ES2362120T3 - Vector para la selección eficaz y/o maduración de un anticuerpo y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Un vector adecuado para eficiente selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: ScFv, fragmentos activos de Abs, secuencias humanizadas de Ab, dicho vector se caracteriza porque i) contiene al menos un elemento capaz de reducir el nivel de expresión del anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: a) un codón de detención suprimido dentro del péptido líder o la secuencia codificadora del anticuerpo; b) un promotor de eficiencia baja que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo; y ii) tiene una mejor eficacia de despliegue de dicho anticuerpo recombinante por medio de: a) fusión de la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante a la secuencia que codifica la parte carboxi-terminal de la proteína pIII; y b) por el uso como péptido líder del péptido líder del anticuerpo recombinante de la fosfatasa alcalina de E. coli; y c) eliminar cualquier codón ámbar entre la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante y la secuencia codificadora de pIII, en el que el nivel de expresión del anticuerpo recombinante se puede reducir con un inhibidor del promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento de mejora de la capacidad de selección del anticuerpo en biblioteca de despliegue de fago, en el que dicha mejora se obtiene a través de la reducción de los niveles de expresión de los anticuerpos producidos en dicha biblioteca.

Campo de la invención

La tecnología de ADN recombinante proporciona una alternativa económica y útil para la producción de anticuerpos monoclonales. El despliegue de anticuerpos recombinantes en la cápside del bacteriófago, conocido como despliegue en fago, no solo permite la generación de una biblioteca de anticuerpos humanos para la selección de ligadores específicos, que proporciona anticuerpos útiles para la terapia que no induce una respuesta inmune perjudicial en los pacientes, sino que también facilita la maduración de afinidad de los anticuerpos a través de la construcción de una biblioteca de anticuerpos mutantes, que proporciona clones con mayor afinidad.

La posibilidad de hallar ligadores de alta afinidad en una biblioteca de anticuerpos recombinantes caracteriza su calidad, que depende de varios factores como tamaño, diversidad y fuente de los genes de inmunoglobulina de la biblioteca.

Se sabe que varios tejidos linfoides de donantes inmunizados o no inmunizados, tales como linfocitos de sangre periférica, bazo y médula ósea e incluso tejido de ganglios linfáticos metastático o drenado de individuos afectados por tumores pueden actuar como fuente del repertorio de anticuerpos específicos.

Si bien las bibliotecas de anticuerpos sin tratamiento son más diversas y llevan al aislamiento de especificidades de anticuerpo amplias, es razonable sugerir que la construcción de una biblioteca de anticuerpos recombinantes a partir del repertorio de Ig de un paciente afectado por una enfermedad específica puede proporcionar fragmentos de anticuerpos de mayor afinidad contra antígenos particulares.

Varios estudios publicados describen la construcción de bibliotecas de anticuerpos recombinantes provenientes de ganglios linfáticos asociados con tumor (Clin. Exp. Immunol. 1997 109(1):166-74; Int. J. Mol. Med. 2004 14(4):72935; World J. Gastroenterol. 2004 10 (18):2619-23). Estos estudios se basan en la idea general de que el tejido del ganglio linfático de los pacientes con cáncer está infiltrado con células B activadas, que pueden servir como fuente de anticuerpos específicos de tumor.

Es relativamente difícil obtener ganglios linfáticos metastáticos o drenados de los pacientes con cáncer de mama como material quirúrgico fresco. De acuerdo con la práctica médica reciente el cirujano extirpa solo un ganglio linfático centinela o un pequeño agrupamiento de ganglios (ganglio centinela y los más próximos a este), de este modo se realiza una cirugía menos invasiva y se reducen los efectos secundarios, en vez de extirpar docenas de ganglios linfáticos de acuerdo con la técnica quirúrgica previa. Después de la disección del ganglio linfático centinela, prácticamente se estudia el ganglio entero para determinar la presencia de micrometástasis o células cancerosas únicas. En consecuencia, en la cirugía de cáncer de mama el ganglio metastático está prácticamente no disponible como material quirúrgico descartado.

La evidencia de que los anticuerpos derivados de linfocitos B infiltrantes del tumor (TIL-B) también pueden reconocer células tumorales se obtuvo por la producción de hibridomas humanos, obtenidos de TIL, capaces de secretar anticuerpos específicos de tumor (Lancet. 1982 1(8262):11-4; Br. J. Cancer, 1983 47(1): 135-45); por la expansión de las células B de TIL de las biopsias de tumor humano (Cancer Immunol. Immunother. 1994 38(4):225-32); por la expansión de las células B de TIL derivado de melanoma y posterior clonación del anticuerpo scFv de un clon de células B único con reactividad específica para melanoma (Cancer Res. 1995 55:3584-91); y por transplante subcutáneo de tejido de cáncer pulmonar humano en ratones inmunodeficientes productores de anticuerpos humanos derivados de TIL-B, que reconocieron dos proteínas específicas de tumor (Cancer Invest. 2000;18(6):5306; Cancer Res. 2002 62(6):1751-6), de este modo se sugiere una función específica de TIL-B en el tumor.

Recientemente, el carcinoma cervical y un tipo raro de cáncer de mama, clasificado como carcinoma medular (MCB) han demostrado que se caracterizan por infiltrados linfoplasmacíticos que se correlacionan con mejor pronóstico y supervivencia del paciente. Estas enfermedades se investigaron para entender la naturaleza de los linfocitos B infiltrados en tumores (TIL-B) por el uso también de procedimientos de despliegue en fago. El estudio de la estructura molecular de las regiones variables del anticuerpo proporcionó evidencia de las respuestas inmuno humorales dirigidas por antígeno en los carcinomas de mama medulares, así como en los tumores cervicales. La predominancia oligoclonal hallada en los genes del anticuerpo derivado de los TIL indicó la posible selección clonal de las moléculas de Ig contra neoantígenos específicos sobreexpresados o expresados específicamente, en tejido tumoral (Cancer Immunol. Immunother. 2001 50(10): 523-32; Cancer Res. 2001 61(21):7889-99; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001 98(22):12659-64; J. Immunol. 2002 169 (5):2701-11).

A pesar de las muy importantes indicaciones mencionadas anteriormente de que el tejido tumoral está infiltrado con células B activadas, que pueden servir como fuente de anticuerpos específicos de tumor, varios grupos de investigación, en los experimentos de inmunopurificación realizados con bibliotecas de despliegue en fago derivadas de TIL contra antígenos tumorales conocidos purificados, o células tumorales vivas o secciones de tejido congelado, no pudieron seleccionar ni un anticuerpo específico que discrimine entre células tumorales y normales ni uno reactivo con antígenos tumorales de la superficie celular (Cancer Res. 2001 61(21):7889-99; Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 2001 98(22):12659-64; Int. J. Cancer 2001 93:832-40). Solo más tarde, dos grupos diferentes pudieron identificar anticuerpos específicos que reconocen células tumorales de esta clase de bibliotecas de despliegue en fago (J. Immunol. 2002 169:1829-36; J Immunol. 2005 175(4):2278-85).

Un abordaje alternativo, basado en una biblioteca derivada de tumor con expresión en fago y protocolos de detección en placa directa, que evitan las limitaciones del sistema de despliegue en fago, permitieron a Wu y colegas (Cancer Immunol Immunother. 2002 51 (2): 79-90) aislar múltiples anticuerpos que se unen específicamente a células tumorales cultivadas. Este estudio indica que las dificultades observadas en la selección de anticuerpos anti-tumor de las bibliotecas de despliegue en fago derivadas de TIL provienen de la imperfección de los vectores de despliegue conocidos en la técnica. Sin embargo, la detección directa tampoco es un procedimiento excelente para la selección de anticuerpos recombinantes de una biblioteca grande. En efecto es un procedimiento laborioso que demanda gran cantidad de tiempo y medios, en comparación con la tecnología de despliegue en fago. Barbas et al. (Phage Display: a laboratory manual, ISSN:0-87969-546-3, (2001) páginas I-XVI, 1,1) describen vectores para despliegue en fago (pComb3H y pComb3X) en los que los fragmentos scFv se unen al extremo C de 180 aminoácidos de la proteína de cubierta gpIII (aa230-460) del fago filamentoso. También se describen fagémidos que comprenden promotores de eficiencia baja o reprimibles (plac) en el vector de fagémido y los procedimientos para usar dichos vectores en la selección y maduración del scFv. La solicitud de patente Europea EP 1 452 599 describe vectores para despliegue en fago, fagémidos y bibliotecas de despliegue en fago que despliegan varios péptidos epitópicos o dominios proteicos con potencial para unirse a un material blanco de interés. El documento WO 92/01047 describe un procedimiento de producir un miembro multimérico de un par de unión específica (sbp), que comprende expresar en un organismo huésped recombinante una primera cadena polipeptídica del miembro sbp o una población genéticamente diversa de este tipo de miembro sbp fusionado a un componente de un paquete de despliegue genético replicable secretado (rgdp) que de este modo despliega el polipéptido en la superficie del paquete y que expresa en un organismo huésped recombinante una segunda cadena polipeptídica del multímero y que causa o permite que las cadenas polipeptídicas se unan entre sí para formar el multímero como parte de la rgdp, al menos una de las cadenas polipeptídicas que se expresa en el ácido nucleico es capaz de empaquetarse por medio del uso del componente a través del cual el material genético de cada rgdp codifica una cadena polipeptídica. También describe vectores de fagémido en la que las secuencias de nucleótidos del scFv se fusionan a la proteína de cubierta de gIII de un fago filamentoso y la preparación de dicho scFv. El documento WO 93/11236 describe un procedimiento para proporcionar una biblioteca de paquetes de despliegue genético replicable (rgdps), cada una que exhibe en su superficie, el miembro del par de unión específica (sbp), y cada una que contiene ácido nucleico con una secuencia derivada de la especie mamífera, que codifica la cadena polipeptídica que es componente del miembro sbp desplegado en la superficie; y (b) selección por unión con el autoantígeno (Ag), uno o más miembros sbp con especificidad para el auto-antígeno.

El solicitante realizó un análisis de las bibliotecas de despliegue en fago de anticuerpos recombinantes derivadas de TIL-B por la utilización de un nuevo vector de fagémido pKM19 y demostró la eficiente selección de anticuerpos específicos de tumor contra los antígenos tumorales deseables así como contra las células de carcinoma de mama vivas.

Compendio de la invención

Los autores han hallado que es posible mejorar la eficiencia de la selección y/o maduración de los anticuerpos recombinantes de la biblioteca por el uso del sistema de despliegue en fago, tras las modificaciones de los vectores de la técnica previa. Los vectores de la técnica previa son, es decir, vectores de fagémidos como en "Antibody Engineering - A practical approach (McCafferty, J. Hoogenboom, H. & Chiswell D., eds), pp,325, Oxford University Press, 1996)".

En consecuencia es un objeto de la presente invención un vector adecuado para la eficiente selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: ScFv, fragmentos activos de Ab, secuencias humanizadas de Ab, dicho vector se caracteriza porque i) contiene al menos un elemento capaz de reducir el nivel de expresión del anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: a) un codón de detención suprimido dentro del péptido líder o la secuencia codificadora del anticuerpo; b) un promotor de eficiencia baja que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo; y ii) tiene una eficacia mejorada del despliegue de dicho anticuerpo recombinante por medio de: a) fusionar la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante con una secuencia codificadora para la parte carboxi-terminal de la proteína pIII; y b) usar como péptido líder del anticuerpo recombinante el péptido líder de la fosfatasa alcalina de E. coli, y c) eliminar cualquier codón ámbar entre la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante y la secuencia codificadora de pIII, en la que el nivel de expresión del anticuerpo recombinante se puede reducir con un inhibidor del promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo.

El vector de la invención puede ser un plásmido, un fagémido, un fago o cualquier otro vector conocido por los expertos en la técnica.

Barbas et al. (Phage Display: a laboratory manual, ISSN: 0-87969-546-3, (2001) páginas I-XVI, 1,1) describen vectores para despliegue en fago (pComb3H y pComb3X) en los que los fragmentos scfV se unen al extremo C-terminal de 180 aminoácidos de la proteína de cubierta gpIII (aa230-460) del fago filamentoso. También describen fagémidos que comprenden promotores de eficiencia baja o reprimibles (plac) en el vector de fagémido y procedimientos para usar dichos vectores en la selección y maduración del scFv.

La Solicitud de la patente europea EP 1 452 599 describe vectores para despliegue en fago, fagémidos y bibliotecas de despliegue en fago que despliega varios péptidos epitópicos o dominios de proteína con potencial para unirse a un material blanco de interés.

El documento WO 92/01047 describe un procedimiento de producir un miembro multimérico de un par de unión específica (sbp), que comprende expresar en un organismo huésped recombinante una primera cadena polipeptídica del miembro sbp o una población genéticamente diversa de este tipo de miembro sbp fusionado a un componente de un paquete de despliegue genético replicable secretado (rgdp) que de este modo despliega el polipéptido en la superficie del paquete y que expresa en un organismo huésped recombinante una segunda cadena polipeptídica del multímero y que causa o permite que las cadenas polipeptídicas se unan entre sí para formar el multímero como parte de la rgdp, al menos una de las cadenas polipeptídicas que se expresa en el ácido nucleico es capaz de empaquetarse por medio del uso del componente a través del cual el material genético de cada rgdp codifica una cadena polipeptídica. También describe vectores de fagémido en los que las secuencias de nucleótidos del scFv se fusionan a la proteína de cubierta de gIII de un fago filamentoso y la preparación de dicho scFv. El documento WO 93/11236 describe un procedimiento para proporcionar una biblioteca de paquetes de despliegue genético replicable (rgdps), cada una que exhibe en su superficie, el miembro del par de unión específica (sbp), y cada una que contiene ácido nucleico con una secuencia derivada de la especie mamífera, que codifica la cadena polipeptídica que es componente del miembro sbp desplegado en la superficie; y (b) selección por unión con el autoantígeno (Ag), uno o más miembros sbp con especificidad para el auto-antígeno

En consecuencia es un objeto de la presente invención un vector adecuado para la eficiente selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: ScFv, fragmentos activos de Ab, secuencias humanizadas de Ab, dicho vector caracterizado porque

i) contiene al menos un elemento capaz de reducir el nivel de expresión del anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: a) un codón de detención suprimido dentro del péptido líder o la secuencia codificadora del anticuerpo; b) un promotor de eficiencia baja que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo; y

ii) tiene una eficiencia mejorada de despliegue en dicho anticuerpo recombinante por medio de: a) fusión de la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante a una secuencia codificadora para la parte carboxiterminal de la proteína pIII; y b) usar como péptido líder del anticuerpo recombinante el péptido líder de la fosfatasa alcalina de E. coli, y c) eliminar cualquier codón ámbar entre la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante y la secuencia codificadora de pIII,

en la que el nivel de expresión del anticuerpo recombinante se puede reducir con un inhibidor del promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo.

Los promotores de eficiencia baja son conocidos en la técnica y se ejemplifican en Biochem J. 1970 117: 741-746). Los inhibidores adecuados para los promotores son conocidos en la técnica y se ejemplifican en J. Bacteriol. 1979,138(1):40-7.

Un objeto adicional de la presente invención es un vector de fagémido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

Este vector, llamado pKM19, se diseña para el despliegue de anticuerpos recombinantes en formato de cadena única sobre la superficie de un fago filamentoso.

Un objeto adicional de la invención es una biblioteca de anticuerpo de despliegue en fago obtenida por la clonación del ADNc en el vector de la invención. Preferiblemente la biblioteca se obtiene por la clonación en el vector de la invención del ADNc de las células productoras de anticuerpo, más preferiblemente linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) o linfocitos de sangre periférica (PBL). En un aspecto preferido, tales células productoras de anticuerpo se aíslan de un sujeto afectado por tumor, preferiblemente de un sujeto afectado de cáncer de mama. Alternativamente la biblioteca consiste en una biblioteca de anticuerpos sintética o semisintética, también mutada para la maduración de afinidad de los anticuerpos.

Otro objeto de la presente invención es una célula huésped transformada con el vector de la invención. Un objeto adicional de la presente invención es un procedimiento para mejorar la selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante que comprende la etapa de clonación y expresión del ADNc, o secuencias de anticuerpo sintéticas o semisintéticas, incluso mutadas para maduración de afinidad de los anticuerpos en el vector que se describió anteriormente.

La invención se describirá a continuación por medio de ejemplos no limitantes con referencia a las siguientes figuras:

Descripción detallada de los dibujos

Figura 1. Se describen esquemáticamente los elementos esenciales del plásmido pKM16 plásmido útiles para la producción de anticuerpos solubles en formato scFv y los elementos esenciales de los plásmidos pKM17, pKM18 y pKM19 útiles para la producción de anticuerpos desplegados en el fago. Estos plásmidos dirigen la expresión del anticuerpo bajo el control del promotor pLac. Los sitios de clonación únicos NcoI y NotI permiten la inserción de un gen del anticuerpo para expresar los anticuerpos de cadena simple con un péptido líder de la enzima periplásmica bacteriana, fosfatasa alcalina (líder PhoA). El plásmido pKM17 codifica la proteína pIII entera (406 aa) y los plásmidos pKM18 y pKM19 codifican la parte carboxi-terminal de pIII (197 aa). El plásmido pKM19 contiene el codón ámbar en el líder PhoA.

Figura 2. Se describe la estructura detallada del vector pKM19 de fagémido. La modificación específica realizada se informa en la figura y se describe en el texto.

Figura 3. Producción de scFv soluble por el uso del plásmido pKM16 plásmido. Tres clones independientes obtenidos por la clonación del gen del antígeno anti-carcino-embrionario (CEA) scFv en pKM16 se analizaron para determinar producción de scFv soluble (líneas del gel 1-3). Las fracciones de la proteína periplásmica se purificaron de las bacterias por el procedimiento de congelamiento y descongelamiento. Se incluye el marcador de tamaño de proteína. Se desarrolló la membrana de transferencia Western con un anticuerpo secundario conjugado con AP anti-FLAG. Las bandas correspondientes a los anticuerpos scFv solubles (peso molecular esperado 26 kDa) migran entre las bandas de 24,5 y 35,9 kDa.

Figura 4. Eficiencia de despliegue de los plásmidos pKM17, pKM18 y pKM19 en comparación con un sistema de fagémido clásico. Los anticuerpos scFv anti-CEA desplegados por tres plásmidos diferentes, se ensayaron por ELISA contra la proteína de CEA y se compararon con el fago MA39 (anti-CEA/pDN322). El fago auxiliar, M13K07, que no despliega fragmentos del anticuerpo, se incluyó como control negativo. Los datos registrados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado. La concentración de fago más alta, marcada con asterisco, corresponde a 10" TU para todos los fagos y 3x1010 TU, para anti-CEA/pKM17. El ELISA se realizó por medio del anti-M13 (panel A), o alternativamente, el anticuerpo secundario anti-FLAG (panel B).

Figura 5. Filtración de muestras de fago. Aproximadamente 2x1011 TU/pocillo de cada preparación o la correspondiente cantidad de muestras de filtrado se analizaron en ELISA y se desarrollaron con anti-M13 (panel A) o anticuerpos secundarios anti-FLAG (panel B). Los datos registrados son los valores promedio de ensayos realizados por duplicado. Los datos muestran la reactividad de los filtrados contra CEA como porcentaje de la reactividad original de muestras no filtradas (100%).

Figura 6. Competición con scFv de anti-CEA soluble. Los sobrenadantes recién preparados de los fagos MA39 (10 µL) y anti-CEA/pKM19 (5 µL) en competición con varias cantidades del anticuerpo anti-CEA soluble purificado. Los datos se expresan como porcentaje de reactividad de los sobrenadantes sin competidores. El scFv anti-SP2 soluble irrelevante se usó como control negativo.

Figura 7. Competición con filtrados de sobrenadante del fago. Los sobrenadantes recién preparados de los fagos de MA39 (10 µL) y anti-15 CEA/pKM19 (5 µL) compitieron con 10 µL o 50 µL de filtrados de los mismos sobrenadantes del fago. Los datos se expresan como porcentaje de la reactividad de los sobrenadantes sin competidores.

Figura 8. Transferencia Western de los fagos recombinantes purificados con PEG. Los extractos de proteína de aproximadamente 5x109 PFU de los fagos MA39, anti-CEA/pKM18 y anti-CEA/pKM19, y 1x109 PFU de antiCEA/pKM17 se fraccionaron por SDS-PAGE y se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. Las tiras de membrana se desarrollaron con un anticuerpo conjugado con AP anti-FLAG. El marcador de tamaño de la proteína se incluye (última tira). Las proteínas scFv-pIII (66,1 kDa) y scFv-∆pIII (45,2 kDa) migran como bandas de peso molecular superiores a causa de un residuo anómalo de la proteína pIII descripta antes (Goldsmith y Konigsberg, 1977).

Figura 9. Selección contra la proteína SP2-GST. Se muestra la reactividad de las mezclas de fago derivados de la primera y segunda rondas de inmunopurificación de la biblioteca de scFvEC23. GST (glutatión S-transferasa), leche y estreptavidina, presentes en el sistema de selección, se incluyen como controles negativos. Los datos registrados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado. La entrada de fagos se normalizó. Aproximadamente 3x109 TU por pocillo individual de cada preparación se analizaron en ELISA.

Figura 10. Selección por afinidad del gen de anti-CEA maduro de una biblioteca de maduración. En este ensayo, las reacciones inmunológicas positivas se desarrollaron con un anticuerpo secundario conjugado con AP anti-FLAG, a fin de moderar las señales positivas y hacer visible el aumento de reactividad durante el procedimiento de selección. El fago auxiliar, M13K07, que no despliega fragmentos del anticuerpo, se incluyó como control negativo. Se muestra la reactividad del anticuerpo anti-CEA original en pKM19 (anti-CEA/pKM19), biblioteca de maduración (Lib.), mezclas de fagos después de la primera y segunda ronda de selección (I ronda, II ronda) y clones únicos (cl,1, cl,2) de la mezcla de fagos después de la segunda ronda de selección por afinidad, analizada en proteína de CEA y GST irrelevante. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado. La entrada de fago se normalizó. Aproximadamente 3x1010 TU por pocillo individual de cada preparación se analizaron en ELISA.

Figura 11. Reactividad por ELISA de scFv maduros solubles. Se ensayaron varias cantidades de anticuerpos solubles en placas recubiertas con CEA. Se desarrollaron los scFv unidos por medio de un anticuerpo secundario anti-FLAG. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado. El anticuerpo anti-SP2 irrelevante y el anticuerpo anti-CEA E8 maduro, obtenidos previamente (Pavoni et al., 2006), se incluyeron como controles.

Figura 12. Especificidad de clones maduros. Aproximadamente 250 ng por pocillo de anticuerpos originales y maduros en forma soluble se ensayaron con CEA y varias proteínas irrelevantes. El anticuerpo anti-SP2 irrelevante se incluyó como control negativo. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado.

Figura 13. Análisis V(D)J de los genes del anticuerpo derivado de TIL. A. ADNc de SMART derivado de 10 muestras tumorales diferentes (pacientes B84, B85, B87, B89, B90, B91, B92, B93, B95, B96), de mamas normales, testículos normales y linfocitos de cuatro donantes sanos (L1, L2, L3, L4), se usaron como molde para la amplificación de las regiones del anticuerpo V(D)J. Las muestras de ADNc se normalizaron por amplificación del gen constitutivo de βactina. Los fragmentos de V(D)J se amplificaron bien de todos los moldes con exclusión del ADNc de los testículos normales. B. Los mismos productos de PCR se fraccionaron por PAGE lo que da una resolución alta para bandas de ADN.

Figura 14. Distribuciones de subclase de anticuerpo. Las muestras de ADNc de mama normal y B84 ADNc amplificadas por PCR, que no muestran bandas oligoclonales en la prueba V(D)J, tienen prevalencia de las bandas de IgA en comparación con IgG1 y IgG2 (panel izquierdo), mientras que las tres muestras, que muestran bandas oligoclonales fuertes en la prueba previa (B91, B92 y B93), tienen prevalencia de bandas IgG1 o IgG1 e IgG2 en comparación con IgA (panel derecho).

Figura 15. Secuencias de aminoácidos de regiones variables de 30 clones aleatorios obtenidos por la clonación de los genes del anticuerpo de cadena γ derivados del ADNc de B92 y B93. La secuencia de péptidos se informa en código de letra única. Los aminoácidos idénticos en clones similares se representan con un guión.

Figura 16. Selección en las proteínas ED-B, MUC1 y CEA. Se analizó la reactividad de las mezclas de fagos derivadas de la segunda y tercera rondas de inmunopurificación en comparación con la biblioteca original. GST se incluye como un control negativo. Se usó un control negativo adicional, la proteína D que posee cola de 6His como una proteína blanco usada en la selección en caso de la inmunopurificación de ED-B. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado. La biblioteca ScFvEC23 deriva de PBL. MixTIL es una mezcla de 4 bibliotecas derivadas de TIL (ScFvB87, ScFvB95, ScFvB96 y ScFvmix) como se indica en la tabla 1.

Figura 17. Reactividad por ELISA de anticuerpos de scFV desplegados sobre clones de fago único. Se analizó la reactividad de los clones de fago único seleccionados contra ED-B (clones EDE1, EDE3, EDE5, EDB5, tabla 5), MUC1 (clones ME 1, ME2, MB5, tabla 5) y CEA (clones CB3, CB37, CB40, CB41, CB53, CB60, tabla 5) después de la tercera ronda de selección por medio de las proteínas respectivas. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por duplicado. Varia proteínas irrelevantes y un anticuerpo de fago irrelevante anti-SP2 se incluyen como controles negativos.

Figura 18. Se analizó la reactividad por inmunopurificación basada en células contra células de carcinoma de mama fijo (MCF7) y fibroblasto humano (HFF) de las mezclas de fagos derivadas de la cuarta y quinta rondas de inmunopurificación en comparación con la biblioteca original. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por triplicado. Las bibliotecas scFvB96 y mixLIB se definen la Tabla 2.

Figura 19. Reactividad celular por ELISA contra las células fijas de los clones de fago único. Los datos informados son los valores promedio de los ensayos realizados por triplicado. Célula en desarrollo con anticuerpo anti-SP2 irrelevante se incluye como control negativo. MCF7 y MDA-MB-468: células de carcinoma de mama fijo; HFF: fibroblasto humano y MCF10-2A: células epiteliales de mama humanas.

Figura 20. Origen de anticuerpos scFv de anti-MCF7. Un μl de cada biblioteca de fago de scFv se amplificó por PCR por medio de los cebadores de oligonucleótidos específicos para los genes de anticuerpo analizados. Se usó el fago purificado por PEG correspondiente como control positivo (línea última). También se analizó el gen del anticuerpo anti-SP2 irrelevante de origen conocido, seleccionado antes de la biblioteca de scFvEC23; derivado de PBL. Se seleccionaron el anticuerpo anti-MUC1 MB5 y el anticuerpo anti-CEA CB37 de la mezcla de la biblioteca derivada de TIL. Los anticuerpos de la mezcla 11, mezcla 12, mezcla 17 y mezcla 39 se seleccionaron de la mezcla de anticuerpos de la biblioteca derivados de TIL y derivados de PBL se definen en la Tabla 5.

Figura 21. Tinción de fluorescencia de carcinoma MCF7 de mama no permeabilizado y células fijas de epitelio de mama normal MCF10-2A por anticuerpos scFv desplegados en fago (mezcla17 (A), mezcla7 (B)).

Figura 22. A. Tinción de fluorescencia de células de carcinoma de mama MCF7, antígeno tumoral MUC1 que expresa SkBr3 y células de epitelio de mama normal MCF10-2A por medio de anticuerpo scFv anti-MUC1 MB5 desplegado en fago; B. Tinción de células de adenocarcinoma colorrectal LoVo que expresan CEA por anticuerpo scFv anti-CEA CB37 desplegado en fago. Se incluye la tinción de las células MCF10-2A control negativo. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO 1: Construcción de nuevo vector pKM19 de fagémido para el despliegue de los anticuerpos de cadena simple sobre el fago filamentoso.

Introducción

Este trabajo describe la construcción de un nuevo vector de fagémido pKM19 para el despliegue de los anticuerpos de cadena simple sobre el fago filamentoso. Este vector se caracteriza por varias diferencias comparadas con los sistemas canónicos.

a) Codón ámbar

Los fagémidos clásicos contienen un codón ámbar entre los genes de scFv y gpIII, de este modo dirigen la producción de scFv libres y anticuerpos de fusión scFv-pIII en bacterias supresoras, tales como TG1, o DH5αF’, o XL1-Blue, generalmente usadas para la amplificación del fago. Estas cepas bacterianas, que portan la mutación supE, son supresoras de inserción de glutamina con eficiencia de supresión dependiente del codón siguiente al TAG

(J. Mol. Biol. 1983 164(1):59-71; Mol. Gen. Genet. 1987 207(2-3):517-518). En tal sistema, los anticuerpos scFv solubles libres producidos se secretan en el periplasma y posteriormente filtran del periplasma en el medio. En el protocolo de purificación de fago estándar por PEG/NaC1, los anticuerpos scFv libres se coprecipitan con partículas de fago. Como resultado, la concentración de los anticuerpos libres en la suspensión del fago puede ser cinco a diez veces mayor que la concentración de la proteínas fusionadas scFv-pIII ensambladas en la partícula del fago. En una selección posterior, los anticuerpos libres abundantes compiten con los anticuerpos desplegados en fago para la unión del blanco. Esto interfiere la eficiencia de inmunopurificación y retrasa el procedimiento de selección, especialmente:

i) cuando la concentración de antígeno está limitada (por ejemplo, bioinmunopurificación en células vivas, células ex-vivo),

ii) en rondas de inmunopurificación posterior, donde la concentración de fago específico es relativamente alta, o

iii) en bibliotecas de maduración, que contienen muchos anticuerpos relativos con la misma especificidad.

En consecuencia se necesitan fagémidos clásicos para una mejor selección y/o maduración de anticuerpos.

Tal como se espera a partir de los datos de la bibliografía, la presencia de un codón ámbar ubicado en una secuencia que codifica un péptido líder de fosfatasa alcalina en pKM19, produce un nivel de expresión relativamente bajo de anticuerpos recombinantes en la bacteria supresora de ámbar que alberga este plásmido.

Se demostró (Gene 1999 228: 23-31) que la inhibición del promotor lac solo por represión catabólica con glucosa no es suficiente para equilibrar las tasas de crecimiento de diferentes clones con o sin codones de detención. La expresión de scFv menor obtenida mediante el pKM19, reduce la toxicidad de los anticuerpos recombinantes para el huésped bacteriano y no tiene influencia en la eficacia del despliegue.

Por medio del pKM 19 los autores demostraron:

(i)

que el nivel presente de la expresión del anticuerpo es suficiente para producir anticuerpos del fago altamente reactivos, lo que da una señal similar en la prueba ELISA en comparación con el fago pKM18 sin codón ámbar;

(ii)

que los anticuerpos específicos se pueden aislar fácilmente de una biblioteca scFv construida de los linfocitos de sangre periférica de un paciente con anticuerpos contra una proteína blanco después de solo dos rondas de selección;

(iii) que la maduración del anticuerpo anti-CEA produce el aislamiento de mejores clones de scFv sin codones de detención en comparación con la maduración realizada por el uso del vector canónico (BMC Cancer 2006 6:41).

b) Proteína del gen III

El vector pKM19 permite la clonación de los fragmentos scFv como fusión amino terminal de la proteína del gen III suprimida.

Los vectores de despliegue de fago comúnmente usados para scFv producen la incorporación en las partículas del fago del pIII entero fusionado al fragmento del anticuerpo (en Antibody Engineering - A practical approach: McCafferty, J. Hoogenboom, H. & Chiswell D., eds, pp,325, Oxford University Press, 1996), mientras que en el caso de plásmido pComb3 utilizado para el despliegue de Fab (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991 88(18):7978-7982), el fragmento del anticuerpo se fusiona con la mitad del carboxi terminal de la pIII. La infectividad de tales fagos recombinantes se obtiene durante su propagación, ya que la superinfección con un fago auxiliar proporciona la proteína del gen III nativa.

De acuerdo con los datos presentes, la fusión del anticuerpo de cadena simple a la parte C-terminal de pIII mejora la producción del fago y la eficiencia del despliegue de un anticuerpo en comparación con la fusión de la proteína pIII wt. Estos datos están de acuerdo con los datos previos de Kretzschmar (Gene 1995 155(1):61-65). La mejora de la eficiencia del despliegue en combinación con la eliminación de los anticuerpos scFv libres de la mezcla de incubación facilita la selección por afinidad y produce un enriquecimiento más rápido de las mezclas de fagos para los clones específicos. Esto también puede contribuir a la reducción de los codones de detención en clones seleccionados ya que se necesita una cantidad menor de rondas de inmunopurificación/amplificación para completar la selección. Los clones defectuosos de crecimiento rápido tienen menos oportunidad de ser aislados.

c) Péptido líder PhoA

En bacterias que albergan el vector pKM19, después de la síntesis de la proteína recombinante, el péptido líder PhoA se escinde con líder peptidasa después de la translocación de membrana, y scFv-pIII se ensambla en la partícula del fago. De esta manera, el sitio de escisión entero de la fosfatasa alcalina, una proteína periplásmica genuina de E.coli, se conserva para garantizar el procesamiento eficiente y correcto y el ensamblaje del anticuerpo. Como resultado, la proteína madura contiene dos aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal del scFv. En el sistema descrito, es necesario volver a clonar el gen del anticuerpo en el plásmido apropiado para la producción posterior de los anticuerpos solubles. En esta etapa, los aminoácidos adicionales se pueden conservar o eliminar de acuerdo con requerimientos específicos.

En conclusión, la combinación de expresión relativamente baja de los anticuerpos desplegados por la introducción del codón ámbar antes del gen del anticuerpo con mejor eficiencia de despliegue hace útil al nuevo fagémido pKM19 para la selección de los anticuerpos scFv recombinantes contra los blancos deseados de una biblioteca grande, así como para su maduración de afinidad. El plásmido garantiza el despliegue eficiente y permite la reducción del sesgo biológico contra anticuerpos "difíciles" en la delicada etapa de selección inicial. Más aún, este vector es particularmente útil para la maduración de afinidad de los anticuerpos, ya que altos niveles de expresión pueden aumentar la avidez de las partículas del fago que despliegan Ab, que llevan a la selección de anticuerpos con solo afinidad modesta.

Procedimientos

Cepas bacterianas y fagos

Se usó la cepa bacteriana DH5αF’ (supE44∆lacU169 (Φ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endAlgyrA96 thi-1 relA1 F’ [traD36 proAB+ lacIqlacZ∆M15]) para la producción de anticuerpos soluble y de fago. El fago auxiliar M13 KO7 (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) se usó para la preparación del fago.

El anticuerpo del fago anti-CEA, MA39 (BMC Cancer 2006 6: 41), en el plásmido pDN322 (J. Biol. Chem. 1998 273 (34): 21769-21776) se usó como fuente del gen del anticuerpo anti-CEA.

Construcción de plásmidos

El plásmido pC89 (J. Mol. Biol. 1991 222(2): 301-310) se amplificó por PCR inversa con los oligonucleótidos KM161, KM162, que contienen los sitios HindIII y NotI (subrayados) (KM161 5’- GAGGAAGCTTCCATTAAACGGGTAAAATAC-3’(SEQ ID 78); KM162 5’- TGCAATGGCGGCCGCTAATATTGTTCTGGATATTACCAGC-3’[SEQ ID 79]). En la PCR inversa se usó una mezcla de Taq polimerasa con ADN polimerasa Pfu para aumentar la fidelidad de la síntesis de ADN. Se realizaron veinticinco ciclos de amplificación (95ºC-30seg, 55ºC-30seg, 72ºC-20min). El producto de PCR se digirió con las Endonucleasas HindIII y NotI y se ligó con un dúplex del oligonucleótido KM163KM164 que codifica el péptido FLAG y cola His (KM163 5’- AGCTTCCTC ATG TAG GCG GCC GCA GGA GAC TAC AAA GAC GAC GAC GAC AAA CAC CAC CAT CAC CAC CAT TAA-3’[SEQ ID,80]; KM164 5’- GGCC TTA ATG GTG GTG ATG GTG GTG TTT GTC GTC GTC GTC TTT GTA GTC TCC TGC GGC CGC CTA CAT GAGGA-3’ [SEQ ID 81]). El dúplex de ADN clonado contenía un sitio NotI interno, corriente arriba de la secuencia que codifica el péptido FLAG, mientras que el sitio NotI, usado para la clonación del dúplex, no fue restaurado. El plásmido pKM15 resultante se digirió nuevamente con las endonucleasas HindIII, NotI y se ligó con el dúplex de KM175KM176 que codifica la secuencia líder y los primeros dos aminoácidos de la proteína bacteriana PhoA, que contiene el sitio de clonación de NcoI (KM175 5’-AGC TTA TAA AGG AGG AAA TCC TCA TGA AAC AGA GCA CCA TCG CAC TGG CAC TGT TAC CGT TAC TGT TCA CCC CGG TTA CCA AAG CAC GTA CCA TGG TTT CCC TTGC-3’ [SEQ ID 82]; KM176 5’-GGC CGC AAG GGA AAC CAT GGT ACG TGC TTT GGT AAC CGG GGT GAA CAG TAA CGG TAA CAG TGC CAG TGC GAT GGT GCT CTG TTT CAT GAG GAT TTC CTC CTT TATA-3’ [SEQ ID 83]). Este nuevo plásmido pKM16 se destinó para la producción de anticuerpo de cadena simple soluble (Figura 1).

El plásmido pKM16 se amplificó por PCR inversa con los oligonucleótidos KM181, KM182, que presentan los sitios de restricción EcoRI y BamHI, respectivamente (KM181 5’-GTG GTG ATG GAA TTC TTT GTC GTC GTC GTC TTT GTA GTC-3’[SEQ ID 84]; KM182 5’- CAC CAT TAA GGA TCC TAA TAT TGT TCT GGA TAT TAC CAG C-3’ [SEQ ID 85]). El gen III de longitud completa (Número de acceso V00604) y la parte 3’ del gen que codifica los últimos 197 aa del pIII se amplificaron por medio de los oligonucleótidos KM183-KM185 o KM184-KM185 que contienen los sitios BamHI y Ncori (subrayados) y se ligó en pKM16 digerido, que da los nuevos plásmidos pKM17 y pKM18, respectivamente (KM183 5’- TC TAT TCT GAA TTC GCT GAA ACT GTT GAA AGT TGT TTA GC-3’ [SEQ ID 86]; KM184 5’- GC CAA TCG GAA TTC CTG CCT CAA CCT CCT GTG AAT GCT-3’ [SEQ ID 87]; KM185 5’- GAA CTG GGA TCC TTA AGA CTC CTT ATT ACG CAG TAT G-3’[SEQ ID 88]).

Un fragmento corto del plásmido pKM18 que codifica la secuencia líder se amplificó por PCR con los cebadores KM186-KM180, que introducen una mutación ámbar en el gen PhoA del péptido líder (KM186 5’- ACC CGT AAG CTT ATA AAG GAG GAA ATC CTC ATG AAA TAG AGC ACC ATC GC-3’[SEQ ID 89]; KM180 5’- TAG CCC CCT TAT TAG CGT TTG-3’ [SEQ ID 90]). El producto de PCr resultante se digirió con HindIII y NotI y se clonó en pKM18, se digirió con Hindi y NotI y se purificó en agarosa, para construir el plásmido pKM19.

Producción de anticuerpo soluble

Una colonia individual se inoculó en 50 ml de LB que contiene 100 μg/ml de Ap y 2% de glucosa. El cultivo se desarrolló a 37ºC durante 2-3 h hasta una D.O.=0,8. Las células recuperadas por centrifugación se resuspendieron en 50 ml de LB con Ap y 1 mM de IPTG y se incubaron toda la noche a 30-32ºC. El pellet celular se resuspendió en 500 μl de PBS. Después de tres ciclos de congelamiento y descongelamiento, los desechos celulares se sedimentaron por centrifugación. El sobrenadante resultante se usó para ELISA o para transferencia Western.

Purificación de linfocitos de sangre periférica y síntesis de ADNc

Los linfocitos se aislaron de 10 ml de sangre periférica fresca del paciente EC23 (con estadio avanzado de cáncer de mama) con un anticoagulante por medio de Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aisló ARNm de los linfocitos por medio del uso del kit Dynabeads ARNm DIRECT (Dynal, Noruega). El ARNm se aisló de linfocitos por medio del uso del kit Dynabeads ARNm DIRECT (Dynal, Oslo; Noruega). Se usó un μg del poli(A)+ ARN de los linfocitos para sintetizar el ADNc de longitud completa por medio del kit de construcción de biblioteca de ADN SMART (Clontech, Palo Alto, CA).

Construcción de biblioteca de scFv

El repertorio del gen del anticuerpo se amplificó por medio de un conjunto de cebadores diseñado para la amplificación de los dominios VH y VL del anticuerpo, mientras que los fragmentos scFv enteros se ensamblaron in vitro como se describió en [Pope, A.R., Embleton, M.J. & Mernaugh R. (1996) Construction and use of antibody gen repertoires. En: Antibody Engineering - A practical approach (McCafferty, J., Hoogenboom, H. & Chiswell D., eds), pp,325, Oxford University Press]. Estos últimos posteriormente se amplificaron por PCR con cebadores de extensión apropiados, que incorporan los sitios de restricción NcoI, NotI, y permiten la clonación de los genes de scFv en un vector pKM19. Los productos de PCR resultantes se purificaron en 1% de gel de agarosa de punto de fusión bajo (NuSieve 3:1 agarosa, Rockland, ME), se cortaron con NcoI/NotI y se insertaron en el plásmido digerido. La biblioteca scFvEC23 transformada contenía 1,77x107 clones independientes con el inserto de scFv de longitud completa. La biblioteca de scFvEC23 deriva de los PBL obtenidos de un solo paciente EC23 con estadio avanzado de cáncer de mama.

Construcción de biblioteca de scFv de anti-CEA mutado

La biblioteca de maduración para el scFV de anti-CEA se construyó como se describió previamente (BMC Cancer 2006 6:41). En breves palabras, se generaron los fragmentos del gen de scFv mutado por la amplificación por PCR con los cebadores: KM144-KM143 (KM143, 5’-GTCATCGTCGGAATCGTCATCTGC-3’ [SEQ ID 91]; KM144, 5’TGTGCGAAAAGTAATGAGTTTCTTTTTGACTACTGGGGC-3’ [SEQ ID 92]) y KM148-KM145 (KM148, 5’CTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGA-3’ [SEQ ID 93]; KM145,5’TCCGCCGAATACCACATAGGGCAACCACGGATAAGAGGAGTTACAGTAATAGTCAGCC-3’ [SEQ ID 94]) que introducen mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de las cadenas pesada o liviana con frecuencia baja. Cada base subrayada de los oligonucleótidos KM144 y KM145 se reemplazó con la mezcla de G/A/T/C con una frecuencia de 10%. Las partes del gen del anticuerpo de scFv faltantes se amplificaron con cebadores KM148-KM157 y KM158KM143 para HC y LC, respectivamente (KM157 5’-TTT CGC ACA GTA ATA TAC GG-3’ [SEQ ID 95]; KM158 5’-TAT GTG GTA TTC GGC GGA-3’ [SEQ ID 96]). A fin de reconstruir el gen entero, los fragmentos correspondientes se combinaron y amplificaron en un procedimiento similar a PCR sin cebadores de oligonucleótido. el productos de PCR resultante se utilizó para amplificar el gen entero con cebadores externos KM148, KM143. El fragmento de ADn final se purificó en agarosa, digirió con enzimas de restricción NcoI y NotI, y se ligó con el plásmido pKM19 digerido. La biblioteca resultante contenía 2,2x106 clones de anticuerpo mutados.

Competición con scFv soluble

Las placas de ELISA se recubrieron, bloquearon y lavaron como antes. Varias cantidades de anticuerpo anti-CEA soluble MA39 (BMC Cancer 2006 6: 41) en 100 µL de buffer de bloqueo se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 30 min a 37ºC. Posteriormente, se añadieron 10 µL (4,5x109 TU) del sobrenadante del fago MA39 o 5 µL (3x108 TU) del sobrenadante anti-CEA/pKM19 a los pocillos y se incubaron durante otra 1 h a 37ºC. Las placas se lavaron y el fago unido detectado por un anticuerpo anti-M13 conjugado por HRP. Un scFv anti-SP2 soluble irrelevante (Tabla 5), se usó a una concentración alta (400 ng/pocillo) como control negativo. Una cantidad menor del fago anti-CEA/pKM19, en comparación con MA39, se usó para la reactividad moderada por ELISA de este fago.

En el caso de competición con filtrados de los sobrenadantes del fago, se usaron 10 µL o 50 µL de los filtrados MA39 o pKM19/anti-CEA en 100 µL del buffer de bloqueo como competidores. Los filtrados del fago se obtuvieron de sobrenadante del fago recién preparados por el uso de una columna de filtración Microcon 100.

Transferencia Western de fagos purificados con PEG

El fago se purificó de acuerdo con precipitación de PEG/NaCl estándar (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989). Los extractos proteicos de las muestras de fago se fraccionaron por SDS-PAGE y transfirieron en una membrana de nitrocelulosa. Las tiras de membrana se desarrollaron con un anticuerpo conjugado con AP anti-FLAG.

ELISA del fago

Las placas multipocillo (Immunoplate Maxisorb, Nunc, Roskilde, Dinamarca) se revistieron ON a 4ºC con una solución de proteína a una concentración de 10 mg/ml en 50 mM de NaHCO3, pH 9,6. Después de descartar la solución de revestimiento, las placas se bloquearon durante 1 h a 37 ºC con buffer de bloqueo de ELISA (5% de leche deshidratada no grasa, 0,05% de Tween-20 en PBS). Las placas se lavaron varias veces con buffer de lavado (0,05% de Tween-20 en PBS). El fago purificado en PEG en buffer de bloqueo (1:1) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 1 h a 37ºC. Las placas se lavaron y el fago unido se detectó con un anticuerpo secundario anti-M13 conjugado con HRP (27-9421-01, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), o anti-FLAG conjugado con HRP (A9044, Sigma, St. Louis, MO), o anti-FLAG conjugado con AP (A9469, Sigma). En el caso de los conjugados con HRP, la inmunoreacción se desarrolló por la incubación con sustrato líquido TMB (Sigma) durante 15 min y se detuvo por la adición de 25 µL de H2SO4 2 M. Los resultados se expresaron como la diferencia entre las absorbancias a 450 y 620 nm, que se determina con un lector de ELISA automatizado. El anticuerpo conjugado a AP se detectó por incubación con 1 mg/ml de solución de fosfato de p-nitrofenilo en buffer sustrato (10% de buffer de dietanolamina, 0,5 mM de MgCl2, pH 9,8) durante 60 min. Los resultados se expresaron como la diferencia entre las absorbancias 405 y 620 nm.

Los anticuerpos se definen en la tabla 5.

Resultados

El plásmido pKM16 (Figura 1) usado para la producción de anticuerpos solubles en configuración scFv se construye como se describió anteriormente. Este plásmido dirige la expresión de proteína bajo el control del promotor lacP. Los sitios de clonación únicos NcoI y NotI permiten la inserción de un gen del anticuerpo capaz de expresar los anticuerpos de cadena simple con un péptido líder de la enzima periplásmica bacteriana, fosfatasa alcalina (AP), y con los dos primeros aminoácidos de la proteína AP madura, en el extremo terminal amino del anticuerpo; y FLAG/cola His en el extremo terminal carboxi del anticuerpo. A fin de confirmar las calidades prácticas del plásmido, un gen de un anticuerpo de cadena simple de especificidad conocida, el anti-CEA MA39, se amplificó por PCR y se clonó en el vector pKM16. Los autores posteriormente analizaron las proteínas periplásmicas purificadas por congelamiento-descongelamiento en la transferencia Western desarrollada con un anticuerpo secundario anti-FLAG (Figura 3). Las bandas del anticuerpo de cadena simple migraron como proteínas con el peso molecular esperado. La secuenciación de la proteína N-terminal por la degradación de Edman confirma el procesamiento correcto del péptido líder.

Fagémidos para el despliegue del anticuerpo scFv

Un fagémido clásico (pDN322) que despliega el anticuerpo de cadena simple anti-CEA, MA39, se comparó con los vectores pKM17, pKM18 y pKM19 que despliegan el mismo anticuerpo, para la producción y eficiencia del despliegue de la partícula el fago. Los plásmidos pKM17 y pKM18 (Figura 1) permiten desplegar los fragmentos del anticuerpo sobre una partícula de fago por fusión a, respectivamente, la pIII entera (1-406 aa) o el dominio carboxi terminal solo (210-406 aa) de la proteína. El plásmido pKM19, derivado de pKM18, alberga un codón ámbar en la secuencia líder, de este modo lleva a una menor producción de las proteínas de fusión de scFv-pIII en comparación con pKM18. Este es un experimento con datos que muestra en la bacteria supE, la eficiencia de supresión de este codón TAG, que depende del contexto del nucleótido, es aproximadamente 10-15% (J. Mol. Biol. 1983 164(1): 5971; Mol. Gen. Genet. 1987 207(2-3): 517-518).

Los autores realizaron pruebas funcionales por la clonación del gen del anticuerpo de cadena simple anti-CEA en tres nuevos plásmidos y se los confrontó con el clon original MA39 (anti-CEA en pDN322).

Se incubaron tres colonias individuales por cada clon en 10 ml de medio y se amplificó el fago como se describe en el Ejemplo 2. Después del rescate del fagémido se titularon los sobrenadantes. Los autores obtuvieron un intervalo entre 5 a 1x1011 TU/ml para MA39, pKM18 y pKM19, que despliegan el anticuerpo anti-CEA, mientras que antiCEA/pKM17 generó títulos cinco a diez veces menores (Tabla 1).

Tabla 1. Producción de fago por diferentes vectores de fagémido que codifican el mismo gen de anti-CEA.

Fago

Clon Título Fago Clon Título

MA39

1 1,5x1011 anti-CEA/pKM18 1 2,52x1011

2

2,55x1011 2 2,5x1011

3

5,1x1011 3 1,75x1011

anti-CEA/pKM17

1 6x1010 anti-CEA/pKM19 1 3x1011

2

4,1x1010 2 1,8x1011

3

1,95x1010 3 2,8x1011

5

Las preparaciones de fago se analizaron en ELISA, donde el desarrollo se realizó por el uso de anti-M13, o alternativamente, el anticuerpo secundario anti-FLAG. Se aplicaron diferentes cantidades de fago por pocillo de ELISA, los autores demostraron mayor eficiencia del despliegue para los fagos pKM18 y pKM19 en comparación con pKM17 y mucho mayor en comparación con MA39 (Figura 4). Es interesante que el clon de MA39, que produce un

10 nivel de anticuerpos mayor que anti-CEA/pKM17, como se muestra por el desarrollo con anticuerpo anti-FLAG, (Figura 4B), tiene una señal más débil cuando el ELISA se desarrolla con el anticuerpo secundario anti-M13 (Figura 4A).

Esto indica que los scFv libres, producidos por el sistema de fagémido clásico, filtran en el medio y coprecipitan con las partículas del fago, en consecuencia compiten con los anticuerpos desplegados en fago por la unión al blanco.

15 Este fenómeno se debe a la presencia de un codón ámbar entre los genes de scFv y pIII.

A fin de verificar esta hipótesis, los autores filtraron preparaciones frescas del fago MA39 y anti-CEA/pKM19 por medio de Microcon 100 Centrifugal Filter Devices (Millipore Corporation, Bedford, MA), capaces de retener partículas grandes del fago y pasar a través de scFv solubles. La prueba ELISA de las preparaciones de fago, antes y después de la filtración, desarrolladas con anticuerpos anti-M13 o anti-FLAG, muestra que:

20 (i) los filtrados de MA39 y pKM19 prácticamente pierden los anticuerpos desplegados en las partículas del fago, como se espera;

(ii) los anticuerpos libres están presentes en ambas preparaciones (Figura 5).

Sin embargo, el nivel de anticuerpos libres en la muestra de anti-CEA/pKM19 es marcadamente menor. Los anticuerpos libres en esta muestra son el resultado de la eliminación de anticuerpos, inevitable durante la

25 preparación del fago y que pueden aumentar como resultado del contacto con los componentes del sistema de filtración; mientras que los anticuerpos libres en las muestras MA39 son el resultado de la expresión libre del anticuerpo y la filtración en el medio junto con la eliminación.

Para analizar la capacidad competitiva de los anticuerpos libres en los sobrenadantes del fago, nosotros debemos hacer competir los sobrenadantes del fago de los fagos MA39 y anti-CEA/pKM19 con el anticuerpo soluble anti-CEA 30 de concentración conocida (Figura 6) o con cantidades diferentes de filtrados de sobrenadantes de ambos fagos (Figura 7). Estos dos experimentos muestran que los scFv libres compiten eficientemente con los anticuerpos del fago. Diez μl del filtrado de MA39 ya compiten con 10 μl de su propio sobrenadante del fago y 5 μ del sobrenadante anti-CEA/pKM19, mientras que la misma cantidad del filtrado de anti-CEA/pKM19 no tiene efecto. Se observa competición marcada solo en un exceso de diez veces de filtrado de anti-CEA/pKM19 con el mismo sobrenadante

35 del fago (50 μl del filtrado a 5 μl de sobrenadante). El análisis de transferencia Western (Figura 8) de varios fagos purificados por PEG desarrollados con un anticuerpo anti-FLAG detecta: (i) la banda superior de cada muestra que corresponde a la fusión scFv-pIII en caso de los fagos MA39 y anti-CEA/pKM17 y scFv-%pIII en caso de antiCEA/pKM18 o anti-CEA/pKM19; (ii) una presencia notable de anticuerpos libres en la muestra MA39; (iii) presencia de productos de degradación en las muestras de fago como se describió previamente (Gene 1995 155(1):61-65).

40 Generación de biblioteca desplegada en anticuerpo scFv y aislamiento de las especificidades de unión por medio del nuevo plásmido pKM19

El plásmido pKM19, un derivado de pKM18, que alberga el codón ámbar en la secuencia líder se usó para la generación de la biblioteca scFv para estudiar si una baja producción de anticuerpos fusionados permite la selección eficiente de un anticuerpo específico contra una molécula blanco.

Una biblioteca de anticuerpo scFv se construyó a partir de linfocitos humanos de sangre periférica como se describió en Materiales y Procedimientos. La biblioteca se seleccionó contra la fusión de GST de un polipéptido de 168 aa de largo SP2 de Streptoccocus pneumoniae (FEMS Microbiol. Lett. 2006 262(1):14-21), que fue reactivo con la muestra de sangre utilizada para la construcción de la biblioteca scFv.

Se diseñó un procedimiento de selección para crear una alta concentración de la proteína blanco en volumen de incubación pequeño, por el uso de proteína biotinilada para la inmunopurificación y Dynabeads revestidas con estreptavidina para el aislamiento del fago unido, como se describió en el Ejemplo 2. Después de completar dos rondas de inmunopurificación, nosotros ensayamos la reactividad de las mezclas de fagos en ELISA (Figura 9). La mezcla de fagos, después de la segunda ronda de selección por afinidad, fue altamente reactiva con la proteína de fusión y negativa con las proteínas irrelevantes, tales como GST, leche y estreptavidina, que se presentaron como portador de proteína o componentes del sistema de selección y todas se usaron como controles negativos en ELISA, de este modo se indica la sucesiva selección de anticuerpo específicos.

Finalmente, los autores aislaron y secuenciaron un número de clones positivos para confirmar la secuencia correcta de scFv. Uno de los genes identificados de scFv se clonó en pKM16 para la producción de anticuerpo anti-SP2 soluble (Tabla 5), que se usó como un anticuerpo control irrelevante en los experimentos descritos en las Figuras 6, 11 y 12.

Maduración del anticuerpo scFV de anti-CEA por medio del uso del vector pKM19

La selección por afinidad de una biblioteca de maduración se llevó a cabo como se describió en BMC Cancer 2006

6:41. La Figura 10 muestra que la reactividad del fago contra la proteína de CEA crece en cada ronda de selección sucesiva. Se aislaron los clones de fago único con mejor reactividad (Figura 10). Los autores secuenciaron 19 clones aleatorios de la mezcla de fagos después de la segunda ronda de selección. Ninguno los clones secuenciados de la mezcla de fagos que tiene aumento de afinidad (0 de 19) presentó codones de detención en su secuencia, mientras que 70% (9 de 13) de los clones del sistema de fagémido clásico contenían tales mutaciones (P=0,00002, calculadas de acuerdo con la prueba de chi cuadrado). En consecuencia, el uso del vector de pKM19 para la maduración de un anticuerpo anti-CEA aumenta significativamente los resultados de la selección.

Dos genes del anticuerpo aislados de la biblioteca de maduración (clones 1 y 2), se clonaron en pKM16, y se produjeron los anticuerpos solubles y se compararon con el anti-CEA MA39 soluble original y el anticuerpo E8 maduro con el fagémido canónico (Pavoni et al., 2006). La Figura 11 confirma la mayor afinidad de los anticuerpos maduros.

La prueba de especificidad sobre los scFv recién seleccionados muestra su baja reactividad umbral con proteínas irrelevantes, comparable con la del anticuerpo original (Figura 12).

EJEMPLO 2: Construcción de la biblioteca derivada de TIL y selección del anticuerpo

Introducción

La identificación de los anticuerpos recombinantes específicos del tumor de la biblioteca de despliegue derivados de los ganglios linfáticos de pacientes con cáncer se describió en [Clin. Exp. Immunol. 1997 109(1):166-74; Int. J. Mol. Med. 2004 14(4):729-35; World J. Gastroenterol. 2004 10(18):2619-23].

Se sabe que aproximadamente 7% de las secuencias de anticuerpo de cadena pesada derivadas de ganglio linfático y entre 18-68% derivadas de TIL pertenecen a los grupos clonales (Cancer Immunol. Immunother. 2003 52(12):715738). Esto indica que tanto los ganglios linfáticos drenantes del tumor como los linfocitos infiltrantes del tumor son fuentes promisorias de anticuerpos específicos de tumor. Los autores mostraron por amplificación por PCR de las regiones del gen del anticuerpo específicas de diez de tumores de mama primarios (ninguno es del tipo histológico raro MBC) de pacientes entre 49-79 años, que 7 de 10 de estas muestras (70%), tenían una prominencia de la expresión del anticuerpo IgG, en comparación con la subclase IgA, que se correlaciona con la oligoclonalidad de la región hipervariable de los anticuerpos de cadena pesada, lo que sugiere una respuesta inmune específica a los antígenos expresados en el tumor. La clonalidad de los anticuerpos derivados del tumor se confirmó por análisis de secuenciación.

Los autores identificaron un panel de anticuerpos específicos del tumor a partir de las bibliotecas descritas que fueron reactivos con el dominio de ED-B, de las células de carcinoma de mama MUC1, CEA y MCF7 usadas en las selecciones respectivas. Es interesante que en la realización de la selección basada en células sin etapa de inmunopurificación sustractiva en el epitelio de mama normal, en contraste con numerosos protocolos de selección descritos previamente [Int J Mol Med. 2004 14(4):729-35; World J Gastroenterol. 2004 10(18):2619-23; Int J Oncol. 2000 16(1):187-95; Cancer Res. 1999 59(11):2718-23; Biochem Biophys Res Cmmun. 2001 280(2):548-52], los autores aislaron solo un scFv de 10 que no era específico del tumor y también reconocieron epitelio de mama normal. Esto probablemente indica que nuestra biblioteca de tamaño modesto contiene un muy restringido repertorio de anticuerpos naturales provisto por TIL-B, más que un vasto repertorio de anticuerpos creado por la transposición de cadena del anticuerpo. Más aún, la selección de anticuerpos de una mezcla bibliotecas derivadas de PBL y TIL muestra claramente que la última biblioteca es más eficiente en una inmunopurificación basada en células. En efecto, todos los anticuerpos de cadena simple anti-MCF7 aislados parecieron derivar de los linfocitos infiltrantes del tumor. En síntesis, la biblioteca derivada de TIL proporcionó buenos resultados en todas las selecciones realizadas, que proporcionan un panel de anticuerpos humanos específicos de tumor, que reconocen antígenos de la superficie celular del tumor útiles para la terapia y diagnóstico del cáncer.

En este estudio nosotros demostramos que la aplicación del nuevo vector de despliegue en fagos mejorado pKM19 llevó al aislamiento de un panel grande de anticuerpos derivados de trozos de tejido tumoral extirpado en la cirugía del tumor, contra antígenos tumorales conocidos y células tumorales enteras, y que son potencialmente útiles en la terapia del cáncer. Estos resultados son similares a los resultados obtenidos por la detección directa de la biblioteca de expresión del anticuerpo derivado de TIL soluble (Cancer Immunol. Immunother. 2002 51(2):79-90). La detección directa es un abordaje de detección sin sesgo que no depende de las etapas de amplificación del fago y resulta más eficiente en comparación con la selección por afinidad realizada con los vectores de despliegue canónicos, que no pudieron seleccionar anticuerpos específicos de tumor en trabajos análogos (Cancer Res. 2001 61(21):7889-99; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001 98(22):12659-64; Int. J. Cancer 2001 93:832-40). Nuestros resultados indican que el vector pKM19 mejora los resultados de la selección en comparación con los vectores de despliegue clásicos y al mismo tiempo, proporciona la posibilidad de aplicar metodologías de selección por afinidad, que facilitan la manipulación con bibliotecas grandes.

En conclusión, nuestros resultados indican que las respuestas inmunes naturales a los antígenos relacionados con el tumor existen en la mayoría de los pacientes con cáncer de mama, no solo en los histológicamente definidos como MCB. Se obtuvieron muestras tumorales tan pequeñas como 0,2 g como material quirúrgico y se pueden aprovechar como una fuente apropiada para la generación de bibliotecas de despliegue en fago recombinante enriquecidas para los anticuerpos específicos de tumor: el aislamiento de un panel de scFv antitumorales a través de la selección contra blancos de proteína deseables, así como contra células de carcinoma de mama vivas, muestra que este abordaje es muy promisorio para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos. Más aún, la investigación de los blancos de proteína que induce la producción de anticuerpos específicos de las células tumorales en un microambiente del tumor puede (i) proporcionar detalles importantes acerca de la inmunorreactividad individual de un paciente dado, lo que proporciona un valor pronóstico; (ii) abrir una gran perspectiva para el descubrimiento de nuevos antígenos específicos del tumor.

Procedimientos

Muestras de tejido y sangre

Los especímenes de carcinoma de mama y la sangre periférica fresca de pacientes con cáncer de mama (B81-B96, EC23) se obtuvieron de M. G. Vannini Hospital, Roma. Todas las muestras biológicas se obtuvieron mediante consentimiento informado.

Líneas celulares

La líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 (Número ATTC: HTB-22), MDA-MB-468 (Número ATTC: HTB132) y SkBr3 (Número ATTC: HTB-30), y línea celular de adenocarcinoma de colon LoVo (Número ATTC: CCL-229) se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fibroblastos de prepucio humano (HFF) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de L-glutamina. Las células epiteliales de mama inmortales MCF10-2A (Número ATTC CRL-10781) [Cancer Res. 1990 50(18):6075-86] se propagaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y usaron como controles negativos en las pruebas ELISA.

Proteínas de antígeno tumoral purificado

La proteína de CEA humana, purificada del carcinoma de colon y metástasis hepática, se adquirió en USBiological (#C1300-16, United States Biological, Swampscott, MA).

El dominio ED-B recombinante biotinilado de la fibronectina se obtuvo de Sigma-Tau S.p.A. (Pomezia, Roma).

La proteína MUC1 recombinante se obtuvo en varias etapas. Dos oligonucleótidos superpuestos KM358 5’-ACT TCA GCT CCG GAC ACC CGT CCG GCT CCG GGT TCC ACC GCT CCG CCG GCT CAC GGT GTC-3’ [SEQ ID 97] y KM359 5’-CGG AGC CGG ACG GGT GTC CGG AGC TGA AGT GAC ACC GTG AGC CGG CGG AGC GGT GGA ACC-3’ [SEQ ID 98] codificados por la repetición de 20-aa MUC1, se ensamblaron en un proceso tipo PCR, en el que se realizaron 25 ciclos de amplificación por PCR con 0,2 pM/μl de KM358 y KM359. Posteriormente se cortó la banda de ADn de peso alto del gel de agarosa y se ligó con un adaptador corto, obtenido por el apareamiento de un oligonucleótido KM328 5’-CT AGT TCG TCG GGT TCG TCG GGA-3’ [SEQ ID 99] y uno fosforilado: KM329 5’-TCC CGA CGA ACC CGA CGA A-3’ [SEQ ID 100]. El fragmento de ADN resultante se purificó del exceso de adaptador, se fosforiló y clonó en pGEX-SN digerido y defosforilado [Int J Cancer. 2003 106(4):534-44], derivado del plásmido pGEX-3X [Gene 1988 67:31-40]. La proteína recombinante MUC1 fusionada a GST, que contiene una secuencia de MUC1 de 107-aa, que contiene 5,3 repeticiones, se purificó de acuerdo con procedimientos estándares [Gene 1988 67:31-40].

Purificación de linfocitos de sangre periférica

Los linfocitos se aislaron de 10 ml de sangre periférica fresca mezclada con anticoagulante por el uso de Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ARNm se aisló de los linfocitos por medio del uso del kit de ARNm directo Dynabeads (Dynal, Noruega).

Extracción de ARN y síntesis de ADNc

Se obtuvieron especímenes de tumor de aproximadamente 200 mg de pacientes con carcinoma de mama como muestras de descarte quirúrgico e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. El ARN total se preparó con el sistema de aislamiento de ARN total (Promega, Madison, WI) y se purificó a poli A+ ARN por medio del uso de los sistemas de aislamiento de ARNm PolyATract (Promega). Se usaron quinientos ng de poli(A)+ ARN de carcinomas de mama o 1 μg del poli(A)+ ARN de los linfocitos para sintetizar el ADNc de longitud completa por medio del kit de construcción de biblioteca de ADNc SMART (Clontech, Palo Alto, CA).

Análisis de la expresión del gen del anticuerpo por PCR

La región hipervariable del anticuerpo V(D)J se amplificó por PCR a partir de los moldes de ADNc por medio de cebadores específicos de sitio 5’-GGACACGGCT(G/C)TGTATTACTG-3’[SEQ ID 101] y 5’GCTGAGGAGACGGTGACC-3’[SEQ ID 102] diseñados en un estudio por Hansen y colegas [Proc Natl Acad Sci USA 2001 98(22):12659-64]. La determinación de la subclase IgG1, IgG2 y IgA se realizó como se describió en [J Immunol. 2002 169(5):2701-11] por la combinación en forma individual de los cebadores específicos de la región constante para los genes de IgG1, IgG2 y IgA (CG1d, CG2a y CA1, respectivamente) con un conjunto de cebadores de la cadena pesada variable: VH135, VH3a, VH3f, VH4, VH4b. Estos cebadores se diseñaron para la construcción de la biblioteca de Fab humana [Barbas CF III, Burton DR (1994) Monoclonal antibodies from combinatorial library. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual].

Construcción de la biblioteca de scFv

El repertorio de genes del anticuerpo se amplificó por medio del conjunto de cebadores diseñados para la amplificación de los dominios del anticuerpo VH y VL [Pope, A.R., Embleton, M.J. & Mernaugh R. (1996) Construction and use of antibody gene repertoires. En: Antibody Engineering - A practical approach (McCafferty, J., Hoogenboom, H. & Chiswell D., eds), pp,325, Oxford University Press] y los fragmentos scFv se ensamblaron in vitro como se describió antes [Pope AR et al., 1996]. Los fragmentos scFv posteriormente se amplificaron por PCR con cebadores de extensión apropiados, que incorporan los sitios de restricción NcoI, NotI, lo que permite la clonación de los genes scFv en el vector pKM19. Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa de fusión baja 1% (NuSieve 3:1 agarosa, Rockland, ME). Los fragmentos de ADN se digirieron con NcoI/NotI y se insertaron en el vector pKM19. El ADn ligado se usó para transformar las células bacterianas competentes DH5αF’ (supE44∆lacU169(Φ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-1 relA1 F’ [traD36 proAB+ lacIqlacZ∆M15]) por electroporación.

Las células transformadas se sembraron en 20 placas de agar (ø 15 cm), que contienen agar LB, 100 μ g/ml de ampicilina y 1% de glucosa. Después de la incubar toda la noche a 37ºC, las colonias bacterianas se desprendieron de las placas y resuspendieron en LB, que contiene 10% de glicerol. Las alícuotas de esta suspensión celular se conservaron a -80ºC y se usaron para la amplificación del fago.

Amplificación del fago

Se incubaron cuarenta μl de células bacterianas desprendidas en 40 ml de LB que contiene ampicilina y 1% de glucosa hasta D.O=0,2. Las bacterias se recolectaron por centrifugación y resuspensión en 40 ml de LB con ampicilina sin glucosa. Aproximadamente 6x109 pfu de M13K07 auxiliar se añadieron a cada ml de suspensión celular, se incubaron durante 15 min a 37ºC sin agitación y otras 2 h en un agitador. Se añadió kanamicina a la concentración final de 20 μ g/ml y las células se incubaron ON a 32ºC. El fago se purificó de acuerdo con la precipitación de PEG/NaCl estándar [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989].

Selección basada en células de anticuerpos de biblioteca desplegada en fago

Las células semiconfluentes MCF-7 (aproximadamente 2x107) se enjuagaron 3 veces con buffer PBS y se incubaron con 2 ml de 2 mM de EDTA en PBS durante 15 min a 37ºC. Diez ml de PBS que contiene 10 mM de MgCl2 se añadieron a las células, estas se extrajeron con precisión por pipeteo. Las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron una vez con 10 ml de PBS/MgCl2 y finalmente se resuspendieron en 1 ml de buffer de bloqueo recién preparado: 4% de leche en polvo no grasa, 0,05% de Tween 20, 5x1011 pfu de fago destruido por UV f1. Las células se bloquearon durante 30 min a RT sobre rueda giratoria, posteriormente se recolectaron e incubaron durante 1 h a 37ºC sobre la rueda con aproximadamente 5x1011 TU de biblioteca de anticuerpo scFv recién amplificada en 1 ml de buffer de bloqueo. Las células se lavaron 5 veces con PBS/Tween. El fago unido se eluyó por el añadido de 400 µL de HCl 0,1 M, pH 2,2 (ajustado por glicina). La suspensión celular se incubó con solución de elución durante 10 min a RT, se neutralizó con 40 µL de Tris-HCl 2 M, pH 9,6 y se usó para la infección de las células bacterianas. Las bacterias se sembraron en dos placas de agar LB (o 15 cm), que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 1% de glucosa. Las bacterias desprendidas se usaron para la amplificación del fago.

Selección por afinidad sobre blancos de proteína purificada

CEA y MUC1 se biotinilaron como se describió en [Harlow E. & Lane D. Antibody: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988]. Aproximadamente 5x1011 TU de biblioteca de anticuerpo scFv recién amplificada se preincubaron con 50 µL de extracto bacteriano AD202 en buffer de bloqueo durante 30 min a 37 ºC. Veinte γ de una proteína biotinilada se añadieron a la mezcla de reacción y se incubaron durante otra h a 37ºC a agitación suave. El fago unido se capturó por medio de Dynabeads M-280 revestidas con estreptavidina (112,05, Dynal, Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se lavaron 5-10 veces con PBS/Tween, posteriormente, se eluyeron y amplificaron como antes.

Experimentos de ELISA

Las células se cultivaron en una placa de 96 pocillos hasta casi confluente. Después de descartar el medio de crecimiento, 100 µL de 4% de paraformaldehído recién preparado (#15710, Electron Microscopy Science, Hatfield, PA) en PBS se añadieron rápidamente durante 10 min. La solución de fijación se extrajo por pipeteo y las células se incubaron con buffer de bloqueo (5% de leche, 0,05% de Tween 20 en PBS) durante 30 min a RT. El fago purificado por PEG en buffer de bloqueo (1:1) se añadió a las células y se incubó durante 1 hora a 37ºC bajo agitación suave. Las células se lavaron 3 veces y un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Pharmacia) se usó para desarrollar la reacción. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Tinción de inmunofluorescencia

Las células se cultivaron en una placa de 24 pocillos para el cultivo celular (Nunc, Roskilde, Dinamarca), se fijó como antes y se bloqueó con 3% de BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. El fago purificado con PEG en 1% de BSA/PBS se añadió a las células y se incubó durante 1 h bajo agitación suave a 37ºC. Las células se lavaron tres veces con 1% de BSA/PBS y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-M13 (27-9420-01, Amersham Biosciences) durante 30 min a 37ºC. Las células se lavaron como antes y posteriormente se incubaron con un anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón conjugado con FITC (554001, BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA) a una concentración de 5 µg/ml durante 30 µmin a 37ºC bajo agitación suave. Después de la última incubación, las células se lavaron cinco veces, se secaron en la oscuridad, se montaron en medio Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) y cubreobjetos, y se analizaron por medio de microscopia de fluorescencia invertida.

Todos los anticuerpos se definen en la tabla 5.

Resultados

Caracterización del infiltrado celular linfoplasmático en muestras de tumor de mama

Diez especímenes de tumor de pacientes con cáncer de mama (47-79 años) se examinaron para determinar la presencia y naturaleza de TIL-B por amplificación por PCR de segmentos de anticuerpo V(D)J (CDR3) y por comparación de la representación de las clases de anticuerpo IgG y IgA.

Los patrones de expresión de los genes del fragmento de anticuerpo se analizaron por PCR semicuantitativa a partir del molde de ADNc de SMART. El panel de ADNc de los diez carcinomas de mama, de las muestras de mama normal, testículos normales y linfocitos de sangre periférica de los donantes sanos se normalizaron por la amplificación por PCR de un gen constitutivo, β-actina y se muestran en la Figura 13A.

Las regiones de cadena pesada hipervariable del anticuerpo V(D)J) se amplificaron como se describió en Materiales y Procedimientos. Después del análisis por electroforesis en gel de agarosa, los mismos productos de PCr se fraccionaron por 10% de PAGE de alta resolución (Figura 13B). En la aplicación de esta técnica, los autores observan que 7 de 10 muestras derivadas de tumor contienen varios números de bandas diferenciadas, que caracterizan la oligoclonalidad de la respuesta inmune en estos patrones, mientras que los fragmentos de ADN de mama normal y linfocitos periféricos bien amplificados no contienen bandas intensivas y forman una mancha, que consiste en las bandas de diferente longitud. La oligoclonalidad observada de las inmunoglobulinas no se correlaciona con la edad de los pacientes.

A fin de analizar las distribuciones de subclase del anticuerpo, nosotros amplificamos los genes de Ig del ADNc del carcinoma de mamas y mamas normales, por medio de cebadores específicos de subclase. De acuerdo con el ensayo previo, las 3 muestras de ADNc de tumor, que no contienen bandas oligoclonales en las regiones V(D)J amplificadas por PCR, tienen una prevalencia de la banda de IgA en comparación con las bandas de IgG1 e IgG2, exactamente como en una muestra de mama normal donde IgA generalmente representa la principal clase de Ig (Br. Med. J. 1976 2(6034):503-506). Por otra parte, las muestras que muestran oligoclonalidad en el primer ensayo contienen IgG1, o IgG1 e IgG2 como bandas de anticuerpo dominantes, en contraste con la mama normal. La Figura 14 muestra cuatro ejemplos más característicos junto con la muestra de mama normal.

La oligoclonalidad de los anticuerpos derivados de TIL-B en pacientes con cáncer de mama se confirmó por secuenciación

Los autores seleccionaron dos muestras de ADNc (B92, B93) que proporcionan las bandas únicas más fuertes en la prueba V(D)J, para el análisis de secuenciación. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de 17 y 13 clones 5 elegidos aleatoriamente que contienen genes del anticuerpo γ que derivan de ADNc de B92 y B93, respectivamente, y se dedujeron sus secuencias de aminoácidos. Los 30 clones codificaron en marco cadenas pesadas organizadas correctas. Los anticuerpos aislados más frecuentemente (B92-A y B93-A1) contenían regiones V(D)J de la longitud exacta correspondiente a las bandas fuertes que se observaron primero en la Figura 13B (líneas con las muestras B92 y B93) (Figura 15), en consecuencia se indica que tanto la amplificación por PCR con cebadores de cadena

10 pesada variable como la etapa de clonación no introducen ningún sesgo particular que interfiere en las frecuencias de cadena pesada de la biblioteca construida.

Como se indica en la figura 15, se identificaron seis mutaciones somáticas en los fragmentos del anticuerpo. Estas mutaciones se localizan en las CDR variables de la cadena γ de la misma especificidad, mientras que solo halló una mutación fuera de las regiones variables (P=0,0002). Por ende, la oligoclonalidad del repertorio de anticuerpos

15 derivado de un tejido tumoral es una respuesta inmune natural que ocurre dentro del tejido tumoral dirigido por antígenos tumorales y no un artefacto introducido por la amplificación por PCR.

Construcción de bibliotecas

Se construyeron cuatro bibliotecas de anticuerpo scFv por medio del uso de siete ADNc como molde, caracterizados por la oligoclonalidad de la respuesta inmune (ver lista de bibliotecas en la Tabla 2). Solo la biblioteca scFvEC23 20 (descrita en el Ejemplo 1) se construyó a partir de linfocitos de sangre periférica, obtenidos de un paciente solo con estadio avanzado de cáncer de mama.

Tabla 2. Lista de biblioteca de anticuerpos ScFv

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Selección de anticuerpos anti-tumorales específicos de la biblioteca de despliegue en fagos generada a partir de 25 TIL-B y PBL

Los autores examinaron directamente la posibilidad de seleccionar fragmentos de anticuerpo específicos de la

biblioteca de fagos contra antígenos de cáncer comunes que incluyen el dominio ED-B de fibronectina [EMBO J.

1987 6(8):2337-42], MUC1 [Cancer Res. 1992 52(22):6365-70; Hum Pathol. 1995 26(4):432-9], y CEA [J. Clin. Lab.

Anal. 5: 344-366; Semin Cancer Biol. 1999 9:67-81; Cancer Res. 2002 62:5049-5057]. En las condiciones descritas 30 en Materiales y Procedimientos una mezcla de cuatro bibliotecas desplegada en anticuerpo scFv derivada de TIL

(scFvB87, scFvB95, scFvB96 y scFvmix) denominada biblioteca mixTIL (Tabla 2) y la biblioteca de scFvEC23 se

inmunopurificaron por separado contra tres blancos de proteína en varias rondas. En cada caso nosotros

observamos que las mezclas de fago fueron ya positivas contra el antígeno seleccionado después de la segunda y

tercera rondas de inmunopurificación (Figura 16). Los clones elegidos aleatoriamente se analizaron para determinar 35 la reactividad de unión contra los antígenos. Los resultados de la prueba de los clones del fago aleatorio de las

mezclas de fagos de la tercera ronda se sintetizan en la Tabla 3. Los clones positivos se analizaron por búsqueda de

huella genética por medio del uso de digestión doble con HaeIII y AluI y se secuenciaron los clones de anticuerpo

únicos. La Figura 17 represente el ELISA de scFv-fagos únicos seleccionados sobre antígenos purificados. Los clones únicos analizados se unen fuertemente con los antígenos respectivos y no reaccionan con proteínas irrelevantes. Este resultado indica que el vector pKM19 es una herramienta adecuada para la selección de anticuerpos anti-tumorales de la biblioteca derivada de TIL y PBL.

Tabla 3. Resultado de las selecciones a través del uso de tres antígenos tumorales purificados.

Antígeno blanco Biblioteca Clones positivos/ clones Genes de anticuerpo analizados aislados

ED-B mixTIL 10/10 1

scFvEC23 10/10 3

MUC1 mixTIL 2/16 1

scFvEC23 6/8 2

CEA mixTIL 17/20 4

scFvEC23 15/20 3

5

Selección basada en células de los anticuerpos específicos de tumor.

Los autores analizaron la funcionalidad de una biblioteca derivada de TIL única (scFvB96) por la selección de anticuerpos específicos de cáncer de mama a través de la inmunopurificación basada en células de la línea celular de carcinoma de mama MCF-7. Cuatro bibliotecas, que incluyen scFvB87, scFvB95, scFvmix y scFvEC23, se 10 combinaron entre sí (biblioteca denominada mixLIB, tabla 2) y se inmunopurificaron en el mismo tipo de células. Cuatro o cinco rondas de selección rondas en las células MCF-7 fueron necesarias para la biblioteca mixLIB o scFvB96, respectivamente, a fin de enriquecer las mezclas de fagos para los ligadores de células específicas (Figura 18). Posteriormente, los clones elegidos aleatoriamente se analizaron para determinar la presencia de anticuerpo ScFv entero. Los clones de scFv-fago de longitud completa se analizaron por ELISA basado en células, y se

15 analizaron por búsqueda de huella genética, y se secuenciaron varios clones positivos. Las secuencias de aminoácidos se dedujeron de las secuencias de ADN, lo que confirma las estructuras del anticuerpo en marco correctas. Los datos del análisis del clon se sintetizan en la Tabla 4.

Tabla 4 Resultado de la selección en células de carcinoma de mama humano MCF7 intactas/vivas.

Selección de MCF-7

Biblioteca scFvB96 mixLIB

Ronda de selección 5 4

scFv de longitud completa/ clones analizados 12/40 30/40

Clones positivos/ clones analizados de longitud 5/12 22/30 completa

Genes del anticuerpo aislados 2 8

20 La reactividad y especificidad de los anticuerpos seleccionados en las células se verificaron por ELISA en líneas celulares de carcinoma de mama: MCF-7, MDA-MB-468, y células normales, como controles negativos: MCF10-2A (epitelio de mama humano), HFF (fibroblastos humanos) (Figura 19). Entre 10 anticuerpos scFv seleccionados diferentes scFv pertenecientes a 7 grupos de especificidad (los anticuerpos (mix7, mix12, mix25 tienen la misma secuencia de cadena pesada y diferentes cadenas livianas; los anticuerpos mix8 y mix39 tienen secuencias

25 similares con diferencias menores), 9 son específicas para las células de carcinoma de mama, mientras que solo el anticuerpo scFv B96/4F se une también a las células epiteliales normales.

Anticuerpos seleccionados en células derivados de TIL

Los anticuerpos scFv Mix11, mix12, mix17, mix23 y mix39 (Tabla 4) se seleccionaron de una mezcla de bibliotecas derivadas de PBL y TIL. Los autores investigaron el origen de estos anticuerpos a fin de observar cuál tipo de 30 biblioteca actúa mejor en condiciones de selección iguales. Un μl de cada biblioteca amplificada se usó como molde para la amplificación por PCR con el par de cebadores de oligonucleótido específicos para cada anticuerpo (Figura 20). Este análisis muestra que los 5 anticuerpos scFv analizados, se aislaron de una mezcla de bibliotecas, pertenecientes a los anticuerpos derivados de TIL. Los genes del anticuerpo de mix7 y mix25 (que tienen la misma

cadena pesada que mix12, tabla 5), y mix8 (similar a la mix39, tabla 5) se considera que tienen un origen similar. Para el anticuerpo anti-SP2 irrelevante, que se seleccionó de la biblioteca de scFvEC23, se confirmó su origen de la biblioteca derivada de PBL. Los anticuerpos anti-MUC1 MB5 y anti-CEA CB37, que se seleccionaron de la mezcla de cuatro bibliotecas derivadas de TIL (mixTIL) se mostraron que derivan de la biblioteca scFvmix y scFvB96, respectivamente.

Tinción de fluorescencia de las células tumorales

Se ensayaron las especificidades de unión de varios clones, que incluyen mix17, mix7 (Figura 21), anticuerpo anti-Mucl MB5 y anti-CEA CB37 (Figura 22) por la tinción de inmunofluorescencia de las células tumorales directamente con los anticuerpos scFv desplegados en el fago. El scFv de Mix17 reconoce la mayor parte de las células de células de carcinoma de mama MCF7 no permeabilizadas en este experimento (Figura 21A), mientras que mix7 tiñe un bajo porcentaje de células, probablemente células y apoptóticas.

El anticuerpo MB5 tiñe intensivamente las células MCF7, conocidas por alta expresión de MUC1, y también reacciona bien con otra línea celular de carcinoma de mama, SkBr3 (Figura 22). El anticuerpo CB37 tiñe las células LoVo. No se observó tinción umbral en el epitelio de mama normal para ambos anticuerpos MB5 y CB37.

EJEMPLO 3: Maduración de anticuerpos scFV de anti-MUC1 y anti-CEA

Para aumentar la afinidad de los anticuerpo específicos de tumor CB37 y MB5, nosotros realizamos la maduración de afinidad del anticuerpos in vitro. La nueva biblioteca de maduración se creó por la combinación de genes de cadenas VH simples derivadas de CB37 y MB5, respectivamente, con varios genes de las cadenas VL derivados de TIL y PBL de los pacientes con tumor. Las bibliotecas se construyeron como se describe en los Ejemplos 1 y 2.

Procedimientos

Selección por afinidad

La selección por afinidad se realizó por medio de las proteínas biotiniladas como se describe en el Ejemplo 2, con la diferencia de que para la primera ronda de selección por afinidad, nosotros usamos 10 μ g de la proteína y para la segunda solo 50 ng. Los clones hallados positivos en el ELISA se analizaron por PCR y huella genética con las enzimas de restricción AluI y HaeIII para identificar clones diferentes. Se determinó la secuencia de ADN de los clones. Los genes del anticuerpo de los clones que tienen reactividad contra proteínas blanco mayor que los anticuerpos originales se clonaron en pKM16 para producir los scFv en forma soluble como se describe en el Ejemplo 1.

Caracterización de anticuerpos maduros

Los fragmentos del anticuerpo maduro se caracterizaron por la unión al antígeno.

Los nuevos anticuerpos anti-MUC1 MB5/C’1 y MB5/C’3 y los anticuerpos anti-CEA maduros CB37/3B y CB37/9C (Tabla 5) en forma soluble se caracterizaron por resonancia del plasmón superficial (Biacore) como se describe en BMC Cancer 2006 6:41. Los resultados se muestran en la tabla 6.

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Tabla 6. Valores cinéticos de anticuerpos de cadena simple originales y madurados por afinidad. El anticuerpo anti-CEA CB37 original no es estable en forma soluble. Los anticuerpos de cadena simple maduros tienen afinidad nanomolar Ka= constante de asociación, Kd = constante de disociación, KD = Ka/Kd, SE = error estándar. Los datos se expresan en Molar.

scFv ka(+/-SE) kd(+/-SE) KD

MB5 2,13E+04 (2,45E+02) 8,55E-03(6,25E-05) 4,01E-07

MB5/C’1 1,53E+05(4,15E+02) 1,45E-03(1,29E-05) 9,46E-09

MB5/C’3 7,11E+04(4,33E+02) 1,64E-03(2,46E-05) 2,31E-08

CB37 ---

CB37/3B 1,27E+05 (9,79E+02) 1,42E-04(3,23E-05) 3,66E-09

CB37/9C 1,00E+05 (5,75E+02) 4,65E-04(2,54E-05) 1,42E-09

5

Este estudio con Biacore proporcionó medidas cuantitativas de la cinética de unión y disociación de scFv-antígeno. La Tabla 6 informa los valores de cinética de los scFv originales maduros por afinidad. Los anticuerpos antiMUC1 maduros MB5/C’1 y MB5/C’3 tienen más de 42 veces y 17 veces mayor afinidad con el antígeno, en comparación con MB5, respectivamente. Los anticuerpos anti-CEA maduros CB37/3B y CB37/9C tienen afinidad nanomolar. Más

10 aún, los anticuerpos maduros son más estables que el CB37 original, que no fue reactivo en forma soluble. Estos resultados indican que el vector pKM19 es una herramienta adecuada para la maduración de los anticuerpos scFv.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A TECHNOGEN S.C.p.A MINENKOVA, Olga PAVONI, 5 Emiliano

<120> Vector para la selección eficaz y/o maduración de un anticuerpo y usos del mismo

<130> PCT 96530 10

<150> EP0 502 8501.4

<151> 27-12-2005

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 3770 20 <212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

imagen2

imagen1

imagen3

<210> 2

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(738)

<220>

<221> característica miscelánea

<222>

(274)..(274) 15 <223> n is a, c, g, o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222>

(387)..(387) 20 <223> n is a, c, g, o t

<400> 2 <210> 3

imagen1

imagen4

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

característica miscelánea 10 <222> (92)..(92)

<223> 'Xaa' en la posición 92 significa Thr, Ala, Pro ó Ser.

<400> 3

<210> 4

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(741)

<400> 4

<210> 5

<211> 247

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 5

<210> 6

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(741)

imagen1

imagen5

imagen1

imagen1

imagen5

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 247 <212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 7 <210> 8

imagen1

<211> 750

<212> DNA

<213> Escherichia coli 5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (750)

10 <400> 8

imagen1

imagen1

<210> 9

<211> 250

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 9

imagen1

imagen1

<210> 10

<211> 752

<212> DNA 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(750) 10

<400> 10

imagen1

imagen1

<210> 11

<211> 250

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 11

imagen1

imagen6

<210> 12

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(750)

<400> 12

<210> 13

<211> 250

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 13

<210> 14

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(741)

<400> 14

<210> 15

<211> 247

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 15

<210> 16

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(771)

imagen1

imagen1

imagen7

imagen1

imagen1

imagen8

<400> 16

imagen1

imagen1

<210> 17

<211> 257

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 17

imagen1

imagen1

<210> 18

<211> 735

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(735)

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 245

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 19

imagen1

<210> 20

<211> 765

<212> DNA 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(765) 10

<400> 20

imagen1

imagen1

<210> 21

<211> 255

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 21

imagen1

imagen9

<210> 22

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(786)

<400> 22

<210> 23

<211> 262

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 23

<210> 24

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(786)

imagen1

imagen1

imagen1

imagen10

<400> 24

imagen1

imagen1

<210> 25

<211> 262

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 25

imagen1

imagen1

<210> 26

<211> 789

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(789)

<400> 26 <210> 27

imagen1

imagen1

<211> 263

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 27

imagen1

<210> 28

<211> 747

<212> DNA 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(747) 10

<400> 28

imagen1

imagen1

<210> 29

<211> 249

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 29

imagen1

imagen11

<210> 30

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(747)

<400> 30

<210> 31

<211> 249

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 31

<210> 32

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(732)

<400> 32

<210> 33

<211> 244

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 33

<210> 34

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(372)

imagen1

imagen1

imagen1

imagen12

imagen1

imagen1

imagen13

<400> 34 5 <210> 35

imagen1

<211> 124

<212> PRT

<213> Escherichia coli

10 <400> 35 <210> 36

imagen14

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(756)

<400> 36

imagen1

imagen1

<210> 37

<211> 252

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 37 <210> 38

imagen1

<211> 735

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(735)

<400> 38

imagen1

<210> 39

<211> 245

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 39 <210> 40

imagen1

<211> 761

<212> DNA 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(759) 10

<400> 40

imagen1

imagen1

<210> 41

<211> 253

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 41

imagen1

imagen15

<210> 42

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(765)

<400> 42

<210> 43

<211> 255

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 43

<210> 44

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(759)

<400> 44

<210> 45

<211> 253

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 45

<210> 46

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(768)

<400> 46

<210> 47

<211> 256

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 47

<210> 48

<213> Escherichia coli

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(765)

imagen1

imagen1

imagen16

imagen1

imagen1

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imagen1

imagen1

imagen15

<400> 48

imagen1

<210> 49

<211> 255

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 49

imagen1

<210> 50

<211> 768

<212> DNA

<213> Escherichia coli

5 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(768)

imagen18

<210> 51

<211> 256

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 51

imagen1

<210> 52

<211> 744

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(744)

<400> 52

imagen1

imagen1

<210> 53

<211> 248

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 53

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imagen1

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 54

imagen1

10

<210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> Escherichia coli

15

<400> 55

imagen1

<210> 56 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Escherichia coli

imagen19

<210> 57

<211> 18

<212> PRT 30 <213> Escherichia coli

<400> 57

imagen1

35 <210> 58

<211> 16

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 58

imagen1

<210> 59 5 <211> 16

<212> PRT

<213> Escherichia coli

imagen20

<210> 60

<211> 16 15 <212> PRT

<213> Escherichia coli .

<400> 60

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20

<210> 61

<211> 18

<212> PRT

<213> Escherichia coli

25

<400> 61

imagen21

<212> PRT

<213> Escherichia coli

imagen22

<210> 63

<211> 17

<212>

PRT 40 <213> Escherichia coli

<400> 63

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 64

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 65

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 66

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 67

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 68

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 69

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<210> 72

<211> 17

<212>

PRT 25 <213> Escherichia coli

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imagen1

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5

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> Escherichia coli

10

<400> 70

imagen23

imagen24

<400> 72

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30 <210> 73

<211> 17

<212> PRT

<213> Escherichia coli

35 <400> 73 <210> 74

imagen1

<211> 13

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 74

imagen1

<210> 75

<211> 13

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 75

imagen1

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 76

imagen1

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 77

imagen1

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 78 30 gaggaagctt ccattaaacg ggtaaaatac

<210> 79

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22> cebador sintético 3

<400> 79 tgcaatggcg gccgctaata ttgttctgga tattaccagc

<210> 80

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 80

imagen1

<210> 81

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 81

imagen1

<210> 82

<211> 106

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 82

imagen1

<210> 83

<211> 106

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 83

imagen1

<210> 84

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 84 gtggtgatgg aattctttgt cgtcgtcgtc tttgtagtc 39

<210> 85

<211> 40 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 85 caccattaag gatcctaata ttgttctgga tattaccagc

40

<210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebadores

<400> 86 tctattctga attcgctgaa actgttgaaa gttgtttagc

40

<210> 87 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebadores

<400> 87 gccaatcgga attcctgcct caacctcctg tcaatgct

38

<210> 88 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 88 gaactgggat ccttaagact ccttattacg cagtatg

37

<210> 89 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 89 acccgtaagc ttataaagga ggaaatcctc atgaaataga gcaccatcgc

50

<210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 90 tagccccctt attagcgttt g

21

<210> 91

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 91 gtcatcgtcg gaatcgtcat ctgc 24

<210> 92

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 92 tgtgcgaaaa gtaatgagtt tctttttgac tactggggc 39

<210> 93

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 93 ctattgccta cggcagccgc tgga 24

<210> 94

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 94 tccgccgaat accacatagg gcaaccacgg ataagaggag ttacagtaat agtcagcc 58

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 95 tttcgcacag taatatacgg 20

<210> 96

<211> 18

<212> DNA .

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 96 tatgtggtat tcggcgga 18

<210> 97

<211> 60 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 97 acttcagctc cggacacccg tccggctccg ggttccaccg ctccgccggc tcacggtgtc

60

<210> 98 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador <400> 98 cggagccgga cgggtgtccg gagctgaagt gacaccgtga gccggcggag cggtggaacc

60

<210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 23 ctagttcgtc gggttcgtcg gga

99

<210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 100 tcccgacgaa cccgacgaa

19

<210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 101 ggacacggct gctgtattac tg

22

<210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 102 gctgaggaga cggtgacc

18

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un vector adecuado para eficiente selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: ScFv, fragmentos activos de Abs, secuencias humanizadas de Ab, dicho vector se caracteriza porque

   i) contiene al menos un elemento capaz de reducir el nivel de expresión del anticuerpo recombinante perteneciente al grupo de: a) un codón de detención suprimido dentro del péptido líder o la secuencia codificadora del anticuerpo; b) un promotor de eficiencia baja que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo; y

   ii) tiene una mejor eficacia de despliegue de dicho anticuerpo recombinante por medio de: a) fusión de la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante a la secuencia que codifica la parte carboxi-terminal de la proteína pIII; y b) por el uso como péptido líder del péptido líder del anticuerpo recombinante de la fosfatasa alcalina de E. coli; y c) eliminar cualquier codón ámbar entre la secuencia codificadora del anticuerpo recombinante y la secuencia codificadora de pIII, en el que el nivel de expresión del anticuerpo recombinante se puede reducir con un inhibidor del promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia codificadora del anticuerpo.

2. 2.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el vector es un plásmido, un fagémido o un fago.

3. 3.

   Un vector de fagémido de acuerdo con la reivindicación 2 que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:

   1.

4. 4.

   Una biblioteca de anticuerpo de despliegue en fago que consiste en el vector de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 y ADNc, o secuencias de anticuerpo sintéticas o semisintéticas, incluso mutadas por maduración de afinidad de anticuerpos clonados en dicho vector.

5. 5.

   La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 4 en la que los ADNc derivan de las células productoras de anticuerpo.

6. 6.

   La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 5 en la que las células productoras de anticuerpo son Linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) o Linfocitos de sangre periférica (PBL).

7. 7.

   La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 6 en la que las células productoras de anticuerpo se aíslan de un sujeto afectado por tumor.

8. 8.

   La biblioteca de acuerdo con la reivindicación 7 en la que el sujeto afectado por tumor es un sujeto afectado de cáncer de mama.

9. 9.

   Una célula huésped transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 1 a 3.

10. 10.

    Un método para mejorar la selección y/o maduración de un anticuerpo recombinante que comprende la etapa de clonar y expresar ADNc, o secuencias de anticuerpo sintéticas o semisintéticas, incluso mutadas por maduración de afinidad de los anticuerpos en el vector de acuerdo con la reivindicación 1 a 3.