CN101506351A - 用于癌症预测和预后及监测癌症治疗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物标记物、用于预见和预测癌症的生物标记物的用途以及用于监测癌症治疗效果的生物标记物的用途。具体地讲，本发明涉及作为多激酶抑制剂的生物标记物的VEGF－165的用途。

Description

用于癌症预测和预后及监测癌症治疗的方法
发明领域
[001]本发明涉及生物标记物、用于癌症预测和预后的生物标记物的用途以及用于监测癌症治疗效果的生物标记物的用途。具体地讲，本发明涉及作为多激酶抑制剂(multi-kinase inhibitor)的生物标记物的VEGF-165的用途。
发明背景
[002]血管内皮生长因子受体(VEGFRs)及其配体、血管内皮生长因子(VEGFs)在内皮细胞迁移和增殖中发挥关键作用。所述VEGFR/VEGF系统包括三种受体(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)和四种配体(VEGF-A、B、C、D，及E和胎盘生长因子)。另外，VEGF-A由四种亚型组成，VEGF-121、VEGF-165、VEGF-185和VEGF-204。其源于VEGF-A基因的另一种转录。所述受体是带有细胞内酪氨酸激酶域的血浆跨膜蛋白。由于具有其它的蛋白激酶，VEGFRs的激活是内皮细胞增殖的调节信号中关键的机制，而且VEGFR/VEGF的异常被认为是多种人体疾病中的异常血管发生的原因，如牛皮癣和恶性肿瘤。
[003]在胚胎形成中，VEGFR/VEGF系统对血管系统的正确发育是必要的。在成人中，VEGFR/VEGF在伤口愈合、炎症和血管发生中是重要的。
[004]药物治疗前患者中循环VEGF-165水平的非侵袭性测试是做出治疗决定的一种可能的重要辅助。虽然已在人体中用总VEGF-A测试作为疾病后果的预后的指示，但直至本发明，尚未见报道在患者化疗和治疗结果之前VEGF-165水平之间的相关性。因此，VEGF-165可用作有价值的预后的指示剂，并可用作监测用多激酶抑制剂治疗的有效性的生物标记物。
发明概述
[005]本发明涉及生物标记物、用于癌症预测和预后的生物标记物的用途以及用于监测癌症治疗效果的生物标记物的用途。具体地讲，本发明涉及作为多激酶抑制剂(如索拉非尼)的生物标记物VEGF-165的用途。
[006]在一实施方案中，本发明涉及在用多激酶抑制剂(如索拉非尼(Sorafenib))治疗前使用定量免疫测定法测定人体体液中VEGF-165蛋白的水平。该水平尤其可用作用多激酶抑制剂(如索拉非尼)治疗的癌症患者的有效指示剂，以便从这种疗法受益。
[007]临床上可使用VEGF-165预处理水平的测定法作为患者疗法选择的一种治疗辅助，用以监测患者肿瘤形成前(preneoplastic)/肿瘤形成疾病的状态，和/或检测肿瘤形成前/肿瘤形成疾病的患者如何响应疗法。在一实施方案中，可用VEGF-165的水平在患者疗法选择中帮助决定患者疗法的最佳方法。
[008]可在患者样本中测定VEGF-165的水平，患者样本为例如，但不限于血液、血清、血浆、尿、唾液、精液、乳房分泌液、脑脊髓液、眼泪、痰、粘液、淋巴、细胞溶胶、腹水、胸膜渗出液、羊水、膀胱洗液和细支气管肺泡灌洗液。
[009]在另一实施方案中，本发明涉及通过测定患者样本中的VEGF-165的预处理水平并根据可能患者结果对VEGF-165水平的计算图(nomogram)估算可能的结果，而使用免疫测定法作为选择患者的一种方法，所述患者可能受益于多激酶抑制剂(如索拉非尼)的治疗。
[010]监测患者中与激活的VEGF-165途径相关的疾病状态的方法还可用于预测疾病的预后，其中患者样本中总VEGF-165蛋白的水平是对患者治疗结果好与坏的指征。所述预后可以是一种选自下列的临床结果：响应率(RR)、完全响应(CR)、部分响应(PR)、稳定的疾病(SD)、和临床益处[包括完全响应(CR)、部分响应(PR)和稳定的疾病(SD)]、进展时间(TTP)、无疾病进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。
[011]这些方法可以使标准模式，例如夹心免疫测定形式的免疫测定法，如夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)或者等同的测定法。这些免疫测定法可使用单克隆抗体，如抗-VEGF-165单克隆抗体。另外，所述单克隆抗体可以被生物素化。
[012]本发明另一实施方案涉及一种测定患者样本中总VEGF-165蛋白水平中系列变化的定量免疫测定法，其作为一种患病(例如，肿瘤形成前/肿瘤形成疾病)患者的治疗选择方法。
[013]例如，一种这样的治疗选择方法可包括下列步骤：
(a)对取自对照群体的样本中的总VEGF-165蛋白的平均水平进行免疫学检测和定量；
(b)对取自患者的样本中的总VEGF-165蛋白随时间推移的水平进行免疫学检测和定量；和
(c)根据患者样本中VEGF-165蛋白的水平，确定是否使用常规疗法和/或多激酶抑制剂(如索拉非尼)疗法治疗该患者。
[014]例如，如果发现患者样本中VEGF-165蛋白的水平在约70pg/ml以上，可得出结论：该患者患有VEGF驱动的疾病，可做出确定，即使用多激酶抑制剂(如索拉非尼)疗法治疗该患者，可单独使用该疗法或者与一或多种其它疗法联合使用。
[015]VEGF-165途径涉及的疗法可以是多激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、二芳基脲、VEGFR-2的反义抑制剂或者单克隆抗体疗法等。例如，VEGF-165途径涉及的疗法可以是二芳基脲索拉非尼，其是一种血管生成抑制剂以及酪氨酸激酶抑制剂，或者酪氨酸激酶抑制剂，STI571(也称为甲磺酸伊马替尼或
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)。
[016]本发明的另一实施方案涉及用定量免疫测定法检测与一或多种其它蛋白水平结合的VEGF-165水平的变化。这些其它蛋白可包括，例如抑制剂(如金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1))、癌蛋白(oncoproteins)(如HER-2/neu、ras p21)、生长因子受体(如表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生的生长因子受体α(PDGFR-α))、转移蛋白(metastasis proteins)(如尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA))、肿瘤标记物(如癌胚抗原(carcinoembryonic)(CEA))和肿瘤抑制剂(suppressors)(如p53)。然后可使用这些方法，例如作为诊断/预测工具，对疾病患者进行疗法选择，监测患者的疾病状态，并监测患病患者如何响应VEGF途径涉及的或其它的疗法。这将有利于检测患者(例如癌症患者)总VEGF-165和其它蛋白的系列变化，如激活VEGF-165途径的蛋白，作为一种扩大临床前景的手段、治疗资源和诊断/预测参数，以得到最有希望的治疗效果而选择最佳的治疗组合。
[017]在另一实施方案中，本发明提供一种在患者样本中供监测治疗效果的试验试剂盒，其包含一种对一种蛋白的特异性抗体。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括使用该试剂盒的说明书。在某些实施方案中，所述试剂盒还可包括供混悬或固定细胞的溶液、可检测的标记或标签、促使多肽易于结合抗体的溶液、溶解细胞的溶液或者纯化多肽的溶液。在再一实施方案中，该抗体对VEGF-165具有特异性。
图示说明
[018]图1说明患者群体中稳定的和发展的疾病的平均VEGF-165水平。
[019]图2说明患者群体中所测定的稳定的和发展的疾病的平均肿瘤皱缩度。
发明详述
[020]应清楚的是本发明不受限于具体的方法学、试验方案、细胞系、动物的种属、结构和试剂，因此可以变化。还应清楚的是此处所用的命名法目的仅为说明具体的实施方案，并不意味着限定本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限定。
[021]必需注意的是：除上下文明确指明外，此处以及所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数。因此，例如，对于“一种基因”是指一或多种基因，并包括本领域技术人员已知的其等同物，依次类推。
[022]除另有定义，否则此处所用的所有技术和科学术语均具有本领域任一普通技术人员通常了解的属于本发明的相同意义。虽然，可在本发明的实践和测试中使用类似于或等同于本文所述的任何方法、设备和材料，但现在描述的是优选的方法、设备和材料。
[023]在此所提及的所有出版物和专利均结合到本发明中作为参考，目的在于例如描述和公开所述各出版物中描述的结构和方法学，其可与目前所述的发明结合使用。所提供的以上及贯穿于正文中所讨论的所述出版物的公开内容仅仅限于本申请提交日期之前。在此不解释为允许所述发明人无权提前公开在先发明的内容。
定义
[024]为方便起见，以下给出本说明书、实施例和所附权利要求书中所用的某些术语和词组的意义。
[025]此处所用的术语“患者样本”指从患者获得的样本。样本可以是任何生物学组织或流体。所述样本可以是源自患者的样本。这些样本包括，但不限于血液、血清、血浆、尿、唾液、精液、乳房分泌液、脑脊髓液、眼泪、痰、粘液、淋巴、细胞溶胶、腹水、胸膜渗出液、腹膜流体、羊水、膀胱洗液和细支气管肺泡灌洗液、血细胞(例如白细胞)、组织和活组织检查样本(例如肿瘤活组织检查)或者其中的细胞。生物学样本还可包括组织切片，如供组织学检查目的用的冷冻切片。
[026]术语“生物标记”包括很宽范围的细胞内外事件以及全机体生理学变化。生物标记可基本代表细胞功能的任何方面，例如，但不限于信号分子产生的水平或速率、转录因子、代谢产物、基因转录物以及蛋白的翻译后变形。生物标记可包括转录物水平的全染色体组分析或者蛋白水平和/或变体(modifications)的全蛋白组(proteome)分析。
[027]生物标记还可以指基因或基因产物，与未治疗的疾病细胞相比，其上调或下调患病患者的化合物治疗的疾病细胞。即，该基因或基因产物对所治疗的细胞具有足够的特异性，可将其任选与其它基因或基因产物一起鉴定、预测或检测小分子的效果。因此，生物标记是一种特征在于显现疾病细胞中化合物的效力或者所述疾病细胞对化合物治疗的响应的基因或基因产物。
[028]术语“癌症”包括但不限于固体瘤，如乳房、呼吸道、大脑、生殖器官、消化道、尿道、眼、肝、皮肤、头和颈、甲状腺、甲状旁腺的癌症及其它们的远期的转移病灶。该术语还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
[029]乳腺癌的实例包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
[030]呼吸道癌的实例包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺胚细胞瘤。
[031]脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑(hypophtalmic)神经胶质瘤、小脑和大脑星细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层和松果腺肿瘤。
[032]男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官癌包括但不限于子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道和外阴癌以及子宫肉瘤。
[033]消化道肿瘤包括但不限于肛门、结肠、结肠直肠、食管、胆囊、胃、胰脏、直肠、小肠和唾液腺癌。
[034]尿道肿瘤包括但不限于膀胱、阴茎、肾、肾盂、输尿管和尿道癌。
[035]眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。
[036]肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(带有或不带有纤维层状变型的肝细胞癌)、胆管癌(cholangiocarcinoma)(肝内胆汁管癌)和混合性肝细胞胆管癌。
[037]皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波济氏瘤、恶性黑素瘤、Merkel细胞皮肤癌和非-黑素瘤皮肤癌。
[038]头颈癌包括但不限于喉/下咽/鼻咽/口咽癌以及唇和口腔癌。
[039]淋巴瘤包括但不限于AIDS-相关淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、霍奇金氏病和中枢神经系统淋巴瘤。
[040]肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞癌、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
[041]白血病包括但不限于急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病和毛状细胞白血病。
[042]本文中所用的术语“患者”和“病患”包括哺乳动物(例如人和动物)。
[043]本发明涉及测定患者样本中VEGF-165蛋白水平的定量免疫测定法。这些测试可用于对患有与VEGF-165途径相关的疾病的患者选择疗法。此处所用“VEGF-165途径”被定义为通过VEGF-165蛋白的过度表达或突变激活VEGF-165途径，由此包括上调节和/或突变刺激VEGF-165途径。
[044]与激活的VEGF-165途径相关的瘤形成疾病以及导致瘤形成疾病的前期癌的实例如下：转移性成神经管细胞瘤、胃肠基质瘤(GIST)、隆凸性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、慢性骨髓增生性疾病(CMPD)、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、甲状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌和血液恶性肿瘤。因此，可单独使用VEGF-165蛋白水平或者与其它蛋白(例如其它癌蛋白)水平联合使用，以预测临床结果和/或作为一种疗法选择的辅助。
[045]因此，本发明公开和要求免疫测定法定量测定患者样本中VEGF-165水平(例如循环的VEGF-165水平)的应用，目的是评估癌症患者将受益于多激酶抑制剂(如索拉非尼)治疗的可能性。
[046]在本发明的一实施方案中，在诊断时或在治疗前，对取出的患者样本中的VEGF-165蛋白进行定量。这些患者样本可以是例如血液、血清、血浆、尿、唾液、精液、乳房分泌液、脑脊髓液、眼泪、痰、粘液、淋巴、细胞溶胶、腹水、胸膜渗出液、羊水、膀胱洗液和细支气管肺泡灌洗液以及其它的体液样本。患者样本可以是新鲜采集的或冷冻的，并可以用肝素、柠檬酸盐或EDTA处理。
[047]例如，可用于本发明方法中的一种免疫测定法为夹心ELISA法(sandwich ELISA)。但是，可理解的是除在此公开的那些方法以外，可使用其它方法对患者样本中的VEGF-165蛋白进行定量。另外，可使用很多检测方法显像VEGF-165蛋白，如发光标记法。
[048]很多方法可适合用于本发明的方法。例如，患者样本中的VEGF-165蛋白的检测和定量可通过酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、双抗体夹心测定法、聚集测定法、荧光免疫测定法、免疫电子和扫描显微镜检查法以及其它本领域一般已知的其它测定法进行。这些测定法中VEGF-165蛋白的定量可通过本领域已知的常规方法进行。在一实施方案中，循环VEGF-165蛋白水平中的系列变化可通过夹心测定法检测和定量，其中使用常规技术将捕获抗体固定在载体的表面。
[049]适合的载体包括，例如合成的聚合物载体，如聚丙烯、聚苯乙烯、取代的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(如聚酰胺和聚氯乙烯)、玻璃珠、琼脂糖和硝基纤维素。
[050]本发明方法中可使用的一种ELISA夹心免疫测定法的实例使用纯化的小鼠抗-人VEGF-165单克隆抗体作为捕获抗体，并使用生物素化山羊抗-人VEGF-165多克隆抗体作为检测抗体。将捕获单克隆抗体固化在微量滴定板孔中。将稀释的人血清/血浆样本或VEGF-165标准品(重组野生型VEGF-165蛋白)在各孔中孵育，使得通过捕获单克隆抗体结合VEGF-165抗原。洗涤各孔后，将固化的VEGF-165抗原暴露于生物素化的检测抗体，然后再次洗涤各孔。然后加入链霉抗生物素-辣根过氧化物酶缀合物。最后洗涤后，向各孔加入TMB蓝底物(Blue Substrate)，以检测结合的过氧化物酶的活性。将反应通过加入2.5N硫酸终止，在450nm处测定吸光度。样本的吸光值与VEGF-165标准品相关使得允许定量测定血清或血浆中VEGF-165的值(pg/ml)。
[051]应清楚的是其它蛋白(例如抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肿瘤标记物、肿瘤抑制剂、与VEGF途径有关的蛋白)可适合于与VEGF-165联合检测和定量。例如，适合于与VEGF-165一同检测的其它蛋白包括金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)、HER-2/neu、ras p21、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生的生长因子受体α、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)、癌胚抗原(CEA)和p53。这些其它蛋白可使用本领域技术人员已知的测定法检测。例如HER-2/neu和TIMP-1的定量免疫测定法为市售提供，如Oncogene Science TIMP-1ELISA(OncogeneScience，Cambridge，MA(USA))，其可检测人血清或血浆中ng/ml的TIMP-1的水平。
[052]监测VEGF-165的预治疗水平可以为用多激酶抑制剂(如索拉非尼)治疗后的临床效果的指征。一种评估临床效果的方法可以是对下列参数的判定：响应率(RR)、完全响应(CR)、部分响应(PR)、稳定的疾病(SD)、临床益处(包括完全响应(CR)、部分响应(PR)和稳定的疾病(SD))、进展时间(TTP)、无疾病进展存活期(PFS)和总存活期(OS)。[053]此处术语“抗体”用其广义含义，并特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。本发明方法可用的抗体可通过常规的方法学和/或通过遗传工程制备。例如，本发明抗体包括与VEGF-165结合的抗体。
[054]“抗体片断”包括抗体全长的一部分，通常是其抗原结合或可变区域。抗体片段的实例包括Fab、Fab′，F(ab′)2和Fv片段、双体、线性抗体、单链抗体分子、生物特异性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[055]此处所用术语“单克隆抗体”指从基本上同种抗体群得到的抗体，即各单个抗体包括相同的种群，除可以以少量出现的可能的天然存在的突变体外。单克隆抗体具有高度特异性，即定向针对单一的抗原位置。另外，与一般包括定向针对不同决定子(抗原决定簇)的不同的抗体的常规的(多克隆)抗体制备不同，各单克隆抗体定向针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆的”指作为从基本上同种抗体群得到的抗体的特性，并不被解释为通过任何具体方法需要产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过Kohler等(Nature 256：495，1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4,816,567)。还可采用例如Clackson等(Nature352：624-628，1991)和Marks等(J.MoI.Biol.222：581-597，1991)描述的技术，从噬菌体抗体库中分离单克隆抗体。
[056]此处单克隆抗体还包括“嵌合的(chimeric)”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链部分与源于特定种类的抗体中的对应序列相同或类似，或者属于特定抗体类型或亚型，而所述链的其余部分与源自另一种种类的抗体中的对应序列相同或类似，或者属于另一种抗体类型或亚型，以及这种抗体的片断，只要它们呈现所要求的生理学活性即可(参见，例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855，1984)。
[057]非人类(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含源自非人类免疫球蛋白的最小化序列。对于大部分来讲，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中该受体的高变异度区域残基被具有所要求的特异性、亲合性和能力的非人类(供体抗体)(如小鼠、大鼠、家兔或非人类灵长类动物)的高变异度区域残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的骨架区域(FR)残基可被对应的非-人类残基代替。另外，人源化抗体可包含在受体抗体或在供体抗体中未发现的残基。可进行这种修饰以进一步净化抗体的性能。所述人源化抗体一般可基本上包括所有的至少一种或者一般两种可变区域，其中所有的或基本上所有的高变异度区域都对应于非人免疫球蛋白的那些区域，而所有的或基本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列的那些区域。所述人源化抗体还可任选包含至少一部分的免疫球蛋白不变区域(Fc)，一般为人免疫球蛋白的一部分。有关综述参见Jones等，(Nature 321：522-525，1986)；Reichmann等，(Nature 332：323-329，1988)；和Presta，(Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596，1992)。
[058]“单链Fv”或“sFv”抗体片断包括抗体的VH和VL域，其中这些域出现于单多肽链中。所述Fv多肽一般还包括VH和VL域之间的多肽连接体(linker)，VH和VL域能使sFv为抗原结合形成所要求的结构。有关综述参见Pluckthun(单克隆抗体的药理学(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，Vol.113，Rosenburg和Mooreeds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994)。
[059]术语“双体(diabodies)”指带有两个抗原结合位点的小抗体片断，所述片断包括在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变域(variabledomain)(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用很短以致不能在相同链上两个结构域之间配对的连接体。可强迫所述各结构域与另一条链的互补区域配对，并产生两个抗原结合位点。有关双体更详细的描述见例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993)。
[060]术语“线型抗体”指Zapata等(Protein Eng.8(10)：1057-1062，1995)所述的抗体。简言之，这种抗体包括形成一对抗原结合域的一对串联的Fd片断(VH-CH1-VH-CH1)。线型抗体可以具有双重特异性或单一特异性。
[061]本发明可用的代表性单克隆抗体包括小鼠抗-人总VEGF-165单克隆抗体，如在设计用于测定人VEGF-165的Oncogene Science夹心ELISA试剂盒中发现的那些。本发明可用的单克隆抗体用于鉴定各种实验室预测试验(例如临床样本)中的VEGF-165蛋白。
[062]描述此处所用的其它分子生物学技术(包括抗体的制备)的一般内容包括Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques， Methods in Enzymology(分子克隆技术指南，酶学方法)，Vol.152，Academic Press，Inc.)；Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press；Cold Spring Harbor，N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的最新实验设计)，(F.M.Ausabel等.[Eds.]，Current Protocols(最新方案)，a joint venture betweenGreen Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(2000增补本))；Harlow等(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual(克隆抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)，Paul[Ed.])；Fundamental Immunology(基础免疫学)，(Lippincott Williams&Wilkins(1998))；和Harlow等(Using Antibodies：A Laboratory Manual(抗体使用：实验室手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
[063]可将本发明鉴定VEGF-165蛋白使用的抗体以任何常规的方式标记。标记物的实例是辣根过氧化物酶，标记抗体的方法实例是通过使用生物素-链霉抗生物素缀合物。
[064]适当时，可以以任何直接或间接的方式，将用作示踪物的本发明免疫测定法中使用的抗体进行标记，使得产生可见的或能够可见的信号。可检测的标记物质包括放射性核素，如3H、125I和131I；荧光剂，如异硫氰酸荧光素和其它荧光色素、藻胆蛋白质、藻红蛋白、稀土螯合物、得克萨斯红、丹酰(dansyl)和蓝光碱性蕊香红；比色剂(colorimetric reagents)(色原体)；电子-不透明材料，如胶体金；生物发光剂；化学发光剂；染料；酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、α-、β-半乳糖苷酶等；辅酶；酶底物；酶辅因子；酶抑制剂；酶亚单位；金属离子；游离基；或者提供一种检测或测定所形成的免疫复合物的存在或量的方法的任何其它免疫学活性或惰性物质。酶底物组合的实例是辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)，以及碱性磷酸酶和对硝基苯基磷酸酶(pNPP)。
[065]本发明另一种检测和定量系统产生发光信号、生物发光(BL)或化学发光(CL)。在化学发光(CL)或生物发光(BL)测定法中，测定密度或总发射光，并与未知的分析物的浓度相关。可使用光度计(作为检测器的光电倍增管)或电偶合装置定量检测光，或者通过照相或X-射线薄膜定量。使用这种测定法的主要优点是简单并且分析灵敏，能够测定和/或定量极小量的分析物。
[066]发光标记物的实例是吖啶鎓酯、吖啶鎓磺酰甲酰胺、鲁米诺、伞形酮、异氨基苯二酰肼(isoluminol)衍生物、发光蛋白，如水母素和源于萤火虫的萤光素酶、海产细菌、Varqulla和海肾萤光素酶(Renilla)。可将鲁米诺任选与增强剂分子，如4-碘苯酚或4-羟基桂皮酸一起使用。CL信号一般通过在碱性条件下用氧化剂处理产生。
[067]其它的发光检测系统是那些其中信号(检测标记物)通过底物酶反应产生的系统。已研制出CL和BL检测方案以检测碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、辣根过氧化物酶(HRP)和黄嘌呤氧化酶标记物等。AP和HRP是两种酶标记物，其可通过CL和BL反应的范围定量。例如，可将AP与底物一起使用，如金刚烷基1，2-二氧杂环丁烷芳基磷酸酯底物(例如AMPPD或CSPD；Kricka，LJ.，＂Chemiluminescence and Bioluminescence，Analysis by(化学发光和生物发光分析)，＂Molecular Biology and Biotechnology(分子生物学和生物工程)：A Comprehensive Desk Reference(办公桌参考大全)(ed.R.A.Meyers)(VCH Publishers；N.Y.，N.Y.；1995))；例如，4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2’-金刚烷胺]二钠盐，其带有或不带有增强剂分子，如1-(三辛基鏻甲基)-4-(三丁基鏻甲基)苯二氯化物。可将HRP与诸如2’，3’，6’-三氟苯基-甲氧基-10-甲基二氢化吖啶-9-羧酸酯的底物一起使用。
[068]CL和BL反应不仅可适用于分析酶，还适用于分析其它底物、辅因子、抑制剂、金属离子等。例如，鲁米诺、萤火虫荧光素酶和海产细菌荧光素酶反应物分别是产生或消耗过氧化物、ATP和NADPH的指示剂反应物。可将它们与涉及氧化酶、激酶和脱氢酶的其它反应偶联，并可用于测定该偶联反应的任何组分(酶、底物、辅因子)。
[069]可将检测标记直接或间接连接到本发明测定法中所用的抗体上。可检测的标记的间接连接的实例是抗体和标记物之间的结合对的应用或者信号扩增系统的应用。
[070]可用于将抗体与可检测标记物连接的结合对的实例为生物素/卵白素、链霉抗生物素或抗生物素；卵白素/抗-卵白素；甲状腺素/甲状腺素结合球蛋白；抗原/抗体；抗体/抗-抗体；碳水化合物/外源凝集素；半抗原/抗-半抗原；染料和疏水性分子/疏水性蛋白结合位点；酶抑制剂、辅酶或辅因子/酶；多核酸/同染色体多核酸序列；荧光素/抗-荧光素；二硝基苯酚/抗-二硝基苯酚；维生素B12/内在因子；可的松、氢化可的松/氢化可的松结合蛋白；和特异性受体蛋白的配体/膜相关特异性受体蛋白。
[071]标记物与抗体直接或间接连接的各种方法在本领域是熟知的。例如，标记物可以以共价键或非共价键结合。抗体轭合方法的实例在下列文献中描述，Avarmeas等，Scan.J.Immunol.8(Suppl.7)：7，1978；Bayer等，Meth.Enzymol.62：308，1979；Chandler，等.，J.Immunol.Meth.53：187，1982；Ekeke和Abuknesha，J.Steroid Biochem.11：1579，1979；Engvall和Perimann，J.Immunol.109：129，1972；Geoghegan等，Immunol.Comm.7:1，1978；和Wilson和Nakane，免疫荧光法和相关技术(ImmunofluorescenceandRelated Techniques)，Elsevier/North HollandBiomedical Press；Amsterdam(1978)。
[072]依据标记物的性质，可使用各种技术检测和定量标记物。对于荧光剂，可使用很多种荧光计。对于化学发光剂，可用光度计或胶片。使用酶，可通过荧光分析、光度法、分光光度法或视觉上检测或测定荧光性、化学发光性或有色的产物。
[073]其它标记物的实例是各种类型的具有吖啶鎓、苯并吖啶鎓或杂环系统的二氢化吖啶类型的化学发光化合物。吖啶鎓酯的实例包括那些具有杂环或环系统的化合物，其具有正氧化态的杂原子，包括诸如下列的环系统，如吖啶鎓、苯并[a]吖啶鎓、苯并[b]吖啶鎓、苯并[c]吖啶鎓、苯并咪唑阳离子、喹啉鎓、异喹啉鎓、喹嗪鎓(quinolizinium)、环取代的喹啉鎓、菲啶鎓和喹喔啉鎓。
[074]示踪物可通过将所选择的抗体直接或间接连接在吖啶鎓或苯并吖啶鎓酯上存在的活性官能团上来制备，如本领域技术人员熟知的方法(参见，例如Weeks，等.，Clin.Chem.29(8)：1474-1479，1983)。化合物的实例为带有芳环离去基团的吖啶鎓和苯并吖啶鎓酯，其在芳环的对位或间位存在活性官能团(参见，例如美国专利No.4,745,181和WO94/21823)。
[075]此处所用“涉及VEGF途径疗法”包括靶向VEGF途径的任何疗法，包括抑制VEGF蛋白表达(例如反义寡核苷酸)、预防VEGFR激活必要的膜定位或者抑制VEGFR的下游效应器(例如Raf丝氨酸/苏氨酸激酶)。涉及VEGF途径疗法包括多激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体和二芳基脲。
[076]激酶抑制剂的实例是二芳基脲索拉非尼，一种小分子并是新的Raf(一种蛋白-丝氨酸/苏氨酸激酶)和VEGFR(血管内皮生长因子受体，一种受体酪氨酸激酶)的双重作用抑制剂，并且因此是肿瘤细胞增殖和血管生成两种的抑制剂(Onyx Pharmaceuticals，Richmond，CA，和Bayer Pharmaceuticals Corporation，West Haven，CT(USA)；Lyons等，Endocrine-Related Cancer(内分泌腺相关癌)8：219-225，2001)。另外，已发现索拉非尼能抑制涉及肿瘤发展和新血管生成的数种其它受体酪氨酸激酶，包括PDGFR-β、Flt-3和c-KIT。PD166285(Pfizer，Groton，CT)，一种普通的酪氨酸激酶抑制剂，可对抗PDGF和FGF-2-介导的响应(Bansai，等.，J.Neuroscience Res.74(4)：486-493，2003)。
[077]靶向于VEGF途径的其它示例性疗法包括Sutent/SU11248、PTK787、MLN518、PKC-412、CDP860和XL9999。Sutent/SU11248(苹果酸舒尼替尼，一种二氢吲哚-2-酮)(Pfizer，Groton，CT)靶向作用于受体酪氨酸激酶(RTKs)，包括PDGFR，具有抗血管生成和抗肿瘤作用。PDGFR通过调节外膜细胞的增殖和迁移而在培养血管生成中发挥明显作用，外膜细胞是一种支持血管的细胞，并且认为Sutent/SU11248能抑制PDGFR的血管生成作用。
[078]PTK 787(Novartis，Basel瑞士以及Schering AG，Berlin，德国)是一种口服小分子的抗血管生成剂(苯胺酞嗪)，对PDGFR和对VEGFR以及对c-Kit酪氨酸激酶受体具有活性(参见，例如Garcia-Echevera和Fabbro，Mini Reviews in Medicinal Chemistry 4(3)：273-283，2004)。
[079]MLN518(先前被称为CT53518；Millenium Pharmaceuticals，Cambridge，MA)是一种口服的小分子，其被设计为抑制III型受体酪氨酸激酶(RTKs)，包括PDGFR、FLT3和c-Kit。
[080]PKC-412[米哚妥林(midostaurin)；N-苯甲酰基-十字孢碱(十字孢碱(staurosporine)的一种衍生物，一种链霉菌属细菌的产物)；Novartis，Basel，瑞士)抑制PDGFR、VEGFR和多种蛋白激酶Cs，“其对带有PDGFR突变的野生型KIT的患者特别有效”(PKC 412-An Interviewwith Charles Blanke，MD，FACP(www.gistsupport.org/pkc412.html)，还可参见Reichardt，等.，J.Clin.Oncol.23(16S)：3016，2005)。
[081]XL999[几种谱系选择性激酶抑制剂TM(SSKIs)之一，源自Exelixis(South San Francisco，CA，USA)]抑制VEGFR以及其它的RTKs，如PDGFR-β、FGFR1和FLT3。
实施例
[082]此处所述的结构、材料、组合物和方法均指本发明的代表性实例，应清楚的是本发明的范围并不受限于所述实施例的范围。本领域技术人员将了解在实践本发明时，可对所公开的结构、材料、组合物和方法进行改变，并且这些改变被认为在本发明的范围之内。
实施例1.人血清和血浆样本制品的固相夹心微量滴定ELISA
[083]适合VEGF-165 ELISA分析的样本包括用肝素钠、柠檬酸盐或EDTA治疗的人血浆以及人血清。由于可能的干扰因素，在人血清和血浆的制备和测定中必须特别小心。在稀释前，通过微量离心应从样本中除去任何的絮凝剂。进行检测的血清或血浆样本的初浓度应该约为12-13％(用样本稀释剂1:8稀释样品)。例如，可将40μl样本稀释至280μl样本稀释剂中，然后将100μl加入到微量滴定板的各孔中。
操作步骤
[084]以下ELISA实验方案用于夹心ELISA(Oncogene Science，Cambridge，MA)，以测定人血浆或血清中的人VEGF-164。
1.制备洗板的工作溶液(1X)(作为测试试剂盒的部分提供)。
2.加入预稀释的样本和对照物，用吸量管向各适当孔中加入100μL(一式二份)的各个6个VEGF-165标准物(0-8000pg/mL)，各样本和标准物使用干净的吸管。将标准物0加入另一孔中，用作底物空白的测定。
3.用干净的塑料外膜或平板盖(sealer)覆盖各孔。将微量滴定板在37℃下孵育1.5小时。
4.小心除去塑料外膜或平板盖。用每孔300μL洗板缓冲液洗涤各孔，6个循环。(洗涤三个循环，将板旋转180°，然后再洗涤3个循环)。
5.用吸量管向所有各孔中加入100μL检测抗体，除底物空白孔外，该孔保持空的。然后用新塑料膜片覆盖各孔。将微量滴定板在37℃下孵育1小时。
6.通过将适当体积的缀合物浓缩液(1:50稀释)稀释成缀合物稀释液，制备工作缀合物。
7.按步骤4洗涤各孔。立即进行步骤8。
8.用吸量管向所有各孔中加入100μL工作缀合物，除底物空白孔外，该孔保持空的。然后用新塑料膜片覆盖各孔。将微量滴定板在室温(20-27℃)下孵育1小时。
9.通过将等份溶液A和溶液B混合，制备工作底物。6mL各底物溶液将提供12mL工作底物，足以展开一微量滴定板。根据所用的条带数，调节工作底物的体积。充分混合。
10.将工作底物分配到洁净试剂槽内，使其达到室温。
11.按步骤5洗涤各孔。注意：不允许使各板干燥。立即进行步骤12。
12.用吸量管向所有各孔中加入100μL工作底物，然后用塑料膜或平板盖覆盖平板。将微量滴定板在室温(20-27℃)下孵育45分钟。
13.用吸量管向所有各孔中加入100μL终止溶液。
14.使用分光光度计的平板读数计，在650nm波长处测定各孔吸光度。应在加入终止溶液的30分钟内读取各孔。
标准曲线
[085]通过使用VEGF-165标准品(重组人VEGF-165)，在6个不同浓度0、150、1000、3000、5000和8000pg/ml下，构建标准曲线来进行定量分析。
人血清和血浆样本
[086]冷冻血浆样本从被证实患有非小细胞肺癌、并在用索拉非尼治疗前的患者中得到。
实施例2.采自非小细胞肺癌患者的血浆
[087]按照制造商指导，利用Oncogene Science VEGF-165 ELISA(Oncogene Science，Cambridge，MA)，用一式二份样本测定VEGF-165水平。对每名患者测定两份测量结果的平均值。该研究中31名患者的平均VEGF-165水平在表1中报告。表2表示各患者组中放射性测定平均肿瘤皱缩度(shrinkage)。结果表明随响应索拉非尼治疗后显示稳定病情的患者中的平均VEGF-165水平为67.9pg/ml。索拉非尼治疗后仍显示发展性疾病的那些患者具有的平均VEGF-165水平为227.2pg/ml。显示稳定病情的那些患者具有5.1％的平均肿瘤皱缩度，而那些病情发展的患者具有20.6％的平均肿瘤生长。这些结果可示于图1和2中。
表1：VEGF-165
表2：肿瘤皱缩度
Figure A200680047741D00252
[088]以上给出的本发明实施方案的描述目的在于示例性说明和描述。但其并非是穷举的或者将本发明限定于所公开的精确形式，对于以上公开内容，可能存在很多明显的修饰和改变。选择和描述所述实施方案是为了解释本发明的机理及其实际用途，以使得本领域其它技术人员能够利用适于所涉及的具体用途时的各种实施方案以及带有各种修饰的各实施方案中的本发明。在此摘引的所有参考文献均结合到本发明中作为参考。

Claims (36)

1.一种监测患者中与VEGF-165途径有关的疾病状态和/或监测患有该病的患者如何响应治疗的方法，其包括在所取的患者样本中免疫性检测和定量VEGF-165蛋白水平的随时间推移的系列变化，其中VEGF-165蛋白水平随时间推移的增加表明疾病的发展和对该疗法的负性反应，而其中VEGF-165蛋白水平随时间推移的降低表明疾病的减轻和对该疗法的正性反应。
2.权利要求1的方法，其中所述疗法选自多激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体和二芳基脲。
3.权利要求1的方法，其中所述疗法是一种涉及VEGF-165途径的疗法。
4.权利要求2的方法，其中所述涉及VEGF-165途径的疗法是酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼或二芳基脲索拉非尼。
5.权利要求1的方法，其中所述疾病是肿瘤形成前/肿瘤形成疾病。
6.权利要求5的方法，其中所述肿瘤形成前/肿瘤形成疾病选自转移性成神经管细胞瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、胃肠基质瘤、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、甲状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌、血液恶性肿瘤和导致上述癌症的前期癌。
7.权利要求1的方法，该方法还用于所述疾病的预后，其中患者样本中的VEGF-165蛋白水平预示所述患者的较好或较差预后。
8.权利要求7的方法，其中所述预后是选自下列的临床后果：响应率(RR)、完全响应(CR)、部分响应(PR)、稳定的疾病(SD)、进展时间(TTP)、无疾病进展存活期(PFS)、总存活期(OS)和临床益处，其包括完全响应(CR)、部分响应(PR)和稳定的疾病(SD)。
9.权利要求7的方法，其中VEGF-165水平的增加预示早期复发或肿瘤转移的可能性较大。
10.权利要求1的方法，其中所述患者的样本是治疗前样本。
11.权利要求1的方法，其中所述患者样本选自血液、血清、血浆、尿、唾液、精液、乳房分泌液、脑脊髓液、眼泪、痰、粘液、淋巴、细胞溶胶、腹水、胸膜渗出液、羊水、膀胱洗液和细支气管肺泡灌洗液。
12.权利要求1的方法，其中所述体液是血清或血浆。
13.权利要求1的方法，其中所述免疫学检测和定量是通过夹心ELISA或等同的测定法形式的免疫测定法进行的。
14.权利要求13的方法，其中所述夹心ELISA或等同的测定法包括使用一或多种选择性结合VEGF-165蛋白的单克隆抗体。
15.权利要求1的方法，其还包括使用一种免疫测定法检测或者检测和定量患者样本中的一或多种其它蛋白水平。
16.权利要求15的方法，其中所述其它蛋白选自抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肿瘤标记物和肿瘤抑制剂。
17.权利要求16的方法，其中所述抑制剂是金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)，所述癌蛋白选自HER-2/neu和ras p21，所述生长因子受体选自表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生的生长因子受体α(PDGFR-α)，所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，所述转移蛋白是尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)，所述肿瘤标记物是癌胚抗原(CEA)，而所述肿瘤抑制剂是p53。
18.一种对患病病人的治疗选择方法，其包括：
(a)对取自对照群体中各个体的对照样本中的VEGF-165蛋白的平均水平进行免疫学检测和定量；
(b)对取自患者的等量患者样本中的VEGF-165蛋白水平随时间推移的系列变化进行免疫学检测和定量；
(c)将患者样本中VEGF-165蛋白水平与对照样本中VEGF-165蛋白的平均水平相比较；和
(d)根据患者样本中的VEGF-165蛋白水平与对照样本中VEGF-165蛋白的平均水平之间的差别，并根据患者样本中VEGF-165蛋白水平的系列变化，确定是否使用常规疗法和/或涉及VEGF-165途径的疗法治疗患者。
19.权利要求18的方法，其中所述患者的样本是预处理样本。
20.权利要求18的方法，该方法还用于所述疾病的预后，其中患者样本中的VEGF-165蛋白水平预示所述患者的较好或较差的预后。
21.权利要求20的方法，其中所述预后是选自下列的临床后果：响应率(RR)、完全响应(CR)、部分响应(PR)、稳定的疾病(SD)、进展时间(TTP)、无疾病进展存活期(PFS)、总存活期(OS)和临床益处，其包括完全响应(CR)、部分响应(PR)和稳定的疾病(SD)。
22.权利要求18的方法，其中所述疾病是肿瘤形成前/肿瘤形成疾病。
23.权利要求22的方法，其中所述肿瘤形成前/肿瘤形成疾病选自转移性成神经管细胞瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、胃肠基质瘤、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、甲状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌、血液恶性肿瘤和导致上述癌症的前期癌。
24.权利要求18的方法，其中所述患者样本来自对治疗没有响应的癌症患者。
25.权利要求18的方法，其还包括测定或测定并定量患者样本中一或多种其它蛋白的水平的免疫检测法的用途。
26.权利要求25的方法，其中所述其它蛋白是或者所述其它蛋白选自抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肿瘤标记物和肿瘤抑制剂。
27.权利要求26的方法，其中所述抑制剂是金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)，所述癌蛋白选自HER-2/neu和ras p21，所述生长因子受体选自表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生的生长因子受体α(PDGFR-α)，所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，所述转移蛋白是尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)，所述肿瘤标记物是癌胚抗原(CEA)，而所述肿瘤抑制剂是p53。
28.一种在患者中检测与VEGF-165途径相关的疾病的诊断方法，其包括：
(a)对取自对照群体中各个体的对照样本中的VEGF-165蛋白的平均水平进行免疫学检测和定量；
(b)对取自患者的患者样本中的VEGF-165蛋白随时间推移的系列变化进行免疫学检测和定量；和
(c)将患者样本中VEGF-165蛋白水平与对照样本中VEGF-165蛋白的平均水平相比较；
其中患者样本中VEGF-165蛋白水平高于对照样本中VEGF-165蛋白的平均水平为患者中激活的VEGF-165途径和存在疾病的指征。
29.权利要求28的方法，其中步骤(a)和(b)的所述免疫学检测和定量是通过夹心ELISA或等同的测定法形式的免疫测定法进行的。
30.权利要求28的方法，该方法还用于所述疾病的预后，其中患者样本中的VEGF-165蛋白水平为所述患者的较好或较差预后的指征。
31.权利要求30的方法，其中所述预后是一种选自下列的临床结果：响应率(RR)、完全响应(CR)、部分响应(PR)、稳定的疾病(SD)、进展时间(TTP)、无疾病进展存活期(PFS)、总存活期(OS)和临床益处，其包括完全响应(CR)、部分响应(PR)和稳定的疾病(SD)。
32.权利要求28的方法，其中所述疾病是肿瘤形成前/肿瘤形成疾病。
33.权利要求32的方法，其中与激活的PDGF途径相关的所述肿瘤形成前/肿瘤形成疾病选自转移性成神经管细胞瘤、胃肠基质瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、甲状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌、血液恶性肿瘤和导致上述癌症的前期癌。
34.权利要求28的方法，其还包括测定或测定并定量患者样本中一或多种其它蛋白的水平的免疫检测法的用途。
35.权利要求34的方法，其中所述其它蛋白是或者所述其它蛋白选自抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肿瘤标记物和肿瘤抑制剂。
36.权利要求35的方法，其中所述抑制剂是金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)，所述癌蛋白选自HER-2/neu和ras p21，所述生长因子受体选自表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生的生长因子受体α(PDGFR-α)，所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，所述转移蛋白是尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)，所述肿瘤标记物是癌胚抗原(CEA)，而所述肿瘤抑制剂是p53。
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