JP6224456B2 - 葉酸受容体アルファ発現癌の診断および予後マーカーとしての葉酸受容体アルファ - Google Patents
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Description
本発明は、対象が肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するための方法、FRα発現癌に罹患している対象において、肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌の進行を評価するための方法、FRα発現癌の対象を少なくとも4つの癌治療群のうちの1つに階層化するための方法、卵巣癌または肺癌のMORAb−003治療の有効性を評価するための方法、および対象が肺癌もしくは卵巣癌などのFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するための、または対象における肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌の進行を評価するためのキットを提供する。
第一の態様において、本発明は、対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを、対象由来の試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定し;細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較することによって評価する方法を対象とし、対象由来の試料におけるFRαのレベルと対照試料におけるFRαのレベルとの間の差は、対象がFRα発現癌に罹患しているという指標であり、対象由来の試料におけるFRαのレベルは、試料をFRαに結合する抗体と接触させることによって評価される。特定の実施形態において、試料は、尿、血清、血漿または腹水のいずれかである。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
さらなる態様において、本発明は、FRα発現癌に罹患している対象におけるFRα発現癌の進行を、対象由来の試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定し;細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較することによって評価する方法を対象とし、対照試料におけるFRαのレベルと比較した場合の対象由来の試料におけるFRαのレベルの増加は、癌が急速に進行するという指標であり;対照試料におけるFRαのレベルと比較した場合の対象由来の試料におけるFRαのレベルの減少は、癌が穏やかに進行するまたは退行するという指標であり、それにより対象におけるFRα発現癌の進行を評価し、対象由来の試料における細胞に結合しないFRαのレベルは、試料をFRαに結合する抗体と接触させることによって評価される。特定の実施形態において、試料は、尿、血清、血漿または腹水である。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
さらなる態様において、本発明は、FRα発現癌に罹患している対象を、対象由来の試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定し;細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルに基づいて、対象を少なくとも4つの癌治療群の1つに階層化することによって、少なくとも4つの癌治療群の1つに階層化する方法を提供し、対象由来の試料において、細胞に結合しないFRαのレベルは、試料をFRαに結合する抗体と接触させることによって評価される。例えば、試料は、尿、血清、血漿または腹水からなる群から選択される。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号l(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRLl1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
一態様において、本発明は、卵巣癌または肺癌を患っている対象における卵巣癌または肺癌のMORAb−003治療の有効性を、MORAb−003が予め投与された対象由来の試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定し;細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較することによって監視する方法を提供し、対照試料におけるFRαのレベルと比較した場合、対象由来の試料におけるFRαのレベルの増加は、MORAb−003治療が有効でないという指標であり;対照試料におけるFRαのレベルと比較した場合、対象由来の試料におけるFRαのレベルの減少は、MORAb−003治療が有効であるという指標である。特定の実施形態において、対象由来の試料における細胞に結合しないFRαのレベルは、試料をFRαに結合する抗体と接触させることによって評価される。例えば、試料は、尿、血清、血漿または腹水であってもよい。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
一態様において、本発明は、卵巣癌または肺癌などのFRα発現癌を患っている対象がMORAb−003による治療に応答するかどうかを、対象由来の試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定し;対象由来の試料における細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較することによって予測する方法を提供し、対象由来の試料におけるFRαのレベルと対照試料におけるFRαのレベルの間の差は、対象がMORAb−003による治療に応答するという指標である。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
別の態様において、本発明は、卵巣癌または肺癌を有する対象を、前記対象由来の試料(例えば、尿、血清、血漿または腹水)において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定し;細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較し;治療有効量のMORAb−003を前記対象に投与することによって治療する方法を提供し、前記対象由来の試料におけるFRαのレベルと対照試料におけるFRαのレベルとの間の差は、対象が卵巣癌または肺癌に罹患しているという指標である。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
一態様において、本発明は、対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するためのキットまたは対象におけるFRα発現癌の進行を評価するためのキットであって、対象由来の試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定するための手段;および対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価する、またはFRα発現癌の進行を評価するキットを使用するための使用説明書を含むキットを提供する。例えば、FRα発現癌は、肺癌、中皮腫、卵巣癌、腎臓癌、脳癌、子宮頸癌、鼻咽腔癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、子宮内膜癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、骨癌、下垂体癌、結腸直腸癌および甲状腺髄様癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、FRα発現癌は卵巣癌である。なお別の実施形態において、FRα発現癌は、非小細胞肺癌、例えば腺癌である。さらなる実施形態において、試料は、尿、血清、血漿または腹水のいずれかである。
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。
本明細書で使用するとき、以下の用語の各々は、このセクションにおける用語と関連付けられた意味を有する。
本発明は、少なくとも部分的には、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)が、対照試料と比較して、FRα発現癌を有する対象の生体液、例えば、尿または血清においてレベル増加して見出されるという予期せぬ発見に基づいている。さらに、本発明は、少なくとも一部には、試料中の細胞に結合しないFRαのレベルを評価するのに必要な感受性を示す免疫学的アッセイの同定に基づいており、同様の従来の試みは失敗を繰り返していた。実際に、本発明は、試料、例えば尿または血清中の細胞に結合しないFRαのレベルを正確に評価することができる免疫学的アッセイを提供することによって、肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌についてのFRαに基づく診断アッセイを開発する従来の試みの中で観察された課題を克服する。
具体的には、本発明は、対象が肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するための診断方法、肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌の進行を予測するための予後方法、および対象がFRα発現癌を発症する危険性のレベルを評価するための危険性評価方法を提供する。さらに、本発明は、肺癌または卵巣癌などのFRα発現癌を癌治療群に階層化するための階層化方法を提供する。本明細書に検討されている本発明の種々の態様および実施形態は、非制限的であり、本明細書で検討されているまたは以下で特許請求されている方法およびキットのいずれかに適用してもよい、記載されている特定の実施形態の全ての可能な組み合わせを包含することが意図される。
いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号27に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR1アミノ酸配列を含む抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号28に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号29に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR3アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号31に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR1アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号32に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号33に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR3アミノ酸配列を含む。FRαに結合する抗体は、配列番号27に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号28に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号29に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号31に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号32に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号33に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号27に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号28に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号29に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、また、配列番号31に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号32に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号33に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を有してもよい。
いつくかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号35に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR1アミノ酸配列を含む抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号36に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号37に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR3アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号39に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR1アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号40に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号41に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR3アミノ酸配列を含む。FRαに結合する抗体は、配列番号35に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号36に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号37に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号39に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号40に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号41に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号35に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号36に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号37に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、また、配列番号39に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号40に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号41に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を有してもよい。
いつくかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号43に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR1アミノ酸配列を含む抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号44に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号45に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR3アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号47に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR1アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号48に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号49に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR3アミノ酸配列を含む。FRαに結合する抗体は、配列番号43に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号44に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号45に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号47に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号48に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号49に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号43に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号44に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号45に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、また、配列番号47に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号48に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号49に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を有してもよい。
いつくかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号51に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR1アミノ酸配列を含む抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号52に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号53に実質的に同じであるまたは同一である軽鎖CDR3アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号55に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR1アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号56に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR2アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、FRαに結合する抗体は、配列番号57に実質的に同じであるまたは同一である重鎖CDR3アミノ酸配列を含む。FRαに結合する抗体は、配列番号51に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号52に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号53に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号55に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号56に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号57に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を含んでもよい。FRαに結合する抗体は、配列番号51に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号52に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号53に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含んでもよく、また、配列番号55に実質的に同じであるまたは同一であるCDR1アミノ酸配列;配列番号56に実質的に同じであるまたは同一であるCDR2アミノ酸配列;および配列番号57に実質的に同じであるまたは同一であるCDR3アミノ酸配列を有する重鎖を有してもよい。
試料中のポリペプチドを検出するための抗体を用いる、当業者に知られている様々なアッセイフォーマットがあり、例えば、限定されないが、酵素免疫吸着法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫蛍光分析、免疫沈降、溶液相アッセイ、平衡透析、免疫拡散法および他の技術が挙げられる。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年;Weir,D.M.、Handbook of Experimental Immunology,1986年、Blackwell Scientific、Bostonを参照されたい。例えば、アッセイはウェスタンブロットフォーマットにおいて行われてもよく、生物学的試料からのタンパク質調製は、ゲル電気泳動に置かれ、適切なメンブレンに転写され、抗体と反応させるようにする。次に、メンブレン上の抗体の存在は、当該技術分野において周知であり、以下に記載されるように、適切な検出試薬を用いて検出され得る。
本発明はまた、対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価し、FRα発現癌の進行を評価し、対象がFRα発現癌を発症する危険性のレベルを評価しまたはFRα発現癌の治療もしくは治療計画の有効性を監視するためのキットを提供する。これらのキットは、FRαの発現レベルを決定するための手段、およびFRα発現癌の進行を評価し、対象がFRα発現癌を発症する危険性のレベルを評価し、またはFRα発現癌に対する治療もしくは治療計画の有効性を監視するためのキットを使用するための使用説明書を含む。
さらなる実施形態において、本発明はまた、試料中のFRαのレベルを監視および比較することによって、癌、例えばFRα発現癌、または癌細胞、例えば卵巣癌細胞の増殖、進行および/または攻撃性(aggressiveness)を調節する調節因子、すなわち候補もしくは試験化合物または薬剤(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド(peptoid)、小分子または他の薬物)を同定するための方法(本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも称される)を提供する。このようなアッセイは、典型的には、癌または癌細胞に対する活性が測定されるべきである試験化合物または試験化合物の組み合わせを含む。本明細書に記載されるアッセイなどのアッセイを介して同定される化合物は、例えば、FRα発現癌または癌細胞、例えば卵巣癌細胞の攻撃性の調節、例えば阻害、改善、治療または予防に有用であり得る。試料中のFRαのレベルを監視することによって、FRα発現癌が進行しているまたは退行しているかどうかを決定し、試験化合物が所望の効果を有するかどうかを決定することができる。例えば、FRα発現癌が、高レベルのFRαが悪い予後と関連付けられる実施形態において、試験化合物の投与後のFRαのレベルの減少は、試験化合物の有効性を示す。対照的に、試験化合物の投与後のFRαのレベルの増加は、試験化合物が卵巣癌の治療に有効でないことを示す。対照的に、FRα発現癌が、高レベルのFRαが良好な予後と関連付けられる癌である実施形態において、試験化合物の投与後のFRαのレベルの増加は、試験化合物の有効性を示す。対照的に、試験化合物の投与後のFRαのレベルの減少は、卵巣癌の治療に有効でないことを示す。
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によって測定される卵巣癌を有するまたは有しないヒト対象由来の尿試料におけるFRαレベルの決定
材料および方法
尿試料をヒト対象から得て、卵巣癌に罹患している対象および卵巣癌に罹患していない正常な対照対象を含んでいた。尿試料におけるFRαのレベルは、以下の手法に従って、電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)を用いて決定された(Nambaら、(1999年)Analytical Science 15:1087−1093参照)。
モノクローナル抗葉酸受容体アルファ抗体をマイクロビーズ(Dynabeads M−450 Epoxy、Dynal)の表面全体に被覆した。36mgのマイクロビーズを0.15mol/Lリン酸緩衝生理食塩水pH7.8(PBS)中の1.2mLの抗体MOV18(0.36mg/mL、Enzo Life Science)と混合し、16時間、室温にて穏やかに混合した。次に、マイクロビーズは、0.1%の正常なウサギ血清(NRS)、150mmol/LのNaCl、0.01%Tween 20 pH7.5を含む50mMのHEPES緩衝液(洗浄緩衝液)で5回洗浄された。その後、被覆されたマイクロビーズは、20%NRS、150mmol/LのNaClおよび0.01%Tween 20 pH7.5を含む1.2mLの50mM HEPES緩衝液(反応緩衝液)中に懸濁され、未結合表面をブロッキングし、3.5時間、室温にて穏やかに混合した。最後に、マイクロビーズは、洗浄緩衝液で5回洗浄され、10%NRS、150mmol/LのNaCl、10mmol/LのEDTA−2Naおよび0.01%Tween 20 pH7.5を含む1.2mLの50mMのHEPES緩衝液(反応緩衝液)で再懸濁され、マイクロビーズの濃度を30mg/mLにした。マイクロビーズを4℃にて使用するまで保存した。
PBS中の1mlのMORAB−003(1mg/mL)は、14μLのRu(10mg/mL)と混合され、抗体とRuの初期モル比は1:20であり、30分間、室温にて遮光して振とうした。反応は、25μLの2mol/Lグリシン溶液を添加することによって停止させ、その後、20分間インキュベートした。標識された抗体は、PBSで溶出させるSephadex G−25(GE Healthcare)を用いたゲル濾過によって精製された。最初に溶出された黄色の画分を回収し、抗体およびRuの濃度は、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific)の手段およびそれぞれ455nmの吸収によって決定された。最終モル比は、式:最終モル比=[(455での吸収)/13700]/[Ab(mg/mL/150000)]によって計算された。標識された抗体を4℃にて使用するまで保存した。
抗体被覆されたマイクロビーズは、Picolumi 8220(Sanko、Tokyo、Japan)の試薬表に設定され、その後、反応緩衝液中で1.5mg/mlの濃度(作業溶液)を調節した。Ru標識された抗体は、Picolumi 8220の試薬表に設定され、その後、抗体の濃度を反応緩衝液中2μg/ml(作業溶液)を調節した。
表1は、卵巣癌罹患の個々の対象および非罹患女性対照対象におけるFRαの尿レベルを示す。
高レベルのFRαは、卵巣癌の対象の尿において検出された。さらに、FRαのレベルは、卵巣癌と正常な女性の対照群の間で有意に異なっていた(p=0.03、片側)。
希釈直線性−電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によって測定される連続希釈された尿試料におけるFRαレベルの決定
希釈直線性はアッセイの精度の測定である。2つの尿試料は、10倍および100倍に連続希釈された。各試料のFRαレベルは、実施例1に記載されるように測定し、誤差率を評価するために比較された。誤差率は以下のように計算された:
尿試料の遠心分離−再現性の対処
具体的な尿試料についてのECLIAアッセイの再現性はまた試験された。例えば、表4に反映されるように、同じ試料のECLIAアッセイは様々な結果をもたらした。
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によって決定された卵巣癌を有するまたは有しないヒト対象由来の遠心分離された尿試料におけるFRαレベルの決定
実施例3の結果に基づいて、対象におけるFRαレベルを評価するためのアッセイは遠心分離工程を導入するために修正された。FRαレベルは、実施例1において使用されたものと同じ試料において決定され、卵巣癌を有する対象群および正常な女性の対照対象の群を含んだ。
使用された方法は、尿試料を10000×gで1分間遠心分離し、その後、得られた上清を反応緩衝液中で1:51に希釈したことを除いて、実施例1に記載される通りであった。
表7は、卵巣癌に罹患している対象および健常な女性の対照対象由来の遠心分離された尿試料および遠心分離されていない尿試料におけるFRαのレベルを示す。
イムノブロッティングによる尿沈渣におけるFRαの検出
実施例3および4に示された結果に基づいて、尿沈渣/沈殿物におけるFRαの存否はウェスタンブロッティングを用いて評価された。
2人の卵巣癌患者由来の尿試料は、FRα濃度がそれぞれ18,747pg/mLと145,564pg/mLとして測定され(表10(上述)参照)、以下の手法に供された。対照試料は、HeLa細胞溶解物10μg、肝組織溶解物20μgおよび卵巣癌組織溶解物20μgからなっていた。
・900μLの尿を2分間、10000gにて遠心分離した。
・上清を除いた。
・残りのペレットを15μLのPAGE試料緩衝液(292mMのLDS含有)に溶解し、続いて70℃にて10分間煮沸した。
・全試料(約20μL)をNuPAGEビス−トリスゲル(Invitrogen)に充填した。
・電気泳動後、タンパク質をPVDFメンブレンに転写した。
・1%スキムミルク/0.05%Tween 20/PBSをブロッキングのために添加した。
・メンブレンを0.05%Tween 20/PBSで洗浄した。
・2μg/mlのモノクローナル抗体548908(R&D Sysetms)0.5mLを添加し、60分間、室温にてインキュベートした。
・メンブレンを0.05%Tween 20/PBSで洗浄した。
・10mLの抗マウスIgG−HRP(DAKO p0447、1:2000)を添加し、60分間インキュベートした。
・メンブレンを0.05%Tween 20/PBSで洗浄した。
・Pierce ECL基質をメンブレンに添加した。
・基質からメンブレンを除き、次に、LAS−3000(FUJIFILM)システムを用いて画像化した。
得られたイムノブロットを図3に示す。この図において、レーン1から5は、以下の供給源から検出されたFRαに対応する:
(1)測定されたFRαレベルが18,747pg/mLである卵巣癌患者由来の尿
(2)測定されたFRαレベルが145,564pg/mLである卵巣癌患者由来の尿
(3)HeLa細胞溶解物:10μg
(4)肝組織溶解物:20μg
(5)卵巣癌組織溶解物:20μg
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によるグアニジン処理された正常ヒト尿試料におけるFRαレベルの決定
遠心分離がFRαレベルの減少をもたらした実施例4の結果、および遠心分離から得られた尿沈渣が免疫反応性FRαを含むことが示された実施例5の結果に基づいて、方法は、FRαのより定量的および正確な測定を得るために、尿の沈渣を可溶化させるように追求された。
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によって測定される卵巣癌を有するおよび卵巣癌を有しないヒト対象由来のグアニジン処理された尿試料におけるFRαレベルの決定
グアニジン処理はFRαアッセイと干渉しないことが示された実施例6の結果に基づいて、変更されたアッセイプロトコールを用いて、実施例1における卵巣癌を有するおよび卵巣癌を有しない対象由来の尿試料においてFRαを測定した。
材料および方法
用いられた方法は、尿試料が、反応緩衝液中の6Mグアニジン緩衝液と1:1比に混合され、続いて1:26に希釈されたことを除き、実施例1に記載される通りであった。
表10は、卵巣癌に罹患している対象および健常な女性の対照対象由来のグアニジン処理された尿試料におけるFRαのレベルを示す。
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によるグアニジン処理された尿試料において決定されたFRα濃度のクレアチニン補正
FRαの濃度は、卵巣癌患者および正常な女性対照由来のグアニジン処理された尿試料のECLIAを用いて予め決定された(実施例7、表10参照)。ここで、これらのFRα濃度は、糸球体濾過率について標準化するために、尿のクレアチニンレベルについて補正された。得られた値をROC分析に供した。
尿のクレアチニンレベルは、厚生労働省によって承認されている試験キットであるdeterminer L CRE(Kyowa Medex、日本)によって決定された。尿のFRα濃度について補正された値は以下のように計算された:
尿のFRαクレアチニン補正(ng/g)
=(尿FRα(ng/L)×1000)/(尿クレアチニン(mg/dL)×10)
=(尿FRα(ng/L)×1000)/尿クレアチニン(mg/L)
=尿FRα(ng/L)/尿クレアチニン(g/L)
=尿FRα(ng)/尿クレアチニン(g)
または
=1/1000×尿FRα(μg)/尿クレアチニン(g)
表13は、得られたクレアチニン補正されたFRαレベルを示す。
酵素イムノアッセイ(EIA)およびその最適化
1.酵素イムノアッセイ(EIA)
マイクロタイタープレートへの抗体被覆
モノクローナル抗葉酸受容体アルファ抗体は、以下のようにマイクロタイタープレート(Nunc−イムノプレート、Thermo Scientific)の表面に被覆された。50mmol/Lの炭酸塩緩衝液pH9.4中の100μlの抗体(吸光度は280nmにて0.02)をウェルに分注し、続いて、16時間、4℃にて被覆した。次に、マイクロタイターは、0.05%Tween20(PBS−T)を含むPBSで2回洗浄された。その後、20%の正常なウサギ血清pH7.8を含む0.15mLのPBSをウェルに分注し、未結合表面をブロッキングし、続いて、1時間、室温にてブロッキングした。最後に、マイクロタイターは、PBS−Tで2回洗浄された。抗体被覆されたプレートを乾燥させ、使用するまでアルミニウムバッグ中に4℃にて維持した。
ビオチン標識は、EZ−Link Sulfo−NHS−LC−LC−Biotin(製造番号21338、Thermo Scientific)について、製造業者の推奨に従って行った。要約すると、0.4mLのPBS中の1mgの抗体は、10mMのSulfo−NHS−LC−LC−Biotinの0.013mLと混合され、抗体とビオチンの初期のモル比は1:20であり、続いて、30分間、室温にてインキュベートされた。ビオチンをカップリングさせた抗体は、PBSで溶出されるPD−10カラム(GE Healthcare)を用いるゲル濾過によって精製され、未反応のビオチンを除いた。ビオチンの取り込みのレベルを決定するために、EZ Biotih定量キット(製造番号28005、Thermo Scientific)を用いた。ビオチン標識された抗体を使用するまで−80℃にて保存した。
第一の反応について、40μLの血漿または標準抗原および60μLの50mM HEPES緩衝液(10%NRS、150mmol/LのNaCl、10mmol/LのEDTA−2Na、0.01%Tween 20 pH7.5)(反応緩衝液)を抗体被覆ウェルに分注した。プレートを18時間、4℃にてインキュベートし、続いて、PBS−Tで5回洗浄した。第二の反応について反応緩衝液中の10μg/mLのビオチン標識された抗体の100μLを分注した。プレートを1時間、室温にてインキュベートし、続いてPBS−Tで5回洗浄した。100μLの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたストレプトアビジン(Pierce)を分注した。室温にて30分のインキュベーション後、プレートをPBS−Tで5回洗浄した。最後に、発色について、100μLのTMB溶液(KPL)を分注し、15分間遮光して維持した。100μLの1NのHClの添加より発色を停止させた後、450nmでの吸光度をプレートリーダーを用いて読み込んだ。全ての洗浄工程は、自動プレートウォッシャー(AMW−8、BioTec、日本)によって自動的に行われ、全てのEIA測定は2点測定で行われた。
上記EIA手法は、部分的には、この手法を最適化するために設計された以下の実験に基づいて達成された。
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)および酵素イムノアッセイ(EIA)を用いたヒト血漿におけるFRαの比較
FRαのレベルは、実施例1と図1(捕捉抗体としてMORAb−003および標識された検出抗体としてルテニウム(Ru)標識されたMOV−18を用いる)に記載されている電気化学発光アッセイ(ECLIA)および実施例9と図8に記載されている酵素イムノアッセイ(EIA)を用いて、卵巣癌患者および健常な女性の対照から採取されたヒト血漿試料において測定された。両アッセイにおいて、40μLの血漿をアッセイした。
ヒト血漿におけるFRαのEIA測定のための異なるタイプの抗体の実施可能性
1.抗体の組み合わせの予備実験
捕捉/検出抗体の種々の組み合わせを考慮した。予備実験は、表17に記載される結果を示した。
卵巣癌患者および正常な健常女性の対照由来の血漿におけるFRαのレベルは、捕捉抗体とビオチン標識された抗体の異なる組み合わせを用いた酵素免疫吸着法(EIA)により測定され、ECLIAアッセイを用いて測定されたFRαのレベルと比較された。
ECLIA法は実施例1に記載され、図1(捕捉抗体としてMORAb−003抗体、および標識された検出抗体としてMov−18抗体を用いる)に示される通りであった。EIA法は、捕捉/検出抗体の3つの異なる組み合わせを用いることを除いて、実施例9に記載され、図10に示される通りであった:MOV18/MORAb−003、548908/MORAb−003および6D398/MORAb−003。抗体548908と6D398は市販されている。548908抗体はR&D System(North Las Vegas、NV)から得られ、6D398抗体はUS Biological(Swampscott,MA 01907)から得られた。
EIA法およびECLIA法を用いて決定されたFRαの濃度(pg/mL)を図18に示す。さらに、捕捉/検出抗体の種々の組み合わせを用いたEIAによって決定されたFRαの濃度(pg/ml)は、図11に図示されている。
卵巣癌患者由来の試料におけるEIAとECLIAによって決定されたFRαの血漿レベル
血清FRαレベルの測定は、卵巣癌患者(n=17)群および正常対照(n=35)群において、ECLIAおよびEIAを用いて決定された。EIA測定について、548908捕捉抗体/MORAb−003検出抗体の組み合わせを採用した。EIA手法は、他には実施例9に記載される通りであった。ECLIA手法は、実施例1に記載される通りであった。結果を表20に示す。
電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)によって測定された肺癌患者および卵巣癌患者由来の合致した尿および血清試料におけるFRαレベルの決定
FRαレベルは、ECLIAを用いて、肺癌患者および卵巣癌患者由来の合致した尿および血清試料において決定され、試料は同じ患者から採取された。また、血清と尿のFRαレベル間の相関を決定した。
利用されたECLIA法は実施例1に記載される通りである。グアニジンは、実施例6に記載されるように、尿沈渣を可溶化するために用いられた。
肺癌患者および卵巣癌患者由来の血清および尿のECLIAアッセイの結果を表22に示す。
卵巣癌を有する患者、肺癌を有する患者および正常な対照由来の血清試料におけるFRαのレベルの評価
卵巣癌を有する患者、肺癌を有する患者および正常な対照の血清におけるFRαレベルを評価した。血清のFRαレベルは、捕捉−検出抗体の2種の対を用いてECLIAにより評価された;対1、ここでは9F3は捕捉躯体であり、24F12は検出抗体であり、対2、ここでは26B3は捕捉抗体であり、19D4は検出抗体であった。
3種の検出抗体および捕捉抗体の対を用いた尿におけるFRαのレベルの評価
尿試料におけるFRαのレベルの検出における3つの抗FRα抗体対の能力を評価した。用いられた抗体対は以下の通りであった:(1)検出抗体として26B3および捕捉抗体として9F3、および(2)検出抗体として24F12および捕捉抗体として9F3。
2つの抗体対は、完全な較正曲線、および6Mグアニジン、3MグアニジンまたはPBS対照のいずれかにおいて、2分間、1:1希釈で前処理された尿を用いて試験された。以下の尿試料を試験した:1:80に希釈された3つのヒト尿プール、および1:80に希釈された5つのヒトの個々の尿(男性1人、女性4人)。
血清および血漿におけるFRαのレベルの評価
FRαのレベルは、別々の2日に血清および血漿の試料において評価された。試料の由来の対象は、正常な対象または卵巣癌または肺癌を有する患者のいずれかであった。
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態の多数の均等物を認識し、またはたかが日常的な実験を用いてそれを確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。従属請求項に開示された実施形態のいずれかの組み合わせは、本発明の範囲内にあることが意図される。
Claims (21)
- 対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するためのデータを提供する方法であって、
対象由来の尿試料をFRαに結合する抗体と接触させ、これにより、尿試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定すること;および
対象由来の尿試料における細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較すること;を含み、
対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの増加が、対象がFRα発現癌に罹患しているという指標である、前記方法。 - FRα発現癌が、肺癌、中皮腫、卵巣癌、腎臓癌、脳癌、子宮頸癌、鼻咽腔癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、子宮内膜癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、骨癌、下垂体癌、結腸直腸癌および甲状腺髄様癌からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- FRα発現癌が卵巣癌である、請求項1に記載の方法。
- FRα発現癌が肺癌である、請求項2に記載の方法。
- FRα発現癌が非小細胞肺癌である、請求項4に記載の方法。
- 非小細胞肺癌が腺癌である、請求項5に記載の方法。
- 尿試料における、約9500pg/mL超、約10,000pg/mL超、約11,000pg/mL超、約12,000pg/mL超、約13,000pg/mL超、約14,000pg/mL超、約15,000pg/mL超、約16,000pg/mL超、約17,000pg/mL超、約18,000pg/mL超、約19,000pg/mL超または約20,000pg/mL超の濃度のFRαの存在が、対象が卵巣癌に罹患しているという指標である、請求項1に記載の方法。
- 抗体が、下記からなる群から選択される、請求項1に記載の方法:
(a)MORAb−003抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(b)CDRH1として配列番号1(GFTFSGYGLS)、CDRH2として配列番号2(MISSGGSYTYYADSVKG)、CDRH3として配列番号3(HGDDPAWFAY)、CDRL1として配列番号4(SVSSSISSNNLH)、CDRL2として配列番号5(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号6(QQWSSYPYMYT)を含む抗体;
(c)MOV18抗体;
(d)MOV18抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(e)548908抗体;
(f)548908抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(g)6D398抗体;
(h)6D398抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(i)26B3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(j)CDRH1として配列番号55(GYFMN)、CDRH2として配列番号56(RIFPYNGDTFYNQKFKG)、CDRH3として配列番号57(GTHYFDY)、CDRL1として配列番号51(RTSENIFSYLA)、CDRL2として配列番号52(NAKTLAE)およびCDRL3として配列番号53(QHHYAFPWT)を含む抗体;
(k)26B3抗体;
(l)19D4抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(m)CDRH1として配列番号39(HPYMH)、CDRH2として配列番号40(RIDPANGNTKYDPKFQG)、CDRH3として配列番号41(EEVADYTMDY)、CDRL1として配列番号35(RASESVDTYGNNFIH)、CDRL2として配列番号36(LASNLES)およびCDRL3として配列番号37(QQNNGDPWT)を含む抗体;
(n)19D4抗体;
(o)9F3抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(p)CDRH1として配列番号31(SGYYWN)、CDRH2として配列番号32(YIKSDGSNNYNPSLKN)、CDRH3として配列番号33(EWKAMDY)、CDRL1として配列番号27(RASSTVSYSYLH)、CDRL2として配列番号28(GTSNLAS)およびCDRL3として配列番号29(QQYSGYPLT)を含む抗体;
(q)9F3抗体;
(r)24F12抗体と同じエピトープに結合する抗体;
(s)CDRH1として配列番号47(SYAMS)、CDRH2として配列番号48(EIGSGGSYTYYPDTVTG)、CDRH3として配列番号49(ETTAGYFDY)、CDRL1として配列番号43(SASQGINNFLN)、CDRL2として配列番号44(YTSSLHS)およびCDRL3として配列番号45(QHFSKLPWT)を含む抗体;
(t)24F12抗体;
(u)LK26HuVK(配列番号13);LK26HuVKY(配列番号14);LK26HuVKPW(配列番号15);およびLK26HuVKPW,Y(配列番号16)からなる群から選択される可変領域軽鎖を含む抗体;
(v)LK26HuVH(配列番号17);LK26HuVH FAIS,N(配列番号18);LK26HuVH SLF(配列番号19);LK26HuVH I,I(配列番号20);およびLK26KOLHuVH(配列番号21)からなる群から選択される可変領域重鎖を含む抗体;
(w)重鎖可変領域LK26KOLHuVH(配列番号21)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;
(x)重鎖可変領域LK26HuVH SLF(配列番号19)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体;ならびに
(y)重鎖可変領域LK26HuVH FAIS,N(配列番号18)および軽鎖可変領域LK26HuVKPW,Y(配列番号16)を含む抗体。 - 抗体が、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Fab、Fab’2、ScFv、SMIP、アフィボディ、アビマー、バーサボディ、ナノボディおよびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 抗体が標識される、請求項1に記載の方法。
- 抗体が、放射性標識、ビオチン標識、発色団標識、蛍光色素標識、ECL標識および酵素標識からなる群から選択される標識を用いて標識される、請求項10に記載の方法。
- FRαのレベルが、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光分析、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散法、溶液相アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ(ECLIA)およびELISAアッセイからなる群から選択される技法を用いて決定される、請求項1に記載の方法。
- 対照試料が、健常対象におけるFRαの標準化された対照レベルを含む、請求項1に記載の方法。
- 尿試料が、尿試料におけるFRαレベルを決定する前にグアニジンで処理される、請求項1に記載の方法。
- 尿試料が、尿試料におけるFRαのレベルを決定する前に希釈される、請求項1に記載の方法。
- 尿試料が、尿試料におけるFRαのレベルを決定する前に、遠心分離、ボルテックスまたはその両方にかけられる、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、
対象由来の尿試料におけるFRαのレベルが、尿試料を
(a) 固体支持体に固定されおよびMORAB−003抗体と標識されたMOV18抗体、
(b)固体支持体に固定されおよび24F12抗体と標識された9F3抗体、
(c)固体支持体に固定されおよび19D4抗体と標識された26B3抗体、ならびに
(d)固体支持体に固定されおよび26B3抗体と標識された9F3抗体
からなる群から選択される一対の抗体と接触させることによって評価される、方法。 - 卵巣癌に罹患している対象における卵巣癌の進行を評価するためのデータを提供する方法であって、
対象由来の尿試料をFRαに結合する抗体と接触させ、これにより、尿試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定すること;および
対象由来の尿試料における細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較すること;を含み、
(i)対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの増加が、卵巣癌が急速に進行しているという指標であり;または
(ii)対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの減少が、卵巣癌が穏やかに進行しているという指標である;
前記方法。 - 卵巣癌を患っている対象における卵巣癌のMORAb−003治療の有効性を監視するためのデータを提供する方法であって、
対象由来の尿試料をFRαに結合する抗体と接触させ、これにより、MORAb−003が予め投与された対象由来の尿試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定すること;および
対象由来の尿試料における細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較すること;を含み、
(i)対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの増加が、MORAb−003治療が有効ではないという指標であり;または
(ii)対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの減少が、MORAb−003治療が有効であるという指標である;
前記方法。 - 卵巣癌を患っている対象がMORAb−003による治療に応答するかどうかを予測するためのデータを提供する方法であって、
対象由来の尿試料をFRαに結合する抗体と接触させ、これにより、尿試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定すること;および
対象由来の尿試料における細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルと対照試料におけるFRαのレベルを比較すること;を含み、
対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの増加が、対象がMORAb−003による治療に応答するであろうという指標である、前記方法。 - 対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するための、または対象における卵巣癌の進行を評価するためのキットであって、
対象由来の尿試料において、細胞に結合しない葉酸受容体アルファ(FRα)のレベルを決定する手段、および
対象がFRα発現癌に罹患しているかどうかを評価するための、または卵巣癌の進行を評価するためのキットの使用説明書
を含み、
前記使用説明書が、対照試料におけるFRαのレベルと比較して、対象由来の尿試料におけるFRαのレベルの増加が、対象がFRα発現癌に罹患しているという指標であること、または卵巣癌が急速に進行しているという指標であること、を示している、
前記キット。
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