WO2007142276A1 - 分泌型ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子の測定方法 - Google Patents

分泌型ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子の測定方法 Download PDF

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WO2007142276A1
WO2007142276A1 PCT/JP2007/061486 JP2007061486W WO2007142276A1 WO 2007142276 A1 WO2007142276 A1 WO 2007142276A1 JP 2007061486 W JP2007061486 W JP 2007061486W WO 2007142276 A1 WO2007142276 A1 WO 2007142276A1
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egf
monoclonal antibody
antibody
secretory
binds
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PCT/JP2007/061486
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Eisuke Mekada
Ryo Iwamoto
Shingo Miyamoto
Kenya Shitara
Akiko Furuya
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Osaka University
Fukuoka University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a secreted heparin binding epidermal growth factor-like growth factor (hereinafter referred to as HB-EGF).
  • HB-EGF heparin binding epidermal growth factor-like growth factor
  • HB-EGF was purified and isolated from the culture supernatant of human macrophage-like cell line U-937 in 1992 by Higashiyama et al., And cDNA was cloned (Non-patent Document 1).
  • HB-EGF shares the six cysteines that are conserved in the EGF family, belongs to the EGF family, binds to EGFR (ErbBl) and ErbB4, fibroblasts (BALB3T3), smooth muscle cells (Bovine aorti c smooth muscle cells) And has a proliferation promoting activity against keratinocytes.
  • Membrane-type HB-EGF is not only a precursor of secretory HB-EGF, but also membrane-type HB-EGF itself has biological activity! Reported that it is involved in the entry of diphtheria toxin into cells (Non-patent Document 2).
  • HB-EGF knockout mice Produced HB-EGF knockout (KO) mice and analyzed the physiological functions of HB-EGF (Non-patent Document 3).
  • HB-EGF KO mice showed ventricular dilatation, decreased cardiac function, and heart valve hypertrophy, and more than half died within a few days after birth. This indicates that HB-EG F is an essential protein for cardiac development and functional maintenance.
  • HB-EGF HBuc
  • HBAtm HB-E GF
  • keratinocyte hyperplasia occurred in HBAtm-expressing mice, and abnormalities were also observed in the heart. Therefore, conversion of HB-EG F to membrane-type secretory form is essential for the expression of physiological functions of HB-EGF. For normal function expression, this conversion process must be strictly controlled in the body. is important.
  • Non-Patent Documents 5 to 8 So far, high expression of HB-EGF has been reported in various cancers such as breast cancer, liver cancer, knee cancer, and bladder cancer. It has also been reported that HB-EGF is an important factor for cancer growth (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • Mikada et al. Is a model system for transplanting human ovarian cancer cell lines into nude mice, and is the ability to introduce RNA interference (RNAi) of HB-EGF into cell lines, or a specific inhibitor of HB-EGF. It was shown that administration of the diphtheria toxin mutant CRM197 to cell line transplanted mice showed a remarkable tumor growth inhibitory effect.
  • HB-EGF Showed increased proliferation rate, increased colony-forming ability, increased VEGF expression, increased CyclinDl expression, etc. in vitro when the HB-EGF gene was introduced into a bladder cancer cell line. Reported increased tumorigenicity and tumor angiogenesis. Such changes are observed only when the membrane-type HB-EGF or secretory HB-EGF gene is expressed, and when the protease-resistant membrane-type HB-EGF gene is forcibly expressed, it is not recognized. I got it. Therefore, it was suggested that secreted HB-EGF may be an important factor related to tumor growth in ovarian cancer and bladder cancer. Regarding the expression of HB-EGF in clinical specimens, Mekada et al.
  • Non-patent Document 11 Showed that only HB-EGF of the EGF family was upregulated in cancer tissues and ascites of ovarian cancer patients, and low expression in patients with high HB-EGF expression. Reported a poorer prognosis than other patients (Non-patent Document 11). As described above, particularly in ovarian cancer, secretory HB-EGF is involved in cancer growth by the autocrine or paracrine mechanism.
  • HB-EGF has been reported to be involved in diseases such as cardiac hypertrophy, smooth muscle hyperplasia, and pulmonary hypertension (Non-Patent Documents 12 to 14).
  • Non-patent Document 9 Quantified the concentration of HB-EGF in the ascites of ovarian cancer patients using a non-conjugated carrier and radiolabeled diphtheria toxin. So far, polyclonal antibodies (manufactured by R & D) and one kind of monoclonal antibodies (manufactured by R & D) have been known as anti-HB-EGF antibodies reactive to secretory HB-EGF.
  • Non-Patent Document 1 Science, Vol. 251, 936, 1991
  • Non-Patent Document 2 Cell, Vol. 69, 1051, 1992
  • Non-Patent Document 3 PNAS, Vol. 100, 3221, 2003
  • Non-Patent Document 4 of Cell Biology, Vol. 163, 469, 2004
  • Non-Patent Document 5 Breast Cancer Res. Treat., Vol. 67, 81, 2001
  • Non-Patent Document 6 Oncol. Rep., Vol. 8, 903, 2001
  • Non-patent literature 7 Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 202, 1705, 1994
  • Non-patent literature 8 Cancer Research, Vol. 61, 6227, 2001
  • Non-Patent Document 9 Cancer Research, Vol. 64, 5720, 2004
  • Non-Patent Document 10 Cancer Research, Vol. 64, 5283, 2004
  • Non-Patent Document 11 Clin Cancer Res, Vol. 11, 4783, 2005
  • Non-Patent Document 12 Nat. Med., Vol. 8, 35, 2002
  • Non-Patent Document 13 Clin. Invest., 95, 404, 1995
  • Non-Patent Document 14 Nat. Med., 8, 41, 2002
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring secretory HB-EGF, which can be easily and rapidly measured.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • secretory HB-EGF Two types of monoclonal antibodies or antibody fragments that bind to different epidermal growth factor-like growth factor-like growth factors (hereinafter referred to as secretory HB-EGF).
  • a method for measuring secretory HB-EGF comprising using
  • a secretory HB-EGF-containing test solution is bound with a monoclonal antibody that binds to secretory HB-EGF (hereinafter referred to as anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A) or an antibody fragment thereof.
  • a monoclonal antibody that binds to secretory HB-EGF hereinafter referred to as anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A
  • a monoclonal antibody that binds to a secretory HB-EGF epitope different from the above (hereinafter referred to as anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody B) or its antibody fragment was subjected to an immunoreaction
  • a method for measuring secretory HB-EGF in the test liquid which comprises measuring a label.
  • a kit for measuring secretory HB-EGF comprising two types of monoclonal antibodies or antibody fragments that bind to different epitopes of secreted HB-EGF.
  • a simple and rapid measurement characterized by using two types of monoclonal antibodies that react with secreted HB-EGF and different epitopes of secreted HB-EGF. It is possible to provide a method for measuring secretory HB-EGF in a test solution.
  • FIG. 1 shows the reactivity of various anti-HB-EGF antibodies in a nodding ELISA.
  • the upper panel shows the reactivity of various antibodies to the HB-EGF-immobilized plate, and the lower panel shows the reactivity of various antibodies to the BSA-immobilized plate.
  • the horizontal axis represents the concentration of each antibody, and the vertical axis represents the binding activity of each antibody.
  • ⁇ represents monoclonal antibody KM511, country represents monoclonal antibody KM3566, ⁇ represents monoclonal antibody KM3567, mouth represents monoclonal antibody KM3579, ⁇ represents monoclonal antibody KM3580, and ⁇ represents monoclonal antibody KM3841.
  • FIG. 2 shows standard curves of HB-EGF in sandwich ELISA using various anti-HB-EGF antibodies.
  • the horizontal axis shows the HB-EGF concentration, and the vertical axis shows the OD415 value.
  • the country is a combination of the monoclonal antibody KM3566 and the biotin-labeled monoclonal antibody KM3579;
  • the combination of antibody KM3567 and piotin-labeled monoclonal antibody K M3580, and ⁇ represent the combination of monoclonal antibody KM3841 and piotin-labeled monoclonal antibody KM3580, respectively.
  • the country is a combination of monoclonal antibody KM 3579 and iotin-labeled monoclonal antibody KM3566;
  • the combination of antibody KM3580 and piotin-labeled monoclonal antibody KM3567, and ⁇ represents the combination of monoclonal antibody KM3580 and piotin-labeled monoclonal antibody KM3841.
  • the present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the examples are merely illustrative of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
  • HB-EGF is a growth factor of the EGF family, and includes membrane type HB-EGF, secretory type HB-EGF, and the like.
  • Secreted HB-EGF is a signal sequence, pro region, heparin-binding domain, EGF-like domain, jackstamen brand main, transmembrane domain, or cytoplasmic domain that constitutes membrane HB-EGF.
  • HB-EGF with an extracellular domain containing an EGF-like domain released by HB-EGF has the activity of binding to diphtheria toxin or EGF receptor ErbBl.
  • Examples of the secretory HB-EGF include the following proteins (a), (b), and (c).
  • (c) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3, and having an activity of binding to the EGF receptor ErbBl;
  • a protein that has an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, replaced, inserted, and / or added, and that binds to the EGF receptor ErbBl is: Molecular 'Crowing 2nd Edition, Current'Protocols' In 'Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Procedurals'National' Academic 'Science ' US (p roc . Natl. Acad. Sci.) USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (198 5), etc.
  • a protein that can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited. However, deletion, substitution, Or it is a number which can be added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3 and having an activity of binding to the EGF receptor ErbBl is SEQ ID NO: 1, At least 80% or more, preferably 85% or more, with a protein having the amino acid sequence described in 2 or 3; More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more, and a protein having an activity to bind to the EGF receptor ErbBl. .
  • the homology value is a value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, and the base sequence is BLAST [Journal's ⁇ Biology (J. Mol. Biol), 215, 403 (1990)], the numerical values calculated using default parameters.
  • BLAST2 Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997)]; Genome Res., 7, Ri 49 (1997); http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLA3 ⁇ 4i, info / infomation3.html]! /, and numerical values calculated using default parameters.
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, amino acid sequence d 1 for-, q, penalty for nucleotide mismatch) force 3, 1 for r (reward for nucleo tide match), 10 for e (expect value) force, 11 for W (wordsize) base sequence 3 for amino acid residues, 20 if -y (Dropoff (X) for blast extemsions in bits) is blastn, 25 for programs other than blastn (http: ⁇ www.ncbi.nlm. nih.gov/blast cgihelp.html) o Also, FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)] and the like can be cited as amino acid sequence analysis software.
  • the method for measuring secretory HB-EGF of the present invention includes an immunological measurement method characterized by using two types of monoclonal antibodies or antibody fragments thereof that bind to different epitopes.
  • antigen-antibody reactions such as immunoassay method, immunoblotting method, agglutination reaction, complement binding reaction, hemolysis reaction, precipitation reaction, colloidal gold method, chromatography method, immunostaining method were used. Any method can be used, but the Imnoasse method is preferred.
  • the immunoassay method is a method for detecting or quantifying an antibody or an antigen using an antigen or an antibody to which various labels have been applied.
  • a radioimmunodetection method RIA
  • an enzyme Immunodetection methods ⁇ or ELISA
  • fluorescent immunodetection methods FIA
  • Powers such as photoimmunodetection (luminescent immunoassay), physicochemical detection (TIA, LAPIA, PCIA), flow cytometry, etc.
  • enzyme immunodetection is used.
  • any known radioisotope edited by Koji Ishikawa et al., Enzyme Immunoassay, Medical School
  • 32P, 1251, 1311, etc. can be used.
  • any known enzyme edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School
  • any known enzyme edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School
  • alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase and the like can be used.
  • the enzyme immunoassay measures and detects by measuring the substance produced by the action of the enzyme, but the method and production of measuring the absorbance of a substance having an absorption maximum in the ultraviolet or visible part.
  • Various measurement methods can be used, such as a method of measuring the fluorescence intensity of the produced fluorescent material and a method of measuring the emission intensity of the produced material.
  • a substrate for alkaline phosphatase that generates a substance having an absorption maximum in the ultraviolet or visible region by alkaline phosphatase action is, for example, 4--trophelin. An acid etc. are mentioned.
  • 4— -Trophenol phosphate is converted to 4—-trophenol by alkaline phosphatase.
  • alkaline phosphatase substrate that generates luminescence by the action of alkaline phosphatase, for example, 3- (2'-spiroadamantane) 4-methoxy-1- (3'-phosphoryloxin) fere- 1, 2 Dioxetane 'disodium salt (AMPPD), 2 Black mouth 1-5— ⁇ 4—Metoxispiro [1, 2 Dioxetane 1 3, 2, 1 (5, Black mouth) tricyclo [3. 3.
  • Decane] 4—yl ⁇ Phenol phosphate 'Nisodium salt (CDP—StarTM), 3 — ⁇ 4-Methoxyspiro [1, 2 Dioxetane 1, 3, 2, 1 (5, 1-n) tricyclo [ 3. 3. 13, 7] Decane] — 4-yl ⁇ Phenol phosphate 'Disodium salt (CSPDTM), [10-Methyl-9 (10 H) -Ataridi-luiden] phenoxymethyl phosphate' And disodium salt (LumigenTMAPS 5).
  • the enzyme cycling reaction reagent AmpliQ containing NADPH which is a substrate for alkaline phosphatase, is used as a reagent to produce pigments by the action of alkaline phosphatase. (Manufactured by Dako).
  • any known luminescent material [Imai Kazuhiro, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Laboratory 42 (1998)] can be used.
  • atelidum esters, mouth fins and the like can be used.
  • any known fluorescence can be used.
  • a measurement method in the immunoassay method there are a competitive method, a sandwich method [Immunology Illustrated 5th Edition (Nankodo)], etc., preferably a sandwich method.
  • the target substance and the first antibody (antisecretory HB-EGF monoclonal antibody A) in the test solution bound by the antigen-antibody reaction are added to the second antibody (antisecretory HB-EGF monoclonal antibody B).
  • the target substance in the test solution is detected or quantified with separate antibodies. In many cases, it includes a step of washing non-reactive sample components and measurement system components in the test solution during the measurement operation.
  • a test solution containing secretory HB-EGF can be transferred to a solid phase to which a monoclonal antibody that binds to secretory HB-EGF (hereinafter referred to as anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A) or an antibody fragment thereof is bound.
  • a secretory HB-EGF that is different from the anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A labeled with the solid phase by binding the monoclonal antibody or antibody fragment thereof in the solid phase to the secreted HB-EGF.
  • a monoclonal antibody (hereinafter referred to as anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody B) or an antibody fragment thereof is added to perform an immunoreaction, and the label in the solid phase is measured.
  • An example is a method for measuring secretory HB-EGF in a test solution.
  • the test solution to be measured is brought into contact with the first antibody.
  • Non-reacted sample components in the test solution are washed and removed from the reaction system, and then the second antibody (to the complex of the target substance and the first antibody in the test solution bound by the antigen-antibody reaction is added.
  • Anti-secretory HB-E GF monoclonal antibody B (or its antibody fragment) reacts and participates in the reaction in the measurement system. This is a method for detecting or quantifying the target substance in the test solution present in the reaction system after washing away the components such as the second antibody that have not been removed.
  • a secretory type is prepared by shaping various polymer materials to suit the application.
  • a monoclonal antibody or antibody fragment thereof that binds to HB-EGF is used in solid phase.
  • Shapes are tubes, beads, plates, fine particles such as latex, sticks, etc., and materials are polystyrene, polycarbonate, polybutene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymetatalylate, gelatin, agarose, cellulose, polyethylene terephthalate.
  • Polymer materials such as glass, ceramics and metals.
  • a method for immobilizing a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that binds to secretory HB-EGF it can be prepared by a known method such as a physical method and a chemical method, or a combination thereof.
  • a 96-well polystyrene immunoassay microterplate with a monoclonal antibody that binds to secretory HB-EGF, etc., on a hydrophobic solid phase can be mentioned.
  • the reaction buffer used in the sandwich method should provide a solvent environment for the binding reaction between the antibody immobilized antibody solid phase monoclonal antibody or its antibody fragment and the antigen in the test solution. Any of these may be used, including surfactants, buffers, proteins such as BSA and casein, preservatives, stabilizers, and reaction accelerators.
  • the cleaning solution used in the sandwich method includes buffering agents such as Tris phosphate tris (trishydroxymethylamino methane), Good Buffers such as HEPES and MOPS, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Surfactants such as Triton TMX-705, salts such as NaCl, KC1 and ammonium sulfate, proteins such as BSA and casein, preservatives such as sodium azide, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl dodecyl Examples thereof include a liquid containing at least one of a modifying agent such as sulfate and a stabilizing agent such as polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, dextran sulfate, and chondroitin sulfate.
  • buffering agents such as Tris phosphate tris (trishydroxymethylamino methane), Good Buffers such as HEPES and MOPS, Tween 20, Tween 40, Tween 60
  • Tween PBS composed of 0.1 mmol / L sodium chloride, 0.05% Tween 20 and pH 7.4 10 mmol / L phosphate buffer, 0.15 mol ZL sodium chloride, 0.05% Tween 20 and pH 7 4 Tween TB consisting of 10 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.4) s.
  • the labeled secondary antibody or antibody fragment thereof used in the sandwich method includes a monoclonal antibody that binds to a secreted HB-EGF epitope different from the primary antibody, such as horse radish peroxidase (HRP), Examples include small intestine alkaline phosphatase and labeling enzymes such as 13 galactosidase, buffer, protein such as BSA and casein, and preservatives.
  • HRP horse radish peroxidase
  • Examples include small intestine alkaline phosphatase and labeling enzymes such as 13 galactosidase, buffer, protein such as BSA and casein, and preservatives.
  • a reagent for detecting a label used in the sandwich method for example, horseradish rust peroxidase, a substrate for absorbance measurement such as tetramethylbenzidine or orthophenyldiamine, Hydroxyphenyl hydroxyphenylpropionate Fluorescent substrate such as hydroxyphenylacetic acid, luminous substrate power such as luminol Alkaline phosphatase, 4-fluorophenyl phosphate and other absorbance measurement substrate, 4-methyl Examples thereof include fluorescent substrates such as umbelliferyl phosphate.
  • an antibody used in the method for measuring secretory HB-EGF in the sample of the present invention two monoclonal antibodies that react with different epitopes of secreted HB-EGF can be used.
  • Use antibody fragments such as Fab, Fab ', F (ab)
  • the above-mentioned antisecretory HB-EGF monoclonal antibody A is adsorbed and immobilized on the surface of an appropriate immobilization carrier.
  • the anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A is immobilized by, for example, diluting the antibody in an appropriate buffer solution such as a phosphate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution, etc. And reacting at 4 to 37 ° C for 30 minutes or more.
  • the protein binding ability on the surface of the fixed carrier is blocked.
  • free binding groups on the surface of a fixed carrier are contacted with a blocking buffer.
  • blocking buffer for example, a buffer containing 1-10% ushi serum albumin, 10-30% Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products), for example, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer Liquid etc.
  • the blocking treatment can be performed by reacting at 4 to 37 ° C for 30 minutes or more.
  • test solution may be diluted with a buffer containing a protein such as 0.01 to 1% urine serum albumin, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, etc. Good.
  • test solution is not limited as long as it contains secretory HB-EGF such as blood, plasma, serum, spleen, urine, stool, tissue fluid, and culture fluid!
  • secretory HB-EGF such as blood, plasma, serum, spleen, urine, stool, tissue fluid, and culture fluid
  • a buffer containing a surfactant such as T W een20 optionally phosphate buffer
  • a surfactant such as T W een20 optionally phosphate buffer
  • phosphate buffer for example, borate buffer, washed several times with carbonate buffer and the like.
  • the secretory HB-EGF present in the test solution specifically binds to the pre-fixed anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A, thereby anti-secretory HB-EGF. It is fixed to a fixed carrier via F monoclonal antibody A.
  • the carrier on which secretory HB-EGF is immobilized is used as an antisecretory HB-EGF monoclonal antibody (antisecretory HB — EGF monoclonal antibody B), which is different from antisecretory HB-EGF monoclonal antibody A and epitope.
  • antisecretory HB-EGF monoclonal antibody B which is different from antisecretory HB-EGF monoclonal antibody A and epitope.
  • Contact with a solution containing The antisecretory HB-EGF monoclonal antibody B can be labeled in advance with the aforementioned label as required.
  • buffer containing a surfactant such as T W een20 optionally, for example, phosphate buffer, borate buffer, Wash the carrier several times with carbonate buffer or the like.
  • a surfactant such as T W een20
  • the anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody B is preliminarily bound and binds to the fixed carrier via the anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A and secretory HB-EGF.
  • the binding amount of HB-EGF monoclonal antibody B reflects the amount of secreted HB-EGF in the biological sample.
  • the antisecretory HB-EGF monoclonal antibody B immobilized as described above can be measured according to the label of the antisecretory HB-EGF monoclonal antibody B.
  • the label of the antibody can be measured as described above.
  • the amount of bound secondary antibody can be measured, a standard curve can be prepared using a standard substance, and the amount of secreted HB-EGF in the test solution can be measured.
  • a calibration curve is obtained by preparing a solution containing secreted HB-EGF whose concentration is known as a standard substance in several stages and performing the above-described sandwich method together with the test solution. It is out.
  • secretory HB-EGF is increased. Patients with advanced disease can also be examined.
  • Diseases in which secretory HB-EGF is increased include cancer, heart disease, arteriosclerosis and the like.
  • a method for examining a disease patient whose secreted HB-EGF is enhanced for example, it can be performed as follows.
  • the secretory HB-EGF in the healthy subject's living body is quantified in advance using the biological sample from which the vitality of a plurality of healthy subjects is also collected.
  • the disease is a secretory HB-EGF-related disease.
  • the prognosis of a disease patient whose secreted HB-EGF is enhanced can be examined.
  • a disease in which secretory HB-EGF is enhanced can be examined by the following method.
  • a biological sample of a patient is periodically collected, and secreted HB-EGF in the biological sample is measured by the method for measuring secreted HB-EGF of the present invention. If the amount of secreted HB-EGF is increased compared to the previous time, it can be determined that the patient's condition is worse.
  • a drug for administration to patients with various diseases can be selected using the measurement method of the present invention.
  • a drug to be administered to a patient with a disease in which secretory HB-EGF is enhanced can be selected by the following method.
  • Biological samples of patients who are regularly administered with various drugs are collected, and the secretory HB-EGF is measured by the method of the present invention. If the amount of secreted HB-EGF is increased compared to the previous time, it can be determined that the drug administered to the patient has an effect on the patient.
  • kits of the present invention a force constituted by a combination of instruments or reagents, as long as it contains a substance that is essentially the same as each component described below or essentially the same as a part thereof.
  • Reagents include anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A or an antibody fragment thereof and labeled secretory HB-EGF monoclonal antibody B or an antibody fragment thereof. If necessary, a diluted solution of the test solution, antibody immobilization Also included are immobilized solid phase, reaction buffer solution, washing solution, reagent for detecting a labeled product, and standard substances such as secretory HB-EGF.
  • Examples of the diluted solution of the test solution include an aqueous solution containing a protein such as BSA or casein in a surfactant or buffer.
  • a monoclonal antibody that binds to secretory HB-EGF is immobilized on a material that has been shaped to suit the application. Phased ones are used. Shapes are tubes, beads, plates, fine particles such as latex, stick strength etc. Polystyrene, polycarbonate, polybulutoluene, polypropylene, polyethylene, polychlorinated bulu, nylon, polymetatalylate, gelatin, agarose, cellulose And polymer materials such as polyethylene terephthalate, glass, ceramics and metals.
  • a method for immobilizing monoclonal antibody A that binds to secretory HB-EGF it can be prepared by a known method such as a physical method and a chemical method, or a combination thereof.
  • a 96-well immunoassay microterplate made of polystyrene is prepared by immobilizing monoclonal antibody A or the like that binds to secretory HB-EGF on a hydrophobic solid phase.
  • the reaction buffer is not particularly limited as long as it provides a solvent environment for the binding reaction between the antibody-immobilized solid-phase anti-secretory monoclonal antibody A and the antigen in the biological sample. , Surfactants, buffers, proteins such as BSA and casein, preservatives, stabilizers, reaction accelerators and the like.
  • the cleaning solution includes Tris (trishydroxymethylaminomethane) phosphate, buffers such as Good Buffers such as HEPES and MOPS, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Triton TMX— Surfactants such as 705, salts such as NaCl, KC1 and ammonium sulfate, proteins such as BSA and casein, preservatives such as sodium azide, denaturation such as guanidine hydrochloride and urea dodecyl sulfate Liquids containing at least one stabilizer such as an agent, polyethylene dallicol, carboxymethylcellulose, dextran sulfate, chondroitin sulfate.
  • buffers such as Good Buffers such as HEPES and MOPS
  • Tween 20 Tween 40, Tween 60, Tween 80
  • Triton TMX— Surfactants such as 705, salts such as NaCl, KC1 and ammonium
  • Tween PBS consisting of 0.05% Tween 20 and pH 7.4 10mmol / L phosphate buffer, 0.15mol / L sodium chloride, 0.05m Tween 20 and pH 7.4 10mmol / L
  • Tween TBS which has Tris monohydrochloride buffer (pH7.4).
  • the labeled anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody B or an antibody fragment thereof may be a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that binds to a secreted HB-EGF epitope different from the anti-secretory HB-EGF monoclonal antibody A.
  • Labeled enzymes such as horse radish peroxidase (HRP), urinary intestinal alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, etc., buffers, proteins such as BSA and casein, and preservatives are used.
  • the labeling enzyme as a reagent for detecting the labeled body, for example, horseradish rust peroxidase, a substrate for absorption measurement such as tetramethylbenzidine and ortho-dienediamine, hydroxyphenol hydroxyphenol- Luminescent substrate such as lupropionate hydroxyphenolacetate, luminescent substrate such as luminol Alkaline phosphatase, absorbance substrate such as 4-trophophosphate, fluorescent substrate such as 4-methylumbelliferyl phosphate Etc.
  • a substrate for absorption measurement such as tetramethylbenzidine and ortho-dienediamine
  • hydroxyphenol hydroxyphenol- Luminescent substrate such as lupropionate hydroxyphenolacetate
  • luminescent substrate such as luminol Alkaline phosphatase
  • absorbance substrate such as 4-trophophosphate
  • fluorescent substrate such as 4-methylumbelliferyl phosphate Etc.
  • Examples of the standard substance include secretory HB-EGF described in SEQ ID NO: 1, peptides containing two types of antibody epitopes used in the kit, and the like.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that binds to an epitope bound by a monoclonal antibody produced by Hypridoma KM3580 (FERM BP-10574), and an epitope that binds to a monoclonal antibody produced by Hypridoma KM3841 (FERM BP-10575). It relates to monoclonal antibodies and their antibody fragments that bind to topes.
  • Monoclonal antibodies and antibody fragments used in the present invention can be produced by known monoclonal antibody production methods.
  • Antigens include cDNA encoding secreted HB-EGF or partial fragments thereof Examples include secreted HB-EGF or partial fragments thereof obtained by introducing an expression vector into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like. It is also possible to purify secretory HB-EGF from various human tumor cultured cells or human tissues that express a large amount of secreted HB-EGF. Furthermore, a synthetic peptide having a secretory HB-EGF partial sequence can be prepared and used as an antigen.
  • the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention includes Molecular loning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Pres s (1989) and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley. Using the method described in & Sons (1987-1997), etc., the DNA encoding the same can be expressed in the host cell and produced by the following method, for example.
  • a full-length cDNA is inserted downstream of a promoter of an appropriate expression vector to prepare a recombinant vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding secreted HB-EGF or a partial fragment thereof is prepared based on the full-length cDNA, and the DNA is replaced with the above-mentioned full-length cDNA. Fragments may be used.
  • the recombinant vector is introduced into a host cell suitable for the expression vector, thereby producing a secreted HB.
  • any strain can be used as long as it can express the target gene, such as Escherichia coli and animal cells.
  • the expression vector contains an appropriate promoter at a position where it can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome and can transcribe the DNA encoding secreted HB-EGF or a partial fragment thereof. Is used.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention is not a prokaryotic organism.
  • the vector preferably contains a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA used in the present invention, and a transcription termination sequence.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTacl, and pBTac2 (all of which are Roche Diagnos tics), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYPIO (JP-A 58-110600), pKYP200 [A gricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 2 77 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • coli IGKA2 (FERM BP-6798), JP 60-221091], pTerm2 (US4686191, US4939094, US516 0735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [j. BacterioL, 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pME18SFL3, and the like.
  • the promoter may be any as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be mentioned.
  • artificially modified promoters such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, let I promoter, etc. in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Shine 'Dalgarno which is a ribosome binding sequence is used.
  • a plasmid in which the distance between the sequence and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention can be substituted so as to be an optimal codon for expression in the host.
  • the production rate of the target secretory H B-EGF or a partial fragment thereof can be improved.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for gene expression in the above recombinant vector, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli XL1-Blue, Otsuki Koji XL2-Blue, large-donated DH1, large-donated fungus MC1000, large-donated fungus KY3276, large-donated fungus W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, etc. Can be mentioned.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli XL1-Blue, Otsuki Koji XL2-Blue, large-donated DH1, large-donated fungus MC1000, large-donated fungus KY3276, large-donated fungus W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], Gene, 17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • examples of expression vectors include pcDNAU pc DM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3— 3 (JP-A-2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 13 07 (1987) )], PAGE210, pME18SFL3, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene promoter, early sv40 Examples include promoters, retrovirus promoters, metallotine promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • the enhancer of IE gene of human CMV may be used with a promoter.
  • any method for introducing the recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9) 2-227075
  • ribofusion method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
  • gene expression methods include secretion production, fusion protein, and the like according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989). Expression or the like can be performed.
  • secretory HB-EGF or a partial fragment thereof with a sugar or sugar chain added can be obtained.
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, and the secretory HB-E GF or a partial fragment thereof is produced and accumulated in the culture, and is collected from the culture. Type HB-EGF or partial fragments thereof can be produced.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be carried out according to a usual method used for host culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside or the like is used for culturing a microorganism transformed with a recombinant vector using the trp promoter. Etc. may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained by using animal cells as a host a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [V irology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or A medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums can be used.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% C02.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, an animal cell, or the like having a recombinant vector incorporating a DNA encoding the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention is usually used.
  • the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention is obtained by culturing according to the culture method of (2) above, producing and accumulating the secreted HB-EGF or a partial fragment thereof, and collecting from the culture. Can be manufactured.
  • gene expression methods include secretory production, fusion protein, and the like according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989). Expression or the like can be performed.
  • the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof can be produced in a host cell, secreted outside the host cell, or produced on the host cell membrane. Secreted HB-EGF or partial fragments thereof to be produced By changing the structure, it is possible to select an appropriate method.
  • the production amount can also be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • Secreted HB-EGF or a partial fragment thereof can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cell When the secreted HB-EGF or a partial fragment thereof is expressed in a dissolved state in the cell, the cell is recovered by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, Crush the cells with a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Jetylaminoethyl (DEAE) —Sepharose, anion exchange chromatography using a resin such as DIAION HP A-75 (Mitsubishi Chemical), SS mark harose FF (Pharmacia)
  • a purified sample can be obtained by using a method such as electrophoresis such as electric point electrophoresis alone or in combination.
  • HB-EGF or a partial fragment thereof When secreted HB-EGF or a partial fragment thereof is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is similarly collected and then disrupted and centrifuged to obtain a precipitate fraction. The insoluble material of the polypeptide is recovered. The recovered insoluble matter of the protein is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution, the protein is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified preparation of secreted HB-EGF or a partial fragment thereof is obtained by the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • a secreted HB-EGF or a partial fragment thereof or a derivative such as a sugar modification product thereof is secreted extracellularly
  • the secreted HB-EGF or a partial fragment thereof is put in the culture supernatant.
  • derivatives such as sugar modifications can be recovered. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to
  • the secretory HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention includes Fmoc method (fluorylmethyloxycarbol method), tBoc method (tbutyloxycarbo- It can also be produced by chemical synthesis methods such as In addition, chemical synthesis is performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, No ⁇ Kinenorema 1 ⁇ , Pharmacia, Protein Technology Instrument, bynthe ceU-Vega, PerS India, Shimadzu, etc. I'll do it with you.
  • Fmoc method fluorylmethyloxycarbol method
  • tBoc method tbutyloxycarbo- It can also be produced by chemical synthesis methods such as
  • chemical synthesis is performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, No ⁇ Kinenorema 1 ⁇ , Pharmacia, Protein Technology Instrument, bynthe ceU-Vega, PerS India, Shimadzu, etc. I'll do it with you.
  • mice, rats, or hamsters 3 to 20 weeks old are immunized with the antigen prepared as described above, and antibody-producing cells in the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animal are collected.
  • Immunization involves administering the antigen subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally to the animal with an appropriate adjuvant (eg, Freund's Adjuvant, complete hydroxyl gel and pertussis vaccine).
  • an appropriate adjuvant eg, Freund's Adjuvant, complete hydroxyl gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (cushion serum albumin) or KLH (Keyhole Lime hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA cushion serum albumin
  • KLH Keyhole Lime hemocyanin
  • Antigen administration is performed 5 to L0 times every 1 to 2 weeks after the first administration. 3-7 after each administration
  • Plasma samples are collected from the fundus venous plexus on the day, and the serum reacts with the antigen by an enzyme immunoassay [Antioodies-A Laooratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. Mice, rats, or hamsters whose sera showed sufficient antibody titers against the antigen used for immunization are provided as a source of splenocytes.
  • the spleen In the fusion of spleen cells and myeloma cells, 3 to 7 days after the final administration of the antigen substance, the spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the spleen cells are collected. The spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged (120 Orpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, and Tris-salt ammonium buffer ( Treat with PH 7.65) for 1-2 minutes to remove red blood cells, wash 3 times with MEM medium, and provide as splenocytes for fusion.
  • MEM medium Non-sui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Tris-salt ammonium buffer Treat with PH 7.65
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used.
  • myeloma cell line P3-X63 Ag8— U1 P3— U1
  • P3— U1 Current Topics m Microbiology and Immunology, 18: 1- 7, 1978
  • P3- NSl / l-Ag41 NS-1
  • SP2 / O -Agl4 SP-2
  • P3—X63— Ag8653 6
  • HAT medium hypoxanthine (10 _4 M) in normal medium, Thymidine ( 1.5 x 10 _5 M) and aminopterin (4 Medium with X 10 _7 M) Suspended in 100 ml. Dispense this suspension into a 96-well culture plate at 100 ⁇ per well, and incubate at 37 ° C for 7-14 days in a 5% CO incubator.
  • a part of the culture supernatant is taken and reacted with an antigen containing secreted HB-EGF or a partial fragment thereof used in the present invention by a binding assay described later, and secreted.
  • a type that does not react with the antigen and does not contain type HB-EGF or a partial fragment thereof is selected.
  • cloning was repeated twice by limiting dilution (first time using HT medium (medium excluding HAT medium power aminopterin) and second time using normal medium), and a stable and strong antibody titer was observed. The resulting product is selected as a monoclonal antibody-producing hyperidoma strain.
  • pristane 2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane (Pristane) O. 5ml intraperitoneally and bred for 2 weeks
  • 8 ⁇ To L0 week old mice or nude mice, (4) The obtained anti-HB-EGF monoclonal antibody-producing hybridoma cells 2 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 7 cells Z are injected intraperitoneally. Hypridoma becomes ascites tumor in 10-21 days.
  • This mouse also collected ascites, centrifuged (3, OOOrpm, 5 minutes) to remove solids, salted with 40-50% ammonium sulfate, and then subjected to force prillic acid precipitation, DEAE-Sepharose Purify using column, protein A-force ram or gel filtration column, collect IgG or IgM fractions, and use as purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the antibody is determined by an enzyme immunoassay using a subcluster epiting kit.
  • the amount of protein is quantified by the Raleigh method and absorbance at 280 nm.
  • the antigen secretory HB-EGF or a partial peptide obtained by the method described in (1) is used.
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (cushion serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) is prepared and used.
  • the serum of the immunized animal, the culture supernatant of the hybridoma producing the monoclonal antibody, or the purified antibody was separated as the first antibody. Pour and react. After washing well with PBS or PBS-0.05% Tween, anti-immunoglobulin antibody labeled with piotin, enzyme, chemiluminescent substance, or radiation compound as the second antibody is dispensed and reacted. After washing thoroughly with PBS-Tween, perform the reaction according to the labeling substance of the second antibody.
  • FMAT Applied System
  • Specific examples of the monoclonal antibody that is selected by the above-described method and binds to secretory HB-EGF used in the present invention include monoclonal antibody KM3566 produced by Hypridoma cell line KM3566, Monoclonal antibody KM3567 produced by Hypridoma cell line KM3567, Monoclonal antibody KM3579 produced by Hypridoma cell line KM3579, Monoclonal antibody KM3 580 produced by Hypridoma cell line KM3580, and Monoclonal antibody KM384 produced by Hypridoma cell line KM3841 1 can be given.
  • Hypridoma cell lines KM3566 and KM3579 were incorporated on April 24, 2006 in accordance with the Budapest Treaty.
  • FERM BP—10490, FERM BP—10491, and KM3567, KM3580, and KM3841 are patent biological deposit centers (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) based on the Budapest Treaty as of March 23, 2006. It has been deposited as FE RM BP—10573, FERM BP—10574, and FERM BP—10575 at East 1-chome 1 1 Central 6).
  • Antibody fragments can be prepared by genetic engineering techniques or protein chemistry techniques based on the antibody described in 1 above.
  • Examples of genetic engineering techniques include constructing a gene encoding the target antibody fragment, and expressing and purifying it using an appropriate host such as an animal cell, plant cell, insect cell, or E. coli.
  • Examples of protein chemistry techniques include site-specific cleavage and purification methods using proteolytic enzymes such as pepsin and papain.
  • proteolytic enzymes such as pepsin and papain.
  • Fab can be produced proteolytically by treating IgG with the proteolytic enzyme papain. After papain treatment, if the original antibody is an Ig G subclass with protein A binding properties, it can be separated from IgG molecules and Fc fragments by passing through a protein A column and recovered as a uniform Fab ( Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995). For IgG subclass antibodies that do not have protein A binding, the Fab should be recovered in fractions eluted at low salt concentrations by ion exchange chromatography; less than 0 (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995
  • Fab can be produced mostly using Escherichia coli, or using insect cells or animal cells.
  • DNA encoding the V region of an antibody can be cloned into the Fab expression vector from the hyperidoma obtained from 1 above to prepare a Fab expression vector.
  • Any Fab expression vector can be used as long as it can incorporate and express Fab DNA.
  • An example is pIT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988).
  • Fab expression vectors can be introduced into appropriate E. coli to produce and accumulate Fabs in inclusion bodies or periplasm. Inclusion bodies can be made into active Fabs by the refolding method usually used in proteins, and when expressed in periplasm, active Fabs leak into the culture supernatant.
  • Uniform Fabs can be purified after refolding or from the culture supernatant by using a column to which an antigen is bound (Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992).
  • F (ab ') is a protein that can be obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme pepsin.
  • DTNB 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)
  • S—S bonding can also be used (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
  • Fab ′ is obtained by treating F (a) described in 3 (2) above with a reducing agent such as dithiothreitol.
  • Fa can be produced by genetic engineering, mostly using E. coli, insect cells and animal cells.
  • the Fab ′ expression vector can be prepared by cloning DNA encoding the V region of the antibody from the hyperdoma obtained from 1 above into a Fa expression vector. Any Fab ′ expression vector can be used as long as it can incorporate and express DNA for Fa.
  • pAK19 BIO / TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992.
  • Fa expression vector can be introduced into appropriate E. coli and Fa can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm. Inclusion bodies can be made into active Fa by the refolding method usually used for proteins.
  • Uniform Fa When expressed in periplasm, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, and lysis The bacteria can be crushed by treatment such as, and recovered outside the cells. Uniform Fa can be purified after refolding or from bacterial lysates by using a protein G column (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRES3 ⁇ 4, 1996).
  • scFv can be prepared by genetic engineering using phage or E. coli, insect cells, animal cells, and the like.
  • the scFv expression vector can be prepared by cloning DNA encoding the V region of the antibody from the hyperidoma obtained from 1 above into an scFv expression vector.
  • any vector can be used as long as it can incorporate and express scFv DNA.
  • pCANTAB5E manufactured by Pharmacia
  • pHFA Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994
  • scFv By introducing the scFv expression vector into appropriate Escherichia coli and infecting the helper phage, a phage that expresses scFv fused to the phage surface protein on the phage surface.
  • scFv can be generated and accumulated in inclusion bodies or periplasm of E. coli into which the scFv expression vector has been introduced. Inclusion body strength can also be converted into active scFv by the refolding method usually used for proteins. When expressed in periplasm, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, saccharation, etc. By this treatment, the bacteria can be crushed and recovered outside the cells. Uniform scFv can be purified from the lysate after refolding or from bacteria by using cation exchange chromatography (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PR ESS, 1996).
  • a diabody can be produced by genetic engineering, mostly using Escherichia coli, insect cells and animal cells. For example, after obtaining DNA encoding the antibody VH and VL from the above-mentioned 1 or ibridoma obtained from 1 above, DNA linked to the linker so that the amino acid residue encoded by the linker is 8 residues or less is prepared, and diabody A diabody expression vector can be prepared by cloning into an expression vector. Any diabody expression vector can be used as long as it can incorporate and express diabody DNA. For example, pCAN TAB5E (manufactured by Pharmacia), pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994) and the like can be mentioned. An inclusion body of E.
  • coli into which a diabody expression vector has been introduced can produce and accumulate diabody in the periplasm.
  • Inclusion bodies can be made into active diabodies by the refolding method usually used for proteins.
  • lysozyme When expressed in the periplasm, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, lysis, etc. By this treatment, the bacteria can be crushed and recovered outside the cells.
  • Uniform scFv can be purified after refolding or from the bacterial disruption solution by using cation exchange chromatography (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRE SS, 1996).
  • dsFv can be produced mostly using E. coli, insect cells and animal cells.
  • mutations are introduced at appropriate positions in the DNA encoding the antibody VH and VL from the ribosome and hybridoma obtained from 1 above, and the encoded amino acid residue is cis-modified. Create DNA substituted for tin.
  • Each of the prepared DNAs can be cloned into a dsFv expression vector to prepare VH and VL expression vectors.
  • Any dsFv expression vector may be used as long as it can incorporate and express dsFv DNA.
  • pULI9 Protein Engineering, 7, 697-704, 1994.
  • VH and VL expression vectors can be introduced into appropriate E.
  • coli and dsFv can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm.
  • Inclusion bodies! /, Periplasma can also be obtained by mixing VH and VL, and mixing them into active dsFv by the refolding method usually used for proteins. After refolding, it can be further purified by ion exchange chromatography and gel filtration (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • Recombinant human secretory HB-EGF (catalog number 259-HE / CF) manufactured by R & D Systems, Inc.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • KLH Calbiochem
  • HB-EGF dissolved in 0.1M ammonium acetate buffer (PH7.0) and KLH dissolved in 0.1M ammonium acetate buffer (PH 7.0) and adjusted to 30 mgZmL The mixture was mixed so as to have a ratio of 4: 1, dartal aldehyde having a final concentration of 0.05% was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction, dialyzed with PBS was used as an immunogen.
  • HB-EGF or HB-EGF-KLH prepared in (1) above was added to 2 mg of aluminum hydroxide annunciation [Antibodies-A Laooratory ManuaL, CoLd Spring Harbor Laboratory, p9 9, 1988] and pertussis vaccine (Chiba Prefecture) Serum research laboratory) 1 x 109 cells and HB-EGF-deficient mice (provided by Laboratory for Cell Function, Osaka University Research Institute for Microbial Diseases, PNAS, VOL.100, NO.100, 3221-3226, 2003). From 2 weeks after administration, 25 g of HB-EGF or HB-EGF-KLH alone was administered once a week for a total of 4 times.
  • the serum antibody titer was examined by the enzyme immunoassay shown below, and the spleen was removed 3 days after the final immunization for the mouse force that showed a sufficient antibody titer.
  • the spleen was chopped in a MEM (Minimum EssentiaL Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with tweezers, and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). Tris-salt ammonium buffer solution (PH7.6) was added to the resulting precipitate fraction and treated for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes. The resulting precipitate fraction (cell fraction) was washed 3 times with MEM medium and used for cell fusion.
  • MEM Minimum EssentiaL Medium
  • PH7.6 Tris-salt ammonium buffer solution
  • HB-EGF from Example 1 (1) was dispensed into a 96-well ELISA plate (Grainer) at 0.5 ⁇ g / mL and 50 ⁇ L / well, and left at 4 degrees overnight. Then, what was adsorbed was used. After washing the plate, 1% bovine serum albumin (BSA) -PBS was added at 50 / z L / well and left at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups. After standing, 1% BSA-PBS was discarded, and 50 ⁇ L / well of immunized mouse antiserum and hypridoma culture supernatant as the primary antibody were poured into the plate and left for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • Tween-PBS polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • Peroxidase-labeled Usagi anti-mouse IgG gamma chain was added at 50 L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazol-6-sulfonic acid) ammonium] substrate solution [lmmoL / L ABTS / 0.1 moL / L Fur (PH4.2), 0.1% H202] was added, the color was developed, and the absorbance at OD415 nm was measured using a plate reader (Emax; MoLecuLar Devices).
  • mice spleen cells obtained in Example 1 (2) and the myeloma cells obtained in Example 1 (4) were mixed at 10: 1 and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). Dissolve the cells of the resulting precipitate fraction, and mix with polyethylene glycol-1000 (PEG-lOOO) l at 37 ° C with stirring. g, 0.5 mL of MEM medium 1 mL, and 0.35 mL of dimethyl sulfoxide were added to 10 8 mouse spleen cells, and 1 mL of MEM medium was added several times to the suspension every 1-2 minutes. MEM medium was added to make the total volume 50 mL.
  • PEG-lOOO polyethylene glycol-1000
  • HAT medium 10% Medium containing HAT Media Supplement (Invitro's, manufactured by Yen Co., Ltd.) in RPMI 1640 medium supplemented with fetal bovine serum Suspended in 100 mL o 200 mL / well of this suspension in a 96-well culture plate Dispense each by 5% CO incubator
  • the 8 mg-old nude female mice (BALB / c) treated with pristane were injected intraperitoneally with 5-20 ⁇ 10 6 cells / mouse of the neurobrima strain obtained in Example 1 (5). After 10 to 21 days, ascites was collected (1 to 8 mL / mouse) from a mouse in which ascites accumulated due to the hybridoma becoming ascites tumor. The ascites was centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to remove solids. Purified IgG monoclonal antibodies were obtained by purification by the force prillic acid precipitation method [Antibodies-A Laboratory ManuaL, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988].
  • the subclass of the monoclonal antibody was determined by ELISA using a sub-clustering kit.
  • the subclasses of monoclonal antibodies KM3566, KM3567, and KM3580 were IgG1
  • the subclasses of KM3579 and KM3841 were IgG2b.
  • Binding ELISA was performed according to the method shown in Example 1 (3).
  • monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, KM3580, KM3841, and negative control antibody KM511 (anti-GCSF derivative monoclonal antibody) were diluted serially at a 5-fold dilution from 10 ⁇ g / mL. A thing was used. [0085] The results are shown in FIG. Monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, KM3580, and KM3841 all reacted with HB-EGF but not with BSA.
  • HB-EGF 20 ng of HB-EGF (R & D) per lane was fractionated by SDS-polyacrylamide electrophoresis, and the gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane.
  • purified antibodies of monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, KM3580, KM3841, and negative control antibody KM511 were each 2 ⁇ g / mL / l% BSA-PBS at room temperature. Time response.
  • the membrane was thoroughly washed with Tween-PBS, and diluted peroxidase-labeled mouse immunoglobulin (Zymet) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • the membrane was thoroughly washed with Tween-PBS, and bands were detected using ECL TM Western blotting detection regent (manufactured by Amersham Pharmacia).
  • Purified antibodies of monoclonal antibodies KM3566, KM3567, KM3579, KM3580, KM3841 are prepared to 1 mg / mL / PBS using PBS, and the volume ratio of the antibody solution to 0.5 mol / L carbonate buffer (PH 9.2) is 4: 1. 1 mg / mL EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce) / ⁇ , ⁇ -dimethylformamide was added in the same amount as the carbonate buffer. After slowly reacting with stirring at room temperature for 1.5 hours, free piotin was removed by PBS dialysis and used as a piotin-labeled antibody.
  • Monoclonal antibody was dispensed into a 96-well ELISA plate at 5 ⁇ g / mL / PBS, 50 ⁇ L / well, and allowed to stand overnight at 4 degrees for adsorption. After washing the plate, 1% BSA-PBS was added at 50 / zL / well and left at room temperature for 1 hour to block remaining active groups. After standing, 1% BSA-PBS was discarded, and 50 L / well of secreted HB-EGF diluted stepwise from 1 ⁇ g / mL to 5-fold dilution was dispensed to the plate and left for 2 hours.
  • monoclonal antibody KM3566 was immobilized on a solid phase, combined with piotin-labeled monoclonal monoclonal antibody KM3579 or piotin-labeled monoclonal antibody KM3580, and monoclonal antibody KM3567 was immobilized on a solid phase.
  • secretion in a biological sample which can be measured easily and rapidly, is characterized by using two types of monoclonal antibodies that bind to different epitopes of secreted HB-EGF.
  • a method for measuring type HB-EGF can be provided.

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Abstract

　簡便かつ迅速に測定することが可能な、生体試料中の分泌型HB-EGFの測定方法が求められている。本発明は、分泌型HB-EGFの異なるエピトープに反応する２種類のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、分泌型HB-EGFを測定する方法を提供することができる。

Description

明 細 書
分泌型へパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子の測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、分泌型へパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子 (heparin binding ep idermal growth factor-like growth factor;以下、 HB- EGFと称す。）の測定方法に関 する。
背景技術
[0002] HB— EGFは 1992年、東山らによりヒトマクロファージ様細胞株 U— 937の培養上清 より精製、単離され、 cDNAがクローユングされた (非特許文献 1)。 HB- EGFは EGF ファミリーに保存されている 6つのシスティンを共有し EGFファミリーに属し、 EGFR( ErbBl)と ErbB4に結合し、線維芽細胞（BALB3T3)、平滑筋細胞（Bovine aorti c smooth muscle cell)、およびケラチノサイトに対して増殖促進活性を有する。 膜型 HB-EGFが細胞表面でプロテアーゼによって切断されると、 EGF様ドメインを含 む細胞外ドメインが遊離されて、分泌型 HB-EGFを生じる。分泌型 HB-EGFは、表皮 細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージなど種々の組織、細 胞より分泌され、細胞の増殖や分化、炎症反応などに関与する。膜型 HB-EGFは分 泌型 HB-EGFの前駆体であるだけでなぐ膜型 HB-EGF自身も生物活性を有して!/ヽ る Naglichらは膜型 HB-EGFがジフテリアトキシンのレセプターとして機能し、ジフテリ ァトキシンの細胞内への進入に関与していることを報告した (非特許文献 2)。
[0003] 目加田らは HB-EGFノックアウト（KO)マウスを作製して、 HB-EGFの生理的機能を 解析した (非特許文献 3)。 HB-EGF KOマウスは心室の拡張、心機能の低下、およ び心臓弁肥大の症状を示し、半数以上が生後数日で死亡した。このことは、 HB-EG Fが心臓の発達と機能維持に必須な蛋白質であることを示している。
次に目加田らはプロテアーゼによる切断部位に変異を挿入して分泌型に変換され なくなった HB-EGF (HBuc)と膜貫通領域を除去して分泌型として合成される HB-E GF (HBAtm)の 2種類の HB- EGF変異体を発現する組換えマウスを作製し、膜型お よび分泌型の HB-EGFの生理的機能を解析した (非特許文献 4)。その結果、 HBuc 発現マウスは HB-EGFKOマウスに近似した症状を示したことから、分泌型 HB- EGF が活性型蛋白質として機能していると考えられた。一方、 HBAtm発現マウスではケ ラチノサイトの過形成が起こり、また心臓にも異常が認められた。したがって、 HB-EG Fの膜型力 分泌型への変換は HB-EGFの生理機能発現に必須であり、正常な機能 発現の為には、この変換のプロセスが体内で厳密にコントロールされることが重要で ある。
[0004] これまでに乳癌、肝癌、膝癌、膀胱癌等、種々の癌で HB-EGFの高発現が報告さ れている（非特許文献 5〜8)。また、 HB-EGFが癌の増殖に重要な因子であることが 報告された (非特許文献 9、 10)。目加田らはヌードマウスにヒト卵巣癌細胞株を移植 するモデル系にお 、て、 HB- EGFの RNAinterf erence (RNAi)を細胞株へ導入す る力、あるいは HB-EGFの特異的阻害剤であるジフテリアトキシン変異体 CRM197を 細胞株移植マウスに投与することにより、顕著な腫瘍増殖阻害効果が認められること を示した。また、東山らは膀胱癌の細胞株に HB-EGF遺伝子を導入した株では、 in vitroにおいて増殖速度亢進、コロニー形成能亢進、 VEGF発現亢進、 CyclinDl 発現亢進等が認められ、 invivoにおいてもヌードマウスにおける造腫瘍性が亢進や 腫瘍血管新生の亢進が認められることを報告した。このような変化は膜型 HB-EGFも しくは分泌型 HB-EGF遺伝子を発現させた場合にのみ認められ、プロテアーゼ抵抗 性膜型 HB-EGF遺伝子を強制発現させた場合には認められな力つた。したがって、 分泌型 HB-EGFは卵巣癌や膀胱癌において腫瘍増殖に関わる重要な因子である可 能性が示唆された。臨床検体における HB-EGFの発現に関しては、目加田らが卵巣 癌患者の癌組織と腹水において、 EGFファミリーのうち HB-EGFのみが発現亢進して おり、さらに HB-EGF高発現の患者は低発現の患者に比べて予後が悪いことを報告 した (非特許文献 11)。以上のように、特に、卵巣癌では、分泌型 HB-EGFがオートク ラインもしくはパラクラインの機序により癌の増殖に関与している。
[0005] また、癌以外にも心肥大、平滑筋過形成、肺高血圧等の疾患において、 HB-EGF の関与が報告されている (非特許文献 12〜14)。
目加田らはへノ^ン結合担体と放射標識したジフテリアトキシンを用いて、卵巣癌 患者腹水中の HB-EGF濃度を定量して 、る（非特許文献 9)。 これまでに分泌型 HB-EGFに反応性を有する抗 HB-EGF抗体としてポリクローナル 抗体 (R&D社製）および 1種類のモノクローナル抗体 (R&D社製）が知られて 、る。 非特許文献 1 : Science, Vol. 251, 936, 1991
非特許文献 2 : Cell, Vol. 69, 1051, 1992
非特許文献 3 : PNAS, Vol. 100, 3221, 2003
非特許文献 4 : of Cell Biology, Vol. 163, 469, 2004
非特許文献 5 : Breast Cancer Res. Treat. , Vol. 67, 81, 2001
非特許文献 6 : Oncol. Rep. , Vol. 8, 903, 2001
非特許文献 7 : Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 202, 1705, 1994 非特許文献 8 : Cancer Research, Vol. 61, 6227, 2001
非特許文献 9 : Cancer Research, Vol. 64, 5720, 2004
非特許文献 10 : Cancer Research, Vol. 64, 5283, 2004
非特許文献 11 : Clin Cancer Res, Vol. 11, 4783, 2005
非特許文献 12 : Nat. Med., Vol. 8, 35, 2002
非特許文献 13 : Clin. Invest., 95, 404, 1995
非特許文献 14 : Nat. Med., 8, 41, 2002
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、簡便かつ迅速に測定することが可能な、分泌型 HB-EGFの測定方法を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は以下の（1)〜（7)に関する。
(1) 分泌型へパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（epidermal growth factor-li ke growth factor,以下、分泌型 HB-EGFと称す）の異なるェピトープに結合する 2種 類のモノクローナル抗体または抗体断片を用いることを特徴とする、分泌型 HB-EGF の測定方法。
(2) 分泌型 HB- EGF含有被検液を、分泌型 HB- EGFに結合するモノクローナル抗 体 (以下、抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aと称す)またはその抗体断片を結 合させた固相へカ卩えて、当該固相中の当該モノクローナル抗体またはその抗体断片 と分泌型 HB-EGFとを結合させ、当該固相に標識した抗分泌型 HB-EGFモノクローナ ル抗体 Aとは異なる分泌型 HB-EGFのェピトープに結合するモノクローナル抗体 (以 下、抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Bと称す)またはその抗体断片をカ卩えて免 疫反応を行 ヽ、固相中の標識を測定することを特徴とする該被検液中の分泌型 HB- EGFの測定方法。
(3) 2種類のモノクローナル抗体力 以下の（a)から（e)力 選ばれる 2つのモノクロ ーナル抗体である、上記（1)または（2)項に記載の方法。
(a)ハイプリドーマ KM3566 (FERM BP— 10490)が生産するモノクローナル抗体 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(b)ハイブリドーマ KM3579 (FERM BP— 10491)が生産するモノクローナル抗 体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(c)ハイブリドーマ KM3567 (FERM BP— 10573)が生産するモノクローナル抗体 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(d)ハイブリドーマ KM3580 (FERM BP— 10574)が生産するモノクローナル抗 体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(e)ハイプリドーマ KM3841 (FERM BP— 10575)が生産するモノクローナル抗体 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(4) 分泌型 HB-EGFの異なるェピトープに結合する 2種類のモノクローナル抗体ま たはその抗体断片を含む、分泌型 HB-EGFの測定用キット。
(5) ハイプリドーマ KM3580 (FERM BP— 10574)が生産するモノクローナル抗 体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片
(6) ハイプリドーマ KM3841 (FERM BP— 10575)が生産するモノクローナル抗 体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
(7) 上記（5)または（6)記載のモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマ。 発明の効果
本発明によれば、分泌型 HB-EGFに対して分泌型 HB-EGFの異なるェピトープに 反応する 2種類のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする簡便かつ迅速に測定 することが可能な、被検液中の分泌型 HB-EGFを測定する方法を提供することができ る。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]ノインデイング ELISAにおける各種抗 HB-EGF抗体の反応性を示す。上段には HB-EGFを固相化したプレートに対する各種抗体の反応性を、下段には BSAを固相 化したプレートに対する各種抗体の反応性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に 各抗体の結合活性を示す。◊はモノクローナル抗体 KM511、國はモノクローナル抗 体 KM3566、參はモノクローナル抗体 KM3567、口はモノクローナル抗体 KM3579、〇 はモノクローナル抗体 KM3580、▲はモノクローナル抗体 KM3841をそれぞれ表す。
[図 2]各種抗 HB- EGF抗体を用いたサンドイッチ ELISAにおける HB- EGFの標準曲線 を示す。横軸に HB-EGFの濃度を、縦軸に OD415の値を示す。上段中、國はモノクロ ーナル抗体 KM3566とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3579の組み合わせ、參は モノクローナル抗体 KM3567とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3579の組み合わ せ、口はモノクローナル抗体 KM3566とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3580の 組み合わせ、〇はモノクローナル抗体 KM3567とピオチン標識モノクローナル抗体 K M3580の組み合わせ、△はモノクローナル抗体 KM3841とピオチン標識モノクローナ ル抗体 KM3580の組み合わせをそれぞれ表す。下段中、國はモノクローナル抗体 KM 3579とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3566の組み合わせ、參はモノクローナル 抗体 KM3579とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3567の組み合わせ、口はモノク ローナル抗体 KM3580とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3566の組み合わせ、〇 はモノクローナル抗体 KM3580とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3567の組み合 わせ、△はモノクローナル抗体 KM3580とピオチン標識モノクローナル抗体 KM3841 の組み合わせをそれぞれ表す。 以下の実施例により本発明をより具体的に説明す るが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定する ものでない。
発明を実施するための最良の形態
[0010] HB- EGFは EGFファミリーの増殖因子であり、膜型 HB- EGF、分泌型 HB- EGFなど が包含される。 分泌型 HB- EGFとは、膜型 HB- EGFを構成しているシグナル配列、プロ領域、へパ リン結合ドメイン、 EGF様ドメイン、ジャクスタメンブランドメイン、膜貫通ドメイン、細胞 質ドメインのうち、プロテアーゼにより遊離された EGF様ドメインを含む細胞外ドメイン を有する HB- EGFを!、う。 HB- EGFはジフテリアトキシンまたは EGF受容体 ErbBlに結 合する活性を有する。
[0011] 分泌型 HB-EGFとしては、下記 (a)、（b)、（c)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、且つ、 EGF受容体 ErbB 1に結合する活性を有する蛋白質；
(c)配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、且つ、 EGF受容体 ErbBlに結合する活性を有する蛋白質；
配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置 換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、 EGF受容体 ErbBlに 結合する蛋白質とは、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント 'プロトコールズ 'ィ ン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、ヌクレイツク'アシッド'リサーチ（Nucleic Acids Resear ch) , 10, 6487 (1982)、プロシーデイングス'ナショナル'アカデミック 'サイエンス 'ユー エスエー (proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 79, 6409 (1982)、ジーン（Gene) ,34, 315 (198 5)、などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1、 2または 3で 表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAに部位特異的変異を導入す ることにより取得できる蛋白質をいう。欠失、置換、挿入および/または付加されるアミ ノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、上記部位特的変異導入法 などの周知の技術により、欠失、置換、もしくは付加できる程度の数であり、例えば、 1 〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個であ る。
[0012] また、配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、か つ、 EGF受容体 ErbBlに結合する活性を有する蛋白質とは、配列番号 1、 2または 3 に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくともと 80%以上、好ましくは 85%以上、 より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上、最も 好ましくは 99%以上の相同性を有し、かつ、 EGF受容体 ErbBlに結合する活性を有 する蛋白質をいう。
[0013] 相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プロダラ ムを用いて算出される数値であって、塩基配列については BLAST [ジャーナル'ォブ •モレキユラ一 ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 215,403(1990)]においてデフォルトパラメ 一ターを用いて算出される数値などがあげられる。アミノ酸配列については、 BLAST2 [ヌクレイック'アシッド'リサーチ (Nucleic Acid Res.), 25, 3389 (1997)]；ゲノム'リサ一 チ (Genome Res.), 7,り 49 (1997)； http://www.ncbi. nlm.nih. gov/Education/BLA¾ i，inf o/infomation3.html]にお!/、てデフォルトパラメータを用いて算出される数値などがあ げられる。デフォルトパラメータ一としては、 G(Cost to open gap)が塩基配列の場合 は 5、アミノ酸配列の場合は 11、 -E(Cost to extend gap)が塩基配列の場合は 2、アミ ノ酸目 d列の場合は 1、— q、penalty for nucleotide mismatch)力 3、— r(reward for nucleo tide match)が 1、— e(expect value)力 10、— W (wordsize)が塩基配列の場合は 11残基 、アミノ酸残基の場合は 3残基、 - y(Dropoff (X) for blast extemsions in bits)が blastnの 場合は 20、 blastn以外のプログラムでは 25である（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov /blast cgihelp.html) oまた、アミノ酸配列の解析ソフトとしては FASTA [メソッズ 'イン 'ェンザィ モロジ一（Methods in Enzymology) , 183, 63 (1990)]などもあげられる。
[0014] 本発明の分泌型 HB-EGFの測定方法としては、異なるェピトープに結合する 2種類 のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いることを特徴とする、免疫学的測定 方法があげられる。
免疫学的測定方法としては、ィムノアッセィ法、ィムノブロッテイング法、凝集反応、 補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色 法など抗原抗体反応を利用した方法であれば 、かなるものも包含されるが、好ましく はィムノアッセィ法があげられる。
[0015] ィムノアツセィ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原 を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫 検出法 (RIA)、酵素免疫検出法 (ΕΙΑまたは ELISA)、蛍光免疫検出法 (FIA)、発 光免疫検出法（luminescent immunoassay)、物理化学的検出法（TIA, LAPIA , PCIA)、フローサイトメトリーなどがあげられる力 好ましくは酵素免疫検出法があ げられる。
[0016] 放射免疫検出法で用いる放射性標識体としては、任意の公知 (石川榮次ら編、酵 素免疫測定法、医学書院)の放射性同位元素を用いることができる。例えば、 32P、 1251、 1311等を用いることができる。
酵素免疫検出法で用いる酵素標識体としては、任意の公知 (石川榮次ら編、酵素 免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファタ ーゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラーゼ等を用いることができる。
[0017] さらに酵素免疫測定法は酵素の作用により生成した物質を測定することにより、測 定 ·検出を行うが、紫外部または可視部に吸収極大を有する物質の吸光度を測定す る方法、生成した蛍光物質の蛍光強度を測定する方法、生成した物質の発光強度を 測定する方法など多様な測定方法をとることが出来る。例えば酵素標識体としてアル カリフォスファターゼを用いる場合は、アルカリフォスファターゼ作用により紫外部また は可視部に吸収極大を有する物質を生成するようなアルカリ性ホスファタ一ゼの基質 としては、例えば 4— -トロフエ-ルリン酸等が挙げられる。 4— -トロフエ-ルリン酸は アルカリフォスファターゼにより 4— -トロフエノールに変換される。アルカリフォスファ ターゼ作用により発光を生成するようなアルカリフォスファタ一ゼの基質としては、例 えば 3— (2'—スピロアダマンタン） 4—メトキシ一 4— (3'—ホスホリルォキシン）フ ェ-ル 1, 2 ジォキセタン'ニナトリウム塩 (AMPPD)、 2 クロ口一 5— {4—メトキ シスピロ [1, 2 ジォキセタン一 3, 2，一（5，クロ口）トリシクロ [3. 3. 13, 7]デカン]— 4—ィル }フエ-ルホスフェート 'ニナトリウム塩（CDP— StarTM)、 3— {4—メトキシ スピロ [1, 2 ジォキセタン一 3, 2，一（5，一クロ口）トリシクロ [3. 3. 13, 7]デカン] — 4—ィル }フエ-ルホスフェート 'ニナトリウム塩（CSPDTM)、 [10—メチル—9 (10 H)—アタリジ-ルイデン]フエノキシメチルリン酸'ニナトリウム塩（LumigenTMAPS 5)等が挙げられる。
また、アルカリフォスファターゼの作用により色素を生成する試薬として、アルカリフ ォスファタ一ゼの基質である NADPHを含有する酵素サイクリング反応試薬 AmpliQ (ダコ社製）が挙げられる。
[0018] 発光免疫検出法で用いる発光標識体としては、任意の公知 [今井一洋編、生物発 光と化学発光、廣川書店；臨床検査 42 (1998) ]の発光体を用いることができる。例 えば、アタリジ-ゥムエステル、口フィン等を用いることができる。
蛍光免疫検出法で用いる蛍光標識体としては、任意の公知 (川生明著、蛍光抗体 法、ソフトサイエンス社製)の蛍光を用いることができる。例えば、 FITC、 RITC等を 用!/、ることができる。
[0019] ィムノアッセィ法における測定方法としては、競合法、サンドイッチ法 [免疫学ィラス トレイテッド第 5版 (南光堂) ]等があげられるが、好ましくはサンドイッチ法があげられ る。
サンドイッチ法は、抗原抗体反応で結合した被検液中の目的物質と第一の抗体（ 抗分泌型 HB- EGFモノクローナル抗体 A)に、第二の抗体 (抗分泌型 HB- EGFモノク ローナル抗体 B)を同時に、または別々に反応させ、被検液中の目的物質を別々の 抗体で検出または定量する方法である。多くの場合、測定操作中に被検液中の非反 応のサンプル成分や測定系成分を洗浄する工程を含む。例えば、分泌型 HB-EGF 含有被検液を、分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体 (以下、抗分泌型 HB -EGFモノクローナル抗体 Aと称す)またはその抗体断片を結合させた固相へカ卩えて、 当該固相中の当該モノクローナル抗体またはその抗体断片と分泌型 HB-EGFとを結 合させ、当該固相に標識した抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aとは異なる分泌 型 HB-EGFのェピトープに結合するモノクローナル抗体（以下、抗分泌型 HB- EGFモ ノクローナル抗体 Bと称す)またはその抗体断片を加えて免疫反応を行 、、固相中の 標識を測定することを特徴とする該被検液中の分泌型 HB-EGFの測定方法があげら れる。
[0020] 具体的には、固相に第一の抗体 (抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aまたはそ の抗体断片)を固定した後、測定したい被検液を第一の抗体と接触させる。被検液 中の非反応のサンプル成分を洗浄し、反応系から除去した後、抗原抗体反応で結合 した被検液中の目的物質と第一の抗体との複合体に、第二の抗体 (抗分泌型 HB-E GFモノクローナル抗体 Bまたはその抗体断片）を反応させ、測定系中の反応に関与 しなかった第二の抗体などの成分を洗浄除去した後、反応系に存在する被検液中の 目的物質を検出または定量する方法である。
[0021] サンドイッチ法に用いる、分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体またはそ の抗体断片を固定化させる固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形し た素材に、分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片を固 相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなど の微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビュルト ルェン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタタリレート、 ゼラチン、ァガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラ ス、セラミックスや金属等があげられる。分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗 体またはその抗体断片の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれ らの併用等公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製 96ゥエル の免疫測定用マイクロタープレートに分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体 等を疎水固相化したものがあげられる。
[0022] サンドイッチ法に用いる、反応緩衝液としては、抗体固定ィ匕固相のモノクローナル 抗体またはその抗体断片と被検液中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提 供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、 BSAやカゼイン などの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等があげられる。
サンドイッチ法に用いる、洗浄液としては、リン酸ゃトリス（トリスヒドロキシメチルァミノ メタン）、 HEPESや MOPSなどのグッドバッファ一類などの緩衝剤などに、ツイーン 2 0、ツイーン 40、ツイーン 60、ツイーン 80、トリトン TMX— 705などの界面活性剤、 N aCl、 KC1や硫酸アンモ-ゥムなどの塩、 BSAやカゼインなどの蛋白質、アジ化ナトリ ゥムなどの防腐剤、塩酸グァ-ジン、尿素ゃソディウムドデシルサルフェートなどの変 性剤、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸、コン ドロイチン硫酸などの安定化剤の少なくとも 1種類を含む液があげられる。具体的に は、 0. 15mol/L塩化ナトリウム、 0. 05%ツイーン 20および pH7. 4の 10mmol/L リン酸緩衝液からなるツイーン PBS、 0. 15molZL塩化ナトリウム、 0. 05%ツイーン 20および pH7. 4の 10mmol/Lトリス—塩酸緩衝液（pH7. 4)からなるツイーン TB sなどがあげられる。
[0023] サンドイッチ法に用いる、標識された二次抗体またはその抗体断片としては、一次 抗体と異なる分泌型 HB-EGFのェピトープに結合するモノクローナル抗体に西洋ヮ サビペルォキシダーゼ（HRP)、ゥシ小腸アルカリフォスファターゼ、 13 ガラクトシダ ーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、 BSAやカゼインなどのタンパク質 、防腐剤などを混合したものがあげられる。
[0024] サンドイッチ法に用いる、標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて 、例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフエ 二レンジァミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフエ-ルヒドロキシフエ-ルプロピオ ン酸ゃヒドロキシフエニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質力 アル カリフォスファターゼであれば、 4 -トロフエ-ルフォスフェートなどの吸光度測定用 基質、 4ーメチルゥンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
[0025] 本発明の試料中の分泌型 HB-EGFの測定方法に用いられる抗体としては、分泌型 HB-EGFの異なるェピトープに反応する 2種類のモノクローナル抗体であれば、 、か なるモノクローナル抗体であってもよぐ Fab、 Fab'、 F (ab) などの抗体断片を用い
2
てもよい。具体的には、ハイプリドーマ KM3566 (FERM BP— 10490)が生産する モノクローナル抗体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその 抗体断片、ハイプリドーマ KM3567 (FERM BP— 10573)が生産するモノクローナ ル抗体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片、 ハイプリドーマ KM3579 (FERM BP— 10491)が生産するモノクローナル抗体が結 合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片、ハイプリドー マ KM3580 (FERM BP— 10574)が生産するモノクローナル抗体が結合するェピト ープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片、ハイプリドーマ KM3841 (F ERM BP- 10575)が生産するモノクローナル抗体が結合するェピトープに結合 するモノクローナル抗体またはその抗体断片力 なる群力 選ばれる 2つのモノクロ ーナル抗体があげられる。また、巿販抗体である抗ヒト HB-EGFモノクローナル抗体（ R&D社、カタログ NO.MAB259)を用いてもよ!ヽ。
[0026] 本発明の測定方法に用いられる 2種類のモノクローナル抗体の具体的な組み合わ せとしては、ハイプリドーマ KM3566が生産するモノクローナル抗体と、ノ、イブリドーマ KM3579が生産するモノクローナル抗体またはハイプリドーマ KM3580が生産するモノ クローナル抗体の組み合わせ、ハイプリドーマ KM3567が生産するモノクローナル抗 体と、ハイプリドーマ KM3579が生産するモノクローナル抗体またはハイプリドーマ KM 3580が生産するモノクローナル抗体の組み合わせ、ハイプリドーマ KM3580が生産す るモノクローナル抗体とハイプリドーマ KM3841が生産するモノクローナル抗体の組み 合わせなどがあげられ、また、これらの組み合わせのうち、少なくとも一抗体が抗体断 片であってもよい。
[0027] 本発明のサンドイッチ法による分泌型 HB-EGFを測定する方法の具体例を以下に 示す。
まず、適当な固定担体の表面に上述の抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aを 吸着固定する。抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aの固定は、例えば、当該抗 体を適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等に希釈した 後、これを固定担体の表面に接触させ、そして 4〜37°Cにて 30分間以上反応させる ことなどにより行うことができる。
[0028] 次に、固定担体表面の蛋白質結合能をブロックする。例えば、固定担体表面上の 遊離結合基をブロッキング緩衝液と接触させる。
ブロッキング緩衝液としては、例えば 1〜10%のゥシ血清アルブミン、 10〜30%ブ ロックエース (雪印乳業社製)を含有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝 液、炭酸緩衝液等があげられる。
[0029] ブロッキング処理は、 4〜37°Cにて 30分間以上反応させることにより行うことができ る。
次に、抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aを被検液と接触させる。被検液は必 要に応じて、例えば 0. 01〜1%のゥシ血清アルブミンなどの蛋白質を含有する緩衝 液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等で希釈してもよい。
[0030] 被検液としては、血液、血漿、血清、脾液、尿、糞便、組織液、培養液など分泌型 H B-EGFを含むものであれば限定されな!、。
抗分泌型 HB- EGFモノクローナル抗体 Aと被検液との接触は、 4〜37°Cにて 30分 間以上反応させることにより行うことができる。
接触させた後、必要に応じて TWeen20等の界面活性剤を含有する緩衝液、例え ばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等を用いて数回洗浄する。
[0031] このとき、被検液中に存在する分泌型 HB-EGFが、あらかじめ固定されている抗分 泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aと特異的に結合することにより、抗分泌型 HB-EG Fモノクローナル抗体 Aを介して固定担体に固定される。
次に、分泌型 HB-EGFが固定された前記担体を、抗分泌型 HB-EGFモノクローナ ル抗体 Aとェピトープの異なる抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 (抗分泌型 HB — EGFモノクローナル抗体 B)を含有する溶液と接触させる。抗分泌型 HB— EGFモ ノクローナル抗体 Bは必要に応じて、前述の標識体で予め標識しておくことができる。
[0032] 未吸着の抗分泌型 HB— EGFモノクローナル抗体 Bを除去するには、必要に応じ て TWeen20等の界面活性剤を含有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝 液、炭酸緩衝液等を用いて担体を数回洗浄する。これにより抗分泌型 HB—EGFモ ノクローナル抗体 Bは、あらかじめ結合されて 、る抗分泌型 HB— EGFモノクローナ ル抗体 A及び分泌型 HB- EGFを介して、固定担体に結合し、抗分泌型 HB— EGFモ ノクローナル抗体 Bの結合量が生体試料中の分泌型 HB-EGFの量を反映することに なる。
[0033] 上記のようにして固定された抗分泌型 HB— EGFモノクローナル抗体 Bは、抗分泌 型 HB— EGFモノクローナル抗体 Bの標識体に応じて測定することができる。また、 抗分泌型 HB— EGFモノクローナル抗体 Bに対して特異的な抗体を用い、該抗体を 種々の方法により予め標識しておくことにより、該抗体の標識を測定することもできる 上記のようにして、結合された二次抗体の量を測定し、標準物質を用いて検量線を 作成し、被検液中の分泌型 HB-EGFの量を測定することができる。
[0034] 検量線は、標準物質として濃度が既知である分泌型 HB-EGFを含む溶液を数点段 階希釈したものを準備し、被検液とともに上述のサンドイッチ法を行うことにより得るこ とがでさる。
本発明の分泌型 HB-EGFを測定する方法を用いることにより、分泌型 HB-EGFが亢 進する疾患の患者を検査することもできる。
[0035] 分泌型 HB— EGFが亢進する疾患としては、癌、心疾患、動脈硬化などがあげられ る。
分泌型 HB-EGFが亢進する疾患患者を検査する方法としては、例えば、以下のよう にして行うことができる。
複数の健常者の生体力も採取した生体試料にっ 、て、本発明の分泌型 HB-EGF の測定方法用いることにより、予め健常者の生体内の分泌型 HB-EGFを定量する。
[0036] 次に、被検者の生体力も採取した被検液について、上記と同様の方法により分泌 型 HB-EGFを定量する。
健常者と被検者との被検液中の分泌型 HB-EGF量を比較する。被検者の分泌型 H B-EGFの存在量が健常者と比較して増加して 、る場合には、分泌型 HB-EGF関連 疾患であると判定することができる。
[0037] また、本発明の測定方法を用いることにより、分泌型 HB-EGFが亢進する疾患患者 の予後を検査することができる。例えば、以下の方法により、分泌型 HB-EGFが亢進 する疾患を検査することができる。
定期的に患者の生体試料を採取し、本発明の分泌型 HB-EGFの測定方法により、 生体試料中の分泌型 HB-EGFを測定する。分泌型 HB-EGF量が前回に比較して上 昇している場合には、患者の病態が悪ィ匕していると判断することができる。
[0038] また、本発明の測定方法を用いて、各種疾患患者へ投与するための薬剤を選択す ることができる。例えば、以下の方法により、分泌型 HB-EGFが亢進する疾患患者へ 投与するための薬剤を選択することができる。
定期的に各種薬剤を投与された患者の生体試料を採取し、本発明の方法により分 泌型 HB-EGFを測定する。分泌型 HB-EGF量が前回に比較して上昇して 、る場合に は、患者に投与されて 、る薬剤が患者へ効果を有して 、な 、と判断することができる
[0039] 本発明のキットとしては、機器または試薬の組み合わせにより構成される力 以下に 述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含ま れていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。 試薬としては抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aあるいはその抗体断片および 標識された分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Bあるいはその抗体断片を含み、また 、必要に応じ、被検液の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識体の 検出用試薬、分泌型 HB-EGFなどの標準物質なども含まれる。
[0040] 被検液の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに BSAやカゼインなどのタン ノ ク質を含む水溶液などがあげられる。
分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体 Aを固定ィ匕させる固相としては、各 種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、分泌型 HB-EGFに結合するモノク ローナル抗体を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレ ート、ラテックスなどの微粒子、スティック等力 素材としてはポリスチレン、ポリカーボ ネート、ポリビュルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビュル、ナイロン、 ポリメタタリレート、ゼラチン、ァガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の 高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。分泌型 HB-EGFに結合する モノクローナル抗体 Aの固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれら の併用等公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製 96ゥエル の免疫測定用マイクロタープレートに分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体 A等を疎水固相化したものがあげられる。
[0041] 反応緩衝液は、抗体固定ィ匕固相の抗分泌型モノクローナル抗体 Aと生体試料中の 抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよ いが、界面活性剤、緩衝剤、 BSAやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反 応促進剤等があげられる。
洗浄液としては、リン酸ゃトリス（トリスヒドロキシメチルァミノメタン）、 HEPESや MO PSなどのグッドバッファ一類などの緩衝剤などに、ツイーン 20、ツイーン 40、ツイ一 ン 60、ツイーン 80、トリトン TMX— 705などの界面活性剤、 NaCl、 KC1や硫酸アン モ -ゥムなどの塩、 BSAやカゼインなどの蛋白質、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、塩 酸グァ-ジン、尿素ゃソディウムドデシルサルフェートなどの変性剤、ポリエチレンダリ コール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸などの安 定化剤の少なくとも 1種類を含む液があげられる。具体的には、 0. 15molZL塩ィ匕ナ トリウム、 0. 05%ツイーン 20および pH7. 4の 10mmol/Lリン酸緩衝液からなるツイ ーン PBS、 0. 15mol/L塩化ナトリウム、 0. 05%ツイーン 20および pH7. 4の 10m mol/Lトリス一塩酸緩衝液 (pH7. 4)力もなるツイーン TBSなどがあげられる。
[0042] 標識された抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Bまたはその抗体断片としては、 抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aと異なる分泌型 HB-EGFのェピトープに結合 するモノクローナル抗体またはその抗体断片に西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP) 、ゥシ小腸アルカリフォスファターゼ、 β ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベ ルしたもの、緩衝剤、 BSAやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを混合したもの が用いられる。
[0043] 標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ヮサビペル ォキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフエ-レンジァミンなどの吸 光測定用基質、ヒドロキシフエ-ルヒドロキシフエ-ルプロピオン酸ゃヒドロキシフエ- ル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質力 アルカリフォスファターゼであ れば、 4 -トロフエ-ルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、 4ーメチルゥンベリ フェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
[0044] 標準物質としては、配列番号 1記載の分泌型 HB-EGF、キットに用いられる 2種類の 抗体のェピトープを含有するペプチドなどがあげられる。
また、本発明は、ハイプリドーマ KM3580 (FERM BP— 10574)が生産するモノ クローナル抗体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体、ハイプリドー マ KM3841 (FERM BP— 10575)が生産するモノクローナル抗体が結合するェピ トープに結合するモノクローナル抗体およびそれらの抗体断片に関する。
[0045] 本発明に用いられるモノクローナル抗体および抗体断片の製造方法としては、公 知のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。
以下に、本発明に用いるモノクローナル抗体およびその抗体断片の製造方法を詳 細に説明する。
1.モノクローナル抗体の製造方法
(1)抗原の調製
抗原としては、分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片をコードする cDNAを含む 発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入することにより得られた 、分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片などがあげられる。また、分泌型 HB-EGF を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞またはヒト組織などカゝら分泌型 HB-EGF を精製することもできる。さらに、分泌型 HB-EGFの部分配列を有する合成ペプチド を調製し、抗原に用いることもできる。
[0046] 本発明で用いられる分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片としては、 Molecular し loning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Pres s (1989)や Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、これをコードする DNAを宿 主細胞中で発現させて、製造することができる。
[0047] まず、全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより 、組換えベクターを作製する。この際もし必要であれば、全長 cDNAをもとにして分泌 型 HB-EGFまたはそれらの部分断片をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片 を調製し、上記全長 cDNAの代わりに該 DNA断片を使用してもよい。次いで、該組換 えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、分泌型 HB
-EGFまたはそれらの部分断片を生産する形質転換体を得ることができる。
[0048] 宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであ れば 、ずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中へ の組込が可能で、分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片をコードする DNAを転写 できる位置に適当なプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
[0049] 大腸菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合には、本発明において用いられ る分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片をコードする DNAを含有してなる組換え ベクターは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム 結合配列、本発明にお ヽて用いられる DNA及び転写終結配列を含むベクターであ ることが好ましい。該組換えベクターは、さら〖こ、プロモーターを制御する遺伝子を含 んでいてもよい。
[0050] 発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれも Roche Diagnos tics社製）、 pKK233-2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (P romega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKYP200 [A gricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 2 77 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescript II S K (-) (Stratagene社製）、 pTrs30 [大腸菌 JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407)より調製] 、 pTrs32 [大腸菌 JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製]、 pGHA2 [大腸菌 IG HA2 (FERM BP- 400)より調製、特開昭 60- 221091]、 pGKA2 [大腸菌 IGKA2 (FERM BP- 6798)より調製、特開昭 60- 221091]、 pTerm2 (US4686191、 US4939094, US516 0735)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400[j. BacterioL, 172, 2392 (1990)]、 pGEX (Pharmacia社製）、 pETシステム（Novagen社製）、 pME18SFL3等を挙げること ができる。
[0051] プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいか なるものでもよい。例えば、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター、 PLプロモータ 一、 PRプロモーター、 T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモ 一ターを挙げることができる。また、 Ptrpを 2つ直列させたタンデムプロモーター、 tac プロモーター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーター等のように、人為的に設計改変 されたプロモーター等も用いることができる。
[0052] また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン'ダルガルノ
(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節 したプラスミドを用いることが好ま U、。本発明にお 、て用いられる分泌型 HB- EGFま たはそれらの部分断片をコードする DNAの塩基配列においては、宿主内での発現に 最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、 目的とする分泌型 H B-EGFまたはそれらの部分断片の生産率を向上させることができる。さらに、上記組 換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
[0053] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属等に属する微生物、例えば、大腸菌 XL1-Blue、 大月昜菌 XL2-Blue、大募菌 DH1、大募菌 MC1000、大募菌 KY3276、大募菌 W1485 、大腸菌 JM109、大腸菌 HB101、大腸菌 No.49、大腸菌 W3110、大腸菌 NY49等を 挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、 Gene, 17, 107 (1982)や Molecular & General Geneti cs, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
[0054] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pc DM8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ; Cytotechnology, 3, 133, ( 1990)]、 pAS3— 3 (特開平 2— 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)]、 pcDNAI/ Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103 [J.Biochemistry, 101, 13 07 (1987)]、 pAGE210、 pME18SFL3等を挙げることができる。
[0055] プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用い ることができ、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプ 口モーター、 sv40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチォネィ ンプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等を挙げることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい
[0056] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 29 9)等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げることができる。
[0057] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989)に ci載 れ飞 いる方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。真核生物由 来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された分泌型 HB-EGFまた はそれらの部分断片を得ることができる。 [0058] 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該分泌型 HB-E GFまたはそれらの部分断片を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、分泌 型 HB-EGFまたはそれらの部分断片を製造することができる。該形質転換体を培地 に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。 プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた 組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を 培地に添カ卩してもよい。
[0059] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、ダルベッコ改変 MEM培地 [V irology, 8, 396 (1959)]、 199培地 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)]又はこ れら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常 pH6 〜8、 30〜40°C、 5% C02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。また、培養中必要に応 じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カ卩してもよい。
[0060] 上記のとおり、本発明において用いられる分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断 片をコードする DNAを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞等由 来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養して該分泌型 HB-EGFまたはそ れらの部分断片を生成蓄積させ、該培養物より採取することにより、本発明において 用いられる分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片を製造することができる。
[0061] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press (1989)に ci載 れ飞 いる方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片の生産方法としては、宿主細胞内に生産 させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法 があり、使用する宿主細胞や、生産させる分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片 の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
[0062] 分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生 産される場合、ポールソンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方 法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)] 、又は特開平 05-336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該遺 伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
[0063] また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片は、例えば、以下のようにして単離 '精製 することができる。
分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片が細胞内に溶解状態で発現した場合に は、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕 機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕 し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清か ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HP A-75 (三菱化学社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-S印 h arose FF (Pharmacia社製）等のレ
ジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ二ルセファ ロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の 電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
[0064] また、分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片が細胞内に不溶体を形成して発現 した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として 該ポリペプチドの不溶体を回収する。回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で 可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該蛋白質を正常な立体構 造に戻した後、上記と同様の単離精製法により分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分 断片の精製標品を得ることができる。 [0065] 分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片又はその糖修飾体等の誘導体が細胞外 に分泌された場合には、培養上清にぉ ヽて該分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分 断片又はその糖修飾体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記 と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性 画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる
[0066] また、本発明にお ヽて用いられる分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片は、 Fm oc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ- ル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、 Advanced ChemTech 社、ノヽ ~~キン 'ェノレマ1 ~~社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 bynthe ceU-Vega社、 PerS印 tive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成す ることちでさる。
[0067] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記のように調製した抗原を免疫し て、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例え ば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant)や水酸化ァ ルミ-ゥムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原 が部分ペプチドである場合には、 BSA (ゥシ血清アルブミン）や KLH (Keyhole Li mpet hemocyanin)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原 として用いる。
[0068] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜： L0回行う。各投与後 3〜7
日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔A ntioodies - A Laooratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, 1988〕などで べ る。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたは ハムスターを脾細胞の供給源として提供する。
[0069] 脾細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後 3〜7日 目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。 脾臓を MEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（120 Orpm、 5分間）した後、上清を捨て、トリス—塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (PH7. 65)で 1 〜2分間処理し赤血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して融合用脾細胞として提 供する。
[0070] (3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、 8—ァザ グァニン耐'性マウス（BALBZc由来）骨髄腫細胞株 P3 - X63 Ag8— U1 (P3— U1 ) (Current Topics m Microbiology and Immunology、 18:1- 7, 1978)、 P3- NSl/l-Ag41 (NS-1) (European J. Immunology, 6: 511— 519, 1976)、 SP2 /O -Agl4 (SP- 2) (Nature,276: 269— 270, 1978)、 P3—X63—Ag8653 (653) J.Immunology, 123: 1548— 1550, 1979)、 P3—X63—Ag8 (X63) (Nat ure, 256:495— 497, 1975)など力用いられる。これらの細胞株は、 8—ァザグァ- ン培地〔RPMI— 1640培地にグルタミン（1. 5mM)、2—メルカプトェタノール（5 X l 0- 5M)、ジヱンタマイシン（10 μ g/ml)および牛胎児血清（FCS)を加えた培地（ 以下、正常培地という。）に、さらに 8—ァザグァニン（15 /z gZml)をカ卩えた培地〕で 継代する力 細胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 107個以上 の細胞数を確保する。
[0071] (4)細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1 . 83g、リン酸一カリウム 0. 21g、食塩 7. 65g、蒸留水 1リットル、 pH7. 2)でよく洗浄 し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞 = 5〜10 : 1になるよう混合し、遠心分離（ 1, 200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌し ながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール— 1 , 000 (PEG- 1, 000) 2g、 MEM2 mlおよびジメチルスルホキシド 0. 7mlの混液 0. 2〜lmlZl08 抗体産生細胞を 加え、 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mlを数回加えた後、 MEM培地を加えて全量 が 50mlになるようにする。遠心分（900rpm、 5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細 胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HAT培地〔正 常培地にヒポキサンチン（10_4M)、チミジン（1. 5 X 10_5M)およびアミノプテリン（4 X 10_7M)をカ卩えた培地〕 100ml中に懸濁する。この懸濁液を 96穴培養用プレート に 100 μ 1Ζ穴ずつ分注し、 5%COインキュベータ一中、 37°Cで 7〜14日間培養す
2
る。
[0072] 培養後、培養上清の一部をとり後で述べるバインディングアツセィなどにより、本発 明にお ヽて用いられる分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片を含む抗原に反応し 、分泌型 HB-EGFまたはそれらの部分断片を含まな 、抗原に反応しな 、ものを選択 する。ついで、限界希釈法によりクローユングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地 (HA T培地力 アミノプテリンを除いた培地）、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して 強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株として選択 する。
(5)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2, 6, 10, 14ーテトラメチルペンタデカン（Pristane) O. 5mlを腹 腔内投与し、 2週間飼育する〕した 8〜： L0週令のマウスまたはヌードマウスに、（4)で 得られた抗 HB-EGFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 106〜5 X 107細 胞 Z匹を腹腔内注射する。 10〜21日でハイプリドーマは腹水癌化する。このマウス 力も腹水を採取し、遠心分離 (3, OOOrpm, 5分間）して固形分を除去後、 40〜50 %硫酸アンモ-ゥムで塩祈した後、力プリル酸沈殿法、 DEAE—セファロースカラム 、プロテイン A—力ラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは、 I gM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
[0073] 抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法に より行う。蛋白量の定量は、ローリー法および 280nmでの吸光度より算出する。
(6)バインディングアツセィ
抗原としては、（1)に記載の方法により得られる、分泌型 HB-EGFや部分ペプチド を用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、 BSA (ゥシ血清アルブミン)や KLH (Keyhole Limpet hemocyanin)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し て、これを用いる。
[0074] これら抗原を 96穴プレートに分注し固層化した後、第一抗体として、被免疫動物血 清、モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの培養上清もしくは精製抗体を分 注して反応させる。 PBSまたは PBS— 0.05%Tweenで、よく洗浄した後、第二抗体 としてピオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ィムノグ ロブリン抗体を分注して反応させる。 PBS— Tweenでよく洗浄した後、第二抗体の標 識物質に応じた反応を行なう。測定機器として FMAT (アプライドバイォシステム社)を 用いる場合には、ホモジ-ァスバインディングアツセィが可能である為、上記の方法 のうち洗浄操作は不要である。
[0075] 前述したような方法で選択される、本発明にお 、て用いられる分泌型 HB-EGFに結 合するモノクローナル抗体の具体例としては、ハイプリドーマ細胞株 KM3566が生産 するモノクローナル抗体 KM3566、ハイプリドーマ細胞株 KM3567が生産するモノク ローナル抗体 KM3567、ハイプリドーマ細胞株 KM3579が生産するモノクローナル 抗体 KM3579、ハイプリドーマ細胞株 KM3580が生産するモノクローナル抗体 KM3 580、およびハイプリドーマ細胞株 KM3841が生産するモノクローナル抗体 KM384 1をあげることができる。ハイプリドーマ細胞株 KM3566および KM3579は、平成 18 年 1月 24日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に FERM B P— 10490、 FERM BP— 10491として、また KM3567、 KM3580および KM3841は 平成 18年 3月 23日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に FE RM BP— 10573、 FERM BP— 10574、 FERM BP— 10575として寄託されて いる。
[0076] 2.抗体断片の製造方法
抗体断片は、上記 1に記載の抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質ィ匕学 的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物 細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うな どの方法があげられる。
[0077] 蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた 部位特異的切断、精製などの方法があげられる。 抗体断片として、 Fab、 F(ab' )
2、 Fa 、 scFv、 diabody, dsFvの製造法について以下 に具体的に説明する。
(1) Fabの作製
Fabは、蛋白質ィ匕学的には IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作 製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテイン A結合性を有する Ig Gサブクラスであれば、プロテイン Aカラムに通すことで、 IgG分子や Fc断片と分離し、 均一な Fabとして回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practi ce, third edition, 1995)。プロテイン A結合性を持たない IgGサブクラスの抗体の場合 は、イオン交換クロマトグラフィーにより、 Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収 すること; 0でさる (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995
) o
[0078] また、 Fabは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細 胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 1より得られたハイプリドーマより 抗体の V領域をコードする DNAを、 Fab発現用ベクターにクローユングし、 Fab発現べ クタ一を作製することができる。 Fab発現用ベクターとしては、 Fab用の DNAを組み込 み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pIT106 (Scien ce, 240, 1041-1043, 1988)などがあげられる。 Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導 入し、封入体あるいはペリプラズムに Fabを生成蓄積させることができる。封入体から は、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、活性のある Fabとすることが でき、また、ペリブラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持った Fabが漏 出する。リフォールデイング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用 いることにより、均一な Fabを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992)。
[0079] (2) F(a ）の作製
2
F(ab' )は、蛋白質ィ匕学的には IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより
2
、作製することができる。ペプシンの処理後は、 Fabと同様の精製操作により、均一な F(ab' )として回収することができる (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
2
third edition, Academic Press, 1995)。また、下記 3 (3)に記載の Fa を o- PDMゃビ スマレイミドへキサンなどのようなマレイミドで処理し、チォエーテル結合させる方法や
、 DTNB[5,5 ' -dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]で処理し、 S-S結合させる方法によって も作製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 19 96)。
[0080] (3) Fa の作製
Fab'は、上記 3 (2)に記載の F(a ）をジチオスレィトールなどの還元剤で処理して
2
得ることができる。また、 Fa は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞 や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 1より得られたハイプリ ドーマより抗体の V領域をコードする DNAを、 Fa 発現用ベクターにクローユングし、 Fab'発現ベクターを作製することができる。 Fab'発現用ベクターとしては、 Fa 用の D NAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 p AK19 (BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992)などがあげられる。 Fa 発現べクタ 一を適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリブラズムに Fa を生成蓄積させる ことができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、 活性のある Fa とすることができ、また、ペリブラズムに発現させた場合は、リゾチ一 ムによる部分消化、浸透圧ショック、ソ-ケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、菌 体外へ回収させることができる。リフォールデイング後あるいは菌の破碎液からは、プ 口ティン Gカラムなどを用いることにより、均一な Fa を精製することができる（Antibod y Engineering, A Practical Approach, IRL PRES¾,1996)。
[0081] (4) scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞な どを用いて作製することができる。例えば、上記 1より得られたハイプリドーマより抗体 の V領域をコードする DNAを、 scFv発現用ベクターにクローユングし、 scFv発現べクタ 一を作製することができる。 scFv発現用ベクターとしては、 scFvの DNAを組み込み発 現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCANTAB5E (Phar macia社製）、 pHFA (Human Antibodies &Hybridomas, 5, 48-56, 1994)などがあげら れる。 scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させるこ とで、ファージ表面に scFvがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを 得ることができる。また、 scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプ ラズムに scFvを生成蓄積させることができる。封入体力もは、通常蛋白質で用いられ るリフォールデイング法により、活性のある scFvとすることができ、また、ペリブラズムに 発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソ-ケーシヨンなど の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールデイング後ある いは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一 な scFvを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PR ESS, 1996)。
(5) diabodyの作製
diabodyは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用 いて作製することができる。例えば、上記 1より得られたノ、イブリドーマより抗体の VHと VLをコードする DNAを取得後、リンカ一がコードするアミノ酸残基が 8残基以下となる ように連結した DNAを作製し、 diabody発現用ベクターにクローユングし、 diabody発現 ベクターを作製することができる。 diabody発現用ベクターとしては、 diabodyの DNAを 組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCAN TAB5E (Pharmacia社製）、 pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994)など があげらる。 diabody発現ベクターを導入した大腸菌の封入体ある 、はペリプラズムに diabodyを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフ オールデイング法により、活性のある diabodyとすることができ、また、ペリプラズムに発 現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソ-ケーシヨンなどの 処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールデイング後あるい は菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一な scFvを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRE SS, 1996)。
(6) dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用い て作製することができる。まず、上記 1より得られたノ、イブリドーマより抗体の VHおよ び VLをコードする DNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシス ティンに置換された DNAを作製する。作製した各 DNAを dsFv発現用ベクターにクロ 一ユングし、 VHおよび VLの発現ベクターを作製することができる。 dsFv発現用べクタ 一としては、 dsFv用の DNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いる ことができる。例えば、 pULI9 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)などがあげら れる。 VHおよび VLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプ ラズムに dsFvを生成蓄積させることができる。封入体ある!/、はペリプラズムカも VHお よび VLを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、活性のあ る dsFvとすることができる。リフォールデイング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよ びゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Protein Engineering, 7, 697-704 , 1994) ο
実施例 1
抗 HB-EGFモノクローナル抗体の作製
(1)免疫原の調製
R&Dシステム社製リコンビナントヒト分泌型 HB-EGF (カタログ番号 259-HE/CF)凍 結乾燥品をダルベッコリン酸バッファー（Phosphate buffered saline: PBS)にて溶解し たもの、または免疫原性を高める目的で以下の方法で KLH (カルビオケム社)とのコ ンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、 HB-EGFを 0.1M 酢酸アンモ-ゥム バッファー（PH7.0)に溶解したものと、 KLHを 0.1M 酢酸アンモ-ゥムバッファー（PH 7.0)に溶解して 30 mgZmLに調整したものを、重量比 4: 1となるよう混合し、終濃度 0 .05%のダルタールアルデヒドを添加し、室温で 5時間、攪拌反応させた。反応後、 PB Sで透析したものを免疫原として用いた。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（1)で調製した HB- EGFまたは HB- EGF- KLH 25 gを水酸化アルミニウムァ ンュノ ント [Antibodies - A Laooratory ManuaL, CoLd Spring Harbor Laboratory, p9 9、 1988] 2 mgおよび百日咳ワクチン (千葉県血清研究所製） 1 X 109細胞とともに HB- EGF欠損マウス (大阪大学微生物病研究所 細胞機能分野研究室より供与、 PNAS、 VOL.100, NO.100、 3221-3226、 2003)に投与した。投与 2週間後より、 HB- EGFまた は HB- EGF- KLH 25 gのみを 1週間に 1回、計 4回投与した。該マウスの眼底静脈よ り部分採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体 価を示したマウス力も最終免疫 3日後に脾臓を摘出した。脾臓を MEM (Minimum Esse ntiaL Medium)培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（120 0 rpm、 5分間）した。得られた沈殿画分にトリス—塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (PH7.6)を 添加し、 1〜2分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分 (細胞画 分)を MEM培地で 3回洗浄し、細胞融合に用いた。
(3)酵素免疫測定法 (バインディング ELISA)
アツセィには実施例 1 (1)の HB- EGFを 96穴の ELISA用プレート（グライナ一社）に 0. 5 μ g/mL、 50 μ L/穴で分注し、 4度で一晩放置して吸着させたものを用いた。該プ レートを洗浄後、 1 %牛血清アルブミン (BSA) -PBSを 50 /z L/穴加え、室温で 1時 間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、 1% BSA-PBSを捨て、該プレ ートに一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイプリドーマ培養上清を 50 μ L/穴分 注し、 2時間放置した。該プレートを 0.05%ポリオキシエチレン（20)ソルビタンモノラウ レート [ (ICI社商標 Tween 20相当品：和光純薬社製) 1/PBS (以下 Tween-PBSと表記） で洗浄後、 2次抗体としてペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウス IgGガンマ鎖 (キルケ ガード アンド ペリー ラボラトリーズ社)を 50 L/穴加えて室温、 1時間放置した。 該プレートを Tween-PBSで洗浄後、 ABTS〔2.2-アジノビス（3-ェチルベンゾチアゾー ル -6-スルホン酸）アンモ-ゥム〕基質液〔lmmoL/L ABTS/0.1moL/L クェン酸バッ ファー（PH4.2)、 0.1 %H202〕を添カ卩し、発色させ OD415 nmの吸光度をプレートリー ダー（Emax;MoLecuLar Devices社）を用いて測定した。
(4)マウス骨髄腫細胞の調製
8-ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U.l (P3- U1： ATCCより購入）を 10%ゥシ胎児血清添加 RPMI1640 (インビトロジヱン社)で培養し、細胞融合時に 2 X 1 07個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
(5)ハイプリドーマの作製
実施例 1 (2)で得られたマウス脾細胞と実施例 1 (4)で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1 になるよう混合し、遠心分離（1200rpm、 5分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよ くほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングリコール— 1000 (PEG-lOOO) l g、 MEM培地 1 mL、およびジメチルスルホキシド 0.35 mLの混液を 108個のマウス脾細 胞あたり 0.5 mLカ卩え、該懸濁液に 1〜2分間毎に MEM培地 lmLを数回加えた後、 M EM培地を加えて全量が 50 mLになるようにした。該懸濁液を遠心分離 (900 rpm、 5分 間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットに よる吸込み吸出しでゆるやかに HAT培地〔10 %ゥシ胎児血清添加 RPMI 1640培地に HAT Media Supplement (インビトロシ'、ェン社製）をカ卩えた培地〕 100 mL中に懸濁した o該懸濁液を 96穴培養用プレートに 200 L/穴ずつ分注し、 5%COインキュベータ
2
一中、 37°Cで 10〜14日間培養した。培養後、培養上清を実施例 1 (3)に記載した酵 素免疫測定法で調べ、 HB-EGFに反応する穴を選び、そこに含まれる細胞から限界 希釈法によるクローユングを 2回繰り返し、抗 HB-EGFモノクローナル抗体産生ハイブ リドーマ株 KM3566、 KM3567, KM3579, KM3580および KM3841を確立した。
(6)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（BALB/c)に実施例 1 (5)で得られたノヽイブ リドーマ株を 5〜20 X 106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、ハイブリド 一マが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜8 mL/匹） した。該腹水を遠心分離 (3000 rpm、 5分間）し固形分を除去した。精製 IgGモノクロ一 ナル抗体は、力プリル酸沈殿法 [Antibodies - A Laboratory ManuaL, Cold Spring H arbor Laboratory, 1988〕により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサ ブクラスはサブクラスタイピングキットを用いた ELISA法により決定した。その結果、モ ノローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3580のサブクラスは IgGlであり、 KM3579, K M3841のサブクラスは IgG2bであった。
実施例 2
モノクローナル抗体の反応性の検討
(1)バインディング ELISAにおける HB-EGFとの反応性
バインディング ELISAは、実施例 1 (3)に示した方法に従って行なった。 1次抗体に はモノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, KM3580, KM3841,および陰性 対照抗体 KM511 (抗 GCSF誘導体モノクローナル抗体）の各精製抗体を 10 μ g/mLか ら 5倍希釈で段階的に希釈したものを用いた。 [0085] 結果を図 1に示す。モノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, KM3580およ び KM3841は、いずれも HB- EGFに反応し、 BSAには全く反応しなかった。
(2)ウェスタンブロットにおける HB-EGFとの反応性
1レーンあたり、 20 ngの HB- EGF (R&D社）を SDS-ポリアクリルアミド電気泳動にて分 画し、泳動後のゲルを PVDF膜に転写した。該膜を 10 % BSA-PBSでブロッキング後 、モノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, KM3580, KM3841,および陰性 対照抗体 KM511の精製抗体をそれぞれ 1 μ g/mL/l%BSA-PBSにて室温で 2時間反 応させた。該膜を Tween-PBSでよく洗浄した後、希釈したペルォキシターゼ標識マウ スィムノグロブリン (ザィメット社)を室温で 1時間反応させた。該膜を Tween-PBSでよく 洗浄し、 ECLTMウェスタンブロッテイングディテクシヨンリージェンッ（アマシャムファ ルマシア社製)を用いてバンドを検出した。
[0086] モノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, KM3580, KM3841は!、ずれも HB -EGFの分子量に該当する 15〜30キロダルトン付近のバンドを検出した。
実施例 3
[0087] HB-EGF定量系の構築
(1)ピオチン標識抗体の調製
モノクローナル抗体 KM3566、 KM3567, KM3579, KM3580, KM3841の精製抗体を 、 PBSを用いて 1 mg/mL/PBSに調製し、該抗体溶液と 0.5 mol/L炭酸バッファー（PH 9.2)を容量比 4 : 1で混合し、さらに炭酸バッファーと同量の 1 mg/mL EZ-Link Sulfo- NHS- Biotin (ピアス社） /Ν,Ν-ジメチルホルムアミドを添カ卩した。室温でゆっくりと 1.5時 間攪拌反応させた後、 PBS透析により遊離のピオチンを除いた後、ピオチン標識抗体 として用いた。
(2)サンドイッチ ELISAによる分泌型 HB- EGFの定量
96穴 ELISAプレートにモノクローナル抗体を 5 μ g/mL/PBS、 50 μ L/穴で分注し、 4 度で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、 1 %BSA-PBSを 50 /z L/穴加 え、室温で 1時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、 1%BSA-PBS を捨て、該プレートに 1 μ g/mLから 5倍希釈で段階的に希釈した分泌型 HB- EGFを 5 0 L/穴分注し、 2時間放置した。該プレートを Tween-PBSで洗浄後、 2次抗体として（ 1)で調製したピオチン標識抗体 (2 μ g/mL)を 50 μ L/穴加えて室温、 1時間放置した 。該プレートを Tween- PBSで洗浄後、希釈したペルォキシダーゼ標識ストレプトアビ ジン (ベクター社)を 50 /z L/穴加えて室温、 1時間放置した。該プレートを Tween-PBS で洗浄後、 ABTS基質液を添カ卩して発色させ、 OD415 nmの吸光度を、プレートリーダ 一 (Emax)を用いて測定した。
[0088] 図 2に示すように、モノクローナル抗体 KM3566を固相化し、ピオチン標識モノクロ一 ナル抗体 KM3579またはピオチン標識モノクローナル抗体 KM3580を用いた組み合 わせ、モノクローナル抗体 KM3567を固相化し、ピオチン標識モノクローナル抗体 KM 3579またはピオチン標識モノクローナル抗体 KM3580を用いた組み合わせ、モノクロ ーナル抗体 KM3579を固相化し、ピオチン標識モノクローナル抗体 KM3566またはビ ォチン標識モノクローナル抗体 KM3567を用いた組み合わせ、モノクローナル抗体 K M3580を固相化し、ピオチン標識モノクローナル抗体 KM3566、ピオチン標識モノクロ ーナル抗体 KM3567またはピオチン標識モノクローナル抗体 KM3841を用いた組み 合わせ、モノクローナル抗体 KM3841を固相化し、ピオチン標識モノクローナル抗体 K M3580を用いた組み合わせにおいて、 HB-EGFを高感度に検出することができた。 産業上の利用可能性
[0089] 本発明によれば、分泌型 HB-EGFの異なるェピトープに結合する 2種類のモノクロ ーナル抗体を用いることを特徴とする、簡便かつ迅速に測定することが可能な、生体 試料中の分泌型 HB-EGFを測定する方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号 1-人工配列の説明：分泌型 HB— EGFアミノ酸配列
配列番号 2-人工配列の説明： EGF様ドメインアミノ酸配列
配列番号 3-人工配列の説明： EGF様ドメインアミノ酸配列

Claims

請求の範囲
[1] 分泌型へパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（epidermal growth factor-like gr owth factor,以下、分泌型 HB-EGFと称す）の異なるェピトープに結合する 2種類の モノクローナル抗体または抗体断片を用いることを特徴とする、分泌型 HB-EGFの測 定方法。
[2] 分泌型 HB- EGF含有被検液を、分泌型 HB-EGFに結合するモノクローナル抗体 (以 下、抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Aと称す)またはその抗体断片を結合させ た固相へ加えて、当該固相中の当該モノクローナル抗体またはその抗体断片と分泌 型 HB-EGFとを結合させ、当該固相に標識した抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗 体 Aとは異なる分泌型 HB-EGFのェピトープに結合するモノクローナル抗体 (以下、 抗分泌型 HB-EGFモノクローナル抗体 Bと称す)またはその抗体断片をカ卩えて免疫反 応を行 ヽ、固相中の標識を測定することを特徴とする該被検液中の分泌型 HB-EGF の測定方法。
[3] 2種類のモノクローナル抗体力 以下の（a)から（e)から選ばれる 2つのモノクローナ ル抗体である、請求項 1または 2項に記載の方法。
(a)ハイプリドーマ KM3566 (FERM BP— 10490)が生産するモノクローナル抗体 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(b)ハイブリドーマ KM3579 (FERM BP— 10491)が生産するモノクローナル抗 体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(c)ハイブリドーマ KM3567 (FERM BP— 10573)が生産するモノクローナル抗体 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(d)ハイブリドーマ KM3580 (FERM BP— 10574)が生産するモノクローナル抗 体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
(e)ハイプリドーマ KM3841 (FERM BP— 10575)が生産するモノクローナル抗体 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体
[4] 分泌型 HB-EGFの異なるェピトープに結合する 2種類のモノクローナル抗体またはそ の抗体断片を含む、分泌型 HB- EGFの測定用キット。
[5] ハイプリドーマ KM3580 (FERM BP— 10574)が生産するモノクローナル抗体が 結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
[6] ハイプリドーマ KM3841 (FERM BP— 10575)が生産するモノクローナル抗体が 結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
[7] 請求項 5または 6記載のモノクローナル抗体を生産するノ、イブリドーマ。
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