KR20140024838A - 엽산 수용체 알파-발현 암에 대한 진단 및 예후 마커로서의 엽산 수용체 알파 - Google Patents

엽산 수용체 알파-발현 암에 대한 진단 및 예후 마커로서의 엽산 수용체 알파 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하기 위한 방법 및 키트, FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 난소암의 진행을 예측하기 위한 방법 및 키트, 피검체가 FRα-발현 암을 발병할 위험 수준을 평가하기 위한 방법 및 키트, 및 FRα-발현 암을 가진 피검체를 암 치료 그룹으로 계층화시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고 상기 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교함을 포함한다.

Description

엽산 수용체 알파-발현 암에 대한 진단 및 예후 마커로서의 엽산 수용체 알파{FOLATE RECEPTOR ALPHA AS A DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC MARKER FOR FOLATE RECEPTOR ALPHA-EXPRESSING CANCERS}
관련 출원
본 출원은 2010년 11월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/410,497호, 및 2011년 7월 15일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/508,444호의 출원일의 이익을 주장하고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 배경
사람에서, 엽산에 대한 고친화성 수용체는 알파, 베타 및 감마의 3개의 이소형으로 존재한다. 상기 알파 및 베타형은 전형적으로 글리코실 포스파티딜리노시톨(GPI) 앵커에 의해 세포의 막에 결합된다. 이들은 세포외 및 세포내이입 구획 사이를 재순환하고 엽산을 세포 내로 수송할 수 있다. 가용성 형태의 FRα는 막에 앵커링된 엽산 수용체 상의 프로테아제 또는 포스포리파제 작용에 의해 유도될 수 있다.
엽산 수용체 알파(FRα, FR-알파, FOLR-1 또는 FOLR1로서도 언급됨)는 맥락총, 폐, 갑상선, 신장, 자궁, 유방, 나팔관, 부고환 및 침샘의 상피 조직들을 포함하는, 다양한 상피 조직들에서 발현된다(문헌참조: Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman SD et al, Cancer Res 52: 6708-6711). 폐암(예를 들면, 기관지폐포 암종, 유암종, 및 비-소세포 폐암, 예를 들면, 선암종); 중피종; 난소암; 신암; 뇌암(예를 들면, 역형성 상의세포종, 소뇌의 연소성 모양세포성 성상세포종 및 뇌 전이); 자궁경부암; 비인두암; 중배엽 유도된 종양; 두경부의 편평 세포 암종; 자궁내막암; 난소의 자궁내막 선암종; 장액 낭선암종, 유방암; 방광암; 췌장암; 골암(예를 들면, 높은 등급 골육종); 뇌하수체암(예를 들면, 뇌하수체 선종); 결장직장암 및 갑상선 수질암을 포함한 각종 암에서 FRα의 과발현이 관찰되었다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제7,754,698호; 미국 특허 출원 제2005/0232919호; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2) : 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Fisher R.E. J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Parker N. et al. Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007)]을 참조한다. 일부 유형의 암(예를 들면, 두경부의 편평 세포 암종)에서, 고수준의 FRα 발현은 보다 심한 예후와 관련되는 반면, 다른 유형의 암(예를 들면, 비-소세포 폐암)에서, 보다 높은 수준의 FRα 발현은 보다 우수한 예후와 관련된다. 예를 들면, 문헌[Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009)]을 참조한다.
암의 조기 검출은 생존율 및 삶의 질을 개선시킨다. 조기 검출 및 치료의 가능성을 개선하기 위해서는 암 발병 위험 수준을 측정하고 암의 진행을 예측하기 위한 비-침습성 암 진단 방법이 강하게 요구되고 있다. 본 발명은 FRα-발현 암에 대한 상기 요건을 충족시킨다.
본 발명의 요약
본 발명은, 피검체가 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법, FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법, FRα-발현 암 피검체를 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 분류하는 방법, 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료의 효능을 평가하는 방법 및 피검체가 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하거나 피검체에서의 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 키트를 제공한다.
피검체가 FR α-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법
제1 양상에서, 본 발명은 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα 수준 사이의 차이는 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸다는 지표이고; 상기 방법에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을, FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 특정 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액이다.
다른 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 FRα-발현 암에 결렸다는 지표이다. 추가의 양상에서, 본 발명은 피검체가 암에 걸렸는지를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 FRα-발현 암에 결렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, FRα-발현 암은 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 다른 실시형태에서, FRα-발현 암은 비-소세포 폐암, 예를 들면, 선암종이다.
다른 양상에서, 본 발명은 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정함에 의해 피검체가 난소암에 걸렸는지를 평가하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα가 약 9100pg/ml 초과의 농도로 존재하는 것은 상기 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 양상에서, 뇨 샘플에서의 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 또는 약 20,000 pg/mL 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
다양한 양상에서, FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 측정한다. 예를 들면, 상기 항체는,
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 또는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체; (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체; (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1쌍의 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 예를 들면, 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
특정 실시형태에서, FRα의 수준은 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상(solution phase) 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 건강한 피검체에서의 FRα의 표준화된 대조군 수준이다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플은 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 구아니딘으로 처리한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플은 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 희석시킨다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플은 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 원심분리하거나 와류교반(vortexing)하거나 둘 다 행한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 피검체가 난소암에 걸렸는지를 평가하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 피검체로부터 유도된 샘플에서와 대조군 샘플에서의 FRα 수준 사이의 차이는 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이고; 상기 방법에서 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체, (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체, (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체, 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다.
피검체에서의 FR α 발현 암의 진행을 평가하는 방법
추가의 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 이에 의해 피검체에서의 FRα-발현 암의 진행을 평가하며, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 암이 신속하게 진행할 것이라는 지표이고, 여기서 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 암이 서서히 진행하거나 퇴행할 것이라는 지표이고; 상기 방법에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 FRα에 결합하는 항체와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 평가한다. 특정 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액이다.
다른 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암에 걸린 피검체에서의 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 이로써 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하며, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 암이 신속하게 진행할 것이라는 지표이고, 여기서 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 암이 서서히 진행하거나 퇴행할 것이라는 지표이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 이에 의해 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하며, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 암이 신속하게 진행할 것이라는 지표이고, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 암이 서서히 진행하거나 퇴행할 것이라는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비소세포 폐암, 예를 들면, 선암종이다.
다른 양상에서, 본 발명은 피검체가 난소암에 걸렸는지를 평가하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고, 여기서, 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα가 약 9100 pg/ml 초과의 농도로 존재하는 것은 상기 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 양상에서, 뇨 샘플에 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 또는 약 20,000 pg/mL 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
다양한 양상에서, FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 측정한다. 예를 들면, 상기 항체는:
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 또는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체; (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체; (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한 쌍의 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 예를 들면, 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
특정 실시형태에서, FRα의 수준은 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 건강한 피검체에서 FRα의 표준화된 대조군 수준이다. 다른 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 피검체로부터 이전에 수득된 샘플이다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 구아니딘으로 처리한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 희석시킨다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 원심분리하거나 와류교반하거나 둘 다 행한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암에 걸린 피검체에서의 난소암의 진행을 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 이에 의해 피검체에서 난소암의 진행을 평가하고, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 난소암이 신속하게 진행할 것이라는 지표이고, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 난소암이 서서히 진행하거나 퇴행할 것이라는 지표이고; 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체, (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체, (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체, 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다.
FR α-발현 암을 암 치료 그룹으로 계층화하는 방법
추가의 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암에 걸린 피검체를 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체를, 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 기준으로 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시키며, 상기 방법에서 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체를, 상기 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 기준으로 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화함에 의해, FRα-발현 암에 걸린 피검체를 4개 이상의 암 치료 그룹중 하나로 계층화시키는 방법을 제공한다. 추가의 양상에서, 본 발명은, 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체를, 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 기준으로 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시킴에 의해, FRα-발현 암에 걸린 피검체를 4개 이상의 치료 그룹 중 하나로 계층화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비소세포 폐암, 예를 들면, 선암종이다.
다른 양상에서, 본 발명은 피검체가 난소암에 걸렸는지를 평가하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고, 여기서, 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα가 약 9100 pg/ml 초과의 농도로 존재하는 것은 상기 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 양상에서, 뇨 샘플에 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 또는 약 20,000 pg/mL 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
다양한 양상에서, FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 측정한다. 예를 들면, 상기 항체는:
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 또는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체; (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체; (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한 쌍의 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 예를 들면, 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
특정 실시형태에서, FRα의 수준은 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 건강한 피검체에서의 FRα의 표준화된 대조군 수준이다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 구아니딘으로 처리한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 희석시킨다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 원심분리하거나 와류교반하거나 둘 다 행한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체는 I기, II기, III기 또는 IV기 난소암으로 분류된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암 피검체를 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체를 상기 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 기준으로 4개 이상의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화하고, 상기 방법에서 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체, (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체, (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체, 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다.
난소암 또는 폐암의 MORAb -003 치료의 효능을 모니터링하는 방법
하나의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체에서 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 사전에 MORAb-003을 투여받은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 MORAb-003 치료가 효과적이지 않다는 지표이고; 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 MORAb-003 치료가 효과적이라는 지표이다. 특정 실시형태에서, 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체에서 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 사전에 MORAb-003을 투여받은 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 MORAb-003 치료가 효과적이지 않다는 지표이고; 대조군 샘플에서의 FRα 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 MORAb-003 치료가 효과적이라는 지표이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체에서 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료 효능을 모니터링하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 사전에 MORAb-003을 투여받은 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 MORAb-003 치료가 효과적이지 않다는 지표이고; 대조군 샘플에서의 FRα 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 MORAb-003 치료가 효과적이라는 지표이다.
다양한 양상에서, FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 측정한다. 예를 들면, 상기 항체는:
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 또는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체; (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체; (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한 쌍의 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 예를 들면, 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
특정 실시형태에서, FRα의 수준은 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 건강한 피검체에서의 FRα의 표준화된 대조군 수준이다. 다른 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 상기 피검체로부터 이전에 수득된 샘플이다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 구아니딘으로 처리한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 희석시킨다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 원심분리하거나 와류교반하거나 둘 다 행한다.
피검체가 MORAb -003 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법
하나의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암과 같은 FRα 발현 암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암과 같은 FRα 발현 암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고, 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준사이의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암과 같은 FRα 발현 암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이다.
추가의 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비소세포 폐암, 예를 들면, 선암종이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하며, 여기서, 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα가 약 9100 pg/ml 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 뇨 샘플에 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 또는 약 20,000 pg/mL 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 측정한다. 예를 들면, 상기 항체는:
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 또는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체; (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체; (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한 쌍의 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 예를 들면, 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
특정 실시형태에서, FRα의 수준은 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 건강한 피검체에서의 FRα의 표준화된 대조군 수준이다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 구아니딘으로 처리한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 희석시킨다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 원심분리하거나 와류교반하거나 둘 다 행한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암과 같은 FRα 발현 암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이고; 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체, (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체, (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체, 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 치료용 MORAb-003은 (a) 서열번호 7로 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8로 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체; (b) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 또는 (c) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체이다.
난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 방법
다른 양상에서, 본 발명은, 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액)에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고(여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 난소암 또는 폐암에 걸렸다는 지표이다); 치료학적 유효량의 MORAb-003을 상기 피검체에게 투여함에 의해 난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고(여기서, 상기 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 난소암 또는 폐암에 걸렸다는 지표이다); 치료학적 유효량의 MORAb-003을 상기 피검체에게 투여함에 의해 난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고(여기서, 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 난소암 또는 폐암에 걸렸다는 지표이다); 치료학적 유효량의 MORAb-003을 상기 피검체에게 투여함에 의해 난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고(여기서, 상기 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα가 약 9100 pg/ml 초과의 농도로 존재하는 것은 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이다); 치료학적 유효량의 MORAb-003을 상기 피검체에게 투여함에 의해, 난소암을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 뇨 샘플에 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 또는 약 20,000 pg/mL 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 측정한다. 예를 들면, 상기 항체는:
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16); 또는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체; (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체; (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한 쌍의 항체와 접촉시킴으로써 평가한다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 항체는 예를 들면, 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, 또는 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
특정 실시형태에서, FRα의 표지는 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정한다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 대조군 샘플은 건강한 피검체에서의 FRα의 표준화된 대조군 수준이다.
특정 실시형태에서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 구아니딘으로 처리한다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 희석시킨다. 대안으로 또는 조합으로, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 원심분리하거나 와류교반하거나 둘 다 행한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 상기 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표이고; 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체, (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체, (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체, 및 (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 예를 들면, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다.
본 발명의 이전 양상의 다양한 실시형태에서, 치료용 MORAb-003은 (a) 서열번호 7로 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8로 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체; (b) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 또는 (c) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체이다.
본 발명의 키트
하나의 양상에서, 본 발명은 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하거나 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하기 위한 수단; 및 상기 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하거나 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다. 예를 들면, 상기 FRα-발현 암은 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비소세포 폐암, 예를 들면, 선암종이다. 추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액이다.
추가의 실시형태에서, 상기 수단은 엽산 수용체 알파(FRα) 결합제, 예를 들면, 항체를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는:
(a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
(c) MOV18 항체;
(d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(e) 548908 항체;
(f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(g) 6D398 항체;
(h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
(k) 26B3 항체;
(l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
(n) 19D4 항체;
(o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
(q) 9F3 항체;
(r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
(s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
(t) 24F12 항체;
(u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
(v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
(w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
(x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
(y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 상기 항체는 방사선-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지 또는 효소 표지를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 표지로 표지된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 키트는 피검체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단을 포함한다.
본 발명은 하기의 발명의 상세한 설명 및 도면에 의해 추가로 설명된다.
도 1은 실시예에 기재된 바와 같이 뇨에서 FRα를 평가하기 위한 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 방법의 개략도이다. 고형 지지체에 부착된 MOV18 항체는 뇨에서 FRα에 결합되어 있다. 이어서, 상기 FRα는 Ru-표지된 MORAb-003 항체에 결합시킴에 의해 검출되었다.
도 2는 ECLIA에 의해 측정시 난소암 피검체 및 정상 대조군 피검체의 뇨에서 FRα 수준의 분포를 보여준다(실시예 1 참조).
도 3은 면역블롯팅을 사용한 난소암 환자의 뇨에서의 FRα의 검출(레인 1 상에서 희미한 밴드, 레인 2 상에서 명백한 밴드)을 도시한다(실시예 5 참조).
도 4는 실시예 7에 기재된 바와 같이, 뇨를 구아니딘으로 처리한 후 ECLIA에 의해 측정시 난소암 피검체 및 정상 대조군 피검체의 뇨에서 FRα 수준의 분포를 보여준다.
도 5는 실시예 7에 기재된 바와 같이, 뇨를 구아니딘으로 처리한 후 뇨에서의 FRα 수준에 대한 ECLIA 측정의 민감성 및 특이성을 보여주는 ROC 곡선을 도시한다. 곡선 이하 면적(AUC)은 대조군 피검체로부터 난소암 피검체를 분리하는데 있어서 시험의 정확도를 측정한다. 9100pg/mL의 컷오프 값(이를 초과하는 시험 결과는 비정상인 것으로 간주된다)을 사용하였다.
도 6은 크레아티닌 수준에 대한 보정 후 난소암(OC) 및 정상 대조군 피검체에서의 FRα 수준의 분포를 보여준다. FRα의 크레아티닌-보정된 수준에 있어서 난소암 환자와 대조군 사이에는 통계학적으로 유의적인 차이가 있다(p=0.007)(실시예 8 참조).
도 7은 구아니딘-처리된 뇨 샘플의 전기화학발광 분석(ECLIA)을 사용하여 측정된 크레아티닌-보정된 FRα 수준에 대한 ROC 분석을 도시한다(실시예 8 참조).
도 8은 실시예 9에 기재된 바와 같이 샘플에서의 FRα(즉, FRα)의 수준을 평가하기 위해 사용되는 효소 면역분석(EIA) 방법을 도시한다. MOV-18은 포획 항체로서 작용하고, 이는 생물학적 유체 기원의 FRα에 결합하였다. 상기 FRα는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 아비딘(아비딘-HRP)을 사용하여 검출된 비오티닐화된 MORAb-003에 결합시킴에 의해 검출하였다.
도 9는 실시예 9에 기재된 바와 같이, 한 단계 및 두 단계 항온처리 과정을 사용하여 혈청에서 FRα의 측정에 대해 수득된 결과를 도시한다.
도 10은 실시예 11에 기재된 바와 같이, 사람 혈장에서 FRα의 수준을 평가하기 위해 효소 면역분석(EIA) 방법과 함께 사용된 3개의 상이한 조합의 포획 및 검출 항체의 개략도이다.
도 11은 실시예 11에 기재된 바와 같이, 3개 조합의 포획 및 검출 항체와 함께 EIA를 사용하여 측정된 개별 피검체들에 대한 FRα의 혈장 농도(pg/mL)를 보여준다.
도 12는 OD 값과 FRα 농도 사이의 관계를 도시한다(실시예 11 참조).
도 13은 EIA를 사용한 측정시 난소암을 갖는 피검체 및 정상 대조군 피검체에서의 혈장 FRα 농도의 분포를 보여준다(실시예 12 참조).
도 14는 EIA 및 ECLIA를 사용하여 측정된 FRα 혈장 농도 사이의 상호관계를 도시한다(실시예 12 참조).
도 15는 혈청 및 뇨에서 FRα 수준에 대한 ECLIA 측정 사이의 상호관계를 보여준다. 폐암 환자에 대한 상호관계는 r=0.24(상부 패널)이고 난소암 환자에 대한 연관성은 r=0.76(하부 패널)이다(실시예 13 참조).
도 16은 쌍 1을 사용하여 수행된 분석에 대한 혈청 대 혈장 FRα 수준의 상호관계를 보여준다(실시예 16 참조).
도 17은 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대한 혈청 대 혈장 FRα 수준의 상호관계를 보여준다(실시예 16 참조).
도 18은 쌍 1 대 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대한 혈청 FRα 수준의 상호관계를 보여준다(실시예 16 참조).
도 19는 쌍 1 대 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대한 혈장 FRα 수준의 상호관계를 보여준다(실시예 16 참조).
도 20은 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대한 혈청 FRα 수준의 하루 동안의 상호관계를 보여준다(실시예 16 참조).
본 발명은 적어도 부분적으로 대조군 샘플과 비교하여 세포에 결합하지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)가 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암을 갖는 피검체의 체액, 예를 들면, 뇨 또는 혈청에서 상승된 수준으로 발견된다는 예상치 않은 발견을 기초로 한다. 또한, 본 발명은 적어도 부분적으로 이전에 반복적으로 시도하여 실패했던, 샘플에서의 FRα 수준 평가를 위해 필요한 민감성을 나타내는 면역학적 분석의 동정을 기초로 한다. 결과로서, 본 발명은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 평가함에 의해 FRα-발현 암을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 실제로, 본 발명은 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 정확하게 평가할 수 있는 면역학적 분석을 제공함에 의해 난소암과 같은 FRα-발현 암에 대한 FRα 기반 진단학적 분석을 개발하기 위해, 이전의 시도 동안에 관찰된 과제를 해결한다.
따라서, 피검체가 FRα-발현 암을 갖거나 이를 발병할 위험에 처해 있는지를 평가하고 추가로 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은 피검체에서 난소암의 발병의 존재, 정도 또는 위험성을 평가하는데 있어서, 샘플, 예를 들면, 뇨 및 혈청에서의 세포에 결합되어 있지 않은 FRα의 수준을 대조군 수준과 비교함을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 샘플, 예를 들면, 뇨 또는 혈청에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 평가하는데 있어서, MORAb-003 항체, MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 갖는 항체의 용도를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, MOV18 항체 또는 MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 548908 항체, 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 6D398 항체 또는 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 양상은 하기의 서브섹션에서 추가로 상세히 기재된다:
I. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어 각각은 본 섹션에서 정의된 의미를 갖는다.
부정관사 "a" 및 "an"은 본원에서 문법적으로 하나 또는 하나 이상(즉 적어도 하나)를 언급하기 위해 사용된다. 예를 들면, 요소("an element")는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "피검체"는 수의과 피검체를 포함하는, 사람 및 비-사람 동물을 언급한다. 상기 용어 "비-사람 동물"은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들면, 비-사람 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 피검체는 사람이다.
상기 용어 "암" 또는 "종양"은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 피검체에서, 조절되지 않는 증식, 불멸성, 전이성 잠재력, 신속한 성장 및 증식 속도 및 특정의 특징적인 형태적 특성과 같은, 암-유발 세포에 전형적인 특징을 소유하는 세포의 존재를 언급한다. 암 세포는 흔히 종양 형태이지만 상기 세포는 피검체내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 비-종양성 암 세포, 예를 들면, 백혈병 세포일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "암"은 악성 암뿐만 아니라 악성 전-암을 포함한다.
본원에 사용된 "FRα-발현 암"은 암 세포가 FRα를 발현함을 특징으로 하는 임의의 유형의 암을 포함한다. 특정 실시형태에서, FRα-발현 암은 상기 암 세포가 상승된 수준의 FRα가 피검체 기원의 생물학적 샘플에서 검출가능한 방식으로 FRα를 분비하거나, 흘리거나, 내보내거나 방출할 수 있음을 특징으로 하는 암성 상태를 포함한다. FRα-발현 암은 폐암(예를 들면, 기관지폐포 암종, 유암종 및 비-소세포 폐암, 예를 들면, 선암종); 중피종; 난소암; 신암; 뇌암(예를 들면, 역형성 상의세포종, 및 소뇌의 연소성 모양세포성 성상세포종); 자궁경부암; 비인두암; 중배엽 유도된 종양; 두경부의 편평 세포 암종; 자궁내막암; 난소의 자궁내막 선암종; 장액 낭선암종, 유방암; 방광암; 췌장암; 골암(예를 들면, 높은 등급 골육종); 뇌하수체암(예를 들면, 뇌하수체 선종)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제7,754,698호; 미국 특허 출원 제2005/0232919호; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2): 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007)]을 참조한다. 특정 실시형태에서, FRα-발현 암은 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비소세포 폐암과 같은 폐암이다. 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 결장직장암 및 갑상선 수질암이다.
본원에 사용된 "FRα-발현 암에 걸린" 피검체는 자격있는 임상의에 의해 상기 암을 갖는 것으로 임상적으로(예를 들면, 본 발명의 방법에 의해) 진단된 자 또는 상기 암의 하나 이상의 징후 또는 증상(예를 들면, 생물학적 유체에서 FRα의 상승된 수준)을 나타내고 후속적으로 자격있는 임상의에 의해 상기 암을 갖는 것으로 임상적으로(예를 들면, 본 발명의 방법에 의해) 진단된 자이다. FRα-발현 암의 동물 모델로서 작용하는 비-사람 피검체는 또한 "FRα-발현 암에 걸린" 상기 용어 피검체 범위내에 속할 수 있다.
상기 용어 "난소암"은 당업계에 인지된 질환을 언급하고 상피 난소암 (EOC; 서구 국가에서 >90%의 난소암), 배아 세포 종양(난소암의 약 2 내지 3%), 및 기질 난소암 각각을 포함한다. 난소암은 종양 조직의 분화를 기준으로 상이한 그룹으로 계층화된다. 등급 I에서, 상기 종양 조직은 잘 분화되어 있다. 등급 II에서, 종양 조직은 적당히 잘 분화되어 있다. 등급 III에서, 상기 종양 조직은 불량하게 분화되어 있다. 이러한 등급은 등급 I 및 II 보다 덜 선호되는 예후와 상호관련된다.
난소암은 암의 전이를 기준으로 상이한 단계로 계층화된다. I기는 일반적으로 하나의 난소(IA기) 또는 2개의 난소(IB기)를 둘러싸는 캡슐내에 국한되어 있지만 일부 I기(즉, IC기) 암에서 악성 세포는 복수액, 복막 세정 유체 또는 난소의 표면상에서 검출될 수 있다. II기는 1개 또는 2개 난소 기원의 종양에서 다른 골반 구조체로의 확장 또는 전이를 포함한다. IIA기에서, 상기 종양은 자궁, 나팔관 또는 둘 다로 확장되거나 전이된다. IIB기는 종양의 골반으로의 확장을 포함한다. IIC기는 IIA기 또는 IIB기이고, 여기서, 악성 세포는 복수액, 복막 세정 유체 또는 난소의 표면상에서 검출될 수 있다. III기에서, 상기 종양은 소장 또는 장막으로의 하나 이상의 악성 연장을 포함하거나 미시적 (IIIA기) 또는 거시적(< 2 센티미터 직경, IIIB기; > 2 센티미터 직경, IIIC기) 크기의 골반외 복강 이식체를 형성하거나 복막후 또는 사타구니 림프절(IIIC기의 대안의 지표)로 전이된다. IV기에서, 종양의 원거리(즉, 비-복막) 전이가 검출될 수 있다.
난소암의 다양한 기의 지속기간은 현재 공지되어 있지 않지만 각각 적어도 약 1년인 것으로 사료된다(문헌참조: Richart et al, 1969, Am. J. Obstet. Gynecol. 105:386). 예후는 기가 상승하는 단계에서 감소한다. 예를 들면, I기, II기, III기 및 IV기 난소암을 갖는 것으로 진단된 사람 피검체에 대한 5년 생존율은 각각 80%, 57%, 25%, 및 8%이다.
난소암의 이전 유형, 그룹 및 기 각각은 본원에 사용된 바와 같은 용어 "난소암"에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "폐암"은 일부 경우에 전이를 유발하는 조절되지 않은 세포 성장을 포함하는 폐 조직 내의 질환을 언급한다. 폐암은 남성 및 여성에서 가장 흔한 암-관련 사망의 원인이다. 대부분의 1차 폐암은 상피 세포로부터 유래된 폐의 암종이다. 폐암의 주요 유형은 소세포 폐암종(SCLC) 및 비-소세포 폐암종(NSCLC)이다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비-소세포 폐암이다.
소세포 폐암 또는 소세포 폐암종(SCLC)은 폐의 악성 암이고, 여기서, 상기 암 세포는 편평한 형태 및 빈약한 세포질을 갖고; 따라서, SCLC는 흔히 "귀리 세포 암종"으로 불리운다. SCLC는 일반적으로 NSCLC 보다 더 전이성이고 때로는 편평 세포 암종과 함께 나타난다.
본원에 사용된 용어 "비-소세포 폐암"은 또한 비-소세포 폐암종(NSCLC)으로서 공지되어 있고 소세포 폐암종(SCLC) 이외의 상피 폐암을 언급한다. 3개의 주요 서브타입이 있다: 선암종, 편평 세포 폐암종, 및 대형 세포 폐암종. 다른 덜 통상적인 유형의 비-소세포 폐암은 다형성의 유암종, 침샘 암종 및 비전형적인 암종을 포함한다. 선암종은 폐암의 대략 40%를 차지하고 비흡연 사람들중 가장 흔한 유형의 폐암이다. 편평 세포 암종은 폐암의 약 25%를 차지한다. 폐의 편평 세포 암종은 여성 보다는 남성에서 보다 흔하고 다른 유형의 폐 암종 보다는 흡연 이력과 보다 더 고도로 관련되어 있다. 폐의 편평 세포 암종의 적어도 4개의 변이체(유두상, 소세포, 청정 세포 및 기저양)가 있다. 대형 세포 폐암종은 폐에서 형질전환된 상피 세포로부터 기원하는 악성 신생물의 이종성 그룹이다. 대형 세포 폐 암종은 소세포 암종, 편평 세포 암종 또는 선암종의 광 미시적 특징이 없는 암종이다.
상이한 기 측정 시스템은 SCLC 및 NSCLC에 대해 사용된다. SCLC는 동측성 기흉에 국한된 제한된 질환 또는 동측성 기흉을 넘어서는 전이를 갖는 확장성 질환으로서 분류된다.
NSCLC는 종양-결절-전이(TNM) 기 측정 시스템을 사용하여 분류될 수 있다. 문헌[Spira J & Ettinger, D.S. Multidisciplinary management of lung cancer, N Engl J Med, 350:382- (2004) (이후부터, Spira); Greene FL, Page DL, Fleming ID, Fritz AG, Balch CM, Haller DG, et al (eds). AJCC Cancer Staging Manual. 6th edition. New York: Springer-Verlag, 2002: 167-77 (이후부터 Greene); Sobin LH, Wittekind CH (eds). International Union Against Cancer. TNM classification of malignant tumours. 6th edition. New York: Wiley-Liss (2002) (이후부터 Sobin)]을 참조한다. 또한, NSCLC는 전형적으로 하기 분류 계획에 의해 측정된 암의 기에 따라 처리된다(http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/non-small-cell-lung/Patient/page2#Keypoint1O을 참조한다).
상기 잠복(숨겨진)기에서, 암 세포는 가래(폐로부터 기침시 나오는 점액)에서 발견되지만 이미지화 또는 기관지내시경 검사에서 어떠한 종양도 폐에서 관찰될 수 없거나 종양은 너무 소형이어서 검출되지 않는다.
0기(동일계 암종)에서, 비정상적인 세포는 기도의 내벽에서 발견된다. 이들 비정상적인 세포는 암이 될 수 있고 인접한 정상 조직으로 전이한다. 0기는 또한 동일계 암종으로 불리운다.
암이 형성되는 I기는 IA기 및 IB기로 분류된다.
IA기에서, 상기 종양은 단지 폐에 존재하고 3센티미터 이하이다.
IB기에서, 상기 암은 림프절로 전이하지 않고 하기 중 하나 이상은 사실이다: (i) 상기 종양은 3센티미터 초과이지만 5센티미터 이하이고; (ii) 암은 주요 기관지로 전이하고 기도가 기관지에 접목하는 곳의 2센티미터 아래에 있고; (iii) 암은 폐를 덮고 있는 막의 가장 안쪽 층으로 전이하고; (iv) 폐 부분은 기도가 기관지가 접목하는 영역에서 붕괴하거나 폐렴(폐의 염증)을 나타냈다.
IIA기에서, 암은 1차 종양으로서 흉부의 동일한 측 상의 특정 림프절로 전이하고; 상기 암은 (a) 5cm 이하이고/이거나, (b) 주요 기관지로 전이하고/하거나, 폐 내벽의 가장 안쪽 층으로 전이한다. 또는, 암은 림프절로 전이하지 않고/않거나; 상기 암은 (d) 5cm를 초과하지만 7cm 이하이고/이거나, (e) 주요 기관지로 전이하고/하거나, (f) 상기 폐 내벽의 가장 안쪽 층으로 전이한다. 폐의 부분은 붕괴하거나 염증이 될 수 있다. IIA기는 종양의 크기, 종양이 발견되는 곳 및 림프절에 암이 있는지의 여부에 따라 2개 부분으로 나누어진다. 제1 부분에서, 암은 종양으로서 흉부의 동일한 측 상의 림프절로 전이한다. 암을 갖는 림프절은 폐내 또는 기관지 근처에 있다. 또한, 하기 중 하나 이상은 사실이다: (i) 상기 종양은 5cm 이하이고, (ii) 암은 주요 기관지로 전이하고 기도가 기관지에 접목하는 곳 적어도 2cm 아래에 있고, (iii) 암은 폐를 덮고 있는 막의 가장 안쪽 층으로 전이하고, (iv) 폐 부분은 기도가 기관지를 접목하는 영역에서 붕괴하거나 폐렴(폐의 염증)을 나타냈다. 제2 부분에서, 암은 림프절로 전이하지 않고 하기중 하나 이상은 사실이다: (i) 상기 종양은 5cm 초과이지만 7cm 이하이고, (ii) 암은 주요 기관지로 전이하고 기도가 기관지를 접목하는 곳 적어도 2cm 아래에 있고, (iii) 암은 폐를 덮고 있는 막의 가장 안쪽 층으로 전이하고, (iv) 폐 부분은 기도가 기관지에 접목하는 영역에서 붕괴하거나 폐렴(폐의 염증)을 나타냈다.
IIB기에서, 암은 1차 종양으로서 흉부의 동일한 측 상의 특정 림프절에 전이하고; 상기 암은 (a) 5cm 초과이지만 7cm 미만이고/이거나, (b) 주요 기관지로 전이하고/하거나 (c) 폐 내벽의 내부 안쪽 층으로 전이한다. 폐 부분은 붕괴되거나 염증이 될 수 있다. 또는, (d) 상기 암은 7cm 초과이고/이거나; (e) 주요 기관지로 전이하고/하거나, (f) 횡경막으로 전이하고/하거나, (g) 흉부 벽 또는 흉부 벽의 내벽으로 전이하고/하거나; (h) 심장 주변의 막으로 전이한다. 폐의 동일한 엽에 하나 이상의 별도의 종양이 있을 수 있고; 암은 횡경막을 조절하는 신경으로 전이할 수 있고; 전체 폐는 붕괴되거나 염증이 될 수 있다. IIB기는 종양의 크기, 종양이 발견된 곳 및 림프절에 암이 있는지의 여부에 따라 2개의 부분으로 나누어진다. 제1 부분에서, 암은 종양으로서 흉부의 동일한 측 상의 인접한 림프절로 전이한다. 암을 가진 림프절은 폐내에 또는 기관지 근처에 있다. 또한, 하기 중 하나 이상은 사실이다: (i) 상기 종양은 5cm 초과이지만 7cm 이하이고, (ii) 암은 주요 기관지로 전이하고 기도가 기관지에 접목하는 곳 적어도 2cm 아래에 있고, (iii) 암은 폐를 덮고 있는 막의 내부 안쪽 층으로 전이하고, (iv) 폐 부분은 기도가 기관지가 접목하는 영역에서 붕괴되거나 폐렴(폐의 염증)을 나타낸다. 제2 부분에서, 암은 림프절로 전이하지 않고 하기 중 하나 이상은 사실이다: (i) 상기 종양은 7cm 초과이고, (ii) 암은 주요 기관지(기도가 기관지에 접목하는 곳 2cm 아래에 있다), 흉부 벽, 횡경막 또는 상기 횡경막을 조절하는 신경으로 전이하고, (iii) 암은 심장 주변의 막 또는 흉부 벽을 따라 전이하고, (iv) 전체 폐는 붕괴되거나 폐렴(폐의 염증)을 나타내고, (v) 폐의 동일한 엽에는 하나 이상의 별도의 종양이 있다.
IIIA기는 종양의 크기, 상기 종양이 발견되는 곳 및 어느 림프절이 암을 갖는지의 여부(경우에 따라)에 따라 3개의 부분으로 나누어진다. IIIA기의 제1 부분에서, 암은 종양으로서 흉부의 동일한 엽상의 림프절로 전이한다. 암을 갖는 상기 림프절은 흉골(흉부 골) 근처 또는 기관지가 폐로 진입하는 곳 근처에 있다. 또한, 상기 종양은 임의의 크기일 수 있고; 폐 부분(기도가 기관지에 접목하는 곳) 또는 전체 폐는 붕괴되거나 폐렴(폐의 염증)을 나타낼 수 있고; 폐의 동일한 엽에는 하나 이상의 별도의 종양이 있을 수 있고; 암은 하기 중 어느 하나로 전이할 수 있다: (i) 주요 기관지이지만 기도가 기관지에 접목하는 영역이 아닌 기관지, (ii) 흉부 벽, (iii) 횡경막 및 이를 조절하는 신경, (iv) 폐 주변 또는 흉부 벽에 배열된 막, (iv) 심장 주변의 막. IIIA기의 제2 부분에서, 암은 종양으로서 흉부의 동일한 측 상의 림프절로 전이한다. 암을 갖는 상기 림프절은 폐내에 있거나 기관지 근처에 있다. 또한, 상기 종양은 임의의 크기일 수 있고; 전체 폐는 붕괴되거나 폐렴(폐의 염증)을 나타낼 수 있고; 암을 갖는 폐의 임의의 엽에 하나 이상의 별도의 종양이 있을 수 있고; 암은 하기 중 어느 하나로 전이할 수 있다: (i) 주요 기관지이지만 기도가 기관지에 접목하는 영역이 아닌 기관지, (ii) 흉부벽, (iii) 횡경막 및 이를 조절하는 신경, (iv) 폐 주변 또는 흉부 벽에 배열된 막, (v) 심장 또는 이의 주변 막, (vi) 상기 심장으로 이어지거나 이로부터 유래하는 주요 혈관, (vi) 기도, (vii) 식도, (viii) 후두(소리 상자)를 조절하는 신경, (ix) 흉골(흉부 골) 또는 골격, (x) 용골(기도가 기관지로 접목하는 곳). IIIA기의 제3 부분에서, 암은 림프절로 전이하지 않고 상기 종양은 임의의 크기일 수 있고, 암은 하기 중 하나로 전이한다: (i) 심장, (ii) 심장을 유도하거나 이로부터 유래되는 주요 혈관, (iii) 기도, (iv) 식도, (v) 후두(소리 상자)를 조절하는 신경, (vi) 흉골 (흉부 골) 또는 골격, (vi) 용골(기도가 기관지에 접목하는 곳).
IIIB기는 종양의 크기, 종양이 발견되는 곳, 및 어느 림프절이 암을 갖는지의 여부에 따라 2개의 부분으로 나누어진다. 제1 부분에서, 암은 쇄골 상의 림프절로 전이하거나 종양으로서 흉부의 반대 측 상의 림프절로 전이하고; 상기 종양은 임의의 크기일 수 있고; 폐의 부분(기도가 기관지에 접목하는 곳) 또는 전체 폐는 붕괴되거나 폐렴(폐의 염증)을 나타낼 수 있고; 암을 갖는 폐의 임의의 엽에서 하나 이상의 별도의 종양이 있을 수 있고; 암은 하기 중 어느 하나로 전이할 수 있다: (i) 주요 기관지, (ii) 흉부 벽, (iii) 횡경막 및 이를 조절하는 신경, (iv) 폐 주변 또는 흉부 벽에 따른 막, (iv) 심장 또는 이의 주변 막, (v) 심장으로 이어지거나 이로부터 유래되는 주요 혈관, (vi) 기도, (vii) 식도, (viii) 후두(소리 상자)를 조절하는 신경, (ix) 흉골 (흉부 골) 또는 골격, (x) 용골(기도가 기관지에 접목하는 곳). IIIB기의 제2 부분에서, 암은 종양으로서 흉부의 동일한 측 상의 림프절로 전이하고; 암을 갖는 림프절은 흉골(흉부 골) 근처 또는 기관지가 폐에 진입하는 곳 근처에 있고; 상기 종양은 임의의 크기일 수 있고; 동일한 폐의 상이한 엽에는 별도의 종양이 있을 수 있고; 암은 하기 중 어느 하나로 전이한다: (i) 심장, (ii) 심장으로 이어지거나 이로부터 유래하는 주요 혈관, (iii) 기도, (iv) 식도, (v) 후두(소리 상자)를 조절하는 신경, (vi) 흉골(흉부 골) 또는 골격, (vii) 용골 (기도가 기관지에 접목하는 곳).
IV기에서, 상기 종양은 임의의 크기일 수 있고 암은 림프절로 전이할 수 있다. 하기 중 하나 이상은 사실이다: 2개의 폐에서 하나 이상의 종양이 있고; 암은 폐 또는 심장 주변의 유체에서 발견되고; 암은 뇌, 간, 부신, 신장 또는 골과 같은 신체의 다른 부분으로 전이한다.
따라서, 이전 발명의 다양한 실시형태에서, 상기 폐암은 피검체의 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청)에서 정상적이거나 암성 세포와 같은 세포에 결합되지 않은 FRα 수준의 평가를 기준으로 이전 기(예를 들면, 잠복기, 0기, IA기, IB기, IIA기, IIB기, IIIA기, IIIB기 또는 IV기)들 중 어느 하나로 계층화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "엽산 수용체 알파"(또한 FRα, FR-알파, FOCR-1 또는 FOLR1로서 언급됨)는 엽산에 대한 알파 이소형의 고친화성 수용체를 언급한다. 막에 결합한 FRα는 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커에 의해 상기 세포 표면에 부착되고, 세포외와 세포내이입 구획 사이를 순환하고 엽산을 세포내로 수송할 수 있다. FRα는 여성 생식관, 태반, 유방, 신장 근위세뇨관, 맥락총, 폐 및 침샘의 조직을 포함하는 다양한 상피 조직에서 발현된다. 가용성 형태의 FRα는 막 부착된 엽산 수용체상에 프로테아제 또는 포스포리파제가 작용하여 유도될 수 있다.
사람 FRα에 대한 컨센서스 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 본원에서 각각 서열번호 24 및 25에 제시되어 있다. 변이체, 예를 들면, 천연에 존재하는 대립형질 유전자 변이체 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 서열은 본원에 사용된 바와 같은 용어에 의해 포괄된다.
본원에 사용된 용어 "세포에 결합되지 않은"은 암성 세포와 같은 세포의 세포 막에 부착되어 있지 않은 FRα를 언급한다. 특정 실시형태에서, 세포에 부착되지 않은 FRα는 임의의 세포에 결합되어 있지 않고 생물학적 유체, 예를 들면, 뇨 또는 혈청 중에 자유롭게 부유하거나 용해되어 있다. 예를 들면, FRα는 정상 또는 암성 세포로부터, 예를 들면, 암성 세포의 표면으로부터 생물학적 유체로 유출되거나 분비되거나 외부로 수송될 수 있다.
본원에 사용된 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파의 "수준"은 단백질 수준의 측정을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정된 바와 같은 엽산 수용체 알파 단백질의 수준을 언급한다. 상기 방법은 예를 들면, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 고확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광측정기, 비색 분석법, 분광측정 분석법, 유동 세포측정기, 면역확산(단일 또는 이중), 용액상 분석법, 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역분석법 (RIA), 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 면역형광 분석법, 및 전기화학발광 면역분석법(하기에 예시된) 등을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 수준은 본원에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 항체계 기술을 사용하여 측정한다.
일반적으로 세포에 결합되지 않은 FRα에 특이적인 항체 또는 결합 단백질을 웨스턴 블롯 및 면역형광 기술을 위해 고형 지지체상에 고정화시키는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 고형상 지지체 또는 담체는 항원 또는 항체와 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 널리 공지된 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철석을 포함한다.
당업자는 항체 또는 항원을 결합시키기 위해 많은 다른 적합한 담체를 인지할 것이고 본 발명에 사용하기 위한 상기 지지체를 채택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 피검체 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청)로부터 분리된 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 수행하여 니트로셀룰로스와 같은 고형상 지지체상에 고정화시킬 수 있다. 이어서, 상기 지지체는 적합한 완충액으로 세척하고 이어서 표지된 항체로 처리할 수 있다. 이어서, 상기 고형상 지지체는 완충액으로 2회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거할 수 있다. 이어서, 고형 지지체상에 결합된 표지의 양은 통상적인 수단으로 검출할 수 있다. 전기영동 기술을 사용하여 단백질을 검출하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다(문헌참조: R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
다른 표준 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Principles And Practice Of Immunoassay, 2nd Edition, Price and Newman, eds., MacMillan (1997) and Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988), 이 각각은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다]에서 검토될 수 있는 면역분석 기술을 포함한다.
엽산 수용체 알파의 발현 수준을 측정하기 위해 면역분석에 사용되는 항체는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 결합제 또는 항체와 관련된 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 결합제 또는 항체에 커플링(즉, 물리적 결합)시킴에 의한 결합제 또는 항체의 직접적인 표지화, 및 직접적으로 표지된 또 다른 시약과의 반응에 의한 결합제 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간접적인 표지화의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 표지화시키고, 예를 들면, 방사선 표지시키거나, 발색단 표지시키거나, 형광단 표지시키거나, 효소 표지시킨다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 항체 유도체(예를 들면, 기질, 또는 단백질-리간드 쌍의 단백질 또는 리간드(예를 들면, 비오틴-스트렙타비딘)와 접합된 항체) 또는 세포에 결합되지 않은 FRα에 특이적으로 결합하는 항체 단편(예를 들면, 단일쇄 항체, 분리된 항체 초가변 도메인)이다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 프로테오믹 방법, 예를 들면, 질량 분광측정기가 사용된다. 질량 분광측정기는 하전된 분자(또는 이의 단편)를 생성하도록 화학적 화합물을 이온화시키고 이들의 질량 대 하전 비율을 측정하는 것으로 이루어진 분석 기술이다. 전형적인 질량 분광측정 과정에서, 샘플은 피검체로부터 수득하고 질량 분광측정기상에 로딩하고 이의 성분(예를 들면, FRα)은 상이한 방법(예를 들면, 이들을 전기 빔으로 충격을 가함에 의해)으로 이온화시키고 하전된 입자(이온)를 형성시킨다. 이어서, 입자의 질량 대 하전 비율은 이들이 전기장을 통과함에 따른 이온 작용으로부터 계산한다.
예를 들면, 뇨 또는 혈청과 같은 샘플을 단백질-결합 칩에 적용함을 포함하는 매트릭스-연합된 레이져 탈착/이온화 타임-오브-플라이트 질량 분광측정기 (MALDI-TOF MS) 또는 표면-증진된 레이져 탈착/이온화 타임-오브-플라이트 질량 분광 측정기(SELDI-TOF MS)(문헌참조: Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029)를 사용하여 FRα의 수준을 측정할 수 있다.
추가로, 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 측정하기 위한 생체내 기술은 FRα에 결합하여 검출가능한 분자로 전환시키는, FRα에 대해 지시된 표지된 항체를 피검체에 도입함을 포함한다. 피검체에서의 세포에 결합되지 않은 검출가능한 FRα의 존재, 수준 또는 위치는 표준 이미지화 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 피검체내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직 뿐만 아니라, 피검체로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직을 총체적으로 언급한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 샘플은 암성 세포에 결합되지 않은 FRα를 함유하는 생물학적 유체이다. 생물학적 유체는 생리학적 온도에서 전형적으로 액체이고 피검체 또는 생물학적 공급원 중에 존재하거나 이로부터 유출되거나, 발현되거나 달리 추출되는 천연 유체를 포함할 수 있다. 특정 생물학적 유체는 특정 조직, 기관 또는 국소 영역으로부터 유래하고 특정 다른 생물학적 유체는 피검체 또는 생물학적 공급원에서 보다 전반적으로 또는 전신적으로 위치할 수 있다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 뇨, 뇌척수 유체, 침, 안구 유체, 낭종 유체, 눈물, 변, 가래, 분비 조직 및 기관의 점막 분비액, 질 분비물, 부인과 유체, 비-고형 종양과 관련된 것들과 같은 복수액 유체, 늑막, 심막, 복막, 복부 및 기타 체강의 유체, 기관지 세척 등에 의해 수거된 유체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨 또는 혈청이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 복수액을 포함하지 않거나 복수액 샘플이 아니다. 또 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 복수액 유체를 포함하지 않거나 복수액 유체가 아니다.
하나의 실시형태에서, 상기 샘플은 피검체로부터 제거된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 샘플은 피검체내에 존재한다. 생물학적 유체는 또한 피검체 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액, 예를 들면, 세포 또는 기관 조건화된 매질을 포함하는 세포 및 기관 배양 매질, 세척 유체 등을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 샘플의 단지 일부를 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 측정하기 위한 분석에 적용하거나 샘플의 다양한 일부를 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 측정하기 위한 다양한 분석에 적용한다. 또한, 많은 실시형태에서, 상기 샘플은 상기 분석 전에 물리적 또는 화학적 수단으로 전처리할 수 있다. 예를 들면, 실시예 부분에서 보다 상세하게 논의된 실시형태에서, 샘플, 예를 들면, 뇨 샘플은 세포에 결합되지 않은 FRα에 대한 샘플을 분석하기 전에 원심분리, 희석 및/또는 가용화 물질(예를 들면, 구아니딘 처리)을 사용한 처리에 적용한다. 상기 기술은 본 발명의 분석의 정확도, 신뢰도 및 재현성을 증진시키는 작용을 한다.
본원에 사용된 용어 "대조군 샘플"은 예를 들면, 난소암에 걸리지 않은 건강한 피검체 기원의 샘플, 평가될 피검체보다 덜 중증이거나 보다 느리게 행하는 난소암을 갖는 환자 기원의 샘플, 일부 다른 유형의 암 또는 질환을 갖는 피검체 기원의 샘플을 포함하는 임의의 임상적으로 관련된 대조군 샘플을 언급한다. 대조군 샘플은 하나 이상의 피검체로부터 유도된 샘플을 포함할 수 있다. 대조군 샘플은 또한 평가될 피검체 기원의 보다 이른 시점에서 만들어진 샘플일 수 있다. 예를 들면, 상기 대조군 샘플은 질환의 조기 단계에서 또는 치료 투여 또는 일부 치료 전에 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암의 개시 전에 평가될 피검체로부터 채취한 샘플일 수 있다. 상기 대조군 샘플은 또한 폐 또는 난소암과 같은 FRα발현 암의 동물 모델, 또는 동물 모델로부터 유래된 조직 또는 세포주 기원의 샘플일 수 있다. 측정 그룹으로부터 이루어진 대조군 샘플에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 예를 들면, 평균, 중간 또는 모드 값을 포함하는 집중 경향의 측정과 같은 임의의 적당한 통계학적 측정을 기반으로 측정될 수 있다.
용어 "대조군 수준"은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하기 위해 사용되는 FRα의 수용되거나 사전 측정된 수준을 언급한다. 하나의 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 느린 질환 진행을 갖는 피검체(들) 기원의 샘플(들)에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기반으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 세포에 결합되지 않은 FRα의 대조군 수준은 신속한 질환 진행을 갖는 피검체(들) 기원의 샘플에서의 수준을 기반으로 한다. 또 다른 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 영향받지 않는, 즉, 질환에 걸리지 않은 피검체(들), 즉 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암을 갖지 않는 피검체 기원의 샘플(들)에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기반으로 한다. 또 다른 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 난소암에 대한 치료제의 투여 전에 피검체(들) 기원의 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기반으로 한다. 또 다른 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 시험 화합물과 접촉되지 않은, 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암을 갖는 피검체(들) 기원의 샘플(들)에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기반으로 한다. 또 다른 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 시험 화합물과 접촉된, 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암을 갖지 않는 피검체 기원의 샘플(들)에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기준으로 한다. 하나의 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 폐 또는 난소 암과 같은 FRα-발현 암의 동물 모델 기원의 샘플(들)에서, 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암의 동물 모델로부터 유래된 세포 또는 세포주에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기반으로 한다.
하나의 실시형태에서, 상기 대조군은 예를 들면, 폐 또는 난소암과 같이 FRα-발현 암을 갖지 않는 피검체 집단 기원의 세포에 결합되지 않은 FRα 수준의 평균치를 사용하여 미리 측정된 대조군과 같은 표준화된 대조군이다. 본 발명의 여전히 다른 실시형태에서, FRα의 대조군 수준은 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암을 갖는 피검체로부터 유도된 비-암성 샘플(들)에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 기반으로 한다. 예를 들면, 개복술 또는 다른 의학적 과정이 난소의 한 부분에서 난소암의 존재를 밝히는 경우, FRα의 대조군 수준은 난소의 비-환부를 사용하여 측정될 수 있고 상기 대조군 수준은 난소의 환부에서 FRα의 수준과 비교할 수 있다. 유사하게, 생검 또는 다른 의학적 과정이 폐의 한 부분에서 폐암의 존재를 밝히는 경우, FRα의 대조군 수준은 폐의 비-환부를 사용하여 측정될 수 있고, 상기 대조군 수준은 폐의 환부에서 FRα의 수준과 비교할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 피검체 기원의 샘플(즉, 시험 샘플)에서 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파의 수준과 대조군 샘플에서 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파의 수준의 "차이"는 광범위하게 2개의 샘플 중 엽산 수용체 알파 수준의 수준에서 임의의 임상적으로 관련되고/되거나 통계학적으로 유의적인 차이를 언급한다. 예시적인 실시형태에서, 상기 차이는 수용자 작동 특성 (ROC) 분석(이의 예는 실시예 6에 제공된다)을 사용하여 측정된 컷오프 값을 기준으로 선택된다.
다른 실시형태에서, 상기 차이는 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 측정하기 위한 방법의 검출 한계치보다 커야만 한다. 상기 차이는 적어도 평가 방법의 표준 오차보다 큰 것이 바람직하고 바람직하게 상기 차이는 평가 방법의 표준 오차보다 적어도 약 2-, 약 3-, 약 4-, 약 5-, 약 6-, 약 7-, 약 8-, 약 9-, 약 10-, 약 15-, 약 20-, 약 25-, 약 100-, 약 500-, 약 1000-배 이상이다. 상기 차이는 임의의 적당한 파라미터 또는 비-파라미터 기재 통계학적 또는 비교를 포함하는 임의의 적당한 비교에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준에서 "증가"는 대조군 샘플에서의 FRα의 수준보다 약 2배, 보다 바람직하게는 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배 이상인 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 증가는 또한 대조군 샘플에서의 FRα의 평균 수준보다 바람직하게 적어도 약 1.5, 및 보다 바람직하게는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 이상의 표준 편차인, 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 또한, 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준에서 "감소"는 대조군 샘플 중 FRα 수준보다 바람직하게 적어도 약 2배, 및 보다 바람직하게는 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배 이상 적은, 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 감소는 또한 대조군 샘플에서의 FRα의 평균 수준 미만으로 바람직하게 적어도 약 1.5, 및 보다 바람직하게는 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5 이상의 표준 편차인, 표준 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다.
본원에 사용된 용어 FRα 결합제, 예를 들면, 항-FRα 항체와 "샘플을 접촉시키는"이라는 용어는 적어도 샘플의 일부가 상기 제제 또는 항체와 접촉하도록 상기 샘플 또는 이의 임의의 일부를 상기 제제 또는 항체에 노출시킴을 포함한다. 상기 샘플 또는 이의 일부는 몇몇 방식으로, 예를 들면, 이를 제제 또는 항체와 접촉시키기 전에 이를 물리적 또는 화학적 처리(예를 들면, 희석 또는 구아니딘 처리)에 적용함에 의해 변화될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 Ig 분자의 필수적 에피토프 결합 특징을 보유하는, 임의의 기능적(즉, 항원-결합) 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 이의 유도체 뿐만 아니라, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 상기 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당업계에 공지되어 있고, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fabc 단편, Sc 항체(단일쇄 항체), 디아바디, 개별 항체 경쇄, 개별 항체 중쇄, 항체쇄 간의 키메라 융합체 등과 같은 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 아부류일 수 있다.
각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 상기 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. 상기 VH 및 VL 영역은 골격 영역(FR)으로 호칭되는 보다 보존된 영역과 함께 상호분산된 상보성 결정 영역(CDR)으로 호칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고 항체의 이소형을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 정의한다.
중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자로 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합부"는 항원(예를 들면, 세포에 결합되지 않은 FRα)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 언급한다. 이것은 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음을 나타낸다. 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAb; (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb; 및 (viii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (ix) 임의로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개의 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되어 있지만 이들은 이들이 단일 단백질 쇄(여기서, VL 및 VH 영역은 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지된; 문헌참조: Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883)를 형성하도록 쌍을 이룬다)로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 상기 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합부"내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고 상기 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 활용하기 위해 스크리닝한다. 항원-결합부는 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 면역글로불린 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체 및 사람 항체, 및 천연적으로 존재하거나 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 재조합적으로 제조되는 항체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체는 이특이적 항체이다. "이특이적 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다[문헌참조: Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553].
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체는 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 PCT 공개 공보 WO 94/04678에 기재된 바와 같은 낙타과 항체이다.
VHH로서 동정된 소형의 단일 가변 도메인인 낙타과 항체 영역은 표적에 대해 고친화성을 갖는 소형 단백질을 생성하도록 유전자 조작 기술에 의해 수득될 수 있고 "낙타과 나노바디"로서 공지된 저분자량의 항체 유래된 단백질을 수득한다[문헌참조: 미국 특허 제5,759,808호; 또한 Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; and Lauwereys et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520]. 낙타과 항체 및 항체 단편의 유전자 조작된 라이브러리는 예를 들면, 제조원[Ablynx, Ghent, Belgium]으로부터 시판된다. 따라서, 본 발명의 특징은 FRα에 대해 고친화성을 갖는 낙타과 나노바디이다.
발명의 다른 실시형태에서, 발명의 방법에 사용하기 위한 항체는 디아바디, 단일쇄 디아바디 또는 디-디아바디이다.
디아바디는 VH 및 VL 도메인이 동일한 쇄상에서 2개의 도메인 간에 쌍을 이루기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄로 발현되는 2가, 이특이적 분자이다. 상기 VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성함으로써 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(문헌참조: Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2: 1121-1123). 디아바디는 동일한 세포내에서 구조체 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 형태), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA(VL-VH 형태)를 갖는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 발현함으로써 제조될 수 있다. 이들 대부분은 세균에서 가용성 형태로 발현될 수 있다.
단일쇄 디아바디 (scDb)는 2개의 디아바디 형성 폴리펩타이드 쇄를 대략 15개 아미노산 잔기의 링커로 연결시킴에 의해 제조된다(문헌참조: Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(l):21-36). scDb는 가용성의 활성 단량체 형태로 세균에서 발현될 수 있다(문헌참조: Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21).
디아바디는 Fc와 융합하여 "디-디아바디"가 생성될 수 있다(문헌참조: Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).
항체의 기능성 성질을 나타내지만 다른 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 유전자에 의해 암호화되거나 생체내 항체 유전자의 재조합에 의해 제조되는 것들 이외의 폴리펩타이드)로부터 이들의 골격 및 항원 결합부가 유래하는 FRα 결합 분자가 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이들 결합 분자의 상기 항원 결합 도메인(예를 들면, FRα 결합 도메인)은 지시된 진화 과정을 통해 제조된다[문헌참조: 미국 특허 제7,115,396호]. 항체의 가변 도메인의 폴드(fold)와 유사한 전체 폴드("면역글로불린형" 폴드)를 갖는 분자는 적당한 스캐폴드 단백질이다. 항원 결합 분자를 유도하기 위해 적합한 스캐폴드 단백질은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 이량체, 테나신, N-캐드헤린, E-캐드헤린, ICAM, 티틴, GCSF-수용체, 사이토킨 수용체, 글리코시다제 억제제, 항생제 색소단백질, 미엘린 막 접착 분자 P0, CD8, CD4, CD2, 부류 I MHC, T-세포 항원 수용체, CD1, C2 및 VCAM-1의 I-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 I-세트 면역글로불린 도메인, 미오신-결합 단백질 H의 I-세트 면역글로불린 도메인, 텔로킨의 I-세트 면역글로불린 도메인, NCAM, 트위친, 뉴로글리안, 성장 호르몬 수용체, 에리트로포이에틴 수용체, 프롤락틴 수용체, 인터페론-감마 수용체, β-갈락토시다제/글루쿠로니다제, β-글루쿠로니다제, 트랜스글루타미나제, T-세포 항원 수용체, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 조직 인자 도메인, 사이토크롬 F, 녹색 형광 단백질, GroEL, 및 타우마틴을 포함한다.
항체 또는 항체 단편과 관련되어 사용되는 경우 "특이적 결합"은 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 암호화된 도메인을 통한 목적하는 단백질의 하나 이상의 에피토프로의 결합을 나타내지만 이는 항원성 분자의 혼합 집단을 함유하는 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인지하지 않고 결합하지 않는다. 전형적으로, 항체는 표면 플라스몬 공명 분석 또는 세포 결합 분석에 의한 측정시 Kd가 약 1 x 10-8M 미만인 동족 항원과 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은 엽산 수용체 알파 "결합제"는 비-항체 결합제 뿐만 아니라 세포에 결합되지 않는 FRα에 결합하는 항체를 포함한다. 비-항체 결합제 또는 결합 분자를 제조하기 위해, 항원 결합 표면을 형성하는 스캐폴드 단백질의 영역(예를 들면, 위치 및 구조에서 항체 가변 도메인 면역글로불린 폴드의 CDR과 유사한 영역)에서의 서열이 무작위화된 클론의 라이브러리가 생성될 수 있다. 라이브러리 클론은 목적하는 항원(예를 들면, FRα)에 특이적으로 결합하는 것에 대해 및 다른 기능(예를 들면, FRα의 생물학적 활성의 억제)에 대해 시험된다. 선택된 클론은 상기 항원에 대해 보다 높은 친화성의 유도체를 제조하기 위해 추가의 무작위화 및 선택을 위한 기본으로서 사용될 수 있다.
고친화성 결합 분자는 예를 들면, 문헌[참조: 미국 특허 제6,818,418호 및 제7,115,396호; Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 12297; 미국 특허 제6,261,804호; 미국 특허 제6,258,558호; 및 Szostak et al. WO98/31700, 이의 전문은 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 스캐폴드로서 피브로넥틴 III(10Fn3)의 10번째 모듈을 사용하여 제조된다.
비-항체 결합 분자는 표적 항원에 대한 결합가를 증가시키기 위해 이량체 또는 다량체로서 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 항원 결합 도메인은 Fc-Fc 이량체를 형성하는 항체의 불변 영역(Fc)과의 융합체로서 발현된다[문헌참조: 미국 특허 제7,115,396호, 이의 전문은 본원에 참조로서 인용된다].
"항원"은 면역계에 의해 인지되는 분자이고; 상기 용어는 본래 "항체 생성기"로부터 유래한 것이고 항체에 특이적으로 결합하는 분자를 포함한다. 분자 수준에서, 항원은 항체의 항원-결합 부위에 결합되는 이의 능력을 특징으로 한다. 본 발명에서, 상기 항원은 FRα인데, 예를 들면, 세포에 결합되지 않은 FRα 또는 이의 일부이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항원, 예를 들면, 항체에 의해 결합될 수 있는 FRα의 분자 표면 특징을 언급한다. 항원 분자, 정상적으로 "대형"의 생물학적 중합체는 일반적으로 특이적 항체에 대한 상호작용점으로서 작용할 수 있는 여러 표면 특징을 제공한다. 임의의 상기 명백한 분자 특징은 에피토프를 구성한다. 따라서, 대부분의 항원은 여러 명백한 항체에 의해 결합되는 잠재력을 갖고 상기 항체 각각은 전형적으로 특정 에피토프에 특이적이다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 결합제, 예를 들면, 항체는 세포에 결합되어 있지 않고 수용체의 막 결합 형태로 있지 않은 수용체 형태로 가용한 FRα상의 에피토프에 결합한다. 예를 들면, 상기 항체는 MORAB-003이 결합하는 FRα상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 문장 "FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행"은 덜한 중증에서 보다 중증 상태로의 상기 암의 진행을 포함한다. 이것은 종양의 수 또는 중증도, 전이 정도, 암이 성장하고 전이하는 속도 등의 증가를 포함할 수 있다. 예를 들면, "난소암의 진행"은 덜한 중증에서 보다 중증 상태로의 상기 암의 진행, 예를 들면, I기에서 II기로, II기에서 III기로의 진행 등을 포함한다. 대안적으로, 상기 문장 "FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행"은 보다 중증 상태에서 덜한 중증 상태로의 FRα-발현 암의 퇴행을 언급할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, "난소암의 진행"은 IV기에서 III기로, III기에서 II기로의 퇴행 등을 언급한다. 다른 실시형태에서, "FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행"은 FRα-발현 암의 증상의 개시로부터 측정된 생존율 또는 FRα-발현 암의 진단시로부터 생존율을 언급할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "계층화"는 FRα-발현 암, 예를 들면, 난소암 또는 폐암을 당업계에 수용된 계층화 뿐만 아니라 암의 전이 정도를 기준으로 적당한 기로 특징 분석함을 언급한다. 예를 들면, 계층화는 FRα-발현 암을 I기, II기, III기 또는 IV기로 특징 분석함을 포함한다. 특정 실시형태에서, I기는 신체의 한 부분으로 국소화된 암을 언급한다. 특정 실시형태에서, II기 및 III기는 국소적으로 진전된 암을 언급하고, 여기서 기들 간에 구분된 특징은 흔히 특정 암에 특이적이다. 최종적으로, IV기는 다른 기관 또는 신체 전반에 걸쳐 전이되거나 전파된 암을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생존"은 암에 대해 치료받는 피검체의 생명 연장을 언급한다. 하나의 실시형태에서, 생존은 종양이 재발하는데 실패한 것을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재발하다"는 종양에 대한 1차 치료제가 투여된 피검체에서 종양 또는 암성 세포의 재성장을 언급한다. 상기 종양은 본래의 부위 또는 신체의 또 다른 부위에서 재발할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 재발하는 종양은 치료받은 피검체에 대한 본래의 종양과 동일한 유형이다. 예를 들면, 피검체가 난소암 종양을 갖고 치료받고 후속적으로 또 다른 난소암 종양을 나타낸 경우, 상기 종양은 재발하였다. 추가로, 암은 이것이 본래 존재했던 조직과는 상이한 기관 또는 조직에서 재발할 수 있다.
II . 본 발명의 방법 및 키트
본 발명은 적어도 부분적으로 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)가 대조군 샘플과 비교하여 FRα-발현 암을 갖는 피검체의 체액, 예를 들면, 뇨 또는 혈청에서 상승된 수준으로 발견되는 예상치 않은 발견을 토대로 한다. 더욱이, 본 발명은 적어도 부분적으로 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 평가하는데 필요한 민감성을 나타내는 면역학적 분석의 동정을 기반으로 하고, 여기서, 상기에 대한 이전의 시도는 계속적으로 실패했었다. 실제로, 본 발명은 샘플, 예를 들면, 뇨 또는 혈청에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 정확하게 평가할 수 있는 면역학적 분석을 제공함에 의해 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암에 대한 FRα-기반 진단학적 분석을 개발하기 위해, 이전의 시도 동안에 관찰된 난제를 극복한다.
따라서, 피검체가 FRα-발현 암을 가졌거나 이를 발병할 위험에 처해있는지를 평가하고 추가로 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 상기 방법은 피검체에서 난소암의 존재, 정도 또는 발병할 위험을 평가하는데 있어서 대조군 수준과 비교하여 샘플, 예를 들면, 뇨 및 혈청중에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 비교함을 포함한다.
A. 진단학적 방법, 예후적 방법, 위험 평가 방법 및 계층화 방법
구체적으로, 본 발명은 피검체가 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암에 걸렸는지의 여부를 평가하기 위한 진단 방법, 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암의 진행을 예측하기 위한 예후적 방법 및 피검체가 FRα-발현 암을 나타낼 위험 수준을 평가하기 위한 위험 평가 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암 피검체를 암 치료 그룹으로 계층화시키기 위한 계층화 방법을 제공한다. 여기서 논의된 본 발명의 다양한 양상 및 실시형태는 본원에 논의되거나 하기에 청구된 임의의 방법 및 키트에 적용될 수 있는 언급된 특이적 실시형태의 모든 가능한 조합을 비제한적으로 포괄하는 것으로 의도된다.
본 발명의 방법은 FRα-발현 암을 진단하거나, FRα-발현 암의 진행을 예측하거나, 피검체가 FRα-발현 암을 나타낼 위험의 수준을 평가하기 위해 당업자가 사용하는 임의의 다른 방법과 연계하여 수행될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플(뇨 또는 혈청과 같은)에서 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준을 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준과 상기 대조군 샘플에서의 FRα 수준의 차이는 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸다는 지표이다. 특정 실시형태에서, 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준은 상기 샘플을 세포에 결합되지 않은 FRα와 결합하고 (a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 및 (b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. 하나의 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 피검체가 폐암 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준을 비교함을 포함하고, 여기서, 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 간의 차이는 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸다는 지표이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하며, 여기서, 피검체로부터 유도된 혈청 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 간의 차이는 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸다는 지표이다. 특정 실시형태에서, 상기 피검체는 혈청에서의 FRα의 수준을 증진시키는 스테로이드와 같은 제제로 처리하지 않았다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이고 상기 피검체는 혈청에서의 FRα의 수준을 증진시키는 스테로이드와 같은 제제로 처리하지 않았다.
본 발명의 방법 및 키트에서, FRα-발현 암은 암 세포가 FRα를 발현함을 특징으로 하는 암을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα는 암 세포, 예를 들면, 암세포의 표면으로부터 상기 피검체의 생물학적 유체로 방출된다. FRα-발현 암은 폐암(예를 들면, 기관지폐포 암종, 유암종 및 비-소세포 폐암, 예를 들면, 선암종); 중피종; 난소암; 신암; 뇌암(예를 들면, 역형성 상의세포종, 소뇌의 연소성 모양세포성 성상세포종); 자궁경부암; 비인두암; 중배엽 유도된 종양; 두경부의 편평 세포 암종; 자궁내막암; 난소의 자궁내막 선암종, 장액 낭선암종, 유방암; 방광암; 췌장암; 골암(예를 들면, 높은 등급 골육종); 뇌하수체암(예를 들면, 뇌하수체 선종)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다.
본 발명의 방법 및 키트의 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 폐암이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암종(NSCLC)이다. 하나의 상기 실시형태에서, 상기 NSCLC는 선암종, 편평 세포 폐암종, 대형 세포 폐암종, 다형성 NSCLC, 유암종, 침샘 암종 및 비분류된 암종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 NSCLC는 선암종이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 소세포 폐암종(SCLC)이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 기관지폐포 암종이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 폐 유암종이다.
본 발명은 또한 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정함에 의해 상기 피검체가 난소암에 걸렸는지를 평가하는 방법을 제공하고, 여기서, 뇨 샘플 중에 FRα가 약 3000 a.u./ml 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다. 특정 실시형태에서, 뇨 샘플에서의 FRα가 약 4000 a.u./ml 초과, 약 5000 a.u./ml 초과, 약 6000 a.u./ml 초과, 약 7000 a.u./ml 초과, 약 8000 a.u./ml 초과, 약 9000 a.u./ml 초과, 약 10,000 a.u./ml 초과, 약 11,000 a.u./ml 초과, 약 12,000 a.u./ml 초과, 약 13,000 a.u./ml 초과, 약 14,000 a.u./ml 초과, 약 15,000 a.u./ml 초과, 약 16,000 a.u./ml 초과, 약 17,000 a.u./ml 초과, 약 18,000 a.u./ml 초과, 약 19,000 a.u./ml 초과, 약 20,000 a.u./ml 초과, 약 21,000 a.u./ml 초과, 약 22,000 a.u./ml 초과, 약 23,000 a.u./ml 초과, 약 24,000 a.u./ml 초과, 약 25,000 a.u./ml 초과, 약 26,000 a.u./ml 초과, 약 27,000 a.u./ml 초과, 약 28,000 a.u./ml 초과, 약 29,000 a.u./ml 초과 또는 약 30,000 a.u./ml 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 피검체로부터 유도된 뇨 샘플에서의 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정함에 의해 피검체가 난소암에 걸렸는지의 여부를 평가하는 방법을 제공하고, 여기서, 뇨 샘플 중에 FRα가 약 9100pg/ml 초과의 농도로 존재한다는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이거나 약 9100pg/ml 미만의 농도는 피검체가 난소암에 걸리지 않았다는 지표이다. 예를 들면, 뇨 샘플 중에 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 약 20,000 pg/mL 초과, 약 21,000 pg/mL 초과, 약 22,000 pg/mL 초과, 약 23,000 pg/mL 초과, 약 24,000 pg/mL 초과, 약 25,000 pg/mL 초과, 약 26,000 pg/mL 초과, 약 27,000 pg/mL 초과, 약 28,000 pg/mL 초과, 약 29,000 pg/mL 초과, 약 30,000 pg/mL 초과, 약 40,000 pg/mL 초과, 약 50,000 pg/mL 초과, 약 60,000 pg/mL 초과, 약 70,000 pg/mL 초과, 약 80,000 pg/ml 초과, 약 90,000 pg/ml 초과, 약 100,000 pg/ml 초과 또는 약 150,000 pg/ml 초과의 농도로 존재하는 것은 피검체가 난소암에 걸렸다는 지표이다.
본 발명의 이전 양상의 특정 실시형태에서, 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨 샘플 또는 혈청 샘플과 같은 샘플)에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 대조군 샘플에서의 FRα 수준과 비교하고, 여기서, 상기 수준 간의 차이는 피검체가 폐 또는 난소암과 같은 FRα-발현 암에 걸렸다는 지표이다. 특정 실시형태에서, 상기 차이는 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시, 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα 수준의 증가를 나타내고, 여기서, 상기 증가는 FRα-발현 암의 존재 또는 성장의 지표이다. 대안적으로, 상기 차이는 상기 FRα 수준의 감소를 나타내고, 여기서, 상기 감소는 FRα-발현 암의 부재 또는 퇴행의 지표이다. 본원에 사용된 바와 같이, 피검체 기원의 샘플(즉, 시험 샘플)에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파의 수준과 대조군 샘플에서의 엽산 수용체 알파 수준 간의 "차이"는 광범위하게 상기 2개의 샘플에서의 엽산 수용체 알파의 수준에 있어서 임의의 임상적으로 관련된 변화(증가 또는 감소를 포함함) 및/또는 통계학적으로 유의적인 차이를 언급한다. 예시적인 실시형태에서, 상기 차이는 수용자 작동 특성 (ROC) 분석을 사용하여 측정된 컷오프 값을 기준으로 선택되고, 이의 예는 실시예 6에 제공된다. 최적의 컷오프 값은 사용되는 분석 방법 및 조건에 따라 다양할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 차이는 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준을 측정하기 위한 방법의 검출 한계치 초과이어야만 한다. 상기 차이는 적어도 평가 방법의 표준 오차를 초과하는 것이 바람직하고, 바람직하게, 상기 차이는 평가 방법의 표준 오차보다 적어도 약 2-배 초과, 약 3-배 초과, 약 4-배 초과, 약 5-배 초과, 약 6-배 초과, 약 7-배 초과, 약 8-배 초과, 약 9-배 초과, 약 10-배 초과, 약 15-배 초과, 약 20-배 초과, 약 25-배 초과, 약 100-배 초과, 약 500-배 초과, 약 1000-배 초과이다. 상기 차이는 임의의 적당한 파라미터 또는 비-파라미터 기재 통계학적 또는 비교를 포함하는 임의의 적당한 비교에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, FRα 수준의 "증가"는 ROC 분석을 사용하여 측정된 컷오프 값을 초과하는 수준을 언급할 수 있다. 또한, 이것은 대조군 샘플에서의 FRα의 수준보다 2% 이상, 및 보다 바람직하게 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 약 300% 이상, 약 400% 이상, 약 500% 이상, 약 600% 이상, 약 700% 이상, 약 800% 이상, 약 900% 이상 또는 약 1000% 이상인 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 증가는 또한 대조군 샘플에서의 FRα의 평균 수준 초과로 적어도 약 1.5 이상, 및 보다 바람직하게 약 2 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 5 이상의 표준 편차인 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 또한, 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준 "감소"는 ROC 분석을 사용하여 측정된 컷오프 값을 초과하지 않는 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 이것은 또한 대조군 샘플에서의 FRα의 수준보다 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 약 30% 미만, 약 40% 미만, 약 50% 미만, 약 60% 미만, 약 70% 미만, 약 80% 미만, 또는 약 90% 미만인, 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다. 감소는 또한 대조군 샘플에서의 FRα의 평균 수준 미만으로 바람직하게 적어도 약 1.5 이상, 및 보다 바람직하게 약 2 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 5 이상의 표준 편차인, 시험 샘플에서의 수준을 언급할 수 있다.
본 발명의 방법 및 키트에 유용한 샘플은 세포에 결합되지 않은 FRα의 검출가능한 수준을 함유할 수 있는 임의의 조직, 세포, 생검 또는 체액을 함유한다. 하나의 실시형태에서, 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈장, 협측 찰과상, 침, 뇌척수액, 대변 또는 기관지폐포 세척액일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 샘플은 FRα-발현 종양 샘플 또는 FRα-발현 암이 발견될 수 있는 조직 또는 세포의 샘플이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨 또는 혈청 샘플이다.
신체 샘플은 예를 들면, 생검을 사용하거나 특정 영역을 박리하거나 면봉으로 긁어내거나 체액을 인출하기 위해 바늘을 사용하는 것을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 피검체로부터 수득할 수 있다. 다양한 신체 샘플을 수거하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
FRα 단백질 수준을 검출하고 정량하기 위해 적합한 샘플은 당업자에게 공지된 방법에 따라 새롭거나, 동결시키거나 고정시킬 수 있다. 적합한 조직 샘플은 바람직하게 절단하고 추가의 분석을 위해 현미경 슬라이드상에 위치시킨다. 고체 샘플, 즉, 조직 샘플은 가용화시키고/시키거나 파쇄시키고 이어서 가용성 추출물로서 분석할 수 있다. 액체 샘플은 또한 물리적 또는 화학적 처리할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 뇨 샘플은 원심분리, 와류교반 및/또는 희석 처리하고/하거나 가용화 물질(예를 들면, 구아니딘 처리)로 처리한다.
하나의 실시형태에서, 새롭게 수득된 생검 샘플은 예를 들면, 액체 질소 또는 디플루오로디클로로메탄을 사용하여 동결시킨다. 상기 동결된 샘플은 예를 들면, OCT를 사용한 절단을 위해 탑재하고 연속으로 저온유지 장치에서 절단한다. 상기 연속 절단물을 유리 현미경 슬라이드상에 수거한다. 면역조직화학적 염색을 위해, 상기슬라이드는 예를 들면, 크롬-알룸, 젤라틴 또는 폴리-L-라이신으로 피복시켜 상기 절단물이 상기 슬라이드에 확실히 고정되도록 할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 샘플을 절단 전에 고정화하고 매립시킨다. 예를 들면, 조직 샘플은 예를 들면, 포르말린으로 고정화시키고 연속으로 탈수시키고 예를 들면, 파라핀에 매립시킬 수 있다.
일단 샘플이 수득된 경우, 세포에 결합되지 않은 FRα를 검출하고 정량하기 위해 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법이 하기 섹션 (B)에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다(핵산 또는 바람직하게는 단백질 수준에서). 예시적인 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서던 블롯, 면역조직화학, 용액상 분석, ELISA, 예를 들면, 증폭된 ELISA, 면역침전 분석, 면역형광 분석, 유동 세포 측정 분석, 면역화학 분석, 질량 분광측정 분석, 예를 들면, MALDI-TOF 및 SELDI-TOF, 핵산 하이브리드화 기술, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
많은 실시형태에서, 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청)에서 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가한다. FRα에 결합하는 항체는 당업계에 공지되어 있고 (i) 유럽 특허원 제86104170.5호(Rettig)(이의 전문은 본원에 참조로서 인용된다)에 기재된 바와 같은 상기 뮤린 모노클로날 LK26 항체(이의 중쇄 및 경쇄는 본원에서 서열번호 22 및 23으로 나타낸다); (ii) 국제 공개 공보 WO2004/113388 및 미국 특허 제5,646,253호(이들 각각의 전문은 본원에 참조로서 인용된다)에 기재된 바와 같이 MORAB-003 항체를 포함한다. 상기 모노클로날 항체 MOV18 및 MOvl9는 또한 FRα 분자(이전에 gp38/FBP로서 공지된)상의 상이한 에피토프에 결합한다[문헌참조: Miotti, S. et al. Int J Cancer, 38: 297-303 (1987)]. 예를 들면, 상기 MOV18 항체는 문헌[Coney et al. Cancer Res, 51: 6125-6132(1991)]에 교시된 바와 같은 서열번호 26 (TELLNVXMNAK*XKEKPXPX*KLXXQX)(12번 위치에서 트립토판 또는 히스티딘 잔기가 가능하고 21번 위치에서 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기가 가능함을 주목한다)에 기재된 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "MORAb-003"는 FRα에 특이적으로 결합하고 서열번호 7의 성숙한 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 성숙한 경쇄 서열을 포함하는 항체를 언급한다. MORAb-003에 대해 상기 상응하는 전구 단백질 아미노산 서열은 서열번호 9(중쇄) 및 10(경쇄)로 나타낸다. 상기 MORAb-003 항체는 하기의 CDR을 포함한다: CDRH1로서 서열번호 1, CDRH2로서 서열번호 2, CDRH3으로서 서열번호 3, CDRL1로서 서열번호 4, CDRL2로서 서열번호 5 및 CDRL3으로서 서열번호 6. MORAb-003 항체 생산 세포는 2006년 4월 24일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209)에 기탁되었고 수탁 번호 PAT-7552를 부여받았다.
FRα에 결합하고 본 발명의 방법에 사용하기 위한 다른 항체는 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (또한 9F3으로서 언급됨), 19D4.B7 (또한 19D4로서 언급됨), 24F12.B1 (또한 24F12로서 언급됨), 및 26B3.F2 (또한 26B3으로서 언급됨)을 포함한다. 이들 항체, 이들의 CDR 및 이들의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열, 및 이들을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표 33에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 이들 항체는 뮤린 IgG 또는 이의 유도체이다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 사람, 사람화된 또는 키메라이다.
9F3
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 27과 실질적으로 동일하거나, 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 28과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 29와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 31과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 32와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 33과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 27과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 28과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 29와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 31과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 32와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 33과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 27과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 28과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 29와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있고, 또한 서열번호 31과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 32와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 33과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는다.
FRα에 결합하는 항체는 서열번호 30과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 34와 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 30과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하고 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 34와 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 천연 또는 비환원된 형태의 FRα와 결합할 수 있는 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (9F3) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 IgG2a 불변 영역을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 2011년 5월 19일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209)에 기탁되고 수탁 번호 PTA-11887을 부여받은 항체 생산 세포에 의해 제조되는 항체이다. 몇몇 실시형태에서, FRα와 결합하는 항체는 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다.
19 D4
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 35와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 36과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 37과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 39와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 40과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα와 결합하는 항체는 서열번호 41과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 35와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 36과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 37과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 39와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 40과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 및 서열번호 41과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 35와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 36과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 37과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있고, 또한 서열번호 39와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 40과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 41과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는다.
FRα에 결합하는 항체는 서열번호 38과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 42와 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 38과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하고 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 42와 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 천연 또는 비환원 형태의 FRα와 결합할 수 있는 19D4.B7 (19D4) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 IgG2a 불변 영역을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 2011년 5월 19일자로 아메리칸 컬쳐 콜렉션(10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209)에 기탁되고 수탁번호 PTA-11884를 부여받은 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 상기 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 상기 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다.
24F12
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 43과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 44와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 45와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 47과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 48과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 49와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 43과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 44와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 45와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 47과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 48과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 49와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 43과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 44와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 45와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있고, 또한 서열번호 47과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 48과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 49와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는다.
FRα와 결합하는 항체는 서열번호 46과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα와 결합하는 항체는 서열번호 50과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα와 결합하는 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 46과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하고 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 50과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα와 결합하는 항체는 천연 또는 비환원 형태의 FRα와 결합할 수 있는 24F12.B1 (24F12) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 IgG1 불변 영역을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 2011년 5월 19일자로 아메리칸 컬쳐 콜렉션(10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209)에 기탁되고 수탁번호 PTA-11886을 부여받은 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 상기 기탁된 항체 생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 상기 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다.
26B3
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 51과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 52와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 53과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 56과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 서열번호 57과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 51과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 52와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 53과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 56과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 57와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 51과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 52와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 53과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있고, 또한 서열번호 55와 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR1 아미노산 서열; 서열번호 56과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 57과 실질적으로 동일하거나 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는다.
FRα에 결합하는 항체는 서열번호 54와 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα에 결합하는 항체는 서열번호 58과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. FRα와 결합하는 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 54와 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 58과 실질적으로 동일하거나 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 천연 또는 비환원 형태의 FRα와 결합할 수 있는 26B3.F2 (26B3) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 뮤린 IgG1 불변 영역을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 2011년 5월 19일자로 아메리칸 컬쳐 콜렉션(10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209)에 기탁되고 수탁번호 PTA-11885를 부여받은 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체이다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 상기 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 상기 기탁된 항체-생산 세포에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다.
CDR의 항원 결합 배열은 CDR 스캐폴딩으로서 항체형 단백질을 사용하여 유전자 조작될 수 있다. 유전자 조작된 항원-결합 단백질은 FRα에 결합하는 항체의 범위내에 포함된다.
FRα에 결합하는 기타 시약 항체는 당업계에 공지되어 있고 현재 다수의 상기 시약 항체가 하기 표에 열거된 바와 같이 시판되고 있다(http://www.biocompare.com에서 항-FRα 항체의 검색을 기준으로).
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
바람직한 실시형태에서, FRα에 결합하는 항체는 뮤린 LK26 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 바와 같은 하기의 CDR 중 하나 이상을 포함한다: CDRH1로서 서열번호 l (GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT). 본 발명에 사용될 수 있는 항-FRα 항체에 관한 것으로 이의 내용이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제5,646,253호를 참조한다. 추가의 돌연변이는 이의 내용이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제5,646,253호에 교시된 바와 같은 골격 영역에서 만들어질 수 있다, .
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 LK26HuVK(서열번호 13) LK26HuVKY(서열번호 14), LK26HuVKPW(서열번호 15), 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 영역 경쇄; 및 LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 가변 영역 중쇄를 포함한다. 미국 특허 제5,646,253호 및 미국 특허 제6,124,106호를 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 샘플은 FRα가 항체 결합에 접근할 수 있도록 하기 위해 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 면역세포화학 또는 면역조직화학 방법의 특정 양상에서, 슬라이드는 전처리 완충액에 이전시키고 임의로 가열하여 항원 접근성을 증가시킬 수 있다. 전처리 완충액에서 샘플의 가열은 세포의 지질 이중층을 신속하게 붕괴시키고 항원(새로운 표본의 경우일 수 있지만 전형적으로 고정된 표본에 존재하는 것이 아니다)(즉, FRα 단백질)이 항체 결합에 보다 접근할 수 있게 한다. 상기 용어 "전처리 완충액"은 특히, 항체 결합에 대한 FRα 단백질 접근성을 증가시킴에 의해 면역염색에 대한 세포학적 또는 조직학적 샘플을 제조하기 위해 사용되는 완충액을 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 전처리 완충액은 pH-특이적 염 용액, 중합체, 세제, 또는 비이온성 또는 음이온성 계면활성제, 예를 들면, 에톡실화된 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 알카노에이트 또는 알콕실레이트 또는 이들 계면활성제의 블렌드 또는 담즙염의 용도를 포함할 수 있다. 상기 전처리 완충액은 예를 들면, 데옥시콜산, 나트륨 염 또는 나트륨 라우레쓰-13-카복실레이트(예를 들면, 산도판(Sandopan) LS) 또는 및 에톡실화된 음이온성 복합체 0.1% 내지 1%의 용액일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 전처리 완충액은 또한 슬라이드 저장 완충액으로서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 샘플, 예를 들면, 상기 뇨 샘플은 원심분리하고/하거나, 와류교반하고/하거나, 희석시키고/시키거나, 구아니딘 처리한다.
FRα 단백질이 항체 결합에 보다 접근하도록 하기 위한 임의의 방법은 본 발명의 수행에 사용될 수 있고 당업계에 공지된 항원 검색 방법을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다]을 참조한다.
FRα 단백질 접근성을 증가시키기 위한 전처리 후, 샘플은 적당한 블록킹제, 예를 들면, 퍼옥시다제 블록킹 시약, 예를 들면, 과산화수소를 사용하여 블록킹시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 샘플은 항체의 비-특이적 결합을 막기 위한 단백질 블록킹 시약을 사용하여 블록킹시킬 수 있다. 상기 단백질 블록킹 시약은 예를 들면, 정제된 카제인을 포함할 수 있다. 이어서, FRα에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 상기 샘플과 항온처리한다.
항체 결합을 검출하기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. FRα에 결합하는 항체는 항체 결합 수준에 상응하고 따라서 FRα 단백질 발현 수준에 상응하는 검출가능한 시그날을 생성하는 화학적 시약의 사용을 통해 검출할 수 있다. 본 발명의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법 중 하나에서, 항체 결합은 표지된 중합체에 접합된 2차 항체를 사용하여 검출한다. 표지된 중합체의 예는 중합체-효소 접합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 복합체 중 상기 효소는 전형적으로 항원-항체 결합 부위에서 크로마겐의 침적을 촉매함으로써 목적하는 바이오마커의 발현 수준에 상응하는 세포 염색을 수득하기 위해 사용된다. 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 알칼린 포스파타제(AP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법에서, FRα 단백질에 결합하는 항체는 2차 항체에 접합된 HRP-표지된 중합체를 사용하여 검출한다. 항체 결합은 또한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 결합하는 종-특이적 프로브 시약 및 종 특이적 프로브 시약에 결합하는, HRP에 접합된 중합체를 사용하여 검출할 수 있다. 슬라이드는 임의의 크로마겐, 예를 들면, 크로마겐 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 항체 결합에 대해 염색시키고, 이어서 헤마톡실린, 및 임의로 블루잉 제제(bluing agent), 예를 들면, 수산화암모늄 또는 TBS/Tween-20을 사용하여 대비염색시킨다. 다른 적합한 크로마겐은 예를 들면, 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC)를 포함한다. 본 발명의 몇몇 양상에서, 슬라이드는 세포기술자 및/또는 병리학자가 현미경으로 검토하도록 하여 세포 염색, 예를 들면, 형광 염색(즉, FRα 발현)을 평가한다. 대안적으로, 샘플은 자동화 현미경을 통해 검토될 수 있거나 양성 염색 세포의 동정을 촉진시키는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 요원에 의해 검토될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 항체를 표지시킨다. 예를 들면, 항체 결합의 검출은 항-FRα 항체를 검출가능한 물질에 커플링시켜 촉진시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보족 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사능활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보족 그룹 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사능활성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 14C, 또는 3H를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 방사능 표지, 발색단 표지, 형광단 표지 또는 효소 표지로 표지된다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 동결된 샘플은 상기된 바와 같이 제조하고 후속적으로 예를 들면, 트리스-완충 식염수(TBS)를 사용하여 적당한 농도로 희석된 FRα에 대한 항체로 염색시킨다. 1차 항체는 상기 슬라이드를 비오티닐화된 항-면역글로불린에서 항온처리함에 의해 검출할 수 있다. 상기 시그날은 임의로 증폭시키고 상기 항원의 디아미노벤지딘 침전을 사용하여 가시화시킬 수 있다. 추가로, 슬라이드는 임의로 예를 들면, 헤마톡실린을 사용하여 대비염색시켜 상기 세포를 가시화시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 고정되고 매립된 샘플은 FRα에 대한 항체를 사용하여 염색시키고 상기된 바와 같이 동결된 부분에 대해 대비염색시킨다. 추가로, 샘플은 임의로 제제로 처리하여 상기 시그날을 증폭시킴으로써 항체 염색을 가시화시킬 수 있다. 예를 들면, 비오티닐-티라미드에 이어서 퍼옥시다제 접합된 스트렙타비딘과 반응시키는 서양고추냉이-촉매화된 침적(문헌참조: Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, DAKO, Carpinteria, CA)을 사용할 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용되는 특정 항체의 농도는 결합 시점, FRα에 대한 항체의 특이성 수준 및 샘플 제조 방법과 같은 상기 인자에 따라 다양할 것임을 인지할 것이다. 더욱이, 다중 항체가 사용되는 경우, 상기 요구되는 농도는 항체가 예를 들면, 칵테일로서 동시에 또는 개별 항체 시약으로서 연속적으로 샘플에 적용되는 정도에 의해 영향을 받을 수 있다. 추가로, FRα에 결합하는 항체를 가시화하기 위해 사용되는 상기 검출 화학은 목적하는 시그날 대 노이즈 비율을 생성하도록 최적화해야만 한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 프로테오믹 방법, 예를 들면, 질량 분광측정기는 FRα 단백질을 검출하고 정량하기 위해 사용된다. 예를 들면, 혈청과 같은 샘플을 단백질-결합 칩에 적용함을 포함하는 매트릭스-연합된 레이져 탈착/이온화 타임-오브-플라이트 질량 분광측정기 (MALDI-TOF MS) 또는 표면 증진된 레이져 탈착/이온화 타임-오브-플라이트 질량 분광측정기 (SELDI-TOF MS)(문헌참조: Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029)을 사용하여 FRα 단백질을 검출하고 정량할 수 있다. 질량 분광측정 방법은 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,622,824호, 제5,605,798호 및 제5,547,835호에 기재되어 있다.
본 발명은 추가로 적어도 부분적으로 예후 바이오마커로서, 즉, 난소암 또는 비-소세포 폐암과 같은 FRα-발현 암의 진행 및/또는 중증도의 바이오마커로서 FRα의 동정을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명은 난소암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 여기서, 대조군 샘플과 비교시 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청 샘플)에서의 FRα 수준의 차이는 상기 암이 신속하게 진행할 것이라는 지표이다. 유사하게, 피검체가 FRα-발현 암을 발병할 위험 수준을 평가하는 방법은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교함을 포함하고, 여기서, 상기 대조군 샘플과 비교시, 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청 샘플)에서의 FRα의 수준의 차이는 상기 피검체가 건강한 개체에서 정상적인 위험과 비교하여 FRα-발현 암을 발병할 보다 높은 수준의 위험을 가진다는 지표이다.
하나의 실시형태에서, 상기 차이는 증가이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 차이는 감소이다. 몇몇 유형의 암(예를 들면, 두경부의 편평 세포 암종, 난소암)에서, 보다 높은 수준의 FRα 발현은 악한 예후와 관련되는 반면, 암의 다른 유형(예를 들면, 비-소세포 폐암)에서 보다 높은 수준의 FRα 발현은 보다 좋은 예후와 관련된다. 따라서, 하나의 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암 또는 두경부의 편평 세포 암종이고 상기 차이는 증가이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 비-소세포 폐암이고 상기 차이는 감소이다.
특정 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하고, 여기서, 상기 대조군 샘플과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청 샘플)에서의 FRα 수준의 증가는 암이 신속하게 진행할 것임을 나타내거나, 상기 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준의 감소는 상기 암이 서서히 진행하거나 퇴행할 것이라는 지표이다. 유사하게, 피검체가 FRα-발현 암을 발병할 위험 수준을 평가하는 방법은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준과 대조군 샘플에서의 FRα 수준을 비교함을 포함하고, 여기서, 상기 대조군 샘플과 비교시, 상기 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청 샘플)에서의 FRα 수준의 증가는 상기 피검체가 건강한 개체에서 정상적인 위험과 비교시 FRα-발현 암을 발병할 보다 높은 수준의 위험을 가진다는 지표이거나 상기 대조군 샘플에서의 FRα 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준 감소는 피검체가 건강한 개체중의 정상적인 위험과 비교시 FRα-발현 암을 발병할 위험이 보다 낮다는 지표이다.
당업계에 공지된 임의의 분석적 방법을 사용한 임의의 임상적으로 관련되거나 통계학적으로 유의적인 증가 또는 감소는 본 발명의 예후적 위험 평가 및 기타 방법에서 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, FRα 수준의 증가는 실시예 6에 예시된 바와 같은 ROC 분석을 사용하여 측정된 컷오프 값을 초과하는 수준을 언급한다. 또 다른 실시형태에서, FRα 수준의 감소는 ROC 분석을 사용하여 측정된 컷오프 값을 초과하지 않는 시험 샘플에서의 수준을 언급한다.
다른 실시형태에서, 상기 증가 또는 감소는 FRα의 수준을 측정하는 방법의 검출 한계치를 초과해야만 한다. 추가의 실시형태에서, 상기 증가 또는 감소는 적어도 평가 방법의 표준 오차보다 커야만 하고 바람직하게는 상기 차이는 상기 평가 방법의 표준 오차보다 적어도 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 25배 이상, 약 100배 이상, 약 500배 이상, 약 1000배 이상이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 증가 또는 감소는 파라미터 또는 비파라미터 기재 통계, 비교, 회귀 분석 등을 사용하여 평가한다.
다른 실시형태에서, 상기 증가 또는 감소는 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 보다 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000% 이상 또는 이하인, 피검체로부터 유도된 샘플에서의 수준이다. 대안적인 실시형태에서, 상기 증가 또는 감소는 대조군 샘플에서의 FRα의 평균 수준보다 적어도 약 1.5, 및 보다 바람직하게는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 이상의 표준 편차 초과 또는 미만인 피검체로부터 유도된 샘플에서의 수준이다. 본원에 사용된 바와 같이 문장 "FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행"은 적게 심각한 내지 보다 심각한 암 상태 기원의 FRα-발현 암의 진행을 언급할 수 있다. 이것은 종양의 수 또는 중증도, 전이도, 암이 성장하고 전이하는 속도 등의 증가를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 진행은 덜 심각한 기에서 보다 심각한 기로의 진행이고, 여기서, 상기 기는 당업계에 공지된 기 측정 계획에 따라 평가한다. 상기 FRα-발현 암이 난소암인 하나의 실시형태에서, 상기 진행은 I기에서 II로의 진행, II기에서 III기로의 진행 등을 언급한다. 상기 FRα-발현 암이 비-소세포암(NSCLC)인 또 다른 실시형태에서, 상기 진행은 0기에서 IA로의 진행, IA기에서 IB기로의 진행, IB기에서 IIA기로의 진행, IIA기에서 IIB로의 진행, IIB기에서 IIC기로의 진행 등을 언급한다. 상기 FRα-발현 암이 비-소세포암(NSCLC)인 또 다른 실시형태에서, 상기 진행은 TNM 분류 시스템하에 측정시 덜 심각한 기에서 보다 심각한 기로의 진행을 언급한다[문헌참조: Spira; Greene; Sobin].
대안적으로, 상기 문장 "FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행"은 종양의 수 또는 중증도, 전이의 정도, 암이 성장하고 전이하는 속도 등의 감소와 같이 보다 심각한 상태에서 덜 심각한 상태로의 FRα-발현 암의 퇴행을 언급할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 진행은 보다 심각한 기에서 덜 심각한 기로의 진행이고, 여기서, 상기 기는 당업계에 공지된 기 측정 계획에 따라 평가한다. 상기 FRα-발현 암이 난소암인 하나의 실시형태에서, 상기 진행은 IV기에서 III기로 퇴행, III기에서 II기로의 퇴행 등을 언급한다. 상기 FRα-발현 암이 비-소세포 폐암(NSCLC)인 또 다른 실시형태에서, 상기 진행은 IV기에서 IIIB기로의 진행, IIIB기에서 IIIA기로의 진행, IIIA기에서 IIB기로의 진행 등을 언급한다. 상기 FRα-발현 암이 비-소세포 폐암(NSCLC)인 또 다른 실시형태에서, 상기 진행은 TNM 분류 시스템하에 측정시 보다 심각한 기에서 덜 심각한 기로의 진행을 언급한다[문헌참조: Spira; Greene; Sobin].
추가의 실시형태에서, 당업자에게 공지된 퇴행 분석의 방법을 포함할 수 있는, 본 발명의 방법을 사용하여, 피검체가 FRα-발현 암에 걸릴 가능성, 피검체중에서 FRα-발현 암의 진행, FRα-발현 암을 발병할 위험성 수준, FRα-발현에 대해 치료받은 피검체에서 암 재발 위험성, FRα-발현 암에 대해 치료받은 피검체의 생존, FRα-발현 암을 치료하기 위한 치료 계획의 효능 등을 계산하기 위해 FRα의 수준이 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 퇴행 모델은 CART [문헌참조: Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK], Cox [문헌참조: www.evidence-based-medicine.co.uk], 대수적, 정상 및 로그 정상[문헌참조: www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html], 로지스틱[문헌참조: www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression], 파라미터, 비-파라미터, 세미-파라미터[문헌참조: www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion], 선형[문헌참조: www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression], 또는 부가적[문헌참조: www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model] 모델을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시형태에서, 퇴행 분석은 FRα의 수준을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 퇴행 분석은 추가의 임상적 및/또는 분자 공변수를 포함할 수 있다. 상기 임상적 공변수는 피검체의 연령, 종양 기, 종양 등급, 종양 크기, 치료 계획, 예를 들면, 화학치료 및/또는 방사선 치료, 임상적 결과(예를 들면, 재발, 질환 특이적 생존, 치료 실패) 및/또는 진단 후 시간의 함수로서 임상적 결과, 치료 개시 후 시간 및/또는 치료의 완성 후 시간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분자 공변수는 추가의 분자 마커 값을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 FRα-발현 암이 난소암인 실시형태에서, 상기 마커는 예를 들면, 혈청 CA125 수준, 혈청 DF3 수준 및/또는 혈장 LPA 수준을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 치료 또는 치료 계획의 효과를 모니터링하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체에서 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료 효능을 모니터링하기 위한 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 피검체는 이전에 MORAb-003을 투여받았다); 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 비교하는 단계(여기서, 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준의 증가 또는 무변화는 상기 MORAb-003 치료가 효과적이지 않다는 지표이고; 대조군 샘플에서의 FRα 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준의 감소는 상기 MORAb-003 치료가 효과적이라는 지표이다)를 포함한다.
예를 들면, 상기 대조군 샘플은 치료 계획에 적용되지 않은 피검체로부터 유래될 수 있고, 시험 샘플은 치료 계획 중 적어도 일부에 적용된 피검체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 상기 시험 샘플 및 상기 대조군 샘플은 동일한 피검체로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 상기 시험 샘플은 치료제, 예를 들면, MORAb-003의 투여 후 피검체로부터 유도된 샘플일 수 있다. 상기 대조군 샘플은 치료제의 투여 전에 또는 치료 계획의 조기 단계에서 피검체로부터 유도된 샘플일 수 있다. 따라서, 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플에서의 FRα 발현 수준의 감소는 치료제가 FRα-발현 암, 예를 들면, 난소암의 진행을 감소시켰다는 지표이다. 보다 높은 수준의 FRα가 악한 예후와 관련된 FRα-발현 암, 예를 들면, 난소암 또는 두경부의 편평 세포 암종에 대해, 상기 대조군 샘플과 상대적으로 상기 시험 샘플에서의 FRα 발현 수준의 감소는 치료제가 FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 지연시키거나 암의 퇴행을 유발하는데 효과적이라는 지표이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다.
본 발명의 이러한 양상의 다양한 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨, 혈청, 혈장 또는 복수액일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨 또는 혈청이다. 더욱이, 상기 FRα는 상기 샘플을 FRα와 결합하는 항체와 접촉시킴에 의해, 임의로 본원에 기재된 항체 및 본원에 기재된 분석 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 상기 MORAb-003 치료 항체는 (a) 서열번호 7에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체; (b) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 또는 (c) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체이다.
특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 다른 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 폐암이다. 보다 특정 실시형태에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)이다. 하나의 상기 실시형태에서, 상기 NSCLC는 선암종, 편평 세포 폐암종, 대형 세포 폐 암종, 다형성 NSCLC, 유암종, 침샘선 암종 및 비분류된 암종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 NSCLC은 선암종이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 소세포 폐 암종(SCLC)이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 기관지폐포 암종이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 폐암은 폐 유암종이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 샘플에서 측정된 FRα 수준을 기준으로 FRα-발현 암을 앓는 환자를 암 치료 그룹으로 계층화시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 FRα-발현 암을 앓는 피검체를 적어도 4개의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시킴을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 FRα-발현 암을 앓는 피검체를 적어도 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개 또는 약 10개의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시킴을 포함한다.
본 발명에 따라, FRα의 수준은 중증도, 즉 FRα-발현 암의 기와 연관될 수 있다. 예를 들면, 난소암은 본원에 제시된 바와 같이 암의 중증도를 기준으로 상이한 기로 계층화된다. 따라서, 본 발명은 난소암을 I기, 예를 들면, IA기, IB기 또는 IC기; II기, 예를 들면, IIA기, IIB기 또는 IIC기; III기, 예를 들면, IIIA기, IIIB기 또는 IIIC기; 또는 IV기 난소암으로 계층화하기 위한 방법을 제공한다.
SCLS 또는 NSCLC는 본원에 제시된 바와 같은 암의 중증도에 따라 상이한 기로 계층화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 폐암, 예를 들면, SCLS 또는 NSCLC를 잠복(숨은) 기; 0기; I기, 예를 들면, IA기 및 IB기; II기, 예를 들면, IIA기 및 IIB기; III기, 예를 들면, IIIA기 및 IIIB기; 또는 IV기 폐암으로 계층화하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 적어도 부분적으로 FRα가 FRα-발현 암의 치료를 위한 예측 바이오마커로서 작용할 수 있다는 발견을 토대로 한다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 피검체에서의 FRα의 수준을 평가함에 의해 피검체가, 예를 들면, MORAb-003을 사용한 치료에 반응할지의 여부 및 예를 들면, MORAb-003을 사용한 치료를 언제 개시할지를 평가하는 것을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 FRα-발현 암, 예를 들면, 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할지를 예측하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하고; 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 비교하며, 여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 간의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응한다는 지표이다.
특정 실시형태에서, 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 암 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준 간의 차이 정도는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응한다는 지표이다. 예를 들면, 상기 평가 방법의 표준 오차의 적어도 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 100배, 약 500배, 약 1000배 이상의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응한다는 지표이다. 대안으로 또는 조합으로, 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 약 600%, 약 700%, 약 800%, 약 900% 또는 약 1000%의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응한다는 지표이다. 대안으로 또는 조합으로, 적어도 약 1.5, 및 보다 바람직하게 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 이상의 표준 편차의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응한다는 지표이다.
다양한 실시형태에서, 상기 MORAb-003 치료 항체는 (a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체; 또는 (b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4 (SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체이다.
다양한 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨, 혈장, 혈청 또는 복수액이다. 특정 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨 또는 혈청이다. 추가의 실시형태에서, FRα-발현 암은 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 FRα-발현 암은 난소암이다. 또 다른 실시형태에서, FRα-발현 암은 비-소세포 폐암, 예를 들면, 선암종이다.
B. FR α-발현 암을 검출하기 위한 항- FR α 항체 기반 분석
항체를 사용하여 샘플에서 폴리펩타이드를 검출하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 분석 포맷이 있고, 이는 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 면역형광측정법, 면역침전법, 용액 상 분석, 평형 희석법, 면역확산법 및 기타 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[문헌참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston]. 예를 들면, 상기 분석은 웨스턴 블롯 포맷에서 수행될 수 있고, 여기서, 생물학적 샘플 기원의 단백질 제제는 겔 전기영동에 적용하고 적합한 막으로 이전시키고 항체와 반응하도록 방치한다. 이어서 막상에 항체의 존재는 당업계에 널리 공지되어 있고 하기된 적합한 검출 시약을 사용하여 검출할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 분석은 표적 FRα 폴리펩타이드에 결합하고 이를 샘플의 나머지 부분으로부터 제거하기 위한, 고형 지지체상에 고정화된 항체의 용도를 포함한다. 이어서, 상기 결합된 FRα 폴리펩타이드는 특징적인 FRα 폴리펩타이드 항원성 결정인자와 반응성인 제2 항체, 예를 들면, 검출가능한 리포터 잔기를 함유하는 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 상기 실시형태에 따라, 상기 고정화된 항체 및 특징적인 항원성 결정인자를 인지하는 제2 항체는 본원에 기재된 바와 같은 MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 또는 이의 변이체로부터 선택된 본원에 기재된 모노클로날 항체 중 임의의 2개일 수 있다. 대안적으로, 경쟁 분석을 사용할 수 있고, 여기서, FRα는 검출가능한 리포터 잔기와 표지시키고 상기 고정화된 항체와 상기 샘플의 항온처리 후 고정화된 항-FRα 항체에 결합하도록 방치한다. 상기 샘플의 성분이, 표지된 폴리펩타이드의 항체로의 결합을 억제하는 정도는 상기 샘플과 고정화된 항체의 반응성을 지적하고 결과로서 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 지적한다.
상기 고형 지지체는 항체가 부착될 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 물질, 예를 들면, 미세역가 플레이트내 시험 웰, 니트로셀룰로스 필터 또는 또 다른 적합한 막일 수 있다. 대안적으로, 상기 지지체는 비드 또는 디스크, 예를 들면, 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 플라스틱, 예를 들면, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 상기 항체는 특허 및 과학 문헌에 상세하게 기재된, 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 고형 지지체상에 고정화시킬 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 샘플에서의 FRα의 검출 분석법은 2개-항체 샌드위치 분석법이다. 상기 분석은 먼저, 고형 지지체, 통상적으로 미세역가 플레이트의 웰상에 고정화된 FRα 특이적 항체(예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 또는 이의 변이체)를 상기 생물학적 샘플과 접촉시켜 샘플 중에 천연적으로 존재하고 항체와 반응성인 항원성 결정인자를 갖는 가용성 분자가 상기 고정화된 항체와 결합하도록 방치시켜(예를 들면, 실온에서 30분 항온처리 시간이면 일반적으로 충분하다) 항원-항체 복합체 또는 면역 복합체를 형성하도록 함에 의해 수행할 수 있다. 이어서, 상기 샘플의 비결합된 성분은 상기 고정화된 면역 복합체로부터 제거한다. 이어서, FRα와 특이적인 제2 항체를 첨가하고, 여기서, 제2 항체의 항원 결합 부위는 고정화된 제1 항체(예를 들면, 고형 지지체상에 고정화된 모노클로날 항체와 동일하지 않은, 본원에 기재된 바와 같은 MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 또는 이의 변이체)의 항원 결합 부위가 FRα에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하지 않는다. 상기 제2 항체는 본원에 제공된 바와 같이 검출가능하게 표지시켜 이를 직접적으로 검출할 수 있다. 대안적으로, 상기 제2 항체는 검출가능하게 표지된 제2 (또는 "제2 단계") 항-항체의 사용을 통해 또는 본원에 제공된 바와 같은 특이적 검출 시약을 사용함에 의해 간접적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 방법은, 면역분석법에 익숙한 자들은 2개-항체 샌드위치 면역분석에서 특정 항원(예를 들면, FRα)을 면역학적으로 검출하기 위해 수많은 시약 및 구성이 있음을 인지할 수 있으므로 임의의 특정 검출 과정으로 제한되지 않는다.
상기된 2개 항체 샌드위치 분석을 사용하는 본 발명의 특정 바람직한 실시형태에서, FRα에 특이적인 제1 고정화된 항체는 폴리클로날 항체이고, FRα에 특이적인 제2 항체는 폴리클로날 항체이다. 본 발명의 특정 다른 실시형태에서, FRα에 특이적인 제1 고정화된 항체는 모노클로날 항체이고 FRα에 특이적인 제2 항체는 폴리클로날 항체이다. 본 발명의 특정 다른 실시형태에서, FRα에 특이적인 제1 고정화된 항체는 폴리클로날 항체이고 FRα에 특이적인 제2 항체는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 특정 다른 실시형태에서, FRα에 특이적인 제1 고정화된 항체는 모노클로날 항체이고 FRα에 특이적인 제2 항체는 모노클로날 항체이다. 예를 들면, 이들 실시형태에서, 본원에서 제공되고 본원에 기재된 모노클로날 항체 MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 또는 이의 변이체는 FRα 폴리펩타이드 상에서 특징적이고 비경쟁적인 항원성 결정인자(예를 들면, 에피토프)를 인지하여 상기 모노클로날 항체의 임의의 짝 형성 조합이 사용될 수 있음을 주지해야 한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서, FRα에 특이적인 제1 고정화된 항체 및/또는 FRα에 특이적인 제2 항체는 당업계에 공지되고 본원에 언급된 임의의 종류의 항체이고, 예를 들면, Fab 단편, F(ab')2 단편, 면역글로불린 V-영역 융합 단백질 또는 단일쇄 항체가 비제한적으로 예시될 수 있다. 당업계에 친숙한 자들은 본 발명이 본원에 기재되고 청구된 방법에서 기타 항체 형태, 단편, 유도체 등의 사용을 포함함을 인지할 것이다.
특정의 특히 바람직한 실시형태에서, 제2 항체는 검출가능한 리포터 잔기 또는 표지, 예를 들면, 효소, 염료, 방사성핵종, 발광 그룹, 형광 그룹 또는 비오틴 등을 함유할 수 있다. 이어서, 고형 지지체에 결합된 채로 남아있는 제2 항체의 양은 특이적으로 검출가능한 리포터 잔기 또는 표지에 적당한 방법을 사용하여 측정한다. 방사성활성 그룹에 대해, 섬광 계수 또는 자가방사선촬영 방법이 일반적으로 적당하다. 항체-효소 접합체는 다양한 커플링 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 검토를 위해, 예를 들면, 문헌(Scouten, W. H., Methods in Enzymology 135:30-65, 1987)을 참조한다. 분광측정 방법을 사용하여 염료(예를 들면, 효소 반응의 비색 생성물을 포함함), 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다. 비오틴은 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사선활성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 커플링된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 첨가하고(일반적으로 특정 기간 동안), 이어서 반응 생성물의 분광기 분석, 분광측정분석 또는 기타 분석으로 검출할 수 있다. 표준물 및 표준 첨가물을 사용하여 널리 공지된 기술을 사용한 샘플에서의 메소텔린 폴리펩타이드의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 FRα-발현 암의 존재에 대한 스크리닝 방법은 피검체 기원의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 종양 관련 마커의 검출에 의해 추가로 증진될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 결합되지 않은 FRα의 반응성을 검출하는 것 뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있고 본원에 제공된 확립된 방법을 사용하여 악성 병태에 대한 하나 이상의 추가의 가용성 마커의 검출을 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다. 상기된 바와 같이, 용이하게 수득된 생물학적 유체의 샘플에서 검출가능한 다수의 가용성 종양 관련 항원이 있다.
C. 본 발명의 키트
본 발명은 또한 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지의 여부를 평가하거나, FRα-발현 암의 진행을 평가하거나, 피검체에서 FRα-발현 암이 발병할 위험성 수준을 평가하거나, FRα-발현 암의 치료제 또는 치료 계획의 효과를 모니터링하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 FRα의 발현 수준을 측정하기 위한 수단 및 FRα-발현 암의 진행을 평가하거나, 피검체에서 FRα-발현 암이 진행할지의 위험 수준을 평가하거나, FRα-발현 암에 대한 치료제 또는 치료 계획의 효과를 모니터링하기 위한 키트의 사용 지침서를 포함한다.
본 발명의 키트는 임의로 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유용한 추가의 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 피검체 기원의 샘플, 대조군 샘플, 예를 들면, 서서히 진행하는 암을 가진 피검체 및/또는 암을 앓지 않는 피검체 기원의 샘플을 수득하기 위한 수단, 하나 이상의 샘플 구획 및 본 발명의 방법의 수행 및 조직 특이적 대조군/표준물을 기재하는 지침 자료를 포함할 수 있다.
FRα의 수준을 측정하기 위한 수단은 상기 논의된 바와 같이 단백질 수준을 평가하기 위해 당업계에 공지된 방법, 및 본원에 논의된 바와 같이 예를 들면, MARAb-003 항체를 사용하는 특이적 바람직한 실시형태를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 하나의 실시형태에서, FRα의 수준은 피검체로부터 유도된 샘플(예를 들면, 뇨 또는 혈청)을 엽산 수용체 알파(FRα) 결합제와 접촉시킴으로써 평가한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 결합제는 항체이다. FRα에 결합하는 많은 유형의 항체는 본 발명의 방법에서 상기 논의되고 또한 본 발명의 키트에 사용될 수 있다.
FRα의 수준을 측정하기 위한 수단은 예를 들면, FRα의 수준을 측정하기 위한 분석에 사용하기 위한 완충제 또는 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 지침서는 예를 들면, 상기 분석을 수행하기 위해 인쇄된 지침서 및/또는 FRα의 발현 수준을 평가하기 위한 지침서일 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 피검체로부터 샘플을 분리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이들 수단들은 피검체로부터 유체 또는 조직을 수득하기 위해 사용될 수 있는 장비 또는 시약 중 하나 이상의 항목을 포함할 수 있다. 피검체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단은 또한 혈액 샘플 기원의 혈액 성분, 예를 들면, 혈청을 분리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 사람 피검체에 사용하기 위해 디자인된다.
III . 스크리닝 분석
추가의 실시형태에서, 본 발명은 또한 샘플 중 FRα의 수준을 모니터링하고 비교하고, 이에 의해 조절제, 즉, 암, 예를 들면, FRα-발현 암 또는 암 세포, 예를 들면, 난소암 세포의 성장, 진행, 및/또는 침습성을 조절하는 후보물 또는 시험 화합물 또는 제제(예를 들면, 단백질, 펩타이드, 펩타이드모사체, 펩토이드, 소분자 또는 기타 약물)를 동정하기 위한 방법(또는 본원에서 "스크리닝 분석법"으로서 언급됨)을 제공한다. 상기 분석은 전형적으로 이의 암 또는 암세포에 대한 활성이 평가되어야만 하는 시험 화합물 또는 조합된 시험 화합물을 포함한다. 본원에 기재된 것들과 같은 분석법을 통해 동정된 화합물은 예를 들면, FRα-발현 암 또는 암 세포, 예를 들면, 난소암 세포의 침습성을 조절하기 위한, 예를 들면, 억제하거나, 완화시키거나, 시험하거나, 예방하기 위해 유용할 수 있다. 샘플 중 FRα의 수준을 모니터링함에 의해, FRα-발현 암이 진행성인지 또는 퇴행성인지를 그리고 시험 화합물이 목적하는 효과를 갖는지를 측정할 수 있다. 예를 들면, FRα-발현 암이, 보다 높은 수준의 FRα가 악한 예후와 관련된 암인 실시형태에서, 시험 화합물(들)의 투여 후 FRα의 수준의 감소는 시험 화합물이 효과적이라는 지표이다. 반대로, 시험 화합물(들)의 투여 후 FRα 수준의 증가는 상기 시험 화합물이 난소암을 치료하는데 효과적이지 않다는 지표이다. 반대로, FRα-발현 암이, 보다 높은 수준의 FRα가 양호한 예후와 관련된 암인 실시형태에서, 시험 화합물(들)의 투여 후 FRα 수준의 증가는 시험 화합물이 효과적이라는 지표이다. 반대로, 시험 화합물(들)의 투여 후 FRα 수준의 감소는 상기 시험 화합물이 난소암을 치료하는데 효과적이지 않다는 지표이다.
본 발명의 스크리닝 분석법에 사용되는 시험 화합물은 천연 및/또는 합성 화합물의 시스템적 라이브러리를 포함하는, 임의의 가용한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 시험 화합물은 또한 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(펩타이드의 기능성 기를 갖고 효소적 분해에 내성이고 이에도 불구하고 생활성 상태로 남아있는 신규한 비-펩타이드 골격을 갖는 분자의 라이브러리; 문헌참조: Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); 공간적으로 다룰 수 있는 평행 고형상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; '1개-비드 1개-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당업계에 공지된 조합적 라이브러리 방법 중 임의의 많은 방법에 의해 수득할 수 있다. 상기 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 방법은 펩타이드 라이브러리로 제한되고, 다른 4개의 방법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용될 수 있다(문헌참조: Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당업계, 예를 들면, 문헌[참조 DeWitt et al. (1993) Pwc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233]에서 찾을 수 있다.
화합물의 라이브러리는 용액(문헌참조: Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421) 중에, 또는 비드(문헌참조: Lam, 1991, Nature 354:82-84) 상에, 칩(문헌참조: Fodor, 1993, Nature 364:555-556) 상에, 세균 및/또는 포자(문헌참조: Ladner, USP 5,223,409) 상에, 플라스미드 (문헌참조: Cull et al, 1992, Pwc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) 상에 또는 파아지(문헌참조: Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.) 상에 제공될 수 있다.
본 발명은 추가로 추가의 제한으로 해석되지 말아야 하는 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다. 도면 뿐만 아니라 본원에 전반적으로 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허원의 내용은 표현적으로 이들의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
실시예
실시예 1. 전기화학발광 면역분석(ECLIA)에 의한 측정시 난소암을 앓는 사람 피검체 및 난소암을 앓지 않는 사람 피검체 기원의 뇨 샘플에서의 FRα 수준의 측정
재료 및 방법
뇨 샘플은 난소암에 걸린 피검체 및 난소암에 걸리지 않은 정상 대조군 피검체를 포함하는 사람 피검체로부터 수득하였다. 뇨 샘플에서의 FRα의 수준은 하기의 과정에 따른 전기화학발광 면역분석(ECLIA)을 사용하여 측정하였다(문헌참조: Namba et al. (1999) Analytical Science 15: 1087-1093):
i. 마이크로 비드에의 항체 피복
모노클로날 항-엽산 수용체 알파 항체는 마이크로 비드(Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal)의 표면에 걸쳐 피복시켰다. 36mg의 마이크로 비드는 0.15 mol/L의 인산 완충액 식염수 pH 7.8 (PBS) 중의 1.2mL의 항체 MOV18(0.36mg/mL, Enzo Life Science)와 혼합하고, 이어서, 실온에서 16시간 동안 약하게 혼합하였다. 이어서, 상기 마이크로 비드는 0.1% 정상 토끼 혈청(NRS), 150 mmol/L NaCl, 0.01% Tween 20 pH 7.5 (세척 완충액)을 함유하는 50mM HEPES 완충액으로 5회 세척하였다. 이후, 상기 피복된 마이크로 비드는 20% NRS, 150 mmol/L NaCl 및 0.01% Tween 20 pH 7.5 (반응 완충액)를 함유하는 1.2mL 50mM HEPES 완충액 중에 현탁시켜 비결합된 표면을 차단시킴에 이어서 실온에서 3.5시간 동안 약하게 혼합하였다. 최종적으로, 상기 마이크로 비드는 세척 완충액으로 5회 세척하였고, 10% NRS, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA-2Na 및 0.01% Tween 20 pH 7.5 (반응 완충액)을 함유하는 1.2mL 50mM HEPES 완충액으로 재현탁시켜 마이크로 비드의 농도가 30 mg/mL이 되도록 하였다. 상기 마이크로 비드는 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
ii . 루테늄- 킬레이트 - NHS ( Ru )를 이용한 항체 표지화
PBS 중의 1ml MORAB-003(1 mg/mL)을 14㎕의 Ru(10mg/ml)과 혼합하고(항체 대 Ru의 초기 몰비는 1:20이었다), 이어서 암실의 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 상기 반응은 25㎕의 2mol/L 글라이신 용액을 첨가하고, 이어서 20분 동안 항온처리하여 종결시켰다. 상기 표지된 항체는 Sephadex G-25 (GE Healthcare)를 사용하여 겔 여과에 의해 정제하고 PBS로 용출시켰다. 제1 용출된 황색 분획물을 수거하고 항체 및 Ru의 농도는 각각 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)에 의해 455nm에서의 흡광도로 측정하였다. 상기 최종 몰비는 하기의 식으로 계산하였다: 최종 몰비 = [(455에서 흡광도)/13700)]/[Ab(mg/mL/150000)]. 상기 표지된 항체는 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
iii . 1단계 면역분석
상기 항체 피복된 마이크로 비드는 반응 완충액으로 비드의 농도를 1.5mg/ml(작동 용액)로 조정한 후 Picolumi 8220 (Sanko, Tokyo, Japan)의 시약 표에 따라 설정되었다. 상기 Ru 표지된 항체는 반응 완충액을 이용하여 항체의 농도를 2 μg/ml (작동 용액)로 조정한 후 Picolumi 8220의 시약 표에 따라 설정되었다.
10㎕의 뇨 (반응 완충액에 1:51로 희석시킴) 또는 표준 FRα(반응 완충액 중에서 제조됨) 및 100㎕의 반응 완충액을 반응 튜브(Sanko, Tokyo, Japan)에 분배하고 Picolumi 8220에 따라 설정하였다.
하기의 단계는 자동적으로 Picolumi 8220에 의해 수행하였다. 25㎕의 비드(작동 용액) 및 180㎕의 Ru 표지된 항체(작동 용액)을 분배하였다. 30 +/-2℃에서 26분 항온처리한 후, 상기 비드를 세척하고 300 ㎕의 전해질 용액(Sanko, Tokyo, Japan)으로 현탁시켰다. 이어서, 상기 세척된 비드는 전극으로 이동시키고 전기화학발광(ECL) 방출을 측정하였다.
모든 ECL 측정은 2회 수행하였다.
결과
표 1은 난소암을 앓는 개별 피검체 및 난소암에 걸리지 않은 여성 대조군 피검체에서 뇨의 FRα 수준을 도시한다.
Figure pct00004
도 2는 표 1에 제시된 바와 같이, 난소암을 앓는 피검체 및 정상의 여성 대조군 피검체에서 뇨에서의 FRα 수준의 분포를 도시한다.
표 2는 난소암 그룹 및 정상의 여성 대조군 그룹에서의 FRα의 수준에 대한 피검체의 수(n), 평균, 표준 편차(SD), 최대(Max.) 및 최소(Min.) 값을 요약한다.
Figure pct00005
논의
고수준의 FRα는 난소암을 앓는 피검체의 뇨에서 검출되었다. 또한, FRα의 수준은 난소암과 정상의 여성 대조군 그룹 사이에 상당한 차이가 있었다(p=0.03, 일방(one-sided)).
실시예 2. 희석 선형성 - 전기화학발광 면역분석(ECLIA)에 의해 측정된 연속 희석된 뇨 샘플에서의 FRα 수준의 측정
희석 선형성은 분석의 정확성의 척도이다. 2개의 뇨 샘플은 10 및 100의 배수로 연속으로 희석시켰다. 각각의 샘플의 FRα 수준은 실시예 1에 제시한 바와 같이 측정하고 비교하여 % 오차를 평가하였다. % 오차는 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00006
상기 결과는 표 3에 제시되어 있다:
Figure pct00007
이전의 결과는 허용가능한 오차 내에서, 뇨가 정확한 수준의 FRα을 보유하면서 100 이상의 배수까지 희석될 수 있는, 사람 뇨 샘플에서의 FRα 수준을 평가하는데 있어서 희석 선형성을 입증한다. 따라서, 상기 뇨 샘플의 희석은 FRα의 수준을 측정하기 전에 고려될 수 있다.
실시예 3: 뇨 샘플의 원심분리- 어드레싱 재현성
또한, 특정 뇨 샘플에 대한 ECLIA 분석의 재현성도 시험하였다. 예를 들면, 표 4에 반영된 바와 같이, 동일한 샘플의 ECLIA 분석은 다양한 결과를 유도하였다.
Figure pct00008
뇨 샘플에서의 불용성 물질(침전물)의 존재는 FRα의 수준을 측정하는데 있어서 나타나는 다양성에 관여하는 것으로 추정되었다. 결과로서, FRα의 수준 측정 전에 뇨 침강물을 제거하기 위한 샘플의 원심분리는 상기 분석의 정확도 및 재현성을 증진시키기 위한 옵션으로서 고려하였다.
표 5는 3개의 샘플이 ECLIA 분석의 수행 전에 원심분리되는 경우 수득된 결과를 나타낸다.
Figure pct00009
상기 제시된 바와 같이, 상기 결과는 원심분리가 보다 일관된 FRα 농도의 측정을 제공함을 지적한다.
추가로, 2개의 샘플은 실시예 1에 제시된 ECLIA 분석에 의한 FRα 수준의 측정 전에, (i) 원심분리(2분 동안 2000 x g)하고 FRα의 측정을 위해 상청액을 제거하고(하기 표 6에서 샘플 "A"로서 나타냄), (ii) 원심분리에 이어서 와류교반(하기 표 6에서 샘플 "B"로서 나타냄)하였다. 상기 결과는 하기 표 6에 나타낸다.
Figure pct00010
차이 (%)는 다음과 같이 측정하였다:
표 6에 나타낸 바와 같이, ECLIA 분석에 의해 측정된 FRα의 수준은 뇨가 침전물을 제거하기 위한 원심분리에 의해 세정되었는지의 여부 또는 뇨가 침강물을 현탁시키거나 분산시키기 위해 와류교반되었는지의 여부에 따라 다양하다. 따라서, 특정 실시형태에서, 뇨 샘플의 원심분리 또는 와류교반은 FRα의 수준을 측정하기 전에 수행할 수 있다.
실시예 4. 전기화학발광 면역분석( ECLIA )에 의해 측정된 난소암을 앓는 사람 피검체 및 난소암을 앓지 않는 사람 피검체 기원의 원심분리된 뇨 샘플에서의 FR α 수준의 측정.
실시예 3의 결과를 기준으로, 피검체에서 FRα 수준을 평가하기 위한 분석은 원심분리 단계를 도입하기 위해 변형시켰다. FRα 수준은 난소암을 앓는 피검체 그룹 및 정상의 여성 대조군 피검체 그룹을 포함하는, 실시예 1에 사용된 동일한 샘플에 대해 측정하였다.
재료 및 방법
사용된 방법은 뇨 샘플을 1분 동안 10000 x g로 원심분리하고, 이어서 수득한 상청액을 반응 완충액에서 1:51로 희석시키는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
결과
표 7은 난소암에 걸린 피검체 및 건강한 여성 대조군 피검체 기원의 원심분리된 뇨 샘플 및 원심분리되지 않은 뇨 샘플에서의 FRα의 수준을 나타낸다.
Figure pct00012
표 7에 제시된 결과에 따라, 이전에 표 6에서 입증된 바와 같이 원심분리는 일부 샘플에서 FRα 수준의 측정에 있어서 감소를 유도하였다.
실시예 5: 면역블롯팅에 의한 뇨 침강물에서의 FR α의 검출
실시예 3 및 실시예 4에 나타낸 결과를 토대로, 뇨 침강물/침전물 중의 FRα의 존재 또는 부재는 웨스턴 블롯팅을 사용하여 평가하였다.
재료 및 방법
FRα의 농도가 각각 18,747 pg/mL 및 145,564 pg/mL로 측정된 2명의 난소암 환자 기원의 뇨 샘플(하기 표 10 참조)을 하기의 과정에 적용하였다. 대조군 샘플은 HeLa 세포 용해물 10㎍, 간 조직 용해물 20㎍, 및 난소암 조직 용해물 20㎍으로 이루어졌다.
ㆍ 900 ㎕의 뇨를 10000g에서 2분 동안 원심분리하였고,
ㆍ 상청액은 제거하였고,
ㆍ 잔류하는 펠렛은 15㎕의 PAGE 샘플 완충액(292mM LDS를 함유함)에 용해시키고, 이어서 10분 동안 70℃에서 비등시켰고,
ㆍ전체 샘플(대략 20 ㎕)은 NuPAGE 비스-트리스 겔(Invitrogen) 상에 로딩하였고,
ㆍ전기영동 후, 단백질을 PVDF 막으로 이동시켰고,
ㆍ 차단을 위해 1% 스킴 밀크/0.05% Tween 20/PBS를 첨가하였고,
ㆍ 상기 막을 0.05% Tween 20/PBS로 세척하였고,
ㆍ 2 μg/ml로 0.5ml의 모노클로날 항체 548908(R&D System)를 첨가하고 실온에서 60분 동안 항온처리하였고,
ㆍ 상기 막은 0.05% Tween 20/PBS로 세척하였고,
ㆍ 10mL의 항-마우스 IgG-HRP (DAKO p0447, 1:2000)를 첨가하고 60분 동안 항온처리되게 하였고,
ㆍ 상기 막은 0.05% Tween 20/PBS로 세척하였고,
ㆍ Pierce ECL 기질을 상기 막에 첨가하였고,
ㆍ 상기 막을 기질로부터 제거하고 이어서 LAS-3000(FUJIFILM) 시스템을 사용하여 이미지화하였다.
결과
수득한 면역블롯은 도 3에 나타낸다. 상기 도면에서, 레인 1 내지 5는 하기의 공급원으로부터 검출된 FRα에 상응한다:
(1) 18,747 pg/mL의 측정된 FRα 수준을 갖는 난소암 환자 기원의 뇨
(2) 145,564 pg/mL의 측정된 FRα 수준을 갖는 난소암 환자 기원의 뇨
(3) HeLa 세포 용해물: 10 μg
(4) 간 조직 용해물: 20 μg
(5) 난소암 조직 용해물: 20 μg
웨스턴 블롯에서 레인 6은 분자량 마커를 나타내고 레인 1, 2, 3 및 5에서 관찰된 밴드가 FRα에 대해 예상된 분자량으로 이동함을 입증한다.
레인 3 및 5는 양성 대조군 샘플이고 레인 4는 음성 대조군 샘플이다. 레인 1 상의 희미한 밴드 및 레인 2 상의 명백한 밴드는 FRα가 웨스턴 블롯팅에 의해 난소암 환자의 뇨 침강물에서 검출될 수 있음을 입증한다.
실시예 6. 전기화학발광 면역분석( ECLIA )에 의한 구아니딘-처리된 정상 사람 뇨 샘플에서의 FRα 수준의 측정.
원심분리가 FRα 수준을 감소시키는 실시예 4의 결과 및 원심분리로부터 수득된 뇨 침강물이 면역반응성 FRα를 함유하는 것으로 나타난 실시예 5의 결과를 토대로, 뇨의 침강물을 가용화시켜 보다 정량적이고 정확한 FRα의 측정을 수득하기 위한 방법이 모색되었다.
이와 관련하여, FRα 수준을 평가하기 전에 구아니딘을 사용한 정상의 여성 뇨 샘플의 처리를 시도하였다.
사용된 상기 방법은 뇨 샘플이 완충액(PBS) 중의 6M 구아니딘 또는 단독의 완충액과 1:1의 비율로 혼합된 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 이어서, 상기 뇨 샘플은 반응 완충액에 1:51로 희석시켰다.
상기 분석의 결과는 표 8에 나타낸다.
Figure pct00013
상기 실험의 결과는 구아니딘이 FRα 측정을 방해하지 않음을 지적한다. 순수한 항원 대조군(Std Ag)에 대해 나타낼 수 있는 바와 같이, 상기 구아니딘 처리 및 후속적 희석 방법은 FRα의 측정에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는다. 추가로, 평가된 모든 3개의 뇨 샘플에서, FRα의 수준은 구아니딘으로 처리되지 않은 샘플에 비해 구아니딘으로 처리된(가용화된) 샘플에서 보다 높음이 주지될 것이다.
뇨 샘플의 구아니딘 전처리의 신뢰도는 추가로 3개의 샘플을 구아니딘에 노출시키고 각각의 구아니딘 처리된 샘플의 FRα 농도를 ECLIA 분석을 사용하여 3회 측정함에 의해 평가하였다. 상기 결과는 하기 표 9에 나타낸다:
Figure pct00014
상기 제시된 바와 같이, 상기 결과는 FRα 분석 전에 뇨의 구아니딘 처리가 매우 낮은 CV와 함께 일관된 FRα 농도의 측정을 제공함을 지적한다.
실시예 7. 전기화학발광 면역분석( ECLIA )에 의한 측정시 난소암을 앓는 사람 피검체 및 난소암을 앓지 않는 사람 피검체 기원의 구아니딘 처리된 뇨 샘플에서의 FRα 수준의 측정.
구아니딘 처리가 FRα 분석을 방해하지 않는 것으로 나타난 실시예 6의 결과를 토대로, 변형된 분석 프로토콜을 사용하여 실시예 1에서 난소암을 앓는 피검체 및 난소암을 앓지 않는 피검체 기원의 뇨 샘플에서의 FRα를 측정하였다.
하기의 분석 프로토콜을 사용하였다:
재료 및 방법
사용된 상기 방법은 뇨 샘플이 6M 구아니딘 완충액과 1:1의 비율로 혼합되고 후속적으로 반응 완충액에 1:26으로 희석된 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
결과
표 10은 난소암에 걸린 피검체 및 건강한 여성 대조군 피검체 기원의 구아니딘 처리된 뇨 샘플에서의 FRα의 수준을 나타낸다.
Figure pct00015
도 4는 구아니딘 처리와 함께 변형된 프로토콜을 사용하여, 난소암에 걸린 피검체 및 정상의 여성 대조군 피검체의 뇨에서의 FRα 수준의 분포를 보여준다. 그룹 간의 통계학적으로 유의적인 차이가 관찰되었다. 표 11은 상기 결과를 요약한다.
Figure pct00016
상기 실험으로부터의 데이터를 사용하여, 수용자 작동 특징(ROC) 분석을 수행하였다. 도 5는 뇨를 구아니딘으로 처리한 후 뇨에서의 FRα 수준의 ECLIA 측정의 민감성 및 특이성의 ROC 곡선을 보여준다. AUC는 곡선 이하 면적이고, 이는 대조군 피검체로부터 난소암을 분리하는데 있어서 시험의 정확도를 측정한다.
9100 pg FRα/mL의 임의의 컷오프 값을 사용했을 때, 상기 AUC는 표 12에 나타낸 바와 같이, 70%의 양성 예측 값 및 80%의 음성 예측 값과 함께 0.70이었다. 상기 컷오프 값을 사용했을 때, 19명의 난소암 환자 중 15명은 FRα의 농도가 9100pg/mL 초과이고 10명의 정상의 피검체 중 8명은 FRα의 농도가 9100pg/mL 미만이었다.
Figure pct00017
실시예 8: 전기화학발광 면역분석( ECLIA )에 의해 구아니딘 처리된 뇨 샘플에서 측정된 FR α 농도의 크레아티닌 보정
FRα의 농도는 난소암 환자 및 정상의 여성 대조군 기원의 구아니딘 처리된 뇨 샘플의 ECLIA를 사용하여 이전에 측정하였다 (실시예 7, 표 10 참조). 여기서, 이들 FRα의 농도는 사구체 여과율에 대해 정상화하기 위해 뇨 크레아티닌 수준에 대해 보정하였다. 상기 수득한 값은 ROC 분석에 적용하였다.
방법
상기 뇨 크레아티닌 수준은 보건복지부 장관에 의해 승인된 키트, 결정기 L CRE(Kyowa Medex, Japan)에 의해 측정하였다. 뇨 FRα 농도에 대해 상기 보정된 값은 다음과 같이 계산하였다:
뇨 FRα 크레아티닌 보정(ng/g)
= (뇨 FRα (ng/L) x 1000)/(뇨 크레아티닌 (mg/dL) xlO)
= (뇨 FRα (ng/L) x 1000)/뇨 크레아티닌 (mg/L)
= 뇨 FRα (ng/L)/뇨 크레아티닌 (g/L)
= 뇨 FRa (ng)/뇨 크레아티닌 (g)
또는
= 1/1000 x 뇨 FRα (㎍)/뇨 크레아티닌 (g)
결과
표 13은 수득한 크레아티닌-보정된 FRα 수준을 제공한다.
Figure pct00018
도 6은 뇨 크레아티닌 수준에 대한 보정 후 난소암(OC) 및 정상의 여성 대조군 피검체에서의 FRα 수준의 분포를 보여준다. FRα의 크레아티닌-보정된 수준에서 난소암 환자와 대조군간에는 통계학적으로 유의적인 차이가 있다(p=0.007).
난소암 및 정상의 대조군 피검체에 대한 요약 데이터는 표 14에 제공된다.
Figure pct00019
상기 크레아티닌-보정된 FRα 수준은 추가로 ROC 분석에 적용하였다. 상기 ROC 곡선은 도 7에 나타낸다. 표 15는 크레아티닌-보정된 시험의 다양한 컷오프 값에 대한 민감성, 특이성 및 곡선 이하 면적(AUC)을 제공한다.
Figure pct00020
이전에 주지된 바와 같이, 난소암 환자의 뇨와 건강한 여성 대조군 피검체 기원의 뇨 간에는 명백한 차이가 있다.
실시예 9: 효소 면역분석(EIA) 및 이의 최적화
1. 효소 면역분석( EIA )
미세역가 플레이트에 항체 피복
상기 모노클로날 항-엽산 수용체 알파 항체는 다음과 같이 미세역가 플레이트의 표면상에 피복하였다(Nunc-immunoplate, Thermo Scientific). 50nmol/L의 카보네이트 완충액(pH 9.4) 중에 100㎕의 항체(280nm에서 흡광도 0.02)는 웰에 분배하고 16시간 동안 4℃에서 피복시켰다. 이어서, 상기 미세플레이트는 0.05% Tween20 (PBS-T)을 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. 이후, 20% 정상의 토끼 혈청(pH 7.8)을 함유하는 0.15 mL의 PBS는 웰에 분배하여 비결합된 표면을 차단시킴에 이어서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 최종적으로, 상기 미세플레이트는 PBS-T로 2회 세척하였다. 상기 항체 피복된 플레이트는 건조시키고 사용할 때까지 알루미늄 백에서 4℃에 유지시켰다.
비오틴 표지화
비오틴 표지화는 EZ-링크 설포-NHS-LC-LC-비오틴 (제품 번호. 21338, Thermo Scientific)에 대한 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, PBS 0.4mL 중의 1 mg의 항체는 0.13mL의 10mM 설포-NHS-LC-LC-비오틴과 혼합하고, 항체 대 비오틴의 초기 몰비는 1:20이었고, 이어서 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 상기 비오틴 커플링된 항체는 PD-10 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 겔 여과하고 PBS로 용출시켜 비-반응된 비오틴을 제거함에 의해 정제하였다. 비오틴 혼입 수준을 측정하기 위해, 상기 EZ 비오틴 정량 키트(제품 번호. 28005, Thermo Scientific)를 사용하였다. 상기 비오틴 표지된 항체는 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
2단계 면역분석
제1 반응에 대해, 40㎕의 혈장 또는 표준 항원, 및 10% NRS, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA-2Na, 0.01% Tween 20(pH 7.5)(반응 완충액)을 함유하는 60㎕의 50mM HEPES 완충액을 항체 피복된 웰에 분배하였다. 상기 플레이트는 4℃에서 18시간 동안 항온처리하고, 이어서 PBS-T로 5회 세척하였다. 제2 반응을 위해, 반응 완충액 중의 100㎕의 10 μg/mL 비오틴 표지된 항체를 분배하였다. 상기 플레이트는 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, 후속적으로 PBS-T로 5회 세척하였다. 100 ㎕의 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 스트렙타비딘(Pierce)을 분배하였다. 실온에서 30분 항온처리한 후, 상기 플레이트는 PBS-T로 5회 세척하였다. 최종적으로, 발색을 위해, 100 ㎕의 TMB 용액 (KPL)을 분배하고 암실에서 15분 동안 유지시켰다. 100㎕의 1N HCl을 첨가함에 의해 발색을 종료시킨 후, 450nm에서의 흡광도는 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 모든 세척 단계는 자동-플레이트 세척기(AMW-8, BioTec, Japan)로 자동으로 수행하였고 모든 EIA 측정은 2회 수행하였다.
도 8은 포획 항체로서 MOV18을 사용하고 검출 항체로서 비오티닐화된 MORAb-003을 사용하는 EIA 분석을 도시한다.
2. EIA 과정의 최적화
상기 EIA 과정은 부분적으로 상기 과정을 최적화하기 위해 디자인된 하기의 실험을 기준으로 도래하였다.
첫번째로, 아비딘-HRP, 비오틴 표지된 항체 및 HRP 표지된 항체를 비교하였다. HRP 표지된 항체와 비교하여, 비오틴 표지된 항체 및 아비딘-HRP는 보다 높은 시그날을 제공하고, 따라서 비오틴 표지된 항체 및 아비딘-HRP를 사용하였다.
두번째로, 한 단계 및 두 단계 항온처리 과정을 비교하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 두 단계 항온처리 과정은 보다 높은 시그날을 생성하였고 따라서 사용하였다.
세번째로, 제2 항온처리 시간을 최적화하기 위해, 1 내지 4시간의 항온처리 시간을 비교하였다. 상기 결과는 1시간 항온처리 시간이 최고의 시그날 대 노이즈 비율을 제공하고 따라서, 후속적으로 1시간의 항온처리 시간을 사용했음을 지적했다.
네번째로, 비오틴 표지된 항체의 작동 농도, HRP 표지된 항체 및 샘플 용적을 최적화하기 위해, 다양한 농도를 EIA 분석의 상기 기재에 제시된 바와 같이 사용하였다. 최적의 값 농도는 상기되어 있다.
실시예 10: 전기화학발광 면역분석( ECLIA ) 및 효소 면역분석( EIA )을 사용한 사람 혈장에서의 FR α의 비교
FRα의 수준은 실시예 1 및 도 1에 기재된 전기화학발광 분석(ECLIA)(포획 항체로서 MORAb-003 및 표지된 검출기 항체로서 루테늄(Ru)-표지된 MOV-18을 사용함) 및 실시예 9 및 도 8에 기재된 효소 면역분석(EIA)을 사용하여 난소암 환자 및 건강한 여성 대조군으로부터 채취한 사람 혈장 샘플에서 측정하였다. 2개의 분석에서, 40㎕의 혈장을 분석하였다.
표 16은 EIA 및 ECLIA를 사용하여 측정된 바와 같이 난소암 및 정상의 대조군 피검체에서 FRα의 혈장 수준을 보여준다.
Figure pct00021
단지 예외와 함께, 피검체 모두에 대한 결과는 EIA를 사용하여 혈청에서 검출된 FRα의 농도가 ECLIA를 사용하여 검출된 수준 미만임을 지적했고, 포맷된 바와 같은 EIA 분석이, 포획(MOV-18) 및 검출기 항체(MORAb-003)의 특정 조합이 사용되는 경우의 ECLIA 분석 만큼 민감하지 못함을 입증한다. 따라서, 다른 유형의 항체를 사용한 추가의 실험은 보다 민감한 EIA 과정을 개발하기 위해 수행하였다.
실시예 11: 사람 혈장에서 FR α의 EIA 측정에 대한 상이한 유형의 항체의 실행가능성
1. 항체 조합의 예비 실험
다양한 조합의 포획/검출기 항체를 고려하였다. 예비 실험은 표 17에 제시된 결과를 제공하였다.
Figure pct00022
2. 다양한 항체 조합을 사용한 EIA 분석의 비교 및 상기 ECLIA 분석에 대한 비교
난소암 환자 및 정상의 건강한 여성 대조군에서의 FRα의 수준은 포획 및 비오틴 표지된 항체의 상이한 조합과 함께 효소 결합된 면역흡착 분석(EIA)을 사용하여 측정하고 ECLIA 분석을 사용하여 측정된 FRα의 수준과 비교하였다.
재료 및 방법
상기 ECLIA 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같고 도 1에 도시되어 있다(포획 항체로서 MORAb-003 항체 및 표지된 검출기 항체로서 Mov-18 항체를 사용함). 상기 EIA 방법은 도 10에 도시된 바와 같이 3개의 상이한 조합의 포획/검출기 항체가 사용되는 것을 제외하고는 실시예 9에 기재된 바와 같다: MOV18/MORAb-003, 548908/MORAb-003 및 6D398/MORAb-003. 상기 항체 548908 및 6D398은 시판되고 있다. 상기 548908 항체는 제조사(R&D Systems (North Las Vegas, NV))로부터 수득하였고 상기 6D398 항체는 제조사(US Biological (Swampscott, MA 01907))로부터 수득하였다.
결과
EIA 및 ECLIA 방법을 사용하여 측정된 FRα(pg/ml)의 농도는 표 18에 나타낸다. 추가로, 다양한 조합의 포획/검출기 항체를 사용하여 EIA에 의해 측정된 FRα(pg/ml)의 농도는 도 11에서 그래프로 도시한다.
Figure pct00023
표 18에서의 데이터는 EIA와 함께 54908-MORAb-003 조합을 사용한 FRα 수준의 측정이 ECLIA 분석을 사용하여 수득된 결과와 가장 유사한 결과를 유도함을 지적한다. 정량적 분석을 수행하여 상기 관찰을 확인하였다. 추가로, 이들 데이터는 FRα의 검출이 사용되는 항체 및 항체 조합에 고도로 의존함을 입증한다. 따라서, 상이한 항체 조합은 생물학적 유체에서의 FRα의 측정을 위해 사용될 수 있다. 추가로, EIA 및 ECLIA 분석 포맷으로부터 수득된 데이터는 유사하기 때문에, 다양한 분석 포맷이 FRα의 측정을 위해 사용될 수 있다.
EIA 방법을 위해 사용되는 포획 및 검출 항체의 3개의 조합 각각에 대해, 퇴행 분석을 수행하였고 EIA로 측정된 FRα(pg/ml)의 농도는 ECLIA 분석으로 측정된 농도와 상호관련이 있었다. 상기 분석 결과는 표 19 및 도 12에 나타낸다.
Figure pct00024
548098-MORAb-003 포획-검출 조합을 사용한 EIA에 대한 결과는 ECLIA에 대한 결과와 고도로 상호관련이 있었다(r=0.96).
실시예 12: 난소암 환자 기원의 샘플에서 EIA 및 ECLIA 에 의해 측정된 FR α의 혈장 수준
혈청 FRα 수준의 측정은 ECLIA 및 EIA를 사용하여 난소암 환자(n=17) 및 정상 대조군(n=35) 그룹에서 측정하였다. 상기 EIA 측정을 위해, 548908 포획/MORAb-003 검출기 항체 조합을 사용하였다. 상기 EIA 과정은 실시예 9에 기재된 바와 같다. 상기 ECLIA 과정은 실시예 1에 기재된 바와 같다. 상기 결과는 표 20에 나타낸다.
Figure pct00025
Figure pct00026
도 13은 EIA를 사용하여 측정된 바와 같은 난소암을 앓는 피검체 및 정상의 여성 대조군 피검체에서 혈장 FRα 농도의 분포를 보여준다.
표 21은 EIA를 사용하여 측정된 바와 같이 난소암 및 정상의 여성 대조군 피검체에서 혈장 FRα 농도에 대한 요약 기재 통계를 보여준다.
Figure pct00027
도 14는 추가로 EIA 및 ECLIA를 사용하여 측정된 FRα 혈장 농도 간의 상호관계를 도시한다. 상기 상호관계는 높다 (r=0.95).
실시예 13. 전기화학발광 면역분석( ECLIA )에 의해 측정된 바와 같이 폐암 환자 및 난소암 환자 기원의 일치된 뇨 및 혈청 샘플에서의 FRα 수준의 측정
FRα 수준은 샘플이 동일한 환자로부터 채취된, ECLIA를 사용한 폐암 및 난소암 환자 기원의 일치된 뇨 및 혈청 샘플에서 측정하였다. 혈청과 뇨 FRα 수준 간의 상호관계를 또한 측정하였다.
재료 및 방법
사용된 ECLIA 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같다. 구아니딘은 실시예 6에 기재된 바와 같은 뇨 침강물을 가용화시키기 위해 사용하였다.
결과
폐암 및 난소암 환자 유래의 혈청 및 뇨의 ECLIA 분석의 결과는 표 22에 나타낸다.
폐암 환자의 혈청 및 뇨 FRα 수준에 대한 요약 데이터는 표 23에 나타낸다.
Figure pct00029
난소암 환자의 혈청 및 뇨 FRα 수준에 대한 요약 데이터는 표 24에 나타낸다.
Figure pct00030
도 15는 동일한 환자로부터 채취한 일치된 혈청 및 뇨 샘플에서의 FRα 수준의 ELICA 측정 간의 상호관계를 보여준다. 폐암 환자에 대한 상호관계는 r=0.24(상부 패널)이었고 난소암 환자에 대한 상호관계는 r=-0.76(하부 패널)이었다.
이들 데이터는 특히 폐암 환자에 대해 나타낸 바와 같이 뇨와 혈청에서 측정된 FRα 농도 간의 상호관계의 상대적 부재를 입증한다. 추가로, 이들 데이터는 FRα가 기본적으로 정상의 대조군에 비해 폐암 환자의 혈청에서의 배경 수준을 초과하여 검출가능하지 않는 반면 FRα는 상기 환자의 뇨에서 검출가능함을 입증한다.
실시예 14. 난소암을 갖는 환자, 폐암을 갖는 환자 및 정상 대조군 기원의 혈청 샘플에서의 FRα의 수준 평가
난소암을 갖는 환자, 폐암을 갖는 환자 및 정상 대조군의 혈청중에서 FRα 수준을 평가하였다. 혈청 FRα 수준은 2개의 상이한 쌍의 포획-검출 항체와 함께 ECLIA를 사용하여 평가하였다: 9F3이 포획 항체이고 24F12가 검출 항체인 쌍 1, 및 26B3이 포획 항체이고 19D4가 검출 항체인 쌍 2.
상기 FRα 쌍은 완전한 교정기 곡선을 사용하여 시험하였고 196명의 개별 혈청은 1:4로 희석시켰다. 하나의 실험에서, 26B3은 플레이트 로트상에서 CR 가공 후 포획 항체로서 사용하였고(75 μg/mL, +B, +T) 19D4는 1.0㎍/mL에서 검출 항체로서 사용하였다. 또 다른 실시형태에서, 9F3은 포획 항체로서 사용하고 24F12는 1.0㎍/mL에서 검출 항체로서 사용하였다. 각각은 13.3의 표지 대 단백질 비(L/P)를 사용하여 CR 가공하였다(로트 10070). 희석제 100 (Meso Scale Discovery, Gakbersburg, Maryland) + 사람 항-마우스 항체(HAMA) +-mIgG는 샘플 및 교정기에 대해 사용하였다. 희석제 3 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)은 검출을 위해 사용하였다.
하기 프로토콜은 ECLIA를 위해 사용하였다. 샘플은 50㎕/웰로 첨가하였다. 상기 샘플은 2시간 동안 진탕시키고, 이어서 세제 Tween 20(PBST)과 함께 인산 완충 식염수(PBS) 용액으로 세척하였다. 상기 검출 항체는 25㎕/웰로 첨가하였다. 상기 샘플은 2시간동안 진탕시키고, 이어서 PBST로 세척하였다. 최종적으로, 상기 샘플의 전기화학발광(ECL) 방출은 2X MSD® 완충액 T로 판독하였다.
상기 결과는 하기 표 25에 나타낸다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
이전의 데이터를 기준으로, 9F3, 2412, 26B3 및 19D4 항체가 피검체로부터 유도된 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈청에서의 FRα의 수준을 검출하는데 유용함은 자명하였다. 더욱이, (i) 포획 항체로서 9F3 및 검출 항체로서 24F12 및 (ii) 포획 항체로서 26B3 및 검출 항체로서 19D4의 특정 조합은 생물학적 샘플에서의 FRα의 수준을 평가할 수 있고 특히 효과적이었다.
실시예 15. 3개의 상이한 검출 및 포획 항체 쌍을 사용하여 뇨에서의 FR α의 수준 평가
뇨 샘플에서의 FRα 수준을 검출하는데 있어서 3개의 항-FRα 항체 쌍의 능력을 평가하였다. 사용된 상기 항체 쌍은 다음과 같다: (1) 검출 항체로서 26B3 및 포획 항체로서 9F3, 및 (2) 검출 항체로서 24F12 및 포획 항체로서 9F3.
방법
2개의 항체쌍은 완전한 교정기 곡선으로 시험하였고 뇨는 6M 구아니딘, 3M 구아니딘 또는 PBS 대조군에서 2분 동안 1:1 희석으로 전처리하였다. 하기의 뇨 샘플을 시험하였다: 3개의 사람 뇨 풀은 1:80으로 희석시키고 5개의 사람 개별 뇨는 1:80(1명의 남성, 4명의 여성)으로 희석시켰다.
플레이트는 웰당 하나의 포획으로서 4스팟 STD상에서 150μg/mL으로, +B, +T로 생도팅하였다(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). 검출은 1 μg/mL로 수행하였다. 희석제 100 + HAMA + mIgG는 샘플 및 교정기에 대해 사용하였다. 희석제 3은 검출을 위해 사용하였다. 희석제는 제조원(Meso Scale Discovery)으로부터 입수한 시판되는 희석제이다.
하기의 프로토콜은 ECLIA에 대해 사용하였다. 샘플은 50㎕/웰로 첨가하였다. 상기 샘플은 2시간 동안 진탕시켰다. 샘플을 세제 Tween 20(PBST)과 함께 인산 완충 식염수(PBS) 용액으로 세척하였다. 상기 검출 항체는 25㎕/웰로 첨가하였다. 상기 샘플은 2시간 동안 진탕시키고, 이어서 PBST로 세척하였다. 최종적으로, 상기 샘플의 전기화학발광(ECL) 방출은 2X MSD 완충액 T로 판독하였다.
이들 실험 결과는 표 26-27에 나타낸다.
Figure pct00041
Figure pct00042
이전의 데이터를 기준으로, 9F3, 2412, 26B3 및 19D4 항체가 피검체로부터 유도된 생물학적 샘플에서의 FRα의 수준을 검출하는데 유용함은 자명하였다. 더욱이, (1) 검출 항체로서 24F12 및 포획 항체로서 9F3 및 (2) 검출 항체로서 24F12 및 포획 항체로서 9F3의 조합은 생물학적 샘플에서의 FRα의 수준을 평가할 수 있고 특히 효과적이었다.
상기된 프로토콜에 따르고 동일한 2쌍의 항체를 사용하는 제2 세트의 실험은 1:80으로 희석된 4개의 여성 사람 개별 뇨를 사용하여 수행하였다. 상기 뇨는 3M 구아니딘 또는 PBS 대조군에서 2분 동안 1:1 희석액으로 전처리하였다. 상기 결과는 표 28-29에 나타낸다.
Figure pct00043
Figure pct00044
상기 제2 세트의 실험 결과는 추가로 제1 세트의 실험 결과를 확인시켜주고 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준이 ECLIA 분석과 같은 분석을 사용하고 26B3, 9F3, 24F12 항체를 사용하여, 예를 들면 뇨중에서 신뢰할 수 있을 정도로 평가될 수 있음을 입증한다. 추가로, 상기 결과는 상기 분석이 FRα에 결합하는 검출 및 포획 항체(예를 들면, 검출 항체로서 26B3 및 포획 항체로서 9F3, 및 검출 항체로서 24F12 및 포획 항체로서 9F3) 쌍을 사용하여 FRα를 효과적으로 검출할 수 있음을 입증한다.
실시예 16. 혈청 및 혈장에서의 FR α 수준의 평가
FRα의 수준은 2개의 개별 날짜에 혈청 및 혈장 샘플에서 평가하였다. 샘플이 유래된 피검체는 정상의 피검체 또는 난소암 또는 폐암을 갖는 환자이다.
FRα 수준을 평가하기 위한 프로토콜은 상기 실시예 14에 제시된 바와 동일하다. FRα 수준을 평가하기 위해 사용되는 항체의 쌍은 또한 실시예 14에 기재된 바와 동일하고, 즉, 9F3이 포획 항체이고 24F12가 검출 항체인 쌍 1과 26B3이 포획 항체이고 19D4가 검출 항체인 쌍 2이다.
상기 결과는 표 30에 제공된다.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
이전의 데이터를 기준으로, 9F3, 2412, 26B3 및 19D4 항체가 피검체로부터 유도된 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈청 또는 혈장에서의 FRα의 수준을 검출하는데 유용함은 자명하였다. 더욱이, (i) 포획 항체로서 9F3 및 검출 항체로서 24F12 및 (ii) 포획 항체로서 26B3 및 검출 항체로서 19D4의 특정 조합은 생물학적 샘플에서의 FRα의 수준을 평가할 수 있고 특히 효과적이었다.
쌍 1 및 쌍 2 둘 다를 사용하여 수행된 분석에 대해, 혈청과 혈장 FRα 수준 간에는 높은 상호관련이 있었다. 도 16은 쌍 1을 사용하여 수행된 분석을 위한 혈청 대 혈장 FRα 수준에서 상호관련성을 보여준다(실시예 16 참조). 상기 R2 값은 0.8604이었다. 도 17은 쌍 2를 사용하여 수행된 분석을 위한 혈청 대 혈장 FRα 수준에서 상호관련성을 보여준다(실시예 16 참조). 상기 R2 값은 0.9766이었다.
혈청 및 혈장 샘플 둘 다에 대해, 쌍 1 및 쌍 2를 사용하여 측정된 FRα 수준 간에는 높은 상호관련성이 있었다. 도 18은 쌍 1 대 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대해 혈청 FRα 수준에서 상호관련성을 보여준다(실시예 16 참조). 상기 R2 값은 0.9028이었다. 도 19는 쌍 1 대 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대해 혈장 FRα 수준에서 상호관련성을 보여준다(실시예 16 참조). 상기 R2 값은 0.8773이었다.
상기 결과는 또한 상이한 날짜에 측정된 FRα 수준 간에는 높은 상호관련성이 있음을 보여주었다. 도 20은 쌍 2를 사용하여 수행된 분석에 대해 혈청 FRα 수준에서 날짜간 상호관련성을 보여준다. 상기 R2 값은 0.9839이었다.
등가물
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 상기 등가물은 하기의 청구항에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 종속항에 기재된 실시형태의 임의의 조합은 본 발명의 범위내에 있는 것으로 고려된다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
SEQUENCE LISTING <110> MORPHOTEK INC. <120> FOLATE RECEPTOR ALPHA AS A DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC MARKER FOR FOLATE RECEPTOR ALPHA-EXPRESSING CANCERS <130> 118557-01420 <150> US 61/508,444 <151> 2011-07-15 <150> US 61/410,497 <151> 2010-11-05 <160> 90 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Leu Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Met Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 His Gly Asp Asp Pro Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 61 cagcagtaca gtggttaccc actcacg 27 <210> 62 <211> 323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 62 ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggaa aaggtcacca tgacctgcag ggccagctca 60 actgtaagtt acagttactt gcactggtac cagcagaagt caggtgcctc cccccaactc 120 tggatttatg gcacatccaa cttggcttct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 180 tctgggacct cttactctct cacaatcagc agtgtggagg ctgaagatgc tgccacttat 240 tactgccagc agtacagtgg ttacccactc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg 300 aaacgggctg atgctgcacc aac 323 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 63 agtggttatt actggaac 18 <210> 64 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 64 tacataaagt ccgacggtag caataattac aacccatctc tcaaaaat 48 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 gagtggaagg ctatggacta c 21 <210> 66 <211> 389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 66 gagtcaggac ctggcctcgt gagaccttct cagtctctgt ctctcacctg ctctgtcact 60 ggctactcca tcaccagtgg ttattactgg aactggatcc ggcagtttcc aggaagcaga 120 ctggaatgga tgggctacat aaagtccgac ggtagcaata attacaaccc atctctcaaa 180 aatcgaatct ccatcactcg tgacacatct aagaaccagt ttttcctgaa gttgaattct 240 gtgactactg aggacacagc tacatatttc tgtacaaggg agtggaaggc tatggactac 300 tggggtcagg gaacctcagt caccgtctcc tcagccaaaa caacaccccc atcagtctat 360 ccactggccc ctgggtgtgg agatacaac 389 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of 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Claims (25)

  1. 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교(여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸다는 지표이다)하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가하는,
    피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 뇨, 혈청, 혈장 및 복수액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FRα-발현 암이 폐암, 중피종, 난소암, 신암, 뇌암, 자궁경부암, 비인두암, 두경부의 편평 세포 암종, 자궁내막암, 유방암, 방광암, 췌장암, 골암, 뇌하수체암, 결장직장암 및 갑상선 수질암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FRα-발현 암이 난소암인, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 FRα-발현 암이 폐암인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 FRα-발현 암이 비-소세포 폐암인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 비-소세포 폐암이 선암종인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 샘플에 FRα가 약 9500 pg/mL 초과, 약 10,000 pg/mL 초과, 약 11,000 pg/mL 초과, 약 12,000 pg/mL 초과, 약 13,000 pg/mL 초과, 약 14,000 pg/mL 초과, 약 15,000 pg/mL 초과, 약 16,000 pg/mL 초과, 약 17,000 pg/mL 초과, 약 18,000 pg/mL 초과, 약 19,000 pg/mL 초과, 또는 약 20,000 pg/mL 초과의 농도로 존재하는 것이 피검체가 난소암에 걸렸다는 것의 지표인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 FRα의 수준이,
    (a) MORAb-003 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (b) CDRH1로서 서열번호 1(GFTFSGYGLS), CDRH2로서 서열번호 2(MISSGGSYTYYADSVKG), CDRH3으로서 서열번호 3(HGDDPAWFAY), CDRL1로서 서열번호 4(SVSSSISSNNLH), CDRL2로서 서열번호 5(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 6(QQWSSYPYMYT)을 포함하는 항체;
    (c) MOV18 항체;
    (d) MOV18 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (e) 548908 항체;
    (f) 548908 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (g) 6D398 항체;
    (h) 6D398 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (i) 26B3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (j) CDRH1로서 서열번호 55(GYFMN), CDRH2로서 서열번호 56(RIFPYNGDTFYNQKFKG), CDRH3으로서 서열번호 57(GTHYFDY), CDRL1로서 서열번호 51(RTSENIFSYLA), CDRL2로서 서열번호 52(NAKTLAE) 및 CDRL3으로서 서열번호 53 (QHHYAFPWT)을 포함하는 항체;
    (k) 26B3 항체;
    (l) 19D4 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (m) CDRH1로서 서열번호 39(HPYMH), CDRH2로서 서열번호 40(RIDPANGNTKYDPKFQG), CDRH3으로서 서열번호 41(EEVADYTMDY), CDRL1로서 서열번호 35(RASESVDTYGNNFIH), CDRL2로서 서열번호 36(LASNLES) 및 CDRL3으로서 서열번호 37(QQNNGDPWT)을 포함하는 항체;
    (n) 19D4 항체;
    (o) 9F3 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (p) CDRH1로서 서열번호 31(SGYYWN), CDRH2로서 서열번호 32(YIKSDGSNNYNPSLKN), CDRH3으로서 서열번호 33(EWKAMDY), CDRL1로서 서열번호 27(RASSTVSYSYLH), CDRL2로서 서열번호 28(GTSNLAS) 및 CDRL3으로서 서열번호 29(QQYSGYPLT)를 포함하는 항체;
    (q) 9F3 항체;
    (r) 24F12 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체;
    (s) CDRH1로서 서열번호 47(SYAMS), CDRH2로서 서열번호 48(EIGSGGSYTYYPDTVTG), CDRH3으로서 서열번호 49(ETTAGYFDY), CDRL1로서 서열번호 43(SASQGINNFLN), CDRL2로서 서열번호 44(YTSSLHS) 및 CDRL3으로서 서열번호 45(QHFSKLPWT)를 포함하는 항체;
    (t) 24F12 항체;
    (u) LK26HuVK(서열번호 13); LK26HuVKY(서열번호 14); LK26HuVKPW(서열번호 15); 및 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 경쇄를 포함하는 항체;
    (v) LK26HuVH(서열번호 17); LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18); LK26HuVH SLF(서열번호 19); LK26HuVH I,I(서열번호 20); 및 LK26KOLHuVH(서열번호 21)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 영역 중쇄를 포함하는 항체;
    (w) 중쇄 가변 영역 LK26KOLHuVH(서열번호 21) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체;
    (x) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH SLF(서열번호 19) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체; 및
    (y) 중쇄 가변 영역 LK26HuVH FAIS,N(서열번호 18) 및 경쇄 가변 영역 LK26HuVKPW,Y(서열번호 16)를 포함하는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 측정되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체가 뮤린 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 이특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab'2, ScFv, SMIP, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), 버사바디(versabody), 나노바디(nanobody), 및 도메인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체가 표지되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체가 방사성-표지, 비오틴-표지, 발색단-표지, 형광단-표지, ECL 표지 및 효소-표지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표지로 표지되는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, FRα의 수준이 웨스턴 블롯 분석, 방사선면역분석, 면역형광측정, 면역침전, 평형 투석, 면역확산, 용액상 분석, 전기화학발광 면역분석(ECLIA) 및 ELISA 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기술을 사용함에 의해 측정되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 대조군 샘플이 건강한 피검체에서의 FRα의 표준화된 대조군 수준을 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 구아니딘으로 처리하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 희석하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 샘플에서의 FRα의 수준을 측정하기 전에 상기 샘플을 원심분리하거나 와류교반하거나 둘 다 행하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준이,
    (a) 고형 지지체에 고정화된 MOV18 항체 및 표지된 MORAB-003 항체;
    (b) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 24F12 항체;
    (c) 고형 지지체에 고정화된 26B3 항체 및 표지된 19D4 항체; 및
    (d) 고형 지지체에 고정화된 9F3 항체 및 표지된 26B3 항체
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 한 쌍의 항체와 상기 샘플을 접촉시킴으로써 평가되는, 방법.
  19. FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교(여기서, 상기 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 상기 암이 급속히 진행할 것이라는 지표이고, 상기 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 상기 암이 서서히 진행하거나 퇴행할 것이라는 지표이다)하고, 이에 의해 상기 피험체에서의 상기 FR- 발현 암의 진행을 평가하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가하는,
    FRα-발현 암에 걸린 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하는 방법.
  20. FRα-발현 암에 걸린 피검체를 적어도 4개의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시키는 방법으로서,
    상기 방법은,
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 기준으로 상기 피검체를 적어도 4개의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시키는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 FRα의 수준은 상기 샘플을 FRα에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 평가하는,
    FRα-발현 암에 걸린 피검체를 적어도 4개의 암 치료 그룹 중 하나로 계층화시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 FRα-발현 암이 난소암이고, 상기 피검체가 I기, II기, III기, 또는 IV기의 난소암으로 계층화되는, 방법.
  22. 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체에서 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료의 효능을 모니터링하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    사전에 MORAb-003을 투여받은 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 증가는 MORAb-003 치료가 효과적이지 않다는 지표이고; 상기 대조군 샘플에서의 FRα 수준과 비교시 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준의 감소는 MORAb-003 치료가 효과적이라는 지표인,
    난소암 또는 폐암을 앓는 피검체에서 난소암 또는 폐암의 MORAb-003 치료의 효능을 모니터링하는 방법.
  23. 난소암 또는 폐암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 상기 대조군 샘플에서의 FRα 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것이라는 지표인,
    난소암 또는 폐암을 앓는 피검체가 MORAb-003을 사용한 치료에 반응할 것인지를 예측하는 방법.
  24. 난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 방법으로서,
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 샘플은 뇨 또는 혈청을 포함한다); 및
    상기 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 대조군 샘플에서의 FRα의 수준과 비교하는 단계(여기서, 상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 FRα의 수준과 상기 대조군 샘플에서의 FRα의 수준 사이의 차이는 상기 피검체가 난소암 또는 폐암에 걸렸다는 지표이다), 및
    치료학적 유효량의 MORAb-003을 상기 피검체에게 투여함에 의해 난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 단계를 포함하는,
    난소암 또는 폐암을 갖는 피검체를 치료하는 방법.
  25. 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하거나 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 키트로서,
    상기 피검체로부터 유도된 샘플에서의 세포에 결합되지 않은 엽산 수용체 알파(FRα)의 수준을 측정하기 위한 수단, 및
    상기 피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하거나 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 상기 키트의 사용 지침서를 포함하는,
    피검체가 FRα-발현 암에 걸렸는지를 평가하거나 피검체에서 FRα-발현 암의 진행을 평가하기 위한 키트.
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