KR20080073711A - 암의 예측 및 예후 방법, 및 암 치료 모니터링 방법 - Google Patents

암의 예측 및 예후 방법, 및 암 치료 모니터링 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암의 예측 및 예후를 위한 생물지표 및 생물지표의 용도, 뿐만 아니라 암 치료의 효능을 모니터링하기 위한 생물지표의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 멀티-키나아제 억제제를 위한 생물지표로서 VEGF-165 의 용도에 관한 것이다.

Description

암의 예측 및 예후 방법, 및 암 치료 모니터링 방법 {METHODS FOR PREDICTION AND PROGNOSIS OF CANCER, AND MONITORING CANCER THERAPY}
기술분야
본 발명은 암의 예측 및 예후를 위한 생물지표 및 생물지표의 용도, 뿐만 아니라 암 치료의 효능을 모니터링하기 위한 생물지표의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 멀티-키나아제 억제제를 위한 생물지표로서 VEGF-165 의 용도에 관한 것이다.
배경기술
혈관 상피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 및 이들의 리간드, 혈관 상피 성장 인자 (VEGF) 는 상피세포 이행 및 증식에서 중요한 역할을 한다. VEGFR/VEGF 시스템은 3개의 수용체 (VEGFR-1, VEGFR-2, 및 VEGFR-3) 및 4개의 리간드 (VEGF-A, B, C, D, 및 E 그리고 태반 성장 인자) 를 포함한다. VEGF-A 는 추가로 VEGF-A 유전자의 대안적 전사로부터 유도되는, 4개의 이소형태 (isoform), VEGF-121, VEGF-165, VEGF-185, 및 VEGF-204 로 이루어진다. 수용체는 세포내 티로신 키나아제 도메인을 갖는 플라스마 막 관통 (spanning) 단백질이다. 기타 단백질 키나아제와 함께로서, VEGFR 의 활성화는 상피 세포 증식에 대한 신호 조절에서 중 요한 기전이고, VEGFR/VEGF 의 비정상은 건선 및 악성 종양과 같은 다수 인간 질병의 비정상적 혈관신생에 기여한다고 생각된다.
유성생식에 있어서, VEGFR/VEGF 시스템은 혈관 시스템의 정확한 발달을 위해 필수적이다. 성인에 있어서, VEGFR/VEGF 는 상처 치유, 염증 및 혈관신생에 있어서 중요하다.
약물 치료 이전에 환자의 VEGF-165 수준을 산출하기 위한 비(非)침습성 분석은 치료적 결정 과정에 대한 잠재적으로 중요한 부가물이다. 총 VEGF-A 의 분석이 질병 결과의 예후적 표시로서 인간에게 사용되고 있어도, 본 개시까지, 화학 요법 이전에 환자에 있어서 VEGF-165 의 수준과 치료 결과 사이에서의 상관관계가 보고되지 않았다. 그러므로, VEGF-165 는 귀중한 예후적 표시로서, 그리고 멀티 키나아제 억제제를 이용한 치료 효능을 모니터링하기 위한 생물지표로서 작용할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 암의 예측 및 예후를 위한 생물지표 및 생물지표의 용도 뿐만 아니라 암 치료의 효능을 모니터링하기 위한 생물지표의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브 (Sorafenib)) 에 대한 생물지표로서 VEGF-165 의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 로의 치료에 앞서 인간 체액내 VEGF-165 단백질의 수준을 측정하기 위한 정량적 면역측정 의 용도에 관한 것이다. 상기 수준은 상기 치료법으로부터 이익을 얻기 위해 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 로 치료된 암 환자를 위한 가능성의 표시로서 특히 유용하다.
VEGF-165 의 예비치료 수준의 측정은, 환자에 있어서 전종양성/종양성 질병의 상태를 모니터링하기 위해, 및/또는 전종양성/종양성 질병을 갖는 환자가 치료법에 응답하는 방식을 모니터링하기 위해, 환자 치료법 선택을 위한 치료적 보조 수단으로서 임상적으로 사용될 수 있다. 한 구현예에서, VEGF-165 의 수준은 환자 치료법 선택에 일조하는데 사용될 수 있고, 환자 치료법을 위한 최적 방법에 대해 결정하는데 사용될 수 있다.
VEGF-165 의 수준은 하기로 제한되지 않는 환자 샘플, 예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 침, 정액, 유방 삼출액, 수액, 눈물, 가래, 점액, 임파액, 시토졸 (cytosol), 복수, 흉수, 양수, 방광 세척액, 및 기관지폐포세척액에서 측정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 의 예비치료 수준의 측정 및 유사한 환자 결과 대 VEGF-165 수준의 계산도표에 기초한 가능한 결과 평가에 의해 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 로부터 이익을 얻을 것 같은 환자의 선택 방법으로서 면역측정의 용도에 관한 것이다.
환자에 있어서 활성화 VEGF-165 경로에 관련된 질병의 상태 모니터링 방법은 추가로 질병에 대한 예후일 수 있고, 여기에서 환자 샘플에서의 전체 VEGF-165 단백질의 수준은 환자에 대한 양호 또는 불량 치료 결과를 나타낸다. 예후는 반 응율 (response rate; RR), 완전 반응 (complete response; CR), 부분 반응 (partial response; PR), 안정 병변 (stable disease; SD), 임상 이득 [완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR) 및 안정 병변 (SD) 포함], 진행 시간 (time to progression; TTP), 무진행 생존율 (progression free survival; PFS) 및 전반적 생존율 (overall survival; OS) 로 이루어진 군으로부터 선택된 임상적 결과일 수 있다.
상기 방법은 표준 포맷으로, 예를 들어, 샌드위치 효소 결합 면역흡수 측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 또는 동등한 측정법과 같은 샌드위치 면역측정법 형태의 면역측정법일 수 있다. 상기 면역측정법은 단일클론 항체, 예컨대, 항-VEGF-165 단일클론 항체를 사용할 수 있다. 더욱이, 단일클론 항체는 비오틴화될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는, 질병, 예를 들어, 전종양성/종양성 질병을 갖는 환자를 위한 치료법 선택 방법으로서, 환자 샘플내 전체 VEGF-165 단백질의 수준의 시리얼 변화를 측정하기 위한 정량적 면역측정법에 관한 것이다.
예로서, 한가지 상기 치료 선택법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) 대조 개체군으로부터 샘플내 전체 VEGF-165 단백질 수준의 면역학적 검출 및 정량화 단계;
(b) 시간에 따라 환자로부터 채취된 샘플내 전체 VEGF-165 단백질 수준의 면역학적 검출 및 정량화 단계; 및
(c) 환자 샘플내 VEGF-165 단백질 수준에 기초하여 환자를 치료하기 위한 종래 치료법 및/또는 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 치료법의 사용 결정 단 계.
예를 들어, 환자 샘플내 VEGF-165 단백질 수준이 70 pg/ml 초과로 측정되면, 환자가 VEGF 구동 질병을 갖는 것으로 결론낼 수 있고, 환자를 치료하기 위해 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 치료법을 단독으로 또는 하나 이상의 기타 치료법과 함께 사용하는 것을 결정할 수 있다.
VEGF-165 경로 유도 치료법은 멀티-키나아제 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 비스-아릴 우레아, VEGFR-2 의 안티센스 억제제 또는 단일클론 항체 치료법 등일 수 있다. 예를 들어, VEGF-165 경로 유도 치료법은, 혈관신생 억제제 뿐만 아니라 티로신 키나아제 억제제, 또는 티로신 키나아제 억제제, STI571 (또한 이마티니브 (imatinib) 메실레이트 또는 Gleevec® 로 공지됨) 인, 비스-아릴 우레아 소라페니브일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 하나 이상의 기타 단백질(들) 수준과 조합으로 VEGF-165 수준의 변화를 검출하기 위한 정량적 면역측정법의 용도에 관한 것이다. 상기 부가적 단백질(들)은, 예를 들어, 억제제 (예. 메탈로프로테이나아제-1 의 조직-억제제 (TIMP-1)), 종양단백질 (예. HER-2/neu, ras p21), 성장 인자 수용체 (예. 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 알파 (PDGFR-α)), 전이 단백질 (예. 유로키나제형 플라스미노겐 활성제 (urokinase-type plasminogen activator; uPA)), 종양 마커 (예. 암배아성 항원 (CEA)), 및 종양 억제제 (예, p53) 를 포함할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어, 진단/예후 장비, 질병에 걸린 환자에 대한 치료법 선택, 환자의 질병 상태의 모니터링 및 질 병에 걸린 환자가 VEGF 경로 유도 또는 기타 치료법에 반응하는 방식의 모니터링으로서 사용될 수 있다. 가장 유망한 치료 결과를 위한 적합한 치료 조합을 선택하기 위해 임상적 원근 치료 자원, 및 진단/예후 변수를 확대하기 위한 수단으로서, VEGF-165 경로를 활성화하는 단백질과 같은 전체 VEGF-165 및 부가 단백질 모두에서의 시리얼 변화를 위해 환자 (예. 암 환자) 를 시험하는 것이 유익할 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은, 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함하는, 환자 샘플에 있어서 치료제의 효능을 모니터링하기 위한 시험 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 키트는 추가로 키트 사용을 위한 설명서를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 추가로 세포, 검출가능한 태그 또는 라벨을 매달거나 고정하기 위한 용액, 폴리펩티드를 항체의 결합에 용이하게 하기 위한 용액, 세포를 용해하기 위한 용액 또는 폴리펩티드의 정제를 위한 용액을 포함할 수 있다. 또다른 추가 구현예에서, 항체는 VEGF-165 에 대해 특이적이다.
도 1 은 안정 및 진행성 병변을 위한 환자 개체군에 있어서 중간 VEGF-165 수준을 나타낸다.
도 2 는 안정 및 진행성 병변을 위한 환자 개체군에서 측정된 평균 종양 수측율을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명이 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포 라인, 동물 종 또는 속, 구성 및 시약에 제한되지 않고 그대로 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어가 특정 구현예 만을 기재할 목적이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 한정하는 의도는 아님을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 첨부된 청구범위에서, 단수는 본문에서 달리 명확하게 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "유전자" 에 대한 언급은 하나 이상의 유전자에 대한 언급이고, 종래 기술에 공지된 이의 등가물 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 전체 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 동일 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 임의의 방법, 장치 및 물질 또는 등가물이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있어도, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 이제 기재된다.
본원에 언급된 전체 공보 및 특허는, 예를 들어, 현재 기재된 발명과 관련하여 사용될 공보에 기재되는 구성 및 방법의 기재 및 개시 목적으로 참조로서 본원에 포함된다. 상기 개시되고 명세서 전반에 걸친 공보는 본 출원의 출원일에 앞서 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 선행 발명에 의해 상기 개시를 앞당기도록 본 발명자에게 제공된 승인으로서 본원에서 추론되지 않는다.
정의
편의상, 상세한 설명, 실시예 및 첨부 청구범위에서 사용된 특정 용어 및 구의 의미는 아래 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "환자 샘플" 은 환자로부터 수득된 샘플을 언급한다. 샘플은 임의의 생물학적 조직 또는 유체일 수 있다. 샘플은 환자로부터 유래된 샘플일 수 있다. 상기 샘플은, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 침, 정액, 유방 삼출액, 수액, 눈물, 가래, 점액, 임파액, 시토졸, 복수, 흉수, 양수, 방광 세척액, 및 기관지폐포세척액, 혈액 세포 (예. 백혈구), 조직 또는 생체 샘플 (예. 종양 생체), 또는 이들로부터의 세포를 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 또한 조직의 절편, 예컨대, 조직학적 목적으로 선택된 냉동 절편을 포함할 수 있다.
용어 "생물지표" 는 광범위의 세포내 및 세포외 결과 뿐만 아니라 전체 유기체 생리학적 변화를 포함한다. 생물지표는 본질적으로 세포 기능의 임의의 측면, 예를 들어, 신호 분자, 전사 인자, 대사물질, 유전자 전사체 뿐만 아니라 단백질의 후번역 변형물의 수준 또는 비율을 나타내지만 여기에 제한되지 않는다. 생물지표는 전사 수준의 전체 게놈 분석 또는 단백질 수준 및/또는 변형물의 전체 단백질 유전 정보 분석을 포함할 수 있다.
생물지표는 또한 비(非)치료된 병든 세포에 비교되는 질병을 갖는 대상체의 화합물 치료된 병든 세포에서 과잉발현 또는 과소발현되는 유전자 또는 유전자 생성물을 언급할 수 있다. 즉, 소형 분자의 효능의 동정, 예측 또는 검출을 위 해, 유전자 또는 유전자 생성물은, 임의로 기타 유전자 또는 유전자 생성물과 함께, 사용될 수 있는 치료된 세포에 충분히 특이적이다. 따라서, 생물지표는 병든 세포에서 또는 화합물에 의한 치료에 대한 병든 세포의 반응에서 화합물의 효능 특징인 유전자 또는 유전자 생성물이다.
용어 "암" 은 고형 종양, 예컨대, 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상샘, 부갑상샘, 및 이들의 원거리 전이의 암을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 상기 용어는 또한 임파종, 육종 및 백혈병을 포함한다.
유방암의 예는 침습성 관상 암종, 침습성 소엽 암종, 상피내 관상 암종 및 상피내 소엽 암종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
기도암의 예는 소세포 및 비(非)소세포 폐 암종, 뿐만 아니라 기관지선종 및 흉막폐아세포종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
뇌암의 예는 뇌간 및 하이포프탈믹(hypophtalmic) 신경교종, 소뇌 및 대뇌 별아교세포종, 속질모세포종, 뇌실막세포종, 뿐만 아니라 신경외배엽 종양 및 솔방울샘 종양을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
남성 생식 기관의 종양은 전립선암 및 고환암을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 여성 생식 기관의 종양은 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암 및 외음부 암, 뿐만 아니라 자궁의 암종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
소화관의 종양은 항문암, 결장암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 타액선암을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
요로의 종양은 방광암, 음경암, 신장암, 신우암, 요로암 및 여성요도암을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
안암 (eye cancer) 은 안내 흑색종 및 망막아종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
간암의 예는 간세포 암종 (섬유층판형 변이형이 있거나 없는 간세포 암종), 담관암종 (간내담관 암종), 및 혼합 간세포-담관세포암종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
피부암은 편평세포 암종, 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 악성 흑색종, 메르켈 (Merkel) 세포 피부암, 및 비(非)흑색종 피부암을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
두경부암은 후두암 / 하인두암 / 비인두암 / 구인두암, 및 구순암과 구강암을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
임파종은 AIDS-관련 임파종, 비호지킨 임파종, 피부 T세포 임파종, 호지킨 질병, 중추 신경계의 임파종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
육종은 연조직의 육종, 골육종, 악성섬유조직구종, 임파 육종 및 횡문근육종을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 모발성 세포 백혈병을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체" 는 포유류 (예. 인간 및 동물) 을 포함한다.
본 발명은 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 단백질의 수준을 측정하는 정량적 면역측정에 관한 것이다. 상기 측정은 VEGF-165 경로에 관련된 질병의 환자에 대한 치료법 선택에 유용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "VEGF-165 경로" 는 VEGF-165 단백질의 과발현 또는 돌연변이에 의해 활성화된 VEGF-165 경로로서 정의되고, 그대로 과잉발현된 및/또는 돌연변이 자극된 VEGF-165 경로를 포함한다.
활성화 VEGF-165 경로에 관련된 종양성 질병, 뿐만 아니라 종양성 질병을 초래하는 전암 (precancer) 의 예는 하기이다: 전이성 수모세포종, 위장관 간질종양 (GIST), 융기성 피부섬유육종 (DFSP), 만성 골수증식성 질환 (CMPD), 결장직장암, 결장암, 폐암, 비소세포 (non-small-cell) 폐암, 소세포 폐암, 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 췌장암, 방광암, 신장암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 뇌종양, 간세포암, 및 혈액 종양. 따라서, VEGF-165 단백질의 수준은, 단독 또는 기타 단백질 (예. 기타 종양단백질) 의 수준과 조합으로, 임상적 결과 예측 및/또는 치료법 선택의 보조로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 암환자가 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 로의 치료로부터 이익을 얻는 가능성을 측정하기 위해 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 수준 (예. 순환형 VEGF-165 수준) 을 정량적으로 측정하기 위한 면역측정의 적용을 개시하고 청구한다.
본 발명의 한 구현예에서, VEGF-165 단백질은 진단 시 또는 치료에 앞서 작 성된 환자 샘플에서 정량화된다. 상기 환자 샘플은, 예를 들어, 기타 체액 샘플 중에서, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 정액, 유방 삼출액, 수액, 눈물, 가래, 점액, 임파액, 시토졸, 복수, 흉수, 양수, 방광 세척액, 및 기관지폐포 세척액일 수 있다. 환자 샘플은 신선 또는 냉동일 수 있고, 헤파린, 시트레이트 또는 EDTA 로 처리될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 면역치료의 예로서는 샌드위치 ELISA 이다. 그러나, 본원에 개시된 것 이외에, 기타 방법이 사용되어 환자 샘플에서 VEGF-165 단백질을 정량화시킬 수 있음이 인식될 수 있다. 더욱이, 다수의 검출 방법이 사용되어 VEGF-165 단백질, 예컨대, 발광성 라벨을 가시화시킬 수 있다.
다수의 포맷이 본 발명의 방법으로 사용에 채택될 수 있다. 예를 들어, 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 단백질의 검출 및 정량화는, 종래 기술에 통상적으로 공지된 기타 측정 중에서, 효소 결합 면역흡수 측정법, 표지면역 측정법, 이중 항체 샌드위치 측정법, 응집반응 측정법, 형광 면역측정법, 면역전자 및 주사 현미경법으로 수행될 수 있다. 상기 측정법에 있어서 VEGF-165 단백질의 정량화는 종래 기술에 공지된 종래 방법으로 채택될 수 있다. 한 구현예에서, 순환 VEGF-165 단백질 수준의 시리얼 변화는 포획 항체가 지지체의 표면 위에서 종래 기술을 이용하여 고정되는 샌드위치 측정법으로 검출 및 정량화될 수 있다.
적합한 지지체는, 예를 들어, 합성 중합체 지지체, 예컨대, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 치환 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 (예컨대, 폴리아미드 및 폴리비닐클로라이드), 유리 비즈, 아가로오스 및 니트로셀룰로오스를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 ELISA 샌드위치 면역측정법의 예는 포획 항체로서 정제된 마우스 항-인간 VEGF-165 단일클론 항체 및 검출 항체로서 비오틴화 염소 항-인간 VEGF-165 다클론 항체를 이용한다. 포획 단일클론 항체는 마이크로티터 플레이트 웰 위에서 고정된다. 희석된 인간 혈청/혈장 샘플 또는 VEGF-165 표준형 (재조합 야생형 VEGF-165 단백질) 은 포획 단일클론 항체에 의해 VEGF-165 항원을 결합시키기 위해 웰에서 접종된다. 웰의 세척 후, 고정된 VEGF-165 항원은 비오틴화 검출 항체에 노출된 후 웰이 다시 세척된다. 그 다음 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다아제 접합물을 첨가한다. 최종 세척 이후, TMB 청색 기질 (Blue Substrate) 이 웰에 첨가되어 결합된 퍼옥시다아제 활성을 검출한다. 반응은 2.5 N 황산의 첨가로 멈춰지고, 흡광도는 450 nm 에서 측정된다. 샘플의 흡광도 값과 VEGF-165 표준형의 상관관계로는 혈청 또는 혈장의 pg/ml 로 VEGF-165 의 정량값을 측정한다.
기타 단백질 (예. 억제제, 종양 단백질, 성장 인자 수용체, 혈관신생 인자, 전이 단백질, 종양 마커, 종양 억제제, VEGF 경로에 관련된 단백질) 이 VEGF-165 와 조합으로 검출 및 정량화에 적합할 수 있음이 인식될 수 있다. 예를 들어, VEGF-165 와 함께 시험에 적합한 기타 단백질은 메탈로프로테이나아제-1 (TIMP-1), HER-2/neu, ras p21, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제형 플라스미노겐 활성제 (uPA), 암배아성 항원 (CEA) 및 p53 의 조직 억제제를 포함한다. 상기 기타 단백질은 종래 기술의 당업자에 공지된 측정법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, HER-2/neu 및 TIMP-1 의 정량 검출법은, 인간 혈청 또는 혈장에 있어서 TIMP-1 수준의 ng/ml 값을 검출할 수 있는 Oncogene Science TIMP-1 ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA (USA)) 와 같이 시판된다.
VEGF-165 의 예비치료 수준의 모니터링은 멀티-키나아제 억제제 (예. 소라페니브) 로의 치료에 따른 임상적 결과를 나타낼 수 있다. 임상적 결과의 한 평가 방법은 반응율 (RR), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정 병변 (SD), 임상 이득 (완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR) 및 안정 병변 (SD) 포함), 진행 시간 (TTP), 무진행 생존율 (PFS) 및 전반적 생존율 (OS) 의 평가일 수 있다.
본원에서 용어 "항체" 는 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 단일클론 항체 (전신 단일클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예. 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 항체는 종래 방법 및/또는 유전 공학으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 VEGF-165 에 결합하는 항체를 포함한다.
"항체 단편" 은 전신 항체, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변형 도메인의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 항체 단편으로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디 (diabodies); 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 이중특이적 항체; 및 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 균일성 항체의 개체군으로부터 수득된 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일 개체군을 포함하는 개별 항체를 언급한다. 단일클론 항체는 고 특이적, 즉, 단일 항원성 부위에 대해 유도된다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정인자 (항원결정인자) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 종래 (다클론) 항체 제제와 대조로, 각 단일클론 항체는 항원에 관한 단일 결정인자에 대해 유도된다. 변경 유전자 "단일클론" 은 실질적으로 항체의 균일 개체군으로부터 수득됨에 따라 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요구하는 것으로 파악되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 먼저 Kohler, et al., (Nature 256:495, 1975) 에 의해 기재된 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예. U.S. 특허 No. 4,816,567 참고) 에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 또한 예를 들어, Clackson, et al., (Nature 352:624-628, 1991) 및 Marks, et al., (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991) 에 기재된 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 단일클론 항체는 또한, 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 강 또는 아강에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 동족인 한편, 사슬(들)의 나머지가 또다른 종으로부터 유도되거나 또다른 항체 강 또는 아강에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 동족인 "키메릭(chimeric)" 항체 (면역글로불린), 뿐만 아니라 상기 항체의 단편을 포함한다 (예. U.S. 특허 No. 4,816,567; 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984 참고).
비(非)인간 (예. 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체이다. 대부분, 인간화 항체는, 목적하는 특이성, 친화성 및 성능을 갖는 마우스, 렛트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여체 항체) 으로부터의 극가변 부위 잔류물에 의해 수용체의 극가변 부위 잔류물이 대체되는 인간 면역글로불린 (수용체 항체) 이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 골격 부위 (FR) 는 상응하는 비인간 잔류물에 의해 대체될 수 있다. 더욱이, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔류물을 포함할 수 있다. 상기 변형이 실시되어 추가로 항체 성능을 개량시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 1 개 이상 또는 전형적으로 2 개의 가변형 도메인 전체를 포함할 수 있고, 여기에서 가변형 부위 전체 또는 실질적으로 전체는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 전체 또는 실질적으로 전체는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 면역글로불린 일정 부위 (Fc) 의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 검토를 위해, Jones, et al., (Nature 321 :522-525, 1986); Reichmann, et al., (Nature 332:323-329, 1988); 및 Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992) 참고.
"단일사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기에서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴 리펩티드는 추가로 sFv 로 항원 결합을 위한 목적 구조를 형성할 수 있는 VH 과 VL 도메인 사이에서 폴리펩티드 링커를 포함한다. 검토를 위해, Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994) 참고.
용어 "디아바디" 는 2개 항원 결합 위치를 갖는 소형 항체 단편을 언급하고, 여기에서 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 에서 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 동일 사슬 위에 2개 도메인 사이에서 쌍으로 만들기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 보상 도메인으로 쌍으로 만들고 2개의 항원 결합 위치를 만드는데 집중된다. 디아바디는 더욱 완전히, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161 ; 및 Hollinger, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993) 에 기재되어 있다.
표현 "선형 항체" 는 Zapata, et al., (Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995) 에 기재된 항체를 언급한다. 간단히, 상기 항체는 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한 쌍의 탠덤 (tandem) Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1) 을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본 발명에 따라 유용한 대표적인 단일클론 항체는 마우스 항인간 전체 VEGF-165 단일클론 항체, 예컨대, 인간 VEGF-165 를 측정하기 위해 고안된 Oncogene Science sandwich ELISA 키트에서 알아낸 것을 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 단일클론 항체는 각종 실험실 예후 시험에서의 VEGF-165 단백질, 예를 들어, 임 상 샘플을 동정하는 작용을 한다.
항체의 제조를 포함하여, 본원에서 유용한 부가적 분자 생물학 기술을 기재하는 일반 본문은 Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (supplemented through 2000)); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); 및 Harlow, et al., (Using Antibodies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)) 을 포함한다.
VEGF-165 단백질을 동정하기 위해 본 발명에 따라 유용한 항체는 임의의 종래 방식으로 라벨화될 수 있다. 라벨의 예는 양고추냉이 퍼옥시다아제이고, 항체 라벨화 방법의 예는 비오틴-스트레파비딘 복합체를 이용하는 것이다.
적합하게, 추적자로서 사용되는 본 발명의 면역측정법에서 사용되는 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 가시적이거나 또는 가시적으로 될 수 있는 신호가 되는 임의의 방식으로 라벨화될 수 있다. 검출가능한 마커 물질은 방사성핵종, 예컨대, 3H, 125I, 및 131I; 형광물질, 예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 기타 형광색소, 피코빌리단백질 (phycobiliprotein), 피코에리틴 (phycoerythin), 희토류 킬레이트, 텍사스 레드 (Texas red), 단실 (dansyl) 및 로다민 (rhodamine); 비색계 시약 (색원체); 전자-불투명 재료, 예컨대, 콜로이드성 금; 생물냉광제 (bioluminescer); 화학냉광제 (chemiluminescer); 염료; 특히, 효소, 예컨대, 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 글루코오스 옥시다아제, 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 아세틸콜린스테라아제, 알파-, 베타-갈락토시다아제; 보조효소; 효소 물질; 효소 보조인자; 효소 억제제; 효소 서브유니트; 금속 이온; 유리 라디칼; 또는 형성되는 면역복합체의 존재 또는 양의 검출 또는 측정 수단을 제공하는 임의의 기타 면역학적 활성 또는 불활성 물질을 포함한다. 효소 기질 조합물의 예는 양고추냉이 퍼옥시다아제 및 테트라메틸 벤지딘 (TMB), 그리고 알칼리 포스파타아제 및 파라니트로페닐 포스페이트 (pNPP) 이다.
본 발명에 따른 또다른 검출 및 정량화 시스템은 발광 신호, 생물발광 (BL) 또는 화학발광 (CL) 을 만들어낸다. 화학발광 (CL) 또는 생물발광 (BL) 측정에서, 강도 또는 총 발광은 미지 분석물의 농도에 따라 측정되고 관련된다. 광은 휘도계 (검출기로서 광전자 증배관) 또는 전하 결합 소자를 이용하여 정량적으로, 또는 사진 필름 또는 X-선 필름을 이용하여 정성적으로 측정될 수 있다. 상기 측정 이용의 주요 이점은, 극소량의 분석물을 검출 및/또는 정량화시키는, 이들의 간편성 및 분석적 민감성이다.
예시적 발광 라벨은 아크리디늄 에스테르, 아크리디늄 술포닐 카르복사미드, 루미놀 (luminol), 움벨리페론 (umbelliferone), 이소루미놀 유도체, 발광단백질, 예컨대, 에쿼린 (aequorin), 및 반딧불이, 해양 박테리아, 바르콸라 (Varqulla) 및 레닐라 (Renilla) 로부터의 루시페라아제 (luciferase) 이다. 루미놀은 임의로 강화제 분자, 예컨대, 4-요오도페놀 또는 4-히드록시신남산과 함께 사용될 수 있다. 전형적으로, CL 신호는 염기성 조건 하에서 산화제로의 처리로 발생된다.
부가적 발광 검출 시스템은 신호 (검출가능한 마커) 가 기질 상의 효소 반응에 의해 생성되는 것이다. CL 및 BL 검출 방식은 특히 알칼리 포스파타아제 (AP), 글루코오스 옥시다아제, 글루코오스 6-포스페이트 데히드로게나아제, 양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 및 크산틴-옥시다아제 라벨을 측정하기 위해 개발되었다. AP 및 HRP 는 CL 및 BL 반응의 범위에 의해 정량화될 수 있는 2개 효소 라벨이다. 예를 들어, AP 는 기질, 예컨대, 아다만틸 1,2-디옥세탄 아릴 포스페이트 기질 (예. AMPPD 또는 CSPD; Kricka, LJ., "Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis by, "Molecular Biology and Biotechnology : A Comprehensive Desk Reference (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y., N.Y.; 1995)); 예를 들어, 4-메톡시-4-(3-포스페이트페닐) 스피로 [1,2-디옥세탄-3,2'-아다만탄] 의 2나트륨 염과 함께, 강화제 분자, 예컨대, 1-(트리옥틸포스포늄 메틸)-4-(트리부틸포스포늄 메틸) 벤젠 디오클로라이드 있거나 없이 사용될 수 있다. HRP 는 기질, 예컨대, 2',3',6'-트리플루오로페닐-메톡시-10-메틸아크리단-9-카르복실레이트와 함께 사용될 수 있다.
CL 및 BL 반응은 효소 뿐만 아니라 기타 기질, 보조인자, 억제제, 금속 이온 등의 분석용으로 채택될 수 있다. 예를 들어, 루미놀, 반딧불이 루시퍼라아제 및 해양 박테리아 루시퍼라아제 반응은 각각 퍼옥시드, ATP 및 NADPH 의 생산 또는 소비에 대한 표시 반응이다. 이들은 옥시다아제, 키나아제 및 데히드로게나아제를 포함하는 기타 반응에 커플링될 수 있고, 커플링된 반응의 임의의 성분 (효소, 기질, 보조인자) 을 측정하는데 사용될 수 있다.
검출가능한 마커는 본 발명의 측정에 사용되는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 검출가능한 라벨의 간접 연결의 예는 항체와 마커 사이의 결합 쌍의 사용 또는 신호 증폭 시스템의 사용이다.
검출가능한 마커에 항체를 연결하는데 사용될 수 있는 결합 쌍의 예는 비오틴/아비딘, 스트렙타비딘 또는 안티비오틴; 아비딘/안티아비딘; 티록신 (thyroxine)/티록신 결합 글로불린; 항원/항체; 항체/항항체; 탄수화물/렉틴 (lectin); 합텐 (hapten)/안티합텐 항체; 염료 및 소수성 분자/소수성 단백질 결합 위치; 효소 억제제, 보조효소 또는 보조인자/효소; 폴리핵산 (polynucleic acid)/동족성 폴리핵산 서열; 플루오레세인/안티플루오레세인; 디니트로페놀/안티디니트로페놀; 비타민 B12/고유인자; 코르티손, 코르티솔/코르티솔 결합 단백질; 및 특이적 수용체 단백질에 대한 리간드/막 관련 특이적 수용체 단백질이다.
항체에 직접적으로 또는 간접적으로 라벨을 연결하기 위한 각종 수단이 종래 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 라벨은 공유 결합 또는 비공유결합될 수 있다. 예시적 항체 접합 방법은 Avarmeas, et al., Scan. J. Immunol. 8(Suppl. 7): 7, 1978); Bayer, et al., Meth. Enzymol. 62:308, 1979; Chandler, et al., J. Immunol. Meth. 53:187, 1982; Ekeke and Abuknesha, J. Steroid Biochem. 11:1579, 1979; Engvall and Perlmann, J. Immunol. 109:129, 1972; Geoghegan, et al., Immunol. Comm. 7:1, 1978; 및 Wilson and Nakane, Immunofluorescence and Related Techniques, Elsevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978) 에 기재되어 있다.
라벨 성질에 따라, 각종 기술이 라벨의 검출 및 정량화에 사용될 수 있다. 형광물질에 대해, 다수의 형광계가 이용가능하다. 화학냉광제에 대해, 발광계 또는 필름이 이용가능하다. 효소로, 형광성, 화학냉광성 또는 착색 생성물이 형광계적으로, 발광계적으로, 분광광도계적으로 또는 가시적으로 측정 또는 평가될 수 있다.
헤테로시클릭 고리 시스템의 아크리디늄, 벤즈아크리디늄 또는 아크리단 유형을 갖는 각종 유형의 화학발광성 화합물은 라벨의 다른 예이다. 아크리디늄 에스테르의 예는, 아크리디늄, 벤즈[a]아크리디늄, 벤즈[b]아크리디늄, 벤즈[c]아크리디늄, 벤지미다졸 양이온, 퀴놀리늄, 이소퀴놀리늄, 퀴놀리지늄, 시클릭 치환 퀴놀리늄, 페난트리디늄 및 퀴녹살리늄과 같은 고리 시스템을 포함하는, 양의 산화 상태에서 헤테로원자를 함유하는 헤테로시클릭 고리 또는 고리 시스템을 갖는 화합물을 포함한다.
종래 기술 (예. Weeks, et al., Clin. Chem. 29(8): 1474-1479, 1983 참고) 의 당업자에 널리 공지된 바와 같이, 추적자는 직접적으로 또는 간접적으로 아크리 디늄 또는 벤즈아크리디늄 에스테르 위에 존재하는 반응성 작용기를 선택된 항체에 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 화합물의 예는 아릴 고리의 파라 또는 메타 위치에서 존재하는 아릴 고리 이탈기 및 반응성 작용기를 갖는 아크리디늄 및 벤즈아크리디늄 에스테르이다 (예. U.S. 특허 No. 4,745,181 및 WO 94/21823 참고).
본원에서 사용된 바와 같은 "VEGF 경로 유도 치료법" 은, VEGF 단백질 발현 (예. 안티센스 올리고뉴클레오티드) 의 억제, VEGFR 활성화에 필수적인 막 국소화의 방지, 또는 VEGFR 의 다운스트림 작동인자 (예. Raf 세린/트레오닌 키나아제) 의 억제를 포함하여, VEGF 경로를 목표로 하는 임의의 치료법을 포함한다. VEGF 경로 유도 치료법은 멀티-키나아제 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 단일클론 항체 및 비스-아릴 우레아를 포함한다.
키나아제 억제제의 예는 비스-아릴 우레아 소라페니브, 소형 분자 및 양쪽 Raf (단백질-세린/트레오닌 키나아제) 및 VEGFR (혈관 상피 성장 인자 수용체, 수용체 티로신 키나아제) 의 신규 이중 작용 억제제, 그리고 결과적으로 양쪽 종양 세포 증식 및 혈관신생의 억제제 (Onyx Pharmaceuticals, Richmond, CA, and Bayer Pharmaceuticals Corporation, West Haven, CT (USA); Lyons, et al., Endocrine-Related Cancer 8:219-225, 2001) 이다. 또한, 소라페니브는, PDGFR-β, Flt-3 및 c-KIT 를 포함하여, 종양 진행 및 신생혈관증식에 관련된 몇몇 기타 수용체 티로신 키나아제를 억제한다고 알려졌다. 일반 티로신 키나아제 억제제인 PD166285 (Pfizer, Groton, CT) 는 양쪽 PDGF 및 FGF-2-매개 반응을 대항할 수 있다 (Bansai, et al., J. Neuroscience Res. 74(4):486-493, 2003).
VEGF 경로를 목표로 하는 기타 예시적 치료법은 하기를 포함한다: Sutent/ SU11248, PTK 787, MLN518, PKC-412, CDP860, 및 XL9999. Sutent/SU11248 (서니티니브 (sunitinib) 말레이트; 인돌린-2-온) (Pfizer, Groton, CT) 은 항혈관신생 및 항종양 효과를 갖는, PDGFR 을 포함하는 수용체 티로신 키나아제 (RTK) 를 목표로 한다. PDGFR 은 혈관을 지지하는 세포인 주위세포의 증식 및 이행을 조절함으로써 혈관신생을 촉진시키는 중요한 역할을 하고, Sutent/SU 11248 는 PDGFR 의 혈관신생 작용을 억제한다고 여겨진다.
PTK 787 (Novartis, Basel, Switzerland and Schering AG, Berlin, Germany) 은 PDGFR, 뿐만 아니라 VEGFR 및 c-Kit 티로신 키나아제 수용체에 대해 활성인 경구 소형 분자 항혈관신생 제제 (아닐리노프탈라진) 이다 (예. Garcia-Echevera and Fabbro, Mini Reviews in Medicinal Chemistry 4(3):273-283, 2004 참고).
MLN518 (이전에 CT53518 로서 공지됨; Millenium Pharmaceuticals, Cambridge, MA) 은, PDGFR, FLT3 및 c-Kit 를 포함하여, 유형 III 수용체 티로신 키나아제 (RTK) 를 억제하도록 고안된 경구 소형 분자이다.
PKC-412 [미도스타우린 (midostaurin); N-벤조일-스타우로스포린 (staurosporine) (스타우로스포린의 유도체, 스트렙토마이세스 박테리아의 생성물); Novartis, Basel, Switzerland)] 는 "PDGFR 에서 돌연변이와 함께 야생형 KIT 의 환자에 있어서 특히 매력적으로 만드는" PDGFR, VEGFR 및 다중 단백질 키나아제 Cs 를 억제한다 (PKC 412-An Interview with Charles Blanke, MD, FACP (www.gistsupport.org/pkc412.html); 또한 Reichardt, et al., J. Clin. Oncol. 23(16S):3016, 2005 참고).
XL999 (몇몇 Spectrum Selective Kinase Inhibitors™ (SSKI) from Exelixis (South San Francisco, CA, USA) 중 하나] 는 VEGFR, 뿐만 아니라 기타 RTK, 예컨대, PDGFR-베타, FGFR1 및 FLT3 을 억제한다.
실시예
본원에서 기재된 구조, 재료, 조성물 및 방법은 본 발명의 대표예인 것을 의도하고, 본 발명의 범위가 실시예의 범위로 제한되지 않음이 이해될 것이다. 종래 기술의 당업자는 본 발명이 개시된 구조, 재료, 조성물 및 방법에 관한 변형으로 실시될 수 있고, 상기 변형이 본 발명의 범위내로서 여겨짐을 인식할 것이다.
실시예 1. 인간 혈청 및 혈장 샘플 제조를 위한 고상 샌드위치 마이크로티터 ELISA
VEGF-165 ELISA 에 의한 분석에 적합한 샘플은 헤파린, 시트레이트, 또는 EDTA 그리고 인간 혈청으로 처리된 인간 혈장을 포함한다. 가능한 방해 인자로 인해, 인간 혈청 및 혈장의 제조 및 분석을 특히 주의해야 한다. 희석에 앞서 마이크로원심분리에 의해 샘플로부터 임의의 응집제 재료를 제거해야 한다. 시험받는 혈청 또는 혈장 시료의 초기 농도는 약 12 - 13 % (샘플 희석제내 시료의 1:8 희석액) 이어야 한다. 예를 들어, 40 ㎕ 의 샘플을 280 ㎕ 의 샘플 희석제 속에 희석시키고, 100 ㎕ 를 마이크로플레이트 웰에 첨가하였다.
측정 과정
하기 ELISA 프로토콜은 인간 혈장 또는 혈청에서 인간 VEGF-164 를 측정하기 위해 샌드위치 ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA) 로 사용되는 것이다.
1. (측정 키트의 일부로서 제공된) 플레이트와시 (Platewash) 의 작업 용액 (1X) 을 제조한다.
2. 미리희석된 샘플 및 대조군을 첨가한다 (각 샘플 및 표준에 대해 깨끗한 피펫 끝을 이용하여 적합한 웰 속에 100 ㎕ 를 피펫으로 잰 각각의 6개 VEGF-165 표준 (0 내지 8000 pg/mL) 2배). 바탕 기질의 측정에 사용되도록 표준 0 을 부가 웰에 첨가한다.
3. 웰을 깨끗한 플라스틱 랩 또는 플레이트 밀봉기로 덮는다. 마이크로티터 플레이트를 1.5 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션한다.
4. 조심해서 플라스틱 랩 또는 플레이트 밀봉기를 제거한다. 플레이트와시 완충액의 6회 순환으로 웰당 300 ㎕ 를 이용하여 웰을 세척한다 (3회 순환 동안 세척하고, 플레이트를 180°회전시키고, 추가로 3회 순환 동안 세척한다).
5. 빈채로 방치된 바탕 기질 웰을 제외하고 전체 월에 검출기 항체 100 ㎕ 를 피펫으로 잰다. 웰을 신선한 플라스틱 랩 조각으로 덮는다. 마이크로티터 플레이트를 1 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션한다.
6. 접합 희석제 속에 적당한 부피의 접합 농축물 (1:50 희석액) 을 희석시킴으로써 작업 접합액을 제조한다.
7. 단계 4 에서와 같이 웰을 세척한다. 즉시 단계 8 로 진행한다.
8. 빈채로 방치된 바탕 기질 웰을 제외하고 전체 월에 작업 접합액 100 ㎕ 를 피펫으로 옮긴다. 웰을 신선한 플라스틱 랩 조각으로 덮는다. 마이크로티터 플레이트를 1 시간 동안 실온 (20 - 27 ℃) 에서 인큐베이션한다.
9. 동등 부의 용액 A 및 용액 B 를 조합함으로써 작업 기질을 제조한다. 6 mL 의 각 기질 용액은 1개의 마이크로티터 플레이트를 현상하기에 충분한 12 mL 의 작업 기질을 제공할 것이다. 사용된 스트립의 수에 기초하여 작업 기질의 부피를 조정한다. 양호하게 혼합한다.
10. 작업 기질을 깨끗한 시약 트로프 (trough) 속에 투여하고 실온으로 만든다.
11. 단계 5 에서와 같이 웰을 세척한다. 주의: 플레이트를 건조시키지 말것. 즉시 단계 12 로 진행한다.
12. 100 ㎕ 의 작업 기질을 전체 웰 속으로 피펫으로 옮기고 플레이트를 플라스틱 랩 또는 플레이트 밀봉기로 덮는다. 마이크로티터 플레이트를 실온 (20 - 27 ℃) 에서 45 분 동안 인큐베이션시킨다.
13. 100 ㎕ 의 중지 용액을 전체 웰 속으로 피펫으로 옮긴다.
14. 650 nm 파장에서 분광광도계 플레이트 판독기를 이용하여 각 웰에서 흡광도를 측정한다. 웰을 중지 용액 첨가 30 분 이내에 판독해야 한다.
표준 곡선
0, 150, 1000, 3000, 5000 및 8000 pg/ml 의 6개 상이한 농도에서 VEGF-165 표준 (재조합 인간 VEGF-165) 을 구축함으로써 정량 분석을 실시하였다.
인간 혈청 및 혈장 샘플
소라페니브로 처리하기에 앞서 확인된 비소세포 폐암 환자로부터 냉동 혈장 샘플을 수득하였다.
실시예 2. 비소세포 폐 암종 환자로부터의 혈장
제조자 지시에 따라 Oncogene Science VEGF-165 ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA) 를 이용하여 VEGF-165 수준을 측정하기 위해 2중 샘플을 사용하였다. 2중 측정의 평균값을 각 환자에 대해 결정하였다. 상기 연구에서 31명 환자에 대한 중간 VEGF-165 수준을 표 1 에 보고하였다. 표 2 는 각각의 환자 그룹에서 방사선학으로 측정된 평균 종양 수축율을 나타낸다. 결과는 안정 병변을 나타내는 소라페니브 치료에 후속적으로 응답하는 환자에 있어서 VEGF-165 의 중간 수준이 67.9 pg/ml 이었음을 나타내었다. 소라페니브 치료에도 불구하고 진행성 병변을 나타내는 환자는 227.2 pg/ml 의 중간 VEGF-165 수준을 가졌다. 안정 병변을 나타내는 환자가 5.1 % 의 평균 종양 수축률을 갖는 반면, 진행성 병변의 환자는 20.6 % 의 평균 종양 성장율을 가졌다. 상기 결과는 도 1 및 2 에서 그래픽으로 나타내었다.
VEGF-165
안정 병변 진행성 병변
중간 VEGF-165 (pg/ml) 67.9 227.2
n 23 8
종양 수축률
안정 병변 진행성 병번
평균 종양 수축율 % -5.1 20.6
n 22 8
SEM -3.1 7.6
본 발명의 상기 구현예의 기재는 예시 및 기재 목적으로 나타내고 있다. 본 발명을 개시된 정확한 형태로 확대하거나 제한할 의도가 아니며, 명백하게 많은 변형 및 변종이 상기 교시의 관점에서 가능하다. 본 발명의 원리 및 이의 실제 적용을 설명하여 이에 의해 종래 기술의 당업자가 본 발명을 각종 구현예에서 그리고 각종 변형으로 고려된 특정 용도에 적합한 바대로 이용하기 위해 구현예는 선택되고 기재되었다. 본원에 인용된 전체 문헌은 참조로 포함된다.

Claims (36)

  1. 시간에 따른 VEGF-165 단백질 수준의 증가는 하기 치료법의 질병 진행 또는 음성 반응을 표시하고, 시간에 따른 VEGF-165 단백질 수준의 감소는 하기 치료법의 질병 완화 또는 양성 반응을 표시하는, 환자내 VEGF-165 경로와 관련된 질병 상태의 모니터링 방법 및/또는 시간에 따라 채취된 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 단백질 수준의 시리얼 변화를 면역학적으로 검출하고 정량화하는 것을 포함하는 치료법에 상기 질병의 환자가 반응하는 방식의 모니터링 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 치료법이 멀티-키나아제 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 단일클론 항체 및 비스-아릴 우레아로부터 선택되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 치료법이 VEGF-165 경로 유도 치료법인 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 VEGF-165 경로 유도 치료법이 티로신 키나아제 억제제 이마티니브 메실레이트 또는 비스-아릴 우레아 소라페니브인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 질병이 전종양성/종양성 질병인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 전종양성/종양성 질병이 전이성 수모세포종, 융기성 피부섬유육종, 위장관 간질종양, 결장직장암, 결장암, 폐암, 비소 (non-small) 세포 폐암, 소세포 폐암, 만성 골수증식성 질환, 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 췌장암, 방광암, 신장암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 뇌종양, 간세포암, 혈액 종양, 및 상기 언급된 암을 초래하는 전암 (precancer) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 단백질의 상기 수준이 상기 환자에 대한 양호 또는 불량 예후의 표시로, 상기 질병의 추가 예후인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 예후가 반응율 (RR), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정 병변 (SD), 진행 시간 (TTP), 무진행 생존율 (PFS), 전반적 생존율 (OS), 및 임상 이득 [완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR) 및 안정 병변 (SD) 포함] 으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상적 결과인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, VEGF-165 의 증가 수준이 초기 재발 또는 전이의 높은 가능성의 표시인 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 환자 샘플이 예비치료 샘플인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 환자 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 침, 정액, 유 방 삼출액, 수액, 눈물, 가래, 점액, 임파액, 시토졸 (cytosol), 복수, 흉수, 양수, 방광 세척액 및 기관지폐포 세척액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 체액이 혈청 또는 혈장인 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 면역학적 검출 및 정량화가 샌드위치 ELISA 또는 등가 측정 형태의 면역측정에 따르는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 샌드위치 ELISA 또는 등가 측정이 VEGF-165 단백질을 선택적으로 결합하는 하나 이상의 단일클론 항체의 사용을 포함하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 대상 샘플에 있어서 하나 이상의 기타 단백질의 수준을 검출하거나, 또는 검출하고 정량화하기 위해 면역측정의 사용을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 기타 단백질이 억제제, 종양단백질, 성장 인자 수용체, 혈관신생 인자, 전이 단백질, 종양 마커 및 종양 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 억제제가 메탈로프로테이나아제-1 (TIMP-1) 의 조 직 억제제이고, 상기 종양단백질이 HER-2/neu 및 ras p21 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 성장 인자 수용체가 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFR-α) 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 혈관신생 인자가 혈관 상피 성장 인자 (VEGF) 이고, 상기 전이 단백질이 우로키나아제형 플라스미노겐 활성제 (uPA) 이고, 상기 종양 마커가 암배아성 항원 (CEA) 이고, 상기 종양 억제제가 p53 인 방법.
  18. 하기 단계를 포함하는, 질병을 갖는 인간 환자에 대한 치료법 선택 방법:
    (a) 대조 개체군의 개체로부터 채취된 대조 샘플내 VEGF-165 단백질의 평균 수준의 면역학적 검출 및 정량화 단계;
    (b) 시간에 따라 환자로부터 채취된 동등한 환자 샘플내 VEGF-165 단백질 수준의 시리얼 변화의 면역학적 검출 및 정량화 단계;
    (c) 환자 샘플내 VEGF-165 단백질의 수준을 대조 샘플내 VEGF-165 단백질의 평균 수준과 비교하는 단계; 및
    (d) 환자 샘플내 VEGF-165 단백질의 수준과 대조 샘플내 VEGF-165 단백질의 평균 수준 사이의 차이에 기초하여, 그리고 환자 샘플내 VEGF-165 단백질의 수준 중에서 시리얼 변화의 관점에서 환자를 치료하기 위해 종래 치료법 및/또는 VEGF-165 경로 유도 치료법의 사용 여부 결정 단계.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 환자 샘플이 예비치료 샘플인 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 환자 샘플내 VEGF-165 단백질의 상기 수준이 상기 환자에 대한 양호 또는 불량 예후의 표시로, 상기 질병에 대한 추가 예후인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 예후가 반응율 (RR), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정 병변 (SD), 진행 시간 (TTP), 무진행 생존율 (PFS), 전반적 생존율 (OS), 및 임상 이득 [완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR) 및 안정 병변 (SD) 포함] 으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상적 결과인 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 질병이 전종양성/종양성 질병인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 전종양성/종양성 질병이 전이성 수모세포종, 융기성 피부섬유육종, 위장관 간질종양, 결장직장암, 결장암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 만성 골수증식성 질환, 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 췌장암, 방광암, 신장암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 뇌종양, 간세포암, 혈액 종양, 및 상기 언급된 암을 초래하는 전암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 환자 샘플이 치료에 응답하지 않는 암 환자로부터인 방법.
  25. 제 18 항에 있어서, 대상 샘플에 있어서 하나 이상의 기타 단백질의 수준을 검출하거나, 또는 검출하고 정량화하기 위해 면역측정의 사용을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 기타 단백질이 억제제, 종양단백질, 성장 인자 수용체, 혈관신생 인자, 전이 단백질, 종양 마커 및 종양 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 억제제가 메탈로프로테이나아제-1 (TIMP-1) 의 조직 억제제이고, 상기 종양단백질이 HER-2/neu 및 ras p21 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 성장 인자 수용체가 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFR-α) 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 혈관신생 인자가 혈관 상피 성장 인자 (VEGF) 이고, 상기 전이 단백질이 우로키나아제형 플라스미노겐 활성제 (uPA) 이고, 상기 종양 마커가 암배아성 항원 (CEA) 이고, 상기 종양 억제제가 p53 인 방법.
  28. 하기 단계를 포함하는, 환자내 VEGF-165 경로와 관련된 질병을 검출하기 위한 진단 방법:
    (a) 대조 개체군의 개체로부터 채취된 대조 샘플내 VEGF-165 단백질의 평균 수준의 면역학적 검출 및 정량화 단계;
    (b) 시간에 따라 환자로부터 채취된 환자 샘플의 샘플내 VEGF-165 단백질 수준의 시리얼 변화의 면역학적 검출 및 정량화 단계; 및
    (c) 환자 샘플내 VEGF-165 단백질의 수준을 대조 샘플내 VEGF-165 단백질의 평균 수준과 비교하는 단계
    (대조 샘플내 VEGF-165 단백질의 평균 수준보다 높은 환자 샘플내 VEGF-165 단백질의 수준은 활성화된 VEGF-165 경로 및 환자내 질병 존재의 표시이다).
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b) 의 면역학적 검출 및 정량화가 샌드위치 ELISA 또는 등가 측정 형태의 면역측정에 따르는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 환자 샘플에 있어서 VEGF-165 단백질의 상기 수준이 상기 환자에 대한 양호 또는 불량 예후의 표시로, 상기 질병의 추가 예후인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 예후가 반응율 (RR), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정 병변 (SD), 진행 시간 (TTP), 무진행 생존율 (PFS), 전반적 생존율 (OS), 및 임상 이득 [완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR) 및 안정 병변 (SD) 포함] 으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상적 결과인 방법.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 질병이 전종양성/종양성 질병인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 활성화된 PDGF 경로와 관련된 상기 전종양성/종양성 질병이 전이성 수모세포종, 융기성 피부섬유육종, 위장관 간질종양, 결장직장암, 결장암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 만성 골수증식성 질환, 급성 골수성 백혈병, 갑상선암, 췌장암, 방광암, 신장암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 뇌종양, 간세포암, 혈액 종양, 및 상기 언급된 암을 초래하는 전암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  34. 제 28 항에 있어서, 환자 샘플에 있어서 하나 이상의 기타 단백질의 수준을 검출하거나, 또는 검출하고 정량화하기 위해 면역측정의 사용을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 기타 단백질이 억제제, 종양단백질, 성장 인자 수용체, 혈관신생 인자, 전이 단백질, 종양 마커 및 종양 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 억제제가 메탈로프로테이나아제-1 (TIMP-1) 의 조직 억제제이고, 상기 종양단백질이 HER-2/neu 및 ras p21 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 성장 인자 수용체가 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFR-α) 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 혈관신 생 인자가 혈관 상피 성장 인자 (VEGF) 이고, 상기 전이 단백질이 우로키나아제형 플라스미노겐 활성제 (uPA) 이고, 상기 종양 마커가 암배아성 항원 (CEA) 이고, 상기 종양 억제제가 p53 인 방법.
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