressão de um câncer que expressa FRα de um estado mais grave para um estado menos grave, tal como uma diminuição no número ou gravidade de tumores, no grau de metástase, na velocidade com a qual o câncer cresce e se espalha, e similares. Em certas modalidades, a progressão é uma progressão de um estágio mais grave para um estágio menos grave, em que o estágio é avaliado de acordo com um esquema de estagiamento conhecido na técnica. Em uma modalidade, em que o câncer que expressa FRα é câncer de ovário, a progressão refere-se a uma regressão do Estágio IV para o Estágio III, do Estágio III para o Estágio II, etc. Em uma outra modalidade, em que o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), a progressão refere-se a uma progressão do Estágio IV para o Estágio IIIB, Estágio IIIB para o Estágio IIIA, Estágio IIIA para o Estágio IIB, etc. Em uma outra modalidade, em que o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), a progressão refere-se a uma progressão de um mais grave para um estágio menos grave determinado no sistema de classificação TNM. Vide Spira; Greene; Sobin.
[00234]Em modalidades adicionais, o nível de FRα pode ser usado para calcular a probabilidade de que um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, a progressão de um câncer que expressa FRα em um sujeito, o nível de risco de desenvolver um câncer que expressa FRα, o risco de reocorrência do câncer em um sujeito sendo tratado para um câncer que expressa FRα, a sobrevivência de um sujeito sendo tratado para um câncer que expressa FRα, a eficácia de um regime de tratamento para tratar um câncer que expressa FRα, e similares, usando os métodos da invenção, que podem incluir métodos de análise de regressão conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, modelos de regressão adequados incluem, mas sem limitações, CART (por exemplo, Hill, T, and Lewicki, P. (2006) “STATISTICS Methods and Applications” StatSoft, Tulsa, OK), Cox (por exemplo, www.evidence- based-medicine.co.uk), exponenciais, normais e log normais (por exemplo, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), logísticos (por exemplo, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic regression), paramétricos, não paramétricos, semiparamétricos (por exemplo, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), lineares (por exemplo, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), ou aditivos (por exemplo, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model).
[00235]Em uma modalidade, uma análise de regressão inclui o nível de FRα. Em modalidades adicionais, uma análise de regressão pode incluir adicional covari- áveis clínicas e/ou moleculares. Tais covariáveis clínicas incluem, mas sem limitações, idade do sujeito, estágio do tumor, grau do tumor, tamanho do tumor, regime de tratamento, por exemplo, quimioterapia e/ou terapia de radiação, resultados clínicos (por exemplo, relapso, sobrevivência específica da doença, falha na terapia), e/ou resultados clínicos em função de tempo depois do diagnóstico, tempo depois do início da terapia, e/ou tempo depois de término do tratamento. Covariáveis moleculares podem incluir, mas sem limitações, valores do marcador molecular adicionais. Por exemplo, em modalidades em que o câncer que expressa FRα é câncer de ovário, tais marcadores podem incluir, por exemplo, níveis CA125 do soro, níveis DF3 do soro, e/ou níveis LPA do plasma.
[00236]Em outros aspectos, a invenção diz respeito a métodos para monitorar o eficiência de uma terapia ou regime de tratamento. Por exemplo, a presente invenção diz respeito a métodos para monitorar a eficácia de tratamento com MO- RAb-003 de câncer de ovário ou câncer de pulmão em um sujeito sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão. Especificamente, os métodos envolvem determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula, em uma amostra derivada do dito sujeito, em que o dito sujeito foi previamente administrado com MORAb-003; e comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, em que um aumento ou mudança no nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 não é eficiente; e em que uma diminuição no nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o tratamento com MORAb-003 é eficiente.
[00237]Por exemplo, a amostra controle pode ser derivada de um sujeito não submetido ao regime de tratamento e uma amostra teste pode ser derivada de um sujeito submetido a pelo menos uma porção do regime de tratamento. Alternativamente, a amostra teste e a amostra controle podem ser derivadas do mesmo sujeito. Por exemplo, a amostra teste pode ser uma amostra derivada de um sujeito depois da administração de um produto terapêutico, tal como MORAb-003. A amostra con-trole pode ser uma amostra derivada de um sujeito antes da administração de produto terapêutico ou em um precoce estágio de regime do produto terapêutico. Dessa maneira, uma diminuição no nível de expressão de FRα na amostra teste, relativa à amostra controle, é uma indicação de que terapia diminuiu a progressão do câncer que expressa FRα, por exemplo, câncer de ovário. Para cânceres que expressam FRα em que um maior nível de FRα é associado com um prognóstico de piora, tal como, por exemplo, câncer de ovário ou carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, uma diminuição no nível de expressão de FRα na amostra teste, relativa à amostra controle, é uma indicação de que terapia é efetiva para diminuir a progressão do câncer que expressa FRα, ou causando uma regressão do câncer, no sujeito sofrendo com o câncer que expressa FRα. Em uma modalidade preferida, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário.
[00238]Em várias modalidades deste aspecto da invenção, a amostra pode ser urina, soro, plasma ou ascites. Em modalidades particulares, a amostra é urina ou soro. Além disso, o FRα pode ser determinado colocando a amostra em contato com um anticorpo que liga FRα, opcionalmente, usando anticorpos conforme descrito aqui e métodos de ensaio conforme descrito aqui.
[00239]Em várias modalidades, o tratamento com anticorpo MORAb-003 é (a) um anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO:7 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO:8; (b) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; ou (c) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3..
[00240]Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em outras modalidades, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão. Em modalidades mais específicas, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em uma tal modalidade, o NSCLC é selecionado do grupo que consiste em adenocarcinoma, carcinoma do pulmão de célula escamosa, carci noma do pulmão de célula grande, NSCLC pleomórfico, tumor carcinóides, carcinoma da glândula salivar, e não classificado carcinoma. Em uma modalidade preferida, o NSCLC é adenocarcinoma. Em modalidades alternativas, o câncer de pulmão é carcinoma do pulmão de célula pequena (SCLC). Em uma outra modalidade, o câncer de pulmão é carcinoma bronquioalveolar. Ainda em uma outra modalidade, o câncer de pulmão é um tumor carcinóide do pulmão.
[00241]Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a métodos de estratificar um sujeito com um câncer que expressa FRα nos grupos de terapia de câncer com base no nível de FRα determinado em uma amostra. Em uma modalidade preferida, o método envolve estratificar um sujeito com um câncer que expressa FRα em pelo menos um dos quatro grupos de terapia de câncer. Em outras modalidades, o método envolve estratificar um sujeito com um câncer que expressa FRα em pelo menos um de cerca de dois, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco, cerca de seis, cerca de sete, cerca de oito, cerca de nove, ou cerca de dez grupos de terapia de câncer.
[00242]De acordo com a presente invenção, os níveis de FRα podem ser associados com a gravidade, isto é, o estágio, do câncer que expressa FRα. Por exemplo, câncer de ovário é estratificado nos diferentes estágios com base na gravidade do câncer, apresentada aqui. Dessa maneira, a presente invenção diz respeito a métodos para estratificar câncer de ovário nos Estágio I, por exemplo, câncer de ovário no Estágio IA, Estágio 1B ou Estágio IC; Estágio II, por exemplo, Estágio IIA, Estágio IIB ou Estágio IIC; Estágio III, por exemplo, Estágio IIIA, Estágio IIIB ou Estágio IIIC; ou Estágio IV.
[00243]SCLS ou NSCLC pode ser estratificado nos diferentes estágios com base na gravidade do câncer, apresentada aqui. Dessa maneira, a presente invenção diz respeito a métodos para estratificar o câncer de pulmão, por exemplo, SCLS ou NSCLC, no estágio oculto (escondido); estágio 0; Estágio I, por exemplo, Está- gios IA e IB; Estágio II, por exemplo, câncer de pulmão nos Estágios IIA e IIB; Estágio III, por exemplo, Estágios IIIA e IIIB; ou Estágio IV.
[00244]Ainda em um outro aspecto, a presente invenção é considerada, pelo menos em parte, na observação que FRα pode servir como um preditivo de biomar- cadores para tratamento de cânceres que expressam FRα. Especificamente, os métodos da presente invenção provê avaliar se um sujeito responderá ao tratamento, por exemplo, com MORAb-003, e, se e quando o tratamento começa, por exemplo, com MORAb-003, avaliando os níveis de FRα em um sujeito.
[00245]Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para prever se um sujeito sofrendo de um câncer que expressa FRα, por exemplo, câncer do ovário ou de pulmão, responderá ao tratamento com MORAb-003, determinando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra derivada do dito sujeito; e comparando o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, em que uma diferença entre o nível de FRα na amostra derivada do dito sujeito e o nível de FRα na amostra controle é uma indicação de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
[00246]Em certas modalidades, o grau de diferença entre os níveis de FRα não ligado a uma célula cancerígena na amostra teste comparado com a amostra controle é indicativo de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003. Por exemplo, uma diferença de pelo menos cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 100, cerca de 500, cerca de 1.000 vezes ou mais que o erro padrão do método de avaliação é indicativo de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003. Alternativamente, ou em combinação, uma diferença de pelo menos cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 100 %, cerca de 150 %, cerca de 200 %, cerca de 300 %, cerca de 400 %, cerca de 500 %, cerca de 600 %, cerca de 700 %, cerca de 800 %, cerca de 900 % ou cerca de 1.000 % é indicativo de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003. Alternativamente, ou em combinação, uma diferença de pelo menos cerca de 1,5, e mais preferivelmente cerca de dois, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou mais desvios padrões é indicativo de que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
[00247]Em várias modalidades, o tratamento com anticorpo MORAb-003 é (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; ou (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3.
[00248]Em várias modalidades, a amostra é urina, plasma, soro ou ascites. Em modalidades particulares, a amostra é urina ou soro. Em modalidades adicionais, o câncer que expressa FRα é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, mesotelioma, câncer de ovário, câncer renal, câncer cerebral, câncer cervical, câncer nasofaringeal, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer do endométrio, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ósseo, câncer pituitário, câncer colorretal e câncer da tireóide medular. Em uma modalidade particular, o câncer que expressa FRα é câncer de ovário. Em uma outra modalidade, o câncer que expressa FRα é câncer de pulmão de célula não pequena, tal como adenocarcinoma. B. Ensaios Basedos no Anticorpo Anti-FRα para Detectar Cânceres que Expressam FRα
[00249]Existe uma variedade de formatos de ensaio conhecida pelos versados na técnica para usar um anticorpo para detectar um polipeptídeo em uma amos- tra, incluindo, mas sem limitações, ligados ao ensaio imunoabsorvente de enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imunofluorimetria, imunoprecipitação, ensaio da fase da solução, diálise de equilíbrio, imunodifusão e outras técnicas. Vide, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Por exemplo, o ensaio pode ser realizado em um formato Western blot, em que uma preparação da proteína a partir da amostra biológica é submetida a eletroforese de gel, transferida para um membrana adequada e reagida naturalmente com o anticorpo. A presença do anticorpo na membrana pode então ser detectada usando um reagente de detecção adequado, bem conhecido na técnica e descrito a seguir.
[00250]Em uma outra modalidade, o ensaio envolve o uso de um anticorpo imobilizado em um suporte sólido para ligar ao polipeptídeo de FRα alvo e removê-lo do restante da amostra. O polipeptídeo de FRα ligado pode então ser detectado usando um segundo reativo do anticorpo com um determinante antigênico de poli- peptídeo de FRα distinto, por exemplo, um reagente que contém um fração reporta- dora detectável. Como um exemplo não limitante, de acordo com esta modalidade o anticorpo imobilizado e o segundo anticorpo que reconhece determinantes antigêni- cos distintos podem ser qualquer dos dois anticorpos monoclonais descritos aqui selecionados de MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 ou variantes destes conforme descrito aqui. Alternativamente, um ensaio competitivo pode ser utilizado, no qual FRα é marcado com uma fração reportadora detectável e ligado naturalmente no anticorpo anti-FRα imobilizado depois de incubação do anticorpo imobilizado com a amostra. A extensão na qual os componentes da amostra inibem a ligação do poli- peptídeo marcado no anticorpo é indicativo da reatividade da amostra com o anticorpo imobilizado, e em decorrência disso, indicativo do nível de FRα na amostra.
[00251]O suporte sólido pode ser qualquer material conhecido pelos versa- dos na técnica no qual o anticorpo pode ser anexado, tal como um poço de teste em uma placa microtituladora, um filtro de nitrocelulose ou uma outra membrana adequada. Alternativamente, o suporte pode ser uma esfera ou disco, tal como vidro, fibra de vidro, látex ou um plástico tal como poliestireno ou poli(cloreto de vinilideno). O anticorpo pode ser imobilizado no suporte sólido usando uma variedade de técnicas conhecida pelos versados na técnica, que são no geral descritas na patente e literatura científica.
[00252]Em certas modalidade preferidas, o ensaio para detecção de FRα em uma amostra é um ensaio sanduíche de dois anticorpos. Este ensaio pode ser realizado primeiro colocando em contato um anticorpo FRα específico (por exemplo, MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 ou variantes destes conforme descrito aqui) que foi imobilizado em um suporte sólido, comumente o poço de uma placa microti- tuladora, com a amostra biológica, de maneira tal que uma molécula de ocorrência natural solúvel na amostra e com um determinante antigênico que é reativo com o anticorpo é ligado naturalmente no anticorpo imobilizado (por exemplo, um tempo de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente é no geral suficiente) para formar um complexo antígeno-anticorpo ou um complexo imune. Os constituintes não ligados da amostra são então removidos dos complexos imunes imobilizados. Em seguida, um segundo anticorpo específico para FRα é adicionado, em que o sítio de combinação antígeno do segundo anticorpo não inibe competitivamente a ligação do sítio de combinação de antígeno do primeiro anticorpo imobilizado no FRα (por exemplo, MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 ou variantes deste conforme descrito aqui, que não é o mesmo do anticorpo monoclonal imobilizado no suporte sólido). O segundo anticorpo pode ser detectavelmente marcado as conforme provido aqui, de maneira tal que ele possa ser diretamente detectado. Alternativamente, o segundo anticorpo pode ser indiretamente detectado através do uso de um anti- anticorpo secundário detectavelmente marcado (ou "segundo estágio"), ou usando um reagente de detecção específico conforme provido aqui. O método da invenção em questão não é limitado a nenhum procedimento de detecção particular, como aquele com familiaridade com imunoensaios perceberão que existem inúmeros reagentes e configurações para detectar imunologicamente um antígeno particular (por exemplo, FRα) em um imunoensaio sanduíche de dois anticorpos.
[00253]Em certas modalidade preferidas da invenção usando o ensaio sanduíche de dois anticorpos descrito anteriormente, o primeiro, anticorpo imobilizado específico para FRα é um anticorpo policlonal e o segundo anticorpo específico para FRα é um anticorpo policlonal. Em certas outras modalidades da invenção, o primeiro, anticorpo imobilizado específico para FRα é um anticorpo monoclonal e o segundo anticorpo específico para FRα é um anticorpo policlonal. Em certas outras modalidades da invenção o primeiro, anticorpo imobilizado específico para FRα é um anticorpo policlonal e o segundo anticorpo específica para FRα é um anticorpo monoclonal. Em certas outras modalidades da invenção, o primeiro, anticorpo imobilizado específico para FRα é um anticorpo monoclonal e o segundo anticorpo específico para FRα é um anticorpo monoclonal. Por exemplo, nessas modalidades deve-se notar que anticorpos monoclonais MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 ou variantes destes conforme descrito aqui, conforme provido aqui reconhecem determinantes antigênicos distintos e não competitivos (por exemplo, epítopos) no polipeptídeo de FRαs, de maneira tal que qualquer combinação em pares desses anticorpos mono- clonais pode ser empregada. Em outras modalidades preferidas da invenção, o primeiro, anticorpo imobilizado específico para FRα e/ou o segundo anticorpo específico para FRα pode ser qualquer um dos tipos de anticorpos conhecidos na técnica e referidos aqui, por exemplo, a título de ilustração e não limitação, fragmentos Fab, fragmento F(ab’)2s, proteínas de fusão da região V de imunoglobulina ou anticorpos de cadeia única. Versados na técnica perceberão que a presente invenção engloba o uso de outras formas de anticorpo, fragmentos, derivados e similares nos métodos revelados e reivindicados aqui.
[00254]Em certas modalidades particularmente preferidas, o segundo anticorpo pode conter uma fração reportadora detectável ou marcador tal como uma enzima, corante, radionuclídeo, grupo luminescente, grupo fluorescente ou biotina, ou similares. A quantidade do segundo anticorpo que permanece ligada no suporte sólido é então determinada usando um método apropriado para a fração reportadora detectável específica ou marcador. Para grupos radioativos, contagem de cintilação ou métodos autoradiográficos são no geral apropriados. Conjugados anticorpo- enzima podem ser preparados usando uma variedade de técnicas de acoplamento (para revisão vide, por exemplo, Scouten, W. H., Methods in Enzymology 135:30-65, 1987). Métodos espectroscópicos podem ser usado para detectar corantes (incluindo, por exemplo, produtos colorimétricos de reações enzimáticas), grupos lumines- centes e grupos fluorescentes. Biotina pode ser detectada usando avidina ou estrep- tavidina, acoplada com um diferente grupo reportador (comumente um grupo radioativo ou fluorescente ou uma enzima). Os grupos reportadores de enzima podem no geral ser detectados pela adição de substrato (no geral por um período de tempo específico), seguido por análise espectroscópica, espectrofotométrico ou outra análise dos produtos da reação. Padrões e adições padrões podem ser usados para determinar o nível de mesotelina polipeptídeo em uma amostra, usando técnicas bem conhecidas.
[00255]Um método de classificar a presença de um câncer que expressa FRα de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente melhorado pela detecção de mais que um marcador associado ao tumor em uma amostra biológica de um sujeito. Dessa maneira, em certas modalidades a presente invenção diz respeito a um método de classificação que, além de detectar a reatividade de FRα não ligado a uma célula, também inclui detecção de pelo menos um marcador solúvel adicional de um condição maligna usando métodos estabelecidos conhecidos na técnica e providos aqui. Conforme notado anteriormente, existem atualmente inúmeros antígenos associados ao tumor solúveis que são detectáveis nas amostras de fluidos biológicos facilmente obtidas. C. Estojos da Invenção
[00256]A invenção também diz respeito a estojos para avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer que expressa FRα, para avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα, para avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolva um câncer que expressa FRα, ou para monitorar a eficiência de uma terapia ou regime de tratamento para um câncer que expressa FRα. Esses estojos incluem meios para determinar o nível de expressão de FRα e instruções para uso do estojo para avaliar a progressão de um câncer que expressa FRα, para avaliar o nível de risco de que um sujeito desenvolva um câncer que expressa FRα, ou para monitor a eficiência de uma terapia ou regime de tratamento para um câncer que expressa FRα.
[00257]Os estojos da invenção podem opcionalmente compreender componentes adicionais usados para realizar os métodos da invenção. A título de exemplo, os estojos podem compreender meios para obter uma amostra de um sujeito, uma amostra controle, por exemplo, uma amostra de um sujeito com câncer progredindo lentamente e/ou um sujeito não tendo câncer, um ou mais compartimentos da amostra, e material instrucional que descreve o desempenho de um método da invenção e controles/padrões específicos do tecido.
[00258]Os meios para determinar o nível de FRα incluem conhecido métodos na técnica para avaliar níveis de proteína, como anteriormente discutido, e modalidades específicas preferidas, por exemplo, utilizando o anticorpo MORAb-003, conforme discutido aqui. Assim, por exemplo, em uma modalidade, o nível de FRα é avaliado colocando em contato uma amostra derivada de um sujeito (tal como urina ou soro) com um receptor alfa de agente de ligação de folato (FRα). Em uma modalidade preferida, o agente de ligação é um anticorpo. Muitos dos tipos de anticorpos que ligam FRα são discutidos anteriormente nos métodos da invenção e podem também ser utilizados nos estojos da invenção.
[00259]Os meios para determinar o nível de FRα podem adicionalmente incluir, por exemplo, tampões ou outro reagentes para uso em um ensaio para determinar o nível de FRα. As instruções podem ser, por exemplo, instruções impressas para realizar o ensaio e/ou instruções para avaliar o nível de expressão de FRα.
[00260]Os estojos das invenções podem também incluir meios para isolar uma amostra de um sujeito. Esses meios podem compreender um ou mais ítens de equipamento ou reagentes que podem ser usados para obter um fluido ou tecido de um sujeito. Os meios para obter uma amostra de um sujeito podem também compreender meios para isolar componentes do sangue, tal como soro, de uma amostra de sangue. Preferivelmente, o estojo é projetado para uso com um sujeito humano. III. Ensaios de Classificação
[00261]Em modalidades adicionais, a invenção também diz respeito a métodos (também referidos aqui como "ensaios de classificação") para identificar modu- ladores, isto é, candidato ou compostos testes ou agentes (por exemplo, proteínas, peptídeos, peptidomiméticos, peptóides, moléculas pequenas ou outro medicamentos), que modulam o crescimento, progressão e/ou agressividade de câncer, por exemplo, um câncer que expressa FRα, ou uma célula cancerígena, por exemplo, um câncer de ovário célula, monitorando e comparando os níveis de FRα em uma amostra. Tais ensaios tipicamente compreendem um composto teste, ou uma combinação de compostos testes, cuja atividade contra câncer ou um célula cancerígena deve ser avaliada. Compostos identificados por meio de ensaios tais como aqueles descritos aqui podem ser usados, por exemplo, para modular, por exemplo, inibir, aliviar, tratar, ou impedir agressividade de um câncer que expressa FRα ou uma célula cancerígena, por exemplo, uma célula de câncer de ovário. Monitorando o nível de FRα em uma amostra, pode-se determinar se o câncer que expressa FRα está progredindo ou regredindo e se o composto teste tem o efeito desejado. Por exemplo, em modalidades em que o câncer que expressa FRα é um câncer para o qual maiores níveis de FRα são associados com um prognóstico de piora, uma diminuição no nível de FRα depois da administração do(s) composto(s) teste(s) seria indicativo da eficácia do composto teste. Ao contrário, um aumento no nível de FRα depois da administração do(s) composto(s) teste(s) indicaria que o composto teste não é efetivo no tratamento de câncer de ovário. Ao contrário, em modalidades em que o câncer que expressa FRα é um câncer para o qual maiores níveis de FRα são associados com um prognóstico de melhora, um aumento no nível de FRα depois da administração do(s) composto(s) teste(s) seria indicativo da eficácia do composto teste. Ao contrário, uma diminuição no nível de FRα depois da administração do(s) com- posto(s) teste(s) indicaria que o composto teste não é efetivo no tratamento câncer de ovário.
[00262]Os compostos testes usados nos ensaios de classificação da presente invenção podem ser obtidos de qualquer fonte disponível, incluindo bibliotecas sistemáticas de compostos naturais e/ou sintético. Compostos testes podem também ser obtidos por qualquer das inúmeras abordagens nos métodos de biblioteca combinatorial conhecidos na técnica, incluindo bibliotecas biológicas; bibliotecas peptói- de (bibliotecas de moléculas com as funcionalidades de peptídeos, mas com uma espinha dorsal não peptídeo inédita, que são resistentes a degradação enzimática mas que no entanto permanecem bioativos; vide, por exemplo, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas de fase sólida ou fase em solução paralelas espacialmente endereçável; métodos de biblioteca sintética exigindo descon- volução; o método de biblioteca 'uma-esfera um-composto'; e métodos de biblioteca sintética usando seleção de cromatografia de afinidade. As abordagens da biblioteca biológica e biblioteca peptóide são limitadas à bibliotecas de peptídeo, enquanto as outras quatro abordagens são aplicáveis ao peptídeo, oligômero não peptídeo ou bibliotecas molécula pequena dos compostos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
[00263]Exemplos de métodos para o síntese de bibliotecas moleculares podem ser observados na técnica, por exemplo, em: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
[00264]Bibliotecas dos compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), ou em esferas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chipes (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bactérias e/ou esporos, (Ladner, USP 5,223,409), plasmídeos (Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) ou no fago (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.).
[00265]A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não deverão ser interpretados como adicionalmente limitantes. Os teores de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados por todo este pedido, bem como as figuras, estão expressamente incorporados aqui pela referência na sua íntegra. EXEMPLOS EXEMPLO 1. DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS DE FRα EM AMOSTRAS DE URINA DE SUJEITOS HUMANOS COM E SEM Câncer de Ovário MEDIDOS POR IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA).
Materiais e Métodos
[00266]Amostras urina foram obtidas dos sujeitos humanos, incluindo sujei- tos sofrendo de câncer de ovário e sujeitos controles normais não sofrendo de câncer de ovário. Os níveis de FRα nas amostras de urina foram determinados usando um imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) de acordo com o seguinte procedimento (vide Namba et al. (1999) Analytical Science 15:1087-1093): i. Revestimento de anticorpo para microesferas
[00267]O anticorpo do receptor alfa anti-folato monoclonal foi revestido sobre a superfície de microesferas (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal). Trinta seis miligramas de microesferas foram misturados com 1,2 mL de anticorpo MOV18 (0,36 mg/mL, Enzo Life Science) em 0,15 mol/L de salina tamponada com fosfato pH 7,8 (PBS), seguido por mistura suave por 16 horas à temperatura ambiente. As microes- feras foram então lavadas 5 vezes com tampão HEPES 50 mM contendo 0,1 % de soro de coelho normal (NRS), 150 mmol/L de NaCl, 0,01 % de Tween 20 pH 7,5 (tampão de lavagem). A seguir, as microesferas revestidas foram suspensas em 1,2 mL de tampão HEPES 50 mM contendo 20 % NRS, 150 mmol/L de NaCl e 0,01 % de Tween 20 pH 7,5 (tampão de reação) para bloquear a superfície não ligada, seguido por mistura suave por 3,5 horas à temperatura ambiente. Finalmente, as mi- croesferas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem e ressuspensas com 1,2 mL de tampão HEPES 50 mM contendo NRS 10 %, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA-2Na e 0,01 % de Tween 20 pH 7,5 (tampão de reação) de forma que a concentração de microesferas fosse 30 mg/mL. As microesferas foram armazenadas a 4 °C até o uso. ii. Marcação do Anticorpo com Rutênio-Quelato-NHS (Ru)
[00268]Um mililitro de MORAB-003 (1 mg/mL) em PBS foi misturado com 14 μL de Ru (10 mg/mL), razão molar inicial de anticorpo para Ru foi 1:20, seguido por agitação por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. A reação foi terminada adicionando 25 μL de 2 mol/L de solução de glicina seguido por incubação por 20 minutos. O anticorpo marcado foi purificado por filtração de gel usando Sephadex G- 25 (GE Healthcare) eluído com PBS. A primeira fração amarela eluída foi coletada e a concentração de anticorpo e Ru foi determinada por meio do estojo de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific) e absorção a 455 nm respectivamente. A razão molar final foi calculada pela fórmula: razão molar final = [(absorção a 455)/13.700]/[Ab(mg/mL/150.000)]. O anticorpo marcado foi armazenado a 4 °C até o uso. iii. Imunoensaio de Uma Etapa
[00269]As microesferas revestidas do anticorpo foram colocadas na mesa de reagente do Picolumi 8220 (Sanko, Tokyo, Japão) depois de ajustar a concentração das esferas a 1,5 mg/mL (solução funcional) em tampão de reação. O anticorpo marcado de Ru foi colocado na mesa de reagente do Picolumi 8220 depois de ajustar a concentração de anticorpo a 2 μg/mL (solução funcional) em tampão de reação.
[00270]Dez microlitros de urina (diluídos 1:51 em tampão de reação) ou FRα padrão (preparados em tampão de reação) e 100 μL de tampão de reação foram dispensados em um tubo de reação (Sanko, Tokyo, Japão) e colocados no Picolumi 8220.
[00271]As etapas seguintes foram corridas automaticamente por Picolumi 8220. Trinta cinco microlitros de esferas (solução funcional) e 180 μL de anticorpo marcado de Ru (solução funcional) foram dispensados. Depois de 26 minutos de incubação a 30 +/-2 °C, as esferas foram lavadas e suspensas com 300 μL de solução de eletrólito (Sanko, Tokyo, Japão). As esferas lavadas foram subsequentemente transferidas para o eletrodo e emissão de eletroquimioluminescência (ECL) foi medida. Todas as medições ECL foram realizadas em duplicata. Resultados
[00272]A tabela 1 representa os níveis de urina de FRα em sujeitos individuais e sujeitos controles fêmeas não sofrendo de câncer de ovário. Tabela 1: Níveis de FRα em urina de sujeitos controles fêmeas com câncer de ovário e normal
Figure img0009
Figure img0010
[00273]A figura 2 representa a distribuição de níveis de FRα em urina em sujeitos com câncer de ovário e em sujeitos controles fêmeas normais, conforme mostrado na tabela 1.
[00274]A tabela 2 sumariza o número de sujeitos (n), valores médios, desvio padrão (SD), máximo (Max.) e mínimo (Min.) para os níveis de FRα no grupo com câncer de ovário e no grupo controle de fêmea normal. Tabela 2: Sumário de medição da FRα da Urina
Figure img0011
Discussão
[00275]Um alto nível de FRα foi detectado na urina de sujeitos com câncer de ovário. Além disso, os níveis de FRα diferiram significativamente entre grupo controle de fêmeas com câncer de ovário e normal (p=0,03, um lado). EXEMPLO 2. LINEARIDADE DE DILUIÇÃO - DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS DE FRα EM AMOSTRAS DE URINA serialmente diluída MEDIDOS POR IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA)
[00276]Linearidade de diluição é um medida de precisão de um ensaio. Du- as amostras de urina foram serialmente diluídas por um fator de 10 e 100. Os níveis de FRα de cada amostra foram medidos apresentados no exemplo 1 e comparados para avaliar o erro percentual. O erro percentual foi calculado como a seguir: [[(FRα em amostra diluída)*(fator de diluição)] - (F Rα em amostra não diluída)] *100 (FRα em amostra não diluída)
[00277]Os resultados são apresentados na tabela 3: Tabela 3: Linearidade de Diluição para Urina
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[00278]Os resultados anteriores demonstram linearidade de diluição na avaliação dos níveis de FRα em amostras de urina de humano e que, dentro de erros aceitáveis, urina pode ser diluída até um fator de pelo menos 100 retendo ao mesmo tempo níveis precisos de FRα. Dessa maneira, diluição das amostras de urina pode ser considerada antes de determinar os níveis de FRα. EXEMPLO 3: CENTRIFUGAÇÃO DE AMOSTRAS DE URINE - ABORDANDO REPRODUTIBILIDADE
[00279]A reprodutibilidade do ensaio ECLIA para uma amostra de urina particular foi também testada. Por exemplo, conforme refletido na tabela 4, ensaios ECLIA da mesma amostra resultaram em resultados variados. Tabela 4. Reprodutibi idade sem centrifugação da amostra
Figure img0013
[00280]A presença de material insolúvel (precipitados) nas amostras de urina foi hipotetizada ser responsável pela variabilidade vista em medições dos níveis de FRα. Em decorrência disso, centrifugação de amostras a fim de remover sedimento de urina, antes da medição de níveis de FRα, foi considerada uma opção para aumentar a precisão e reprodutibilidade do ensaio.
[00281]A tabela 5 representa os resultados obtidos quando três amostras foram centrifugadas antes do desempenho do ensaio ECLIA. Tabe a 5. Reprodutibilidade com centrifugação da amostra
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[00282]Conforme apresentado anteriormente, os resultados indicam que centrifugação proveu medições mais consistentes de concentração de FRα.
[00283]Adicionalmente, duas amostras foram submetidas a (i) centrifugação (a 2.000 x g por 2 minutos) e o sobrenadante removido para medição de FRα (representado como amostra “A” a seguir na tabela 6) e (ii) centrifugação seguida por turbulência (representado como amostra “B” a seguir na tabela 6), antes da medição de níveis de FRα pelo ensaio ECLIA apresentados no exemplo 1. Os resultados são refletidos na tabela 6 a seguir. Tabela 6: Efeito de centrifugação nos níveis de FRα em urina
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Diferença (%) foi determinada como a seguir: [(Nível de FRα em “B”) - (Nível de FRα em “A”)] *100 (Nível de FRα em “A”)
[00284]Conforme mostrado na tabela 6, os níveis de FRα determinados pelo ensaio ECLIA variam dependendo de se urina foi clarificada por centrifugação para remover precipitados ou se a urina foi turbilhonada para suspender ou dispersar sedimentos. Dessa maneira, em certas modalidades centrifugação ou turbulência de amostras de urina pode ser realizada antes de determinar níveis de FRα. EXEMPLO 4. DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS FRA EM AMOSTRAS DE URINA CENTRIFUGADA DOS SUJEITOS HUMANOS COM E SEM CÂNCER DE OVÁRIO MEDIDOS POR iMUNoENsAio ELETRoQUiMioLUMiNEsCENTE (ECLiA).
[00285]Com base nos resultados de Exemplo 3, o ensaio para avaliar níveis de FRα em sujeitos foi modificado para introduzir uma etapa de centrifugação. os níveis de FRα foram determinados nas mesmas amostras utilizadas no exemplo 1, incluindo o grupo de sujeitos com câncer de ovário e o grupo de sujeitos controles fêmeas normais. Materiais e Métodos
[00286]A metodologia utilizada foi conforme descrito no exemplo 1, exceto que as amostras de urina foram centrifugadas por 10.000 x g por 1 minuto e o so- brenadante resultante subsequentemente diluído por 1:51 em tampão de reação. Resultados
[00287]A tabela 7 representa os níveis de FRα em amostras de urina centrifugadas e não centrifugadas de sujeitos sofrendo de câncer de ovário e sujeitos controles fêmeas saudáveis. Tabela 7: nível FRα1 de urina em grupo controle com câncer de ovário e normal
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[00288]De acordo com os resultados apresentados na tabela 7, centrifugação resultou em uma diminuição na medição de níveis de FRα em algumas amostras, conforme previamente demonstrado na tabela 6. Exemplo 5: Detecção de FRα em Sedimento de Urina por Immunoblotting
[00289]Com base nos resultados mostrados nos exemplos 3 e 4, a presença ou ausência de FRα em sedimento de urina/precipitado foi avaliada usando western blotting.
Materiais e Métodos
[00290]Amostras de urina de 2 pacientes com câncer de ovário para os quais concentrações de FRα foram medidas a 18,747 pg/mL e 145,564 pg/mL, respectivamente (Vide tabela 10 supra), foram submetida aos seguintes procedimentos. Amostras controle consistiram em lisato celular HeLa a 10 μg, lisato de tecido do fígado 20 μg, e lisato do tecido com câncer de ovário 20 μg. • 900 μL de urina foram centrifugados por 2 minutos a 10.000 g • sobrenadante foi removido • o precipitado remanescente foi dissolvido em 15 μL de tampão de amostra PAGE (contendo 292 mM de LDS) e subsequentemente fervido a 70 °C por 10 minutos. • Toda a amostra (aprox. 20 μL) foi carregada n o bis-tris gel NuPAGE (Invi- trogen) • Depois de eletroforese, proteínas foram transferidas para membrana PVDF • 1 % de leite desnatado / 0,05 % de Tween 20 / PBS foram adicionados para bloqueio • O membrana foi lavada com 0,05 % de Tween 20 / PBS • 0,5 mL de anticorpo monoclonal 548908 (R&D Systems) a 2 μg/mL foi adicionado e incubado por 60 minutos à temperatura ambiente • A membrana foi lavada com 0,05 % de Tween 20 / PBS • 10 mL de IgG-HRP de anti-camundongo (DAKO p0447, 1:2000) foram adicionados e incubados naturalmente por 60 minutos • A membrana foi lavada com 0,05 % de Tween 20 / PBS • Substrato Pierce ECL foi adicionado na membrana • A membrana foi removida dos substratos e então imageadas usando o sistema LAS-3000 (FUJIFILM)
Resultados
[00291]O imunoblot resultante é mostrado na figura 3. Nesta figura, pistas 15 correspondem a FRα detectado das seguintes fontes: (1) urina de paciente com câncer de ovário com um nível de FRα medido de 18.747 pg/mL (2) urina de paciente com câncer de ovário com um nível de FRα medido de 145.564 pg/mL (3) lisato celular HeLa: 10 μg (4) lisato do tecido do fígado: 20 μg (5) lisato tecido de câncer de ovário: 20 μg
[00292]Pista 6 no western blot representa marcadores de peso molecular e demonstra que a faixa observada nas pistas 1, 2, 3 e 5 corre no peso molecular esperado para FRα.
[00293]Pistas 3 e 5 são amostras controle positivo e pista 4 é um amostra controle negativo. O faixa fraca na pista 1 e a faixa clara na pista 2 demonstraram que FRα pode ser detectado no sedimento de urina de pacientes com câncer de ovário por western blotting. EXEMPLO 6. DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS DE FRα EM AMOSTRAS DE URINA DE HUMANO NORMAL TRATADO COM GUANIDINA POR IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA).
[00294]Com base nos resultados do exemplo 4 no qual centrifugação resultou em menores níveis de FRα, e os resultados do exemplo 5 onde o sedimento de urina obtido a partir da centrifugação foi mostrou conter FRα imunorreativo, foram procurados métodos para solubilizar os sedimentos de urina para obter medições mais quantitativas e precisas de FRα.
[00295]Com relação a isso, foi tentado tratamento de amostras de urina de fêmea normal com guanidina antes de avaliar níveis de FRα.
[00296]A metodologia utilizada foi conforme descrito no exemplo 1, exceto que as amostras de urina foram misturadas em uma razão 1:1 tanto com guanidina 6 M em tampão (PBS) quanto em tampão sozinhas. Subsequentemente, as amostras de urina foram diluídas por 1:51 em tampão de reação.
[00297]Os resultados deste ensaio são mostrados na tabela 8. Tabela 8: Nível de FRα de urina normal de tratamento com ou sem com guanidina
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[00298]Os resultados deste experimento indicaram que guanidina não interfere com medições de FRα. Como pode ser visto para o controle de antígeno puro (Std Ag), esta metodologia de tratamento com guanidina e diluição subsequente não tem nenhum efeito na medição de FRα. Adicionalmente, será notado que em todas três (3) amostras de urina avaliadas, os níveis de FRα foram maiores nas amostras tratadas (solubilizadas) com guanidina com relação às amostras não tratadas com guanidina.
[00299]A confiabilidade de pré-tratamento com guanidina de amostras de urina foi adicionalmente avaliada expondo três amostras a guanidina e medindo a concentração de FRα de cada qual amostra de guanidina tratada 3 vezes usando o ensaio ECLIA. Os resultados são refletidos na tabela 9 a seguir: Tabela 9: Reprodutibilidade intraensaio de urina tratada com guanidina
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[00300]Conforme apresentado anteriormente, os resultados indicam que tratamento de urina com guanidina antes do ensaio FRα forneceu medições consistentes de concentração de FRα com CV’s muito baixo. EXEMPLO 7. DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS DE FRα EM AMOSTRAS DE URINA TRATADAS COM GUANIDINA DE SUJEITOS HUMANOS COM E SEM CÂNCER DE OVÁRO MEDIDA POR IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA).
[00301]Com base nos resultados do exemplo 6 no qual tratamento com gua- nidina mostrou não interferir com ensaios FRα, um protocolo de ensaio modificado foi empregado para medir FRα nas amostras de urina dos sujeitos com e sem câncer de ovário no exemplo 1. O seguinte protocolo de ensaio foi empregado: Materiais e Métodos
[00302]A metodologia utilizada foi conforme descrito no exemplo 1, exceto que as amostras de urina foram misturadas em uma razão 1:1 com um tampão de guanidina 6 M e subsequentemente diluída por 1:26 em tampão de reação. Resultados
[00303]A tabela 10 representa os níveis de FRα em amostras de urina tratadas com guanidina de sujeitos sofrendo de câncer de ovário e sujeitos controles fêmeas saudáveis. Tabela 10: Nível de urina de FRα em grupo controle com câncer de ovário e normal
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[00304]A figura 4 mostra a distribuição de níveis de FRα na urina de sujeitos sofrendo de sujeitos controles fêmeas com câncer de ovário e normal usando o protocolo modificado com tratamento com guanidina. Uma diferença estatisticamente significativa entre grupos foi observada. A tabela 11 sumariza esses resultados. Tabela 11: Sumário de medição de FRα na urina
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[00305]Usando os dados deste experimento, uma análise característica operacional do receptor (ROC) foi realizada. A figura 5 mostra uma curva ROC da sensibilidade e especificidade da medição de ECLIA de níveis de FRα em urina depois que a urina foi tratada com guanidina. AUC é a área sob a curva, que mede a precisão do teste na separação de câncer de ovário de sujeitos controles.
[00306]Usando um valor de corte arbitrário de 9.100 pg FRα/mL, o AUC foi 0,70 com um valor preditivo positivo de 70 % e um valor preditivo negativo de 80 %, conforme mostrado na tabela 12. Usando este valor de corte, 15/19 pacientes com câncer de ovário tiveram uma concentração de FRα acima de 9.100 pg/mL e 8/10 sujeitos normais tiveram uma concentração de FRα menor que 9.100 pg/mL. Tabela 12: Tratamento com guanidina para medição de urina
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EXEMPLO 8: CORREÇÃO DE CREATININA DE CONCENTRAÇÕES DE FRα DETERMINADAS EM AMOSTRAS DE URINA TRATADAS COM GUANIDINA POR IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA).
[00307]Concentrações de FRα foram previamente determinadas usando ECLIA de amostras de urina tratadas com guanidina de controles de pacientes com câncer de ovário e fêmea normal (Vide exemplo 7, tabela 10). Aqui, essas concentrações de FRα foram corrigidas para níveis de creatinina na urina a fim de normalizar para a taxa de filtração glomerular. Os resultantes valores foram submetidos a um análise ROC. Métodos
[00308]O nível de creatinina na urina foi determinado pelo estojo de teste aprovado Ministry of Health, Labour and Welfare, determinador L CRE (Kyowa Me- dex, Japão). O valor corrigido para concentração de FRα de urina foi calculado como a seguir: = Correção de Creatinina FRα na Urina (ng/g) = (FRα na Urina (ng/L) x 1.000) / (Creatinina na Urina (mg/dL) x10) = (FRα da Urina (ng/L) x 1.000) / Creatinina na Urina (mg/L) = FRα da Urina (ng/L) / Creatinina na Urina (g/L) = FRα da Urina (ng) / Creatinina na Urina (g) ou = 1/1.000 x FRα da Urina (μg) / Creatinina na Urina (g) Resultados
[00309]A tabela 13 apresenta o níveis resultantes de FRα corrigidos por cre- atinina. Tabela 13: Níveis de FRα corrigidos de creatinina determinados usando ECLIA de amostras de urina tratadas com guanidina
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[00310]A figura 6 mostra a distribuição de níveis de FRα em câncer de ovário (OC) e sujeitos controles fêmeas normais depois da correção para níveis de crea- tinina na urina. Existe uma diferença estatisticamente significativa entre pacientes com câncer de ovário e controles em níveis de FRα corrigidos por creatinina (p=0,007).
[00311]Os dados do sumário para câncer de ovário e sujeitos controles normais são providos na tabela 14. Tabela 14: Estatísticas do sumário para níveis de FRα corrigidos por creati- nina
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[00312]Os níveis de FRα corrigidos por creatinina foram adicionalmente submetidos a um análise ROC. A curva ROC é mostrada na figura 7. A tabela 15 apresenta a sensibilidade, especificidade, e área sob a curva (AUC) para vários valores de cortes do teste corrigido por creatinina. Tabela 15: Sensibilidade, especificidade, e AUC para vários valores de cor- tes do teste FRα corrigido por creatinina
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[00313]Conforme previamente notado, existe um clara discriminação entre urinas de pacientes com câncer de ovário e aquelas de sujeitos controles fêmeas saudáveis. EXEMPLO 9: IMUNOENSAIO DE ENZIMA (EIA) E OTIMIZAÇÃO DESTE 1. Imunoensaio de Enzima (EIA) Revestimento de anticorpo em placas microtituladoras
[00314]O anticorpo do receptor alfa anti-folato monoclonal foi revestido na superfície de placas microtituladoras (Nunc-imunoplate, Thermo Scientific) como a seguir. Uma centena de microlitros de anticorpo (absorbância 0,02 a 280 nm) em 50 mmol/L de tampão de carbonato pH 9,4 foram dispensados nos poços, seguido por revestimento por 16 horas a 4 °C. As microplacas foram então lavadas 2 vezes com PBS contendo 0,05 % de Tween 20 (PBS-T). A seguir 0,15 mL de PBS contendo 20 % de soro de coelho normal pH 7,8 foi dispensado nos poços para bloquear a superfície não ligada, seguido por bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as microplacas foram lavadas 2 vezes com PBS-T. As placas revestidas com anticorpo foram secas e mantidas a 4 °C em sacos de alumínio até o uso. Marcação com biotina
[00315]Marcação com biotina foi conduzida de acordo com as recomendações do fabricantes para o EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Produto No. 21338, Thermo Scientific). Resumidamente, 1 mg de anticorpo em 0,4 mL de PBS foi misturado com 0,013 mL de 10 mM Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina, com uma razão molar inicial de anticorpo para biotina de 1:20, seguido por incubação por 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo acoplado em biotina foi purificado por filtração de gel usando uma coluna PD-10 (GE Healthcare) eluído com PBS para remover biotina não reagida. A fim de determinar o nível de incorporação de biotina, o estojo de quantitação EZ Biotin (Produto No. 28005, Thermo Scientific) foi usado. O anticorpo marcado com biotina foi armazenado a -80 °C até o uso. Imunoensaio de duas etapas
[00316]Para a primeira reação, 40 μL de plasma ou antígeno padrão e 60 μL de tampão HEPES 50 mM contendo 10 % de NRS, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA-2Na, 0,01 % de Tween 20 pH 7,5 (tampão de reação) foram dispensados nos poços revestidos com anticorpo. A placa foi incubada por 18 horas a 4 °C, e subsequentemente lavada 5 vezes com PBS-T. Para a segunda reação, 100 μL de 10 μg/mL de anticorpo marcado com biotina em tampão de reação foram dispensados. A placa foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente, e subsequentemente lavada 5 vezes com PBS-T. 100 μL de com peroxidase do rábano silvestre (Pierce) foram dispensados. Depois de 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-T. Finalmente, para o desenvolvimento da cor, 100 μL de solução TMB (KPL) foram dispensados e deixados por 15 minutos no escuro. Depois de interromper desenvolvimento da cor adicionando 100 μL de HCl 1N, a absorção a 450 nm foi lida usando uma leitora de placa. Todas as etapas de lavagem foram automaticamente feitas por autolavadora de placa (AMW-8, BioTec, Japão), e todas medições EIA foram realizadas em duplicata.
[00317]A figura 8 representa o ensaio EIA usando MOV18 como o anticorpo de captura e MORAb-003 biotinilado como o anticorpo detector. 2. Otimização de procedimentos EIA
[00318]Os procedimentos EIA anteriores chegaram em parte com base nos seguintes experimentos projetados para otimizar o procedimento.
[00319]Primeiro, avidina-HRP, anticorpo marcado com biotina e anticorpo marcado com HRP foram comparados. Comparado com anticorpo marcado com HRP, anticorpo marcado com biotina e avidina-HRP forneceu um sinal maior; portanto, anticorpo marcado com biotina e avidina-HRP foram empregados.
[00320]Segundo, procedimentos de incubação de uma e duas etapas foram comparados. Conforme representado na figura 9, um procedimento de incubação de duas etapa produziram um sinal maior e foi assim empregado.
[00321]Terceiro, para otimizar o segundo tempo de incubação, tempos de incubação de uma a quatro horas foram comparados. Os resultados indicaram que um tempos de incubação de hora times forneceram o sinal mais alto para razão do ruído e portanto um tempo de incubação de um hora foi subsequentemente empregado.
[00322]Quarto, a fim de otimizar a concentração funcional de anticorpo marcado com biotina, anticorpo marcado com HRP e volume da amostra, várias concentrações foram empregadas apresentadas na descrição anterior do ensaio EIA. As concentrações de valores ideais são descritas anteriormente. EXEMPLO 10: COMPARAÇÃO DE FRα EM PLASMA DE HUMANO USANDO IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA) E IMUNOENSAIO DE ENZIMA (EIA)
[00323]Os níveis de FRα foram medidos em amostras de plasma de humano tiradas de pacientes com câncer de ovário e controles fêmeas saudáveis usando o ensaio de eletroquimioluminescência (ECLIA) descrito no exemplo 1 e figura 1 (usando MORAb-003 como o anticorpo de captura e MOV-18 marcado rutênio (Ru) como o anticorpo detector marcado) e o imunoensaio de enzima (EIA) descrito no exemplo 9 e A figura 8. Em ambos ensaios, 40 μL de plasma foram ensaiados.
[00324]A tabela 16 mostra os níveis de FRα no plasma em sujeitos com câncer de ovário e controles normais, determinados usando o EIA e ECLIA. Tabela 16: Concentrações de plasma de FRα determinadas usando métodos EIA e ECLIA
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[00325]Com somente uma exceção, os resultados para todos os sujeitos indicaram que as concentrações de FRα detectadas em soro usando EIA são mais baixas que os níveis detectados usando ECLIA, demonstrando que o ensaio EIA, conforme formatado, não é tão sensível quanto o ensaio ECLIA quando esta combinação de captura particular (MOV-18) e detectores de anticorpo (MORAb-003) é usada. Portanto, adicionalmente experimentos com outros tipos de anticorpos foram conduzidos para desenvolver um procedimento EIA mais sensível. EXEMPLO 11: VIABILIDADE DE DIFERENTES TIPOS DE ANTICORPOS PARA MEDIÇÕES EIA DE FRα EM PLASMA DE HUMANO 1. Experimentos Preliminares de Combinações de Anticorpo
[00326]Várias combinações de captura/detectores de anticorpo foram consideradas. Experimentos preliminares produziram os resultados apresentados na tabela 17. Tabela 17
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2. Comparação de ensaios EIA usando várias combinações de anticorpo e comparação com o ensaio ECLIA
[00327]Os níveis de FRα em plasma de pacientes com câncer de ovário e controles fêmeas saudáveis normais foram medidos usando uma ensaio imunoab- sorvente ligado a enzima (EIA) com diferentes combinações de captura e anticorpo marcados com biotina e comparado com os níveis de FRα medidos usando o ensaio ECLIA. Materiais e Métodos
[00328]O método ECLIA foi conforme descrito no exemplo 1 e representado na figura 1 (usando o anticorpo MORAb-003 como o anticorpo de captura e o anticorpo Mov-18 como o anticorpo detector marcado). O método EIA foi conforme descrito no exemplo 9, exceto que três diferentes combinações de captura/detectores de anticorpo foram empregados, conforme representado na figura 10: MOV18/MORAb- 003, 548908/MORAb-003 e 6D398/MORAb-003. Os anticorpos 548908 e 6D398 são comercialmente disponíveis. O anticorpo 548908 foi obtido pela R&D Systems (North Las Vegas, NV) e o anticorpo 6D398 foi obtido pela US Biological (Swampscott, MA 01907). Resultados
[00329]As concentrações de FRα (pg/mL) determinadas usando os métodos EIA e ECLIA são mostrados na tabela 18. Além do mais, as concentrações de FRα (pg/mL) determinadas por EIA usando várias combinações de captura/detectores de anticorpo são representadas graficamente na figura 11. Tabela 18: Concentrações de plasma de FRα (pg/mL) determinadas usando os métodos EIA e ECLIA com várias combinações de anticorpos de captura e detectores.
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[00330]Os dados na tabela 18 indicam que as medições de níveis de FRα com EIA usando a combinação 54908-MORAb-003 produziram resultados que são mais similares com os resultados obtidos usando o ensaio ECLIA. Análises quantiti- vas foram realizadas, confirmando esta observação. Adicionalmente, esses dados demonstram que a detecção de FRα é altamente dependente dos anticorpos e combinação de anticorpo empregados. Dessa maneira, diferentes combinações de anticorpo podem ser empregadas para a determinação de FRα em fluidos biológicos. Além do mais, uma vez que os dados obtidos dos formatos de ensaio EIA e ECLIA são similares, vários formatos de ensaio podem ser usados para a determinação de FRα.
[00331]Para cada qual das três combinações de anticorpos de captura e detectores usadas para o método EIA, uma análise de regressão foi realizada, e as concentrações de FRα (pg/mL) determinadas com EIA foram correlacionadas com as concentrações determinados com o ensaio ECLIA. Os resultados desta análise são mostrados na tabela 19 e na figura 12. Tabela 19: Correlações de concentrações de FRα no plasma medidas por ECLIA com concentrações medidas por EIA usando três combinações de anticorpos de captura e detectores
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[00332]Os resultados para EIA usando a combinação captura-detector de 548098-MORAb-003 correlacionou altamente (r=0,96) com os resultados para ECLIA. EXEMPLO 12: NÍVEIS DE PLASMA DE FRα DETERMINADOS POR EIA E ECLIA EM AMOSTRAS DE PACIENTES COM CÂNCER DE OVÁRIO
[00333]Medições de níveis de FRα no soro foram determinadas em um gru- po de pacientes com câncer de ovário (n=17) e controles normais (n=35) usando ECLIA e EIA. Para as medições EIA, a combinação captura de 548908/anticorpo detector de MORAb-003 foi empregada. O procedimento EIA foi de outra forma conforme descrito no exemplo 9. O ECLIA procedimento foi conforme descrito no exemplo 1. Os resultados são mostrados na tabela 20. Tabela 20: Concentrações de plasma de FRα em pacientes com câncer de ovário e controles normais, determinadas usando EIA e ECLIA
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[00334]A figura 13 mostra a distribuição de concentrações de FRα no plasma em sujeitos controles fêmeas com câncer de ovário e normal determinada usando EIA.
[00335]A tabela 21 mostra estatísticas descritivas do sumário para as concentrações de FRα no plasma em sujeitos controles fêmeas com câncer de ovário e normal determinadas usando EIA. Tabela 21: Sumário de concentrações de plasma FRα em sujeitos controles fêmeas com câncer de ovário e normal determinadas usando EIA.
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[00336]A figura 14 adicionalmente representa a correlação entre concentrações de plasma FRα determinadas usando EIA e ECLIA. A correlação é alta (r=0,95). EXEMPLO 13. DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS FRα EM AMOSTRAS DE SORO E URINA CASADAS E PACIENTES COM CÂNCER DE PULMÃO E PACIENTES COM CÂNCER DE OVÁRIO MEDIDOS POR IMUNOENSAIO ELETROQUIMIOLUMINESCENTE (ECLIA).
[00337]Níveis de FRα foram determinados em amostras de urina e soro casadas em pacientes com câncer de pulmão e câncer de ovário usando ECLIA onde as amostras foram tiradas do mesmo paciente. A correlação entre soro e níveis de urina de FRα foi também determinada. Materiais e Métodos
[00338]A metodologia ECLIA utilizada é conforme descrito no exemplo 1. Guanidina foi usada para solubilizar sedimentos de urina conforme descrito no exemplo 6. Resultados
[00339]Os resultados do ensaio ECLIAs de soro e urina de pacientes com câncer de pulmão e câncer de ovário são apresentados na tabela 22. Tabela 22: concentrações de FRα em amostras de urina e soro casadas de pacientes com câncer de pulmão e pacientes com câncer de ovário, determinadas por ECLIA
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[00340]Dados do sumário para soro e níveis de urina de FRα de pacientes com câncer de pulmão estão apresentados na tabela 23. Tabela 23: Estatísticas do sumário para concentrações de FRα em amostras de urina e soro casadas de pacientes com câncer de pulmão, determinadas por ECLIA
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[00341]Dados do sumário para soro e níveis de urina de FRα de pacientes com câncer de ovário estão apresentados na tabela 24. Tabela 24: Estatísticas de sumário para concentrações de FRα em amostras de urina e soro casadas de pacientes com câncer de ovário, determinadas por ECLIA
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[00342]A figura 15 mostra correlações entre medidas ECLIA de níveis de FRα em amostras de urina e soro casadas tiradas do mesmo paciente. A correlação para pacientes com câncer de pulmão foi r=0,24 (painel superior) e a correlação para pacientes com câncer de ovário foi r=-0,76 (painel inferior).
[00343]Esses dados demonstram a relativa falta de correlação entre concentrações de FRα medidas em urina versus soro, especialmente conforme mostrado para pacientes com câncer de pulmão. Adicionalmente, esses dados demonstram que FRα é basicamente não detectáveis acima de níveis de fundo no soro de paci- entes com câncer de pulmão versus controles normais enquanto FRα é detectável na urina desses pacientes. EXEMPLO 14. AVALIAÇÃO DE NÍVEIS DE FRα EM AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES COM CÂNCER DE OVÁRIO, PACIENTES COM CÂNCER DE PULMÃO, E CONTROLES NORMAIS
[00344]Os níveis de FRα no soro de pacientes com câncer de ovário, pacientes com câncer de pulmão, e controles normais foram avaliados. Níveis de FRα no soro foram avaliados usando ECLIA com dois diferente pares de anticorpo detector de captura: Par 1, no qual 9F3 foi o anticorpo de captura e 24F12 foi o anticorpo detector, e Par 2, no qual 26B3 foi o anticorpo de captura e 19D4 foi o anticorpo detector.
[00345]Os pares de FRα foram testados com curvas de calibração total e 196 soros individuais diluídos 1:4. Em um experimento, 26B3 foi usado como o anticorpo de captura depois do processamento CR em um lote de placa (75 μg/mL, +B, +T) e 19D4 foi usado como o anticorpo detector a 1,0 μg/mL. Em um outro experimento, 9F3 foi usado como o anticorpo de captura e 24F12 foi usado como o anticorpo detector a 1,0 μg/mL. Cada qual foi processado com CR (lote 10.070) com um marcador para razão de proteína (L/P) de 13,3. Diluente 100 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) + anticorpo anti-camundongo humano (HAMA) +mIgG foi usado para amostras e calibrador. Diluente 3 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) foi usado para detecções.
[00346]O seguinte protocolo foi empregado para o ECLIA. Amostras foram adicionadas a 50 μL/poço. As amostras foram agitadas por 2 horas e subsequentemente lavadas com solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) com o detergente Tween 20 (PBST). O anticorpo detector foi adicionado a 25 μL/poço. As amostras foram agitadas por 2 horas e então foram lavadas com PBST. Finalmente, a emissão de eletroquimioluminescência (ECL) das amostras foi lida com 2X MSD® Buffer T.
[00347]Os resultados são mostrado na tabela 25 a seguir. tabela 25: níveis de FRα em soro de pacientes com câncer de ovário, paci- entes com câncer de pulmão, e controles normais
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1 LLOQ é o limite inferior de quantitação 2 A concentração retroajuste é feito para levar em conta a diluição da amos- tra.
[00348]Com base nos dados anteriores, ficou aparente que os anticorpos 9F3, 2412, 26B3 e 19D4 foram usadas em detecção de níveis de FRα nas amostras biológicas, por exemplo, soro, derivadas de um sujeito. Além disso, o particular combinações de (i) 9F3 as um anticorpo de captura e 24F12 as um anticorpo detector e (ii) 26B3 as um anticorpo de captura e 19D4 as um anticorpo detector foram capazes e particularmente efetivos na avaliação de níveis de FRα nas amostras biológicas. Exemplo 15. Avaliação de Níveis de FRα em Urina USANDO TRÊS DIFERENTES PARES DE DETECTOR E ANTICORPO DE CAPTURA
[00349]A capacidade de três pares de anticorpo anti-FRα em detectar os níveis de FRα nas amostras de urina foi avaliada. Os pares de anticorpo utilizados foram como a seguir: (1) 26B3 como anticorpo detector e 9F3 como anticorpo de captura, e (2) 24F12 como anticorpo detector e 9F3 como anticorpo de captura. Método
[00350]Dois pares de anticorpo foram testados com curvas de calibração total e urina pretratada com uma diluição 1:1 por 2 minutos tanto em guanidina 6 M, guanidina 3 M quanto em controle PBS. As seguintes amostras de urina foram testadas: três agrupamentos de urina de humano diluídas 1:80, e cinco urinas de humano individual diluídas 1:80 (um macho, quatro da fêmeas).
[00351]Placas foram Biodotted a 150 μg/mL, +B, +T, em 4spot STD ((Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)), uma captura por poço. Detecções foram corridas a 1 μg/mL. Diluente 100 + HAMA + mIgG foi usado para amostras e calibrador. Diluente 3 foi usado para detecções. Diluentes foram diluentes comercialmente disponíveis obtidos pela Meso Scale Discovery.
[00352]O protocolo seguinte foi empregado para o ECLIA. Amostras foram adicionadas a 50 μL/poço. As amostras foram agitadas por 2 horas. As amostras foram lavadas com solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) com o detergente Tween 20 (PBST). O anticorpo detector foi adicionado a 25 μL/poço. As amostras foram agitadas por 2 horas e subsequentemente lavadas com PBST. A emissão de eletroquimioluminescência (ECL) das amostras foi lida com 2X MSD Buffer T.
[00353]Os resultados desses experimentos são mostrados nas tabelas 2627. Tabela 26: Detecção de níveis de FRα em urina usando 26B3 como anticor- po detector e 9F3 como anticorpo de captura
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tabela 27: Detecção de níveis de FRα em urina usando 24F12 como anticor- po detector e 9F3 como anticorpo de captura
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[00354]Com base nos dados anteriores, ficou aparente que os anticorpos 9F3, 24F12, 26B3 e 19D4s foram usados na detecção de níveis de FRα nas amostras biológicas derivadas de um sujeito. Além disso, as combinações de (1) 26B3 como anticorpo detector e 9F3 como anticorpo de captura e (2) 24F12 como anticorpo detector e 9F3 como anticorpo de captura foram capazes e particularmente efetivos na avaliação dos níveis de FRα nas amostras biológicas.
[00355]Um segundo conjunto de experimentos, seguindo o protocolo descrito anteriormente e usando os mesmos dois pares de anticorpos, foram conduzidos utilizando quatro das urinas de humano fêmea individual diluídas 1:80. A urina foi pré-tratada com uma diluição 1:1 por 2 minutos tanto em guanidina 3 M quanto controle PBSe. Os resultados são mostrados nas tabelas 28-29. Tabela 28: Detecção de níveis de FRα em urina usando 26B3 como anticor- po detector e 9 F3 como anticorpo de captura
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tabela 29: Detecção de níveis de FRα em urina usando 24F12 como anticor- po detector e 9 F3 como anticorpo de captura
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[00356]Os resultados deste segundo conjunto de experimentos adicionalmente confirmam os resultados do primeiro conjunto de experimentos e demonstram que o nível de FRα que não é ligado a uma célula podem ser confiavelmente avaliados, por exemplo, em urina, usando ensaios tal como o ensaio ECLIA e usando o anticorpo 26B3, 9F3, 24F12s. Adicionalmente, os resultados demonstram que tais ensaios podem detectar efetivamente FRα usando pares de detector e anticorpos de captura que ligam FRα (tal como, por exemplo, 26B3 como anticorpo detector e 9F3 como anticorpo de captura, e 24F12 como anticorpo detector e 9F3 como anticorpo de captura). EXEMPLO 16. AVALIAÇÃO DE NÍVEIS DE FRα EM SORO E PLASMA
[00357]Os níveis de FRα foram avaliados nas amostras de soro e plasma nos dois dias separados. Os sujeitos dos quais as amostras foram derivadas foram tanto sujeitos normais quanto pacientes com câncer do ovário ou de pulmão.
[00358]O protocolo para avaliar níveis de FRα foi o mesmo apresentado no exemplo 14 anteriormente. Os pares de anticorpos usados para avaliar níveis de FRα foram também os mesmos do exemplo 14, isto é, Par 1, no qual 9F3 foi o anticorpo de captura e 24F12 foi o anticorpo detector, e Par 2, no qual 26B3 foi o anti- corpo de captura e 19D4 foi o anticorpo detector.
[00359]Os resultados são providos na tabela 30. Tabela 30: Níveis de FRα avaliados em amostras de soro e plasma nos dife- rentes dias
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[00360]Com base nos dados anteriores, ficou aparente que os anticorpos 9F3, 2412, 26B3 e 19D4 foram usados na detecção de níveis de FRα nas amostras biológicas, por exemplo, soro ou plasma, derivados de um sujeito. Além disso, as combinações particulares de (i) 9F3 como um anticorpo de captura e 24F12 como um anticorpo detector e (ii) 26B3 como um anticorpo de captura e 19D4 como um anticorpo detector foram capazes e particularmente efetivos na avaliação de níveis de FRα nas amostras biológicas.
[00361]Para ensaios conduzidos usando tanto o Par 1 quanto o Par 2, houve uma alta correlação entre soro e níveis de FRα no plasma. A figura 16 mostra a correlação em níveis de FRα no soro versus plasma para ensaios conduzidos usando Par 1 (vide exemplo 16). O valor R2 foi 0,8604. A figura 17 mostra a correlação em níveis de FRα no soro versus plasma para ensaios conduzidos usando Par 2 (vide exemplo 16). O valor R2 foi 0,9766.
[00362]Tanto para amostras de soro quanto plasma, houve uma alta correlação entre níveis de FRα medidos usando Par 1 e Par 2. A figura 18 mostra a correlação em níveis de FRα no soro para ensaios conduzidos usando Par 1 versus Par 2 (vide exemplo 16). O valor R2 foi 0,9028. A figura 19 mostra a correlação em níveis de FRα no plasma para ensaios conduzidos usando o par 1 versus par 2 (vide exemplo 16). O valor R2 foi 0,8773.
[00363]Os resultados também mostraram que houve uma alta correlação entre níveis de FRα medidos nos diferentes dias. A figura 20 mostra a correlação inter- dia em níveis de FRα no soro para ensaios conduzidos usando o par 2. O valor R2 foi 0,9839.
EQUIVALENTES
[00364]Versados na técnica perceberão, ou serão capazes de certificar usando não mais que experimento de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes são considerados englobados pelas reivindicações seguintes. Qualquer combinação das modalidades reveladas nas reivindicações dependentes são contempladas no escopo da invenção. Tabela 33: SEQUÊNCIAS
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Claims (39)

1. Método de avaliar se um sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou de pulmão, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: colocar uma amostra de urina derivada do dito sujeito em contato com um anticorpo que se liga a FRα, determinando assim o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina; comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle; identificar um aumento no nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito em comparação com o nível de FRα na amostra controle; e determinar que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou de pulmão com base no dito aumento.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é identificado como estando sofrendo de câncer de ovário.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é identificado como estando sofrendo de câncer de pulmão.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de célula não pequena.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de pulmão de célula não pequena é adenocarcinoma.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a presença de FRα na dita amostra a uma concentração maior que cerca de 9.500 pg/mL, cerca de 10.000 pg/mL, cerca de 11.000 pg/mL, cerca de 12.000 pg/mL, cerca de 13.000 pg/mL, cerca de 14.000 pg/mL, cerca de 15.000 pg/mL, cerca de 16.000 pg/mL, cerca de 17.000 pg/mL, cerca de 18.000 pg/mL, cerca de 19.000 pg/mL, ou cerca de 20.000 pg/mL é uma indicação de que o sujeito está so- frendo de câncer de ovário.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é: (a) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 26B3; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) o anticorpo 26B3; (l) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 19D4; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) o anticorpo 19D4; (o) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 9F3; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) o anticorpo 9F3; (r) um anticorpo que liga no mesmo epítopo que o anticorpo 24F12; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) o anticorpo 24F12; (u) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); e LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); e LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21); (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) e a região variável de cadeia leve LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) e a região variável de cadeia leve LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); ou (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) e a região variável de cadeia leve LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, na- nocorpo ou um anticorpo do domínio.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é marcado.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é marcado com um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, um ECL marcador ou um marcador de enzima.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de FRα é determinado usando uma técnica que é análise western blot, radioimunoensaio, imunofluorimetria, imunoprecipitação, diálise de equilíbrio, imunodifusão, ensaio da fase da solução, imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) ou ensaio ELISA.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra controle compreende um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina derivada do sujeito é tratada com guanidina antes de determinar o nível de FRα.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina é diluída antes de determinar o nível de FRα.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de urina é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes de deter- minar o nível de FRα.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra de urina derivada do dito sujeito em contato com um par de anticorpos que são: (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB- 003 marcado, (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3 imobilizado em um suporte sólido e um anticorpo marcado compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3, ou (c) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3 imobilizado em um suporte sólido e um anticorpo marcado compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3.
17. Método de avaliar a progressão de câncer de ovário em um sujeito sofrendo de câncer de ovário, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compre- ende: colocar uma amostra de urina derivada do dito sujeito em contato com um anticorpo que se liga a FRα, determinando assim o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina; comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle; e (i) identificar um aumento no nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o câncer de ovário progredirá rapidamente com base no dito aumento; ou (ii) identificar uma diminuição no nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o câncer de ovário progredirá lentamente com base na dita diminuição.
18. Método de estratificar um sujeito sofrendo de câncer de ovário em um de pelo menos quatro grupos de terapia de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: colocar uma amostra de urina derivada do dito sujeito em contato com um anticorpo que se liga a FRα, determinando assim o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina; comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle; e estratificar o sujeito em um de pelo menos quatro grupos de terapia de câncer com base no nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é estratificado em câncer de ovário do Estágio I, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV.
20. Método de monitorar a eficácia de tratamento com MORAb-003 de câncer de ovário em um sujeito sofrendo de câncer de ovário, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: colocar uma amostra de urina derivada do dito sujeito em contato com um anticorpo que se liga a FRα, determinando assim o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina, em que o dito sujeito foi previamente administrado com MORAb-003; e comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle; e (i) identificar um aumento no nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o tratamento com MORAb-003 não é eficiente; ou (ii) identificar uma diminuição no nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o tratamento com MORAb-003 é eficiente.
21. Método para prever se um sujeito sofrendo de câncer de ovário responderá ao tratamento com MORAb-003, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: colocar uma amostra de urina derivada do dito sujeito em contato com um anticorpo que se liga a FRα, determinando assim o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina; e comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de urina derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle; e identificar um aumento no nível de FRα na amostra de urina derivada do dito sujeito em comparação com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003.
22. Método de avaliar se um sujeito está sofrendo de um câncer de ovário ou de pulmão que expressa receptor alfa de folato (FRα), o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar o nível de FRα que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito; e comparar o nível de FRα que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, identificar um aumento no nível de FRα na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito em comparação com o nível de FRα na amostra de controle; e determinar que o sujeito está sofrendo de câncer de ovário ou câncer de pulmão com base no dito aumento, em que o nível de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra de soro ou plasma em contato com um par de anticorpos que se ligam a FRα em um ensaio sanduíche de dois anticorpos, em que o ensaio sanduíche de dois anticorpos é um ensaio ele- troquimioluminescente (ECLIA) ou imunoensaio de enzima (EIA).
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é identificado como estando sofrendo de câncer de ovário.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é identificado como estando sofrendo de câncer de pulmão.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão de célula não pequena.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de pulmão de célula não pequena é adenocarcinoma.
27. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que os anticorpos que se ligam a FRα são selecionados do grupo consistindo em: (a) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que o anticorpo MORAb-003; (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:1 (GFTFSGYGLS) como CDRH1, SEQ ID NO:2 (MISSGGSYTYYADSVKG) como CDRH2, SEQ ID NO:3 (HGDDPAWFAY) como CDRH3, SEQ ID NO:4 (SVSSSISSNNLH) como CDRL1, SEQ ID NO:5 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:6 (QQWSSYPYMYT) como CDRL3; (c) o anticorpo MOV18; (d) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que o anticorpo MOV18; (e) o anticorpo 548908; (f) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que o anticorpo 548908; (g) o anticorpo 6D398; (h) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que o anticorpo 6D398; (i) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54; (j) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1 , SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3; (k) um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreen- dendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:58 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54; (l) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38; (m) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3; (n) um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:38; (o) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30; (p) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3; (q) um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30; (r) um anticorpo que liga especificamente no mesmo epítopo que um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46; (s) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3; (t) um anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:50 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:46; (u) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; ou SEQ ID NO: 16; (v) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; ou SEQ ID NO: 21; (w) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 16; (x) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 19 e a região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 16; e (y) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 18 e a região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 16.
28. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que os anticorpos que se ligam a FRα são selecionados do grupo consistindo em um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo quimérico, um Fab, Fab’2, ScFv, nanocorpo ou um anticorpo do domínio.
29. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de FRα é determinado por um imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA).
30. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de controle compreende um nível de controle padronizado de FRα em um sujeito saudável.
31. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que (i) a amostra de soro ou plasma derivada do sujeito é tratada com guanidina antes da determinação do nível de FRα, (ii) a amostra de soro ou plasma derivada do sujeito é diluída antes da determinação do nível de FRα, e/ou (iii) a amostra de soro ou plasma derivada do sujeito é centrifugada, turbilhonada, ou ambos, antes da determinação do nível de FRα.
32. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o par de anticorpos é selecionado de: (a) anticorpo MOV18 imobilizado em um suporte sólido e anticorpo MORAB- 003 marcado, (b) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:31 (SGYYWN) como CDRH1, SEQ ID NO:32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) como CDRH2, SEQ ID NO:33 (EWKAMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:27 (RASSTVSYSYLH) como CDRL1, SEQ ID NO:28 (GTSNLAS) como CDRL2 e SEQ ID NO:29 (QQYSGYPLT) como CDRL3 imobilizado em um suporte sólido e um anticorpo marcado compreendendo SEQ ID NO:47 (SYAMS) como CDRH1, SEQ ID NO:48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) como CDRH2, SEQ ID NO:49 (ETTAGYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:43 (SASQGINNFLN) como CDRL1, SEQ ID NO:44 (YTSSLHS) como CDRL2 e SEQ ID NO:45 (QHFSKLPWT) como CDRL3, ou (c) um anticorpo compreendendo SEQ ID NO:55 (GYFMN) como CDRH1, SEQ ID NO:56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) como CDRH2, SEQ ID NO:57 (GTHYFDY) como CDRH3, SEQ ID NO:51 (RTSENIFSYLA) como CDRL1, SEQ ID NO:52 (NAKTLAE) como CDRL2 e SEQ ID NO:53 (QHHYAFPWT) como CDRL3 imobilizado em um suporte sólido e um anticorpo marcado compreendendo SEQ ID NO:39 (HPYMH) como CDRH1, SEQ ID NO:40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) como CDRH2, SEQ ID NO:41 (EEVADYTMDY) como CDRH3, SEQ ID NO:35 (RASESVDTYGNNFIH) como CDRL1, SEQ ID NO:36 (LASNLES) como CDRL2 e SEQ ID NO:37 (QQNNGDPWT) como CDRL3.
33. Método de avaliar a progressão de câncer de ovário em um sujeito sofrendo de câncer de ovário, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito por meio de um ensaio sanduíche de dois anticorpos, em que o ensaio sanduíche de dois anticorpos é um ensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) ou imunoensaio de enzima (EIA); comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula com o nível de FRα em uma amostra controle, (i) identificar um aumento no nível de FRα na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o câncer de ovário progredirá rapidamente com base no dito aumento; ou (ii) identificar uma diminuição no nível de FRα na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o câncer de ovário progredirá lentamente com base na dita diminuição.
34. Método de estratificar um sujeito sofrendo de câncer de ovário em um de pelo menos quatro grupos de terapia de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito por meio de um ensaio sanduíche de dois anticorpos, em que o ensaio sanduíche de dois anticorpos é um ensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) ou imunoensaio de enzima (EIA); e estratificar o sujeito em um de pelo menos quatro grupos de terapia de câncer com base no nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é estratificado em câncer de ovário do Estágio I, Estágio II, Estágio III ou Estágio IV.
36. Método de monitorar a eficácia de tratamento com MORAb-003 de câncer de ovário em um sujeito sofrendo de câncer de ovário, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito por meio de um ensaio sanduíche de dois anticorpos, em que o ensaio sanduíche de dois anticorpos é um ensaio eletroquimioluminescente (ECLIA) ou imunoensaio de enzima (EIA), em que o dito sujeito foi previamente administrado com MORAb-003; e comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na dita amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle; e (i) identificar um aumento no nível de FRα na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o tratamento com MORAb-003 não é eficiente; ou (ii) identificar uma diminuição no nível de FRα na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito comparado com o nível de FRα na amostra controle e determinar que o tratamento com MORAb-003 é eficiente.
37. Método para prever se um sujeito sofrendo de câncer de ovário responderá ao tratamento com MORAb-003, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula em uma amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito; e comparar o nível de receptor alfa de folato (FRα) que não é ligado a uma célula na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito com o nível de FRα em uma amostra controle, identificar um aumento no nível de FRα na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito em comparação com o nível de FRα na amostra de controle e determinar que o sujeito responderá ao tratamento com MORAb-003, em que o nível de FRα que não é ligado a uma célula na amostra de soro ou plasma derivada do dito sujeito é avaliado colocando a amostra de soro ou plasma em contato com um par de anticorpos que se ligam a FRα em um ensaio sanduíche de dois anticorpos, em que o ensaio sanduíche de dois anticorpos é um ensaio ele- troquimioluminescente (ECLIA) ou imunoensaio de enzima (EIA).
38. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um dos anticorpos que se ligam a FRα é marcado.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador é um rádio marcador, um marcador de biotina, um marcador de cromoforo, um marcador de fluorforo, um ECL marcador ou um marcador de enzima.
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