BRPI0618092A2 - métodos "in vitro" para monitorar o estado de uma doença, de seleção de terapia e de diagnóstico de cáncer - Google Patents

Abstract

<b>MéTODOS IN VITRO PARA MONITORAR O ESTADO DE UMA DOENçA, DE SELEçãO DE TERAPIA E DE DIAGNóSTICO DE CáNCER<d>. A presente invenção refere-se a biomarcadores e ao uso de biomarcadores para a predição e prognóstico de câncer assim como o uso de biomarcadores para monitorar a eficácia de tratamento de câncer. Especificamente, essa invenção refere-se ao uso de VEGF como um biomarcador para inibidores de multiquinase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA PREDIÇÃO E PROGNÓSTICO DE CÂNCER E MONITORAMENTODE TERAPIA DE CÂNCER".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a biomarcadores e o uso de bio-marcadores para a predição e prognóstico de câncer assim como o uso debiomarcadores para monitorar a eficácia de tratamento de câncer. Especifi-camente, essa invenção refere-se ao uso de VEGF como um biomarcadorpara inibidores de multiquinases.

Antecedente da Invenção

Receptores do fator de crescimento endotelial vascular (VEG-FRs) e seus Iigantes1 fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs),desempenham papéis críticos na migração e proliferação de célula endoteli-al. O sistema VEGFR/VEGF inclui três receptores (VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3) e quatro Iigantes (VEGF-A, B, C, D e E e o fator de crescimentoplacentário). VEGF-A ainda consiste em quatro isoformas, VEGF-121, VEGF-165, VEGF-185 e VEGF-204, derivados da transcrição alternativa do genede VEGF-A. Os receptores são proteínas que atravessam a membranaplasmática com domínios de tirosina quinase intracelulares. Como com ou- tras proteínas quinases, a ativação das VEGFRs é um mecanismo-chave naregulação de sinais para a proliferação de célula endotelial e acredita-se queanormalidades de VEGFR/VEGF contribuem para angiogênese anormal emvárias doenças humanas tais como psoríase e malignidades.

Na embriogênese, o sistema VEGFR/VEGF é essencial para o desenvolvimento correto do sistema vascular. Em adultos, VEGFR/VEGF éimportante para a cura de lesões, inflamação e angiogênese.

Um ensaio não invasivo para níveis de VEGF circulante em pa-cientes antes do tratamento com fármaco é um adjunto potencialmente im-portante para tomar a decisão terapêutica. Embora ensaios de VEGF-A total tenham sido usados em seres humanos como um indicador de prognósticoda evolução da doença, até a presente descrição, nenhuma correlação entreos níveis de VEGF em pacientes antes da quimioterapia e a evolução dotratamento foi relatada. Portanto, VEGF pode servir como um indicador deprognóstico valioso e como um biomarcador para monitorar a eficácia dotratamento com um inibidor de multiquinase.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a biomarcadores e o uso de bio-marcadores para a predição e prognóstico de câncer assim como o uso debiomarcadores para monitorar a eficácia do tratamento de câncer. Especifi-camente, essa invenção refere-se ao uso de VEGF como um biomarcadorpara um inibidor de multiquinase (por exemplo, Sorafenib).

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se ao uso deimunoensaios quantitativos para medir níveis de proteína VEGF em fluidoscorporais humanos antes do tratamento com um inibidor de multiquinase(por exemplo, Sorafenib). Os ditos níveis são particularmente úteis como umindicador do potencial para pacientes com câncer tratados com um inibidorde multiquinase (por exemplo, Sorafenib) se beneficiar de tal terapia.

A medida de níveis pós-tratamento de VEGF, assim como a al-teração nos níveis de VEGF durante o curso do tratamento, pode ser usadaclinicamente como um auxílio terapêutico para selecionar a terapia do paci-ente, monitorar o estado de uma doença pré-neoplásica/neoplásica ém umpaciente e/ou monitorizar como um paciente com um paciente com doençapré-neoplásica/neoplásica está respondendo a uma terapia. Em uma moda-lidade, os níveis de VEGF podem ser usados para auxiliar na seleção daterapia do paciente e para tomar decisões sobre o método ótimo para a te-rapia do paciente.

Os níveis de VEGF podem ser medidos em amostras de pacien-te tais como, mas não limitadas a sangue, soro, plasma, urina, saliva, sê-men, exsudato mamário, fluido cérebro-espinhal, lágrimas, escarro, muco,linfa, citosóis, ascite, efusões pleurais, fluido aminiótico, lavados vesicais elavados broncoalveolares.

Em outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de um imu-noensaio como um método para selecionar pacientes que têm possibilidadede se beneficiar de um tratamento com inibidor de multiquinase (por exem-pio, Sorafenib) pela medida dos níveis pré-tratamento de VEGF em amos-tras do paciente e avaliação da provável evolução com base em um nomo-grama de resultado de provável evolução do paciente versus níveis deVEGF.

Um método para monitorar o estado de uma doença associadacom uma via de VEGF ativada em um paciente pode ser ainda prognósticopara uma doença, em que os níveis de proteína VEGF total nas amostras dopaciente são indicativos de uma evolução de tratamento melhor ou pior parao paciente. O prognóstico pode ser uma evolução clínica selecionada a partirdo grupo que consiste em taxa de resposta (RR), resposta completa (CR),resposta parcial (PR), doença estável (SD), benefício clínico [incluindo res-posta completa (CR), resposta parcial (PR) e doença estável (SD)], tempopara progressão (TTP)1 sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevidaglobal (OS).

Esses métodos podem ser em formatos padrão, por exemplo,um imunoensaio na forma de um imunoensaio sanduíche, tal como um en-saio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou um ensaio equivalente.Esses imunoensaios podem usar anticorpos monoclonais, tais como anticor-pos monoclonais anti-VEGF. Além disso, o anticorpo monoclonal pode serbiotinilado.

Outra modalidade da invenção refere-se a um imunoensaioquantitativo para medir alterações seriadas nos níveis de proteína VEGF totalem amostras do paciente, como um método de seleção de terapia para um pa-ciente com uma doença, por exemplo, uma doença pré-neoplásica/neoplásica.

Como um exemplo, um de tais métodos de seleção de terapiacompreende as etapas de:

(a) detectar imunologicamente e quantificar o nível de proteínaVEGF total em uma mostra a partir de uma população de controle;

(b) detectar imunologicamente e quantificar o nível de proteínaVEGF total em uma amostra retirada de um paciente ao longo do tempo; e

(c) determinar se usar de terapia convencional e/ou terapia cominibidor de multiquinase (por exemplo, Sorafenib) para tratar o paciente ba-seado no nível de proteína VEGF nas amostras do paciente.

Por exemplo, se o nível de proteína VEGF em uma amostra dopaciente é descoberto estar acima de 70 pg/ml, a conclusão que poderia sertirada é de que o paciente tem uma doença direcionada por VEGF, e podeser tomada a decisão de usar a terapia com inibidor de multiquinase (porexemplo, Sorafenib) para tratar o paciente, tanto isolada como em conjuntocom uma ou mais terapias.

Uma terapia direcionada para a via de VEGF pode ser inibidoresde multiquinase, inibidores de tirosina quinase, bisaril uréias e inibidores an-tisenso de VEGFR-2 ou terapias com anticorpo monoclonal ou similares. Porexemplo, uma terapia direcionada para a via de VEGF pode ser a bisaril u-réia, Sorafenibe que é um inibidor da angiogênese assim como um inibidorde tirosina quinase, ou com o inibidor da tirosina quinase, STI571 (tambémconhecido como mesilato de imatinibe ou Gleevec®).

Outra modalidade da invenção refere-se ao uso de imunoensai-os quantitativos para detectar alterações nos níveis de VEGF em combina-ção com os níveis de uma ou mais outras proteínas. Tal(is) proteína(s) adi-cional(is) pode(m) incluir, por exemplo, inibidores (por exemplo, inibidor teci-dual de metaloproteinase-1 (TIMP-1)), oncoproteínas (por exemplo, HER-2/neu, ras p21), receptores de fator do crescimento (por exemplo, receptordo fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor do fator de crescimen-to derivado de plaqueta alfa (PDGFR-α)), proteínas de metástase (por e-xemplo, ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA)), marcadores tu-morais (por exemplo, antígeno carcinoembriônico (CEA)) e supressores detumor (por exemplo, p53). Esses métodos podem então ser usados, por e-xemplo, como ferramentas de diagnóstico/prognóstico, seleção de terapiapara pacientes com uma doença, monitoramento do estado de uma doençaem um paciente e monitoramento de como um paciente com uma doençaestá respondendo a uma terapia direcionada para a via de VEGF ou outraterapia. Pode ser vantajoso testar pacientes (por exemplo, pacientes comcâncer) quanto a alterações seriadas em VEGF total e proteínas adicionais,tal como as proteínas que ativam a via de VEGF, como um meio de aumen-tar a perspectiva clínica, recursos terapêuticos e parâmetros de diagnósti-co/prognóstico a fim de selecionar as combinações terapêuticas ótimas paraas evoluções de tratamento mais promissoras.

Em outra modalidade, a invenção fornece um kit de teste paramonitorar a eficácia de um terapêutico em uma amostra de paciente, quecompreende um anticorpo específico para uma proteína. Em certas modali-dades, o kit ainda inclui instruções para uso do kit. Em certas modalidades, okit pode incluir ainda soluções para suspender ou fixar as células, sinalizado-res (tags) detectáveis ou marcadores, soluções para tornar um polipeptídeosuscetível à ligação de um anticorpo, soluções para Iisar células ou soluçõespara purificação de polipeptídeos. Em outra modalidade ainda, o anticorpo éespecífico para VEGF.Descrição da Figura

Figura 1 ilustra os níveis médios de VEGF basais (pré-tratamento)e durante o tratamento em populações de pacientes.

Descrição Detalhada da Invenção

Deve ser compreendido que essa invenção não está limitada asmetodologias, protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros de ani-mais, construtos e reagentes particulares descritos e como tal pode variar.Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é apenas para opropósito de descrever modalidades particulares e não pretende limitar oescopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicaçõesanexas.

Deve ser observado que como usadas aqui e nas reivindicaçõesanexas, as formas no singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referências noplural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Assim, porexemplo, a referência a um "gene" é a referência a um ou mais genes e in-clui equivalentes desse conhecidos pelos versados na técnica e assim su-cessivamente.

A menos que definido de outra maneira, todos os termos técni-cos e científicos usados aqui tem o mesmo significado que o comumentecompreendido por aquele versado na técnica a qual essa invenção pertence.Embora quaisquer métodos, equipamentos e materiais similares ou equiva-lentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da in-venção, os métodos, equipamentos e materiais preferidos são descritos ago-ra.

Todas as publicações e patentes mencionadas aqui estão incor-poradas por meio desse por referência com o propósito de descrever e di-vulgar, por exemplo, os construtos e metodologias que estão descritos naspublicações que podem ser usadas em relação à invenção presentementedescrita. As publicações discutidas acima e por todo o texto são fornecidas apenas por sua descrição antes da data de depósito do presente pedido.Nada aqui deve ser compreendido como uma admissão de que os invento-res não estão no direito de anteceder tal descrição em virtude de invençãoanterior.Definições

Por conveniência, os significados de certos termos e frases em-pregadas no relatório descritivo, exemplos e reivindicações anexas são for-necidos abaixo.

O termo "amostra de paciente", como usado aqui, refere-se auma amostra obtida de um paciente. A amostra pode ser de qualquer tecido ou fluido biológico. A amostra pode ser uma amostra que é derivada de umpaciente. Tais amostras incluem, mas não são limitadas a sangue, soro,plasma, urina, saliva, sêmen, exsudato mamário, fluido cérebro-espinhal,lágrimas, escarro, muco, linfa, citossóis, ascite, efusões pleurais, fluido peri-toneal, fluido amniótico, lavados vesicais e lavados broncoalveolares, células sangüíneas (por exemplo, células brancas), amostras de tecido ou biópsia(por exemplo, biópsia de tumor) ou células dos mesmos. Amostras biológi-cas também podem incluir seções de tecidos tais como seções congeladasretiradas com propósitos histológicos.

O termo "biomarcador" abrange uma ampla faixa de eventos in- tra e extracelulares assim como alterações fisiológicas no organismo inteiro.Biomarcadores podem representar essencialmente qualquer aspecto da fun-ção celular, por exemplo, mas não limitados a níveis ou taxas de produçãode moléculas de sinalização, fatores de transcrição, metabólitos, transcritosde genes assim como modificações pós-traducionais de proteínas. Biomar-cadores podem incluir a análise do genoma completo de níveis de transcritoou análise do proteoma completo de níveis e/ou modificações de proteína.

Um biomarcador também pode referir-se a um gene ou produtode gene que é regulado positiva ou negativamente em uma célula doentetratada com um composto de um indivíduo que tem a doença comparadacom uma célula doente não tratada. Ou seja, o gene ou produto de gene ésuficientemente específico para a célula tratada em que ele pode ser usado,opcionalmente com outros genes ou produtos de gene, para identificar, pre-dizer ou detectar a eficácia de uma molécula pequena. Assim, um biomarca-dor é um gene ou produto de gene que é característico de eficácia de umcomposto em uma célula doente ou da resposta daquela célula doente aotratamento pelo composto.

O termo "câncer" inclui, mas não é limitado a tumores sólidos,tais como cânceres de mama, trato respiratório, cérebro, órgãos reproduto-res, trato digestivo, trato urinário, olho, fígado, pele, cabeça e pescoço, tire-óide, paratireóide e suas metástases distantes. O termo também inclui Iinfo-mas, sarcomas e leucemias.

Exemplos de câncer de mama incluem, mas não são limitados acarcinoma ductal invasivo, carcinoma Iobular invasivo, carcinoma ductal insitu e carcinoma Iobular in situ.

Exemplos de cânceres do trato respiratório incluem, mas nãosão limitados a carcinoma de pulmão de pequenas células è de células não-pequenas, assim como adenoma brônquico e blastoma pleuropulmonar.

Exemplos de cânceres de cérebro incluem, mas não são limita-dos a glioma de tronco cerebral e hipoftálmico, astrocitoma cerebelar e cere-bral, meduloblastoma, ependimoma, assim como tumor neuroectodérmico epineal.

Tumores dos órgãos reprodutores masculinos incluem, mas nãosão limitados a câncer de próstata e testículo. Tumores dos órgãos reprodu-tores femininos incluem, mas não são limitados a câncer de endométrio, cer-vical, ovariano, vaginal e vulvar assim como sarcoma do útero.

Tumores do trato digestivo incluem, mas não são limitados acânceres anal, do cólon, colorretal, esofageano, vesícula biliar, gástrico, pan-creático, retal, intestino delgado, e glândulas salivares.

Tumores do trato urinário incluem, mas não são limitados a, be-xiga, pênis, rim, pelve renal, ureter, e cânceres uretrais.

Cânceres do olho incluem, mas não são limitados a melanomaintraocular e retinoblastoma.

Exemplos de cânceres do fígado incluem, mas não são limitadosa carcinoma hepatocelular (carcinomas de célula hepática com ou sem vari-ante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma de duto biliar intra-hepáti-co) e colangiocarcinoma hepatocelular misto.

Cânceres de pele incluem, mas não são limitados a carcinomade célula escamosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pelede célula de Merkel e câncer de pele não melanoma.

Cânceres de cabeça e pescoço incluem, mas não são limitadosa câncer de laringe/hipofaringe/nasofaringe/orofaringe e câncer do lábio ecavidade oral.

Linfomas incluem, mas não são limitados a Iinfoma relacionado aAIDS, Iinfoma não Hodgkin, Iinfoma cutâneo de célula T, doença de Hodgkine Iinfoma do sistema nervoso central.

Sarcomas incluem, mas não são limitados a, sarcoma do tecidoconjuntivo, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma, e rab-dominiosarcoma.

Leucemias incluem, mas não são limitadas a leucemia mielóideaguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemiamielóide crônica, e leucemia de célula pilosa.

O termo "paciente" ou "indivíduo" como usado aqui inclui mamí-fero (por exemplo, seres humanos e animais).

A presente invenção está direcionada a imunoensaios quantitati-vos que medem os níveis de proteína VEGF em amostras de pacientes. Es-ses ensaios podem ser úteis para a seleção de uma terapia para um pacien-te com uma doença associada com uma via de VEGF ativada. Como usadoaqui, uma "via de VEGF ativada" é definida como uma via de VEGF ativadatanto por superexpressão como por mutação de proteína VEGF e como tal,abrange vias de VEGF reguladas positivamente e/ou estimuladas por mutação.

Exemplos de doenças neoplásicas associadas com uma via deVEGF ativada, assim como pré-cânceres que levam a doenças neoplásicas,são os seguintes: meduloblastoma metastático, tumores do estroma gastro-intestinal (GIST), dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP), doenças mielo-proliferativas crônicas (CMPD), câncer colorretal, câncer de cólon, câncer depulmão, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer de pulmão de cé-lula pequena, leucemia mielóide aguda, câncer de tireóide, câncer pancreá-tico, câncer de bexiga, câncer de rim, melanoma, câncer de mama, câncerde próstata, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço,tumores de cérebro, carcinoma hepatocelular, e malignidades hematológi-cas. Dessa forma, os níveis de proteína VEGF sozinhos ou em combinaçãocom os níveis de outras proteínas (por exemplo, outras oncoproteínas) po-dem ser usados para prever a evolução clínica e/ou como auxílio em seleçãode terapia.

Dessa forma, a presente invenção descreve e reivindica a apli-cação de um imunoensaio para medir quantitativamente os níveis de VEGFem amostras de pacientes (por exemplo, níveis de VEGF circulante) a fim deavaliar a probabilidade de que um paciente que sofre de câncer possa sebeneficiar de tratamento com um inibidor de multiquinase (por exemplo, Sorafenib).

Em uma modalidade da invenção, a proteína VEGF é quantifica-da em amostras de paciente retiradas no momento do diagnóstico (por e-xemplo, carcinoma de célula renal), assim como pontos de tempo subse-qüentes pós-tratamento (por exemplo, dia 31 do primeiro ciclo de tratamento,dia 1 do terceiro ciclo de tratamento). Tais amostras de paciente podem ser,por exemplo, sangue, soro, plasma, urina, saliva, sêmen, exudato de mama,fluido cerebroespinhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citossois, ascitesões pleurais, fluido amniótico, lavados de bexiga, e lavados broncoalveola-res, entre outras amostras de fluidos corporais. As amostras de paciente po-dem ser frescas ou congeladas, e podem ser tratadas com heparina, citratoou EDTA.

Como um exemplo de imunoensaio que pode ser usado nos mé-todos da invenção está um ELISA sanduíche. Entretanto, pode ser apreciadoque outros métodos, além daqueles descritos aqui, podem ser usados paraquantificar proteína VEGF em amostras de pacientes. Além disso, váriosmétodos de detecção podem ser usados para visualizar a proteína VEGF talcomo marcadores luminescentes.

Muitos formatos podem ser adaptados para uso com os métodosda presente invenção. Por exemplo, a detecção e quantificação de proteínaVEGF em amostras de paciente podem ser realizadas por ensaios imunoab-sorventes ligados a enzima, radioimunoensaios, ensaios sanduíche de doisanticorpos, ensaios de aglutinação, imunoensaios fluorescentes, microscopiaimunoeletrônica e de varreduras, entre outros ensaios comumente conheci-dos na técnica. A quantificação da proteína VEGF em tais ensaios pode seradaptada por métodos convencionais conhecidos na técnica. Em uma moda-lidade, mudanças seriadas nos níveis de proteína VEGF circulantes podemser detectadas e quantificadas por um ensaio sanduíche no qual o anticorpode captura foi imobilizado usando técnicas convencionais sobre a superfíciedo suporte.

Suportes adequados incluem, por exemplo, suportes de políme-ro sintético, tais como polipropileno, poliestireno, poliestireno substituído,poliacrilamidas (tal como poliamidas e polivinilcloreto), esferas de vidro, aga-rose e nitrocelulose.

Um exemplo de um imunoensaio de ELISA sanduíche que podeser usado nos métodos da presente invenção, usa anticorpo monoclonal an-ti-VEGF humano de camundongo purificado como o anticorpo de captura eanticorpo policlonal anti-VEGF humano de cabra biotinilado como o anticor-po detector. O anticorpo monoclonal de captura é imobilizado em poços deplaca de microtitulação. Amostras de soro/plasma humanos diluídas ou pa-drões de VEGF (proteína de VEGF selvagem recombinante) são incubadasnos poços para permitir a ligação de antígeno de VEGF pelo anticorpo mo-noclonal de captura. Após lavagem dos poços, o antígeno de VEGF imobili-zado é exposto a um anticorpo detector biotinilado após os poços serem Ia-vados novamente. Um conjugado de estrepavidina-peroxidase de rábanosilvestre é então adicionado. Após uma lavagem final, um Substrato TMBBlue é adicionado aos poços para detectar atividade de peroxidase ligada. Areação é paralisada pela adição de ácido sulfúrico 2,5 N, e absorbância èmedida a 450 nm. Correlacionar os valores de absorbância de amostras comos padrões de VEGF permite a determinação de um valor quantitativo deVEGF em pg/ml de soro ou plasma.

Pode ser apreciado que outras proteínas (por exemplo, inibido-res, oncoproteínas, receptores de fator de crescimento, fatores angiogêni-cos, proteínas de metástase, marcadores tumorais, supressores de tumor,proteínas associadas com a via de VEGF) podem ser adequadas para de-tecção e quantificação em combinação com VEGF. Por exemplo, outras pro-teínas adequadas para teste junto com VEGF incluem inibidor tecidual demetaloproteinase-1 (TIMP-1), HER-2/neu, ras p21, receptor de fator de cres-cimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento derivado deplaqueta alfa, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ativador deplasminogênio tipo uroquinase (uPA), antígeno carcinoembriônico (CEA) ep53. Essas outras proteínas podem ser detectadas usando ensaios que sãoconhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, imunoensaios para aquantificação de HER-2-neu e TIMP-1 são disponíveis comercialmente, talcomo o ELISA de TIMP-1 de Oncogene Science (Oncogene Science, Cam-bridge, MA (USA)) que pode detectar valores em ng/ml de níveis de TIMP-1em soro ou plasma humano.

Monitoramento dos níveis de pré-tratamento de VEGF pode serindicativo de evolução clínica após tratamento com um inibidor de multiqui-nase (por exemplo, Sorafenib). Método de avaliar uma evolução clínica podeser a avaliação da taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), respostaparcial (PR), doença estável (SD), benefício clínico (incluindo resposta com-pleta (CR)1 resposta parcial (PR), e doença estável (SD)), tempo para pro-gressão (TTP), sobrevida livre de progressão (PFS), e sobrevida global(OS).

O termo "anticorpo" é usado aqui no seu sentido mais amplo ecobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo os anticorpos deextensão completa), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (porexemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo. Anticorposúteis de acordo com os métodos da invenção podem ser preparados por me-todologia convencional e/ou engenharia genética. Por exemplo, anticorposde acordo com a invenção incluem aqueles anticorpos que se ligam a VEGF.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo de extensão completa, geralmente o domínio de ligação ao antíge-no ou variável desse. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem frag-mentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculasde anticorpo de cadeia única; anticorpos bioespecíficos; e anticorpos multi-específicos formados de fragmentos de anticorpos.

O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a umanticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homo-gênea, isso é, anticorpos individuais que compreendem uma população i-dêntica exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem es-tar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são alta-mente específicos, isso é, direcionados contra um único sítio antigênico. A-lém disso, ao contrário de preparações de anticorpo (policlonal) convencio-nais que incluem tipicamente anticorpos diferentes direcionados contra de-terminantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionadocontra um único determinante sobre o antígeno. O modificador "monoclonal"indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substan-cialmente homogênea de anticorpos, e não pode ser considerado como re-querendo produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exem-pio, os anticorpos monoclonais a ser usados de acordo com a presente in-venção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Ko-hler, et al., (Nature 256: 495, 1975), ou podem ser feitos por métodos deDNA recombinante (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567). Anti-corpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagosusando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et ai, (Nature 352:624-628, 1991) e Marks, et ai, (J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991).

Os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos"quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ouleve é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorposderivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ousubclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s)é(são) idêntica(s) ou homóloga(s) a seqüências correspondentes em anti-corpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou sub-classe de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde queeles exibam a atividade biológica desejada (vide, por exemplo, Patente U.S.No. 4.816.567; e Morrison, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855,1984).

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem-plo, de murino) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência míni-ma derivada de imunoglobulina não humana. Para a maioria, anticorpos hu-manizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais re-síduos de região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos deregião hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal co-mo um camundongo, rato, coelho ou primata não humano, que tem a especi-ficidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos daregião estrutural (FR) da imunoglobulina humana podem ser substituídos porresíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humaniza-dos podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorporeceptor ou no anticorpo doador. Tais modificações são feitas para refinarmais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado podecompreender substancialmente tudo de pelo menos um ou tipicamente doisdomínios variáveis, nos quais toda ou substancialmente toda a região hiper-variável corresponde àquelas de uma imunoglobulina não humana e toda ousubstancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imuno-globulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também podecompreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imu-noglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para umarevisão, vide Jones, et al., (Nature 321:522-525, 1986); Reichmann, et al,(Nature 332:323-329, 1988); e Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596,1992).

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" compre-endem os domínios V^H e V^L do anticorpo, em que esses domínios estão pre-sentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo deFv ainda compreende um ligante polipeptídico entre os domínios V^H e V^L quepossibilita que sFv forme a estrutura desejada para ligação com antígeno.Para uma revisão, vide Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibo-dies, Vol. 113, Rosenburg & Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp.269-315,1994).

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti-corpo com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreen-dem um domínio variável de cadeia pesada (V^H) conectado a um domíniovariável de cadeia leve (V^L) na mesma cadeia de polipeptídeo (V^H-V^L). Pelouso de um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre osdois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com osdomínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação aoantígeno. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP404.097; WO 93/11161; e Hollinger, et al, (Proc. Natl. Acad. Sei. USA90:6444-6448,1993).

A expressão "anticorpos lineares" refere-se a anticorpos descri-tos em Zapata, et al, (Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995). Resumidamen-te, tais anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (V^H-C^H1-V^H-C^H1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Anticor-pos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Anticorpos monoclonais representativos úteis de acordo com apresente invenção incluem anticorpos monoclonais de camundongo anti-VEGF total humano, tais como aqueles encontrados no kit de ELISA sanduí-che de Oncogene Science designado para medir VEGF humano. Anticorposmonoclonais úteis de acordo com essa invenção servem para identificar pro-teínas VEGF em vários testes laboratoriais de prognóstico, por exemplo, emamostras clínicas.

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas molecularesadicionais úteis aqui, incluindo a preparação de anticorpos, incluem Berger &Kimmel (Guide to Molecular Cloninq Techniques. Methods in Enzymoloqy,Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et ai, (Molecular Cloning: A La-boratorv Manual. (Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press;Cold Spring Harbor1 N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in MolecularBiology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, um empreendimentoconjunto entre Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc.(suplementado até 2000)); Harlow et ai, (Monoclonal Antibodies: A Labora-torv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Fun-damental Immunoloav, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); e Harlow, etai, (Usina Antibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1998)).

Os anticorpos úteis de acordo com a presente invenção paraidentificar proteínas VEGF podem ser marcados de qualquer maneira con-vencional. Um exemplo de um marcador é a peroxidase de rábano silvestree um exemplo de um método de marcação de anticorpos é o uso de comple-xos de biotina-estreptavidina.

Como apropriado, anticorpos usados nos imunoensaios dessainvenção que são usados como traçadores podem ser marcados de qual-quer maneira, diretamente ou indiretamente, o que resulta em um sinal que évisível ou pode ser tornado visível. Substâncias marcadoras detectáveis in-cluem radionuclídeos, tais como 3H, 125I, e 131I; fluorescentes tais como isoti-ocianato de fluoresceína e outros fluorocromos, ficobileproteínas, ficoeritina,quelatos de terras raras, vermelho do Texas, dansil e rodamina; reagentescolorimétricos (cromógenos); materiais elétron-opacos, tais como ouro coloi-dal; bioluminescentes; quimioluminescentes; corantes; enzimas, tais comoperoxidase de rábano silvestre, fosfatases alcalinas, glicose oxidase, glico-se-6-fosfato desidrogenase, acetilcolinesterase, alfa-, beta-galactosidase,entre outras; coenzimas; substratos enzimáticos; co-fatores de enzimas; ini-bidores de enzimas; subunidades de enzimas; íons de metal; radicais livres;ou qualquer outra substância imunologicamente ativa ou inerte que forneçaum meio de detectar ou medir a presença ou quantidade de imunocomplexoformado. Exemplares de combinações de substrato de enzima são peroxida-se de rábano silvestre e tetrametil benzidina (TMB) e fosfatases alcalinas eparanitrofenil fosfato (pNPP).

Outros sistemas de detecção e quantificação de acordo com es-sa invenção produzem sinais luminescentes, bioluminescentes (BL) ou qui-mioluminescentes (CL). Em ensaios quimioluminescentes (CL) ou biolumi-nescentes (BL)1 a intensidade ou a emissão total de luz é medida e relacio-nada com a concentração do analito desconhecido. A luz pode ser medidaquantitativamente usando um luminômetro (tubo fotomultiplicador como odetector) ou dispositivo de carga acoplada, ou quantitativamente por meio defilme fotográfico ou de raio X. As principais vantagens de usar tais ensaiossão sua simplicidade e sensibilidade analítica, possibilitando a detecção e/ouquantificação de quantidades muito pequenas de analito.

Exemplares de marcadores luminescentes são ésteres de acri-dínio, carboxamidas de sulfonil acridínio, luminol, umbeliferona, derivados deisoluminol, fotoproteínas, tais como equorina, e Iuciferases de vagalumes,bactérias marinhas, Vargulla e Renilla. Luminol pode ser usado opcional-mente com uma molécula intensificadora tal como 4-iodofenol ou ácido 4-hidróxi-cinâmico. Tipicamente, um sinal CL é gerado pelo tratamento comum oxidante sob condições básicas.

Sistemas de detecção luminescentes adicionais são aqueles emque o sinal (marcador detectável) é produzido por uma reação enzimáticaem um substrato. Esquemas de detecção CL e BL foram desenvolvidos paratestar fosfatases alcalinas (AP), glicose oxidase, glicose 6-fosfato desidroge-nase, peroxidase de rábano silvestre (HRP) e marcadores de xantina oxida-se entre outros. AP e HRP são dois marcadores enzimáticos que podem serquantificados por uma variedade de reações CL e BL. Por exemplo, AP podeser usada com um substrato, tal como o substrato adamantil 1,2-dioxetanoaril fosfato (por exemplo, AMPPD ou CSPD; Kricka, L.J., "Chemiluminescen-ce and Bioluminescence, Analysis by," Molecular Bioloav and Biotechnoloqy:A Comprehensive Desk Reference (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y.,N.Y.; 1995)); por exemplo, um sal dissódico de 4-metoxi-4-(3-fosfatefenil)espiro[1,2-dioxetano-3,2'-adamantano], com ou sem uma molécula intensificadoratal como dicloreto de 1-(trioctilfosfonio metil)-4-(tributilfosfonio metil) benze-no. HRP pode ser usada com substratos, tais como 2',3',6'-trifluorofenil-metoxi-10-metilacridano-9-carboxilato.

Reações CL e BL podem ser adaptadas para análise não ape-nas de enzimas, mas também de outros substratos, cofatores, inibidores,íons de metal e similares. Por exemplo, reações de luminol, Iuciferase devagalume e Iuciferase bacteriana marinha são reações indicadoras para aprodução ou consumo de peróxido, ATP e NADPH, respectivamente. Elaspodem ser acopladas a outras reações que envolvem oxidases, quinases edesidrogenases e podem ser usadas para medir qualquer componente dareação acoplada (enzima, substrato, cofator).

O marcador detectável pode estar ligado diretamente ou indire-tamente a um anticorpo usado em um ensaio dessa invenção. Exemplo deuma ligação indireta do marcador detectável é o uso de um par de ligaçãoentre um anticorpo e um marcador ou o uso de um sistema de amplificaçãode sinal.

Exemplos de pares de ligação que podem ser usados para ligaranticorpos a marcadores detectáveis são biotina/avidina, estreptavidina ouanti-biotina; avidina/anti-avidina; tiroxina/globulina de ligação a tiroxina; antí-geno/anticorpo; anticorpo/anti-anticorpo; carboidrato/lecitinas; hapte-no/anticorpo anti-hapteno; corantes e moléculas hidrofóbicas/sítios de liga-ção de proteínas hidrofóbicas; inibidor de enzima, coenzima ou cofa-tor/enzima; ácido polinucleico/seqüência homóloga de ácido polinucleico;fluoresceína/anti-fluoresceína; dinitrofenol/anti-dinitrofenol; vitaminaB12/fator intrínseco; cortisona, cortisol/proteína de ligação ao cortisol; e Ii-gantes para proteína receptora específica /proteínas receptoras específicasassociadas à membrana.

Vários meios de ligar marcadores diretamente ou indiretamentea anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, marcadores podem serligados tanto covalentemente quanto não covalentemente. Exemplares de mé-todos de conjugação de anticorpos estão descritos em Avarmeas, et al., Scan.J. Immunol. 8(Supl. 7): 7, 1978); Bayer, et al., Meth. Enzymol. 62:308, 1979;Chandler, et al., J. Immunol. Meth. 53:187, 1982; Ekeke & Abuknesha, J.Steroid Biochem. 11:1579, 1979; Engvall & Perlmann, J. Immunol. 109:129,1972; Geoghegan, et al., Immunol. Comm. 7:1, 1978; e Wilson & Nakane,Immunofluorescence and Related Techniques, Elsevier/North Holland Bio-medical Press; Amsterdam (1978).

Dependendo da natureza do marcador, várias técnicas podemser empregadas para detectar e quantificar o marcador. Para fluorescentes,um grande número de fluorômetros está disponível. Para quimioluminescen-tes, luminômetros ou filmes estão disponíveis. Com enzimas, um produtofluorescente, quimioluminescente ou colorido pode ser determinado ou me-dido fluorometricamente, luminometricamente, espectrofotometricamente ouvisualmente.

Vários tipos de compostos quimioluminescentes do tipo de acri-dínio, benzacridínio ou acridano que têm sistemas de anéis heterocíclicossão outros exemplos de marcadores. Exemplos de ésteres de acridínío in-cluem aqueles compostos que têm anéis heterocíclicos ou sistemas de anelque contem o heteroátomo em um estado de oxidação positivo incluindo sis-temas de anel tais como acridínio, benz[a]acridínio, benz[b]acridínio,benz[c]acridínio, um cátion de benzimidazol, quinolínio, isoquinolínio, quino-lizinio, um quinolínio substituído cíclico, fenantridínio e quinoxalinio.

O traçador pode ser preparado para acoplar ao anticorpo sele-cionado, tanto diretamente quanto indiretamente, um grupo funcional reativopresente no éster de acridínio ou benzacridínio, como é bem-conhecido poraqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Weeks, et al., Clin. Chem.29(8): 1474-1479, 1983). Exemplos de compostos são ésteres de acridínio ebenzacridínio com um grupo de partida de anel de arila e o grupo reativofuncional presente tanto na posição para quanto meta do anel de arila (vide,por exemplo, Patente U.S.No. 4.745.181 e WO 94/21823).

Como usado aqui, "terapias direcionadas para a via de VEGF"incluem quaisquer terapias que são direcionadas para a via, incluindo inibi- ção da expressão da proteína VEGF (por exemplo, oligonucleotídeos anti-senso), prevenção da localização de membrana essencial para ativação deVEGFR ou inibição de efetores à jusante de VEGFR (por exemplo, Raf seri-na/treonina quinases). Terapias direcionadas para a via de VEGF incluemser inibidores de multiquinase, inibidores de tirosina quinase, anticorpos mo- noclonais e bisaril uréias.

Um exemplo de inibidor de quinase é a bisaril uréia Sorafenib,uma pequena molécula e um novo inibidor de dupla ação de ambas Raf (u-ma proteína serina/treonina quinase) e VEGFR (um receptor do fator decrescimento endotelial vascular, um receptor de tirosina quinase) e conse- qüéntemente um inibidor tanto da proliferação celular tumoral como da angi-ogênese (Onyx Pharmaceuticals, Richmond, CA, e Bayer PharmaceuticalsCorporation, West Haven, CT (USA); Lyons, et al., Endocrine-Related Cân-cer 8:219-225, 2001). Além disso, foi descoberto que Sorafenibe inibe váriosoutros receptores de tirosina quinase envolvidos na progressão do tumor e neovascularização, incluindo PDGFR-β, Fit-3 e c-KIT. PD166285 (Pfizer,Groton, CT), um inibidor de tirosina quinase geral, pode antagonizar tantosas respostas mediadas por PDGF como FGF-2 (Bansai, et ai, J. Neurosci-ence Res. 74(4):486-493, 2003).

Outras terapias exemplares que atingem a via de VEGF incluem: Sutent/SU 11248, PTK 787, MLN518, PKC-412, CDP860, e XL9999. Su-tent/SU11248 (malato de sunitinibe; uma indolin-2-ona) (Pfizer, Groton, CT)atinge o receptor de tirosina quinases (RTKs) incluindo PDGFR com efeitosantiangiogênicos e anti-tumorais. PDGFR desempenha um papel significati-vo na promoção de angiogênese pela regulação da proliferação e migração de pericitos, células que suportam vasos sangüíneos, e acredita-se que Su-tent/SU11248 iniba da ação angiogênica de PDGFR.

PTK 787 (Novartis, Basel, Suíça e Schering AG, Berlin, Alema-nha) é um agente anti-angiogênese oral de molécula pequena (anilinoftalazi-na) ativo contra PDGFR1 assim como contra VEGFR e receptores c-Kit detirosina quinase (vide, por exemplo, Garcia-Echevera & Fabbro, Mini Revi-ews in Medicinal Chemistry 4(3):273-283, 2004).

MLN518 (anteriormente conhecido como CT53518; MilleniumPharmaceuticals, Cambridge, MA) é uma molécula pequena, oral destinadapara inibir receptores tirosina quinase (RTKs) tipo III, incluindo PDGFR,FLT3 e c-KIT.

PKC-412 [midostaurina; N-benzõil-estaurosporina (um derivadode estaurosporina, um produto da bactéria Streptomyces); Novartis, Basel,Suíça) inibe PDGFR, VEGFR e múltiplas proteínas quinases Cs, "o que otorna especialmente atraente em pacientes com KIT selvagem com muta-ções em PDGFR" (PKC 412- Uma entrevista com Charles Blanke, MD,FACP (www.gistsupport.org/pkc412.html); vide também Reichardt, et al., J.Clin. Oncol. 23(16S):3016, 2005).

XL999 (um dos vários Inibidores de Quinase de Espectro Seleti-vo™ (SSKIs) de Exelixis (São Francisco do Sul, CA, EUA)) inibe VEGFR,assim como outros RTKs, tais como PDGFR-beta, FGFR1 e FLT3.Exemplos

As estruturas, materiais, composições e métodos aqui descritospretendem ser exemplos representativos da invenção, e será compreendidoque o escopo da invenção não está limitado pelo escopo dos exemplos. A-queles versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticadacom variações nas estruturas, materiais, composições e métodos descritos etais variações são consideradas dentro do âmbito da invenção.

Exemplo 1. ELISA Sanduíche de Microtitulação em Fase Sólida para Prepa-ração de Amostra de Soro e Plasma Humanos.

Amostras adequadas para análise pelo ELISA para VEGF inclu-em plasma humano tratado com heparina, citrato ou EDTA e soro humano.Devido a possíveis fatores de interferência, cuidado especial deve ser toma-do na preparação e teste de soro e plasma humanos. Qualquer material flo-culante deve ser removido das amostras por microcentrifugação antes dadiluição. A concentração inicial do espécime de soro ou plasma a ser exami-nado deve ser de cerca de 12-13% (uma diluição 1:8 do espécime no diluen-te da amostra). Por exemplo, 40 μΙ de amostra podem ser diluídos em 280 μΙde diluente de amostra e 100 μΙ adicionados aos poços da microplaca.

Procedimento do Ensaio

O seguinte protocolo de ELISA é usado para o ELISA sanduíche(Oncogene Science, Cambridge, MA) para medir VEGF humano em plasmaou soro humanos.

1. Prepare uma solução de trabalho (1X) de Platewash (Forneci-do como parte do kit de ensaio).

2. Adicione amostras pré-diluídas e Controles e cada um dosseis padrões de VEGF (0 a 8000 pg/ml) em duplicata por pipetar 100 μΙ nospoços apropriados usando pipetas de pontas limpas para cada amostra eStandard. Adicione Padrão 0 a um poço adicional para ser usado para de-terminação de Branco do Substrato.

3. Cubra os poços com embalagem plástica ou selador de placalimpos. Incube a placa de microtirulação por 1,5 horas a 37°C.

4. Cuidadosamente remova a embalagem plástica ou selador deplaca. Lave os poços usando 300 pL por poço com seis ciclos de tampãoPlatewash (lave por três ciclos, gire a placa 180°, e lave por mais três ciclos.

5. Pipete 100 μί do Anticorpo detector em todos os poções ex-ceto o poço de branco de Substrato que é deixado vazio. Cubra os poçoscom um pedaço limpo de embalagem plástica. Incube a placa de microtitula-ção por 1 hora a 37°C.

6. Prepare Conjugado de Trabalho por diluir um volume apropri-ado de Concentrado de Conjugado (diluição 1:50) em Diluente de Conjuga-do.

7. Lave os poços como na Etapa 4. Siga imediatamente para aEtapa 8.

8. Pipete 100 pL de Conjugado de Lavagem em todos os poçosexceto o poço de branco do Substrato, que é deixado vazio. Cubra os poçoscom um pedaço limpo de embalagem plástica. Incube a placa de microtitula-ção em temperatura ambiente (20-275C) por 1 hora.

9. Prepare Substrato de Trabalho por combinar partes iguais deSolução A e Solução B. Seis mL de cada solução de Substrato fornecerão12 mL de Substrato de Trabalho, suficiente para desenvolver uma placa demicrotitulação. Ajuste o volume de Substrato de Trabalho com base no nú-mero de fitas usadas. Misture bem.

10. Dispense o Substrato de Trabalho em um recipiente de rea-gente limpo e deixe-o ir para temperatura ambiente.

11. Lave os poços como na Etapa 5. ATENÇÃO: não deixe queas placas sequem. Siga imediatamente para a etapa 12.

12. Pipete 100 μί de Substrato de Trabalho em todos os poços ecubra a placa com embalagem plástica ou selador plástico. Incube a placade microtitulação em temperatura ambiente (20-27QC) por 45 minutos.

13. Pipete 100 pL de Solução de Parada em todos os poços.

14. Meça a absorbância em cada poço usando um leitor de pla-ca espectrofotométrico em um comprimento de onda de 650 nm. Ospoços devem ser lidos dentro de 30 minutos da adição de Solução de Para-da.

Curvas padrão

Análises quantitativas foram feitas pela construção de uma curvapadrão usando padrão de VEGF (VEGF recombinante humano) em seisconcentrações diferentes de 0, 150, 1000, 3000, 5000 e 8000 pg/mL).Amostras de Soro e Plasma humanos

Amostras de plasma congeladas foram obtidas de pacientescom carcinoma de célula renal confirmado antes do tratamento com Sorafe-nibe.

Exemplo 2. Plasma de Pacientes com Carcinoma de Célula Renal

Amostras em duplicata foram usadas para medir o nível deVEGF usando um ELISA de VEGF (R&D Systems, Minneapolis, MN) pelasinstruções do fabricante. O valor médio das medidas em duplicata foi deter-minado para cada paciente. Os níveis médios de VEGF estão relatados naTabela 1 para três pontos de tempo, Basal (pré-tratamento), Ciclo 1 Dia 21 eCiclo 3 Dia 1 para um grupo de pacientes tratados com Sorafenibe e umgrupo de pacientes tratados com um placebo. Os mesmos dados são mos-trados na Figura 1. Os resultados mostram que o grupo de pacientes trata-dos com Sorafenibe tem níveis de VEGF que aumentam significativamentedo Basal (p « 0,01 usando teste t pareado) em ambos os pontos de tempo,mas isso não ocorre no grupo tratado com placebo (p <0,05).

Tabela 1: VEGF

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A descrição da modalidade anterior da invenção foi apresentadapara fins de ilustração e descrição. Não se pretende ser exaustivo ou limitara invenção à forma precisa descrita, e obviamente várias modificações evariações são possíveis levando em consideração os ensinamentos acima.As modalidades foram escolhidas e descritas a fim de explicar os princípiosda invenção e sua aplicação prática para permitir dessa forma que outrosversados na técnica utilizem a invenção em várias modalidades e com váriasmodificações como são adequadas ao uso particular contemplado. Todas asreferências citadas aqui estão por meio desta incorporadas por referência.

Claims (36)

1. Método para monitorar o estado de uma doença associadacom a via de VEGF em um paciente, e/ou monitorar como um paciente coma dita doença está respondendo a uma terapia, que compreende detectarimunologicamente e quantitativamente alterações seriadas nos níveis deproteína VEGF em amostras de pacientes tomadas ao longo do tempo, emque níveis crescentes de proteína VEGF ao longo do tempo indicam pro-gressão de doença ou uma resposta negativa a dita terapia, e em que níveisdecrescentes de proteína VEGF ao longo do tempo indicam remissão dedoença ou uma resposta positiva a dita terapia.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita tera-pia é selecionada a partir de inibidores de multiquinase, inibidores de tirosinaquinase, anticorpos monoclonais, e bisaril uréias.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita tera-pia é uma terapia direcionada para a via de VEGF.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a dita tera-pia direcionada para a via de VEGF é a o inibidor de tirosina quinase mesila-to de imatinibe ou a bisaril uréia Sorafenibe.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita doen-ça é uma doença pré-neoplásica ou neoplásica.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a dita doen-ça pré-neoplásica ou neoplásica é selecionada a partir do grupo que consis-te em meduloblastoma metastático, dermatofibrosarcoma protruberans, tu-mores do estroma gastrointestinal, câncer colorretal, câncer de cólon, câncerde pulmão, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmãode pequenas células, doenças mieloproliferativas crônicas, leucemia mielói-de aguda, câncer de tireóide, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncerde rim, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário,câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, tumores de cérebro, carcino-ma hepatocelular, malignidades hematológicas, e pré-cânceres que levamaos cânceres acima mencionados.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 que ainda é prognós-tico para a dita doença, em que os ditos níveis de proteína VEGF nas amos-tras do paciente são indicativos de um prognóstico melhor ou pior para o ditopaciente.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o dito prog-nóstico é uma evolução clínica selecionada a partir do grupo que consisteem taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), resposta parcial (PR),doença estável (SD), tempo para progressão'(TTP), sobrevida livre de pro-gressão (PFS)1 sobrevida global (OS), e benefício clínico, que compreenderesposta completa (CR), resposta parcial (PR), e doença estável (SD).

9. Método de acordo com a reivindicação 7, em que níveis cres-centes de VEGF são indicativos de uma maior probabilidade de recorrênciaprecoce ou metástase.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as ditasamostras do paciente são amostras pré-tratamento.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita a-mostra do paciente é selecionada a partir do grupo que consiste em sangue,soro, plasma, urina, saliva, sêmen, exsudato de mama, fluido cerebroespi-nhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citossois, ascite, efusões pleurais, fluidoamniótico, lavados vesicais, e lavados broncoalveolares.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita a-mostra do paciente é soro ou plasma.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita de-tecção e quantificação imunológica é por um imunoensaio na forma de umELISA sanduíche ou ensaio equivalente.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o ELISAsanduíche ou ensaio equivalente compreende o uso de um ou mais anticor-pos monoclonais que se ligam seletivamente a proteína VEGF.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoainda o uso de um imunoensaio para detectar ou detectar e quantificar níveisde uma ou mais proteínas nas amostras do paciente.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a dita ou-tra proteína ou as ditas outras proteínas são selecionadas a partir do grupoque consiste em inibidores, oncoproteínas, receptores de fator de crescimen-to, fatores angiogênicos, proteínas de metástase, marcadores tumorais, esupressores de tumor.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o dito ini-bidor é inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1), as ditas oncoprote-ínas são selecionadas a partir do grupo que consiste em HER-2/neu e rasp21, os ditos receptores de fator de crescimento são selecionados a partir dogrupo que consiste em receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)e receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta alfa (PDGFR-α), odito fator angiogênico é fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), adita proteína de metástase é ativador de plasminogênio do tipo uroquinase(uPA), o dito marcador de tumor é antígeno carcinoembriogênico (CEA), e odito supressor de tumor é p53.

18. Método de seleção de terapia para um paciente humano comuma doença, que compreende:(a) detectar e quantificar imunologicamente o nível médio de pro-teína VEGF em amostras de controle tomadas de indivíduos de uma popula-ção de controle;(b) detectar e quantificar imunologicamente alterações seriadasnos níveis de proteína VEGF em amostras equivalentes de pacientes toma-das do paciente ao longo do tempo.(c) comparar os níveis de proteína VEGF nas amostras do paci-ente com o nível médio de proteína VEGF nas amostras de controle; e(d) determinar se usar terapia convencional e/ou terapia direcio-nada para a via de VEGF para tratar o paciente com base nas diferençasentre os níveis de proteína VEGF nas amostras do paciente e o nível médiode proteína VEGF nas amostras de controle, e como resultado de alteraçõesseriadas entre o níveis de proteína VEGF nas amostras do paciente.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que as ditasamostras do paciente são amostras pré-tratamento.

20. Método de acordo com a reivindicação 18 que é ainda prog-nóstico para a dita doença, em que os ditos níveis de proteína VEGF nasamostras do paciente são indicativos de um prognóstico melhor ou pior parao dito paciente.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o ditoprognóstico é uma evolução clínica selecionada a partir do grupo que consis-te em taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), resposta parcial (PR),doença estável (SD), tempo para progressão (TTP), sobrevida livre de pro-gressão (PFS), sobrevida global (OS), e beneficio clínico, que compreenderesposta completa (CR), resposta parcial (PR), e doença estável (SD).

22. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a dita do-ença é uma doença pré-neoplásica ou neoplásica.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, cuja dita doençapré-neoplásica/neoplásica é selecionada a partir do grupo que consiste emmeduloblastoma metastático, dermatofibrosarcoma protruberans, tumores doestroma gastrointestinal, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de pul-mão, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de pe-quenas células, doenças mieloproliferativas crônicas, leucemia mielóide a-guda, câncer de tireóide, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer derim, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, cân-cer cervical, câncer de cabeça e pescoço, tumores de cérebro, carcinomahepatocelular, malignidades hematológicas, e pré-cânceres que levam aoscânceres acima mencionados

24. Método de acordo com a reivindicação 18, em que as amos-tras do paciente são de um paciente com câncer que não respondeu ao tra-tamento.

25. Método de acordo com a reivindicação 18, ainda compreen-dendo o uso de um imunoensaio para detectar ou detectar e quantificar ní-veis de uma ou mais proteínas nas amostras do indivíduo.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a dita ou-tra proteína ou as ditas outras proteínas são selecionadas a partir do grupoque consiste em inibidores, oncoproteínas, receptores de fator de crescimen-to, fatores angiogênicos, proteínas de metástase, marcadores tumorais esupressores de tumor.

27. Método de acordo com a reivindicação 26 em que o dito ini-bidor é inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1), as ditas oncoprote-ínas são selecionadas a partir do grupo que consiste em HER-2/neu e rasp21, os ditos receptores de fator de crescimento são selecionados a partir dogrupo que consiste em receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)e receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta alfa (PDGFR-α), odito fator angiogênico é fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), adita proteína de metástase é ativador de plasminogênio do tipo uroquinase(uPA), o dito marcador de tumor é antígeno carcinoembriogênico (CEA), e odito supressor de tumor é p53.

28. Método de diagnóstico para detectar uma doença associadacom uma via de VEGF em um paciente que compreende:(a) detectar e quantificar imunologicamente o nível médio de pro-teína VEGF em amostras de controle tomadas de indivíduos de uma popula-ção de controle;(b) detectar e quantificar imunologicamente alterações seriadasna proteína VEGF em amostras de um paciente tomadas de um paciente aolongo do tempo; e(c) comparar os níveis de proteína VEGF nas amostras dos pa-ciente com o nível médio de proteína VEGF nas amostras de controle;em que um nível de proteína VEGF nas amostras do pacienteque está acima do nível médio de proteína VEGF nas amostras de controle éindicativo de uma via de VEGF ativada e a presença de doença no paciente.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a dita de-tecção e quantificação imunológica das etapas (a) e (b) é por um imunoen-saio na forma de um ELISA sanduíche ou ensaio equivalente.

30. Método de acordo com a reivindicação 28 que é ainda prog-nóstico para a dita doença, em que os ditos níveis de VEGF nas amostrasdo paciente são indicativos de um prognóstico melhor ou pior para o dito pa-ciente.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o ditoprognóstico é uma evolução clínica selecionada a partir do grupo que consis-te em taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), resposta parcial (PR),doença estável (SD), tempo para progressão (TTP)1 sobrevida livre de pro-gressão (PFS), sobrevida global (OS), e beneficio clínico, que compreenderesposta completa (CR), resposta parcial (PR), e doença estável (SD).

32. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a dita do-ença é uma doença pré-neoplásica ou neoplásica.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que dita do-ença pré-neoplásica/neoplásica associada com uma via de PDGF ativada èselecionada a partir do grupo que consiste em meduloblastoma metastático, tumores do estroma gastrointestinal, dermatofibrosarcoma protruberans,câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pulmão decélulas não-pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, doençasmieloproliferativas crônicas, leucemia mielóide aguda, câncer de tireóide,câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de rim, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de ca-beça e pescoço, tumores de cérebro, carcinoma hepatocelular, malignidadeshematológicas, e pré-cânceres que levam aos cânceres acima mencionados.

34. Método de acordo com a reivindicação 28, ainda compreen-dendo o uso de um imunoensaio para detectar ou detectar e quantificar ní- veis de uma ou mais outras proteínas nas amostras do paciente.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que em que adita outra proteína ou as ditas outras proteínas são selecionadas a partir dogrupo que consiste em inibidores, oncoproteínas, receptores de fator decrescimento, fatores angiogênicos, proteínas de metástase, marcadores tu- morais e supressores de tumor.

36. Método de acordo com a reivindicação 35 em que o dito inibidor é inibi-dor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1), as ditas oncoproteínas são se-lecionadas a partir do grupo que consiste em HER-2/neu e ras p21, os ditosreceptores de fator de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e receptorde fator de crescimento derivado de plaqueta alfa (PDGFR-α), o dito fatorangiogênico é fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a dita proteí-na de metástase é ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), odito marcador de tumor é antígeno carcinoembriogênico (CEA), e o dito su-pressor de tumor é p53.