KR101698884B1 - 신호 서열 독립적인 피나인 파지 디스플레이 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주로 pIX에서 유래하는 새로운 융합 단백질을 통해 사상 파지에 표시되는 펩티드에 대한 대안의 스캐폴드를 제공한다. 사상 파지의 라이브러리는 융합 단백질에서 생성될 수 있고, 파지미드와 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템이 본 발명의 일부이다. 본 발명의 태양은 상기 발명의 융합 단백질을 인코딩 하는 핵산 및 헬퍼 파지를 포함하는 파지미드로 구성된 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 키트이다.
Description
본 발명은 주로 pIX에서 유래하는 새로운 융합 단백질을 통해 사상 파지에 표시되는 펩티드에 대한 대안의 스캐폴드를 제공한다. 사상 파지의 라이브러리는 융합 단백질에서 생성될 수 있고, 파지미드와 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템이 본 발명의 일부이다. 본 발명의 태양은 상기 발명의 융합 단백질을 인코딩 하는 핵산 및 헬퍼 파지를 포함하는 파지미드로 구성된 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 키트이다.
단백질 식별, 특성화 및 변형에 대한 조합 접근의 사용은 학술과 상업적 연구 그리고 개발 에서 큰 성공을 거두었습니다. 이러한 측면에서, 사상(filamentous)박테리오 파지 또는 파지 디스플레이 기술은 최초의 라이브러리 플랫폼 존재와 지배 기술로 여전히 왕위의 길을 닦아왔다. 따라서, 파지 디스플레이는 기초 및 응용 단백질 발견 뿐만 아니라 가장 빠르게 성장하고 있는 전세계 화합물 클래스인 신규의 단백질 기반 진단 및 치료 발전에 폭넓게 적용된다.
조합 파지 디스플레이 기술의 원리는 단백질 외피에 의해 캡슐화된 게놈에 의해 인코딩되는 아주 동일한 단백질을 그것의 표면에만 표시하는 각각의 비리온의 특성에 의해 제공되는 유전자형-표현형 링키지에 기초한다. 상기 파지 입자 자체는 다양한 이화학적 조건에 강하게 저항한다; 그러므로 파지 디스플레이는 경쟁 조합 기술에 비해 많은 선택 체제에서 우수한 융통성을 제공한다.
이형 폴리펩티드의 파지 디스플레이는 사상 파지 외피의 모든 다섯가지 구조 단백질을 이용하여 성취되었으나, 단지 pIII-및 어느 정도의 pVIII 디스플레이만 폭넓게 사용되었다 (그림 1).
이형 융합은 짧은 펩타이드일 경우에만, 파지 게놈 기반 벡터를 이용하는 다가의 디스플레이 시스템이 선호된다. 반면, 접힌 도메인을 필요로 하는 큰 융합(fusions)의 경우, 대부분의 적용은 파지미드 시스템에서 도움이 될 것이다. 후자의 경우, 항체-pIII 파지 디스플레이가 지금까지 그 분야를 지배하고 있으나, 대안의 스캐폴드가 새벽녁에서 초기 빛을 발하고 있으며, 내일의 단백질 엔지니어링 도구의 확장에 대한 필요성이 지속되고 있다. 매우 바람직한 적용은 타겟에 결합된 동안 파지 비리온으로 박테리아를 감염하여 간단히 파지 디스플레이 라이브러리에서 고친화성 특정 펩타이드 또는 단백질의 바인더를 효과적으로 얻는 것이다.
Endemann 과 Model은 1995 (PMID : 7616570) 작은 외피pIX가 그것의 N-말단에 융합된 다른 단백질과 기능하지 않음을 보고했다. 따라서, 이러한 보고는 pIX가 파지 디스플레이에 사용될 수 없다고 결론 지었다.
Gao 등 (PMID : 10339535, 12239343와 WO0071694)와 Khalil 등 (PMID : 17360403)은 후에 N-말단 pIX 융합 디스플레이는 파지미드에서 발현될 때 그리고, 신호 서열 의존적인 주변 세포질(periplasmic) 타겟팅과 조합되어 사용될 때 허용된다는 것을 보여주었다. 이러한 시스템에서, 보완성은 야생형(wt) pIX 파지미드 구조시 헬퍼 파지 게놈에서 기증될때, 일어난다.
WO0071694의 그림 2A (삽입된 융합 단백질 없이) 및 WO0071694의 그림 2B (삽입된 융합 단백질 포함)에 공개된 상기 파지미드는 명확하게 pelB 신호 서열(7 페이지, 라인 2-14, 그림 텍스트와 함께)을 포함한다.
위에서 언급했듯이, 전에 pIX는 N 말단에 융합된 다른 단백질과 기능하지 않음을 제안했었고, Gao 등은 단독 또는 둘의 조합을 그들의 성공에 대한 두 가능한 이유로 제시했다.
한 가능한 이유는 원핵의 리더 서열 (신호 서열) 이 융합 단백질의 N-말단에 부착되고, 따라서 주변 세포질 공간으로 재조합 단백질의 타겟팅을 가능하게 하고, 그렇게 함으로써 세포질에 축적을 방지하는 것이었다.
또 다른 가능한 이유는 재조합 단백질이 Endemann and Model 에 의한 것 같이, 파지 게놈이 아니라 파지미드에서 발현되고, 따라서 파지미드 구조에 필수적으로 필요한 헬퍼파지에서 야생형 pIX가 재조합 PIX 융합 단백질을 보완했다. 그러므로 야생형의 기능성을 보존하게된다. 그렇지 않으면, 예를 들어, 상기 파지가 야생형과 융합 단백질의 혼합을 구성하는 재조합 수정으로 인해 손실될되 수 있다.
Khalil 등(PMID : 17360403)는 매우 동일한 비리온(virion)의 각 말단 끝에 표시되는 외인성 펩타이드의 이중특이성 사상 파지 비리온의 특성을 이용한 적용(응용)을 설명한다. 그들은 원핵의 신호 서열 의존적인 pIX 디스플레이 파지미드를 보완하는 일반적인 pIII 파지 게놈 벡터의 조합을 사용하여 이것을 달성했다. 이 설정에서 이러한 파지 게놈 벡터는 파지미드 구조에 있어 헬퍼 파지로 제공된다.
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본 발명의 목적은 사상 파지에 표시되는 펩티드에 대해 대체가능한 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 태양은 사상 파지에서 유래한 pIX 융합 단백질이며, 상기 융합 단백질은 원핵의 N-말단 신호서열을 포함하지 않고, 그러므로 외인성의 펩티드에 직접 융합된다.
본 발명의 다른 태양은 상기 발명의 융합단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 일태양은 상기 발명의 융합 단백질을 포함하는 사상 파지에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 사상 파지의 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 파지미드와 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템에 관한 것으로, 상기 파지미드는 상기 발명의 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일 태양은 파지미드와 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 키트에 관한 것으로, 상기 파지미드는 상기 발명의 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 주로 pIX에서 유래하는 새로운 융합 단백질을 통해 사상 파지에 표시되는 펩티드에 대한 대안의 스캐폴드를 제공한다. 사상 파지의 라이브러리는 융합 단백질에서 생성될 수 있고, 파지미드와 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템이 본 발명의 일부이다. 본 발명의 태양은 상기 발명의 융합 단백질을 인코딩 하는 핵산 및 헬퍼 파지를 포함하는 파지미드로 구성된 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 키트이다.
도 1은 사상 파지 구조의 개략도이다. 비리온은 단일가닥 DNA 분자를 덥는 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 야생형에서, 파지는 pVIII 약 2700 카피와 비리온의 각 끝에서 발견되는 네 개의 단백질 pIII, pVI, pVII 및 PIX중 하나의 약 3-5 카피가 있다. 비리온 크기는 pVIII 외피 단백질당 약 2.3 뉴클레오티드에서 게놈의 크기에 따라 달라지고, 그러므로, 입자의 길이는 pVIII의 삽입된 카피의 증가 또는 감소에 의해 달라진다. 특히, pIII 및 pVIII 구조는 x-선 섬유 회절, 결정학 및 NMR에 의해 특징되었다. 작은 외피 단백질 pIII는 글리신-리치 지역에 의해 분리된 세개의 독특한 도메인을 포함하고 있다:N1 (TolA 에 결합), N2 (F pilus에 결합) 및 CT (비리온에 통합되고 정상의 비리온 어셈블리에 중요함)
도 2는 신규한 pGALD9 (A) 와 pGALD97△L (B) pIX 디스플레이 파지미드의 개략도이다. 두 파지미드의 벡터 백본은 pIII 디스플레이 파지미드 pSEX81 (서열번호 2) 에 기초하고, 상기 서열은 GenBank의 접속 번호: Y14584로 접속될 수 있고 컨스트럭트에 대한 자세한 내용은 재료 및 방법에 설명되어 있다. 두 파지미드는 각각의 NcoI/HindIII및 MluI/NotI 부분의 쉬운 카세트 교환을 통해 프레임에서 외인성 서열(E1과 E2로 명명) 단편(segment)을 수용할 수 있다. 상기 카세트는 여기에서 설명된 다른 컨스트럭트 사이에서 다양한 합성 링커 서열에 의해 연결된다. 약어 : lacPO, 락 프로모터; SD, 샤인-달가노 서열; pelB, 세균 펙테이트 리에이즈의 신호 서열; TP, 트립신 프로테아제 사이트; t, T7 전사 종결부위.
도 3는 (A) scFv 항-phOx (서열번호 11) 및 pGALD9△L, pGALD9, pSEX81에서 표시된 (C) scFv 항-NIP의 파지미드 역가(titers)이다. 모든 파지미드는 앰피실린 저항 마커를 보유한다; 따라서 역가는 밀리리터 용액당 엠피실린 저항 콜로니 형성 단위 (cfuampR / ML)로 표시된다. pGALD9△L, pGALD9, pSEX81에서 표시된 (B) scFv 항-phOx (서열번호11) 와 (D) scFv 항-NIP 의 헬퍼파지에 대한 파지미드 비율은 헬퍼파지 역가(cfukanR/ml)에 의해 나눠진 파지미드 역가(cfuampR/ml) 의 비율로 나타냈다. 비리온 패키징은 슈퍼 감염 후에, (기본 발현, basal expression)없이 또는 0.1 mM IPTG 존재 (IPTG 유도) 의 최종 농도로 재료와 방법에 설명된 것과 같이 표준 파지미드 구조에 의해 수행되었다.
도 4는 기능적인 (A) scFv 항-phOx (서열번호11)와 (B) scFv anti-NIP (서열번호 3) 를 비교한 항원 특이적인 ELISA는 pIX와 PIII 사이, 그리고 신호 서열과 그리고 신호 서열 없이(△L) 나타낸다. 상기 ELISA는 맑은 비리온을 포함하는 상청액100 ml/well 를 사용하여 재료와 방법에서 설명한대로 수행되었다. 상기 항-M13HRP 는 항원과 블록(block)에 대한 비리온 검출 MAb의 비특이적인 흡수에 대한 음성 대조군이다(C와 D). A와 B의 ELISA가 반복되었으나 신호 포화 전에 중단되었으며, 상대 표시 레벨은 역가 기능으로서 항원 반응을 사용하여 결정되었다.
도 5에서, 친화도 선택에 명백한 타겟-특이적인 농축 (enrichment) 은 캡시드 디스플레이 스캐폴드, 관심 단백질의 발현 (POI) 및 용출 조건에 따라 다르다. 선택 라운드 1 및 2 후에, 8개 각각의 phOx-/NIP-스파이크(spiked) 라이브러리에서 적정되지 않은 비리온을 포함하는 상청액의 동등한 볼륨이 ELISA로 항원 반응에 대해 평가되었다. 가능한 최대 반응을 계산하기 위해, 라운드 0에서 유래된 스파이크 농축에서 복제 상청액(clonal supernatants)이 포함되었고, 묘사된 결과는 원뿔 모양으로 나타낸 최대 가능한 반응의 프랙션으로 배경 신호를 빼서 나타냈다.
도 2는 신규한 pGALD9 (A) 와 pGALD97△L (B) pIX 디스플레이 파지미드의 개략도이다. 두 파지미드의 벡터 백본은 pIII 디스플레이 파지미드 pSEX81 (서열번호 2) 에 기초하고, 상기 서열은 GenBank의 접속 번호: Y14584로 접속될 수 있고 컨스트럭트에 대한 자세한 내용은 재료 및 방법에 설명되어 있다. 두 파지미드는 각각의 NcoI/HindIII및 MluI/NotI 부분의 쉬운 카세트 교환을 통해 프레임에서 외인성 서열(E1과 E2로 명명) 단편(segment)을 수용할 수 있다. 상기 카세트는 여기에서 설명된 다른 컨스트럭트 사이에서 다양한 합성 링커 서열에 의해 연결된다. 약어 : lacPO, 락 프로모터; SD, 샤인-달가노 서열; pelB, 세균 펙테이트 리에이즈의 신호 서열; TP, 트립신 프로테아제 사이트; t, T7 전사 종결부위.
도 3는 (A) scFv 항-phOx (서열번호 11) 및 pGALD9△L, pGALD9, pSEX81에서 표시된 (C) scFv 항-NIP의 파지미드 역가(titers)이다. 모든 파지미드는 앰피실린 저항 마커를 보유한다; 따라서 역가는 밀리리터 용액당 엠피실린 저항 콜로니 형성 단위 (cfuampR / ML)로 표시된다. pGALD9△L, pGALD9, pSEX81에서 표시된 (B) scFv 항-phOx (서열번호11) 와 (D) scFv 항-NIP 의 헬퍼파지에 대한 파지미드 비율은 헬퍼파지 역가(cfukanR/ml)에 의해 나눠진 파지미드 역가(cfuampR/ml) 의 비율로 나타냈다. 비리온 패키징은 슈퍼 감염 후에, (기본 발현, basal expression)없이 또는 0.1 mM IPTG 존재 (IPTG 유도) 의 최종 농도로 재료와 방법에 설명된 것과 같이 표준 파지미드 구조에 의해 수행되었다.
도 4는 기능적인 (A) scFv 항-phOx (서열번호11)와 (B) scFv anti-NIP (서열번호 3) 를 비교한 항원 특이적인 ELISA는 pIX와 PIII 사이, 그리고 신호 서열과 그리고 신호 서열 없이(△L) 나타낸다. 상기 ELISA는 맑은 비리온을 포함하는 상청액100 ml/well 를 사용하여 재료와 방법에서 설명한대로 수행되었다. 상기 항-M13HRP 는 항원과 블록(block)에 대한 비리온 검출 MAb의 비특이적인 흡수에 대한 음성 대조군이다(C와 D). A와 B의 ELISA가 반복되었으나 신호 포화 전에 중단되었으며, 상대 표시 레벨은 역가 기능으로서 항원 반응을 사용하여 결정되었다.
도 5에서, 친화도 선택에 명백한 타겟-특이적인 농축 (enrichment) 은 캡시드 디스플레이 스캐폴드, 관심 단백질의 발현 (POI) 및 용출 조건에 따라 다르다. 선택 라운드 1 및 2 후에, 8개 각각의 phOx-/NIP-스파이크(spiked) 라이브러리에서 적정되지 않은 비리온을 포함하는 상청액의 동등한 볼륨이 ELISA로 항원 반응에 대해 평가되었다. 가능한 최대 반응을 계산하기 위해, 라운드 0에서 유래된 스파이크 농축에서 복제 상청액(clonal supernatants)이 포함되었고, 묘사된 결과는 원뿔 모양으로 나타낸 최대 가능한 반응의 프랙션으로 배경 신호를 빼서 나타냈다.
발명의 일태양의 문맥에서 묘사된 구현예와 특성은 또한 본 발명의 다른 태양에도 적용된다.
본 적용에서 인용된 모든 특허와 비특허 참고문헌은 전부 참조에 의해 여기에 통합된다.
우리는 여기 신규 개념을 제시하는데, 사상 파지 비리온의 구조 외피 단백질pIX는 유전적으로 변형되고, 이러한 변경된 버전이 N-말단 펩티드 또는 단백질 도메인을 인코딩한다.
pIX 융합 단백질
일 태양에서, 본 발명은 사상 파지에서 유래한 pIX 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질은 pIX N-말단에 외인성 펩티드의 융합을 포함한다. 이러한 융합 단백질은 예를 들면 파지 디스플레이의 문맥에서 유용하다.
외인성 펩티드를 나타낼 때, 펩티드는 융합 단백질의 pIX 아미노산 부분의 N-말단 끝에 임의의 링커 아미노산을 가지거나 또는 없이 상기 pIX 단백질의 원래 부분이 아닌 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 원핵의 N-말단 신호 서열을 포함하지 않는다.
여기 사용된 바대로, 용어 펩티드는 짧은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 그리고 이들의 단편을 포함한다.
용어 pIX 단백질은 (서열번호 1 :MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS) 에 공개된 아미노산 서열을 나타낸다.
구현예에서, pIX 단백질은 서열번호 1의 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 75 % 동일성, 80 % 동일성, 81 % 동일성, 82 % 동일성, 83 % 동일성, 84 % 동일성, 85 % 동일성, 86 % 동일성, 87 % 동일성, 88 % 동일성, 89 % 동일성, 90 % 동일성, 91 % 동일성, 92 % 동일성, 93 % 동일성, 94 % 동일성, 95 % 동일성, 96 % 동일성, 97 % 동일성, 98 % 동일성, 99 % 동일성을 가진 아미노산으로 구성된다.
서열 동일성(유사성)
공통적으로 정의된 "동일성"은 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 유전자 또는 단백질 사이의 서열 동일성으로 정의된다.
그러므로, 본 문맥에서, “서열 동일성”은 뉴클레오티드 수준에서, 핵산 사이의 동일성 측정과 아미노산 수준에서 단백질 사이의 동일성 측정이다. 상기 단백질 서열 동일성은 서열이 정렬될 때, 각 서열의 주어진 위치에서 아미노산 서열을 비교하여 결정될 수 있다. 유사하게 핵산 서열 동일성은 서열이 정렬될 때, 각 서열의 주어진 위치에서 뉴클레오티드 서열을 비교하여 결정될 수 있다.
두 아미노산 서열 또는 두 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서, 서열들은 최적의 비교 목적으로 정렬된다(예를 들면, 두번째 아미노산 또는 핵산 서열과 최적 정렬을 위해 첫번째 아미노산 또는 핵산 서열에 간격(gap)이 도입될 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드는 다음에 비교된다. 첫번째 서열의 위치가 두번째 서열의 상응하는 위치에 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지될 때, 그 다음에 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 서열에 의해 공유된 동일한 위치 수의 기능이다. (예를 들면 동일성 %= 동일한 위치의 수/위치의 토탈 수(예, 중복 위치) x 100). 일 구현예에서 두 서열은 같은 길이이다.
수동으로 서열을 정렬하고, 동일한 아미노산의 수를 계산할 수 있다. 선택적으로 동일성 퍼센트 결정을 위한 두 서열의 정렬은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 통합된다 (Altschul 등. 1990). BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자와 동종 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어길이=12으로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 동종 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST program, 점수 = 50, 단어길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해 갭트(gapped) BLAST가 이용될 수 있다. 선택적으로, PSI-Blast는 분자 사이의 먼 관계를 감지하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다. NBLAS, XBLAST, 그리고 갭트BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.를 봐라. 선택적으로 EMBL 데이터베이스에 있는 예를 들어 BLAST 프로그램에 의해 서열이 정렬된 후에 서열 동일성이 계산될수 있다(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST). 일반적으로 예를 들어, “스콜링 매트릭스(scoring matrix)” 와 “갭 페널티(gap penalty)”에 대한 디폴트 세팅은 정렬을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 상기 BLASTN와 PSI BLAST 디폴트 세팅은 유용할 수 있다.
두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않고, 위에 설명된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정할 때, 정확한 매치만이 계산된다.
접힌(Folded) 단백질
바람직한 구현예에서, 용어 펩티드는 항체 유래 도메인 같은 접힌 단백질만을 의미한다. 숙련된 수신인은 접힌 단백질이 항체 또는Fv, scFv, Fab, 싱글 도메인을 포함하는 항체의 단편, 단백질 A의 Z 도메인 또는 이의 단편(애피바디, Affibody), 안키린(Ankyrin) 또는 이의 단편, 달핀(DARPin) 또는 이의 단편, T 세포 수용체 또는 이의 단편, , MHC 클래스 I 또는 II 또는 이들의 단편, 피브로넥틴 또는 이의 단편, 안티칼린(Anticalins) 또는 이의 단편, PDZ-도메인 또는 이의 단편, IgNAR 또는 이의 단편, CTLA4 또는 이의 단편, ImmE7 또는 이의 단편, 노틴(Knottins) 또는 이의 단편, 아비머(avimer) 또는 이의 단편, GFP 또는 이의 단편 및 다른 유전자-암호화된 생물학적 형광단임을 인식할 것이다.
원칙적으로, 그것이 표시되는 한, 무언가의 라이브러리를 만들 수 있다. 그러므로, 그것의 가장 간단한 형태에서, 겹(fold)인 규칙 구조와 비교해서, 비구조적인 구성을 가진 무언가 사이를 단지 분리할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 용어 펩티드는 2에서 50aa사이의 짧은 펩티드만을 의미한다. 어떤 길이에서, 짧은 무작위의 코일 펩티드는 정의된 2차 또는 3차 폴드를 채택할 정도로 충분히 길 것이고, 그러므로 접힌 도메인 정의(definition) 로 들어간다. 명백히, 이는 화학적 조성에 따라 다를 것이고, 그러므로, 20aa 펩티드는 무작위 코일일 것이고, 반면 다른 20aa펩티드는 접힐 수 있고, 접힌 도메인 정의로 분류될 것이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 pIX 융합 단백질은 서열번호 1의 위치 1-32, 2-32, 3-32, 4-32, 5-32, 6-32, 7-32, 8-32, 9-32, 10-32, 11-32 및 12-32로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 원칙적으로, 파지미드 문맥에서, 임의의 pIX N-말단 변형은 트랜스멤브레인 부분이 유지되고, 정상의 비리온 결합 및 조립을 가능하게 한다.
서열번호 1 (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS) 은 사상 파지 pIX 구조 외피 단백질 (야생형 pIX)의 아미노산 서열이다. 가장 바람직하게, 상기 pIX 융합 단백질은 서열번호 1의 위치 1-32로 구성된다.
서열번호 1은 아래 설명된 신호/리더 서열과 혼동해서는 안된다.
신호서열
바람직하게, 외인성 펩티드는 융합단백질의 pIX 서열의 N- 말단 끝에 임의의 링커 아미노산과 함께 또는 링커 아미노산 없이 직접 융합된다.
그러나, 다른 바람직한 구현예에서, 상기 pIX 융합 단백질은 원핵의 N-말단 리더 서열을 포함하지 않는다.
용어 “리더서열”은 용어 “신호 펩티드”그리고 “신호 서열”과 교대해서 사용되고, 그람 음성 박테리아의 주변 세포질 막 공간에 단백질(리더 서열의 부분)을 타겟하는 아미노산 서열을 의미한다. 종종 사용되는 리더 서열의 예는 pelBss, OmpAss, TorAss, malEss, phoAss, lamBss, Blass, 그리고 DspAss, mglBss, sfmCss, tolBss 그리고 TorTss이다. 이러한 신호 서열은 세포질에서 주변 세포질 공간으로 적어도 SRP-의존적인, SEC-의존적인, TatABC-의존적인 또는 YidC-의존적인 전좌(translocation)를 포함한다고 알려진 E.coli의 분비 기기에 완전한 단백질을 타겟한다고 알려져 있다(Baneyx et al. PMID: 15529165). 그러므로, 용어 N-말단 신호 서열은 단백질의 N-말단 부분의 신호 서열을 의미한다.
E. coli 분비 기기에 단백질을 타겟하는 특성을 보유하고 그렇게 함으로써 세포질 구획에서 주변 세포질 구획으로 단백질을 전좌하는 신호 서열은 아미노산 조성의 화학적 특성에 의해 정의된 특징 또는 모티프를 통해 부분적으로 확인될 수 있다.
현존하는 기능성 신호 서열의 다양성은 그것들을 확인하는데 아직 현재의 지식을 초과하고 있다. 그러므로, 같은 종류의 신호 서열로 펩티드를 정의하는 현재 상태의 기술은 예를 들면 신경망 또는 발견적 방법론에 의해 템플릿 기반 테이터 기반의 지식을 사용하여 테이타 마이닝을 통해 일반적으로 수행된다. 오늘날 SignalP, PROSITE 의PPSEARCH (EMBL-EBI), SecretomeP, TatP 같은 개방형 액세스 채널을 통해 지역사회에 이용가능한 다양한 도구가 있다.
도전은 분비 단백질의 클래스는 더욱 크며, 이러한 의미에서, 규칙을 벗어나는 세포질 구획에서 내보내지며, 이것은 신호 서열 모티브를 확인할 수 없게 한다. 그러나 데이터 마이닝을 통해, 또한 문제가 있는 신호서열의 특성을 정의하거나 원핵 단백질의 분비 능력의 가능성을 얻을 수 있다. 원핵의 분류군에 대해 이러한 도구는 아직 존재하지 않는다.
그러므로, 신호 서열로 펩티드를 최종적으로 확인하는 현재 이용가능한 유일한 방법은 그것이 진짜 신호 서열인지 아닌지를 확립하는 펩티드의 특성을 검증하는 실험 방법에 의한 것이다. 신호 서열에 주어진 아미노산 위치가 변경될 수 있고 그러나 원래의 기능성 또는 증가된 수송 능력 같은 변경된 기능성에 의해 신호 펩티드로서 그것의 기능을 보유하는 이러한 펩티드에서 엔지니어링이 수행될수 있는 것은이 명확하다. 또한 아미노산의 삭제 또는 첨가가 이용될 수 있다. 이러한 분석과 엔지니어링은 Ff pVIII 신호서열, Sec-경로를 타겟하는 g8pss, 그리고 Tat-경로를 타겟하는 TorAss를 가지고 실제로 행해졌다. 특히 Shen등의 결과는 기능적 엔지니어링을 위한 잘 확립된 가이드 라인으로 제공할 수 있으나, pIII 신호서열과 세균 펙테이트 리에이즈 신호 서열의 변경된 돌연변이는 아니다.
신호 서열의 기능성은 추가로 다음 두개의 속성으로 분류된다.
1. E. coli 의 분비 기기에 단백질 (단백질의 일부)을 타겟하고, 그렇게 함으로써, 그것을 세포질 구획에서에서 주변 세포질 구획으로 전좌시키며, 이러한 프로세스의 과정에서, 지질단백질 신호 펩티다제 또는 리더 펩티다제 같은 특정 프로테아제에 의해 남아있는 단백질로에서 단백질 가수분해적으로 분리된다.
2. E. coli 의 분비 기기에 단백질 (단백질의 일부) 을 타겟하고 그렇게 함으로써, 그것을 세포질 구획에서에서 주변 세포질 구획으로 전좌시키며, 전좌 후에 단백질의 부분으로 여전히 남아있다.
신호 서열의 대부분은 위에 주어진 상황 1)에 있지만, 이러한 단백질이 쉽게 상황 2)로 설계될 수 있다는 것은 명확하다. 따라서, 예로, 돌연변이 pelBss 와 원래 상황 1)에 속해 있으나 상황 2)로 변경된 다른 것들 같이 현재 알려진 임의의 신호 서열은 여전히 유사한 신호 서열로 간주된다.
또한, 상황 1)의 신호 서열은 상황 2)로 변경되거나 또는 직접 상황 2)에 있는 신호 서열을 선택하고 그리고나서, 전좌 후에 신호 서열을 제거하는 것을 상상할 수 있다. 이것은 단백질이 캡시드 단백질에 융합될때, 숙주의 내생의 프로테아제 및/또는 예로 파지 디스플레이의 경우에 행해질 수 있다. 그리고나서, 정의된 절단이 수행될 수 있는 신호서열의 적당한 지역 또는 단백질의 일부, 인공적인 프로테아제 사이트에서 행해질 수 있다. 선택된 프로테아제 사이트의 두가지 유형을 구상할 수 있다.
A. 프로테아제 사이트는 항체 또는 다른 관심 스캐폴드 예, 주요 조직 적합 유전자 복합체 분자 또는 T 세포 수용체, 와 결합한 카르복시펩티다아제 A, 3C 리노바이러스 프로테아제 사이트 같은 관심 단백질의 예측 사이트만을 절단하지 않는다. 이러한 접근법을 사용하여 위의 상황 2)에 맵핑하는 신호 서열의 사용에 의해 그리고 캡시드 융합에 기능성과 균질성을 얻을 수 있는 신호 펩티드를 인공적으로 제거하기 위한 선택 등에 사용되기 전에 예를 들어 관심 단백질의 파지 디스플레이를 구상할 수 있다.
B. 상기 프로테아제 사이트는 예를 들어 트립신 같은 설계된 사이트 이외에 관심 단백질을 절단한다.
두 상황은 여전히 신호 서열-의존적인 파지 디스플레이로 간주될 것이다.
외인성 펩티드
바람직한 구현예에서, pIX 융합 단백질의 외인성 펩티드는 항체 또는Fv, scFv, Fab, 싱글 도메인을 포함하는 항체의 단편, 단백질 A의 Z 도메인 또는 이의 단편(애피바디, Affibody), 안키린(Ankyrin) 또는 이의 단편, 달핀(DARPin) 또는 이의 단편, T 세포 수용체 또는 이의 단편, , MHC 클래스 I 또는 II 또는 이들의 단편, 피브로넥틴 또는 이의 단편, 안티칼린(Anticalins) 또는 이의 단편, PDZ-도메인 또는 이의 단편, IgNAR 또는 이의 단편, CTLA4 또는 이의 단편, ImmE7 또는 이의 단편, 노틴(Knottins) 또는 이의 단편, 아비머(avimer) 또는 이의 단편, GFP 또는 이의 단편 및 다른 유전자-암호화된 생물학적 형광단으로 구성된 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, pIX 융합 단백질의 외인성 펩티드는 라이브러리 멤버이다.
본 문맥에 사용된 라이브러리는 다른 펩티드들의 컬렉션을 나타낸다. 상기 펩티드들은 접힌 도메인 또는 예를 들어 2-50 아미노산의 짧은 펩티드일 수 있다. 이러한 라이브러리는 주어진 타겟에 결합하는 새로운 리간드를 확인하는데 사용될 수 있어, 관심이 있다.
pIII 또는 pVIII을 사용하여 표시된 라이브러리와 비교해서, 라이브러리를 표시하기 위한 pIX를 사용하는 여러 가지 이점이 있다. pIX 디스플레이는 방향성 및 수가에 관한 pIII 디스플레이와 같은 자산을 보유하지만, 친화도 선택 후에 예를 들어, 구조에 관한 시스템에 통제되지 않거나 원치 않는 이질성을 도입하는 pIII 디스플레이에 발생하는 것으로 알려진 현상인 감염력에 영향을 주지 않는다.
또한, pIX 디스플레이는 pIII 및 pVIII 디스플레이의 필수조건인 원핵의 N-말단 신호 서열의 필요없이 달성될 수 있다. 마지막으로, pIII 디스플레이의 임의의 타겟 고정된 종은 일반적으로 이러한 타겟-파지 결합의 파괴(일반적으로 경쟁하거나 또는 높거나 낮은 pH 용출에 의해)를 필요로 한다. 이것은 예를 들어 pIII 디스플레이에 고 친화도 또는 안정적인 바인더의 회수를 심각하게 방해하는 것으로 알려져 있다. 심지어 파지-타겟 상호 작용 후 감염에 필요한 pIII가 변형되지 않고, pIX 디스플레이의 선택적인 상호작용에 쉽게 이용가능하다. 이것은 예를 들어 고정된 파지가 전체 감염력을 유지하고, 그러므로 타겟에 결합된 동안 감염에 의해 간단히 복원될수 있는 산성 용출 같은 결합 파괴의 필요성을 완전히 제거한다.
핵산
발명의 두 번째 태양은 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이다. 발명의 핵산은 플라스미드, 벡터, 파지 게놈, 파지미드 또는 파스미드의 일부일 수 있다.
용어 핵산은 단량체 뉴클레오티드의 체인으로 구성된 거대분자(고분자)를 의미한다. 생화학에서 이 분자는 세포 내에서 유전 정보 또는 양식 구조를 나른다. 가장 일반적인 핵산은 디옥시리보핵산 (DNA)와 리보핵산 (RNA)이다. 또한, 용어 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 모폴리노 (Morpholino) 및 잠금 핵산 (LNA) 뿐만 아니라 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA) 같은 인공 핵산을 포함한다. 이들 각각은 분자의 백본을 변화하여 자연스럽게 발생하는 DNA 또는 RNA로부터 구분될 수 있다.
파지미드 또는 파스미드는 플라스미드로 증식할 수 있는 벡터를 생산하기 위해 파상파지 Ff와 플라스미드의 하이브리드로 개발된 클로닝 벡터 유형이고, 또한 바이러스 입자에 외가닥DNA로 패키지된다. 플라스미드와 유사하게, 파지미드는 DNA 단편에 복제하도록 사용될 수 있고, 기술의 범위(형질전환, 전기천공법)에 의해 박테리아 숙주에 도입될 수 있다. 그러나, 예로 VCSM13 또는 M13K07 같은 '헬퍼' 파지와 파지미드를 포함한 박테리아 숙주의 감염은 필요한 바이러스 구성요소가 외가닥 DNA 복제와 파지미드DNA를 파지 입자로 패키징하는 것을 가능하게 된다.
따라서, 본 발명의 일태양은 사상 파지에서 유래한 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 구성된 파지 게놈 또는 파지미드에 관한 것으로, 상기 융합 단백질은 원핵의 N-말단 신호 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 구현예에서 상기 파지 게놈 또는 파지미드는 사상 파지에서 유래한 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 구성되며, 상기 융합 단백질은 원핵의 N-말단 신호 서열을 포함하지 않고, 상기 pIX 융합 단백질은 서열번호 1 (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS) 의 위치 1-32, 2-32, 3-32, 4-32 및 5-32로 이루어진 군에서 선택된 서열로 구성된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 외인성 펩티드는 상기 pIX 서열의 N-말단 끝에 직접 융합된다.
본 발명의 구현예는 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드에 관한 것으로, 상기 pIX에 융합된 외인성 펩티드는 항체 또는Fv, scFv, Fab, 싱글 도메인을 포함하는 항체의 단편, 단백질 A의 Z 도메인 또는 이의 단편(애피바디, Affibody), 안키린(Ankyrin) 또는 이의 단편, 달핀(DARPin) 또는 이의 단편, T 세포 수용체 또는 이의 단편, , MHC 클래스 I 또는 II 또는 이들의 단편, 피브로넥틴 또는 이의 단편, 안티칼린(Anticalins) 또는 이의 단편, PDZ-도메인 또는 이의 단편, IgNAR 또는 이의 단편, CTLA4 또는 이의 단편, ImmE7 또는 이의 단편, 노틴(Knottins) 또는 이의 단편, 아비머(avimer) 또는 이의 단편, GFP 또는 이의 단편 및 다른 유전자-암호화된 생물학적 형광단으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 구현예는 pIX 라이브러리 멤버에 융합된 외인성 펩티드이다.
사상 파지
본 발명의 세번째 태양은 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 사상파지이다. 상기 사상 파지 비리온은 파지미드를 수용한다.
종종 박테리오 파지로 불리는 파지는 여기에 바이러스를 감염하고, 복제하는 것을 의미하고, 박테리아에서 분비된다. 사상 박테리오 파지 또는 사상 파지는 파지 외피 단백질로 싸여있는 외가닥 DNA (ssDNA)분자를 가진 파지이다. 상기 분비된 사상 파지 입자는 표현형적으로 사상(실모양) 구조를 가진다.
여기 사용된 용어 사상 파지는 파지 게놈 유래 비리온과 파지미드 유래 비리온 모두를 포함한다.
용어 헬퍼 파지는 예를 들어 파지미드로 정의된 분리된 그리고 관련되지 않은 결함이 있는 바이러스를 도와주는 바이러스를 의미한다. 파지미드 자체는 파지 게놈도 기능성 바이러스도 아니지만, 결함이 있는 바이러스에 의해 이미 점유된 같은 숙주 세포를 감염하여 복제하기 위해 단순히 파지 게놈에서 파생된 하나 또는 여러 개의 요소를 포함하는 플라스미드이며, 결함있는 바이러스가 놓치고 있는 단백질과 파지미드를 포함하는 비리온을 형성할 필요를 제공한다.
일 구현예에서, 사상 파지는 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 구성된 파지미드를 포함하는 파지가 특히 바람직하다.
파지 라이브러리는 하나 이상의 사상 파지 외피 단백질의 부분으로 펩티드 또는 단백질을 표시(디스플레이)하는 사상 파지의 컬렉션이다. 이러한 라이브러리는 다른 펩티드 또는 단백질을 표시하는 둘 이상의 파지를 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 일구현예에서, 상기 사상 파지는 사상 파지 외피 단백질의 하나 이상의 부분으로 펩티드 또는 단백질을 표시하고 있다.
구현예에서 사상 파지는 추가적으로 pIII 융합단백질, pVII 융합단백질, 또는 pVIII 융합단백질을 포함한다.
발명의 태양은 사상 파지의 라이브러리로, 상기 사상 파지는 하나 이상의 pIII, pVII, pVIII 또는 pIX에 융합된 외인성 펩티드 또는 단백질을 표시하고 있다.
라이브러리는 하나 이상의 사상 파지 외피 단백질의 부분으로 펩티드 또는 단백질을 표시하는 사상 파지 컬렉션이다.
이러한 라이브러리는 다른 펩티드 또는 단백질을 표시하는 둘 이상의 파지를 포함할 수 있다.
본 발명의 태양은 다른 단백질을 표시하는 둘 이상의 사상 파지로 구성된 파지 라이브러리에 관한 것으로, 이들 단백질의 적어도 하나는 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드에서 발현된 pIX 융합 단백질이다.
본 발명의 구현예는 다른 펩티드 또는 단백질을 표시하는 둘 이상의 사상 파지를 포함하는 파지 라이브러리에 관한 것이다.
특별한 구현예에서 이들 펩티드 또는 단백질의 적어도 하나는 본 발명의 pIX 융합 단백질이다.
구현예에서, 펩티드는 pIX 그리고 pIII, pVII 또는 pVIII의 어느 하나에서 자발적으로 표시된다.
다른 구현예에서, 펩티드는 pIX 그리고 pIII, pVII 또는 pVIII로 구성된 군에서 선택된 둘 또는 셋에서 자발적으로 표시된다.
가끔 wildtype, wild-type 또는 wt로 쓰여진 용어 야생형(wild type)은 자연에서 발생하는 대로, 유기체, 계통, 유전자 또는 특성의 전형적인 형태이다. 야생형은 자연적 집단에서 가장 흔한 표현형을 의미한다. 야생형은 또한 야생형 표현형를 생성하는 데 필요한 각 로커스의 대립 유전자를 의미한다. 야생형은 유전자형과 표현형에 대한 참조의 표준이다. 생물학에서 그것은 특별히 자연적으로 발생하는 개체와 의도적으로 변형된 개체 사이의 차이를 의미한다. 사이트-디렉티드 돌연변이 유발은 야생형 유전자의 유전자 서열에서 특정 뉴클레오티드 돌연변이를 허용하는 연구기법이다. 야생형 단백질은 wt-(단백질의 이름)으로 쓰이고, 예로 야생형 pIX 단백질은wt pIX, wt -pIX 또는 wildtype pIX로 쓰여진다.
따라서, 발명의 일 태양은 wt pIX를 인코딩하는 유전자 및/또는 wt pIX 단백질을 포함하지 않는 본 발명의 사상 파지에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 wt pIX를 인코딩하는 유전자 및/또는 wt pIX 단백질을 추가적으로 포함하는 본 발명의 사상 파지에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 사상 파지에 관한 것이다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 사상 파지는 wt pIX를 인코딩하는 유전자 및/또는 wt pIX 단백질을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 사상 파지는 wt pIX를 인코딩하는 유전자 및/또는 wt pIX 단백질을 포함하지 않는다.
본 발명의 추가 태양은 wt pIX 단백질에 의한 상보성 없이 파지 디스플레이에서 기능하는 pIX 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 사상 파지에 관한 것으로, 추가적으로 pIII 융합 단백질, pVII 융합 단백질 및 pVIII 융합 단백질에서 선택된 하나 이상의 군을 포함한다.
파지 디스플레이 시스템
본 발명의 다섯번째 태양은 파지미드 또는 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템으로, 상기 헬퍼 파지는 본 발명의 pIX 융합단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
파지 디스플레이 시스템, 파지 디스플레이 기법, 파지 디스플레이 기술 또는 간단히 파지 디스플레이는 그들을 인코딩하는 유전 정보와 단백질을 연결하는 박테리오 파지를 이용한 단백질-단백질, 단백질-펩티드 및 단백질-DNA 상호 작용의 발견과 연구에 관한 방법을 의미한다.
표시하고 있는 단백질 또는 표시된 단백질은 리간드에 의해 감지 또는 고정에 대해 접근가능한 파지 외피 단백질에 융합되는 단백질을 의미한다.
본 발명의 여섯번째 태양은 파지미드 및 헬퍼파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템이며, 상기 파지미드는 본 발명의 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 파지 디스플레이 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드 그리고 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 태양은 다른 단백질을 표시하고 있는 둘 이상의 사상 파지를 포함하는 파지 라이브러리에 관한 것으로, 이들 단백질의 적어도 하나는 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드에서 발현된 pIX 융합단백질이다.
본 발명의 구현예는, pIII 융합 단백질, pVII 융합 단백질 및 pVIII 융합 단백질로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 융합단백질의 파지 라이브러리를 포함한다.
키트
발명의 일곱번째 태양은 파지미드 및 헬퍼 파지로 구성된 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 키트로, 상기 파지미드는 발명의 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 키트는 코딩 영역과 헬퍼 파지(예,M13K07, VCSM13 또는 기타)의 N-말단에 여러 복제 사이트가 있는 pIX 인코딩 유전자를 가진 파지미드를 포함해야 한다. 상기 키트는 파지 클론의 감염, 발현, 고정, 선택 및 검출을 위한 프로토콜을 보충해야 한다. 상기 키트는 버퍼에 대한 필요한 레시피 및 특정 어세이 수행을 위한 미디어를 또한 포함해야 한다.
키트는 파지 디스플레이 라이브러이 또는 단일 파지 입자의 어느 하나로서 단일 또는 이중특이 융합 단백질을 가진 파지 입자를 생성하는 시약의 컬렉션이다. 키트는 파지미드, 헬퍼 파지, 박테이라 계통 및 시약과 어세이 설명에 대한 레시피를 가진 프로토콜을 포함할 수 있다. 키트는 연구, 진단 및 치료 시약 개발에 사용될 수 있다.
본 발명의 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드 그리고 헬퍼 파지를 포함하는 파지 디스플레이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 사상 파지를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 다음의 제한하지 않는 실시예에 추가적인 자세한 내용이 설명될 것이다.
실시예들
실시예 1: pIX 파지 디스플레이
시약
모든 미디어와 버퍼는 본질적으로 Sambrook등에 설명된 대로 본질적으로 준비되었다(2001). 분자 복제 : 실험실 설명서, 콜드 스프링 하버, NY : 콜드 스프링 하버 연구소의 출판. 항- M13 - HRP 항체는 GE 헬스케어 바이오 사이언스 AB (Uppsala, Sweden)에서 구입했다. 제한 효소 (RE)은 스트라타진 (LaJolla, CA, USA)로부터 획득된 DpnI를 제외하고 뉴잉글랜드 바이오랩스 (Ipswich, MA, USA) 에서 구입했다. DNA 올리고는 MWG 생명 공학 AG (Ebersberg, 독일)에서 구입했다. 소 혈청 알부민 (BSA)과 Tween 20 은 시그마-알드리치 (Oslo, Norway)에서 구입했다. Pfu 터보 DNA 중합 효소는 스트라타진 (LaJolla, CA, USA)에서 구입했다. BSA에 컨쥬게이션된 haptens 2-phenyloxazol-5-one (phOx) 및 5-nitrophenacetyl (NIP)는 그 밖에 설명된 대로 필수적으로 준비되었다 (Nakela et al, PMID; 722243 및 Michaelsen et al, PMID: 2125362). Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)는 Fermentas (Burlington, Canada)에서 구입했다. Triethylamine (TEA) 및 Trypsin/EDTA 는 각각 시그마 - 알드리치 (Oslo, Norway) 와 BioWhittaker (Lonza Group Ltd., Visp, Switzerland)에서 구입했다. E. coli 의 스트레인 XL1 - 블루는 Stratagene (LaJolla, CA, USA)에서 구입했다. M13K07 헬퍼 파지는 GE 헬스케어 바이오 사이언스 AB (Uppsala, Sweden)에서 구입했다. phOx-BSA 에 대한 특이성을 가진 single chain Fv (scFv) 를 보유하는 pSEX81 (서열번호 2) 파지미드 (pIII 디스플레이) 는 Affitech AS (Oslo, Norway)에 의해 친절하게 제공되었다. scFv anti-NIP (서열번호 3)( 게시되지 않은)를 보유하는 원핵의 발현 벡터 pSG1는 pHOG21 (Kiprianov 등, PMID : 9005945)에 기초하고, pLNOH2와 pLNOK (Norderhaug등, PMID: 9202712)에서 파생된 항체 다양한 유전자에서 사내에서 만들었다. Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)는 퍼멘타스(Burlington, Canada)에서 구입했다. Triethylamine (TEA) 및 Trypsin/EDTA 는 각각 시그마-알드리치 (Oslo, Norway) 와 바이오휘타커 (Lonza Group Ltd., Visp, Switzerland)에서 구입했다. E. coli 의 스트레인 XL1-블루는 스트라타진 (LaJolla, CA, USA)에서 구입했다. M13K07 헬퍼 파지는 GE 헬스케어 바이오 사이언스 AB (Uppsala, Sweden)에서 구입했다. phOx-BSA 에 대한 특이성을 가진 single chain Fv (scFv) 를 보유하는 pSEX81 (서열번호 2) 파지미드 (pIII 디스플레이) 는 Affitech AS (Oslo, Norway)에 의해 친절하게 제공되었다. scFv anti-NIP (서열번호 3)(게시되지 않음)를 보유하는 원핵의 발현 벡터 pSG1는 pHOG21 (Kiprianov 등, PMID : 9005945)에 기초하고, pLNOH2와 pLNOK (Norderhaug등, PMID: 9202712)에서 파생된 항체 가변 유전자에서 사내에서 만들었다.
신규한 pIX 디스플레이 파지미드 벡터 pGALD9 및 pGALD9에 대한 컨스트럭션 벡터
백본에 대한 시작 템플릿으로, 위에서 설명된 pSEX81 (서열번호2) 파지미드가 선택되었다(GenBank accession no.: Y14584). 첫째, 이 벡터에서 스트레치를 인코딩하는 원핵의 pelB 신호 서열(N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C) (서열번호4)를 제거하기 위하여, 시험관내 돌연변이 유발에서 NcoI RE 사이트는 프라이머 쌍 a41g-frwd/a41g-rev rev (5'-AGAGGAGAAATTAACCATGGAATACCTATTGCCTACGGC-3'/5- GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT-3') (서열번호 5 및 서열번호 6, 각각)를 사용하여 QuikChange ™ 에 의해 N-말단 맨끝에 도입되었고 그렇게 함으로써, A 에서 G까지 pelB ORF의 두번째 코돈에 첫번째 코돈을 변화시킨다. 돌연변이 유발 후에, 상기 벡터는 NcoI 절단되고, 다시 붙여지고, 프라이머 쌍pHOG_EcoRI_frwd/scTCR_rev(5'-TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3'/5'-TTTGGATCCAGCGGCCGC-3')(서열번호 7 및 서열번호 8, 각각)을 사용하여 벡터의 관련있는 부분을 리트리빙하는 두번째 PCR에 템플릿으로 사용된다. 그리고나서, 이러한 PCR 단편은 표준 기술을 사용하여 호환가능한 EcoRI / HindIII RE 사이트에 원래의 pSEX81 (서열번호 2)에 이동되었고 DNA의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 이 단계는 부분을 인코딩하는 pelB 신호 서열을 제거했으나, 원래의 pSEX81(서열번호 2)에서 발견되는 NcoI/NotI RE 사이트에 의해 정의된 외인성 서열 전에 단지 하나의 Ala 잔기를 더할 뿐만 아니라, 일반적인 전사와 번역에 중요한 lacPO 및 Shine-Dalgarno sequence (SD)쪽으로 시작 코돈과 그것의 상대 위치를 보존했다. 새로운 컨스트럭트는 pSEX81△L 로 명명되었다. 두번째 pXI 인코딩 서열은 5' 엔드 RE-태그드 프라이머 쌍 pIX_EcoRV / pIX_NheI(5'-ATATGATATCAGAATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCC-3' /5'-ATATGCTAGCTTATCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGG-3') (서열번호 9 및 서열번호 10)을 사용하여 M13K07에서 증폭되었다. 그리고 나서, 이 PCR 단편은 호환가능한 RE 사이트에 pSEX81 (서열번호 2), 및 pSEX81△L 파지미드에 이동되었으며, 그렇게 함으로써 양쪽다에 pIII 인코딩 영역을 교환하고, 원래 pSEX81 (서열번호 2)에 NcoI/NotI-정의된 카세트의 프레임pIX 융합에서 N-말단을 낸다. 새로운 컨스트럭트는 DNA 시퀸싱에 의해 확인되었고, 각각 pGALD9와 pGALD9△L으로 명명했다. pSG1에서 scFv 항(anti)-NIP (서열번호 3) 유닛을 가지고 위에 설명된 다양한 파지미드에 scFv anti-phOx (서열번호11) 유닛을 전환하기 위해, 표준기술을 사용하여 NcoI/NotI RE 정의된 카세트 교환으로 행해졌다. 여기 설명된 모든 파지미드는 표준 기술을 이용하여 전기천공법에 의해 E. coli XL1-Blue에 도입되었다.
파지 입자 준비
M13K07 헬퍼 파지와 비리온 어셈블리를 사용하여 E. coli XL1-Blue에서 파지 구조는 설명된 스폿 적정에 의해 측정되었다(Welschof 등, PMID: 9050877 및 Koch 등, PMID: 11126120).
파지-캡쳐 효소결합면역흡착측정법(ELISAs)
phOx-BSA 또는 NIP-BSA는 pH 7.4 PBS, 4℃에서 하룻밤 동안 MaxiSorp™ 마이크로타이터 플레이트 웰 (Nunc, Roskilde, Denmark)에 흡수되었다. 상기 웰은 실온에서 1시간 비리온 준비동안, 2% BSA가 함유된 PBS (w/v)에 로 블락되었고, 그 후 더해졌고, 캡쳐된 비리온이 실온에서 1시간동안 항- M13-HRP (1:5,000) 로 검출되기 전에 실온에서 한 두시간 동안 반응되었다. 각 단계 사이에, 상기 웰은 3배 PBST (PBS/0.05% Tween 20) 로 씻어졌다. 상기 웰은 30분 후에 TMB 용해성 기질로 현상되었고, 1M HCl로 중단되었고, 흡광도는 A450nm에서 읽혀졌다. 비리온당 표시된 융합 단백질의 기능으로 Ag 반응성을 정량화하기 위해, 1M HCl 을 더해 신호 포화가 임의의 샘플에 대해 관찰되기 전에 상기 ELISA 현상은 중단되었고, 다음 공식에 따라 흡수성 읽기는 변화되었다: 상대 디스플레이 레벨 =(A450nm/파지미드 적정)x 1012
스파이크트 phOx-/NIP-BSA 선택
신선한 비리온 샘플이 1 mM IPTG 유도와 함께 또는 없이 준비되었으며, 상기 설명된대로 PEG 침전되었고, 적정되었다.
그리고 나서, 상기 타겟-특이 개체는 중간 사이즈 조합 라이브러리에 해당하는 107 의 알려진 다양성을 주는 1:107 수준에서 관련없는 백그라운드에 스파이크트되었다.
NIP-BSA 선택에 대해, scFv 항-NIP는 scFv 항-phOx 상대에 스파이크트되었고, 역도 같다. 초기 입력은 모든 12 모델 라이브러리에 대한 패닝 1 라운드에서 103의 복잡한 수준에서 1X 1010 cfuampR였다.
간단히, 타겟은 패닝 라운드 1및 2 각각에 대해 1 mg/ml 및 0.1mg/ml 100 ml 볼륨을 사용하여 같은 플레이트에 3배수로 MaxiSorp™ 마이크로타이터 플레이트 웰에 고정되었다.
패닝하기전에, 각각의 사전 블락된 100 ml(PBSTM에서) 비리온 준비전에 상기 웰은 실온에서 1-2시간 PBSTM 으로 블락되었으며, 상기 웰은 더해졌고, 실온에서 1.5h 동안 교반해서 반응되었다.
1) pH 6.8 Tris-HCl, 100 ml/웰 을 포함하는 신선한 웰로 이동에 의한 중화 후에, 다음으로 실온에서 5분동안 100 mM TEA (pH 12) 100 ml/웰을 더함으로써, 타겟 결합된 비리온(3배수 웰)이 용출되기 전에 상기 웰은 마이크로타이터 워셔를 사용하여 증류수에서 5번, 다음으로 PBST에서 9번 씻어졌다; 2) 신선한 웰에 이동후에 실온에서 10분동안 Tryspin/EDTA 100 ml/웰을 더했다; 3) MOI10에서 M13K07 헬퍼 파지로 보충된 미리 예열된 YT-TAG 10 ml(30 mg/ml 테트라사이클린, 100 mg/ml 엠피실린, 0.1M 글루코스를 포함하는2x YT) 을 이동한 후에, 37℃ 에서 30분간 교반한 200 ml/웰 로그기(A600nm ~ 0.5, 5x 107 cells 이상에 해당) E. coli XL1-Blue를 더했다.
배양은 37℃에서 30분간 강하게 교반한 후에, 37℃에서 15분간 약하게 교반되었다. MOI10에서 M13K07 헬퍼 파지로 보충된 YT-TAG 1 ml 이 더해지기전에, 샘플에서 용출된 TEA 및 Trypsin은 37℃에서 15분간 약한 교반으로 배양된 9 ml YT-TAG에 로그기 E. coli XL1-Blue 배양을 감염하는데 사용되었다.
배양은 37℃에서 30분간 강하게 교반한 후에, 37℃에서 15분간 약하게 교반되었다. 그 후 모든 샘플은 실온에서 10분간 3000-g에서 원심분리되었고, 상청액은 버리고 펠렛을 앰피실린 100 mg/ml 및 카나마이신 50 mg/ml가 함유된 사전 예열된 2x YT 10 ml 에서 온화하게 다시 서스펜드했다.
해당 샘플은 1 ㎜의 IPT가 보충되었고, 모든 샘플은 강한 교반과 함께 30℃ 에서 배양되었다. 다음날, 상기 배양액은 실온에서 10분간 4000-g에서 원심분리되었고, 상청액은 0 .2 mm 필터를 통과하여 깨끗한 15-ml 투브로 멸균 필터되었다.
이러한 상청액은 다음으로 최소 샘플당109 cfuampR 의 인풋에 상응하는 샘플당 볼륨50 ml 를 사용하여 설명된대로, 패닝의 다음 라운드로 보내졌다. 상청액을 함유하는 비리온 선택의 제 2라운드 후에, 위에 설명된 대로, 항원 특이적인 ELISA 로 보내졌다.
결과
사상파지의 5개 모두의 구조 외피 단백질(FD, M13 및 F1)은 튀어나온 비리온에 통합되기 전에 그램음성 숙주의 내막에서 발견되는 내재단백질로 알려져 있다(Endeman and Model, PMID: 7616570). 이러한 보고는 pIX가 임의의 N-말단 융합 변경을 허용하지 않더라도, 캡시드 단백질 자체가 손상 비리온에 접근가능한 용매라고 결론지었다. Gao 등(PMID: 10339535 and 12239343) 및 Khalil 등(PMID: 17360403) 은 후에 N-말단 pIX 융합 디스플레이가 파지미드에서 발현되고, 신호 서열 의존적인 주변 세포질 타겟팅과 조합해서 사용될 때, 허용되는 것을 보았다. 이러한 시스템에서, 야생형 pIX 가 파지미드 구조에 대해 헬퍼 파지 게놈에서 기부됨으로 보완성은 일어난다. 이러한 디스플레이가 주변 세포질로 임의의 신호 서열 의존적인 타겟팅이 없이 허용되는지를 테스트하기 위해, 우리는 각각 신호서열이 있거나 없거나 N-말단 pIX 디스플레이를 가능하게 하는 pGALD9 및 pGALD9△L 로 명칭되는 두개의 신규한 파지미드를 만들었다 (도 2).
두 개의 다른 pIX의 융합은 이러한 신규의 파지미드를 사용하여 분석을 위해 선택되었고, 표준 pIII 디스플레이를 사용하여 그들의 상대를 비교했다. 두 융합은 합텐 컨쥬게이트 phOx-BSA (scFv anti-phOx)에 특이적인 인간 항체 가변 유전자 세그먼트 또는 합텐 컨쥬게이트 NIP-BSA (scFv anti-NIP)에 특이적인 쥐과 항체 가변 유전자 세그먼트에 기반한 항체 단편 scFvs 였다. 특히, 상기 scFv 항-phOx (서열번호:11)은 인간 항체 scFv 라이브러리에서 선택되었으며 E. coli 에서 다소 잘 발현하는 것으로 알려져 있다(Marks 등, PMID: 1748994). 반면에, 파지에 디스플레이될때, 많은 쥐과 하이브리도마 가변 유전자는 E. coli 에 잘 발현하지 않는 것으로 알려져 있다(Krebber 등, PMID: 9032408).
scFvs의 pIX 디스플레이는 정상 비리온 어셈블리를 방해하지는 않는다. 따라서 우리는 재료 및 방법에 설명된 대로, 표준 파지미드 구조 및 적정을 사용하여, 신호서열 있거나 없거나 그리고 또한 표준 pIII 디스플레이(신호 서열 의존적인 주변 세포질 타겟팅에 절대적인 필요조건을 가지고 있는)와 함께 이러한 scFv 디스플레이 파지미드의 성능을 비교했다. (도 3)
적정 결과 실제로 파지미드 함유 비리온은 모든 경우에 만들어졌다. (그림 3A와 C). scFv의 융합은 프로모터 유도없이 lac PO (기초 발현)에서 발현될 때, 두 pIX 디스플레이 버전과 pIII 대조군은 scFv 항-phOx에 대한 비교할만한 역가를 얻었다(Figure 2A). 반대로, pIII 및 신호 서열 의존적인 pIX 디스플레이 각각에 비교해서, 신호 서열 독립적인 scFv 항-NIP pIX 디스플레이의 역가는 5-10배 더 높다 (그림 3C). 증가된 scFv 융합 발현이 lacPO의 IPTG유도 강제시, 신호 서열 의존적인 pIX 및 pIII 디스플레이 둘다의 역가에서 약 10배 감소했다. 반대로, 두 신호 서열 독립적인 pIX 변종에서 단지 작은효과만 있었다(그림 3A 및 C). pIX의 야생형 보완성이 이러한 시스템의 헬퍼 파지에 존재할 때, 신호 서열 의존적인 pIX와 pIII 디스플레이가 비리온 어셈블리 과정을 방해하는 것을 보여주기 때문에 이러한 발견은 놀랍고 중요했다. 반면, 이러한 효과는 IPTG 유도에 대한 신호서열 독립적인 pIX 디스플레이 경우에 단지 경미하다. 이러한 효과는 신호서열 있거나 없거나 pIX 에 표시되는 scFv 항-NIP의 결과를 비교할 때 가장 두드러지며, 전자는 역가에서, 100배 감소를 나타낸다. 두 scFvs에 대해, 신호 서열 독립적인 pIX 버전에서 행해질 때, 비리온 어셈블리는 pIII만큼 좋거나 더욱 좋다는 것이 또한 주목할 만하다.
어떤 조합 선택 플랫폼의 핵심은 표현형 선택을 통해 유전자형의 리트리벌(retrieval)을 가능하게 하는 물리적 표현형-유전형 커플링이다. 이러한 물리적 링크가 손상 또는 분실된 경우, 이러한 시스템이 기능이 없게 된다. 파지미드 디스플레이로 번역되는 것은 헬퍼 파지 구조시 헬퍼 파지 게놈이 아닌, 비리온으로 요약되는 파지미드가 임의의 선택에 중요한 것을 의미한다. 파지미드와 헬퍼 파지는 다른 항생제 선택 마커를 수용하며, 이 개념은 감염 적정동안 적절한 선택 성장(앰피실린(ampR) 또는 카나마이신 (kanR))으로 인한 각각의 콜로니 형성 단위 (cfu)에 기초하여 헬퍼 파지에 대한 파지미드 비율을 계산하여 쉽게 평가될 수 있다. 상기 비율은 실현가능하도록 임의의 효율적인 다운스트림 선택에 대해 1 이상이어야 한다.
위에서 설명한 비리온 준비의 헬퍼파지에 대한 파지미드의 비율을 평가할 때(그림 3B 및 D), 세 가지 디스플레이 루트 사이의 중요한 차이점이 드러났다. 프로모터 유도없이 표준 비리온 패키징을 사용하여 (기본 발현), 모든 세 루트는 scFv 항-phOx에 대해 다양했고 (그림 2B), 반면 scFv 항-NIP의 경우(그림 3D), 서열 독립적인 pIX 변종에 대해서만, 참이었다. 프로모터 유도에 대해(IPTG 유도), pIII 및 서열 의존적인 pIX 변종은 심각한 표현형-유전자형 링키지의 손실을 보였으며, 상기 효과는 scFv 항-NIP 융합에서 가장 두드러졌다. 반대로, 두 신호 서열 독립적인 pIX 변종에 대해 이러한 효과는없거나(scFv 항-phOx) 또는 온화했다(scFv 항-NIP). 게다가 상기 결과는 표준 pIII 및 신호서열 의존적인 pIX 디스플레이에 비교하여, 신호 서열 독립적인 pIX 디스플레이가 우수한 표현형-유전형 링키지 표현형을 보유하는 것을 명확하게 보여준다.
위의 샘플을 기반으로, 우리는 다음으로 항원 특이적인 ELISA 에서 이러한 비리온의 기능적인 scFv 디스플레이를 평가했다(그림. 4). 상기 결과는 명확하게 세 가지 디스플레이 루트에서 기능적인 scFv 디스플레이를 보여주었다 (그림 4A와 B). 샘플이 파지미드 역가에 따라 정규화되지 않을 때, 신호 강도를 직접 비교할 수 없다. 또한, 신호 포화는 여러 샘플에서 관찰되었다. 적절하게 세 개의 디스플레이 루트 사이의 기능적 차이를 평가하기 위해, 재료 및 방법에 설명된 대로, 상대 디스플레이 레벨 (비리온당 기능성 표시 단위)은 새로운 항원 특이적인 ELISA 에서 결정되었다(그림 4C 및 D). III 와 신호 서열 의존적인 pIX 변종 사이에 디스플레이 레벨이 상당한 반면, 신호 서열 독립적인 pIX 디스플레이는 상당히 낮았다. 두 scFvs 및 두 기본 발현 및 IPTG 유도에서 참이었다. 기대된 대로, 세 디스플레이 루트 및 두 scFv는 IPTG 유도에 대해 높은 디스플레이를 나타냈다. 그러나, 그림 3B 및 D에 주어진 비율의 빛에서 그림 4C 및 D에 대한 결과를 보는 것이 가장 중요하다. 예를 들면, scFv 항-NIP 단위의 pIII 및 신호 서열 의존적인 pIX 디스플레이는 신호 서열 독립적인 pIX 상대에 비교하여, 10-20 배 (기본 발현) 및 25 배 (IPTG 유도) 높은 디스플레이를 나타낸다. 그러나, 두 전 루트는 매우 약하거되나 분실된 표현형-유전자형 링크를 가지며, 그들의 유전자형은 표현형 선택시 손실되는 것 같이, 조합 선택에서, 체제가 그들을 비기능적이게 할 수 있다. 이 효과는 scFv 항-phOx 단위에 대해 또한 사실이나, IPTG유도에만이다. 또한, IPTG 유도 신호 서열 독립적인pIX 변종에서 scFv 항-phOx 단위의 표시 레벨은 기본 발현에서 pIII 및 신호 서열 의존적인pIX 변종과 비교된다. 이러한 데이터의 관점에서 scFv 디스플레이 (Gao, PMID: 12239343) 에 대한 pIX (신호 서열 의존적)를 이용하는 유일한 보고는 비리온 패키징시 항상 IPTG 유도를 사용하나, 헬퍼 파지에 대한 파지미드 비율은 보고되지 않았다는 점에서 흥미롭다.
scFv 포맷은 유리한 발현 프로필에 의해 E. coli 에서 종종 사용되나 (Bradbury 및 Marks, PMID: 15261570), 여러 보고는 친화도 선택시, 높은 친화 바인더를 리트리빙 (retrieving)시 (de Haard, 등, PMID: 10373423 및 Hoogenboom, PMID: 16151404) 및 (Rothe 등, PMID: 18191144), 항체 Fab 단편 같은 낮은 레벨의 디스플레이 포맷의 장점을 정확히 기술한다.
따라서, 신호 서열 독립적인 scFv - pIX 디스플레이는 낮은 레벨 디스플레이를 얻을 것으로 보인다 하더라도, 이것은 실제로 고친화성 선택에 적용될때, 매우 유리한 것으로 판명 수 있다.
그러므로, 친화도 선택에서, 신호서열 독립적인 pIX디스플레이가 수행하는 방법을 평가하기 위해, 우리는 기존의 pIII 디스플레이를 비교했다.
비리온은 IPTG 유도의 존재 또는 부재시 생산되었고, 상기 관심의 단백질은 scFv 항- phOx 또는 항-NIP 중 하나 였다.
따라서, 총4 파지 집단이 두 타겟 phOx과 NIP-BSA, 각각에 대해 평가되었다. 각각의 경우에, 타겟 특이적인 scFv는 특이성 없는 scFv와 1: 107의 비율에서 함께 혼합했다.
중요하게도 두 scFvs는 교차 반응하지 않는다. 친화도 선택의 두 라운드가 그 후 수행되었다.
세 가지 다른 용출 전략이 이용되었다; 높은 pH, 단백질 분해 또는 직접 감염 중 하나. 선택의 두 번째 라운드 후에, 농축 (enrichment) 은 항원 특이적인 다클론성의 파지 ELISA 에 의해 확인되었다(Fig. 5).
관심의 단백질이 pIX에 표시되었을 때, 선택은 POI가 pIII에 표시될 때보다 대략 동등하게 효과적이고 대부분의 경우에 보다 효율적이었다. 특히 높은 pH (TEA) 또는 단백질 분해 (트립신) 용출을 이용하는 표준 pIII 디스플레이 루트는 pIX에 비해 약한 농축을 나타냈다.
선택은 디스플레이 루트 및 용출 조건에 독립적으로 IPTG 유도보다 없는 것이 더욱 효율적이었고, 부정적인 효과는 pIII 디스플레이 루트에 가장 심각한 것으로 나타났다.
따라서, 신호 서열 독립적인 pIX의 낮은 디스플레이 특성은 좋지 않은 선택으로 번역되지 않았다. 변경되지 않는 pIII 와 완전히 용매에 노출됨으로써, 라이브러리 선택 단계 후에, 비리온 구조는 비리온-타겟 본드를 깨지않고, 불필요한 용출단계를 만들지 않고, 높은 처리 프로토콜의 속도를 높여 효과적으로 수행될 수 있다.
후자는 또한 높은 친화 바인더의 분리를 촉진시킬 수 있고, 상기 용출이 다양한 전략에 저항하게 할 수 있다(Balass 등, PMID: 8954559).
<110> NEXTERA AS
<120> Signal Sequence-Independent pIX Phage Display
<130> 11PC275
<150> US 61/155,437
<151> 2009-02-25
<150> DK 09/000,666
<151> 2009-05-28
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> Bacteriophage M13
<400> 1
Met Ser Val Leu Val Tyr Ser Phe Ala Ser Phe Val Leu Gly Trp Cys
1 5 10 15
Leu Arg Ser Gly Ile Thr Tyr Phe Thr Arg Leu Met Glu Thr Ser Ser
20 25 30
<210> 2
<211> 4860
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phagemid
<400> 2
tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 60
ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 120
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 180
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 240
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 300
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 360
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 420
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 480
caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc 540
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 600
cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 660
gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 720
ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 780
tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 840
aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 900
ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 960
agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 1020
gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 1080
gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 1140
gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 1200
tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 1260
ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 1320
cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 1380
gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 1440
cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 1500
tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 1560
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 1620
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 1680
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 1740
cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 1800
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 1860
accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 1920
tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 1980
cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 2040
gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 2100
ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 2160
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 2220
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 2280
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 2340
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 2400
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 2460
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc aggtatcacg 2520
aggccctttc gtcttcacct cgagagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 2580
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 2640
aattgtgagc ggataacaat ttcacacaga attcattaaa gaggagaaat taaccatgaa 2700
atacctattg cctacggcag ccgctggctt gctgctgctg gcagctcagc cggccatggc 2760
gcaagttcag ctgcagcagt ctggggctga actggtgagg cctggggtct cagtgaagat 2820
ttcctgcaag ggttctggct acaaattcac tgattatgct acgcactggg tgaaacagag 2880
tcatgcaaag agtctagagt ggattggagt tattagtact tactatggtg atactactta 2940
taaccagaag ttcaagggca aggccacaat gactgtcgac aaatcctcca gcacagccta 3000
tatggaactt cccagactga catctgatga ttctgccatc tattattgtg ccctgttacg 3060
cccctttgct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgta tcctcaggga gtgcatccgc 3120
cccaaagctt gaagaaggtg aattttcaga agcacgcgta gatatcgtgc tgacccaatc 3180
tccactctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca 3240
gagtctgtta aacagtggaa atcaaaataa cgacttggcc tggtaccagc agaaaccagg 3300
gcaacgtcct aaactgttga tctacggggc atccactagg gaatctgggg tccctgatcg 3360
cttcacaggc agtggatctg gaaccgattt cactcttacc atcagcagtg tgcaggctga 3420
agacctggca gtttattact gtcagaatga tcatagttat ccgttaacgt tcggtgctgg 3480
caccaagctg gaaatcaaac gggcggccgc tggatccaaa gatatcagag ctgaaactgt 3540
tgaaagttgt ttagcaaaat cccatacaga aaattcattt actaacgtct ggaaagacga 3600
caaaacttta gatcgttacg ctaactatga gggctgtctg tggaatgcta caggcgttgt 3660
agtttgtact ggtgacgaaa ctcagtgtta cggtacatgg gttcctattg ggcttgctat 3720
ccctgaaaat gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct gagggtggcg gttctgaggg 3780
tggcggtact aaacctcctg agtacggtga tacacctatt ccgggctata cttatatcaa 3840
ccctctcgac ggcacttatc cgcctggtac tgagcaaaac cccgctaatc ctaatccttc 3900
tcttgaggag tctcagcctc ttaatacttt catgtttcag aataataggt tccgaaatag 3960
gcagggggca ttaactgttt atacgggcac tgttactcaa ggcactgacc ccgttaaaac 4020
ttattaccag tacactcctg tatcatcaaa agccatgtat gacgcttact ggaacggtaa 4080
attcagagac tgcgctttcc attctggctt taatgaggat ttatttgttt gtgaatatca 4140
aggccaatcg tctgacctgc ctcaacctcc tgtcaatgct ggcggcggct ctggtggtgg 4200
ttctggtggc ggctctgagg gtggtggctc tgagggtggc ggttctgagg gtggcggctc 4260
tgagggaggc ggttccggtg gtggctctgg ttccggtgat tttgattatg aaaagatggc 4320
aaacgctaat aagggggcta tgaccgaaaa tgccgatgaa aacgcgctac agtctgacgc 4380
taaaggcaaa cttgattctg tcgctactga ttacggtgct gctatcgatg gtttcattgg 4440
tgacgtttcc ggccttgcta atggtaatgg tgctactggt gattttgctg gctctaattc 4500
ccaaatggct caagtcggtg acggtgataa ttcaccttta atgaataatt tccgtcaata 4560
tttaccttcc ctccctcaat cggttgaatg tcgccctttt gtctttggcg ctggtaaacc 4620
atatgaattt tctattgatt gtgacaaaat aaacttattc cgtggtgtct ttgcgtttct 4680
tttatatgtt gccaccttta tgtatgtatt ttctacgttt gctaacatac tgcgtaataa 4740
ggagtcttaa tgatctagag gcctgtgcta atgatcagct agcttgaggc atcaataaaa 4800
cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggttaacgtc 4860
4860
<210> 3
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment of scFv
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln Ala Val Val Thr
130 135 140
Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
165 170 175
Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr
180 185 190
Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile
195 200 205
Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Thr Gln Thr Glu Asp Glu
210 215 220
Ala Met Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal sequence
<400> 4
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala
20
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
agaggagaaa ttaaccatgg aatacctatt gcctacggc 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
gccgtaggca ataggtattc catggttaat ttctcctct 39
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
tagctcactc attaggcacc c 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
tttggatcca gcggccgc 18
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
atatgatatc agaatgagtg ttttagtgta ttctttcgcc 40
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
atatgctagc ttatcatgag gaagtttcca ttaaacggg 39
<210> 11
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Tyr Lys Ser Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Phe Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Thr Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Leu Val Pro Lys Arg Thr Ala Thr Leu His Tyr Tyr Ile Asp
100 105 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser
115 120 125
Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ser
130 135 140
Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val
165 170 175
Ser Trp Tyr Val Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Asp Asn Asn Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Gly Ser Leu Arg Glu
225 230 235 240
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
245 250
Claims (12)
- 사상파지에서 유래한 pIX 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 융합 단백질은 원핵의 N-말단 신호 서열을 포함하지 않고, 외인성 펩티드가 상기 pIX 서열의 N-말단 끝에 직접 융합되는 것인 파지 게놈 또는 파지미드.
- 제 1항에 있어서,
상기 pIX 융합 단백질은 서열번호 1의 위치 1-32, 2-32, 3-32, 4-32 및 5-32로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 것인 파지 게놈 또는 파지미드.
- 제 1항에 있어서,
상기 외인성 펩티드는 항체 또는 Fv, scFv, Fab, 싱글 도메인을 포함하는 항체의 단편, 단백질 A의 Z 도메인 또는 이의 단편(애피바디, Affibody), 안키린(Ankyrin) 또는 이의 단편, 달핀(DARPin) 또는 이의 단편, T 세포 수용체 또는 이의 단편, MHC 클래스 I 또는 II 또는 이들의 단편, 피브로넥틴 또는 이의 단편, 안티칼린(Anticalins) 또는 이의 단편, PDZ-도메인 또는 이의 단편, IgNAR 또는 이의 단편, CTLA4 또는 이의 단편, ImmE7 또는 이의 단편, 노틴(Knottins) 또는 이의 단편, 아비머(avimer) 또는 이의 단편, GFP 또는 이의 단편 및 다른 유전자-암호화된 생물학적 형광단으로 구성된 군에서 선택된 것인 파지 게놈 또는 파지미드.
- 제 1항에 있어서,
상기 외인성 펩티드는 라이브러리 멤버인 것인 파지 게놈 또는 파지미드.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 따른 파지 게놈 또는 파지미드를 포함하는 사상 파지.
- 제 5항에 있어서,
야생형 pIX를 인코딩하는 유전자 및/또는 상기 야생형 pIX 단백질을 더 포함하는 사상파지.
- 제 5항에 있어서,
상기 파지는 야생형 pIX를 인코딩하는 유전자 또는 상기 야생형 pIX 단백질을 포함하지 않는 것인 사상파지.
- 제 5항에 있어서,
pIII 융합 단백질, pVII 융합 단백질 및 pVIII 융합 단백질에서 선택된 하나 이상의 군을 더 포함하는 것인 사상파지.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 따른 파지 게놈 또는 파지미드 및 헬퍼파지를 포함하는 파지 디스플레이 시스템.
- 제 9항의 파지 디스플레이 시스템을 포함하는 키트.
- 다른 단백질을 표시하는 적어도 두개 이상의 사상 파지를 포함하며, 이들 단백질 중의 적어도 하나는 제 1항에 따른 상기 파지 게놈 또는 파지미드에서 발현된 상기 pIX 융합 단백질인 파지 라이브러리.
- 삭제
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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