CN1860132A - 细胞外Hsp90的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了细胞外Hsp90的抑制剂。细胞外Hsp90的抑制导致肿瘤细胞的侵袭力降低。此外，本发明涉及抑制细胞外Hsp90功能的分子用于生产治疗或者预防癌细胞的侵袭和/或转移潜力的药物的用途。

Description

细胞外Hsp90的抑制剂
本发明受到National Institutes of Health授予的CA81668的政府支持。政府具有本发明的一定权利。
发明背景
恶性肿瘤脱落细胞，其迁移到新的组织并产生继发性肿瘤。产生继发性肿瘤的过程称为转移并且是复杂的过程，其中肿瘤细胞在远离原发性肿瘤的部位定居。Liotta((1986)Cancer Res.46，1-7)已经提出转移过程的三步假说：第一步是肿瘤细胞通过细胞表面受体附着。然后锚定的肿瘤细胞分泌水解酶或者诱导宿主细胞分泌酶，所述酶局部降解基质。在接近肿瘤细胞表面的高度局部化区域最可能发生基质裂解。第三步是肿瘤细胞移动到被蛋白水解改变的基质区域。从而，基质的侵袭不仅仅是由于被动生长压力而且需要主动生物化学机制。周围正常组织的降解是恶性肿瘤侵袭力的主要特征。转移形成的过程取决于肿瘤细胞的侵袭力。因此，开发抑制侵袭力从而防止原发性肿瘤转移的药物是有用的。
最近，研究集中在鉴定参与转移的特定蛋白，其可以用作更好的诊断或者改进的治疗策略的基础。已经鉴定为分子伴侣分子并且对于几种致癌蛋白的稳定性和功能必需的一种蛋白是热激蛋白90(Hsp90)。该名称是一般术语，用于描述称作Hsp90α和β的两种同种型。Hsp90同种型的结构和功能在Csermely等人：Pharmacol.Ther.卷79，1998，No.2，The 90-kDa Molecular Chaperone Family：Structure，Function，and Clinical Applications.AComprehensive Review，p.131，p.146中描述。Hsp90是真核细胞的细胞质中最丰富的伴侣蛋白并且约组成细胞中所有蛋白的1-2％。Hsp90的细胞内功能包括蛋白(类固醇受体)的稳定和诸如激酶和其他信号传导蛋白的蛋白的成熟。然而，Hsp90与多种功能有牵连，所述功能包括突变蛋白的进化稳定性、细胞骨架重排、细胞核转运、细胞增殖和细胞凋亡、蛋白降解、抗原呈递和脂多糖识别。Hsp90在细胞中非常丰富，还与许多疾病有关，所述疾病为从癌症到自身免疫病到心血管疾病。例如，针对Hsp90的免疫显性LKVIRK表位的单克隆抗体在真菌感染的治疗中显示出治疗活性并且由Neutec公司以商标名Mycogrip用于临床试验。
还表明细胞对应激应答而分泌Hsp90(Liao等人(2000)J.Biol.Chem.275，189-96)，但是还未知该分泌的相关的功能。
尽管Hsp90在细胞内具有确定的功能，但是关于其在细胞外的发生和其功能报导很少。已经发现Hsp90是抗原呈递细胞上受体的有效抗原肽呈递分子(presenter)。还发现Hsp90是与细胞的细胞外表面上脂质筏(lipid raft)结合的四种蛋白之一，所述蛋白结合脂多糖并启动细胞内应答(Triantafilou等人(2002)Trends inImmunology 23，301-4)。已经发现Hsp90在某些肿瘤细胞的表面上超表达，这些细胞为：microcitomas、黑素瘤和肝癌细胞系(Ferrarini等人(1992)Int.J.Cancer 51，613-19)。已经假定这些细胞系表面上的Hsp90的表达与抗原呈递有关，但是还不能得到清楚的证据。
由于Hsp90与调节在肿瘤的表型驱动中重要的几种信号传导途径有关，所以Hsp90当前正被评估作为抗癌药物开发的细胞内靶。Hsp90功能的抑制已经表明导致参与细胞增殖、细胞周期调节和细胞凋亡的信号传导蛋白的选择性降解。最近已经表明一些已知的抗生素(例如，格尔德霉素、根赤壳素和香豆霉素A1)是Hsp90的抑制剂并且在WO 00/53169中描述。在该文献中，提出了抑制伴侣蛋白与其客户分子结合的方法，其中所述方法提出将伴侣蛋白与香豆素或者香豆素衍生物接触。然而，WO 00/53169的教导仅涉及细胞间Hsp90蛋白的抑制。
已经在临床试验中测试了例如格尔德霉素类似物17-AAG的抑制剂，但是存在穿过所有细胞区室的蛋白的非特异抑制导致的毒性问题(Dunn(2002)J.Natl.Cancer Inst 94，1194-5)。此外，缺乏对多种细胞信号传导过程中Hsp90与其客户蛋白之间相互作用的了解使得存在用毒性抑制剂抑制细胞内Hsp90的潜在危险。
确定蛋白的生理功能是确定干扰该蛋白功能是否是治疗疾病的可能方法的先决条件。必须记住在生理条件下，即在患者的天然发生的肿瘤细胞中，Hsp90与其他蛋白一起作用，所述蛋白可以相互调节和干扰。Hsp90和相互作用蛋白之间的功能相互作用决定了其生理作用。
还报导Hsp90作为细胞核中跨膜蛋白转运的分子伴侣(Schlatter等人(2002)Biochem.J.362，675-84)，并且与白血病、肺癌和卵巢癌细胞中药物流出有关(Rappa等人，(2002)Oncol.Res.12，113-9和Rappa，等人(2000)Anticancer Drug Des15，127-34)。
本发明首次阐明细胞外Hsp90的抑制导致肿瘤细胞侵袭力的降低。本发明还表明了抑制细胞外Hps90的新方法，从而可以防止与攻击细胞外Hsp90有关的副作用。
本发明还表明了Hsp90抑制和基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌之间的相互关系。MMPs通过消化周围细胞外基质以允许细胞通过穿过致密组织进行侵袭。我们的结果表明Hsp90当在纤维肉瘤细胞中超表达时通过增加MMPs的分泌或者活性而对于癌细胞的侵袭是关键的。我们还证明使用本发明的分子可以抑制依赖Hsp90的侵袭。
本发明涉及使用干扰肿瘤细胞上的细胞外Hsp90功能的分子治疗特定癌症。提供了可用于减少或者抑制特定肿瘤细胞的侵袭力和/或转移潜力的化合物、组合物和方法。此外，提供了允许确定肿瘤细胞是否依赖于功能性细胞外Hps90实现其侵袭力和/或转移潜力的方法。
发明概述
本发明涉及可以特异结合细胞外Hsp90的分子。此外，如果需要，本发明的分子可以用可检测基团标记，或可以是生物缀合物(bioconjugate)的部分。
本发明还涉及含有细胞外Hsp90的抑制剂的药物组合物。
在另一实施方案中，本发明涉及编码细胞外Hsp90的抑制剂的核酸分子(如果抑制剂选自多肽、抗体或者抗体片段)，以及含有这类核酸的载体和含有这类载体的宿主细胞。
在另一实施方案中，本发明还涉及抑制细胞外Hsp90功能的分子用于生产治疗或者预防癌细胞的侵袭和/或转移潜力的药物的用途。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗或者预防患者中细胞的侵袭和/或转移潜力的方法，其中所述方法包括对有需要的人施用治疗有效量的根据本发明的分子，和/或药物组合物。
在另一实施方案中，本发明涉及确定癌细胞侵袭力对细胞外Hsp90的功能性的依赖性的方法。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定用于抑制癌细胞的侵袭力的分子，尤其鉴定结合Hsp90的此类配体的方法。
在另一实施方案中，本发明涉及用于降低基质金属蛋白酶(MMP)活性的分子类别的用途。
定义
如文中所用，除非另外说明，将应用下面的定义。
如文中所用“多肽”是含有多于10个、优选多于20个、最优选多于30个，且少于10000个，更优选少于2500个，最优选少于1000个氨基酸的分子。还包括含有修饰或者非天然氨基酸的多肽。
如文中所用术语“抗体”和“免疫球蛋白”指任意免疫结合剂，包括多克隆抗体和单克隆抗体。依赖于重链中的恒定结构域的类型，将抗体分成5大类之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些大类的一些还分成亚类或者同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。
抗体还可以选自经修饰的免疫球蛋白，例如，化学或者重组产生的抗体、CDR移植抗体或者人源化抗体、定点诱变抗体，它们在它们的CDR区，尤其CDR3区中显示出与本发明的相应抗体片段相当大的氨基酸序列同一性并且保持与相应抗体片段基本相同的对Hsp90结合的亲和力。
抗体的CDRs(互补决定区)是这些分子的部分，它们决定抗体的特异性并且与特定配体接触。CDRs是该分子的最易变的部分并且造成这些分子的多样性。
本文中所用的“相当大氨基酸序列同一性”指两条所比对的氨基酸序列，尤其比对的CDRs具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％相同，更优选仅5个氨基酸不同，更优选仅3个氨基酸不同，更优选仅1个氨基酸不同。
术语“抗体片段”用于指具有抗原结合区的抗体样分子的任意片段，并且该术语包括诸如scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、单结构域抗体(DABs)、微型双功能抗体(diabody)等等的抗体片段。制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域众所周知的(见Kabat等人(1991)J.Immunol.147，1709-19)，特别并入本文作用参考。
“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链中。通常，scFv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，该接头使得scFv形成用以抗原结合的所需的结构。
“Fv”片段是保留完整抗原结合部位的最小的抗体片段。
“dsFv”是二硫化物稳定的Fv。
“Fab”片段是抗原结合片段，其含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。
“Fab’”片段是还原的F(ab’)2片段。
“F(ab’)2”片段是含有通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段。
“单结构域抗体(DAB)”是具有仅一条(而不是两条)来源于抗体结构的仅一个结构域的蛋白链的抗体。Dab利用如下发现，即对于某些抗体，抗体分子的一般几乎和完整分子一样好地结合其靶抗原(Davies等人，(1996)Protein Eng.9：531-537)。
“微型双功能抗体”是二价或者双特异抗体，其中VH和VL结构域在一条多肽链上表达，但是使用的接头太短而不允许相同链上的两个结构域配对，从而强迫所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位(Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6444-6448)。
文中所用术语“生物缀合物”指细胞外Hsp90的抑制剂分别共价或者非共价连接和/或偶联另一种蛋白、固体基质(例如，珠子)，从而该抑制剂自身形成多聚体，或者连接和/或偶联细胞毒性剂，其增强对靶定细胞的毒性，或者连接和/或偶联细胞抑制剂、前体药物或者效应分子，其能够修饰表达Hsp90的细胞或者募集免疫细胞。
术语“标记”或者“被标记的”分别指可检测的标记或者所述标记的掺入，例如，通过掺入荧光团-、生色团-或者放射-标记的氨基酸或者使荧光团-，生色团-或放射标记与配体附着，或者使通过经标记的第二种分子检测的部分附着来实现掺入，所述经标记的第二种分子含有可以通过光学或者比色方法检测的荧光标记或者酶活性。这种两步检测系统的实例是众所周知的生物素-抗生物素蛋白系统。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域公知的(例如，见Lobl等人(1988)Anal.Biochem.，170，502-511)并且可应用于不同类别的分子。
“表位”包括能够特异结合免疫球蛋白或者抗体片段的任意蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团，如暴露的氨基酸、氨基糖或者其他糖侧链组成并且通常具有特异三维结构特征，以及特定电荷特征。
如文中所用的“治疗转移性肿瘤”或者“治疗微转移”指肿瘤的转移受到作为单一药物或者与其他药物联合的本发明分子的稳定化、预防、延迟或者抑制。稳定疾病或者“无变化”(NC)描述如下疾病过程，其中在至少四周内转移无变化或者减小少于50％或者增加少于25％。预防可以为例如，治疗开始后没有检测到新转移。这可以导致与未受治疗的患者相比受到治疗的患者的2-到3倍中位数和/或％-年存活率。延迟可以表示治疗开始后在至少8周、3个月、6个月或者甚至1年内没有检测到新的转移。抑制可以指与未受治疗的组相比，用本发明的分子治疗的组的新转移的平均大小或者总数低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或者甚至90％。肿瘤学领域的技术人员按照用于检测转移的通常接受的实践和诊断方法，例如，Harrisons Principles of Internal Medicine第15版，2001Mc Graw Hill中概述的可以检测转移的数目、大小和流行。
如文中所用“转移瘤”包括能够转移的处于原发部位的肿瘤和处于继发部位的转移的肿瘤。
“微转移”是大小小于2mm的肿瘤细胞的积累，其通常仅可以通过组织学方法检测。
如文中所用“侵袭力”是细胞通过其他细胞层迁移或者通过细胞外基质迁移的能力。可以通过实施例中描述的Matrigel测定法评估侵袭力。侵袭测量为在一定温育期间内达到滤器的下表面的细胞的百分数。
如文中所用“转移潜力”是肿瘤细胞在远离该肿瘤细胞所来源的原发肿瘤的部位形成新肿瘤(转移)的能力。“治疗有效量”是除去或者减小患者的肿瘤负担，或者防止、延迟或者抑制转移的量。剂量将依赖于许多参数，包括肿瘤的性质、患者病史、患者状况、细胞毒性剂的可能的共同使用和施用方法。施用方法包括注射(例如，肠胃外、皮下、静脉内、腹膜内，等等)，其中抑制细胞外Hsp90功能的分子在无毒的药学上可接受的载体中提供。通常选择适宜的载体和稀释剂以便不显著损害结合剂的生物学活性(例如，结合特异性、亲和性和稳定性)，如水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、5％人血清清蛋白、固定油类、油酸乙酯或者脂质体。可接受的载体可以包括生物相容的、惰性或者生物可吸收的盐、缓冲剂、寡糖或多糖、聚合物、粘弹性化合物如透明质酸、粘性提高剂、防腐剂等等。此外，药物组合物或者制剂还可以包括其他载体、佐剂或者无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等等。一般的剂量可以为约0.01到约20mg/kg，或者更具体地，约1到约10mg/kg。
使用抑制Hsp90功能的分子的治疗方法可以与化学疗法、手术和放射疗法联合，这依赖于肿瘤的类型、患者状况、其他健康问题和多种因素。抑制Hps90功能的分子还可以用作治疗组合物的单一有效药物。
“抑制细胞外Hps90的分子”是导致细胞外Hsp90的生物学活性的抑制的分子。细胞外Hsp90的生物学活性的抑制可以通过测量细胞外Hsp90的生物学活性的一种或多种指标(如Hsp90依赖性的侵袭力)来评估。Hsp90的生物学活性的这些指标可以通过几种体外或者体内测定法的一种或多种来评估(见实施例)。优选地，通过侵袭性人细胞，尤其实施例中所用的细胞的Hsp90诱导的侵袭力的抑制来评估分子抑制Hsp90活性的能力。
本发明的“抑制细胞外Hsp90功能的分子”不是作为蛋白功能的通常抑制剂的分子，像蛋白酶，像变性剂，例如，尿素或者盐酸胍，像重金属原子或者像与生物分子(脂质、蛋白、糖)共价和非特异反应的小分子(例如，醛或者异氰酸盐)。抑制理解为与在相同实验条件下不含本发明的分子的阴性对照相比功能的降低。
此外，对于本发明的多肽，尤其本发明的抗体或者抗体片段，如果当所述抗体片段以1nM到50μM，优选约20μM存在时，本发明多肽在如实施例描述的实验中降低癌细胞的侵袭力30％以上，优选60％以上，那么认为本发明的多肽抑制细胞外Hsp90的生物功能。
此外，对于细胞外Hsp90的抑制剂，如果所述抑制剂当以10nM到100μM，优选约1μM浓度存在时，在如实施例描述的实验中降低侵袭性癌细胞的侵袭力30％以上，优选60％以上，那么本发明包括所述抑制剂。
文中所用“细胞外Hsp90”是与细胞膜松散结合且在细胞外的Hsp90，并且不将其理解为包括分离的Hsp90。这可以包括通过翻译后修饰或者物理整合将Hsp90插入细胞膜从而将Hsp90暴露于细胞的细胞外表面或者将Hsp90分泌到细胞外空间。
术语细胞外Hsp90的“抑制剂乃是任意实体，其结合细胞外Hsp90并且降低其功能，特别是关于细胞性质，如侵袭力和/或转移潜力。这种实体可以是离子或者非离子的有机或无机小分子(例如，优选具有小于1500Da的分子量)；天然和非天然发生的大分子；可以经修饰，尤其经天然发生的或者非天然发生的糖部分或者化学修饰的多肽；抗体，尤其单克隆抗体、抗体片段，等等。
如果不另外指出，术语“a”不被理解为“一个”并且可以指“一个和/或一个以上”。
发明详述
为了更完整地理解本发明，提供了下面的详细描述。
本发明涉及抑制剂，其可以特异结合细胞外Hsp90或者更具体地，可以抑制与癌细胞的侵袭力和/或转移潜力有关的Hsp90功能。细胞外Hsp90的抑制剂优选基本上不能进入细胞或者以如此方式修饰从而该修饰基本上抑制其细胞摄入。本发明抑制剂的修饰可以通过将所述抑制剂缀合到天然发生的大分子，如多肽、糖或者人造生物相容的聚合物来实现。
优选地，本发明的抑制剂为分别与另一种蛋白、固体基质(例如，珠子)的生物缀合物，从而该抑制剂自身形成多聚体，或者与将增强对靶定细胞的毒性的细胞毒性剂、能够修饰表达Hsp90的细胞或者募集免疫细胞的细胞抑制剂、前体药物或者效应分子的生物缀合物。
从而，用于抑制细胞外Hsp90的本发明抑制剂可以是细胞内Hsp90的公知的抑制剂，如格尔德霉素及其类似物，如17 AAG；根赤壳素；香豆素抗生素，如新生霉素或者基于嘌呤的Hsp90抑制剂，如PU3(当用于抑制细胞外Hsp90时)。然而，优选修饰公知抑制剂从而细胞摄入基本上被阻止从而消除与(细胞内)Hsp90的抑制剂的可能的毒性有关的任何副作用。
一组细胞毒性剂包括，但不限于，柔红霉素、紫杉醇、阿霉素、氨甲蝶呤、5FU、长春灭瘟碱、放线菌素D、依托泊苷、顺铂、阿霉素、金雀黄素和核糖体抑制剂(例如，trichosantin)，或者多种细菌毒素(例如，假单胞菌外毒素、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)A蛋白)。
本发明的抑制剂优选选自多肽、抗体、抗体片段、香豆素和/或基于嘌呤的Hsp90抑制剂和它们的类似物。
使用多种双功能蛋白偶联剂制备含有本发明的多肽，尤其本发明的抗体片段或者抗体以及细胞毒性部分的生物缀合物。这些试剂的一些实例为3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)；亚氨酸酯的双功能衍生物，如dimethyl adipimidate HCl；活性酯，如辛二酸二琥珀酰亚胺酯；醛如戊二醛；双叠氮基(bisazido)化合物，如his(R-叠氮基苯甲酰)己二胺；双重氮衍生物，如双-(R-重氮基苯甲酰)乙二胺；二异氰酸酯，如甲苯2，6-二异氰酸酯；和双活化的含氟化合物，如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。用于产生生物缀合物的方法在March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms and Structure，第五版，Wiley-Interscience；或Bioconjugate Techniques，Ed.Greg Hermanson，Academic Press中详述。
在另一优选实施方案中，本发明的多肽为抗体，在一个优选实施方案中，为来源于scFv抗体片段的抗体，在另一优选实施方案中，为多克隆或者单克隆抗体，尤其是人单克隆抗体。
结合细胞外Hsp90的抗人Hsp90抗体可以选自经修饰的免疫球蛋白，例如，化学或者重组产生的抗体或者人源化抗体、定点诱变抗体，所述经修饰的免疫球蛋白在它们的CDR区，尤其在它们的CDR3区域中显示出与本发明的相应抗体片段相当大的氨基酸序列同一性，并且保持与相应抗体片段基本相同的对Hsp90结合的亲和性。
在另一优选实施方案中，抗人Hsp90抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，尤其IgG和IgM，更具体地，IgG1、IgG2a、Ig2b、IgG3、IgG4。
在本发明的另一优选实施方案中，本发明的抑制剂具体为抗体片段。
优选地，本发明的抑制剂为抗体片段，尤其scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、单结构域抗体或者微型双功能抗体，更具体地，scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或者微型双功能抗体，更具体地，scFv、单结构域抗体或者微型双功能抗体，更优选地，scFv。
在另一实施方案中，本发明的抗体片段特异识别Hsp90的一个或多个表位，或者Hsp90的保守变体的表位，或者Hsp90的肽片段。
作为实例，增加本发明分子的生物学活性的一种方法是联合使用所述分子(或者配体)与CALI(生色团辅助激光/光灭活)。
CALI(生色团辅助激光/光灭活)的原理是基于光化学反应的局部起始，其导致产生短暂的活性种类，这些活性种类又选择性修饰靶分子并导致其功能失活。高度特异但是非抑制性配体(例如，抗体、抗体片段、小分子)经适宜的荧光团(例如，异硫氰酸荧光素)标记。在靶分子(例如，蛋白)和配体之间形成复合体后，用激光或者白色光照射复合体以分别激发生色团或者荧光团。该激发触发光化学反应，其启动产生短暂活性种类(例如，羟基自由基或者高度活性氧种类)。这些活性种类在它们产生部位周围的小半径范围内修饰该蛋白。由于活性种类的短寿命，其可以行进的距离非常短。因此，蛋白内氨基酸残基的修饰在非常接近配体的结合位点处发生。损伤效果局限于15-40的半径，其远低于细胞内两种蛋白的平均距离，该平均距离为约80，(假设平均胞质蛋白浓度为300mg/ml，平均蛋白大小为50kDa)，从而确保该过程的高度空间分辨率。该原理在图12中显示。对于配体的结合位点接近或者位于所述蛋白的重要功能结构域内的情况，这些诱导的修饰导致该蛋白的永久失活。该蛋白的功能失活以适宜的读出测定法测量并且在疾病相关的生理功能背景，像细胞侵袭、细胞粘着、细胞信号传导或细胞凋亡中评价。
用CALI失活蛋白对于各自蛋白是非常特异的。Linden等人表明用孔雀绿标记的抗-β-半乳糖苷酶抗体甚至在该相同溶液中存在碱性磷酸酶的条件下也可以使β-半乳糖苷酶有效失活。激光照射10分钟后95％的β-半乳糖苷酶被灭活而碱性根本不受影响(Linden等人(1992)Biophys.J.61，956-962)。Jay还阐明结合到蛋白的单个表位的染料标记的抗体足够灭活乙酰胆碱酯酶(Jay(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5454-58)。
Henning等人描述针对多种蛋白成功应用CALI(Henning等人Drug Discovery 62-71)。这些蛋白包括膜蛋白(例如，T细胞受体的α-、β-、ε-链，β1整联蛋白、ephrin A5或者FAS受体)、信号转导分子(例如，Calicineurin、亲环蛋白A或者PKC)、细胞骨架蛋白(例如，肌动蛋白、埃兹蛋白或驱动蛋白)或者转录因子。Henning等人还描述CALI可用于鉴定作为药物靶的新蛋白，并且同时阐明它们在目的生物背景中的功能(Henning等人(2002)CurrentDrug Discovery May，17-19)。
CALI的一些应用实例表明该技术能够将特异但是非抑制性配体转化成阻断试剂。因此，这些配体可用于调节抑制性配体的作用。CALI还可以用于进一步增强本身已经具有抑制效果的配体的抑制效果。实验部分说明了实施例，其中在侵袭力或者粘着测定中整合CALI。
分子的化学修饰可以是加入生色团或者荧光团。生色团是由于与光相互作用的流动电子而具有高度光学活性的分子的部分。如果生色团吸收光谱的可见范围的光，那么生色团称作荧光团。生色团的一些实例为例如，荧光素衍生物、罗丹明衍生物、香豆素衍生物、卟啉衍生物、酞菁衍生物、萘酞菁(naphthalocyanines)衍生物、伊红衍生物、三苯基甲烷衍生物或者吖啶衍生物。化学修饰生物分子的一组生色团和有用的衍生物在The Sigma Aldrich Handbooks of Stainsand Dyes，Ed.，F.J.Green(1990)ISBN No.0-941633-22-5中公开。
在本发明的另一方面，用可检测标记标记抑制剂。具体地，可检测标记的实例为放射性同位素、生色团、荧光团或者酶。
通过使用本发明的生物缀合物或者多肽，尤其本发明的抗体或者抗体片段可以检测癌相关的Hsp90抗原的表达。从受试者采集样品，例如，从怀疑患有肿瘤的组织采集活组织检查样品。通常，在进行测定前处理样品。可以使用的测定法包括ELISA、RIA、EIA、蛋白印迹分析、免疫组织学染色等等。依赖于所用的测定法，可以通过酶、荧光团或者放射性同位素标记抗原或者抗体。(见，例如，Coligan等人(1994)Current Protocols in Immunology，John Wiley & SonsInc.，New York，New York；和Frye等人(1987)Oncogene4，1153-1157.)。
在另一实施方案中，本发明的经修饰的多肽或者生物缀合物结合人细胞外Hsp90并减小癌细胞的侵袭力和/或转移潜力。一种测量人癌细胞的侵袭力程度的方法在实施例中给出。
本发明还涉及药物组合物，其含有有效量的细胞外Hsp90的抑制剂，所述药物组合物具体用于减小癌细胞的侵袭力和/或转移潜力。优选地，所述抑制剂基本上不能进入细胞或者以如此方式修饰从而该抑制剂的细胞摄入基本上被阻止。本发明的药物组合物可用于制备预防和/或治疗增殖性疾病如癌症或者转移的药物。
本发明还涉及含有有效量的至少一种抑制剂，尤其一种抗体或者抗体片段的药物组合物，还涉及所述抗体或者抗体片段用于制备预防和/或治疗增殖性疾病、癌症或者转移的药物的用途。
在另一实施方案中，本发明包括诊断试剂盒。这种试剂盒含有至少一种生物缀合物和/或至少一种抑制剂或者它们的标记形式，并且还由实施标准竞争或者夹层测定法所需的试剂和材料组成。所述诊断试剂盒可用于测定生物样品，尤其某些癌细胞类型的侵袭潜力。试剂盒将通常还包含容器。
另一方面，本发明包括筛选或者转体内(ex vivo)测试细胞的侵袭和/或转移行为的方法，该方法包括步骤：
a)在基本上阻止Hsp90抑制剂的细胞摄入条件下将细胞与一种或多种所述Hsp90抑制剂接触；
b)分析根据步骤a)处理的细胞的迁移；
c)比较根据步骤a)处理的细胞与未处理细胞的迁移，和任选地
d)测定根据步骤a)处理的细胞与未处理细胞的迁移百分比。
在本发明该方面的优选实施方案中，实施筛选从而细胞在适于该细胞生长的条件下与凝胶样基质接触并且步骤b)包括分析细胞通过所述基质的迁移。
文中所用术语“凝胶样基质”理解为水含量为至少90％的半固体物质，其允许与所述基质接触培养癌细胞并允许侵袭性癌细胞通过所述“凝胶样基质”的0.1mm到1mm，优选0.3mm厚的片层迁移，但是非侵袭性细胞不能迁移。这种“凝胶样基质”的实例是类似蛋白和糖组合物中细胞外基质的物质，尤其通过商业途径可以获得的“Matrigel”。具体地，“凝胶样基质”含有选自IV型蛋白胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白的蛋白之一。更具体地，凝胶样基质含有IV型蛋白胶原，纤连蛋白和层粘连蛋白。更具体地，凝胶样基质含有IV型蛋白胶原、层粘连蛋白、触觉蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或者IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、触觉蛋白和玻连蛋白。
本发明还提供了通过筛选ALDUs的文库鉴定特异结合Hsp90的抑制剂的方法，其中这些抑制剂能够抑制癌细胞的Hsp90相关的侵袭力、粘着性和/或转移潜力。所述方法包括步骤：
a)将可扩增的配体展示单位(ALDU)的文库与癌细胞，例如，与肉瘤细胞接触；
b)将所述癌细胞和结合所述癌细胞的ALDUs与未结合所述癌细胞的ALDUs分离；
c)扩增结合到所述癌细胞的ALDUs；
d)通过功能筛选测定法鉴定影响Hsp90的所述生物活性的步骤c)后的ALDU或者衍生自ALDU的配体。
e)鉴定能够结合Hsp90的步骤d)后的ALDU或者衍生自ALDU的配体。
f)测定所述配体的化学特性。
优选的——但不是唯一可能的——所述步骤的顺序是a、b、c、d、e和任选f。
文中所用“可扩增的配体展示单位”(ALDU)是具有双重功能的分子或者一组分子：它们可以通过配体结合靶细胞；并且它们具有与所述配体物理结合的关于其特性的信息，其允许个别的单位被鉴定和扩增。ALDUs的实例为可用于选择扩增(SELEX)方法的寡核苷酸，尤其是RNAs，噬菌体展示文库的噬菌体、病毒展示文库的病毒、核糖体展示技术的核糖体，还包括个别化珠子，其携带可鉴定的分子或者配体，尤其是化学实体，例如，结合到珠子的小分子，其能够被惰性化学标记识别。优选这样的ALDUs，其含有作为可鉴定组分的核酸。例如，通过核酸扩增方法像RT-PCR、PCR、LCR等可以体外扩增这些ALDUs，或者它们可以在体内扩增，例如，单个噬菌体可以感染细菌并且几轮感染后可以产生数百万基本上相同的后代。ALDUs文库是一组相似但是通常不同的ALDUs，例如，噬菌体文库的噬菌体，其在另外相同的噬菌体表面的背景中展示不同的scFvs。
文中提到的“来源于ALDU”的配体是这样的配体，其已经通过这种ALDU展示并且已经通过与靶细胞表面的结合进行选择。作为实例，如果ALDU是展示scFv的噬菌体文库的噬菌体，那么“来源于ALDU的配体”在该情况中是多肽，这里为scFv。作为另一实例，对于核糖体展示，“来源于ALDU”的配体是这样的多肽，其通过含有核糖体、RNA和该多肽的复合体呈递。
所述方法有利地组合了基于结合到癌细胞表面的筛选步骤和基于功能测定的筛选步骤。因此，将ALDUs的文库与癌细胞以如此方式接触从而文库的那些对癌细胞的表面抗原具有特异性的ALDUs可以结合与例如癌细胞的表面有关的结构。例如，可以允许展示抗体或者抗体片段的噬菌体文库的噬菌体结合所培养的癌细胞，或者，作为另一实例，可以允许RNA-寡核苷酸文库的RNA结合这类癌细胞。
代表用步骤d)得到的抗体或者抗体片段的ALDUs的特性可以通过例如，对编码所述抗体或者抗体片段的DNA测序来确定，或者对于使用栅格化或编号的噬菌体的商业文库，通过确定栅格位置或者噬菌体数目来确定。栅格位置或者数目可以揭示ALDU代表的抗体或者抗体片段的特性。
文中所用“配体”是通过可扩增的配体展示单位(ALDU)可以展示的分子。配体可以是结合细胞外Hsp90并抑制其功能的任意实体。配体是ALDU的部分，ALDU通过该部分可以结合靶。
如文中提到的“特异结合细胞外Hsp90”的配体可以是在实施例中给出的缓冲液条件下结合Hsp90的配体。可以例如，通过使用所称作的BIACORE系统(见，例如，Fivash等人Curr Opin Biotechnol.(1998)9，97-101)测量配体和Hsp90之间的解离常数，且“特异结合”可以理解为指如果在标准条件下测量，配体和Hsp90之间的解离常数低于10μM，优选低于1μM，更优选低于500、400、300、200、100、50、20nM，最优选为0.1nM到20nM，所述标准条件为例如，20℃，环境压力，和适宜的缓冲液，例如，20mM Tris，100mM NaCl，0.1mM EDTA中，总pH7.0。
文中所用两种组分的“接触”指允许两种组分物理上相互接触并相互结合。
文中所用“分离”指两种或多种组分的物理分离，例如，结合ALDU的细胞可以与游离的ALDU通过离心分离，其中结合ALDU的细胞沉淀下来而游离ALDU仍然在上清液中。
文中所用“扩增”是将ALDU或者来源于ALDU的配体数目增加至少2倍，优选10、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或甚至十亿倍的任意过程。例如，单个噬菌体可以通过感染细菌扩增，并且受感染的细菌产生感染噬菌体的若干大部分相同的拷贝，或者DNA分子可以通过PCR方法扩增产生104个或更多大部分相同的子DNA分子。
文中所用“鉴定”指定位或者识别具有特定性质的个别组分，例如，ALDU，并分离所述个别组分。
文中所用“确定配体的化学特性”指确定配体的结构组成。例如，如果ALDU文库是展示scFv的噬菌体文库，那么“确定配体的化学特性”指测定scFv多肽的序列，例如，通过对编码其所来源的噬菌体的scFv的区域进行测序来测定。
文中所用“筛选测定法乃旨在检测在具有稍微不同的性质的其他相似个体中具特定性质的个体，例如，ALDU。为了具有筛选测定法的资格，必须在某一功能测定中试验至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或甚至100个个体以发现其中所检测的个体中具有所需要的功能的一个个体/多个个体。
在根据本发明的分离步骤(b)中，癌细胞和结合癌细胞的ALDUs与未结合的ALDUs分离，以便选择对癌细胞具有特异性的那些ALDUs。例如，通过除去溶液可以实现分离，其中已经从培养瓶中贴壁生长的经培养的癌细胞并且与未结合的ALDUs的溶液进行所述接触步骤；或者作为另一实例，具有在其上结合的SELEX文库RNA的癌细胞可以通过离心分离，而未结合的RNAs作为溶液的部分保留在上清液中，其中已经进行了接触步骤。备选地，通过离心、密度离心、过滤、FACS分选、免疫沉淀或者固定到固体支持体可以实现分离。例如，利用结合靶的ALDU的复合体与未结合的ALDU相比具有不同的生物化学性质这一事实可以将结合癌细胞的ALDU与未结合的ALDUs分离。那些改变的生物化学性质可以是大小、特异结合、电荷密度、密度等等。
过滤可以分离结合的ALDUs与未结合的ALDUs，例如，如果滤器的大小使得结合癌细胞的ALDUs被该滤器的孔保留，而未结合的ALDUs可以穿过该滤器的孔。如果靶很大，像癌细胞，并且ALDU很小，例如，噬菌体、病毒、核酸或者展示配体的核糖体，那么通过大小过滤是有用的。
密度离心根据生物分子的密度将它们分离。如果结合靶的ALDU的密度与未结合的ALDU的密度不同，那么可以进行密度离心。例如，如果ALDU是致密的，例如，展示配体的核糖体，并且靶不是那么致密，像肉瘤细胞或者来源于癌细胞膜的载体，那么可以应用密度离心。
FACS可以基于靶标的荧光分离结合癌细胞的ALDU复合体和未结合的ALDUs。通过用荧光染料标记癌细胞然后使悬浮培养基中的经标记的癌细胞穿过狭窄的下滴喷嘴(dropping nozzle)从而每个癌细胞都是在小的、分开的小滴中来实施FACS。通常用基于激光的检测系统激发荧光染料并且使具有例如荧光阳性癌细胞的小滴带电。带电和不带电的小滴当穿过电板时分离并且可以收集到两个不同的管中。这样，含有结合到癌细胞的ALDUs的小滴与含有未结合的ALDUs的大批溶液分离。
可以将癌细胞固定到固体支持体以便分离结合到固定化癌细胞的ALDUs与未结合的ALDUs。癌细胞向固体支持体的固定通常通过使用表面活化的固体支持体或者固体支持体表面与癌细胞的特异结合来进行，在所述特异结合中使用例如，对癌细胞具有特异结合性质的生物分子。为了分离结合到固定化癌细胞的ALDUs与未结合的ALDUs，将固定的癌细胞与含有未结合的ALDUs的大批溶液分离。
通过从固定化癌细胞除去含有未结合的ALDUs的大批溶液可以进行结合到固定化癌细胞的ALDUs与含有未结合的ALDUs的大批溶液的分离。例如，如果癌细胞通过共价相互作用固定到例如，塑料微量滴定板的孔上，那么通过除去溶液并用洗涤溶液洗涤所述孔可以分离含有未结合的ALDUs的大批溶液。
在根据本发明方法的扩增步骤(c)中，扩增结合靶的ALDUs，以便得到足够高浓度的ALDUs，从而它们可用于功能筛选中。该扩增步骤利用ALDU的可扩增的内在性质。例如，已经与步骤b)中未结合的噬菌体分离，但是仍然结合癌细胞的展示例如，抗体或者抗体片段的噬菌体可以通过如下方法扩增，即首先回收结合的噬菌体，例如，通过从癌细胞洗脱噬菌体，然后使用回收的噬菌体洗脱物感染细菌，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)。然后大肠杆菌中噬菌体的扩增导致总噬菌体数目的显著增加，但是这样，能够结合癌细胞的那些单独噬菌体的浓度显著增加了。根据优选实施方案，通过洗脱结合癌细胞的ALDU，或者通过在ALDU保持可扩增的条件下裂解癌细胞并随后扩增可以实现扩增步骤。结合癌细胞的ALDUs可以例如，通过使用如实施例中阐明的具有低pH和/或高盐的溶液首先从癌细胞洗脱，并随后扩增，例如，从而所洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌以便产生大量子代噬菌体。然而，从靶的洗脱步骤尽管是方便的，但是不是必需的，因为，例如，对于噬菌体文库，甚至仍然结合癌细胞的噬菌体也能够感染大肠杆菌，并因而能够产生大量相同的后代，从而甚至当仍然结合癌细胞时也是可以扩增的。因此，不必从靶细胞除去噬菌体，因为仍然结合靶细胞的噬菌体可以感染所加入的细菌并因而扩增。
作为另一实例，核糖体展示文库的mRNA(其通过与展示相应于该mRNA的多肽的核糖体附着而与癌细胞表面结合)可以直接用于RT-PCR，而不必在扩增靶前从靶除去完整ALDU。从而其中在扩增ALDU前从靶回收结合靶的ALDU的步骤是任选步骤。
扩增ALDU还可以是确定结合到癌细胞的这种ALDUs的配体的化学特性，然后扩增该配体。也就是说，例如，对于展示抗体或者抗体片段的噬菌体文库，例如，通过PCR可以从结合癌细胞的噬菌体克隆编码这些配体的DNA，并且可以重组产生配体，例如，抗体或者抗体片段，以产生用于功能筛选测定法的足够量配体。这样，不是ALDU自身而是ALDU展示的配体得到扩增。然而，这在本发明的范围内，因为扩增步骤的目标是产生足够高浓度的配体以用于功能筛选测定法中，并且这可以通过扩增所述配体或者展示该配体的ALDU来实现。
在根据本发明方法的鉴定步骤(d)中，结合癌细胞的ALDU或者来源于ALDU的配体可基于其在功能筛选测定法中对Hsp90的生物功能的影响来鉴定。对于这种功能筛选测定法，ALDUs或者来源于它们的配体有利地个别化，从而来自功能筛选测定法的信号或者模式与个体ALDU或者配体的个体类型相关。这可以通过例如，用每种单独配体填充多孔板的不同孔，然后在那些单独孔中进行Hsp90的所需要的生物功能的测定法来完成。
在另一实例中，已经结合癌细胞并且与未结合的噬菌体分离的噬菌体可以通过感染细菌并在例如软琼脂中接种受感染的细菌，从而形成代表单独噬菌体的克隆的单个噬菌斑来完成个别化。可以在Hsp90功能的生物筛选测定中检查那些单独噬菌斑的效应。在这种测定中，可以鉴定在对Hsp90功能的功能筛选测定中具有效应的个体噬菌斑。然后例如通过对所分离的噬菌斑的噬菌体DNA进行测序可以鉴定噬菌斑的噬菌体展示的配体，所述噬菌斑代表通过其结合癌细胞的能力初步选择的单个噬菌体克隆。从而，对于ALDU自身用于功能筛选测定法的情况，如果需要，可以确定ALDU展示的配体的特性。
在优选实施方案中，所述配体能够抑制Hsp90的生物功能。例如，Hsp90的生物功能可以是侵袭或者粘着。
在另一实施方案中，ALDU或者来源于ALDU的配体用于鉴定根据本发明的未经修饰的配体的根据本发明的方法的步骤d)中的功能筛选测定法中。
在再一个实施方案中，用于根据本发明的鉴定配体的方法的步骤d)中的功能筛选测定法的ALDU或者来源于ALDU的配体经化学修饰以增加它们的生物活性或者赋予ALDU或者所述配体生物活性。作为实例，增加ALDU或者配体的生物活性或者赋予ALDU或者配体生物活性的一种方法是联合使用ALDU或者所述配体与前面描述的生色团辅助激光灭活(CALI)。CALI还可以用于进一步增强自身已经具有中和和抑制作用的配体的抑制效果。
这也表明ALDU上展示的配体的性质对于鉴定适宜的分子不是关键的，对成功筛选根据本发明的Hsp90抑制分子具有影响的更多是ALDU可被鉴定和扩增的能力。
然而，如前面解释的，通过增加个体ALDU的数目，但也通过增加个体ALDU所展示的配体的数目，可以实现ALDU的扩增。因为这在原则上也可以通过在组合化学文库中展示小化学分子的个体珠子来实现(见Ohlmeyer等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，10922-26；Liu等人J.Am.Chem.Soc.(2002)124，7678-80；Liang等人Science(1996)274，1520-2)，所以这些珠子形式文库也是ALDUs的文库。可以在微球体珠上合成小分子，所述微球体珠可以以惰性化学标记做索引。在合成方案的每一步期间，编码步骤号和该步骤所用的化学试剂的标记分子附着到该珠子。然后该标记阵列用作二进制代码以记录每个珠子的反应历史。然后可以以更大规模容易地合成所鉴定的化合物。
根据本发明所用的ALDU是生物ALDU，从而关于其特性的信息以核酸，例如RNA或者DNA形式存储。在优选实施方案中，ALDU选自用于病毒展示的病毒、用于噬菌体展示的噬菌体、用于细菌展示的细菌、用于核糖体展示的所核糖体、用于酵母展示的酵母和用于选择和扩增的寡核苷酸。
用于噬菌体展示的噬菌体可以是可以培养得到并且适合基因工程技术改造并且能够在它们的表面展示外源配体的所有噬菌体。噬菌体展示已经在Smith等人(1985)Science，228，1315-17中公开，抗体的噬菌体展示已经在WO 91/17271中公开。
用于细菌展示的细菌是可以在培养物中保持、适合基因工程技术改造并且能够在它们的表面展示配体的细菌。用于细菌展示的细菌的实例在Dougherty等人，(1999)Protein Eng.12，613-21；和Westerlund-Wickstrom B.(2000)Int.J.Meth.Microbiol.290，223-30中公开。
用于核糖体展示的核糖体已经在Shaffizel等人，(1999)J.Immunol.Methods 231，119-35；和Willson等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，3750-5中公开。
用于选择/扩增(Selex)的寡核苷酸已经在Tuerk和Gold(1990)Science 249，505-10，和Tuerk等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6988-92中公开。
然而，可以培养并且适合基因工程技术改造并且从而能够在它们的表面展示外源配体的低级真核生物也可以用作ALDUs，例如，如Boder和Wittrup(2000)Methods Enzymol.328，430-44中公开的遗传修饰的酵母。
本发明的方法、鉴定本发明的配体的方法包括如下鉴定步骤d)，即在空间上分离ALDUs库的不同ALDU然后如此筛选空间上分离的ALDUs对Hsp90的生物功能的影响从而所得结果可以分配给个体ALDU。ALDUs库的不同ALDU的空间分离可以例如，通过用各种个体配体填充多孔板的不同孔并将那些多孔板用于功能筛选测定来实现。如果例如，在一个孔中Hsp90的生物功能受到抑制，那么可鉴定抑制Hsp90的所述生物功能的一个配体，因为实验人员知道他放入每个单独孔中的每种配体的特性。
在另一优选实施方案中，根据本发明的鉴定配体的方法可以包括确定所述配体的特性的步骤，其中该确定步骤通过对所鉴定的ALDU的DNA进行测序、采集所鉴定的ALDU的核酸的PCR指纹图谱或者，对于来源于ALDU的配体，通过这种配体的质谱法来实现。在Marks等人(J.Mol.Biol.(1991)222，581-97)中公开了例如噬菌体的PCR指纹法。在Shevchenko等人((1996)Anal.Chem.68，850-58)或Spengler等人((1992)Rapid.Commun.Mass.Spectrom.6，105-8.)中公开了配体，例如，多肽的质谱分析。
根据本发明的鉴定配体的方法还可以包括至少一个额外的筛选ALDUs的步骤，例如，其中筛选是基于ALDUs的生物化学性质的。这种额外的筛选步骤可以包括选自流式细胞术、ELISA、免疫沉淀、结合测定法、免疫组织化学实验、亲和力研究、免疫印迹法和蛋白阵列的方法。通过ALDU或者来自ALDU的配体的大小、形状、密度、电荷密度、疏水性或者结合特异性可以确定生物化学性质。ALDU或者来自ALDU的配体的生物化学性质形成上述筛选ALDUs的方法的适用性的基础。通常通过用荧光染料标记细胞然后使悬浮培养基中的那些标记细胞穿过狭窄的下滴喷嘴从而每个细胞在一个小的分开的小滴中来进行流式细胞术。基于激光的检测系统通常用于激发荧光染料，并登记含有例如，荧光阳性细胞的小滴。
在本发明的另一优选实施方案中，鉴定本发明的配体的方法可以还包括扣除选择步骤。扣除选择步骤是除去具有不需要的性质的ALDUs的步骤。例如，如果结合对照细胞的性质是不需要的，那么除去能够结合对照细胞的ALDUs可以实现扣除选择步骤。作为实例，如果想要选择对癌细胞特异的ALDUs，那么可以首先选择结合癌细胞的那些ALDUs，洗脱结合的ALDUs，例如，噬菌体，然后通过例如将所洗脱的ALDUs库与非癌细胞接触并除去结合非癌细胞的那些ALDUs，以除去能够结合非癌细胞的那些ALDUs。保持在上清液中的ALDUs是癌细胞特异的ALDUs，其可以用于根据本发明鉴定配体的方法的功能筛选测定法中。
在步骤e)中，ALDUs(例如，噬菌体)库富含结合Hsp90的ALDUs。那些结合Hsp90的ALDUs可以最终通过本领域中公知的多种方法在步骤f)中鉴定。
在本发明的优选实施方案中，上面的方法包括替代步骤e)和f)的进一步的步骤：
e)将ALDUs，例如分离的噬菌体与重组Hsp90接触；
f)用缓冲的去污剂和/或高盐溶液洗涤所述Hsp90；和
g)洗脱ALDUs，例如，结合Hsp90的噬菌体；和
h)确定所述洗脱的ALDU，例如噬菌体所代表的配体，例如，抗体或者抗体片段的特性。
所用的“去污剂”可以是去污剂溶液，优选缓冲的，并且可以是浓度为0.001-0.5％，优选0.01-0.1％的Tween。文中所用“高盐”指高盐溶液，优选缓冲的，并且离子强度为10mM到1M，具体是20-500mM，更具体是50-350mM，甚至更优选80-250mM。通常有用的阴离子为例如，氯离子、柠檬酸根、磷酸根、磷酸氢根或者硼酸根。通常有用的阳离子为，例如，钠、钾、锂、钙或者镁。
上面段落中的缓冲液通常具有7-8的pH。例如，具有具体是1-20％，更具体是5-15％，甚至更优选约10％FCS的DMEM或者PBS可以用作缓冲液。
通过以200到300的g值温和离心3到20分钟，具体是5到10分钟实现结合噬菌体的细胞的分离。结合到细胞和固定化Hsp90的噬菌体的洗脱通过用2-100mM，具体是4-50mM，更具体是5-20mM，甚至更优选约10mM，pH为0到2.5，具体是1到2.5，更具体是1.5到2.5的甘氨酸洗涤来实现。
此外，根据本发明可以使用细胞外Hsp90的所有抑制剂调节并特别是减小基质金属蛋白酶(MMP)的活性和/或减小基质金属蛋白酶的分泌。
提供了下面的实施例(包括所进行的实验和得到的结果)仅用于阐明目的并且不应理解为限制本发明。
附图简述
图1显示了染色的HT-1080细胞通过Matrigel涂覆的8μm滤器的侵袭(左图)。右图显示了作为对照的HS-27细胞的侵袭。37℃温育6小时后定量荧光。所给出的数据为n＝3孔的平均值+/-SD。
图2显示了mAb1.5.1对HT-1080细胞侵袭的抑制作用。光照射(用CALI)后用Matrigel涂覆的细胞迁移室在趋化性测定中测定侵袭。将不存在任何抑制分子时HT-1080细胞的侵袭作为对照(左边条形)。mAb1.5.1抑制HT-1080细胞侵袭的约35％(p值＜0.001)。
图3显示了scFv1对HT-1080细胞的侵袭的抑制作用。光照射(用CALI)后用Matrigel涂覆的细胞迁移室在趋化性测定中测定侵袭。将不存在任何抑制分子时HT-1080细胞的侵袭作为对照(左边条形)。scFv1抑制HT-1080细胞侵袭的约46％(p值＜0.05)。
图4显示了侵袭的抑制与抗体浓度的相关性。将对Hsp90、Hsp90α、Hsp90β的特异抗体(都来自Stressgen)、α辅肌动蛋白4(MartinR.Pollak，Children′s Hospital，Boston，MA)和mAb1.5.1用FITC标记并能在光照射后以3种浓度(10μg/mL，20μg/mL和40μg/mL)在侵袭测定中试验。还显示了阳性对照β1整联蛋白(Chemicon，20μg/mL)和阴性对照(0，无抗体)。mAb1.5.1、Hsp90和Hsp90α抗体都表现出侵袭的浓度依赖性抑制，而Hsp90β和α辅肌动蛋白4却不表现出所述抑制。每个条形对都黑暗对照标准化并且代表一式三份的至少2个实验的平均值±s.e.m。
图5显示了免疫沉淀实验的结果。将mAb1.5.1或者抗-Hsp90抗体(Stressgen#SPA-830)与HT-1080细胞的裂解物温育。通过SDS-PAGE分离免疫复合物并用mAb1.5.1或者抗-Hsp90抗体进行免疫印迹。两种抗体识别相同的特异带，表明两种抗体结合相同的蛋白。
图6显示了Hsp90和mAb 1.5.1的共免疫细胞化学。第一个图显示了HT-1080细胞前沿附近Hsp90α/β(Affinity Bioreagents#PA3012 &PA3-013)的定位。第二个图显示了使用mAb 1.5.1的前沿附近的相同定位。当图像重叠时，可以看到完全的蛋白共定位(右图)。这表明mAb 1.5.1和Hsp90识别相同的蛋白。对于罗丹明(红色，Hsp90α/β)和FITC(绿色，mAb 1.5.1)使用546和480的激发滤色片组和590和535的发射滤色片组收集图像(Zeiss Axiovert 10，使用Neofluar40-x/0.75数值孔径透镜)。图中定标线代表10μm。
图6.1使用针对β1-整联蛋白(c)和Hsp90α(e)的抗体对HT-1080细胞的表面免疫细胞化学分析显示了不同的表面染色。阴性对照[仅小鼠第二抗体(a)和仅兔第二抗体(b)]、α辅肌动蛋白4(d)和Hsp90β(f)没有显示可检测的表面染色。用Olympus BH-3显现图像并使用SPOT数码相机(Digital Instruments)收集。
图6.2使用针对β1-整联蛋白(c)和Hsp90α(e)的抗体对MD-MDA231腺癌细胞的表面免疫细胞化学分析显示了不同的表面染色。阴性对照[仅小鼠第二抗体(a)和仅兔第二抗体(b)]、α辅肌动蛋白4(d)和Hsp90β(f)没有显示可检测的表面染色。用OlympusBH-3显现图像并使用SPOT数码相机(Digital Instruments)收集。
图6.3使用Hsp90α和Hsp90β特异抗体对HT-1080条件培养基的免疫印迹显示了Hsp90α但不是Hsp90β的细胞外定位。Hsp90α存在于HT-1080细胞的无血清条件培养基中，但是Hsp90β不存在于所述培养基中。
图7显示了用如前面描述的活HT-1080细胞进行的表面蛋白生物素化实验。通过SDS-PAGE分离表面生物素化蛋白和未生物素化的细胞内蛋白。将Hsp90和α辅肌动蛋白4抗体用于免疫印迹分析。Hsp90显示了表面(S)和细胞内(IC)定位，但是α辅肌动蛋白仅在细胞内库中发现。
图8显示了FACS分析的结果。阐明了scFv1对HT-1080细胞(粗线)和作为对照的HS-27细胞(细线)的结合活性。
图9显示了从肽质谱分析得到的肽匹配物。来自mAb 1.5.1的免疫沉淀的胰蛋白酶消化的肽片段在Survevor HPLC上和具有75μM纳喷雾(nanospray)C18柱(New Objectives)的LCO Deca离子阱质谱仪(ThermoFinnigan)上运行。将所得的PMF(肽质量片段)用于在NCBI和Swiss-Prot数据库中检索智人(Homo sapiens)的所有条目。所匹配的肽覆盖24％(172/732残基)Hsp90α和33％(241/724残基)Hspβ。
图10显示了新生霉素对HT-1080细胞侵袭的浓度依赖性作用。用新生霉素或者萘啶酮酸预处理HT-1080细胞1小时并进行侵袭测定。新生霉素显示出对侵袭的剂量依赖性抑制(通过ANOVA分析在＞0.05mM时p≤0.01)。萘啶酮酸对侵袭没有影响。该测定中细胞的生存力未受影响(数据未显示)。每个数据点对无药物对照标准化并代表一式三份的两个实验的平均值±s.e.m。
图11表明加入新生霉素后MMP分泌减少。以给定浓度的新生霉素或者萘啶酮酸(作为对照)处理40,000 HT-1080细胞6小时。在所测试的新生霉素的最高浓度时MMP活性减少了＞75％，用萘啶酮酸没有看到酶活性的减少。两条带(A和B)对应于未鉴定的MMP(为了清楚将图像倒转)。
图12显示了生色团辅助的激光/光灭活(CALI)的原理。
图13显示了scFv展示载体pXP10的载体图和相应序列。
图14显示了scFv表达载体pXP14的载体图和相应序列。
图15显示了小鼠文库的构建引物的序列。
图16显示了scFv1的氨基酸序列(SEQ ID NO.：1)(CDR3区域加下划线)和核苷酸序列(SEQ ID NO.：2)。
图17表明抗-Hsp90α抗体共免疫沉淀来自HT-1080条件培养基的MMP2。将免疫沉淀的蛋白用抗-MMP2或者Hsp90α进行免疫印迹。Hsp90的抑制抑制了MMP2分泌。
图18显示了格尔德霉素(GA)处理后条件培养基中的MMP2含量。用无血清培养基中的20μM格尔德霉素(GA)处理HT-1080细胞并通过酶谱法进行测定。GA处理后MMP2(72kDa明胶酶)活性降低～35％。通过银染显现总蛋白含量以确保相等加样。
图19显示了MMP2含量和Hsp90α含量之间的相关性。将HT-1080细胞用格尔德霉素缀合的琼脂糖珠(GA-珠)或者对照珠(珠)处理或者不处理(0)。条件培养基对MMP2或者Hsp90α进行免疫印迹。GA珠处理后活性MMP2水平降低了80％，原-MMP2水平降低了15％。
图20表明用不同量的格尔德霉素缀合的琼脂糖珠(GA-珠)处理后肿瘤细胞的侵袭力降低。将HT-1080细胞不用珠子处理、用5％或10％(v/v)GA-珠或者对照珠处理并测定侵袭力。GA-珠处理的细胞显示出侵袭力的45％降低，而对照珠处理的细胞仅显示侵袭力的15％降低(p＜0.01，t-检验)。将每个数据点对未处理对照标准化并且代表两个一式三份测定的平均值±标准误。
实施例
实施例1：产生单克隆抗体(例如mAb1.5.1)
在三个月内用固定或者裂解的HT-1080细胞免疫小鼠2次。对于固定，将汇合的(1×107/75cm2瓶)HT-1080细胞用PBS洗涤一次，然后用PBS和刮擦来移出。通过吹吸重悬细胞，以220×g离心5分钟，并用10mL 2％多聚甲醛在4℃固定10分钟。将细胞用PBS洗涤，然后重悬在1mL PBS中。通过胰蛋白酶消化汇合的HT-1080细胞产生裂解细胞，将其用PBS洗涤1次，然后以12000×g沉淀1分钟。然后室温下在裂解缓冲液(溶于0.33M Tris-HCl，pH 7.5中的0.67Triton-X-100)中裂解细胞5分钟。以12000×g离心裂解物5分钟。通过向PD-10柱加入裂解物来除去Triton-X-100并用3.5mL PBS洗脱蛋白。用Micro-BCA试剂盒(Pierce)定量蛋白，并将150μg/mL/小鼠用于免疫。
如以前描述的(Harlow和Lane，1988)进行杂交瘤的产生。
通过首先将HT-1080细胞的汇合单层(96孔透明薄底板的每孔40,000个)在4％多聚甲醛/PBS中室温下固定30分钟，然后在0.2％Triton-X-100中透化5分钟，以初次筛选杂交瘤上清液。用未稀释的杂交瘤上清液温育后，用溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的0.1％牛血清清蛋白(BSA)洗涤3次，每次5分钟。在室温下加入FITC-标记的兔抗小鼠第二抗体并保持1小时。重复相同的0.1％BSA/PBS洗涤，并在室温下加入第三FITC-标记的山羊抗兔抗体并保持1小时。最后一轮洗涤后，将细胞保存在4℃ PBS中直到成像。对于FITC使用480的激发滤色片组和535的发射滤色片组收集图像(ZeissAxiovert 10，使用Neofluar 40X/0.75数值孔径透镜)。相对于阳性对照(抗-β1整联蛋白，Chemicon#MAB1963和抗凝溶胶蛋白，Sigma#G4896)和阴性对照(无第一抗体)对细胞的染色打分。
然后通过表面免疫细胞化学对经试验对HT-1080结合阳性的杂交瘤进行表面表达试验。对于表面蛋白免疫细胞化学，将HT-1080细胞的汇合单层(96孔透明薄底板的每孔40,000个)与杂交瘤上清液在37℃/5％CO2下温育1小时。用溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的0.1％牛血清清蛋白(BSA)洗涤3次，每次5分钟后，将细胞在2％多聚甲醛中固定2分钟。进行另一轮0.1％BSA/PBS洗涤，并在室温下加入FITC-标记的兔抗小鼠第二抗体并保持1小时。重复相同的洗涤，并在室温下加入第三FITC-标记的山羊抗兔抗体并保持1小时。最后一轮洗涤后，将细胞保存在4℃PBS中直到成像。通过显微镜术在ZeissAxiovert 10上使用Neofluar 40X/0.75数值孔径透镜显现表面染色。在对于FITC使用480的激发滤色片组和535的发射滤色片组收集图像。相对于阳性对照(抗-β1整联蛋白，Chemicon#MAB1963和抗凝溶胶蛋白，Sigma#G4896)和阴性对照(无第一抗体)对细胞的表面染色打分。
实施例2：免疫文库的构建
将两BALB/c小鼠的每一只用2×107个多聚甲醛固定的HT-1080细胞(人纤维肉瘤细胞系；ATCC，CCL-121)进行皮内免疫。第一次免疫后，在39天内重复注射两次，处死小鼠并分离脾脏并将其在液氮中冷冻。
使用RNeasy Midi试剂盒(QIAGEN#75142)按照生产商描述的使用每种脾脏制剂的一半分离总RNA。通过变性甲醛凝胶和光度测量确定RNA浓度和纯度。
用8.9μg新鲜制备的RNA和10pmol引物混合物(IgG1-c，IgG2a-c，IgG2b-c，IgG3-c，VLL-c，VLK-c)使用SuperscriptTMII试剂盒(GibcoBRL Life Technologies#18064-014)合成cDNA。这些引物与编码κ和λ家族的IgG重链(VH)基因和轻链(VL)基因的RNA退火。使用无限制位点的9种正向引物(M-VH1、M-VH2、M-VH3、M-VH4、M-VH5、M-VH6、M-VH7、M-VH8、M-VH9)和4种反向引物(M-JH1、M-JH2、M-JH3、M-JH4)的36种独立组合从1μl cDNA通过PCR扩增VH基因。用无限制位点的引物混合物(M-VK1、M-VK2、M-VK3、M-VK4、M-VL1、M-JK1、M-JK2、M-JK3、M-JL1)PCR扩增VL基因。凝胶纯化PCR产物(QIAquick凝胶提取试剂盒，#28706)，并对于VH使用有限制位点的9种正向引物(MVH1 SfiI、MVH2 SfiI、MVH3 SfiI、MVH4 SfiI、MVH5 SfiI、MVH6 SfiI、MVH7 SfiI、MVH8 SfiI、MVH9 SfiI)和4种反向引物(M-JH1 SalI、M-JH2 SalI、M-JH3 SalI、M-JH4 SalI)的独立组合再扩增，并且对于VL使用有限制位点的引物混合物(M-VK1 ApaLI，M-VK2 ApaLI，M-VK3 ApaLI，M-VK4 ApaLI，M-VL1 ApaLI，M-JK1 NotI，M-JK2 NotI，M-JK3 NotI，M-JL1 NotI)再扩增。将PCR产物凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，#28706)并对于VH使用限制性位点SfiI/SalI和对于VL使用ApaLI/NotI克隆到噬菌体展示载体pXP10。通过电穿孔将连接混合物转染到大肠杆菌TG-1中，得到107个独立克隆(噬菌体)的文库大小，该文库表达不同的单链抗体片段(scFv)。
实施例3：scFv的选择和筛选(对固定细胞的选择)
从用固定的HT-1080细胞免疫的小鼠产生的噬菌体展示文库选择单链Fv。用噬菌体展示载体pXP10产生文库。
如下所述选择表达对肿瘤细胞具有高亲和性的scFv的噬菌体：将HT-1080细胞用0.05％EDTA收获，用多聚甲醛固定，在PBS中稀释到1×107个细胞/ml，并固定到96孔UV交联板(Corning Costar)的孔上。将UV交联板的孔用溶于PBS中的5％脱脂奶粉(#70166，F1uka)(MPBS)封闭。将1012cfu(集落生成单位)噬菌体文库/106个细胞用MPBS在25℃下预封闭1小时并随后与细胞在室温(RT)温育1.5小时。UV交联板的孔经PBS+0.05％Tween-20洗涤6次，随后用PBS洗涤6次。通过加入10mM甘氨酸pH2.2洗脱结合的噬菌体并用1M Tris/HCl pH 7.4中和。通常，在第一轮选择中洗脱103到106cfu，从而与最初所有组成成分相比富集的所有组成成分的多样性减少了。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1来扩增含有富集的所有组成成分的洗脱物。通过在补加100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB琼脂板上30℃过夜(o/n)生长选择和增殖含有噬菌粒的大肠杆菌。该步骤后，富集的所有组成成分可以作为多克隆库进行扩增并以反复方式用于其他轮的选择直到实现会聚到所需要的性质或者在空间上分开并在单个克隆水平上筛选。通过用辅助噬菌体VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染前几轮选择的指数生长的培养物并在补力100μg/ml氨苄青霉素(amp)和50μg/ml卡那霉素(kan)的2xTY中20℃下过夜生长培养物来产生用于下一轮选择的噬菌体颗粒。将来自澄清细菌上清液的准备进行选择的噬菌体用0.5M NaCl/4％PEG-6000沉淀并重悬在PBS中。如实施例4中描述的进行一轮选择，然后在单个克隆水平上筛选。
实施例4：scFv的选择和筛选(对固定细胞的筛选)
为了筛选，将噬菌体展示载体中所含的编码所选scFv的基因再克隆到表达载体pXP14中。该载体指导与Strep-标记和E-标记融合的scFv的表达并且不含有丝状噬菌体基因-3。来自单个菌落的含有表达载体的大肠杆菌TG1在微量滴定板的各个孔中生长从而每个孔仅含有一个scFv克隆。细菌在30℃生长在96孔微量滴定板中(#9297，TPP)补加100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2xTY中直到OD600为0.7。用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达并在25℃持续过夜。通过加入鸡蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)到终浓度50μg/ml并在25℃下保持1小时然后以3000×g离心15分钟制备含有单链Fv的澄清裂解物。筛选ELISA前，通过加入等体积DMEM+10％FCS并保持1小时封闭澄清的裂解物。对于筛选ELISA，将HT-1080细胞用0.05％EDTA收获，用多聚甲醛固定，在PBS中稀释到1×107个细胞/ml，并固定到96孔UV交联板(Corning Costar)的孔上。用MPBS封闭UV交联板的孔并加入含有scFv的封闭的澄清裂解物并在25℃保持1.5小时。将板用PBS+0.1％Tween 20洗涤2次并用PBS洗涤1次，与HRP缀合的α-E-标记(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；用MPBS+0.1％Tween-20以1∶5000稀释)温育1小时，用PBS+0.1％Tween-20洗涤3次并用PBS洗涤3次，用POD(#1 484281，Roche)显影并在370nm读信号。
用上述ELISA筛选方法针对HT-1080细胞和对照人成纤维细胞Hs-27(ATCC CRL-1634)再试验阳性克隆并将其以甘油原液保存。在通常的筛选中，筛选2760(30×92)个克隆对HT-1080细胞的结合，其中5％阳性定义为扣除背景的信号＞0.1的克隆。对155个阳性克隆再试验与Hs-27对照细胞相比对HT-1080细胞的特异结合，其中28％阳性定义为对HT-1080的扣除背景的信号为Hs-27对照细胞的信号值的至少2倍的克隆。
实施例5：测序和大规模表达
通过Sequiserve GmbH，Vaterstetten，德国，使用引物pXP2Seq2(5′-CCCCACGCGGTTCCAGC-3′和pXP2 Seq1(5′TACCTATTGCCTACGGC-3′)进行scFv1及其基因的测序。氨基酸序列和核苷酸序列在图中显示。
通过测序鉴定的独特克隆从甘油原液在LB/Amp(100μg/ml)/1％葡萄糖琼脂板上划线并在30℃温育过夜。将10mlLB/Amp/Glu(1％)培养基接种一个菌落并在30℃和200rpm摇动下生长过夜。次日上午将过夜培养物置于冰上直到接种2L锥形瓶中的补加100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的1L 2xTY培养基。培养物在25℃摇动生长直到OD600达到0.5-0.6，然后用0.1mM终浓度的IPTG诱导。加入新鲜氨苄青霉素至50μg/ml并继续在22℃摇动温育过夜。上午将培养物以5000×g在4℃离心15分钟，抛弃上清液并将沉淀用移液器小心地在冰上重悬浮在含有完全蛋白酶抑制剂(#1697498，Roche)的10ml预冷PBS-0.5M Na缓冲液中。重悬浮完成后，将细菌悬浮液转移到20ml oak-ridge离心管并在冰上加入鸡蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至终浓度50μg/ml并保持1小时。在4℃下以20000×g离心裂解的细菌15分钟并将上清液(裂解物)转移到15ml塑料管中。为了亲和纯化，将裂解物以1ml/分钟加到通过平行蛋白纯化系统用10个柱体积(CV)PBS-0.5M Na缓冲液平衡的1mlStrepTactin(#2-1505-010，IBA)柱上。用PBS洗涤10CV后，用5CV PBS/5mM脱硫生物素(#D-1411，Sigma)进行洗脱并收集1ml级分。在UV280下测量级分，合并含有蛋白的级分并用Amicon超速离心过滤装置(Ultra Centrifugal Filter Devices)10.000 MWCO(#UFC801024，Millipore)以4700×g浓缩。在用考马斯蓝染色的12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上检查浓缩的scFv的纯度并将所述scFv与20％甘油以等分试样在-80℃冷冻。
实施例6：FACS分析肿瘤细胞的特异结合
为了检验所纯化的抗HT-1080 scFv特异结合靶细胞的能力，我们用HT-1080细胞(ATCC CCL-121)和作为对照细胞系的Hs-27细胞(106个细胞/ml)进行了荧光激活细胞分选仪(FACS)分析(见图)。细胞与CellWash(BD(Becton，Dickinson and Company)#349524)中的10μg/ml纯scFv在4℃温育20分钟，洗涤，用第二FITC-标记的抗E-标记mab(Amersham #27-9412-01)检测结合的scFv。洗涤样品并在Becton Dickinson FACSscan上分析。图8显示了与scFv1反应的细胞的log荧光强度(FL1-H；x轴)对相对细胞数(计数；y轴)。细线代表对照细胞系(HS-27)，粗线代表HT-1080细胞。与对照细胞系相比，scFv1以最高达10倍的信号特异染色肿瘤细胞系。
实施例7：用FITC标记scFv
通过下面的方法用异硫氰酸荧光素(FITC)(Molecular Probes，Eugene，美国#F1906)标记scFv：将溶于无水二甲亚砜中的10mg/mlFITC溶液的等分试样以30∶1(FITC∶scFv1)的比率加入溶于PBS/0.5M NaHCO3，pH 9.5的100μg scFv1中。在搅拌下将样品在室温温育2小时，用脱盐柱(2Micro Spin G-25，Pharmacia 27-5325-01)分离游离FITC。通过质谱法和UV/VIS光谱学测定标记比率，从而在280nm下计算蛋白浓度和在494nm下计算FITC浓度。
实施例7.1：用FITC标记mAb1.5.1
将新鲜制备的溶于无水二甲亚砜中的10mg/ml FITC(MolecularProbes，Eugene，美国#F1906)溶液以1∶5的比率加入纯化的mAb1.5.1抗体(T-gel Absorbant，Pierce Biotechnology #20500)。向反应物加入等体积0.5M NaHCO3，pH 9.5，并在室温摇动下将反应物温育2小时。用脱盐柱(PD-10，Amersham#17-0851-01)分离游离FITC。通过494nm下的VIS光谱学并假设从标记完全回收蛋白来计算FITC的浓度来测定比率。
实施例8：用于鉴定抑制性抗体片段的侵袭测定法
将ChemoTx系统(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作96孔形式的一次性趋化性/细胞迁移室，其具有8μm滤器Track蚀刻的聚碳酸酯孔径，5.7mm直径/位点。
将在Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)中稀释的13.3μl的0.3mg/ml Matrigel(Matrigel是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤，即富含细胞外基质蛋白的肿瘤提取的溶解的基膜制剂。其主要组分是层粘连蛋白，然后是胶原IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、触觉蛋白和巢蛋白。其还含有TGF成纤维细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤中天然发生的其他生长因子)(Becton Dickenson，BD #356234)应用于96孔板上B-H行和A行的膜滤器。将1.2μg/位点I型胶原S(Roche #10982929)在0.05M HCl(Sigma #945-50)中稀释并在干燥器中20℃下温育过夜以凝胶化。使HT-1080细胞在补加GlutamaxI(862mg/l(Gibco #31966-021)与10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中生长至70-80％汇合。将细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗涤2次，然后在原位用Bisbenzimide H 33342(Sigma#B-2261)标记，然后以1∶100在DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中在37℃，7.5％CO2下稀释15分钟。将细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤两次并用DMEM/Glutamax I/0.1％BSA在37℃，7.5％CO2中装载15分钟以进行回收。用无Ca2+、Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗涤两次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)使细胞脱离，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤两次，悬浮在Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes中并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀释到6.7×106个细胞/ml。将6.7×106个细胞/ml与作为侵袭抑制的阴性对照的40μg/ml对照scFv和HT-1080特异的scFv以1∶1在冰上温育1小时。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀释到6.7×105个细胞/ml后，将HT-1080细胞和HT-1080细胞/scFv稀释液一式三份地以3.4×104个细胞/孔的密度移液到趋化性室(B-H行)并在37℃，7.5％CO2中温育6小时。将含有5％FCS的DMEM/Glutamax I用作下面室中的化学引诱剂。在趋化性室的I型胶原S涂覆的A行中从1×104到4×104个细胞/位点作标准曲线。将DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA用于下面室中(细胞不迁移)。从膜的顶部刮除未迁移的细胞后(除了A行上的标准曲线)，在FluostarGalaxy(bMG)微量滴定板读出器上使用370/460nm的激发/发射波长测量通过膜迁移(对于标准曲线未迁移)的细胞的荧光。
实施例9：用CALI进行靶鉴定的侵袭测定
该实施例一般与实施例8相同，只是使用FITC-标记的scFv(见，实施例7关于标记的内容)并且在侵袭测定中整合CALI方法。
将ChemoTx系统((Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作具有96孔形式的一次性趋化性/细胞迁移室，其具有8μm滤器Track蚀刻的聚碳酸酯孔径，5.7mm直径/位点。
将13.3μl在Dulbecco PBS(Gibco#14040-091)中稀释的0.3mg/ml Matrigel(见实施例8)应用于96孔板B-H行和A行的膜滤器。将1.2μg/位点I型胶原S(Roche#10982929)在0.05M HCl(Sigma#945-50)中稀释并在干燥器中20℃温育过夜以凝胶化。使HT-1080细胞在补加GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)与10％FCS(Gibco#10270106))的DMEM中生长至70-80％汇合。将细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗涤2次，然后在原位用Bisbenzimide H 33342(Sigma#B-2261)标记，然后以1∶100在DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中37℃下，7.5％CO2中稀释15分钟。将细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤2次，并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA在37℃，7.5％CO2中装载15分钟以进行回收。用无Ca2+，Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗涤两次后，用0.5mMEDTA(Sigma#E8008)使细胞脱离，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤两次，悬浮在DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes稀释到6.7×106个细胞/ml。将6.7×106个细胞/ml与CALI后作为侵袭抑制对照的40μg/ml FITC-标记的抗β1整联蛋白单克隆抗体(JB1，Chemicon#MAB1963)和HT-1080特异FITC-标记的scFv以1∶1在冰上温育1小时。将1.3×105个HT-1080细胞/孔或HT-1080细胞/scFv或Ab稀释液一式三份地移液到两个96孔板、黑色、超薄透明平底特定光学器件(Costar#3615)。一个板在黑暗中在冰上保持，另一个板在冰块上以488nm的连续波激光照射(0.5W，30秒)。在用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀释到6.7×105个细胞/ml后，将HT-1080细胞和HT-1080细胞/scFv稀释液一式三份地以3.4×104个细胞/孔的密度移液到趋化性室(B-H行)(未照射的一式三份在照射的一式三份旁边)，并在37℃，7.5％CO2中温育6小时。将含有5％FCS的DMEM/Glutamax I用作下面室中的化学引诱剂。在趋化性室的I型胶原S涂覆的A行中从1×104到4×104个细胞/位点作标准曲线。将DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA用于下面室中(细胞不迁移)。从膜的顶部刮除未迁移的细胞后(除了A行上的标准曲线)，在FluostarGalaxy(bMG)微量滴定板读出器上使用370/460nm的激发/发射波长测量通过膜迁移(对于标准曲线未迁移)的细胞的荧光。在一般实验中，45000值与100％迁移细胞相对应。
通过使用上述Transwell培养系统比较侵袭肿瘤细胞外基质(Matrigel)的能力评估HT-1080细胞的侵袭表型。scFv1显示CALI后对HT-1080细胞侵袭的抑制效果为46％。用CALI进行的侵袭测定的结果在图3中显示。图3表明CALI转化抑制性抗体片段中的scFv1。
实施例9.1：用CALI以抗体(例如mAb1.5.1)进行侵袭测定法以鉴定靶
将ChemoTx系统(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)用作具有96孔形式的一次性趋化性/细胞迁移室，其具有8μm滤器Track蚀刻的聚碳酸酯孔径，5.7mm直径/位点。
将13.3μl在冷Dulbecco PBS(Gibco#14040-091)中稀释的0.3mg/ml Matrigel(见实施例8)应用于96孔板上B-H行和A行的膜滤器。将0.3μg/位点小鼠IV型胶原(Becton-Dickenson#354233)在0.05M HCl(Sigma#945-50)中稀释并在干燥器中20℃温育过夜以凝胶化，使HT-1080细胞在补加MEM非必需氨基酸(IX，Gibco#11140050)和青霉素/链霉素(1X，Gibco#15140122)与10％FBS(Hyclone#SH30070.03)的DMEM中生长至70-80％汇合。将细胞用DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素(BSA，Sigma#A-7030)洗涤1次，然后在原位用溶于DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素中的3μM Cell TrackerOrange(Molecular Probes#C-2927)在37℃下，7.5％CO2中标记15分钟。将细胞用DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素于37℃、7.5％CO2洗涤一次15分钟，以进行回收。用无Ca2+、Mg2+的Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Gibco#14170112)洗涤1次后，用Versene(Gibco#15040066)使细胞脱离，并用HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素(HBSS，Gibco+14025092)收集，用HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素洗涤两次，悬浮在HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素中并用HBSS/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素稀释到8×106个细胞/ml。将8×106个细胞/ml与CALI后作为侵袭抑制对照的40μg/mlFITC-标记的抗β1整联蛋白单克隆抗体(JB1，Chemicon#MAB1963)和mAbs以1∶1在冰上温育1小时。将3×105个HT-1080细胞/孔或HT-1080细胞/mAbs一式三份地移液到两个透明96孔板(Costar#3370)。一个板在黑暗中在冰上保持，而另一个板在冰块上以300W蓝色滤光(blue filtered-light)(Roscolux#69，BrillantBlue)照射1小时。在用DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素稀释到8×105个细胞/ml后，将HT-1080细胞和HT-1080细胞/mAbs稀释液一式三份地以4×104个细胞/孔的密度移液到趋化性室(B-H行)(未照射的一式三份在照射的一式三份旁边)，并在37℃，7.5％CO2中温育6小时，将含5％FCS的DMEM在下面的室中做为化学引诱剂。对趋化性室的小鼠IV型胶原S涂覆的A行进行从1×104到4×104个细胞/位点作标准曲线。将DMEM/MEM非必需氨基酸/0.1％BSA/MEM氨基酸/青霉素-链霉素用于下面室中(细胞不迁移)。从膜的顶部刮除未迁移的细胞后(除了A行上的标准曲线)，在Tecan Spectrafluor Plus荧光板读出器(激发：544，发射：590nm)上测量通过膜迁移(对于标准曲线未迁移)的细胞的荧光。识别β1整联蛋白(数据未显示)和mAb1.5.5的阳性对照在暴露于光后都显示出侵袭力的显著降低(p＜0.01，未配对t检验)(数据在图2中显示)。阴性对照(无抗体)不显示出降低。每个条形对阴性对照标准化并且代表一式三份的两个实验的平均值+s.e.m。
实施例10：细胞基质粘着测定
用溶于Dulbecco PBS(Gibco#14040-091)中的I型胶原S以1μg/孔(Roehe#10982929)涂覆96孔板(TPP#9296)(细胞培养物处理的)的B-H行，用2％BSA(Sigma#A-7030)/Dulbeccos PBS在4℃涂覆A行孔10-12过夜。将板用Dulbeccos PBS洗涤，用2％BSA/Dulbeccos PBS将B-H行和A行孔10-12在37℃封闭1小时，并用Dulbeccos PBS再次洗涤。使HT-1080细胞在补加GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021)与10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中生长至70-80％汇合。将细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma#A-7030)洗涤两次，然后在原位用Bisbenzimide H 33342(sigma#B-2261)进行标记，并在DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中以1∶100在37℃、7.5％CO2下稀释15分钟。将细胞用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤两次并用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA在37℃、7.5％CO2下装载15分钟以进行回收。用无Ca3+，Mg2+的PBS(Gibco，10010-015)洗涤2次后，用0.5mM EDTA(Sigma#E8008)使细胞脱离，并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco#15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤两次，悬浮在Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes中并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes稀释到6.7×106个细胞/ml。将6.7×106个细胞/ml与CALI后作为粘着抑制对照的40μg/ml FITC-标记的抗β1整联蛋白单克隆抗体(JB1，Chemicon#MAB1963)和HT-1080特异的FITC标记的scFv以1∶1在冰上温育1小时。将1.3×105个HT-1080细胞/孔或HT-1080细胞/scFV或Ab稀释液一式三份地移液到两个96孔板、黑色、超薄透明平底特定光学器件(Costar#3615)。一个板在黑暗中保持在冰上，而另一板在冰块上用488nm的连续波激光照射(0.5W，30秒)。在用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀释到6.7×105个细胞/ml后，将HT-1080细胞和HT-1080细胞/scFv稀释液一式三份地移液到涂覆和封闭的板上(未照射的一式三份在照射的一式三份旁边)。在A行10-12孔中，将6.7×105个细胞/ml与DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA作为背景对照移液。将板在37℃，7.5％CO2下温育1小时并用Dulbeccos PBS洗涤两次，从而洗除未粘着的细胞。在A行1-9孔中，进行从1×104到4×104个细胞/孔作标准曲线，在所有其他孔中，移取50μlDulbeccos PBS。用370/460nm的激发/放射波长在Fluostar Galaxy(bMG)微量培养板读出器上测量粘着1型胶原S(对于标准曲线为未粘着的)的细胞的荧光。scFv1将HT-1080细胞与1型胶原S的粘着抑制50％(数据未显示)。
实施例11：免疫沉淀
对于mAbs的免疫沉淀，将HT-1080细胞的汇合单层用含有蛋白酶抑制剂混合物(Bohrenger Mannheim)的1mM Tris-Cl，pH 8.0在4℃裂解15分钟。用dounce匀浆器进一步裂解细胞5分钟。将裂解物用抗小鼠IgG-琼脂糖(Sigma)在4℃预吸附1小时。将来自靶杂交瘤克隆的腹水液(10μL/1mg细胞提取物)在4℃温育过夜。用抗-小鼠IgG琼脂糖珠在4℃分离抗体-蛋白复合体1小时。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析免疫沉淀的蛋白，通过与靶腹水的免疫印迹进一步分析mAb免疫沉淀物。
对于scFv免疫沉淀，将HT-1080特异的scFv偶联到StreptactinSepharose(50μg/50μl树脂)并将洗过的scFv-珠加入澄清的裂解物中(1mg总蛋白)，并在4℃保持2-3小时。用溶于PBS 0.1％Tween20中的50μl 10mM D-脱硫生物素洗脱scFv-靶复合物。通过SDS-PAGE和银染分析免疫沉淀的蛋白。
实施例12：通过质谱法鉴定蛋白
对于mAb靶鉴定，下一步将来自通过SDS-PAGE从免疫沉淀物分离的考马斯染色条带进行凝胶内消化。胰蛋白酶消化的肽片段在Surveyor HPLC和安装75μM纳喷雾C18柱(New Objectives)的LCQDeca离子阱质谱仪(ThermoFinnigan)上运行。将所得PMF(肽质量片段)用于检索NCBI和Swiss Prot数据库中智人的所有条目。
对于scFv靶鉴定，切下染色的条带并用胰蛋白酶进行凝胶内消化。从凝胶片提取肽片段，在ZipTipμC18上脱盐并将洗脱的肽在涂有特氟隆的MALDI靶(Applied Biosystems)上点样。样品在STR-DEVoyager MALDI质谱仪(Applied Biosystems)上分析并将所得肽质量用于通过PMF(肽质量指纹图谱)进行蛋白鉴定，检索NCBI和SwissProt数据库中智人的所有条目。
实施例13：免疫细胞化学
对于表面蛋白免疫细胞化学，将汇合单层的HT-1080细胞(96孔透明薄底板的每孔40,000个)与杂交瘤上清液在37℃/7％CO2下温育1小时。在溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的0.1％牛血清清蛋白(BSA)中洗涤3次，每次5分钟后，将细胞在2％多聚甲醛中固定2分钟。进行另一轮0.1％BSA/PBS洗涤并在室温加入FITC-兔-抗-小鼠第二抗体并保持1小时。重复相同洗涤并在室温加入第三FITC-山羊-抗-兔抗体并保持1小时。最后一轮洗涤后，将细胞在4℃保存在PBS中直到成像。通过显微镜术在Zeiss Axiovert 10上使用Neofluar 40X/0.75数字孔径透镜显现表面染色。对于FITC用设置在480的激发滤色片和535的发射滤色片收集图像。结果在图6、6.1和6.2中显示结果。
实施例14：细胞表面的生物素化
如Hanwel1等人(J Biol Chem 277：9772)中描述的实施细胞表面蛋白的生物素化。在SDS-PAGE凝胶上分离表面生物素化库和未生物素化细胞内库，并转移以用抗-Hsp90(Stressgen#SPA-830)或者α-辅肌动蛋白-4(Martin A.Pollak，Children Hospital，Boston，MA)进行免疫印迹。结果在图7中显示。Hsp90显示出表面(S)和细胞内(IC)都定位，但是仅在细胞内库中发现α辅肌动蛋白。mAb1.5.1也显示出表面和细胞内定位(数据未显示)。
实施例15：新生霉素或萘啶酮酸对HT-1080细胞侵袭的浓度依赖性
将8×106个HT-1080个细胞/mL以所显示的浓度的新生霉素或者萘啶酮酸预处理1小时并如实施例9.1中描述的进行侵袭测定。新生霉素显示出侵袭的剂量依赖的抑制(＞0.5mM时p＜0.01)。萘啶酮酸对侵袭没有影响。在该测定中新生霉素处理的细胞的生存力不受影响(数据未显示)。每个数据点对无药物对照标准化并代表一式三份地两个实验的平均值+s.e.m。结果在图10中显示。
实施例16：MMP分泌的抑制
以给定浓度的新生霉素或萘啶酮酸处理40,000个HT-1080细胞6小时。用含有10mg/mL明胶的SDS-PAGE凝胶分离来自所处理细胞的条件培养基。在室温下用2.5％Triton-X-100处理30分钟从凝胶分离SDS。允许蛋白在37℃消化溶于消化缓冲液(0.1M Tris-Cl2，pH8.0，5mM CaCl2，0.04％ NaN3)中的明胶48小时。将凝胶进行考马斯染色并干燥以用于光密度分析法。平行的凝胶用银染以显示相等的蛋白上样(数据未显示)。在受试新生霉素的最高浓度下MMP活性减小＞75％，而用萘啶酮酸没有看到酶活性的减少。结果在图11中显示。
实施例17：新生霉素与琼脂糖的共价偶联和MMP活性的抑制
该实施例阐明HT-1080细胞表面上Hsp90功能的抑制。已经显示用新生霉素——一种香豆素抗生素处理HT-1080纤维肉瘤细胞减小了细胞侵袭基膜屏障的能力并且显著减小了基质金属蛋白酶(MMP)活性/分泌。因为以短的时间表(6小时)进行该实验，所以不会发生细胞内Hsp90靶的显著耗竭。
新生霉素与大分子载体像琼脂糖的共价偶联抑制新生霉素的细胞摄入，并从而导致Hsp90的任何细胞内抑制。Marcu等人描述了将新生霉素缀合到琼脂糖的方法(Marcu等人(2000)J Natl CancerInst 92，242-8；Staudenbauer和Orr(1981)Nucleic Acids Res.9，3589-603)。在该方法中，首先将环氧活化的琼脂糖6B(SigmaChemical Co)用蒸馏水洗涤和膨胀。膨胀的珠子用偶联缓冲液(0.3M碳酸钠，pH9.5)进一步洗涤。将新生霉素通过与偶联缓冲液中的膨胀的珠子在37℃温育20小时而有效地与珠子缀合。用偶联缓冲液洗除未缀合的新生霉素，且剩余的未结合的环氧活化基团用1M乙醇胺在30℃封闭12小时。用溶于偶联缓冲液中的0.5M NaCl、蒸馏水、溶于0.1M乙酸钠(pH 4.0)中的0.5M NaCl充分洗涤珠子以除去任何多余的新生霉素和乙醇胺。然后将新生霉素-琼脂糖珠在含有1mMEDTA、10％乙二醇和200mM KCl的25mM HEPES(pH 8.0)中在4℃黑暗中平衡。
进行明胶酶实验前，通过体外结合测定法证明缀合Hsp90的新生霉素-琼脂糖的有效结合。将HT-1080细胞在含有蛋白酶抑制剂(片剂，Boehringer Mannheim)的TNESV(1％Nonidet P-40，2mM EDTA，和100mM NaCl，和1mM原钒酸钠)中裂解。使300μg该裂解物与100μL新生霉素-琼脂糖缀合物在4℃温育1小时。用TNESV充分洗涤后，将结合珠子的蛋白用2×SDS-PAGE上样缓冲液(125mMTris-HCl pH6.8，10％2-巯基乙醇，10SDS，10％甘油，和痕量溴酚蓝)洗脱并煮沸5分钟。蛋白在10％SDS-PAGE凝胶上电泳。这些凝胶或者进行银染或者转移到硝酸纤维素上用抗-Hsp90抗体(AC88，Stressgen，Inc.)进行免疫印迹。
对于明胶酶测定，用Versene将贴壁的HT-1080细胞首先轻轻从组织培养皿取出。将无血清DMEM中的5×104个细胞与0.1μL、1μL或者10μL新生霉素-琼脂糖缀合物合并并在轻微摇动下在硅氧烷化eppendorf管中室温下温育1小时。平行进行含有未缀合新生霉素的琼脂糖珠子的对照样品。所述温育后，将细胞转移到组织培养物处理的96孔板，并在37℃/5％CO2下再温育6小时。来自这些样品的条件培养基然后与2×SDS-PAGE上样缓冲液(无2-巯基乙醇)合并。这些样品在含有10mg/ml明胶的10％SDS-PAGE凝胶上电泳。通过与2.5％Triton-X-100在室温温育30分钟从凝胶除去SDS。允许蛋白在消化缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，5mM CaCl2，0.04％NaN3)中38℃下消化明胶48小时。将凝胶进行考马斯染色并干燥以用于光密度分析法。平行凝胶进行银染以显示蛋白的相等上样。MMP活性随着新生霉素-琼脂糖的量的增加而降低。
实施例18：通过格尔德霉素和固定化格尔德霉素(GA-珠)抑制MMP活性
可以显示基质金属蛋白酶MMP2与来自HT-1080条件培养基的Hsp90α共免疫沉淀(图17)。我们然后将已知的Hsp90抑制剂格尔德霉素应用于HT-1080细胞以试验Hsp90的抑制是否减小了MMP2活性。将HT-1080细胞用无血清培养基中的20μM格尔德霉素(GA)处理并通过酶谱法测定分泌的MMP2。GA处理后MMP2(72kDa明胶酶)活性减少～35％(p＜0.01)。通过银染显现条件培养基中的总蛋白含量以确保相等上样(见图18)。
格尔德霉素是Hsp90的众所周知的细胞透膜抑制剂。用10μM格尔德霉素(GA)处理1小时导致HT-1080细胞侵袭的显著的～35％减少(p＜0.05，t检验)，当加入活化的MMP2(100ng)时消除所述减少(数据未显示)。由于其细胞通透性，格尔德霉素不能隔离Hsp90的细胞内和细胞外定位。为了显示Hsp90在肿瘤细胞侵袭中的细胞外作用，将格尔德霉素固定在琼脂糖珠(GA-珠)上以防止质膜的交换(实验细节见Whitesell等人，Proc Natl Acad Sci USA 91，8324-8(1994))。用GA-珠处理HT-1080细胞后，在条件培养基中见到活性MMP2的80％减少，但是原-MMP2仅减少15％(图19)。使用体外侵袭测定法(见，实施例8)，用GA-珠处理的HT-1080细胞显示出侵袭力的显著的45％减少(p＜0.01，t检验)。未处理珠也以有限程度(＜15％)抑制侵袭，可能是由于珠子对孔的物理封闭(见图20)。所有这些结果一起表明如下机制：其中细胞外Hsp90α与原-MMP2的结合帮助该蛋白酶的活化，导致侵袭表型。Hsp90α的抑制导致活性MMP-2的减小和肿瘤细胞的侵袭力减小。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.含有人细胞外Hsp90的抑制剂的药物组合物，其中所述抑制剂基本上不能进入细胞。
2.根据权利要求1或2的药物组合物，其中抑制剂选自多肽、抗体、抗体片段、香豆素和缀合到载体的基于嘌呤的Hsp90抑制剂和它们的类似物。
3.根据权利要求1或2中任一项的药物组合物，其中Hsp90抑制剂包含选自格尔德霉素和其类似物如17AAG、根赤壳素和香豆素抗生素如新生霉素和基于嘌呤的Hsp90抑制剂如PU3的一种或多种化合物。
4.根据权利要求1的药物组合物，其中抑制剂是抗体。
5.根据权利要求4的药物组合物，其中抑制剂是单克隆抗体。
6.权利要求1的药物组合物，其中抑制剂是抗体片段。
7.根据权利要求1的药物组合物，其中抑制剂经可检测标记进行标记。
8.根据权利要求1-7中任一项的抑制剂用于制备预防和/或治疗增殖性疾病、癌症或者转移的药物组合物的用途。
9.权利要求8的用途，其中抑制剂选自多肽、抗体、抗体片段、香豆素和基于嘌呤的Hsp90抑制剂。
10.根据权利要求9的用途，其中抑制剂是抗体，具体地是单克隆抗体。
11.根据权利要求10的用途，其中抑制剂是抗体片段。
12.编码人细胞外Hsp90的抑制剂的核酸分子，其中抑制剂是抗体或者抗体片段。
13.试剂盒，其含有根据权利要求1-7中任一项的抑制剂和适宜的试验容器。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中抑制剂是受到标记的。
15.转体内筛选或者试验细胞的侵袭和/或转移行为的方法，其包括步骤：
a)在基本阻止所述Hsp90抑制剂的细胞摄入的条件下将细胞与一种或多种人Hsp90抑制剂接触；
b)分析根据步骤a)处理的细胞的迁移；
c)比较根据步骤a)的细胞与未处理细胞的迁移；和任选地
d)确定与未处理细胞相比的迁移百分数。
16.根据权利要求15的方法，其中步骤a)还包括在适于细胞生长的条件下将所述细胞与凝胶样基质接触的步骤，并且步骤b)包括分析细胞通过凝胶样基质的迁移的步骤。
17.使用根据权利要求7的标记分子诊断细胞的增殖疾病、癌症或者转移潜力的方法。
18.鉴定特异结合人细胞外Hsp90的配体的方法，其中所述配体能够抑制癌细胞的侵袭力、粘着和/或转移潜力，所述方法包括步骤：
a)将可扩增的配体展示单位(ALDUs)的文库与癌细胞接触；
b)将所述癌细胞和结合所述癌细胞的ALDUs与不结合所述癌细胞的ALDUs分离；
c)扩增结合所述癌细胞的ALDUs；
d)鉴定影响癌细胞的侵袭力、粘着和/或转移潜力的步骤c)后的ALDU或者衍生自ALDU的配体；
e)鉴定能够结合Hsp90的步骤d)后的ALDU或者衍生自ALDU的配体；
f)及任选地确定所述ALDU代表的配体的特性。
19.权利要求18的方法，其具有代替步骤e)和f)的进一步的步骤：
e)将步骤c)的ALDUs与固定化Hsp90接触；
f)将所述固定化Hsp90和与其结合的ALDUs与不结合所述固定化Hsp90的ALDUs分离；
g)扩增结合所述固定化Hsp90的ALDUs；
h)及任选确定所述ALDU代表的配体的特性。
20.通过权利要求20或21的方法可以得到的细胞外Hsp90的抑制剂。
21.根据权利要求1到7中任一项的抑制剂用于调节和尤其是降低基质金属蛋白酶(MMP)的活性和/或减少其分泌的用途。

Claims (23)

1.细胞外Hsp90的抑制剂，前提条件是所述抑制剂不是Mycograb单克隆抗体。
2.根据权利要求1的抑制剂，其中所述抑制剂受到修饰从而所述修饰基本上阻止了其细胞摄入。
3.根据权利要求1的抑制剂，其中所述抑制剂的修饰包括将该抑制剂缀合到载体。
4.根据权利要求1的抑制剂，其中所述抑制剂选自多肽、抗体、抗体片段、香豆素和基于嘌呤的Hsp90抑制剂和它们的类似物。
5.根据权利要求4的抑制剂，其中Hsp90抑制剂是选自格尔德霉素和其类似物如17AAG、根赤壳素和香豆素抗生素如新生霉素和基于嘌呤的Hsp90抑制剂如PU3的一种或多种化合物。
6.根据权利要求1的抑制剂，其中所述抑制剂是抗体，具体地是单克隆抗体。
7.根据权利要求1的抑制剂，其中所述抑制剂是抗体片段。
8.根据权利要求1的抑制剂，其中所述抑制剂经可检测的标记进行标记。
9.药物组合物，其含有根据权利要求1-8的抑制剂，其中所述抑制剂基本上不能进入细胞，前提条件是该抑制剂不是Mycograb单克隆抗体。
10.根据权利要求1-8的抑制剂用于制备预防和/或治疗增殖性疾病、癌症或者转移的药物组合物的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述抑制剂选自多肽、抗体、抗体片段、香豆素和基于嘌呤的Hsp90抑制剂。
12.根据权利要求11用途，其中所述抑制剂是抗体，具体地是单克隆抗体。
13.根据权利要求12用途，其中所述抑制剂是抗体片段。
14.编码细胞外Hsp90的抑制剂的核酸分子，其中所述抑制剂是抗体或抗体片段。
15.试剂盒，其含有权利要求1-8任一项的抑制剂和适宜的试验容器。
16.根据权利要求15的试剂盒，其中所述抑制剂是受到标记的。
17.转体内筛选或者试验细胞侵袭和/或转移行为的方法，其包括步骤：
a)在基本阻止所述Hsp90抑制剂的细胞摄入的条件下将细胞与一种或多种Hsp90抑制剂接触；
b)分析根据步骤a)处理的细胞的迁移；
c)比较根据步骤a)的细胞与未处理细胞的迁移；和任选地
d)确定与未处理细胞相比的迁移百分数。
18.根据权利要求17的方法，其中步骤a)还包括在适于细胞生长的条件下将所述细胞与凝胶样基质接触的步骤，并且步骤b)包括分析细胞通过凝胶样基质的迁移的步骤。
19.使用根据权利要求8的标记分子诊断细胞的增殖疾病、癌症或者转移潜力的方法。
20.鉴定特异结合Hsp90的配体的方法，其中所述配体能够抑制癌细胞的侵袭力、粘着和/或转移潜力，所述方法包括步骤：
a)将可扩增的配体展示单位(ALDUs)的文库与癌细胞接触；
b)将所述癌细胞和结合所述癌细胞的ALDUs与不结合所述癌细胞的ALDUs分离；
c)扩增结合所述癌细胞的ALDUs；
d)鉴定影响癌细胞的侵袭力、粘着和/或转移潜力的步骤c)后的ALDU或者衍生自ALDU的配体；
e)鉴定能够结合Hsp90的步骤d)后的ALDU或者衍生自ALDU的配体；
f)及任选地确定所述ALDU代表的配体的特性。
21.权利要求20的方法，其具有代替步骤e)和f)的进一步的步骤：
e)将步骤c)的ALDUs与固定化Hsp90接触；
f)将所述固定化Hsp90和与其结合的ALDUs与不结合所述固定化Hsp90的ALDUs分离；
g)扩增结合所述固定化Hsp90的ALDUs；
h)及任选确定所述ALDU代表的配体的特性。
22.通过权利要求20或21的方法可以得到的细胞外Hsp90的抑制剂。
23.权利要求1到8的抑制剂用于调节和尤其是降低基质金属蛋白酶(MMP)的活性和/或减少其分泌的用途。
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