UA125593C2 - Антитіло в7-н3, його антигензв'язуючий фрагмент та його медичне застосування - Google Patents
Антитіло в7-н3, його антигензв'язуючий фрагмент та його медичне застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA125593C2 UA125593C2 UAA201910562A UAA201910562A UA125593C2 UA 125593 C2 UA125593 C2 UA 125593C2 UA A201910562 A UAA201910562 A UA A201910562A UA A201910562 A UAA201910562 A UA A201910562A UA 125593 C2 UA125593 C2 UA 125593C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- binding fragment
- human
- light chain
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 111
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 110
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 110
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 99
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 2
- 101100156339 Caenorhabditis elegans vit-5 gene Proteins 0.000 claims 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 abstract 3
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 abstract 1
- 102000048770 human CD276 Human genes 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 101150036800 SOV gene Proteins 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 20
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 2
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 IYNDLOXRXUOGIU-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMMGKOVEOFBCAU-BCDBGHSCSA-N 3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid Chemical compound C1C[C@@H](OC(C)=O)[C@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC(=O)[C@@H]3[C@]21C HMMGKOVEOFBCAU-BCDBGHSCSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100501772 Arabidopsis thaliana ESR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100078869 Arabidopsis thaliana MUTE gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003402 Arthropod sting Diseases 0.000 description 1
- 241001289141 Babr Species 0.000 description 1
- 101100340271 Caenorhabditis elegans ida-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369802 Caenorhabditis elegans tim-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100022323 Drosophila melanogaster Marf gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- UOACKFBJUYNSLK-XRKIENNPSA-N Estradiol Cypionate Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H](C4=CC=C(O)C=C4CC3)CC[C@@]21C)C(=O)CCC1CCCC1 UOACKFBJUYNSLK-XRKIENNPSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101001109700 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000102542 Kara Species 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 241001590612 Mabra Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100456970 Mus musculus Mfn2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100042271 Mus musculus Sema3b gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000697033 Ostracion meleagris Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000030013 Poga Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 101100209990 Rattus norvegicus Slc18a2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101150110390 Slc10a6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 241000838698 Togo Species 0.000 description 1
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001199012 Usta Species 0.000 description 1
- 101150068402 Wipf1 gene Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007131 hydrochloric acid regeneration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Даний винахід стосується антитіла B7-H3 або його антигензв’язуючого фрагмента, що зв’язується з B7-H3 людини, де антитіло B7-H3 або його антигензв’язуючий фрагмент вибирають із будь-якого з наступних моноклональних антитіл або його антигензв’язуючого фрагмента, таких як (i)-(ii): (i) варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність HCDR, як показано в SEQ ID NO: 10, 11 та 12; і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність LCDR, як показано в SEQ ID NO: 13, 14 та 15; (ii) варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність HCDR, як показано в SEQ ID NO: 16, 17 та 18; і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність LCDR, як показано в SEQ ID NO: 19, 20 та 21.
Description
ЗБО І МО: 16, 17 та 18; і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність І СОВ, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 19, 20 та 21.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Представлений винахід стосується антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагменту; представлений винахід, крім того, стосується антитіла людини, яке включає ділянку СОВ антитіла В7-НЗ, представлений винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка включає антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, та його застосування як діагностичного реагенту та терапевтичного препарату при лікуванні захворювань, пов'язаних з
В7-НЗ.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Імунна відповідь, опосередкована Т-клітинами, відіграє надзвичайно важливу роль у протипухлинному процесі організму, однак для активації та проліферації Т-клітин є необхідним не тільки сигнал антигену, який розпізнається ТСА, але й другий сигнал, який надається співстимуляцією молекули. Молекули родини В7 належать до надродини співстимулюючої молекули імуноглобуліну. Все більше досліджень показують, що молекули цієї родини відіграють важливу регуляторну роль у нормальній імунній функції та патологічному стані в організмі.
В7-НЗ є членом родини В7 і належить до трансмембранного протеїну типу І, який містить сигнальний пептид на амінному кінці, позаклітинну імуноглобуліноподібну варіабельну ділянку (ІМ) та константну ділянку (І94С), трансмембранну ділянку та цитоплазматичну ділянку хвоста, яка містить 45 амінокислот (Тівиє Апіїдепб5. 2007 Ай; 70 (2): 96-104). В даний час В7-НЗ включає в основному два види сплайсингу, В7-НЗа та В7-НЗр. Позаклітинний домен В7-НЗа складається з двох імуноглобулінових доменів ІдДмМ-ІдС (також відомих як 2І987-НЗ), тоді як позаклітинний домен В7-НЗБЬ складається з чотирьох імуноглобулінових доменів Ідм-Ідс-Ід4М-ІдсС (також відомих як 4І987-НЗ).
Протеїн В7-НЗ не експресується або погано експресується в нормальних тканинах і клітинах, але інтенсивно експресується в різних пухлинних тканинах і тісно пов'язаний з прогресуванням пухлини, виживаністю пацієнта та прогнозом. Клінічно досліджено, що В7-НЗ надмірно експресується у багатьох видах раку, особливо при недрібноклітинному раку легень, раку нирок, раку епітелію сечовивідних шляхів, колоректальному раку, раку передміхурової залози, мультиформній гліобластомі, раку яєчників та раку підшлункової залози. (І пд Сапсег. 2009 Мом; 66(2): 245-249; Сііп Сапсег Вев5. 2008 Аца 15; 14(16): 5150-5157).
Крім того, в літературі також повідомляється, що при раку передміхурової залози рівень експресії В7-НЗ позитивно корелює з клінічним патологічним злоякісним захворюванням (таким як об'єм пухлини, інвазія за межі передміхурової залози або оцінка Глісона), а також з прогресуванням раку (Сапсег Рез. 2007 Аца 15; 67(16):7893-7900). Аналогічно, у мультиформній гліобластомі експресія В7-НЗ обернено пропорційна з безподійним виживанням, а при раку підшлункової залози експресія В7-НЗ пов'язана з метастазуванням в лімфатичні вузли та патологічним прогресуванням. Тому, В7-НЗ розглядається як новий маркер пухлини та потенційна терапевтична мішень.
В даний час існують терапевтичні стратегії, специфічні для В7-НЗ-мішені для доклінічних досліджень, наприклад, антитіла, спрямовані на мишачі В7-НЗ, будуть посилювати інфільтративні СО8-позитивні Т-клітини в пухлині та інгібувати ріст пухлини (Мой Раїної. 2010
Аца; 23 (8)): 1104-1112). Крім того, патент МО 2008/066691 показує, що антитіла, які розпізнають В7-НЗ варіант В7-НЗа, виявляли іп мімо протипухлинну дію на аденокарциному. У клінічних дослідженнях, АЮС мишачого В7-НЗ-антитіла, кон'югований з радіоактивним І, значно інгібував ріст нейробластоми у пацієнтів (/ Мешооосо! 97 (3): 409-18 (2010)). Однак, досліджувані в даний час антитіла В7НЗ є гуманізованими антитілами, які були розроблені шляхом гуманізації мишачих антитіл. Однак, гуманізовані антитіла при імунізації мають більш високу імуногенність, ніж повністю людські антитіла, які не містять ніяких компонентів мишачих антитіл. Це є несприятливим чинником для застосування у людей.
Технологія фагового дисплею стосується злиття екзогенного протеїну або поліпептиду з протеїном оболонки фага, щоб експресувати екзогенний протеїн на поверхні фага. Бібліотека фагових антитіл являє собою бібліотеку антитіл, створену шляхом поєднання технології фагового дисплею, технології ампліфікації ПЛР та технології експресії протеїну.
Найбільшою перевагою бібліотеки фагових антитіл є отримання повністю людського антитіла шляхом імітації трьох процесів продукування антитіл іп мімо без імунізації іп мімо. Крім того, бібліотека фагових антитіл має такі переваги: 1) Досягається уніфікація генотипу та фенотипу; крім того, експериментальний метод є простим і швидким, тоді як традиційний спосіб отримання антитіл за гібридомною технологією займає кілька місяців; але, на відміну від цього, технологія бібліотеки антитіл займає лише кілька тижнів. 2) Експресований продукт являє собою 60 повністю людське антитіло, а його молекулярна маса є малою, антитіло переважно експресується у вигляді активних фрагментів Раб і см; в порівнянні з повним антитілом воно має очевидні переваги в проникності в тканини. 3) Можливість скринінгу є великою: технологія гібридоми використовується для скринінгу з тисяч клонів, в той час як технологію бібліотеки антитіл можна використовувати для відбору з мільйонів чи навіть сотень мільйонів молекул; тому буде отримано більше типів антитіл. 4) Широке застосування: використання прокаріотичної експресійної системи призводить до більш очевидної переваги у великомасштабному виробництві (Ст Оріп Віоїеснпої. 2002 Оес; 13 (6): 598-602; ІттипоїесНнпоіоау, 2013, 48 (13) 48 (13): 63-73).
В даний час в патентах, таких як М/О2008100934, М/О2010096734, МОг2012147713,
МО2015181267, МО2016044383 тощо, повідомляється про антитіла В7-НЗ, проте більшість з них є мишачими антитілами або гуманізованими антитілами; і більшість з них досі перебувають у клінічній фазі І та фазі збору даних досліджень, як в країні, так і за кордоном, жодне із антитіл, націлених на В7-НЗ, не доступне на ринку; тому необхідним є подальший розвиток отримання повністю людського антитіла В7-НЗ з більш високою активністю, високою афінністю та високою стабільністю для лікування відповідних захворювань та застосування.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Метою даного винаходу є створення моноклонального антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, який зв'язується з амінокислотною(ими) послідовністю(ями) або тривимірною структурою позаклітинної ділянки В7-НЗ. Крім того, ще однією метою представленого винаходу є скринінг та отримання високоактивних і високостабільних повністю анти-людських антитіл В7-
НЗ людини, які повністю конкурують з моноклональним антитілом або його фрагментами.
Крім того, представлений винахід передбачає ДНК, яка кодує антитіло, вектор, який включає
ДНК, трансформант, отриманий шляхом трансформації вектора, спосіб отримання антитіла або його фрагмента з використанням трансформанту, і діагностичного реагенту або терапевтичного агента, в якому зазначене антитіло або його фрагмент застосовують як активний інгредієнт.
В одному аспекті представлений винахід відноситься до антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента, який зв'язується з людським В7-НЗ, при цьому антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент вибирають з будь-якого моноклонального антитіла або його наступного антигензв'язуючого фрагмента (1)-(ії):
Зо () моноклональне антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, який включає одну або більше послідовностей ділянки СОВ, вибраних із наступні послідовностей, або вибраних із амінокислотних послідовностей з ідентичніст щонайменше, 95 95, відносно наступного: - послідовності НСОВ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла, як показано в 5ЕО ІЮ
МО: 10, 11 ї 12; і амінокислотні послідовності СОВА варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 13, 14 і 15; (і) моноклональне антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які включає одну або більше послідовностей ділянки СОВ, вибраних із наступні послідовностей, або вибраних із амінокислотних послідовностей з ідентичніст щонайменше, 95 95, відносно наступного: - послідовності НСОВ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла, як показано в 5ЕО ІЮ
МО: 16, 17 ї 18; і послідовності СОВА варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла, як показано в 5ЕО ІО МО: 19, 20 і 21.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому моноклональне антитіло є рекомбінантним антитілом.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому моноклональне антитіло є людським рекомбінантним антитілом або його антиген-зв'язуючим фрагментом.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому послідовності каркасних (ЕВ) варіабельних ділянок легкого ланцюга та варіабельних ділянок важкого ланцюга людського рекомбінантного антитіла, є одержаними із легкого ланцюга і важкого ланцюга людської зародкової лінії, відповідно, або їх мутантної послідовності.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому людське рекомбінантне антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІЮ МО: б або 8 або його варіанті; в якому варіант має 1-10 амінокислотних заміщень у послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, як показано в 5ЕО І МО: 6 або 8.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому людське 60 рекомбінантне антитіло містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІЮ МО:
7 або 9 або його варіант; в якому варіант має 1-10 амінокислотних заміщень у послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО І МО: 7 або 9.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому антитіло В7-НЗ додатково містить константну ділянку антитіла людини, переважно антитіло В7-НЗ являє собою повнорозмірне антитіло, яке складається з послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга, як показано в 5ЕО І МО: 22 ї 23, відповідно; або повнорозмірне антитіло, яке складається з послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІО МО: 22 і 26, відповідно; або повнорозмірне антитіло, яке складається з послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІО МО: 24 і 25, відповідно.
У переважному варіанті здійснення передбаченим є антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, в якому антигензв'язуючий фрагмент є вибраним із групи, яка складається з Раб, Раб, ЕК(ар)2, одно- ланцюгового антитіла (5сЕм), димерізованої М-ділянки (діатіло), дисульфід-стабілізованої М- ділянки (й5Ем) і СОВ-вмісного пептиду.
В іншому аспекті представлений винахід стосується виділеного антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента, який характеризується тим, що воно конкурує з антитілом В7-НЗ або його антигензв'язуючим фрагментом, як описано вище, для зв'язування з В7-НЗ людини.
Представлений винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка включає терапевтично ефективну кількість антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента, відповідно до представленого винаходу, та один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, розріджувачів або наповнювачів.
Представлений винахід також стосується молекули нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло
В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, як описано в представленому винаході.
Представлений винахід також стосується рекомбінантного вектора, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, як описано вище.
Представлений винахід також стосується клітини-господаря, трансформованої рекомбінантним вектором, як описано вище, де клітина-господар є вибраною із групи, яка складається з прокаріотичної клітини та еукаріотичної клітини, переважно, еукаріотичної клітини, більш переважно, клітини ссавців або клітини дріжджів.
Представлений винахід також стосується способу отримання антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента, відповідно до представленого винаходу, в якому спосіб включає культивування клітини-господаря, як описано вище, в культурі для утворення та накопичення антитіла В7-НЗ або антигензв'язуючого фрагмента, відповідно до представленого винаходу, і виділення накопиченого антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента з культури.
Представлений винахід також стосується способу імунологічного виявлення або вимірювання В7-НЗ, де спосіб включає використання антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента, як описано в представленому винаході.
Представлений винахід також стосується реагента для виявлення або вимірювання В7-НЗ людини, де реагент містить антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, як описано в представленому винаході.
Представлений винахід також стосується діагностичного реагенту для виявлення захворювань, пов'язаних із В7-НЗ позитивними клітинами, при цьому діагностичний реагент містить антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, як описано в представленому винаході.
Представлений винахід також стосується способу діагностики захворювань, пов'язаних з В7-
НЗ-позитивними клітинами, при цьому спосіб включає виявлення або визначення В7-НЗ або В7-
НЗ-позитивних клітин за допомогою використання антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента, як описано в представленому винаході.
В іншому аспекті представлений винахід також стосується використання антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента, як описано в представленому винаході, для одержання діагностичного реагенту для лікування захворювань, пов'язаних з В7-НЗ-позитивними клітинами.
В іншому аспекті представлений винахід також стосується терапевтичного засобу для лікування захворювань, пов'язаних із В7-НЗ-позитивними клітинами, де терапевтичний засіб містить антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, як описано в представленому винаході, або містить фармацевтичну композицію, як описано вище, або молекулу нуклеїнової кислоти, як описано вище.
Представлений винахід також стосується способу лікування захворювань, пов'язаних з В7- бо НЗ-позитивними клітинами, при цьому спосіб включає індукування клітинної загибелі В7-НЗ-
позитивних клітин за допомогою використання антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, як описано в представленому винаході, або фармацевтичної композиції, як описано вище, або молекули нуклеїнової кислоти, як описано вище.
В іншому аспекті представлений винахід додатково стосується застосування антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, або фармацевтичної композиції або молекули нуклеїнової кислоти, як описано в представленому винаході, в отриманні терапевтичних агентів для лікування захворювань, пов'язаних з В7-НЗ-позитивними клітинами.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фігура 1: Здатність зв'язування різних антитіл з людським антигеном 21Ід-87-НЗ;
Фігура 2: Здатність зв'язування різних антитіл з людським антигеном 41д-87-НЗ;
Фігура 3: Здатність до перехресного зв'язування різних антитіл з мишачим антигеном В7-НЗ;
Фігура 4: Здатність зв'язування різних антитіл з клітинами О87Ма;
Фігура 5: Ендоцитарний ефект різних антитіл на клітини О87Ма.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
1. ВИЗНАЧЕННЯ
З метою більш глибокого розуміння представленого винаходу, деякі технічні та наукові терміни конкретно визначені нижче. Якщо конкретно не зазначено в даному документі, то всі інші технічні та наукові терміни, які використовуються в даному документі, мають значення, яке, зазвичай, розуміється фахівцем у даній галузі техніки, якої стосується представлений винахід.
В даному документі використовується трибуквений код і однобуквений код для амінокислот, як описано в .). ріоІ. спет, 243, р. 3558 (1968).
Як використовується уданому документі, "антитіло" стосується імуноглобуліну, структури з чотирипептидних ланцюгів, з'єднаних між собою дисульфідними зв'язками між двома однаковими важкими ланцюгами та двома однаковими легкими ланцюгами. Різні константні ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну демонструють різні амінокислотні склади та впорядкованість, отже, представляють різні види антигенності. Відповідно, імуноглобуліни можуть бути розділені на п'ять категорій та називані як ізотипи імуноглобуліну, а саме І9М, дО,
Іс, ІДА та ІДЕ з важким ланцюгом |, б, у, а і є, відповідно. За своїм амінокислотним складом шарнірної ділянки та кількістю та розташуванням дисульфідних зв'язків важкого ланцюга, за таким самим типом Ід можна поділити на різні підкатегорії, наприклад, ЇдС можна поділити на
ЧИ, аг, щдаЗ та Ідс4. Легкі ланцюги можна розділити на к-ланцюг або А-ланцюг, через різні константні ділянки. Кожен Іде серед п'яти типів має к-ланцюг або А-ланцюг.
Відповідно до представленого винаходу, легкий ланцюг антитіла, як описано в даному документі, додатково містить константну ділянку легкого ланцюга, де константна ділянка легкого ланцюга включає людський або мишачий к-ланцюг, А-ланцюг або його варіант.
Відповідно до представленого винаходу, важкий ланцюг антитіла, як описано в даному документі, додатково містить константну ділянку важкого ланцюга, де константна ділянка важкого ланцюга включає людський або мишачий Іда1, Ідаг, ІдаЗ, Ідс4 або його варіант.
Послідовність, приблизно з 110 амінокислот, в безпосередній близькості до М-кінця важкого та легкого ланцюгів антитіла, значною мірою змінюється, є відомою як варіабельна ділянка (ділянка Ем); інша послідовність амінокислот, в безпосередній близькості до С-кінця, є відносно стабільною та відомою як оконстантна ділянка. Варіабельна ділянка включає три гіперваріабельні ділянки (НМР) і чотири каркасні ділянки (ЕР), які мають відносно збережену послідовність. Три гіперваріабельні ділянки визначають специфічність антитіла, також є відомою як ділянка, яка визначає комплементарність (СОН). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюга (І СУВ) і кожна варіабельна ділянка важкого ланцюга (НСУР) складається з трьох ділянок СОВ і чотирьох ділянок ЕН, послідовно впорядкованих від амінокислотного кінця до карбоксильного кінця, і являє собою: ЕНТ, СОВІ1, ЕВ2, СОН2, ЕВЗ, СОВЗ і ЕН4. Три СОК легкого ланцюга відносяться до СОВА, ЇСОВ2 та І! СОВЗ; три СОВ важкого ланцюга відносяться до
НОСОВІ, НОСОВ і НСОВЗ. Кількість та розташування СОВ амінокислотних залишків в І! СУВ та
НСМРЕ ділянках антитіла, або антиген-зв'язуючого фрагмента, в даному документі, відповідають відомим критеріям нумерації Караях (І СОВ1-3, НСОН2-3) або відповідають критеріям нумерації
Кабаї та Споїпіа (НСОНТ1).
Терміни "людське антитіло" і "похідна людського антитіла" використовуються взаємозамінно і стосуються антитіла, яке включає одну або більше варіабельних і константних ділянок, отриманих з людської імуноглобулінової послідовності. Один з переважних способів здійснення полягає в тому, що всі варіабельні та константні ділянки отримують 3 людських імуноглобулінових послідовностей, тобто є "повними похідними людського антитіла" або "повністю людським антитілом". Ці антитіла можуть бути отримані різними способами, 60 включаючи антитіла, отримані за допомогою технології фагового дисплею, що включає виділення В-клітин 3 людського РВМС, селезінки, тканини лімфатичного вузла та конструювання природних одноланцюгових фагових бібліотек людських антитіл, або шляхом імунізації трансгенних мишей, які експресують легкі та важкі ланцюги людського антитіла та скринінг.
Термін "мишаче антитіло", який використовується у представленому винаході, стосується моноклонального антитіла людського В7-НЗ, отриманого відповідно до знань та навичок у відповідному рівні техніки. Під час отримання досліджуваному суб'єкту ін'єкційно вводять антиген В7-НЗ, після чого виділяють антитіла, які експресують гібридоми, що мають бажану послідовність або функціональні властивості. У переважному варіанті здійснення винаходу мишаче антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент додатково містить константну ділянку легкого ланцюга мишачого каппа-ланцюга, лямбда-ланцюга або його варіант, або додатково містить константну ділянку важкого ланцюга мишачого ІдсСсті, дае, диИЗ або їх варіанти.
Термін "химерне антитіло" означає антитіло, яке утворюється шляхом злиття варіабельної ділянки мишачого антитіла з константною ділянкою людського антитіла, щоб полегшити імунну відповідь, викликану мишачим антитілом. Для створення химерного антитіла створюється гібридома, що секретує специфічне мишаче моноклональне антитіло, і ген варіабельної ділянки клонується з клітин мишачої гібридоми, а потім клонується бажаний константний ген антитіла людини і з'єднується з геном варіабельної ділянки миші з утворенням химерного гена, який згодом може бути вставлений у вектор експресії, і, нарешті, молекула химерного антитіла експресується в еукаріотичній або прокаріотичній системі. У переважному варіанті здійснення представленого винаходу легкий ланцюг химерного антитіла В7-НЗ додатково містить константну ділянку легкого ланцюга, отриману з людського каппа-, лямбда-ланцюга або його варіанту. Важкий ланцюг химерного антитіла В7-НЗ додатково містить константну ділянку важкого ланцюга, похідну від людського Ід, дае, ІдаЗ або Іда4 або їх варіанти, і переважно включає константну ділянку важкого ланцюга, отриману з людського да, Ідс2 або ІдСс4, або варіант Ідс1, Ід022 або ІдСба4і з амінокислотною мутацією (наприклад, мутацією МУТЕ або зворотною мутацією).
Термін "гуманізоване антитіло", також відомий як СОВ-прищеплене антитіло, стосується
Зо антитіла, утвореного шляхом щеплення мишачих СОВ-послідовностей до каркасу варіабельної ділянки людського антитіла (тобто антитіла, продуковані в межах різних типів каркасних послідовностей антитіл зародкової лінії людини). Гуманізоване антитіло долає гетерологічну відповідь, індуковану химерним антитілом, яке несе велику кількість компонентів мишачого протеїну. Такі каркасні послідовності можуть бути отримані з загальнодоступних баз даних ДНК, включаючи послідовності зародкової лінії людських генів або загальнодоступні посилання.
Наприклад, послідовності ДНК зародкової лінії людських генів варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюгів можна знайти, наприклад, в Базі даних послідовностей зародкових ліній людини "МВазе" (доступна в Інтернеті за адресою м/млу.тгссре.сот.ас.ик//разеє), а також знайдена у Кабаї, ЕА, єї а), 1991 бедиепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, Бій еайіоп.
СОВ-трансплантат може знижувати афінність антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента до антигену, завдяки каркасним залишкам, які контактують з антигеном. Така взаємодія може бути результатом гіпермутації в соматичних клітинах. Відповідно, все ще може існувати необхідність щеплювати такі донорні каркасні амінокислоти з каркасом гуманізованих антитіл. Залишки амінокислоти з антитіла В7-НЗ, яке не належить людині, або його антигензв'язуючого фрагмента, які беруть участь у зв'язуванні антигену, можуть бути ідентифіковані шляхом вивчення послідовностей та структур варіабельної ділянки мишачого моноклонального антитіла. Кожен залишок у донорній структурі СОВ, який відрізняється від зародкової лінії, може вважатися релевантним. Якщо найближча зародкова лінія не може бути визначеною, послідовність можна порівняти із загальною послідовністю підтипу або послідовністю миші з високим відсотком подібності. Вважається, що рідкісні каркасні залишки є результатом соматичної гіпермутації, і тому вони відіграють важливу роль у зв'язуванні.
Термін "антигензв'язуючий фрагмент" або "функціональний фрагмент" антитіла стосується одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, В7-НЗ). Було показано, що фрагменти антитіл повної довжини можуть бути використані для антигензв'язуючої функції антитіл. Приклади фрагментів зв'язування, включених у термін "антиген-зв'язуючий фрагмент" антитіла, включають: (ї) Рар-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з домену МІ, МН, СІ ї СНІ; (її) Е(ар)2 фрагмент, двовалентний фрагмент, що містить два фрагменти Раб, пов'язані дисульфідними зв'язками в шарнірній ділянці, (ії) Га-фрагмент, що складається з домену МН та СНІ; (ім) Ем-фрагмент, що бо складається з домену МН і МІ одного плеча антитіла; (у) окремий домен або фрагмент ЯДАБ
(Улага сеї аї. (1989) Маїште 341: 544-546), що складається з домену МН; (мі) окрему ділянку, яка визначає компліментарність (СОВА); або (мії) комбінацію двох або більше окремих СОВ, необов'язково пов'язаних синтетичним лінкером. Крім того, хоча домен Мі та домен УН фрагмента Ем кодуються окремими генами, вони можуть бути пов'язані синтетичним лінкером, використовуючи рекомбінантний спосіб, таким чином, щоб вони могли генерувати єдиний протеїновий ланцюг з одновалентною молекулою шляхом парування домену Мі і УНН (називається одно-ланцюг Ем (5сЕм); дивіться, наприклад, Віга еї а!. (1988) бсієпсе 242: 423-426; апа Низюп еї аї. (1988) Ргос. Маї!. Асад. сі ОБА 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також призначені для включення в термін "антиген-зв'язуючий фрагмент" антитіла. Такі фрагменти антитіл отримують, використовуючи звичайні методики, відомі в даній галузі техніки, і функціональний скринінг фрагментів використовується таким же чином, як і для інтактних антитіл. Ділянки зв'язування антигену можуть бути отримані способами рекомбінантної ДНК або ферментативним або хімічним розриву інтактного імуноглобуліну. Антитіла можуть мати різний фенотип, наприклад, Іде (наприклад, підтип Ід, Ідс2, аз або Ідас4), антитіла ІдАт, ІдАг, дО,
ІЧЕ або Ід9мМ.
Антигенв'язуючі фрагменти, відповідно до представленого винаходу, включають Раб, Е (аб) 2, Бар одноланцюгові антитіла (5сЕм), димерізовану М ділянку (діатіло), дисульфід- стабілізовану М ділянку (а5Ем), СОВ, який містить пептид тощо.
Раб являє собою фрагмент антитіла, який має молекулярну масу близько 50 000 ї має антигенв'язуючу активність, такий фрагмент отримують шляхом обробки молекули антитіла Ід протеазним папаїном (розщеплення амінокислотного залишку в положенні 224 Н-ланцюга), де приблизно половина М-кінця Н-ланцюга і весь І -ланцюг зв'язані дисульфідним зв'язком.
Еаб, відповідно до представленого винаходу, можна отримати, обробляючи моноклональні антитіла, відповідно до представленого винаходу, які специфічно розпізнають людський В7-НЗ і зв'язуються з послідовністю амінокислот позаклітинної ділянки або їх тривимірною структурою з папаїном. Крім того, Бар можна отримати, вставляючи ДНК, що кодує Еар антитіла, в прокаріотичний експресійний вектор або еукаріотичний вектор експресії та введення вектора в прокаріот або еукаріот для експресії Еаб.
Кабр)г являє собою фрагмент антитіла, отриманий шляхом розщеплення нижньої частини
Зо двох дисульфідних зв'язків в шарнірній ділянці дб з пепсином. Він має молекулярну масу близько 100 000 і антигензв'язуючу активність, і включає дві ділянки Рар, які зв'язані в шарнірному положенні.
Кабв)2, відповідно до представленого винаходу, можна отримати, обробляючи моноклональне антитіло, за представленим винаходом, яке специфічно розпізнає людський В7-
НЗ ії зв'язується з амінокислотною послідовністю позаклітинної ділянки або тривимірною структурою їх пепсином. Крім того, ЕК(абБ)2 може бути отриманий шляхом з'єднання Раб, описаного нижче, з тіоетерним або дисульфідним зв'язком.
Еар' являє собою фрагмент антитіла, який має молекулярну масу приблизно 50 000 і має антигензв'язуючу активність. Його отримують шляхом розщеплення дисульфідного зв'язку в шарнірній ділянці згаданого вище Е(аб)2-Рабр", відповідно до представленого винаходу, може бути отриманий шляхом обробки Е(аб)2, відповідно до представленого винаходу, який специфічно розпізнає В7-НЗ людини і зв'язується з амінокислотною послідовністю позаклітинної ділянки або її тривимірною структурою за допомогою відновлюючого агента (такого як дитіотреїтол).
Крім того, Бабр' може бути отриманий шляхом вставки ДНК, яка кодує фрагмент Рар' антитіла, в прокаріотичний експресійний вектор або еукаріотичний експресійний вектор та введення вектора в прокаріот або еукаріот для експресії Баб'.
Термін "одноланцюгове антитіло", "одноланцюговий Ем" або "5сГу" відноситься до молекули, яка включає варіабельний домен важкого ланцюга антитіла (або дінянку МН) і варіабельний домен легкого ланцюга антитіла (або ділянку МІ), з'єднані за допомогою лінкера. Такі молекули 5сСЕм мають загальну структуру: МН2-МіІ -лінксер-УН-СООН або МН2МН-лінкер-МІ -СООН.
Відповідні лінкери в рівні техніки складаються з повторних послідовностей амінокислот ССО або їх варіантів, наприклад варіант, що має 1-4 повтори (НоїїЇїдег єї а). (1993), Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОБА 90: 6444-6448). Інші лінкери, які можуть бути використані в представленому винаході, описані в АІйНап еї аї. (1995), Ргоївїп Епд. 8: 725-731, Спої еї аї. (2001), Єиг. У. Іттипої. 31: 94- 106, Ни єї аї. (1996), Сапсег Рез. 56: 3055-3061, Кіргуапом еї а!. (1999), 9). Мої. Віої!. 293: 41-56 апа Роомегз еї аї. (2001), Сапсег Іттипої.
ОсЕМ, відповідно до представленого винаходу, можна отримати за наступними стадіями: отримання кДНК, що кодує МН та МІ моноклонального антитіла, відповідно до представленого бо винаходу, яке специфічно розпізнає В7-НЗ людини і зв'язується з амінокислотною послідовністю позаклітинної ділянки або їх тривимірною структурою; конструювання ДНК, що кодує 5сгм; вставка ДНК в прокаріотичний вектор експресії або еукаріотичний вектор експресії; а потім введення вектора експресії в прокаріот або еукаріот для експресії зазначеного 5сгм.
Діатіло являє собою фрагмент антитіла, в якому зсЕм є димеризованим, і є фрагментом антитіла, що має двовалентну антигензв'язуючу активність. У двовалентній антигензв'язуючій активності два антигени можуть бути однаковими або різними.
Діатіло, відповідно до представленого винаходу, можна отримати за наступними стадіями: отримання кДНК, що кодує МН та МІ моноклонального антитіла, відповідно до представленого винаходу, яке специфічно розпізнає В7-НЗ людини і зв'язується з амінокислотною послідовністю позаклітинної ділянки або її тривимірною структурою; конструювання ДНК, що кодує зсЕм таким чином, що довжина лінкерного пептиду становить 8 або менше амінокислотних залишків; вставка ДНК в прокаріотичний вектор експресії або еукаріотичний вектор експресії; а потім введення вектора експресії в прокаріот або еукаріот для експресії діатіла. а5Ем отримують шляхом заміщення одного амінокислотного залишку у кожному з МН та МІ. залишком цистеїну, а потім зв'язуванням поліпептидів через дисульфідний зв'язок між двома залишками цистеїну. Амінокислотний залишок, який повинен бути заміщений залишком цистеїну, може бути вибраний на підставі прогнозування тривимірної структури антитіла у відповідності з відомим способом (Ргоїєїп Епаіпеегіпо, 7, 697 (1994)). а5зЕм, відповідно до представленого винаходу, може бути отриманий за наступними стадіями: отримання кКДНК, що кодує МН та МІ моноклонального антитіла, відповідно до представленого винаходу, яке специфічно розпізнає В7-НЗ людини і зв'язується з послідовністю амінокислот позаклітинної ділянки або її тривимірною структурою; конструювання азЕм-кодуючої
ДНК; вставка ДНК в прокаріотичний вектор експресії або еукаріотичний вектор експресії; а потім введення вектора експресії в прокаріот або еукаріот для експресії зазначеного а5гУ.
СОВ-вмісний пептид є сконструйованим однією або декількома ділянками СОВА МН або Мі.
Пептиди, що містять кілька СОВ, можуть бути зв'язані безпосередньо або через відповідний пептидний лінкер.
Пептид, який містить СОВА, за представленим винаходом, може бути отриманий за наступними стадіями: конструювання ДНК, що кодує СОВ МН та Мі моноклонального антитіла, відповідно до даного винаходу, яке специфічно розпізнає людський В7-НЗ і зв'язується з послідовністю амінокислот позаклітинної ділянки або з трирозмірною структурою; вставка ДНК в прокаріотичний вектор експресії або еукаріотичний вектор експресії; а потім введення вектора експресії в прокаріот або еукаріот для експресії зазначеного пептиду. Пептид, який містить СОВ, також може бути отриманим за способами хімічного синтезу, такими як спосіб ЕРтос або спосіб
ІВос.
Термін "СОВ" стосується однієї з шести гіперваріабельних ділянок в межах варіабельного домену антитіла, що, в першу чергу, сприяє зв'язуванню антигену. Одне з найбільш часто використовуваних визначень для шести СОВ надає КаБбаї Е.А. евї аї. (1991) Зедиепсез ої ргоївіп5 ої іттипо!іодіса! іпіегте5і. МІН Рибіїсайоп 91-3242. Як використовується у даному документі, визначення Кара! СОВА стосується лише СОН, СОВ2 і СОВЗ варіабельного домену легкого ланцюга (СОВ І 1, СОН 12, СОН ІЗ або 11, І 2, І 3), а також СОВ2 і СОВЗ варіабельного домену важкого ланцюга (СОВА Н2, СОВ НЗ або Н2, НЗ).
Термін "каркас антитіла", як використовується у даному документі, відноситься до частини варіабельного домену МІ або МН, яка служить каркасом для петлі зв'язування антигену (СОВ) варіабельного домену. По суті, це є варіабельним доменом без СОВ.
Термін "епітоп" або "антигенний детермінант" стосується ділянки антигену, до якого специфічно зв'язується імуноглобулін або антитіло (наприклад, специфічний сайт на молекулі
В7-НЗ). Епітопи, як правило, містять, щонайменше, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 суміжних або несуміжних амінокислот в унікальній просторовій конформації. Дивіться, наприклад, Еріюре Марріпу Ргоїосоіїв іп Меїйодз іп МоїІеєсшіаг Віоіоду, Мо!. 66, с.Е. Моїтів, Еа. (1996).
Терміни "специфічне зв'язування", "селективне зв'язування", "селективно зв'язується" і "специфічно зв'язується" стосуються зв'язування антитіла з епітопом на заздалегідь визначеному антигені. Як правило, антитіло зв'язується з афінністю (КО) менше ніж, приблизно, 10-77 М, такою як, приблизно, менше ніж, приблизно, 10 М, 109 М або 1079 М або менше.
Термін "КО" або "Ка" стосується константи рівноваги дисоціації для конкретної взаємодії антитіло-антиген. Як правило, антитіло, відповідно до представленого винаходу, зв'язується з
В7-НЗ з константою рівноваги дисоціації (КО) менше ніж, приблизно, 10-7 М, такою як менше ніж, приблизно, 103 М, 109 М або 10-9 М або менше, наприклад, як визначено за допомогою методів 60 поверхневого плазмонового резонансу (РЕ) на приладі ВІАСОВЕ.
Термін "конкурентне зв'язування" стосується того, що антитіло розпізнає і зв'язується з тим самим епітопом (також відомим як антигенний детермінант) або його частиною позаклітинного домену В7НЗ людини, який розпізнається моноклональним антитілом, за представленим винаходом. Антитіло, яке зв'язується з тим самим епітопом, що і моноклональне антитіло, за представленим винаходом, стосується до антитіла, яке розпізнає і зв'язується з амінокислотною послідовністю В7-НЗ людини, яка розпізнається моноклональним антитілом, відповідно до представленого винаходу.
Термін "молекула нуклеїнової кислоти", як використовується в представленому документі, стосується молекули ДНК та молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК. Нуклеїнова кислота "ефективно зв'язана", коли вона знаходиться у функціональному взаємозв'язку з іншою послідовністю нуклеїнових кислот. Наприклад, якщо промотор або енхансер впливає на транскрипцію кодуючої послідовності, промотор або енхансер є ефективно зв'язаним з кодуючою послідовністю.
Термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона була зв'язана. В одному варіанті здійснення вектор являє собою "плазміду", яка стосується до кільцевої дволанцюгової петлі ДНК, в яку може бути лігований додатковий сегмент ДНК. В іншому варіанті здійснення вектор являє собою вірусний вектор, в якому додатковий сегмент ДНК може бути лігований у вірусний геном. Розкриті в даному документі вектори здатні самовідтворюватися в клітині-господарі, в яку вони були введені (наприклад, бактеріальний вектор, який має бактеріальне походження реплікації та епісомальний вектор ссавців), або можуть бути інтегровані в геном клітини-господаря при введенні в клітину-господаря, тим самим реплікуватися разом з геном господаря (наприклад, неепісомальний вектор ссавців).
Способи отримання та очищення антитіл та антигензв'язуючих фрагментів добре відомі в даній галузі техніки, такі як Соїд бргіпа Наїтбог Апіїроду Тесппіса! Сціде, СНарієїв 5-8 апа 15.
Наприклад, мишей можна імунізувати В7-НЗ людини або його фрагментом, і отримане антитіло можна реорганізувати, очистити та секвенувати, використовуючи загальноприйнятий спосіб, відомий у даній галузі техніки. Антигензв'язуючий фрагмент також може бути отриманий загальноприйнятим способом. Антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, відповідно до представленого винаходу, генетично сконструйовані для додавання однієї або декількох людських ЕВ-ділянок в ділянку СОВ, що не належить людині.
Послідовності зародкової лінії РЕА людини можуть бути отримані шляхом вирівнювання варіабельних генів зародкової лінії людського антитіла з використанням бази даних та програмного забезпечення МОЕ на веб-сайті ІптМипоСепетТісв (ІМТ) за адресою пер //таої.сіпевз.її або з журналу Іттиподіобиїп5 20011І58М4012441351.
Термін "клітина-господар" стосується клітини, в яку введений вектор експресії. Клітини- господарі можуть включати бактеріальні, мікробні, рослинні або тваринні клітини. Бактерії, чутливі до трансформації, включають членів родини Епіегорасіепасеає, таких як штами
ЕзсеНетісніа соїї або ЗаІтопеїа; ВасііІасєає, такі як Васіїйив в5Їибійв; Рпештососсив; Зігеріососсив та Наеторніш5 іпПшеплгає. Відповідні мікроорганізми включають басспаготусе5 сегемівіає та
Рісніа разіогіз. Відповідні клітинні лінії господарів тварин включають СНО (СпПіпезе Натввіег омагу сеї! І пе) та клітини М50О.
Сконструйоване антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, відповідно до представленого винаходу, можна отримати та очистити за загальноприйнятими способами. Наприклад, послідовність(ї) КДНК, які кодують важкий ланцюг та легкий ланцюг, можуть бути клоновані та рекомбіновані у вектор експресії 45. Рекомбінантний вектор експресії імуноглобуліну може бути стабільно трансфікований клітинами СНО. Як більш рекомендований рівень техніки, системи експресії ссавців призводять до глікозилювання антитіл, особливо на високо консервативному
М-кінцевому сайті на ділянці Ес. Стабільні клони отримують шляхом експресії антитіл, які специфічно зв'язуються з В7-НЗ людини. Позитивні клони поширюються в безсироватковому середовищі в біореакторі для отримання антитіл. Культуральне середовище, яке містить секретоване антитіло, може бути очищено за загальноприйнятим способом. Наприклад, очищення здійснюється за допомогою колонки А або с берпагозе ЕЕ, яка була врівноважена сумісним буфером. Неспецифічно зв'язані компоненти видаляються промиванням. Зв'язане антитіло елююють методом з градієнтним рН, а фрагменти антитіл виявляють за допомогою
ЗО5-РАСЕ та збирають. Антитіло може бути відфільтроване і концентроване за загальноприйнятим способом. Розчинний агрегат і мультимери також можуть бути видалені за загальноприйнятими способами, такими як виключення за розміром або іонний обмін. Продукт 60 потрібно одразу заморозити, наприклад, при -70 "С, або ліофілізувати.
"Введення" та "лікування", коли застосовуються до тварини, людини, експериментального суб'єкта, клітини, тканини, органу чи біологічної рідини, відносяться до контакту екзогенного фармацевтичного, терапевтичного, діагностичного реагенту або композиції з твариною, людиною, суб'єктом, клітиною, тканиною, органом або біологічною рідиною. "Введення" та "лікування" можуть стосуватися, наприклад, терапевтичних, фармакокінетичних, діагностичних, дослідницьких та експериментальних способів. Обробка клітини включає контактування реагенту з клітиною, а також контактування реагенту з рідиною, де рідина контактує з клітиною. "Введення" та "лікування" також означають способи лікування іп міо та ех мімо, наприклад, клітини реагентом, діагностичним, зв'язуючою композицією або іншою клітиною. "Лікування", коли застосовується до людини, ветеринарії чи суб'єкта дослідження, стосується терапевтичного лікування, профілактичних або профілактичних заходів, досліджень та діагностичних застосувань. "Лікувати" означає введення терапевтичного засобу, такого як композиція, яка містить будь- яку зі зв'язуючих сполук, відповідно до представленого винаходу, внутрішньо або зовнішньо пацієнту, який має один або більше симптомів захворювання, щодо яких агент має відому терапевтичну активність. Як правило, засіб вводять у кількості, ефективній для полегшення одного або декількох симптомів захворювання при лікуванні пацієнта чи популяції, щоб індукувати регресію такого симптому (симптомів) або запобігти прогресуванню будь-якою клінічно вимірюваною мірою. Кількість терапевтичного засобу, ефективна для полегшення будь- якого конкретного симптому захворювання (також його називають "т-ерапевтично ефективна кількість"), може змінюватись залежно від таких чинників, як стан хвороби, вік і вага пацієнта та здатність засобу викликати бажану відповідь у пацієнта. Полегшення симптому захворювання можна оцінити за допомогою будь-якого клінічного вимірювання, яке зазвичай застосовують лікарі або інші кваліфіковані медичні працівники для оцінки ступеня вираженості або прогресування цього симптому. Навіть якщо варіант здійснення представленого винаходу (наприклад, спосіб лікування або засіб) не є ефективним для полегшення цільових симптомів захворювання у кожного пацієнта, він повинен полегшити цільовий симптом (симптоми) захворювання в статистично значущій кількості пацієнтів, визначеній будь-яким статистичним тестом, відомим у даній галузі, таким як І-критерій Ст'юдента, критерій хі-квадрат, критерій
Зо Манна-Уїтні, критерій Краскела-Уоллиса (Н-тест), критерій Джонкхіера-Терпстра та критерій
Уілкоксона. "Консервативна модифікація" або "консервативне заміщення або заміна" стосується заміщення амінокислот у протеїні іншою амінокислотою, яка має схожі характеристики (наприклад, заряд, розмір бічного ланцюга, гідрофобність / гідрофільність, конформація основного ланцюга та жорсткість тощо), такі що зміни часто можна вносити без зміни біологічної активності протеїну. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що, як правило, одне амінокислотне заміщення в несуттєвій ділянці поліпептиду істотно не змінює біологічної активності (дивіться, наприклад, УМаїзоп єї аі. (1987) МоїІесціаг Віооду ої Ше Сепе, Пе
Вепіатіп/Ситтіпов5 Риб. Со., Раде 224, (Ай єдйоп)). Крім того, заміщення на структурно або функціонально схожі амінокислоти навряд чи можуть порушити біологічну активність. "Ефективна кількість" включає кількість, яка достатня для полегшення або запобігання симптому або стану медичного захворювання. Ефективна кількість також означає кількість, яка є достатньою для того, щоб дозволити або полегшити діагностику. Ефективна кількість для конкретного пацієнта або ветеринарного суб'єкта може змінюватись залежно від таких чинників, як: стан, який підлягає лікуванню, загальний стан здоров'я пацієнта, спосіб і доза введення, а також тяжкість побічних ефектів. Ефективна кількість може бути максимальною дозою або режимом дозування, що дозволяє уникнути значних побічних ефектів або токсичних ефектів. "Екзогенна" відноситься до речовини, яка виробляється поза організмом, клітиною або людиною, залежно від ситуації. "Ендогенна" відноситься до речовини, яка виробляється в клітині, організмі чи людині, залежно від ситуації. "Ідентичність" стосується подібності послідовностей між двома полінуклеотидними послідовностями або двома поліпептидними послідовностями. Коли положення у двох послідовностях, які потрібно порівнювати, зайняті однією і тією ж основою або субодиницею амінокислотного мономера, наприклад, якщо кожне положення двох молекул ДНК обидва займає аденін, то молекули вважаються гомологічними в цьому положенні. Відсоткова ідентичність між двома послідовностями є функцією кількості співпадаючих або гомологічних положень, спільно використовуваних двома послідовностями, розділеної на кількість положень для порівняння х 100. Наприклад, при оптимальному вирівнюванні послідовності(ей), якщо є 6 збігів або гомологів серед 10 положень між двома послідовностями, тоді дві послідовності 60 вважаються на 60 95 гомологічними; якщо серед 100 положень між двома послідовностями є 95 збігів або гомологів, то дві послідовності вважаються на 9595 гомологічними. Зазвичай, порівняння проводиться, коли максимальний відсоток ідентичності отримують шляхом вирівнювання двох послідовностей.
Як використовуються у даному документі, вирази "клітина", "клітинна лінія" та "клітинна культура" використовуються взаємозамінно, і всі такі терміни включають їх потомство. Таким чином, слова "трансформант" та ""трансформована клітина" включають первинні досліджувані клітини та культури, отримані з них, незалежно від кількості пасажів. Слід також розуміти, що все потомство може не бути абсолютно однаковим за вмістом ДНК через навмисні або ненавмисні мутації. Включеним є мутантне потомство, яке має ту саму функцію або біологічну активність, як скриноване для первинно трансформованої клітини. У випадку іншої назви, це чітко розуміється з контексту.
Як використовується у даному документі, "полімеразна ланцюгова реакція" або "ПЛР" стосується процедури або методики, в якій невелика кількість конкретної порції нуклеїнової кислоти, РНК та / або ДНК, ампліфікується, як описано, наприклад, у патенті США Мо. 4,683,195.
Зазвичай, необхідно отримати інформацію про послідовності з кінця або за межею цільової ділянки, тому можуть бути сконструйовані олігонуклеотидні праймери; ці праймери є ідентичними або схожими з протилежними ланцюгами шаблону, який потрібно ампліфікувати. 5-кінцеві нуклеотиди двох праймерів можуть бути ідентичними кінцям матеріалу, що підлягає ампліфікації. ПЛР можна використовувати для ампліфікації специфічних послідовностей РНК, специфічних послідовностей ДНК із загальної геномної ДНК та кДНК, транскрибованої із загальної клітинної РНК, фагової або плазмідної послідовності тощо. Дивіться, як правило,
Миїїїв еї аї. (1987) Соїй Ббргіпд Наптог БЗутр. Опцапі. Віої. 51:263; Епісп єй., (1989) РСВ
ТЕСНМОГ ОДУ (СосКюп Ргезв, М.У.). Використовуваний у даному документі ПЛР розглядається як приклад (але не єдиний) способу реакції полімерази нуклеїнової кислоти для ампліфікації досліджуваного зразка нуклеїнової кислоти, при цьому, зазначений спосіб включає використання відомої нуклеїнової кислоти, як праймера, та полімерази нуклеїнової кислоти для ампліфікації або продукування специфічної частини нуклеїнової кислоти. "Необов'язковий" або "необов'язково" означає, що описана згодом подія або ситуація може (але не обов'язково) відбуватися, включаючи випадки, коли подія чи ситуація відбувається або не відбувається. Наприклад, "необов'язково містить 1-3 варіабельні ділянки важкого ланцюга антитіла" означає, що варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла з певною послідовністю може бути присутньою, але не обов'язково. "Фармацевтична композиція" означає суміш, яка містить одну або більше, описаних в даному документі, сполук або їх фізіологічно / фармацевтично прийнятну сіль або проліки разом з іншими хімічними компонентами, такими як фізіологічний / фармацевтично прийнятний носій і ексципієнт. Призначення фармацевтичної композиції полягає в тому, щоб сприяти введенню в організм і полегшувати абсорбування активного інгредієнта і, тим самим, проявляти біологічну активність.
Крім того, представлений винахід стосується способу імунологічного виявлення або визначення В7-НЗ, реагенту для імунологічного виявлення або визначення В7-НЗ, способу імунологічного виявлення або визначення клітин, які експресують В7-НЗ, та діагностичного реагенту для діагностики захворювань, які пов'язані з позитивними клітинами В7-НЗ, які містять моноклональне антитіло або фрагмент антитіла, відповідно до представленого винаходу, який специфічно розпізнає людський В7/-НЗ і зв'язується з амінокислотною послідовністю позаклітинної ділянки або її тривимірною структурою як активний інгредієнт.
У представленому винаході способом виявлення або визначення кількості В7-НЗ може бути будь-який відомий спосіб. Наприклад, він включає імунодетекцію або аналіз.
Імунодетекція або аналіз є способом виявлення або визначення кількості антитіла або антигену з використанням міченого антигену або антитіла. Приклади імунодетекції або аналізу включають спосіб імунологічних антитіл (ВІА), мічених радіоактивними речовинами, імуноферментний аналіз (ЕІА або ЕГІЗА), флуоресцентний імуноаналіз (РІА), люмінесцентний імуноаналіз, метод вестерн-блоттінгу, фізико-хімічні методи тощо.
Вищезазначені захворювання, пов'язані з позитивними клітинами В7-НЗ, можна діагностувати шляхом виявлення або визначення клітин, які експресують В7-НЗ, за допомогою моноклональних антитіл або фрагментів антитіл відповідно до представленого винаходу.
Для виявлення клітин, які експресують поліпептид, можна використовувати відому імунодетекцію, і переважно використовувати імунопреципітацію, флюоресцентне фарбування клітин або імуногістохімічне фарбування тощо. Крім того, може використовуватися спосіб фарбування флуоресцентним антитілом тощо за допомогою системи ЕМАТ8ТООНТ5 (Арріїєй (510) Віозувієт).
У представленому винаході живий зразок для виявлення або визначення В7-НЗ не є особливо обмеженим, за умови, що він має можливість включати клітини, які експресують В7-
НУ, такі як клітини тканини, кров, плазма, сироватка, підшлункова рідина, сеча, кал, тканинна рідина або культуральна рідина.
Діагностичний реагент, який містить моноклональне антитіло або його фрагмент, відповідно до представленого винаходу, може додатково містити реагент для здійснення реакції антиген- антитіло або реагент для виявлення реакції, залежно від бажаного діагностичного способу.
Реагент для здійснення реакції антиген-антитіло включає буфери, солі тощо. Реагент для виявлення включає реагенти, зазвичай використовувані для імунодетекції або вимірювання, такі як мічені вторинні антитіла, які розпізнають моноклональні антитіла, фрагменти антитіл або їх кон'югати, субстрати, які відповідають міткам тощо.
Представлений винахід також стосується способу лікування захворювань, які відносяться до позитивних клітин В7-НЗ людини, особливо при лікуванні раку та запалення. 2. ПРИКЛАДИ ТА ПРИКЛАДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Представлений винахід описано нижче у поєднанні з прикладом, однак обсяг представленого винаходу не обмежений ним. У прикладах, відповідно до представленого винаходу, коли конкретні експериментальні умови не описані, зазвичай, проводяться в звичайних умовах, як описано в Со бргіпа Нагбог Апіїбоду Тесппоіоду Іарогаюгу Мапаиаї,
Моїіесшіаг Сіопіпд Мапиаї або в умовах, які рекомендовані виробником вихідних матеріалів або продуктів. Якщо джерело реагентів конкретно не вказано, реагенти є комерційно доступними звичайними реагентами.
Приклад 1. Отримання антигену В7-НЗ та протеїна для виявлення
Дизайн антигену В7-НЗ
Як шаблон для В7-НЗ, відповідно до представленого винаходу, використовували В7-НЗ людини, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 1, та амінокислотну послідовність антигену та протеїну для виявлення, що включені у представлений винахід. Якщо не вказано інше, наступний антиген В7-
НЗ являє собою В7-НЗ людини.
Людський В7-НЗ повнорозмірний протеїн: В7-НЗ (ЗЕО ІЮ МО: 1):
РЕРЦеЕМ АС МЕ А ТОТО УПАК КО ВАТАМА ТАМ АОС МА
ОПЕУВБСЕ УВКР УООВАНОВУ ТТ ТОРТА У АКУ ЧТ ОАТЬКСЯЕ пе КУПА Ко Мем А УУА
ОУЕН КПТМ ТЕ КУТУ АХА ЬАКУ
СТЕК КОС ЕК САН ННІ КО МАТ АК НТК ОСНО ВІВ
Зо Примітка:
Подвійнопідкреслена частина являє собою сигнальний пептид (сигнальний пептид: 1-28);
Підкреслена частина являє собою позаклітинний домен В7-НЗ (позаклітинний домен: 29- 466), в якому 29-139 являє собою Ід-подібний домен М-типу 1, а 145-238 являє собою Ід- подібний домен С2-типу 1; 243-357 являє собою Ід-подібний домен МУ-типу 2, 363-456 являє собою Ід-подібний домен С2 типу 2;
Ділянка, підкреслена пунктиром, являє собою частину трансмембранного домену (трансмембранний домен: 467-487);
Ділянка, виділена курсивом, являє собою внутрішньоклітинний домен (цитоплазматичний домен: 488-534).
Мишача В7-НЗ амінокислотна послідовності повної довжини (5ЕО ІО МО: 2)
зро АВМ МН ОКО КО ОА ВАТА ОА ек УКУТОКОХКУТСВУ ТОВ Оу ААУ ЮК РЕМ сих РОМ
МУ СВХОВУРЕЛВУВКОЦОС У Т ОКУ ГО МАЕ ЕОУНЗУКУУ есе ев ЗАКО ее зві ев ла вав
АГАККС КАК КОСЕ ЕЕ АСАК ННЯ ЛЕ СКТАСКЕ РК РУ А КЕН КТА
Примітка:
Подвійнопідкреслена частина являє собою сигнальний пептид (сигнальний пептид: 1-28);
Підкреслена частина являє собою позаклітинний домен В7-НЗ (позаклітинний домен: 29- 248), де 29-139 являє собою Ід-подібний домен У-типу, а 145-238 являє собою Ід-подібний домен С2-типу;
Частина, підкреслена пунктиром, являє собою частину трансмембранного домену (трансмембранний домен: 249-269);
Частина, виділена курсивом, являє собою внутрішньоклітинний домен (цитоплазматичний домен: 270-316).
Людський антиген В7-НЗ (ЗЕО ІО МО: 3), який використовується для скринінгу та виявлення, є комерційним продуктом (НаеО саїй 1949-83-050/СЕ, скорочено 21Ід-В7-НЗ), і його послідовність є такою:
ГсУВУВІРУУ УСТА ССР ОБКОМУ
ОО АХАМ ТАЄ АООКАМ АСВ УВУАЗЕ ГУМОК ОЗААХХ хоУузарузе мМ емо МБ ВО МАУС УТ
ЗАГ НННЯ
Примітка: Підкреслена частина являє собою позаклітинну ділянку В7-НЗ; частина, виділена курсивом, являє собою маркер Нів-іаа.
Людський антиген В7-НЗ (5ЕО ІО МО: 4), який використовується для виявлення, являє собою комерційний продукт (5іпоВіоіодісаї саї Ж 11188-НО8ВН, скорочено 414-87-НЗ), і його послідовність є такою: вЕХОХВЕрРУУАВУСЄТВА ТС рЕрОоОг ДО КО КО НВКАКО
Ева ни ее ни ЕЕ и иа
СОХААВУЗКРЕМТЬЕВУКроАРОВ ТУ ПТО З ОС А У ЖООВОо УВО
МУТТОМАВРОСТТ ОУН ВУХ САМО ТУ СТ УКВ СОБАНЕХУТТРОВ, мова ТАН А ВО АСК ОВУ ВУ АОС У ВВ
АХ ОУААРЕВО УТРО КОТУ ТЕС ЕКО цУ вВотеМУуттвивакоцчнн ву КУМ СЛОВО УКкрУ СА НОВУТІ
ГОМ НАНини
Примітка: Підкреслена частина являє собою позаклітинну ділянку В7-НЗ; частина, виділена курсивом, являє собою маркер Нів-іаа.
Мишачий антиген В7-НЗ (ЗЕО ІО МО: 5), який використовується для скринінгу та виявлення, являє собою комерційний продукт (НО саї Ж 1397-83-050 / СЕ), а його послідовність є такою:
УБУСУБВРУУАСУЮТВАТ ВСЕ ВЕРСЕМ АСВ КОТ КОСУНЕТО
КОСА КАТА КЕНІЯ УССОМА В С УКУТО Оу ТС УКВ АКУК,
ХЕ МмаАМЕКСЬ КОМУ Уч ПОС У КВУ СОМ ОВ ТОВ,
Те ши ни
Примітка: Підкреслена частина являє собою позаклітинну ділянку В7-НЗ; частина, виділена курсивом, являє собою маркер Нів-іаа.
Приклад 2. Скринінг позитивної(их) послідовності(ей) щодо специфічного зв'язування з В7-
НЗ людини
В-клітини виділяли з тканин РВМС селезінки та лімфатичних вузлів, і РНК екстрагували для побудови публічної/відкритої бібліотеки фагових антитіл 5сЕм (місткість 3,2 х 1019),
Сконструйовану бібліотеку нативних фагових антитіл 5сЕм упаковували для утворення фагових частинок, а потім піддавали сортуванню рідкофазним методом. Фаг зв'язували з біотінільованим
В7-Н3З у рідкій фазі, а потім відокремлювали стрептавідиновими магнітними кульками. З метою отримання позитивної(их) послідовності(ей) зв'язування з В7-НЗ людини (Не саї хх 1949-83-050 / СЕ), біотінільований В7-НЗ людини використовували для сортування, а 500 моноклональних колоній відбирали та упаковували у фагові антитіла 5сЕм для фагового ЕІ ІЗА-тестування.
Активність зв'язування моноклонального фага з В7-НЗ людини (НО саї 2 1949-83-050 / СЕ) та
В7-НЗ миші (ВО саї 2 1397-83-050 / СЕ) тестували окремо: 1 мкг / мл людського В7-НЗ або мишачого В7-НЗ та 195 В5А наносили на ЕГІБА-планшети, додавали супернатант фагів, розведений 1:11 блокуючим буфером, і виявляли анти-МІЗ3 НАР; були відібрані клони зі значенням ЕГІЗА при 00450, що перевищує 0,5, і співвідношення значень ЕГІЗА при 00450 для зв'язування з В7-НЗ людини або миші до значення ЕЇГІЗА при 00450 для зв'язування з 1 95
В5А, що перевищує 2,0, і було отримано 9 клонів.
Приклад 3. Конструювання моноклональних антитіл повної довжини
Антитіла повної довжини були сконструйовані для цих 9 клонів, отриманих методом скринінгу бібліотеки фагів, а потім було підтверджено, що два антитіла (01702 та Н1703, відповідно) мають сильну афінність за допомогою аналізу зв'язування ЕЇГІЗА. Процес конструювання моноклональних антитіл повної довжини був таким:
На основі послідовності (послідовностей) антитіл 5сЕм, отриманих шляхом фазового скринінгу, були розроблені праймери для конструювання фрагмента гена МН/УК//І. кожної послідовності одноланцюгового антитіла за допомогою ПЛР Були отримані варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів п1702 та п1703. » послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга п1702
Мини Ов АН АС АБС АННИ КОСА НІ
МКРУРКОХКСКЕ ТАКА БИ а Я УТ САВА А НОЮ
ЗЕОІЮ МО: 6 » послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга п1702
ОГУУТОБЕРХКУУУРОС ПНТ ССО УВІ НУ УЖ ГОСТ СОА ЕВ Уч КУ
МУРОВАНІ САВА ДОВ СН УК ПУ ОТ КЕ,
ЗЕО ІЮ МО: 7 » послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга п1703
ООН о а АВ ГТ АМІЖУО РОКОКО ВОНИ
УТРО КСНУ ПО О мА КАНА РУ КС АКОСУСЕУНА НУО
ТТУгуУх
ЗЕО ІЮ МО: 8 » послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга Нп1703
ІНВ ОБРХ А ЗУСОКУТ ОА ЗОКТУОМККООК ОКА НІ АВС ДОКР
ЕЕ НЕО Я ЗО ЕОР АТУ КСО УТ О Е КК
ЗЕОІЮО МО: 9
Примітка: Порядок являє собою В1-С081-ЕН2-СО0Н2-ЕВНЗ3-СОВЗ-ЕН4, виділена курсивом частина у послідовності є послідовністю ЕН, а послідовності СОВ є підкресленими.
Послідовності СОВ у легкому та важкому ланцюгах кожного антитіла показані в Таблиці 1.
Таблиця 1
СОВ-ділянки кожного важкого та легкого ланцюга : ЗаЗМ5ІЗНУ ЗЕО ІЮО МО:
НОСОВ 1 (| (ІРІР5ЗБЗА 5ЕО ІЮ МО: 10 ІСОВ1 13 о 1702 нНсОоВ2 | ІЗМраЗМК ЗЕО ІО МО: 11 сорв2 МТМ ЗЕО ІО МО: 14
АВБЗАВІ МАБЕОМ 5ЕО ІЮО МО: АІНМОВОЇМУМ 5ЕО І МО: нсОов З 12 о І совЗ 15 о
НСОВ1 |агтТЕ5БМА ЗЕОО МО: 16 ІСОВ1 ОБІЗТМ 5ЕО О МО: 19 1703 неова2 | ІзаЗас5тТ ЗЕО ЮО МО: 17 сорв2 АМ5 5ЕО ІЮ МО: 20
АКОаУаРМУНАГОМ 5ЕО ІЮО МО: ООБУЗБТРМУМУТ 5ЕО 10 нсОов З І совЗ , 18 МО: 21
Потім варіабельну ділянку антитіла гомологічно рекомбінували з фрагментом гена константної ділянки (СН1-ЕС / СІ) для конструювання повнодовжинного антитіла МН-СНІ-ЕС /
МК-СІ /МІ-Сї.
Конструйовані повнодовжинні антитіла Н1702-Іда1, п1703-І421 являють собою наступне: п1702-ІдДа1: амінокислотна послідовність важкого ланцюга п1702-9а1: (5ЕО ІЮ МО: 22)
СУКА НВОСЮ УВО ТАЗА РАМН УКОАРОКО У УАУ
Уроку УМОВ ВОМ ОМ АС АУ У УСВА УА
ЕС АБУТ УВАЗІ КОСРЗУКР АРЕЗКЕТЗООТААОССУ ВЕУ ВРИВУ ГУ
ЗМ ОАТТСУНІВРАЧ ЛЕК ЯБУ ТУ СОТ СУМНЕ МТКУ
ПЕКУКРКБСОІКТНТОСВРОСТАРЕЦ НОВУ ЕРРКРКОТЕ МІБВТВЕУТСУ У УВУ
ЗНУ КЕМ УТ УВО УВУНЧАКТКРАЕВОУчО У УКУСУ НОМУ ОК Е
УКОСУ КУКАСРАНЕКТяКАКСОРКЕРОУХ ТВО МО УК СУ КУ
РИ УЄ ЧЕМ МКУ КТ ТРУБОК УКВ СС МУКЕСТУ
МНЕ АБВХНУ ТЕМ Мч амінокислотна послідовність легкого ланцюга 11702: Лямбда (5ЕО І МО: 23)
СУТО БЕКУ ВМТ СОС аБОоУІ5НУг УСТ АОС АРВЕМІ ГУ
ММА УРОКОВ ОКА ОАВОСУ САНУ ЄМ УКСОККТ
КЕР СОКАМИ ТЕРРА ЧМКАТ АК СТ ЗБОКУ ВОАУТ УА КАПВСВРУК,
АСУБКТІКЕКОЗКМК ААУ ВІТ УКЕНЕУ СОУСУ УЄКТУАРТЕ
Се п1703-ІдДа1: амінокислотна послідовність важкого ланцюга Н1703-І9Са1: (ЗЕО ІО МО: 24)
ЗУССОВК КМУ НГ АСААОВТ ТЕ УАМЕЖУКОАРОКОВЕ У В
А БОМБА УКОВУ ПУКСОМУКМ СЯ М АСВ ТАМ УТА
УНАБВУОКНТУТУКААЗІКОРЕОУВРСАРХВКВ ОСА ОСЬУКОЖВВЕНУ
ТУКА УНТвРАУТ ОВО БУ У УВК МУ СМ У КНЕУ
КУОККУВКОСОКТИТСРРСРАРЕ ССР БУКЕРРЕРЕ ТУПО МІК ВЕУ ТУ УУ
ПУ5НЕВВЕУКЕМУ У У УВУНКМАЕТЕРЕСКОУ МКУ КУТУ КИМ
ККУ КСКУХМКАСРАНЕКПКАКОСОВАКРОУ УТРО ЕКО УС УК
ОР МНАУВУуКа ВІВ КТГ У ІОВ ОКУ КВ
СУМНЕ АКНМНУТО КВ РОК амінокислотна послідовність легкого ланцюга п1703: Каппа (ЗЕО ІО МО: 25)
НЕ СТОБОМЗАЯУ ОВУ ПТСКАОМУ УЖ УСДОКРОКАКНЛІМАУВО
ПОБУ ВХ БОЗОКО НЕТ СТАТУС КМТ ВАУТЕОСОТ КУ ВІК
КТ УААРБУКТВВЕВЕО КОТ АВУУСТУМЕ ТРАК АКУ ЄЮ ВМАКОВМВОВ
УТОГ У ВТ КАВУ ЕКНЕУТАСЕУ ТО ВУ КВЕККОВС
Для подальшого підвищення стабільності антитіла амінокислотну послідовність легкого ланцюга п1702 мутували, де специфічна мутація включає те, що перший амінокислотний залишок О на М-кінці легкого ланцюга був заміщений на 0, перший амінокислотний залишок 5 на С-кінці видаляли, щоб отримати більш стабільне і уніфіковане моноклональне антитіло. п1702-1 амінокислотна послідовність легкого ланцюга з модифікацією мутації: (ЗЕО ІЮ МО: 26)
ПРУУТОБЕЕВУХВОО ГУ ГОТОВО УБІВН УРОКУ ОО ТРООАРАМНЛУ
МЕТО УРОВЕКО З СК А ХЛ ТО ААУ ЧНУ СКОБУ УРСИНКУЄ
КОТУ ООБКАМВЕТ У ТЕРРА К ОСАМКАТ УК ВО УВА ТУКА УК
АСУКТТКРУКОВКМКУААВУ ТРЕКУ ТНЕУ ЮКТУАРТЕ
С
Приклад 4. Експресія та очищення повністю людських антитіл
Плазміди, які експресують легкий і важкий ланцюг антитіла, відповідно, трансфікували у клітини НЕК29ЗЕ у співвідношенні 1,5:1, а супернатант клітинної культури збирали через 6 днів, а клітинний дебріс видаляли швидкісним центрифугуванням та очищенням, яке виконували з використанням колонки Ргоївіп А. Колонку промивали РВ5 до тих пір, поки показник А280 не впав до базової лінії. Цільовий протеїн елюювали кислотним елюентом з рН 3,0 - рН 3,5 і нейтралізували 1 М Ттів-НСЇІ, рН 8,0-9,0. Елюйований зразок відповідним чином концентрували та додатково очищали гель-хроматографією на колонці Зирегаєх 200 (СЕ), яку врівноважували
РВ5 для видалення агрегату. Пік мономеру збирали і аліквотували для використання.
Ефективність та сприятливий ефект антитіл, відповідно до представленого винаходу, перевіряли наступними методами тестування:
Приклад дослідження 1. Аналіз зв'язування ЕГІ5А
Для дослідження здатності зв'язування відібраних антитіл В7-НЗ з різними формами людських В7-НЗ іп міїто, для аналізу зв'язування іп міо використовували людські 2Ід-87-НЗ (Саі-41949-83-050/СЕ, ВУ) та людські 414-87-НЗ (Саїй 11188-НОВН, 5іпо Віоіодісаї).
Людський протеїн В7-НЗ (219 / 419) розводили до концентрації 1 мкг / мл за допомогою буфера РВ5, рН 7,4 (бЗідта, Р4417-100ТАВ), і додавали в 96-лунковий планшет ЕїЇїбза в об'ємі 100 мкл / лунку (Сотіпа, СІ 53590-100 ЕА) і поміщали при 4 "С на ніч, на 16-20 годин. Після видалення рідини додавали 595 блокуючого розчину знежиреного молока (сухе знежирене молоко СцапаМіпа), розведеного буфером РВБ5ЗТ (рН 7,4 РВ5, який містить 0,05 95 Гмуєеп-20), додавали по 120 мкл / лунку, і суміш інкубували при 37 "С протягом 2 години для блокування. В
Зо кінці блокування блокуючий розчин відкидали, і планшет 4 рази промивали буфером РВ5Т.
Потім додавали 100 мкл / лунку відповідних В7-НЗ антитіл із серійним розведенням. Початкова концентрація становила 1 мкМ, потім розводили буфером РВ5Т до 8 градієнтів і інкубували при 37 "С протягом 1 години в інкубаторі. Після інкубації реакційний розчин в планшеті відкидали, і планшет промивали 4 рази РВО5Т. НАР-мічений фрагмент ЕРеу козиного анти-людського Ід вторинного специфічного антитіла (дасквзоп Іттипо Незвєагсі, 109-005-008), розведеного РВ5Т (1: 4000), додавали по 100 мкл / лунку та інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після 4- разового промивання планшета РВ5Т, хромогенний субстрат ТМВ (КРІ., 52-00-03) додавали по 100 мкл / лунку, інкубували протягом 3-5 хв при кімнатній температурі, і додавали 1 М Н»5О» по 100 мкл / лунку для припинення реакції. Значення поглинання зчитували за допомогою зчитуючого пристрою для мікропланшетів МОМОТаг при 450 нм, та розраховували значення
ЕС5О для зв'язування між антитілом та антигеном. Результати представлені в Таблиці 2, на
Фігурі 1 та Фігурі 2.
Таблиця 2
Здатність зв'язування різних антитіл з людським антигеном 21Ід-87-НЗ та 41Ід-87-НЗ
Результати показують, що п1702 і п1703 мають значну здатність до зв'язування як з людським 21Ід-87-НЗ, так і з людським 4Ід-87-НЗ, а п1702 має більш сильну зв'язувальну здатність.
Приклад дослідження 2. Аналіз перехресного зв'язування з В7-НЗ, отриманий з різних видів
Для дослідження здатності до зв'язування відібраних антитіл В7-НЗ з В7-НЗ, отриманих з різних видів іп міо, для аналізів зв'язування іп міо використовували мишачий В7-НЗ (Саї. ж1397-83-050/СЕ, На 0).
Протеїн В7-НЗ, отриманий з різних видів (миша В7-НЗ), розбавляли до концентрації 1 мкг / мл за допомогою буфера РВ5, рН 7,4 (бідта, Р4А417-100ТАВ), додавали в 96-лунковий планшет для мікротитрування в об'ємі по 100 мкл / лунку (Соптіпо, СІ 53590-100 ЕА) і поміщали при 4 "С в темноту, на 16-20 годин. Після видалення рідини додавали по 120 мкл / лунку 5 95 блокуючого розчину знежиреного молока (сухе знежирене молоко Сиапоміпо), розведеного буфером РВОТ (рН 7.4 РВ5, який містить 0,05 95 Тмееп-20), і суміш інкубували при 37 "С протягом 2 годин для блокування. В кінці блокування блокуючий розчин відкидали, і планшет 4 рази промивали буфером РВ5Т. Потім додавали по 100 мкл / лунку відповідних В7-НЗ антитіл при початковій концентрації 1 мкМ, розбавляли буфером РВ5ОТ до 8 градієнтів та інкубували при 37 "С протягом 1 години в інкубаторі. Після інкубування реакційний розчин в планшеті відкидали, і планшет 4 рази промивали РВОТ та додавали по 100 мкл /лунку НеЕР-міченого фрагмента Есу козиного анти-людського Ідсї вторинного специфічного антитіла (даскзоп Іттипо Незеагси, 109- 005-008), розведеного РВБТ (1:4000) і інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після промивання планшета 4 рази РВ5Т, хромогенний субстрат ТМВ (КРІ., 52-00-03) додавали по 100 мкл / лунку, інкубували протягом 3-5 хвилин при кімнатній температурі, і 1 М НО; додавали по 100 мкл / лунку для зупинення реакції, значення абсорбції зчитували за допомогою зчитуючого пристрою для мікропланшетів МОМОаг при 450 нм, розраховували значення ЕС50 для зв'язування між антитілом та антигеном (результати показані в Таблиці З та на Фігурі 3).
Таблиця З
Здатність зв'язування різних антитіл з мишачим В7-НЗ-антигеном
Зо Результати показали, що здатність зв'язування 1702 і п1703 з мишачим В7-НЗ була слабкою, що свідчить про те, що два моноклональних антитіла специфічно зв'язуються з В7-НЗ людини.
Приклад дослідження 3. Дослідження Віасоге на афінність антитіл
Афінність реакції анти-В87-НЗ антитіл до В7-НЗ людини та миші визначали за допомогою використання приладу Віасоге, СЕ.
Біосенсорний чіп Ргоївіп А (Саї. 2 29127556, СЕ) був використаний для афінного захоплення певної кількості антитіл, які підлягають дослідженню. Серію, розведену антигеном 21І49-87-НЗ людини (Саї. 1949- В3-050 / СЕ, ВО), антигеном людини 414-87-НЗ (Саї. Мо 11188-НОВН, 5іпо
Віоіодіса) або мишачим антигеном В7-НЗ (Саї. й 1397-83-050/СЕ, На) пропускали через поверхню мікросхеми. Сигнал реакції в реальному часі був виявлений за допомогою інструменту Віасоге (Віасоге Т200, СЕ), щоб отримати криві асоціації та дисоціації. Після завершення кожного циклу дисоціації біочіп промивали та регенерували розчином для регенерації гліцин-соляної кислоти (рН 1,5) (СаїяВА-1003-54, СЕ). Буфер, використаний в експерименті, був буферним розчином НВ5-ЕР (рН 7,4) (Саї. ях ВА-1001-88, СЕ).
Експериментальні дані були узгоджені з використанням програмного забезпечення для оцінки ВІА версії 4.1 СЕ в (1:11) моделі Лангмюра для отримання значень афінності. Результати експериментів наведені в
Таблиця4-6.
Таблиця 4
Таблиця 5
Реакції афінності різних антитіл до людського антигену 4Ід4-87-НЗ
Таблиця 6
Реакції афінності різних антитіл до мишачого антигену В7-НЗ
Результати афінності дослідження Віасоге показують, що п1702 має сильну афінність до людського 41д-87-НЗ, досягаючи рівня в нМ, тоді як афінність до людського 2Ід-87-НЗ або мишачого В7-НЗ є порівняно слабшою; п1703 має слабку афінність до людського 414-87-НЗ, людського 2ІД-87-НЗ та мишачого В7-НЗ.
Приклад дослідження 4. Аналіз зв'язування клітин іп міо
У цьому експерименті зв'язування антитіла оцінювали, виходячи з інтенсивності флуоресцентного сигналу зв'язку антитіл на клітинній поверхні. Після інкубування 10 мкг первинного антитіла з 2 х 105 0В7Ма клітинами на кризі протягом 30 хвилин, надлишок антитіла видаляли промиванням. Клітини інкубували з АРС анти-людського ІДС Ес (Віоіїєдепа, 409306) протягом ЗО хвилин при кімнатній температурі, а після видалення надлишку антитіла зчитували сигнал флуоресценції на клітинній поверхні за допомогою ВО Мегзе (результати показані на
Фігурі 4). Результати показують, що п1702 специфічно зв'язується з пухлинною клітиною
И87Ма, яка надмірно експресує В7-НЗ.
Приклад дослідження 5. Дослідження ендоцитозу іп міо
У цьому експерименті ефект ендоцитозу антитіла оцінювали виходячи з інтенсивності сигналу флуоресценції, який визначався інтерналізованим антитілом. Антитіло В7-НЗ та АРС антилюдське Ідс Ес (Віоїєдепа, 409306) змішували при мольному співвідношенні 1:2 та інкубували на кризі протягом 15 хвилин. Після інкубування суміші антитіл з 2 х 105 087Ма клітинами на кризі протягом 30 хвилин, надлишок антитіла видаляли промиванням, а потім клітини переносили в попередньо прогріте до 37 "С середовище і інкубували при 37 "С протягом
О, 15, 30, 60 і 120 хвилин, відповідно. Клітини центрифугували і повторно суспендували в буфері для елюювання антитіл, щоб позбутися антитіл. Після інкубування протягом 7 хвилин при кімнатній температурі буфер для елюювання антитіл видаляли промиванням, а сигнал внутрішньоклітинної флуоресценції зчитували за допомогою ВО Мегзе (результати показані на
Фігурі 5). Результати показують, що і Н1702, і п1703 були ефективно ендоцитозовані в клітини
Зо після зв'язування з клітиною 0В7Ма.
Приклад дослідження 6. Оцінка Ті» на щурах 50 4 щури 50 (придбані у У5) Ехрегітепіа! Апіта! Со., П.), 2 самці та 2 самки, утримували в циклі світло / темнота, налаштованого на 12/12 годин, при постійній температурі 2453 "С, вологості 50-60 95 та вільному доступі до їжі та води. У день експерименту щурам 50 вводили досліджуваний агент у хвостову вену в дозі З мг / кг та об'ємі ін'єкції 5 мл / кг.
Час забору крові: У перший день введення, кров відбирали з очного дна через 5 хвилин, 8 годин, 24 годин, 2 дні, З дні, 5 днів, 8 днів та 15 днів після введення, 200 мкл кожного разу (еквівалентно 100 мкл сироватки); зібрані зразки крові поміщали при кімнатній температурі на півгодини до згортання, а потім центрифугували при 10000 х уд протягом 10 хвилин при 4 с.
Супернатант збирали і одразу зберігали при -80 "С. Концентрацію антитіл В7-НЗ в сироватці крові вимірювали за допомогою ЕГ І5А, і проводили аналіз на ПК. Результати наведені в таблиці
Таблиця 7
Ті» антитіла В7-НЗ у щурів 50
Ті» (серед.ж50, год.) п1702 ЇМ (З мг/кг) 185:-17
Результати показують, що період напіввиведення антитіла, відповідно до представленого винаходу, у щурів становив приблизно 185 год. (7,7 дня).
Приклад дослідження 7. Фізична стабільність антитіл В7-НЗ
ДСК використовували для виявлення термічної стабільності різних антитіл, і порівнювали теплову стабільність в різних буферних системах при різних умовах рН. Типовими буферними системами, які відповідають різним рН, були 10 мМ РВ (рН 7) та 10 мм ацетат (рН 5,2). Зразок розчиняли у відповідному буфері, а концентрацію зразка контролювали на рівні приблизно 1 мг / мл. Виявлення проводили з використанням МістоСа!" МР-Саріїагу 050 (Маїмет). Перед виявленням кожен зразок і порожній буфер дегазували вакуумним дегазатором протягом 1-2 хвилин. По 400 мкл зразка або порожнього буфера додавали до кожної лунки планшета як зразок (навантаження приладу становить 300 мкл). До двох останніх пар планшетів з лунками додавали, відповідно, 14 95 ЮОесоп 90 та данг2О для очищення. Після того, як планшет для зразків був завантажений, була встановлена пластикова м'яка кришка. Температура сканування починалася від 25 "С і закінчувалась при 100 "С. Швидкість сканування становила 60 "С / год.
Результати наведені в Таблиці 8. У кількох тестових системах і п1702, і 1703 показали гарну термічну стабільність.
Таблиця 8
Результати ДСК різних антитіл
Буфер Тт-початок СС) тм сс) п 702 рн 65,59 78,97 рн, 61,33 73,19 п1 703 рН 60,65 75
Чистоту зразка контролювали за допомогою 5ЕС-ВЕРХ для дослідження стабільності за певних умов концентрації. Як приклад, умови концентрації зразка контролювали на рівні приблизно 40-50 мг / мл. Стабільність різних антитіл порівнювали в системі РВ5 (рН 7,4) та системі оцтова кислота / сахароза рН 5,2 при температурі 492С, 30 "С, 40 "С протягом одного місяця зберігання. Чистоту антитіла досліджували, з використанням колонки для ВЕРХ Хргідаде ргооїєїп ВЕН 5ЕС 200А (У/аїегв). Після місячного дослідження як п1702, так ії Н1703, показали гарну стабільність. Результати наведені в Таблиці 9.
Зо
Таблиця 9
Результати стабільності різних антитіл 4 "С/ місяць / 30 "С/ місяць / 40 "С місяць / чистота чистота чистота п1702/оцтова кислота 99,25 90 98,68 95 97,85 90 п1702/РВ5 99,21 95 98,07 95 96,34 90 п1703/оцтова кислота 99,31 95 99,04 95 98,38 90 п1703/РВ5 99,18 95 98,56 95 96,99 90
Результати показують як п1702, так і Н1703, демонструють відмінну стабільність як в буфері з оцтовою кислотою, так і в РВ5 буфері.
Приклад дослідження 8. Хімічна стабільність В7-НЗ-антитіл
Хімічна модифікація, після отримання антитіла, є однією з найпоширеніших причин, яка призводить до проблеми стабільності продукту, особливо високого ступеня модифікації дезамідування, окислення або ізомеризації в деяких амінокислотах в ділянці СОВ. Таких змін слід уникати або зменшувати. 500 мкг антитіл для дослідження розчиняли в 500 мкл РВ5 рН 7,4 і витримували на водяній бані при 402С; зразки були відібрані в 0, 10 та 20 день, відповідно, для експериментів з ферментативним гідролізом. 100 мкг зразків відбирали в різні моменти часу і розчиняли в 100 мкл розчину 0,2 М Нів-НСІ, 8 М Сца-НСІ, рН 6,0; додавали З мклО1 г/млОтТт і витримували на водяній бані при 50 С протягом 1 години; після цього зразки двічі ультрафільтрували з додаванням розчину 0,02 М Нів-НСЇ, рН 6,0 та З мкл 0,25 мг / мл трипсину.
Суміш гідролізували в темноті при 379С на водяній бані. Сайти потенційної модифікації аналізували за допомогою мас-спектрометрії (результати показані в Таблиці 10) за допомогою
Адіієпі 6530 О-ТОБЕ. Результати показують, що Н1702 і п1703, описані в представленому винаході не мають значно підвищеної тенденції до дезамідування, окислення або гетерогенності, що свідчить про те, що молекули мають відмінну хімічну стабільність.
Таблиця 10
Хімічна стабільність різних антитіл п1702
Приклад дослідження 9. Стабільність антитіла М702-1
Тип лямбда має на С-кінці ще одну амінокислоту 5, порівняно з легким ланцюгом типу каппа, і стерична перешкода 5 може бути чинником, який спричиняє нестабільність дисульфідної зв'язку між легсим ланцюгом і важким ланцюгом. Кінцева амінокислота 5 може бути вибита шляхом молекулярног клонування, і стабільність антитіла в лужному стані буде значно покращена.
Коли першою амінокислотою на М-кінці легкого ланцюга депротеїнізованого антитіла є О, в антитілі також може відбуватися часткова циклізація, що призводить до збільшення гетерогенності заряду зразка, впливаючи на стабільність складу та продукт. Перша амінокислота ОО на М-кінці була мутованою до ОО шляхом молекулярного клонування, щоб усунути неповну циклізацію та значно покращити стабільність антитіла. Вищеописана модифікація суттєво не впливає на афінність сконструйованого антитіла до його антигену.
Стабільність п1702 та п1702-1 перевіряли за допомогою способу 5ЕС, невідновлюючого
Зо методу аналізу СЕ-505 (рН 9,0) та способу аналізу ІЕХ.
Виявлення 5ЕС: використовували хроматограф Умаїег5 е2695 та колонку Хбгідде ВЕН 200А
ЗЕС. Завантажували 50 мкг антитіла, і елюювання проводили за допомогою рухомої фази РВ5 при постійному градієнті.
Спосіб СЕ-505 МА:
Зразки обробляли за допомогою аналітичного набору Весктап 505-ММУ Апаїувзів КІії.
Буферний розчин додавали до 100 мкг випробовуваного антитіла, денатурували нагріванням в буфері для зразків, як описано в протоколі для використання. Дані збирали за допомогою апарату капілярного електрофорезу РА8ОО.
Спосіб ІЕХ:
Використовували хроматограф У/аїєг5 Асдийу Н-Сіаз5 та колонку ТПепто МАБРас 5СХ-10.
Завантажували 50 мкг досліджуваного антитіла і застосовували лінійний градієнт, використовуючи набір СХ-1 рН Стгадієпі Виїег як рухому фазу; отримували ультрафіолетовий сигнал на довжині хвилі 280 нм.
Таблиця 11
Порівняння стабільності п1702 та Н1702-1 77777777717.7.7юЮИ ІЕС 77777777 СЕе5ОВ(рНОЮ п1702 100 95 71,21 95 40,5 96 п1702-1 100 96 94,67 95 86,21 9о
Хоча винахід був детально описано фігурами та конкретними варіантами здійснення з метою чіткого розуміння, опис та варіанти здійснення не повинні тлумачитися як обмеження обсягу прав за представленим винаходом. Весь загальнодоступний вміст літератури та патентів, цитованих у даному документі, є включеним як посилання в повному обсязі.
гу Я «ах со кітіз пуУгІеркц ну А Я скл пів: ях зх «МО» ЗХАМОСВМ НЕМОВ МЕВІСІМЕ СО... ЖНАМЕНАХ НЕМОВ РНАВМАФВНКТЄА ФО... «І. АНТИиТІЛИ вУ-нЯ. УГО АМТИГЕНдВ'язУючии ФеАгМЕНТ ТА МОГО МЕДИЧНЕ
ЗАСТКУВАННЯ
«НІ 0 УНаСУаСвИт «іх В
ВН КІ З ГЖх пт: Зо кат ї Н -дтйх жІВОВЗацепсВ Тіп «зи ХЕ «вії СУМ «вій ВАТ «те ВаКЕ Зав етУ дока «ВЕ «ай пПЕПЦТИД
УТ : 2 ту ухгкізуитзуУх У гу см иа у НЯ песамітни МТЗ
АйтТі» нюДСЬКИ повВнОрОозВіОна дмівнокистатна паспідевмість ВІН «МН 1 ха : Ко АИ че ложу ха дз зону та іх г з су им сти
Мет ен ода ага Аго шіу Зв вка «1у ВО Б51У жаї пі уаі су АЛа ч пок боса 5
Ж ТЯ ля М т «ді мл кл по ти ІМ тем 4 їм я. ФРІ АЛІУ зам а ий и
Аіа кер ші вза веб тгв Би о СУХ Бей о тлР ошіУу лів ем ші мві 5ів
ЗМ Ух ЗА ом режим ке. и мети. 1, че Стих з и 14 їй У "іга я чл ши ОН чаї вгосбіц АЮ вго Зв Ууді ів їев су! «Зіу тБе азо АЇВ тв осец
Зк я 45 й ГУ У й жк сук Се» бер оте чего Вра щін о Бго 5іу Бе оЧегорец Дів ОЇ пен дев
БІ НУ що їанотіе тро ів ів Тит Ав отТВе бук шій оре ЗВ нів Чет Ве дІВ
То ТХ ІВ пів біу бій дев сій Бі хнК дів тут лів АБ Абе ТНК АВ ре вне ке 7 - -е 7 Зх
Бго АБЮ би вБец о Аїа вій с1у жи Мід бак опе АР бана Бі дей Уві
ЩО 105 Ма со АЛ дах жу: и, дід тк ТК ук пи мА щем тідй т «;
Ага ЗАЛ АЇВ АБроБін «Ту пек орав отнк Сух Ра уйі Чет Я) Аго Аз 115 128 157 пвх бЯе сив о Ат щу А др рам; мів оц А Ал У рю дю ик ве обі 5вгоАіз Аа хаї йог одер пів Узі АТ дів БКОо тТУК ої Не
Іо У іч у у х поь Ку йо ах с щої кг пет ому
Кг о щерг МЕЖ ївгобец біз Бго деп фу а зе ага Бр ссіУ АВ ОТКХ зах 5 155 пе дир ях сет тугі «шву мух сур «т ху М тку їх и: Зять у: тя
Ма! ОТВг Кіа тв оСув бек о зав отук бів Біу Туг вра зів дів оц узі 1655 178 175 зве осткв сій яв сі біл іо Уйі орга вами тве біт дв уд ЛвкОотвк
БдрЕОТЕВОФбіп АЗВОФІУ біпім Ууті Бга баб отас о бІіУ В ОМІ Тит От; - ау ? й дух т ст їі їі щюЮ
Зак ошій мМеаб Дід дев пі щій діу Бец ор АНО Уві мі бек і Об)
А Уа ноя
ЕЕ дк Ох зе. Кок СУК ан ч Фа Зує скик Маух туш окр До йочкі м
Асцоад Уві фен ЦіУ АР АБИ піУу ТВботТук Би був БИ УВІ Аг АТ
АХУ чле Уа
ТО АХ «ки по с застій их хе лід шо схе сут е уд чяи. Кіх хх ти Ск втз о УВІ Беносіп бій АВ лів нах аб чего Уві твРб охіє ТВе ово Од трат М зак тую
ТУ Ка К5а Ка
Агпрое о рука тн обі дів Уві Біщ УР сій Уві вто бів ем октав ха ах 250 235 за Аїд мер Уйі бі ТВгоАБроАЛа ТР опо Агоа Су Чег о бвв о 5Вг Вго ру лк й пл ка хх КИ
АН ну 3 ух п «. . с Ще али с « ії гою Еш р сек із Бк ші Вб обаг фец Аївовій бу Акп вед Ті тро Зі без тв:
ВХ зав зи жу МАК Кк паж ЧУ и щі ем хім ач хо хг че мл: утіх, чо Ак ху М,
АД ОотТагоОїУ» бі оїаб мат Ві щей овапе їй охів біу ага Ах бій Ту ищИ Ха М й Жоотрххую к хат х ее Зо суую я одну дому їі их АХ -їек
ЗМ одіш Ту Аід ЕВ Ага тпг дів гру БВ ОоБиа ав оба си оАІЩ ІВ іх ща чу ах
ЕН 315 ЗЕ зе
УТ Фр ще І з пер з зам тю ху ж зе ОА СЯ те сват віжЖ Ач АІВ ВВР обер ага оце іп Ак Ма два Уді АТв яв обі Фі 325 о 35 аг оБре твг суб вве омаї же ЖІ Аг АЖ вне БУ ЗВГ ОВІіВ АТ ОВ
ЕЕ хх 35 ча ке Во Я пе ак грек Вей Ко Ж жвИе ра й
Меоїлюи біб УДі ІМ АР Рг Туг Баг оЇуУ» БКОо Бак омМиХ тТпт ре с
Кк БІ. БІ-К рго аз Бух Азросен Ага Бео Оіу зр оївк о мЩаії твготів твгоСух бак ал 325 ЗВО щаготуг Ага шіу тує рРгаозів Аїш оФбіб Уді бяеотка Зій АВ оту сія
БУ Уч З алу спі чні веш о кви тТвгбосіє дв оУВІ ТНе о ТНе Зве о Зі. мех дія деп оби
Й 05 а3а ДІ сій біу гец бне дев Уві Ні Заг ові рен Аг уві ді Кер обім Аїа ло 5 450 ашвошіУ Те Туг Зв Сув Бей Уаі Ага дей Бр Уві ем шій сій Ір «35 ва 545
Аза ні зі факт уві ТВг жі їв Бі «і вбга мес оте вна ру ве
КЗ 5 І 4ко ій оАТа ібм трромаі ТБ Уа щі ев веб ма бує ец Ж АЇВ ої еи
Зх Я 473 че
Каи о хаі АТЯ Сей АВ Ве уві бу5 їгб о Аго ру ї1в уз ПІРй бог сук 455 90 Фах
Фів сів біз ази Аза зі фа о шів днз біпоавробіу Зі оту ів іх
М 5ох 5 его цу ТВбодій без оФів вк рем о рмх НТ Щек дер шаг БУ ЇМ АЗо
Уа зах дяді Фів ої їі аа
І
«0 «кі 51 «евих РЕТ «ВІ» Миз лютих «Ех «РІЇ ПЕНТИД «ОХ мищшача повногнхаміорма амінокиаслотна веслідовнішть ВУНЯ еко
Мат їжа Ага пі ттрозіж фі бо сбагомві БіуУ ма! Суя Маї Ак тег
У 5 15 їх діз емо оту Узі Кей Су бви був вач о тйт дім Аїд судні Бій ма! їв го ХУ 36 маї Жак осі) АБ орго Узі жа Ай ев Уа аз Отнг АБО дів т яз 35 я чи
Ага бив Зегб бе ЗакКобек і вго пІУ Вйе Ваг бан АТя дів бор Аа зи у а
Ман хе ТР ОШій Бей Тит А5В Отак був піп Бей ущі нь Зековпв ТНК
ЕХ то Її 82 піз сі дата йазросій ші Бер АТВ Ту бог Аза де тк АІЗ ром БНФ
Зо З5 вго аю сви їв) уві біп б1ту Ав Аїд Вр їни аго Бору бій агвожай по 105 ма дка ма! Твг аз Бій ші вро тує УВе о сСує ри Уущі Жак хі» сій АБ х х - КУ Ь; 5
ЗІЗ 125 125 вве аби Заг дів дів Ук! б5вбоббц Фів Уді діб АЛ о Бго тує зак рук ї3В їУ ке йго бег Мет Тв орФц Бі БР Ана КЗ азо Бей вгоа бро ЧіУ Ан Мох. тах 150 ММ 150
УВі тре хто твкоСубв Яегобог о тує Біб біу тТеровто Пій від Бім ох ї55 170 75 вна тТго бух зв обіу іп Фу Уві бро бою ТВг обі дей маї ТВгОТНе 155 ІК ї13а че обіп мех дій дя Сію ага бі Бей ве дхпоУуді нія баг оєві ем їЗ5 ще гот дгв о уді Уві г БІіУ АТїа й ІМ ТВготук Зег бух дев а! Акц Али
Іо 235 РАЗІ 21 : В пго уві фей іп пів дар оаіз ніж іх Баг оуаї ТНК ОЖХ1е Упг оту си хау РОЗ 235 А та ік) ТВе вва орго Рг Фів АТВ ів Тр УВІ Те уз шіУ бе) пет т745 250 55 мв' сич рец Уа! Уаі во феу мі Кіа фей о Аіфд орто) уві Схи5 ТБродго
ВО 7265 РЕЖ
УФ Ше ру» біб зЗвт су шт Фіз сів дкп Аза алу АТа жів дев 1 зх -8 зх 22х зо що
АВЕОСІУ АВ ОБІУ бів піУ Зат бу ТВРОДІВ рен Аг о РГО Сей фух РКО 230 ЕХ ло
Чет біб ваза Бух Зія азроахр «Ту «Ів сів гів Ав за ВК ЗІБ
ТС еу КІ сЕІ» 3 «ЙТАх. РЕТ ! й «ід ШТУЧНА песлідовваєть «ох «АЮ ПЕН ТИК чи оку су жаліти ямі се ха
АЙЛЖх лзмісвкий питигбоез ВНІ: лхо-В/НЕ «НВ 3
Бео о зін Щі Бі сУар вко Фів ар обго Уа Уві АТ бе о чді 5ІЖ То
Н ій К5У 15 7, з що Н ну тю ТМ 5 сич щ сети юки клі: тики шах мо ге
А АЇЖ ТАК Овен Сув Суб вт Бе того вко бім Бе у рах аб оган
ТО 25 За
З кі ; з бле мл е тру йду СВ лит те У
Аів сій беб деп освяз КІЗ СтТгО Біл рев заг ОодУВ ОТвг губ Зб рев оці 35 Зі ах : х му ще ке и Но поши нн ВИ м НИ х чо
Ніз чего везе АТа бій о біу Бі Аз шій Б1У БЕ АЮ ТуК АЇВ Ах АгО
Б чЕ 50 її ї , с І пт ж ме іп оце Б з тнгоатаз без Бе Бго до меш іє АЇа сій ОфУу АБа АТ Бек о БОМ Аго
З Й А пк ту 05 ТО 75 У и т , х. ще зх хе в-я ша ож ит ру, ша тури себто тк іш ху їти іп оАєсор ма! Ага Уаї Ах ан одіЮ піу бет вйФ ївгобух важ УДі я за З не ті пк й Вже Мі Кі Зх бі ТІ раз ЩОКИ ди ліх її:
Заб 11 АгО Аа бат шіу чнг о АЇЗ дів Ууці бог о рош ів Уа Аза АВ ог й до з мМ це КЯН й вгО ту БЕК Офрущ Бра БагБ Ме тве Геи У: го Ам о дЕріви ага 115 КУ М вка сі АЮ ТБгоУВІ ТВТ ЖІ о ТКК Сук Закобаг туК Фів сі тує о рго 13 135 ча І х й ши зу Ва сбкмщ «сій акти Фе Іти ші и ча бу рми ки птн ояів бін Ууді вве ткробіп АБ ЗУ З3ія сіу уді Бра без Тр вір тах Ве 155 Що
Зоре ср код ето я и - ль пи ем хе г зва ха ТКе так Зав осів мех дія дев опів о1й бу бом вве ами Уа! 18 Мо 175 вн ше Ма, , по и НК ень он НИ че коди СТЕ сту Фа їжи
Ех ет їі рен дб Уді ді Мн сСіу ді АБИ бву ТигОотує 5еб Сук
ЩІ і 153
БУ й . Бо ч Й . ох х я у
ШВУ Ага АЙ ОВГО тУві грец ій іп Ав оОдІ нт аг его діІ тн 195 век ТИХ тів тнровг) пів вра бот врО Те бі Мія нів мів МіВОоМНів Ні
Бех х З 7 чу 21 ТА ке «В Я «ХМ ЧА
ПИ пи «Вій РК «еї5к штучна вослідовністк «фе «В2іх пЕЖТИВ що М хеййУ аюдІВКиИМ Днтигав ВНІ: З14-В7НІ «ЦО я і пали У му Ж дв пему хе г хі пає ЦИНК пу тЕржх іїпу Сів Уві бій обов) во ЗЕ Ар овта маї таї Аа о вау уві БІ ТР: ї і 15 15 зв Аза тагозвносСує Суд ше БВе Чигорро Зі ру б їж Кл обаг цю о 5 Зо
АТ ШІ фев АБИ Огез 10 ТКО Осій рою ТВе зо тег бук 51Б фев ж 15 3 45 : ле ге акті тру ті док мл йти Ки АЛ Ск їз се їх
НІВ дег вне ат бі БВІіУ БІй о Азрв хів бу Маг одів ТУг дІВв АБП ОГО щі БО ч ч н тку ее их ди Аа тім 1 ле та ле іс, де
ІбгоАТа фви рйе Бго ЛУ цец ін АЇй сіб біУ депо АТа ЗБЕ о геу Аге пе вх зе іє
Р ТУ КО ще п хо хи м я че - Лу. ія пови Уа Чу ув у: т
Ме БІЙ АТО Ма: дгД Ук аїв Ар ос) біу бег вва твс бує вне уд
І вх аа зх
Заг жів Аго Азова Зіу бек да вата хві ек обви Біл Уа вія Аа 19 5 що
Бгто тує зако вує Бе баг Ме тек ін шій ВгБ АЖ Був АВ ін; АГО їх 120 ке Й вгоопіу ахвотне Уві жве Те тн обу Зевгодег ТУ вій іу тук га їхо їх Й; ів Аїв ші аз вче тер осів дев осію чів ші Маї еко ів тТвросіу 345 5 ї55 зе
Аж УВІ Те оте бог бій меї із Ази 15 бів б1Уу мем обне зро ма 185 тв 17У мів зекоїів ве дго аз Уа їв; сію Афа АЖ ШТЖ ТК БУК ВК Су» 1505 155 І їву уві ага дип овКо УВІ рем ОТй піп АБроАЛа Ніз Яогологоуві тик їх Ре 2 їта тк Бгто Зіп де Заг обго тТвКобіу діа хі ів маРф тв омаї века «о І 215 ТИ із ап бго Уві Упі лів фе) оУці СТУ ТНгоазрояїй тб обпо ага суз ах 25 235 тай
Зег опа бек орг сіц вто 5іу Бе бак оіву аа іон дав ів тів 255 15 255
ТгвоФів ев ТК АЛЮ ТБг ОБУ пів рев ові із пе ве тве біб бу ра тай важ гр Аз овіп Бі Баг Аа Туг дів аа др т АЇщ їв вве ОВЕВ АтИА
ТІ та І 285 з. Р т ча сю ВІ У х --О в в З іні їі Дін бів піУ ле Аа Бик ої ака ів оспій ако У: ага ув! 253 295 Зос 145 а5р бід ві 5 вве пи сук впе ві Веб ЗБ ак аз рве ТУ 05 Кан І І КБ «ВК ОА Ап хаї шероідв піп Уа! АБ дів Бго Тр Янг фуз Бо пет
Зах З Зх меж ТВт ес бі бго Азповух аз осец го вго Оіу аз тк уді ТК їяй хя5 КУ тів так Су Шнробаб Туг Ага спі Тук о вго із Аза пів Ул Бо тгр 355 Зо зЗЕх із яз піу іп обі ві ге сей тТвб обі Аза зі тб Отак УВК сн
БУВ ЗУ во мес дій Аж сій пів (Ф1у Сей Рівз дк очді Віз бик Уа? інв ака соми 155 зв Зх МЕ
Мві фе бі АТІ Аза біу тТаботує Заг су рем ха Агу два овга о ма! я Я 415 іа жів сій Аза АіБ Ніз а1у шШтероуаї ТВгОЇТо ТВброФфіу дів Вко Мої я2о а ва
ТВг о ніз ніз ні5 ні ві Віз
НОЯ Кк «В10ю В. «ил байк «від РЕ «В1Їх шручна послідояністев «ВО «ай» пЕНТИД «23» мишачий зитирен ВНІ «Ях 5
Щі Б УЖ шій а бак пін Ар обтго Уа У Аз ви УВІ дев ТвК ї а іа 1У
АшШЖ АТВ ТНК бе яко Суз Заб оБне зас ро бі; вто біу ре Заг оуемМ ло Р 5
Хід чій іву джпо сей їіфія тер офій іже отВг ой ук бух 1 ря мВ
БК За 45
Ніж дек оРБа те бії Ві ага АзЗроЗів біу ЗвеоАіа ЗуЄ Зв Ам Аг хо ч 5 тТЕгОоАіз (жа вне Без дао бо фе Уа цій бі АБ ліз дев оби вага
Я БЕЗ БІ їед бій йга кві бгоа за Тв оаав овін БІУ Зак остБує тв осує вва уд 5 Ку; 5 хг ожків Фів дав вна Ахпосджб о мів дів Уа чЧегоїнлу Пій У від мій що Що еще
Бго тТук баг уз рго 5ег о Мек тнгобей біз Ре дп уз авроїен Аг 135 15 ї25 вгообіу Аза мес маї тТнг хі їБг осуд Жабо зе ту ЗУБ хіу ТУк орга 38 її іо ін аіа шівн Уві вва їгт юУв АЖ СТУ бій і маї вто бе) ТБ У 145 ії 155 БИ дк оУаі тТВгоївкК 5ає чів мот Аа дай чів АБ фу гц вве АкроУвї 155 ї7а І 175 ні Бег Майї спо вго Маі маї ів сію аа за су ТВг тує Берг осує ід їх о
Мен оУуаі аго азп ор Уаі Спи бій оБтй Аби лів нів біу Заг омаї ТВг 155 203 КО
Ха тве іу Фів вро и ЯївР ово нів ну ніж ча мів нія 1 315 ТО хом о «ЕІ 15 «кій РУ «33 ШЕрРучна послідовна шть «ВЕ: «нет ДЮМЕН «Ей капіабельна ділявка легхаго ланцюєа Ні «аОпа б бів ов) зій сви мат бів зекошіу ші біу Щі ат шія вка обіу тк ї 5 10 я хагоівноАго кем бек Суз йїз віта бек шію вно З БбБе бек врода ява І Я І БІ дід мет ні тка уні аг віп дід вка су ву іу ви піц тгроУаї
Бк 40 35 «іа Уа! їх1е баг отТує дер піу оз АБ Бут Тук тує хві АЗИ Вк У 55 БО ух біу ати шнНе Те ОХТе Заг Аг де АБИ Зеб рує дев ТВ ОБец тує 5 в їх ка
Мгц щі Мих Ащ Заг ово АКа АїВ Бій А ТНК ОАТВ Ні Тук тТук Суз х жо 25 ліз ага бек ат дез іс тут А1д бно ве азо тує Тер оші Бір оту 120 щу Км «ін їац чаї жЖВг о Уві 5екбкобиу
ТУ
«іх 7 «іх КУ «їй ВЕК «1 ї» цтучнв посліданність «й х «ВЕЖ» ДОМЕН «МИ жниМабеньна діланка пегкого панцаєв ПОЗ «400 У «івотвге Уві УДТ тТВг Фів біб га Баг овеча Чебоуві 5еб веб сі оту ї 5 15 й 15 тТвВгомді твгоїеу ув обуч «Ру іш обег бет бБіу Жак омдф че їрлесхакг 2 | не
Мі5 туго Бро 5ек тка тує підсвій ТВ ота сі Бій аза его дго меж
Ук чо 4
Бем тії ТУР АБпОТВг й5а ТВгОАгЗ бог бог СТУ Уа Бго а5О Або но зо 5 в .
Баг ослім бег тів фев шіу вай вух АТа дій фс) ТВ жів тв (У Аа й 7о 75 хо сів Аа дер АН пі бог др тує Тук Су діа Бій Міх уві йо АГ 5 щ ау аа ів труді РіводіУ СТУ біу ТВ руб снз ТВО ве
Не. тп що с ду «В В «ЛІ 135 «Аа ВЕК й Й «КМЗ Втучна послідовність з «Ех
Ух пещЕМ й ша ВКМ Й пам слціших МІХ «Р3їх Запідйсивнв ділянка важкого лазувиа БІТИ
ЕМ й Й Ще Щ
КК с щі - - кр; шу ація и ко піб «у а бом т; пре ал м УВО УР бій бгОо БУ КУ ій уві біб ке ші Фіз пого обпіу аіу щу У - Не ї 5 І їх х Я ї с за жи х 5 пух Аа АТа Заг сіу Ба оїве вра Уагожеер туї забг фам Ага бе; бик обу АТК АТа дерозіу ще ївоОБНе зе ; ку па сх цк мой - ях. вх с Сім фа квоуці
З А Уа ту лю Ага шій АЇВ вки обіу я У БІ ви сі То 53
Аій мех зак оугр Уві Аг ків ків вко бу лу У їв 35 ЗУ це «ж т1е 5 ЗУ ве Ф1у Ту Бех їйгОтує ту Аїя Ар оЗек уд сег одій ї18 Бек озіу же опік у дев ЯВк оту; іх р 55 по ще . м ре Ка лат ВК оів дп тМг рено тук
УБУу ато тує тр ої1ів пог ага 5 УМИСНЕ ОО АТ ТМпгОоБем ту?
Був БЕРУ ато тує тв бів ослаг о АКО АЗИ АХ хе Не В
Ку 7 М бух 7 х гм г во га Б 4 щу лом су студен тик ї вжнК обен яр АР щі АБИ ТНКОоАТВ ДІ ЖК тує спюкя
Мекобій Мекойят ЗК ово аг АТаАа фу дерти у У Ту я киш нв1 те што пін пр;
З яхт: жу ка ал мін КІЗ пи аз Ме т шіУу сій ПТУ іа Кук Фі Угі Бі Бгаожді нів дів іпроазро ум тт вх й ШЕУ Тпх МАМ
Заг отвгоуді їне Ууді Закон т «и» В й ким ЗЦЕ «їй РКХ й шк кеїйМ штучна послідовність «ВИК кет ДОМЕН ; пдицюга ВТМ чт й глин пркоакоОо пишцюта ві «ай Жеа впріайбЗельна дійвики легкабо памуюта ві «пах З . | я кт й 5 Ід 1 ЕК ще зи веб Ада жарт У пі
АХ ТЕ они КОЗУ: гора ЖЕК пигоБоао Зб ОА ВЕГ УЧ пу
АВ од оАТОа БО Тег оБІЙ ЗК ОБГО ТЕ їй Квиу її д ЕН; жі тврОСюВ "зав ат Заг озУ баг зів сиг тве стуї
АЕВ ОА за ЯН РЕ ТВКОоСу5 АгО дів его ще їв
Й Й пі в ня кі та ь с М ал тх тр тує (1й «(ІВ уз вро ту гу аа Кт оХіш Бемоцем ів
КвВ о АИи Тго тує щі ів 1 УЗ оо 5іУу суч Аза їх хоп 4 ї
Я їх ї з їй пох ХЕ ше - ; зас пі ряд Бій заг ощіє ша Бго пого АКА ВК ХЕ пу дат віх ма! Зеаб сіу яв бій заг обію уаї вро ве з хі 55 ЩО з т х і час Ха їжі щіМ КУ г т «ее пу Ти оніє ре отТВК івц ТНК Хі тв жщК ів ІВ го его Б3у Жак пу Так оніх Ре ТНК ни ТВ хіе ци
ЩЕ То шо й І КйЙ
Мч ; у - 2 дл ва срУує «ер осувг пе мої ї Є 1 ВЕ тут тур ЦУЗ пора ЗО хе гу мах,
Фі АБО ОРВа я ТВг тут тук сух ціа ва Баг оту пі ще це овйв стр 1 ЕТ Тв реє чт Міесттн їх тк тв о Бнеа бі бій шіу ТВробУЗ Узі віч хів ух
ТЕ ОТйе Би 51 х У аа Не
ЩЕ 105 «ВЗ» о сію В -835х штучни песлідавність
ТУ
«кін» «айук ДОМЕВО «дей ВІТОХ орні «ий й мк М ше щі ші ке жі вва о Зег Бак вк АВ у а
Н х
«а «іх «иа йм ВТ хе» Учна послідовні стіх «Ох «сифіз ДОМЕН сейй3з ВЕК нев: «НІХ її ї12 Бас отуК АВ ау чек зап мк ї У «Ам а «і 19 «12» ВВЕ «их штучна ПОСЛІДОВНІСТЬ «й М хакі» ДОМЕН хоейе ВІД нСрКї «пом і й
Дін АКБа чис дід ага венотуг лів лег Ре АБИ ОТук
ХМ 5 18 «вал 5 «І Х ка З «їй РК «ФА» штуУЗда паплідпанаисть «ЙЯ «Ек ДОМЕН «ий3 ВНІЛОЖ вБКОВІ «Мюех 13 цег о біу Зег ма бар оТве ово НІВ тує т 5 «ак ола «їх З «Аз ВЕЖ «15: штучмнв послідовність шо «2Рїх ДОМЕН якій МАМ їсСрКО о 1 пот дя 1 ках 15 «12 Що їй виду «23» цручна Зослідсвність ха «иа ІТ) БирКЗ «ке 15 Й аа жіє мів Уа) Ар оАка азр ожте тер Ма) 4 к Тл ії : 1.
«ЯМ ЗЕ яазі1ї» 8 «оба ВАТ тур ре чаттух ач «Ж РУЧНА ГСЛІДОВН СТІ «8205 «ЙИЛУ дн
Ух ЗОУДІ фкских «АкЯе БІТУМ нс «ОА ЗЕ яІУ Бе тт вав зас баг тує Дій 3 5
М 1 -«831з КЕ
ДУ що «ях ВК -е33» щтучна леснідавнієть кое пу поки «жк ДОМЕН
СИ Ма ул чия «й БР СОН кам, ЕЙ
ЯН ху їТе заг озіу бебі Фіх вк ОТьг т 5 ї З
УАПх 15 ках ле «АЖ ВК ве арену стічних і шу «13» штучна песлтдовністаь
КК НАТОЯ лм
А при «ТК ДОМЕН «си ОНАЗ НСрАЗ «хх й «м ЗЕ
Зо гно й у В уу ук дуцтЬ шніх чу ам залу дів бух ШІУу ЖВі йіу Кг) УНІ Ні аа Бо Азро УВІ! 1 З 1 тю тра «ДЛ ТМ «ие В «ий РЕ
ТУ не гризти і ха ШТУЧНА пОсВіДдаВНЬюТьЬ
ТЗ посух х пінки «ВВЕ доми «аж ВИМ Бек йо Ву
НК В піп обдеє То зве о тве тугб х ій ії 2 «Я ли сі «ЛІ» вдт ли пек зу В се дЕ М ут, «І5х щрУЧАЯ ПпПОШЛІДОВНЯ СТЬ злл ж дх киш ме ДОМЕН рух НК чи «ЙТїх ВІКИ Ср «830 00 т мо дату
Діво ку ж
Ж
«й І «хіїМ 0 «Кіа РК еВ штучна послідовність. ее київ ДОМЕК «жа ЗІЗ БЖ ів шій чаготук уз ТК о вго Мек тги оту х 5 10 «її аа «ях ОРВВТ «їі шШтуЧчЧВаА ПОСПІДОВМ Сх
Ех «КЕ ДІ ЕН «Вкї» важнкив лавцює ПІ -уаої «00 3 піпомві зіч бен ді сій бог опіУ Ту Шію ді Уді бій о рго Зі ТК
Заг вв Ага по бевопух АЗа Аа хеб о піу Ба хів ве заг чего оЧяхт го сх в
АЇв миє ні тв оУЗіЇ Або шів дія РгО БТУу бух ЗУ ви біз тт охві 35 Бе 5
АТа ві їі Зак отже Ар опіж бог заяв руч тУК Тр о УуВі аза бек У о 55 аа
Бек зі деп Вб ТНК їі ЗЕ АФ АЗО АБИ ЕвК цу АЗИ ОТИТ Бенотук же 75 75 85
Мен ошій Мет Апродек без АБ АВ АЗрОїв» АРа Уа тТук тк Сх хів сдку пет діа Де ївБц тує ді бет рРаж дар отук тТеропту Біл чхх щю 105 що
АїВ Маи мі тТвб Уа)? Бврозег Аа Бає тТВг рук ку Кгш Зав маї ва 115 123 155 вгаомец АТ В бог бог овух БЕК ОТНК си 01іу Бі ТВЖ АТХ АВ Бо 130 вк 140 «іУ КУБ івв'уйі Бу5 Азот вче Вр) бі Бго уві То уаї шнек отр ї43У5 іо 3 ї158
Ана очаг о Біу за веб о твне Чек осі таї нях так о Вбаео ово Аїд очаі Мен хв 7 175 цій век Зає зіу ши Тук пек оззу зег еко жаї ні ТБгоУуді вго ЗЕг
Ід 125 19
Хет его ви осіу Твгобіва тк о тук тів Си ази Уві аАзп міч ім КО
Мвт одЕВ ТНК огцух МА? Азрогув ру УВІ БІД БО Кук Хаг СУ АБИ ух
Ка ТІ5 лей тТЕБомів тТвг ос вга Его Се» ВгоО АТа Вео бід ів інь біу ку сВго ткож) ріж рен Не БРО БгО о Зух Рей оуБ о АкВ ОТГ Пец Ме жів 245 Тл 255
Ат тве вра бід Уді Жве сук маї жа! уві взмомаі Зеб міс біб ач
Й з 255 а
Бер ІВ Уді зу ЕВ оду ТК ТУК Уці Аз бЗіу Уаї шФ1Ь МНі НІВ Ази лід вуЗ ЯВКУ ге Ага біз Бій Бій тут дяв бшг отв тук Ак У ва ню
Уаї его мат їжи ТНК ОУЦІі ізи міє шій АбвотКо о фбои Аа Фіу бух чу і ще 1 Ж З
Тук їв ух уз хВі ЖеБ дж із АТВ Бвуа орг Аа Бе Її би бух
Хнго Ха Бек зує АТВ о їув у бій Вга А ів БРО біп ові Бук те
ЗИ ха ї53 ін овРО Рг: Жег Абе АВ ій ви ТНК гу АБа Фів Уді его фжа тТву я КК кон 355 Зо Зх сек туман тво «вух зт тує дх ядрі у ах тат бу» Бввомаі Був сіу вна оту вро бот о АЗр ха АХ Уві біз тгрохіц
З 323 ї8а екол іх шія Вб ші о дьнодан о туК фу Таб отак сг Бр жар ія ї85 ЕН зах кі
Ав пер оаво йіу бот Бе вне реп Зуг дит був Бей ТйгоУні ваз бух
СІ ру реж кн и и и и а ИН ох мо кт зе ОАГЕ Та ів БІУ дай ді вчи Баг осуй бегоуді мех мій чів
ЕВ ядУ 450 вів фу ніз ази НІ Ууг ТВ ОМ БУ пегобеу Бей опер бат оБрО бію
ЗІ В 5
Кук пхїух 3 «30» 33 «Зх тів «Віох РТ
Кей» оштУЧИД ПОСРРІДКНИОСТЬ» «ЕД -Ї21х домен кал е дагжим ваниют БІЙ) «ЯІНІх й шівп о тнг чаї ді Те одів бів г Кир Ве Яиб Уві бер ово пу у х м т і 5 10 Ж кре з Ки вм жк туя Он я Фо жу хи ше я ху трі ха
ТгоУві ТВгорги тТйкосСух ТУ ей Заг о бег Зіу Заг ді 5еєб тТВРОВЕ? тах зх та
Кх ях Ко;
Зх ще пк, Фк ОКО я їх Не сь ук Ем ная не з -о- ие 5
Мі Тук рев АК ТТ ТУуК «ІВ сів Те овКО ФФУ шій Аз вРкш яма Мох 35 З шк : т Ф ч жі о джу ве щи дам бами Я лив зи, дош фак в цес 12 тує Аза ївг яз) Тв ага ек Зег о угу сув) фго АзВ ОАЕ ЕЛЕ
ЖІ ка
Фа алі ха тів ому се ї ххх по А я р хе Кк и У
Жак ожіу Баеготіє бБи Фі Ач ГУБ АБ одій ни оте Хі Те осФіх Аа
Ще ТУ БУ
У чу ще х у дозу дах сту сту ши дв СЕ вені лу. дк іп віз зр азр Бі бе за тує тут бух Вій їв Віа ма) Аза одгй
Хе ІН з ах жів стеж маї вне «лу Чі щшіу профе інв ТК оУДІ це ФРУу ІЙ іп ща ї15
Бтго куз із аз оБго тТлгоУуді теоре Ре обо бго ее ек іч «їв
Зх їжа її25 . кр ат Я НЯ ложу іш «Р чім іти ТВ шли ди УК ток мен шів дій дп СУБ дан тк оіжв жі Суз вм ТІВ ББГОднНи РНе тут 530 155 340 хну т руч на и в ЕН НА ЧИ НК дхмж ак обагоотуйих гаї не
Бгто піМ аїЗ3 УВІ тТвгоУВІ 14 гробу Аза йо бу Ве рго Ма вух зх Мк КУ 150 па пи и Нр оц п А КА УААН аіа ші ха! сів твгК оте був го жар гу ФІ БЕК АН АН 15 Ту
ЩІ 170 175 їй Аід дог ойег о тук цои дек рову ТйгоБгОУ Біб бій оТго рух беконів
ТК 15 І: лу жахи хі шию фс і в зм Я ко у зифих де м ж з пк; сф к
Ат о5ат гук оЖаг осСук шій уді ТК ОонМІх са офі ЗК ОТиу Уаї (ІВ ж» ї35 по я
ТВгоухі вів БР ТВе обІіМ бух Баг щІйб Зк:
А я І ш «ДІ тА «їн Я ха ВЕЖ «ПАМ шщтУЧНЯ Лі ДОВНІсТЬь
Кая хахіме «ИЙ» ДИКЕ
ТАТУ, гі маєтеТу зву З ЗиЗ тку «й832 важкий явацве ВУХО «Не я у, ще ее щу Де и АН зіпоузі чіпів Чіп «чів че діє ші ші бебі пій ве Му Б1у
З а ла з
У а вх; Кл перо ва ісп; ойпкв обох кт) 41 при 7 с мери доле дом стю
ЗК осв АгЗ фа Берг осуЗ Ав А1вВ бе біу БНе таг о Бме бог обег отут га ро То із меж его Ткш о Ууді вка Бір Аів вко Ту муз БІУ зи овіш те хі 4 зх
Зег АТа хів ев біу За опіу Віу зег оте тут Бук АТа Аз» Заг Ущді хо 5 ІЗН
КЕ БУ Аг тут ТР ктів 5Зат лгц а5Б о АЗп Зак Бук АЖ Отак фенотує с ТО У ВИ «ши «я чин я хи Ал их дет ун А р жи ик и веноцій мес ап чего еп або Ан сій дхр Тв о АЇВ Ук Туг тук суз
Кх ща ч5 чн нн и я НИ УЧ міх рі ті пром уз их вк сит дів фу лі Уді сім БО чаї ніз вів (ев дароУі Тгропіу ій Ту
З2пз щ їх твеоїпг Уві ТНгоУді бег бек дій зем тн рух ТУ Веб зе уні вна 315 асигу зі ща 125 1 вгО іси 814 Бго Бе бек му Заг КР Зег о Біу БІУ Ве ді АТМ КО 135 3 145 ри урання т еоойовк паху т: о яру жа и фе г ік ог шо ск
Зі су ем У руб дз о ТуУЄ ВВ бто Біц бго щі тТВго Уа: Жак ота 145 М їх АБО
ЧУНч ож и АТ я Боже зе Ми Ми зас ск г яти 1 НеВНИШУНИ дей его зі діа івц о твРочеє сіу жаї мів Тег Бе веб АТа о Уді сви ї155 жо 175
Січ км хе 352 бек стер щі їжи Фр в: Аг су3 сема м тег трах шів баг баг осіу іже туго Чаросеночеє его мар Уаф Те оМді Б) Че
НЕ їде їз
Жекошак іду «Ту ТНК ОБІВ ТНе туго тів Сух дав ау Аж ніх ух во
Мах ОЗ вия
Зегоази ТВгориз чаї азрв зу ГУ Ма Уще ргОа фу ЗВг обу паром ех гі КІН З тн нт тТвгоКух вБго брго сук Бгто йіа пго см сеи ви Ру іх та рим зи с М
КО ЩО ХУ а
Зап маі вВае си Ка ОВО ВгО фУуш БО цу Аве їйгоїви Мекокія черг
З Га) 235 дк ТК Кевін Ууді ТВеосСжв жі Ууді Уді дн уа| ер оні сів Ао
Зм ЗК сут
М шу А ОХ
Мет «1 хи ри «т сх жати віку зах тях дин м ку ха ФК х сяде
БР обі удо Буї Бне дей тТгпотУуК УВІ БВ Бі хв) іш вро НТ АЗИ 75 г тка
Уч Ач аз є щу ях З чрухих - туш ті чи хи «її
А1 гру ТНБ ОБуз вго вка Бім біо бій туго ази бе тнт тує двох 2 55 309 уві заг уві рем те уві зви ВТБ Бій АВ отео ем ом Зіу БУЄ 3
ЗУ ща хіх КВ
ЯУуг бух сСух пух МЩаі Загодяп уп ОАТа еВ Ве АТВОВРО Тія «1 4-3 че БЕ З55 також: Бак обу АЇа Суп Фіу ів ва Ат дів Бгто Фів уді ТК оївг
КО Й 145 АК
ПУХ я шт ау ішн вгОо го чего Ага АБО СІ без тйпгосбуз ап обій Ма Бер бе отне 155 ЗО З р еДДАчННИ зач зо Фев и х зіва ху блуд чн ж. НУ лу сн
Су беу Уві Бу у БНФ що пго бак АЗр ОХ АТ УВО бід теги
ТУ. ен с.
З7О БУД ЗО ет вжи БІ ій БгОо бів АХ АЗИ Ту ма ТВ ОТ вгО го УЩі Кен зх ЗО ЗУ що х они ле рах» жа. вн жи й сти кое пої і км тА деу їх ази Зет аз Зі 5агокмлЕй Кто БУК Баг оїУБ ВН отак о УдДі до
У Кк 7 я і п і р 43їо іх ик з. тик йо ях а з. ха Тех тк й щи з чи Сн
Хег ага тТгвр ців ші Сі дез Уа) не бак Суто вк Уві мех нів ТИ
АТО 425 30 лін фан оніб деп нів Туг ТйК о бів Бу бак ву би меу ик вка хугу
БА яаВ зах
В ал а вач «ис 35 сим МІХ «ійх ВАТ «Кіїх штучна поспудавнасИт ве хек «акію ДОМЕВ хи пегкей язгнишеЮг БІО «ВО зх
Фа 17 Ко ит мо Ті: пожеж ж лк іо шк 15 тету мі
АбвоЇЗЕ де оц Биг обі ж ВгОо шаг чек бе чего дів бйгоУБР іх
3 ї іо ї5 зав Аг мВ) тТвгоХТа тв? Суз ака віз Забій Зебк їв Бек оте тує реє й 30 ївеу Ач тва отуК ів іп іме Ето шіж рух Аїд Бгто їі вве бен тів
І ЗУ 40 5 Й ява оа1в Уві бак об1іу без бір обег БІУ уйТ Бго пирога Бе пев опту 5х ЩЕ ас сіу Заг озфу таб ОоМмія евеочіТ ви те зе ке 5еє вез Зіпойго
ВЗ ТО 75 КО
Зі аеро вне АЇВ тТаготуг Тук Суб сів обіп его отук чего ївРовгОо мех
За Зх тевотйе вв ЗУ бів оЗру ТВговух ма обім іа муз ге тне Уві АТа вже: Де ло
Аза оВгеа швК жа! бе жів бе Бгто бго бек дв шіч дій ге гу ще це | 12 325 ві ївВт АТа дов оуді УВ? бм5 рев ого овни вий Ве ууУк ВгО АК ТИ ша її 11 дів із уаї чів теп оїув Уа! дер АТа вец ій бек фіу дж ат ї4х ООСЕ5О 155 І 150 іа боти бек узі те обін бій оавробогоруз авробеє ТВготекК Чек оце
Іі 170 Туч
УкгоЗаг о твг вец таг озец баг мух дій аАзЗротук віз вуз Ві вух Уві що шо Ко тек Аіа бух шію ма? тає ні біб ціх бев о чвгбозаеб вто ща тв Су ї55 КЕ 205
Заг вве АЗИ Ага іх бій Сух 210 М «Ме 25 сі РІ «й» ЮРЕ «ТІВ» штучна ПОСЛІДОВНЕ СТЬ «КМ «кі» ДОМЕН «803» веткий пинцюг ВЕЙОХ-ї «ще То й . Й Й
АвротТНг УВІ Уві ЖТВгобій сі РКО беє Ра Бик оуді бек рго біу ФУ ї 5 16 15 твгоуаї ТАК рев тТвгосСув ФІУ Сен ак «его шіу зви маі зве отврозає за йх зі ціз туго вро дого тТРО ТуУуЄ БІЙ Пій жЖНе рко обіу бій АВ вгО ка мех
За С 5 ів па ту дя тТВаРОАУй ТВк оАго 5егозеє Ту МА Бго Ар о АР ВВЕ
ЗО з щ дег о біу дат хів фе) О1У Аки БУ» ТВ АТВ о ізнр ТНК Її ткРосіУу дів їх та Т5 55 «і Аїа АБ оАЗА ін Баг АЗИ тТук тут су Аа жа ні Уа зр йгу 85 За ще аврогіє тТгроУді вве оіфу сім сію ТНК Був іно тк Уаі сен Фів Фів 00 зах що
БкО уз АВ ази БКка ТВ мат твг офян рРБеорРО вро Бе бак бі Би
Ма | 150 ЗА бен шіа Аід Ап огУує дів ТЬгбоувги ма! Суб уви 118 ВЗаб о АЗо вве сту? 135 | 135 14О вро біу віз миї Тнг УБТ АїВ ТК ів він дв слу Бак обра мні у з 158 ТУ мн дій шіу Уа! Бій тТегОТВг гру Бгто его їув бій Зеб о Ази Ап обу тТуг 355 їй 25 віз яз зек Бак Туг ін бек оїки ТБг оре біб бій тер обух Я НІХ
Іко Й 100 БЮ, «гц Зег отук Фк су Зіпй маф тб омі бід бі Зеботве УВі бів цу
Кк ще ЕМ
Твг Ома! Аїв веЗ оте Фів Су 21 І
Claims (19)
1. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент, який зв'язується з В7-НЗ людини, де антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент вибирають із будь-якого з наступних моноклональних антитіл або його антигензв'язуючого фрагмента, таких як (1)- (ії): () варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність НСОК, як показано в ЗЕО ІО МО: 10, 11 та 12; і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність Ї СОР, як показано в ЗЕО ІЮО МО: 13, 14 та 15; (ії) варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність НСОК, як показано в ЗЕО ІО МО: 16, 17 та 18; і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла, яка містить послідовність І! СОК, як показано в ЗЕО ІЮО МО: 19, 20 та 21.
2. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, де моноклональне антитіло є рекомбінантним антитілом.
3. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 2, де моноклональне антитіло є людським рекомбінантним антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом.
4. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 3, в якому каркасні послідовності (ЕК) легкого ланцюга і важкого ланцюга варіабельних ділянок людського рекомбінантного антитіла отримані з легкого ланцюга і важкого ланцюга людської зародкової лінії, відповідно, або з їх мутантної послідовності.
5. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 4, де рекомбінантне антитіло людини включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, як показано в ЗЕО ІЮ МО: 6 або 8, або її варіант; яке характеризується тим, що варіант має делецію, заміщення або додавання 1-10 амінокислот у варіабельній ділянці важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 6 або 8.
6. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 4, де рекомбінантне антитіло людини включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІО МО: 7 або 9, або її варіант; яке характеризується тим, що варіант має делецію, заміщення або додавання 1-10 амінокислот у варіабельній ділянці легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 7 або 9.
7. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким одним з пп. 1-6, де антитіло В7-НЗ додатково містить константну ділянку антитіла людини, переважно антитіло В7- НЗ є антитілом повної довжини, яке складається з важкого ланцюга і легкого ланцюга, як показано в ЗЕО ІО МО: 22 і 23, відповідно, або антитілом повної довжини, яке складається з важкого і легкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІЮО МО: 22 і 26, відповідно, або антитілом повної довжини, яке складається з важкого і легкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 24 ї 25, відповідно.
8. Антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким одним з пп. 1-6, в якому фрагмент, який зв'язує антиген, вибраний із групи, яка складається з Бар, Раб, Е (аб)2 і одноланцюгового антитіла (5сЕм), димеризованої М-ділянки (діатіла), дисульфід-стабілізованої М-ділянки (азЕм) і СОК-вмісного пептиду.
9. Фармацевтична композиція, яка включає терапевтично ефективну кількість антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким одним з пп. 1-38 та один або більше фармацевтично прийнятних носіїв, розріджувачів або допоміжних речовин.
10. Молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким одним з пп. 1-8.
11. Рекомбінантний вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 10.
12. Клітина-хазяїн, трансформована рекомбінантним вектором за п. 11, де клітина-хазяїн вибрана із групи, яка складається з прокаріотичної клітини та еукаріотичної клітини, переважно еукаріотичної клітини, більш переважно клітини ссавців або дріжджової клітини.
13. Спосіб отримання антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким одним з пп. 1-8, де спосіб включає: - культивування клітини-хазяїна за п. 12 в культурі для формування та накопичення антитіла В7- НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким одним з пп. 1-8, і - виділення накопиченого антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента з культури.
14. Спосіб імунологічного виявлення або вимірювання В7-НЗ, де спосіб включає стадію виявлення В7-НЗ з використанням антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким одним з пп. 1-8.
15. Реагент для виявлення або вимірювання людського В7-НЗ, де реагент включає антитіло В7- НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким одним з пп. 1-8.
16. Діагностичний реагент для виявлення захворювань, пов'язаних з позитивними клітинами В7- НЗ людини, де діагностичний реагент містить антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким одним з пп. 1-8, при цьому захворювання, пов'язане з позитивними клітинами В7-НЗ людини, являє собою рак.
17. Спосіб діагностики захворювань, пов'язаних з В7-НЗ-позитивними клітинами людини, який включає стадію виявлення або визначення В7-НЗ або В7-НЗ-позитивних клітин за допомогою використання антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким одним з пп. 1-8, при цьому захворювання, пов'язане з позитивними клітинами В7-НЗ людини, являє собою рак.
18. Терапевтичний засіб для лікування захворювань, пов'язаних з позитивними клітинами В7- НЗ, де терапевтичний засіб включає антитіло В7-НЗ або його антигензв'язуючий фрагмент за будь-яким одним з пп. 1-38 або фармацевтичну композицію за п. 9, або молекулу нуклеїнової кислоти за п. 10, при цьому захворювання, пов'язане з позитивними клітинами В7-НЗ людини, являє собою рак.
19. Спосіб лікування захворювань, пов'язаних з В7-НЗ-позитивними клітинами, де спосіб бо включає індукування загибелі В7-НЗ-позитивних клітин з використанням антитіла В7-НЗ або його антигензв'язуючого фрагмента за будь-яким одним із пп. 1-8 або фармацевтичної композиції за п. У, або молекули нуклеїнової кислоти за п. 10, при цьому захворювання, пов'язане з позитивними клітинами В7-НЗ людини, являє собою рак. як ц ж вн ш зв 8 | / /
а 2. / ї о / /
4. ГІ; гл нки, -ї «і «й -й гу й й Се (НИ
Фіг. 1
3. К-я ул з. ли ж Ве Ф п вежтнх СОН: / і я ВТО
| 7. / и -й «й «а і Ж й Коз'іям
Фіг. 2 К- Й / щ 48 Її а ВІТ 8 / Р й і Б Із й / Я Й Й ши й. кп кктед спр жінко Я 5 я -8 -й -й й й й Год вм
Фіг. З т 40004 ре: ж ВІТ 5 ін й я - зх ся е Це ; ЖЕ Е БЕ ! У шк з
5. оо» о п - о З Ку К концентрація гніМ! сріг. 4 Ох - г Каже х Й Язоогном й Гу г -е ВАЖИВ г Ми -е МОЗ їж ОВ ий о осей сни часіхвипини
Фіг. 5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710206261 | 2017-03-31 | ||
| PCT/CN2018/081249 WO2018177393A1 (zh) | 2017-03-31 | 2018-03-30 | B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA125593C2 true UA125593C2 (uk) | 2022-04-27 |
Family
ID=63674249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201910562A UA125593C2 (uk) | 2017-03-31 | 2018-03-30 | Антитіло в7-н3, його антигензв'язуючий фрагмент та його медичне застосування |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10899837B2 (uk) |
| EP (1) | EP3604337A4 (uk) |
| JP (1) | JP7158403B2 (uk) |
| KR (2) | KR102662387B1 (uk) |
| CN (1) | CN109937212B (uk) |
| AU (1) | AU2018243123A1 (uk) |
| BR (1) | BR112019019111A2 (uk) |
| CA (1) | CA3056474A1 (uk) |
| MX (1) | MX2019011117A (uk) |
| RU (1) | RU2765306C2 (uk) |
| TW (1) | TWI796328B (uk) |
| UA (1) | UA125593C2 (uk) |
| WO (1) | WO2018177393A1 (uk) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018177393A1 (zh) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
| CN109963591B (zh) * | 2017-08-04 | 2023-04-04 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途 |
| US10916053B1 (en) | 2019-11-26 | 2021-02-09 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images |
| US11403813B2 (en) | 2019-11-26 | 2022-08-02 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images |
| US11270523B2 (en) | 2017-11-29 | 2022-03-08 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images |
| WO2020018964A1 (en) | 2018-07-20 | 2020-01-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors |
| EP3880712A4 (en) * | 2018-11-16 | 2022-11-16 | Albert Einstein College of Medicine | MONOCLONAL ANTIBODIES TO THE IGV DOMAIN OF B7-H3 AND USES THEREOF |
| CN112969476B (zh) * | 2018-12-07 | 2024-06-14 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 多特异性蛋白分子 |
| US11030801B2 (en) | 2019-05-17 | 2021-06-08 | Standard Cyborg, Inc. | Three-dimensional modeling toolkit |
| US12056820B2 (en) | 2019-05-17 | 2024-08-06 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Three-dimensional modeling toolkit |
| KR20210006637A (ko) * | 2019-07-09 | 2021-01-19 | 주식회사 와이바이오로직스 | B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 |
| EP4039702A1 (en) * | 2019-09-16 | 2022-08-10 | Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-b7-h3 antibody and application thereof |
| MX2022016180A (es) * | 2020-06-26 | 2023-04-20 | Intocell Inc | Conjugados anticuerpo-fármaco que comprenden anticuerpos anti-b7-h3. |
| WO2022170971A1 (zh) | 2021-02-09 | 2022-08-18 | 苏州宜联生物医药有限公司 | 生物活性物偶联物及其制备方法和用途 |
| US20240158505A1 (en) * | 2021-03-26 | 2024-05-16 | Theranotics Co., Ltd. | B7-h3 antibody or antigen-binding fragment thereof, and use thereof |
| CN116178553B (zh) * | 2022-02-25 | 2023-11-17 | 南京蓬勃生物科技有限公司 | 针对人b7-h3的抗体及其变体 |
| WO2023221975A1 (zh) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | 苏州宜联生物医药有限公司 | 包含蛋白降解剂类生物活性化合物的抗体药物偶联物及其制备方法和用途 |
| TW202402808A (zh) * | 2022-05-18 | 2024-01-16 | 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 | 抗-b7h3抗體及其用途 |
| WO2024106939A1 (ko) * | 2022-11-15 | 2024-05-23 | 주식회사 셀랩메드 | B7-h3에 특이적으로 결합하는 항체 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US20050002935A1 (en) * | 2003-04-17 | 2005-01-06 | Vincent Ling | Use of B7-H3 as an immunoregulatory agent |
| CN101104639A (zh) * | 2006-07-10 | 2008-01-16 | 苏州大学 | 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用 |
| CA2668800A1 (en) | 2006-11-08 | 2008-06-05 | Macrogenics West, Inc. | Tes7 and antibodies that bind thereto |
| US20100203035A1 (en) | 2007-02-14 | 2010-08-12 | Kwon Eugene D | B7-h3 in cancer |
| WO2010096734A2 (en) | 2009-02-20 | 2010-08-26 | John Wayne Cancer Institute | B7-h3 antibody coupled bead assay for isolation and detection of circulating tumor cells in body fluids of melanoma and breast cancer patients |
| US8802091B2 (en) * | 2010-03-04 | 2014-08-12 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof |
| CN106279416B (zh) * | 2010-03-04 | 2019-08-30 | 宏观基因有限公司 | 与b7-h3反应性的抗体、其免疫学活性片段及其用途 |
| RU2668170C2 (ru) | 2011-04-25 | 2018-09-26 | Дайити Санкио Компани, Лимитед | Анти-в7-н3-антитело |
| WO2014160627A1 (en) | 2013-03-25 | 2014-10-02 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors |
| JP6636016B2 (ja) | 2014-05-29 | 2020-01-29 | スプリング バイオサイエンス コーポレーション | 抗ｂ７−ｈ３抗体及びその診断用途 |
| KR102485788B1 (ko) | 2014-08-27 | 2023-01-09 | 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 | 항체, 조성물 및 용도 |
| CA2961609C (en) | 2014-09-17 | 2023-03-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd276 antibodies (b7h3) |
| WO2018177393A1 (zh) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
-
2018
- 2018-03-30 WO PCT/CN2018/081249 patent/WO2018177393A1/zh active Application Filing
- 2018-03-30 TW TW107111275A patent/TWI796328B/zh active
- 2018-03-30 JP JP2019552850A patent/JP7158403B2/ja active Active
- 2018-03-30 BR BR112019019111A patent/BR112019019111A2/pt unknown
- 2018-03-30 US US16/497,687 patent/US10899837B2/en active Active
- 2018-03-30 RU RU2019132843A patent/RU2765306C2/ru active
- 2018-03-30 AU AU2018243123A patent/AU2018243123A1/en active Pending
- 2018-03-30 UA UAA201910562A patent/UA125593C2/uk unknown
- 2018-03-30 CA CA3056474A patent/CA3056474A1/en active Pending
- 2018-03-30 MX MX2019011117A patent/MX2019011117A/es unknown
- 2018-03-30 CN CN201880004340.8A patent/CN109937212B/zh active Active
- 2018-03-30 KR KR1020197027386A patent/KR102662387B1/ko active IP Right Grant
- 2018-03-30 EP EP18776535.9A patent/EP3604337A4/en active Pending
- 2018-03-30 KR KR1020247013811A patent/KR20240063177A/ko active Application Filing
-
2020
- 2020-12-15 US US17/121,893 patent/US11680100B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018177393A1 (zh) | 2018-10-04 |
| US10899837B2 (en) | 2021-01-26 |
| KR20190134614A (ko) | 2019-12-04 |
| JP2020515251A (ja) | 2020-05-28 |
| CN109937212B (zh) | 2022-06-21 |
| RU2765306C2 (ru) | 2022-01-28 |
| KR102662387B1 (ko) | 2024-04-29 |
| CN109937212A (zh) | 2019-06-25 |
| EP3604337A1 (en) | 2020-02-05 |
| US20210101984A1 (en) | 2021-04-08 |
| RU2019132843A (ru) | 2021-04-30 |
| US20200031934A1 (en) | 2020-01-30 |
| TW201837056A (zh) | 2018-10-16 |
| AU2018243123A1 (en) | 2019-09-26 |
| US11680100B2 (en) | 2023-06-20 |
| RU2019132843A3 (uk) | 2021-08-16 |
| JP7158403B2 (ja) | 2022-10-21 |
| MX2019011117A (es) | 2019-11-05 |
| KR20240063177A (ko) | 2024-05-09 |
| BR112019019111A2 (pt) | 2020-05-05 |
| EP3604337A4 (en) | 2021-03-10 |
| CA3056474A1 (en) | 2018-10-04 |
| TWI796328B (zh) | 2023-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA125593C2 (uk) | Антитіло в7-н3, його антигензв'язуючий фрагмент та його медичне застосування | |
| EP1623997B1 (en) | Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours | |
| AU2009245587B2 (en) | Novel antibodies used to treat cancer | |
| EA022759B1 (ru) | Связывающие элементы для пептида c5a с высоким ингибирующим действием | |
| UA117446C2 (uk) | Гуманізоване антитіло до cxcr5 | |
| UA75393C2 (en) | Chimeric monoclonal antibody, identifying gangliosides containing n-glycolyl sialic acid, cells line producing it and pharmaceutical compositions containing it | |
| CN109983032B (zh) | Tim-3抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| CN106999576A (zh) | 癌细胞特异性抗体、抗癌剂、及癌症的检查方法 | |
| CN114773473B (zh) | 抗cd39抗体及其制备方法和用途 | |
| KR20120051603A (ko) | 항카드헤린 항체 | |
| CN116847864A (zh) | 治疗剂和诊断剂以及其用途 | |
| KR20230017778A (ko) | 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-vsig4 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도 | |
| KR20110005887A (ko) | 세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도 | |
| KR20220042055A (ko) | 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-psgl-1 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도 | |
| KR101309485B1 (ko) | 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 | |
| CN117999284A (zh) | 靶向tigit的单克隆抗体 | |
| CN115260306A (zh) | 靶向SARS-CoV-2受体结合基序的单克隆抗体及其识别抗原表位和应用 | |
| US20220185911A1 (en) | Therapeutic antibodies for treating lung cancer | |
| KR101309386B1 (ko) | 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 | |
| JP4470146B2 (ja) | 軟骨型フィブロネクチンの検出方法、該方法を用いる軟骨腫瘍検出方法、抗軟骨型ｆｎモノクローナル抗体、及び該抗体を産生するハイブリドーマ | |
| US20120184719A1 (en) | Hybridoma producing anti-methylated dna antibody and utilization of same | |
| CN117285621A (zh) | 靶向sars-cov-2 s蛋白的抗原结合蛋白及其应用 | |
| WO2007142276A1 (ja) | 分泌型ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子の測定方法 | |
| CN118324916A (zh) | 一种抗人gprc5d的单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| CN113683686A (zh) | 抗新冠病毒中和性单克隆抗体的制备和应用 |