KR101597840B1 - ｐⅦ 파아지 디스플레이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pⅦ로부터 주로 유래하는 신규 융합 단백질을 통하여 필라멘트성 파아지 상에서 디스플레이되는 펩티드용의 대안적 스캐폴드를 제공한다. 필라멘트성 파아지의 라이브러리는 융합 단백질로부터 창제될 수 있으며, 또 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하는 파아지 디스플레이 계는 본 발명의 일부이다. 본 발명의 일 양태는 본 발명의 융합 다백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하는 파아지 디스플레이 계를 함유하는 키트이다.

Description

ｐⅦ 파아지 디스플레이{pⅦ PHAGE DISPLAY}
본 발명은 ｐⅦ 파아지 디스플레이에 관한 것이다.
단백질 확인, 특징화 및 변형을 위한 조합적인 방법의 이용은 학문적 연구 및 상업적 연구 모두에서 매우 성공적이었다. 이와 관련하여, 필라멘트성 박테리오파아지, 또는 파아지 디스플레이 기술은 최초의 라이브러리 플랫폼(platform)이 되는 초석이 되었고 또 여전히 중요한 기술로서 군림하고 있다. 따라서, 파아지 디스플레이는 기본적 및 응용 단백질 발견에서뿐만 아니라 전세계적으로 가장 신속하게 성장하는 화합물 종류인 신규 단백질계 진단제와 치료제의 개발에서도 널리 응용되고 있다.
조합적 파아지 디스플레이 기술의 원리는 그 단백질 외피(protein coat)에 의해 캡슐화된 게놈에 의해 암호화되는 동일한 단백질 표면 상에서만 각 비리온(virion)이 디스플레이되는 특성에 의해 제공되는 유전형-표현형 연계(linkage)를 기본으로 한다. 파아지 입자 자체는 다양한 생리화학적 조건에 대하여 상당히 내성이다; 따라서 파아지 디스플레이는 경쟁하는 조합적 기술에 비교하여 많은 선택 처방에서 월등한 다목적성을 제공한다.
이종(heterologous) 폴리펩티드의 파아지 디스플레이는 필라멘트성 파아지 외피의 총 5개 구조 단백질을 사용하여 달성되었지만, 오직 pⅢ- 및 어느 정도의 pⅧ-디스플레이가 광범위하게 사용되고 있다(도 1).
이종 융합물이 오직 짧은 펩티드이면, 파아지 게놈-계 벡터를 사용하는 다가 디스플레이 계가 바람직한 반면에, 폴딩된 도메인(folded domain)을 필요로 하는 대형 융합물의 경우 대부분의 적용은 파아지미드 계로부터 이득을 얻을 것이다. 후자의 경우, 항체-pⅢ 파아지 디스플레이는 이 분야에서 아주 우세하지만, 대안적인 스캐폴드(scaffolds)가 일찌기 미명으로 출현하고 있고, 장래의 단백질 엔지니어링 도구의 확장을 위해서도 그 필요가 지속되고 있다. 많은 적용에서, 1 이상의 외피 단백질이 동일 바이러스 입자와 관련해서 융합 펩티드를 나타내는 점에서 특이적이고 또 제어되는 방식으로 이특이적(bispecific) 파아지 입자를 제조할 수 있다면 아주 유리할 것이다. 또한, 이런 계는 기존에 확립되어 있는 디스플레이 방법, 특히 pⅢ 및 pⅧ 디스플레이를 방해하지 않아야 한다.
엔데만과 모델(Endemann, Model, 1995)(PMID: 7616570)은 무손상(intact) 파아지에서는 소수 외피 단백질 pⅦ를 얻을 수 없었고 또 pⅦ는 그의 N-말단에 융합된 다른 단백질과는 작용성이 아니라고 보고했다. 따라서, 이 보고는 pⅦ가 파아지 디스플레이에 사용될 수 없다고 결론지었다.
가오 등(Gao et al., 1999)(PMID: 10339535) 및 특허 출원 WO0071694호는 옥타펩티드 FLAG 태그(tag)를 이용한 pⅦ에서의 이종 펩티드 파아지 디스플레이뿐만 아니라 pⅦ 및 pⅨ에서의 동시적 파아지 디스플레이가 복합체 접합 토폴로지를 갖는 작용성 헤테로 이합체성 폴리펩티드(항체 Fv)를 생성하는 것을 개시한다. 이들 저자들은 항체 디스플레이에 대한 대안적 수단을 개발하려고 했다. pⅦ 및 pⅨ 융합 단백질은 디시스트론 배열(dicistronic constellation)을 이용하는 파아지미드로부터 발현되었고, 따라서 생성한 작용성 파아지 입자는 필연적으로 헬퍼(helper) 파아지 게놈으로부터 공여된 야생형 pⅦ 및 pⅨ 단백질에 의한 보완으로 인하여 다양한 양의 pⅦ 및 pⅨ 융합 단백질을 함유했다. 상술한 바와 같이, pⅦ 및 pⅨ가 이들의 N 말단에 융합된 다른 단백질과는 작용성이 아니라는 것은 이미 제시되었고, 또 가오 등은 이들의 성공에 대한 두 가지 가능한 이유, 즉 단독 또는 양쪽의 조합에 의한 이유를 제시했다.
하나의 가능한 이유는 원핵생물 리더 서열(시그널 서열)이 융합 단백질의 N-말단에 부착되어 있어서, 재조합 단백질을 주변세포질 간극(periplasmic space)으로 보내어 세포질에서 축적을 방지하는 것이다. 다른 가능한 이유는 재조합 단백질이 엔데만 및 모델에서와 같이 파아지 게놈으로부터가 아니라 파아지미드로부터 발현됨으로써, 파아지미드 구출(rescue)에 불가피하게 필요한 헬퍼 파아지로부터 얻은 파아지미드 야생형 pⅦ 및 pⅨ는 재조합 pⅦ 및 pⅨ 융합 단백질을 보완함으로써, 재조합 변형(modification)으로 인하여 손실될 수 있었던 야생형 작용성을 보존한다. 즉 파아지는 야생형 및 융합 단백질의 혼합물을 포함할 것이다. 상기 저자들은 pⅦ-pⅨ 디스플레이 포맷이 헤테로 이합체성 어레이의 조합적 디스플레이에 특히 유용할 것이라 보며, 알려지지 않은 이유로 패닝(panning) 수순 동안 특히 강력한 농축(enrichment)을 얻는 것으로 보인다고 언급했다. 상기 저자들은 pⅦ를 유일한 디스플레이 단백질(파아지미드 또는 파아지 게놈과 같은)로 이용하는 것 또는 이특이적 디스플레이를 달성하기 위하여 다른 외피 단백질(pⅨ과는 상이한)에서의 디스플레이와 조합된 pⅦ 디스플레이의 이용을 예상하지 않고 있다.
크와스니코우스키 등(Kwasnikowski et al.)(PMID: 16277988)은 파아지 게놈에서 scFv 단편(fragment)을 유전자 Ⅶ에 직접적으로 유전적으로 안정하게 융합시키는 것을 기재했다. 즉 생성한 파아지는 비천연 pⅦ 단백질을 포함하였고, 또 pⅦ 디스플레이는 다가이었다. 상기 저자들은 파아지 게놈 포맷에서 성공적인 pⅦ 디스플레이에 대한 이유 중의 하나는 이들이 융합 단백질을 주변세포질 간극으로 보내는 원핵생물 시그널 서열과의 융합 유전자를 지지하는 것을 추정했다. 저자들은 이들 계의 독특한 특징은 pⅦ 디스플레이 파아지가 비변형의 야생형 야생형 pⅢ 최소 외피 단백질(minor coat protein)을 포함하는 것이라고 주장했다. 숙주 세포 감염에는 복수의 복제수의 작용성 pⅢ가 필요한 것으로 보고되었기 때문에, 파아지 표면의 야생형 pⅢ의 존재는 선택된 항체의 회수를 상당히 다양하게 촉진할 수 있다. 따라서, 상기 저자들은 이특이적 디스플레이를 예상하지 않을 것이며, 주변세포질 간극을 표적으로 하는 원핵생물 시그널 서열을 갖지 않는 pⅦ 디스플레이를 예상하지 않을 것이다.
칼릴(Khalil et al)(PMID: 17360403)은 외인성 펩티드가 동일한 비리온의 각 말단 끝에서 디스플레이되는 이특이적 필라멘트성 파아지 비리온의 특징을 이용하는 적용을 개시한다. 이들은 pⅨ 디스플레이 파아지미드를 보완하는 보통의 pⅢ 파아지 게놈 벡터의 조합을 이용함으로써 달성했다. 이런 세팅에서, 파아지 게놈 벡터는 파아지미드의 구출에서 헬퍼 파아지로서 작용하므로, pⅦ 변형된 헬퍼 파아지 게놈의 사용에 의한 pⅢ 디스플레이 파아지미드 구출에 의해 이특이적 파아지미드 비리온을 창제하는 것을 암시한다. 또한, 칼릴 등의 이특이적 비리온은 이들의 비리온의 제어되는 바이오틴화를 허용하는 펩티드-pIII 융합을 디스플레이한다. 그러나, 이특이적 비리온을 얻는 방법뿐만 아니라 소정의 비리온 바이오틴화를 얻기 위한 이들 2개 방법 사이에는 구별되는 몇 가지 특징이 존재해서, 이들을 서로 독특하게 만든다.
우선, 칼릴 등의 방법은 pⅢ 파아지미드 디스플레이와 조합되어 사용될 수 없는데, 이는 이들의 pⅢ 융합을 갖는 것이 파아지 게놈 벡터이기 때문이며, 따라서 파아지미드 구출시 이특이성을 얻을 수 없으며 또 pⅢ 융합의 작용성에 아주 유해할 수 있다.
둘째, 상기 저자들이 지적한 바와 같이, 게놈 pⅨ 변형은 파아지 게놈에서 중복되는 유전자로 인하여 실용적인 전략으로 간주되지 않으므로, 이들은 pⅢ 파아지미드(또는 pⅧ) 구출에 사용될 수 있는 임의의 변형된 헬퍼 파아지 게놈 제조에 예상하지 않을 것이며 또 그에 의하여 동일한 비리온의 양쪽 말단 끝까지 소정 표현형 특징을 우세하게 나타낸다. 칼릴 등은 파아지미드, 또는 파아지 게놈 디스플레이에서 변형 pⅦ의 이용을 전혀 언급하지 않고 있다.
셋째, 칼릴 등은 동일한 게놈 내의 1 이상의 캡시드(capsid) 유전자의 동시 변형을 이용하는 것에 의해 이특이적 비리온을 달성하기 위하여 단일 파아지 게놈 변형을 고려하지 않을 것이다. 이들은 시판되는 파아지 게놈 벡터를 통한 표준 pⅢ 펩티드 디스플레이를 이용할 뿐이다.
넷째, 칼릴 등은 폴딩된 도메인이 아니라 짧은 펩티드를 디스플레이하는 이특이적 비리온을 제조할 뿐이고, 변형된 캡시드 단백질 단독 또는 양쪽에서 그러한 디스플레이를 이용하는 것을 고려하지 않을 것이다.
다섯째, 칼릴 등은 시험관내 또는 생체 내에서의 효소 반응에 의해서가 아니라 시험관 내 화학적 콘쥬게이션을 통하여 이들의 pⅢ 디스플레이된 펩티드의 부위-특이적 바이오틴화를 달성한다. 위 저자들은 AviTag와 같은 효소 기질을 디스플레이하는 것에 의해 디스플레이된 잔기의 효소 매개된 바이오틴화를 전혀 고려하지 않는다.
마지막으로, 칼릴 등은 N-말단 시그널 서열을 사용하지 않는 어떤 유형의 디스플레이도 나타내지 않는다.
1. Endemann, H. & Model, P. Loccoation of Filamentous Phage Minor Coat Proteins in Phage and in Infected Cells. Journal of Molecular Biology 250, 496-506 (1995). 2. Gao, C. et al. Making artificial antibodies: A format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays. PNAS 96, 6025-6030 (1999). 3. Kwasnikowski P, Kristensen P, Markiewicz WT. Multivalent display system on filamentous bacteriophage pVII minor coat protein. J Immunol Methods. 2005 Dec 20;307(l-2):135-43. Epub 2005 Oct 28. 4. Khalil AS, Ferrer JM, Brau RR, Kottmann ST, Noren CJ, Lang MJ, Belcher AM. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2007 Mar 20;104(12):4892-7. Epub 2007 Mar 13. 5. Baneyx F, Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol. 2004 Nov;22(11):1399-408. 6. Simons GF, Konings RN, Schoenmakers JG. Genes VI, VII, and IX of phage M13 code for minor capsid proteins of the virion. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1981 Jul;78(7):4194-8. 7. Scott JK, Smith GP. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science. 1990 Jul 27;249(4967):386-90. 8. Koch J, Breitling F, Dubel S. Rapid titration of multiple samples of filamentous bacteriophage (M13) on nitrocellulose filters. Biotechniques. 2000 Dec;29(6):1196-8, 2002. 9. Kipriyanov SM, Moldenhauer G, Little M. High level production of soluble single chain antibodies in small-scale Escherichia coli cultures. J Immunol Methods. 1997 Jan 15;200(l-2):69-77. 10. Welschof M, Terness P, Kipriyanov SM, Stanescu D, Breitling F, Dorsam H, Dubel S, Little M, Opelz G. The antigen-binding domain of a human IgG-anti-F(ab')2 autoantibody. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1997 Mar 4;94(5): 1902-7. 11. Michaelsen TE, Aase A, Westby C, Sandlie I. Enhancement of complement activation and cytolysis of human IgG3 by deletion of hinge exons. Scand J Immunol. 1990 Nov;32(5): 517-28. 12. Nakela O, Kaartinen M, Pelkonen JL, Karjalainen K. Inheritance of antibody specificity V. Anti-2-phenyloxazolone in the mouse. J Exp Med. 1978 Dec l;148(6):1644-60. 13. Løset GA, Lunde E, Bogen B, Brekke OH, Sandlie I. Functional phage display of two murine alpha/beta T-cell receptors is strongly dependent on fusion format, mode and periplasmic folding assistance. Protein Eng Des Sel. 2007 Sep;20(9):461-72. Epub 2007 Oct 9. 14. Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells. J Immunol Methods. 1997 May 12;204(1):77-87. 15. Bradbury AR, Marks JD. Antibodies from phage antibody libraries. J Immunol Methods. 2004 Jul;290(1-2):29-49. 16. de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, de Bruine AP, Arends JW, Hoogenboom HR. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. 17. Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1105-16. 18. Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97. 19. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J MoI Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10.
본 발명의 목적은 필라멘트성 파아지 상에서 디스플레이된 펩티드에 대한 대안적 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태는 필라멘트성 파아지로부터 유래하며 N-말단 시그널 서열을 포함하지 않아서 외인성 펩티드에 대한 직접 융합물인 pⅦ 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 필라멘트성 파아지에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 필라멘트성 파아지의 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하며, 상기 헬퍼 파아지는 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 파아지 디스플레이 계에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하며, 상기 파아지미드는 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 파아지 디스플레이 계에 관한 것이다.
일 양태는 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하며, 상기 헬퍼 파아지는 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 파아지 디스플레이 계를 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1은 필라멘트성 파아지 구조의 개략도이다. 비리온은 단일쇄 DNA 분자를 코팅하는 5개 구조 단백질에 의해 형성된다. 야생형(wt) 파아지에는 약 2700 복제수의 pⅧ, 및 비리온의 각 끝에서 발견되는 4개의 단백질 pⅢ, pVI, pⅦ 및 pⅨ 중의 어느 하나 약 3-5 복제수가 존재한다. 비리온 크기는 pⅧ 외피 단백질당 약 2.3 뉴클레오티드로 게놈 크기에 따라 다르므로, 입자의 길이는 pⅧ의 삽입된 복제수에서의 증가 또는 감소에 따라 조정될 수 있다. 특히, pⅢ 및 pⅧ 구조는 x-선 섬유 회절, 결정학 및 NMR에 의해 특징화되었다. 소수 외피 단백질 pⅢ는 글리신이 풍부한 영역(glycin-rich regions)에 의해 분리된 3개의 분명한 도메인을 함유한다: Nl(TolA에 결합), N2(F 필루스(pilus)에 결합) 및 CT(비리온에 통합되며 또 정상 비리온 어셈블리에 중요하다).
도 2
AviTagTM, HIS6-태그 및 FLAG-태그의 대장균(E. coli) K12 코돈 최적화. (A) 시판되고 있는 AviTagTM DNA 서열과 대장균 K12 코돈 사용의 대조. 적색 칼럼은 제출된 서열이고 또 흑색 칼럼은 참조 세트이다. (B) 상부 라인은 원래의 AviTagTM를 나타내는 반면에, 하부 라인은 A에서의 결과에 따라 조절된 변형 서열을 나타낸다. (C) 코돈 최적화된 FLAG 펩티드. (D) 코돈 최적화된 HIS6 펩티드.
도 3
wt 헬퍼 파아지와 비교한 변형된 헬퍼 파아지의 역가
도 4
ELISA 분석 M13K07 AviTag-pⅦ
정상화된(normalised) 파아지 제제를 스트렙트애비딘(Streptavidin)(SA) 비드와 혼합하여 바이오틴화된 비리온을 흡수하며 또 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA를 실시했다.
도 5
M13K07에서 pⅦ 융합물로서 FLAG-태그의 접근성을 나타내는 ELISA 분석. 정상화된 파아지 제제를 ELISA 에세이에 사용했다. M2 및 M5 MAb에 대한 M13K07-FLAG 만의 특이적 FLAG-태그 검출이 있다. M5 MAb에 의한 FLAG-태그의 더 강한 검출이 있다.
도 6
M13K07(서열번호: 31) 및 VCSM13(서열번호: 32)에 대한 pⅦ 융합물로서 HIS-태그의 접근성을 나타내는 분석. 정상화된 파아지 제제를 탈론 다이나비드(Talon Dynabeads)와 혼합하여 HIS6-태그화된 비리온을 흡수하며 또 실시예 1에 기재된 바와 같이 ELISA를 실시했다.
도 7
(A) cfuampR/ml로 나타낸 scTcR 및 scFv-pⅢ 디스플레이된 파아지미드의 파아지미드 역가. (B). 헬퍼 파아지 역가(cfukanR/ml)로 나누어진 파아지미드 역가(cfuampR/ml)의 비율로 나타낸 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율.
도 8
스트렙트애비딘 코팅된 다이나비드에 의한 파아지 구출 후 AviTag의 특이적 접근성을 나타내는 scTCR 파아지미드 AviTag의 ELISA 분석. 삽입된 그림은 M13K07-AviTag 헬퍼 파아지의 시그널 값을 나타낸다. 정상화된 파아지 제제를 사용했다.
도 9
파아지미드 비리온을 2개의 항 FLAG 항체, M2 및 M5에 의해 포획함으로서 2개의 상이한 파아지미드, pFKPDNscTCR Vαβ4B2A1(A) 및 pSEX-scFv 항-phOx(B)에서 pⅦ 융합물로서 FLAG-태그의 접근성을 나타내는 ELISA 분석. 정상화된 파아지 제제를 사용했다.
도 10
pⅦAviTag를 사용하여 파아지미드-유래 비리온 상에서 디스플레이된 scTCRpⅢ(A) 및 scFvpⅢ(B)의 작용성을 나타내는 ELISA 분석. 정상화된 파아지 제제를 사용했다.
도 11
FLAG-태그 및 HIS6-태그를 사용하여 파아지미드-유래 비리온 상에서 디스플레이된 scTCR(A) 및 scFv(B)의 작용성을 나타내는 분석. 정상화된 파아지 제제를 사용했다.
도 12
pⅦAviTag를 갖는 또 갖지 않는 게놈 파아지 fUSE5-scTCRpⅢ의 역가
도 13
스트렙트애비딘 비드에 의해 파아지를 포획한 다음 결합된 파아지를 항 M13-항체에 의해 검출하는 것에 의한 게놈 fUSE5-AviTag 파아지 제제의 작용성을 나타내는 ELISA 분석. 정상화된 파아지 제제를 사용했다.
도 14
AviTag-pⅦ를 사용하여 게놈 파아지 fUSE5 상에서 pⅢ-디스플레이된 scTCR의 작용성을 나타내는 ELISA 분석. 정상화된 파아지 제제를 사용했다.
도 15
신규 pGALD7(A) 및 pGALD7ΔL(B) pⅦ 디스플레이 파아지미드의 개략도. 양쪽 파아지미드의 벡터 골격은 진뱅크(GenBank) 수탁번호 Y14584로 입수할 수 있는 서열인 pSEX81(서열번호: 29)을 기본으로 하며, 또 작제물에 대한 상세한 사항은 원료 및 방법란에 상세하게 기재되어 있다. 양쪽 파아지미드는 Ncol/HindⅢ 및 MluI/NotI 부분 각각의 손쉬운 카세트 교환을 통하여 프레임내(in frame) 외인성 서열(E1 및 E2이라 칭함)의 카세트를 수용할 수 있다. 상기 카세트는 본 명세서에 기재된 상이한 작제물 중에서 다양할 수 있는 합성 링커 서열에 의해 연결된다. 약어: lacPO, lac 프로모터; sd, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열; pelB, 세균 펙테이트 리아제의 시그널 서열; TP, 트립신 단백질분해효소 부위; t, T7 전사 터미네이터.
도 16
pGALD7ΔL(pⅦΔL), pGALD7(pⅦ), pSEX81(pⅢ) 및 pSEX81ΔL(pⅢΔL)로부터 디스플레이된 scFv 항-phOx(서열번호: 26)의 파아지미드 역가.
모든 파아지미드는 암피실린 내성 마커를 포함하고 있어, 그 역가는 밀리리터 용액 당 암피실린 내성 콜로니 형성 단위(cfuampR/ml)로 나타낸다.
도 17
시그널 서열(ΔL)을 갖는 경우와 갖지 않는 경우에 pⅦ 및 pⅢ 사이에서 작용성 scFv 항-phOx(서열번호:26) 디스플레이를 비교하는 항원 특이적(phOx-BSA) ELISA. ELISA는 원료 및 방법란에 기재된 바와 같이 실시하였고 또 희석되지 않고 사용된 pGALD7(pⅦ)(1.1 x 107 cfuampR/ml에 상응함)을 제외하고는, 모든 샘플에 대하여 역가 인풋(titer input)은 2 x 1010 cfuampR/ml이었다. 항-M13HRP는 항원 및 블록에 대한 비리온 검출 MAb의 비특이적 흡착에 대한 음성 대조군임.
도 18
(A) cfuampR/ml로 나타낸 pGALD7ΔL(pⅦΔL), pGALD7(pⅦ), pSEX81(pⅢ) 및 pSEX81ΔL(pⅢΔL)으로부터 디스플레이된 scFv 항-phOx의 파아지미드 역가. (B) 헬퍼 파아지 역가(cfukanR/ml)로 나누어진 파아지미드 역가(cfuampR/ml)의 비율로서 나타낸 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율. 비리온 팩케이징은 원료 및 방법(-)란에 기재된 바와 같은 표준 파아지미드 구출에서와 같이 실시하거나, A 및 B 모두에서 초(super) 감염 후 존재하는 최종 농도 0.1mM IPTG를 이용하여 실시했다.
도 19
시그널 서열(ΔL)을 갖는 경우 및 갖지 않는 경우와 pⅦ 융합 디스플레이의 IPTG 유도(0.1 mM)를 갖는 경우 및 갖지 않는 경우에 작용성 scFv 항-phOx pⅦ 디스플레이를 비교한 항원 특이적(phOx-BSA) ELISA. 이런 ELISA는 원료 및 방법란에 기재된 바와 같이 실시하였으며, pGALD7(pⅦ)은 희석하지 않고 사용한 반면(IPTG를 사용하지 않은 경우와 사용한 경우 각각 2.0 x 109 내지 1.1 x 107 cfuampR/ml에 상응함), 역가 인풋은 pGALD7ΔL(pⅦΔL)에 대하여는 2 x 1010 cfuampR/ml이었다. 항-M13HRP는 항원 및 블록에 대한 비리온 검출 MAb의 비특이적 흡착에 대한 음성 대조군임.
도 20
시그널 서열(ΔL)을 갖는 경우와 갖지 않는 경우에 작용성 scTCR(A) 및 scFv-항-NIP(B) pⅦ 디스플레이를 비교한 항원 특이적 ELISA. ELISA는 희석되지 않은 투명 상층액 상에서 동일 부피를 이용하여 원료 및 방법란에 기재된 바와 같이 실시했다. 항-M13HRP는 항원 및 블록에 대한 비리온 검출 MAb의 비특이적 흡착에 대한 음성 대조군임. (A)에서, 4B2A1 T 세포 수용체에 특이적인 GB113 항체 클론(Bogen et al., PMID: 1700755)은 scTCR Vαβ4B2A1(LØset et al., PMID: 17925331)에 대한 동종(cognate) I-Ed/λ2315 리간드를 치환하는 대체 항원으로 사용되었다.
도 21
(A) 원료 및 방법란에 기재된 바와 같이 표준 파아지미드 구출을 이용하여 pGALD7ΔL 및 pGALD7로부터 디스플레이된 scTCR Vαβ4B2A1 및 scFv 항-NIP(서열번호: 27)의 파아지미드 역가. (B) (A)에서와 동일 샘플의 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율.
도 22
(A) A6O0nm에서 광학 밀도(OD)로서 나타낸, 비리온 팩케이징 방법 측정의 말기에 각 대장균 배양액의 세포 밀도. 특히, 모든 배양은 A6O0nm 0.025의 동일 밀도에서 개시하였고 또 A600nm 0.1에 도달할 때 MOI5에서 M13K07에 의해 초 감염되었다. 팩케이징이 허용되어 말기 배양액 OD를 측정하기 전에 30℃에서 ON을 진행했다.
본 발명의 요지 중의 하나와 관련하여 기재된 실시 형태 및 특징은 본 발명의 다른 요지에 대해서도 적용될 수 있음을 알아야 한다.
본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
우리는 여기서 필라멘트성 파아지 비리온의 구조 외피 단백질 pⅦ이 유전적으로 변형되어 그 변형물이 N-말단 서열 태그를 암호화하도록 하는 신규 발상을 제시한다. pⅦ에 융합되는 태그의 유형에 따라서, 비리온은 특이적 태그 검출 성능뿐만 아니라 그 계의 고유한 특성으로서 유연한 정제 및 고정화 수단을 갖게 된다. 이 방법은 pⅦ 상에서 새로운 라이브러리 생성을 비롯하여 파아지미드 벡터의 파아지 게놈-계가 적용되는지에 상관없이 모든 기존의 pⅢ 및 pⅧ 디스플레이 계에 직접적으로 양립 가능하다. 따라서 우리의 발상은 이미 높은 다양성을 가진 파아지 디스플레이 기술을 유례없이 확장시킨다.
현재의 보고는 필라멘트성 파아지 게놈이 N-말단 펩티드 변형을 견디며, 파아지의 생존능 및 작용성을 방해하지 않고 pⅦ의 시그널 서열을 갖지 않는 것을 최초로 밝힌다. 이것은 M13K07(서열번호: 31), VCSM13(서열번호: 32) 및 fUSE5(서열번호: 30) 게놈뿐만 아니라 파아지미드의 경우에 사실이었고 또 다양한 파아지 균주 사이의 서열 및 표현형 보존이 아주 높기 때문에 이것은 모든 필라멘트성 파아지에 대부분 적용된다.
선택된 pⅦ 융합물 중의 하나는 지금까지 보고된 가장 효율적인 BirA 기질인 펩티드로서 AviTag의 원핵생물 코돈 최적화된 융합물이었다. 이 pⅦ 펩티드 디스플레이를 pⅢ 디스플레이와 조합함으로써, 우리는 이특이적 비리온이 생성됨을 나타낸다. 이것은 변형된 M13K07 헬퍼 파아지에 의해 구출될 때 파아지미드계 디스플레이로부터 얻은 파아지-게놈계 벡터 fUSE5(서열번호: 30)의 경우에 사실이었다. 이런 이특이적 성질이 pⅧ 디스플레이와 조합되어 이용될 수 있음은 용이하게 알 수 있다. 특히 파아지미드-유래 비리온의 경우, 내인성 바이오틴화 수준은 매우 낮았다.
그러나, 높은 바이오틴화 수준이 바람직한 경우, 이것은 이들 비리온의 시험관내 바이오틴화에 의해서뿐만 아니라 신규 F-양성 대장균 AVB100FmkⅡ 균주의 사용을 통한 생체내 바이오틴화의 이용에 의해서도 용이하게 달성될 수 있다.
따라서, 현재의 발상은 애비딘-바이오틴 기술(및 기타 포획 시스템)과 우세한 파아지 디스플레이 플랫폼(파아지 및 파아지미드) 및 디스플레이 계(pⅢ 및 pⅧ)의 조합을 허용한다. 이런 발상은 또한 pⅢ 및/또는 pⅧ 융합을 방해하지 않고 바이오틴 부분을 파아지 입자에 대하여 제어되고, 부위-특이적 부착을 허용하므로, 작용성 보존을 확실하게 한다. 이런 계는 추가의 변형 없이 기존의 플랫폼에 직접적으로 양립하며, 사용 여부의 선택을 가능하게 한다.
결론적으로, 게놈-유래 비리온 및 파아지미드-유래 비리온은 모두 pⅦ 변형을 견딜 수 있어, 보기에 정상인 작용성 및 생존능을 갖는 비리온을 얻는다.
pⅦ 융합 단백질
일 요지로서, 본 발명은 필라멘트성 파아지로부터 기인하며, pⅦ의 N-말단에 대하여 외인성 펩티드의 융합물을 포함하는, pⅦ 융합 단백질을 제공한다. 이런 융합 단백질은 예컨대 파아지 디스플레이와 관련하여 유용하다.
외인성 펩티드를 지칭할 때, 의미하는 것은 융합 단백질의 pⅢ, pⅦ 또는 pⅧ 아미노산 부분의 N-말단에 대한 어떠한 링커(linker) 아미노산을 갖거나 또는 갖지 않는 원래 pⅢ, pⅦ 또는 pⅧ 단백질의 일부가 아닌 펩티드를 의미한다. 바람직한 실시 형태로서, 상기 융합 단백질은 N-말단 시그널 서열을 포함하지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 펩티드는 짧은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 그의 단편을 포함한다.
용어 pⅢ 단백질은 서열번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 지칭한다.
일 실시 형태로서 pⅢ 단백질은 서열번호: 2의 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성, 예컨대 80% 동일성, 81% 동일성, 82% 동일성, 83% 동일성, 84% 동일성, 85% 동일성, 86% 동일성, 87% 동일성, 88% 동일성, 89% 동일성, 90% 동일성, 91% 동일성, 92% 동일성, 93% 동일성, 94% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 pⅧ 융합 단백질은 외인성 펩티드에 융합된, pⅧ 단백질, 또는 그의 단편을 지칭한다.
용어 pⅧ 단백질은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 지칭한다.
일 실시 형태로서 pⅧ 단백질은 서열번호: 3의 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성, 예컨대 80% 동일성, 81% 동일성, 82% 동일성, 83% 동일성, 84% 동일성, 85% 동일성, 86% 동일성, 87% 동일성, 88% 동일성, 89% 동일성, 90% 동일성, 91% 동일성, 92% 동일성, 93% 동일성, 94% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 pⅦ 단백질은 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 지칭한다.
일 실시 형태로서 pⅦ 단백질은 서열번호: 1의 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성, 예컨대 80% 동일성, 81% 동일성, 82% 동일성, 83% 동일성, 84% 동일성, 85% 동일성, 86% 동일성, 87% 동일성, 88% 동일성, 89% 동일성, 90% 동일성, 91% 동일성, 92% 동일성, 93% 동일성, 94% 동일성, 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다.
서열 동일성
일반적으로 정의되는 바와 같이 "동일성"은 본 명세서에서는 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 유전자 또는 단백질 사이에서 서열 동일성으로 정의된다.
따라서, 본 명세서에서, "서열 동일성"은 아미노산 수준에서 단백질 사이의 동일성의 측도 및 뉴클레오티드 수준에서 핵산 사이의 동일성의 측도이다. 단백질 서열 동일성은 서열이 정렬될 때 각 서열에서 소정 위치의 아미노산 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 유사하게, 핵산 서열 동일성은 서열이 정렬될 때 각 서열에서 소정 위치에 있는 뉴클레오티드를 비교함으로써 결정될 수 있다.
2개 아미노산 서열 또는 2개 핵산 서열의% 동일성을 결정하기 위하여, 서열들은 최적 대조 목적을 위해 정렬된다(예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적 정렬하기 위하여 제1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭(gap)이 도입될 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 중의 한 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치에서와 같이 동일 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 상기 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 간의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일 위치의 개수의 함수이다 (즉% 동일성 = 동일 위치의 #/위치의 전체 #(예컨대, 중복 위치) x 100). 일 실시 형태로서 2개 서열은 동일 길이이다.
수동으로 서열을 정렬하고 동일 아미노산의 수를 셀 수 있다. 다르게는, % 동일성을 결정하기 위한 2개 서열의 정렬은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 이런 알고리즘은 (Altschul et al. 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어길이 = 12에 의해 실시하여 본 발명의 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 연구는 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3에 의해 실시하여 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 대조 목적을 위한 갭을 가진(gapped) 정렬을 얻기 위하여, Gapped BLAST를 이용할 수 있다. 다르게는, PSI-Blast를 이용하여 반복된 연구를 실시하여 분자 사이의 거리 관계를 검출한다. NBLAST, XBLAST, 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트(default) 변수가 이용될 수 있다. 참조 http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 다르게는, 서열 동일성은 서열을 예컨대 BLAST 프로그램에 의해 EMBL 데이터베이스로 정렬한 후에 계산할 수 있다(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST). 일반적으로, 예컨대 "점수 매트릭스(scoring matrix)" 및 "갭 페널티(gap penalty)"에 관한 디폴트 세팅이 정렬에 이용될 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, BLASTN 및 PSI BLAST 디폴트 세팅이 유리할 수 있다.
2개 서열 사이의 % 동일성은 상기 기재한 것과 유사한 수법을 이용하여 측정할 수 있으며, 갭을 허용하거나 허용하지 않을 수 있다. % 동일성 산출시, 정확히 매칭된 것만 계수한다.
폴딩된 단백질
바람직한 실시 형태로서, 용어 펩티드는 오로지 항체 유래 도메인과 같은 폴딩된 단백질을 지칭한다. 당업자는 폴딩된 단백질이 항체 또는 그의 단편, 커버링 Fv, scFv, Fab, 단일 도메인, 단백질 A의 Z 도메인(Affibody), 안키린(Ankyrin) 또는 그의 단편, T 세포 수용체 또는 그의 단편, MHC 클래스 I 및 II, 피브로넥틴 또는 그의 단편, 애비머(Avimers), 안티칼린(Anticalins), PDZ-도메인, IgNAR 또는 그의 단편, CTLA4 또는 그의 단편, ImmE7, 크노틴(Knottins), GFP 및 기타 유전자-암호화된 생물학적 형광단일 수 있음을 인식할 것이다.
원칙적으로, 디스플레이될 수 있는 것인 한 어떤 것의 라이브러리를 작성할 수 있으므로, 최고 수준에서, 정돈된 구조, 즉 폴딩된 구조와 비교하여 비-구조화된 배열만을 갖는 것 사이를 분리할 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태로서, 용어 펩티드는 오로지 2 내지 50 aa 사이의 짧은 펩티드를 지칭한다. 일부 길이에서 짧은 랜덤 코일(random coil) 펩티드는 정의된 이차 또는 삼차 폴딩을 채용할 만큼 충분히 길 수 있으므로, 폴딩된 도메인 정의에 들어간다. 분명히, 이것은 화학적 조성에 따라 다를 것이므로, 20 aa의 1개 펩티드는 여전히 랜덤 코일일 수 있고, 반면에 다른 20 aa 펩티드는 폴딩될 수 있으므로, 폴딩된 도메인 정의에 들어간다.
다른 바람직한 실시 형태로서, 본 발명의 pⅦ 융합 단백질은 서열번호: 1의 위치 1-33, 2-33, 3-33, 4-33 및 5-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
서열번호: 1(MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR)은 필라멘트성 파아지의 구조 외피 단백질 pⅦ(야생형 pⅦ)의 아미노산 서열이다. 가장 바람직하게는, pⅦ 융합 단백질은 서열번호: 1의 위치 1-33을 포함한다.
시그널 서열
바람직하게는, 외인성 펩티드는 어떠한 링커 아미노산을 사용하거나 사용하지 않고 직접 융합 단백질의 pⅦ 서열의 N-말단에 융합된다. 다른 바람직한 실시 형태로서, pⅦ 융합 단백질은 N-말단 리더 서열을 포함하지 않는다.
용어 "리더 서열"은 용어 "시그널 펩티드" 및 "시그널 서열"과 상호교환적으로 사용되며, 또 단백질(리더 서열이 일부분인)을 그램 음성 세균의 세포질주변 막 공간으로 향하게 하는 아미노산 서열을 지칭한다. 흔히 사용된 리더 서열의 예는 pelBss, OmpAss, TorAss, malEss, phoAss, lamBss, Blass, 및 DspAss, mglBss, sfmCss, tolBss 및 TorTss이다. 이런 시그널 서열은 완전 단백질을 공지된 대장균의 분비 기구로 향하게 하는 것으로 알려져 있고 세포질에서부터 주변세포질 간극까지 적어도 SRP-의존적, SEC-의존적, TatABC-의존적 또는 YidC-의존적 전위(translocation)를 포함하는 것으로 알려져 있다(Baneyx et al. PMID: 15529165). 따라서, 용어 N-말단 시그널 서열은 단백질의 N-말단 부분에 있는 시그널 서열을 지칭한다.
단백질(그의 일부분임)을 대장균의 분비 기구로 향하게 하는 특성이 있어서 단백질을 세포질로부터 주변세포질 구획으로 전위시키는 시그널 서열은 이들의 아미노산 조성의 화학적 특성에 의해 정의되는 사인(signature) 또는 모티프(motif)에 의해 확인된다.
그러나, 기존의 다양한 작용성 시그널 서열은 아직까지 이들을 확인하는 현재의 지식을 초과하지 않으므로, 어떤 펩티드를 동종 시그널 서열로서 확인하는데 있어서 종래 기술은 예컨대 신경 네트워크 또는 체험적 방법에 의해 주형으로 작용하는 지식 기반 데이터를 이용하여 데이터 마이닝(data mining)을 통하여 전형적으로 실시된다. SignalP, PROSITE의 PPSEARCH(EMBL-EBI), SecretomeP, TatP와 같은 오늘날의 개방 접근형 채널을 통하여 소통할 수 있는 몇 가지 도구가 있다.
분비 단백질이 세포질 구획으로부터 수송되고, 어떠한 시그널 서열 모티프도 확인될 수 없는 규칙으로부터 벗어나는 면에서 분비 단백질의 종류에 대한 난제는 더욱 더 높지만, 데이터 마이닝을 통하여 시그널 서열 특징을 정의하거나 또는 고려중인 진핵생물 단백질의 분비 성능의 확률을 얻을 수 있다. 아직까지, 원핵생물 분류학에는 그러한 도구가 존재하지 않는다.
펩티드를 시그널 서열로 최종적으로 확인한 현재 이용가능한 유일한 방법은 진짜 시그널 서열인지 여부를 확립하기 위하여 펩티드의 특성을 확인하는 실험 수단에 의해서이다. 엔지니어링이 그러한 펩티드에서 실시되어 시그널 서열 중의 소정 아미노산 위치가 변경될 수 있지만, 천연적 작용성에 의해 또는 증가된 수송 능력과 같은 변경된 작용성에 의해 시그널 펩티드로서 그의 작용을 유지하는 것이 또한 분명하다. 아미노산의 결실 또는 부가도 이용될 수 있다. 이런 분석 및 엔지니어링은 Ff pⅧ 시그널 서열, Sec-경로를 표적화하는 g8pss, 및 Tat-경로를 표적화하는 TorAss에 의해 실시했다. 특히 쉔 등(Shen et al)의 결과는 pⅢ 시그널 서열 및 세균성 펙테이트 리아제 시그널 서열의 작용성이지만 변경된 돌연변이체를 엔지니어링하기 위한 잘 확립된 가이드라인으로 작용할 수 있다.
시그널 서열의 작용성은 다음 2개 특성으로 더 구분될 수 있다:
1. 단백질(그의 일부)을 대장균의 분비 기구로 보냄으로써 단백질을 세포질에서부터 주변세포질 구획으로 전위하며 또 상기 과정 중 지단백질 시그널 펩티다아제, 또는 리더 펩티다아제와 같은 특이적 단백질분해효소에 의해 잔류하는 단백질을 단백질분해적으로 분리한다.
2. 단백질(그의 일부)을 대장균의 분비 기구로 보냄으로써 단백질을 세포질에서부터 주변세포질 구획으로 전위시키며 또 전위 이후 단백질의 일부로서 잔류한다.
대다수의 시그널 서열은 상기에 기재된 상황 1)까지 지도화하지만, 이들 단백질은 상황 2)까지 용이하게 엔지니어링될 수 있음이 분명하다. 따라서, 현재 공지된 시그널 서열, 예컨대 돌연변이체 pelBss 및 원래 상황 1)에 속하지만 상황 2)로 변경될 수 있는 다른 서열은 동종 시그널 서열로 여전히 간주된다.
또한, 상황 1)의 시그널 서열을 상황 2)로 변경하거나, 또는 상황 2)로 지도화하는 시그널 서열을 직접 선택한 다음 전위 이후에 시그널 서열을 제거하는 것을 고려할 수 있다. 이것은 숙주의 내인성 단백질분해효소에 의하거나 및/또는 단백질이 캡시드 단백질에 융합될 때 예컨대 파아지 디스플레이의 경우에 실시될 수 있다. 시그널 서열의 적합한 영역, 또는 단백질에 인공 단백질분해효소 부위를 엔지니어링하여서 소정의 절단을 실시할 수 있다. 여기서 2개의 상이한 유형의 단백질 분해효소 부위를 선택할 수 있다:
A. 단백질분해효소 부위는 관심을 갖고 있는 단백질은 절단하지 않고, 주요 조직적합 복합체 분자 또는 T 세포 수용체와 같은 관심을 갖고 있는 항체 또는 기타 스캐폴드와 조합된, 예컨대 카복시펩티다아제 A, 또는 3C 리노바이러스(rhinovirus) 단백질분해효소 부위와 같은 예정된 부위만을 절단한다. 이런 방법을 이용함으로써, 상기 상황 2)까지 시그널 서열 맵핑(mapping) 이용에 의해 관심 있는 단백질의 파이지 디스플레이를 예상할 수 있으며 또 선택 등에 사용하기 전에 시그널 펩티드를 인공적으로 제거하여 캡시드 융합에 대한 작용성과 균일성을 얻는다.
B. 단백질분해효소 부위는 예컨대 트립신과 같은 엔지니어링된 부위 이외에 관심을 갖고 있는 단백질을 절단한다.
양쪽 상황은 시그널 서열-의존적 파아지 디스플레이으로 간주될 것이다.
야생형 보완( complementation )
지금까지, 시그널 서열을 갖지 않는 pⅦ 융합물은 파아지 입자의 지속되는 생산에 대하여 비작용성인 것으로 믿어졌다(Endeman et al., 1995; Gao et al., 1999). 따라서, 그 N-말단에 직접 융합된 외인성 펩티드를 갖는 pⅦ 융합 단백질은 파아지 게놈 상의 제2 유전자로부터 또는 헬퍼 파아지의 공여에 의해 wt pⅦ 단백질에 의해 보완되어야 한다.
때로 와일드타입 또는 wt로 기재되는 용어 야생형은 생물, 균주, 유전자의 전형적인 형태이거나, 또는 천연에서 생기는 그대로의 특징을 갖는다. 야생형은 천연 집단에서 가장 일반적인 표현형을 지칭한다. 야생형은 또한 야생형 표현형을 생성하는데 필요한 각 장소에서 대립유전자를 지칭한다. 야생형은 유전형 및 표현형에 대한 기준이 되는 표준이다. 생물학에서, 이것은 특히 천연 산출 생물과 의도적으로 돌연변이된 생물 사이의 차이점에 관한 것이다. 부위 특이적 돌연변이는 야생형 유전자의 유전자 서열에서 특이적 뉴클레오티드의 돌연변이를 허용하는 연구 수법이다. 야생형 단백질은 wt-(단백질 명칭)로 표기하며, 예컨대 야생형 pⅦ 단백질은 wt pⅦ, wt-pⅦ 또는 야생형 pⅦ로 표기한다.
본 발명자들은 이런 pⅦ 융합 단백질이 작용성이며 또 wt pⅦ 단백질에 의해 반드시 보완될 필요는 없다는 것을 발견했다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 wt pⅦ 단백질에 의한 보완없이 파아지 디스플레이에서 작용성인 pⅦ 융합 단백질에 관한 것이다.
크와스니코우스키 등은 야생형 pⅦ 단백질에 의해 보완되지 않아도 되었던 pⅦ 융합 단백질을 보고했다. 그러나, 크와스니코우스키 등의 pⅦ 융합 단백질은 외인성 펩티드의 N-말단에 시그널 펩티드를 포함했다. 상기 시그널 펩티드는 N-말단 pⅦ 융합 단백질을 주변세포질 간극으로 표적화하고 또 세포질에서 그의 축적을 방지하기 위해 필수적인 것으로 추정되었다.
pⅦ 융합 단백질의 N-말단에서 시그널 펩티드의 부재는 다양한 이점을 갖는다. 시그널 펩티드는 보통 단백질 분해적으로 제거되고 또 이런 과정은 흔히 완료되지 않아서, 단백질의 집합이 발현될 때, 가공된 단백질의 상이한 N-말단을 생성하므로, 계 내에 랜덤 이질성을 도입하고, 여전히 리더 펩티드를 갖는 단백질의 작용성에 영향을 줄 수 있어, 가공된 단백질에서 바람직하지 않은 오류를 초래한다. 이것은 시그널 펩티드가 존재하지 않을 때 방지된다.
또한, 펩티드의 라이브러리가 디스플레이될 때, 펩티드의 일부는 단백질분해를 방지하거나 또는 단백질 분해에 영향을 줄 수 있고, 이는 다시 디스플레이된 단백질의 활성 및 그에 따라 작용성 라이브러리 다양성에 영향을 줄 것이다. 시그널 펩티드를 포함하지 않는 다른 놀라운 이점은 시그널 펩티드를 사용할 때와 반대로, 파아지의 생존능 및 작용성이 나쁜 영향을 받지 않는 것이다. 크와스니코우스키 등은 N 말단에 리더 서열(시그널 펩티드)을 포함하는 pⅦ 융합 단백질에 의한 파아지의 역가 감소를 보고했다.
외인성 펩티드
일 실시 형태로서, 외인성 펩티드는 소정 표적에 결합하는 친화성 태그이다. 이런 친화성 태그는 예컨대 소정 항체에 결합할 수 있다. 친화성 태그 및 소정 표적의 쌍은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
단백질 태그는 재조합 단백질 상에 유전자적으로 그라프트(grafted) 되는 펩티드 서열이다. 흔히 이들 태그는 화학물질에 의해 또는 단백질분해 또는 인테인 접합(splicing)과 같은 효소적 수단에 의해 제거된다. 태그는 다양한 목적을 위해 단백질에 부착된다.
친화성 태그는 단백질에 부가되어 있어서 이들은 친화성 수법을 이용하여 이들의 조 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
미가공 N-말단 FLAG 태그를 사용하는 특징은 그것이 손상되지 않은 그의 포밀-Met 잔기를 보유하고 있어서 항-FLAG MAb Ml과의 Ca2 + 의존적 상호작용을 허용하는 것이다. 따라서 비리온은 Ml 상에 결합(고정화됨)될 수 있고 또 예컨대 EDTA에 의해 양이온을 단순히 킬레이팅하는 것으로 방출됨으로써, 이종 융합물을 변성하는 극한 pH 없이 매우 약한(mild) 용출을 제공한다. M1을 사용하는 것에 의해 상기 계는 존재하는 다른 FLAG 융합물(내부, 가공된 N-말단 또는 C-말단)과 함께 간섭 없이 사용될 수 있음을 의미하며, 이는 이들이 M1에 의해 또는 단순히 [Ca2 +]를 단순히 낮게 유지하는 것에 의해 인식되지 않기 때문이다.
바람직한 실시 형태로서, pⅦ 융합 단백질의 외인성 펩티드는 AviTag(서열번호: 4), FLAG 태그(서열번호: 9), HIS 태그(서열번호: 12), HAT 태그, HA 태그, c-Myc 태그, Strep 태그, V5 태그, 항체 또는 그의 단편, T 세포 수용체 또는 그의 단편, MHC 클래스 I 및 II, 안키린, IgNAR 또는 그의 단편, 피브로넥틴 또는 그의 단편, 단백질 A의 Z 도메인, CTLA4 또는 그의 단편, ImmE7, GFP 및 다른 유전자-암호화된 생물학적 형광단으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
서열번호: 2(MSGLNDIFEAQKIEWHE)는 바이오틴 부분을 기질 서열에 효소 매개된 부위 특이적 커플링시킬 수 있는 대장균 효소 BirA 서열의 기질 서열이다. 따라서, 파아지 디스플레이 기술 및 애비딘-바이오틴 기술의 이점을 조합한다. pⅦ 상에서 라이브러리가 디스플레이되지 않는 융합 라이브러리는 예컨대 고-친화성 라이브러리 구성원의 확인을 위한 표적에 대해 먼저 분별(fractionated)된 다음 애비딘에 대한 바이오틴 결합을 이용하거나, 또는 비리온 상에서 pⅦ 융합을 비롯한 수단에 의한 애비딘-유사 매트릭스를 이용하여 고정화된다. 다르게는, pⅦ 상에서 라이브러리가 디스플레이되지 않는 융합 라이브러리는 예컨대 애비딘 또는 애비딘-유사 매트릭스 상에서 제어되는, 특이적 방식으로 랜덤하게 또는 소정 어레이로 먼저 고정화된 다음, 비리온 상의 pⅦ 융합을 비롯한 수단에 의해 예컨대 SEREX와 같은 표적 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 이런 pⅢ 또는 pⅧ 융합 라이브러리의 구성원은 애비딘- 또는 애비딘-유사 리포터(reporter) 복합체의 사용에 의하여 표적 상호작용 이전에 또는 이후에 벌크(bulk)로 또는 단일 클론으로 검출될 수 있다. 용어 리포터는 본 명세서에서는 예컨대 효소, 핵산 종 또는 합성 또는 생물학적 형광단을 지칭한다.
AviTag에 대해 개략적으로 기재한 것과 본질적으로 동일한 논리이지만, AviTag가 거의 비가역적 고정화를 초래하는 반면에, HIS6은 이미다졸을 사용한 약한 용출을 허용한다. HIS 태그는 모든 이용가능한 IMAC 매트릭스와 양립할 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태로서, pⅦ 융합 단백질의 외인성 펩티드는 라이브러리 구성원이다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 라이브러리는 상이한 펩티드의 집합을 지칭한다. 이들 펩티드는 폴딩된 도메인이거나 또는 예컨대 2-50 아미노산의 짧은 펩티드이다. 이런 라이브러리는 아주 중요한데 그 이유는 이들이 소정 표적에 대한 새로운 리간드 결합을 확인하는데 사용될 수 있기 때문이다. pⅢ 또는 pⅧ를 사용하여 디스플레이되는 라이브러리와 비교하여 라이브러리 디스플레이를 위해 pⅦ를 사용하는 몇 가지 이점이 존재한다. pⅦ 디스플레이는 특이성 및 원자가에 관련하여 pⅢ 디스플레이와 동일한 이점을 함유하지만, 예컨대 친화성 선택 후 구출시 제어되지 않고 바람직하지 않게 계에 도입된 이종 성질인, pⅢ 디스플레이와 함께 생기는 것으로 알려진 현상인, 감염성에는 나쁜 영향을 주지 않을 것이다. 또한 pⅦ 디스플레이는 pⅢ 및 pⅧ 디스플레이를 위해 필수적인 N-말단 리더 펩티드를 필요로 하지 않고 달성될 수 있다. 마지막으로, pⅢ 디스플레이에서 표적 고정화된 종은 보통 표적-파아지 결합의 파괴(보통 경쟁적, 또는 높은 또는 낮은 pH 용출에 의해)를 필요로 한다. 이것은 예컨대 pⅢ 디스플레이에서 고-친화성 또는 안정한 결합제의 복구를 현저하게 저해하는 것으로 알려져 있다. 감염에 필요한 pⅢ는 변형되지 않고 또 파아지-표적 상호작용 후에도 pⅦ 디스플레이에서 대안적인 상호작용을 용이하게 얻을 수 있다. 이것은 결합 파괴, 예컨대 산성 용출에 대한 필요성을 완전히 제거하는데, 이는 고정화된 파아지가 충분한 감염성을 유지하므로 표적에 결합되는 동안 감염에 의해 간단히 복구될 수 있다.
핵산
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산이다. 이 핵산은 파아지 게놈 내에 또는 파아지미드 내에 포함될 수 있다.
용어 핵산은 단량체성 뉴클레오티드의 사슬로 이루어진 고분자(macromolecule)를 지칭한다. 생화학에서, 이들 분자는 유전자 정보를 전달하거나 또는 세포 내에서 구조물을 형성한다. 가장 흔한 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)이다. 또한, 용어 핵산은 펩티드 핵산(PNA), 모폴리노 및 LNA(locked nucleic acid), 뿐만 아니라 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오세 핵산(TNA)과 같은 인공 핵산을 포함한다. 이들의 각각은 분자의 주쇄에 대한 변화에 의하여 천연 산출 DNA 또는 RNA로부터 구별된다.
파아지미드 또는 파스미드는 플라스미드로서 증식할 수 있고 또한 바이러스 입자에서 단일쇄 DNA로서 팩케이징될 수 있는 벡터를 생성하는 필라멘트성 파아지 Pf 및 플라스미드의 하이브리드로서 개발된 클로닝 벡터 유형이다. 플라스미드와 유사하게, 파아지미드는 DNA 단편을 클론하기 위하여 사용될 수 있고 또 다양한 수법(형질전환, 엘렉트로포레이션)에 의해 세균 숙주로 도입될 수 있다. 그러나, 파아지미드를 함유하는 숙주 세포를 예컨대 VCSM13 또는 M13K07과 같은 '헬퍼' 파아지로 감염시키면, 필요한 바이러스 성분을 제공하므로, 단일쇄 DNA 복제 및 파아지미드 DNA의 파아지 입자로의 팩케이징을 가능하게 한다.
필라멘트성 파아지
본 발명의 제3 양태는 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 필라멘트성 파아지이다. 필라멘트성 파아지는 파아지 게놈 또는 파아지미드를 포함할 수 있다.
흔히 박테리오파아지라 불리는 파아지는 여기서는 감염성, 복제성이며 세균으로부터 분비되는 바이러스를 의미한다. 필라멘트성 박테리오파아지, 또는 필라멘트성 파아지는 파아지 피막 단백질에 의해 팩케이징된 단일쇄 DNA 게놈(ssDNA 게놈)을 갖는 파아지이다. 분비된 필라멘트성 파아지 입자는 표현형적으로 필라멘트성 구조를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 필라멘트성 파아지는 파아지-게놈 유래 비리온 및 파아지미드-유래 비리온을 포함한다.
일 실시 형태로서, 필라멘트성 파아지는 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지 않는데, 이는 융합 단백질은 헬퍼 파아지에 의해 공여되었을 수 있기 때문이다.
용어 헬퍼 파아지는 그 자체는 파아지 게놈도 아니고 작용성 바이러스도 아니며, 단지 파아지 게놈으로부터 유래한 1 또는 몇 개의 요소를 함유하는 플라스미드로서, 결함있는 바이러스에 의해 이미 점유된 동일 숙주 세포를 감염시키고 또 결함있는 바이러스가 갖지 않는 단백질을 제공하는 것에 의해 재생하여 파아지미드를 함유하는 완전한 생활환 비리온을 형성할 필요가 있는, 별개의 및 관련되지 않은 결함 있는 바이러스를 돕는 바이러스를 지칭한다.
다른 실시 형태로서, 필라멘트성 파아지는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 필라멘트성 파아지는 파아지 게놈 또는 파아지미드를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 파아지 게놈을 포함하는 파아지가 특히 바람직하다.
다른 실시 형태로서, 본 발명의 필라멘트성 파아지는 wt pⅦ 및/또는 wt pⅦ 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 즉 필라멘트성 파아지에 의해 디스플레이된 융합 단백질 디스플레이 수는 wt pⅦ 대 pⅦ 융합 단백질의 비율을 조절하는 것에 의해 조절될 수 있다. 이런 계는 wt pVII 단백질이 헬퍼 파아지(7+7)로부터 공여되는지 또는 파아지 게놈(77) 상의 제2 유전자로부터 공여되는지에 따라서 또한 77 계 또는 7+7 계로 지칭될 수 있다.
다른 실시 형태로서, 필라멘트성 파아지는 wt pⅦ 유전자 및/또는 wt pⅦ 단백질을 포함하지 않는다. 즉 필라멘트성 파아지는 pⅦ 융합 단백질만을 포함하고 wt. pⅦ 단백질은 포함하지 않는다.
바람직한 실시 형태로서, 필라멘트성 파아지는 pⅢ 융합 단백질 또는 pⅧ 융합 단백질을 더 포함한다. 라이브러리는 pⅢ 또는 pⅧ에서 디스플레이될 수 있고 또 pⅦ 융합 단백질은 예컨대 애비딘 또는 애비딘-유사 매트릭스를 사용하여 친화성 정제, 고정화 또는 검출을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 필라멘트성 파아지는 야생형 형태만의 pⅨ 단백질을 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 필라멘트성 파아지의 라이브러리이며, 상기 필라멘트성 파아지는 pⅢ, pⅦ 또는 pⅧ에 대한 융합물로서 외인성 펩티드 또는 단백질을 디스플레이한다.
라이브러리는 1 이상의 필라멘트성 파아지 외피 단백질의 일부로서 펩티드 또는 단백질을 디스플레이하는 필라멘트성 파아지의 집합이다. 이런 라이브러리는 상이한 펩티드 또는 단백질을 디스플레이하는 2 또는 그 이상의 파아지를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태로서, 펩티드는 pⅦ 및 pⅢ 또는 pⅧ에서 동시에 디스플레이된다.
다른 바람직한 실시 형태로서, pⅦ에서 디스플레이되는 외인성 펩티드는 AviTag(서열번호: 4), FLAG 태그(서열번호: 9), HIS 태그(서열번호: 12), HAT 태그, HA 태그, c-Myc 태그, Strep 태그, V5 태그, 항체 또는 그의 단편, T 세포 수용체 또는 그의 단편, 안키린, IgNAR 또는 그의 단편, 피브로넥틴 또는 그의 단편, MHC 클래스 I 및 II, 단백질 A의 Z 도메인, CTLA4 또는 그의 단편, ImmE7, GFP 및 다른 생물학적 유전자-암호화된 형광단으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시 형태에서, pⅢ 또는 pⅧ에서 디스플레이되는 펩티드는 바람직하게는 라이브러리 구성원이다. 다른 실시 형태로서, 라이브러리 구성원은 pⅦ에서 디스플레이되는 반면에, pⅢ 또는 pⅧ는 AviTag(서열번호: 4), FLAG 태그(서열번호: 9), HIS 태그(서열번호: 12), HAT 태그, HA 태그, c-Myc 태그, Strep 태그, V5 태그, 항체 또는 그의 단편, T 세포 수용체 또는 그의 단편, MHC 클래스 I 및 II, 안키린, IgNAR 또는 그의 단편, 피브로넥틴 또는 그의 단편, 단백질 A의 Z 도메인, CTLA4 또는 그의 단편, ImmE7, GFP 및 다른 생물학적 유전자-암호화된 형광단으로 이루어진 군으로부터 선택된 외인성 펩티드를 디스플레이한다.
파아지 디스플레이 계
본 발명의 제5 양태는 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하고, 상기 헬퍼 파아지는 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 파아지 디스플레이 계이다.
파아지 디스플레이 계, 파아지 디스플레이 수법, 파아지 디스플레이 기술 또는 단순히 파아지 디스플레이는 단백질을 암호화하는 유전자 정보에 의해 단백질을 연결하기 위해 박테리오파아지를 이용하는 단백질- 단백질, 단백질-펩티드, 및 단백질-DNA 상호작용의 발견 및 연구 방법을 지칭한다.
단백질을 디스플레이하는 것 또는 디스플레이된 단백질은 리간드에 의한 검출 또는 고정화에 접근하기 쉬운 파아지 외피 단백질에 융합된 단백질을 지칭한다.
본 발명의 제6 양태는 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하고, 상기 파아지미드는 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 파아지 디스플레이 계이다.
키트
본 발명의 제7 양태는 파아지미드 및 헬퍼 파아지로 구성되는 파아지 디스플레이 계를 포함하고, 파아지미드는 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 키트이다. 키트는 코딩 영역의 N-말단에 다중 클로닝 부위를 갖는 유전자를 암호화하는 pⅦ를 갖는 파아지미드 및 헬퍼 파아지(예컨대, M13K07, VCSM13 또는 기타)를 포함해야 한다. 키트는 파아지 클론의 감염, 디스플레이, 고정화, 선택 및 검출에 대한 계획을 보충해야 한다. 이들 키트는 또한 특이적 에세이를 실시하기 위한 완충액 및 배지에 대한 필수 방법을 동반해야 한다.
본 명세서에서 지칭하는 키트는 단일 또는 이특이적 융합 단백질을 파아지 디스플레이 라이브러리 또는 단일 파아지 입자로서 갖는 파아지 입자를 생성하기 위한 시약의 집합을 말한다. 키트는 파아지미드, 헬퍼 파아지, 세균 균주 및 시약 및 에세이 기술에 대한 수단을 갖춘 프로토콜을 포함해야 한다. 키트는 연구, 진단 및 치료용 시약의 개발에도 사용될 수 있다.
본 발명의 제8 양태는 파아지 게놈-계 파아지 디스플레이 계를 포함하며, 상기 파아지 게놈은 본 발명의 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 키트이다.
키트는 파아지 게놈 벡터(M13K07, VCSM13, fUSE5(서열번호: 30))와 함께 코딩 영역에서 N-말단적으로 다중 클로닝 부위를 갖는 pⅦ 암호화 유전자를 포함해야 한다. 키트는 파아지 클론의 감염, 디스플레이, 고정화, 선택 및 검출에 대한 계획을 보충해야 한다. 이들 키트는 또한 특이적 에세이를 실시하기 위한 완충액 및 배지에 대한 필수 방법을 동반해야 한다.
본 발명의 제9 양태는 태그를 pⅦ 융합물로 하여pⅢ 융합 파아지미드 라이브러리 또는 단일 pⅢ 융합 파아지미드 클론을 생산하기 위한 헬퍼 파아지를 포함하는 키트이다. 키트는 헬퍼 파아지(M13K07, VCSM13)와 함께 포획 및/또는 검출 목적에 적합한 짧은 펩티드를 암호화하는 삽입 서열을 갖는 pⅦ 암호화 유전자를 포함해야 한다. 키트는 파아지 클론의 감염, 디스플레이, 고정화, 선택 및 검출에 대한 계획을 보충해야 한다. 이들 키트는 또한 특이적 에세이를 실시하기 위한 완충액 및 배지에 대한 필수 방법을 동반해야 한다.
본 발명의 제10 양태는 pⅢ 및 pⅦ 양쪽에서 융합 단백질을 디스플레이하기 위한 파아지 게놈 라이브러리를 생성하기 위한 파아지 게놈 벡터를 포함하는 키트이다. 이런 키트는 파아지 게놈 벡터(Ff)와 함께 각 코딩 영역에서 N-말단에 다중 클로닝 부위를 갖는 PⅢ 및 PⅦ를 암호화하는 유전자를 포함해야 한다. 다르게는, 상기 키트는 포획 및/또는 검출용으로 적합한 짧은 펩티드를 암호화하는 pⅦ에 N-말단으로 삽입된 서열을 갖는 파아지 게놈 벡터 및 pⅢ에 N-말단으로 다중 클로닝 부위를 함유해야 한다. 이런 키트는 파아지 클론의 감염, 디스플레이, 고정화, 선택 및 검출에 대한 계획을 보충해야 한다. 이들 키트는 또한 특이적 에세이를 실시하기 위한 완충액 및 배지에 대한 필수 방법을 동반해야 한다.
본 발명의 제11 양태는,
a. 이특이적 파아지 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계, 이때 파아지는 제1 위치에서 디스플레이된 펩티드 및 제2 위치에 친화성 태그를 포함하며,
b. 표적에 대한 파아지 디스플레이 라이브러리를 선택하는 단계,
c. 상기 파아지 디스플레이 라이브러리를 친화성-태그의 포획 기에 대하여 고정화시키는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명은 이하의 비제한적인 실시예로 더욱 자세하게 설명한다.
실시예
실시예 1. pⅦ에 융합된 펩티드를 갖는 변형된 헬퍼 파아지
FLAG-pⅦ, HIS6-pⅦ, 및 AviTag-pⅦ에 의해 변형된 헬퍼 파아지 M13K07(서열번호: 31) 및 VCSM13(서열번호: 32)는 파아지 디스플레이 기술의 이용을 확대할 가능성을 보여줄 수 있지만, 이런 융합 펩티드는 헬퍼 파아지의 작용성을 포함하지 않아서, 파아지의 적정이 중요한 확인 변수이라는 것이 매우 중요하다. 또한 pⅦ에 융합된 펩티드는 다음 검출 및/또는 고정화에 이용될 수 있어야 한다. 이 실시예는 pⅦ-변형된 헬퍼 파아지가 검출 및/또는 고정화 목적을 위한 다양한 펩티드를 보유하며 또 이들 융합 펩티드는 파아지의 감염성에 나쁜 영향을 주지 않는다는 사실을 지지한다.
엔델만 및 모델(PMID: 7616570)로부터 얻은 초기의 결과는 필라멘트성 파아지(Ff) 캡시드 단백질 pⅦ이 외인성 융합을 견디지 않았음을 나타내었지만, 나중에는 파아지미드-계(Gao et al., PMID: 10339535) 및 파아지 게놈-계(Kwasnikowski et al., PMID: 16277988) 펩티드 및 폴딩된 도메인 디스플레이는 pⅦ에 대한 N-말단 융합물로서 허용될 수 있음이 밝혀졌다. 양쪽 경우에, 성공 비결은 원핵생물 시그널 서열, 또는 리더 펩티드를 융합물의 극단의 N-말단에 부가함으로써 융합 단백질의 주변세포질 표적화하고, 그에 따라 융합물을 대장균 숙주의 SEC 경로로 표적화하는 것을 필요로 한다.
생산적인 pⅦ 디스플레이는 N-말단 리더 펩티드를 보유하여 재조합 pⅦ이 주변세포질 구획으로 확실히 수송되게 하는 파아지미드 상에서 암호화되는 N-말단 융합과 관련하여서만 이전에 밝혀져 있었다(Endeman et al., 1995; Gao et al., 1999).
그러나, 비리온으로 혼입되기 전에, wt pⅦ는 주변세포질 간극과 면하는 그 N-말단을 갖는 그램 음성 대장균 숙주의 내막(inner membrane)에서 통합 막 단백질로서 발견되는 것은 공지되어 있다. 또한, 이 막이 결합된 바와 같이, 성숙 wt pⅦ는 그의 아미노-말단 포밀 기(Simons et al., PMID; 6945579)를 유지하며, 주변세포질 리더 펩티다아제에 의해 N-말단적으로 가공되지 않는 것으로 보이며, 이는 세포질 구획(Baneyx 및 Mujacic, PMID: 15529165) 외부에서 발견되는 시그널 서열-특이적 단백질의 대다수에서 그러하다. pⅦ ORF에서는 어떠한 분명한 시그널 서열-유사 모티프가 확인될 수 없으므로, 세포질로부터 주변세포질로의 전위 모드는 파악되지 않은 채 있지만, 대부분은 대장균에서 확인된 4개의 주요 분비 기구, 즉 SEC-, SRP- 및 Tat- 및 YidC 경로를 포함하지 않을 것이다(Baneyx 및 Mujacic, PMID: 15529165; Samuelson et al., PMID: 10949305). 필라멘트성 파아지 비리온의 구조는 도 1에 도시되어 있다.
시약
모든 배지 및 완충액은 기본적으로 샘브룩 등(Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))에 기재된 바와 같이 제조했다. 항-M13-HRP 항체 및 M2 및 M5 항체는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB, Uppsala, Sweden) 및 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich, Oslo, Norway)로부터 구입했다. 제한효소(RE)는, 스트라타진(Stratagene, LaJoIIa, CA, USA)으로부터 입수한 DpnI을 제외하고는, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)으로부터 구입했다. DNA 올리고는 MWG 바이오테크 AG(Ebersberg, Germany)로부터 구입했다. Dynabeads MyOneTM-스트렙트애비딘 자성 비드 및 TalonTM Ni-NTA 자성 비드는 인비트로겐(Invitrogen, Oslo, Norway)로부터 구입했다. BSA 및 Tween 20은 시그마-알드리히 (Oslo, Norway)로부터 구입했다. Pfu Ultra DNA 및 Phusion DNA 중합효소는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA) 및 시그마-알드리히(Oslo, Norway)로부터 각각 구입했다. TMB soluble은 Chalbiochem으로부터 구입했다.
세균 균주, 파아지
대장균 균주 XLl-Blue는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입했다. M13K07 헬퍼 파아지는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(Uppsala, Sweden)로부터 구입한 반면에, VCSM13(서열번호: 32)는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입했다.
AviTagTM-, HIS6-, 및 FLAG-pⅦ의 디자인 및 시험관내 돌연변이
AviTagTM(N-MSGLNDIFEAQKIEWHE-C)의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 GCUA 서버(http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html)를 이용하여 대장균 K12 균주에서 코돈 이용과 비교했다. AviTagTM 펩티드 서열(서열번호: 4)의 원핵생물 코돈-최적화된 서열은, 제조자의 수순(Stratagene, LaJolla, CA, USA)에 따라서 프라이머쌍 BirA-pⅦ_frwd/BirA-pⅦ_rev(5'-
Figure 112010017743108-pct00001
을 이용하여 시험관내 돌연변이로 QuikChangeTM 에 의해 pⅦ 또는 F에 N-말단적으로 부착되었다. 상기에 기재된 것과 동일한 방식으로, FLAG-태그(N-DYKDDDDK-C)(서열번호:9) 및 HIS6-태그(N-HHHHHH-C)(서열번호: 12)의 대장균 K12 코돈 최적화된 태그는 프라이머쌍 FLAG-pⅦ-frwd/ FLAG-pⅦ-rev(5'-
Figure 112010017743108-pct00002
(각각 서열번호: 7 및 서열번호: 8) 및 HIS6-pⅦ-frwd/HIS6-pⅦ-rev(5'-
Figure 112010017743108-pct00003
(각각 서열번호: 10 및 서열번호: 11)을 이용하여 N-말단적으로 pⅦ 또는 F에 부착시켰다. 다양한 작제물은 모든 경우에서 DNA 서열결정화(ABI 랩 DNA 시퀀싱 코어 퍼실리티 실험실내, Dept. Molecular Biosciences, University of Oslo)에 의해 확인했다. 클린 벡터 백그라운드를 확실히 하기 위하여, 변형된 pⅦ를 함유하는 BsrGI/SnaBI RE 단편은 표준 수법을 이용하여 양립성 RE 부위 상의 M13K07wt 또는 VCSM13wt 게놈으로 이동시켰다. DNA 작제물을 엘렉트로포레이션(electroporation) 에 의해 다양한 대장균 숙주에 도입했다. 프라이머 디자인은 ClustalW를 이용한 M13K07(뉴 잉글랜드 바이오랩스 시퀀스)(서열번호:31) 및 VCSM13(진뱅크 수탁번호: AY598820)(서열번호:32) 서열의 서열 정렬을 기본으로 한다. 변형된 AviTagTM-, HIS6-, 및 FLAG-서열의 서열은 도 2에 도시한다.
파아지 입자의 제조
파아지는 기본적으로 기재된 바와 같이 M13K07(서열번호: 31), VCSM13(서열번호: 32) 작제물에 의해 형질전환된 대장균 XLl-Blue로부터 증폭했다(Scott and Smith, PMID: 1696028).
바이오틴화된 비리온의 SA 비드-포획
10㎕/튜브 TM-스트렙트애비딘 비드를 새로운 1.5-ml 튜브에 전달하고 또 PBS(w/v) 중의 2% BSA 500㎕를 부가했다. 유사하게, 250㎕의 청정 상층액 또는 적당량의 파아지를 1.5-ml 튜브에 넣고 또 250㎕의 2% BSA로 보충했다. 이 튜브를 실온(RT)에서 1시간 동안 회전 휠 상에서 배양했다. 그 후, 다이날 튜브 자성 랙(Dynal tube magnet rack)을 이용하여 비드를 먼저 고정화하는 것에 의해 3x 비드를 세척했다. 그 상층액은 버리고 또 0.05% Tween 20(PBST)을 함유하는 0.5 ml의 PBS를 각 튜브에 부가했다. 이 튜브를 랙으로부터 빼내고 또 랙에 다시 넣기 전에 간단하게 소용돌이처리(vortexed)시켰다. 그 상층액을 다시 투명하게 만들고 2회 반복해서 세척했다. 이들 튜브를 랙으로부터 제거하고 또 250㎕의 블로킹된 파아지 및 250㎕의 PBST를 각 튜브에 부가했다. 이 튜브들을 회전 휠 상, 실온에서 1.5 시간 동안 배양했다. 이 튜브를 상기 기재한 바와 같이 PBST로 3x 세척했다. 항-M13 MAb-HRP(1:2000)를 함유하는 0.5 ml의 PBST를 각 튜브에 부가한 다음 그 튜브들을 회전 휠 상, 실온에서 1시간 동안 배양했다. 이 튜브들을 상기 기재한 바와 같이 PBST로 3x 세척했다. 0.5 ml의 ABTS를 각 튜브에 부가하고 또 자성 랙에 두기 전에 이 튜브들을 벤치에서 30분간 방치한 다음 100㎕의 상층액을 Maxisorp ELISA 스트립(Nunc, Roskilde, Denmark)으로 전달했다. 흡수는 TECAN ELISA 판독기 장치를 이용하여 A405 nm에서 측정했다.
파아지-포획 효소 결합된 면역흡착 에세이(ELISA)
4℃에서 철야로 M2 및 M5 항체를 MaxiSorpTM 마이크로티터 플레이트 웰(Nunc, Roskilde, Denmark)에 PBS, pH 7.4 중 2.5 내지 5 ㎍/ml 농도로 흡수시켰다. 상기 웰들은 실온에서 1시간 동안 PBS(w/v) 중의 2% 탈지유에 의해 블로킹되었고, 비리온에 포획되기 전에 RT에서 1 내지 2시간 동안 부가되어 방치되는 비리온 제제는 실온에서 1시간 동안 항-M13-HRP(1:5,000)에 의해 검출되었다. 각 단계 사이에서, 웰들은 PBST에 의해 3x 세척되었다. 이 웰들은 ABTS 기질에 의해 발색되며 또 흡수는 30분 후 A405nm에서 흡수를 판독했다.
결과
A - 헬퍼 파아지의 적정.
16 ml 2x YT는 신선한 XLl-Blue 배양액으로 접종시키고 또 37℃/250-rpm에서 A600nm 0.4-0.8까지 배양했다. 10㎕의 각 희석 파아지 제제를 96-웰 마이크로티터 플레이트로 전달했다. 190㎕의 XLl-Blue 배양액을 상기 파아지 희석물을 갖는 각 웰로 전달했다. 상기 플레이트는 50 분/37℃에서 배양했다. BA82/20 막을 LB-kan 한천 접시 상에 놓고, 3 ㎕ 부피/샘플을 상기 막 위에 점을 찍고(spotting) 또 그 접시를 37℃/ON에서 배양했다. 콜로니를 계수했다(도 3).
B - 삽입된 펩티드 AviTag의 접근성 및 작용성:
BirA 효소는 아세틸-CoA-카복실라아제이며 또 모든 대장균에서 내생적으로 발견된다. 파아지와 관련하여 그러한 세포로 AviTag의 도입은 소량(~7%)의 내인성 BirA(Sholle et al., PMID: 16628754)에 의한 표적 바이오틴화를 초래함을 나타내었다. 비리온이 BirA에 대한 효소 기질로서 조립되고 작용하는 점에서 N-말단 pⅦ 변형이 실제로 작용성인지 여부인지 시험하기 위하여, 우리는 생성한 비리온이 SA-코팅된 자성 비드를 사용하여 조 상층액으로부터 포획될 수 있는지 시험했다.
다이날 스트렙트애비딘 비드에 의한 M13K07-AviTag pⅦ의 포획.
2개 파아지가 에세이에 사용되었다: 숙주로부터 내인성 BirA에 의해 생체내 바이오틴화된 M13K07-AviTag 및 M13K07wt. 결과는 특이적 SA 포획을 분명히 나타낸 반면에, M13K07(서열번호: 31)은 결합하지 않았다. 따라서, AviTag-pⅦ 융합물은 비리온을 wt pⅦ로서 수용하는 반면에, N-말단 AviTag가 BirA 효소에 접근할 수 있고 또 바이오틴화에 대한 기질로서 인식되는 점에서 실제로 작용성이어야 한다(도 4).
FLAG-태그
ELISA 에세이는 2개의 항 FLAG 항체, M2 및 M5에 의한 파아지 포획에 의해 M13K07(서열번호: 31)에서 pⅦ 융합물로서 FLAG-태그의 접근성을 나타내기 위하여 실시되었다. 이 에세이에는, 야생형 M13K07, M13K07-His 및 M13K07-AviTag가 포함되었다(도 5).
His-태그
M13kO7-HIS6 및 VCSM13-HIS6을 사용하여 다이날 탈론 비드(Dynal Talon Beads)(IMAC 매트릭스)에 대한 특이적 결합에 대해 시험했다.
간단히 말해, 탈론 비드는 2% BSA와 30분간 회전하면서 배양하는 것에 의해 블로킹시켰다. 이 비드를 세척하고 또 250㎕의 역가 매칭된 BSA-블로킹된 파아지 상층액(2 x 1010 cfukanR/ml에 상응함)을 부가하고 회전 휠 상에서 30분간/실온에서 더 배양했다. 비드를 PBST로 세척한 후, 항-M13 MAb-HRP(1:2000 희석됨)를 각 튜브에 부가하고 또 이 튜브를 회전 휠 상에서 45분간/실온에서 더 배양했다. 세척한 후, ABTS를 각 튜브에 부가하고 또 자성 랙에 두기 전에 실온에서 15분간 배양했다. 100㎕ 부피의 각 용액을 Maxisorp ELISA 스트립으로 전달했다. 흡수는 TECAN ELISA 판독기 장치를 이용하여 A405nm에서 측정했다. 그 결과는 HIS6-pⅦ 함유 비리온이 우선적으로 Ni-NTA 자성 비드에 결합되는 것을 분명히 나타낸다. 에세이 최적화에 의해 극복될 수 있는 낮은 시그널에도 불구하고, Ni-NTA 매트릭스에 대한 동종 비리온의 특이한 결합이 있다. 이런 특정 pⅦ 융합물의 가장 매력적인 적용은 예컨대 스핀 칼럼뿐만 아니라 Ni-NTA 매트릭스의 부위-특이적 및 따라서 균질 지향적 고정화의 조합으로 Ni-NTA 정제에 이용할 가능성이 있는 것이다(도 6).
실시예 2. 파아지미드의 팩케이징에서 변형된 헬퍼 파아지의 작용성
본 발명의 유망성은 pⅦ 이외의 파아지 외피 단백질, 바람직하게는 pⅢ 또는 pⅧ에서 폴딩된 도메인을 디스플레이하는 파아지미드의 작용성 팩케징을 위하여 변형된 헬퍼 파아지를 이용하는 것이다. 하기 실시예는 pⅦ에 융합된 상이한 펩티드를 갖는 변형된 헬퍼 파아지가 작용성 파아지미드 팩케이징을 실시할 수 있고 또 이들 파아지미드는 작용성 pⅦ 펩티드 융합뿐만 아니라 pⅢ 외피 단백질에 융합된 폴딩된 작용성 도메인을 디스플레이하는 것을 지지한다. 이런 방식으로 실시예는 파아지미드를 사용한 이특이적 디스플레이에도 작용한다.
시약
모든 배지 및 완충액은 기본적으로 샘브룩 등(Molecular cloning: a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))에 기재된 바와 같이 제조했다. 항-M13-HRP 항체 및 M2 및 M5 항체는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(Uppsala, Sweden) 및 시그마-알드리히(Oslo, Norway)로부터 각각 구입한 반면에, F23.2 및 GB113 항체는 B. Bogen 박사(Institute of Immunology, University of Oslo, Norway)로부터 친절한 선물로 받았다. 다이나비드 MyOneTM-스트렙트애비딘 자성 비드는 인비트로겐(Oslo, Norway)으로부터 구입했다. BSA 및 Tween 20은 시그마-알드리히(Oslo, Norway)로부터 구입했다. BSA에 콘쥬게이트된 햅텐 2-페닐옥사졸-5-온(phOx)은 본질적으로 다른 곳에 기재된 바와 같이 제조했다(Makela et al., PMID; 722243).
세균 균주, 파아지 및 파아지미드
대장균 균주 XLl-Blue는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입했다. M13K07 헬퍼 파아지는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(Uppsala, Sweden)로부터 구입했다. pSEX81(서열번호:29), 소 혈청 알부민(BSA)에 결합된 2-페닐옥사졸-5-온(phOx)에 대한 특이성을 갖는 scFv를 보유하는 파아지미드는 아피테크 에이에스(Affitech AS, Oslo, Norway)에 의해 친절하게 제공되었다. pFKPDN-scTCR Vαβ4B2A1은 (LØset et al 2007, PMID: 17925331)(서열번호: 28)에 기재되어 있다.
파아지 입자의 제조
M13K07 헬퍼 파아지 및 비리온 어셈블리를 사용한 대장균 XLl-Blue으로부터의 파아지미드 구출은 Welschof et al., PMID: 9050877 및 Koch et al., PMID: 11126120에 기재된 바와 같이 스폿 적정에 의해 모니터링했다.
파아지-포획 효소 결합된 면역흡착 에세이(ELISA)
MAb M2, M5, F23.2, GB113, phOx-BSA를 PBS, pH 7.4 중의 2.5 내지 5 ㎍/ml 농도로 철야로 4℃에서 MaxiSorpTM 마이크로티터 플레이트 웰(Nunc, Roskilde, Denmark)에 흡수시켰다. 상기 웰은 2% 탈지유, 또는 PBS(w/v) 중의 2% BSA에 의해 실온에서 1시간 동안 블로킹시키고, 이어 비리온 제제를 부가하며 또 포획된 비리온이 항-M13-HRP(1:5,000)에 의해 실온에서 1시간 동안 검출되기 전에 실온에서 1 내지 2시간 동안 반응시켰다. 각 단계 동안, 웰을 PBST로 3x 세척했다. 이들 웰을 ABTS 기질을 이용하여 발색시키고 또 A405nm 에서 30분간 흡수를 판독했다.
결과:
A - 변형된 M13K07에 의한 파아지미드의 팩케이징 및 적정
상이한 폴딩된 도메인을 갖는 2개 파아지미드인 scTcR 및 scFv를 pⅢ 융합물로 디스플레이하는 pFKPDNscTCR Vαβ4B2Al pSEX-scFv 항-phOx를 이용했다. 양쪽 모두 3개의 변형된 및 wt M13K07 헬퍼 파아지에 의해 팩케이징되었다. 간단히 말해, 2개 파아지미드 클론의 철야 배양액을 변형된 및 wt 헬퍼 파아지에 의해 감염시켰다. 배양한 후, 배양액을 원심분리하고 또 세균 펠릿은 암피실린 및 카나마이신을 갖는 YT-배지에 재현탁시키고 또 30℃에서 ON를 배양했다. 원심분리에 의해 투명화된 상층액을 하류(downstream)로 사용했다. 대장균 XL-1 Blue를 파아지 희석물로 감염시키고 또 파아지미드와 헬퍼 파아지의 적정을 위해 암피실린 및 카나마이신 플레이트 상에서 플레이팅했다(도 7).
팩케이징된 양쪽 파아지미드는 높은 비율을 나타내며, 이는 모든 3개의 변형된 M13K07 헬퍼 파아지 포맷에 의한 성공적이고 작용성인 팩케이징을 나타낸다.
B - 파아지미드 pⅢ 디스플레이에서 헬퍼 파아지에 의해 제공된 pⅦ의 작용성
pⅦ-AviTag 디스플레이: AviTag-pⅦ 작용성과 관련하여, 비드 상에서 SA 포획은 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 실시했다. 시그널은 낮지만, AviTag-pⅦ 함유 비리온의 특이적 포획이 있다(도 8). 양성 대조군(삽입 그림)과 비교한 바와 같이, 바이오틴화의 수준은 AviTag-pⅦ 융합물을 모두 보유할 때, M13K07 비리온 상에서보다는 파아지미드 비리온 상에서 더 낮음이 분명하다. 그러나, 파아지와 관련하여 내인성 AviTag 바이오틴화는 37℃에서 7% 범위 내로 알려져 있다(Scolle et al PMID: 16628754). M13K07-AviTag는 37℃에서 팩케이징되는 반면에, 파아지미드 구출은 30℃에서만 실시되며, 이는 관찰된 차이가 더 낮은 온도에서 더 낮은 내인성 BirA 활성 자체로 인한 것임을 강하게 제시한다. 따라서, 장래의 이용을 위하여 비리온 바이오틴화 효율은 상기 특징을 이용하도록 증가되어야 한다. 이것은 비리온의 시험관내 바이오틴화에 의해 유리하게 실시될 수 있으며 바이오틴화 표준 수법을 이용하여 100%에 가까워야 한다(Scolle et al PMID: 16628754). 다르게는, BirA 효소를 과발현하는 것에 의해 생체내 바이오틴화를 실시할 수 있다. 파아지미드 또는 파아지 이상으로 게놈 벡터가 동일 세포에 존재하도록 대장균을 초-형질전환시키는 것은 표준 플라스미드에 의해 비리온으로의 팩케이징을 초래하며, 따라서 유전형-표현형 연계의 상실을 유도하는 것은 공지되어 있다. 이것은 BirA가 플라스미드로부터 과발현된 경우일 것이다. 단일 클론 평가를 위해서는 이런 것은 허용될 수 있지만, 이 방법을 조합적 수법과 결합할 때에는 패닝 동안 회수된 표현형 변이체의 손실을 초래할 수도 있기 때문에 허용될 수 없다. 다르게는, BirA는 대장균 MC1061-유도된 AVBlOO 균주(Avidity, CO, USA)에 의해 제안된 바와 같은 염색체 통합으로부터 과발현될 수 있다. 그러나 이 균주는 파아지미드계에 필수불가결한 F 필리(pili) 구조를 암호화하는 F 플라스미드를 결여하고 있다. 그러나 AVB1OO은 파아지 게놈과 직접적으로 양립할 수 있어서, 헬퍼 파아지에 의해 보완될 필요가 없다. 따라서 본 발명자들은 AVB1O0 균주를 변형된 M13K07 헬퍼 파아지와 조합하여 파아지미드-계 파아지 디스플레이에 채용하기 위해, AVB100을 표준 콘쥬게이션(실시예 5)에 의해 XL1-Blue에 접속시켰다.
pⅦ-Flag 디스플레이:
ELISA 에세이는, 2개의 항 FLAG 항체, M2 및 M5에 의해 파아지미드 비리온을 포획함으로써 2개의 상이한 파아지미드-유래 비리온인 pFKPDNscTCR Vαβ4B2Al(도 9A) 및 pSEX-scFv 항-phOx(도 9B)에서 pⅦ 융합으로 FLAG-태그의 접근성을 나타내기 위하여 실시했다. 간단히 말해, 항체를 4℃에서 ELISA 플레이트 ON 상에 코팅시켰다. 이 플레이트를 세척하고 또 파아지미드 제제를 상기 플레이트 상, 실온에서 2시간 동안 배양했다. 이들 플레이트를 세척하고 또 항-M13 HRP 콘쥬게이트된항체와 함께 배양했다. 플레이트를 세척하고 ABTS soluble을 부가한 다음 RT/30분간 배양하여 시그널을 생기게 했다(도 9).
FLAG-특이적 반응성은 M13K07-FLAG에 의해 팩케이징된 파아지미드-유래 비리온에 대해 얻은 반면에, 모든 다른 샘플은 음성이었다. 즉 팩케이징된 파아지미드-유래 비리온은 FLAG 태그를 작용성 pⅦ-융합물로 디스플레이한다.
A. pⅢ 파아지미드 디스플레이의 작용성.
AviTag(도 10), FLAG-태그(도 11) 및 HIS6-태그(도 11)를 디스플레이하는 2개의 상이한 파아지미드-유래 비리온인, pFKPDNscTCR Vαβ4B2Al 및 pSEX-scFv 항-phOx를 scTcR 및 scFv pⅢ-융합의 작용성 디스플레이에 대해 각각 에세이했다.
ELISA 에세이는 scFv 항-phOx(서열번호: 26)에 대해 scTCR 및 phOx-BSA를 결합시키는 이들의 특이적 표적, MAB GB113에 의해 파아지미드 비리온을 포획함으로써 실시했다. BSA를 블록(block)으로 사용하였고 또 wt M13K07에 의해 구출된 파아지미드는 대조군으로 사용했다. 간단히 말해, 4℃에서 ELISA 플레이트 ON 상에 표적을 코팅했다. 이들 플레이트를 세척하고 또 파아지미드 제제는 상기 플레이트상, 실온에서 2시간 동안 배양했다. 이들 플레이트를 세척하고 또 항-M13 HRP 콘쥬게이트된 항체와 함께 더 배양했다. ABTS를 부가하고 RT/30분간 배양한 다음 A405nm에서 흡수를 측정하는 것에 의해 시그널을 생성시켰다(도 10 및 11).
그 결과, 모든 팩케이징된 파아지미드에 대해 동종 Ag-반응성이 얻어짐을 나타낸다. 따라서 이 분석은 변형된 헬퍼 파아지가 pⅢ 디스플레이에 나쁜 영향을 주지 않지만, 동일 비리온 상에서 pⅦ 단백질에 대하여 소정의 표현형을 제공함을 확인시켜 준다.
실시예 3. pⅢ 및 pⅦ 상에서 게놈 파아지 디스플레이
본 발명은 pⅦ 외피 단백질 상에서 디스플레이 특성을 갖는 게놈 파아지 벡터의 생성을 허용한다. 이런 디스플레이는 pⅢ 디스플레이와 같은 비리온의 감염성에만 영향을 주지 않을 것이다. 또한, 본 발명은 pⅦ 및 pⅢ/pⅧ 상에서 이특이적 디스플레이 또는 모든 3개의 외피 단백질의 디스플레이를 조장한다. 이하의 실시예는 게놈 파아지 디스플레이 계에서 pⅢ 및 pⅦ 상에서 이특이적 디스플레이를 지지하며, 작제물이 증식, 비리온 어셈블리, 비론 농도, pⅢ 디스플레이 표현형에 관하여 야생형 파아지와 완전히 유사하게 작용하며 또 pⅦ 펩티드 융합에서 선택적으로 생체내 바이오틴화된 것을 나타낸다.
시약
모든 배지 및 완충액은 샘브룩 등(Molecular cloning: a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))에 기재된 바와 같이 본질적으로 제조한다. 항-M13-HRP 항체는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(Uppsala, Sweden)으로부터 구입하였고 또 F23.2 및 GB113 항체는 비. 보겐(B. Bogen) 교수(Institute of Immunology, University of Oslo, Norway)로부터 받은 친절한 선물이었다. 제한효소(RE)는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 얻은 DpnI을 제외하고는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(Ipswich, MA, USA)으로부터 구입했다. DNA 올리고는 MWG 바이오테크 AG(Ebersberg, Germany)으로부터 구입했다. Dynabeads MyOneTM-스트렙트애비딘 자성 비드는 인비트로겐(Oslo, Norway)로부터 구입했다. dm5CTP는 퍼멘타스(Fermentas, Burlington, Canada) BSA로부터 구입하였고 또 Tween 20은 시그마-알드리히(Oslo, Norway)로부터 구입했다. Pfu Turbo DNA 및 Phusion DNA 중합효소는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA) 및 시그마-알드리히(Oslo, Norway)으로부터 각각 구입했다. QIAquick PCR 클린-업 키트는 퀴아겐(Qiagen, Hilden, Germany)으로부터 구입했다.
세균 균주, 파아지 및 파아지미드
대장균 균주 XLl-Blue는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입한 반면에, 대장균 균주 MC1061 및 K91K는 G. P. 스미스 박사(Division of Biological Sciences, University of Missouri, USA)로부터 받은 친절한 선물이었다. 소 혈청 알부민(BSA)에 결합된 2-페닐옥사졸-5-온(phOx)에 대하여 특이성을 갖는 scFv를 보유하는 pSEX81(서열번호:29) 파아지미드는 아피테크 에이에스(Oslo, Norway)에 의해 친절하게 제공되었다. fUSE5-scTCR Vαβ4B2Al pⅢ 디스플레이 벡터는 (LØset et al 2007, PMID: 17925331)에 기재되어 있다.
AviTagTM-pⅦ의 디자인 및 시험관내 돌연변이
AviTagTM(N-MSGLNDIFEAQKIEWHE-C)의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 GCUA 서버(http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html)를 이용하여 대장균 K12 균주에서의 코돈 이용과 비교했다. AviTagTM 펩티드 서열의 원핵생물 코돈-최적화된 서열은 프라이머쌍 BirA-pⅦ_frwd/BirA-pⅦ_rev
Figure 112010017743108-pct00004
을 사용하여 제조자(Stratagen, LaJoIIa, CA, USA)의 방법에 따라서 시험관내 돌연변이에서 QuikChangeTM 에 의해 pⅦ ORF에 N-말단적으로 부착시켰다. 클린 벡터 백그라운드를 확실히 하기 위하여, 변형된 pⅦ를 함유하는 BsrGI/SnaBI RE 단편을 표준 수법을 이용하여 양립성 RE 부위 상의 비변형 fUSE5-scTCR Vαβ4B2Al 게놈에 클로닝시켰다. 이 DNA 작제물은 엘렉트로포레이션에 의해 대장균 MC1061에 도입했다. 프라이머 디자인은 공고된 fUSE5 서열(진뱅크 수탁번호: AF218364)(서열번호: 30)을 기본으로 했다.
신규 게놈 pⅦ 디스플레이 벡터 pGⅦ 및 pGⅦΔL의 작성
프라이머 디자인 및 벡터 어셈블리는 심리스 방법(SeamLess protocol)(스트라타진, LaJoIIa, CA, USA)에 기재된 바와 같이 본질적으로 실행했다. VCSM13 게놈 DNA(서열번호: 32)를 주형으로 하고 또 프라이머쌍 VCSM13_F/VCSM13_R
Figure 112010017743108-pct00005
을 사용하여, 심리스 방법(스트라타진, LaJoIIa, CA, USA)에 기재된 바와 같이 본질적으로 Pfu Turbo 중합효소에 의해 완전 게놈을 PCR 증폭시켰다. 마찬가지로, 모두 scFv 항-phOx(서열번호:26) 단위를 지니는 pSEX81ΔL(이후 실시예 4에 기재됨) 및 pSEX81(서열번호: 29)은 Phusion DNA 중합효소(Sigma, Oslo, Normay)와 함께 프라이머쌍 pGALDL_F/pGAL_R(5'-
Figure 112010017743108-pct00006
을 사용한 표준 PCR에서 주형으로 사용하여 scFv 단위를 증폭시켰다. PCR에 이어, 모든 3개 절편을 PCR 클린업 키트(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)에 의해 정제하고 또 RE를 EarI으로 분해시켰다. RE 분해되면, 겔 정제된 절편은 표준 수법을 이용하여 결찰되고 또 XL1-Blue에 엘렉트로포레이트되었다.
콜로니들은 프라이머쌍 pⅦ_frwd/pⅦ_rev
Figure 112010017743108-pct00007
(각각 서열번호: 24 및 서열번호: 25)를 사용한 표준 PCR에서 PCR 스크리닝에 의해 확대시키고 또 정확한 삽입물 크기를 확인했다. 게놈 pⅦ 디스플레이 벡터는 pGⅦ(시그널 서열-의존적 scFv-pⅦ 디스플레이를 가짐) 및 pGⅦΔL(시그널 서열없이 scFv-pⅦ 디스플레이를 가짐)로 나타내었다. 이들은 pⅦ에 대한 N-말단에 인-프레임 융합으로서 scFv ORF를 함유하며 정상적인 전사 및 번역에 중요한 상류 pV ORF에 대하여 그의 개시 코돈의 정확한 위치를 유지한다. 특히, 이들 파아지 게놈 벡터의 어셈블리는 3 단계 PCR 어셈블리에 의해 용이하게 제조될 수 있으며, 이때 외인성 ORF는 벡터 골격에 대하여 상보적인 5'-프라이머 태그 오버헹(overhangs)에 의해 PCR 증폭되며, 이것은 삽입물의 부위를 커버하는 벡터의 5'- 및 3'-부분으로부터 증폭된 상보적 절편과 PCR 소잉(SOEing)에 의해 접합(splicing)될 수 있다. 파아지 게놈의 이상적인 부분은 모든 Ff 게놈에서 pⅦ 또는 F와 플랭킹(flanking)하여 발견되는 2개의 독특한 RE 부위 BsrGI/SnaBI를 비롯한 절편을 포함해야 한다. RE 분해된 SOEing 생성물은 예컨대 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 상보적인 RE 분해된 벡터 골격에 편리하게 삽입될 수 있다. 다른 편리한 어셈블리 수단은 원폿으로 어닐링(annealed)되고, 결찰되며 또 플랭킹 프라이머에 의해 PCR 증폭될 수 있는 짧은 오버래핑 올리고뉴클레오티드에 의해 적절한 융합 ORF의 인공 유전자 어셈블리를 완전하게 제조하는 것이다. 이 전략은 동일 단편이 SOEing 방법에서와 같이 작용하게 할 수 있거나 또는 파아지 게놈으로의 삽입이 기재(Tillett 및 Neilan, PMID: 10481038)된 바와 같이 예컨대 재조합을 기초로 할 수 있는 것에 대하여 RE가 독립적일 수 있게 한다. 수법들을 합한 것도 용이하게 고안할 수 있다.
파아지 입자의 제조
fUSE5 파아지는 본질적으로 기재(스코트(Scott) 및 스미스(Smith), PMID: 1696028)된 바와 같이 대장균 MC1061으로부터 증폭시켰다. 비리온 어셈블리는 기재(Scott 및 Smith, PMID: 1696028 및 Koch et al., PMID: 11126120)된 바와 같이 스폿 적정에 의해 모니터링했다. 적용되는 경우, 비리온을 정제하고, 또한 기재(샘브룩 등(Sambrook et al)(Molecular cloning: a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))한 바와 같이 PEG/NaCl 석출에 의해 농축시켰다.
파아지-포획 효소 결합된 면역흡착 에세이(ELISAs)
F23.2, GB113 항체는 4℃에서 철야로 MaxiSorpTM 마이크로티터 플레이트 웰(Nunc, Roskilde, Denmark)에 PBS, pH 7.4 중의 2.5 내지 5 ㎍/ml 농도로 흡수시켰다. 웰들을 PBS(w/v) 중 2% 탈지유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹하고, 이어 비리온 제제를 부가하고 또 포획된 비리온이 실온에서 1시간 동안 항-M13-HRP(1:5,000)에 의해 검출되기 전에 실온에서 1 내지 2시간 동안 반응시켰다. 각 단계 사이에, 웰들을 PBST를 사용하여 3회 세척했다. 웰들은 ABTS 기질로 발색시키고 또 30분 후 A405nm에서 흡수를 판독했다.
A - fUSE5-scTCR-AviTag 게놈 파아지의 적정
wt도 pⅦ-변형된 fUSE5-scTCR Vαβ4B2Al도 숙주 독성을 전혀 나타내지 않는다. 비리온 생산 및 PEG 석출 효율과 관련된 pⅦ-변형된 fUSE5-scTCR Vαβ4B2Al 버전(version) 사이의 표현형 차이는 존재하지 않는다. pⅦ-변형된 fUSE5-scTCR Vαβ4B2Al 버전의 역가는 fUSE5 계(도 12)에 의해 얻을 수 있는 최대 이론적 역가와 근접했다.
B - fUSE5-Ⅶ-AviTag 융합 펩티드의 작용성
이 ELISA 분석은 스트렙트애비딘 비드에 의한 비리온 포획에 이어 항 M13-항체에 의한 결합 파아지의 검출에 의해 게놈 파아지 제제의 작용성을 시험하기 위한 것이다. 간단히 말해, MyOne 스트렙트애비딘 다이나비드는 BSA에 의해 블로킹되었고, 세척된 다음 pⅦ-AviTag 융합 펩티드를 갖는 fUSE5 파아지(scTCR/pⅦ-AviTag) 및 갖지 않는 fUSE5 파아지(scTCR/pⅦ)의 역가-정상화된 샘플에 의해 배양했다. 비드를 세척하고 또 결합된 파아지는 항-M13-HRP 콘쥬게이트된 항체에 의해 검출했다. ABTS 부가에 의해 시그널을 생성시키고 또 TECAN ELISA 판독기 장치를 이용하여 A405nm에서 측정했다. 그 결과는 pⅦ-BirA 펩티드를 얻을 수 있고 또 바이오틴화되어있으며, 따라서 파아지 게놈-유래 비리온에 대한 고정화 및 검출 태그로서 작용할 수 있음을 보여준다(도 13).
C - fUSE5-scTCR pⅢ-융합의 작용성
이 ELISA 분석은 게놈-암호화된 AviTag-pⅦ를 갖거나 갖지 않는 파아지 게놈-유래 비리온 제제의 pⅢ 융합 작용성을 시험하기 위한 것이다. ELISA 에세이는 scTCR Vαβ4B2Al)(서열번호:28); MAB GB113 및 F23.2를 각각 인식하는 2개의 상이한 항체에 의해 파아지 비리온을 포획하는 것에 의해 실시했다. 탈지유는 음성 대조군으로 사용되었다. 간단히 말해, 항체를 4℃에서 ELISA 플레이트 ON 상에 코팅했다. 이들 플레이트를 세척하고 또 파아지 역가 정상화된 제제는 상기 플레이트 상, 실온에서 2시간 동안 배양했다. 이들 플레이트를 세척하고 또 항-M13 HRP 콘쥬게이트된 항체와 함께 더 배양한 다음 100 ㎕의 ABTS를 부가하고 또 실온에서 배양했다. 흡수는 20분 후 OD405nm에서 TECAN ELISA 판독기 장치를 이용하여 측정했다. 결과는 scTCR 표현형이 2개의 fUSE5 버전 사이는 구별할 수 없음을 보여준다. 따라서, pⅦ 변형은 파아지의 표현형에 전혀 나쁜 영향을 주지 않는 것으로 보인다(도 14).
실시예 4: pⅦ 상에서 파아지미드 디스플레이
시약
모든 배지 및 완충액은 본질적으로 샘브룩 등(Molecular cloning: a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))에 기재된 바와 같이 제조했다. 항-M13-HRP 항체는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(Uppsala, Sweden)으로부터 구입하였고 또 GBl 13 항체는 비.보겐 교수(Institute of Immunology, University of Oslo, Norway)로부터 받은 친절한 선물이었다. 제한효소(RE)는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입한 DpnI을 제외하고는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(Ipswich, MA, USA)으로부터 구입했다. DNA 올리고는 MWG 바이오테크 AG(Ebersberg, Germany)으로부터 구입했다. BSA 및 Tween 20은 시그마-알드리히(Oslo, Norway)로부터 구입했다. Pfu Turbo DNA 중합효소는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입했다. BSA에 콘쥬게이트된 햅텐 2-페닐옥사졸-5-온 phOx 및 5-니트로펜아세틸(NIP)은 본질적으로 기재(마켈라 등(Makela et al), PMID; 722243 및 Michaelsen et al., PMID: 2125362)바와 같이 제조했다. 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)는 퍼멘타스(Burlington, Canada)로부터 구입했다.
세균 균주, 파아지 및 파아지미드
대장균 균주 XL1-Blue는 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA)으로부터 구입했다. M13K07 헬퍼 파아지는 GE 헬쓰케어 바이오-사이언시스 AB(Uppsala, Sweden)로부터 구입했다. 소 혈청 알부민(BSA)에 결합된 2-페닐옥사졸-5-온(phOx)에 대하여 특이성을 지닌 scFv를 보유하는 pSEX81(서열번호:29) 파아지미드는 아피테크 에이에스(Oslo, Norway)에 의해 친절하게 제공되었다. pFKPDN-scTCR Vαβ4B2Al pⅢ 디스플레이 파아지미드는 다른 곳에 기재(LØset et al 2007, PMID: 17925331)되어 있다. scFv 항-NIP(서열번호:27)(미공개)를 보유하는 원핵생물 디스플레이 벡터 pSG1은 pHOG21(키프리아노브 등(Kiprianov et al.), PMID: 9005945)를 기본으로 하며 또 pLNOH2 및 pLNOK(노데르하우그 등(Norderhaug et al), PMID: 9202712)으로부터 유래한 항체 가변 유전자로부터 실험실내에서 제조했다.
신규한 pⅦ 디스플레이 파아지미드 벡터 pGALD7 및 pGALD7ΔL의 작성
벡터 골격에 대한 출발 주형으로서, 상기 기재된 pSEX81(서열번호:29) 파아지미드를 선택했다(진뱅크 수탁번호: Y14584). 먼저, 상기 벡터에서 스트레치(strech)를 암호화하는 원핵생물 pelB 시그널 서열(N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C)(서열번호:33)을 제거하기 위하여, 프라이머쌍 a41g-frwd/a41g-rev
Figure 112010017743108-pct00008
(각각 서열번호: 13 및 서열번호: 14)를 사용하여 시험관내 돌연변이에서 QuikChangeTM에 의해 극단 N-말단에 NcoI RE 부위를 도입함으로써, pelB ORF의 제2 코돈 중의 제1 뉴클레오티드를 A에서 G로 변경했다. 돌연변이에 이어, 벡터를 NcoI으로 분해시키고, 재결찰시키며 또 프라이머쌍 pHOG_EcoRI_frwd/scTCR_rev(5'-
Figure 112010017743108-pct00009
(각각 서열번호: 15 및 서열번호: 16)을 사용하여 벡터의 관련 부분을 회복하는 제2 PCR에서 주형으로 사용했다. 이 PCR 단편을 표준 수법을 이용하여 양립성 EcoRI/HindⅢ RE 부위 상에 있는 원래의 pSEX81(서열번호: 29)로 이동시키고 DNA 서열결정에 의해 확인했다. 이 단계는 pelB 시그널 서열 암호화 부분을 완전히 제거하였지만, 정상적인 전사 및 번역에 중요한 lacPO 및 샤인-달가노 서열(SD)을 향하는 개시 코돈 및 그의 관련 위치는 보존하였을 뿐만 아니라 원래의 pSEX81(서열번호:29)에서 발견되는 NcoI/NotI RE 부위에 의해 정의된 외인성 서열 앞에 오직 1개의 Ala 잔기를 부가했다. 새로운 작제물은 pSEX81ΔL로 나타내었다. 둘째, pⅦ 암호화 서열은 5'-말단 RE-태깅된(tagged) 프라이머쌍 pⅦ_EcoRV/pⅦ_NheI
Figure 112010017743108-pct00010
(각각 서열번호: 17 및 서열번호: 18)을 사용하여 M13K07로부터 증폭시켰다. 이 PCR 단편을 양립하는 RE 부위 상의 pSEX81(서열번호: 29), 및 pSEX81ΔL 파아지미드로 이동시켜, pⅢ 암호화 영역을 양쪽에서 변경시켜 원래의 pSEX81(서열번호:29)에서 NcoI/NotI-정의된 카세트의 N-말단 인-프레임 pⅦ 융합을 초래했다. 이 새로운 작제물은 DNA 서열결정화에 의해 확인하였고 또 각각 pGALD7 및 pGALD7ΔL로 나타내었다. 상기 기재된 바와 같은 다양한 파아지미드에서 scFv 항-phOx(서열번호: 26) 단위를 pFKPDN 및 pSG1으로부터 얻은 scTCR Vαβ4B2Al 및 scFv 항-NIP(서열번호: 27) 단위로 변경하기 위하여, 표준 수법을 이용하여 NcoI/NotI RE 정의된 카세트 교환에서와 같이 상기 시험을 실시했다. 본 명세서에 기재된 모든 파아지미드는 표준 수법을 이용한 엘렉트로포레이션에 의해 대장균 XL1-Blue에 도입되었다.
파아지 입자의 제조
M13K07 헬퍼 파아지 및 비리온 어셈블리를 이용하여 대장균 XL1-Blue로부터의 파아지미드 구출은 기재(웰스코프 등(Welschof et al), PMID: 9050877 및 Koch et al., PMID: 11126120)된 바와 같이 스폿 적정에 의해 모니터링했다.
파아지-포획 효소 결합된 면역흡착 에세이
MAb GB113, phOx-BSA 또는 NIP-BSA는 PBS, pH 7.4 중의 2.5 내지 5 ㎍/ml 농도로 4℃에서 철야로 MaxiSorpTM 마이크로티터 플레이트 웰(Nunc, Roskilde, Denmark)에 흡수시켰다. 상기 웰을 2% 탈지유, 또는 PBS(w/v) 중의 2% BSA에 의해 실온에서 1시간 동안 블로킹시킨 다음 비리온 제제를 부가하고 또 포획된 비리온이 항-M13-HRP(1:5,000)에 의해 실온에서 1시간 동안 검출되기 전에 실온에서 1 내지 2시간 동안 반응시켰다. 각 단계 사이에 웰들을 PBST에 의해 3회 세척했다. 이 웰들은 ABTS 기질에 의해 발색되며 또 30분 후 A405nm 에서 흡수를 판독했다.
결과
상기 기재된 변형된 헬퍼 파아지로부터 결과에 의해 촉발되어, 폴딩된 도메인의 pⅦ 디스플레이를 또한 평가했다. 가오 등 및 크와스니코우스키 등은 그러한 디스플레이는 시그널 서열-특이적 주변세포질 타겟팅과 조합되어 사용될 때에 허용됨을 나타내 보였으므로, 본 발명자들은 pGALD7 및 pGALD7ΔL이라 불리는 2개의 신규 파아지미드를 작제하여, 각각 시그널 서열을 이용하고 또 이용하지 않는 N-말단 pⅦ 디스플레이를 허용했다(도 15).
초기 작제물은 인간 항체 가변 절편을 기본으로 하고 또 햅텐 콘쥬게이트 phOx-BSA에 대하여 특이적인 scFv 단위를 함유했다. 앞에서 기재한 pⅦ 변형된 헬퍼 파아지에 의하여, scFv의 pⅦ 디스플레이는 정상적인 비리온 어셈블리를 방해하지 않아야 한다. 따라서 본 발명자들은 원료 및 방법란에 기재된 바와 같은 표준 파아지미드 구출 및 적정법을 이용하여 시그널 서열을 갖거나 갖지 않는 이들 scFv 항-phOx pⅦ 디스플레이 파아지미드의 성능을 시그널 서열을 갖거나 갖지 않는 표준 pⅢ 디스플레이와 비교했다(도 16).
적정 결과는 실제로 파아지미드-함유 비리온이 모든 경우에서 제조되었음을 보여주었다. 그러나, pⅦΔL 파아지미드는 표준 pⅢ 디스플레이보다 약 30배 낮은 역가를 얻은 반면에, 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이에서는 총 105-배 감소가 있었다. pⅦ의 wt 보완이 상기 계에서 헬퍼 파아지로부터 존재하므로, 상기 발견은 놀랍고도 중요하였는데, 이는 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이(pⅦ)가 심각하게 비리온 어셈블리 과정을 방해하고 있음을 보여주기 때문이며, 한편 상기 효과는 시그널 서열이 적은(less) pⅦ 디스플레이(pⅦΔL)의 경우에서는 최소이다. 이와 대조적으로, 시그널 서열을 갖거나 갖지 않는 pⅢ 디스플레이 사이의 역가 차이는 최소이었다.
상기 측정된 역가를 기초로, 본 발명자들은 희석되지 않았던 pGALD7-유래 샘플을 제외하고는, 역가 정상화된 인풋을 이용한 phOx-BSA 특이적 ELISA법으로 이들 비리온 샘플 상에서 작용성 scFv 디스플레이를 평가하였고 파아지미드 역가는 매우 낮았다(도 17).
그 결과는 시그널 서열이 적은 pⅦ 버젼 및 표준 pⅢ으로부터의 작용성 scFv 디스플레이를 분명히 나타낸 반면에, 다른 샘플은 음성이었다. 이런 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이가 음성 결과를 얻었다는 것은 2000-배 적은 비리온 인풋으로 인하여 예상되었다. pⅢ는 SEC-경로를 통하여 주변세포질로 수송되므로, 시그널 서열이 적은 pⅢ 버전은, 비리온 혼입에 전제조건인 주변세포질 표적화에 있어서 손상이 있는 pⅢ 융합물을 얻는 것은 알려져 있다. 따라서 상기 샘플로부터 얻은 비리온은 헬퍼 파아지 유래 pⅢ(물리적 표현형-유전형 연계 상실)만을 함유하지만, 파아지미드 팩케이징 효율은 정상과 근사하며 또 정상 역가(도 16에 도시된 바와 같이)를 초래한다. 시그널 서열이 적은 pⅦ 디스플레이 및 표준 pⅢ 디스플레이는 작용성 디스플레이를 얻었지만, 항원 결합 능력이 pⅢ에 대해 강한 것으로 보이는 것은 분명하다. 이것은 pⅢ 디스플레이의 더 높은 작용성을 반드시 반영하는 것은 아닌데, 이는 표준 pⅢ 디스플레이가 일가 내지 단가(oligovalent) 디스플레이의 혼합물로 하여금 결합력(avidity) 효과를 유발하게 하는 것으로 문헌에 잘 알려져 있기 때문이다(브래드버리(Bradbury)와 마크스(Marks), PMID: 15261570). 이런 효과는 상호작용의 진정한 고유한 친화성을 마스킹하며, 탁월한 디스플레이 특성으로 인하여 scFv 단위가 흔히 바람직하지만, 예컨대 비리온당 더 적은 단위의 의미에서 더 낮은 수준으로 발현된 포맷이 친화성 선택에 훨씬 강한 결합제를 초래함은 문헌에 광범위하게 수록되어 있다(드 하아드 등(de Haard, et al), PMID: 10373423, 후겐붐(Hoogenboom), PMID: 16151404). 따라서, pGALD7ΔL로부터 얻은 더 낮은 시그널은 일가 scFv 디스플레이에 더 가까운 것을 반영하고 있으며, 이는 많은 응용에서 이로울 수 있다.
본 명세서에서 적용된 모든 파아지미드 중의 scFv-pⅦ/pⅢ 디스플레이 카세트는 lac 프로모터에 의해 제어되며 또 비리온 팩케이징은 IPTG 유도를 갖지 않는 표준 수법을 이용하여 실시했다(웰스코프 등(Welschof et al), PMID: 9050877). 따라서, 팩케이징하는 동안 IPTG를 사용하여 더 강한 디스플레이를 가함으로써 scFv 디스플레이를 증가시킬 수 있을 것이다. 또한 파아지미드 파아지 디스플레이의 중요한 특징은 작용성 디스플레이가 파아지미드의 헬퍼 파아지 매개된 구출에 의존적이라는 사실이다. 따라서, 파아지 게놈-계 디스플레이와 대조적으로, 소정 세포로부터 비리온에 팩케이징될 수 있는 ssDNA의 2개 공급원이 존재한다 - 파아지미드, 또는 헬퍼 파아지 게놈. 중요하게는 양쪽 유형의 비리온은 동일한 숙주 세포 내에서 생산되고 발견되므로 캡시드 단백질의 매우 동일한 풀에 대한 접근성을 가질 것이다. 조합적 파아지 디스플레이 기술에 대한 기초를 형성하는 물리적 유전형-표현형 연계의 보존을 확실하게 하기 위하여, 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율이 파아지미드 우대인 것이 무엇보다 가장 중요하다. 새로운 실험에서, 본 발명자들은 상기 기재한 바와 같이 동일한 파아지미드-유래 샘플을 제조하여, 팩케이징 동안 포함된 IPTG를 갖거나 갖지 않는 비리온 어셈블리를 대조했다. 적정하는 동안, 본 발명자들은 헬퍼 파아지 게놈에서 발견된 카나마이신 내성에 의하여 헬퍼 파아지 게놈 역가를 측정했다.
현재의 적정 결과(도 18A)는 표준 조건에서 상이한 파아지미드를 비교할 때 파아지미드 역가 면에서 이전의 팩케이징(도 16)에서와 동일한 경향을 나타내었지만, 이번에는 pGALD7ΔL(pⅦΔL) 및 pGALD7(pⅦ)가 약간 더 높은 역가를 가졌다. pⅦ, 또는 pⅢ 발현의 IPTG 유도시, 모든 파아지미드는 역가 감소를 나타내지만, 그 효과는 서열 시그널-특이적 pⅦ pGALD7 파아지미드의 경우에 가장 심각하다. 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율을 측정(도 18B)하여 표준 조건(IPTG 존재하지 않음)하에서 상이한 파아지미드를 비교할 때, 표현형-유전형 연계의 완전한 손실을 나타내는 서열 시그널-특이적 pⅦ pGALD7 파아지미드를 제외하고는, 모든 샘플은 정상 범위의 파아지미드 우세인 비율을 나타낸다. IPTG 유도시, 표현형-유전형의 비결합성은 pGALD7 파아지미드의 경우에 더욱 더 현저하였고 또한 시그널 서열이 적은 pⅢ(pⅢΔL)은 상기 특징을 소량(비율 0.5) 나타내었다. 그러나, 후자의 작제물은 그럼에도 불구하고 pⅢ 디스플레이에 대해 비작용성이므로 대조군에 포함되었다.
도 18A에 도시된 파아지미드 역가를 기초로 하여, 본 발명자들은 도 17에 도시된 것과 유사하게 phOx-BSA 특이적 ELISA법으로 pGALD7DL 및 pGALD7 비리온의 작용성 scFv 디스플레이를 평가했다. 정상화된 역가 인풋을 이용.
결과는 시그널 서열이 적은 pGALD7ΔL에 의해 작용성 scFv-pⅦ 디스플레이를 다시 달성하였고 또 IPTG-강제된 pⅦ 융합 디스플레이시 phOx-BSA 반응성이 현저히 증가함을 보여주었다. 이런 항원 반응성에서의 증가는 비리온당 pⅦ 융합 개수의 증가뿐만 아니라 원래 pⅦ 융합을 지니는 비리온 개수 증가를 아마도 반영하는 것으로 보인다. 후자는 표준 pⅢ 디스플레이에서 1 내지 10%의 파아지미드-함유 비리온만이 실제로 융합물을 함유하는 것으로 보인다(Bradbury, Marks, PMID: 15261570). 한편, 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이는 다시 작용성 phOx-BSA 결합을 전혀 나타내지 않았다. 도 18B를 기초로 하여, IPTG 비-유도 샘플에서 관찰된 약한 항원 반응성은 pⅦ 융합물을 낮은 수준으로 지니는 비리온을 함유하는 헬퍼 파아지에 할당된 것임에 틀림없다.
지금까지, 본 발명자들은 scFv 항-phOx(서열번호:26)의 작용성 pⅦ 파아지미드-계 디스플레이, 단위를 분명히 나타내었고 또 상기 작제물이 동일 scFv의 pⅢ 디스플레이에 필적하여서 파아지미드 역가 및 항원 결합 능력에서 최소한의 감소만을 나타냄을 분명하게 밝혔다.
scFv 항-phOx(서열번호:26)는 인간 항체 scFv 라이브러리용으로 선택되었고 또 대장균(마크스 등(Marks et al.), PMID: 1748994)에서 비교적 잘 발현하는 것으로 알려져 있다. pⅦ 디스플레이가 더욱 유망한 융합 파트너의 작용성 디스플레이 능력을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 쥐 하이브리도마의 항체 가변 유전자를 기초로 한 scFv 항-NIP(서열번호: 27)뿐만 아니라 쥐 T 세포 클론 4B2A1(LØset et al., PMID: 17925331)로부터 얻은 가변 유전자를 기본으로 한 scTCR를 pGALD7ΔL 및 pGALD7에 서브클로닝했다. 파아지가 디스플레이(크레버 등(Krebber et al.), PMID: 9032408)될 때 및 파아지 디스플레이를 수용하기 특히 어려운 것으로 밝혀진 폴딩된 단백질류에 T 세포 수용체가 있을 때(리 등(Li et al.), PMID: 15723046, 및 LØset et al., PMID: 17925331), 많은 하이브리도마 가변 유전자가 대장균에서 잘 발현하지 않는 것은 잘 공지되어 있다.
이들 신규 파아지미드로부터의 비리온은 표준 파아지미드 구출법에 의해 제조하였고 또 ELISA법으로 항원 결합능을 시험했다(도 20).
이 결과는 작용성 pⅦ 디스플레이가 scFv 항-NIP(서열번호: 27) 및 scTCR Vαβ4B2A1에 의해 모두 달성되었고 또 scFv 항-phOx(서열번호:26)에 의해 이전에 관찰되었던 것과는 대조적으로 이것은 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이를 갖거나 갖지 않는 경우임을 나타내었다. 도 20에서 관찰된 시그널은 직접 비교되지 않으며, 이는 비리온 역가가 에세이 이전에 정상화되지 않았기 때문이다. scFv 항-phOx(서열번호: 26)의 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이의 완전한 비-작용성 측면에서, 상기 샘플을 적정하고 또 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율을 측정했다(도 21).
파아지미드 역가는 시그널 서열이 적은 pⅦ 디스플레이(pGALD7ΔL)가 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이에 비하여 월등한 성능을 나타냄을 분명히 보여준다(도 21A). 이것은 scTCR 및 scFv 항-NIP에 대해 사실이었지만, 그 차이는 scFv 항-phOx에 대해 관찰된 역가보다 덜 현저했다(도 6 및 8 참조). 헬퍼 파아지에 대한 파아지미드 비율을 비교할 때, pGALD7ΔL는 scTCR 및 scFv 항-NIP(서열번호: 27)의 경우 모두에서 파아지미드가 강한 우세인 비율로 탁월한 성능을 나타내었다(도 21B). scFv 항-phOx(서열번호: 26)와 관련하여 관찰된 유전형-표현형 연계의 심각한 상실은 이들 비율로부터 scTCR 및 scFv 항-NIP(서열번호: 27)에 대해서는 관찰되지 않았다(도 18 대 도 21B). 그러나, pGALD7ΔL가 분명히 월등했다.
상기 결과의 측면에서, 비리온 팩케이징하는 동안 숙주 세포 증식에 관련하여 scTCR 및 scFv 항-NIP 사이에 분명한 차이가 존재함을 발견한 것은 주목할 만했다(도 22).
도 22로부터 분명한 것은 pGALD7ΔL 함유 배양액만이 숙주 세포 증식에 대하여 최소한의 영향을 가진 반면에, 그 생장은 pGALD7 파아지미드를 함유하는 클론에 의해 현저하게 억제되는 것이다. 이것은 시그널 서열-특이적 pⅦ 디스플레이 파아지미드로부터의 숙주 독성을 강하게 제시하는 반면에, 시그널 서열이 제거되자마자 그러한 독성은 전혀 또는 거의 관찰되지 않는다.
실시예 5. 대장균 균주 AVBlOOFmkⅡ의 작성
시약 및 세균 균주
모든 배지 및 완충액은 본질적으로 샘브룩 등(Molecular cloning:a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))에 기재된 바와 같이 제조했다. 대장균 균주 XL1-Blue 및 AVB1OO(MC1061 기본)은 스트라타진(LaJoIIa, CA, USA) 및 Avidity(Denver, CO, USA)로부터 각각 구입했다.
결과
F 플라스미드 양성 대장균 AVB1OO(염색체성 StrR)를 얻기 위하여 세포를 다음과 같이 XL1-Blue(F 플라스미드 TetR)와 메이팅했다. 각 균주의 단일 콜로니를 적절한 항생체가 보충된 5 ml LB 배지에 접종하고 또 37℃에서 철야로 급격하게 진탕하면서 배양했다. 다음 날, 신선한 5 ml 배양액은 각 1 ml가 혼합되어 37℃에서 1시간 동안 정지상으로 배양되기 전에, A600nm 0.1에서 개시하여 급격하게 진탕하면서 37℃에서 미드 로그(mid log) 상으로 생장시켰다. 그후 10 ㎕의 상기 혼합물을 100 ㎍/ml Str 및 30㎍/ml Tet를 함유하는 5 ml 신선 LB 배지로 전달하고 또 급격하게 진탕하면서 37℃에서 철야로 배양했다. 다음날, 이 배양액의 희석물을 100 ㎍/ml Str 및 30 ㎍/ml Tet를 함유하는 한천 접시에 분포시키고, 또 생성한 콜로니는 AVBlOOFmkⅡ로 불리는 신규 F 플라스미드 양성 AVBlOO 균주의 공급원으로 사용했다.
<110> Bio-Medisinsk Innovasjon AS <120> PVII PHAGE DISPLAY <130> DIP10110KR <150> US60/956871 <151> 2007-08-20 <150> PA200701673 <151> 2007-11-26 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Bacteriophage M13 <400> 1 Met Glu Gln Val Ala Asp Phe Asp Thr Ile Tyr Gln Ala Met Ile Gln 1 5 10 15 Ile Ser Val Val Leu Cys Phe Ala Leu Gly Ile Ile Ala Gly Gly Gln 20 25 30 Arg <210> 2 <211> 424 <212> PRT <213> Bacteriophage fd <400> 2 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 1 5 10 15 His Ser Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu 20 25 30 Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr 35 40 45 Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys 50 55 60 Thr Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp 100 105 110 Thr Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile 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atggctggcg gtaatattgt 5220 tctggatatt accagcaagg ccgatagttt gagttcttct actcaggcaa gtgatgttat 5280 tactaatcaa agaagtattg ctacaacggt taatttgcgt gatggacaga ctcttttact 5340 cggtggcctc actgattata aaaacacttc tcaagattct ggcgtaccgt tcctgtctaa 5400 aatcccttta atcggcctcc tgtttagctc ccgctctgat tccaacgagg aaagcacgtt 5460 atacgtgctc gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 5520 gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 5580 tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 5640 gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 5700 atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 5760 cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 5820 ctatctcggg acggatcgct tcatgtggca ggagaaaaaa ggctgcaccg gtgcgtcagc 5880 agaatatgtg atacaggata tattccgctt cctcgctcac tgactcgcta cgctcggtcg 5940 ttcgactgcg gcgagcggaa atggcttacg aacggggcgg agatttcctg gaagatgcca 6000 ggaagatact taacagggaa gtgagagggc cgcggcaaag ccgtttttcc ataggctccg 6060 cccccctgac aagcatcacg aaatctgacg ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg 6120 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg cggctccctc gtgcgctctc ctgttcctgc 6180 ctttcggttt accggtgtca ttccgctgtt atggccgcgt ttgtctcatt ccacgcctga 6240 cactcagttc cgggtaggca gttcgctcca agctggactg tatgcacgaa ccccccgttc 6300 agtccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gaaagacatg 6360 caaaagcacc actggcagca gccactggta attgatttag aggagttagt cttgaagtca 6420 tgcgccggtt aaggctaaac tgaaaggaca agttttggtg actgcgctcc tccaagccag 6480 ttacctcggt tcaaagagtt ggtagctcag agaaccttcg aaaaaccgcc ctgcaaggcg 6540 gttttttcgt tttcagagca agagattacg cgcagaccaa aacgatctca agaagatcat 6600 cttattaagg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6660 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6720 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6780 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6840 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6900 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccgattc gagctcgccc 6960 cggggatcga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg tctgcgttgt 7020 cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt caacaaagcc 7080 gccgtcccgt caagtcagcg taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa ccaattctga 7140 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 7200 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 7260 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 7320 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 7380 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 7440 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 7500 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 7560 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 7620 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 7680 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 7740 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 7800 caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 7860 attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 7920 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat 7980 gtaagcagac agttttattg ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca 8040 gagattttga gacacaacgt ggctttcccc ccccccccct gcaggtctcg ggctattctt 8100 ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 8160 aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttaaata tttgcttata 8220 caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg ggtacatatg attgacatgc 8280 tagttttacg attaccgttc atcgattctc ttgtttgctc cagactctca ggcaatgacc 8340 tgatagcctt tgtagacctc tcaaaaatag ctaccctctc cggcatgaat ttatcagcta 8400 gaacggttga atatcatatt gatggtgatt tgactgtctc cggcctttct cacccttttg 8460 aatctttacc tacacattac tcaggcattg catttaaaat atatgagggt tctaaaaatt 8520 tttatccttg cgttgaaata aaggcttctc ccgcaaaagt attacagggt cataatgttt 8580 ttggtacaac cgatttagct ttatgctctg aggctttatt gcttaatttt gctaattctt 8640 tgccttgcct gtatgattta ttggatgtt 8669 <210> 32 <211> 8669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCSM13 interference-resistant helper phage, complete genome. <400> 32 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 60 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 120 gccagccgat tcgagctcgc ccggggatcg accagttggt gattttgaac ttttgctttg 180 ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag 240 ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta 300 caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 360 attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 420 aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 480 tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 540 gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt 600 ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 660 accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 720 acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 780 attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 840 agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 900 cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 960 acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 1020 tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 1080 catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac 1140 cccccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt 1200 atcttgtgca atgtaacatc agagattttg aaacacaacg tggctttccc cccccccccc 1260 ctgcaggtct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 1320 ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 1380 acaatttaaa tatttgctta tacaatcttc ctgtttttgg ggcttttctt attatcaacc 1440 ggggtacata tgattgacat gctagtttta cgattaccgt tcatcgattc tcttgtttgc 1500 tccagactct caggcaatga cctgatagcc tttgtagacc tctcaaaaat agctaccctc 1560 tccggcatga atttatcagc tagaacggtt gaatatcatg ttgatggtga tttgactgtc 1620 tccggccttt ctcacccttt tgaatcttta cctacacatt actcaggcat tgcatttaaa 1680 atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc tcccgcaaaa 1740 gtattacagg gtcataatgt ttttggtaca accgatttag ctttatgctc tgaggcttta 1800 ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt taacgctact 1860 actattagta gaattgatgc caccttttca gctcgcgccc caaatgaaaa tatagctaaa 1920 caggttattg accatttgcg aaatgtatct aatggtcaaa ctaaatctac tcgttcgcag 1980 aattgggaat caactgttac atggaatgaa acttccagac accgtacttt agttgcatat 2040 ttaaaacatg ttgagctaca gcaccagatt cagcaattaa gctctaagcc atccgcaaaa 2100 atgacctctt atcaaaagga gcaattaaag gtactctcta atcctgacct gttggagttt 2160 gcttccggtc tggttcgctt tgaagctcga attaaaacgc gatatttgaa gtctttcggg 2220 cttcctctta atctttttga tgcaatccgc tttgcttctg actataatag tcagggtaaa 2280 gacctgattt ttgatttatg gtcattctcg ttttctgaac tgtttaaagc atttgagggg 2340 gattcaatga atatttatga cgattccgca gtattggacg ctatccagtc taaacatttt 2400 actattaccc cctctggcaa aacttctttt gcaaaagcct ctcgctattt tggtttttat 2460 cgtcgtctgg taaacgaggg ttatgatagt gttgctctta ctatgcctcg taattccttt 2520 tggcgttatg tatctgcatt agttgaatgt ggtattccta aatctcaact gatgaatctt 2580 tctacctgta ataatgttgt tccgttagtt cgttttatta acgtagattt ttcttcccaa 2640 cgtcctgact ggtataatga gccagttctt aaaatcgcat aaggtaattc acaatgatta 2700 aagttgaaat taaaccatct caagcccaat ttactactcg ttctggtgtt tctcgtcagg 2760 gcaagcctta ttcactgaat gagcagcttt gttacgttga tttgggtaat gaatatccgg 2820 ttcttgtcaa gattactctt gatgaaggtc agccagccta tgcgcctggt ctgtacaccg 2880 ttcatctgtc ctctttcaaa gttggtcagt tcggttccct tatgattgac cgtctgcgcc 2940 tcgttccggc taagtaacat ggagcaggtc gcggatttcg acacaattta tcaggcgatg 3000 atacaaatct ccgttgtact ttgtttcgcg cttggtataa tcgctggggg tcaaagatga 3060 gtgttttagt gtattctttc gcctctttcg ttttaggttg gtgccttcgt agtggcatta 3120 cgtattttac ccgtttaatg gaaacttcct catgaaaaag tctttagtcc tcaaagcctc 3180 tgtagccgtt gctaccctcg ttccgatgct gtctttcgct gctgagggtg acgatcccgc 3240 aaaagcggcc tttaactccc tgcaagcctc agcgaccgaa tatatcggtt atgcgtgggc 3300 gatggttgtt gtcattgtcg gcgcaactat cggtatcaag ctgtttaaga aattcacctc 3360 gaaagcaagc tgataaaccg atacaattaa aggctccttt tggagccttt ttttttggag 3420 attttcaacg tgaaaaaatt attattcgca attcctttag ttgttccttt ctattctcac 3480 tccgctgaaa ctgttgaaag ttgtttagca aaaccccata cagaaaattc atttactaac 3540 gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 3600 gctacaggcg ttgtagtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 3660 attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 3720 ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 3780 tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 3840 aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 3900 aggttccgaa ataggcaggg ggcattaact gtttatacgg gcactgttac tcaaggcact 3960 gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 4020 tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 4080 gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgtcaa tgctggcggc 4140 ggctctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct 4200 gagggtggcg gctctgaggg aggcggttcc ggtggtggct ctggttccgg tgattttgat 4260 tatgaaaaga tggcaaacgc taataagggg gctatgaccg aaaatgccga tgaaaacgcg 4320 ctacagtctg acgctaaagg caaacttgat tctgtcgcta ctgattacgg tgctgctatc 4380 gatggtttca ttggtgacgt ttccggcctt gctaatggta atggtgctac tggtgatttt 4440 gctggctcta attcccaaat ggctcaagtc ggtgacggtg ataattcacc tttaatgaat 4500 aatttccgtc aatatttacc ttccctccct caatcggttg aatgtcgccc ttttgtcttt 4560 ggcgctggta aaccatatga attttctatt gattgtgaca aaataaactt attccgtggt 4620 gtctttgcgt ttcttttata tgttgccacc tttatgtatg tattttctac gtttgctaac 4680 atactgcgta ataaggagtc ttaatcatgc cagttctttt gggtattccg ttattattgc 4740 gtttcctcgg tttccttctg gtaactttgt tcggctatct gcttactttt cttaaaaagg 4800 gcttcggtaa gatagctatt gctatttcat tgtttcttgc tcttattatt gggcttaact 4860 caattcttgt gggttatctc tctgatatta gcgctcaatt accctctgac tttgttcagg 4920 gtgttcagtt aattctcccg tctaatgcgc ttccctgttt ttatgttatt ctctctgtaa 4980 aggctgctat tttcattttt gacgttaaac aaaaaatcgt ttcttatttg gattgggata 5040 aataatatgg ctgtttattt tgtaactggc aaattaggct ctggaaagac gctcgttagc 5100 gttggtaaga ttcaggataa aattgtagct gggtgcaaaa tagcaactaa tcttgattta 5160 aggcttcaaa acctcccgca agtcgggagg ttcgctaaaa cgcctcgcgt tcttagaata 5220 ccggataagc cttctatatc tgatttgctt gctattgggc gcggtaatga ttcctacgat 5280 gaaaataaaa acggcttgct tgttctcgat gagtgcggta cttggtttaa tacccgttct 5340 tggaatgata aggaaagaca gccgattatt gattggtttc tacatgctcg taaattagga 5400 tgggatatta tttttcttgt tcaggactta tctattgttg ataaacaggc gcgttctgca 5460 ttagctgaac atgttgttta ttgtcgtcgt ctggacagaa ttactttacc ttttgtcggt 5520 actttatatt ctcttattac tggctcgaaa atgcctctgc ctaaattaca tgttggcgtt 5580 gttaaatatg gcgattctca attaagccct actgttgagc gttggcttta tactggtaag 5640 aatttgtata acgcatatga tactaaacag gctttttcta gtaattatga ttccggtgtt 5700 tattcttatt taacgcctta tttatcacac ggtcggtatt tcaaaccatt aaatttaggt 5760 cagaagatga aattaactaa aatatatttg aaaaagtttt ctcgcgttct ttgtcttgcg 5820 attggatttg catcagcatt tacatatagt tatataaccc aacctaagcc ggaggttaaa 5880 aaggtagtct ctcagaccta tgattttgat aaattcacta ttgactcttc tcagcgtctt 5940 aatctaagct atcgctatgt tttcaaggat tctaagggaa aattaattaa tagcgacgat 6000 ttacagaagc aaggttattc actcacatat attgatttat gtactgtttc cattaaaaaa 6060 ggtaattcaa atgaaattgt taaatgtaat taattttgtt ttcttgatgt ttgtttcatc 6120 atcttctttt gctcaggtaa ttgaaatgaa taattcgcct ctgcgcgatt ttgtaacttg 6180 gtattcaaag caatcaggcg aatccgttat tgtttctccc gatgtaaaag gtactgttac 6240 tgtatattca tctgacgtta aacctgaaaa tctacgcaat ttctttattt ctgttttacg 6300 tgcaaataat tttgatatgg taggttctaa cccttccatt attcagaagt ataatccaaa 6360 caatcaggat tatattgatg aattgccatc atctgataat caggaatatg atgataattc 6420 cgctccttct ggtggtttct ttgttccgca aaatgataat gttactcaaa cttttaaaat 6480 taataacgtt cgggcaaagg atttaatacg agttgtcgaa ttgtttgtaa agtctaatac 6540 ttctaaatcc tcaaatgtat tatctattga cggctctaat ctattagttg ttagtgctcc 6600 taaagatatt ttagataacc ttcctcaatt cctttcaact gttgatttgc caactgacca 6660 gatattgatt gagggtttga tatttgaggt tcagcaaggt gatgctttag atttttcatt 6720 tgctgctggc tctcagcgtg gcactgttgc aggcggtgtt aatactgacc gcctcacctc 6780 tgttttatct tctgctggtg gttcgttcgg tatttttaat ggcgatgttt tagggctatc 6840 agttcgcgca ttaaagacta atagccattc aaaaatattg tctgtgccac gtattcttac 6900 gctttcaggt cagaagggtt ctatctctgt tggccagaat gtccctttta ttactggtcg 6960 tgtgactggt gaatctgcca atgtaaataa tccatttcag acgattgagc gtcaaaatgt 7020 aggtatttcc atgagcgttt ttcctgttgc aatggctggc ggtaatattg ttctggatat 7080 taccagcaag gccgatagtt tgagttcttc tactcaggca agtgatgtta ttactaatca 7140 aagaagtatt gctacaacgg ttaatttgcg tgatggacag actcttttac tcggtggcct 7200 cactgattat aaaaacactt ctcaggattc tggcgtaccg ttcctgtcta aaatcccttt 7260 aatcggcctc ctgtttagct cccgctctga ttctaacgag gaaagcacgt tatacgtgct 7320 cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 7380 ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 7440 tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 7500 ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg 7560 atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 7620 ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 7680 gacggatcgc ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc ggtgcgtcag cagaatatgt 7740 gatacaggat atattccgct tcctcgctca ctgactcgct acgctcggtc gttcgactgc 7800 ggcgagcgga aatggcttac gaacggggcg gagatttcct ggaagatgcc aggaagatac 7860 ttaacaggga agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc cataggctcc gcccccctga 7920 caagcatcac gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga aacccgacag gactataaag 7980 ataccaggcg tttccccctg gcggctccct cgtgcgctct cctgttcctg cctttcggtt 8040 taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg tttgtctcat tccacgcctg acactcagtt 8100 ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact gtatgcacga accccccgtt cagtccgacc 8160 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggaaagacat gcaaaagcac 8220 cactggcagc agccactggt aattgattta gaggagttag tcttgaagtc atgcgccggt 8280 taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt gactgcgctc ctccaagcca gttacctcgg 8340 ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc gaaaaaccgc cctgcaaggc ggttttttcg 8400 ttttcagagc aagagattac gcgcagacca aaacgatctc aagaagatca tcttattaag 8460 gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 8520 aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 8580 atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 8640 gcgatctgtc tatttcgttc atccatagt 8669 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 33 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20

Claims (16)

  1. 필라멘트성 파아지로부터 유래하는 pⅦ 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 융합 단백질은 N-말단 시그널 서열을 포함하지 않고, pⅦ 융합 단백질이 서열번호: 1 (MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR)의 아미노산 위치들 1-33, 2-33, 3-33, 4-33 및 5-33으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 파아지 게놈 또는 파아지미드.
  2. 제1항에 있어서, pⅦ 융합 단백질은 pⅦ에 융합된 펩티드를 포함하고, 상기 pⅦ에 융합된 펩티드는 pⅦ 서열의 N-말단에 직접적으로 융합된 파아지 게놈 또는 파아지미드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, pⅦ 융합 단백질은 pⅦ에 융합된 펩티드를 포함하고, 상기 pⅦ에 융합된 펩티드는 AviTag(서열번호:4), FLAG 태그(서열번호:9), HIS 태그(서열번호:12), HAT 태그, HA 태그, c-Myc 태그, Strep 태그, V5 태그, 항체 또는 그의 단편, T 세포 수용체 또는 그의 단편, MHC 클래스 I 및 II, 안키린, IgNAR 또는 그의 단편, 피브로넥틴 또는 그의 단편, 단백질 A의 Z 도메인, CTLA4 또는 그의 단편, ImmE7 및 GFP 및 기타 생물학적 유전자-암호화된 형광단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파아지 게놈 또는 파아지미드.
  4. 제1항에 있어서, pⅦ 융합 단백질은 pⅦ에 융합된 펩티드를 포함하고, 상기 pⅦ에 융합된 펩티드는 라이브러리 구성원인 파아지 게놈 또는 파아지미드.
  5. 제1항의 파아지 게놈 또는 파아지미드를 포함하는 필라멘트성 파아지.
  6. 제5항에 있어서, wt pⅦ 단백질 또는 wt pⅦ를 암호화하는 유전자 또는 양쪽 모두를 더 포함하는 필라멘트성 파아지.
  7. 제5항에 있어서, 상기 파아지는 wt pⅦ 단백질 또는 wt pⅦ를 암호화하는 유전자 또는 양쪽 모두를 포함하지 않는 필라멘트성 파아지.
  8. 제5항에 있어서, pⅢ 융합 단백질 또는 pⅧ 융합 단백질을 추가로 포함하는 필라멘트성 파아지.
  9. pⅢ, pⅦ 또는 pⅧ에 대한 융합물로서 외인성 펩티드를 디스플레이하는 제 5항에 기재된 필라멘트성 파아지의 라이브러리.
  10. 제9항에 있어서, 펩티드가 pⅦ 및, pⅢ 또는 pⅧ 중의 어느 하나, 또는 양쪽 모두에서 동시에 디스플레이되는 라이브러리.
  11. 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하며, 헬퍼 파아지는 제 1항의 핵산을 포함하는 파아지 디스플레이 계.
  12. 파아지미드 및 헬퍼 파아지를 포함하며, 파아지미드가 제 1항의 핵산을 포함하는 파아지 디스플레이 계.
  13. 제 11항 또는 제 12항의 파아지 디스플레이 계를 포함하는 키트.

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